UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINAPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA

ALUNA: SUELLEN GAVRONSKIFLORIANÓPOLIS, 25/08/2015

Introdução

O termo epigenética refere-se a todas as mudanças reversíveis e herdáveis no genoma funcional que não alteram a sequência de nucleotídeos do DNA

Existem três mecanismos principais de alterações epigenéticas: metilação do DNA, modificação de histonas e ação de RNAs não codificadores

Introdução

Dentre as técnicas que elucidam a ligação de fatores de transcrição ao DNA, destacam-se a PBM (protein binding microarray) (in vitro) e a Chip ou Chip-Seq (Chromatin immunoprecipitation seguida de sequenciamento) (in vivo).

Desvantagens: utilização de FT purificados e de difícil manuseio, não permitindo a análise complexa e multi-paramétrica das modificações epigenéticas.

A tecnologia MagPIE (magnetic protein immobilization on enhancer DNA) foi desenvolvida com o objetivo de permitir a análise multi-paramétrica e rápida das interações entre fatores de transcrição (FT), cromatina e DNA, bem como suas modificações epigenéticas resultantes.

Introdução

Metodologia

Amplificação do DNA e ligação às beads Todas as sequências foram amplificadas e ligadas as beads

com primers com mínima afinidade por fatores de transcrição.

Processo:Beads magnéticas com

streptavidina são precipitadas com um ímã

Beads são resuspendidas no tampão de ligação

Adição de DNA biotinilado

Incubação por 20 a 60’

Lavagem e bloqueio com 4% de leite

Armazenamento

Metodologia

Cultura de célulasForam utilizadas células embrionárias murinas

mantidas em meio DMEM suplementadas com 15% de soro fetal bovino. Quando necessário, as células foram tratadas com doxiciclina para estimular a proliferação e induzir a expressão de fatores de transcrição.

Metodologia

Preparação do lisado nuclearLavagem dupla das células com PBS

gelado

Células foram raspadas, colocadas num pellet e centrifugadas

Células são resuspendidas em solução de lise e incubadas por 15’ a 4°C

Adição de um agente detergente e centrifugação

Resuspensão em solução de lise nuclear, incubação e centrifugação

Purificação em coluna

Preparação de alíquotas, congelamento em nitrogênio líquido e armazenamento a -80°C

Metodologia

Ligação do DNA as proteínasDescongelamento e diluição do lisado

(~1/3mg/ml)

Incubação do lisado com as beads recobertas com o DNA

Incubação por 10’ a 37°C

Resuspensão das beads em 10 μl de solução de anticorpos primários e anticorpos secundários

ligados a um fluoróforo.

Incubação por 20-60’ a 4°C

Lavagem, resuspensão e avaliação por citometria de fluxo

Análise adicional por espectrometria de massas

Junto com DNA competidor

Resultados

Interação DNA-proteína

Amplificação de sequências de DNA

Sequência aleatória de 130pb

Sequência de 150pb de uma região contendo um sítio forte de ligação a Cdx2

Ligação as beads

Incubação com o lisado contendo o

FT Cdx2 com o epítopo V5

Marcação com o anticorpo anti-V5

Análise da interação por citometria de fluxo

Os FTs interagem com sequências

de DNA contendo sítios de ligação

específicas

Resultados

Para confirmar que a ligação do DNA ao FT Cdx2 é dependente do sítio de ligação para Cdx2, foi analisado o efeito de sítios de ligação mutados.Sequências de 40pb com sítios de ligação Cdx2 com um motif fraco e

forte

Amplificação utilizando os primers MagPIE biotinilados

gerando uma seqüência de 88 bp.

Resultados

Somente a mutação do sítio de ligação forte diminui a ligação ao FT

Resultados

A ligação a outros fatores de transcrição (Sox2 e Onecut1) com sítio de ligação mutada também foi afetada.

Resultados

Análise comparativa da afinidade de ligação da sequência de DNA ao fator de transcrição

A intensidade da imunofluorescência é relacionada ao grau de afinidade com o sítio de ligação

Seleção de 16 sequências com afinidades variáveis ao sítio

Cdx2Incubação com o

lisado contendo o FT

Marcação e análise por

citometria de fluxo

Resultados

Análise de múltiplos eventos epigenéticos

Resultados

Metilação do DNA Sequências flanqueadoras de regiões com dinucleotídeos CG

foram amplificadas e marcadas com anticorpos contra citosinas metiladas antes e após a incubação.

A incubação com o lisado induz a reatividade da metil-citosina e pode ser inibida com a pré-incubação do lisado com o inibidor de DNA metiltransferase RG108.

Resultados

Ligação das sequências de DNA a histonas após a incubação com o lisado.

Em todos os experimentos, histonas H1, H2 e H3 foram detectadas, indicando que ocorre a ligação de histonas durante a realização da técnica analisada.

A análise de espectrometria de massas foi realizada nas beads ligadas a sequências de

DNA com o sítio de ligação Cdx2 e sequências aleatórias de 88, 150 e 250 pb.

Resultados

Foi analisado se sequência que possuíam a marcação para H3K4Me1 em células embrionárias apresentavam maior reatividade após incubação com o lisado, o que foi posteriormente confirmado.

Para isso, foram testadas 4 sequências com a marcação e 8 sequências sem.

Resultados

As sequências reativas apresentam uma região de 200pb com sítio de ligação forte para o motif Sox-Oct, dois fatores de transcrição. As sequências não reativas não apresentam este sítio de ligação.

Logo, sabe-se que a sequência de H3K4Me1 apresenta sítio de ligação para os FTs Sox-Oct.

Duplo negativo

Duplo positivo

Resultados

Para testar a relação entre a ligação dos FT e a presença do marcador H3K4Me1, foram sintetizadas sequências com mutações pontuais nos sítios de ligação Oct e Sox2.

Mutações no sítio Oct4 reduziram a reatividade para H3K4Me1 em maior grau quando comparada com a mutação do sítio Sox2

Além disso, a mutação no sítio Oct diminuiu a reatividade do FT Sox2, indicando um relação de cofatores

Isso indica que a metilação de histonas é dependente da ligação com FTs (principalmente Oct4)

Resultados

Para saber se as histonas são ligadas na forma de nucleossomos, foi feita a digestão com Dnase I, uma vez que a presença de nucleossomos impede a ação desta enzima.

Uma região H3K4Me1 de 250 bp foi sintetizada e ligada as beads e sujeitada a digestão com DNAse I antes e após a incubação com o lisado. A incubação com o lisado impediu a digestão por DNAse I o que sugere a presença de nucleossomos.

DNA ladder

Sequência de 250 pb com o sítio de ligação Sox-Oct

antes de ser ligado as beads

Sequência após ligação as beads e digestão com

DNase

Sequência após a ligação as beads e

incubação com o lisado (não digerido)

Resultados

Para saber se ocorria a metilação das histonas durante o MagPIE, foi realizado o ensaio na presença de um análogo não hidrolisável do ATP (ATP gama S), o que diminuiu a atividade da H3K4Me1, sugerindo que ocorre a metilação das histonas durante a incubação com o lisado.

Discussão

É possível monitorar as interações entre DNA e fatores de transcrição pela técnica.

Consiste em uma técnica rápida (resultados são obtidos após 2h), com pequenas quantidades de proteína e cujos complexos DNA-FT são estáveis por várias horas.

Todos esses processos detectados estão relacionados a incubação com o lisado nuclear bruto, uma vez que o mesmo possui as enzimas catalizadoras

Discussão

A técnica de MagPIE permite analisar:1. metilação de histonas;2. metilação do DNA;3. ligação de fatores de transcrição;4. ligação de histonas;5. ligação de nucleosomos;6. atuação de cofatores. A ligação de FTs são dependentes de sequências específicas.

Conclusão

Como alguns citômetros podem ler >10 λ, a análise de simultâneas interações pode ser visualizada por esta técnica.

Espera-se que com o desenvolvimento de mais anticorpos para FTs e modificações de histonas, tais eventos possam ser investigados de forma mais aprofundada.

De forma geral, esta continua sendo uma metodologia promissora para a análise multi-paramétrica de interações e modificações do material genético analisado.

Obrigada!