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i
Aspectos Epidemiolgicos, Clnicos, Imunolgicos e
Teraputicos da Leishmaniose Disseminada produzida
por Leishmania braziliensis
Maria Elisa Alves Rosa
Tese de Doutorado
Salvador (Bahia), 2012
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
FACULDADE DE MEDICINA DA BAHIA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS DA SADE
R 788 Rosa, Maria Elisa Alves
Aspectos epidemiolgicos, clnicos, imunolgicos e teraputicos da leishmaniose disseminada produzida por Leishmania braziliensis/Maria Elisa Alves Rosa.-Salvador, 2012.
75 f.:Il
Orientador: Paulo Roberto Lima Machado
Tese (Doutorado) Universidade Federal da Bahia. Instituto de C. da Sade, 2012.
1. Leishmaniose. 2. Leishmaniose tegumentar. I. Machado, Paulo Lima. II Universidade Federal da Bahia. III. Ttulo.
CDU: 616.993.161
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE MEDICINA
CURSO DE PS GRADUAO EM CINCIAS DA
SADE
Aspectos Epidemiolgicos, Clnicos, Imunolgicos e
Teraputicos da Leishmaniose Disseminada produzida
por Leishmania braziliensis
Maria Elisa Alves Rosa
Professor-orientador: Paulo Roberto Lima Machado
Tese apresentada ao Colegiado do Programa
de Ps-Graduao em Cincias da Sade, da
Faculdade de Medicina da Universidade
Federal da Bahia, como pr-requisito
obrigatrio para a obteno do grau de Doutor
em Cincias da Sade, da rea de concentrao
em Medicina.
Salvador (Bahia), 2012
iii
COMISSO EXAMINADORA:
1- Maria Ilma Andrade Santos Arajo (Presidente) - Doutora em Biologia
Celular e Molecular pela Fundao Oswaldo Cruz, Brasil (1997),
Farmacutica Bioqumica da Universidade Federal da Bahia, Brasil.
2- Anette Chrusciak Talhari - Doutora em Doenas Tropicais e Infecciosas
pela Universidade do Estado do Amazonas, Brasil (2009),
Pesquisadora Iniciante da Fundao de Medicina Tropical Doutor
Heitor Vieira Dourado, Brasil.
3- Heitor de S Gonalves - Doutor em Farmacologia pela Universidade
Federal do Cear, Brasil (2010), Mdico dermatologista do Centro de
Dermatologia Dona Libnia, Brasil.
4- Jussamara Brito Santos - Doutora em Imunologia pela Universidade
Federal da Bahia, Brasil (2005), Professora da Faculdade Baiana de
Medicina e Sade Pblica, Brasil.
5- Nicolaus Albert Borges Schriefer Doutor em Imunologia pela
Universidade de So Paulo, Brasil (2001), Professor Adjunto da
Universidade Federal da Bahia , Brasil.
6- Paulo Roberto Lima Machado (Professor orientador) - Doutor em
Medicina pela Universidade Federal da Bahia, Brasil (2003), Professor
da Faculdade Baiana de Medicina e Sade Pblica, trabalha na
Universidade Federal da Bahia, Brasil.
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iv
DEDICATRIA:
Este trabalho dedicado aos pacientes de Corte de Pedra e minha
amada famlia.
v
EQUIPE:
1- Adriano Queiroz Silva Bilogo, Doutor em Imunologia
2- Edgar Carvalho Doutor e Livre Docente-Pesquisador e Chefe do
Servio de Imunologia do Hospital Universitrio Professor Edgard
Santos, Professor Titular em Medicina da FAMED-UFBA
3- Luiz Henrique Guimares Mdico Clnico, Mestre em Medicina e
Sade
4- Olvia Bacellar Bioqumica, Pesquisadora do Servio de
Imunologia do Hospital Universitrio Professor Edgard Santos
5- Paulo Roberto Lima Machado - Mdico Especialista em
Dermatologia pela Sociedade Brasileira de Dermatologia, Doutor em
Medicina e Pesquisador do Servio de Imunologia do Hospital
Universitrio Professor Edgard Santos
6- Srgio Marcos Arruda Doutor em Patologia Humana e Pesquisador
da Fundao Gonalo Moniz Fundao Oswaldo Cruz
vi
INSTITUIES PARTICIPANTES:
1- Universidade Federal da Bahia Complexo Hospitalar Universitrio
Professor Edgard Santos (COM-HUPES)
Servio de Imunologia
2- Posto de Sade da Vila de Corte de Pedra, Tancredo Neves, Bahia
vii
FONTES FINACIADORAS:
1- Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico
(Cnpq)
2- Fundao de Amparo Pesquisa (FAPESB)
3- National Institutes of Health (NIH)
viii
AGRADECIMENTOS:
1- Paulo Roberto Lima Machado, pelo cuidado na orientao
2- Olvia Bacellar, pela realizao da avaliao imunolgica
3- Srgio Arruda, pela realizao das histopatologias
9
NDICE
I- ndice de Figuras 10 II- ndice de Tabelas 11 III- ndice de Grficos 13 IV- ndice de Siglas 14 V- Resumo 15 VI- Objetivos 16 VII- Introduo 17 VIII- Reviso da Literatura 18 IX- Justificativa 36 X- Casustica, Material e Mtodos 37 XI- Resultados 44 XII- Resumo dos Resultados 53 XIII- Discusso 54 XIV- Propostas de Estudo 57 XV- Concluses 59 XVI- Summary 60 XVII- Referncias Bibliogrficas 61 XVIII- Anexos 70
10
I. NDICE DE FIGURAS
Figura 1 - Histopatologia da borda da lcera e da ppula de 121 pacientes
portadores de Leishmaniose Disseminada acompanhados no Posto de
Sade de Corte de Pedra, BA , 2009-2011
47
Figura 2 - Expresso tecidual de CXCL10 em amostras de lcera e ppula
de pacientes com Leishmaniose Disseminada e Leishmaniose Cutnea,
acompanhados no Posto de Sade de Corte de Pedra, BA, 1998 2001
52
11
II. NDICE DE TABELAS
Tabela 1 LTA no Brasil: espcies de Leishmania, principais vetores,
reservatrios e regies geogrficas
19
Tabela 2 - Aspectos clnico-laboratoriais das formas cutneas de LTA
22
Tabela 3 - Relatos de Leishmaniose Disseminada no Novo Mundo
24
Tabela 4 - Relatos de co-infeco Leishmaniose Disseminada e SIDA
25
Tabela 5 - Citocinas e quimiocinas estudadas e seu papel na resposta
imune frente aos patgenos intracelulares
29
Tabela 6 - Caractersticas demogrficas dos 121 pacientes portadores de
Leishmaniose Disseminada acompanhados no Posto de Sade de Corte de
Pedra, BA, 2009-2011
45
Tabela 7 - Caractersticas clnicas de 121 pacientes portadores de
Leishmaniose Dissemina, acompanhados no Posto de Sade de Corte de
Pedra, BA, 2009-2011
46
Tabela 8 - Nmero de cadeias ganglionares envolvidas em 121 pacientes
portadores de Leishmaniose Disseminada acompanhados no Posto de
Sade de Corte de Pedra, BA, 2009-2011
47
Tabela 9 - Frequncias absoluta e relativa de sintomas sistmicos
observados durante o perodo de disseminao em pacientes com
Leishmaniose Disseminada acompanhados no Posto de Sade de Corte de
Pedra, BA, 2009-2011
47
Tabela 10 - Aspectos laboratoriais em 121 pacientes portadores de
Leishmaniose Disseminada acompanhados no Posto de Sade de Corte de
Pedra, BA, 2009-2011
48
Tabela 11 - Resposta teraputica ao antimonial pentavalente em 114
pacientes com diagnstico de Leishmaniose Disseminada acompanhados
no Posto de Sade de Corte de Pedra - BA, 2009-2011
50
Tabela 12 - Influncia dos aspectos clnicos na resposta ao tratamento
12
com antimonial pentavalente em pacientes com diagnstico de
Leishmaniose Disseminada acompanhados no Posto de Sade de Corte de
Pedra BA, 2009-2011
50
Tabela 13 - Produo de INF e TNF por clulas mononucleares de
sangue perifrico aps estmulo com antgeno solvel de Leishmania em
pacientes portadores de Leishmaniose Disseminada com e sem
envolvimento mucoso, acompanhados no Posto de Sade de Corte de
Pedra, BA, 1998 2001
52
Tabela 14 - Produo tecidual de citocinas e quimiocinas em pacientes
portadores de Leishmaniose Disseminada e Leishmaniose Cutnea,
acompanhados no Posto de Sade de Corte de Pedra, BA, 1998 2001
53
13
III. NDICE DE GRFICOS
Grfico 1 - Distribuio dos casos notificados de Leishmaniose
Tegumentar aAericana, Brasil, 1985 2011
20
Grfico 2 - Proporo de casos de Leishmaniose Disseminada
diagnosticados em Corte de Pedra, Bahia, 1978 2008
25
Grfico 3 - Produo de INF, TNF, IL-5 e IL-10 por clulas
mononucleares de sangue perifrico, aps estmulo com antgeno solvel
de Leishmania em pacientes portadores de Leishmaniose Disseminada
(DL) e Leishmaniose Cutnea (CL), 1998 2001
50
Grfico 4 - Produo de CCL2, CCL3, CCL11, CXCL9 e CXCL10 por
clulas mononucleares de sangue perifrico, aps estmulo com antgeno
solvel de Leishmania em pacientes portadores de Leishmaniose
Disseminada (DL) e Leishmaniose Cutnea (CL), 1998 2001
51
14
IV.NDICE DE SIGLAS
CCL2/MCP-1: do ingls Chemokine (C-C motif) ligand 2/monocyte
chemotactic protein-1
CCL3: do ingls Chemokine (C-C motif) ligand 3
CCL11: do ingls Chemokine (C-C motif) ligand 11
CCL12: do ingls Chemokine (C-C motif) ligand 11
CXCL9: do ingls Chemokine (C-X-C motif) ligand 9
CXCL10/IP-10: do ingls C-X-C motif chemokine 10/ Interferon gamma-
induced protein 10
ELISA: do ingls Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
IgG: do ingls Imunoglobulina G
IL-2: do ingls Interleucina 2
IL-4: do ingls Interleucina 4
IL-5: do ingls Interleucina 5
IL-10: do ingls Interleucina 10
INF: do ingls Interferon gama
TGF: do ingls Transforming growth factor beta
TNF: do ingls Tumor necrosis factor alpha
15
V. RESUMO
Aspectos epidemiolgicos, clnicos, imunolgicos e teraputicos da
Leishmaniose Disseminada produzida por Leishmania braziliensis
A Leishmaniose Disseminada (LD) forma grave de Leishmaniose Tegumentar
Americana (LTA), caracterizada pelo aparecimento de mltiplas leses
pleiomrficas, em mais de 2 segmentos corporais no contguos. Ainda pouco
compreendida, importante pelo carter emergente, gravidade das leses e
dificuldade de tratamento. Objetivo: descrio dos aspectos clnicos,
epidemiolgicos, imunolgicos e teraputicos da LD. Desenho do Estudo:
Srie de casos, Corte Transversal e Coorte. Casustica, Material e Mtodos:
acompanhamento clnico de 121 pacientes de LD. Sangue perifrico e tecido de
64 pacientes de LD e de Leishmaniose Cutnea (LC) foram avaliados quanto
produo in vitro e expresso tecidual de INF, TNF, IL5, IL10, CCL2, CCL3,
CCL11, CXCL9 e CXCL10. Resultados: apresentam maior risco de
desenvolverem LD indivduos adultos, do gnero masculino e lavradores.
Envolvimento mucoso foi observado em 50% dos casos, 64% apresentaram
entre 10 e 50 leses, a reao de Montenegro foi positiva em 65% e Leishmania
braziliensis foi identificada em 97% dos pacientes. Cura clnica foi observada
em 36,8% dos pacientes com o uso de 1 a 4 sries de antimonial pentavalente
(SbV); anfotericina B foi utilizada como medicao de resgate em 29% dos
casos, com cura clnica em 100%. Pacientes adultos apresentaram um risco 9
vezes maior de falha teraputica com o SbV que os menores de 18 anos. A
produo in vitro de IFN e de TNF foi mais baixa em pacientes com LD. A
produo de CXCL9 foi mais elevado nos portadores de LD. A expresso
tecidual das citocinas e quimiocinas foi equivalente nas 2 formas. Concluses:
adultos apresentam maior risco de falha teraputica com o SbV. A avaliao
imunolgica sugere que os pacientes de LD apresentam resposta Th1 deslocada
para os tecidos.
Palavras-chaves: Leishmaniose Disseminada, Leishmaniose Tegumentar
Americana, L. braziliensis
16
VI. OBJETIVOS
GERAL
Caracterizar a Leishmaniose Disseminada, quanto aos seus aspectos
clnicos, imunolgicos e teraputicos.
ESPECFICOS
1. Caracterizar os aspectos clnicos da Leishmaniose Disseminada
2. Caracterizar a resposta teraputica ao antimonial e anfotericina B
3. Analisar a resposta imune in vitro, quanto produo das citocinas
INF, TNF, IL5 e IL10 e das quimiocinas CCL2, CCL3, CCL11,
CXCL9 e CXCL10
4. Analisar a resposta imune in situ, por meio da determinao da
produo local das citocinas INF, TNF, IL5 e IL10 e das
quimiocinas CCL2, CCL3, CCL11, CXCL9 e CXCL10
17
VII. INTRODUO
A Leishmaniose Disseminada (LD) forma grave de Leishmaniose
Tegumentar Americana (LTA), associada a severo comprometimento cutneo
e frequncia mais elevada de envolvimento mucoso, quando comparada
Leishmaniose Cutnea (LC).
Na regio de Corte de Pedra Bahia, tem se observado, nos ltimos dez
anos, nmeros cada vez mais elevados de diagnstico de LD.
O acompanhamento clnico dos pacientes portadores de LD revela uma
dificuldade no manejo teraputico dessa forma de LTA, com necessidade de
numerosas sries de antimonial pentavalente ou do uso da anfotericina B para
a cura clnica.
A LD apresenta peculiaridades no quadro clnico que a distinguem da
LC: mltiplas leses em diversos segmentos corporais, elevado ndice de
associao com leso mucosa, presena de sintomas sistmicos no momento
da disseminao e a ausncia de comorbidades imunossupressoras. A LD
tambm deve ser diferenciada da Leishmaniose Cutneo Difusa (LCD), forma
anrgica de LTA, associada a mltiplas leses no ulceradas e riqueza de
parasitas nessas leses.
Estudos realizados pelo nosso grupo tm demonstrado que a LD
apresenta caractersticas imunolgicas prprias que a caracterizam como uma
forma particular dentro do espectro clnico da LTA.
18
VIII. REVISO DA LITERATURA
1. Aspectos epidemiolgicos
A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) uma doena
infecciosa, zoontica, no contagiosa, causada por protozorio do gnero
Leishmania, capaz de envolver pele e mucosas. A leishmaniose tegumentar
considerada, pela Organizao Mundial de Sade, importante problema
de Sade Pblica em 88 pases, com registro anual de 1 a 1,5 milhes de
casos (SVS/MS, 2007; Goto et al, 2012).
A LTA acomete outras espcies animais alm do homem e o meio
ambiente desempenha papel importante na sua epidemiologia. Em todas as
regies do mundo, descrita a transmisso do parasita entre animais
silvestres, entretanto, o desequilbrio ambiental proporcionado pela
penetrao do homem nas florestas implicou numa mudana do ciclo vetor-
reservatrio. Assim que os animais domsticos e o homem entram no
circuito do ciclo de vida da Leishmania (SVS/MS, 2007).
No Brasil, a Leishmaniose Tegumentar apresenta variedade de
espcies de Leishmania, vetores e reservatrios, com diferentes padres de
transmisso (Tabela 1).
So descritos trs perfis epidemiolgicos de transmisso das
Leishmanioses: 1- Silvestre quando ocorre a transmisso em rea de
vegetao primria; 2- Ocupacional ou de lazer quando a transmisso
est relacionada derrubada da mata para explorao econmica ou
turstica; 3- Rural ou periurbana - quando a transmisso ocorre em rea de
colonizao, onde j houve a adaptao do vetor ao peridomiclio
(SVS/MS, 2007).
19
Tabela 1: LTA no Brasil: espcies de Leishmania, principais vetores, reservatrios e regies
geogrficas. Espcie de Leishmania Vetores Reservatrios Regio geogrfica
Leishmania (V.)
braziliensis
Lutzomia
complexa,
L. wellcomei,
L. whitmani,
L. migonei,
L. neivai,
L. intermdia
Roedores silvestres,
ces, gatos, cavalos
Todos os estados do Brasil
Leishmania (V.)
guyanensis
L. umbratilis,
L. anduzei
Preguia, tamandu,
gamb
Acre, Amap, Amazonas,
Roraima e Par
Leishmania (L.)
amazonensis
L. laviscutellata,
L. reducta, L.
olmeca nociva
Roedores silvestres Amazonas, Par, Rondnia,
Tocantins, Maranho,
Bahia, Minas Gerais, So
Paulo, Gois e Paran
L. (V.) lainsoni L. ubiquitalis Paca Par, Rondnia e Acre
L. (V.) naiffi L. ayrozai, L.
paraensis,
L. squamiventris
Tatu Par e Amazonas
L. (V.) lindenberg L. antunesi
(provvel)
- Par
L. (V.) shawi L. whitmani Macaco, quati,
preguia
Par e Maranho
Fonte: SVS/MS
No Brasil, a LTA doena infecciosa dermatolgica de grande
importncia, no s pelo risco de deformidades, como pelo prejuzo
psicolgico, econmico e social que produz. considerada uma doena
endmica, em expanso, havendo registro de casos em todas as regies do
pas; Grfico 1 (SVS/MS, 2007).
20
Grfico 1. Distribuio dos casos notificados de Leishmaniose TegumentarAamericana,
Brasil, 1985 2011.
Fonte: SVS/MS
2. Aspectos Clnicos
As LTAs, no Brasil, apresentam peculiaridades clnicas segundo a
rea geogrfica onde houve a transmisso para o homem, contribuindo para
a forma clnica a espcie do parasita, do vetor, do reservatrio e as
caractersticas dos ecossistemas. So descritas quatro formas clnicas
principais: Leishmaniose Cutnea (LC), Leishmaniose Mucosa (LM),
Leishmaniose Disseminada (LD) e Leishmaniose Cutneo Difusa (LCD)
(Marzochi et al, 1994; Marsden et al, 1986; Jones et al, 1987).
LC associada L. braziliensis caracterizada pelo surgimento, no
local da inoculao, aps um perodo de incubao de 2 semanas a meses
(Furtado et al, 1994), de ppula eritematosa, qual se segue ndulo e
posteriormente lcera, dando origem a apresentao clssica da doena:
uma ou mais leses ulceradas, de bordas elevadas e fundo granuloso,
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000 1
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5
19
86
19
87
19
88
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19
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19
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94
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97
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99
20
00
20
01
20
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20
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20
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20
06
20
07
20
08
20
09
20
10
20
11
Casos Notificados de LTA no Brasil
21
localizadas nas reas expostas do corpo (Aguiar Pupo et al, 1946). Est
associada linfadenopatia regional, com ou sem linfangite em 12 a 30%
(Barral et al, 1995; Gontijo et al, 2003). O envolvimento associado da
mucosa nasal pode ser visto em cerca 3% dos casos; Tabela 2 (Jones et al,
1987). Na regio Norte do pas, so observadas mltiplas leses cutneas,
causadas por L. guyanensis e, aparentemente, relacionadas mltiplas
picadas do inseto vetor (SVS/MS, 2007).
Tabela 2 Aspectos clnico-laboratoriais das principais formas cutneas de LTA Aspectos clnico-laboratoriais Formas clnicas
Cutnea Disseminada Difusa
Manifestaes cutneas lceras Ppulas, leses acneiformes,
exulceraes, lceras
Ndulos, placas
infiltradas
Envolvimento Mucoso 3% 38 48% Raro
Aspectos histopatolgicos Infiltrado
linfoplasmocitrio,
granulomas
Infiltrado linfoplasmocitrio,
com ou sem granuloma
Infiltrado de
linfcitos e
macrfagos sem
granuloma
Presena do parasita Poucos ou ausentes Poucos ou ausentes Mltiplos
Espcie de Leishmania L. amazonensis,
L. braziliensis,
L. guyanensis
L. braziliensis,
L. amazonensis,
L. guyanensis,
L. panamensis
L. amazonensis
Reao de Montenegro Positiva ou Negativa Positiva ou Negativa Negativa
Ttulo de anticorpo (IFI) Baixo Baixo a moderado Alto IFI: imunofluorescncia indireta
A LM, na maioria dos casos, secundria Leishmaniose Cutnea,
podendo ocorrer meses ou anos aps o seu tratamento. Em alguns casos,
sinais de doena cutnea esto ausentes e nestes casos, o envolvimento
mucoso pode ser associado Leishmaniose subclnica ou pode representar
doena mucosa primria. O teste de hipersensibilidade tardia fortemente
positivo e o tratamento prolongado costuma ser eficaz. No Brasil,
causada por L. braziliensis, mas h casos relacionados L. amazonensis e
L. guyanensis. Apresenta-se em cinco estgios clnicos (Lessa et al, 1999).
Estgio I: nodulao esbranquiada localizada no septo
cartilaginoso, assoalho e parede lateral, sem ulcerao.
22
Estgio II: ulcerao superficial, com granulaes finas no septo
anterior, conchas inferiores e assoalho da fossa nasal.
Estgio III: a ulcerao se aprofunda, mostrando granulao
grosseira e infiltrao mucosa. Esta se apresenta frivel, com sangramento
fcil e formao de crostas hemticas. O aspecto externo do nariz de
anta ou nariz de tapir, consequente intensa infiltrao edematosa das
cartilagens, do tecido celular subcutneo e da pele. Neste estgio, os
pacientes se queixam de obstruo nasal, rinorria sanguinolenta e dor
local.
Estgio IV: necrose do septo cartilaginoso anterior, podendo haver
perfurao.
Estgio V: o processo inflamatrio intenso com destruio total da
columela e queda da ponta do nariz, dando origem ao nariz em sela
(Marsden et al, 1994; Lessa et al, 1999; Lessa et al, 2012).
A LD forma grave de LTA, descrita inicialmente por Torres, em
1920, na Bahia (Costa et al, 1986). Tambm foi observada no Maranho
(Galvo et al, 1993), Cear (Sousa et al, 2006), Minas Gerais (Ogawa et al,
2006; Sousa et al, 2006) e no Equador (Calvopina et al, 2005); Tabela 3.
Vrias espcies de Leishmania j foram associadas LD, como L.
amazonensis (Carvalho et al, 1994), L. panamensis (Calvopina et al, 2005)
e L. guyanensis (Couppi et al, 2004), porm, a maioria dos casos descritos
no Brasil so causados pela L. braziliensis (Costa et al, 1986; Galvo et al,
1993; Turetz et al, 2002; Vieira-Gonalves et al, 2008).
Na regio de Corte de Pedra, considerada forma emergente,
correspondendo a 1,6% dos casos de LTA diagnosticados no perodo de
1988 a 1993; essa proporo aumentou para 3,9% nos anos de 2004 a 2008
(Grfico 2).
23
Tabela 3- Relatos de Leishmaniose Disseminada no Novo Mundo*
Local Leishmania Nmero
de casos
Nmero
de leses
Tipo das
leses
Leso
Mucosa
Costa et al, 1986 Bahia,
Brasil
L. braziliensis
L. amazonensis
8 - - -
Galvo et al,
1993
Maranho,
Brasil
L. braziliensis 1 58 lcera -
Carvalho et al,
1994
Bahia,
Brasil
L.amazonensis,
L. braziliensis
8 75-800 Ppulas,
lceras,
leses
acneiformes
38%
Turetz et al, 2002 Bahia,
Brasil
L. braziliensis 42 10-300 Acneiforme,
ppulas,
ndulos,
lceras
29%
Couppi et al,
2004
Guiana
Francesa
L. guyanensis 1 425 Ppulas,
nodules
-
Calvopina et al,
2005
Equador L. panamensis 1 69 lceras,
papulas,
crostas
-
Sousa et al, 2006 Cear,
Brasil
Provavelmente
L. braziliensis
1 749 Ppulas,
crostas,
lceras
-
Ogawa et al,
2006
Cear e
Minas
Gerais,
Brasil
rea endmica
de L.
braziliensis
2 - Ppulas,
ndulos,
placas,
leses
acneiformes,
-
Vieira-Gonalves
et al, 2008
Rio de
Janeiro,
Brasil
L. braziliensis 2 - Ppulas,
ndulos,
crostas,
leses
verrucosas
-
Rincn et al,
2008
Santander,
Colmbia
L. panamensis 2 21 lceras,
ndulos,
induraes
-
*Selecionados somente relatos no associados imunossupresso
(-) No informado
A LD se caracteriza pelo surgimento inicial de lcera clssica de LC
qual se seguem, em algumas semanas, mltiplas leses do tipo
acneiformes, papulosas, pequenas placas e pequenas exulceraes,
distribudas em diversos segmentos corporais. Durante o perodo de
disseminao, o paciente pode queixar-se de febre, astenia, mialgia e queda
do estado geral (Carvalho et al, 1994). Como critrio diagnstico de LD
convencionou-se o nmero mnimo de 10 leses em pelo menos 2
segmentos corporais no contguos. O envolvimento mucoso tambm pode
24
ser observado em cerca de 28 a 48% dos casos de LD (Turetz et al, 2002;
Jirmanus et al, 2012). O teste de hipersensibilidade tardia pode ser positivo
ou negativo, so encontrados pouco ou nenhum parasita nas leses (Tabela
2) e o tratamento costuma ser prolongado e difcil.
Muitos casos de LD relatados na literatura esto associados
imunossupresso (Da-Cruz et al, 1992; Durand et al, 1998; Agostini et al,
1998; Borges et al, 1999; Lindoso et al, 2009, Tabela 4), no entanto, os
casos descritos na Bahia so em pacientes aparentemente saudveis (Turetz
et al, 2002; Rosa et al, 2011).
Tabela 4. Relatos de co-infeco Leishmaniose Disseminada e SIDA. Local Leishmania Nmero
de casos
Nmero
de leses
Tipo de
leso
Leso
Mucosa
Da-Cruz et al, 1992 Brasil L. braziliensis 1 - Ppulas,
ndulos
Presente
Machado et al, 1992 Pernambuco,
Brasil
L. braziliensis 1 - Ppulas,
ndulos
Nasal,
orofaringeana
Durand et al, 1998 Frana L. infantum 1 - - -
Agostini et al, 1998 Itlia L. infantum 7 - - -
Borges et al, 1999 Minas
Gerais,
Brasil
- 2 - Ndulos,
pstulas,
lenticulares,
numulares,
sarcodicas
Oral
Schraner et al, 2005 frica L. major 1 - Mculas,
ppulas,
ndulos
-
Posada-Vergara et
al, 2005
- L. braziliensis 2 - Ppulas,
placas,
lceras
Nasal, oral
Gonzalez et al, 2006 Colmbia L. panamensis 1 300 Ndulos,
placas,
crostas
-
Lindoso et al, 2009 - - 6 - Ndulos,
ppulas,
placas,
lceras
Oral, nasal,
genital
Guerra et al, 2011 Amazonas,
Brasil
- 4 - lceras,
ppulas,
ndulos
-
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Posada-Vergara%20MP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16235183http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Posada-Vergara%20MP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16235183
25
Silveira et al (2005 e 2009) descrevem uma forma de LTA
denominada Leishmaniose Cutnea Disseminada Borderline (LCDB),
intermediria entre as formas polares LM e LCD. Associada tanto L. (V.)
braziliensis, quanto L. (L.) amazonensis, caracterizada pela inibio
parcial da resposta inflamatria mediada por clulas T com disseminao
de ppulas eritematosas, leses ulceradas e o envolvimento mucoso pode
ser observado.
Grfico 2. Proporo de casos de Leishmaniose Disseminada diagnosticados em Corte
de Pedra, Bahia, 1978 2008.
Fonte: adaptado de Jirmanus et al, 2012
Na LCD, observam-se vrias leses nodulares no ulcerativas de
evoluo lenta e ausncia de envolvimento mucoso (Barral et al, 1995).
forma grave da infeco, com m resposta ao tratamento, caracterizada por
anergia e deficincia da resposta imune celular especfica contra
Leishmania. No Brasil, causada por L. amazonensis.
Leses cutneas, menos frequentes tambm encontradas so:
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
1978 - 1984 1988 - 1993 1994 - 1998 1999 - 2003 2004 - 2008
1,6% 1,5%
2,4%
3,9%
0,2%
26
Ppulo-tuberosas: ppulas ou ndulos subcutneos que
aumentam em tamanho e profundidade
Vegetantes: leses papilomatosos, midas e friveis
Verrucosas: leses ceratsicas, speras, com crostas e
descamao
Esporotricide: leses ppulo-nodulares seguindo o trajeto
linftico, associado linfangite.
Existe ainda, um grupo de indivduos que habitam as reas
endmicas, sendo considerados portadores da forma subclnica da doena,
por no apresentarem leso cutnea, mas com intradermorreao de
Montenegro positiva (Follador et al, 2002).
No Nordeste do Brasil, regio de Corte de Pedra, Bahia, vem se
verificando formas clnicas atpicas de LTA, caracterizadas por leses
verrucosas, crostosas, lupides e vegetantes, mais concentradas na face e,
algumas vezes, associadas gestao ou co-infeco com HIV
(Guimares et al, 2009).
3. Aspectos imunolgicos da LTA
A LTA uma doena de imunopatognese complexa. Estudos em
modelos experimentais da leishmaniose mostram que uma resposta
inflamatria tipo Th1, rica na produo de IL-2, INF- e TNF-, est
associada resistncia e cura espontnea da leso. J uma resposta tipo
Th2, em que predominam IL-4 e IL-5, est relacionada susceptibilidade
ao parasita (Scott et al, 1988; Scott et al, 1989).
27
No entanto, no homem, esse modelo dicotmico no se repete e a
mesma resposta inflamatria capaz de controlar a proliferao da
Leishmania tambm pode produzir a leso tecidual.
Em relao LD, os estudos tm demonstrado uma produo de
INF- e TNF-, porm em nveis mais baixos quando comparados LC.
Turetz et al (2002) observaram que os pacientes de LD tambm produziam
mais IL-5 e IL-10 (citocinas de padro Th2) que os pacientes portadores de
LC. Esses achados sugerem que a disseminao das leses est relacionada
a uma supresso inicial da resposta protetora Th1, com proliferao do
parasita, posicionando essa forma clnica no meio do espectro imunolgico
das LTA (Carvalho et al, 1994).
Esse racional, de modo algum, se ope ideia da disseminao
observada na LM. Talvez, ambas as formas comecem de maneira
semelhante, com uma imunossupresso nos primeiros momentos da
infeco, proliferao e disseminao do parasita; o que seria seguido por
uma resposta inflamatria exuberante, com nveis elevados de citocinas
pr-inflamatrias do perfil Th1, caractersticos da LM. J uma inflamao
menos intensa, com maior disseminao da Leishmania, levaria LD.
Concorreriam para um ou outro quadro, fatores do hospedeiro, do parasita
e do vetor.
As quimiocinas so mediadores essenciais para o recrutamento das
clulas inflamatrias, para a execuo das funes efetoras e para o
controle da infeco (Tabela 5). O perfil de resposta inflamatria Th1,
protetor contra infeces intracelulares, est associado expresso de
nveis elevados de CCL2/MCP-1, CXCL9 e CXCL10/IP-10 (Ritter &
Krner, 2002).
28
Tabela 5- Citocinas e quimiocinas estudadas e seu papel na resposta imune frente
aos patgenos intracelulares
Citocinas e Quimiocinas
estudadas
Papel na resposta imune frente Leishmania braziliensis
INF Produzido por cepas de LT especficos e clulas natural
killer, estimula perfil Th1 de resposta imune
TNF Produzido por macrfagos e linfcitos T CD4+, estimula
o perfil de resposta Th1 da resposta imune
IL-5 Produzido por linfcitos T e mastcitos, relacionado ao
perfil Th2 da resposta imune
IL-10 Produzido por linfcitos T regulatrios, relacionado
inibio da sntese de citocinas
CCL2/MCP1 recrutamento de moncitos, linfcitos T de memria e
clulas dendrticas
CCL3/MIP-1 recrutamento de leuccitos (inflamao aguda)
CCL11/eotaxina recrutamento de eosinfilos
CXCL9 recrutamento de linfcitos T especficos ativados
CXCL-10/IP-10 deslocamento de moncitos/macrfagos, linfcitos T,
clulas natural killer , clulas dentrticas. Adeso de
linfcitos T s clulas endoteliais. Angiognese
Moll (1997) observou que a expresso de MCP-1 era importante
para a mobilizao de macrfagos para a leso e para o desenvolvimento
da sua ao leishmanicida. Vasquez & Soong (2006) demonstraram que
macrfagos da medula ssea oriundos de camundongos BALB/c e
C57BL/6 tratados com CXCL10/IP10 ou com CXCL2/MCP-1 e
posteriormente expostos L. amazonensis foram capazes de controlar a
proliferao do parasita e apresentaram maior produo de IFN-, IL-12 e
xido ntrico.
Infeco por L. braziliensis estimula maior produo de CXCL-10 e
maior expresso de seu receptor CXCR3 pelos moncitos (Vargas-
Inchaustegui et al, 2010).
Neutrfilos so rapidamente mobilizados para o ponto de inoculao
do microrganismo, de onde so capazes de estimular o recrutamento de
clulas fagocticas; a produo de CCL3 por parte desses neutrfilos fator
29
crtico para atrao das clulas dendrticas imaturas para o local de
inoculao da L. major sendo importante no primeiro momento da resposta
inflamatria (Charmoy et al, 2010).
Como acima mencionado, caractersticas do parasita tambm podem
influenciar o padro de resposta inflamatria do hospedeiro e, por seguinte,
a forma clnica da LTA. Na regio endmica de Corte de Pedra, Bahia, so
encontradas populaes multiclonais de L. braziliensis associadas LC,
LM e LD (Schriefer et al, 2004). Leopoldo et al (2006) observaram que
diferentes sub-espcies de L. braziliensis eram capazes de estimular a
resposta imune em diferentes intensidades.
Homens adultos, lavradores parecem ter mais chance de apresentar a
forma disseminada da LTA (Turezt et al, 2002), sugerindo a existncia de
exposio ocupacional, com participao do vetor e do parasita na gnese
da doena.
4. Aspectos diagnsticos
Diante de leses tpicas de LTA, principalmente em pacientes
oriundos de reas endmicas, o diagnstico clnico epidemiolgico pode
ser realizado. Porm, idealmente, sempre que possvel, o diagnstico
clnico epidemiolgico deve ser confirmado por mtodos laboratoriais.
4.1. Exames diretos
4.1.1. Exames parasitolgicos
Os exames parasitolgicos visam demonstrao do parasita, o que
pode ser feito em material obtido por escarificao, aspirado ou bipsia,
por meio da pesquisa direta, do isolamento em meios de cultura e de
30
exames de imunohistoqumica, que detectam antgenos de Leishmania no
tecido.
Comumente, esses mtodos permitem apenas a observao do
parasita, sem, no entanto, possibilitar a determinao da espcie da
Leishmania. Em laboratrios de referncia, parasitas recuperados de
cultura, podem ter a espcie identificada por meio de pesquisa de
anticorpos espcie especficos (Grimaldi et al, 1996) ou da avaliao do
perfil de isoenzimas por eletroforese (Cupolillo et al, 1995). A
sensibilidade desses mtodos varia de cerca de 58% para a cultura e de
88% para a imunohistoqumica (Goto et al, 2012).
4.1.2. Exames moleculares
A Reao em Cadeia de Polimerase (PCR) possibilita a identificao
do parasita assim como a determinao da espcie de Leishmania em
amostras de tecido.
O exame de PCR tem se mostrado sensvel e especfico no diagnstico
da LTA (de Oliveira et al, 2003,), superando os resultados obtidos com
outros mtodos como o exame direto, as sorologias e a cultura (Andrade et
al, 2005). Chrusciak-Talhari et al (2011) identificaram a espcie de
Leishmania em 100% das amostras de pele estudadas, enquanto que Neves
et al (2011) a identificaram em 93% dos casos de LC. Weirather et al
(2011) desenvolveram mtodo sistematizado de PCR quantitativo capaz de
detectar, quantificar e determinar a espcie de Leishmania a partir de
espcimes clnicos.
4.1.3. Exame histolgico
Os padres histolgicos podem ser auxiliares no diagnstico da
LTA. Nas formas ricas em parasitas, como na LCD, as formas amastigotas
31
de Leishmania podem ser visualizadas. Nas formas em que h escassez de
parasitas, as alteraes teciduais podem ajudar no diagnstico, na presena
de quadro clnico compatvel (Tabela 2).
4.2. Exames indiretos
4.2.1. Exames imunolgicos
A sorologia por Imunofluorescncia Indireta (IFI) mtodo pouco
utilizado em que se pesquisa anticorpos anti-Leishmania. No
recomendado como nico mtodo diagnstico, pois existe a possibilidade
de reao falso positiva em indivduos aparentemente sadios ou com
Trypanossoma cruzi, L. chagasi, esporotricose, paracoccidiodomicose e
com o pnfigo foliceo sulamericano (SVS-MS, 2007).
A Intradermorreao de Montenegro (IDRM) se baseia na resposta
de hipersensibilidade celular tardia. feita pela injeo, na epiderme, a
cerca de 3 cm da dobra cubital, de 0.1ml do antgeno. A leitura realizada
com 48 a 72 horas. O teste negativo na ausncia de ppula ou endurao
ou quando estas so inferiores a 5mm. O teste positivo se caracteriza por
ppula ou endurao maior ou igual a 5 mm. Ulcerao tambm
classificada como positividade. A Reao de Montenegro positiva em
mais de 90% dos casos de leishmaniose tegumentar cutnea e cutneo-
mucosa. Podendo ser falso-negativa nas seguintes situaes: no primeiro
ms do incio das leses, na leishmaniose disseminada e cutneo difusa,
nos pacientes imunossuprimidos. Reao cruzada com protozorio do
gnero Trypanosoma, esporotricose, hansenase virchowiana, tuberculose,
cromomicose e alergia ao diluente so causas de falso-positividade da
IDRM. Aps a cura clnica, a IDRM pode permanecer positiva por vrios
anos, assim como pode ser positiva em indivduos sadios, moradores de
32
reas endmicas, o que limita a sua utilizao como mtodo diagnstico
nico da doena.
5. Aspectos Teraputicos
As drogas de escolha para o tratamento das leishmanioses so os
antimoniais pentavalentes, encontrados em duas apresentaes farmacuticas:
antimoniato de N-metilglucamina e estibugluconato de sdio; no Brasil,
somente a primeira disponvel para uso (SVS/MS, 2007).
Os antimoniais atuam inibindo mecanismos bioenergticos da
Leishmania, como a gliclise e a oxidao de cidos graxos, sendo
consideradas drogas leishmanicidas (SVS/MS, 2007).
O antimonial pentavalente, aps administrao parenteral,
rapidamente eliminado por via renal e aps 6 horas, 80% da droga injetada j
foi eliminada pela urina. Injees repetidas vo, progressivamente,
aumentando os nveis de reteno da droga, que fica concentrada nos tecidos
heptico e esplnico, no entanto, no se sabe a concentrao de antimnio
disponvel na pele e na mucosa (SVS/MS, 2007).
A Organizao Mundial de Sade recomenda uma dose de antimonial
de 15 mg SbV/Kg/d, durante 20 dias para a doena cutnea. No havendo
cicatrizao da leso em at 12 semanas do fim do tratamento, ele dever ser
repetido por mais 30 dias. Para a leishmaniose mucosa, a dose recomendada
de 20 mg SbV/Kg/d durante 30 dias. Em caso de falha na cicatrizao aps 12
semanas, a medicao pode ser repetida mais uma vez. A administrao feita
por via parenteral. A via intramuscular muito dolorosa, deste modo, d-se
preferncia via endovenosa, sem necessidade de diluio e com aplicao
lenta.
33
O antimonial pentavalente conta com um grande nmero de efeitos
colaterais a ele relacionados: artralgias, mialgias, sintomas gastro-intestinais,
febre, fraqueza e alteraes eletrocardiogrficas, Insuficicia Renal Aguda,
alm das vrias limitaes de uso: gestao, idade superior a 50 anos, cardio,
nefro e hepatopatias (SVS/MS, 2007).
Na ausncia de resposta ao antimonial, recomenda-se o uso das drogas
de segunda escolha, como a anfotericina B e a pentamidina.
A anfotericina B um antibitico com ao leishmanicida intra e
extracelular, considerada medicao de primeira escolha no tratamento de
gestantes. Podendo ser encontrada sob duas formulaes principais:
desoxicolato sdico e lipossomal. No Brasil, a anfotericina B lipossomal no
est registrada na Agncia de Vigilncia Sanitria (ANVISA) para tratamento
da LTA.
A anfotericina B liga-se amplamente s protenas do plasma, atingindo
altas concentraes no fgado, bao, pulmes e rins. Parcialmente
metabolizada no fgado, eliminada por via biliar e urinria (Cataln &
Montejo, 2006).
A infuso endovenosa de anfotericina B desoxicolato pode produzir
febre, calafrios, tremores, vmitos, cefaleia e queda da tenso arterial. Tais
efeitos podem ser minimizados com hidratao e administrao de
antiemticos, anti-histamnicos, anti-trmicos e hidrocortisona no momento da
infuso (Cataln & Montejo, 2006; Neves et al, 2011).
A nefrotoxidade o efeito adverso mais relevante e limitador tanto de
dose, quanto de tempo de tratamento, sendo reversvel aps suspenso da
droga, mas a recuperao da funo renal pode demorar semanas (Cataln &
Montejo, 2006). Mais de 25% dos pacientes apresentam hipopotassemia e
hipomagnesemia durante o tratamento. Outros efeitos colaterais observados
34
so: anemia normoctica normocrmica, tromboflebite no local da infuso e
arritmias cardacas.
A infuso da anfotericina B lipossomal est associada a poucos efeitos
colaterais, permitindo doses dirias e totais maiores em menor tempo.
A dose recomendada do desoxicolato sdico de anfotericina B de
1mg/Kg/dose, diariamente ou em dias alternados, at atingir as doses totais de
1-1,5g para as formas cutneas e de 2,5-3g para a forma mucosa (SVS-MS,
2007).
Em relao leishmaniose disseminada, no h recomendao especial
quanto dose ou ao tempo de tratamento.
As pentamidinas so aminas aromticas, hipoglicemiantes, capazes de
comprometer o metabolismo dos protozorios (Neves et al, 2011). So
comercializadas sob duas formas: isotionato e mesilato.
O isotionato de pentamidina completamente absorvido aps
administrao parenteral, apresenta ampla distribuio nos tecidos e a
eliminao se d por via urinria (Costa, 1993).
Os efeitos colaterais relacionados ao uso da pentamidina so: dor,
indurao a abscesso estril no local da injeo, nuseas, vmitos, cefaleia,
adinamia, tonturas, mialgia, hipotenso, hipo e hiperglicemia. Diabetes pode
ser observado em dose acumuladas superiores a 1g (SVS/MS, 2007).
A miltefosina um anlogo da fosfatidilcolina, vem sendo utilizada
para tratamento da Leishmaniose Visceral na ndia (Sundar et al, 2002); sua
eficcia para o manejo a LTA do Novo Mundo est em estudo. Essa
medicao foi desenvolvida com objetivos antitumorais e age inibindo a
biossntese de fosfolipdeo e esterol, no entanto o mecanismo de ao anti-
Leishmania ainda no est bem esclarecido (Schraner et al, 2005).
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Schraner%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15909255
35
A miltefosina administrada em comprimidos, via oral, na dose de
2,5mg/Kg/dia, mximo de 150mg/dose, durante 28 dias. Os efeitos colaterais
mais frequentemente observados so nuseas, vmitos e dor abdominal
(Machado et al, 2010).
36
IX. JUSTIFICATIVA
A LD forma emergente e ainda insuficientemente descrita de LTA,
associada, na maioria dos casos relatados na Bahia, Leishmania braziliensis.
Em Corte de Pedra, foram diagnosticados 422 casos de LD no perodo
de 1988 a 2011, compreendendo 2,6% dos casos de LTA acompanhados na
regio.
O acompanhamento dos pacientes no ambulatrio de Corte de Pedra,
Bahia, tem sugerido que a histria da LD associada a extenso envolvimento
cutneo e mucoso, muitas vezes, com leses desfigurantes, de difcil
tratamento e recidivas frequentes.
Estudos enfocando a imunopatognese da LD tem mostrado a existncia
de resposta inflamatria tipo Th1, porm de menor intensidade quando
comparada aos pacientes de LC. Podem contribuir para tal, caractersticas do
hospedeiro, do parasita e do ambiente.
Assim que a LD assume importncia clnica pela gravidade do
acometimento tegumentar, pela dificuldade no tratamento, pelo
comprometimento da qualidade de vida dos pacientes e pelas questes de
imunopatognese que merecem ser mais estudadas.
37
X. CASUSTICA, MATERIAL E MTODOS
Desenho do estudo: para a caracterizao dos aspectos clnicos da
leishmaniose disseminada foi realizado estudo de srie de casos. Para a anlise
da resposta imune no sangue perifrico e no tecido, foi realizado estudo de
corte transversal. A caracterizao da resposta teraputica foi realizada por
meio do estudo de coorte.
rea do Estudo: O distrito de Corte de Pedra pertence ao municpio de
Presidente Tancredo Neves, cobre uma rea de 8.000km2, estando localizado
no sudeste do estado da Bahia, a 280 Km de Salvador, onde se situa o Servio
de Imunologia do Complexo Hospital Universitrio Professor Edgard Santos
(COM-HUPES). Corte de Pedra est em regio de Mata Atlntica, quase
completamente desmatada para atividade de cultivo, porm ainda restam
algumas poucas reas de preservao. O Posto de Sade de Corte de Pedra
movido por agentes de sade, bastante familiarizados com a doena. Mdicos,
incluindo Otorrinolaringologistas, Dermatologistas e Clnicos visitam este
posto de sade regularmente. Nessas visitas, novos casos de LTA so
diagnosticados, realizadas bipsias e avaliao imunolgica dos indivduos,
bem como feito o acompanhamento do tratamento da LTA. Este Posto de
Sade referncia para o diagnstico e tratamento de LTA de 15 municpios
vizinhos, num raio de 30 km (Presidente Tancredo Neves, Valena, Tapero,
Nilo Peanha, Ituber, Igrapina, Camamu, Teolndia, Wenceslau Guimares,
Gandu, Pirai do Norte, Nova Ibi, Itamari, Ibirapitanga, Mutupe).
Anualmente, uma mdia de 700 pacientes foram acompanhados nessa unidade
de sade nos ltimos 23 anos. Outras doenas como Tripanossomase
Americana (Doena de Chagas) e Leishmaniose Visceral, que poderiam
38
interferir na avaliao imunolgica e diagnstica dos pacientes no so
observadas naquela regio. Desde 1984, o Posto de Sade de Corte de Pedra
tem servido como base de estudos sobre LTA.
Populao do estudo: para os objetivos especficos 1 e 2, foram
acompanhados 121 pacientes com diagnstico inicial de LD, atendidos no
Posto de Sade de Corte de Pedra, Municpio de Tancredo Neves, Bahia, no
perodo de 2009 a 2011. Para os objetivos especficos 3 e 4 foram
selecionados, 64 pacientes (32 com LC e 32 com LD) acompanhados nessa
unidade nos anos de 1998 a 2001. Esses de 64 pacientes foram escolhidos pela
disponibilidade de sangue e amostra de pele j processados.
Definio diagnstica: leishmaniose disseminada caracteriza-se pela
presena de ao menos 10 leses distribudas em dois ou mais segmentos
corporais no contguos. As leses so pleiomrficas - pequenas placas,
ppulas, exulceraes e leses acneiformes - associadas ou no a leses tpicas
de Leishmaniose Cutnea (Costa, 1986; Turetz, 2002). LC caracterizada
pelo aparecimento, no local da inoculao, de ppula eritematosa, que evolui
para ndulo e posteriormente se ulcera, dando origem apresentao clssica
da doena: uma ou mais leses ulceradas, de bordas elevadas e fundo
granuloso, localizadas nas reas expostas do corpo (Aguiar Pupo, 1946).
Critrios de incluso: para os estudos de srie de casos e de coorte
foram includos todos os pacientes com diagnstico de LD admitidos no Posto
de Sade de Corte de Pedra, Bahia, no perodo de 2009 a 2011. Para o estudo
de corte transversal, foram includos 32 pacientes com diagnstico de LD e 32
39
com diagnstico de LC admitidos no mesmo servio de sade no perodo de
1998 a 2001.
Critrios de cura clnica: foram definidos como curados os pacientes
que apresentaram desaparecimento das leses, com reepitelizao completa
das lceras at 90 dias do incio do tratamento e sem sinais de recidiva por um
perodo de 6 meses.
Caracterizao Clnica: todos os pacientes atendidos no Posto de Sade
de Corte de Pedra com diagnstico clnico de LD submetidos avaliao
clnica dermatolgica que constava de exame da pele, com contagem e
caracterizao das leses, pesquisa de linfadenopatia e de envolvimento
mucoso.
Avaliao laboratorial: foram avaliadas 109 intradermorreaes de
Montenegro (IDRM). Em 12 pacientes o registro desse exame foi perdido,
seja porque a reao foi realizada em outro servio e no tivemos acesso ao
resultado, seja porque o paciente no compareceu no dia marcado para a
leitura. Bipsia para PCR, cultura e/ou estudo histopatolgico foi realizada em
65 pacientes. As amostras de tecido foram obtidas aps anestesia local e coleta
por meio de punch de 4mm, conservadas em formalina a 10% por, no mximo
24 horas e depois de desidratas, colocadas em parafina; as lminas foram
coradas com hematoxilina-eosina e cido peridico de Schiff. Wizard
Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI, USA) foi utilizado
para o isolamento do DNA de Leishmania. O DNA purificado foi re-suspenso
em Tris-EDTA (TE) e conservado a -20C at o momento da utilizao.
Deteco do subgnero Viannia foi feito por meio dos primeres 5-
40
GGGGTTGGTGTAATATAGTGG-3 e 5-CTAATTGTGCACG-3. Os
fragmentos cutneos obtidos foram inoculados em meio de cultura, entre 24C
e 26C; a pesquisa das formas promastigotas de Leishmania foram realizadas
a partir do quinto dia da inoculao.
Avaliao da resposta imune: foi realizada avaliao dos nveis sricos
e da expresso tecidual de citocinas (INF, TNF, IL-5, IL-10) e quimiocinas
(CCL2, CCL3, CCL11, CXCL9, CXCL10).
Produo in vitro das citocinas e quimiocinas, aps estimulao:
clulas mononucleares de sangue perifrico foram obtidas a partir
de sangue venoso heparinizado e separado por meio do gradiente
de Ficoll-Hypaque, lavado e re-suspenso at a concentrao de 3
x 106 clulas/ml, em meio de RPMI 1640 com soro AB inativado
pelo calor. As clulas foram estimuladas com antgeno solvel de
Leishmania a 37C, em CO2 a 5%, durante 72 horas. O
sobrenadante foi coletado e estocado a -70C. As citocinas e
quimiocinas foram medidas por ELISA (R&D Systems,
Minneapolis, MN, USA e Pharmingen, San Diego, CA, USA).
Expresso tecidual de citocinas e quimiocinas: amostras de
bipsia da borda das lceras de ambos os grupos de pacientes e
das ppulas dos pacientes com LD foram congeladas num
composto Optimal Cutting Temperature Compound O.C.T
Foi utilizado o mtodo da avidina-biotina peroxidase, com
anticorpos contra MIP-1 (PeproTech, Rochy Hill, NJ, USA),
INF (Genzyme, Cambridge, MA, USA), TNF (Genzyme),
TGF, CXCL9, IL-10 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,
CA, USA), CCL11/eotaxina, CXCL10/IP-10 e CCL12
41
(PeproTech). As amostras de tecido foram incubadas, a 37C,
durante 90 minutos, com anticorpos-ponte biotinilados (Vector
Laboratories, Burlingame, CA, USA e Santa Cruz
Biotechnology). As lminas de controle foram submetidas
incubao com IgG controle, em substituio aos anticorpos
primrios. A colorao foi feita com 3,30-diaminobenzico
(Vector Laboratories) e hematoxilina. As lminas foram
microfotografadas numa magnificao de 200 vezes e as reas
coradas, contadas usando Adobe Photoshop CS3, os resultados
foram expressos em proporo, mdia e desvio padro do nmero
de rea corada.
Anlise estatstica: Os dados foram armazenados em banco de dados
criado no programa GraphPad InStat, mesmo software utilizado para o
tratamento estatstico. Para a caracterizao dos aspectos clnicos, foi
utilizado o clculo da mdia e desvio padro. Para a avaliao das
variveis contnuas no paramtricas foi utilizado o Teste de Mann-
Whitney. Para a avaliao de risco foram utilizados os Testes de Qui-
quadrado e Exato de Fisher. Foram considerados significantes nveis de
p
42
ARTIGO 1
Disseminated Leishmaniasis: clinical, immunological and therapeutics
aspects. Drug Development Research 72:1-5, 2011
DRUG DEVELOPMENT RESEARCH 72 : 437441 (2011)
Disease Overview
Disseminated Leishmaniasis: Clinical, Immunological,and Therapeutic Aspects
Maria Elisa Alves Rosa and Paulo Roberto Lima Machado
Servic-o de Imunologia, Hospital Professor Edgard Santos, Universidade Federal da Bahia,Salvador, Bahia, Brazil 40110-160
Strategy, Management and Health Policy
Enabling
Technology,
Genomics,
Proteomics
Preclinical
Research
Preclinical Development
Toxicology, Formulation
Drug Delivery,
Pharmacokinetics
Clinical Development
Phases I-III
Regulatory, Quality,
Manufacturing
Postmarketing
Phase IV
ABSTRACT Disseminated leishmaniasis (DL) is a distinct, severe, and emerging form of Americantegumentary leishmaniasis. DL has been characterized by more than 10 multiple and pleomorphiccutaneous lesions, distributed in more than two noncontiguous parts of the body. Mucosal involvement isdetected in up to 44% of cases. The development of the DL involves a complex and poorly understoodnetwork involving parasite, host immune response, and the environment, where L. braziliensispolymorphism plays a major role. A decrease in the type 1 immune response in the peripheral blood ofDL patients appears to be caused by the attraction of Leishmania-activated T cells to the multiplecutaneous lesions. DL is a difficult to cure disease and failure to pentavalent antimony therapy is observedin at least 60% of cases. Drug Dev Res 72:437441, 2011. r 2011 Wiley-Liss, Inc.
Key words: disseminated leishmaniasis; L. braziliensis; immunopathogenesis; American tegumentary leishmaniasis
INTRODUCTION
American tegumentary leishmaniasis (ATL) is anoncontagious infectious disease, caused by severalLeishmania species; it can be associated with aspectrum of clinical forms: cutaneous leishmaniasis(CL), mucosal leishmaniasis (ML), anergic diffusecutaneous leishmaniasis (DCL), and disseminatedleishmaniasis (DL).
DL is an emergent and severe form of ATL,initially described in 1920 by Torres in Bahia, Brazil[Costa et al., 1986]. It has also been observed in otherregions of Brazil and South America [Galvao et al.,1993; Ogawa et al., 2006; Calvopina et al., 2005]. DLhas also been reported in the Old World [Alborzi et al.,2008]; some cases are associated with immunosuppres-sion [Agostini et al., 1998; Schraner et al., 2005;Lindoso et al., 2009].
DL can be caused by several species of Leishmania,like L. amazonensis [Carvalho et al., 1994], L. guyanensis[Couppie et al., 2004], and L. panamensis [Calvopina
et al., 2005], but the main causative agent in theNew World is L. braziliensis [Turetz et al., 2002].
The site of Corte de Pedra, located in the south ofthe state of Bahia, provides the opportunity to studythe different clinical manifestations of L. braziliensisinfection. For instance, L. braziliensis can cause CL,ML, DL, and atypical forms of ATL [Jones et al., 1987;Barral-Netto et al., 1995; Guimaraes et al., 2009].Periodic surveys in this region show that the frequencyof DL has been increasing over the past few years. DLwas considered a rare disease, responsible for 0.2% ofcases of all ATL identified from 1978 to 1984 in this
DDR
Published online in Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com).DOI: 10.1002/ddr.20450
Grant sponsor: Brazilian National Research Council (CNPq).
Correspondence to: Paulo Roberto Lima Machado,Hospital Universitario Prof. Edgard Santos, Servic-o de Imunologia,5 andar, Rua Joao das Botas s/n, Canela 40110-160, Salvador-Bahia-Brazil. E-mail: [email protected]
c 2011 Wiley-Liss, Inc.
endemic area [Jones et al., 1987]. However, from 1992to 1998, this figure rose to 1.9% [Turetz et al., 2002].More recently, we documented DL in more than 3% ofATL cases diagnosed in the Health Post of Corte dePedra in the year 2009, indicating that DL is rapidlyspreading in the region.
To understand the dynamics of the spread of DL,we mapped its distribution in our endemic area during19932002. We found two peaks in the incidence ofDL, the first associated with a clustering in the innerregion around Corte de Pedra, and the second with aspread into the coastal region [Scheriefer et al., 2009].
ETIOPATHOGENESIS
A complex and poorly understood networkinvolving parasite, host immune response, and theenvironment is implicated in the development of DL.
Role of the Parasite and Host Immune Response
DL is a disease associated with L. braziliensisinfection in the great majority of cases in Brazil.Although the first case reports of DL in Bahia showedL. amazonensis as well as L. braziliensis as the causativeagents [Costa et al., 1986; Carvalho et al., 1994], duringthe last decades we only have isolated L. braziliensisfrom DL cases [Turetz et al., 2002]. In the endemic areaof Corte de Pedra, the identification of a multiclonalL. braziliensis population structure showed thatL. braziliensis genotypes are accompanied by specificdisease manifestations, including DL [Schriefer et al.,2004; Leopoldo et al., 2006]. We found evidence thatantigens prepared from genotypically distinct strains ofL. braziliensis induce different degrees of immuneresponse. For instance, L. braziliensis antigens derivedfrom DL patients stimulates higher interferon-g (IFNg)and (TNFa) production than L. braziliensis antigensfrom CL patients [Leopoldo et al., 2006].
However, the evaluation of peripheral cytokineproduction in DL patients shows lower IFNg andTNFa production when compared with CL [Turetzet al., 2002], suggesting that a peripheral decrease inthe type 1 immune response allows parasite growth anddissemination. Interestingly, in contrast to DCL, whichis associated with a high in situ parasite load [Convitet al., 1972], Leishmania amastigotes are not readilyfound in DL lesions, and an absence of type 1 immuneresponse against Leishmania antigens is not documentedin DL [Carvalho et al., 1994; Leopoldo et al., 2006].
Data from in situ studies by our group show thatlymphocytic infiltration and the expression of IFNg,TNFa, CCL2, CCL3, CCL11, and CXCL10 do notdiffer among CL and DL, whereas CXCL9 is producedmainly by peripheral blood mononuclear cells(PBMCs) from DL patients compared with CL
(unpublished data). CXCL9 is a chemokine inducedby IFNg and associated with T-lymphocyte recruitmentand proliferation [Whiting et al., 2004; Teixeira et al.,2006]. These data suggest that a decrease in the type 1immune response in the peripheral blood of DLpatients is attributable to the attraction of Leishmania-specific T cells to the multiple cutaneous lesions.Therefore, the preserved tissue immune response inDL may explain the absence or low number ofparasites in the lesions, as well as the development ofulcers similar to that observed in CL.
The presence of DL cases in HIV carriers orimmunosuppressed patients is reported in associationwith other Leishmania species [Agostini et al., 1998;Schraner et al., 2005; Lindoso et al., 2009]. We foundno evidence for any type of immunosuppression in DLpatients from the L. braziliensis endemic area of Cortede Pedra. This data favors the parasites role indetermining the outcome of ATL.
Role of the Environment
Adult males and agricultural workers are athigher risk of acquiring DL as compared with patientswith localized CL [Turetz et al., 2002], suggesting thatexposure to the parasite is associated with occupationalactivities in plantation fields located in previousAtlantic forest regions. The link of DL to specificexposures to occupational products or vectors isunknown and should be investigated.
More recently, we have documented an increasingnumber of DL cases in patients o18 years old,suggesting a pattern of peridomiciliar transmission ofthe disease.
CLINICAL AND LABORATORIAL ASPECTS
DL is clinically different from CL and DCL. DLis defined by the presence of Z10 mixed-type lesions(e.g., acneiform, papular, nodular, and/or ulcerated),located in Z2 body parts (head, trunk, arms, and legs),and some patients present with hundreds of lesions allover the body (Figs. 1 and 2). The number of lesionsmay range from 10 to 800 [Carvalho et al., 1994; Turetzet al., 2002]. Many cases present a dissemination phase,in which a single initial lesion, usually in one extremity,is followed by disseminated lesions that may involve theentire body, after a period of few days up to 8 weeks.Most DL patients (55%) have widespread dissemina-tion (legs, arms, trunk, and face) at the time ofpresentation, and all cases present lesions above thewaistline [Turetz et al., 2002]. The rapid spread of thelesions and occurrence of systemic symptoms (fever,chills, malaise) in 5075% of cases suggests directhematogenic dissemination [Carvalho et al., 1994;Turetz et al., 2002]. Interestingly, some patients
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(25%) develop disseminated disease after initiation oftreatment with pentavalent antimony (Sbv) for theinitial localized lesion [Turetz et al., 2002]. A highfrequency of nasal mucosal involvement is observed inDL and may vary from 29% [Turetz et al., 2002] to 38%[Carvalho et al., 1994] and up to 44% in a recent caseseries Figure 2.
The diagnosis of DL is based mainly on the clinicalcharacteristics as described above. The intradermalleishmania skin test, along with histopathological aspectsand parasite identification, can be used to confirm ATL
and to differentiate it from other clinical forms. Thepositivity of the leishmania skin test varies among theclinical forms of ATL. Whereas it has a sensitivity of84100% for CL and ML [Shaw et al., 1975], patientswith DCL are negative [Convit et al., 1972]. In DL theMontenegro skin test can be positive or negative[Carvalho et al., 1994], with 67% of positivity in 36patients tested (unpublished data). Additionally, thenegativity of the leishmania skin test in DL cases istransitory and is restored after treatment [Carvalhoet al., 1994]. DL histopathology shows a mononuclearinfiltrate with a predominance of plasma cells. In somepatients, a granulomatous reaction and few amastigotesare observed. The acneiform lesions show a follicularpattern, with an intense inflammatory infiltrate aroundthe follicles [Carvalho et al., 1994] (Fig. 3).
The main differential diagnosis of DL iswith anergic diffuse cutaneous leishmaniasis (DCL)(Table 1). DCL is characterized by multiple infiltratingnodules and plaques resembling lepromatous leprosy,as well as by the absence of ulcers, no mucosalinvolvement, and a negative skin test for Leishmaniaantigen. The main causative agents of DCL areL. aethiopica in the Old World and L. amazonensis inthe New World [Bryceson, 1970; Convit et al., 1972].
Fig. 2. DL patient presenting a leishmaniasis classical ulcer in lowerlimb (initial lesion) associated with multiple papules and acneiformlesions in the trunk. [Color figure can be viewed in the online issuewhich is available at wileyonlinelibrary.com.]
Fig. 1. DL patient with erythematous and hyperkeratotic papules andsuperficial nodules on the face, also presenting acneiform lesions inthe thorax. [Color figure can be viewed in the online issue which isavailable at wileyonlinelibrary.com.]
Fig. 3. Histopathology of a DL papular skin lesion caused byL. braziliensis stained by H&E.20. Dermis with chronic inflamma-tion rich in macrophages, lymphocytes, and plasma cells involvinghair follicles. [Color figure can be viewed in the online issue which isavailable at wileyonlinelibrary.com.]
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Co-infection with HIV/AIDS modifies the clinicalpresentation of CL caused by several Leishmaniaspecies. Thus, HIV-co-infected patients may presentwith multiple cutaneous lesions resembling DL orDCL associated or not with mucosal and visceralinvolvement [Nogueira-Castanon et al., 1996; Lindosoet al., 2009]. The presence of a disseminated phaseassociated with systemic symptoms and the presence ofa mixture of multiple acneiform and papular skinlesions after an initial ulcerated lesion, along withparasite paucity in the infiltrate and a Montenegropositive skin test, favors the diagnosis of a classicalDL in an immunocompetent host.
THERAPEUTIC OUTCOME OF DL
DL is a difficult disease to cure and pentavalentantimonials (Sbv) in the form of meglumine antimoni-ate (Glucantime) in its highest dosage of 20 mg/kg/day,for 30 days, is used for treatment. More than 60% ofcases will require more than one course of Sbv to cure[Turetz et al., 2002].
Amphotericin B is an alternative drug for caseswhere Sbv is not effective or cannot be used. We havesuccessfully treated 9 DL patients refractory to Sbv
therapy with desoxycholate amphotericin B. Allpatients were cured with a 3-mg/kg/dose, 3 times aweek, with a total dose ranging from 650 mg to 1 g.However, the administration of Amphotericin B islimited in the rural setting by its toxicity andhospitalization requirement.
More recently, miltefosine, an oral drug activeagainst several Leishmania species, cured a patientwith DL that had failed to respond to previous Sbv andAmphotericin B therapy [Gonzalez and Velez, 2006].The use of miltefosine in DL patients remainsanecdotal and limited by its cost and unavailability inseveral countries, including Brazil. Therefore, DLremains a therapeutic challenge and much effort
remains to find a better therapeutic approach to thissevere form of ATL.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors acknowledge Ednaldo Lima do Lago,Maria Neuza Lago, and Dr. Luiz Henrique Guimaraesfor patients assistance in the endemic area; Dr. SergioArruda for the histopathology photograph. PRLM isinvestigator of the CNPq.
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TABLE 1. Clinical, Histological, Parasitological, and Delayed-TypeHypersensitivity Response in DL and DCL
Disseminatedleishmaniasis
Diffuse cutaneousleishmaniasis
Clinical pictureSkin lesions Acneiform lesions,
papulesInfiltrated nodules
and plaquesUlcers Present Absent
Mucosal involvement Up to 44% of cases AbsentParasite in tissue Absent or few AbundantLeishmania speciesa Mainly L. braziliensis L. amazonensis,
L. aethiopicaMontenegro skin test Positive 460%
of casesNegative
aImmunocompetent host.
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ARTIGO 2
Reappraisal of the immunopathogenesis of disseminated leishmaniasis: in
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Reappraisal of the immunopathogenesis of disseminatedleishmaniasis: in situ and systemic immune response
Paulo R. Machadoa, Maria Elisa A. Rosaa, Diego Costab, Moema Mignaca, Joo S. Silvab,Albert Schriefera, Mauro M. Teixeirac, Olivia Bacellara, and Edgar M. Carvalhoa,d,*aServio de Imunologia, Hospital Universitrio Prof. Edgard Santos, Universidade Federal daBahia, Salvador, BA, BrazilbDepartamento de Bioqumica e Imunologia, Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto,Universidade de So Paulo, Ribeiro Preto, SP, BrazilcDepartamento de Bioqumica e Imunologia, Instituto de Cincias Biolgicas, UniversidadeFederal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, BrazildInstituto Nacional de Cincia e Tecnologia de Doenas Tropicais (CNPq/MCT), Salvador, BA,Brazil
AbstractDisseminated leishmaniasis (DL) is an emerging form of Leishmania braziliensis infectioncharacterised by multiple cutaneous lesions on different parts of the body and a high rate ofmucosal involvement. Systemic production of TNF and IFN in DL patients is lower than incutaneous leishmaniasis (CL) caused by L. braziliensis, which may account for parasitedissemination due to the decreased ability to control parasite growth. In this study, the systemicand in situ immune response of DL and CL patients was characterised through evaluation ofchemokine and cytokine production. In situ evaluation showed similar production of IFN, TNF,IL-10, transforming growth factor-beta (TGF), chemokine (C-C motif) ligand 2 (CCL2), CCL3,CCL11 and chemokine (C-X-C motif) ligand 10 (CXCL10) in papular and ulcerative lesions fromDL as well as in ulcerated lesions from CL. Serum levels of CXCL9, a chemokine that attracts T-cells, was higher in serum from DL than from CL. These data indicate that a decrease in the type 1immune response in peripheral blood of DL patients is due to attraction of Leishmania antigen-activated T-cells to the multiple cutaneous lesions. This may account for the absence of or fewparasites in the lesions and for the development of ulcers similar to those observed in CL.
2011 Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. Published by Elsevier Ltd. All rights reserved.*Corresponding author. Present address: Servio de Imunologia, Hospital Universitrio Prof. Edgard Santos, 5 andar, Rua Joo dasBotas s/n, Canela 40110-160, Salvador, Bahia, Brazil. Tel.: +55 71 3237 7353; fax: +55 71 3245 7110. [email protected],[email protected] (E.M. Carvalho).Authors contributions: PRM, OB, MEAR, AS, JSS and EMC designed the study protocol; PRM and MEAR carried out the clinicalassessment; OB carried out the immunoassays and the systemic cytokine/chemokine determination; DC and MM carried out the in situcytokine/chemokine determinations; AS carried out Leishmania isolation and identification; PRM, OB, DC, JSS, MM and MMTanalyzed and interpreted the data; PRM, MEAR and OB drafted the manuscript; MMT, DC, JSS, AS, MM and EMC revised themanuscript. All authors read and approved the final manuscript. EMC and PRM are guarantors of the paper.Conflicts of interest: None declared.Ethical approval: This study was approved by the Ethics Committee of the Hospital Universitrio Prof. Edgard Santos (Salvador,Brazil).
NIH Public AccessAuthor ManuscriptTrans R Soc Trop Med Hyg. Author manuscript; available in PMC 2011 August 17.
Published in final edited form as:Trans R Soc Trop Med Hyg. 2011 August ; 105(8): 438444. doi:10.1016/j.trstmh.2011.05.002.
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KeywordsDisseminated leishmaniasis; Leishmania braziliensis; Cytokines; Chemokines;Immunopathogenesis; Cutaneous leishmaniasis
1. IntroductionDisseminated leishmaniasis (DL) is an emerging form of Leishmania braziliensis infection,distinguished by its unique clinical and immunological characteristics.13 It is characterisedby the presence of a great number of cutaneous lesions spanning more than one area of thepatients body, mixed types of skin lesions and a high frequency of mucosal involvement.2,3The patient typically reports a single initial lesion, usually on the extremities, followed bydissemination that may involve the entire body, sometimes associated with fever and chills.The importance of DL is outlined by the severity of the disease, therapeutic challenge and anincreasing prevalence. Whilst in 1986 only 0.2% of all cases of L. braziliensis infection wereDL, in 2000 this figure rose to 2%.2,3
DL is distinct from cutaneous leishmaniasis (CL), mucosal leishmaniasis (ML) and diffusecutaneous leishmaniasis (DCL).36 The pathogenesis of DL is not established. In a smallnumber of previously studied cases, we observed a higher frequency of patients with anegative skin test to Leishmania antigen1 and a lower production in vitro of IFN and TNFto Leishmania antigen than in patients with CL.3 Therefore, a decrease in the T-cell responsehas been hypothesised to play a major role in parasite dissemination, and abnormalchemokine production may be associated with this phenomena. The role of chemokineslinking innate to adaptive immunity and in recruiting inflammatory cells to tissue is wellestablished, but remains unknown in DL. For instance, chemokine (C-C motif) ligand 2(CCL2) and CCL3 are associated with antileishmanial activity,7 and tissue expression ofCCL2 is decreased in DCL.8 It is clear that the majority of fresh acneiform lesions of DLdisappear during the first course of antimony therapy,2 but the majority of DL patientsrequire more than a course of antimony therapy to cure and relapse may occur.3 It is notknown why a high failure rate to antimony therapy is observed in these patients. Host andparasitic factors may account both for dissemination and response to therapy. The aim ofthis study was to characterise better the systemic and tissue immune response in patientswith DL compared with patients with localised CL. Cytokines [IFN, TNF, transforminggrowth factor-beta (TGF) and IL-10] and chemokines [CCL2, CCL3, CCL11, chemokine(C-X-C motif) ligand 9 (CXCL9) and CXCL10] were measured in peripheral blood, andtissue expression of these molecules was determined at the lesion site.
2. Materials and methods2.1. Patients
This study included 32 DL patients recruited from 1998 to 2001 at the health post of Cortede Pedra, Bahia State, Brazil. The criteria for diagnosis were a clinical picture of DL asdescribed below, in conjunction with parasite isolation by PCR or a positive skin test forLeishmania antigen plus histopathological features characteristic of leishmaniasis. DL wasidentified according to a case definition of ten or more mixed-type lesions (e.g. acneiform,papular, nodular and/or ulcerated), located on two or more body parts (head, trunk, arms andlegs).3 CL patients were matched by sex and age (5 years) with DL cases. Although notmatched by occupation, all DL and CL patients lived in the same endemic area where up to70% of these patients are farm workers. Patients with CL were characterised by a typicalulcerated lesion with raised borders and had a maximum of three cutaneous lesions. DL andCL patients had a disease duration of 12 months. There was no clinical evidence of HIV
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Trans R Soc Trop Med Hyg. Author manuscript; available in PMC 2011 August 17.
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co-infection in CL or DL patients, and no patient had a positive HIV serology. DL patientswere treated with i.v. pentavalent antimonial (Sbv) (meglumine antimony; Sanofi-Aventis,Paris, France), 20 mg/kg body weight daily for 30 days. Criteria for cure were completeinvolution of papular lesions and/or total scarring of ulcers 90 days after initiation oftherapy. Informed consent was obtained from each participant.
2.2. Soluble Leishmania antigen (SLA)SLA used for skin test and in vitro studies was prepared with an isolate of L. braziliensis aspreviously described.9
2.3. PCR for LeishmaniaDNA isolation was carried out from biopsy samples using the Wizard Genomic DNAPurification Kit (Promega, Madison, WI, USA). Purified DNA was re-suspended in TrisEDTA (TE) buffer and was stored frozen at 20 C until use. Detection of the subgenusViannia used the primers 5-GGGGTTGGTGTAATATAGTGG-3 and 5-CTAATTGTGCACG-3.
2.4. Evaluation of cytokine productionLevels of CCL2/monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1), macrophage inflammatoryprotein 1-alpha (MIP-1)/CCL3, CCL11/eotaxin, CXCL10/IFN-inducible protein 10(IP-10) and CXCL9/monokine induced by IFN (MIG) were measured in the serum of 21DL patients and 21 CL patients by ELISA.7 For determination of cytokines and chemokines,peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were obtained from heparinised venous bloodlayered over a FicollHypaque gradient, then washed and re-suspended in complete medium(RPMI 1640 with 10% heat-inactivated pooled human AB serum) at a concentration of 3 106 cells/ml. These cells were added to 24-well plates and were kept unstimulated or werestimulated with SLA (10 g/ml) for 72 h at 37 C in 5% CO2. Supernatants were thencollected and stored at 70 C. IFN, TNF, IL-10 and IL-5 levels were measured byELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA; and Pharmingen, San Diego, CA, USA).Serum levels of chemokines (CCL2, CCL3, CCL11, CXCL9 and CXCL10) weredetermined by ELISA.10
2.5. Evaluation of cytokine and chemokine expression in situ by immunohistochemistrySkin biopsies from lesion borders of patients with localised CL and DL were frozen inO.C.T. compound (Sakura Finetek, Torrance, CA, USA). Immunohistochemistry wasperformed using the avidinbiotin peroxidase method with mouse anti-human MIP-1(PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA), IFN (Genzyme, Cambridge, MA, USA) and TNF(Genzyme) and rabbit anti-human TGF, CXCL9 and IL-10 (Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz, CA, USA), CCL11/eotaxin, CXCL10/IP-10, CCL12/MCP-1 and MIP-1(PeproTech). After 90 min of incubation at 37 C, slides were incubated with biotinylatedgoat anti-rabbit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) or goat anti-mouse (SantaCruz Biotechnology) antibodies. Staining was developed with 3,30-diaminobenzidine(DAB) (Vector Laboratories) and was counterstained with Mayer haematoxylin. Controlswere performed by incubating slides with IgG isotype control instead of primary antibodiesand proceeding as described above. The whole biopsy section areas weremicrophotographed with a final magnification of 200 and brown-stained areas werecounted using Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems Inc., San Jos, CA, USA) and ImageJsoftware (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Results are expressed aspercent of biopsy area stained positive.
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Trans R Soc Trop Med Hyg. Author manuscript; available in PMC 2011 August 17.
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2.6. Statistical analysisA MannWhitney test was performed for all continuous non-parametric variables. Datawere statistically significant if the probability of a type I error was < 0.05.
3. ResultsDemographic and clinical features of the 32 patients with DL are shown in Table 1. Patientswere primarily adults and male, with a short duration of illness (
Analysis of CXCL9 expression in the tissue was not possible due to cross-reaction of theantibodies leading to high background levels.
In situ expression of IFN, TNF, IL-10 and TGF also showed a similar pattern, with ahigher (non-significant) TGF expression in ulcerated DL (Table 2).
4. DiscussionThe host immunological response plays a pivotal role in the pathogenesis of tegumentaryleishmaniasis. Whilst in CL and ML an exaggerated type 1 immune response is associatedwith tissue damage,12,13 in patients with DCL an absence of cell-mediated immune responseallows parasite multiplication and dissemination.14,15 DL patients may present a hundredlesions and, compared with CL and ML, have a lower production of IFN and TNF.3Therefore, it has been suggested that a decrease in the peripheral production of Th1cytokines may favour dissemination of the lesions in DL. Here we compared the systemicand tissue immune response in CL and DL. These data indicate that the tissue immuneresponse observed in DL is similar to that detected in CL. As these patients present multiplelesions, it is likely that the majority of Leishmania-reactive T-cells are in the lesion, leadingto a decrease in parasite antigen-specific T-cells in the blood and consequently decreasedproduction of TNF and IFN observed in PBMC cultures of DL compared with patientswith CL.
The hypothesis that parasite dissemination in DL is associated with a decrease in type 1immune response comes from studies that show a decreased production of IFN and TNFin supernatants of PBMCs of DL in comparison with CL and also an absence of delayed-type hypersensitivity response to Leishmania antigens in some DL patients.3 This hypothesiswas supported by the role of the absence of type 1 immune response in DCL, the anergicform of CL, which is also associated with multiple cutaneous lesions.6 However, DCLdiffers from DL in clinical, histopathological and immunological features. Specifically, inDCL the lesions usually do not ulcerate and histopathology shows an increase inmacrophages with a high number of amastigotes inside the cells.6,14 In DL the papular andacneiform lesions progress to ulcer, lymphocyte infiltration and granulomas are found, andan absence or low numbers of parasites are documented.2 These histopathological findingsare similar to those observed in CL. We confirmed here that IFN and TNF systemic levelsare significantly lower in DL compared with CL. However, it is clear that the majority ofthese patients produce IFN and some of them produce as much IFN as patients with CL.
Chemokines play a relevant role in the migration of activated T-cells and are themselvesinduced by T-cell-derived cytokines. For example, CXCL9 and CXL10 act on chemokine(C-X-C motif) receptor 3 (CXCR3), which are preferentially expressed on Th1 lymphocytesand are themselves induced by IFN.7 CXCL11 can induce production of IL-12 by dendriticcells, whereas CCL2 and CCL3 can attract monocytic cells and induce antileishmanialactivity.7,16 It has been shown that tissue expression of CCL2 is decreased in DCL incomparison with CL.8 We found no differences regarding the in situ expression of cytokines(IFN, TNF, TGF) and chemokines (CCL2, CCL3, CCL11, CXCL10) comparing papularand ulcerated lesions of DL with the classical ulcerated lesion of CL. In the current series,CXCL9 levels were higher in DL compared with CL. Elevated levels of CXCL9 in theserum of DL patients contrast with the lower production of IFN and TNF by PBMCs ofthese same patients. However, it could indicate that Leishmania-specific T-cells were beingrecruited to the lesion site and were participating in the pathogenesis of the lesion, as pro-inflammatory cytokines are associated with tissue damage in L. braziliensis infection.12,13
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