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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
ADELINE DE ANDRADE CARVALHO
VITRIFICAÇÃO DE TECIDO OVARIANO CAPRINO: EFEITO DE
UM NOVO DISPOSITIVO FECHADO E ADIÇÃO DE CATALASE
FORTALEZA
2013
2
ADELINE DE ANDRADE CARVALHO
VITRIFICAÇÃO DE TECIDO OVARIANO CAPRINO: EFEITO DE
UM NOVO DISPOSITIVO FECHADO E ADIÇÃO DE CATALASE
FORTALEZA
2013
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial
para obtenção do título de Doutor em Ciências
Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Linha de pesquisa: Reprodução e Sanidade de
Pequenos Ruminantes.
Orientadora: Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro Rodrigues.
3
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Estadual do Ceará
Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho
Bibliotecária Responsável – Leila Sátiro – CRB-3 / 544
C391v Carvalho, Adeline de Andrade.
Vitrificação de tecido ovariano caprino: efeito de um novo
dispositivo fechado e adição de catalase/Adeline de Andrade Carvalho.
— 2013.
CD-ROM :190f.il. (algumas color.); 4 ¾ pol.
“CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho
acadêmico, acondicionado em caixa de DVD Slin (19 x 14 cm x 7
mm)”.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual do Ceará, Faculdade de
Veterinária, Doutorado em Ciências Veterinárias, Fortaleza, 2013.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Orientação: Profª. Drª. Ana Paula Ribeiro Rodrigues.
Co-orientação: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo.
1. Criopreservação. 2. Antioxidante. 3. Folículo pré-antral. 4.
Cabra. Título.
CDD: 636.089
4
5
À minha família e ao meu namorado
pelo apoio eterno e incondicional
Dedico
6
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me dar coragem para buscar meus objetivos, força para superar as
adversidades e serenidade para desfrutar dos momentos felizes;
A todas as instituições de ensino as quais frequentei, bem como aos professores
e servidores das mesmas, pois todos têm colaboração na pessoa que hoje sou;
À Universidade Federal do Piauí, especialmente aos Professores Rômulo José
Vieira e Amilton Paulo Raposo Costa, pelos ensinamentos e por me instigarem a visão
crítica e a curiosidade, características tão necessárias a um pesquisador;
À Universidade Estadual do Ceará (UECE), ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências Veterinárias (PPGCV) e ao Laboratório de Manipulação de Oócitos e
Folículos Ovarianos Pré-Antrais (LAMOFOPA), pela oportunidade de fazer meu
doutorado;
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
pela bolsa de doutorado concedida, pois sem esta dificilmente conseguiria concluir meu
almejado doutorado;
Ao Professor José Ricardo de Figueiredo, por sempre me incentivar e me
estimular a crescer e me aperfeiçoar;
Aos Professores Cláudio Cabral Campello, Francielli Weber Santos e Vilceu
Bordignon, pela valorosa contribuição nas publicações;
À Professora Regiane Rodrigues Santos, por sua contribuição tão valorosa e
por sempre estar tão próxima ao longo de todo o doutorado;
À Professora Ana Paula Ribeiro Rodrigues, pela orientação, confiança e apoio,
principalmente nesta etapa final;
7
Aos Doutores Carlos Henrique Lobo e Cláudio Afonso Pinho Lopes, pela
contribuição científica e amizade;
A toda a equipe do LAMOFOPA, incluindo os servidores, alunos que fizeram
parte da equipe, os que ainda estão na equipe e os que estão chegando agora, todos
agregam novos ensinamentos e novas experiências, tanto profissionais quanto pessoais;
À minha equipe de trabalho, Luciana R. Faustino, Cleidson M. G. Silva e
Simone V. Castro, pelo apoio, pelas noites de sono e finais de semana perdidos, e,
principalmente, por tamanho esforço ser realizado sempre de bom humor;
À Simone, pelo companheirismo, nos momentos difíceis e nos momentos
alegres, tanto no âmbito profissional quanto pessoal;
Ao Cleidson e sua esposa, Liliane, pela amizade, pelo carinho, pelo ombro
amigo e por me fazerem sentir como parte da família;
À Luciana, por ser amiga, no sentido mais real e completo da palavra. Em você
encontrei uma amizade tão espontânea e sincera que acredito que nem mesmo a
distância nos afaste;
Aos meus padrinhos (Paulo e Mônica), por estarem sempre ao meu lado e não
me abandonarem em um dos momentos mais difíceis por que já passei. Um muito
obrigado sempre será insuficiente perto da generosidade de vocês;
Aos amigos Alencar, Lurdinha, Socorro, Malu, Mário, Priscilla e Polliana, por
serem meu porto seguro e pessoas que, apesar da minha ausência, sei que me têm afeto
e se preocupam comigo;
Aos amigos que fiz durante toda a vida, apesar do cotidiano insistir em nos
separar, nosso carinho sempre nos aproxima;
Ao meu namorado, Kleverton, por conseguir, mesmo à distância, ser um
namorado sempre presente, compreensivo, por me apoiar a cada instante e me ajudar a
8
levantar nos momentos árduos. Apesar da distância, você consegue me conquistar cada
vez mais, dia após dia;
A toda a minha família, incluindo meus avós (in memorian), meus tios e
primos. A estrutura familiar que tenho me faz mais forte e serena;
Aos meus irmãos, Aline e André, pois a palavra “irmão” significa um
companheirismo eterno e um laço de amor indissolúvel; exatamente a relação que
temos;
À minha sobrinha, Maria Eduarda, por sempre ser motivo de orgulho e de
alegria. Amo tanto e cada dia mais!
Aos meus pais, Adelaide e Luiz. Para estes, nem todas as palavras, por mais
fortes, mais sinceras e mais verdadeiras, jamais serão suficientes. Sou eternamente grata
e amo de forma inexplicável.
Muito Obrigada!
9
“Porque eu sou do tamanho do que vejo,
e não do tamanho da minha altura...”
Alberto Caeiro
(heterônimo de Fernando Pessoa)
10
RESUMO
O desenvolvimento de uma técnica segura e prática para a vitrificação de tecido
ovariano caprino que previna o contato direto da amostra com o nitrogênio líquido, bem
como a contaminação da amostra biológica é uma necessidade da criopreservação de
tecido ovariano. Assim, os objetivos deste estudo foram: 1) desenvolver uma nova
técnica de vitrificação em um sistema fechado e avaliar a morfologia e viabilidade
folicular após a vitrificação de tecido ovariano em fragmento, hemi e ovário inteiro
(Fase 1); 2) avaliar a morfologia e ultraestrutura folicular após vitrificação de tecido
ovariano em fragmento, hemi e ovário inteiro e cultivo in vitro de curta duração (Fase 2)
e 3) analisar o efeito da adição de catalase na solução de vitrificação e/ou remoção do
agente crioprotetor sobre a morfologia e viabilidade folicular bem como sobre os níveis
de espécies reativas de oxigênio (Reactive Oxygen Species - ROS) e integridade do
DNA (Fase 3). Na Fase 1 não foi observada diferença no percentual de folículos
morfologicamente normais e viáveis (P>0,05) após a vitrificação quando comparado ao
tecido ovariano fresco, independente da forma do tecido ovariano vitrificado. Na Fase 2,
antes do cultivo in vitro, foi observada uma redução (P<0,05) no percentual de folículos
morfologicamente normais, em todas as formas vitrificadas (fragmento, hemi e ovário
inteiro), quando comparado ao controle fresco. Além disso, foram verificadas grandes
alterações ultraestruturais quando o tecido ovariano foi vitrificado em ovário inteiro.
Após o cultivo in vitro, a morfologia folicular foi melhor preservada quando o tecido
ovariano foi vitrificado em fragmento, comparada à vitrificação em hemi ou ovário
inteiro (P<0,05) e a ultraestrutura revelou que a vitrificação de hemi-ovário resultou em
maior presença de vacúolos do que a vitrificação de fragmentos. Na Fase 3 observou-se
que a vitrificação sem a presença de catalase resultou em maior nível de ROS do que no
tecido fresco, contudo, a presença de catalase, independente do momento de adição,
manteve os níveis de ROS similares ao controle fresco. Não houve diferença quanto à
viabilidade folicular (P>0,05) e proteínas sinalizadoras de dano (γH2AX) e reparo
(53BP1) do DNA entre os tratamentos testados. Resultados similares foram observados
para a morfologia folicular e fragmentação do DNA quando avaliados os grupos
criopreservados. Em conclusão, a técnica de vitrificação Ovarian Tissue Cryossystem
(OTC) é eficaz para a criopreservação de tecido ovariano caprino, pois mantém a
morfologia, a ultraestrutura e a viabilidade folicular, compatíveis ao tecido fresco, após
11
aquecimento. O uso de catalase no protocolo de vitrificação também é necessário para
manter os níveis de ROS similar ao observado no tecido ovariano fresco.
Palavras-chave: Criopreservação. Antioxidante. Folículo pré-antral. Cabra.
12
ABSTRACT
The development of a safe and practical technique for the caprine ovarian tissue
vitrification that prevents direct contact of the sample with liquid nitrogen, as well as
contamination of the biological sample is needed for cryopreservation of ovarian tissue.
Then, the objectives of this study were: 1) to develop a new vitrification technique in a
closed system and evaluate the follicular morphology and viability after vitrification of
ovarian tissue of fragment, hemi and whole ovary (Phase 1), 2) to evaluate the follicular
morphology and ultrastructure after vitrification of ovarian tissue of fragment, hemi and
whole ovary and after short-term in vitro culture (Phase 2), and 3) to analyze the effect
of addition of catalase in the vitrification solution and/or removal of cryoprotectant
agent on the follicular morphology and viability, as well as on the levels of reactive
oxygen species (ROS) and DNA integrity (Phase 3). In Phase 1, there was no difference
in the percentage of morphologically normal and viable follicles (P>0.05) after
vitrification when compared to fresh ovarian tissue, regardless of the form of ovarian
tissue vitrification. In Phase 2, before in vitro culture, a reduction (P<0.05) in the
percentage of morphologically normal follicles was observed in all forms of vitrification
(fragment, hemi and whole ovary), when compared to the fresh control. In addition,
major ultrastructural changes were observed when the ovarian tissue was vitrified in
whole ovary. After culture in vitro, the follicular morphology was better preserved when
the ovarian tissue was vitrified as fragment compared to vitrification as hemi or whole
ovary (P<0.05) and ultrastructure showed that vitrification of hemi-ovary resulted in
increased number of vacuoles compared with fragments. In Phase 3, the vitrification
without the presence of catalase resulted in higher levels of ROS than fresh tissue.
However, the presence of catalase, regardless of the step of addition, maintained ROS
levels similar to control fresh. There was no difference in follicular viability (P>0.05)
and proteins DNA damage signaling (γH2AX) and repair (53BP1) between treatments.
Similar results were observed for follicular morphology and DNA fragmentation when
evaluated cryopreserved groups. In conclusion, the vitrification technique Ovarian
Tissue Cryosystem (OTC) is effective for vitrification of goat ovarian tissue, causing
little cellular damage when assessed follicular morphology, viability and ultrastructure.
Furthermore, the presence of catalase is necessary to maintain ROS levels similar to that
found in fresh ovarian tissue.
13
Keywords: Cryopreservation. Antioxidant. Preantral follicle. Goat.
14
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DE LITERATURA
Figura 1. Desenho esquemático da morfologia do ovário da maioria dos mamíferos.
Observar a região medular, e os folículos em diferentes estágios de desenvolvimento,
localizados na região cortical (adaptado de GUYTON; HALL, 2006)...........................28
Figura 2. Técnicas desenvolvidas para vitrificação de tecido ovariano. (A) vitrificação
convencional por palhetas e (B) por criotubos, (C) Cobertura direta, (D) agulhas de
acupuntura, (E) Cryosupport e (F) Fibreplug. Imagens obtidas de SAKI; RAHIM;
ZERGANI, 2009; WANG et al., 2008; CHEN et al., 2006;
http://www.cryoguard.com/products/; HASHIMOTO et al., 2010; BEEBE; NOTTLE,
2010.................................................................................................................................35
Figura 3. Representação esquemática de um octâmero de histonas consistindo de duas
moléculas de H2A, H2B, H3 e H4. Adaptado de ZAIDI et al., 2013.............................40
Figura 4. Via de checkpoint 53BP1-dependente. A DSB resulta na fosforilação da
H2AX próximo ao dano do DNA, culminando com o recrutamento e fosforilação da
53BP1 no foco nuclear. A 53BP1, por sua vez, recruta outros fatores, como a p53, e
culmina com a parada do ciclo celular, ativação do checkpoint e reparo do DNA.
Adaptado de ABRAHAM, 2002.....................................................................................43
CAPÍTULO 1
Figura 1. Imagem ilustrativa de uma célula eucariótica evidenciando as organelas
internas no citoplasma e no núcleo. Imagem concedida por Thibodeau e Patton
[103].................................................................................................................................56
Figura 2. Fotomicrografias demonstrativas da ultraestrutura de folículos ovarianos e
oócitos submetidos a procedimentos de criopreservação. (A) Folículo primordial de
15
mulher incluso em ovário inteiro congelado/descongelado evidenciando um oócito (O)
com ruptura de membrana nuclear e condensação da cromatina (seta preta) no núcleo do
oócito (N). Entre as células foliculares (Fc) percebe-se célula folicular alterada com
condensação da cromatina (seta branca). Imagem concedida por Martinez-Madrid [62] e
autorizada pela Elsevier. (B) Oócito bovino imaturo congelado/descongelado com
gotícula lipídica intacta (1) e com lipólise parcial (2). Observam-se áreas de lipólise
(seta branca) e mitocôndrias (m). Aumento de 8000x. Figura adaptada de Isachenko
[48] e autorizada por Wiley Job Network. (C) Oócitos equinos maturos
vitrificados/aquecidos com enturgecimento de mitocôndrias e redução de elétron-
densidade da matriz mitocondrial (setas pretas). Figura concedida por Hochi [46] e
autorizada pela Elsevier. (D) Folículo suíno incluso em tecido ovariano
congelado/descongelado com mitocôndrias túrgidas (m). (l): gotículas lipídicas, (Nu):
núcleo, (CG): células da granulosa e (*): espaços vazios. Figura concedida por Borges
[13] e autorizada pela Elsevier. (E) Folículo ovariano humano incluso em tecido
vitrificado/aquecido com presença de poros na membrana nuclear (setas pretas) e
retículo endoplasmático (ER) e mitocôndrias (M) bem preservados, semelhante ao
tecido fresco. Figura concedida por Sheikhi [95] e autorizada pela Oxford
Journals............................................................................................................................59
Figura 3. Imagens representativas do padrão de citoesqueleto de oócitos felinos
imaturos submetidos à criopreservação evidenciando microfilamentos em vermelho e
microtúbulos em verde. Microfilamentos difusos no ooplasma com uma concentração
ligeiramente maior na zona pelúcida (A), microtúbulos uniformemente distribuídos por
todo ooplasma (A’). Microfilamentos e microtúbulos distribuídos de forma irregular no
citoplasma (B e B’). Barras representativas de 50µm. Figura concedida por Luciano
[59] e autorizada pela Elsevier........................................................................................62
Figura 4. Padrão de organização do fuso meiótico e de cromossomos em oócitos ovinos
maturos submetidos à vitrificação. Fuso normal (A) com cromossomos alinhados na
placa metafásica (A’). Fuso assimétrico (B e B’). Coluna da direita: marcação de β-
tubulina, coluna da esquerda: marcação do DNA com Hoechst. Figura concedida por
Asgari [6] e autorizada pela Elsevier...............................................................................68
16
CAPÍTULO 3
Figure 1. Morphological characteristics and viability of preantral follicles enclosed in
different dimensions of goat ovarian tissue. (A1-A2) Photomicrograph of
morphologically normal goat preantral follicles in the fresh control (A1) and atretic
preantral follicle after the cryopreservation of the whole ovary (A2). Note the
measurement of follicular diameter in A1, obtained by performing by 2 transverse
measurements. In A2, the follicular degeneration is evidenced by a retraction of the
ooplasm (black arrow) and nuclear pyknosis (*) [Bar = 15 µm]. (B1-B2)
Photomicrographs of ovarian stroma with normal (fresh control; B1) and reduced
(whole ovary; B2) cell density. Observe the marking areas randomly selected for
evaluation [Bar= 50 µm]. (C1-C2) Images of preantral follicles unstained, viable follicle
(fresh control; C1) and stained, non-viable follicle (hemi-ovary; C2), with trypan blue
[Bar = 20 µm]..................................................................................................................93
CAPÍTULO 4
Fig. 1. Experimental design to assess the effect of vitrification of different dimensions
of ovarian tissue (fragment, hemi-ovary, whole ovary) on the morphology of goat
preantral follicles. LM: light microscopy; TEM: transmission electronic microscopy;
IVC: in vitro culture......................................................................................................105
Fig. 2. Ovarian Tissue Cryosystem: New stainless steel device developed for the
vitrification procedures. (A) OTC opened enabling the visualization of its 3 constituent
parts: basis (a), insert (b) cover (c). Note the perforations in the upper portion of the
insert to facilitate placement and removal of solutions. (B) Exposure of the tissue (hemi-
ovary) to vitrification solution in the basis of the OTC. (C) Inclusion of the insert in the
basis of the OTC allows for observation of aseptic handling of the insert. (D) Closure of
the basis, with the insert already enclosed, with the cover of the OTC. (E) Storage of
OTC, containing the sample to be vitrified in the liquid nitrogen dewars. Note that this
system prevents contact of the vitrified sample with liquid nitrogen............................108
17
Fig. 3. Photomicrographs of goat ovarian cortical histological sections. (A) Normal
primordial follicle. (B) Degenerated follicles with retraction of ooplasm. Nu, nucleus;
GC, granulosa cells; arrows, shrunken ooplasm............................................................109
Fig. 4. Electron micrographs of goat preantral follicles from fresh control (A) and after
vitrification of fragments (B), hemi-ovary (C), and whole ovary (D). Note in A, B and C
the normal follicular ultrastructure with round mitochondria and intact granulosa cells,
and a degenerated preantral follicle in D. GC: granulosa cells; O: oocyte; Nu: nucleus;
n: nucleolus; m: mitochondria; V: vacuole; arrow: nuclear envelope; *: empty spaces.
Scale bars = 5 µm..........................................................................................................111
Fig. 5. Electron micrographs of goat preantral follicles of in vitro cultured tissues after
vitrification of fragments (A) and hemi-ovary (B). Note in (A), a well-preserved
preantral follicle and in (B), a follicle in advanced stage of degeneration. GC: granulosa
cells; O: oocyte; m: mitochondria; V: vacuole; *: empty spaces. Scale bars = 5
µm..................................................................................................................................112
CAPÍTULO 5
Fig. 1. ROS levels expressed as fluorescence intensity in non-vitrified (fresh control)
and vitrified ovarian tissues in the presence or absence of catalase in
vitrification/washing solutions. A,B indicate statistical difference (P<0.05) between
groups............................................................................................................................131
Fig. 2. Follicular morphology analysis (A-B), apoptosis detection (C-D) and follicular
viability evaluation by trypan blue (E-F) and fluorescent markers (G-H).
Morphologically normal (A) and degenerate (B) preantral follicle stained with HE. Note
in (B) granulosa cells disorganization and ooplasm shrinkage (asterisk). Positive (C)
and negative (C') control for TUNEL assay. Vitrified ovarian tissues were analyzed by
TUNEL assay (D). Arrows indicate TUNEL-positive reaction; arrowhead indicates
TUNEL-negative reaction. Viable (E) and non-viable (F) follicles unstained and stained
by Trypan blue, respectively. Viable follicle (G) and non-viable follicle (H) labeled with
calcein-AM (green) and ethidium homodimer-1 (red), respectively. GC – granulosa
cells, O – oocyte; Nu – nucleus. Scale bars = 30 µm....................................................131
18
Fig. 3. Percentage (mean ± SEM) of morphologically normal preantral follicles. Goat
ovarian tissues were non-vitrified (fresh control) or vitrified-thawed in the presence or
absence of catalase in vitrification/washing solutions. A,B indicate statistical difference
(P<0.05) between treatment...........................................................................................132
Fig. 4. Relative Bcl2/Bax mRNA expression in non-vitrified (fresh control) and vitrified
ovarian tissue in the presence or absence of catalase in vitrification/washing
solutions.........................................................................................................................134
Fig. 5. Immunodetection of 53BP1 protein (green bright fluorescent spots) in goat
ovarian tissue from the fresh control and after vitrification. (A) Preantral follicle from a
negative control sample showing a follicle without fluorescent signal for 53BP1. (B-D)
Goat ovarian follicles positively labeled for 53BP1. Note primordial (B), primary (C)
and secondary (D) follicles with granulosa cells labeled and the absence of fluorescence
signal in the oocytes. GC – granulosa cells; O – oocyte. Scale bars = 30 µm..............135
19
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 3
Table 1. Morphology, viability, follicular diameter, and stromal cell density after
ovarian tissue vitrification at different dimensions (fragment, hemi-ovary, and whole
ovary). *Five animals were used. †For each treatment, two samples: one sample to
histological analysis and another one to viability analysis were used for each animal.
Ovarian tissues samples were obtained from hemi-ovary and whole ovary after
vitrification. A,B,C Different superscripts letters indicate statistically significant
differences (P< 0.05).......................................................................................................94
CAPÍTULO 4
Table 1 Percentage of morphologically normal preantral follicles enclosed in fresh
ovarian tissue and vitrified into fragments, hemi-ovary or whole ovary, before and after
in vitro culture. Data are mean ± SEM. A,B,C
Different upper-case letters within a column
indicate significant difference (P < 0.05).a,b
Different lower-case letters within a row
indicate significant difference before and after culture in the same treatment (P <
0.05)...............................................................................................................................110
CAPÍTULO 5
Table 1. Oligonucleotide primers for GADPH, BCL-2 and BAX used in the gene
expression analyses. *S sense; AS antisense. GAPDH: Glyceraldehyde 3-phosphate
dehydrogenase...............................................................................................................129
Table 2. Stromal cells density and follicular viability (Trypan blue, Calcein
AM/ethidium and TUNEL-positive follicles) in non-vitrified (fresh control) and
vitrified ovarian tissues in presence or absence of catalase. Different superscripts within
columns indicate statistical difference between treatments (P<0.05)............................133
20
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
% - Percentagem
~ - Aproximadamente
= - Igual a
± - mais ou menos
× - Vezes
< - Menor que
> - Maior que
≥ - Maior ou igual
°C - Graus Celsius
µg - Microgramas
µL - Microlitros
µm - micrômetros
53BP1 - p53 binding protein 1 (Proteína Ligada a p53)
ANOVA - Análise de variância
ATP - Adenosina trifosfato
BRCT - Breast cancer 1 carboxyl-terminal domain
BSA - Bovine serum albumin (Albumina sérica bovina)
CAD - Caspase-activated DNase (DNase ativada por caspase)
CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento do Pessoal de Nível Superior
cDNA - DNA complementar
CG - Células da granulosa
cm - Centímetros
CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
CO2 - Dióxido de carbono
C-terminal - Carboxi-terminal
DCHF-DA - 2’,7’-dihydrodichlorofluorescein diacetate
DMSO - Dimethylsulfoxide (Dimetilsulfóxido)
DNA - Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucleico)
DSB - Double-strand breaks (Quebra da fita dupla)
e.g. - Exempli gratia (Por exemplo)
EG - Ethylene glycol (Etilenoglicol)
ER - Endoplasmic reticulum (Retículo endoplasmático)
21
Fc - Follicular cells (Células foliculares)
Fig. - Figura
FINEP - Financiadora de Estudos e Projetos
G2/M - Fase do ciclo celular entre Gap 2 e Mitose
GAPDH - Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (Gliceraldeído-2-fosfato
desidrogenase)
GC - Granulosa cells (Células da granulosa)
H - Histona
h - Hour (Hora)
H2O2 - Hydrogen peroxide (Peróxido de hidrogênio)
HCl - Ácido clorídrico
HE - Hematoxylin-eosin (Hematoxilina-eosina)
i.e. - Id est (isto é)
ITS - Insulin-transferrin-selenium (Insulina-transferrina-selênio)
IU - International unit (Unidade internacional)
IVC - In vitro culture (Cultivo in vitro)
kV - Kilovolt
l - Gotículas lipídicas
L - Litro
LAMOFOPA - Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos Pré-
Antrais
LM - Light microscopy (Microscopia de luz)
m - Mitochondria (Mitocôndria)
M - Mitocôndrias
M - Molar
MEM - Minimum essential medium (Meio essencial mínimo)
mg - Miligramas
MII - Metáfase II
min - Minutes (minutos)
mL - Mililitros
mm - Milímetro
mM - Milimolar
mm3 - Milímetros cúbicos
mmol - Milimol
22
MOIFOPA - Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais
MRN - Complex MRE11-RAD50-NBS1 (Complexo MRE11-RAD50-NBS1)
mRNA - Messenger ribonucleic acid (Ácido ribonucléico mensageiro)
n - número
n - Nucleolus (Nucléolo)
N - Núcleo do oócito
ng - Nanogramas
nm - nanômetros
Nu - Nucleus (Núcleo)
O - Oocyte (Oócito)
O2 - Oxigênio molecular
•O2
- - Radical ânion superóxido
OH• - Hydroxyl radical (Radical hidroxila)
OPS - Open pulled straws
OTC - Ovarian Tissue Cryosystem
P - Probabilidade de erro
pág. - Página
PBS - Phosphate buffered saline (Tampão fosfato-salino)
PCR - Polymerase chain reaction (Reação em cadeia da polimerase)
pH - Pressão de hidrogênio
PPGCV - Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias
qPCR - Quantitative PCR (PCR quantitativa)
rFSH - Recombinant follicle stimulating hormone (Hormônio folículo estimulante
recombinante)
ROS - Reactive oxygen species (Espécies reativas de oxigênio)
RT - Room temperature (Temperatura ambiente)
s - Seconds (Segundos)
SCID - Severe combined immunodeficient
SD - Standard deviation (Desvio padrão)
sec - Seconds (Segundos)
SEM - Standard error of means (Erro padrão da média)
SNK - Student-Newman-Keuls
SSB - Single-strand breaks (Quebra da fita simples)
TEM - Transmission electronic microscopy (Microscopia eletrônica de transmissão)
23
Tm - Transição da fase cristalina líquida para a fase cristalina gel
TUNEL - Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated biotinylated deoxyuridine
triphosphates nick end-labeling
UECE - Universidade Estadual do Ceará
V - Vacuole (Vacúolo)
VG - Vesícula germinativa (Germinal vesicle)
vol - Volume
VS - Vitrification solution (Solução de vitrificação)
w/v - Weight/Volume (Relação peso/volume)
WS - Washing solution (Solução de lavagem)
α-MEM - Minimum essential medium alpha (Meio essencial mínimo alfa)
γ-H2AX - H2AX fosforilada
24
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO............................................................................................................... 25
2. REVISÃO DE LITERATURA....................................................................................... 27
2.1. Estrutura e fisiologia do ovário dos mamíferos......................................................... 27
2.1.1. Morfologia ovariana........................................................................................... 27
2.1.2. Dinâmica folicular.............................................................................................. 28
2.2. Criopreservação na reprodução assistida................................................................... 30
2.2.1. Importância da criopreservação a preservação da fertilidade para mulheres e
animais domésticos......................................................................................................
31
2.2.2. Vitrificação de tecido ovariano.......................................................................... 33
2.2.3. Crioinjúrias......................................................................................................... 37
2.2.3.1. Aumento na produção de espécies reativas de oxigênio (reactive oxygen
species - ROS).........................................................................................................
37
2.2.3.2. Danos ao DNA........................................................................................... 39
3. JUSTIFICATIVA............................................................................................................ 45
4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS......................................................................................... 47
5. OBJETIVOS.................................................................................................................... 48
5.1. Objetivo geral............................................................................................................ 48
5.2. Objetivos específicos................................................................................................. 48
6. CAPÍTULO 1
Caracterização dos danos celulares em gametas femininos e embriões após
criopreservação.....................................................................................................................
49
7. CAPÍTULO 2
Desenvolvimento de um novo dispositivo de vitrificação.................................................... 82
8. CAPÍTULO 3
A espessura do tecido pode influenciar o resultado da vitrificação de córtex ovariano
caprino...................................................................................................................................
86
9. CAPÍTULO 4
Novo método de grande capacidade inovadora para vitrificação de ovários caprinos:
Ovarian Tissue Cryosystem (OTC)...……............................................................................
99
10. CAPÍTULO 5
Adição de catalase às soluções de vitrificação mantém a estabilidade dos folículos pré-
antrais ovarianos....................................................................................................................
119
11. CONCLUSÕES.............................................................................................................. 146
12. PERSPECTIVAS.......................................................................................................... 147
13. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................ 148
14. ANEXOS........................................................................................................................ 180
14.1. Anexo 1 - Depósito de Patente................................................................................ 181
14.2. Anexo 2 - Consulta à base de dados do INPI.......................................................... 185
14.3. Anexo 3 - Aprovação do Comitê de Ética............................................................... 186
14.2. Anexo 4 - Publicações de resultados parciais.......................................................... 187
25
1. INTRODUÇÃO
O conhecimento e os avanços obtidos nas últimas duas décadas acerca da
reprodução assistida têm resultado em grandes conquistas, tanto para a reprodução
humana (DONNEZ et al., 2004) quanto animal (DELA PEÑA et al., 2002). Além disso,
já foi demonstradoo nascimento de descendentes saudáveis após procedimentos de
criopreservação. Especificamente para a reprodução animal, pesquisas em animais
domésticos de grande valor zootécnico (BORDES et al., 2005) e animais em risco de
extinção (SILVA et al., 2012a) têm representado um avanço extremamente significativo
para a agropecuária e preservação de espécies.
Dentre as técnicas de reprodução assistida, pode-se destacar a Manipulação de
Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais (MOIFOPA), que envolvea
preservação, o crescimento e a maturação de folículos ovarianos em estágios iniciais de
desenvolvimento (folículos pré-antrais), antes que tenham seu mecanismo de morte
naturalmente acionado (FIGUEIREDO et al., 2008). Com a MOIFOPA é possível
criopreservar o tecido ovariano, permitindo a conservação do material genético de
fêmeas por longos períodos (RUBINSKY, 2003). O processo de criopreservação,
especificamente no que diz respeito ao método de vitrificação, tem sido investigado
desde o início da década de 40 (LUYET et al., 1940), e, desde então, várias pesquisas
têm sido realizadas com a finalidade de entender e reduzir os danos causados às células
pela exposição a baixas temperaturas.
A criopreservação de tecido ovariano pode ser realizada tanto por congelação
lenta (SALLE et al., 2003) quanto por vitrificação (LORNAGE et al., 2006). Nos
últimos anos, a vitrificação tem se destacado como método de escolha para a
criopreservação de tecido ovariano por sua praticidade de aplicação e baixo custo de
execução, bem como pelos resultados satisfatórios, inclusive com obtenção de
nascimentos em espécies domésticas, como os ovinos (BORDES et al., 2005;
LORNAGE et al., 2006) e até mesmo em humanos (KAWAMURA et al., 2013). Além
disso, a vitrificação possui como grande vantagem a nula ou baixa formação de cristais
de gelo (KEROS et al., 2009), extremamente danosa para a célula (LUNARDI et al.,
2012). Em função dessa característica, várias técnicas de vitrificação têm sido
desenvolvidas (MONIRUZZAMAN et al., 2009; TSANG; CHOW, 2009, RAHIMI et
al., 2003) com a finalidade de maximizar os resultados obtidos.
26
A vitrificação de tecido ovariano tem obtido valiosos resultados como a
preservação da morfologia folicular em humanos (SALEHNIA et al., 2012), bem como
o nascimento de crias saudáveis em ovinos (BORDES et al., 2005; LORNAGE et al.,
2006). Apesar dos nascimentos relatados, verifica-se baixa repetibilidade dos resultados
em animais domésticos, provavelmente por características inerentes ao processo de
vitrificação, como as altas concentrações de agentes crioprotetores. Ademais, as
técnicas desenvolvidas até então exigem uma excessiva manipulação do material
biológico e, em sua maioria, os dispositivos são constituídos de polipropileno (como por
exemplo, palhetas e criotubos), material caracterizado por não ser um bom condutor de
calor (SANSINENA et al., 2012). Assim, têm sido desenvolvidas técnicas que visam o
contato com o nitrogênio líquido na tentativa de acelerar a redução de calor. Contudo, o
contato com o nitrogênio líquido pode ocasionar a contaminação do material biológico
(BIELANSKI et al., 2000; BIELANSKI; VAJTA, 2009), impossibilitando um posterior
transplante ou mesmo a utilização do material para o cultivo in vitro. Os estudos atuais
têm visado o aperfeiçoamento da técnica de forma a garantir a perfeita integridade
morfológica, molecular e funcional dos gametas criopreservados. Dessa forma, danos
como a produção de espécies reativas de oxigênio (Reactive Oxygen Species - ROS) e
danos à integridade do DNA tem ganhado amplitude nos estudos sobre a
criopreservação aplicada à reprodução assistida (RAHIMI et al., 2003; SALEHNIA et
al., 2012).
Para melhor evidenciar a contribuição científica e tecnológica desta tese, a
revisão de literatura a seguir constitui-se de um levantamento sucinto acerca da estrutura
e fisiologia do ovário dos mamíferos, dinâmica folicular, criopreservação na reprodução
assistida, vitrificação de tecido ovariano e crioinjúrias, com destaque para a produção de
ROS e danos ocasionados ao DNA.
27
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. ESTRUTURA E FISIOLOGIA DO OVÁRIO DOS MAMÍFEROS
O ovário é um dos órgãos mais importantes do sistema reprodutor feminino e
possui duas funções fundamentais para a manutenção da fertilidade: (i) função
gametogênica ou exócrina e (ii) função endócrina (GOUGEON, 2004). Quanto à sua
função exócrina, este órgão é responsável por garantir o desenvolvimento dos folículos
ovarianos e possibilitar a ovulação de um oócito apto a ser fertilizado (SAUMANDE,
1991). Do ponto de vista endócrino, o ovário possui a capacidade de produzir fatores de
crescimento e hormônios responsáveis por dar suporte ao crescimento folicular e
preparação do organismo feminino para receber o possível embrião (HIRSHFIELD,
1991).
2.1.1. MORFOLOGIA OVARIANA
A dimensão do ovário dos mamíferos possui uma variação dependente da
espécie e da fase do ciclo ovariano (HAFEZ; HAFEZ, 2004). Porém, de forma geral,
esse órgão é ovoide, apresenta uma forma de amêndoa (JUNQUEIRA; CARNEIRO,
2004) e é dividido em duas regiões (Figura 1), uma cortical e uma medular
(GARTNER; HIATT, 2007; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). Na grande maioria dos
mamíferos, a região cortical é localizada externamente (FIGUEIREDO et al., 2008). A
região cortical é pouco vscularizada, na qual estão presentes células do estroma e
folículos ovarianos em diferentes estágios de desenvolvimento (JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 2004; HAFEZ; HAFEZ, 2004). Já a região medular, em geral localizada
na parte interna do ovário, é responsável pela sustentação, vascularização e inervação do
órgão, sendo constituída por numerosos vasos sanguíneos e linfáticos, nervos e tecido
conjuntivo frouxo (GARTNER; HIATT, 2007; JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). A
superfície do ovário é revestida por epitélio cúbico simples em sua maior extensão e,
sob esse epitélio, o estroma forma uma camada de tecido conjuntivo denso e sem vasos,
a albugínea do ovário (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
28
Figura 1. Desenho esquemático da morfologia do ovário da maioria dos mamíferos.
Notem-se a região medular, e os folículos em diferentes estágios de desenvolvimento,
localizados na região cortical (adaptado de GUYTON; HALL, 2006).
2.1.2. DINÂMICA FOLICULAR
O processo de formação e crescimento folicular é denominado foliculogênese
(FIGUEIREDO et al., 2008). O folículo é considerado a unidade morfofuncional do
ovário e é caracterizado por um oócito circundado por células somáticas (células da
granulosa e da teca) e, com o avançar do desenvolvimento, nota-se nessa estrutura a
zona pelúcida e a cavidade antral preenchida por fluido folicular (McGEE; HSUEH,
2000). O folículo é responsável por albergar o oócito, permitindo que o mesmo
complete seu desenvolvimento e maturação (CORTVRINDT; SMITZ, 2001). Com o
desenvolvimento, o folículo passa por mudanças morfológicas, resultando em diferentes
categorias foliculares de acordo com o seu estágio de evolução (HULSHOF et al.,
1994).
Os folículos ovarianos podem ser classificados em duas grandes categorias: (i)
folículos pré-antrais e (ii) folículos antrais. Essa grande classificação diz respeito à
presença ou não de uma cavidade antral, sendo que somente os folículos antrais
possuem essa cavidade (VARGHESE et al., 2008). Os folículos pré-antrais representam
a fase inicial do desenvolvimento folicular e podem ser subdivididos em primordiais,
intermediários, primários e secundários (FIGUEIREDO et al., 2008). O folículo
primordial encontra-se em estágio de quiescência e representa a reserva oocitária
29
ovariana. Os folículos nesse estágio são caracterizados por um oócito localizado
centralmente circundado por células da granulosa de formato pavimentoso
(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). Através de mecanismos ainda completamente não
elucidados, alguns folículos são selecionados para deixarem o estágio de quiescência e
prosseguirem seu desenvolvimento (FIGUEIREDO et al., 2008). Esse desenvolvimento
é marcado pela mudança conformacional das células da granulosa, que passam do
formato pavimentoso para uma forma cúbica. Assim, um folículo que possui células da
granulosa tanto de formato pavimentoso quanto cúbico é denominado intermediário.
Quando o oócito passa a ser circundado somente por células da granulosa de formato
cúbico os folículos são então denominados primários. A partir dessa fase, o
desenvolvimento é caracterizado pela multiplicação das células da granulosa, passando
o folículo a apresentar duas ou mais camadas de células da granulosa cúbicas. Nessa
fase, o folículo passa a ser denominado secundário. Na fase subsequente já pode ser
observada a cavidade antral e o folículo é então denominado de terciário (fase antral
inicial) e, com o aumento do líquido folicular, o oócito fica preso ao folículo por um
pedículo constituído por células foliculares e passa a ser denominado folículo pré-
ovulatório (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004; MAGOFFIN et al., 2005; RAJKOVIC et
al., 2006).
Numericamente, a população folicular, na maioria dos mamíferos, é
estabelecida ainda na vida intrauterina (ZUCKERMAN, 1951) e, a partir de então,
ocorre uma redução sistemática nesse pool folicular (SHAW; ORANRATNACHAI;
TROUNSON, 2000). Somente a minoria dos folículos chega à ovulação (0,1%),
enquanto a grande maioria é perdida pelo processo de atresia (FIGUEIREDO et al.,
2008). A depleção folicular decorre principalmente da apoptose, processo também
conhecido como morte celular programada (KIESS; GALLAHER, 1998). Esse evento
acomete tanto folículos pré-antrais quanto folículos antrais (TILLY, 1996; MAGOFFIN
et al., 2005) e exerce um papel importante no controle e regulação do número de
folículos que serão ovulados (KIESS; GALLAHER, 1998, GLAMOCLIJA et al., 2005).
Assim, a depleção folicular, na maioria das espécies permite que apenas um oócito seja
ovulado em cada ciclo. Portanto, a grande maioria dos folículos é naturalmente
eliminada, representando uma limitação para as técnicas de reprodução assistida.
Felizmente, a Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-
Antrais (MOIFOPA) é uma alternativa de grande relevância para a reprodução assistida
uma vez que permite a preservação e o desenvolvimento dos folículos pré-antrais em
30
um ambiente extraovariano, ausente de fatores que permitam a dominância folicular e
apoptose dos folículos subordinados (FIGUEIREDO et al., 2008). Assim, a MOIFOPA,
além do isolamento folicular consiste ainda em: (i) criopreservação, que permite
salvaguardar o material genético feminino, e (ii) cultivo in vitro, que possibilita o
desenvolvimento dos folículos ovarianos pré-antrais (FIGUEIREDO et al., 2007). A
criopreservação de folículos pré-antrais inclusos no tecido ovariano caracteriza-se como
uma biotécnica de grande importância por permitir preservar milhares de oócitos a partir
de um único ovário (FIGUEIREDO et al., 2007). Desta forma, pode contribuir para a
manutenção da função ovariana (ARAV et al., 2010), permitindo a retomada da função
reprodutiva após a descongelação e transplante.
2.2. CRIOPRESERVAÇÃO NA REPRODUÇÃO ASSISTIDA
A criopreservação é uma técnica que visa a preservação celular a temperaturas
ultrabaixas, também conhecidas como temperatura criogênicas (RUBINSKY, 2003).
Em geral, utiliza-se a temperatura do nitrogênio líquido (-196°C), mas sabe-se que
abaixo de -40°C a atividade físico-química das células já se encontra suspensa,
podendo, então, essas células serem preservadas por períodos indeterminados
(BAKHACH, 2009). Essa preservação celular está diretamente relacionada à
capacidade da célula de resistir às etapas do procedimento de criopreservação, que se
resumem em cinco: (i) exposição aos agentes crioprotetores; (ii) resfriamento; (iii)
armazenamento; (iv) aquecimento, e (v) remoção dos agentes crioprotetores (SANTOS
et al., 2008).
A primeira etapa é a exposição aos agentes crioprotetores. Nesta fase, o
objetivo é garantir que a célula perca água, para reduzir a formação de cristais de gelo
intracelular, e que a mesma seja substituída por substâncias que proporcionem uma
maior estabilidade às células em baixas temperaturas. A segunda etapa consiste no
resfriamento das células. Nesta etapa, a água passa do estágio líquido para o sólido, na
qual podem ocorrer danos em virtude da redução da temperatura e formação de cristais
de gelo intracelular. Em seguida, o material é armazenado em baixas temperaturas
(terceira etapa), podendo permanecer nesta condição por períodos indefinidos. No
momento adequado, o material criopreservado é então aquecido, com o intuito de que as
células voltem à sua temperatura adequada e retomem seu metabolismo normal. Por
31
fim, é realizada a remoção do agente crioprotetor do interior da célula ou tecido, sendo
substituído por água, e a célula é, portanto, reidratada (SANTOS et al., 2008).
A criopreservação pode ser realizada por dois métodos, a congelação lenta e a
vitrificação (congelação ultra-rápida) (RAHIMI et al., 2003; SALLE et al., 2003).
Independente do método adotado, a criopreservação tem sido bastante utilizada na
reprodução assistida por permitir que o material genético de animais e humanos sejam
preservados por longos períodos e possam ser resgatados para, no momento mais
oportuno, propiciar o nascimentos de descendentes saudáveis (DELA PEÑA et al.,
2002; SALLE et al., 2003; BORDES et al., 2005). A criopreservação tem se mostrado
uma técnica segura e satisfatória e tem sido amplamente empregada para a preservação
de embriões (TSANG; CHOW, 2009), sêmen (BILODEAU et al., 2000), oócitos
(GUPTA et al., 2010) e tecido ovariano (BORDES et al., 2005).
2.2.1. IMPORTÂNCIA DA CRIOPRESERVAÇÃO A PRESERVAÇÃO DA
FERTILIDADE PARA MULHERES E ANIMAIS DOMÉSTICOS
Desde o princípio dos anos 2000, a criopreservação de tecido ovariano tem
ganhado grande destaque para aplicação da reprodução assistida no sexo feminino por
salvaguardar um grande número de oócitos (DELA PEÑA et al., 2002). Além disso, a
criopreservação de tecido ovariano também permite, após o transplante, a
revascularização tecidual (ARAV et al., 2010; RAHIMI et al., 2010) bem como a
restauração da função reprodutiva. Este fato já foi evidenciado pela retomada da função
endócrina (dosagens hormonais), acompanhamento dos ciclos ovarianos após a
criopreservação (ARAV et al., 2010; DONNEZ et al., 2011), gestação e obtenção de
descendentes em murinos (CHEN et al., 2006; HASEGAWA et al., 2006), ovinos
(BORDES et al., 2005; LORNAGE et al., 2006) e humanos (ERNST et al., 2010).
Esta biotécnica tem sido bastante indicada para utilização em mulheres com
câncer (SALLE et al., 2003), pois as drogas utilizadas nos tratamentos oncológicos
atuam interrompendo o ciclo de proliferação celular normal (MALTARIS et al., 2009)
atingindo não apenas as células cancerosas, mas também a capacidade reprodutiva, por
serem gonadotóxicas (BEN-AHARON et al., 2010). Assim, preservar as células
germinativas femininas antes da administração desses medicamentos gonadotóxicos é
uma alternativa de grande relevância para mulheres que desejam gerar uma criança após
a cura da doença. A criopreservação de tecido ovariano tem ganhado destaque na
32
reprodução humana por não necessitar de estimulação hormonal (ZHOU et al., 2010),
como ocorre para a criopreservação de oócitos maturos ou embriões. Assim, nos casos
emergenciais, não há atrasos no início do tratamento oncológico, bem como evita a
estimulação de células cancerosas dependentes de estradiol (ZHOU et al., 2010). Além
de não depender da fase do ciclo reprodutivo, a criopreservação de tecido ovariano
também pode ser realizada em mulheres muito jovens (SHAW; ORANRATNACHAI;
TROUNSON, 2000), sendo, por isso, recomendada para meninas que ainda não tenham
atingido a maturidade sexual (VARGHESE et al., 2008). Esta técnica também pode ser
realizada em mulheres adultas, contudo, é aconselhável para pacientes até os 38 anos,
uma vez que a partir dessa idade ocorre uma abrupta perda dos folículos ovarianos
(FADDY, 2000). Somada às vantagens já mencionadas, a criopreservação de tecido
ovariano também supera questões éticas, legais e religiosas, especialmente quando
realizada em humanos (ZHANG et al., 2009).
A criopreservação também tem ganhado destaque por preservar genótipos
valiosos e/ou raros (SILVA et al., 2012a). Dessa forma, evidencia-se que sua aplicação
também é de grande importância para animais zootecnicamente valiosos, bem como
animais em risco de extinção (COZZI; WHITE, 1995; WANDERLEY et al., 2012,
SILVA et al., 2012b). Na reprodução animal, a criopreservação de tecido ovariano tem
sido utilizada com o intuito de preservar o material genético de animais de alto valor
zootécnico que venham a óbito inesperado (SHAW; ORANRATNACHAI;
TROUNSON, 2000). Dessa forma, mesmo após sua morte, o animal pode continuar
propagando sua genética por meio da reprodução assistida e possibilitar o
melhoramento genético de rebanhos em diferentes localizações geográficas. Além disso,
a criopreservação de tecido ovariano também tem grande relevância para espécies
ameaçadas de extinção (COZZI; WHITE, 1995), viabilizando menor manipulação
desses animais, por não necessitar de tratamentos hormonais (ZHOU et al., 2010),
permitindo a obtenção do material genético de forma mais rápida e segura.
Partindo dessa ideia geral, a criopreservação de tecido ovariano permite a
preservação do pool folicular por períodos indeterminados (RUBINSKY, 2003), bem
como possibilita a retomada da função endócrina quando associada ao transplante de
ovário previamente criopreservado (BORDES et al., 2005). A reserva folicular é
constituída principalmente por folículos na fase inicial de desenvolvimento (cerca de
90%), isto é, folículos primordiais (KATSKA-KSIAZKIEWICZ, 2006). Apesar de
oferecer riscos à função celular, a criopreservação de folículos nesse estágio de
33
desenvolvimento é mais segura, uma vez que os oócitos presentes nesses folículos são
mais crioresistentes. Essa resistência é conferida por fatores tais como: (i) o pequeno
tamanho do oócito; (ii) a baixa taxa metabólica; (iii) o estágio do ciclo celular (parado
em prófase I e, portanto, sem presença do fuso meiótico); (iv) o pequeno número de
células de suporte; (v) a ausência de zona pelúcida; (vi) a ausência de grânulos corticais
e (vii) a pequena quantidade de lipídios intracitoplasmáticos (SHAW;
ORANRATNACHAI; TROUNSON, 2000; KAGAWA; SILBER; KUWAYAMA,
2009).
2.2.2. VITRIFICAÇÃO DE TECIDO OVARIANO
A congelação lenta tem sido utilizada com sucesso há décadas (GOSDEN et
al., 1994; COX; SHAW; JENKIN, 1996; SALLE et al., 2003), contudo, a formação
intracelular de cristais de gelo é uma das maiores desvantagens desse método e pode
resultar em severos danos celulares (LUNARDI et al., 2012). Ao contrário, a
vitrificação tem ganhado destaque por ser um método de criopreservação ultra-rápido
que resulta na solidificação sem cristalização, ou seja, sem formação intracelular de
cristais de gelo (BAGCHI; WOODS; CRITSER, 2008; KEROS et al., 2009).
A etapa crítica da vitrificação é a velocidade de redução da temperatura, que
deve ser superior à taxa de resfriamento crítico da solução para permitir a formação do
estado vítreo antes da organização dos cristais de gelo (POSILLICO et al., 2010). A
água possui uma alta taxa de resfriamento crítico, sendo de extrema dificuldade sua
solidificação e, portanto, necessária sua substituição por agentes crioprotetores, que
possuem uma menor taxa de resfriamento crítico (KIM et al., 2006). Assim, os
crioprotetores são componentes chave para o sucesso da vitrificação e devem possuir
uma baixa toxicidade e e alta facilidade de transpor a membrana celular, a fim de
permitir a penetração de concentração adequada no interior da célula com menores
danos (MUKAIDA; OKA, 2012).
As leis da termodinâmica revelam que, se um líquido é resfriado
suficientemente rápido, pode-se obter um estado sólido amorfo, conhecido como estado
vítreo (RUBINSKY, 2003; BALABAN et al., 2008). Por essa característica, a
vitrificação tem sido amplamente adotada na reprodução assistida pela simplicidade e
rapidez do procedimento (VAJTA et al., 1998). Este método tem sido aplicado com
sucesso para a criopreservação de tecido ovariano (DELA PEÑA et al., 2002; BORDES
34
et al., 2005, LORNAGE et al., 2006) e diversas técnicas já foram desenvolvidas para
este fim (SUGIMOTO et al., 1999; CHEN et al., 2006; CHOI et al., 2007).
As técnicas de vitrificação podem ser subdivididas em três grupos: (i) técnicas
sem o contato direto com o nitrogênio líquido, (ii) técnicas com contato direto com o
nitrogênio líquido e (iii) técnicas com o contato com o vapor de nitrogênio líquido
(Figura 2). As técnicas de vitrificação que não têm contato direto com o nitrogênio
líquido possuem como principal vantagem a ausência de contaminação do material
biológico por patógenos resistentes à temperatura extrema do nitrogênio líquido
(BIELANSKI et al., 2000). Contudo, as técnicas inicialmente desenvolvidas, por serem
constituídas principalmente por polímeros sintéticos, apresentam como desvantagem a
dificuldade de reduzir a temperatura de forma adequada (SANSINENA et al., 2012).
Visando aperfeiçoar essa redução de temperatura, algumas equipes têm investido em
dispositivos fechados fabricados em materiais metálicos, por serem melhores
condutores de calor. Outras equipes têm mantido pesquisas utilizando dispositivos que
mantêm o contato direto do material biológico com o nitrogênio líquido (CHEN et al.,
2006; CHOI et al., 2007; KIM et al., 2011) mesmo correndo o risco de contaminação
das amostras (BIELANSKI et al., 2000; BIELANSKI; VAJTA, 2009). Visando acelerar
a redução de temperatura e reduzir a contaminação do material biológico, têm sido
utilizadas técnicas que permitam apenas o contato parcial com o nitrogênio líquido, ou
seja, com o vapor de nitrogênio. Contudo, já foi demonstrada a resistência de vírus ao
vapor de nitrogênio (GROUT; MORRIS, 2009), indicando que essa alternativa pode
não apresentar adequada biossegurança.
35
Figura 2. Técnicas desenvolvidas para vitrificação de tecido ovariano. (A) vitrificação
convencional por palhetas e (B) por criotubos, (C) Cobertura direta, (D) agulhas de
acupuntura, (E) Cryosupport e (F) Fiberplug. Imagens obtidas de SAKI; RAHIM;
ZERGANI, 2009; WANG et al., 2008; CHEN et al., 2006;
http://www.cryoguard.com/products/; HASHIMOTO et al., 2010; BEEBE; NOTTLE,
2010.
Dentre as técnicas de vitrificação de tecido ovariano que não permitem o
contato direto com o nitrogênio líquido, podemos destacar a vitrificação convencional
(Figura 2A e B). Esta técnica é amplamente utilizada e consiste da utilização de
dispositivos comumente empregados na congelação lenta (palhetas, criotubos ou
macrotubos) imersos diretamente no nitrogênio líquido (BORDES et al., 2005;
CARVALHO et al., 2011) ou expostos ao vapor de nitrogênio (MAZOOCHI et al.,
2008; SALEHNIA et al., 2012). Em 2008, Kader et al. (2008) desenvolveram a técnica
de vitrificação Ohio-Cryo que mantém os fragmentos ovarianos em um dispositivo que
permite uma rápida substituição dos meios de vitrificação e comprime as amostras no
interior deste recipiente buscando acelerar a redução de temperatura por redução do
espaço no qual estão os fragmentos ovarianos. Para também acelerar a redução de
36
temperatura, foi recentemente desenvolvida a técnica de dispositivo de metal fechado,
que consiste em sobrepor o material biológico em uma folha de alumínio que é, então,
fechada e sobreposta em nitrogênio líquido. Em seguida, essa folha é inserida em
criotubos para o armazenamento da amostra (BOS-MIKICH et al., 2012).
As técnicas que possuem o propósito de acelerar a redução de temperatura por
contato direto com o nitrogênio líquido são variadas (CHEN et al., 2006; KEROS et al.,
2009; KIM et al., 2011). Visando reduzir a quantidade de solução crioprotetora e
facilitar a redução de temperatura, foi desenvolvido o método de hemi-palheta, no qual
uma palheta de 0,25 mL tem uma extremidade cortada na forma de bisel (constituindo
uma hemi-palheta) e uma gota contendo o material a ser vitrificado é então colocada
nessa superfície e imediatamente posta em contato com o nitrogênio líquido. Após a
vitrificação a hemi-palheta é armazenada no interior de uma palheta maior (0,5 mL) e
estocada em botijões criogênicos (KEROS et al., 2009). Para acelerar ainda mais a
redução de temperatura, foi desenvolvida a técnica de cobertura direta (Figura 2C), na
qual um criotubo, contendo o tecido ovariano, é preenchido por nitrogênio líquido
(CHEN et al., 2006; ZHOU et al., 2010). Além desta técnica, também tem sido utilizada
a imersão direta do tecido ovariano no nitrogênio líquido sendo estes fragmentos
manipulados com pinças (COURBIERE et al., 2006; ISACHENKO et al., 2003) ou
perfurados com agulhas de acupuntura (Figura 2D) (WANG et al., 2008; XIAO et al.,
2010), ou, ainda, em um Cryosupport (Figura 2E), que consiste em agulhas acopladas a
um criotubo, as quais perfuram o tecido ovariano permitindo maior facilidade no
manuseio e imersão no nitrogênio (HASHIMOTO et al., 2010). Utilizando o mesmo
princípio, a vitrificação por grades de microscopia eletrônica é uma alternativa para
maximizar a redução de temperatura, uma vez que essas grades são constituídas de
metal e apresentam perfurações que possibilitam o contato direto com o nitrogênio
líquido (CHOI et al., 2007; KIM et al., 2011).
A utilização do contato da amostra com o vapor de nitrogênio também tem sido
amplamente empregada. A vitrificação de tecido ovariano por superfície sólida consiste
na imersão parcial de uma superfície metálica em nitrogênio líquido e a sobreposição do
tecido ovariano nesta superfície, sendo a vitrificação realizada através da boa
condutibilidade de calor, própria do metal (HUANG et al., 2008; CARVALHO et al.,
2011; AMORIM et al., 2012). Similarmente, a técnica de Fiberplug (Figura 2F)
consiste de uma haste com a extremidade em forma de gancho na qual é colocada a
solução de vitrificação e o tecido ovariano a ser criopreservado. Em seguida, o
37
Fibreplug é colocado em contato com um bloco de metal imerso em nitrogênio líquido
(WANG et al., 2011).
Apesar das inúmeras estratégias utilizadas por diferentes equipes para
minimizar as crioinjúrias celulares decorrentes da criopreservação, a vitrificação, assim
como a congelação lenta, ainda acarreta danos celulares que podem ser letais às células,
evidenciando a necessidade de estudos visando encontrar estratégias para solucionar tais
problemas.
2.2.3. CRIOINJÚRIAS
Embora a criobiologia tenha evoluído e resultado no nascimento de crias
saudáveis tanto por congelação lenta (GOSDEN et al., 1994; SALLE et al., 2003)
quanto por vitrificação (BORDES et al., 2005, LORNAGE et al., 2006, KAWAMURA
et al., 2013), os processos de exposição aos crioprotetores, redução de temperatura e
posterior aquecimento do material criopreservado resultam em danos celulares tanto do
ponto de vista estrutural, quanto metabólico (ELLIOTT, 2010; TATONE et al., 2010).
Os danos estruturais estão descritos em maiores detalhes no Capítulo 1 desta tese.
Portanto, nesta revisão, dentre os danos metabólicos, serão abordados o aumento das
ROS e os mecanismos moleculares de identificação de dano e reparo do DNA, os quais
estão envolvidos com a perda da viabilidade celular.
2.2.3.1. AUMENTO NA PRODUÇÃO DE ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO
(Reactive Oxygen Species - ROS)
Os processos biológicos de forma geral resultam na produção de ROS
(TATONE et al., 2010), além de serem produzidas também durante o metabolismo
anaeróbico (RAHIMI et al., 2003). As ROS são compostos formados durante etapas
intermediárias da redução do oxigênio molecular (O2) e são exemplificadas,
principalmente pelo radical ânion superóxido (•O2
-), o peróxido de hidrogênio (H2O2), e
o radical hidroxila (OH•), que correspondem às etapas de redução por um, dois ou três
elétrons, respectivamente (KOWALTOWSKI; VERCESI, 1999). O H2O2, por ser uma
molécula apolar, possui a capacidade de atravessar a membrana celular (VEAL; DAY;
MORGAN, 2007) e pode ser convertido em OH• (YAN; CHEN; HUA, 2009). Esses
radicais possuem uma valência livre e por esta característica são altamente reativos.
38
Essa reatividade implica em sequestro de moléculas e início de várias reações de
oxidação e redução (TATONE et al., 2010) que podem resultar em alterações nas
células, sobretudo com danos nas membranas celulares (DINARA et al., 2001; LANE et
al., 2002).
O balanço entre moléculas oxidadas e reduzidas no citoplasma da célula
(estado redox) é um dos fatores que pode influenciar a sobrevivência celular após a
criopreservação. O dano oxidativo à célula já foi descrito durante a criopreservação de
tecidos (WHITELEY; FULLER; HOBBS, 1992; LUZ et al., 2012). O processo de
criopreservação (resfriamento e aquecimento) aumenta a produção de ROS e causa
alterações no metabolismo oxidativo (DOWLING; SIMMONS, 2009). Por essa razão, o
estresse oxidativo é um importante fator a ser avaliado com relação às crioinjúrias
(TATONE et al., 2010). O aumento das ROS está relacionado com o estresse osmótico
em várias células somáticas, assim como em gametas, e pode funcionar como um
mecanismo responsável pela resposta adaptativa das células (HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 1999; BALL; 2008). Além disso, também acredita-se que o reparo das
estruturas celulares danificadas pela criopreservação requer geração de energia e
subsequente aumento de ROS (ODANI et al., 2003).
Após a criopreservação tem sido observada perda da integridade e da
viabilidade de espermatozoides (BAIARDI et al, 1997), oócitos (GUPTA et al., 2010) e
embriões (LANE et al., 2002). Essas alterações estão, por vezes, associadas à
peroxidação lipídica (DINARA et al., 2001; LANE et al., 2002). Em espermatozoides
criopreservados foi observada uma redução de 50% dos níveis de antioxidantes dessas
células (BILODEAU et al., 2000), o que pode resultar em alteração das propriedades da
membrana, interferindo no transporte celular e regulação do pH, em virtude da
peroxidação lipídica (LANE et al., 2002). Durante a criopreservação, o estresse
oxidativo pode ser gerado através de diferentes mecanismos, como o estresse osmótico
e o aumento do metabolismo oxidativo (TATONE et al., 2010). Análises de
microarranjo revelaram que células eucarióticas submetidas à criopreservação tem um
aumento na expressão de genes associados ao metabolismo energético e à defesa
antioxidante (ODANI et al., 2003).
A criopreservação pode aumentar as taxas de peroxidação lipídica por
aumentar os níveis de ROS (LANE et al., 2002) que degradam os ácidos graxos
polinsaturados da membrana plasmática (BAUMBER et al., 2003). O processo de
criopreservação altera as condições físico-químicas da célula (STEPONKUS; LYNCH,
39
1989; FERNÁNDEZ-SANTOS et al., 2008) e as concentrações elevadas de
crioprotetores permeáveis e não permeáveis resultam em estresse osmótico e toxicidade
que podem ser responsáveis por crioinjúrias durante a vitrificação de células e tecidos
(FAHY et al., 1984). A sensibilidade exacerbada (GUERIN; EL MOUATASSIM;
MENEZO, 2001) das células às ROS durante o processo de criopreservação é
decorrente do próprio aumento na produção desses compostos (SOMFAI et al., 2007;
AHN et al., 2002) ou alteração do potencial antioxidante, resultando em danos a
enzimas antioxidantes que protegem as células da peroxidação lipídica (DINARA et al.,
2001).
Os efeitos de ROS são dose-dependentes e, em níveis elevados, estas moléculas
altamente reativas promovem profundas mudanças na célula (TATONE et al., 2010),
inclusive, induzindo a expressão de genes envolvidos com a defesa e a regulação do
ambiente celular e metabolismo energético (ODANI et al., 2003). Os níveis de ROS
parecem aumentar principalmente após o aquecimento celular, uma vez que há a
reintrodução do oxigênio nas células criopreservadas bem como a retomada das reações
de oxidação-redução, culminando com a produção de ROS como subprodutos dessas
reações (EL-WAHSH, 2003; STOREY, 2004, TATONE et al., 2010), evidenciando a
necessidade do aumento das defesas antioxidantes após o aquecimento celular.
As ROS são originadas tanto intracelularmente, por decorrência do
metabolismo celular, quanto extracelularmente, devido a fatores estressantes e
agressivos. Seus principais alvos incluem DNA, lipídeos, proteínas e açúcares, sendo
que a ordem de preferência de ataque depende de muitos fatores, como o local onde a
espécie reativa é gerada, a habilidade relativa de uma biomolécula ser oxidada e a
disponibilidade de íons metálicos associados a essa biomolécula (EVANS;
DIZDAROGLU; COOKE, 2004). No entanto, enquanto lipídeos, proteínas e açúcares
podem ser removidos via degradação, o mesmo não ocorre com o DNA, uma vez que é
a molécula responsável por todas as informações genéticas de todas as células de um
organismo vivo (BERRA; MENCK, 2006). Desta forma, o dano ao DNA se mostra
mais severo e letal às células.
2.2.3.2. DANOS AO DNA
O molde de DNA para a propagação da informação genética no núcleo de
células eucariotas é a cromatina, um polímero dinâmico que serve como uma plataforma
40
de controle central para todos os processos intracelulares como replicação e reparo do
DNA (KHORASANIZADEH, 2004; WOODCOCK; DIMITROV, 2001). A unidade
fundamental da cromatina é o nucleossoma, que consiste de 147 pares de base de DNA
envolvendo um octâmero de histona (Figura 3). Esse octâmero é formado por um
heterotetrâmero central de histonas H4 e H3, circundado por dois heterodímeros das
histonas H2A e H2B (BEDNAR et al., 1995; LUGER et al., 1997). O nucleossoma é
uma estrutura dinâmica regulada por inúmeras modificações pós-traducionais das
histonas, como, por exemplo, no processo de reparo do DNA. Após o dano ao DNA, a
cromatina é modificada para permitir o acesso de proteínas de reparo ao sítio de lesão
do DNA (SMERDON et al., 1983).
Figura 3. Representação esquemática de um octâmero de histonas consistindo de duas
moléculas de H2A, H2B, H3 e H4. Adaptado de ZAIDI et al., 2013.
A molécula de DNA sofre danos constantemente e o estresse oxidativo resulta
não apenas em dano às bases e açúcares, mas também pode causar danos à fita simples
(single-strand breaks - SSB) ou danos à fita dupla (double-strand breaks - DSB)
(HASSA; HOTTIGER, 2005). Contudo, uma DSB pode também ocorrer a partir de
replicação de uma SSB não reparada (BILSLAND; DOWNS, 2005; HASSA;
HOTTIGER, 2005). Por ser observada na dupla fita (HASSA; HOTTIGER, 2005) a
DSB é a lesão mais deletéria ao DNA para a sobrevivência celular e integridade do
genoma (KHANNA; JACKSON, 2001; JACKSON, 2002).
41
A resposta celular global à DSB tem sido considerada como uma cascata de
transdução de sinal clássica onde as lesões são detectadas por sensores proteicos que
ativam cascatas de proteínas quinases, o que resulta em amplificação e a diversificação
do sinal através de uma série de moléculas efetoras (KHANNA; JACKSON, 2001;
JACKSON, 2002). Esse mecanismo de detecção e sinalização dos danos, conhecido
como checkpoint (ponto de verificação), representa a primeira resposta celular contra
lesões no DNA (SHACKELFORD et al., 2001). O checkpoint permite que as células
interrompam o ciclo celular e tenham tempo para reparar os danos, antes de recomeçar o
ciclo e completar eventos subsequentes, como a replicação de DNA e mitose
(SHACKELFORD et al., 2001).
Dentre os sinais de amplificação, as modificações na cromatina e suas histonas
parecem exercer um papel crucial na sinalização do dano do DNA. Modificações nas
histonas podem servir como um sinal de amplificação para marcar posições específicas
de dano ao DNA e proporcionar uma interação ou um sítio de localização para os
mecanismos de reparo correspondentes (HASSA; HOTTIGER, 2005). A histona H2A
possui três subfamílias, a H2A1-H2A2, a H2AZ e a H2AX (RAGAKOU et al., 1998).
Em mamíferos, de acordo com o tipo celular, a H2A1-H2A2 varia em função do
percentual de H2AZ e H2AX (RAGAKOU et al., 1998) e estas representam,
respectivamente, cerca de 10% e 2-25% do total de histonas (ZWEIDLER, 1976). A
H2AX constitui uma das principais variantes da histona H2A (FERNANDEZ-
CAPETILLO et al., 2004) e tem grande relevância por possuir um resíduo de serina
altamente conservado que é rapidamente fosforilado, um processo que parece ser
essencial para a sinalização de dano e recrutamento de fatores de reparo (BERRA;
MENCK, 2006, RAGAKOU et al., 1998).
A fosforilação da histona H2AX ocorre no resíduo de serina 139 da região
carboxi-terminal (C-terminal), resultando na γ-H2AX (KARAGIANNIS; EL-OSTA,
2007), cuja modificação está relacionada especificamente à DSB (FERNANDEZ-
CAPETILLO et al., 2004). A γ-H2AX atua como um marcador sensível à DSB sendo
considerada uma ferramenta valiosa para a identificação deste tipo de dano
(KARAGIANNIS; EL-OSTA, 2007). A fosforilação da H2AX é essencial para a
retenção e posterior aumento na concentração de fatores de reparo aos sítios de dano do
DNA e para amplificar o sinal de DSB (BILSLAND; DOWNS, 2005).
Quando ocorre uma DSB, em poucos minutos forma-se um foco nuclear de γ-
H2AX que recruta fatores de reparo como o complexo MRN, MDC1 e 53BP1
42
(BUCHMANN; SKAAR; DECAPRIO, 2004). O complexo MRN é extremamente
conservado e é formado pelas proteínas Mre11, Rad50 e Nbs1 (D'AMOURS;
JACKSON, 2002; TAUCHI et al., 2002). Este complexo está envolvido no reparo
inicial da DSB devido a sua capacidade de se ligar ao DNA lesado (PETRINI et al.,
2001; D'AMOURS; JACKSON, 2002). O complexo MRN se adere ao sítio da DSB, tão
logo o dano ocorra (KOBAYASHI et al., 2002; TAUCHI et al., 2002) e é considerado
um dos estágios iniciais da resposta à DSB (UZIEL et al., 2003).
A 53BP1 (p53 binding protein 1) foi identificada através da sua habilidade de
se ligar à proteína p53 através de sua região BRCT (IWABUCHI et al., 1994), também
encontrada em muitas proteínas que atuam em resposta ao dano do DNA (JOO et al.,
2002) e que parece mediar as interações proteína-proteína envolvidas nesse processo
(IWABUCH et al., 1998). Inicialmente foi proposto que a 53BP1 possuía uma função
como um co-ativador transcricional da p53 (IWABUCHI et al., 1998). No entanto, a
presença do domínio BRCT sugere que a 53BP1 possui um papel direto na resposta ao
dano do DNA (SCHLUTZ et al., 2000). A ligação da 53BP1 ao domínio central da p53
é requerida para a ligação sítio-específica ao DNA lesado (VOGELSTEIN; LANE;
LEVINE, 2000). Além disso, a 53BP1 está co-localizada com o foco da γH2AX em
células com DSB em avaliação imediata (5 min) e tardia (8 h) (SCHLUTZ et al., 2000).
Portanto, a 53BP1 é uma proteína envolvida na resposta ao dano do DNA que é
rapidamente recrutada ao sítio da DSB, onde parece funcionar em um subconjunto com
a γH2AX (FERNANDEZ-CAPETILLO et al., 2004). Experimento utilizando RNA de
interferência demonstrou que a 53BP1 é essencial para o acúmulo de p53 e do
checkpoint celular na fase de transição G2-M do ciclo celular, em resposta ao dano do
DNA (IWABUCHI et al., 2003), bem como para o recrutamento de fatores relacionados
ao reparo do DNA (Figura 4), indicando que a 53BP1 é um fator central para o reparo
(IWABUCHI et al., 2003). A 53BP1 se acumula no foco da DSB e sua atuação é
dependente da interação com a γH2AX (WARD et al., 2003).
43
Figura 4. Via de checkpoint 53BP1-dependente. A DSB resulta na fosforilação da
H2AX próximo ao dano do DNA, culminando com o recrutamento e fosforilação da
53BP1 no foco nuclear. A 53BP1, por sua vez, recruta outros fatores, como a p53, e
culmina com a parada do ciclo celular, ativação do checkpoint e reparo do DNA.
Adaptado de ABRAHAM, 2002.
Em suma, a resposta ao dano do DNA é constituída por três componentes:
sensores de dano, transdutores de sinal e transmissores dos sinais de dano do DNA
(ZHOU; ELLEDGE, 2000). Dependendo do nível de dano do DNA, essas ações ativam
maquinarias celulares aptas a executarem as três funções de resposta ao dano do DNA.
A primeira função é a parada do ciclo celular, que é essencial para a ocorrência das duas
outras funções. Após a parada do ciclo celular, a célula será direcionada para o reparo
do DNA ou para a apoptose celular (ZHOU; ELLEDGE, 2000; HASSA; HOTTIGER,
2005).
A apoptose é um processo complexo e geneticamente determinado, que é
estabelecido pelo balanço de fatores anti- e pró-apoptóticos (ANAZETTI; MELO,
2007). Essa morte celular é ativada por mecanismos intrínsecos e extrínsecos, como
estresse oxidativo e dano no DNA (JOHNSTONE; RUEFFI; LOWE, 2002). O início, a
44
execução e a regulação da apoptose envolve inúmeros fatores bioquímicos, e a família
das caspases exercem um papel central na via de sinalização da apoptose (CELESTINO
et al., 2009). As caspases são expressas como co-enzimas e, quando ativadas,
desencadeiam a morte celular programada (CELESTINO et al., 2009; ZHANG et al.,
2013). As caspases são divididas em caspases iniciadoras (caspase-2, -8, -9 e -10) e
caspases efetoras (caspase-3, -6 e -7) (STRASSER; O’CONNOR; DIXIT, 2000). As
caspases iniciadoras são clivadas em resposta a estímulos apoptóticos e ativam as
caspases efetoras (GREEN, 2003). As caspases efetoras, por sua vez, ativam a DNase
ativada por caspase (caspase-activated DNase - CAD) responsável pela fragmentação
internucleossomal do DNA (NAGASE et al., 2003) e resultam na fragmentação do
DNA, degradação do citoesqueleto e de proteínas nucleares, bem como a formação de
corpos apoptóticos (ELMORE, 2007).
Embora os estudos sobre os danos da criopreservação sobre a morfologia e
viabilidade celular sejam extensos, ainda são escassos os estudos sobre os efeitos que a
criopreservação pode causar ao DNA. Assim, é fundamental que a influência das
biotécnicas reprodutivas seja avaliada sob a óptica das alterações causadas sobre o
DNA.
45
3. JUSTIFICATIVA
Como pode ser constato na revisão de literatura, embora existam vários relatos
de nascimento de prole saudável em espécies como humanos, murinos e ovinos após a
criopreservação de tecido ovariano, resultados como esses não têm sido observados em
outras espécies como os caprinos, por exemplo. Uma das razões pode ainda estar
relacionada com o próprio método de criopreservação comumente empregado, ou seja, a
congelação lenta, no qual os principais danos celulares são decorrentes da formação
intracelular de cristais de gelo. Desta forma, a vitrificação tem sido utilizada como uma
alternativa para reduzir esses danos, uma vez que neste método, em função da
concentração elevada de crioprotetores e da temperatura ultrabaixa, o estado líquido da
solução de vitrificação se transforma em um estado sólido amorfo (estado vítreo), no
qual não ocorre a formação de cristais de gelo. No entanto, a vitrificação também
oferece riscos às células ou tecidos, os quais podem ser decorrentes de uma redução de
temperatura ineficiente, toxicidade das altas concentrações de crioprotetores,
contaminação pelo nitrogênio líquido, dentre outros. Dentre as técnicas utilizadas para
vitrificação de tecido ovariano, a superfície sólida destaca-se pelos diversos estudos
realizados e resultados satisfatórios obtidos, como a manutenção da morfologia
(SANTOS et al., 2007) e viabilidade (CARVALHO et al., 2011) folicular similar ao
tecido fresco. Contudo, essa técnica constitui-se de um sistema aberto que permite o
contato com o vapor de nitrogênio, que, de acordo com alguns autores, também oferece
risco de contaminação para o material biológico (GROUT; MORRIS, 2009).
Portanto, nesta tese foi desenvolvido um sistema fechado de superfície sólida
utilizando um dispositivo manufaturado em aço inoxidável que, além de evitar o contato
direto com o vapor ou o próprio nitrogênio líquido, é um excelente condutor de calor.
Além disso, o dispositivo desenvolvido é prático e possibilita a manipulação das
soluções crioprotetoras ou de remoção dos crioprotetores de forma rápida e segura,
reduzindo também os riscos de contaminação das amostras pelos manipuladores.
Adicionalmente, o dispositivo também permite a criopreservação simultânea de vários
fragmentos de forma eficaz, bem como possibilita a vitrificação de dimensões maiores
de tecido ovariano, como a metade de ovário e o ovário inteiro.
Apesar das vantagens proporcionadas por essa técnica frente a outras já descritas
na literatura, a criopreservação, seja por congelação lenta ou vitrificação, pode aumentar
os níveis de ROS que culminam com alteração na molécula de DNA e consequente
46
perturbação na função celular. Portanto, na tentativa de minimizar danos dessa natureza,
é necessário o aperfeiçoamento das soluções empregadas na vitrificação, como por
exemplo, a utilização de agentes antioxidantes visando reduzir a produção de ROS.
A utilização da espécie caprina nesta tese tem um significado tanto para a
pesquisa básica, como para a pesquisa aplicada. Para a pesquisa básica, devido à
estrutura morfológica e funcional do ovário, assim como devido ao processo de
foliculogênese da cabra apresentar similaridades ao da mulher, o ovário caprino é
amplamente utilizado como modelo para extrapolação em estudos com ovários
humanos. Além disso, no que concerne ao estudo de folículos pré-antrais, a espécie
caprina já é bastante estudada pela nossa equipe, o que nos fornece bastantes subsídios
para uma análise mais segura do comportamento folicular após os procedimentos de
criopreservação e cultivo in vitro. No tocante à pesquisa aplicada, a utilização da
espécie caprina para esse estudo é de grande interesse, pois os resultados poderão ser
utilizados para a preservação do material genético de animais de alto valor zootécnico,
raças em risco de extinção, bem como de animais transgênicos. Especificamente em
relação a esses últimos, é conhecido que caprinos transgênicos têm sido produzidos com
a finalidade de secretar substâncias terapêuticas no leite (FREITAS et al., 2012). Aliado
a isso, essa espécie tem ainda outro valor agregado para a saúde humana, pois seu leite
representa uma alternativa nutricional viável para indivíduos que apresentam
sensibilidade à lactose bovina.
Desta forma, o desenvolvimento de uma técnica de vitrificação segura e
eficiente e o aperfeiçoamento das soluções utilizadas no procedimento, visando reduzir
as crioinjúrias, é de extrema relevância para a pesquisa e consequente avanço da
criobiologia, bem como para a aplicabilidade prática do processo de criopreservação do
material genético de fêmeas.
47
4. HIPÓTESES CIENTÍFICAS
Todas as etapas do processo de vitrificação podem ser realizadas em um
sistema fechado de superfície sólida, garantindo mais segurança à amostra a ser
criopreservada;
A utilização de um dispositivo que possibilite a vitrificação vários fragmentos
ovarianos, bem como a metade de um ovário ou ovário inteiro não altera a morfologia e
viabilidade folicular;
A vitrificação de tecido ovariano em fragmento, metade de ovário e ovário
inteiro realizada em um novo dispositivo fechado não afeta a capacidade de
desenvolvimento folicular;
A adição de catalase no procedimento de vitrificação reduz os níveis de ROS e
os consequentes danos celulares.
48
5. OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GERAL
Desenvolver uma técnica de vitrificação em um sistema fechado que permita a
criopreservação de vários fragmentos, metade ou ovário inteiro, bem como a realização
de todos os procedimentos em um mesmo dispositivo.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a morfologia e viabilidade folicular após vitrificação em fragmento,
metade de ovário e ovário inteiro por um novo sistema de superfície sólida fechado;
Verificar o efeito da adição de catalase na solução de vitrificação e/ou remoção
do agente crioprotetor sobre a morfologia e viabilidade folicular e níveis de ROS;
Avaliar a fragmentação do DNA de folículos pré-antrais após vitrificação do
tecido ovariano;
Investigar a imunomarcação de proteínas envolvidas no dano e reparo do DNA
de folículos pré-antrais após vitrificação do tecido ovariano.
49
6. CAPÍTULO 1
Caracterização dos danos celulares em gametas femininos e embriões após
criopreservação
Characterization of cellular damage in female gametes and embryos after
cryopreservation
Periódico: Acta Scientiae Veterinariae, v. 40, n. 3, p. 1046, 2012.
50
RESUMO
A criopreservação é uma biotécnica utilizada com sucesso em gametas femininos e
embriões. Esta técnica possui grande importância para a propagação do material
genético de animais de alto valor zootécnico, bem como para preservar a fertilidade de
mulheres que precisem de tratamentos oncológicos. Contudo, a criopreservação pode
resultar em danos à membrana, às organelas citoplasmáticas e ao núcleo celular. A
primeira estrutura a sofrer os danos decorrentes da criopreservação é a membrana
celular, responsável pela homeostase no interior da célula. A criopreservação também
altera a estrutura morfológica e distribuição das gotas lipídicas, resultando em danos aos
lipídios associados ao citoesqueleto celular causando deformação e ruptura do
citoesqueleto. Entre as organelas celulares, as mitocôndrias são mais sensíveis ao
procedimento de criopreservação, uma vez que os cristais de gelo intracelulares
decorrentes da criopreservação ocasionam danos à crista e matriz mitocondrial. Além da
mitocôndria, o retículo endoplasmático também se mostra sensível à criopreservação,
sendo observada alterações da morfologia desta organela após a vitrificação de
embriões. É também conhecido que a criopreservação pode resultar em fragmentação do
DNA culminando com parada do desenvolvimento e morte celular. Além disso, a
criopreservação também pode ocasionar anormalidades cromossômicas, sendo a
aneuploidia a mais frequente e associada à baixa taxa de nascimentos após a
criopreservação de oócitos. A redução na sobrevivência de oócitos e embriões após a
criopreservação parece estar diretamente relacionada aos danos em diferentes
compartimentos e estruturas celulares, os quais são essenciais para a manutenção do
metabolismo celular. Assim, observa-se a necessidade de se obter protocolos de
criopreservação capazes de manter a integridade dos diferentes componentes celulares.
Palavras-chave: Crioinjúria. Oócitos. Organelas celulares. Tecido ovariano.
51
Caracterização dos danos celulares em gametas femininos e embriões após
criopreservação
Characterization of Cellular Damage in Female Gametes and Embryos after
Cryopreservation
Adeline de Andrade Carvalho, Luciana Rocha Faustino, Simone Vieira Castro, José
Ricardo de Figueiredo & Ana Paula Ribeiro Rodrigues
ABSTRACT
Background: Cryopreservation is a biotech successfully employed in female gametes
and embryos. This technique is of great importance for propagation of genetic material
from animals with high-value livestock, as well as to preserve the fertility of women
undergoing cancer treatments. However, low temperatures can result in damage to
different cellular compartments and organelles. This damage culminates in reduced
viability, since they affect cell metabolism.
Review: Cryopreservation consists of maintenance of biological material at low
temperatures, in which chemical reactions are ceased, however, allowing the cells to
preserve their viability. However, the decrease of temperature and subsequent warming
may result in cellular damage. These damages occur in the cell membrane, cytoplasmic
organelles and the cell nucleus. It is believed that the first cell structure undergoing
cryoinjury is the plasma membrane, responsible for maintaining homeostasis within the
cell, and the loss of plasma membrane during temperature reduction is reported to be the
main damage. The membrane damage due to cryopreservation appears to correlate with
the reduction of thermal energy at low temperatures, thus limiting the movement of
molecules through the phospholipids of lipid bilayer. Cryopreservation also alters the
morphology, structure and cellular distribution of lipid droplets, reducing the survival of
oocytes and embryos. The physical state changes, besides changing physicochemical
properties of intracellular lipid may also result in damage to lipids associated with the
cellular cytoskeleton. The interaction between cell lipid phase and components of
cytoskeleton is complex and hardening of these lipids can cause deformation and
52
disruption of cytoskeleton with consequent negative effect on cell survival and
development. The disruption of cytoskeleton can also be intrinsic to change in
dehydration and cellular form that follow the cryopreservation process. Among the
cellular organelles, mitochondria are sensitive to cryopreservation procedures, since the
formation of intracellular ice crystals considered one of the most relevant cryoinjury,
leading to damage to the mitochondrial cristae and matrix. Another important organelle
that undergoes damage as result of cryopreservation is the endoplasmic reticulum, that
change in morphology has been described after vitrification of embryos. It is also
known that cryopreservation may result in fragmentation of DNA even in the absence of
deformation of the cellular morphology, and that these changes can lead to delay in the
development or cell death. In addition to the direct damage to double-stranded DNA,
cryopreservation may trigger chromosomal abnormalities, the aneuploidy is the most
frequent and seems to compromise the developmental competence of oocytes in
addition to being indicated as the main factor for the low achieve of live births.
Conclusion: Cryopreservation is an important alternative for the preservation of
gametes and embryos, however, the cells are subjected to unfavorable conditions that
can compromise cell recovery after thawing/warming. The main cause of reduction in
survival oocytes and embryos after cryopreservation appear to be related to damage in
different cellular compartments and structures, which are essential for maintaining cell
metabolism. Thus, it is observed the need to achieve cryopreservation protocols capable
of maintaining the integrity of different cellular components.
Keywords: cryopreservation, cryoinjury cellular, oocytes, female gametes, embryos,
ovarian tissue.
Descritores: criopreservação, crioinjúria celular, oócitos, gametas femininos, embriões,
tecido ovariano.
53
I. INTRODUÇÃO
II. BASES GERAIS DA CRIOPRESERVAÇÃO CELULAR
III. CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS CÉLULAS EUCARIÓTICAS
IV. PRINCIPAIS DANOS CELULARES CAUSADOS PELA
CRIOPRESERVAÇÃO
1. Danos de membrana
2. Danos em gotículas lipídicas intracitoplasmáticas
e citoesqueleto
3. Danos em organelas celulares
4. Danos nucleares
V. CONCLUSÃO
VI. REFERÊNCIAS
I. INTRODUÇÃO
A criopreservação é uma técnica que tem despertado grande interesse para a
reprodução assistida nos últimos 15 anos, principalmente desde os primeiros relatos de
nascimentos em ovinos [39] e humanos [25] após o transplante de tecido ovariano
previamente criopreservado. Portanto, é compreensível a aplicação cada vez mais
frequente dessa técnica com a finalidade de preservação de gametas femininos com o
objetivo final de manutenção da função reprodutiva da fêmea ou mesmo a produção de
crias após impossibilidade de reprodução natural ou radicalmente, após a morte do
animal.
Considerando a crescente incidência de doenças cancerígenas, aliada ao
sucesso atual dos tratamentos oncológicos, a criopreservação tem ganhado ênfase na
medicina reprodutiva humana por representar uma alternativa para que mulheres,
sobretudo as jovens, possam gerar filhos após o tratamento do câncer [78]. Além disso,
a criopreservação tem sido bastante difundida no âmbito da veterinária por permitir a
disseminação de material genético de animais de alto valor genético e grande
produtividade [117]. Adicionalmente, a criopreservação também tem sido considerada
uma vantajosa ferramenta para preservar animais em vias de extinção [114].
Vários estudos têm sido realizados visando aperfeiçoar o processo de
criopreservação de gametas femininos, seja na forma matura [72,78,102] ou imatura
[11,49,74], como meio de permitir um melhor aproveitamento do potencial reprodutivo
54
mesmo após a morte ou impossibilidade da função reprodutiva da fêmea. Além da
criopreservação de gametas femininos, a criopreservação de embriões também tem sido
bastante estudada e amplamente difundida e estabelecida para aplicação tanto em
humanos [86,87] quanto em animais [27,83]. Contudo, ainda observa-se a inexistência
de um protocolo ideal [67], haja vista as baixas taxas de sobrevivência e
desenvolvimento oocitário até embrião normal [60]. Além disso, também são baixas as
taxas de sobrevivência e implantação embrionária após criopreservação, as quais ainda
são consideradas muito inferiores àquelas obtidas quando se trata de embriões frescos
[57].
A criopreservação de células germinativas pode ser realizada tanto por
congelação lenta como por vitrificação. Ambos os métodos têm sido empregados em
tecido ovariano [66,71], oócitos [12,29,30] e embriões [60,85]. Contudo, esse
procedimento ainda é apontado por alguns autores como uma técnica prejudicial às
células, que pode resultar em danos em diferentes compartimentos celulares, como por
exemplo, na membrana celular [55], nas organelas [63,94] e no núcleo [45,67]. O
conhecimento e a caracterização desses danos são de grande relevância para a
criobiologia, visto que a intensidade com que as lesões celulares ocorrem pode
incapacitar as células de superarem grandes danos, consequentemente, perdendo sua
viabilidade. Desta forma, a presente revisão tem o objetivo de descrever os principais
danos originados em consequência dos procedimentos de criopreservação em tecido
ovariano, oócito maturo e embriões oriundos de seres humanos e animais.
II. BASES GERAIS DA CRIOPRESERVAÇÃO CELULAR
A criopreservação consiste na manutenção de material biológico a
temperaturas criogênicas, nas quais todas as reações químicas, processos biológicos e
atividades físicas intra e extracelulares estão suspensas, contudo, as células conseguem
manter-se íntegras, preservando sua viabilidade [91]. Essas temperaturas são
denominadas criogênicas, sendo frequentemente utilizado o nitrogênio líquido (-196ºC)
para alcançá-las [7]. Em temperaturas entre 0° e 25ºC a atividade celular torna-se lenta,
mas ainda está presente. Contudo, abaixo de -40ºC as trocas físico-químicas são
cessadas e, para garantir a preservação celular por tempo indeterminado, as células
devem ser mantidas a temperaturas inferiores a -130ºC na presença de agentes
crioprotetores [7].
55
Em regiões frias, algumas plantas [9] e animais [22,84] desenvolveram uma
resistência natural às baixas temperaturas. Essa resistência consiste na capacidade de
possibilitar que a água mantenha-se superesfriada em temperaturas próximas a -40ºC
[9]. Esta adaptação é denominada de aclimatação e geralmente envolve a síntese de
açúcares intra e extracelulares que aumentam a pressão osmótica das células e reduzem
a injúria por plasmólise a baixas temperaturas [9,22]. Contudo, em 1949 foi realizada a
descoberta de uma substância com a capacidade de atravessar a membrana celular e
reduzir a formação de cristais de gelo [58,82]. Esta substância, isto é, o glicerol, bem
como outras com propriedades similares, como o propanodiol, etilenoglicol e
dimetilsulfóxido, passaram desde então a ser utilizadas com sucesso na criopreservação
de células e tecidos [17,111].
Apesar dos avanços na criobiologia, tanto a redução de temperatura quanto o
posterior aquecimento celular podem resultar em danos na estrutura da célula [9,28].
Esses danos podem ocorrer na membrana celular [17], nas organelas citoplasmáticas
[47,49,50] e até mesmo no núcleo da célula [23,67]. Em virtude disso, várias pesquisas
têm sido realizadas com o intuito de conhecer as crioinjúrias ocasionadas e amenizar ou
reverter os danos celulares decorrente dessas injúrias [29,30,107]. Devido à
complexidade da estrutura celular eucariótica e as várias organelas essenciais para a
sobrevivência da mesma, cada organela será descrita em maiores detalhes a seguir.
III. CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS CÉLULAS EUCARIÓTICAS
As células de organismos multicelulares apresentam forma e estrutura variáveis
e se diferenciam de acordo com sua função. No entanto, todas as células eucarióticas
apresentam uma organização básica similar (Figura 1). Esta organização consiste em
uma membrana celular externa, constituída por uma bicamada lipídica com proteínas
dispostas nesta bicamada [37]. Esta membrana é responsável por delimitar o citoplasma,
composto por citosol, organelas celulares, proteínas e íons; e o núcleo, que alberga o
material genético da célula, o qual é um compartimento altamente organizado e
separado do citoplasma por uma membrana porosa denominada carioteca [41].
56
Figura 1. Imagem ilustrativa de uma célula eucariótica evidenciando as organelas
internas no citoplasma e no núcleo. Imagem concedida por Thibodeau e Patton [103].
O citoplasma celular, além de albergar fluidos e enzimas, também contém
estruturas físicas altamente organizadas, denominadas organelas intracelulares [33].
Toda esta estrutura é mantida com auxílio de uma complexa rede filamentosa chamada
de citoesqueleto. O citoesqueleto é uma estrutura constituída por microtúbulos formados
por tubulina α e β, microfilamentos de actina e filamentos intermediários específicos de
certas células. Todos estes elementos assumem, além da função esquelética, outras
funções de acordo com as proteínas as quais estão associados [49].
Nas células eucarióticas, o citoesqueleto tem como função principal coordenar
a distribuição de organelas nas células e manter a forma celular. Sendo, portanto, o
citoesqueleto responsável pela sustentação e resistência celular, bem como por
alterações na forma e distribuição das organelas desencadeadas por interações entre a
célula e seu meio e, entre células diferentes [41]. Os microtúbulos executam diversas
funções, dentre elas, a manutenção da estrutura celular, o transporte de moléculas, bem
como estão envolvidos na divisão celular, uma vez que participam da formação do fuso
meiótico [30].
No citoplasma também estão presentes as organelas responsáveis pela
respiração e energia celular, conhecidas como mitocôndrias [20]. A distribuição destas
organelas parece estar associada com o nível de metabolismo celular, através da
conversão de piruvato à adenosina trifosfato (ATP), substância que atua como fonte de
energia para a célula [41]. As células eucarióticas também possuem organelas formadas
por uma interconexão de túbulos e vesículas. Estas estruturas, conhecidas como retículo
57
endoplasmático, são constituídas por membrana, matriz endoplasmática e um meio
aquoso que ocupa o espaço entre os túbulos e vesículas. O retículo endoplasmático pode
ou não ter sua superfície recoberta por ribossomos, sendo, então, denominado de
retículo endoplasmático rugoso e liso, respectivamente [70]. O retículo endoplasmático
rugoso ou granular possui a capacidade de sintetizar novas moléculas proteicas,
enquanto o retículo endoplasmático liso, também chamado de agranular, tem como
função a síntese de substâncias lipídicas, incluindo a produção de hormônios esteróides
[70]. As substâncias produzidas pelo retículo endoplasmático são liberadas no meio
extracelular através de encapsulamento pelas vesículas do complexo de Golgi. Essa
organela possui membranas semelhantes às membranas do retículo endoplasmático
agranular e geralmente é composta por várias camadas de vesículas achatadas e
empilhadas, sendo proeminente em células secretoras [96].
O núcleo celular é um compartimento organizado no qual são encontrados os
cromossomos, responsáveis por armazenar as informações genéticas [54]. Durante a
divisão celular os cromossomos encontram-se aderidos ao fuso meiótico, formado por
microtúbulos e microfilamentos de actina [78]. O núcleo é considerado o centro de
controle da célula por conter os genes que determinam as características proteicas da
célula [54], incluindo proteínas estruturais e enzimas que controlam as atividades
nucleares e citoplasmáticas [41].
Cada compartimento celular citado desempenha um importante papel para
manutenção da homeostase celular. Entretanto, essa homeostase pode ser comprometida
em virtude de alterações em diferentes estruturas celulares decorrentes da
criopreservação, conforme detalhado no próximo tópico.
IV. PRINCIPAIS DANOS CELULARES CAUSADOS PELA
CRIOPRESERVAÇÃO
1. Danos de membrana
De forma geral, todas as membranas celulares são sensíveis às crioinjúrias,
porém, a sobrevivência da célula parece estar mais diretamente relacionada com a
integridade da membrana plasmática do que com as membranas que delimitam as
organelas. A membrana celular possui maior relevância por atuar no procedimento de
criopreservação como uma barreira semipermeável entre o citoplasma e o meio
extracelular, permitindo o movimento (efluxo/influxo) de água e agentes crioprotetores,
58
fundamental para a preservação da célula a temperaturas ultra-baixas [105]. Acredita-se
que a membrana seja o primeiro compartimento a sofrer injúrias decorrentes do frio e
que estas injúrias estejam correlacionadas com a redução de temperatura a qual a célula
é exposta [99]. Um dos graves danos decorrentes da criopreservação é a perda de parte
da membrana plasmática durante a redução de temperatura [1]. Esta perda membranária
é resultado da intensa desidratação celular que precisa ocorrer com o intuito de reduzir a
formação intracelular de gelo de modo a garantir o sucesso da criopreservação, desde
que esta não seja excessiva. Durante a desidratação excessiva e consequente estresse
hídrico, as células se retraem e ocorre uma contração da membrana celular. Esta
contração resulta na aproximação de porções de membrana permitindo uma interação da
bicamada lipídica com ocasional fusão da membrana [94], ocorrendo consequentemente
formação de vesículas e perda de parte do material da membrana. Essa alteração pode
culminar com a perda de elasticidade da membrana e lise da célula ao retornar às
condições isotônicas normais [1].
Os danos de membrana decorrentes da criopreservação também parecem estar
relacionados com a redução da energia térmica a baixas temperaturas e consequente
limitação do movimento de moléculas na bicamada lipídica da membrana [37]. Esses
danos também são influenciados pela composição lipídica da membrana, que influencia
diretamente suas propriedades, inclusive a resistência ao estresse térmico [5,119,121].
Esta composição parece variar de acordo com o desenvolvimento e tipo celular. Já foi
demonstrado, na espécie ovina, que a membrana plasmática de zigotos e oócitos em
diferentes estágios de desenvolvimento possuem diferentes temperaturas de
solidificação, sugerindo ainda que essa variação está relacionada com a composição
fosfolipídica e concentração de colesterol da membrana [120].
Ao avaliar ovários humanos criopreservados utilizando a congelação lenta na
presença de dimetilsulfóxido (DMSO), Martinez-Madri [62] observaram que 96,7% dos
folículos ovarianos apresentavam membranas celular e nuclear intactas. A congelação
lenta de tecido ovariano de cutias (Dasyprocta aguti) com propanodiol também foi
eficaz em preservar as membranas do oócito e das células da granulosa [114]. Contudo,
em caprinos foram relatadas alterações na membrana nuclear (Figura 2A) após
congelação em meio contendo DMSO e sacarose [17].
59
Figura 2. Fotomicrografias demonstrativas da ultraestrutura de folículos ovarianos e
oócitos submetidos a procedimentos de criopreservação. (A) Folículo primordial de
mulher incluso em ovário inteiro congelado/descongelado evidenciando um oócito (O)
com ruptura de membrana nuclear e condensação da cromatina (seta preta) no núcleo do
oócito (N). Entre as células foliculares (Fc) percebe-se célula folicular alterada com
condensação da cromatina (seta branca). Imagem concedida por Martinez-Madrid [62] e
autorizada pela Elsevier. (B) Oócito bovino imaturo congelado/descongelado com
gotícula lipídica intacta (1) e com lipólise parcial (2). Observam-se áreas de lipólise
(seta branca) e mitocôndrias (m). Aumento de 8000x. Figura adaptada de Isachenko
[48] e autorizada por Wiley Job Network. (C) Oócitos equinos maturos
vitrificados/aquecidos com enturgecimento de mitocôndrias e redução de elétron-
densidade da matriz mitocondrial (setas pretas). Figura concedida por Hochi [46] e
autorizada pela Elsevier. (D) Folículo suíno incluso em tecido ovariano
congelado/descongelado com mitocôndrias túrgidas (m). (l): gotículas lipídicas, (Nu):
núcleo, (CG): células da granulosa e (*): espaços vazios. Figura concedida por Borges
[13] e autorizada pela Elsevier. (E) Folículo ovariano humano incluso em tecido
vitrificado/aquecido com presença de poros na membrana nuclear (setas pretas) e
retículo endoplasmático (ER) e mitocôndrias (M) bem preservados, semelhante ao
tecido fresco. Figura concedida por Sheikhi [95] e autorizada pela Oxford Journals.
60
Especificamente em oócitos, a camada glicoprotéica denominada zona
pelúcida, exerce a importante função de impedir a polispermia e, também, se mostra
sensível aos procedimentos de criopreservação [55,98,106]. A presença de vacúolos e
debris na zona pelúcida, por exemplo, já foi relatada após criopreservação de ovários de
camundongas, seja através da congelação lenta ou da vitrificação [55]. Em geral, sabe-
se que a criopreservação de oócitos ocasiona uma redução na taxa de fecundação do
oócito [98] provavelmente por mudanças estruturais da zona pelúcida. Essas alterações
parecem ser ocasionadas pela liberação precoce dos grânulos corticais [16,36,52,64]
devido a um aumento de cálcio após procedimentos de criopreservação [56], resultando
no enrijecimento da zona pelúcida [52]. Contudo, o exato mecanismo que conduz a esse
aumento de cálcio no oócito ainda não é completamente conhecido.
Em embriões criopreservados foi demonstrada uma sensibilidade relativamente
alta da membrana plasmática, uma vez que o processo de congelação/descongelação de
embriões reduziu em cerca de cinco vezes a fluidez da membrana de embriões de
camundongos [2]. Contudo, ao avaliar a transição da fase cristalina líquida para a fase
cristalina gel (Tm) de embriões e oócitos maturos (MII) e imaturos (VG) de mulheres,
Ghetler et al. [37] observaram que a membrana celular de embriões possui uma Tm
mais baixa que a de oócitos, tornando-os menos sensíveis às crioinjúrias. Esta variável
está correlacionada com uma maior resistência ao frio, uma vez que a passagem dos
lipídios da fase líquida para a fase gel ocorre a uma temperatura mais baixa, na qual os
processos biológicos e a cinética de lesão são lentos. Desta forma, acredita-se que os
danos na membrana possam ser reduzidos através da perfusão dos agentes
crioprotetores a uma temperatura acima da Tm da membrana celular, possibilitando o
transporte de crioprotetor e água através da membrana quando a bicamada lipídica ainda
encontra-se em fase líquida, facilitando o transporte transmembrana [19,51,118].
2. Danos nas gotículas lipídicas intracitoplasmáticas e citoesqueleto
O sucesso dos protocolos de criopreservação de tecido ovariano, oócitos e
embriões parece ser dificultado, em grande parte, pela presença de lipídios (Figura 2B),
tanto na forma de gotículas lipídicas intracitoplasmáticas [35] quanto na composição da
membrana celular [37], principalmente nas espécies suína [13] e canina [50]. Além
disso, o procedimento de vitrificação altera a morfologia, estrutura e distribuição celular
das gotículas de lipídios [34], reduzindo a sobrevivência de oócitos e embriões [37].
61
Na vitrificação de oócitos e embriões suínos, algumas pesquisas têm sido
realizadas com o intuito de reduzir a quantidade de lipídio intracelular [67] e aumentar a
sobrevivência oocitária [35] e embrionária [67]. Contudo, a centrifugação e a remoção
química utilizadas nos tratamentos de delipação podem causar danos aos oócitos e
embriões, tornando as células mais frágeis ao processo, especialmente a membrana
celular, que se torna mais sensível [35].
As gotículas lipídicas parecem estar relacionadas aos filamentos intermediários
do citoesqueleto [15,43]. Estes filamentos formam uma rede que se estende do núcleo à
membrana plasmática envolvendo grande parte das organelas celulares [15] e já foram
descritos em associação com o retículo endoplasmático [80], complexo de Golgi [65] e
gotículas lipídicas intracitoplasmáticas [43]. A interação de filamentos intermediários
com gotas lipídicas foi reforçada pela associação dessas estruturas com a vimentina
(grupo de proteínas constituintes dos filamentos intermediários), observada por Traub
[104], embora a finalidade dessa interação ainda seja desconhecida. No entanto,
acredita-se que a interação lipídio-citoesqueleto possa estar relacionada à manutenção
da morfologia celular [10], embora o mecanismo pelo qual este processo ocorra ainda
também não esteja elucidado.
As mudanças de estado físico, além de alterarem as propriedades físico-
químicas dos lipídios intracelulares [49] podem resultar em danos também nos lipídios
associados ao citoesqueleto celular [48] (Figura 3). A interação entre a fase lipídica das
células e os elementos do citoesqueleto é complexa e o enrijecimento desses lipídios
pode causar deformação e ruptura do citoesqueleto [49], com consequente influência na
sobrevivência e desenvolvimento celular [47,88,112].
62
Figura 3. Imagens representativas do padrão de citoesqueleto de oócitos felinos
imaturos submetidos à criopreservação evidenciando microfilamentos em vermelho e
microtúbulos em verde. Microfilamentos difusos no ooplasma com uma concentração
ligeiramente maior na zona pelúcida (A), microtúbulos uniformemente distribuídos por
todo ooplasma (A’). Microfilamentos e microtúbulos distribuídos de forma irregular no
citoplasma (B e B’). Barras representativas de 50µm. Figura concedida por Luciano
[59] e autorizada pela Elsevier.
O rompimento do citoesqueleto pode ser uma alteração intrínseca às mudanças
na forma e desidratação celular que acompanham o processo de criopreservação [113].
Em oócitos, as crioinjúrias parecem afetar principalmente os microtúbulos [3] e a
organização do citoesqueleto [75]. Esses criodanos podem também ser decorrentes da
exposição aos agentes crioprotetores, que podem ocasionar a despolimerização de
microtúbulos e microfilamentos e causar a destruição dos componentes do citoesqueleto
[24]. A exposição ao crioprotetor, etapa fundamental da criopreservação, resultou em
discreta redução no percentual de distribuição normal dos microfilamentos em oócitos
bovinos congelados [94] e oócitos suínos vitrificados [90]. Além disso, a congelação de
oócitos bovinos demonstrou um efeito negativo sobre os microfilamentos, observado
pela drástica redução de oócitos com distribuição normal dos microfilamentos [94].
Contudo, alguns estudos têm mostrado a eficiência de protocolos de
criopreservação com menores danos ao citoesqueleto celular. Em camundongas, a
avaliação de oócitos imaturos criopreservados (congelação lenta), posteriormente
submetidos à maturação in vitro, não revelou qualquer alteração significativa na
63
organização de microtúbulos e microfilamentos [29]. Em oócitos maturos de equinos
vitrificados por OPS (Open Pulled Straws), Tharasanit et al. [102] observaram um
rompimento no citoesqueleto celular, porém, a frequência dessa alteração foi baixa.
Alterações irreversíveis na estrutura dos microtúbulos podem ser ocasionadas
em decorrência do estresse osmótico, do efeito solução e da formação de cristais de gelo
intracelulares, que são efeitos intrínsecos ao processo de criopreservação [94]. A
manutenção da morfologia dos microfilamentos é tão importante quanto a manutenção
da morfologia dos microtúbulos. A preservação do fuso meiótico de oócitos em MII é a
principal dificuldade da criopreservação destas estruturas. Nesta fase, os cromossomos
encontram-se dispostos na placa equatorial e os microtúbulos ligados aos cromossomos
estão estendidos [26], tornando-se mais vulneráveis às crioinjúrias. Vários estudos têm
sugerido que a criopreservação causa alterações na polimerização da tubulina de
microtúbulos do fuso de oócitos em MII, ocasionando uma ruptura no fuso meiótico e
consequente desorganização da cromatina [81,100]. Danos no fuso meiótico já foram
relatados após a vitrificação de oócitos de camundongas [38], ovelhas [100] e mulheres
[61]. Em oócitos de coelha ovulados e congelados não foi perceptível a presença de
actina polimerizada (componente dos microfilamentos), sendo observada a presença de
microfilamentos apenas no corpúsculo polar [111]. Contudo, algumas equipes sugerem
que o citoesqueleto de oócitos em estágio de vesícula germinativa seja mais rígido que
microtúbulos e microfilamentos de oócitos em estágio MII [4]. Uma hipótese é que em
função da complexa interação entre a fase lipídica das células e os elementos do
citoesqueleto, o enrijecimento dos lipídios pode ocasionar uma deformação e até mesmo
ruptura do citoesqueleto. No citoesqueleto rígido de oócitos em vesícula germinativa o
enrijecimento em decorrência dos procedimentos de criopreservação torna-se,
aparentemente, permanente, enquanto oócitos em MII parecem reverter estes danos em
virtude da característica flexível de seu citoesqueleto [48].
3. Danos em organelas celulares
Durante o procedimento de criopreservação, as células podem sofrer severos
danos em sua estrutura. Esses danos estão relacionados com a integridade das organelas
celulares e podem resultar em retardo no crescimento folicular [92] e embrionário [67]
ou até mesmo culminar com a morte da célula [62].
As mitocôndrias, organelas essenciais para o metabolismo celular, são
sensíveis aos procedimentos de criopreservação [12,73], apresentando criodanos
64
ocasionados tanto pela congelação lenta [62] quanto pela vitrificação [66].
Aparentemente, a causa mais relevante desses danos é a formação de cristais de gelo
intracelular, que induz a danos nas cristas e na matriz das mitocôndrias [69],
acarretando em distanciamento das membranas mitocondriais e danos, principalmente, à
membrana mitocondrial interna [79].
A manutenção da morfologia e atividade mitocondrial são características
indispensáveis para diversos eventos que estão envolvidos com a maturação
citoplasmática e retomada da meiose [108], fertilização [115] e desenvolvimento
embrionário [8]. Desta forma, a preservação dessas organelas caracteriza-se como um
dos grandes desafios da criopreservação, uma vez que as mitocôndrias estão
relacionadas com a produção de energia celular [8,41] e, consequentemente, a
integridade mitocondrial está correlacionada com a viabilidade celular [88].
A vitrificação de tecido ovariano de camundongas está relacionada com a
redução na quantidade de cristas mitocondriais, alterações na morfologia mitocondrial
[66] e aumento no número de mitocôndrias [55,66] tanto nas células da granulosa
quanto nos oócitos. Após criopreservação rápida (redução de 1°C/min) de ovário
humano inteiro também foi observada redução nas cristas mitocondriais [62]. No
entanto, em tecido ovariano humano submetido à congelação lenta observou-se um
elevado número de mitocôndrias em oócitos de folículos primordiais e primários
morfologicamente normais, além de matriz com baixa densidade e poucas cristas
periféricas, características consideradas normais em oócitos em estado quiescente ou em
desenvolvimento inicial [71].
Em oócitos humanos maturos vitrificados foi verificada a presença de
mitocôndrias com matriz elétron-densa e cristas bem preservadas. Contudo, foi
observada uma fragmentação da matriz mitocondrial e desintegração da membrana de
algumas mitocôndrias [12]. Já após a congelação lenta de oócitos humanos maturos
(MII), as mitocôndrias encontravam-se uniformemente distribuídas no citoplasma. No
entanto, estas mitocôndrias possuíam aparentes danos nas cristas mitocondriais,
caracterizadas por cristas que não atravessavam a matriz elétron-densa. Além disso, em
um alto percentual de oócitos criopreservados (72%) foi observada uma redução na
densidade da matriz mitocondrial [40]. Quando a congelação lenta foi utilizada em
ovários de camundongas, foi observada presença de mitocôndrias túrgidas e com poucas
cristas [66].
65
As mitocôndrias também têm sido bastante investigadas em embriões
criopreservados em diferentes espécies, como bovinos [107] e suínos [31], uma vez que
o ATP produzido pelas mitocôndrias é essencial para diversos processos celulares em
embriões em desenvolvimento, incluindo a divisão celular e replicação do DNA
genômico [8]. Em embriões de camundongos, após a congelação lenta, foi observado
que a maioria das mitocôndrias apresentava-se agrupada, principalmente, ao longo da
membrana celular. Dentre as mitocôndrias presentes no citoplasma, grande parte exibiu
um baixo potencial de membrana, evidenciando que a criopreservação é capaz de
induzir a despolarização da membrana mitocondrial [2]. Em bovinos, a congelação lenta
de embriões de 7 dias não demonstrou alterações nas mitocôndrias. Contudo, ao se
criopreservar embriões bovinos de 13 dias, observou-se danos na membrana das
mitocôndrias e perda da homogeneidade de sua matriz [69].
Apesar da presença de danos nas mitocôndrias decorrentes do procedimento de
criopreservação, um estudo com blastocistos bovinos vitrificados sugere que esse tipo
de dano pode ser revertido após algumas horas de incubação, cultivando-se os embriões
pós-aquecimento [107]. Nesse estudo, embriões analisados logo depois de aquecidos
demonstraram alterações mitocondriais e redução de elétron-densidade da matriz ou
mitocôndrias túrgidas e com aumento da elétron-densidade da matriz. Curiosamente,
após 4 h de incubação, as mitocôndrias retomaram seu tamanho normal e apenas uma
minoria apresentava áreas com redução de elétron-densidade. Após 24 h de incubação,
as mitocôndrias apresentavam-se com formato normal e matriz elétron-densa. De forma
contrária, em blastocistos suínos vitrificados observou-se o desacoplamento da
membrana mitocondrial interna e matriz mitocondrial com redução de elétron-densidade
[53]. Ainda após vitrificação de blastocistos suínos, Fabian et al. [31] observaram uma
degeneração extensiva das mitocôndrias com desligamento parcial das membranas
interna e externa quando os embriões foram cultivados por 24 h após aquecimento.
Outra importante organela que sofre danos em decorrência da criopreservação
é o retículo endoplasmático, cuja modificação na morfologia foi observada após a
vitrificação de embriões suínos, resultando em dilatação do retículo endoplasmático liso
e presença de pequenas vesículas [31]. Alterações nessa organela também foram
perceptíveis em oócitos suínos [13] e caprinos [17], com enturgecimento da mesma
após a congelação do tecido ovariano (Figuras 2C e 2D). Acredita-se que essa
deformação ocorre como resultado de mudanças no balanço iônico causado por
alterações na permeabilidade da membrana plasmática [21]. O entumecimento de
66
retículo endoplasmático e cristas mitocondriais [23,45] também foi observado após a
vitrificação de oócitos bovinos maturos e imaturos, com estreita proximidade entre as
gotículas lipídicas, mitocôndrias e retículo endoplasmático [23]. Contudo, a congelação
lenta de oócitos imaturos inclusos em tecido ovariano bovino mostrou-se eficiente na
preservação dos retículos endoplasmáticos (liso e rugoso), não sendo perceptíveis
alterações nessas organelas [18].
Em tecido ovariano ovino, após a congelação lenta foi observado um número
variável de vesículas, complexo de Golgi bem desenvolvido e retículos endoplasmáticos
(liso e rugoso) agregados entre si ou formando um complexo com mitocôndrias ou
vesículas [93]. Essas características evidenciam a preservação eficaz destas organelas,
uma vez que também foram observadas em tecido ovariano fresco de ovinos [32],
caprinos [97] e humanos [44]. A preservação de mitocôndrias e retículos
endoplasmáticos (liso e rugoso) também foi observada nos oócitos e células da
granulosa de ovários de camundongas submetidos ao procedimento de vitrificação [42].
As crioinjúrias resultantes da congelação lenta de tecido ovariano humano
mostram-se sutis, uma vez que após aplicação da técnica observou-se numerosos
complexos de Golgi e retículo endoplasmático liso e rugoso preservados no citoplasma
das células foliculares [71]. A vitrificação de tecido ovariano humano também não
resultou em grandes alterações nas organelas celulares, confirmado pela presença de
complexos de Golgi e retículos endoplasmáticos bem definidos e abundantes (Figura
2E) [95]. Contudo, quando a vitrificação foi empregada em oócitos maturos humanos,
complexos de Golgi foram encontrados apenas ocasionalmente e o citoplasma oocitário
mostrou-se ocupado de forma homogênea por vesículas dilatadas de retículo
endoplasmático liso, em virtude da ruptura destas organelas. Em adição, complexos
retículo endoplasmático - mitocôndrias foram encontrados esporadicamente [12].
4. Danos nucleares
A sobrevivência imediata de uma célula depende da sua capacidade de evitar
alterações no seu DNA. Apesar do grande esforço da célula para manter a integridade
do seu material genético, diversos processos desafiam essa capacidade intrínseca. Sabe-
se que a criopreservação pode resultar em fragmentação do DNA, mesmo na ausência
de deformação da morfologia celular. Porém, os mecanismos subjacentes a esses danos
ainda não são conhecidos [68]. Além disso, já foi demonstrado que os cromossomos são
muito susceptíveis a alterações decorrentes dos procedimentos de criopreservação [14].
67
Estas alterações podem ser divididas em estruturais e numéricas. As alterações
numéricas podem ainda ser subdividas em alterações na qual todo o genoma é
multiplicado (poliploidias) e alterações no qual apenas poucos cromossomos são
duplicados ou perdidos (aneuploidias) [54].
Dentre as alterações cromossômicas, a aneuploidia é a mais frequente e parece
comprometer o desenvolvimento competente do oócito [116], além de ser indicada
como o principal fator para a baixa obtenção de nascidos vivos [14,67]. Essas alterações
cromossômicas também podem ser decorrentes da criopreservação de oócitos. Van der
Elst et al. [109] observaram que ao criopreservarem oócitos de camundongas, a
formação parcial do fuso meiótico ocasiona o deslocamento cromossômico em alguns
oócitos, podendo resultar em aneuploidia ou retenção do segundo corpúsculo polar no
momento da fecundação originando, consequentemente, embriões poliplóides.
Em oócitos, o estágio de maturação (oócito imaturo ou oócito maturo) tem sido
implicado como um fator que afeta a qualidade e a competência no desenvolvimento
após criopreservação [45,76]. Os principais danos da criopreservação parecem resultar
principalmente da ruptura do fuso meiótico [89] (Figura 4) em decorrência da
sensibilidade dos microtúbulos à redução de temperatura [23]. No entanto, esse dano
pode ser minimizado pela capacidade dos microtúbulos do fuso meiótico de se
reorganizar durante o resfriamento/aquecimento [110]. As espécies bovina e humana, no
entanto, parecem possuir uma menor capacidade de recuperação do fuso meiótico
devido à falta de material pericentriolar em alguns oócitos [110]. Essas alterações nos
microtúbulos são de fundamental importância para o desenvolvimento de um oócito
competente, pois os microtúbulos participam da formação do fuso meiótico e estão
associados com a segregação cromossômica anormal [30].
68
Figura 4. Padrão de organização do fuso meiótico e de cromossomos em oócitos ovinos
maturos submetidos à vitrificação. Fuso normal (A) com cromossomos alinhados na
placa metafásica (A’). Fuso assimétrico (B e B’). Coluna da esquerda: marcação de β-
tubulina, coluna da direita: marcação do DNA com Hoechst. Figura concedida por
Asgari [6] e autorizada pela Elsevier.
Em oócitos de coelhas naturalmente ovulados e congelados com DMSO foi
observado um elevado número de microtúbulos em torno dos cromossomos, semelhante
ao observado em oócitos não criopreservados. No entanto, quando os oócitos foram
congelados na presença de propanodiol, o fuso meiótico não apresentava conformação
normal, além de apresentarem microtúbulos dispersos no citoplasma celular [111].
Analisando-se oócitos suínos imaturos submetidos à vitrificação, foi observada uma
redução de oócitos com organização do fuso normal (79,5% no controle ou não
vitrificado vs 10,1% vitrificado) e, consequentemente, um aumento de oócitos com fuso
anormal (15,6% controle vs 46,5% vitrificado) e ausente (4,8% controle vs 43,2%
vitrificado). Curiosamente, os oócitos vitrificados mantiveram o alinhamento
cromossômico regular, mesmo quando apresentavam fuso anormal. Quando avaliada a
percentagem de F-actina (componente dos microfilamentos que formam o fuso
meiótico) foi observado que a vitrificação de oócitos imaturos (VG) parece ser mais
deletéria aos microfilamentos do que a vitrificação de oócitos maturos (16,9 vs 37,2%
respectivamente). Contudo, o procedimento de vitrificação, independente do estágio de
maturação oocitária, mostrou uma redução no percentual de normalidade do fuso
quando comparado a oócitos frescos (72,3%) [117].
69
Após vitrificação de oócitos maturos de camundongas observou-se uma
redução de cromossomos normais de oócitos desnudos vitrificados (67,2%) quando
comparados a oócitos frescos (80,4%). Além disso, a taxa de fuso meiótico normal
reduziu de 79,8% para 60,6%, quando os oócitos foram submetidos à vitrificação [77].
No entanto, a congelação lenta de oócitos maturos de camundongas parece ser mais
danosa ao fuso meiótico, visto que o formato de barril característico do fuso meiótico
foi reduzido de 97% em oócitos não criopreservados para 18% em oócitos congelados.
Os demais oócitos congelados exibiram características anormais do fuso como por
exemplo, fuso fusiforme ou retração nos pólos. A congelação lenta também resultou em
menor percentual de cromossomos corretamente alinhados (78%) quando comparados a
oócitos não congelados (97%) [30]. Em oócitos maturos ovinos vitrificados, também foi
perceptível a redução do alinhamento cromossômico normal (79,14% em oócitos
frescos vs 11,11% em oócitos vitrificados) [6].
Em pesquisa realizada com embriões humanos foi observado que a
sobrevivência embrionária pós-congelação está relacionada com o número de células,
cujo núcleo foi preservado, e a redução da sobrevivência embrionária foi relacionada
com o maior número de células do embrião no momento da criopreservação [101],
sugerindo que embriões em estágio mais avançado podem ser mais susceptíveis às
crioinjúrias. A vitrificação de embriões suínos resultou em um acréscimo na perda de
gestações [67] correlacionada principalmente com aneuplodia [14]. No entanto, ainda
não é conhecido o mecanismo exato pelo qual essas alterações cromossômicas são
ocasionadas nem o estágio ao qual o embrião está mais vulnerável aos danos nucleares.
V. CONCLUSÃO
A criopreservação é uma importante alternativa para a preservação de gametas
e embriões, sendo, por isso, bastante aplicada para armazenar o material genético de
animais com alto valor zootécnico, bem como restaurar a fertilidade de mulheres após
tratamentos oncológicos. Contudo, este procedimento submete as células a condições
desfavoráveis que podem comprometer a recuperação celular após
descongelação/aquecimento. Conforme apontado no decorrer desta revisão, diversos
autores têm demonstrado que a causa na redução da sobrevivência de oócitos, folículos
ovarianos (presentes ou isolados do tecido ovariano) e embriões após criopreservação
está relacionada com danos em diferentes compartimentos e estruturas celulares. Essas
70
estruturas são essenciais para o metabolismo e viabilidade da célula e, portanto, a
aplicação de um protocolo de criopreservação capaz de manter essas estruturas intactas
deve levar em conta o grau de desenvolvimento, tipo e número de células.
Declaration of interest. The authors report no conflicts of interest. The authors alone
are responsible for the content and writing of the paper.
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82
7. CAPÍTULO 2
Desenvolvimento de um novo dispositivo de vitrificação
Development of a new vitrification device
Depósito de Patente ao Instituto Nacional de Propriedade Industrial (INPI).
83
RESUMO
O presente capítulo refere-se à invenção de um dispositivo inovador para a
criopreservação de tecido ovariano de cabras. Esse novo dispositivo é um sistema
fechado que evita o contato direto do tecido ovariano com o nitrogênio líquido,
prevenindo assim, a contaminação com patógenos resistentes a temperaturas criogênicas
(-196oC). O novo dispositivo também fornece maior facilidade na adição e retirada das
soluções de vitrificação e remoção dos agentes crioprotetores, além de permitir que
vários fragmentos de tecido ovariano sejam vitrificados simultaneamente. Devido à sua
forma e tamanho, esse dispositivo também permite a vitrificação de hemi ou ovário
inteiro. A presente invenção se situa no campo da Biotecnologia e por seu caráter
confidencial, o Relatório Descritivo de Patente de Invenção enviado ao INPI não está
inserido nesta tese. Contudo, uma breve descrição pode ser obtida a partir dos artigos
científicos publicados com a utilização deste dispositivo (capítulos subsequentes).
Palavras-chave: Patente. Sistema fechado. Técnica de vitrificação.
84
Dispositivo de criopreservação e processos de vitrificação e aquecimento
utilizando tal dispositivo
Ana Paula Ribeiro Rodrigues; José Ricardo de Figueiredo; Adeline de Andrade
Carvalho; Luciana Rocha Faustino; Simone Vieira Castro; Cleidson Manoel Gosmes da
Silva
Atualmente, a vitrificação tem sido bastante utilizada para a criopreservação de
tecido ovariano, por minimizar os danos causados pela formação intracelular de gelo,
comumente observada no processo de congelação lenta. Para isso, vários pesquisadores
têm desenvolvido diferentes técnicas de vitrificação, nas quais os focos principais são a
redução do volume da solução de vitrificação e aumento da taxa de resfriamento. De
acordo com a literatura, essas técnicas têm oferecido resultados satisfatórios. No
entanto, a grande maioria, por ser um sistema aberto, não evita os riscos de
contaminação da amostra pelo contato direto com o nitrogênio líquido. Portanto,
considerando essa problemática, ou seja, a não disponibilidade de um sistema fechado
que permita a vitrificação do tecido ovariano com um mínimo volume de solução, sem
contato direto com o nitrogênio líquido, fomos estimulados a desenvolver uma nova
técnica de vitrificação. Além dessa caracterísitca, esse novo dispositivo é manufaturado
em aço inoxidável, o que garante durabilidade e uma alta resistência à alterações de
temperatura. Além disso, pode ser reutilizado após esterilização, além de possibilitar
uma rápida troca de calor, acelerando os processos de redução de temperatura e
posterior aquecimento do material vitrificado. Por apresentar forma cilíndrica, esse novo
dispositivo garante a uniformidade da redução de temperatura por toda a amostra,
oferecendo assim maior seguraça da realização do procedimento.
A partir desta invenção realizada nesta tese, bem como pelos resultados
satisfatórios obtidos, foi solicitado ao Instituto Nacional de Propriedade Industrial
(INPI) o depósito da patente intitulada “DISPOSITIVO DE CRIOPRESERVAÇÃO E
PROCESSOS DE VITRIFICAÇÃO E AQUECIMENTO UTILIZANDO TAL
DISPOSITIVO”. A invenção tem como inventores Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro
Rodrigues; Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo; M.Sc. Adeline de Andrade Carvalho;
Dra. Luciana Rocha Faustino; M.Sc. Simone Vieira Castro; Dr. Cleidson Manoel
85
Gosmes da Silva. O pedido para o depósito de patente foi realizado no dia 19 de julho
de 2012 e a partir da obtenção do número de protocolo (Anexo 1, pág. 179), os
resultados obtidos com os experimentos realizados foram publicados em revistas
científicas. A técnica desenvolvida nesta tese também foi utilizada em projetos de
outros pós-graduandos como:
1. Estratégias para maximização ou preservação do potencial reprodutivo de fêmeas: das
células-tronco germinativas aos folículos pré-antrais. Tese de Luciana Rocha Faustino
(2013), PPGCV.
2. Criopreservação e cultivo in vitro de ovário ovino: análise de crescimento e matriz
extracelular ovariana. Dissertação de Francisca Tuelly Bandeira de Oliveira (2013),
PPGCV.
Por seu caráter confidencial, o Relatório Descritivo de Patente de Invenção,
enviado ao INPI, não pôde constar nesta tese. Contudo, breves descrições do dispositivo
bem como dos processos de vitrificação e aquecimento utilizando o referido dispositivo
também são obtidas nos capítulos subsequentes desta tese. O pedido de patente já possui
“Certificado de Adição de Invenção” pelo INPI (Anexo 2, pág. 183) e o documento
comprobatório de depósito encontra-se no Anexo 1 desta tese.
86
8. CAPÍTULO 3
A espessura do tecido pode influenciar o resultado da vitrificação de córtex ovariano
caprino
Tissue thickness may influence the outcome of vitrification of goat ovarian cortex
Periódico: Acta Scientiae Veterinariae, v. 41, p. 1150 - 1155, 2013.
87
RESUMO
A principal vantagem da criopreservação de fragmentos ovarianos é a pouca espessura
do tecido, que facilita a penetração dos agentes crioprotetores, mas o tamanho do tecido
pode não ser um fator limitante para alcançar sucesso após a criopreservação de tecido
ovariano. Essa informação é de grande significância considerando que a criopreservação
de hemi-ovário e ovário inteiro pode conservar um maior ou total contingente de
folículos primordiais presentes no ovário. Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar a
vitrificação de diferentes dimensões de tecido ovariano na morfologia, viabilidade e
diâmetro foliculares, bem como a densidade de células do estroma. Para tanto, o tecido
ovariano foi vitrificado em fragmento, hemi-ovário e ovário inteiro e, após o
aquecimento, os folículos pré-antrais foram examinados através de corante viral (azul de
tripan) e análise histológica. Os folículos pré-antrais incubados com azul de tripan
foram considerados viáveis se o oócito e células da granulosa permaneciam não
corados. Os folículos pré-antrais foram classificados como morfologicamente normais
somente quando eles continham oócito e células da granulosa intactos. O diâmetro
folicular foi mensurado considerando os eixos maior e menor de cada folículo; a média
dessas duas mensurações foi utilizada para determinar o diâmetro de cada folículo. A
densidade das células do estroma foi avaliada por calcular o número de células do
estroma em uma área de 100 × 100 µm. Não houve diferença no percentual de folículos
morfologicamente normais e viáveis após a vitrificação quando comparado ao tecido
ovariano fresco, independente da dimensão de tecido ovariano vitrificado. Além disso,
não houve diferença no diâmetro folicular quando comparadas as diferentes dimensões
de tecido ovariano vitrificadas. Entretanto, após a vitrificação foi observada uma
redução na densidade de células do estroma. Esta redução foi mais intensa após a
vitrificação de hemi-ovário e ovário inteiro. Em conclusão, a manutenção da morfologia
e viabilidade folicular demonstrou que a vitrificação de tecido ovariano caprino sob as
condições aplicadas neste estudo pode ser realizada em quaisquer das dimensões de
tecido ovariano (fragmento, hemi-ovário e ovário inteiro).
Palavras-chave: Criopreservação. Hemi-ovário. Ovário inteiro. Viabilidade celular.
88
Tissue Thickness May Influence the Outcome of Vitrification of Goat Ovarian
Cortex
Adeline de Andrade Carvalho, Luciana Rocha Faustino, Simone Vieira Castro, Cleidson
Manoel Gomes da Silva, Cláudio Cabral Campello, José Ricardo de Figueiredo & Ana
Paula Ribeiro Rodrigues
ABSTRACT
Background: The main advantage of the cryopreservation of ovarian fragments is a
thinner tissue, which facilitates the penetration of cryoprotective agents, but the size of
tissue may not be a limiting factor in achieving a successful cryopreservation of the
ovarian tissue. This information is highly significant considering that the
cryopreservation of hemi-ovary or whole ovary may preserve the entire or major part of
the contingent of primordial follicles of ovarian fragments. Therefore, the aim of this
study was to evaluate the vitrification of different dimensions goat ovarian tissue on the
follicular morphology, viability, diameter, and the stromal cell density.
Materials, Methods & Results: The ovarian tissue was vitrified as fragment, hemi-
ovary, or whole ovary, and after warming, the preantral follicles were examined by
trypan blue dye exclusion test and histological analysis. Preantral follicles incubated
with trypan blue were considered viable if the oocyte and granulosa cells remained
unstained. Preantral follicles were classified as morphologically normal only when they
contained intact oocyte and granulosa cells. The follicular diameter was measured
considering the major and minor axes of each follicle; the average of these 2
measurements was used to determine the diameter of each follicle. Ovarian stroma cells
density was evaluated by calculating the number of stromal cell in an area of 100 × 100
µm. There was no difference in the percentage of morphologically normal and viable
follicles after vitrification compared to the control (fresh tissue), regardless of the
dimension of the vitrified ovarian tissue (P> 0.05). In addition, there were no
differences in the follicular diameter after ovarian tissue vitrification, independent of the
dimension (P> 0.05). However, after vitrification, a decrease in the ovarian stromal cells
density was observed (P< 0.05). This reduction was more intense after the vitrification
89
of the hemi-ovary and whole ovary, compared to the ovarian fragment vitrification (P<
0.05).
Discussion: No differences were observed in the percentages of morphologically
normal and viable follicles from fresh or vitrified ovarian tissue (fragment, hemi-ovary,
and whole ovary). These results are in agreement with other reports that did not show
morphological changes after cryopreservation of the whole ovary, and the ovarian
fragments. With respect to follicular diameter, only the diameter of the preantral
follicles in ovarian tissue vitrified as hemi-ovary was similar to that observed in the
fresh control, in the present study. The results demonstrate that fragments and whole
ovary vitrification had greater cell dehydration (exposure to VS) and/or less cell
rehydration (VS removal), showing that minor adjustments are needed in the protocols
of cryoprotectants addition or removal from the fragments and the whole ovary.
However, this reduction in follicular diameter did not appear to have affected the
follicular architecture or cellular viability, which were maintained in all dimensions of
ovarian tissue undergoing vitrification. A reduction in the stromal cell density was
observed, especially in the hemi-ovary and whole ovary as compared to the ovarian
fragment. Previous reports have shown that ovarian stromal cells are responsible for the
production of essential substances for follicular development and these substances are
fundamental for follicles development and these cells tend to be more sensitive to
cryopreservation procedure than ovarian follicles. In conclusion, the maintenance of
follicular morphology and viability demonstrated that vitrification of goat ovarian tissue
under the conditions applied in this study can be performed in any dimension of ovarian
tissue (fragment, hemi-ovary, and whole ovary).
Keywords: cryopreservation, follicular morphology, ovarian tissue thickness, stromal
cell density.
90
INTRODUCTION
The cryopreservation of ovarian tissue has as its main objective to safeguard
female fertility by preserving thousands of preantral follicles enclosed in the ovarian
cortex [4]. Among the livestock species, goats are a commercially interesting species
[20] and, therefore, efforts have been made to develop germplasm banks for the genetic
preservation of animals possessing higher value [5]. Moreover, because the ovary
dimensions from goats and sheep are similar to those from human [21], these species
are considered as viable alternatives to achieve cryopreservation protocols in humans.
The ovarian tissue of ruminants has been cryopreserved in fragments [11] or
even as hemi-ovary [2] or whole ovary [10]. The main advantage of the
cryopreservation of ovarian fragments is to have a thinner tissue, which facilitates the
penetration of cryoprotective agents [17], but the size of tissue may not be a limiting
factor in achieving a successful cryopreservation of the ovarian tissue [16]. This
information is highly significant considering that the cryopreservation of hemi-ovary or
whole ovary may preserve the entire or major part of the contingent of primordial
follicles that, when transplanted, can increase the chances of pregnancy [14].
The success of sheep ovarian tissue cryopreservation, for example, has been
demonstrated by birth of healthy offspring after transplantation of different dimensions
(ovarian fragments [9]; hemi-ovary [2]; whole ovary [10]). However, in goats, only the
cryopreservation of ovarian tissue fragments has been reported [19].
The aim of this study was to evaluate the influence of different dimension of
ovarian tissue (fragment, hemi-ovary, or whole ovary) on the ovarian stroma cells
density, preantral follicles morphological changes, and preantral follicles viability
enclosed in goat ovarian tissue vitrified.
MATERIALS AND METHODS
Collection and vitrification of goat ovarian tissue
Ovaries were collected at a local abattoir from adult crossbred goats (n = 5).
Immediately postmortem, ovaries were washed in 70% alcohol, followed by two washes
in HEPES-buffered minimum essential medium (MEM1) supplemented with antibiotics
(100 µg/mL penicillin1
and 100 µg/mL streptomycin1). This medium was also used to
transport ovaries (at 20°C) to the laboratory, within 1 h after they were recovered. In the
91
laboratory, ovaries (average size 1.4×0.9×0.5 cm) were divided into 2 halves, in which a
hemi-ovary was cut into small fragments (3×3×1 mm), parts of which were either
immediately used a fresh control or subjected to the vitrification procedure. The
remaining hemi-ovary, and the other whole ovary were also cryopreserved, resulting in
3 dimensions for ovarian tissue vitrification: fragments, hemi-ovary, and whole ovary.
The vitrification solution 1 (VS1) was composed of MEM supplemented with 10%
ethylene glycol2 (EG), 10% dimethylsulfoxide
2 (DMSO), 0.25M sucrose
1, and 10
mg/mL bovine serum albumin (BSA1). The vitrification solution 2 (VS2) had the same
composition of VS1, except that the concentration of cryoprotectants was increased
(20% EG and 20% DMSO). The ovarian fragments were exposed to VS1 for 4 min, and
VS2 for 1 min. To vitrify the hemi-ovaries and whole ovaries, both were exposed to
VS1 and VS2 for 8 and 2 min, respectively. The solutions were perfused through hilum
into whole ovaries. All the tissue dimensions were vitrified using a cryodevice
according to the logistics of the solid surface vitrification. This device is a cylinder
made by stainless steel, a good conductor of heat, which enables rapid temperature
reduction. Moreover, this device has a lid to be closed, avoiding tissue contact with
liquid nitrogen during vitrification. After cryostorage (up to 1 week), the vitrified
material was removed from the liquid nitrogen and warmed by maintaining the device at
room temperature (~25°C; 1 min for ovarian fragments and hemi-ovaries, and 2 min for
whole ovaries) followed by immersion in water bath at 37°C (ovarian fragments: 30 s;
hemi-ovary: 1 min, and whole ovary: 2 min). After warming, the cortical tissue from
hemi-ovary and whole ovary were cut into small fragments (3×3×1 mm). For each
treatment (fresh control, fragment, hemi-ovary and whole ovary) two samples (i.e.
fragments) of ovarian tissues were used for histological and viability analysis. The VS
removal was performed by in a three-step equilibrium (5 min each) in (i) MEM + 3
mg/mL BSA + 0.5 M sucrose, (ii) MEM + 3mg/mL BSA + 0.25 M sucrose, and finally
(iii) MEM + 3 mg/mL BSA.
Histological analysis
The ovarian fragments were fixed in Carnoy’s solution (4 h), embedded in
paraffin, serially sectioned (7 µm) and were stained with Hematoxylin-Eosin. Only
preantral follicles with visible nuclei were counted. Preantral follicles (one or more
layers of granulosa cells and no antral cavity, i.e., primordial, primary, and secondary
follicles) were classified as morphologically normal only when they contained intact
92
oocyte and granulosa cells (Figure 1A). The follicular diameter was measured using
Nikon NIS Elements software, considering the major and minor axes of each follicle;
the average of these 2 measurements was used to determine the diameter of each
follicle. Thirty follicles were analyzed per treatment. Ovarian stroma cells density was
evaluated by calculating the number of stromal cell in an area of 100 × 100 µm (Figure
1B). For each treatment, ten fields per slide were assessed and the mean number of
stromal cell per field was calculated [8].
Viability analysis
The preantral follicles were isolated mechanically from all treatment using the
method of Lucci [12]. Briefly, samples were cut into small pieces with a tissue chopper3
adjusted to a sectioning interval of 75 µm. Samples were placed in MEM supplemented
with 3 mg/mL BSA, and suspended 100 times with a large Pasteur pipette (inner
diameter ~1600 µm), followed by 100 times with a smaller Pasteur pipette (inner
diameter ~600 µm) to dissociate preantral follicles from stroma. The obtained material
was then passed through a 200 µm nylon mesh filter. This procedure was performed
within 10 min at room temperature (RT; approximately 25°C). The viability of preantral
follicles was assessed by the trypan blue dye exclusion test. Briefly, 5 µL of 0.4%
trypan blue was added to 100 µL of isolated and suspended preantral follicles, which
were incubated for 1 min at RT [4]. Afterwards, follicles were examined with an
inverted microscope4
and classified as viable if the oocyte and granulosa cells remained
unstained (Figure 1C).
Statistical analysis
For all data, Kolmogorov-Smirnov and Bartlett tests were used to confirm
normal distribution and homogeneity of variances, respectively. The percentages of
morphologically normal, stromal cell density and follicular diameters were submitted to
ANOVA followed Student-Newman-Keuls test. The percentages of viable follicles were
compared by Chi-Square test. For all the statistical analyses, P< 0.05 was considered
significant, and the results were expressed as mean ± SD.
93
Figure 1. Morphological characteristics and viability of preantral follicles enclosed in
different dimensions of goat ovarian tissue. (A1-A2) Photomicrograph of
morphologically normal goat preantral follicles in the fresh control (A1) and atretic
preantral follicle after the cryopreservation of the whole ovary (A2). Note the
measurement of follicular diameter in A1, obtained by performing by 2 transverse
measurements. In A2, the follicular degeneration is evidenced by a retraction of the
ooplasm (black arrow) and nuclear pyknosis (*) [Bar = 15 µm]. (B1-B2)
Photomicrographs of ovarian stroma with normal (fresh control; B1) and reduced
(whole ovary; B2) cell density. Observe the marking areas randomly selected for
evaluation [Bar= 50 µm]. (C1-C2) Images of preantral follicles unstained, viable follicle
(fresh control; C1) and stained, non-viable follicle (hemi-ovary; C2), with trypan blue
[Bar = 20 µm].
RESULTS
Follicular morphology displayed no significant variation among
morphologically normal preantral follicles obtained from fresh control (68.80%) and
preantral follicles from vitrified tissue in fragment (61.40%), hemi-ovary (53.80%), and
whole ovary (56.00%, P> 0.05) [Table 1]. Similar results were observed for follicular
viability under these 3 vitrification conditions, i.e., fragment (90.00%), hemi-ovary
(93.33%), and whole ovary (93.33%).
The stromal cell density was reduced after vitrification, irrespective of the
tissue thickness, compared to the fresh control (355.98 cells; P< 0.05). Moreover, this
94
reduction post vitrification was significantly higher in hemi-ovary (239.24 cells) and
whole ovary (216.08 cells) as compared to the reduction observed after the vitrification
of ovarian fragments (299.66 cells; P< 0.05).
The measurement of the follicular diameter before (fresh control) and after
cryopreservation in the different dimensions of ovarian tissue showed that only the
vitrification in hemi-ovary (31.33 µm) maintained follicular diameter similar to the
fresh control (33.08 µm; P> 0.05). However, no significant reduction in the follicular
diameter (Table 1) was observed among the different dimensions of vitrified ovarian
tissue, i.e., fragment (30.07 µm), hemi-ovary (31.33 µm), and whole ovary (29.49 µm).
Table 1. Morphology, viability, follicular diameter, and stromal cell density after
ovarian tissue vitrification at different dimensions (fragment, hemi-ovary, and whole
ovary).
Treatments Morphologically normal
preantral follicles (%)
(mean ± SD)*†
Viable
preantral
follicles (%)*†
Follicular
diameter (µm)
(mean ± SD) *
Stromal cells density
(cells/100 x 100 µm)
(mean ± SD) *
Fresh control 68.80 ± 6.50A
93.33A
33.08 ± 6.18A
355.98 ± 40.15A
Fragment 61.40 ± 7.02A
90.00A
30.07 ± 4.28B
299.66 ± 33.49B
Hemi-ovary 53.80 ± 10.66A
93.33A
31.33 ± 4.58AB
239.24 ± 43.97C
Whole ovary 56.00 ± 9.46A
93.33A
29.49 ± 3.01B
216.08 ± 17.12C
*Five animals were used. †For each treatment, two samples: one sample to histological
analysis and another one to viability analysis were used for each animal. Ovarian tissues
samples were obtained from hemi-ovary and whole ovary after vitrification. A,B,C
Different superscripts letters indicate statistically significant differences (P< 0.05).
DISCUSSION
The results of this study showed that vitrification of ovarian fragments as either
hemi-ovary or whole ovary can be used for the cryopreservation of goat ovarian tissue.
This observation is supported by the fact that no differences were observed in the
percentages of morphologically normal and viable follicles from fresh or vitrified
ovarian tissue (fragment, hemi-ovary, and whole ovary). These results are in agreement
95
with other reports which showed that morphological changes observed after
cryopreservation of the whole ovary [1], and the ovarian fragments [11] were similar to
those obtained from fresh tissue.
With respect to follicular diameter, only the diameter of the preantral follicles
in ovarian tissue vitrified as hemi-ovary was similar to that observed in the fresh
control, in the present study. The results demonstrate that fragments and whole ovary
vitrification had greater cell dehydration (exposure to VS) and/or less cell rehydration
(VS removal), showing that minor adjustments are needed in the protocols of
cryoprotectants addition or removal from the fragments and the whole ovary. However,
this reduction in follicular diameter did not appear to have affected the follicular
architecture and cellular viability, which were maintained in all dimensions of ovarian
tissue undergoing vitrification. The trypan blue is a vital dye which is only able to enter
cells with compromised membranes and color them blue [6]. The histological
assessment of viability by trypan blue proves to be a reliable method [13,18], and it is
noteworthy that the trypan blue dye exclusion test has been successfully used to
evaluate viability of preantral follicles after cryopreservation and in vitro culture in mice
[3], goats [20] and women [7].
In the present study, a reduction in the stromal cell density was also observed,
especially in the hemi-ovary and whole ovary as compared to the ovarian fragment. We
reiterated prior hypothesis that lesser thickness in the fragments might have favored
both ovarian perfusion of cryoprotectants as well as a uniform reduction of temperature
throughout the entire length of the ovarian tissue, which in turn may have minimized the
damage to the ovarian stromal cells. Additionally, previous reports have shown that
ovarian stromal cells are responsible for the production of essential substances for
follicular development, i.e., growth factors and peptides [15]. These substances are
fundamental for follicles development in vivo or in vitro after cryopreservation and
these cells tend to be more sensitive to cryopreservation procedure than ovarian follicles
[8]. Thus, an evaluation of ovarian stromal cells can be a valuable tool in establishing
cryopreservation protocols owing to the greater sen-sitivity of these cells, which may
show cryoinjuries in the ovarian tissue not easily observed in the follicular analysis.
In conclusion, the maintenance of follicular morphology and viability
demonstrated that vitrification of goat ovarian tissue under the conditions applied in this
study can be performed in any dimension of ovarian tissue (fragment, hemi-ovary, and
whole ovary). A more accurate analysis of ovarian tissue should be addressed in order
96
to reveal changes in the hemi-ovary and whole ovary, which were not detect by
histological analysis, as ultrastructural or functional changes that could be observed by
transmission electron microscopy and in vitro culture/transplantation, respectively.
SOURCES AND MANUFACTURERS
1Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA.
2Dinâmica Química, Diadema, SP, Brazil.
3The Mickle Laboratory Engineering Co., Gomshal, Surrey, UK.
4Nikon, Tokyo, Japan.
Ethical approval. This experiment was approved and performed under the guidelines of
Ethics Committee for Animal Use of State University of Ceará.
Declaration of interest. The authors report no conflicts of interest. The authors alone
are responsible for the content and writing of the paper.
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97
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99
9. CAPÍTULO 4
Novo método de grande capacidade inovadora para vitrificação de caprinos ovários:
Ovarian Tissue Cryosystem (OTC)
Novel wide-capacity method for vitrification of caprine ovaries: Ovarian Tissue
Cryosystem (OTC)
Periódico: Animal Reproduction Science, v. 138, n. 3-4, p. 220 - 227, 2013.
100
RESUMO
O objetivo deste estudo foi verificar a eficiência de uma nova técnica para vitrificação
de tecido ovariano sem o contato direto com o nitrogênio líquido, o Ovarian Tissue
Cryosystem (OTC). De cada par ovariano, fragmentos foram imediatamente
recuperados e fixados para análise (controle fresco) ou o tecido ovariano foi
fragmentado em diferentes dimensões (fragmento, hemi-ovário, ovário inteiro), sendo
parte do tecido posteriormente cultivada in vitro por dois dias. A vitrificação foi
realizada utilizando o OTC. O OTC consiste de uma estrutura cilíndrica feita de aço
inoxidável e composta por três peças (base, insert e tampa), as quais podem ser
fechadas, evitando o contato com o nitrogênio líquido durante o procedimento de
vitrificação. Antes e após o cultivo in vitro o tecido ovariano foi avaliado por histologia.
Independente da dimensão de tecido vitrificada foi observada uma redução (P<0,05) no
percentual de folículos morfologicamente normais no tecido ovariano submetido à
vitrificação quando comparado ao controle fresco. Além disso, a análise ultra-estrutural
demonstrou uma grande extensão de degeneração folicular quando realizada a
vitrificação de ovário inteiro. A manutenção da morfologia folicular após o cultivo in
vitro foi maior quando a vitrificação foi realizada em fragmentos ovarianos quando
comparada vitrificação realizada em hemi-ovário e ovário inteiro. Em conclusão, o
Ovarian Tissue Cryosystem (OTC) abre novas possibilidades para a vitrificação de
fragmentos de tecido ovariano caprino.
Palavras-chave: Criopreservação. Folículos pré-antrais. Tecido ovariano. Ultraestrutura.
101
Novel wide-capacity method for vitrification of caprine ovaries: Ovarian Tissue
Cryosystem (OTC)
A.A. Carvalho a,∗, L.R. Faustino
a, C.M.G. Silva
a, S.V. Castro
a, C.A.P. Lopes
a, R.R.
Santosb,c
, S.N. Báod, J.R. Figueiredo
a, A.P.R. Rodrigues
a
aLaboratory of Manipulation of Oocytes and Preantral Follicles, Faculty of Veterinary,
State University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil
bFaculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, Utrecht, The Netherlands
cAnimal Science Post-graduation Program, Federal University of Pará, Brazil
dLaboratory of Microscopy, Department of Cell Biology, University of Brasília,
Brasília, DF, Brazil
ABSTRACT
In this study we aimed testing the efficiency of a newly developed device for
vitrification of ovaries without contact with liquid nitrogen, Ovarian Tissue Cryosystem
(OTC). From each ovarian pair, fragments were recovered and immediately fixed for
analysis (fresh control) or submitted to vitrification (fragments, hemi-ovary or whole
ovary), either or not followed by in vitro culture for two days. Vitrification was
performed using the OTC system. The OTC is a cylindrical structure made by stainless
steel and composed by three pieces (basis, insert and cover), which can be hermetically
closed avoiding contact of the tissue with liquid nitrogen during vitrification. Before
and after culture, the ovarian tissue was histologically evaluated. Independently from
the size of the ovarian tissue, it was observed a decrease (P < 0.05) in the rates of
normal preantral follicles when fragments (58.1%), hemi-ovary (54.4%) and whole
ovary (54.3%) were vitrified, in comparison with fresh control (68.1%). These data
were confirmed by ultrastructural analysis, which showed a great extension of
degeneration in follicles vitrified in the whole ovary. Follicular survival after
vitrification followed by culture was higher (P < 0.05) when ovarian fragments were
vitrified (36.1%) than in those enclosed in vitrified hemi-ovary (22.3%) or whole ovary
102
(18.4%). In conclusion, the Ovarian Tissue Cryosystem (OTC) opens a new possibility
for successful vitrification of caprine ovarian fragments.
Keywords: Cryopreservation. Goat. Preantral follicles. Ovary.
103
1. Introduction
Cryopreservation of ovarian tissue has been applied in clinical practice since
the reports of ovarian function recovery in human (Aubard et al., 2001), domestic
animals (Wallin et al., 2009; Arav et al., 2010) and endangered species (Shaw et al.,
2000). The main advantage of this technique is the preservation of oocytes enclosed in
primordial follicles (Lin et al., 2008). The success of ovarian tissue cryopreservation
can be recognized by the live birth in different animal species (mice: Takahashi et al.,
2001; Chen et al., 2006; rabbit: Almodin et al., 2004; birds: Liu et al., 2010; sheep:
Salle et al., 2003; Bordes et al., 2005; and human: Donnez et al., 2004, 2012; Sánchez-
Serrano et al., 2010; Dittrich et al., 2012; Revelli et al., 2013). All human live births
from cryopreserved ovarian tissue, until now has been obtained after a slow freezing
program. However, there is still a discussion about which method is better for tissue
cryopreservation. The slow freezing has the advantage of better diffusion of solutes
during freezing (Dittrich et al., 2007). Nevertheless, the vitrification can also be an
extremely valuable technique for cryopreservation of complex systems, such as tissues
and whole organs, due to possibility of avoiding ice formation (Fahy et al., 2006;
Dittrich et al., 2007).
This technique has gained attention because the formation of hexagonal
intracellular crystal ice is avoided (Keros et al., 2009), and often can be performed
without equipment. There are many strategies to perform vitrification of cells and
tissues. Among them, the use of plastic cryovals or straws are reported (Rahimi et al.,
2004; Bordes et al., 2005). However, the polypropylene or polyvynil chloride is not a
good heat conductor, which can compromise the chilling rates in the material to be
vitrified (Sansinena et al., 2012). As an attempt to increase the rate of vitrification,
techniques such as solid-surface vitrification has been applied, resulting in the
preservation of follicular morphology and viability (Santos et al., 2007), as well as in
the preservation of the oocyte ultrastructure (Lunardi et al., 2012). However, when used
an open system, the sample exposure to the nitrogen vapour may allow the exposure to
pathogens resistant to cryogenic temperatures (Grout and Morris, 2009). The risk of
contamination is also observed in other vitrification techniques such as the cryotissue
(Kagawa et al., 2009), the needle immersed vitrification (Wang et al., 2008) and the
direct cover vitrification (Zhou et al., 2010). In all these used techniques, the rates of
success are variable and tissue may be directly exposed to liquid nitrogen or its vapour.
104
Therefore, to improve heat exchange without expose the ovarian tissue to
contaminants, we have developed a device for the vitrification of caprine ovarian tissue.
Such a device, so-called Ovarian Tissue Cryosystem (OTC) will also facilitate the
vitrification process in all phases, i.e. cryoprotectant equilibrium, heat exchange, tissue
storage, and cryoprotectant removal. Furthermore, it should be applied to vitrify
simultaneous several ovarian tissue fragments, large tissue pieces (hemi-ovary) or even
the whole ovary.
2. Materials and methods
This experiment was approved and performed under the guidelines of Ethics
Committee for Animal Use of State University of Ceará. Except where otherwise stated,
all chemicals were obtained from Sigma (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA).
2.1 Collection and preparation of goat ovarian tissue
Ovaries from adult goats (n=5) were collected at a local slaughterhouse.
Immediately post-mortem, ovaries were washed once in 70% alcohol for 10 s, followed
by two washes in HEPES-buffered minimum essential medium (MEM) supplemented
with 100 µg/mL penicillin and 100 µg/mL streptomycin. This medium was also used to
ovaries transportation (at 20 °C) to the laboratory, within 1 h after they were collected.
At the laboratory, for each ovarian pair, one ovary was divided into two halves.
From one hemi-ovary, small fragments (3 mm × 3 mm × 1 mm) were obtained. Part of
the fragments were either immediately destined to non-vitrified tissue (fresh control) or
submitted to the vitrification procedure. The remaining ovary as well as the other hemi-
ovary were also used for the same vitrification procedure used for the fragments. For the
vitrification procedure a new cryodevice called Ovarian Tissue Cryosystem (OTC) was
developed by our team. Both non-vitrified tissue and vitrified tissues (fragment, hemi-
ovary, whole ovary) were cultured for 2 days, and subsequently analyzed by light
microscopy and transmission electronic microscopy (Fig. 1).
105
Fig. 1. Experimental design to assess the effect of vitrification of different dimensions
of ovarian tissue (fragment, hemi-ovary, whole ovary) on the morphology of goat
preantral follicles. LM: light microscopy; TEM: transmission electronic microscopy;
IVC: in vitro culture.
2.2 Vitrification and warming procedures by OTC
Vitrification of ovarian fragments, hemi-ovary or whole ovary was performed.
Equilibrium of the samples in the vitrification solution (VS) was performed gradually in
two steps: (i) VS1 contained MEM supplemented with 10 mg/mL BSA, 0.25 M sucrose,
10% ethylene glycol (EG) (Dinâmica - Dinâmica Química, Diadema, Brazil) and 10%
dimethyl sulfoxide (DMSO) (Dinâmica). Similarly, (ii) VS2 was composed of MEM
supplemented with 10 mg/mL BSA, 0.25 M sucrose, 20% EG and 20% DMSO. The
fragments were initially exposed to VS1 for 4 min. Subsequently, they were exposed to
VS2 for 1 minute. Regarding exposure of the hemi-ovaries to the VS1 for 8 min and
VS2 during 2 min, the tissue was randomly punctured before the ovary was exposed to
the cryoprotectant as previously described (Kim et al., 2010). The whole ovaries were
perfused through the hilum by a needle (31 G). Subsequently, the vitrification solution
(2 mL) was slowly injected (10 seconds), after which the whole ovary was immersed in
the vitrification solution. The same procedure was performed for VS1 and VS2. The
whole ovaries remained immersed for 8 min in VS1 and for 2 min in VS2. All
procedures for exposure to cryoprotectant agents to vitrification were performed in
OTC, which was closed and immediately immersed and stored in liquid nitrogen for one
106
week. For the warming, OTC containing the vitrified samples was exposed to room
temperature (∼25°C) (1 minute for ovarian fragments and hemi-ovary, and 2 min for
whole ovaries), then OTC was immersed at 37°C in a water bath for 30 seconds
(ovarian fragments), 1 minute (hemi-ovary), and 2 min (whole ovary). After warming,
both hemi-ovary and whole ovary were fragmented in pieces of 3x3x1 mm and
submitted to VS removal, as well as the ovarian fragments. VS removal was performed
by in a three-step equilibrium (5 min each) in (i) MEM + 3 mg/mL BSA + 0.5 M
sucrose, (ii) MEM + 3mg/mL BSA + 0.25 M sucrose, and finally (iii) MEM + 3 mg/mL
BSA.
2.3 Ovarian Tissue Cryossystem (OTC)
As shown in Fig. 2, OTC is a cylindrical structure composed by three
structures: (i) a basis (2.1 cm height; 2.8 cm diameter and 0.2 cm thickness), in which
the samples are placed, (ii) an insert (2.8 cm height; 2.3 cm diameter and 0.1 cm
thickness) containing 20 perforation to allow exposure and removal of VS, and (iii) a
cover (2.0 cm height; 2.8 cm diameter and 0.2 cm thickness) to close the device
hermetically. The insert is necessary to reduce the tissue surrounding media and speed
up the ultrarapid cooling which is necessary in vitrification. The OTC is made by
stainless steel, and it can support temperatures lower than −196°C and higher than 200
°C under high pressure, allowing its sterilization and reutilization.
2.4 In vitro culture
Non-vitrified (fresh control) and vitrified ovarian tissues were cultured during
2 days. The in vitro culture was performed at 39°C in 5% CO2 in a humidified
incubator, and all media were incubated for 1 hour before use. The culture medium
consisted of α-MEM (pH 7.2-7.4) supplemented with ITS (1.0 mg/mL insulin, 5.5
mg/mL transferrin, and 5.0 ng/mL selenium), 2 mmol/L glutamine, 2 mmol/L
hypoxantine, 1.25 mg/mL BSA, 50 µg/mL ascorbic acid, 50 µg/mL recombinant follicle
stimulating hormone (rFSH), and 100 µg/mL penicillin-streptomycin (Faustino et al.,
2010).
107
2.5 Histological analysis
Samples were fixed in Millonig’s solution (phosphate-buffered 40% vol/vol
formaldehyde in water) for 12 h, dehydrated in a graded series of ethanol, clarified with
xylene, embedded in paraffin wax, and serially sectioned into 7 µm sections. Every fifth
section was mounted on a glass slide, stained with hematoxylin-eosin (HE), and
evaluated using a light microscope (Nikon, Tokyo, Japan) at magnification of 400x. In
each treatment, a total of 150 preantral follicles (30 per animal) were examined, which
were defined as an oocyte surrounded either by one layer flattened or cuboidal
granulosa cells, or several layers cuboidal granulosa cells without antrum. The quality
of the preantral follicles was classified according to the parameters previously described
(Pinto et al., 2008). Briefly, morphologically normal follicles contained an intact oocyte
and granulosa cells, whereas degenerated follicles contained an oocyte with a pyknotic
nucleus, ooplasma shrinkage and/or granulosa cell layers that had disorganized and
detached from the basement membrane. To avoid evaluating and counting the same
follicle more than once, preantral follicles were analyzed only in the sections in which
an oocyte nucleus was observed.
2.6 Transmission electron microscopy
Ultrastructural analysis was performed using preantral follicles obtained from
non-vitrified tissue (fresh control), vitrified (fragment, hemi-ovary and whole ovary)
and fragment and hemi-ovary cultured in vitro. Briefly, small pieces of ovarian cortex
with maximum dimension of 1 mm3 were fixed in Karnovsky solution (2%
paraformaldehyde and 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer pH 7.2)
for 3 hours at RT. After fixation, the specimens were rinsed in buffer and post-fixed in
1% osmium tetroxide, 0.8% potassium ferricyanide and 5 mM CaCl2 in 0.1 M sodium
cacodylate buffer for 1 hour at RT and in-block contrasted with uranyl acetate.
Subsequently the samples were dehydrated in acetone and embedded in Spurr resin.
Semi-thin sections (4 μm) were cut and stained with toluidine blue and analysed by light
microscopy at 400x magnification. Ultra-thin sections (70 - 75 nm) were obtained from
preantral follicles that were classified as morphologically normal in semi-thin sections
according to standard histological criteria. Then, ultra-thin sections were examined
under a transmission electron microscope (Jeol JEM 1011, Jeol, Tokyo, Japan)
108
operating at 80 kV. The density and integrity of ooplasmic and granulosa cell
organelles, as well as vacuolization, and basement membrane integrity were evaluated.
Fig. 2. Ovarian Tissue Cryosystem: New stainless steel device developed for the
vitrification procedures. (A) OTC opened enabling the visualization of its 3 constituent
parts: basis (a), insert (b) cover (c). Note the perforations in the upper portion of the
insert to facilitate placement and removal of solutions. (B) Exposure of the tissue (hemi-
ovary) to vitrification solution in the basis of the OTC. (C) Inclusion of the insert in the
basis of the OTC allows for observation of aseptic handling of the insert. (D) Closure of
the basis, with the insert already enclosed, with the cover of the OTC. (E) Storage of
OTC, containing the sample to be vitrified in the liquid nitrogen dewars. Note that this
system prevents contact of the vitrified sample with liquid nitrogen.
109
2.7 Statistical analysis
Percentages of morphologically normal follicles were initially submitted to
Kolmogorov-Smirnov and Bartlett tests to confirm normal distribution and homogeneity
of variances, respectively. The percentages of morphologically normal follicles were
compared using one-way ANOVA. The differences were considered to be significant
when P < 0.05 and results were expressed as mean ± standard error of means (SEM).
3. Results
3.1 Histological analysis
A total of 1200 preantral follicles (150 follicles/ treatment) were analyzed.
Morphological features of normal and atretic preantral follicles are shown in Fig. 3.
Immediately after warming (non-cultured tissue), the percentages of normal follicles
was decreased (P < 0.05) in comparison with fresh control (68.1%), independently on
the tissue size, i.e. fragment (58.1%), hemi-ovary (54.5%) or whole ovary (54.3%).
However, no differences (P > 0.1) were found due to tissue size (Table 1).
Fig. 3. Photomicrographs of goat ovarian cortical histological sections. (A) Normal
primordial follicle. (B) Degenerated follicles with retraction of ooplasm. Nu, nucleus;
GC, granulosa cells; arrows, shrunken ooplasm.
After IVC, the percentages of normal follicles was also decreased (P < 0.05) in
vitrified-warmed samples in comparison with cultured control. Only freshly culture
ovarian tissue (cultured control) preserved similar percentages of normal follicles as in
110
the fresh control. Furthermore, vitrification of ovarian fragments presented greater (P <
0.05) rates of normal preantral follicles (36.1%) than those vitrified as hemi-ovary
(22.3%) and whole ovary (18.4 %).
Table 1
Percentage of morphologically normal preantral follicles enclosed in fresh ovarian
tissue and vitrified into fragments, hemi-ovary or whole ovary, before and after in vitro
culture.
Treatments Non-cultured
(%)
In vitro culture
(%)
Control 68.1 ± 1.4 Aa
55.1 ± 2.1 Aa
Fragment vitrified 58.1 ± 0.6 Ba
36.1 ± 1.6 Bb
Hemi-ovary vitrified 54.4 ± 1.5 Ba
22.3 ± 0.9 Cb
Whole ovary vitrified 54.3 ± 0.8 Ba
18.4 ± 0.8 Cb
Data are mean ± SEM. A,B,C
Different upper-case letters within a column indicate
significant difference (P < 0.05).a,b
Different lower-case letters within a row indicate
significant difference before and after culture in the same treatment (P < 0.05).
3.2 Transmission electron microscopy
After ultrastructural analysis only normal follicles observed in semi-thin
sections were evaluated. The follicles from fresh control showed well-delimited
membranes, few vacuoles, and organelles uniformly distributed throughout the
cytoplasm. Round mitochondria were the most evident organelle (Fig. 4A). After
ovarian tissue vitrification fragment and hemi-ovary, the follicles were well-preserved,
similar to the fresh control, with nucleus well-delimited by the nuclear envelope, and
granulosa cells showed normal appearance. Nevertheless, we observed some discreet
changes in those follicles, e.g. presence of larger vacuoles (Fig. 4B and C). Follicles
vitrified in the whole ovary, and non-cultured, exhibited several signals of
vacuolization, multivesicular bodies in the ooplasm and granulosa cells detachment
from the oocyte (Fig. 4D). Ultrastructural analysis after IVC was performed only in
those follicles previously vitrified within ovarian fragments or hemi-ovary. Although
111
follicles from vitrified/cultured fragments presented some vacuoles, mitochondrial
shape was normal and the follicles were intact (Fig. 5A). Follicles recovered from
vitrified hemi-ovary and subsequently cultured, exhibited several vacuoles and
granulosa cells detachment from the oocyte (Fig. 5B).
Fig. 4. Electron micrographs of goat preantral follicles from fresh control (A) and after
vitrification of fragments (B), hemi-ovary (C), and whole ovary (D). Note in A, B and C
the normal follicular ultrastructure with round mitochondria and intact granulosa cells,
and a degenerated preantral follicle in D. GC: granulosa cells; O: oocyte; Nu: nucleus;
n: nucleolus; m: mitochondria; V: vacuole; arrow: nuclear envelope; *: empty spaces.
Scale bars = 5 µm.
4. Discussion
In the present study, we have developed a device, the Ovarian Tissue
Cryosystem (OTC), to improve the capacity of vitrification of several ovarian fragments
112
simultaneously and, in the future, it can be applied also for the preservation of greater
structures such as hemi-ovary and whole ovary.
Fig. 5. Electron micrographs of goat preantral follicles of in vitro cultured tissues after
vitrification of fragments (A) and hemi-ovary (B). Note in (A), a well-preserved
preantral follicle and in (B), a follicle in advanced stage of degeneration. GC: granulosa
cells; O: oocyte; m: mitochondria; V: vacuole; *: empty spaces. Scale bars = 5 µm.
Slow freezing of ovarian tissue has been indicated because of the cell
morphology preservation (Isachenko et al., 2007) and unnafected mRNA expression of
glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) (Isachenko et al., 2009) after
freezing-thawing of ovarian tissue. However, vitrification of ovarian tissue also resulted
in preserved follicular morphology and viability (Santos et al., 2007) and stromal
density (Keros et al., 2009; Ting et al., 2011). Indeed, several studies have shown no
differences when slow freezing and vitrification were compared regarding preservation
of follicular morphology (Isachenko et al., 2009; Kim et al., 2011), ultrastructure (Kim
et al., 2011), percentages of necrotic cells (Rahimi et al., 2004) and tissue
revascularization after transplantation (Rahimi et al., 2010). Vitrification, moreover, has
the advantage to avoid the formation of hexagonal ice crystals (Keros et al., 2009).
In this study, the vitrification was performed without any contact with liquid
nitrogen, avoiding the risks of contamination with pathogens that are resistant to such
temperatures (Grout and Morris, 2009). Recently, Bos-Mikich et al. (2012) also used a
closed metal container for vitrification, which also avoids the direct contact of the
sample with liquid nitrogen. However, samples were disposed in plastic cryovials after
113
be placed in the metal container to avoid contact with liquid nitrogen. Using the OTC,
the cryoprotectant exposure and removal is easily performed, without any direct contact
of the operator with the vitrification solution, and no need of cryovials or straws. This
device follows the logistic of the solid-surface vitrification method, previously
described as a successful method for caprine (Santos et al., 2007) and human (Huang et
al., 2008) ovarian tissue cryopreservation. Moreover, OTC is made of a material
resistant to mechanical shock and extreme temperature changes.
Although we have observed a decrease in the rates of normal preantral follicles
after vitrification, this is not a surprisingly finding once many other authors have found
the same independently on the applied technique (Isachenko et al., 2007; Huang et al.,
2008; Zhou et al., 2010; Carvalho et al., 2011). Such a decrease might be caused by the
osmotic stress to which cells are exposed during vitrification (Vajta et al., 1998),
toxicity of cryoprotectants (Aye et al., 2010), basement membrane impairment (Ghetler
et al., 2005) and other alterations at ionic (Gualtieri et al., 2011) or molecular (David et
al., 2011) level. Thus, we believe follicular degeneration observed in different cellular
compartments may have been influenced by such changes. The ooplasm vacuolization
was the cell damage more frequently found in this study, a result similar to the observed
by Oskam et al. (2010). Vacuolization was prominent in follicles vitrified enclosed in
hemi-ovary and whole ovary. Probably our perfusion procedure was inefficient to allow
the proper penetration of the vitrification solution in the tissue. According Wallin et al.
(2009) vitrification of ovaries from small ruminants is difficult due the large ovarian
volume, becoming difficult a proper perfusion and cryoprotectant removal after
warming, as well as may affect heat exchange, explaining our ultrastructural findings.
One must bear in mind that the success of the vitrification method can only be
evaluated by transplantation of the ovarian tissue, e.g. into the SCID-mouse (Gook et
al., 2005), because only in such conditions it is possible to evaluate tissue recovery after
ischemic stress, the period required for graft revascularization, and survival and
proliferation of stromal cells, which are essential for follicle survival and development.
However, IVC of ovarian tissue after vitrification-warming appears as a suitable and
rapid tool to indicate which protocols should be taken for further studies.
Cellular alterations were more evident after IVC. It is well known that after
cryopreservation the cells need an adaptation time (hours or days) to recover their
metabolism allowing the identification of the cell alterations or even death (Rahimi et
al., 2004; Choi et al., 2008). Furthermore, Men et al. (2003) have shown that
114
cryopreservation makes follicles less tolerant to IVC and more susceptible to cell death.
Therefore, we suggest that vitrified/warmed cells have different needs during IVC, and
a specific protocol to culture of cryopreserved preantral follicles should be developed.
In conclusion, the Ovarian Tissues Cryossystem opens a new possibility for
successful vitrification of caprine ovarian fragments.
Acknowledgments
This work was supported by CNPq, FINEP and CAPES, Brazil. A.A.
Carvalho, J.R. Figueiredo, S.N. Báo and A.P.R Rodrigues are supported by a grant from
CNPq.
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119
10. CAPÍTULO 5
Adição de catalase às soluções de vitrificação mantém a estabilidade dos folículos pré-
antrais ovarianos
Catalase addition to vitrification solutions maintains ovarian preantral follicles stability
Periódico: Research in Veterinay Science (Submetido em outubro de 2013).
120
RESUMO
O objetivo deste estudo foi verificar se a adição de catalase (20 UI/mL) em diferentes
etapas da vitrificação de tecido ovariano caprino afeta os níveis de ROS, morfologia e
viabilidade folicular, densidade de células do estroma, apoptose e expressão de
proteínas relacionadas à sinalização de dano (γH2AX) e reparo (53BP1) do DNA. O
tecido ovariano foi analisado fresco (controle) ou após a vitrificação: sem catalase (-/-),
com catalase nas soluções de vitrificação (+/-), com catalase nas soluções de lavagem (-
/+) ou com catalase em ambas as soluções (+/+). A vitrificação sem catalase (-/-)
resultou em maior nível de ROS que o controle. A adição de catalase, independente da
etapa em que foi adicionada, manteve os níveis de ROS similar ao controle. Não existiu
diferença entre os tratamentos quando analisada a viabilidade folicular, densidade de
células do estroma e detecção de γH2AX e 53BP1. Também não foi observada
diferença na morfologia folicular e fragmentação do DNA nos grupos vitrificados. Em
conclusão, a adição de catalase nas soluções de vitrificação previne a formação de ROS
em tecido ovariano caprino vitrificado.
Palavras-chave: Apoptose. Criopreservação. Dano ao DNA. Espécies reativas de
oxigênio.
121
Catalase addition to vitrification solutions maintains ovarian preantral follicles
stability
AA Carvalhoa*
, LR Faustinoa, CMG Silva
a, SV Castro
a, CH Lobo
b, FW Santos
c,
RR Santosd,e
, CC Campelloa, V Bordignon
f, JR Figueiredo
a, APR Rodrigues
a
a- Laboratory of Manipulation of Oocytes and Preantral Follicles, Faculty of Veterinary,
State University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil; b-
Laboratory of Animal Physiology,
Department of Animal Science, Federal University of Ceará, Fortaleza, CE, Brazil; c-
Laboratório de Biotecnologia da Reprodução (BIOTECH), Universidade Federal do
Pampa (UNIPAMPA), Uruguaiana, RS, Brazil; d-
Faculty of Veterinary Medicine,
Utrecht University, Utrecht, Netherlands; e-
Animal Science Post-graduation Program,
Federal University of Pará, Belém, PA, Brazil; f- Department of Animal Science,
McGill University, Ste-Anne-de-Bellevue, QC, Canada
Abstract
The aim of this study was to verify whether the addition of catalase (20 IU/mL)
at different steps of goat ovarian tissue vitrification affects ROS levels, follicular
morphology and viability, stromal cells density, apoptosis and the expression of proteins
related to DNA-damage signalling (γH2AX) and repair (53BP1). Goat ovarian tissues
were analyzed fresh (control) or after vitrification: without catalase (VS-/WS-), with
catalase in vitrification solutions (VS+/WS-), with catalase in washing solutions (VS-
/WS+) or with catalase in both solutions (VS+/WS+). The vitrification without catalase
had higher ROS levels that the control. The catalase, regardless the step of addition,
maintained ROS levels similar to the control. There were no difference between
treatments regarding follicular viability, stromal cells density and detection of γH2AX
and 53BP1. There was no difference in follicular morphology and DNA fragmentation
between groups vitrified. In conclusion, catalase addition to vitrification solutions
prevents ROS formation in cryopreserved goat ovarian tissues.
Keywords: cryopreservation; ovary; ROS levels; DNA damage; apoptosis.
122
Introduction
Cryopreservation has been largely used for genetic material preservation from
males and females (Fernández-Santos et al., 2008; Gupta et al., 2010; Luz et al., 2012).
However, the exposure of biological samples to cryoprotectant agents associated with
rapid cooling and warming rates generate physical and chemical changes (Fernández-
Santos et al., 2008). These changes may lead to an increase in production of reactive
oxygen species (ROS; Wang et al., 1997), resulting in oxidative stress (Agarwal et al.,
2005). ROS include hydroxyl radical (OH•), superoxide anion (
•O2
-) and hydrogen
peroxide (H2O2) (Rahimi et al., 2003; Agarwal et al., 2005). H2O2 is a nonpolar
molecule, which crosses the cell membrane easily (Choi et al., 2005), and can be
converted to OH• (Yan et al., 2009), a highly reactive and toxic radical to the cell.
The increase in ROS levels affects the cell microenvironment (Fernández-Santos
et al., 2008) resulting in damage to the cell morphology (Luz et al., 2012) and possibly
in DNA (Imlay and Linn, 1988; Lopes et al., 1998). ROS diffusion into the cell results
in damages that can be identified in proteins, lipids and nucleic acid (Guérin et al.,
2001), and may also modulate gene expression (Harvey et al., 2002), leading to cell
apoptosis (Yang et al., 1998).
ROS can react rapidly with nucleotides (Evans and Cooke, 2004), inducing
DNA double-strand break (DSB; Ménézo et al., 2010), which can be evidenced by the
phosphorylation of the histone H2AX (γH2AX), one of the proteins responsible for
DNA DSB signaling (Burma et al., 2001). After H2AX phosphorylation, other proteins
involved in DNA repair, such as the 53BP1 (p53 binding protein 1), are recruited to the
sites of DNA damage (Rappold et al., 2001). 53BP1 is a p53 binding protein, which
binds to the central binding domain of p53 and moves to the site of DNA damage in
response to DSB (Ward et al., 2003).
Despite the occurrence of the cellular events mentioned above, cells have natural
defense mechanisms against oxidative stress comprising the action of antioxidants,
which act inhibiting ROS production or capturing and inactivating them (Veal et al.,
2007). Procedures such as cryopreservation may result in increased ROS production
(Mazzili et al., 1995, Wang et al., 1997) or reduction of antioxidants (Bilodeau et al.,
2000), with consequent alteration of the cellular redox.
For this reason, addition of antioxidants has been investigated in
cryopreservation of sperm (Baumber et al., 2003; Chi et al., 2008), oocytes (Dinara et
123
al., 2001; Gupta et al., 2010) and ovarian tissue (Melo et al., 2011; Luz et al., 2012;
Sanfilippo et al., 2013). Since supplementation of cryopreservation solutions with
antioxidants has only recently being investigated, there is a need to better understand
the role of these substances in a complex tissue as the ovary.
The cellular antioxidant defense systems against the excessive ROS production
can be divided into enzymatic and non-enzymatic (Kefer et al., 2009). The main
enzymatic antioxidants involved in ROS detoxification are glutathione peroxidase,
superoxide dismutase and catalase (Bilodeau et al., 2000). The latter is responsible for
the hydrolysis of H2O2 into water and oxygen (Fernández-Santos et al., 2008), removing
this important initiator of chain reactions that can lead to formation of other ROS
(Aitken et al., 1995).
Higher ROS production can also occur during the resumption of cell metabolism
after freezing and thawing (Agarwal et al., 2005). Although previous studies have
investigated the effect of catalase addition during the warming procedure (Kim et al.,
2004; Fernández-Santos et al., 2008), the ideal period for the inclusion of antioxidants
during the cryopreservation process (e.g., vitrification or cryoprotectants removal) has
so far not been properly tested. Therefore, the aim of this study was to assess the effect
of catalase supplementation of vitrification and washing solutions on ROS production in
vitrified-warmed goat ovarian tissues.
Materials and Methods
This experiment was approved and performed under the guidelines of Ethics
Committee for Animal Use of the State University of Ceará. The cryoprotectants
(ethylene glycol and dimethyl sulfoxide) were obtained from Dinâmica (Dinâmica
Química, Diadema, SP, Brazil) and the other chemicals were obtained from Sigma
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), unless otherwise stated. The pH was
adjusted to 7.4 in all solutions used in this study.
Preparation of ovarian tissue
Ovaries (n = 10) were collected from 5 adult cross-bred goats (Capra hircus) at
a local slaughterhouse. Immediately postmortem, the ovaries were washed once in 70%
124
ethanol for 10 sec and then washed twice in HEPES-buffered minimum essential
medium (MEM) supplemented with 100 µg/mL penicillin and 100 µg/mL streptomycin.
Ovaries were then transported to the laboratory in MEM at 20°C within 1 h after
collection. At the laboratory, ovaries were stripped of the surrounding fat and fibrous
tissue and the ovarian cortex from each ovarian pair was cut into small fragments
(n=18; 3 x 3 x 1 mm) using a scalpel blade under sterile conditions. Part of the
fragments (n=6) were used as fresh control samples and the remaining fragments (n=12)
were vitrified.
Experimental design and vitrification procedures
The ovarian fragments were exposed to vitrification solutions (VS) and
washing/removal solutions (WS) of cryoprotectant agents, either with or without
catalase (from bovine liver; Sigma: C1345), resulting in four different conditions: (1)
vitrification without catalase followed by washing without catalase (VS-/WS-), (2)
vitrification without catalase followed by washing with catalase (VS-/WS+), (3)
vitrification with catalase followed by washing without catalase (VS+/WS-) and (4)
vitrification with catalase followed by washing with catalase (VS+/WS+). The catalase
concentration (20 IU/mL) used in this study was based on a previous study from Luz et
al. (2012), who observed similar rates of morphologically normal preantral follicles
after freezing goat ovarian tissues as compared to fresh ovarian tissues.
The vitrification was performed using the Ovarian Tissue Cryosystem (OTC), a
new vitrification protocol developed by our team (Carvalho et al., 2013). Briefly, the
fragments were exposed to two VS. The VS1 consisted of MEM supplemented with 10
mg/mL bovine serum albumin (BSA), 0.25 M sucrose, 10% ethylene glycol (EG) and
10% dimethyl sulfoxide (DMSO). VS2 had a similar composition of VS1 but with
higher concentration of cryoprotectans (20% EG and 20% DMSO). Tissue fragments
(n=6) were either exposed to vitrification solutions (VS1 and VS2) without catalase or
(n=6) to the same solutions but with catalase. The fragments were initially exposed to
VS1 for 4 min followed by VS2 for 1 min. Both exposures were performed using the
OTC. The vitrification solution was then removed and the OTC containing the ovarian
tissue was closed and immediately immersed vertically into liquid nitrogen. After
cryostorage for up to one week, OTCs containing the vitrified ovarian fragments were
warmed in air at room temperature (RT ∼25°C) for 1 min, followed by immersion in a
125
water bath (37°C) for 30 sec. After warming, the cryoprotectants were removed by a
three-step washing solutions (WS; 5 min each) in WS1: MEM + 3 mg/mL BSA + 0.5 M
sucrose, WS2: MEM + 3 mg/mL BSA + 0.25 M sucrose and WS3: MEM + 3 mg/mL
BSA. The three WS were either supplemented or not with catalase (20 IU/mL).
ROS levels
The ROS levels were determined by a spectrofluorimetric method, using 2’,7’-
dihydrodichlorofluorescein diacetate (DCHF-DA) assay (Loetchutinat et al., 2005).
Prior, fresh control and vitrified tissues were homogenized in cold ice 50 mM Tris–HCl,
pH 7.5 (1/10, w/v). The homogenate was centrifuged for 10 min at 3000×g, and the
pellet was discarded. The low-speed supernatants (S1) were separated and used for ROS
levels assays. To estimate the level of ovarian homogenate ROS production an aliquot
of S1 (10 µL) was incubated with 10 µL of DCHF-DA (1mM) and the oxidation of
DCHF-DA to fluorescent dichlorofluorescein was measured for the detection of
intracellular ROS. The DCF fluorescence intensity emission was recorded at 520 nm
(with 480 nm excitation) using a Spectrofluorimeter (Shimadzu model RF-5301PC) 30
min after the addition of DCHF-DA to the medium.
Evaluation of follicular morphology and stromal cells density
Fresh control and vitrified-warmed ovarian fragments were fixed in Carnoy´s
solution at RT for 4 h, dehydrated in a graded series of ethanol, clarified with xylene,
embedded in paraffin wax, and serially sectioned into 7 µm thickness. The sections
were stained with hematoxylin and eosin for histological analysis and follicular
morphology was examined by microscope (magnification x400). For each treatment,
150 preantral follicles were counted only in sections where the oocyte nucleus was
visible. Preantral follicles were morphologically classified as (i) normal if they
contained an intact oocyte and intact granulosa cells and (ii) degenerate if they
contained a pyknotic oocyte nucleus, shrunken ooplasm, accompanied or not by
disorganized granulosa cells (e.g. increase in volume with or without detachment from
the basement membrane). The presence of at least one of the afore mentioned features
was indicative of atresia.
126
Ovarian stroma cells density was evaluated by calculating the number of stromal
cells in an area of 100 × 100 µm. For each treatment, ten fields per animal were
assessed, resulting a total of 50 fields per treatment, and the mean number of stromal
cells per field was calculated.
Viability analysis by trypan blue and by fluorescent markers
Preantral follicles were isolated from the fresh control and vitrified-warmed
ovarian fragments by the mechanical method described by Lucci et al. 1999, with slight
modifications. Briefly, with a tissue chopper (The Mickle Laboratory Engineering,
Gomshal, Surrey, United Kingdom) adjusted to sectioning interval of 75 μm, samples
were cut into small pieces and placed in 2 mL MEM supplemented with 3 mg/mL BSA.
Samples were then suspended 100 times with a large Pasteur pipette (inner diameter
~1600 µm), followed by 100 times with a smaller Pasteur pipette (inner diameter ~600
µm) to dissociate preantral follicles from stroma. The suspension obtained was then
passed through a 200 µm nylon mesh filter. This procedure was performed within 10
min at RT.
To each 100 µL of follicular suspension, 5 µL of 0.4% trypan blue was added
and incubated for 1 min a RT. Evaluation of trypan blue staining was carried out under
an inverted microscope (Nikon, Tokyo, Japan) at magnification x400. Follicles were
classified as viable if the oocyte and <10% granulosa cells remained unstained, whereas
those which had the oocyte and/or ≥10% granulosa stained in blue were considered non-
viable follicles (Lopes et al., 2009). Stained cells indicate plasma membrane disruption,
and penetration of trypan blue dye. In total, 30 follicles were evaluated per treatment.
For viability analysis by fluorescent markers, preantral follicles found after
follicular isolation were transferred to 100 μL droplets of MEM. The viability was
evaluated by adding 4 µM calcein-AM and 2 µM ethidium homodimer-1 (Molecular
Probes, Invitrogen, Karlsruhe, BW, Germany) to each drop of MEM that contained the
isolated follicles. Samples were then incubated at 37°C for 15 min. Afterward, preantral
follicles were examined using an epifluorescence microscope (Nikon, Tokyo, Japan) at
magnification x400. The wave lengths used for excitation/emission were 458/515 nm
for calcein AM and 525/590 nm for ethidium homodimer-1. Follicles exhibiting green
fluorescence, which indicates the cleavage of the AM group from calcein through
esterases activity, were considered viable. Follicles displaying red fluorescence, which
127
indicates plasma membrane disruption and binding of ethidium to chromatin, were
classified as non-viable (Santos et al., 2007). Thirty preantral follicles were analyzed in
each treatment.
DNA fragmentation assay for the detection of apoptotic cells (TUNEL staining)
DNA fragmentation was analyzed by TUNEL (terminal deoxynucleotidyl
transferase-mediated biotinylated deoxyuridine triphosphates nick end-labeling) assay.
In situ TUNEL analyses were performed using the In Situ Cell Death Detection Kit,
POD (Roche Applied Science, Mannheim, BW, Germany), according to manufacturer’s
instructions. Tissue samples from fresh and vitrified-warmed groups were fixed with
4% (w/v) paraformaldehyde in PBS (pH 7.2) and subsequently dehydrated and
embedded in paraffin wax (Dinâmica, Diadema, SP, Brazil). Tissues sections (5 µm)
mounted on Superfrost Plus slides (Knittel Glass, Bielefeld, NW, Germany) were
deparaffinized with Citrisolve (Fisher Scientific, Ottawa, Ontario, Canada) and
rehydrated in a graded ethanol series. Antigen retrieval was performed by incubating
tissue sections in 0.01 M sodium citrate buffer (pH 6.0) for 5 min, in a pressure cooker.
Sections were washed in PBS and the slides incubated with 3% H2O2 in methanol.
Sections were then washed in PBS and blocked for 1 h at RT using PBS containing 1%
BSA. After washing twice in PBS (5 min), slides were incubated with a TUNEL
reaction mixture (50 µl) for 1 h at 37°C, followed by rinsing in PBS for 5 min (3 times).
Converter POD was added (Roche Applied Science) and the location of the protein
expression was demonstrated by incubation with diaminobenzidine (DAB; 0.05% DAB
in Tris/HCl, pH 7.6, 0.03% H2O2). Finally, sections were counterstained with
hematoxylin. Follicles were considered with fragmented DNA when oocytes were
detected with a dark brown stained nucleus (Demirci et al., 2002). As an internal
positive control, sections were treated with 10 unit/ml DNase I (Invitrogen™, Carlsbad,
CA, USA) in 1 mg/mL BSA, for 10 min at RT, before incubation with the TUNEL
reaction mixture to induce nonspecific breaks in the DNA. Negative control sections
consisted of omitting the terminal deoxynucleotidyl transferase enzyme.
128
RNA extraction and Real-time PCR (qPCR)
The fresh control and vitrified tissue samples were used for RNA extraction.
Isolation of total RNA was performed using Trizol™ (Invitrogen, São Paulo, SP,
Brazil) following manufacturer's recommendations. Briefly, the tissues were macerated
in 1 mL of Trizol and the organic portion was separated from the aqueous phase by
adding 200 µL of chloroform and centrifuged at 12000 g for 15 min, at 4°C. After
centrifugation, to the supernatant the same volume of ethanol 70% was added. Total
RNA was purified from this supernatant using the column system PureLink™ RNA
Mini Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), according to manufacturer's instructions.
RNA preparations were subjected to DNase I treatment with a PureLink™ DNase
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). After this treatment, RNA was washed with the
provided buffer solutions and then re-suspended in 30 μL RNAse free water. RNA
quality and concentration were determined in a NanoDrop™ 2000 spectrophotometer
(Thermo Fisher Scientific, MA, USA). Prior to reverse transcription, the RNA samples
were incubated for 5 min at 65°C, and then chilled on ice. Reverse transcription was
then performed in a total volume of 20 μL made up of 0.5 µg sample RNA, 4 μL 5X
reverse transcriptase buffer (Invitrogen, São Paulo, SP, Brazil), 8 units RNaseOUT, 150
units Superscript III reverse transcriptase, 0.036 U random primers (Invitrogen), 10 mM
DTT and 0.5 mM of each dNTP. This mix was submitted at 25°C for 5 min, 50°C for
40 min and 70°C for 15 min. The resulting cDNA was stored at -20°C until later use.
Minus RT blanks were prepared under the same conditions but without inclusion of
reverse transcriptase. Quantification of mRNA levels for Bcl-2 and Bax was performed
using Power SYBR™ Green PCR Master Mix. Real-time PCR (qPCR) reactions were
carried out using 1 μL cDNA as template in 10 μL of Power SYBR™ Green PCR
Master Mix (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 7.4 μL of ultra-pure water
and 0.5 μM of each primer (Table 1). The reference gene glyceraldehyde-3-phosphate-
dehydrogenase (GADPH) was selected as an endogenous control for normalization and
to study gene expression stability in all samples. The thermal cycling profile for the first
round of PCR was as follows: initial denaturation at 95°C for 10 min, then 40 PCR
cycles (15 sec 95°C, 1 min 60°C, 1 min 72°C), followed by a final extension of 10 min
at 72°C. The specificity for each primer set was tested performing the melting
procedure, starting fluorescence acquisition at 60°C and taking measurements at 10-sec
intervals until the temperature reached 95°C. All reactions were performed using the i-
129
cycler IQ5 system (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). The ΔΔCT method was
used to transform threshold cycle values into normalized relative expression levels
(Schmittgen and Livak, 2008).
Table 1.
Oligonucleotide primers for GADPH, BCL-2 and BAX used in the gene expression
analyses.
Target
gene
Primer sequence (5’ → 3’) Sense
*
Position Genbank
accession no.
GADPH TGTTTGTGATGGGCGTGAACCA S 454–475
NM_001034034.2 ATGGCGTGGACAGTGGTCATAA AS 586–607
BCL-2 ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA S 232–251
XM_004020687.1 GCCAGGAGAAATCAAACAGG AS 387–406
BAX GTTTTCCGACGGCAACTTC S 16–34
JN036558.1 GGATGGTCCTGATCAACTCG AS 109–128
*S sense; AS antisense. GAPDH: Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.
Immunofluorescence detection of γH2AX and 53BP1 proteins
In this analysis we used rabbit polyclonal primary antibodies for detection of
γH2AX (ab2893, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA) and 53BP1 (#4937, Cell
Signaling Technology Inc, Beverly, MA, USA). These proteins are involved in DNA-
damage repair mechanisms. The Alexa Fluor® 488 anti-rabbit IgG Conjugate (#44125S,
Cell Signaling Technology Inc.) was used as secondary antibody. In the negative
control samples the primary antibodies were omitted.
The ovarian tissues derived from fresh control and vitrified samples were
prepared as described for the TUNEL technique. After antigen retrieval, slides were
incubated overnight at 4°C with the primary antibodies diluted 1:500 (γH2AX) and
1:100 (53BP1) in blocking solution (0.1% BSA in PBS). Then, the slides were
incubated with the secondary antibody (Alexa Fluor®
488) diluted 1:500 in blocking
solution for 1 h at RT and counterstained with Evans Blue (1:2000). The slides were
then mounted with Vectashield®
Mounting Media (Vector Laboratories, Inc.,
Burlingame, CA, USA). Image evaluations of the preantral follicles were performed
130
using a laser scanning confocal microscope (LSM 710, Zeiss, Oberkochen, Germany).
All analyzes were performed using the same configuration.
Statistical analysis
All data were initially submitted to Kolmogorov-Smirnov and Bartlett tests to
confirm normal distribution and homogeneity of variances, respectively. The results
obtained from these first analyses were then subjected to analysis of variance using the
PROC GLM procedure of SAS.
Percentages of morphologically normal follicles and stromal cells density were
compared using Student-Newman-Keuls (SNK) test and ROS levels evaluation was
compared using ANOVA one-way followed by post-hoc Duncan’s test. Data of
follicular viability (assessed through Trypan Blue and fluorescent probes assays) were
analyzed for the dispersion of frequencies using the χ² test. Data for relative expression
by qPCR, which did not show homogeneity of variance, were analyzed using a Kruskal-
Wallis non-parametric test. Percentages of TUNEL-positive follicles were compared by
Fisher's exact test. The differences were considered to be significant when P<0.05 and
results were expressed as mean ± standard error of means (SEM).
Results
ROS levels
Groups containing catalase showed ROS levels similar to the fresh control
group. On the other hand, ovarian tissues vitrified and washed in the absence of catalase
(VS-/WS-) resulted in higher ROS levels compared to the fresh control and VS+/WS-
catalase groups (Fig. 1).
131
Fig. 1. ROS levels expressed as fluorescence intensity in non-vitrified (fresh control)
and vitrified ovarian tissues in the presence or absence of catalase in
vitrification/washing solutions. A,B
indicate statistical difference (P<0.05) between
groups.
Evaluation of follicular morphology, viability and stromal cells density
To evaluate follicular morphology, 150 follicles per treatment were analyzed,
totalizing 750 follicles. Morphologically normal or atretic follicles were observed in the
fresh control as well as in the vitrified ovarian tissues, as shown in Fig. 2A and 2B,
respectively.
Fig. 2. Follicular morphology analysis (A-B), apoptosis detection (C-D) and follicular
viability evaluation by trypan blue (E-F) and fluorescent markers (G-H).
132
Morphologically normal (A) and degenerate (B) preantral follicle stained with HE. Note
in (B) granulosa cells disorganization and ooplasm shrinkage (asterisk). Positive (C)
and negative (C') control for TUNEL assay. Vitrified ovarian tissues were analyzed by
TUNEL assay (D). Arrows indicate TUNEL-positive reaction; arrowhead indicates
TUNEL-negative reaction. Viable (E) and non-viable (F) follicles unstained and stained
by Trypan blue, respectively. Viable follicle (G) and non-viable follicle (H) labeled with
calcein-AM (green) and ethidium homodimer-1 (red), respectively. GC – granulosa
cells, O – oocyte; Nu – nucleus. Scale bars = 30 µm.
In the fresh control group, approximately 70% of the follicles were
morphologically normal. This percentage was reduced (P<0.05) after vitrification,
regardless of the addition of catalase (Fig. 3). However, no significant differences were
observed between vitrified groups (P>0.05). Among the morphological changes,
shrinkage of ooplasm and granulosa cells disorganization were the most frequently
changes observed in all treatments.
Fig. 3. Percentage (mean SEM) of morphologically normal preantral follicles. Goat
ovarian tissues were non-vitrified (fresh control) or vitrified-thawed in the presence or
absence of catalase in vitrification/washing solutions. A,B
indicate statistical difference
(P<0.05) between treatment.
The analysis of stromal cells density revealed no significant alteration after
vitrification in any of the conditions tested (VS-/WS-; VS+/WS-; VS-/WS+ and
133
VS+/WS+) compared to the fresh control group (P>0.05). Similarly, there were no
differences among treatments in the follicular viability after vitrification, either assessed
by Trypan blue or fluorescent markers (Table 2).
Table 2.
Stromal cells density and follicular viability (Trypan blue, Calcein AM/ethidium and
TUNEL-positive follicles) in non-vitrified (fresh control) and vitrified ovarian tissues in
presence or absence of catalase.
Treatments
Stroma cells
density
mean ± SEM
Trypan
blue
%(n)
Calcein
AM/ethidium
%(n)
TUNEL-positive
follicles
%(n)
Fresh control 205.38 ± 17.51A 93.33 (28)
A 96.67 (29)
A 20.00 (4)
AB
VS-/WS- 205.92 ± 21.95A 83.33 (25)
A 90.00 (27)
A 10.00 (2)
AB
VS+/WS- 210.12 ± 29.73A 80.00 (24)
A 83.33 (25)
A 6.67 (1)
B
VS-/WS+ 230.92 ± 13.97A 83.33 (25)
A 86.67 (26)
A 10.00 (2)
AB
VS+/WS+ 221.86 ± 24.31A 93.33 (28)
A 93.33 (28)
A 26.67 (5)
A
Different superscripts within columns indicate statistical difference between treatments
(P<0.05).
DNA fragmentation assay for the detection of apoptotic cells (TUNEL staining)
The analysis of preantral follicles enclosed in the ovarian tissue showed presence
of TUNEL-negative and TUNEL-positive follicles in all treatments (Fig. 2C and 2D).
Among the fragments subjected to vitrification, the VS+/WS- group showed lower
percentage of TUNEL-positive follicles (6.67%). This percentage was significantly
lower when compared to VS+/WS+ (Table 2). However, the percentage of follicles with
DNA fragmentation (TUNEL-positive) in these treatments did not differ from the fresh
control and other vitrified groups (VS-/WS-, VS-/WS+). As shown in Fig. 2C’, no
TUNEL-positive signal was observed in the negative control fragments, while TUNEL
staining (brown staining) was consistently observed in the positive control samples.
134
Real-time PCR (qPCR)
qPCR was performed to assess the relative mRNA expression of BCL2 and BAX
genes as indicators of apoptosis. Expression of these genes was assessed in non-vitrified
(fresh control) and vitrified ovarian tissues in the presence or absence of catalase in
vitrification/washing solutions. There were no significant differences in gene expression
between treatments (Fig. 4).
Fig. 4. Relative Bcl2/Bax mRNA expression in non-vitrified (fresh control) and vitrified
ovarian tissue in the presence or absence of catalase in vitrification/washing solutions.
Immunofluorescence staining for γH2AX and 53BP1
Immunofluorescence analysis was performed in order to localize proteins
involved in signaling (γH2AX) and repair (53BP1) of DNA damage.
Analysis of preantral follicles obtained before and after vitrification showed no
labeling of γH2AX protein in any of the tested groups. However, positive
immunostaining for 53BP1 protein was observed in granulosa cells from all follicular
categories analyzed (Fig. 5). The positive immunostaining was observed as green foci in
granulosa cells, and this pattern was observed in all treatments. Negative controls,
obtained by excluding the primary antibodies, showed no signs of immunoreactivity.
135
Fig. 5. Immunodetection of 53BP1 protein (green bright fluorescent spots) in goat
ovarian tissue from the fresh control and after vitrification. (A) Preantral follicle from a
negative control sample showing a follicle without fluorescent signal for 53BP1. (B-D)
Goat ovarian follicles positively labeled for 53BP1. Note primordial (B), primary (C)
and secondary (D) follicles with granulosa cells labeled and the absence of fluorescence
signal in the oocytes. GC – granulosa cells; O – oocyte. Scale bars = 30 µm.
136
Discussion
In the present study, the effects of the addition of catalase at different steps of
the vitrification process on follicular morphology and viability, as well as on ROS
production were investigated in goat ovarian tissues. Furthermore, it was evaluated
whether the vitrification process influences the expression of anti and pro-apoptotic
genes and DNA integrity after vitrification and warming of goat preantral follicles.
In this study, the absence of catalase in both vitrification and washing solutions
(VS-/WS- group) resulted in higher percentage of ROS compared to fresh ovarian
tissues. It is already known that the cryopreservation procedure induces ROS production
(Dinara et al., 2001, Rahimi et al., 2003) and results in plasma membrane lipid
peroxidation (Luz et al., 2012). In addition, the plasma membrane also undergoes
excessive chemical and physical stress due to high salt concentrations and low
temperatures (Holt and North, 1994). These effects can damage the cytoskeleton
(Hinshaw et al., 1986) and increase apoptosis (Yang et al., 1998), due to changes in the
structure and permeability of the cell membrane (Dinara et al., 2001). Based on the
results obtained in this study, we propose that the addition of catalase at any step of
vitrification procedure is necessary to prevent ROS production caused by
cryopreservation. This is probably due to the catalase action on breaking down H2O2 to
water and oxygen (Chi et al., 2008).
In the present study, the percentage of morphologically normal follicles after
vitrification was reduced, regardless the addition of catalase. This result may be due to
damages caused by dehydration and osmotic variations (Paynter et al., 1999), which are
characterized by cytoplasmic shrinkage. Regardless the addition of catalase, no
reduction was observed on follicular viability after vitrification, which is in agreement
with previous studies (Onions et al., 2008; Castro et al., 2011). Nonetheless, viability
results confirmed that the vitrification procedure (ovarian tissue cryosystem - OTC)
used in this study (Carvalho et al., 2013), caused neither disruption in cell membrane
(assessed by trypan blue) nor inactivation of cell enzymatic metabolism (assessed by
calcein-AM).
Stromal cells density was not decreased by any of the treatments tested in the
present study, which suggests that the OTC protocol satisfactorily preserved the stromal
cells population and that the oxidative stress do not seem to affect stromal cells. These
cells are important in the production of peptides and growth factors that are necessary
137
for cell growth and development (Picton et al., 2008). Previous studies have shown that
stromal cells are susceptible to cryopreservation injures (Keros et al., 2009; Faustino et
al., 2010). Therefore, a vitrification protocol that maintains the density of these cells is
crucial to achieve adequate follicular development after warming.
In general, when a cell is subjected to stress conditions such as exposure to
cryoprotectant agents and cooling/thawing procedures, the imbalance between
ROS/antioxidants can induce DNA DSBs (Nowicki et al., 2004), which may lead to cell
apoptosis (Cao et al., 2010; Franke et al., 2010). Cell cycle checkpoints and DNA repair
are the most important cellular defenses against stress factors (Kang et al., 2012), and
the histone H2AX phosphorylation is one of the major signs observed after DNA
damage. However, in the ovarian tissue vitrification conditions used in this study there
was no fluorescent signal for γH2AX in chromatin of goat preantral follicles. However,
it has to be consider that changes induced by cryopreservation in preantral follicles
require an incubation period to be revealed (Paynter et al., 1999).
On the other hand, 53BP1 was detected in granulosa cells of all follicles
analyzed in this study, regardless of the treatment and follicular category. 53BP1 is a
protein that has a great ability to bind the p53 protein (Iwabuchi et al., 1994; Schlutz et
al., 2000, Abraham, 2002) and it is known as the guardian of the genome (Mazoochi et
al., 2009) because it promotes DNA repair or apoptosis during cell checkpoints
(Bourougaa et al., 2010). A study performed by Jullien et al. (2002) showed that 53BP1
is located at kinetochores in a hyperphosphorylated form during mitosis (from prophase
to metaphase), indicating that this protein also plays a role in the mitotic process. Other
studies have demonstrated a close relationship of 53BP1 with cell cycle, showing that
53BP1-deficient cells have deficient G2/M checkpoint (Fernandez-Capetillo et al.,
2002), and that mitotic cells have higher expression of p53 (Tritarelli et al., 2004). The
closely relationship of 53BP1 with the cell cycle suggests that the presence of this
protein in granulosa cells of preantral follicles observed in the present work is likely not
related to DNA damage response. The lack of γH2AX in these cells supports this
hypothesis. Indeed, it is possible that the presence of the 53BP1 is due to the fact that
these cells are proliferating.
Our qPCR results demonstrated that there was no unbalance in Bcl2/Bax
expression ratio. This result is similar to previous findings reported by Mazoochi et al.
(2009) after mouse ovaries vitrification. Bcl2 is a survival molecule which resides in
nuclear envelope and mitochondria and it is known as an anti-apoptotic protein
138
responsible for preventing the beginning of cell death (Hussein et al., 2006; Srivastava
et al., 2010). Contrarily, Bax is a pro-apoptotic protein that stimulates the beginning of
cell death (Hsu and Hsueh, 1998). The unbalance of Bcl2/Bax is the initial factor in the
apoptotic process (Oltvai et al., 1993), which is followed by caspase activation (Zhang
et al., 2013), and DNA fragmentation (Hsu and Hsueh, 1998). In this study, vitrification
performed with or without catalase did not alter the proportion of preantral follicles with
DNA fragmentation compared to the fresh control follicles. The protocol used in this
study caused minimal cellular changes on morphological and molecular aspects of
preantral follicles.
In this study, we have not found significant differences in DNA fragmentation
(assessed by TUNEL) among vitrified and fresh control groups. While this suggests that
the vitrification protocol used in this study preserves DNA integrity, an incubation
period might be necessary for the apoptosis cascade and DNA fragmentation to occur.
Indeed, activation of endogenous endonuclease in necessary to cleave genomic DNA
resulting in its fragmentation (Mazoochi et al., 2008). Nonetheless, cell apoptosis has
been described in follicles that were evaluated without incubation after cryopreservation
(Rahimi et al., 2003; Xiao et al., 2010; Chang et al., 2011). We have found that
supplementation of catalase in both vitrification and washing solutions (VS+/WS+)
resulted in higher percentages of follicles with DNA fragmentation compared to when
catalase was present only in vitrification solution (VS+/WS-). Similarly, it has been
reported by other investigators that excess of antioxidants result in cell toxicity not only
in ovarian tissue but also in cryopreserved sperm and embryos (Donnelly et al., 1999;
Wang et al., 2002; Luz et al., 2012).
In conclusion, findings in the present study indicate that presence of catalase
reduces detrimental effects of vitrification in goat ovarian tissues. Furthermore, since
ROS levels in ovarian tissues vitrified in the presence of catalase (VS+/WS-) remained
unchanged compared to the fresh tissues, we propose that the best step for addition of
catalase is in the vitrification solution.
Acknowledgments
This work was supported by CNPq, FINEP and CAPES, Brazil. A.A. Carvalho, J.R.
Figueiredo and A.P.R Rodrigues are supported by a grant from CNPq.
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146
11. CONCLUSÕES
A utilização de um sistema de superfície sólida fechado (Ovarian Tissue
Cryosystem - OTC) mantém a viabilidade e ultraestrutura de tecido ovariano caprino
vitrificado em pequenos fragmentos (3x3x1 mm).
A adição de 20 UI/mL de catalase em soluções utilizadas para a vitrificação de
tecido ovariano caprino mantém os níveis de ROS similar aos observados no tecido
ovariano fresco.
A vitrificação do tecido ovariano utilizando o OTC não resultou em danos à
cromatina de folículos pré-antrais detectáveis pela fosforilação da H2AX ou
fragmentação da molécula de DNA.
147
12. PERSPECTIVAS
A técnica de criopreservação desenvolvida nesse estudo mostrou-se eficiente e
segura para a vitrificação de fragmentos de tecido ovariano caprino de forma rápida,
eficiente e segura. Contudo, o procedimento ainda precisa ser aperfeiçoado para a
vitrificação de hemi e ovário inteiro. A criopreservação de dimensões maiores de tecido
ovariano é salutar na reprodução assistida por assegurar a preservação de grande parte
ou do completo pool folicular. Além disso, a vitrificação de ovário inteiro é de grande
relevância por permitir preservar não só os folículos ovarianos, mas também o aporte
vascular do órgão, pois favorece o posterior transplante e revascularização tecidual,
culminando com menor perda folicular em decorrência de hipóxia. Assim, evidencia-se
a necessidade de mais estudos nessa área, inclusive aperfeiçoando-se os protocolos de
exposição/perfusão dos crioprotetores, o que, em nossa opinião, pode ter sido uma das
razões para os resultados pouco satisfatórios no caso da vitrificação de hemi ou ovário
inteiro.
Após o cultivo in vitro realizado nesta tese, observou-se uma maior
degeneração dos folículos previamente vitrificados. As agressões celulares sofridas
durante a exposição aos crioprotetores e resfriamento e posterior aquecimento, parecem
tornar as células mais sensíveis. Desta forma, as condições de cultivo devem ser as mais
adequadas possíveis no sentido de garantir aporte nutricional e hormonal necessário
para a recuperação celular. Portanto, acredita-se que um sistema de cultivo in vitro
específico para folículos criopreservado deve ser estabelecido.
Além disso, o resfriamento e aquecimento celular podem resultar em aumento
de ROS. Nesta tese foi observada a necessidade de adição de catalase, contudo,
dimensões maiores de tecido ovariano podem necessitar de concentrações mais elevadas
deste ou de outro antioxidante. Conforme mostrado, as ROS têm o DNA como um dos
principais alvos, evidenciando a necessidade de estudos aprofundados desta relação,
uma vez que a criopreservação visa não somente a preservação da morfologia e
viabilidade celular, como também perspectiva de geração de descendentes saudáveis,
obviamente com o genoma bem preservado.
Por fim, os resultados para a vitrificação de tecido ovariano caprino utilizando o OTC
mostraram-se promissores, o que abre novas perspectivas para a utilização desta técnica
para a criopreservação de tecido ovariano em outras espécies, inclusive a espécie
humana.
148
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14. ANEXOS
181
14.1. DEPÓSITO DE PATENTE
182
183
184
185
14.2. CONSULTA À BASE DE DADOS DO INPI
186
14.3. APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA
187
14.4. PUBLICAÇÕES DE RESULTADOS PARCIAIS
188
189
190
191
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