11

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS

FLÁVIA MARTINS DA SILVA

AVALIAÇÃO DO ESTRESSE ETANÓLICO EM LEVEDURAS NÃO

SACCHAROMYCES DO GÊNERO HANSENIASPORA: UMA CONTRIBUIÇÃO

BIOTECNOLÓGICA

Salvador 2014

12

FLÁVIA MARTINS DA SILVA

AVALIAÇÃO DO ESTRESSE ETANÓLICO EM LEVEDURAS NÃO

SACCHAROMYCES DO GÊNERO HANSENIASPORA: UMA CONTRIBUIÇÃO

BIOTECNOLÓGICA

Orientadora: Profª Drª Maria Eugênia de Oliveira Mamede Co-orientadora: Profª Drª Suzana Telles da Cunha Lima

Dissertação apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade Federal da Bahia, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos, para obtenção do título de Mestre.

Salvador 2014

13

Sistema de Bibliotecas - UFBA

Silva, Flávia Martins da.

Avaliação do estresse etanólico em leveduras não Saccharomyces do gênero Hanseniaspora :

uma contribuição biotecnológica / Flávia Martins da Silva. - 2015.

61 f.: il.

Orientadora: Profª. Drª. Maria Eugênia de Oliveira Mamede.

Co-orientadora: Profª. Drª. Suzana Telles da Cunha Lima.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Faculdade de Farmácia, Salvador,

2014.

14

AVALIAÇÃO DO ESTRESSE ETANÓLICO EM LEVEDURAS NÃO

SACCHAROMYCES DO GÊNERO HANSENIASPORA: UMA CONTRIBUIÇÃO

BIOTECNOLÓGICA

Dissertação apresentada à Faculdade de Farmácia da Universidade Federal da Bahia, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos, para obtenção do título de Mestre.

Aprovada em: ____/_____/______

Banca Examinadora: Profª Drª Maria Eugênia de Oliveira Mamade – Orientação Faculdade de Fármacia - (FFAR) Universidade Federal da Bahia - (UFBA) _____________________________________________ Prof. Dr. Celso Duarte Carvalho Filho Faculdade de Farmácia (UFBA) _____________________________________________ Profª Drª Adriana Oliveira Medeiros Instituto de Biologia - (UFBA) _____________________________________________

15

Dedico esta tese à minha mãe e ao meu pai, e

minha irmã que através do apoio e amor

incondicionais tornaram possíveis todas as

conquistas da minha vida.

16

AGRADECIMENTOS

A minha orientadora Profª Drª Maria Eugênia de Oliveira Mamede pelos

ensinamentos e confiança.

A Profº Drª Suzana Telles da Cunha Lima agradeço profundamente pela

delicadeza, profissionalismo, ética, integridade, paciência, dispensando vários

momentos do seu tempo em orientação e conversas que muito contribuíram para a

execução do meu trabalho. Tenho certeza que levarei para sempre os ensinamentos

dessa admirável profissional e pessoa humana extraordinária.

A Profª Drª Alaise Gil meu muito obrigado pelo carinho, dedicação e a forma

respeitosa que sempre me tratou.

Sou muito grata ao Departamento de Biologia, especialmente a Profª Paula

Ristow pela paciência e acolhimento ao LBM – Laboratório de Biologia Molecular.

A todos os meus queridos colegas que se transformaram em importantes

amigos Adriana, Willian, Igor, Candé meu sincero muito obrigada pelo

companheirismo, parceria e cumplicidade.

Ao LAMUME (Laboratório Multiusuário de Microscopia Eletrônica), do

Laboratório de Física Nuclear Aplicada no Instituto de Física. Ao Professor Antônio

Ferreira por ceder a estrutura do (MEV) e a dedicação de Jessica Guerreiro, a eles o

meu muito obrigada.

A amiga Elizabeth pelos momentos do seu tempo que dedicou na sua ajuda,

carinho e atenção.

17

“Não é o mais forte que sobrevive, nem o mais

inteligente, mas o que melhor se adapta as

mudanças”

Charles Darwin

18

SILVA,Flávia Martins. AVALIAÇÃO DO ESTRESSE ETANÓLICO EM LEVEDURAS

NÃO SACCHAROMYCES DO GÊNERO HANSENIASPORA: UMA

CONTRIBUIÇÃO BIOTECNOLÓGICA.61f.2014. Dissertação (Mestrado) –

Faculdade de Farmácia, Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2014.

Orientadora: Profª Drª Maria Eugênia de Oliveira Mamede.

RESUMO

As leveduras do gênero Hanseniasporas contribuem durante a fermentação etanólica

do mosto uvas com a produção de compostos voláteis que proporcionam sabor, aroma e

características singulares ao vinho. O etanol produzido durante fermentação é um potente

fator de estresse, para as Hanseniasporas provocando inibição do crescimento e

inviabilidade celular, pois, estas não toleram concentrações crescentes de etanol no meio.

No entanto, as leveduras como Saccharomyceas são mais resistentes ao etanol, por

exibirem proteínas de choque térmico(HSPs) e adaptações em sua ultraestrutura celular que

permitem a sua resistência durante a fermentação etanólica. O objetivo deste estudo foi

avaliar o estresse etanólico das Hanseniaspora durante o processo fermentativo, analisando

crescimento celular, o perfil da expressão protéica e as modificações em sua ultraestrutura

em diferentes concentrações de etanol (0%.1%,2%,3%,6%,9%,12%) em cepas Ho

(Hanseniaspora opuntiae) e Hg( Hanseniaspora guillermondii). As alterações na

ultraestrutura foi analisada através da Microscopia eletrônica de Varredura (MEV). A

expressão proteica foi avaliada a partir da análise eletroforética pelo método SDS PAGE

(poliacrilamida do tipo desnaturante). A análise morfológica mostrou alterações induzidas

pelo etanol com comprometimento da integridade da parede celular, plasmólise e autólise

celular a partir de 6% de etanol, no entanto, Scb (Saccharomyces cerevisiae da variedade

bayanus) manteve células viáveis a concentração de etanol até 12%. Os resultados indicam

que a expressão aumentada de peptídeos com pesos moleculares encontrados de 10kDa e

100kDa. Essas proteínas apresentam perfil eletroforético aproximado ao de HSPs e/ou

chaperonas moleculares sintetizadas em resposta às condições de estresse. Nas leveduras

Ho41 e Hg43 não foram encontradas respostas adaptativas ao estresse etanólico, como

pseudohifas ou formas esporuladas, estas em Scb apresentam como forma de resistência

ao estresse etanólico. A única proteína associada ao estresse etanolíco foi a 100kDa, que

apresentou um aumento de expressão durante o estresse etanólico na levedura Hg43 em

19

3% e 6% de etanol. A proteína 100 kDa, já vista associada anteriormente ao estresse

etanolíco. A ausência de outros marcadores protéicos relacionados a resistência etanólica

em Hanseniasporas ( Ho41 e Hg43), possivelmente seria um dado que explicaria a

intolerância dessas leveduras a concentrações crescentes de etanol.

Palavras Chaves: HSPs, Hanseniaspora, Estresse, etanol

20

SILVA,Flávia Martins. STRESS EVALUATION IN ETHANOLIC YEAST SACCHAROMYCES NOT GENDER HANSENIASPORA: A BIOTECHNOLOGY CONTRIBUTION.61f.2014.Dissertation (Master ) - Faculty of Pharmacy, Federal University of Bahia , Salvador , 2014 . Guiding: Profª Drª Maria Eugênia de Oliveira Mamede.

ABSTRACT

The yeast genera Hanseniasporas contribute during the ethanol fermentation of

grapesmust, with the production of the volatile compounds that provide taste, flavor

and singular characteristics to the wine .The ethanol which is produced during

fermentation process, is a powerful stress factor to the Hanseniasporas and it has

caused inhibition of the growth and cell infeasibility, because, they do not tolerate (in

the middle) the ethanol increasing concentration. However, the yeasts such

Saccharomyces are more resistant to ethanol as they exhibit heat shock proteins

(HSPs) and adaptations in their cell ultrastructure that make them resistant during

ethanol fermentation. The aim of this study was evaluate the ethanol stress of the

Hanseniaspora, during the fermentation process. It analysis the cell growth, protein

expression profileand changes in the ultrastructure in different concentrations of the

ethanol (0% .1%, 2%, 3%, 6 %, 9%, 12%) in strains Ho ((Hanseniaspora opuntiae)

and Hg (Hanseniaspora guillermondii). About ultrastructure changes, it was analyzed

by Scanning electron microscopy (SEM). And referring toProtein expression, it was

evaluated from the electrophoretic analysis by the SDS PAGE method (denaturing

polyacrylamide). The morphological analysis showed changes induced by ethanol

compromising the cell wall integrity, and autolysis and plasmolysis cells from 6%

ethanol. However, Scb ((Saccharomyces cerevisiae bayanus variety) remained

viable cell and the concentration of ethanol until 12%. The results indicate increased

expression of peptides found with molecular weights of 10kDa and 100kDa.These

proteins have presented the electrophoretic profile approached of HSPs and /or

synthesized molecular chaperones, in response to stress conditions. In Ho41 and

Hg43 yeasts, were found adaptive responses to ethanol stress, as pseudohyphae or

sporulated forms, these in Scb present as a form of resistance to ethanol stress. The

only protein that could be associated to ethanol stress was a 100Da, which

presented an increased expression during ethanol stress in Hg43 yeast in 3% and

21

6% of ethanol. The 100 kDa’ protein, as seen previously associated to ethanol stress.

The absence of other protein markers related to ethanol resistance in

Hanseniasporas (Ho41 and Hg43), possibly would be a given, that could explain

these yeasts intolerance to increasing ethanol concentration.

Key Words: HSPs, Hanseniaspora, Stress and Ethanol.

22

23

1 INTRODUÇÃO GERAL

A transformação do mosto em vinho é um processo microbiológico complexo,

caracterizado pela predominância sequencial de diferentes espécies de leveduras e

outros microrganismos. A qualidade e as características sensoriais do vinho estão

intimamente associadas com a biodiversidade da microbiota de leveduras. As

leveduras envolvidas na vinificação originam-se da microbiota na superfície da uva e

da flora secundária, que coloniza as superfícies de equipamentos e utensílios

aplicados na fabricação de vinhos. Na prática da vinicultura os principais organismos

responsáveis pela fermentação etanólica são as Saccharomyces e não-

Saccharomyces. No entanto existe um interesse crescente no papel destas

leveduras não Saccharomyces na produção de vinhos, pois elas conferem sabor e

aroma com qualidades e características singulares.

Comparativamente, a levedura fermentativa por excelência, Saccharomyces

cerevisiae, encontra-se em menor concentração no início da fermentação, mas

devido à sua elevada tolerância ao etanol consegue rapidamente predominar, após

os primeiros dias do processo, sendo geralmente a única espécie encontrada no

final da fermentação. No entanto, a transformação de uvas maceradas num produto

acabado, o vinho, envolve um série de complexas interações entre gêneros

relacionados Saccharomyces (Saccharomyces uvarum, Saccharomyces bayanus,

Saccharomycesparadoxus),nãoSaccharomyces(Hanseniaspora,Hanseniaspora,Can

dida,Kluvyveromyces),fungos filamentosos (Aspergillus, Botrytis ePenicillium), e

outras bactérias. Juntos, a dinâmica, o desenvolvimento, a sucessão, e a atividade

metabólica durante fermentação geram uma variedade de metabolitos secundários,

álcoois superiores, ésteres, aldeídos, cetonas, compostos voláteis, ácidos orgânicos,

e enzimas, que interferem com propriedades organolépticas finais e aromáticas do

vinho.

As leveduras Hanseniaspora apresentam menor resistência ao etanol do que

as Saccharomyces, por processos complexos ainda pouco esclarecidos. O etanol é

o produto principal da fermentação e atua como potente fator de estresse para as

células das leveduras. Além do etanol, a temperatura e outros parâmetros físicos e

químicos considerados como fatores de estresse podem também interferir no

desempenho da fermentação como: pH, nutrientes, substâncias inibidoras e outros,

24

que irão influenciar diretamente na expressão de proteínas específicas, chamadas

de proteína de choque térmico(HSP) que contribuem para modificar a atividade

biológica da levedura durante a fermentação do mosto e no seu desempenho

fermentativo.

Há um interesse em saber quais as proteínas de choque (HSPs) são

expressas no momento em que as células das leveduras Hanseniasporas são

expostas á toxicidade etanólica, pois estas exercem um papel importante na

proteção da integridade biológica contra os fatores de estresse.

A proteômica em diferentes condições ambientais é importante para

identificar, as proteínas que estão diretamente relacionadas com a proteção contra

as determinadas variações no ambiente. Estudar determinantes e mecanismos de

adaptação e resistência a um determinado estresse seriam importantes, para

conhecer o porquê do baixo rendimento fermentativo das leveduras não

Saccharomyces. As proteínas de interesse podem também ser identificadas na base

do conhecimento do ponto isoelétrico e do peso molecular aparente, determinados a

partir dos géis bidimensionais.

Seria possível, admitir a hipótese de que, bioprospecção de espécies de

leveduras do grupo Hanseniasporas que tivessem maior expressão destas proteínas

de choque térmico, teriam uma maior proteção e capacidade de resistência ao

estresse, produzido pela toxicidade etanólica. Em consequência disto, teriam uma

maior tolerância á presença do etanol no mosto de uva, podendo-se estender o

tempo de fermentação, contribuindo para produção de compostos voláteis

conhecidos como produtos secundários da fermentação atribuindo qualidade

sensorial ao vinho.

Desta forma este estudo teve como propósito avaliar o comportamento das

leveduras Hanseniasporas em meio etanólico, as alterações na sua ultraestrutura

celular assim como a expressão das proteínas de choque térmico, em condições de

indução ao estresse etanólico , além de servir como bioprospecção e melhoramento

genético dessas espécies.

25

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar o estresse etanólico das leveduras Hanseniaspora opuntiae e

Hanseniaspora guilliermondii durante o processo fermentativo.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1- Avaliar o crescimento celular durante o estresse etanólico.

2 - Analisar o perfil da expressão protéica das leveduras no processo fermentativo

etanólico.

3 - Observar a ultraestrutura por Microscopia Eletrônica de Varredura das leveduras.

4 - Avaliar a síntese das HSPs nas diferentes concentrações de etanol.

26

CAPÍTULO I

REVISÃO DE LITERATURA

1. CARACTERÍSTICA GERAL DAS LEVEDURAS

A vinificação é uma arte milenar que existe desde período Neolítico. A

produção de vinho é o resultado de ações combinadas de diversas espécies de

microrganismos que crescem em diferentes proporções ao longo de uma

fermentação. Um dos mais importantes grupos de microrganismos comercialmente

explorados no processo de vinificação são as leveduras. Sua larga aplicação

biotecnológica tem alto valor comercial em diversas industrias, dentre as quais a de

maior importância é a que utiliza processos fermentativos na fabricação de (pão,

cachaça, vinho,cerveja e álcool combustível) (BAMFORTH, 2005; CORTES, 2010).

Leveduras são microrganismos pertencentes ao reino Fungi, ao filo

Ascomycota e Basidiomycota à ordem Saccharomycetales. São parasitas ou

saprófitas e heterotróficos. Dependentes de carbono orgânico como fonte de energia

e podem estar associadas ao néctar de frutos frescos, vegetais, ou ainda no trato

digestivo de animais, ou em ambientes de baixo recurso hídrico, bem como

presentes em qualquer substrato que lhes forneça o açúcar. (CHENG et al, 2010 ).

A biomassa de levedura em ambientes naturais esta associada a substratos

ricos em açúcar ou compostos de carbono facilmente assimiláveis (flores e frutos).

Em suas necessidades nutricionais, elas utilizam fonte de carbono (mono e

dissacarídeos), nitrogênio, mineral e vitaminas (tiamina, biotina, ácido pantotênico)

para o seu desenvolvimento. Os compostos de nitrogênio (aminoácidos) são

prontamente utilizados como forma de energia. São mesófilas, crescem em faixa

ótima de temperatura de 25 a 28ºC, e em faixa ótima de pH entre 4,0 e 4,5.

(BAMFORTH, 2005).

27

2. PAREDE CELULAR

A parede celular fúngica pode ser caracterizada como uma estrutura

relativamente rígida, porém dinâmica, que participa de vários processos biológicos

essenciais à célula. A sua estrutura oferece suporte osmótico, proteção física, além

de estar relacionada a eventos de sinalização celular, adesão, formação de biofilme,

interações com o ambiente externo, reprodução, sendo por isso necessária para o

crescimento e desenvolvimento dos fungos nos ambientes onde são encontrados

(NIMRICHTER et al, 2005; PEREZ, 2006; MADDIA, et al, 2009).

Pesquisas sobre a composição e organização da parede da célula de

Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Aspergillus fumigatus,

Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa, Hanseniaspora uvarum e

Cryptococcus neoformans são comparados e contrastados (PEREZ,2006). Estas

paredes celulares contêm quitina, quitosano, β - 1, 3 - glucana, β - 1, 6 - glucano,

misturado β - 1, 3-/β-1, 4 - glucana, α - 1, 3 - glucana, a melanina, e glicoproteínas

como principais constituintes. Esses componentes são integrados em conjunto, para

gerar uma matriz de parede celular, na presença de enzimas. Free (2013) realizou

uma comparação entre essas paredes celulares, mostrando que, existe uma grande

quantidade de variabilidade, na organização e composição da parede da célula

fúngica entre as espécies. Isto sugere que esta variabilidade da parede celular pode

influenciar em elementos estruturais e receptores de estresse ambiental que protege

a célula de mudanças ambientais.

Pesquisas têm sido realizadas em torno do entendimento da parede celular

fúngica e sua constituição química, principalmente das leveduras, como

Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe largamente utilizadas na

produção de alimentos (MAGNELLI; CIPOLLO; ROBBINS, 2005; NOMBELA, 2006).

Além da Saccharomyces cerevisiae, outras leveduras de interesse biotecnológico,

têm se destacado: como Pichia pastoris utilizada para a produção de proteínas

heterólogas ou a Hansenula anomala grande produtora de acetato de etila utilizado

como solvente na indústria química. Outras leveduras como a Cândida utilis

produtora de glicerol e a Hanseniaspora guilliermondii, Kloeckera apiculata a

Kloeckera apis caracterizam-se por serem grandes produtora de aroma de interesse

28

enológico. Os constituintes da parede celular fúngica contribuirá para o

conhecimento básico do microrganismo, o entendimento de suas relações com o

meio e comportamento desta em relação ao estresse etanólico durante a

fermentação.

2.1 MEMBRANA

As membranas são estruturas presentes em todos os organismos. É definida

como membranas flexíveis, dinâmicas e seletivamente permeáveis a solutos polares,

o que lhes confere a capacidade de controlar a homeostasia celular. Muitos

processos celulares são organizados ou estão associados à participação de

membranas, tais como transdução de sinal por proteínas de choque térmico (HSPs),

síntese proteíca, lipídica e transporte de metabólitos, e ainda outros que dependem

da capacidade das membranas de sofrerem fissão e se re-associarem, como divisão

celular e endocitose (NELSON, 2005; HENDERSON, 2014).

Em estudo admitiu-se que, características biofísicas das membranas são

resultantes das interações lipídio-lipídio e a sua modulação por interações lipídio-

proteína e proteína-proteína que se relacionam, estimulando respostas a vários tipos

de sinais e alterações de condições fisiológicas principalmente em processos

fermentativos (GROSSMANN et al, 2007; HOFMAN et al, 2008; GUAN et al, 2009).

Em pesquisa realizada com S. cerevisiae foi demonstrado que a membrana

desenvolveu estímulos e respostas adaptativas na presença do peróxido de

nitrogênio ( H2O2 ) realizando alterações na permeabilidade seletiva na presença

deste agente oxidante (SOUSA et al, 2004). Sendo assim as alterações na

composição proteica e lipídica da membrana plasmática é em consequência de suas

propriedades biofísicas a responder a estímulos do meio extracelular (PEDROSO,

2009; FOLMER et al, 2008).

29

2.2 CINÉTICA DE CRESCIMENTO

A cinética do crescimento de leveduras em fermentação segue a

padronização típica de cultivo em laboratório. O desenvolvimento espontâneo das

leveduras no mosto de uvas é acompanhado em três fases: Adaptação (lag),

exponencial (log), fase estacionária e declínio celular (LAGE et al, 2014).

A fase Lag que corresponde à adaptação das leveduras ao meio é a fase

que se caracteriza pela alteração da maquinaria celular e de ajuste às novas

condições ambientais para a multiplicação celular. Representa o período que as

leveduras no mosto se ajustam a um novo ambiente. Após a adaptação, a fase

exponencial é rápida, as leveduras no mosto são influenciadas pela temperatura,

disponibilidade de açúcar dentre outros fatores. Nesta fase as células entram em

crescimento exponencial (HORSEY, 2007).

Com relação a fase estacionária pode durar de 2 á 10 dias, a população de

leveduras se mantem estáveis. Após este período inicia-se o declínio celular.

Estudos mostram que a população de Hanseniaspora decresce gradativamente,

devido à limitação de nutrientes, aumento da concentração de etanol, presença de

fatores killer que contribuem para redução da biomassa de leveduras no mosto de

uvas (LAGE et al, 2014).

3. POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DAS LEVEDURAS

Historicamente a biotecnologia já existia bem antes do homem entender

ciência da biologia, com o desenvolvimento da produção de pães e vinhos. Embora

os microrganismos já são utilizados há milhares de anos na produção de vinhos, a

biotecnologia atua em sistemas celulares para o desenvolvimento de processos e

produtos de interesse econômico e social. Os fungos são microrganismo de grande

interesse biotecnológico. Talvez eles estejam dentre os seres vivos, que mais geram

30

processos e produtos de importância fundamental para a sociedade (OLIVEIRA,

2009).

Segundo Andrieta (2007) a biotecnologia esta voltada para o estudo da

seleção de espécies que favoreçam o desenvolvimento de novos produtos ou

produtos com melhor qualidade. Isto inclui estudos moleculares, que podem ser

utilizados para melhoramento genético como também melhor seleção das espécies.

Durante a última década,as leveduras foram desenvolvidas para a produção

de proteínas heterólogas em rendimentos elevados e com as modificações pós-

traducionais equivalente ou similar às modificações realizadas nos seres humanos.

Avanços têm sido feitos no desenvolvimento de S. cerevisiae como o primeiro

organismo eucariótico para o desenvolvimento de genômica funcional e biologia de

sistemas. Espécies de levedura não Saccharomyces também têm uma enorme

utilidade e potencial para processos biotecnológicos, principalmente na vinificação

(MALAJOVICH, 2011).

Dentre os microrganismos envolvidos no mosto, as leveduras tem papel mais

importante, porque não só executam a fermentação etanólica, ou seja, a conversão

de açúcar da uva em etanol e CO2, mas também irão influênciar no aroma, sabor e

identidade ao vinho. A qualidade do vinho está diretamente relacionada com o

processo produtivo e a excreção de metabólitos durante o seu crescimento e

autólise subseqüente. No processo de vinificação a espécie S. cerevisiae apresenta

alta capacidade fermentativa, um crescimento rápido, eficiente metabolização de

açucares, habilidade na produção e resistência ao etanol e baixos níveis de

oxigênio, tolerância a grandes variações de temperatura. No entanto as leveduras do

gênero Hanseniaspora possibilita originar vinhos de alta qualidade com um caráter

regional único , fornecendo diferenciação e acrescentando um valor comercial em

um mercado altamente competitivo.(FLEET,2008;LAGE et al, 2013).

4. FERMENTAÇÃO ETANÓLICA POR LEVEDURAS

A fermentação em estágio inicial é realizada por uma sequencia de

microrganismos dentre eles as leveduras não-Saccharomyces que integram os

gêneros Kloeckera, Cryptococcus, Torulaspora, Hanseniaspora, Candida, Pichia,

31

Hansenula, Zygosaccharomyces, Metschinikowia, Debaromyces, Issatchenkia e

Rhodotorula caracterizadas por um baixo poder fermentativo , enquanto que a fase

final é dominado pela linhagens de Saccharomyces cerevisiae tolerantes ao etanol

(MARO et al, 2007).

O papel das espécies não-Saccharomyces durante a fermentação é muito

importante, uma vez que irá influenciar fortemente na composição química do

produto final o que sugere que estas leveduras nativas darão características

regionais atraentes e outros composto voláteis distintos para os vinhos . Para a

síntese desses componentes aromáticos, é necessário a ação enzimática que

transforma os compostos neutros da uva em compostos ativos que irão produzir

sabor ao vinho, através da ativação de metabólitos secundários (por exemplo,

ácidos, álcoois, polióis, ésteres, aldeídos, cetonas, ou compostos voláteis de

enxofre) que produzem aroma ao vinho (SENER et al, 2007).

Estudos, anteriores com Pretrorius (2003) e Capello et al (2004) em

experimentos realizados a partir da fermentação inoculada, afirmam que a utilização

de linhagens de leveduras não-Saccharomyces e Saccharomyces (cepa industrial)

asseguram a produção de vinhos de qualidade. No entanto, considera que a

qualidade do vinho está estritamente relacionada com a microbiota natural presente

nas uvas, o que confere ao vinho características típicas e representativas de cada

região vinífera e, portanto adaptadas ao seu habitat.

Nos últimos anos, pesquisadores observaram que as leveduras não-

Saccharomyces contribuem para características na composição sensorial do vinho,

assim, um interesse crescente na aplicação industrial das espécies de leveduras

não-Saccharomyces (HIERRO, 2007). De fato, a adição de leveduras não-

Saccharomyces, como parte de culturas mista com formulações, juntamente com os

de S. cerevisiae, tem sido recentemente indicada como uma maneira de aproveitar

fermentações espontâneas para melhorar a qualidade do vinho (KIM et al, 2010). A

tendência atual, das indústrias de vinhos é de desenvolver produtos originais e

peculiares, utilizando culturas mistas que podem ser úteis para conferir um

determinado aroma e características singulares ao vinhos (MINGORANCE-

CAZORLA et aI, 2003; ASSIS et al, 2012).

Estudos anteriores indicaram que o gênero Hanseniaspora a depender da

espécie se diferencia a partir da produção e tolerância aos níveis de etanol. E

principalmente a produção de outros metabólitos secundários, isto é, glicerol,

32

acetaldeído, acetato de etila e outros que darão características singuralidade a

diversos vinhos (MOLINA, 2007). A empregabilidade de leveduras não-

Saccharomyces, a exemplo da Hanseniaspora uvarum e Hanseniaspora

guilliermondii tornou objeto de interesse para muitos pesquisadores, particularmente

porque são espécies frequentemente identificadas em uvas nas fases iniciais da

fermentação (ROBINSON et al, 2014).

Nos últimos anos, tem havido grandes avanços em pesquisas sobre a

ecologia das leveduras, da fermentação do vinho . Leveduras não- Saccharomyces

crescem cerca de (106-107 UFC / ml), mas, após os primeiros dias da fermentação,

começam a declinar e morrer. Neste momento, S. cerevisiae torna-se predominante

(107-108 UFC / mL) e continua a fermentação até ao final do processo. Esta

diferença de comportamento fermentativo foi analisada anteriormente por Horsey

(2007), que estudou as leveduras Saccharomyces cerevisiae da variedade bayanus

por serem bem adaptadas aos processos fermentativos, e terem ampla utilização na

vinificação. A população de células Saccharomyces cerevisiae se manteve viáveis

durante as fases finais da fermentação, mesmo quando a concentração de açúcar

era baixa e o conteúdo de etanol alto até 15%v/v, resistiram a um baixo pH e

temperatura alta além de serem mais tolerantes ao dióxido de enxofre que outras

leveduras e bactérias.

Muitos fatores afetam no desenvolvimento da biomassa das leveduras

durante a fermentação etanólica, interferindo no desenvolvimento e na diversidade

das espécies.Os fatores interferentes podem ser: a composição química do mosto,

incluindo resíduos de fungicidas / pesticidas, as condições de processamento, a

concentração de etanol, dióxido de enxofre, a temperatura de fermentação, e as

interações entre as diferentes espécies de leveduras (SUN, 2009).

A produção de etanol por S. cerevisiae é considerada como fator killer

importante, pois influencia no declínio da biomassa celular de espécies de não

Saccharomyces durante a fermentação. Geralmente, as espécies Hanseniaspora,

Candida, Pichia, Kluyveromyces, Metschnikowia e Issatchenkia encontradas no

mosto de uvas não são tolerantes as concentrações de etanol superiores a 5-7%,

isto explica, que o declínio e morte celular das leveduras não Saccharomyces,

depende do avanço fermentativo e da produção de etanol (RODRIGUEZ et al,

2010). Contudo, estudos demonstram que temperaturas baixas podem diminuir a

sensibilidade destas espécies de leveduras ao etanol, e consequentemente,

33

fermentações realizadas em temperaturas inferiores a 15-20ºC podem mostrar uma

maior contribuição das leveduras Hanseniaspora e Candida. Em tais condições,

estas espécies podem aumentar a sua sobrevivência igualmente a S. cerevisiae que

predominam até o final da fermentação e, consequentemente, terão um maior

impacto no aroma do vinho.

P'erez e Nevado et al (2006) estudaram o mecanismo envolvido na morte

celular das cepas do gênero Hanseniaspora (Hanseniaspora guillermondii e

Hanseniaspora uvaru) durante fermentações mistas com S. cerevisiae sob

condições de crescimento enológico. Quando S. cerevisiae atingiu biomassa celular

em torno de 107 UFC/mL, foram observadas a redução na população de

Hanseniaspora independentemente da concentração de etanol. Os autores

acreditam na hipótese que, um ou mais compostos tóxicos produzidos pela S.

cerevisiae podem provocar a morte prematura das células do gênero

Hanseniaspora, embora ainda não tenha sido possível identificar o natureza destes

compostos. Estudos tinham anteriormente demonstrado, que as células viáveis da

levedura S. cerevisiae em alta densidade podem causar a queda no crescimento de

algumas espécies não Saccharomyces em culturas mistas (ARNEBORG et al,

2005). Pesquisas tem demonstrado um consenso na importância da aplicação de

métodos moleculares para esclarecer o desempenho e desenvolvimento de

leveduras durante a fermentação de vinho (P'EREZ; NEVADO et al, 2006).

4.1 PRODUÇÃO DE COMPOSTOS AROMÁTICOS POR LEVEDURAS DO

GÊNERO HANSENIASPORA

Segundo Swiegers, (2005) o sabor e o aroma são as principais características

que definem as diferenças entre os estilos de vinho em todo o mundo. As práticas de

viticultura bem como de vinificação afetam estas características sensórias do vinho.

Baseado na definição da química orgânica, o vinho é uma mistura complexa de

inúmeros compostos, incluindo carboidratos, álcoois, aldeídos, ésteres, ácidos,

proteínas e vitaminas. Também contém compostos aromáticos e cromáticos, a

exemplo dos taninos, antocianinas e flavonóides que contribuem expressivamente

para cor e sabor (HORSEY, 2007).

34

Segundo a definição de Silva (2012) o vinho é o produto obtido

exclusivamente por fermentação etanólico, total ou parcial, de uvas frescas ou mosto

de uvas . De um modo geral o processo de vinificação corresponde ao conjunto de

operações mecânicas que levam à obtenção de vinho. A composição do vinho

também é influenciada por diversos fatores: tipo de casta, solo, clima, práticas de

cultivo, leveduras e pelas práticas de vinificação.

Os compostos aromáticos sintetizados pelas leveduras e bactérias presentes

no mosto de uva durante o processo fermentativo, contribuem para formação do

aroma do vinho. Enzimas como as glicosidases estão envolvidas no processo de

transformação bioquímica e são sintetizadas pelas leveduras. Muitos fatores podem

influenciar na composição do aroma, a exemplo da temperatura, teor de sólidos

solúveis existentes no mosto de uva, microbiota que conduz o processo

fermentativo, dentre outros fatores (SWIEGERS, 2005).

Mamede et al (2004) estudou a produção de composto voláteis durante a

fermentação espontanea do mosto de uvas Chardonnay pelas leveduras não

Saccharomyces Kloeckera apiculata e Saccharomyces cerevisiae e obteve

resultados expressivos na produção de compostos importantes para a qualidade do

vinho como, o acetato de etila produzidos pela Kloeckera apiculata.

Leveduras não Saccharomyces, principalmente as Hanseniaspora

guilliermondii e H. uvarum são de grande interesse tecnológico. Estudo realizados

por Pietrowski et al (2012) demonstraram que, em fermentação com o mosto de

maçã, as leveduras H. Guilliermondii e H. uvarum demonstraram grande produção

de ésteres, aldeídos, álcoois superiores.

Hong et al (2013) estudaram o desempenho de Hanseniaspora uvarum em

culturas mista com Saccharomyces cerevisiae em fermentação espontanea e

observaram, grande produção aldeídos produzidos pela Hanseniaspora uvarum,

bem como uma maior pontuação na avaliação sensorial dos consumidores. Esses

dados demonstram a importância da Hanseniaspora spp. nas características

aromáticas do vinho através da síntese de compostos aromáticos primários inativos,

transformando-os em compostos aromáticos ativos.

35

5. ABORDAGEM SOBRE AS PROTEÍNAS DE CHOQUE TÉRMICO EM

LEVEDURAS DURANTE A FERMENTAÇÃO

Diversos parâmetros interferem no processo da fermentação. Os parâmetros

químicos são: disponibilidade e concentração de nutrientes, assimilação de

nitrogênio, oxigênio, vitaminas, minerais, ácidos insaturados; presença de

substâncias inibidoras (etanol, ácido acético, sulfitos, fitoalexinas, micotoxinas,

toxinas das bactérias, resíduos agrotóxicos) e parâmetros físicos naturais:

temperatura, pH, e pressão osmótica (FERREIRA et al, 2006).

Quando a célula se adapta a um novo ambiente, a atividade biológica da

levedura aumenta, principalmente durante a fermentação etanólica, em que

inúmeras condições de estresse surgem, alguns de leve impacto, e outras

potencialmente severas. Dentro dos parâmetros citados, os mais importantes são: a

limitação de nutrientes, a toxicidade do etanol e as variações de temperatura durante

a fermentação (FOLCH-MALLOL et al, 2004).

Diferentes nutrientes podem ser limitados ou esgotados durante as fases da

fermentação, o que leva a uma redução da taxa de crescimento e diminuição da

eficiência da fermentação ou mesmo uma queda completa desta. Saleh et al, 2014,

observou que a trealose é importante para a manutenção da viabilidade celular da

levedura, contudo, é utilizada como carboidrato de reserva durante períodos em que

a sobrevivência da célula depende do nível de trealose e de glicogênio.

A relação entre a fermentação e a resistência ao estresse, está na habilidade

das leveduras de se adaptarem ao meio ambiente, e a fatores extracelulares durante

a fermentação. Estas respostas são transmitidas através de sinais extracelulares,

por receptores proteicos específicos, que se localizam em sua maioria na superfície

da membrana plasmática (BAUER; PETRORIUS, 2000; RODRIGUES, 2010).

As informações das mudanças ocorridas no meio são traduzidas e

interconectadas através de sinais que são relevantes para os mecanismos de

resposta ao estresse. Pesquisas focadas em contribuir no avanço dos mecanismos

moleculares, envolvendo resposta ao estresse são fundamentais para entender as

36

estratégias de adaptação biológica das leveduras durante a fermentação e seu ciclo

de vida (HOHMANN et al, 2003).

Os fatores de estresse como temperatura e concentração de etanol durante a

fermentação interferem no crescimento das leveduras, na sua composição lipídica e

na fluidez da membrana plasmática em resposta adaptativa a condição de estresse.

Em condições adversas do ambiente vários tipos de respostas adaptativas ao

estresse são induzidas. A resposta molecular para reparar danos e proteger

estruturas ocorre quando a célula da levedura Saccharomyces cerevisiae, é

submetida condições de estresse (ESTRUCH, 2000). Essa resposta é caracterizada

pela indução de síntese de trealose em caso de diminuição de nutrientes, síntese de

proteínas específicas, dentre outros parâmetros (MELO, 2006).

5.1 TOXICIDADE ETANÓLICA NAS LEVEDURAS

Durante o processo da fermentação, concentração de nutrientes diminui, pelo

consumo das leveduras e por outros microorganismos, e o etanol produzido se

acumula no meio. O etanol é tóxico para a maioria dos organismos em

concentrações relativamente baixas, a parti de 2% (v / v). A capacidade de romper

com eficiência biológica, processos e mecanismos de proteção aumentam com a

elevação das taxas de etanol. Segundo Silva et al (2008), com processo

fermentativo etanólico origina-se uma série de compostos que podem atuar como

inibidores potenciais. Entre eles podem ser citados os metabólitos secundários,

contaminantes totais e, o etanol produzido no processo. A natureza e concentração

desses compostos dependem das condições do processo, como temperatura do

meio e tempo de fermentação.

Segundo Neto A. (2006) o efeito biológico do etanol na diminuição das taxas

de crescimento e eficiência da fermentação, é em grande parte do resultado de

alterações nas propriedades das membranas celulares, em particular, no aumento

da permeabilidade e alterações na fluidez da membrana. O etanol age de maneira

sinergística intoxicando a célula da levedura, levando-a a morte e

consequentemente diminuindo a viabilidade celular.

37

As estratégias moleculares das leveduras para inibir a desnaturação das

proteínas e os danos irreversíveis da membrana plasmática, é realizada através de

modificações bastante complexas na sua atividade funcional,principalmente na

permeabilidade seletiva. (SALES et al, 2000).

Os fosfolípidos presentes na membrana plasmática desempenham um papel

importante no mecanismo de tolerância ao etanol (SOUZA, 2009). Os efeitos tóxicos

do etanol durante a fermentação para a S. Cerevisiae, envolve modificações na

composição lipídica da membrana, redução da sua atividade metabolica, inibição do

transporte de nutrientes para dentro da célula, a inibição do crescimento e na

viabilidade, além da inibição da levedura na produção de etanol. A avaliação da

capacidade das células das leveduras sobreviverem a exposição ao etanol é útil,

pois seria uma ferramenta para comparar a tolerância de diferentes espécies de

leveduras. Pesquisas demonstram que o método para determinar a tolerância ao

etanol envolve avaliar o crescimento celular na presença de etanol e no meio. Essa

metodologia poderia ser uma ferramenta para avaliar melhor as espécies mais

tolerantes ao etanol (PINA et al, 2004).

O aumento da permeabilidade tem inúmeras consequências fisiológicas com

a dissipação de força motor de prótons, que permite o transporte ativo de inúmeros

compostos, em particular aminoácidos, para o meio intracelular. A célula mantém o

meio intracelular com pH ácido, a ativação do influxo de prótons e a consequente

acidificação intracelular, interferem negativamente na atividade metabólica. Em

resposta, a célula utiliza a H+-ATPase (bomba de prótons) para manter o pH

intracelular dentro de valores compatíveis com o metabolismo homeostático.A

bomba de íons é dependente de ATP, a H+ATPase é uma proteína de membrana

que hidrolisa ATP em ADP que funciona transportando prótons através da

membrana contrabalanceando e mantendo a composição iônica intracelular

(AMBESI et al , 2000; FERNANDES, 2008).

Estudo anterior demonstrado por (ARNEBORG et al, 1995) com a levedura

Pichia stipitis, na presença de 1% v/v de etanol no meio de cultura faz duplicar a

atividade da respectiva H+-ATPase da membrana plasmática e a presença de etanol

no meio, estimula a atividade da H+-ATPase da membrana plasmática em S.

cerevisiae, atingindo o seu triplo da atividade basal,quando as concentrações de

etanol atingem no meio 6-8% v/v.

38

O etanol também afeta a atividade de água reduzindo a disponibilidade de

água. Em consequência disso, em todos os compartimentos celulares a

disponibilidade de água são reduzidos prejudicando os processos biológicos. Outros

processos afetados incluem atividades enzimáticas, enovelamento de proteínas e

estrutura da membrana. A resposta celular a redução de água são semelhantes

tanto para o alto teor de etanol com também temperaturas elevadas. Além disso ,a

composição da membrana é alterada fundamentalmente , com aumento percentuais

de ácidos graxos insaturados e alterações em teor de esteróis (MADEIRA et al,

2010).

5.2 A RESPOSTA A CONDIÇÃO DE ESTRESSE

Durante o estresse fermentativo, existe uma indução de um conjunto de

proteínas cuja síntese é fortemente aumentada, principalmente quando, os

organismos estão expostos a aumentos repentinos de temperatura ou a outros

parâmetros (MORANO et al, 1998). Pesquisas revelam que várias famílias de HSPs

(heat shock protein) são bem conservadas ao longo da evolução, exibindo um

elevado grau de conservação em todos os organismos, a partir de bactérias até

eucariotos superiores, elas desempenham um papel central no metabolismo celular

(CAGLIARI, 2009).

Padrões específicos de indução são observados para todas as respostas ao

estresse, incluindo, por exemplo, além do estresse térmico, etanólico, hiperosmótico,

estresse hiposmótico e limitação de nutrientes. Uma série de adaptações específicas

foi estudada extensivamente, e incluem a síntese de glicerol em resposta ao

estresse hiperosmótico, a síntese de hidratos de carbono, e armazenamento de

glicogênio em caso de privação ou a síntese de trealose em leveduras, em resposta

a escassez de nutrientes (SOUZA, 2009).

Estudos sugerem a existência de uma rede complexa de vias de transdução

de sinais e estas vias incluem, os receptores de sinais de estresse, associada ao

receptor de proteínas de ligação chamada de GTP (proteínas G), e módulos

intermediários que consiste principalmente de um grande número de quinases, que

são reguladas por pequenas moléculas chamada de segundo mensageiro, como

39

AMP cíclico (cAMP) adenosina 3',5'-monofosfato cíclico ou uma cascata de

atividade da proteína quinase (MAPK). Neste modelo, a quinase é uma via de

sinalização em que se fosforila uma proteína alvo específica, que pode incluir fatores

de transcrição, enzimas metabólicas e proteínas estruturais do citoesqueleto. A

fosforilação modula a atividade destas proteínas, seja para induzir ou suprimir suas

atividade (IZAWA et al , 2008).

As proteínas de choque térmico tem função de proteção à desnaturação das

proteínas de membrana como também recuperação das estruturas de membrana.

Pesquisas demonstram que a exposição de um organismo a um estresse específico

induz a uma formação de proteínas específicas apropriadas para aquele estresse

como também induz a formação de outras HSPs que fazem a proteção de outros

estresses, este modelo foi demonstrado em S. cerevisiae (BROSNAN et al, 2000).

Várias famílias de Hsps são induzidas em condições de estresse, como por

exemplo, substrato para o crescimento, mudança de uma fonte específica de

nutriente para uma fonte menos específica, mudanças de temperatura, pH, pressão

osmótica, e a presença de concentrações elevadas de etanol,substâncias tóxicas e

espécies reativas como peróxido de hidrogênio. Em condições favoráveis de

crescimento, maior será a velocidade de desenvolvimento, e menor será

concentração de proteínas Hsp dentro de uma célula, e a menor resistência à tensão

intrínseca (SWAN et al, 1998).

Famílias Hsp são agrupadas de acordo com a homologia da seqüência e são

denominadas de acordo com a média de peso molecular de seus membros. Em S.

cerevisiae as famílias Hsp incluem Hsp104p (membro da família Hsp100p), Hsp83p

(membro da família Hsp90p), Hsp70p, dos quais há pelo menos 10 membros em S.

cerevisiae, Hsp60p Hsp30p, Hsp26p e Hsp12p que também se expressam nesta

levedura. (MORANO et al, 1998).

Pesquisas foram aprimoradas para o estudo das Hsps durante a década de

1980. Inicialmente o modelo foi sugerido por Lewis & Pelham (1985) com a Hsp70p

onde se verificaram a interação com as proteínas desnaturadas, Desde então, vários

estudos têm demonstrado que a maior parte do estresse induzido, as Hsps estão

realmente envolvidos na proteção, solubilização e reparação e enovelamento de

proteínas desnaturadas e agregadas (MORANO et al, 1998) . Famílias de Hsps

parecem estar mantendo o estado de proteínas imatura ou recém-sintetizadas para

a incorporação em complexos de proteínas (JENSEN; JOHNSON, 1999).

40

Outras funções estão associadas a Hsps relacionando a manutenção de

proteínas em estado imaturo por membros das famílias Hsp70p, facilitar a sua

translocação através das membranas do retículo endoplasmático e mitocôndrias

(JENSEN; JOHNSON, 1999). Resgate de proteínas agregadas ou desnaturadas no

citoplasma, associado as atividades das famílias do complexo Hsp104p, Hsp70p e

Hsp40p (GLOVER; LINDQUIST, 1998); a reparação por Hsp104p e Hsp70p de

proteínas desnaturadas do retículo endoplasmático por calor excessivo (HANNINEN

et al, 1999). A aceleração da reativação de proteínas danificadas pelo calor por

Hsp90p (NOLLEN et al, 2002).

Com as alterações nos ácidos graxos que compõem a integridade da

membrana, pesquisas mostram a expressão das HSP 30p e HSP12 sendo que esta

desempenha papel específico durante o estresse etanólico. (SALES et al, 2000).

Enquanto a HSP30 regula a enzima H+ ATPase que consome grande quantidade de

ATP produzido pela célula, bombeando íons para fora do citoplasma equilibrando o

gradiente de concentração. Hsp30p demonstrou controlar e reduzir a atividade

ATPase. A indução das HSPs por etanol tem mecanismo de expressão bastante

semelhante a outros estresses (SOUZA, 2009).

REFERÊNCIAS

ADAMS, D. Fungal cell wall chitinases and glucanases. Microbiology, Reading, [S.l], v. 150, n. 7, 2004. AGUILAR-USCANGA, B.; FRANCOIS, J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Letters in Applied Microbiology, Oxford, v. 37, n. 3, p. 268–274, 2003. AMBESI, A. et al. Biogenesis and function of the yeast plasma-membrane H(+)-ATPase. 1. Exp. Biol. Cambridge, n.203, p.155-160, 2000. AMORIM, H. V. Fermentação Alcoólica: Ciência e Tecnologia. Piracicaba, 2005. ANDRIETTA, M. G. S. et al. Bioethanol – 30 years of Proalcool. [S.l.], 2007. ARANDA et al. Trehalose accumulation in Saccharomyces cerevisiae cells: experimental data and structured modeling a Department of Bioengineering, Unidad

41

Profesional Interdisciplinaria de Biotecnologıa, Instituto Politécnico Nacional (UPIBI-IPN), México, D.F, 2003. ARNEBORG N. et al. Interactive optical trapping shows that confinement is a determinant of growth in a mixed yeast culture. FEMS Microbiol Lett, [S.l.], n. 245 p.155–159. 2005. ASSIS, M. O. et al. “Yeasts isolated from Vitis vinífera L. grapes yeasts of Equatorial Region,” Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, v.71, 2012. BARNETT, J. A. Beginnings of microbiology and biochemistry: the contribution of yeast research School of Biological Sciences. Norwich: University of East Anglia, 2003. BAMFORTH, C. W. The Science Underpinning Food Fermentations. Food, Fermentation and Micro-organisms. Blackwell Science Ltd, Boston, 2005. BAGNAT, M. et al. Lipidrafts function in biosynthetic delivery of proteins to the cell surface in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 2000. BAUER, F. F; PRETORIUS, I. S. Yeast Stress Response and Fermentation Efficiency: How to Survive the Making of Wine. South Africa: Institute for Wine Biotechnology, University of Stellenbosch, 2000. BISSON, L. F. Stuck and sluggish fermentations. Am. J. Enol. Vitic. Missouri, n. 50, p. 107– 119, 1999. BOWMAN N, S. M.; FREE, S. J. The structure and synthesis of the fungal cell wall. BioEssays, Cambridge, v. 28, n. 8, p. 799-808, 2006. BROSNAN, M. P. et al. The stress response is repressed during fermentation in brewery strains of yeast. J Appl Microbiol. [S.l.], 2000. CAGLIARI, T. C. Análise da expressão de chaperonas moleculares em plantas e clonagem, purificação e caracterização inicial das proteínas Hsp100 e Hsp90 de cana de açúcar. 2009. Trabalho de Conclusão de Curso (Dissertação – Doutorado) - Instituto de Biologia Funcional e Molecular da Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, 2009. CAPELLO, M.S. et al. Characterization of Saccharomyces cerevisiae strains isolated from must of grape grown in experimental vineyard. Journal of Applied Microbiology, [S.l.], v.97, p. 1274-1280, 2004. CARDOSO, Maria das Graças; CAMPOS, Gustavo Azevedo et al. Cachaça: Qualidade e Produção. Lavras, 2013. Disponível em:<http:www.editora.ufla.br/Bol Extensao/pdfBE/ bol_07.pdf.> Acesso em: 02 set.2013. CARIDI, A.; RAMONDINO. Biodiversita`fenotipica in ceppi di Hanseniaspora di origine enologica. Enotecnico, São Paulo, n. 45, p. 71-74, 1999.

42

______; TINI, V. Caratteristiche enologiche di Hanseniaspora guilliermondii. Vini d’Italia, [S.l.], n. 23, p.51-57, 1991. ______; MACCARELLI, F. Oenological properties of non-Saccharomyces yeasts associated with wine-making. World J. Microbiol. Biotechnol. New York, n. 14, p. 199-203, 1998. ______; FERRARO L. Combined use of immobilized Candida stellata cells and Saccharomyces cerevisiae to improve the quality of wines. J Appl Microbiol. [S.l.], n. 85, p. 247-254, 1998. CARVALHO, W.; CANILHA, L.; SILVIA, S.S. Uso de Biocatalizadores Imobilizados: Uma alternativa para a condução de bioprocessos. Revista Analytica. São Paulo, n. 23, 2006. CERANTOLA, V. I. at al. Aureobasidin: A arrests growth of yeast cells through both ceramide intoxication and deprivation of essential inositolphosphorylceramides. Mol. Microbiol. [S.l], 2009. CHAROENCHAI C. et al. Screening of non Saccharomyces wine yeasts for the presence of extra cellular hydrolytic enzymes. Aust J Grape Wine, [S.l.], 1997. CHAUD, S. G.; SGARBIERI, V. C. Propriedades funcionais (tecnológicas) da parede celular de leveduras da fermentação alcoólica e das frações glicana, manana e glicoproteína. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 26, n. 2, p. 369-379, 2006. CHENG, Li. S.S, et al. “Yeast species associated with wine grapes in China,” International Journal of Food Microbiology, Philadephia, v. 138, n. 1-2, 2010. CHI Z.; ARNEBORG N. Saccharomyces cerevisae strains with different degrees of ethanol tolerance exhibit diferent adaptative responses to produced ethanol. JInd Microbiol Biotechnol. New York, n. 24, p.75-78. 2000. ______; Controlled mixed culture fermentation: a new perspective on the use of non-Saccharomyces yeasts in winemaking,” FEMS Yeast Research, v.10, 2010. ______. Fermentation behavior and metabolic interactions of multistarter wine yeast fermentations. Int J Food Microbiol, Philadelphia, 2006. ______; FERRARO, L. Combined use of immobilised Candida stellata cells and Saccharomyces cerevisiae to improve the quality of wines. J. Appl. Bacteriol. [S.l.], n. 85, p. 247– 254, 1998. CIANI, Maurizo et al. Controlledmixed culture fermentation: a new perspective on the use of non-Saccharomyces yeasts inwinemaking. FEMS Yeast Res [S.l.], 2010. COCOLIN, L.; HERSEY, A.; MILLS, D.A.; Direct identification of the indigenous yeasts in commercial wine fermentations. Am. J. Enol. Vitic. Missouri, n. 52, p. 49–53, 2001.

43

CORTÉS.J, J. M. Salgado, B. RIVAS, A. M. Torrado and J. M. DOMÍNGUEZ, “Fermentation kinetics and chemical characterisation of vino tostado, a traditional sweet wine from Galicia (NW Spain),” Journal of the Science of Food and Agriculture, New York, v.90, 2010. CROUIGNEAU, A. A., FEUILLAT, M., GUILLOUX-BENATIER, M. Influence of some factors on autolysis of Oenococcus oeni. Vitis. Chile, n. 39, p. 167– 171, 2000. DENNIS, C., BUHAGIAR, R. W. Yeast spoilage of fresh and processed fruits and vegetables, In Biology and Activities of Yeasts. Academic Press, UK. Journal of Yeast and Fungal Research. Maryland, v. 2, n.4, p. 59-64, apr. 2011. ESTRUCH, F. Stress-controlled transcription factors, stress-nduced genes and stress tolerance in budding yeast. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Reviews, Amsterdam, v. 24, p.469-486, 2000. FERREIRA, S. A et al. crescimento micelial e síntese de proteínas de choque térmico em três isolados de fungos ectomicorrízicos sob condições de temperaturas supra-ótimas. Biologia do Solo. Microbiologia Agrícola. Viçosa: Universidade Federal de Viçosa – UFV. 2006. FERNANDES, A.F. V, Leveduras isoladas de produtos frutícolas: capacidade fermentativa e estudos sobre AH+-ATPase da membrana plasmática, 2008. Trabalho de conclusão de curso (tese de Doutorado). Lisboa, Portugal: Universidade Nova de Lisboa; 2008. FERNANDEZ MT, UBEDA JF, BRIONES. Comparative study of non Saccharomyces microflora of musts in fermentation, by physiological and molecular methods. FEMS Microbiol Let, London, 1999. ______. Food Microbiology Fundamentals and Frontiers, Washington, 2002. ______. Growth of yeasts during wine fermentations. J Wine Res, Auckland, n. 1, p. 211–223, 1999. ______. Yeast interactions and wine flavour. Int J Food Microbiol. New York, 2003. ______. Yeasts in fruit and fruit products. In: BOEKHOUT, T., ROBERT, R. (Eds.), Yeasts and Food. Beneficial and Detrimental Aspects. Behrs Verlag, Hamburg, 2003. FERNANDES, Patricia M. B. et.al. Ácidos Graxos de Membrana e Trealose na Resposta de Levedura a Alta Pressão Hidrostática. Vitória: Universidade Federal do Espírito Santo, 2008. FLEET, G.H. Wine yeasts for the future. FEMS Yeast research, London, v.8, n.7, p.979–995.2008. ______. Wine yeasts for the future FEMS Yeast Res 7 [S.l.], 2008.

44

FOLCH-MALLOL J. L. et al. La respuesta a estrés en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Rev Lat Am Microbiol. [S.l.], n. 46, p. 24-46, 2004. FOLMER, V. N. et al. H2O2 induces rapid biophysical and permeability changes in the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta–Biomembranes. Amsterdam, 2008. FREE, Stephen J. Fungal cell wall organization and biosynthesis. Fungal Genet Biol. [S.l.], n. 46, v;10, p.768–781, 2013. FUGELSANG, K.C.; EDWARDS, C.G. Wine Microbiology: Practical Applications and Procedures. 2. ed. Springer, 2007. GLOVER, J.R.; LINDQUIST, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: a novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell, USA, n. 94, p. 73-82. 1998. GRANCHI, L., et al. Dynamics of yeast populations during the early stages of natural fermentation for the production of Brunello di Montalcino wines. Food Technol. Biotechnol. New York, n. 36, p. 313-318, 1998. GROSSMAN, G. et al. Membrane potential governs lateral segregation of plasma membrane proteins and lipids in yeast. Embo J. [S.l.], 2007. ______. Use of oligo-strain yeast cultures to increase complexity of wine aroma. Vitic. Enol. Sci. [S.l.], n. 51, p. 175– 179, 1996. GUAN, X. L., et al. Functional Interactions between Sphingolipids and Sterols in Biological Membranes Regulating Cell Physiology. Mol. Biol. Cell, California, 2009. HENDERSON, C. M.; BLOCK, D. E. Examining the Role of Membrane Lipid Composition in Determining Ethanol Tolerance of Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol. [S.l.], 2014. HANNINEN, A. L. et al. The cytoplasmic chaperone Hsp 104 is required for conformational repair of heat-denatured proteins in the yeast endoplasmic reticulum. Mol. Bioi. Cell, California, n.10, p. 3623-3632, 1999. HANSEN, H. E. et al. The effect of oxygen on the survival of non-Saccharomyces yeasts during mixed cultures fermentations of grape juice with Saccharomyces cerevisiae. J. Appl. Microbiol. USA, n. 91, p. 541-547, 2001. HENICK-KLING, T. et al. Selective effects of sulfur dioxide and yeast starter culture addition on indigenous yeast populations and sensory characteristics of wine. J. Appl. Microbiol. USA, n. 84, p. 865-876, 1998. ______. Selective effects of sulphur dioxide and yeast starter culture addition on indigenous yeast population and sensory characteristics of wine. Journal of Applied Microbiology, USA, n. 84, p. 865-876, 1998.

45

HENSCHKE, P. Wine yeast. In: ZIMMERMAN, F.K., ENTIAN, K.D. (Eds.), Yeast Sugar Metabolism, Biochemistry, Genetics, Biotechnology and Applications. Technomic Publishing, Lancaster, UK, 1997. HIERRO, N. Monitoring of Saccharomyces and Hanseniaspora populations during alcoholic fermentation by real-timequantitative PCR. FEMS Yeast Res 7, [S.l], 2007.

HOFMAN, E. G. et al. EGF. Induces coalescence of different lipid rafts. J. Cell Sci. Cambridge, 2008. HORSEY, I. The Chemistry and Biology of Winemaking. Londres: RCS Publishing, 2007.436p. IVORRA C; PERREZ-ORTIN, J. E.; OLMO M. An inverse correlation between stress resistence and stuck fermentations in wine yeasts. A molecular study. Biotechnol Bioeng, USA, n. 64, p. 698-708, 1999. IZAWA, Shingo et al. Heat shock and ethanol stress provoke distinctly different responses in 3 processing and nuclear export of HSP mRNA in Saccharomyces cerevisiae.Biochem. J. [S.l.], 2008. JENSEN, R.E.; JOHNSON, A.E. Protein translocation: is Hsp70 pulling my chain? Curro Bioi. [S.l.], n. 9, p. 779-782, 1999. JOLLY N. P.; AUGUSTYN O. P. H.; PRETORIUS I. S. The role and use of non-Saccharomyces yeasts in wine production. S Afr J Enol Vitic, South African, 2006. JOHNSTON, M. Feasting, fasting and fermenting: glucose sensing in yeast and other cells. Trends Genet. [S.l.], n.15, p. 29-33, 1999. JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Biologia celular e molecular. 8. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005. KAPTEYN, J. C.; VAN DEN ENDE, H.; KLIS, F. M. Review:The contribution of cell wall proteins to the organization of the yeast cell wall. Biochimica ET Biophysica Acta, Amsterdam, v. 1426, n. 2, p. 373-383, 1999. KIM, S. W. et al. Production and characterization of exopolyasaccharides from an entomopathogenic fungus Cordyceps militaris NG3. Biotechnology Progress, New York, v. 19, n. 2, p. 428-435, 2003. KIM, H. O.; YUN, J. W. A comparative study on the production of exopolysaccharides between two entomopathogenic fungi Cordyceps militaris and Cordyceps sinensis in submerged mycelial cultures. Journal of Applied Microbiology, Oxford, v. 99, n. 4, p. 728-738, 2005. KING, E. S. et al. The effect of multiple yeasts co-inoculation on Sauvignon blanc wine aroma composition, sensory properties and consumer preference, Food chemistry, New York, v.122, 2010.

46

KLIS, F. M.; BOORSMA, A.; DE GROOT, P. W. J. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast, Chichester, Bethesda, v. 23, n. 3, p. 185–202, 2006. LAGE, P. H. guilliermondii impacts growth kinetics and metabolic activity of S. cerevisiae: the role of initial nitrogen concentration. Int. J. Food Microbiol. [S.l.], 2014. LAMBRECHTS, M.G., PRETORIUS, I.S. Yeast and its importance to wine aroma. A review. South African Journal of Enology and Viticulture. South African, n. 21, p. 97–129, 2000. LIMA, U. A.; BASSO, L. C.; AMORIM, H. V. In: LIMA, U. A. Biotecnologia Industrial: Processos Fermentativos e Enzimáticos. São Paulo: Edgard Blücher, 2001. p.1-43. (Biotecnologia Industrial; v.3) LIPKE, P. N.; OVALLE, R. Cell wall architecture in yeast: new structure and new challenges. Journal of Bacteriology, Washington, v. 180, n. 15, p. 3735-3740, 1998. LYND L. R. et al. Thermophilic ethanol production - investigation of ethanol yeld and tolerance in continuous culture. Rev. Biotechnol Appl Biochem. New York, n. 28, p.549-569, 1991. MADDIA, Abhiram et al. Trifluoromethanesulfonic acid-based proteomic analysis of cell wall and secreted proteins of the ascomycetous fungi Neurospora crassa and Candida albicans. Fungal Genet Biol. [S.l.], 2009. MADEIRA, A. Effect of ethanol on fluxes of water and protons across the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. [S.l.], 2010. MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J.Microbiologia de Brock. 10. ed. São Paulo: Prentice Hall, 2004. ______; HOHMANN, S. Stress response mechanisms in the yeast Saccharomyces cerevisiae. In: HOHMANN, S.; MAGER, W.H. (eds). Yeast stress responses. R.G. Austin: Landes Company, p. 1-5. 1997. MAGNELLI, P. E.; CIPOLLO. J. F.; ROBBINS, P. W. Glucanase-driven fractioation allows redefinition of Shizoccharomyces pombe cell wall compositon and structure:assigment of diglucan. Analytical Biochemistry, New York, v. 336, n. 2, p. 202-212, 2005. MALAJOVICH M. A. Biotecnologia. Rio de Janeiro, Edições da Biblioteca Max Feffer do Instituto de Tecnologia, 2011. MAMEDE, Maria Eugênia de Oliveira; PASTORE, Gláucia Maria. Avaliação da produção dos compostos majoritários da fermentação de mosto de uva por

47

leveduras isoladas da região da “Serra Gaúcha” (RS). Ciênc. Tecnol. Aliment, Campinas, n.24, v.3, p.453-458, jul.-set. 2004. MARO, E. D. et al. Yeast dynamics during spontaneous wine fermentation of the Catalenesca grape. International Journal of Food Microbiology, New York, v.117, 2007. ______.; Ercolini, D.; Coppola, S. Yeast dynamics during spontaneous wine fermentation of the Catalenesca grape, International Journal of Food Microbiology, New York, v.117, 2007. MARTINEZ, J.; MILLAN, C.; ORTEGA, J. M. Growth of natural flora during the fermentation of inoculated musts from ‘‘Pedro Ximenez’’ grapes. S. Afr. J. Enol. Vitic. South African, n.10 v. 2, p.31–35, 1989. MELO, H. F. Resposta ao estresse ácido em leveduras da fermentação alcoólica industrial. Recife/PE: UFPE, 2006. MENDES-FERREIRA, A.et al. Transcriptional Response of Saccharomyces cerevisiae to Different Nitrogen Concentrations during Alcoholic Fermentation, Applied and Environmental Microbiology, [S.l.], 2007. MOLINA. A; SWIEGERES, J. H.; VARELA, I. S. Pretorius and E. Agosin, “Influence of wine fermentation temperature on the synthesis of yeast-derived volatile aroma compounds,” Applied Microbiology and Biotechnology, New York, v.77, n.3, 2007. ______. et al. Influence of wine fermentation temperature on the synthesis of yeast-derived volatile aroma compounds. Applied Microbiology and Biotechnology, New York, v.77, n.3, 2007. MILLS, Johannsen E. A.; COCOLIN L. Yeast diversity and persistence in botrytis-affected wine fermentations. Appl Environ Microbiol, n. 68, p. 4884–4893, 2002. MINGORANCE-CAZORLA L, Clemente-Jime´nez JM, Martınez-Rodrıguez S, Las Heras-Vazquez FJ, Rodrıguez-Vico F Contribution of different natural yeasts to the aroma of two alcoholic beverages. World J Microbiol Biotechnol, New York, 2003. MISHRA, P.; Kaur, S. Lipids as modulators of ethanol tolerance in yeasts. Appl. Microbiol. Biotechnol. New York, n. 34, p. 697-702, 1991. MORANO, K. A., LIU, P. C.; THIELE, D.J. Protein chaperones and the heat shock response in Saccharomyces cerevisiae. Cun: Opin. Microbiol. [S.l.], n. 1, p. 97-203, 1998. ______ et al. A transactivation domain in yeast heat shock transcription factor is essential for cell cycle progression during stress. Mol. Cell. Bioi. Washington, n. 19, p. 402-411, 1999.

48

NATHAN, D. E, VOS, M.H.; LINDQUIST, S. In vivo functions of the Saccharomyces cerevisiae Hsp90 chaperone. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, n. 94, p.12949-12956, 1997. NELSON, D. L.; COX, M. M. Principles of Biochemistry. New York: W.H.Freeman and Company, 2005. NETO A, J. M. F. Proteinas de estresse HSP’s como complemento do sistema de defesa antioxidante. Revista Digital. Buenos Aires, Año 17, n.167, abr. 2012. NEVES, L. C. M; Revisão Bibliográfica. [S.l.], 2006. Disponível em http://www.google. com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&sqi=2&ved=0CCQQFjAA&url=http%3A%2F%2Fwww.tses.usp.br%2Fteses%2Fdisponiveis%2F9%2F9134%2Ftde-08102006>. Acesso em: 15 dez. 2013. NIMRICHTER, L. et al. The multitude of targets for the immune system and drug therapy in the fungal cell wall. Microbes and Infection, Paris, v. 7, n. 4, p. 789–798, 2005. ______. Characterization of early deaths ofnon-Saccharomyces yeasts in mixed cultures with Saccharomyces cerevisiae. Arch Microbiol. [S.l.], n.180, p. 257–263, 2003. NOBEL, H.; VAN DEN ENDE, H. V. D.; Klis, F. M. Cell wall maintenance in fungi. Trends in Microbiology, Cambridge, v. 8, n. 8, p. 344-345, 2000. NOLLEN, E. A.; Morimoto, R. I. Chaperoning signaling pathways: molecular chaperones as stresssensing 'heat shock' proteins. J Cell Sci. [S.l.], n.115, p.2809-2816, 2002. NOMBELA, C.; Gil, C.; Chaffin, W. L. Nonconventional protein secretion in yeast. Trends in Microbiology, Cambridge, v. 14, n. 1, p. 15-21, 2006. OLIVEIRA, A.L.C. Estudo Fisiologico e morfológico da aplicação de estresse eletroquímico em cultivos de leveduras, Rio de Janeiro: Escola de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2009. PATTON, J. L.; LESTER, R. L. The Phosphoinositol Sphingolipids of Saccharomyces Cerevisiae Are Highly Localized in the Plasma-Membrane. J. Bacteriol. Washington, 1991. PEDROSO, N. et al. Modulation of plasma membrane lipid profile and microdomains by H2O2 in Saccharomyces cerevisiae. Free Radic. Biol.Me, Louisiana, 2009. P´EREZ-NEVADO, F. et al. Cellular death of two non-Saccharomyces wine-related yeasts during mixed fermentations with Saccharomyces cerevisiae. Int J Food Microbiol, New York, n. 108, p. 336–345, 2006. PÉREZ, P.; RIBAS, J. C. Cell wall analysis. Methods: Amsterdam, v. 33, n. 3, p. 245-251, 2004.

49

PIETROWSKI, Giovana de Arruda Moura et al. Of Fermentation with Hanseniaspora sp. Yeast on the Volatile Profile of Fermented Apple. Agric. Food Chem. [S.l.], 2012. PINA C.; ANTONIO, J; HOOG, T. Inferring ethanol tolerance of Saccharomyces and non-Saccharomyces Yeasts by progressive inactivation. Biotechnol Lett. New York, n. 26, p.1521-1527. 2004. ______. Et al. Ethanol tolerance of five non-Saccharomyces wine yeasts in comparison with a strain of Saccharomyces cerevisiae. Influence of different culture conditions. Food Microbiol. New York, n. 21, p. 439-447, 2004b. PRETORIUS, I.S; WESTHUIZEN vaan der J. J; AUGUSTYN, O.P.H. Yeasts Biodiversity in Vineyards and Wineries and Its importance to the Sounth African wine industry. South African Journal Enology Viticulture, South African, v.20, n.2, p. 61-74, 2003. ______. Tailoring wine yeast for the new millennium novel approaches to the ancient art of winemaking. [S.l.], 2000. ROBINSON, Anthony L. Origins of Grape and Wine Aroma. Part 1. Chemical Components and Viticultural Impacts. Am. J. Enol. Vitic. [S.l.], n.65, v.1, 2014. RODRIGUEZ, R. J. et al. Multiple functions forsterols in Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta 1985. ______. Acetate ester formation in wine by mixed cultures in laboratory fermentations. International Journal of Food Microbiology. New York, n. 86, p.181–188, 2003. ROMANO, P. et al. Secondary products formation as tool for discriminating non-Saccharomyces wine strains. Antonie Van Leeuwenhoek, [S.l.], n. 71, p. 239-242, 1997. ______. Function of yeast species and strains in wine flavour. Int J Food Microbiol, New York, 2003. RODRIGUEZ-COLMAN, M. J. He forkhead transcription factor Hcm1 promotes mitochondrial biogenesis and stress resistance in yeast. J. Biol Chem. [S.l.], 2010. RODRÍGUEZ, M.E. et al. Influence of Candida pulcherrima Patagonian strain on alcoholic fermentation behaviour and wine aroma. International Journal of Food Microbiology, New York, v. 138, n. 1-2, p.19-25, 2010. RUIS, H.The HOG pathway controls osmotic regulation of transcription via the stress response element (STRE) of the accharomyces cerevisiae CIT J gene. EMBO J. New York, n. 13, p. 4382-4389, 1994. SABATE, J. et al. Diversity of Saccharomyces strains in wine fermentations; analysis for two consecutive years. Lett. Appl. Microbiol. Malden, n. 26, p. 452-455. 1998.

50

SALEH, A A et al. Roles of Hsp104 and trehalose in solubilisation of mutant huntingtin in heat shocked Saccharomyces cerevisiae cells. [S.l.], 2014. SALES, K. et al. The LEA-like protein HSP12 in Saccharomyces cerevisiae has a plasma membrane location and protects membranes against desiccation and ethanol-induced stress. Biochim. Biophys. Acta, n. 1463, p. 267-278, 2000. SANTOS, I. J. dos. Cinética de fermentações e estudo de metabólitos e enzimas intracelulares envolvidas na fermentação alcoólica cervejeira conduzida com leveduras de alta e baixa fermentação em diferentes composições de mosto. Viçosa, 2005. SCANNELL, D. R. et al. Independent sorting-out of thousands of duplicated gene pairs in two yeast species descended from a whole-genome duplication. PNAS. Washington, n.104, p. 8397-8402, 2007. SCHOLLER, C. et al. Handbook of Enology.The Chemistry of Wine Stabilization and Treatments. Chichester: John Wiley & Sons Ltd,.2000, v.2. SCHULZ, M.; GAFFNER, J. Analysis of yeast diversity during spontaneous and induced alcoholic fermentations. J. Appl. Bacteriol. USA, n. 75, p. 551– 558, 1993. SCHULZ, T. A.; PRINTZ, W. A. Sterol transport in yeast and the oxysterol binding protein homologue (OSH) family. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Biol. 2007. SENER, Aysun; CANBAFI, Ahmet; ÜNAL, M. Ümit. The Effect of Fermentation Temperature on the Growth, Kinetics of Wine Yeast Species. Turk J Agric For, [S.l], 2007. SHERMAN, F. Getting started with yeast. San Diego: Ademic Press, 2002. SHERMAN, D. et al. Génolevures complete genomes provide data and tools for comparative genomics of hemiascomycetous yeasts. Nucleic Acid Res. Oxford, n. 34: p.D432-D435, 2006. SILVA, Ana Sofia Gomes da. Avaliação dos compostos fenólicos e voláteis ao longo da vinificação. 2012. Trabalho de Conclusão de Curso (Dissertação de mestrado) – Universidade de Aveiro, Aveiro, 2012. SILVA, José Alexandro et.al. Aplicação da Metodologiade Planejamento Fatorial e Análise de Superfícies de Resposta para Otimização da Fermentação Alcoólica. João Pessoa: Química Nova, 2008. SILVA, Juarez de Souza. Produção de álcool combustível na fazenda e em sistema cooperativo. Viçosa. Disponível em:<http://www.ufv.br/poscolheita /Produ% C3%A7%C3%A3o_de_%C3%A1lcool_combust%C3%ADvel_index.htm.>Acesso em: 10 out. 2013.

51

SILVA, Rosimeire; BATISTOTE, Margareth; CEREDA, Marney; Alcoholic Fermentation by the Wild Yeasts under Thermal, Osmotic and Ethanol Stress; Braz. Arch. Biol. Technol. Curitiba, v.56, n.2, p. 161-169, mar/apr. 2013. SILVA, José Alexandro. et.al. Aplicação da Metodologia de Planejamento Fatorial e Análise de Superfícies de Resposta para Otimização da Fermentação Alcoólica. Universidade Estadual da Paraíba: Química Nova, 2008. SMITH, G. J. et al. Cell wall dynamics in yeast. Current Opinionin Microbiology, Oxford, v. 2, n. 4, p. 348-352, 1999. SOARES, D. G.; ANDREZZA, A. C.; SALVADOR, M. Avaliação de compostos com atividade antioxidante em células da levedura Saccharomyces cerevisiae. Rev. Bras. Cienc. Farm. v. 41 n.1 São Paulo. jan. / mar. 2005. SODEN, A. et al. Effects of co-fermentation with Candida stellata and Saccharomyces cerevisiae on the aroma and composition of Chardonnay wine. Aust. J. Grape Wine Res. USA, n.6, p. 21–30, 2000. SOUSA, Lopes A. et al. Decreased cellular permeability to H2O2 protects Saccharomyces cerevisiae cells in stationary phase against oxidative stress. [S.l], 2004. SOUZA, C. S. Avaliação da produção de etanol em temperaturas elevadas por linhagens de Saccharomyces cerevisiae. 2009. Trabalho de Conclusão de curso (Dissertação a titulo de Doutor) - Universidade de São Paulo, São Paulo, 2009. SUN, H. H. Identification of yeast population dynamics of spontaneous fermentation in Beijing wine region, Annals of Microbiology, China, v.59, n.1, 2009. SWAN, T. M.; WATSON, K. Stress tolerance in a yeast sterol auxotroph: role of ergosterol, heat shock proteins and trehalose. FEMS Microbiol Lett. [S.l.], 1998. SWIEGERS, J. H.; CHAMBERS, P.J..; PRETORIUS, I.S. Olfaction and taste: Human perception, physiology and genetics. Australian Journal of Grape and Wine Research, Malden, v.11, n. 2, p.109-113, 2005. TORIJA, M. J. et al. Effects of fermentation temperature on the strain population of Saccharomyces cerevisiae. Int. J. Food Microbiol. New York, n. 80, p. 47-53, 2002. TORO, M. E.; VAZQUEZ, F. Fermentation behaviour of controlledmixed and sequential cultures of Candida cantarellii and Saccharomyces cerevisiae wine yeasts. WorldJ Microbiol Biotechnol, New York, n.18, p.347-354, 2002. WALKER, G. M. Introduction to yeasts: In Yeast Physiology and Biotechnology. Chichester: John Wiley & Sons Ltda, 1998. ZHANG, J. et al. Activation of B lymphocytes by GLIS, a bioactive proteoglycan from Ganoderma lucidum. Life Sciences, Elmsford, v. 71, n. 6, p. 623–638, 2002

52

CAPITULO II

ULTRAESTRUTURA CELULAR E A EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS DAS

LEVEDURAS HANSENIASPORA SOB EFEITO DE ESTRESSE ETANÓLICO

RESUMO

As Hanseniaporas são leveduras de interesse enológico, pois atribuem flavour ao

produto final da fermentação do mosto de uvas. O objetivo do estudo foi avaliar o

estresse etanólico das Hanseniaspora em cepas(Ho e Hg) analisando a

ultraestrutura e o perfil da expressão protéica em diferentes concentrações de etanol

. A ultraestrutura foi analisada através da Microscopia eletrônica de Varredura e a

expressão protéica foi avaliada em análise eletroforética pelo método SDS PAGE.

Na análise da Microscopia, as cepas em meio YM mostraram células jovens com

morfologia apiculadas com brotamento bilateral, pólos distais côncavos com

múltiplas cicatrizes em forma de anéis presentes na separação do broto durante o

brotamento. Acima de 6% de etanol as células tiveram alterações na integridade da

parede celular, plasmólise, perda da turgescência e ativação da autólise celular.

Nas análises de SDS-PAGE as expressões dos pesos moleculares foram

relacionadas como possíveis proteínas HSPs. Ho 41 e Hg 43 apresentaram banda

de peso molecular 10kDa nos estresses (1% , 2%, 3% ,6%). Ho 41 apresentou

100kDa a 3% de estresse e Hg 43 apresentou 100kDa nos estresses 3% e

aumentou expressão em 6%. O etanol é um fator limitante para viabilidade celular

das Hansenisporas, além de acelerar a ativação do programa de morte celular. A

ausência de expressão de outras proteínas (HSPs) que auxiliam no mecanismo

adaptativo, faz com que esta levedura não tenha tolerância a concentrações

crescentes de etanol durante a fermentação do mosto de uvas.

Palavras-chave: etanol, Hansenisapora, ultraestrutura, HSP

53

ABSTRACT

The Hanseniaporas are yeast oenological interest because attribute flavor to the final

product of fermentation of grape must. The objective of the study was to evaluate the

ethanol stress of Hanseniaspora in strains (Ho and Hg) analyzing the ultrastructure

and the profile of protein expression in different concentrations of ethanol. The

ultrastructure was analyzed by electronic scanning microscopy and protein

expression was evaluated in electrophoretic analysis by SDS PAGE method. In the

analysis of microscopy, the strains in YM medium showed young cells with peaked

morphology with bilateral budding, concave distal poles with multiple scars in the

form of rings present in the bud separation during budding. Above 6% ethanol, the

cells were changes in the cell wall, plasmolysis, swelling, and loss of autolysis of cell

activation. On SDS-PAGE analysis of the expression of molecular weights were

related proteins HSPs as possible. Ho 41 and 43 mmHg had a molecular weight of

10kDa band in stresses (1%, 2%, 3%, 6%). Ho 41 100 kDa showed 3% Hg stress

and stress at 100 kDa showed 43% and increased expression 3 by 6%. Ethanol is a

limiting factor for cell viability of Hansenisporas and accelerate the activation of the

cell death program. The absence of expression of other proteins (HSPs) that assist in

the adaptive mechanism, makes this yeast has no tolerance to increasing

concentrations of ethanol during fermentation of the grape must.

Keywords: ethanol, Hansenisapora, ultrastructure, HSPs.

54

1 INTRODUÇÃO

A diversidade ambiental a que os organismos estão expostos desencadeiam

um sequenciamento de respostas biológicas complexas que envolvem mecanismos

gerais e específicos de adaptação. Estes mecanismos dependem de diversos

fatores que interagem entre si. No entanto, os organismos considerados modelos,

desempenham um papel crucial na compreensão desses mecanismos adaptativos,

decorrentes de variações rápidas e bruscas no meio ambiente, pois permitem a

manutenção de um estado de equilíbrio que garanta a sobrevivência e evolução

(ROPIO, 2010).

Durante a fermentação etanólica as células das leveduras estão expostas a

vários estresses ambientais tais como, elevadas concentrações de açúcar no meio,

aumento de temperatura, aumento da concentração de etanol e instabilidade do pH.

As macromoléculas celulares, incluindo as proteínas, ácidos nucléicos e membranas

estão seriamente danificadas em condições de estresse. Consequentemente,

comprometendo o seu crescimento, a viabilidade celular, e o próprio desempenho

fermentativo desta levedura. Para se proteger das condições desfavoráveis,

algumas espécies respondem rapidamente através da síntese de moléculas, que

irão reparar os danos celulares e a desnaturação de proteínas de membrana

causado pelo estresse, essas moléculas são chamadas de proteínas de choque

térmico (SHIMA et al 2009).

A tolerância ao estresse durante o processo fermentativo é alvo de estudos

de investigação sobre os mecanismos moleculares de resposta adaptativa (PURIA

et al 2009). As primeiras pesquisas sobre as respostas moleculares ao estresse

foram observadas em S. cerevisiae, em que a síntese de HSPs é verificada com o

aumento de temperatura de vinificação e o aumento da concentração de etanol entre

outros estresses (SIQUEIRA JUNIOR, 2013). E para garantir a sobrevivência

durante o estresse e proteger os componentes celulares essenciais, a S. cerevisiae

desenvolve mecanismos que permitem rápida retomada das atividades celulares

normais durante o período de recuperação. A célula da Saccharomyces sintetiza

proteínas de choque térmico (HSPs), mas também possui outros mecanismos

adaptativos como: aumento dos níveis de trealose, alterações bioquímicas,

55

enzimáticas na membrana plasmática e alterações morfológicas (ZHANG,

2009;TESNIERE et al, 2013)

As leveduras do gênero Hanseniaspora são alvos de pesquisas, pois são

identificadas nas fases iniciais da fermentação do mosto uvas. Essas leveduras se

tornaram um objeto de interesse crescente, devido a sua potencial contribuição nas

propriedades enológicas ao vinho. A adição dessas leveduras durante o processo

fermentativo no mosto, aumentam os atributos de aromas e sabor dos vinhos.

(MEDINA et al, 2013). No entanto, as espécies Hanseniaspora declinam e tem morte

celular mais rapidamente em uma concentração etanólica superior á 6% no meio.

Isto explica o efeito prejudicial do etanol sobre as proteínas de membrana e outros

componentes celulares, enfraquecendo as interações hidrofóbicas e a atividade

funcional celular. Fisiologicamente o etanol causa nas leveduras não

Saccharomyces um desequilíbrio entre a taxa de produção e o fluxo através da

membrana, o que acarretaria uma acumulação intracelular de etanol, o que

explicaria o maior efeito tóxico do etanol detectado durante a fermentação

(PIZARRO, 2008).

Segundo estudo realizado em S.cerevisiae durante o estresse etanólico foi

verificado a indução de uma série de respostas celulares considerando a depleção

de nutrientes no meio e aumento no percentual do etanol, contribuindo para queda

no crescimento e na formação de esporos aptos resistirem as variação ambiental

(RUIS,1995; CASALONE et al., 2005). A formação de esporos é um evento de

divisão celular anormal em que as células filhas são formadas no citoplasma da

célula mãe. Este processo envolve uma nova formação de duas estruturas celulares

diferentes: a membrana no citoplasma da célula que darão origem a esporos e a

membrana do plasma que forma uma grande parede de esporos que protege a

ultraestrutura celular das variações ambientais (PICCIRILLO, 2010;NEIMAN, 2011).

Além de esporos a S.cerevisiae tem demonstrado a formação de pseudohifas em

resposta de resistência a situação de estresse provocado pela toxicidade etanólica

associada à escassez de nutrientes. (GANCEDO, 2001; FUJITA, 2005).

56

Resposta molecular também foi observada em S.cerevisiae durante a

fermentação. Essas leveduras sintetizam vários marcadores moleculares e seus

cofatores (HSP 104, HSP 82, HSP 60, HSP 42, HSP30, HSP26) que são regulados

positivamente durante a fermentação. Essas chaperonas (HSPs), como também são

chamadas, funcionam ativando o resgate de proteínas de membrana desnaturadas,

restaurando a atividade celular, melhorando a tolerância da levedura S.cerevisiae, e

consequentemente aumentando a produtividade em etanol no meio, respondendo

rapidamente ao estresse fermentativo e homeostasia celular (KIM et al , 2013).

Proteínas de choque térmico (HSPs) são sintetizadas em resposta a uma

grande variedade de estresse. A família das HSPs é dinâmica, extremamente

heterogênea e são induzidas em respostas as variadas condições ambientais. Os

padrões específicos de indução das HSPs são observados para todas as respostas

dos organismos, incluindo a de estresses térmico, hiperosmótico, presença de

etanol, limitação de nutrientes e outros (BAUER et al, 2000).

Proteínas com pesos moleculares diferentes podem aumentar a sua

expressão no estresse de acordo com a linhagem estudada. A espécie S.cerevisiae

é considerada uma grande fermentadora e produtora de etanol, pois é conhecida

como a mais resistente à toxicidade etanólica. Ela participa da fermentação do

mosto juntamente com as leveduras Hanseniaspora e outros microrganismos nos

estágios inicias da fermentação, pois estas não toleram altas concentrações de

etanol ( 2007; ZHANG Q et al, 2009).

Não há muito conhecimento sobre a ultraestrutura e biologia molecular de

leveduras não Saccharomyces especialmente as do gênero Hanseniaspora, durante

o estresse. Dessa forma, foi relevante estudar o crescimento e sua morfologia

celular durante o estresse etanólico, já que este é o principal produto da

fermentação. E este gênero possui grande importância biotecnológica por ser

produtora de compostos voláteis, contribuindo com características singulares ao

mosto de uvas.

As leveduras S.cerevisiae podem servir de modelo na escolha de

marcadores HSP para seleção de espécies não Saccharomyces, avaliando as cepas

57

mais tolerantes ao etanol. Além disso, esses marcadores podem servir para criação

de espécies geneticamente modificadas, por exemplo, Hanseniasporas que

expressassem, estas proteínas poderiam resistir a concentrações bem mais altas de

etanol. No entanto, o estudo de marcadores moleculares de resistência ao estresse

diretamente em Hanseniasporas pode servir tanto para a bioprospecção de espécies

mais resistentes, como para contribuir na síntese de compostos voláteis e aromas,

atribuindo melhor qualidade sensorial ao vinho.

2 MATERIAIS E METÓDOS

O presente estudo foi desenvolvido no Laboratório de Biologia Molecular

Carmen Lemos (LBM) do Instituto de Biologia da Universidade Federal da Bahia em

parceria com o Laboratório Multiusuário de Microscopia Eletrônica do Instituto de

Física LAMUME - (UFBA).

2.1 MATERIAL

2.1.1 Amostra

Empregou-se as culturas de leveduras do gênero Hanseniaspora

guillhiermondii (Hg43), Hansenisaspora Opuntiae (Ho41) isoladas de uvas Vitis

viniferas L., cultivadas na região do Vale do Submédio São Francisco, localizado

entre o estado de Pernambuco e Bahia. e como padrão Saccharomyces cerevisiae

da variedade bayanus (Scb) (Marca Maurivin).

3 MÉTODO

3.1 MEIO DE CULTURA

Para o cultivo das leveduras foi utilizado o meio contendo Agar Yeast Malt

(YM) (1% de glicose (Vetec); 2% de Agar bacteriológico (Acumedia); 0,5% de

peptona (Acumedia); 0,3% de extrato de malte (Acumedia) e 0,3% de extrato de

58

levedura (Acumedia), suplementadas com cloranfenicol (Himedia), na concentração

de 0,001% (100mg/L) (YARROW, 1998).

3.2 MEIO ETANÓLICO

Para a preparação dos inóculos em condições de indução ao estresse

etanólico foi adicionado ao meio YM o etanol - álcool etilico absoluto PA 99,5%

(Anidro) nas proporções 0%,1%,2% 3%, 6%, 9%,12%,(v/v). As leveduras foram

repicadas em triplicatas com auxílio da alça de Drigalski descartável em meio de

cultura adicionada ao etanol. Todas as placas após semeadura foram vedadas com

filmes plásticos e incubadas a 25ºC para avaliação de crescimento com o objetivo de

observar morfologia e crescimento das leveduras do gênero Hanseniaspora em

comparação com a levedura Saccharomyces cerevisiae da variedades bayanus.

(REIS, 2011).

3.3 MICROSCÓPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA - (MEV)

A Microscópica Eletrônica de Varredura (MEV) foi utilizada para fornecer

informações sobre à ultraestrutura da levedura com aumento de até 300.000 vezes.

A imagem eletrônica de varredura é gerada pela incidência de um feixe de elétrons,

em condições á vácuo. As imagens formadas foram realizadas no aparelho MEV

JEOL JSM-6610LV Scanning Electron Microscope, com filamento de tungstênio,

magnificação máxima de 300.000X pertencente ao Laboratório Multiusuário de

Microscopia Eletrônica do Instituto de Física da Universidade Federal da Bahia.

3.4 LISE CELULAR

A lise celular tem o objetivo de romper a parede celular da levedura. As

células foram removidas do meio de cultura sólido para um tubo de centrífuga com

tampa com auxilio de alça de platina. Foi pesado aproximadamente 1 g (peso úmido)

de células de leveduras crescidas em meio sob indução de estresse etanólico.

Adicionou-se 4 mL de tampão de lise. Em seguida ressuspendeu-se as células

usando um vórtex (Digilab) e estas, posteriormente, foram submetidas à sonicação

(Unique DS500). O tubo contendo a suspensão celular foi mantido em gelo e as

células foram sonicadas por 30s a 70Watts, seguidos de 1min de repouso em banho

de gelo. Este processo foi repetido 3 vezes. A suspensão de células lisadas em

59

seguida, foram centrifugadas durante 10 min a 10.000 rpm a 4ºC, para separar a

solução protéica do sedimento contendo o debris celular (FLEURI et al 2008).

3.5 QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS – CURVA DE BSA

Foi realizada uma curva padrão usando-se diferentes concentrações de

albumina do soro bovino (BSA) em função da absorbância obtida a 595nm em

espectrofotômetro, utilizando o método de coloração de Bradford (1976). Este

método foi utilizado para a determinação do conteúdo de proteínas totais, que se

ligam ao corante de um modo proporcional à concentração (MACHINI; MARANA,

2013). Após a leitura das absorbâncias equivalentes as amostras de leveduras

(Ho41 e Hg43) no espectrofotômetro. A concentração das amostras foi determinada

(em mg/ ml) baseado na curva prévia de BSA. A conversão de Absorbância em

concentração de proteína foi obtida com a ajuda do software Graf Pad Prism 5

Project. As amostras dos tubos com o lisado protéico foram aliquotadas

armazenadas em freezer para posteriormente serem utilizadas nas análises de

eletroforéticas.

3.6 ELETROFORESE EM GEL

As análises dos perfis proteicos por eletroforese em gel de poliacrilamida do

tipo desnaturante (SDS-PAGE) foram desenvolvidas de acordo com o método

estabelecido por Laemmli (1970). SDS (sócio dodecil sulfato) é um detergente

aplicado com o objetivo de ação desnaturante sobre as proteínas se associando a

radicais apolares e rompendo interações hidrofóbicas. Esta técnica foi utilizada para

determinação das massas moleculares relativas das proteínas presentes em cada

amostra de levedura. As analises foram realizadas em uma cuba de eletroforese

(Mini-protean 3 cell Eletroforesis®, Biorad), a 75 volts em tampão de corrida (15g de

Tris Base; 72g de glicina; 50ml de SDS 10%, H2O q.s.p. 500ml com agua destilada)

e finalizada quando o azul de bromofenol atingiu a borda inferior do gel. A fonte

utilizada foi Gibco BRL Eletrophoresis Power Supply, modelo 250, da Life

Technologies.

A concentração de proteína aplicada foi padronizada (4ug) com o objetivo de

utilizar a mesma concentração protéica em todos os poços do gel. Dessa forma, a

60

variação na intensidade das bandas pôde ser interpretada como níveis diferentes de

expressão protéica diferentes. Com isso, quanto mais intensa a banda, maior o grau

de expressão naquelas condições. Foram aplicados 5 µl do marcador de peso

molecular BenchMark Protein Ladder. Os géis foram corados por nitrato de prata,

seguindo protocolo padronizado Mortz et al (2001). A coloração consiste

basicamente de imersões em diferentes soluções, seguindo as etapas de: fixação;

incubação, na qual o gel é sensibilizado para aumentar a subsequente formação de

imagens; coloração, quando ocorre a impregnação com o nitrato de prata; e a

revelação quando ocorre o desenvolvimento das imagens.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA

Em meio YM sem estresse etanólico as leveduras mostraram suas

ultraestruturas através da Microscopia eletrônica de Varredura (MEV), conforme

Figs. (1,2,3). As células com morfologia ovais e apiculadas, com brotamento bilateral

formam os ascósporos que é característica de identidade para esta levedura. A

parede celular exterior se mostrou espessa e distorcida evidenciada como célula

alongada. Segundo Deak (1996) as Hanseniasporas apresentam células ovais

jovens em forma de botão e as células apiculadas possuem parede celular alongada

e pólos distais côncavos, além de possuir múltiplas cicatrizes em forma de anéis

presentes na separação do broto na reprodução por brotamento conforme imagem

(Fig.4)

Figura 1 – Meio YM normal - Levedura Hanseniaspora opuntiae - 43 crescida em meio ym normal sob condições normais- Imagem aumentada 1,100x

61

Figura 2 – Meio YM normal - Levedura Hanseniaspora guillermondi crescida em meio Ym normal sob

condições normais- Imagem aumentada 1,900x

Figura 3- Meio etanol 3% - Levedura Hanseniaspora guillermondi crescida em meio Etanol 3% normal sob condições normais- Imagem aumentada 2,500x

62

Figura 4 - Meio etanol 3% - Levedura Hanseniaspora opuntiae crescida em meio Etanol 3% normal sob condições normais- Imagem aumentada 5,500x

63

As leveduras avaliadas Ho41 e Hg43 tiveram crescimento positivo em meio

etanólico até 6%. Estudos similares realizados por Reis (2011) com

Saccharomyceas cerevisae, o qual, submeteu-se a levedura a variadas

concentrações de etanol e observou a resistência e seu crescimento celular até a

concentração limitante de 15% conforme Fig 5.

Figura 5 - Meio etanol 12% - Levedura saccharomyceas cerevisae variedades bayanus -Scb crescida em meio Etanol 12% normal sob condições normais- Imagem aumentada 4,500x

Outra característica foi observada na MEV, quando o feixe de elétrons focava nas

colônias das Hanseniasporas as células se agrupam em direção ao feixe de elétrons

diminuindo a sua viabilidade celular, isto ocorre devido a sua sensibilidade a

descarga elétrica, dificultando no foco das imagens da microscopia eletrônica (Figs

6,7). Dados similares foram obtidos com Hanseniaspora guilliermondii e

Saccharomyceas cerevisae relacionando os efeitos de diferentes correntes elétricas

com a viabilidade celular e observaram que as células das leveduras Hanseniaspora

são sensíveis a correntes elétricas em relação às Saccharomyceas. As cargas

elétricas alteram significativamente o potencial eletroquímico de membrana

provocando queda na atividade metabólica, diminuição da atividade enzimática,

64

perda da turgescência celular ocasionada pela autólise celular e perda da

organização da membrana plasmática nas Hanseniaspora. Comportamento diferente

foi observado em Saccharomyceas que mantiveram resistências as descargas

elétricas (RANALLI et al, 2002).Figura 6 - Meio etanol 1% - Levedura Hanseniaspora opuntiae -

43 crescida em meio Etanol 1% normal sob condições normais- Imagem aumentada 1,600x

Figura 7 Meio etanol 1% - Levedura Hanseniaspora guillermondi crescida em meio Etanol 1% sob condições normais- Imagem aumentada 1,500x

65

Os testes realizados mostraram que as linhagens Ho41 e Hg43 não

cresceram em concentração acima de 6% de etanol diferentemente da Scb, que

suportou a concentração de etanol até 12%. Isso sugere que o etanol é um fator

limitante para viabilidade celular das leveduras Hansenisporas, além de acelerar a

ativação do programa de morte celular. Além disso, nas observações através de

microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi possível verificar as alterações ultra

estruturais induzidas pelo etanol e o comprometimento da integridade da parede

celular conforme, Figs ( 9, 10,11).

Figura 9 - Meio etanol 6% - Levedura Hanseniaspora opuntiae crescida em meio Etanol 6% normal sob condições normais- Imagem aumentada 3,700x

66

Figura 10 - Meio etanol 6% - Meio etanol 6% - Levedura Hanseniaspora opuntiae crescida em meio

Etanol 6% normal sob condições normais- Imagem aumentada 1,800x

Figura 11 - Meio etanol 6% - Levedura Hanseniaspora guillermondi crescida em meio Etanol 6% normal sob condições normais- Imagem aumentada 6,000x

67

Esta análise também foi realizada em Saccharomyces cerevisae por Ceccato

(2000) e Klis (2002) que avaliaram a resposta celular a concentração de 15% de

etanol para esta espécie e verificaram a resistência desta a diferentes

concentrações de etanol. Em estresse ambiental a parede celular da S.cerevisae

ativa múltiplas reações que alteram a sua organização estrutural, elevando o nível

de quitina, aumentando sua resistência em resposta ao estresse, além de ativar uma

cascata de sinalização que induzem a síntese de proteínas de superfície que

protegem as proteínas de membrana.

Estudos anteriores mostram que a presença do etanol inibe a taxa de

crescimento e induz danos na membrana. No modelo Saccharomyces cerevisae foi

observado que o aumento da concentração de etanol no meio promove danos e

dimorfismo em resposta adaptativa a condições ambientais adversas. A depleção de

nutrientes e o aumento de etanol durante o processo fermentativo induzem a

modificações na estrutura celular, apresentando células de forma alongada

denominada de pseudohifas. A forma pseudohifa, a célula se apresenta filamentosa

conseguindo aumentar a relação volume/superfície gastando menos energia a

procura de nutrientes (GIMENO et al, 1992; DICKINSON, 1996). Nas cepas Ho41 e

Hg43 não foram evidenciadas o surgimento de pseudohifas, o que demonstra a

68

intolerância dessas espécies ao estresse etanólico e a incapacidade em responder

rapidamente as alterações ambientais.

Resultados similares também foram obtidos por KLIS (2002) com S.cerevisae

demonstrando que a presença de etanol influenciou no crescimento e alterações na

morfologia. O etanol induziu a filamentação por depleção de nitrogênio,

desenvolvendo pseudohifas.

Coney et al (2013) avaliou a formação de esporos em Saccharomyces

cerevisae, elas foram testadas com éter e etanol adicionadas ao meio de cultura.

Foram identificadas a formação de esporos que conferem as camadas externas da

parede celular maior proteção e resistência as variações ambientais. As espécies

Ho41 e Hg 43 não foram identificadas a formação de esporos em meio etanólico até

6%.

Outro aspecto demonstrado nas pesquisas de Ceccato (2000) é que nas

leveduras em situação de estresse etanólico as células se alongam e se juntam

umas as outras formando cadeias ou aglomerados de células. Conforme Figs

(12,13,14) observa-se o alongamento das células das leveduras Hansenispora com

intenso agrupamento de células.

Figura 12 - Meio etanol 6% - Levedura Hanseniaspora guillermondi crescida em meio Etanol 6% normal sob condições normais- Imagem aumentada 3,700x.

69

Figura 13 - Meio etanol 6% - Levedura Hanseniaspora guillermondi crescida em meio Etanol 6% normal sob condições normais- Imagem aumentada 2,700x

Figura 14 - Meio etanol 6% Levedura Hanseniaspora guillermondi crescida em meio Etanol 6% normal sob condições normais- Imagem aumentada 6,000x

70

ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA

Neste estudo foram avaliadas as cepas (Hg43) e (Ho41) a essas espécies

são atribuídas à incapacidade de sobreviver às concentrações crescentes de etanol

produzido na fermentação mantendo células viáveis no máximo de 6% tolerância. A

descoberta de marcadores protéicos conservados entre essas cepas é importante

para comparar com os marcadores identificados em Saccharomyces cerevisiae

submetidas ao mesmo estresse etanólico e que desempenha resistência a esta

levedura.

Pesquisas com Saccharomyces cerevisiae são realizadas para verificar a

presença de marcadores protéicos como forma de avaliar a resistência ao estresse

causado pelo etanol. Utilizando a metodologia de lise celular, dosagem de proteínas

(SDS_PAGE) avaliando as bandas de expressão dessas proteínas. No entanto,

estudos com não Saccharomyces são escassos e existe o interesse nessas

leveduras de que elas permaneçam viáveis até o final da fermentação. Para isso, é

preciso de informações das estratégias moleculares com relação à expressão

dessas proteínas de choque térmico (Hsps) durante o estresse etanólico (RAMOS et

al 2013).

Os marcadores de expressão descobertos para as cepas Ho41 e Hg43, cepas

específicas para vinho tiveram peso moleculares10 kDa apresentados em todos os

estresses(1%, 2%, 3%, 6%) conforme (Fig 1 e 2). Resultados similares obtidos por

(SIQUEIRA JUNIOR, 2013), que encontrou em S. cerevisiae fermento biológico da

cerveja – Safale (S-04) e estão relacionados ao estresse fermentativo etanólico.

Essa levedura teve crescimento até uma concentração de 15% de etanol v/v. Essa

Hsp10 também foi encontrada em S. cerevisiae em trabalhos realizados por Miura

(2006), que submeteu à levedura a alta pressão hidrostática verificando que esta

Hsp sugere está relacionada viabilidade celular.

Tanto para as espécies Ho 41 como a Hg 43 foi possível verificar a banda de

expressão para o peso molecular 100kDa, a 3% na levedura Ho41 e Hg 43 3% e 6%

de etanol, conforme (Fig 1 e 2). Sendo que em dados similares foram encontrados

71

por (SIQUEIRA JUNIOR, 2013), em S. cerevisiae fermento biológico da cachaça

(ScFC) submetidas a indução etanólica a 12%. O surgimento da expressão dessa

banda sugere a relação entre a H+ATPase como foi descrito por (MONTEIRO et al,

1994), tendo o etanol como um dos fatores ambientais de estresse fermentativo que

estimulam a atividade desta enzima in vivo. A H+-ATPase presente na membrana

plasmática de S. cerevisiae possui diversas funções celulares, entre as quais a

absorção de nutrientes (KOTYK, 1994), a regulação do pH intracelular. Estudos com

Hsp 100 realizados por (ZOLKIEWSKI, 2012) avaliam a funcionalidade desta Hsp

em reativar proteínas desagregadas e ativação enzimática da H+ ATPase.

Outros estudos foram realizados por (SIQUEIRA JUNIOR, 2013) com a

expressão de proteínas HSPs 50 e 30kDa aumentaram sua expressão e em todos

os processos fermentativos (pão, cachaça,cerveja e vinho). De acordo com o mesmo

autor, outros marcadores específicos para leveduras de vinho mais resistentes são

os de 15kDa, os de cerveja, 90kDa, o de cachaça, 20, 80 e 100kDa e os de pão 20-

25 e 70 kDa. A ausência de expressão de proteínas relacionadas a resistência

etanólica nas leveduras Hanseniaspora Ho41 e Hg43, possivelmente seria um dado

que explicaria a intolerância dessas leveduras a concentrações crescentes de

etanol. Apesar de a Hanseniaspora expressar uma proteína de 10 kDa, assim como,

a Saccharomyces, esta proteína está presente mesmo na ausência de estresse em

Ho41, o que impede que a usemos como marcador de resistência. Já na Hg43

aumenta sua expressão a parti de 6% de etanol. Segundo os resultados do gel da

(Fig 1) vemos que apenas uma proteína de 100kDA aumenta sua expressão com

concentrações crescentes de estresse etanólico, sendo que na H.guillermondii o

aumento na síntese dessa proteína se mantém até 6% de etanol (Fig 01), enquanto

na (Fig 02) H. opuntiae a banda se expressa somente a 3%.

72

PESO MOLECULAR(kDa)

Hanseniaspora guilliermondii(Hg 43) Hanseniaspora opuntiae (Ho 41) 1% 2% 3% 6% 1% 2% 3% 6% 225 150 100 X X X 75 50 35 25 15 10 X X X X X X X X

Tabela 1 - PESO MOLECULAR DE PROTEÍNAS DE EXPRESSÃO

73

Figura 1 - Levedura Hanseniaspora guilliermondii Hg 43 - Estresse etanólico

6% 3% 2% 1% M

100KDa

10KDa

74

6% 3% 2% 1% M

Figura 2 - Hanseniaspora opuntiae Ho-41 - Estresse etanólico

100KDa

10KDa

75

CONCLUSÃO

A perda da viabilidade celular das leveduras Hansenisporas ocorre em

decorrência da intolerância dessa espécie as concentrações crescentes de etanol no

meio. Possivelmente, isto acontece devido a falta de adaptações na sua

ultraestrutura celular, que permitam a sua resistência durante a fermentação

etanólica. A ausência na formação de pseudohifas e esporulação é um sintoma de

falta de mecanismo adaptativo, como é visto em Saccharomyces, já que as

pseudohifas formadas expressam proteínas de resistência que tornam as novas

células mais adaptadas a um meio com altas concentrações de etanol e escassez

de nutrientes.

A levedura S. cerevisiae tem uma vantagem adaptativa em relação às

leveduras Hanseniaspora que somente tiveram crescimento até 6%, pois estas

continuam em crescimento positivo até 12% em meio etanólico. A possível

explicação seria a baixa expressão de proteínas relacionadas à resistência etanólica

nas leveduras Hanseniaspora Ho41 e Hg43, possivelmente seria um dado que

explicaria a intolerância dessas leveduras a concentrações crescentes de etanol. No

entanto, seriam relevantes mais pesquisas com essas leveduras, pois elas

compreendem um grupo diverso ecologicamente e bioquimicamente capazes de

alterar a dinâmica fermentativa atribuindo sabor e aroma ao vinho.

Desta forma, torna-se necessário confirmar a identidade desta proteína de

100KDa para poder usá-la como marcador molecular de cepas não- Saccharomyces

mais resistentes. Western blotting com anticorpos anti-HSP confirmaria se são

proteínas heat-shock. Caso contrário, um sequenciamento protéico poderia

identificar de que proteína se trata este marcador.

Como perspectiva futura o melhoramento genético de Hanseniaspora com

inserção do DNA de proteínas de resistência ao estresse determinadas

anteriormente em Saccharomyces com pesos moleculares 50kDa,30kDa,15kDa,

90kDa, 20kDa, 80kDa, 100kDa, 20kDa, 25kDa, 70kDa ( SIQUEIRA JUNIOR, 2013).

76

Isso permitiria a fermentação com leveduras do próprio mosto, porém melhoradas

geneticamente para resistir ao estresse etanólico e contribuindo com mais

compostos voláteis e singuralidade ao vinho.

77

REFERÊNCIAS

A HIGHLY Redundant Gene Network Controls Assembly of the Outer Spore Wall. In: LIN, Coney Pei-Chen et al. S. Cerevisiae. New York: Department of Biochemistry and Cell Biology, Stony Brook University, Stony Brook, 2013. ALEXANDRE, H.; CHAQ, Entier, C. Biochemical aspects of stuck and sluggish fermentation in grape must. J. Md. Microbiol. Biotech. [s.l], n.20, p.20-27, 1998. BAUER, F. F; PRETORIUS. I. S. Yeast Stress Response and Fermentation Efficiency: How to Survive the Making of Wine. South Africa: Institute for Wine Biotechnology, University of Stellenbosch, 2000. BANUETT, F. Signalling in the yeasts: an informational cascade and links to the ¢lamentous fungi. Microbiol. Mol. Biol. Rev. Washington, n.62, p.249-274, 1998. BARATA A.; MALFEITO-FERREIRA M.; LOUREIRO, V. The microbial ecology of wine grape berries. International Journal of Food Microbiology, [S.l], v.153, n.3, p.243–259, 2012. BARNETT, J.A., PAYNE, R.W.; YARROW, D. Yeasts: Characteristics and Identi¢cation. Cambridge University Press, Cambridge. 2000. BIRCH, M. Rosslyn; WALKER, Graeme M. Influence of magnesium ions on heat shock and ethanol stress responses of Saccharomyces cerevisiae. Enzyme and Microbial Technology, Amsterdam, n. 26, 2000. BISSON, L.F., BLOCK, D.E. Ethanol tolerance in Saccharomyces. In: CIANI, M. (Ed.), Biodiversity and Biotechnology of Wine Yeasts. Research Signpost, Kerala, India, p. 85– 98, 2002. BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, Amsterdam, n.72, p.248-254, 1976. BRANCO, P. Survival rate of wine-related yeasts during alcoholic fermentation assessed by direct live/dead staining combined with fluorescence in situ hybridization. Food Microbiol, Amsterdam, 2012. CASALONE, E. et al. Characterization of Saccharomyces cerevisiae natural populations for pseudohyphal growth and colony morphology Research in Microbiology, [S.l], n.156, 2005. CECCATO Antonini; PARAZZI, C. Monitoramento microbiologico da fermentação etanoica: uma experiência. Jornal Cana, Ribeirão Preto. p. 25 - 26, jan. 2000.

78

CONEY, Pei-Chen Lin et al. A Highly Redundant Gene Network Controls Assembly of the Outer Spore Wall in S. cerevisiae Department of Biochemistry and Cell Biology, New York, 2013. DEAK, T.; BEUCHAT, L.R. Handbook of Food Spoilage Yeasts. CRC Press, Boca Raton, FL, 1996. DICKINSON JR. “Fusel” alcohols induce hyphal-like extensions and pseudohyphal formation in yeasts. Microbiology. [S.l], n.142, p.1391–1397, 1996. ESTRUCH, F. Stress-controlled transcription factors, stress-nduced genes and stress tolerance in budding yeast. Federation of European Microbiological Societies Microbiology Reviews, Amsterdam, v. 24, p.469-486, 2000. FLEURI, Luciana Francisco; SATO, Hélia Harumi. Glucanases and chitinases: application in the yeast cell lysis and fungi inhibition. Ciênc. agrotec., Lavras, v. 32, n. 4, p. 1224-1231, jul./ago., 2008. FLEET, G.H. The microorganisms of winemaking-isolation enumeration and identification. In: Fleet, G.H. (Ed.), Wine Microbiology and Biotechnology. Harwood Academic Publishers, Chur, Switzerland, pp. 1 –27, 2008. FOLCH-MALLOL, Jorge Luis et al. La respuesta a estrés en la levadura Saccharomyces cerevisiae. Revisão Latino America de Microbiologia, Mexico, 2006.

Freitas, E,; Cunha Lima, S.T., Carvalho Filho, C.D.,Silva, A.F.Patete depositada no INPI 10 2013 032735 2. Proteínas de choque térmico (HSP)s como marcadoras de leveduras starters de Saccharomyces cerevisiae mais resistentes ao estresse em processos fermentativos JAROLIM, Stefanie et al. Saccharomyces cerevisiae Genes Involved in Survival of Heat Shock. Sydney: University of Western Sydney, 2013. ______. Wine. In: DOYLE, M.P., BEUCHAT, L.R., MONTVILLE, T.J. (Eds.), Food Microbiology Fundamentals and Frontiers, 2nd ed. ASM Press, Washington, DC, p. 747– 772, 2001. ______. Yeast interactions and wine flavour. International Journal of Food Microbiology, [S.l], v.86, n.1-2, p. 11–22, 2003. ______.; LAFON-LAFOURCADE, S., RIBEREAU-GAYON, P. Evolution of yeasts and lactic acid bacteria during fermenta.tion and storage of Bordeaux wines. Applied and Environmental Microbiology. Washington, n.48, p.1034–1038, 1984. FUJITA, A P;HIROKO. Enhancement OF Superficial Pseudohyphal Growth By Overexpression of the SFG1 gene in Yeast SaccharomyceS cerevisiae . Gene, 2005

79

GANCEDO,J.M.Control of pseudohypfae formation in Saccharomyces cerevisiae. Fems Microbiolo. Rev, 2001 GAO, C., FLEET, G.H. The effects of temperature and pH on the ethanol tolerance of the wine yeasts, Saccharomyces cerevisiae, Candida stellata and Kloeckera apiculata. J. Appl. Bacteriol. Malden, n.65, p.405-410, 1998. GATHER, J.; SCHUTZ, M. Impact of glucose-fructose-ratio on stuck fermentations: practical experiences to restart stuck fermentations. Vitic. Enol. Sci. [S.l], n.51, p.214-218, 1996. GIL, J.V. et al. Aroma compounds in wines as influenced by apiculate yeasts. Journal of Food Science, Malden, v. 61, p. 1247-1250, 1996. GIMENO, C. J et al. Flavor Microbiology. Unipolar cell divisions in the yeast S. cerevisiae lead to filamentous growth: regulation by starvation and RAS. Cell. [S.l], 1992. HEARD, G.M., FLEET, G.H. Occurrence and growth of yeast species during the fermentation of some Australian wines. Food Technology in Australia, North Ryde, n.38, v.1, p.22–25, 1986. ______. The effects of temperature and pH on the growth of yeast species during the fermentation of grape juice. J Appl Bacteriol, Malden, n.65, p.23–28, 1998. KIM, I. S. Saccharomyces cerevisiae KNU5377 stress response during high-temperature ethanolfermentation. Mol Cells. [S.l.], 2013. KLIS, Frans M. Dynamics of cell wall structure in Saccharomyces cerevisiae. Amsterdam: University of Amsterdam, 2002. KOTYK, A. Dependence of the kinetics of secondary active transports in yeast on H+-ATPase acidification. J. Membr. Biol., n.138, p.29-35, 1994. LAEMMLI, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. For many years, this was the most-cited paper in all of scientific research b/c of the thousands of applications. Nature, [S.l], n.227, p. 680 – 685, 1970. MACHINI, Maria Terêsa; MARANA, Sandro R. Protocolo Bioquímica experimental. São Paulo: USP, 2013. MADHANI, H. D.; FINK, G. R. The control of ¢lamentous di¡erentiation and virulence in fungi. Trends Cell. Biol. [S.l], n.8, p.348-353, 1998. MAIHERBE, S., BAUER F.; DU TOIT, M. Understanding problem fermentations. A review. S. Afr. J. Enol. Vitic. South African, n.28, p.169-186, 2007 MIURA, T. et al. Systematic analysis of HSP gene expression and effects on cell growth and survival at high hydrostatic pressure in Saccharomyces cerevisiae. Extremobiosphere Research, [S.l.], 2006.

80

MORTZ, E K TN.V H Gorg.Improved Silver Staining Protocols for high sensitivy protein idenfication using matrix assited laser desorpotion ionization time of flight analysis Prteomics,2001 MONTEIRO, G. et al. The in vivo activation of Saccharomyces cerevisiae plasma membrane H+-ATPase by ethanol depends on the expression of the PMA1 gene, but not of the PMA2 gene. Yeast, [S.l.], n.10, p.1439-1446, 1994. MADHANI, H. D.; FINK, G. R. The control of ¢lamentous di¡erentiation and virulence in fungi. Trends Cell. Biol. [S.l], n.8, p.348-353, 1998. MAIHERBE, S., BAUER F.; DU TOIT, M. Understanding problem fermentations. A review. S. Afr. J. Enol. Vitic. South African, n.28, p.169-186, 2007. MELO, H. F. Resposta ao estresse ácido em leveduras da fermentação alcoólica industrial, 2006, 118p. Trabalho de conclusão de curso (Tese de Mestrado), Universidade Federal de Recife, Recife: UFPE, 2006. MEDINA, K,Increased flavour diversity of Chardonnay wines by spontaneous fermentation and co- fermentation with Hanseniaspora vineae. Food Chemic,2013 NEIMAN, Aaron M. Sporulation in the Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae Department of Biochemistry and Cell Biology, Stony Brook University, Stony Brook, New York, p.11794-5215, 2011. PICCIRILLO, Sarah; SAUL, M. Honigberg. Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies Division of Cell Biology and Biophysics, School of Biological Sciences, University o USA Res Microbiol. [S.l], 2010. PIPER, P. W. et al. Induction of major heat-shock proteins of Saccharomyces cerevisiae, including plasma membrane Hsp30, by ethanol levels above critical threshold. Microbiology, [S.l], n.140, p.3031-3038, 1994. PIPER, Peter et al. Weak acid adaptation: the stress response that confers yeasts with resistance to organic acid food preservatives. Microbiology, [S.l], 2001. PIPER, P. Molecular events associated with acquisition of heat tolerance by the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol. Rev. Malden, n.11, p.339-355, 1993. PURIA, R. et al. Critical role of RPI1 in the stress tolerance of yeast during ethanolic fermentation. Chandigarh, India, 2009.

81

PIZARRO, F. J. et al. Growth temperature exerts differential physiological and transcriptional responses in laboratory and wine strains of Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol. Washington, n.74, p.6358-6368, 2008. PRETORIUS, I. S; WESTHUIZEN Vaan Der J. J; AUGUSTYN, O. P. H. Yeasts Biodiversity in Vineyards and Wineries and Its importance to the Sounth African wine industry. South African Journal Enology Viticulture, Joanesburgo, v.20, n.2, p. 61-74, 1999. QUEROL, A.; JIME´NEZ, M.; HUERTA, T., A study on microbiological and enological parameters during fermentation of must from poor and normal grape harvest in the region of Alicante (Spain). Journal of Food Science, Malden, n.55, 1990. RANALLI. G, M. et al. Effects of low electric treatment on yeast microflora. Journal of Applied Microbiology, Milano, 2002. RAMOS, Cíntia Lacerda; DUARTE, Whasley Ferreira; FREIRE, Ana Luiza. Evaluation of stress tolerance and fermentative behavior of indigenous Saccharomyces cerevisiae. Journal of Microbiology, New York, 2013. REIS, V. R. Caracterização de linhages selvagens de saccharomyceas cerevisiaei isoladas de processos fermentativos para produção de etanol. 2011. Trabalho de conclusão de curso (Tese de doutorado) - Universidade de São Paulo, Escola Superior de Agricultura, Piracicaba, 2011. ROPIO, J. A. O complexo mediador e a atividade transcricional do Yap1 e Yap8 na levedura sob estresse de arsênio. 2010. Dissertação a titulo de Mestre da Faculdade de Ciências de Universidade de Lisboa. Portugal, Lisboa, 2010. ROMANO, P. Role of apiculate yeasts on organoleptic characteristics of wine. In: CIANI, M. (Ed.), Biodiversity and Biotechnology of Wine Yeasts. Research Signpost, Kerala, India, p. 99–109, 2002. RUIS, H.; C. SCHÜLLER. Stress signaling in yeast. Bioessays, Malden, n.17, p. 959-966, 1995. THE EJECT of temperature and pH on the growth of yeast species during the fermentations of grape juice. J. Appl. Bacteriol. Malden, n.65, p.23-28, 1998. SALEH, A. A et al. Roles of Hsp104 and trehalose in solubilisation of mutant huntingtin in heat shockedSaccharomyces cerevisiae cells. Biochim Biophys Acta. Amsterdam, 2014. SHIMA, J.; TAKAGI, H. Stress-tolerance of baker's-yeast Saccharomyces cerevisiae cells: stress-protective molecules and genes involved in stress tolerance. Biotechnol Appl Biochem. Malden, 2009. SILVA, Rosimeire Oenning da; BATISTOTE, Margareth; CEREDA, Marney Pascoli. Alcoholic Fermentation by the Wild Yeasts under Thermal, Osmotic and Ethanol

82

Stress. Brazilian Archives of Biology and Technology – Aninternational Journal, Campo Grande, v.56, n.2, mar./abr., 2013. SIQUEIRA JUNIOR, Edgard Freitas de. Perfil de expansão proteica de leveduras comerciais do gênero saccharomyces e o papel das proteínas na seleção de espécies com potencial biotecnológico. 2013. Trabalho de Conclusão de Curso (Dissertação de Mestrado). – Universidade Federal da Bahia, 2013. TESNIERE, Catherine et al. Impact of Nutrient Imbalance on Wine Alcoholic Fermentations: Nitrogen Excess Enhances Yeast Cell Death in Lipid-Limited Must. Montpellier, 2013. ZHANG, Q. et al. Ethanol tolerance in yeast: molecular mechanisms and genetic engineering. [S.l], n.4, 25 apr. 2009. ZHANG,Q ZHAO,X. Ethanol tolerance in yeast : molecular mechanisms and genetic engineering FEMS Microbiol,2009

ZOLKIEWSKI, M.; ZHANG, T.; NAGY, M. Aggregate reactivation mediated by the Hsp100 chaperones. [S.l.], 2012. YARROW, D. Methods for the isolation, maintenance and identification of yeasts. In: KURTZMAN, C. P.; FELL, J. W. The Yeasts, A Taxonomic Study. Fourth edition. Elsevier Science BV, Amsterdam, 1998.

83

CONSIDERAÇÕES FINAIS.

A fermentação e a qualidade do vinho são diretamente dependentes dos

atributos metabólicos das leveduras que dominam de forma rápida e numérica na

fase inicial da fermentação do vinho. As leveduras não Saccharomyces influenciam

de forma relevante na fermentação, atribuindo compostos voláteis e identidade ao

vinho. Técnicas moleculares de seleção que identifiquem entre as espécies de

leveduras do vinho as mais aptas a tolerância etanólica e que essas leveduras

contribuíssem para aromas especiais ao vinho seria de grande importância

biotecnológica e comercial.

As leveduras Hanseniasporas guilliermondii e opuntiae são leveduras com

potencial biotecnológico para produção de aromas em fermentações cruzadas com

Saccharomyces. Contudo, a possível falta de expressão de proteínas de choque

térmico que auxiliam na adaptação ao estresse e de outros mecanismos metabólicos

faz com que as leveduras Hanseniasporas não tenham a mesma capacidade de

adaptação das Saccharomyces. A ausência na formação de estruturas que

respondam as variações ambientais são sintomas de falta de mecanismo adaptativo.

Em perspectivas futuras o melhoramento genético seria uma alternativa para

que as leveduras Hanseniasporas expressassem proteínas de choque que

protegessem a suas estruturas e elas pudessem resistir por mais tempo a toxicidade

etanólica.