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0 UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS JULIANA DE CARVALHO RIBEIRO AÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Eucalyptus citriodora NANOENCAPSULADO SOBRE NEMATOIDES GASTRINTESTINAIS DE PEQUENOS RUMINANTES FORTALEZA 2013

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA

FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS

JULIANA DE CARVALHO RIBEIRO

AÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Eucalyptus citriodora NANOENCAPSULADO SOBRE NEMATOIDES GASTRINTESTINAIS DE

PEQUENOS RUMINANTES

FORTALEZA 2013

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JULIANA DE CARVALHO RIBEIRO

AÇÃO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Eucalyptus citriodora NANOENCAPSULADO SOBRE NEMATOIDES GASTRINTESTINAIS DE

PEQUENOS RUMINANTES

FORTALEZA 2013

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias. Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Linha de Pesquisa: Reprodução e sanidade de pequenos ruminantes. Orientador(a): Profa. Dra. Claudia Maria Leal Bevilaqua

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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Universidade Estadual do Ceará

Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho

Bibliotecário Responsável – Francisco Welton Silva Rios – CRB-3/919

JULIANA DE CARVALHO RIBEIRO

R484a Ribeiro, Juliana de Carvalho

Ação do óleo essencial de Eucalyptus citriodora nanoencapsulado sobre nematoides gastrintestinais de pequenos ruminantes / Juliana de Carvalho Ribeiro. -- 2013.

CD-ROM. 53 f. : il. (algumas color.) ; 4 ¾ pol. “CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho

acadêmico, acondicionado em caixa de DVD Slim (19 x 14 cm x 7 mm)”. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual do Ceará,

Faculdade de Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinária, Curso de Mestrado Acadêmico em Ciências Veterinárias, Fortaleza, 2013.

Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal. Orientação: Prof.ª Dr.ª Claudia Maria Leal Bevilaqua. Co-orientação: Prof.ª Dr.ª Ana Lourdes Camurça Fernandes

Vasconcelos. 1. Quitosana. 2. Nanoemulsão. 3. Nematodeos. 4. Eucalyptus

citriodora. I. Título.

CDD: 547.782

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Dedico

Aos familiares e amigos.

A Deus, pois a fé nos faz crer no incrível,

ver o invisível e realizar o impossível.

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AGRADECIMENTOS

A Deus por toda a sua glória, por ser a luz que ilumina minha vida e me dá esperança. Por me

confortar e me fazer erguer a cabeça em momentos que julguei impossível.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) e à Universidade Estadual

do Ceará (UECE) por terem contribuído com minha formação profissional.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) por ter fornecido

uma bolsa de estudos durante o período de pós-graduação.

Agradeço em especial ao meu pai, Isauro Ribeiro Filho, à minha mãe, Vânia Maria de Carvalho

Ribeiro, e à minha irmã, Monique de Carvalho Ribeiro, por estarem SEMPRE ao meu lado e por

fazerem parte da minha família.

À professora Claudia Maria Leal Bevilaqua por ter me orientado durante graduação e pós-

graduação e me ensinado a ser uma profissional correta e dedicada.

À Dra. Ana Lourdes Camurça Fernandes Vasconcelos por toda a confiança no meu trabalho, à

amizade, à atenção e ao tempo dedicado me ensinando e co-orientando.

Ao Prof. Dr. Haroldo César Beserra de Paula pela grande e importante contribuição com as

análises químicas dos óleos essenciais.

Aos companheiros do LABODOPAR, Wesley Lyeverton Correia Ribeiro, Iara Tersia Freitas

Macedo e Jessica Maria Leite dos Santos, por contribuírem de forma imprescindível na

realização desse trabalho.

Aos eternos integrantes do LABODOPAR, João Batista e Silva Júnior, Fernanda Cristina

Macedo Rondon, Eudson Maia de Queiroz Júnior, Mayara de Aquino Mesquita e Maria Vivina

Barros Monteiro, por terem dedicado tempo e amizade.

A todos os estudantes de iniciação científica que fazem ou fizeram parte do LABODOPAR, em

especial a José Vilemar de Araújo Filho e Rafaela Damasceno Magalhães, por toda a ajuda nos

testes in vitro e in vivo, pelo cuidado com os animais e pelos momentos de conversas e

descontrações.

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Aos meus grandes e queridos amigos, Igor Ciríaco Barroso, Ana Caroline Moura Rodrigues e

Brandinice de Almada Guerra, pela amizade tão importante na minha trajetória de vida.

À minha amiga Bárbara Mara Bandeira Santos que me acompanhou durante toda a graduação e

pós-graduação socorrendo-me, auxiliando-me e dando-me a mão em momentos que mais

necessitei na minha vida profissional e pessoal.

À minha amiga e irmã de coração, Leilane Mercedes Gomes Marculino, por tudo e um pouco

mais, por sempre poder me ouvir e estar ao meu lado, pelos conselhos que me dá, pelo ombro

amigo e pelos doze anos dedicados a nossa amizade.

Ao meu psicólogo Francisco José Medeiros de Andrade que me auxiliou em momentos de

grande necessidade e agonia, fazendo com que compreendesse minhas limitações e ensinando-

me a ultrapassá-las com muita paciência e determinação.

Aos ovinos e camundongos, pois todo o nosso trabalho só pôde ser realizado graças à existência

e sacrifício dessas criaturas.

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RESUMO

A fitoterapia é apontada como alternativa de controle de parasitoses destacando-se o óleo

essencial de Eucalyptus citriodora (OEEc). Porém, a eficácia deste óleo ainda não atingiu os

níveis desejados, tendo-se a necessidade do desenvolvimento de novas formulações, como o

nanoencapsulamento, que pode aumentar o tempo de permanência da droga no organismo do

animal. Este trabalho teve como objetivo avaliar o OEEc nanoencapsulado e livre in vitro e in

vivo sobre nematoides gastrintestinais de pequenos ruminantes. A determinação da composição

química do OEEc foi realizada usando cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa.

Uma solução de 1% de quitosana foi utilizada como matriz encapsulante. Para o encapsulamento

do OEEc, a seguinte metodologia foi realizada: tween 80 foi adicionado ao OEEc na proporção

de (1:4) sob agitação constante por 10 minutos e a solução de quitosana foi adicionada sob

agitação mecânica por 5 minutos. O OEEc nanoencapsulado foi caracterizado por espectroscopia

de infravermelho. O tamanho das partículas e a distribuição foram determinados por

espectroscopia de correlação do fóton. Foi realizado o teste de eclosão de ovos (TEO), onde as

concentrações do OEEc utilizadas foram: 0,4; 0,2; 0,1; 0,5; 0,25 e 0,125 mg/mL. No teste de

desenvolvimento larvar (TDL), as concentrações utilizadas para o OEEc livre e nanoencapsulado

foram: 0,5; 1; 2; 4 e 8 mg/mL. Foram realizadas três repetições com cinco réplicas para os testes

in vitro. A toxicidade aguda do OEEc livre e nanoencapsulado foi avaliada utilizando-se 90

camundongos que receberam doses variando de 500 a 3.500 mg/kg para o cálculo das doses

letais para 10% (DL10) e 50% (DL50) dos animais. Para o teste de redução da contagem de ovos

nas fezes (FECRT) foram utilizados 30 ovinos divididos em 3 grupos (n=10), os quais receberam

250 mg/kg do OEEc livre, nanoencapsulado e da solução de 1% de quitosana e 3% Tween 80.

Fezes foram coletadas antes do tratamento, 10 e 17 dias pós-tratamento para a contagem de ovos

(opg). O OEEc livre e nanoencapsulado inibiu em 97,2% e 92,8% a eclosão larvar, nas doses 4 e

2 mg/mL, respectivamente. No TDL, a eficácia do OEEc livre e nanoencapsulado foi de 99,8 e

98,1% na concentração de 8 mg/mL, respectivamente. As DL10 e DL50 foram de 1998,8 e

2653.0 mg/kg, e 1120,9 e 1680,7 mg/kg para OEEc livre e nanoencapsulado, respectivamente.

No FECRT, o OEEc livre e nanoencapsulado tiveram uma eficácia de 52,3 e 36,0% no dia 10

pós-tratamento e 68,0 e 64,8% no dia 17 pós-tratamento, respectivamente. Porém, o opg dos

animais tratados não diferiu estatisticamente do controle. Em conclusão, o OEEc

nanoencapsulado não obteve eficácia.

Palavras-chave: Quitosana. Nanoemulsão. Nematodeos. Eucalyptus citriodora

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ABSTRACT

Herbal therapy is indicated as an alternative control parasitic highlighting the Eucalyptus

citriodora essential oil of (EcEO). However, the effectiveness of this oil has not reached desired

levels, it is necessary to develop new formulations, such as nanoencapsulation, which can

increase the residence time of the drug in the body of the animal. This study aims to evaluate the

nanoencapsulated and free EcEO in vitro and in vivo on gastrointestinal nematodes of small

ruminants. The determination of the chemical composition of the EcEO was carried out using

mass spectrometry coupled with gas chromatography. A 1% solution of chitosan was used as the

encapsulating matrix. For the encapsulation of EcEO, the following methodology was applied:

tween 80 was added to the EcEO (1:4) under stirring for 10 minutes, and the chitosan solution

was added under mechanical stirring for 5 minutes. The EcEO nanoencapsulated was

characterized by infrared spectroscopy. The particle size and distribution were determined by

photon correlation spectroscopy. Eggs hatching test (EHT) was performed, where the

concentrations of the EcEO were used: 0.4, 0.2, 0.1, 0.5, 0.25 and 0.125 mg/mL. Larval

development test (LDT), the concentrations used for the free and nanoencapsulated EcEO were

0.5; 1; 2; 4 and 8 mg/mL. Three repetitions were carried out with five replicates for in vitro

testing. The acute toxicity of free and nanoencapslated EcEO was assessed using 90 mices

receiving doses ranging from 500 to 3.500 mg/kg to calculate the lethal dose for 10% (LD10)

and 50% (LD50) of the animals. To the fecal egg count reduction test (FECRT) 30 sheep were

divided into 3 groups (n = 10) who received 250 mg/kg of EcEO free, nanoencapsulated and 1%

solution of chitosan and 3% Tween 80. Feces were collected before treatment, 10 and 17 days

after treatment for egg counts (epg). The free and nanoencapsulated EcEO inhibited 97.2% and

92.8% larval hatching in doses 4 and 2 mg/mL, respectively. On the LDT the effectiveness of

free and nanoencapsulated EcEO was 99.8, and 98.1% at the concentration of 8 mg/mL,

respectively. The LD10 and LD50 were 1998.8 and 2653.0 mg/kg, and 1120.9 and 1680.7 mg/kg

for free and nanoencapsulated EcEO respectively. In FECRT the nanoencapsulated and free

EcEO had an efficiency of 52.3 and 36.0% on day 10 post-treatment and 68.0 and 64.8% by day

17 post-treatment respectively. However, opg the treated animals did not differ statistically from

the control. In conclusion, the EcEO did not get the expected efficacy.

Keywords: Chitosan, nanoemulsion, nematodes, Eucalyptus citriodora

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LISTA DE FIGURAS

REVISÃO DE LITERATURA

Figura 1. Folhas, flores e frutos de Eucalyptus citriodora............................................................18

Figura 2. Representações das estruturas primárias de quitina e quitosana, onde n é o grau de

polimerização.................................................................................................................................21

CAPÍTULO 1

Figure 1. Infrared spectra of the sample of Eucalyptus citriodora essential oil nanoencapsulated

with chitosan……………………………………………………………………..………………35

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LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1

Table 1. Effectiveness (± standard error) of free and nanoencapsulated Eucalyptus citriodora

essential oil on Haemonchus contortus eggs hatching……………………………………..……36

Table 2. Effectiveness (± standard error) of free and nanoencapsulated Eucalyptus citriodora

essential oil on Haemonchus contortus larval development…….………………………..……...37

Table 3. Reduction (± standard error) in egg counts per gram of feces (epg) and efficacy of

nanoencapsulated and free Eucalyptus citriodora essential oil

(EcEO)…………………………………………...……………………………………...……….38

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

cm, µm, nm – centímetro, micrômetro, nanômetro

EC50 – Concentration to inhibit 50%

EcEO, OEEc – Óleo essencial de Eucalyptus citriodora, Essential oil of Eucalyptus citriodora

ECUA – Ethics Committee for the Use of Animals

EHT, LDT – Egg hatch test, Larval development test

epg - eggs in feces

FECRT – Fecal egg count reduction test

GC – Gas chromatography

h – horas

IVM, TBZ – Ivermectina, Tiabendazol

kg – quilos

L1, L3– larva de primeiro estágio, larva de terceiro estágio

LD10, LD50- Lethal dose required to 10%, Lethal dose required to 50%

MS – Mass spectrometry

mg, mL, µL – miligramas, mililitros, microlitros

n – número

opg – ovos por grama de fezes

PCS – Photon correlation spectroscopy

rpm – rotações por minuto

T1, T2– Média de opg antes do tratamento, Média de opg pós-tratamento

TDL, TEO – Teste de desenvolvimento larvar, Teste de eclosão de ovos

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO............................................................................................................. 13

2 REVISÃO DE LITERATURA..................................................................................... 15

2.1 Plantas medicinais..................................................................................................... 15

2.2 Óleos essenciais......................................................................................................... 16

2.3 Eucalyptus citriodora................................................................................................ 17

2.4 Encapsulamento......................................................................................................... 20

2.5 Quitosana................................................................................................................... 21

3 JUSTIFICATIVA.......................................................................................................... 23

4 HIPÓTESE CIENTÍFICA............................................................................................ 24

5 OBJETIVOS.................................................................................................................. 25

5.1 Objetivo Geral....................................................................................................... 25

5.2 Objetivos Específicos............................................................................................. 25

6 CAPÍTULO I................................................................................................................. 26

7 CONCLUSÕES............................................................................................................. 45

8 PERSPECTIVAS........................................................................................................... 46

9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................ 47

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1 INTRODUÇÃO

A produção de ovinos e caprinos no Nordeste brasileiro apresenta alguns obstáculos,

dentre eles destacam-se as helmintoses gastrintestinais, representando o mais grave problema

sanitário que acomete os pequenos ruminantes, além de prejudicar economicamente a criação

(VIEIRA, 2008). As perdas econômicas decorrentes das helmintoses são principalmente devido

ao crescimento retardado, perda de peso, redução no consumo de alimentos, queda na produção

de leite, baixa fertilidade e nos casos de infecções maciças, altas taxas de mortalidade, além de

custos para o seu controle (VIEIRA, 1999).

Os nematoides gastrintestinais de ovinos e caprinos identificados na região Nordeste do

Brasil, são: Haemonchus contortus, Trichostrongylus axei, Trichostrongylus colubriformis,

Oesophagostomum columbianum, Trichuris spp., Cooperia spp., Strongyloides papillosus,

Skrjabinema ovis e Bunostomum trigonocephalum. Estes parasitas ocorrem geralmente em

infecções mistas e os sinais clínicos variam com a idade, imunidade, estado nutricional do

hospedeiro, intensidade da carga parasitária e com o gênero de nematoides envolvidos na

infecção, sendo que o mais prevalente é H. contortus (AROSEMENA et al., 1999; SILVA, et al.,

2003). Este nematoide promove elevadas perdas econômicas devido ao hábito hematófago que

acarreta anemia nos animais, além de perda de peso decorrente da diminuição do apetite, danos

às funções gástricas e alterações no metabolismo de proteínas totais (FOX, 1993) e, em elevadas

infecções observa-se edema submandibular. A elevada carga parasitária gera altas taxas de

mortalidade, sendo os animais mais jovens os mais acometidos (SANTA ROSA, 1996).

Os tratamentos utilizando anti-helmínticos previnem e minimizam as perdas de produção

ocasionadas pela verminose gastrintestinal, porém geram elevadas despesas devido à necessidade

de aquisição de fármacos (SOUSA, 2008). Além disso, o uso inadequado de anti-helmínticos

tem resultado na seleção de parasitas resistentes aos princípios ativos disponíveis no mercado

(CARVALHO, 2011).

A resistência anti-helmíntica é consequência de várias modificações genéticas sofridas

pelos organismos de uma população de parasitas devido ao constante uso de um composto

químico, levando-os à sobrevivência (MOTTIER; LANUSSE, 2001). Alguns fatores podem

contribuir para a ocorrência desse fenômeno, como o curto intervalo entre os tratamentos, o uso

de subdosagens e a rápida alternância de diferentes grupos de vermífugos (MOLENTO;

PRICHARD, 1999). Além disso, a maioria dos produtores não vermifugam adequadamente seus

rebanhos em consequência da falta de conhecimentos no que se refere à biologia e à

epidemiologia dos parasitas (VIEIRA et al., 2010). Ultimamente, o fator considerado como o

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mais importante para o desenvolvimento da resistência é a falta de uma população de parasitas

em refugio, que é aquela que ainda não entrou em contato com um anti-helmíntico, sendo,

portanto, uma população sensível. Quando os tratamentos são realizados na seca, época em que a

maior parte da população de parasitas está presente nos animais, estes entram em contato com o

anti-helmíntico, aumentando o número de parasitas resistentes (KENYON et al., 2009).

O desenvolvimento da resistência e a necessidade de reduzir a contaminação anti-

helmíntica, pela presença destes produtos no ambiente e em alimentos de origem animal,

incentivaram busca por novos princípios ativos (NERY et al., 2009). Neste contexto, a utilização

de produtos de origem vegetal no controle do parasitismo por nematoides gastrintestinais pode

ser uma alternativa já que poderão contribuir para a redução do uso e o prolongamento da vida

útil dos medicamentos disponíveis (VIEIRA, 2008).

O conhecimento tradicional sobre a utilização de plantas medicinais na área veterinária

foi adquirido por diversas populações ao longo dos anos e vem sendo repassado verbalmente de

geração a geração (BARBOZA et al., 2007). Em alguns países pode-se observar uma grande

importância com relação ao uso de produtos derivados de plantas, pois o acesso a medicamentos

convencionais para a sanidade animal é difícil (McGAW et al., 2007).

Dentre várias espécies de plantas que estão sendo estudadas, destacam-se as do gênero

Eucalyptus spp., podendo ser considerado como o mais cultivado no mundo (VITTI; BRITO,

2003). Recentemente, o óleo essencial de Eucalyptus citriodora mostrou-se eficaz contra

nematoides gastrintestinais de pequenos ruminantes (MACEDO et al., 2011). Porém, estes

resultados não atingiram os níveis desejados.

Muitas drogas disponíveis no mercado ou produtos que ainda estão sendo testados são

limitados pela baixa disponibilidade no organismo do animal e efeitos secundários indesejáveis

(UNDERWOOD; EPS, 2012). O nanoencapsulamento representa uma alternativa viável e eficaz

contra o parasitismo gastrintestinal, pois pode aumentar a estabilidade física das substâncias

ativas, protegendo-as das interações com os alimentos e aumentando sua atividade (DONSÌ et

al., 2011).

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2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Plantas medicinais

O uso de plantas medicinais tem se destacado devido ao fato de existir uma grande

variabilidade de espécies vegetais associado à facilidade para obtenção e disponibilidade em

determinadas regiões (HEIMERDINGER, 2005). Neste contexto, o Brasil se destaca, pois uma

das suas maiores riquezas é constituída pela biodiversidade de espécies vegetais, constituindo

uma possível fonte para obtenção de novas substâncias com finalidade terapêutica (OMENA et

al., 2007).

Os vegetais possuem dois tipos de metabólitos, denominados primários e secundários, a

partir dos quais se originam os compostos ativos usados no tratamento de diversas doenças. Os

metabólitos primários são substâncias amplamente distribuídas na natureza, estando, no caso de

plantas superiores, concentrados frequentemente em sementes e órgãos de armazenamento. Os

metabólitos primários possuem um importante papel no metabolismo celular básico em virtude

de serem fundamentais para o desenvolvimento fisiológico das plantas (CHAGAS, 2004a).

Os metabólitos secundários são armazenados em menores quantidades que os primários e

a biossíntese desses compostos geralmente é realizada por células e em condições específicas,

dependendo do estágio de desenvolvimento do vegetal e de determinadas condições ecológicas

ou ambientais (CHAGAS, 2004a). A produção dos metabólitos secundários está relacionada à

proteção da planta contra raios ultravioletas, à atração de polinizadores e, ainda, à defesa contra

agentes externos, como microrganismos, insetos e predadores. Dessa forma, estes metabólitos

não são compostos essenciais relacionados ao crescimento e ao desenvolvimento do vegetal

(ATHANASIADOU; KYRIAZAKIS, 2004). Portanto, o metabolismo secundário é considerado

o responsável pela produção de substâncias que, sozinhas ou unidas a outros compostos,

proporcionam as propriedades terapêuticas das plantas. Dentre estes compostos destacam-se os

flavonóides, alcalóides, cumarinas, lignóides, triterpenos, saponinas, polifenóis e taninos

(ALVES, 2001).

Misturas complexas de metabólitos secundários estão presentes em óleos essenciais, dos

quais derivam às essências características ou fragrâncias, desempenhando um papel importante

de proteção dos vegetais (GREATHEAD, 2003). Existe um grande número de plantas

conhecidas atualmente que são utilizadas para a produção de óleos essenciais, destacando-se

diversas espécies que vão desde rasteiras, como é o caso da hortelã, até plantas de porte arbóreo,

como o eucalipto (VITTI; BRITO, 2003).

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2.2 Óleos essenciais

Os óleos essenciais são também chamados de óleos etéreos aromáticos e constituem os

elementos voláteis contidos em vários órgãos das plantas, flores, brotos, sementes, folhas,

galhos, cascas, ervas, madeira, frutas e raízes (GREATHEAD, 2003).

Os óleos essenciais são os responsáveis pela capacidade de adaptação das plantas às

condições do meio em que vivem, proporcionando a capacidade de defesa contra insetos ou

favorecendo sua atração para a dispersão de pólens e sementes; a resistência ao frio quando estão

no estágio de plântula; o efeito alelopático e a redução da perda de água, além disso, reduzem o

apetite dos herbívoros (BAKKALI et al., 2008).

Estudos experimentais relataram uma série de efeitos benéficos promovidos pelos óleos

essenciais para o homem e animais, como: a influência positiva sobre o metabolismo lipídico e

de proteínas ruminais, a produção de ácidos graxos voláteis, a estimulação da digestão de fibras,

a supressão da produção de metano e ação sobre patógenos de origem alimentar (ACAMOVIC;

BROOKER, 2005; BENCHAAR et al., 2008).

Os benefícios dos óleos essenciais são determinados pelos seus componentes que fazem

parte de dois grupos com origem distinta: o grupo principal que inclui os terpenos e terpenóides,

e o grupo dos componentes aromáticos e alifáticos. Todos os compostos de ambos os grupos

possuem um baixo peso molecular (BAKKALI et al., 2008).

Efeitos dos óleos essenciais são atribuídos aos seus compostos principais (BARBOSA et

al., 2010). Porém, muito de suas ações podem ser atribuídas não a um composto isolado, mas ao

sinergismo que existe entre todos os constituintes presentes nos óleos essenciais. Isto quer dizer

que os compostos presentes em menores quantidades, também podem contribuir para melhorar a

atividade do óleo essencial com o aumento da eficácia promovida pelos constituintes presentes

em maiores quantidades (NERIO et al., 2010). Isto reflete a importância da complexa mistura de

constituintes que existe nas composições dos óleos essenciais.

Para que possamos obter uma constituição constante dos óleos essenciais, o ideal seria

extraí-los sob as mesmas condições, ou seja, do mesmo órgão da planta, solo, clima, estação do

ano e, se possível, de plantas que possuam uma idade e estágio do ciclo vegetativo semelhantes

(BAKKALI et al., 2008).

Pesquisas estão sendo realizados para a busca de produtos naturais que sejam igualmente

eficazes quanto os produtos químicos utilizados atualmente. Os óleos essenciais são conhecidos

por possuírem atividade biológica significativa a partir de diversas espécies de plantas. Dentre as

atividades dos óleos essenciais, o efeito nematicida tem se destacado (BARBOSA et al., 2010).

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Óleo essencial extraído de Cymbopogon schoenanthus conseguiu inibir em 97,5% e 93,3% a

eclosão e o desenvolvimento larvar de H. contortus, respectivamente, na concentração de 180

mg/kg (KATIKI et al., 2011). Óleos essenciais extraídos de Croton zehntneri e Lippia sidoides

foram eficazes contra ovos e larvas de H. contortus em 99,9 e 100%, respectivamente, na dose de

1,25mg/mL (CAMURÇA-VASCONCELOS et al., 2007). Óleo essencial de Eucalyptus

staigeriana foi 99,2% eficaz contra ovos e larvas de H. contortus nas doses de 1,35 e 5,4 mg/mL,

respectivamente (MACEDO et al., 2010).

Os óleos essenciais derivados de Eucalyptus spp. são bastante populares no Brasil.

Estima-se que mais da metade de toda a área reflorestada do Brasil está representada por

plantações de eucalipto (VITTI; BRITO, 2003).

2.3 Eucalyptus citriodora

Os óleos essenciais provenientes de Eucalyptus spp. são produzidos por pequenas

cavidades globulares, conhecidas como glândulas que se encontram distribuídas em todo o

parênquima das folhas da maioria das espécies, sendo este o local onde ocorre a sua maior

produção (VITTI; BRITO, 2003).

O óleo extraído das folhas do Eucalyptus spp. possui na sua constituição uma complexa

mistura de componentes orgânicos voláteis que, quando isolados apresentam de 50 a 100 ou até

mais componentes. Dentre eles, destacam-se hidrocarbonetos, álcoois aldeídos, cetonas, ácidos e

ésteres (SINGH et al., 2012).

Existem mais de 600 espécies de Eucalyptus spp. que foram descritas até hoje, destas

pouco mais de 200 foram designadas como produtoras de um relativo teor de óleos essenciais,

porém apenas menos de 20, têm sido usadas na exploração comercial. Dentre elas, três merecem

atenção na produção de óleo essencial no Brasil: E. citriodora, E. globulus e E. staigeriana

(VITTI; BRITO, 2003).

E. citriodora é uma espécie proveniente da Austrália pertencente à família Mirtaceae e

ao sub-gênero Corymbia. Pode ser chamada de eucalipto-cidró ou eucalipto-cheiroso, tendo

como características seu porte que varia em média de 50 a 1000 metros, e a alta densidade de sua

madeira (0,99 g/cm) (Figura 1). É uma espécie bastante indicada para plantios devido aos seus

múltiplos usos. Esta espécie é também conhecida pela presença de óleo essencial em suas folhas

(VITTI; BRITO 1999).

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Figura 1: Folhas, flores e frutos de Eucalyptus citriodora

Fonte: http://www.abundantlifeessentials.com/eucalyptus%20citriodora%20essential%20oil.htm

O óleo essencial de E. citriodora é extraído a partir de folhas parcialmente secas, sendo

amplamente utilizado na indústria de perfumaria e para a produção de mentol sintético a partir do

citronelal. Além deste já foram identificados diversos grupos químicos incluindo

hidrocarbonetos, álcoois, aldeídos, cetonas, ácidos e ésteres (VITTI; BRITO 2003).

No Brasil, os rendimentos do óleo essencial de E. citriodora variam de 1 a 1,6%, o que

significa que a cada tonelada de biomassa foliar destilada pode-se extrair de 10 a 16 kg de óleo

(VITTI; BRITO, 2003).

E. citriodora é a principal espécie comercializada no Brasil, sendo utilizada para

produção de uma gama de produtos essenciais ao bem-estar da sociedade, como papel para

livros, cadernos, higiene pessoal e embalagens; madeira para fabricação de móveis, geração de

energia, carvão vegetal e construção civil (GBENOU et al., 2013). E. citriodora é a espécie que

mais produz óleos essenciais com os quais são fabricados produtos de limpeza, perfumes e

remédios, entre outras aplicações (SINGH et al., 2012).

Diversos estudos demonstraram que citronelal é o principal constituinte de E. citriodora

(BATISH et al., 2008) e tem sido atribuído a este composto as diversas atividades do óleo de E.

citriodora (CLEMENTE et al., 2010). O citronelal pode apresentar-se em diferentes

concentrações: 94,9% (CHAGAS et al., 2002), 71,77% (MACEDO et al., 2011), 60,66%

(SINGH et al., 2012), 83,5% (GBENOU et al., 2013). Tendo como demais constituintes

citronelol (12,58%) e isopulegol (8,19%) (SINGH et al., 2012).

O óleo essencial de E. citriodora e o seu principal composto, o citronelal, tiveram ação

confirmada contra fungos fitopatogênicos, como Macrophomina phaseolina, Colletotrichum

lindemuthianum, Fusarium oxysporum, Helminthosporium oryzae, Alternaria triticina,

Rhizoctonia solani e Alternaria solani (RAMEZANI et al., 2002) e a dose de 40 µL inibiu 100%

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do crescimento micelial de Sclerotium rolfsii, Phytophthora sp, Alternaria alternata,

Colletotrichum sublineolum e R. solani (BONALDO et al., 2007). Este óleo e seus compostos

exibiram atividade antioxidante que variou de moderada a forte o que implicaria em proteção

potencial contra doenças oxidativas podendo ser utilizados como antioxidante natural em

alimentos (SINGH et al., 2012).

E. citriodora apresentou efeito analgésico por 9,43 segundos e anti-inflamatório, além de

conseguir reduzir hipertemia por até 360 minutos e cólicas abdominais sobre ratos Wistar na

dose de 1800 mg/kg (GBENOU et al., 2013). E. citriodora também inibiu a atividade de 17

espécies de bactérias (CIMANGA et al., 2002), assim como, de Staphylococcus aureus,

Escherichia coli e Salmonella choleraeseus (ESTANISLAU et al., 2001).

O efeito inseticida do óleo essencial de E. citriodora foi confirmado pela eficácia de

94,68%, 100% e 88,13% contra ovos, larvas e adultos de Lutzomyia longipalpis, na concentração

de 40, 6,5 e 10 mg/mL, respectivamente (MACIEL et al., 2010). O óleo oriundo das folhas

frescas da planta foi eficaz em 100% sobre formas promastigotas de Leishmania (L.) chagasi

(BRITO, 2007). O efeito acaricida do óleo essencial de E. citriodora foi relatado contra larvas e

fêmeas de B. microplus, obtendo 100% de eficácia nas concentrações de 10 e 25%,

respectivamente (CHAGAS et al., 2002).

O óleo essencial de E. citriodora foi eficaz contra o larvas do nematoide fitoparasita

Meloidogyne incógnita, onde na concentração de 250 ppm obteve um percentual de mortalidade

de 100% (PANDEY et al., 2000). A ação do óleo essencial de E. citriodora contra nematóides

gastrintestinais de pequenos ruminantes foi confirmada in vitro, pois na concentração de 10,6 e

5,3 mg/mL inibiu 99,71 e 98,8% do desenvolvimento larvar e da eclosão de ovos de H.

contortus, respectivamente. O óleo de E. citriodora na dose de 500 mg/kg diminuiu em 58,24% a

contagem de ovos nas fezes de caprinos após 15 dias de tratamento (MACEDO et al., 2011).

Outro estudo in vitro demonstrou que o óleo essencial de E. citriodora na concentração de 5%

conseguiu inibir em 100% a eclosão de larvas de H. contortus, Trichostrongylus spp e

Oesophagostomum spp (CHAGAS, 2004b).

Os resultados obtidos pelo óleo essencial de E. citriodora contra nematoides

gastrintestinais são promissores. Dessa forma, para que se tenha uma melhor eficácia desses

fitoterápicos, há necessidade de novas formulações, que aumentem o tempo de permanência no

organismo do animal. Nesse contexto, o encapsulamento é uma técnica que poderá preencher

esses requisitos.

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2.4 Encapsulamento

O termo encapsulamento é derivado do latim cápsula, que significa pequena caixa. O

encapsulamento consiste basicamente em isolar substâncias do meio externo por um tempo

determinado. O encapsulamento forma uma barreira material, usando-se uma molécula ou uma

partícula sólida, líquida ou gasosa (AZEREDO, 2005). Assim, a indústria farmacêutica utiliza

esta técnica para realizar emulsões fundamentadas em sistemas de liberação controlada, a fim de

promover o transporte de agentes ativos até locais específicos dentro do trato gastrintestinal para

que os bioativos sejam liberados apenas no local de ação (PORTER; WASAN, 2008).

A diferença entre encapsulamento, microencapsulamento e nanoencapsulamento está

apenas no tamanho das partículas. O encapsulamento pode trazer muitos benefícios, como

aumento no tempo de vida útil de um composto volátil, pois a membrana impede a sua

evaporação; a proteção dos efeitos da degradação do princípio ativo; o aumento na absorção de

drogas facilitando a difusão pelo epitélio; modificação do perfil de distribuição e da

farmacocinética da droga no tecido; aumento na penetração e distribuição intracelular da

substância encapsulada (AZEREDO, 2005).

O encapsulamento pode controlar a liberação do princípio ativo aumentando o tempo de

permanência do fármaco no organismo do animal por dias ou semanas. Esta característica pode

ser pertinente para a medicina veterinária, pois a dose utilizada para os medicamentos será menor

quando comparada com a dose do fármaco livre, isto poderá permitir o uso mais abrangente de

medicamentos considerados caros, ou diminuir a quantidade de resíduos nas carcaças e, como

consequência, nos alimentos, levando a um menor impacto ambiental (UNDERWOOD; EPS,

2012).

A escolha do método de encapsulamento é uma etapa importante neste processo e

dependerá: do tamanho da partícula que se quer obter, propriedades físicas e químicas do

bioativo e da matriz, aplicação do produto final, dos mecanismos de liberação e da viabilidade

econômica da produção (AZEREDO, 2005). Porém, não é apenas o método de escolha que irá

garantir o sucesso do encapsulamento, mas também a afinidade entre a matriz e o bioativo, a

forma de armazenamento e a funcionalidade da aplicação final (PARAMERA et al., 2011).

Existe uma variedade de formulações com finalidades diferentes que geram

nanopartículas de diversas formas e tamanhos, com propriedades químicas diferentes, utilizando

diversos tipos de matrizes encapsulantes, como: nanopartículas poliméricas, nanopartículas

sólidas de lipídios, lipossomas, micelas, nanopartículas inorgânicas, nanopartículas magnéticas,

nanoemulsões, dentre outras (UNDERWOOD; EPS, 2012). Nanoemulsões são dispersões onde o

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tamanho das gotas dispersas estão em escala nanométrica, sendo a faixa de tamanho

compreendida entre 1 e 1000 nanômetros (MORAES et al., 2006). As nanoemulsões possuem

algumas vantagens, como: preparação de baixo custo e simples, alta estabilidade, capacidade de

solubilizar substâncias lipofílicas e protege-las da degradação (UNDERWOOD; EPS, 2012).

A liberação do material encapsulado pode ocorrer por difusão por uma rede polimérica,

por rompimento mecânico das partículas, por ativação dos solventes, temperaturas e pressão, ou

ainda, por meios pH-dependentes. Alguns trabalhos chamam atenção sobre o local de liberação

do fármaco, pois estes poderão exercer uma grande influência, com relação ao pH que irão

apresentar, sobre o comportamento das microcápsulas (GASSEROD et al., 1998).

A escolha do material encapsulante ocorre em função das propriedades físicas e químicas

do agente ativo, da aplicação pretendida e do método utilizado para formar as micropartículas. O

encapsulante ideal deve apresentar baixa viscosidade em concentrações elevadas e ser de fácil

manipulação durante o processo; possuir baixa higroscopicidade, para facilitar a manipulação e

evitar aglomeração; não ser reativo com o material a ser encapsulado; ter habilidade de selar e

segurar o material ativo dentro da estrutura da cápsula; liberar completamente o solvente ou

outros materiais utilizados durante o processo de encapsulamento; proporcionar máxima

proteção ao material ativo contra condições adversas, tais como luz, pH, oxigênio e ingredientes

reativos; ser solúvel em solventes comumente usados; possuir as propriedades desejadas de

liberação do material ativo; não apresentar sabor desagradável no caso de consumo oral; e ser

econômico. Os materiais mais utilizados como encapsulantes incluem: carboidratos, gomas,

lipídeos, poliésteres naturais, polímeros sintéticos, proteínas e a quitosana, que é extraída da

casca de crustáceos (SANTOS et al., 2000).

2.5 Quitosana

A quitosana, um biopoliaminosacarídeo natural, é geralmente obtido por desacetilação

alcalina de quitina (Figura 2). É o segundo polímero mais abundante na natureza depois de

celulose, sendo o principal componente do exoesqueleto de crustáceos, como caranguejos,

camarões, lagostins, lagostas, e das paredes celulares de alguns fungos como Aspergillus, Mucor

e Zygomycetes (SINHA et al., 2004). A produção de quitosana é economicamente viável, é um

produto natural, de baixo custo, renovável e biodegradável, de grande importância econômica e

ambiental. Sua utilização reduz o impacto ambiental causado pelo acúmulo nos locais onde é

gerado ou estocado (HEJAZI; AMIJI, 2003; SINHA et al., 2004)

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Figura 2: Representações das estruturas primárias de quitina e quitosana, onde n é o grau de

polimerização (BATTISTI; CAMPANA-FILHO, 2008).

Diversos estudos recentes mostram que a quitosana pode ser utilizada para preparar

microesferas para diversos propósitos. A versatilidade deste polímero permite a preparação de

microesferas de diferentes formas e tamanhos, envolvendo vários produtos e derivados. Podem-

se destacar o fato de que, sendo a quitosana um polissacarídeo, apresenta ainda a vantagem de ter

alta estabilidade em solventes orgânicos em adição à hidrofilicidade e à porosidade dos produtos

formados (DENKBAS et al., 2002). Quando comparada a outros polímeros, a grande quantidade

de orifícios/poros se mostra de maneira linear desde a superfície até seu interior, provendo desta

maneira uma grande difusão do substrato (AZEVEDO et al., 2007).

Dentre as diversas aplicações da quitosana, pode-se destacar a sua utilização na indústria

farmacêutica como adjuvante em formulações sólidas de uso oral, atuando na liberação

controlada de fármacos e melhorando a dissolução e biodisponibilidade de fármacos insolúveis

em água, uma vez que ela apresenta vantagens tais como não-toxicidade, biocompatibilidade e

mucoadesividade (BRANNON-PEPPAS, 1995).

Uma solução de 4% (v/v) de quitosana foi utilizada para encapsular o óleo essencial de E.

staigeriana na formulação de hidrogel, onde houve redução quatro dias pós-tratamento de

40,51% da carga parasitária de Meriones unguiculatus infectados experimentalmente com H.

contortus, na dose de 500 mg/kg por três dias consecutivos (RIBEIRO et al., 2013). Esta mesma

formulação, na dose de 365 mg/kg, foi eficaz contra nematoides gastrintestinais de pequeno

ruminantes, onde houve redução de 60,79% da carga parasitária, treze dias pós-tratamento

(MESQUITA et al., 2013).

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3 JUSTIFICATIVA

O controle dos nematoides é realizado basicamente pela utilização de anti-helmínticos

sintéticos, porém o advento da resistência anti-helmíntica exige a pesquisa de novas substâncias.

Na busca por fitoterápicos, E. citriodora apresenta-se como uma das espécies mais promissoras.

No entanto, a eficácia obtida pelo óleo essencial de E. citriodora, até o presente momento, não

atingiu os níveis esperados. Devido à necessidade de melhorar os resultados propõe-se o

nanoencapsulamento como forma para promover uma maior estabilidade, manter uma ação mais

prolongada da droga e consequentemente aumentar a eficácia do óleo.

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4 HIPÓTESE CIENTÍFICA

O nanoencapsulamento do óleo essencial de E. citriodora promove uma liberação lenta,

aumentando sua eficácia sobre nematoides gastrintestinais de pequenos ruminantes.

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5 OBJETIVOS

5.1 Geral

Avaliar a atividade do óleo essencial de E. citriodora nanoencapsulado contra nematoides

gastrintestinais de pequenos ruminantes.

5.2 Específicos

• Avaliar a ação de E. citriodora nanoencapsulado e livre sobre ovos e larvas de H. contortus;

• Determinar a toxicidade aguda do óleo essencial de E. citriodora nanoencapsulado em

camundongos;

• Avaliar a ação do óleo essencial de E. citriodora sobre a redução de ovos nas fezes de ovinos

naturalmente infectados com nematoides gastrintestinais.

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6 CAPÍTULO 1

Ação do óleo essencial de Eucalyptus citriodora nanoencapsulado e livre sobre nematoides

gastrintestinais de pequenos ruminantes

Effect of free and nanoencapsulated Eucalyptus citriodora essential oils on small ruminant

gastrointestinal nematodes

Periódico: Veterinary Parasitology (Submetido em novembro de 2013)

Qualis: A1

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Effect of free and nanoencapsulated Eucalyptus citriodora essential oils on small ruminant

gastrointestinal nematodes

Juliana de Carvalho Ribeiro1, Iara Tersia Freitas Macedo1, Wesley Lyeverton Correia Ribeiro1,

Ana Lourdes Fernandes Camurça-Vasconcelos1, Jessica Maria Leite dos Santos1, Haroldo Cesar

Beserra de Paula2, José Vilemar de Araújo Filho1, Rafaela Damasceno Magalhães1, Claudia

Maria Leal Bevilaqua1*

1Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias, Universidade Estadual do Ceará, Brazil;

2Departamento de Química Analítica e Físico Química, Universidade Federal do Ceará, Brazil

* Corresponding author:

Claudia Maria Leal Bevilaqua

Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias/FAVET/UECE

Av. Dedé Brasil, 1700, Campus do Itaperi

CEP 60714-903

Fortaleza, Ceará, Brazil

Phone: + 55 85 31019853 Fax: + 55 85 31019840

E-mail: [email protected]

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Resumo

O desenvolvimento de fitoterápicos com ação anti-helmíntica pode ser uma alternativa para o

controle e prevenção sustentável dos nematoides gastrintestinais. O nanoencapsulamento de

óleos essenciais poderá aumentar a absorção de fármacos melhorando sua eficácia. O presente

estudo teve como objetivo avaliar a eficácia in vitro e in vivo do óleo essencial de E.

citriodora (OEEc) livre e nanoencapsulado sobre nematoides gastrintestinais de pequenos

ruminantes. A quitosana foi utilizada como matriz para a formulação de uma nanoemulsão.

Foram realizadas análises cromatográficas e físico-químicas do OEEc. Os testes de eclosão

ovos (TEO) e de desenvolvimento larvar (TDL) avaliaram a eficácia do OEEc

nanoencapsulado e livre sobre ovos e larvas de Haemonchus contortus. A toxicidade aguda do

OEEc foi avaliada utilizando camundongos. A eficácia in vivo foi calculada pela redução da

contagem de ovos nas fezes (FECRT) utilizando 30 ovinos naturalmente infectados com

nematoides gastrintestinais que foram tratados com 250 mg/kg do OEEc livre e

nanoencapsulado. O OEEc livre e nanoencapsulado inibiu a eclosão das larvas em 97,16% e

92,84%, nas concentrações de 4 e 2 mg/ml, respectivamente. OEEc livre e nanoencapsulado

na concentração de 8 mg/ml inibiu o desenvolvimento larvar em 99,76% e 98,07%,

respectivamente. No teste de toxicidade aguda a DL10 e DL50 do OEEc livre e

nanoencapsulado foram de 1998,97 e 2653,05 mg/kg, e de 1120,92 e 1680,67 mg/kg,

respectivamente. OEEc livre e nanoencapsulado reduziu a contagem de ovos nas fezes nos

dias 10 e 17 pós-tratamento porém estes resultados não diferiram significativamente do

controle. O OEEc nanencapsulado não obteve a eficácia esperada in vivo, porém seu uso não

deve ser descartado, pois novas formulações podem ser desenvolvidas para melhorar a

disposição deste óleo no organismo do animal.

Palavras-chave: Quitosana, nanoemulsão, nematoides, Eucalyptus citriodora

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Abstract

Herbal medicines with anthelmintic effects are alternatives for the sustainable control and

prevention of gastrointestinal nematodes. The nanoencapsulation process of essential oils has

been proposed to enhance the absorption of their constituents and improve their efficacy. The

present study aimed to evaluate the efficacy of free and nanoencapsulated Eucalyptus

citriodora essential oil (EcEO) on the gastrointestinal nematodes of small ruminants in vitro

and in vivo. Chitosan was used as a matrix for the formulation of a nanoemulsion.

Chromatographic and physico-chemical analyses of EcEO were performed. Egg Hatch (EHT)

and larval development (LDT) tests were conducted to evaluate the effectiveness of

nanoencapsulated and free EcEO on the eggs and larvae of Haemonchus contortus. Acute

toxicity of free and nanoencapsulated EcEO was evaluated using laboratory animals. Finally,

in vivo efficacy was calculated by treating 30 sheep naturally infected with gastrointestinal

nematodes with 250 mg/kg of free and nanoencapsulated EcEO, which reduced their fecal egg

counts (FECRT). The free and nanoencapsulated EcEO inhibited larvae hatching in 97.16%

and 92.84% at 4 and 2 mg/ml, respectively. Free and nanoencapsulated EcEO at 8 mg/ml

inhibited larval development in 99.76% and 98.07%, respectively. In the acute toxicity test,

the LD10 and LD50 of free EcEO was 1998.97 and 2653.05 mg/kg, respectively, while the

LD10 and LD50 of nanoencapsulated EcEO was 1120.92 and 1680.67 mg/kg, respectively.

Nanoencapsulated and free EcEO reduced fecal egg counts at 10 and 17 days post-treatment,

but these results did not significantly differ from the control. Nanoencapsulated EcEO did not

obtain the expected efficacy in vivo, but new formulations can be developed to improve the

use of this oil in animals.

Keywords: Chitosan, nanoemulsion, nematodes, Eucalyptus citriodora

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1. Introduction

Diseases caused by gastrointestinal nematodes in small ruminants reduce animal

production, causing serious economic losses worldwide (Molento, 2009). In northeastern

Brazil, the following nematodes have already been described: Trichostrongylus spp.,

Oesophagostomum spp., Cooperia spp., Trichuris spp. and Haemonchus contortus, which is

an abomasal nematode that is prevalent throughout the region (Melo et al., 2009). The

inappropriate use of conventional anthelmintics to treat this parasitism led to the emergence of

drug-resistant nematode populations (Jackson and Coop, 2000).

Currently, low cost and less harmful methods have been studied to control and prevent

gastrointestinal parasite infections. Among these are pasture management, selection of

nematode resistant animals and the development of herbal medicines with anthelmintic

activity, which involves the formulation of herbal drugs and their metabolites (Vieira, 2008;

Hoste and Torres-Acosta, 2011).

Eucalyptus spp., belonging to the family Myrtaceae, has several species of economic

importance, and its essential oils have been used for various purposes (Vitti and Brito, 1999;

Silva et al., 2006). The essential oil of Eucalyptus citriodora is well known for its use in the

fragrance industry, and its major constituent is citronellal (Vitti and Brito, 2003). Studies have

shown that E. citriodora oil functions as an antioxidant (Singh et al., 2012), antifungal (Brito

et al., 2012), antibacterial (Cimanga et al., 2002) anti-inflammatory, analgesic (Gbenou et al.,

2013), insect repellent (Seyoum et al., 2003), insecticide (Maciel et al., 2010, Zoubiri and

Baaliouamer, 2011), acaricide (Clement et al., 2010) and nematicide (Macedo et al., 2011).

The encapsulation of essential oils of Eucalyptus spp. was used to improve their

efficacy against gastrointestinal nematodes of small ruminants (Mesquita et al., 2013; Ribeiro

et al., 2013). Encapsulation is the incorporation of a bioactive substance into a material called

an encapsulating matrix, coating material or carrier (Paramera et al., 2011). This incorporation

protects the drug from degradation, improves its absorption and facilitates its diffusion

through the epithelium, thus promoting tissue and intracellular distribution more efficiently

(Couvreur and Vauthier, 2006).

Chitosan is a natural polymer (Sahoo, et al., 2010) obtained by the deacetylation of

chitin, the main component of the exoskeleton of crustaceans (Zivanovic et al., 2005) and the

cell wall of some fungi (Sinha et al., 2004). It has been used as an encapsulating matrix for

drug delivery because it is biodegradable, biocompatible, renewable, non-toxic and aqueous,

and it circumvents the need for organic solvents (Senel et al., 2000; Abreu et al., 2012). The

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chitosan microsphere formulation for the controlled release of drugs improves their

dissolution and bioavailability (Hejazi and Amiji, 2003; Sinha et al., 2004). Thus, the aim of

this study was to evaluate the action of the essential oil of E. citriodora on the gastrointestinal

nematodes of small ruminants by comparing both free and nanoencapsulated forms.

2. Materials and Methods

This study was approved by the Ethics Committee for the Use of Animals of State

University of Ceará under protocol number 12641984-1 and followed the standards of animal

welfare recommended by law.

2.1 Chemical analysis of E. citriodora essential oil

E. citriodora essential oil (EcEO) was purchased from FERQUIMA® (Vargem Grande

Paulista, São Paulo, Brazil). The chemical composition of the EcEO used in this study was

determined by gas chromatography (GC) and mass spectrometry (MS). The oil was analyzed

in a Hewlett-Packard 5971 instrument using the following experimental conditions: DB-1

coated fused silica capillary column (30 m × 0.25 mm); helium carrier gas; injector

temperature of 250°C; detector temperature of 200°C; column temperature

program: 35 to 180°C at 48°C/min and then 180 to 250°C at 10°C/min. For MS, the electron

impact was 70 eV.

Compounds of EcEO were identified according to their GC retention time expressed

through Kovat’s index, which was calculated by the Van den Dool and Kratz equation using a

hydrocarbon homologous series. Additionally, the test compound mass spectra were

compared to spectra in the National Institute for Standard Technology computer

database (NIST; 62,235 compounds) and published spectra (Adams, 2001).

2.2 Nanoencapsulation of E. citriodora essential oil

Chitosan powder (POLYMAR®) was used as encapsulant biopolymer. Chitosan was

solubilized in acetic acid (1%) under constant stirring for 24 hours to obtain a solution of 1%

chitosan. At the end of this period, vacuum filtration was conducted for the remaining

particles still in suspension. In parallel, Tween 80 was added to EcEO at a ratio of 1:4 under

constant stirring for 10 minutes. The organic phase (EcEO + Tween 80) was added to the 1%

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chitosan solution under mechanical stirring for 5 minutes at 18000 rpm, thereby obtaining a

nanoemulsion of chitosan. We tested various proportions of the organic phase in relation to

the chitosan solution to obtain a stable product containing higher oil content. The macroscopic

characteristics of EcEO stability were observed for 72 hours after the preparation of the

nanoemulsion to monitor for a possible phase separation.

2.3 Physicochemical characterization of the nanoemulsion

The nanoemulsion of EcEO was characterized by infrared spectroscopy (FTIR) using

the Shimadzu instrument, model 8300. The particle size and distribution were determined by

photon correlation spectroscopy (PCS) on a Malvern Zetasizer Zen model 3500.

2.4 Egg hatch test (EHT)

Feces was collected directly from the rectum of sheep harboring a monospecific

infection of H. contortus and kept in metabolic cages. H. contortus eggs were recovered

according to Hubert and Kerboeuf (1992). The egg hatch test (EHT) was performed based on

the methodology described by Coles et al. (2006). Briefly, 250 µl of an egg suspension,

containing approximately 100 fresh eggs, was incubated with 250 µl of EcEO at

concentrations of 4, 2, 1, 0.5, 0.25 and 0.125 mg/ml in test tubes for 48 hours at 25°C. After

this time, drops of Lugol were added to the tubes. The eggs and first stage larvae (L1) were

counted under a microscope. Five groups were included: G1: nanoencapsulated EcEO; G2:

free EcEO; G3: negative control consisting of 3% Tween 80 and 1% chitosan; G4: negative

control consisting of 3% Tween 80; and G5: positive control consisting of 0.025 mg/ml

thiabendazole. Three repetitions with five replicates for each concentration and for each

control were performed.

2.5 Larval development test (LDT)

The larval development test (LDT) was performed using an aliquot of egg suspension

obtained as described by Hubert and Kerboeuf (1992). The suspension was incubated

for 24 hours at 37°C to obtain L1. The LDT was performed as described by Camurça-

Vasconcelos et al. (2007). A 1 ml aliquot of solution containing approximately 250 L1 H.

contortus was incubated with 2 g of feces collected from a sheep free of gastrointestinal

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nematodes, and it was added to 1 ml of the oils. After six days, third stage larvae (L3) were

recovered, and drops of Lugol were added. The L3 were counted under an optical microscope.

In this test, five groups were included: G1: nanoencapsulated EcEO at concentrations of 8, 4,

2, 1 and 0.5 mg/ml; G2: free EcEO at the same concentrations; G3: negative control

consisting of 3% Tween 80 and 1% chitosan; G4: negative control consisting of 3% Tween

80; G5: positive control with 0.008 mg/ml ivermectin. Three repetitions with five replicates

for each concentration and for each control were performed.

2.6 Acute toxicity test

A total of 90 female Swiss albino mice (Mus musculus) were used, and they weighed

between 25.8 and 32.6 g. The mice were kept in polypropylene cages and given commercial

feed and water ad libitum. The animals were randomly divided into groups (n = 10) based on

treatment: G1 to G4: 500, 1000, 1500 and 2000 mg/kg of nanoencapsulated EcEO, G5 to G8:

2000, 2500, 3000 and 3500 mg/kg of free EcEO and G9: 4000 mg/kg of matrix containing 1%

chitosan solution and 3% Tween 80.

A single dose of the oils and chitosan solution (control) were orally administered by

esophageal gavage. The doses were established from the results of Macedo et al. (2011)

assuming the nanoencapsulated oil could increase toxicity. The animals were observed for 15

days, and behavioral changes and mortality were recorded. The total number of dead animals

was recorded to calculate the lethal dose for 10% (LD10) and 50% (LD50) of animals.

2.7 Fecal egg count reduction test (FECRT)

A total of 30 mongrel sheep of both sexes were used, and they weighed 30 kg on

average and were aged between 6 and 18 months. The sheep lived in semi-intensive systems,

were fed with commercial feed and hay and received mineral salt and water ad libitum.

The choice of animals was performed according to the number of eggs in feces (epg)

over 500 using the McMaster technique (Ueno and Goncalves, 1998). The sheep were divided

into 3 groups (n = 10): G1: 250 mg/kg of nanoencapsulated EcEO; G2: 250 mg/kg of free

EcEO; and G3: 250 mg/kg of 1% chitosan and 3% Tween 80. Feces was collected directly

from the rectum of the animals before and after 10 and 17 days of treatment. Treatment

efficacy was determined by the reduction of epg. Fecal cultures were performed according to

the method of Roberts and O'Sullivan (1950) for the identification of larvae.

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34

2.8 Statistical analysis

The results of in vitro tests are presented as percentages and were analyzed by an

analysis of variance (ANOVA) followed by comparison with the Tukey test using Graph Pad

Prism 5.0 software. The significance level was set at 5%.

For EHT, the efficacy of each treatment was calculated based on the percentage of

hatching using the following formula: (number of hatched larvae / number of hatched larvae

+ number of eggs) x 100. For the LDT, the efficacy of each treatment was calculated using

the formula: [(L3 control group - L3 treated group) / L3 control group] x 100. The effective

concentration to inhibit 50% (EC50) of hatching and larval development was calculated by

linear regression between the dose and efficacy using probit analysis with the SPSS 8.0

software.

The doses required to kill 50% (LD50) and 10% (DL10) of mice were calculated from

the acute toxicity by probit analysis with the SPSS 8.0 software.

The effectiveness of FECRT was calculated by the BootStreet program through

arithmetic average, using the formula 100 x (1 - [T2 / T1]), where T1 and T2 are the average

epg before and after treatment, respectively (Kochapakdee et al., 1995). To compare the

differences between epg, the data were transformed to log (x + 1) and subjected to an

ANOVA to compare the significant differences between groups by Tukey's test using the

Graph Pad Prism 5.0 software. The significance level was set to 5%.

3. Results

Chromatographic analysis revealed that the major EcEO components were citronellal

(67.48%), citronellol (6.95%) and menthol (6.10%).

To obtain a stable nanoemulsion (no phase separation), 36.36% (v/v) of the EcEO

content was used. Analysis of the resulting nanoemulsion particles demonstrated a mean size

of 232 nm with unimodal distribution and polydispersity. By infrared spectroscopy, chitosan

displayed bands appearing at 1643, 1457, 1375 and 1099 cm-1 (Figure 1). The characteristic

bands of citronellal can be observed at 2923 and 1742 cm-1 and are assigned to CH and C=O

aldehyde groups, respectively. Vibrational modes of (CH) methyls and methylenes of the

essential oil components were observed between 3000 and 2800 cm-1. The band of the

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hydroxyl groups (OH) of chitosan and the essential oil components was observed between

3500 and 3340 cm-1.

Figure 1: Infrared spectra of the sample of Eucalyptus citriodora essential oil

nanoencapsulated with chitosan.

The inhibition of egg hatching was dose-dependent, and the results are shown in

Table 1. The dose of 4 mg/ml of free EcEO inhibited 97.16% of hatching eggs, while the

nanoencapsulated EcEO inhibited 92.84% at a dose of 2 mg/ml. The effective doses to inhibit

50% of hatching eggs (EC50) were 1.33 (0.49 to 8.70) and 0.412 (0.36 to 0.46) mg/ml for free

and nanoencapsulated EcEO, respectively.

4000 3000 2000 10000,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6A

bsor

banc

e

Wavenumber (cm-1)

3438 cm-1

2923 cm-1

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36

Table 1. Effectiveness (± standard error) of free and nanoencapsulated Eucalyptus citriodora

essential oil on Haemonchus contortus eggs hatching.

Concentrations (mg/ml) Effectiveness (%)

Free EcEO Nanoencapsulated EcEO

4 97.16 ± 0.28Aª -

2 58.57 ± 3.21Cb 92.84 ± 1.54Aa

1 23.51 ± 1.87Dc 85.52 ± 2.32Bb

0.5 16.09 ± 1.39EFd 56.86 ± 2.66Cc

0.25 12.51 ± 0.99EFde 25.99 ± 1.36Dd

0.125 - 11.90 ± 0.91Ee

Control 7.46 ± 0.72EFe 9.11 ± 0.57Fe

*TBZ (0.025 mg/ml) 93.57 ± 1.13Aa 93.57 ± 1.13Aa

Capital letters compare the means between the lines. Lowercase letters compare the means between

the columns. Results show different letters differ significantly (P <0.05).

*TBZ: Tiabendazol

The effectiveness of the larval development test was also dose-dependent, and the

results are shown in Table 2. The most effective concentration was 8 mg/ml for both the free

and nanoencapsulated EcEO, which inhibited larval development in 99.76% and 98.07% of

cases, respectively. The EC50 for the development of larvae and 95% confidence intervals

were 1.68 (1.06 to 2.63) and 1.67 (1.05 to 2.58) mg/ml for free and nanoencapsulated EcEO,

respectively.

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37

Table 2. Effectiveness (± standard error) of free and nanoencapsulated Eucalyptus citriodora

essential oil on Haemonchus contortus larval development.

Concentrations (mg/ml) Effectiveness (%)

Free EcEO Nanoencapsulated EcEO

8 99.76 ± 0.16Aa 98.07 ± 0.52Aa

4 83.81 ± 1.70Bb 75.81 ± 2.55Bb

2 47.53 ± 3.15Cc 49.40 ± 2.34Cc

1 25.12 ± 1.37Dd 39.14 ± 3.29Cc

0.5 14.48 ± 2.76Ee 10.07 ± 2.97De

Control 7.74 ± 2.59Ee 7.70 ± 1.67De

*IVM (0.008 mg/ml) 98.90 ± 0.25Aa 98.79 ± 0.26Aa

Capital letters compare the means between the lines. Lowercase letters compare the means

between the columns. Results show different letters differ significantly (P <0.05).

*IVM: Ivermectina

In the acute toxicity test, the LD10 and LD50 of free EcEO was 1998.97 (1365.5 to

2286.1) mg/kg and 2653.05 (2337.9 to 2967.49) mg/kg, respectively, and the LD10 and LD50

of nanoencapsulated EcEO was 1120.92 (551.7 to 1355.5) mg/kg and 1680.67 (1404.0 to

2269.4) mg/kg, respectively.

The reduction in egg counts (FECRT) of free and nanoencapsulated EcEO are

expressed as the mean epg on days 0, 10 and 17 post-treatment (Table 3). Nanoencapsulated

and free EcEO reduced fecal egg counts in 64.76% and 67.96% at 17 days post-treatment, but

these results did not significantly differ from the control.

The larvae recovered in fecal cultures of sheep before treatment were identified as

Haemonchus spp. (94%), Trichostrongylus spp. (5%) and Oesophagostumum spp. (1%), while

those recovered 10 days after treatment were Haemonchus spp. (90%), Trichostrongylus spp.

(7%) and Oesophagostumum spp. (3%).

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38

Table 3. Mean (± standard error) in egg counts per gram of feces (epg) and efficacy of

nanoencapsulated and free Eucalyptus citriodora essential oil (EcEO).

Treatments Day 0 Day 10 Diay 17

Free EcEO

Mean epg 1920 ± 414.1Aa 915 ± 279.4Aab 615 ± 231.7Ab

Effectiveness (%) - 52.34 67.96

Nanoencapsulated EcEO

Mean epg 1930 ± 407.9Aa 1235 ± 282.2Aab 680 ± 174.5Ab

Effectiveness (%) - 36.01 64.76

Tween 80 (3%) + Chitosan

Mean epg 1890 ± 378.8Aa 2075 ± 444.2Aa 940 ± 205.9Aa

Capital letters compare the means among the lines. Lower case letters compare the means between

the columns. Results show different letters differ significantly (P <0.05).

4. Discussion

Anthelmintic resistance and the appreciation of organic animals have boosted the

development of herbal medicines with anthelmintic activity, as this treatment is required in

small ruminant husbandry. Among the studied products are essential oils, which are volatile

substances. The use of nanoemulsions is intended to prevent oil degradation for oral

administration, improving absorption in the animal body (Donsì et al., 2011). This can lead to

increased efficiency of the product with a consequent reduction in the frequency of treatment

(Cui et al., 2006). The process of nanoemulsion in this work was satisfactory because the

formulated particles ranged from 1-1000 nm (Irache et al., 2011). The percentage of

encapsulation obtained was similar to other studies that used hydrogel formulations, which

were obtained at a concentration of 36.5% (v/v) (Mesquita et al., 2013; Ribeiro et al., 2013).

The use of chitosan as a matrix to encapsulate essential oils or their compounds has

been successful in several studies using various encapsulation techniques (Keawchaoon and

Yoksan, 2011). Chitosan has a positive charge, which in turn draws lipids of a negative

charge (Azevedo et al., 2007). Consequently, the compounds bind strongly. This was the

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39

reason for the choice of chitosan as a matrix to encapsulate EcEO. Furthermore, the

hydrophilic-lipophilic balance of this substance is high, which allows it to stabilize oil-water

emulsions (Schulz, 1998).

Infrared radiation causes atoms and groups of atoms in organic compounds to vibrate

with increased amplitude around the covalent bonds that connect them. The vibrational

spectrum usually appears as a series of bands. The positions of the bands in the spectrum can

be displayed as a wave number using reverse drive centimeters (400 - 400 cm-1) or

micrometers (2,5 - 16 µm) (Lopes and Fascio, 2004). The bands for chitosan and citronellal

are characteristic of these compounds (Paula et al., 2011). However, the band at 1565 cm-1,

which corresponds to the group II amide of chitosan, disappeared. This was most likely due to

a joining of the group II amide with the aldehyde citronellal groups (Abreu et al., 2012),

demonstrating encapsulation of EcEO by chitosan.

In vitro studies with the EcEO have demonstrated its lethal effect on Trypanosoma

protozoans (Habila et al., 2010). It was also effective against Lutzomyia longipalpis in

different life stages compared to other species of Eucalyptus spp. (Maciel et al., 2010) and

against engorged larvae of Amblyomma cajennense, Anocentor nitens (Clement et al., 2010)

and Boophilus microplus (Chagas et al., 2002).

EcEO was also effective against gastrointestinal nematodes, inhibiting H. contortus

egg hatching by 98.8% at a dose of 5.3 mg/ml (Macedo et al., 2011). The results from this

study differed, as we obtained a similar efficiency using only 4 mg/ml of free EcEO and 2

mg/ml of nanoencapsulated EcEO. Although chitosan is insoluble in water, organic solvents

and bases (Damian et al., 2005), the prior solubilization of chitosan in acetic acid in the

present study made it water-soluble, explaining the improved effectiveness of the

nanoencapsulated oil.

For the LDT, the results obtained with the free or nanoencapsulated oil were

statistically similar and did not differ from previous studies (Macedo et al., 2011). This is

likely due to the use of feces in the culture medium, which hindered the solubility of chitosan

and consequently, hindered the effect on the larvae.

Previous studies have shown that the LD10 and LD50, conducted through acute

toxicity tests of EcEO, were 2609 (689.7 to 3466.4) mg/kg and 4153.2 (2861.8 to 5849.2)

mg/kg, respectively (Macedo et al., 2011). These results do not corroborate the current study

because the lethal doses were lower for the free and nanoencapsulated EcEO. Furthermore,

the nanoencapsuled oil toxicity incresead, chitosan is not known toxic, so this process resulted

in increased oil toxicity.

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40

The effectiveness of EcEO at 500 mg/kg over three consecutive days in sheep was

66.25% and 60.34% at 8 and 15 days post-treatment, respectively (Macedo et al., 2011). In

the present study, we observed increased efficacy of free and nanoencapsulated oil, as similar

results were obtained with only 250 mg/kg. The increase in the effectiveness of

nanoencapsulated EcEO 17 days post-treatment is due to the slow release provided by the

nanoemulsion. Nevertheless, the fecal egg counts did not differ statistically between the

control and the treatments. This may be because the test was performed at the beginning of

the dry season in the semi-arid region of northeastern Brazil. At this time, the epg and worm

burdens suffer drastic reductions because the free-living stages cannot survive on pasture

(Arosemena et al., 1999).

The nanoencapsulated EcEO did not generate the expected results, likely because the

chitosan matrix did not have the desired effect. However, the use of this oil for the control of

gastrointestinal nematodes in small ruminants should not be disregarded because it is possible

to develop other encapsulating matrices that are more efficient than chitosan. Thus, plant

products can be an alternative for the control of these parasites and may be used in

combination with synthetic products to enhance their effectiveness.

Acknowledgements

The authors would like to thank PRODOC/CAPES and CNPq for a scholarship. Dr. Bevilaqua

and Dr. Camurça-Vasconcelos have grants from CNPq and CAPES, respectively.

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7 CONCLUSÕES

• O OEEc livre e nanoencapsulado obteve eficácia contra ovos e larvas de H. contortus;

• O processo de nanoencapsulamento proporcionou um aumento na toxicidade do OEEc;

• O OEEc livre e nanoencapsulado não obteve a eficácia esperada in vivo;

• O processo de nanoencapsulamento utilizando uma solução de quitosana 1%, não aumentou a

eficácia do OEEc sobre nematoides gastrintestinais de pequenos ruminantes.

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8 PERSPECTIVA

O encapsulamento de fitoterápicos é um método que poderá contribuir com o aumento

na eficácia de produtos naturais. Porém, mais pesquisas nessa área precisam ser desenvolvidas

para que se obtenha um produto eficiente e de qualidade.

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