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Universidade Federal de Sergipe Centro de Ciências Biológicas e da Saúde
Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Avaliação da Resposta Imune Humoral Anti-Pvs48/45 em
Infecções Naturais por Plasmodium vivax da Amazônia
Brasileira
Tatiana Maria Silva Cisne Pessoa
São Cristóvão – Sergipe 2017
i
Tatiana Maria Silva Cisne Pessoa
Avaliação da Resposta Imune Humoral Anti-Pvs48/45 em
Infecções Naturais por Plasmodium vivax da Amazônia
Brasileira
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária da Universidade Federal de Sergipe como parte dos requisitos para a obtenção do Título de Mestre em Biologia Parasitária.
Orientadora: Profa. Dra. Luciane Moreno Storti de Melo
São Cristóvão – Sergipe 2017
ii
iii
TATIANA MARIA SILVA CISNE PESSOA
Avaliação da resposta imune humoral anti-Pvs48/45 em infecções naturais por
Plasmodium vivax da Amazônia brasileira
Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Biologia Parasitária, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária da Universidade Federal de Sergipe.
BANCA EXAMINADORA Profa. Dra. Luciane Moreno Storti de Melo Universidade Federal de Sergipe Orientadora Profa. Dra. Roseli La Corte dos Santos Universidade Federal de Sergipe Laboratório de Parasitologia Membro Titular Interno Profa. Dra. Priscila Lima dos Santos Universidade Federal de Sergipe – Campus Lagarto Membro Titular Externo Profa. Dra. Patrícia Rodrigues Marques de Souza Universidade Federal de Sergipe Membro Suplente Interno Prof. Dr. Rodrigo Anselmo Cazzaniga Universidade Federal de Sergipe - CCBS Membro Suplente Externo
São Cristóvão, 22/02/2017
iv
Dedico este trabalho aos meus pais
Antonio Francisco e Margareth, a base da
minha vida, por não medirem esforços para que
isso fosse possível. A meus irmãos, pelo
companheirismo de sempre e a meu namorado
pela confiança depositada em mim.
v
Agradecimentos
À Profa. Dra. Luciane Moreno Storti de Melo, pela confiança depositada em
mim e por me proporcionar tantas oportunidades, incentivando e melhorando meu
crescimento profissional e desenvolvimento acadêmico. Por todos os
aprendizados e conhecimentos compartilhados e por sempre exigir, me fazendo
acreditar em meu potencial. Pelas palavras de conforto e incentivo nos momentos
difíceis e, principalmente, por sua dedicação pela pesquisa, despertando em mim
o gosto pela Malária. Foi uma honra trabalhar ao seu lado e é com imenso
orgulho que concluo esse metrado sob sua orientação.
Aos colaboradores Dr. Sócrates Herrera e Dra. Myriam Arévalo-Herrera –
Centro de Investigação Científica Caucaseco, Cali-Colômbia, pelo apoio e suporte
com as análises, abrindo as portas para que eu pudesse realizar meu trabalho.
Ao Prof. Dr. Ricardo Luiz Dantas Machado – Instituto Evandro Chagas, pelo
apoio com a pesquisa, disponibilizando as amostras para que eu pudesse realizar
as análises.
À Angela Valencia – Centro de Investigação Científica Caucaseco, Cali-
Colômbia, pelo carinho, dedicação e por todo apoio dentro do laboratório.
À Juliana Diaz, pela carinhosa receptividade e acolhida em sua casa.
À Myrela, por sua prestatividade e apoio com a pesquisa.
Às amigas Juci e Vanessa, minhas companheiras de jornada, por estarem
sempre ao meu lado, compartilhando alegrias, confidências, inseguranças, me
incentivando e trazendo confiança sempre. Obrigada pela amizade de vocês,
meninas! Vocês tornaram esse período um tanto mais leve.
À Coordenação do Programa de Pós-graduação em Biologia Parasitária da
Universidade Federal de Sergipe e professores, pelo carinho e dedicação.
À CAPES pela concessão da bolsa de estudos.
vi
Aos que não participaram diretamente dessa história, mas que foram
indispensáveis para que ela se concretizasse de maneira mais leve,
meus sinceros e especiais agradecimentos.
A Deus, por me permitir realizar mais essa etapa da minha vida, iluminando meu
caminho, me dando serenidade e sabedoria para seguir em frente. Sem Ele nada
disso seria possível.
Aos meus dedicados e incansáveis pais, Antonio Francisco e Margareth, pelo
amor incondicional, e por estarem sempre presentes, buscando meu melhor, me
dando forças e incentivando a persistir nesse caminho. Obrigada por tudo! Amo
vocês!
Aos meus irmãos, verdadeiros companheiros, Chiquinho e Karina, que
mesmo de longe se fazem sempre tão presentes nos meus dias, pelo apoio,
incentivo, pelas conversas e confidências trocadas. Vocês são os melhores!
Ao meu amor, Adam, pelo apoio, carinho e paciência em todos os momentos (sei
que foi um período de muitas mudanças para nós). Obrigada por todo o incentivo,
me mostrando que sou capaz e por acreditar sempre em mim. Sou grata a Deus
por te ter em minha vida. Te amo!
Aos meus cunhados Hermano e Marília, por todo carinho, atenção e por estarem
sempre torcendo por mim.
Aos meus avós maternos Rita e Rivaldo, por todo carinho e cuidado que sempre
tiveram comigo e por todas as orações a mim direcionadas. Aos meus avós
paternos Creuza e Quincas, vocês são meus anjos e sei que estão olhando por
mim e me guiando de onde estiverem.
Aos meus tios, tias e primos, em especial à tia Magaly, minha segunda mãe, que
sempre acolhedora, se fez tão presente em minha vida.
Enfim, o meu muito obrigada a todos que fizeram parte dessa conquista.
vii
“Se você procurar bem, você acaba encontrando.
Não a explicação (duvidosa) da vida,
Mas a poesia (inexplicável) da vida.”
Carlos Drummond de Andrade
viii
Resumo
PESSOA, Tatiana Maria Silva Cisne. Avaliação da resposta imune humoral anti-Pvs48/45 em infecções naturais por Plasmodium vivax da Amazônia brasileira. Sergipe: UFS, 2017. 64p. (Dissertação – Mestrado em Biologia Parasitária).
A malária continua sendo responsável por grande morbidade e mortalidade em muitos países tropicais e subtropicais. Diante de várias tentativas de controle dessa protozoose, as vacinas têm sido alvo de intensa pesquisa, uma vez que esse parece ser o caminho promissor para o controle efetivo da malária. Indivíduos que estão frequentemente expostos ao parasito, por habitarem áreas endêmicas desenvolvem respostas imunes específicas, levando a uma redução da carga parasitária e das manifestações clínicas. Além disso, o soro desses indivíduos pode impossibilitar a fertilização dos gametas nos mosquitos, bloqueando a transmissão desse parasito para o vetor. A proteína Pvs48/45 é encontrada na superfície dos gametócitos e utilizada como alvo dos anticorpos viabilizando essa estratégia de uma vacina de bloqueio de transmissão. O objetivo desse estudo é avaliar a resposta de anticorpos naturalmente adquirida em infecções por Plasmodium vivax contra a proteína Pvs48/45. A pesquisa de anticorpos IgG anti-Pvs48/45 foi realizada por ELISA no soro de 281 amostras de pacientes maláricos residentes na região amazônica brasileira. O ponto de corte foi estabelecido utilizando soro de voluntários que nunca tiveram contato com o plasmódio, estabelecendo a média da densidade óptica (DO) mais três desvios padrão. As amostras foram analisadas em duplicatas e a média da DO foi dividida pelo ponto de corte para estabelecer o índice de reatividade (IR), sendo que amostras com IR ≥ 1 são consideradas positivas. Dos 281soros analisados, em 22,4% foram encontradas respostas de anticorpos específicos anti-Pvs48/45 e os índices de parasitemia e os gametócitos não influenciaram o reconhecimento antigênico desta proteína. Na análise dos subfragmentos, obteve-se que a região C-Terminal + Central da Pvs48/45 foi a que apresentou maior reconhecimento antigênico na amostra em estudo (32%). Diante disso, estudos com a utilização dessa região da proteína podem facilitar o entendimento do potencial imunogênico desse antígeno. Esse estudo visa contribuir para o desenvolvimento de uma vacina de bloqueio de transmissão eficiente contra a proteína Pvs48/45 em ensaios futuros.
Palavras-chave: Pvs48/45; vacina; resposta imune; Malária.
ix
Abstract
PESSOA, Tatiana Maria Silva Cisne. Evaluation of the anti-Pvs48/45 humoral immune response in natural infections by Plasmodium vivax from the Brazilian Amazon. Sergipe: UFS, 2017. 64p. (Dissertation – Master’s degree in Parasite Biology).
Malaria remains a major responsible factor for morbidity and mortality in many tropical and subtropical countries. Due to the several attempts to control this protozoan infection, vaccines have been subject of intensive research, since this seems to be a promising way for the effective control of malaria. Individuals, who are frequently exposed to the parasite by living in endemic areas, develop specific immune responses, leading to a reduction of parasite load and clinical manifestations. Moreover, the serum of such individuals may impair fertilization of gametes in the mosquito, blocking the transmission of this parasite into the vector. The Pvs48/45 protein is found on the surface of gametocytes and used as a target of antibodies enabling this strategy a transmission blocking vaccine. The aim of this study is to evaluate the antibody response in naturally acquired infections by Plasmodium vivax against Pvs48/45 protein. The research of antibodies IgG anti-Pvs48/45 was performed by ELISA in sera from 281 samples of malarial patients living in the Brazilian Amazon. The cutoff point was established using serum from volunteers who never had contact with the plasmodium, establishing the mean optical density (OD) plus three standard deviations. Samples were analyzed in duplicate and the mean OD was divided by cutting point to establish the reactivity index (RI), while samples with IR ≥ 1 are considered positive. Of 281 sera analyzed, in 22.4% were found specific antibody response anti-Pvs48/45 and indices of parasitemia and gametocyte did not influence the antigenic recognition of this protein. With the analysis of the subgroups was obtained that the C-Terminal + Central region of Pvs48/45 was the one with the highest antigenic recognition in the study sample. Therefore, studies using this region of the protein may facilitate the understanding of the immunogenic potential of this antigen. This study aims to contribute to the development of an efficient transmission blocking vaccine against Pvs48/45 protein in future trials.
Keywords: Pvs48/45; vaccine; immune response; Malaria.
LISTA DE ABREVIATURAS
AMA-1 do Inglês Apical Membrane Antigen 1 - Proteína de Membrana Apical
AS01 Sistema Adjuvante Lipossomal
C Região Carboxi-terminal
CSP Proteína Circunsporozoítica
DARC Receptor do Antígeno Duffy para Quimiocinas
DBP do Inglês Duffy Binding Protein - Proteína de Ligação ao Antígeno Duffy
ELISA do Inglês Enzyme-Linked Immunosorbent Assay - Ensaio Imunoenzimático
IFNy Interferon-gamma
KDa Quilodalton
HBcsAg Antígeno Associado ao Vírus da Hepatite B
Montanide ISA 51 Sistema Adjuvante 51
Montanide ISA 720 Sistema Adjuvante 720
MSP do inglês Merozoite Surface Protein - Proteína de Superfície do Merozoíto
N Região Amino-terminal
PfAMA1-FVO Antígeno de Membrana Apical do P. falciparum
PvDBP Proteína de Ligação ao Antígeno Duffy do P. vivax
PvMSP1 Proteína 1 de Superfície do Merozoíto do P. vivax
PvRMC-MSP1 do Inglês P. vivax Recombinant Modular Chimera Based on MSP1 - Quimera Modular Recombinante de P. vivax baseada em MSP1
R Região de Repetição
RTS,S/AS01 Proteína de Superfície do Esporozoíto do P. falciparum
TBV do Inglês Transmission Blocking Vaccine - Vacina de Bloqueio de Transmissão
THP-1 Células T Auxiliares do tipo 1
TRX Tiorredoxina
VK210 Cepa de P. vivax 210
VK247 Cepa de P. vivax 247
VMP001 Proteína 1 de Malária vivax
Sumário
1 INTRODUÇÃO ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 13
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS DA MALÁRIA ----------------------------------------------------------------------- 13
1.2 EPIDEMIOLOGIA ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 14
1.3 CICLO BIOLÓGICO -------------------------------------------------------------------------------------------------- 15
1.4 MATURAÇÃO E INFECTIVIDADE DOS GAMETÓCITOS ------------------------------------------------------ 17
1.5 ASPECTOS DA VACINA ANTI-MALÁRICA ---------------------------------------------------------------------- 18
1.5.1 Bloqueio da infecção ------------------------------------------------------------------------------------ 20
1.5.2 Bloqueio da doença (MSP, AMA-1, DBP) ------------------------------------------------------- 23
1.5.3 Bloqueio da transmissão ------------------------------------------------------------------------------- 26
2 JUSTIFICATIVA --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 28
3 OBJETIVOS --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 29
3.1 OBJETIVO GERAL -------------------------------------------------------------------------------------------------- 29
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ---------------------------------------------------------------------------------------- 29
4 MATERIAIS E MÉTODOS ------------------------------------------------------------------------------------------- 30
4.1 OBJETOS DE ESTUDO --------------------------------------------------------------------------------------------- 30
4.2 ASPECTOS ÉTICOS ------------------------------------------------------------------------------------------------- 31
4.3 ANÁLISES LABORATORIAIS -------------------------------------------------------------------------------------- 32
4.3.1 Avaliação da resposta de anticorpos ------------------------------------------------------------- 32
4.3.2 Produção da Pvs48/45 --------------------------------------------------------------------------------- 33
4.3.3 Titulação das amostras --------------------------------------------------------------------------------- 33
4.3.4 Interpretação dos Resultados ------------------------------------------------------------------------ 34
4.3.5 Análises Estatísticas ------------------------------------------------------------------------------------- 34
5 RESULTADOS ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 34
5.1 ANTIGENICIDADE DA PROTEÍNA PVS48/45 NA AMAZÔNIA BRASILEIRA ----------------------------- 34
5.2 ÍNDICES DE PARASITEMIA E PRESENÇA DE GAMETÓCITOS---------------------------------------------- 36
5.3 REATIVIDADE DAS AMOSTRAS AOS SUBFRAGMENTOS DA PVS48/45 -------------------------------- 38
6 DISCUSSÃO -------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 39
7 CONCLUSÃO E CONSIDERAÇÕES FINAIS --------------------------------------------------------------- 42
8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ---------------------------------------------------------------------------- 44
ANEXO A -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 54
DECLARAÇÃO DE DOAÇÃO DAS AMOSTRAS -------------------------------------------------------------------------------- 54
ANEXO B -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 55
PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP ----------------------------------------------------------------------------------- 55
APÊNDICE A --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 56
ARTIGO A SER SUBMETIDO AO PERIÓDICO ACTA TROPICA, ISSN: 0001-706X -------------------------------- 56
13
1 INTRODUÇÃO
1.1 Considerações gerais da malária
A malária é uma doença parasitária transmitida ao homem por fêmeas
infectadas de mosquitos do gênero Anopheles. É caracterizada por quadros de
febre intermitente, cefaleia, mialgia, cansaço, sudorese, tontura e náuseas.
Apesar da tríade clássica malárica (febre, calafrio e dor de cabeça), sua fase
inicial é bastante inespecífica por seus sintomas serem comuns à maioria das
síndromes febris agudas, o que pode retardar o seu diagnóstico (COSTA et al.,
2010; FRANÇA et al., 2008).
Essa nosologia protozoária é uma das mais importantes em todo o mundo.
Ainda que seja uma doença parasitária que pode ser prevenida e tratada,
continua sendo uma das maiores causas de morbidade e mortalidade em muitos
países tropicais e subtropicais, impactando, dessa forma, a saúde pública dessas
áreas (WHO, 2011). A malária é causada por parasitos do gênero Plasmodium,
sendo cinco espécies reconhecidas por infectar o homem: P. falciparum, P. vivax,
P. malariae, P. ovale e, recentemente, o P. knowlesi, parasito originalmente dos
símios, foi detectado em algumas regiões da Ásia infectando humanos
(LUCHAVEZ et al., 2008). Dentre esses, os dois primeiros estão associados
respectivamente ao maior número de mortalidade/virulência e disseminação
(WHO, 2011). O P. falciparum é o responsável por causar a forma mais grave da
malária, a cerebral, podendo evoluir a óbito (FERREIRA et al., 2012).
Historicamente, casos de infecção complicada por P. vivax são raros. Todavia,
infecções causadas por essa espécie de Plasmodium são mais difíceis de serem
tratadas e ter sua transmissão controlada devido à presença de hipnozoítos
dormentes no fígado, característicos de P. vivax, sendo responsáveis pelas
recaídas. (JAIN, AGRAWAL e SINGH, 2013).
14
1.2 Epidemiologia
A malária está dentro do grupo de doenças negligenciadas, aquelas que
acometem milhares de pessoas, a maioria de baixa renda e em países
subdesenvolvidos (FERREIRA et al., 2012). É uma das doenças mais prevalentes
em países tropicais e, embora a grande maioria dos casos ocorra no continente
africano, a doença encontra-se amplamente distribuída na América Latina,
Sudeste Asiático e Oceania, (WHO, 2008). Essa protozoose afetou cerca de 212
milhões de pessoas pelo mundo em 2015, sendo que, a região africana foi a
responsável pela maioria dos casos (90%) e nas Américas, foram registrados 800
mil casos. Dos casos de malária estimados mundialmente, cerca de 4% são de P.
vivax. Entretanto, fora do continente Africano, e especificamente nas Américas, as
infecções causadas por P. vivax representam cerca de 70% (WHO, 2016).
Estima-se que a malária tenha sido responsável por 429 mil mortes de
indivíduos em todo o mundo durante o ano de 2015, sendo que a maioria ocorreu
no continente Africano (92%). O agente causador do maior número de mortes foi
o P. falciparum, enquanto que o P. vivax, estima-se que tenha sido responsável
por 3100 mortes em 2015, com 86% dos casos ocorrendo fora do continente
Africano. Do total de mortes por malária em 2015, 303 mil foram de crianças
menores de 05 anos, o que equivale a 70% do total global. Embora a mortalidade
global por malária em crianças teve uma redução de 29% desde 2010, ainda é
considerada uma das maiores responsáveis pela morte de crianças, uma vez que
a cada 2 minutos uma criança perde a vida devido a essa parasitose. Na região
das Américas, a redução da mortalidade foi de 37% no período de 2010 a 2015,
embora ainda tenham sido registradas 490 mortes em 2015, sendo que destas,
110 tiveram o P. vivax como agente etiológico (WHO, 2016).
No Brasil, aproximadamente 99% da transmissão da malária concentra-se
na região amazônica, sendo que o P. vivax tem sido a espécie mais prevalente,
responsável por aproximadamente 86% dos casos de malária nesta região, com
taxas ≥ 100 casos para cada 1000 habitantes. Nos últimos 12 anos, foram
notificados em média 423 mil casos por ano, o que representa mais de 50% dos
casos de malária registrados nas Américas (WHO, 2016). Historicamente, entre
os anos de 2000 a 2002, houve redução do número de notificações, mas no
15
período de 2002 a 2005 o número de casos aumentou consideravelmente em
73,7% em relação ao número de casos de 2002. Esse aumento tem sido atribuído
principalmente, à ocupação desordenada das periferias das grandes cidades da
região amazônica (BRAZ, DUARTE E TAUIL, 2013; OLIVEIRA-FERREIRA et al.,
2010; SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2013). Na ultima década,
eventos de redução no número de casos têm sido observados no país. Em 2014,
foram registrados 143.552 casos de malária na região amazônica. Destes casos
notificados, cerca de 4.500 foram importados de países que fazem fronteira com o
Brasil. Em relação ao ano anterior (2013), houve uma redução de 19% dos casos
e ao fazer uma análise comparativa de cada mês, nota-se que essa redução
ocorreu em todos os meses do ano de 2014. Quanto ao agente causador,
Rondônia foi o único estado que apresentou um aumento no número de casos de
malária por P. falciparum (SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2015).
Esses indicadores epidemiológicos destacam a efetividade dos programas de
controle da malária empregados no Brasil nos últimos anos. Entretanto, em 2014
ainda foram registrados 23 óbitos na região amazônica, destes, 11 foram pelo P.
vivax. Fora da região amazônica, ocorreu o registro de 15 óbitos, sendo que 06
tiveram como agente causador o P. falciparum (SECRETARIA DE VIGILÂNCIA
EM SAÚDE, 2015).
1.3 Ciclo Biológico
Parasitos do gênero Plasmodium têm um ciclo de vida que é considerado
um dos mais complicados e fascinantes dentre outros organismos, uma vez que
envolve diferentes estágios de vida desse protozoário (ALY, VAUGHAN e KAPPE,
2009). Esse ciclo é dividido em duas fases, envolvendo dois tipos de hospedeiros.
Uma sexuada ou esporogônica, durante a qual ocorre a multiplicação dos
parasitos no vetor, que é o hospedeiro definitivo e a outra, fase assexuada ou
esquizogônica, na qual ocorre a multiplicação no homem, que é o hospedeiro
intermediário (CDC, 2016).
O ciclo se inicia quando os esporozoítos infectantes são inoculados
diretamente na circulação sanguínea humana pela fêmea infectada do mosquito
16
Anopheles. Esses esporozoítos migram para o fígado, onde invadem os
hepatócitos e se diferenciam em merozoítos hepáticos (fase pré-eritrocítica)
(CORNEJO e ESCALANTE, 2006; RÉNIA E GOH, 2016). A fase hepática é
assintomática e dura em média seis dias, com cada esporozoíto produzindo
milhares de merozoítos que penetram e desenvolvem-se dentro dos eritrócitos
(ARAVIND et al., 2003).
Em P. vivax e P. ovale, os esporozoítos inoculados pelo Anopheles
possuem características genéticas distintas, existindo dois tipos de populações.
Enquanto uma desenvolve-se assim que é inoculada na circulação sanguínea, a
outra se desenvolve lentamente, permanecendo dormente no hepatócito. Essas
formas são denominadas hipnozoítos, os quais permanecem por cerca de seis
meses nesse estado de latência, quando se tornam ativos e completa-se o ciclo
pré-eritrocítico. Essa é uma das características mais marcantes que diferem o P.
vivax do P. falciparum, o desenvolvimento de hipnozoítos dormentes no fígado,
causando infecções tardias, conhecidas como recaídas em P. vivax (MUELLER et
al., 2009). Essa característica de ativação dos hipnozoítos latentes
proporcionados por infecções anteriores pode ser a explicação para a
periodicidade dos surtos de malária por P. vivax (WHITE, 2011). Apesar de o
ponto de gatilho para ativação dos hipnozoítos não estar bem compreendido,
supõe-se que o stress esteja envolvido nessa ativação (MUELLER et al., 2009).
Após o término da primeira fase do ciclo, os merozoítos rompem os
hepatócitos, caindo na corrente sanguínea, onde se ligam e invadem as
hemácias, dando origem ao ciclo eritrocítico (CORNEJO e ESCALANTE, 2006),
fase de estágio sanguíneo (OCAÑA-MORGNER et al., 2003). Neste ciclo, os
merozoítos se diferenciam em trofozoítos, os quais fazem sucessivas divisões
celulares, originando os esquizontes eritrocitários. Após a maturação dos
esquizontes dentro das hemácias, estas células se rompem, liberando os
esquizontes na corrente sanguínea (ARAVIND et al., 2003).
Após o rompimento do eritrócito parasitado, novos merozoítos são
liberados na corrente sanguínea, dando início a um novo ciclo de invasão de
eritrócitos, que resultará nos sintomas clínicos da doença. Esse ciclo eritrocítico
varia de acordo com as espécies. P. falciparum, P. vivax e P. ovale possuem um
17
ciclo de 48h enquanto que o ciclo eritrocítico de P. malariae dura cerca de 72h.
Merozoítos de P. vivax têm preferência ou até mesmo uma exigência por
reticulócitos como células hospedeiras. (MUELLER et al., 2009).
Nem todos os merozoítos evoluem para a forma de esquizonte, sendo
estes capazes de se diferenciar nas formas sexuadas do parasito, que são os
gametócitos (ARAVIND et al., 2003; MUELLER et al., 2009). Os gametócitos, em
fase de maturação, se ingeridos pela fêmea do Anopheles durante o repasto
sanguíneo, desenvolvem-se em seu estômago e dão origem a macro e
microgametas, que sofrem mudanças morfológicas, levando à fertilização
(CIRIMOTICH et al., 2010). Após várias divisões mitóticas, o oocisto gera uma
grande quantidade de esporozoítos, que migram para a glândula salivar do
mosquito, estando aptos para infectar um novo hospedeiro vertebrado reiniciando
o ciclo (KOYAMA, 2012).
1.4 Maturação e infectividade dos gametócitos
A transmissão dos estágios de vida do Plasmodium entre o vetor e o
hospedeiro humano é bastante eficaz. Apesar disso, existem alguns fatores que
influenciam a infectividade e transmissibilidade dos gametócitos inoculados na
corrente sanguínea do hospedeiro durante o repasto sanguíneo. Dentre esses
fatores estão a idade e o sistema imune do hospedeiro humano. Em crianças e
jovens, a prevalência e densidade dos gametócitos são altas. Esse número de
gametócitos e, consequentemente, sua infectividade e potencial de transmissão,
decrescem com o aumento da idade do paciente e a imunidade adquirida com a
exposição frequente à infecção malárica. (STONE et al., 2015).
A transmissibilidade dos gametócitos se diferencia, também, de acordo
com a espécie do Plasmodium. Em P. vivax, a transmissibilidade passa a ser
maior por ocorrer uma produção significativamente mais rápida de gametócitos
maduros, uma vez que o ciclo de vida dessa espécie é mais curto em
comparação com o P. falciparum (VALLEJO et al., 2016). Entretanto, a duração
do transporte dos gametócitos de P. vivax é curta quando comparada ao P.
18
falciparum, circulando pelo organismo do hospedeiro por no máximo 03 dias
(OLLIARO, et al., 2016).
Para que uma transmissão seja bem sucedida, alguns fatores podem ter
influência, tais como a proporção de gametócitos machos, a duração da infecção
e o nível de maturação do gametócito (BOUSEMA e DRAKELEY, 2011). Em
estudos realizados por Vallejo e colaboradores (2016), verificou-se que a
ocorrência de gametócitos maduros prevalece em pacientes assintomáticos
quando comparados a pacientes que apresentam infecções agudas e recentes,
indicando que nestas infecções, as agudas e recentes, há a prevalência do
desenvolvimento e replicação das formas assexuais do parasito. Além disso, o
período infeccioso dessa forma parasitária é determinado pela cepa do P. vivax e,
também, por fatores relacionados ao hospedeiro humano e, possivelmente, ao
mosquito vetor.
1.5 Aspectos da Vacina Anti-malárica
Há décadas, uma busca incessante pela vacina contra a malária, vem
sendo realizada. As vacinas são alvo de intensa pesquisa e de investimento em
seu desenvolvimento, uma vez que esse parece ser o caminho promissor para o
controle da malária futuramente. Existem várias proteínas que têm sido alvo de
pesquisa para serem utilizadas como antígenos vacinais e, a depender da
proteína, a estratégia de ação utilizada se modifica. Entretanto, apesar de
décadas de estudo e muitos resultados aparentemente promissores, ainda não
temos uma vacina efetiva. Uma das razões para essa dificuldade no
desenvolvimento de uma vacina eficaz é justamente a enorme complexidade do
parasito, seu ciclo biológico envolve diferentes formas de vida que possuem
diferentes células alvo e uma ampla diversidade genética com antígenos de
superfície altamente polimórficos de P. falciparum e P. vivax nas diferentes
regiões do mundo (VERSIANI et al., 2013). A falta de correlatos imunológicos de
proteção e um modelo experimental animal também são considerados obstáculos
para o desenvolvimento da vacina (GIRARD et al., 2007).
19
De início, o foco de desenvolvimento de vacinas foi direcionado para a
espécie mais virulenta de malária, o P. falciparum. Hoje, P. vivax, apesar de não
ser o mais virulento, é responsável por um grande número de casos, com um
valor estimado de 8.500.000 casos por ano em todo o mundo e, no Brasil, 86%
dos casos de malária são pelo P. vivax, o que reforça a necessidade de estudos
vacinais para ambas a espécies (VERSIANI et al., 2013; SECRETARIA DE
VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2013; WHO, 2016).
Uma vacina para o P. vivax será necessária, não só em populações
endêmicas, mas principalmente naquelas populações onde as taxas de
transmissão são baixas e toda a população é não imune à doença, sendo mais
susceptível a adquiri-la. A vacina ideal é aquela que garante 90% de prevenção
de malária e também impede a sua transmissão. Desenvolver essa vacina ideal é
algo um pouco distante da realidade, mas uma vacina que previna 80% dos
indivíduos de se contaminarem com o plasmódio ou até mesmo uma que não
impeça o indivíduo de ficar doente, mas que corte a transmissão já é uma meta
que pode ser minimamente aceitável (MUELLER et al., 2015).
O desenvolvimento de vacinas para a malária concentra-se principalmente
nos esporozoítos da fase hepática e nos estágios sanguíneos, pois é justamente
com a interrupção desses estágios que ocorrerá a proteção do indivíduo
hospedeiro contra a doença e, consequentemente, impedirá a propagação do
parasito pelo sangue. (SAUERWEIN, 2007; TSUBOI et al., 2003). As vacinas que
focam nesses estágios de vida do parasito baseiam-se nas de estratégias de
bloqueio da infecção e invasão (MAZUMDAR et al., 2010).
Outra e mais nova vertente de estratégia de vacina é a de bloqueio de
transmissão que tem como objetivo impedir a transmissão do parasito entre os
mosquitos vetores. Essa vacina não impede que o indivíduo adquira a doença,
mas corta o ciclo de transmissão para o mosquito, impedindo que haja
transmissão de indivíduos infectados para indivíduos não infectados (ARÉVALO-
HERRERA et al., 2011), como também prevenindo o surgimento de uma re-
emergência de transmissão em áreas onde a completa eliminação já tinha sido
alcançada (MUELLER et al., 2015).
20
Para que uma vacina contra malária seja eficaz, é de extrema importância
que estejam incluídos nela vários tipos de antígenos e, também, alvos para
diferentes estágios de vida do parasito (GIRARD et al., 2007).
1.5.1 Bloqueio da infecção
Por gerarem uma resposta ao anticorpo capaz de neutralizar os
esporozoítos e impedindo-os de invadir os hepatócitos, as vacinas que focam nos
esporozoítos são conhecidas como vacinas de estratégia pré-eritrocítica ou de
bloqueio de infecção. Além dessa neutralização, esse tipo de vacina se propõe a
induzir uma resposta imune mediada por células, que é capaz de interferir na
multiplicação intra-hepática do parasito (GIRARD et al., 2007).
O primeiro estudo de eficácia da vacina contra P. vivax em humanos foi
feito com a proteína 1 de malária vivax (VMP001), uma nova proteína que
incorpora as regiões amino e carboxi terminais da proteína circunsporozoíta
(CSP) e uma região de repetição que contém sequências de repetição das
variantes de P. vivax VK 210 (tipo 1) e VK 247 (tipo 2). De acordo com os
resultados obtidos, essa vacina foi bem tolerada e imunogênica, uma vez que
todos os voluntários geraram satisfatórias respostas imunes humorais e celulares
para o antígeno da vacina. Entretanto, essa vacina não foi capaz de induzir
proteção estéril. Houve apenas um retardo no período pré-patente em 59% dos
indivíduos vacinados e uma associação entre os níveis de anticorpos anti-tipo 1 e
o período pré-patente (BENNETT et al., 2016).
Peptídeos sintéticos derivados da CSP de P. vivax, N (região amino-
terminal), R (região de repetição), C (região carboxi-terminal), tiveram sua
imunogenicidade testada e obteve-se que todas as formulações dos três
peptídeos foram imunogênicas e induziram produção de anticorpos específicos e
de Interferon - gamma (IFN-γ). O peptídeo N induziu uma resposta mais rápida e
consistente que os outros dois e o C foi o que induziu resposta de forma mais
lenta. Quanto à produção de IFN-γ, células de 94% dos indivíduos demonstraram
resposta do IFN-γ em algum ponto durante o estudo, independentemente do
21
peptídeo ou da dose, indicando que a vacina foi capaz de induzir uma resposta
específica mediada por células T na maioria dos participantes (HERRERA et al.,
2005). Estudo realizado com a mistura desses três peptídeos sintéticos formulada
em dois diferentes sistemas adjuvantes lipossomais: Montanide ISA 720 e
Montanide ISA 51 (emulsões de água em óleo) constitui uma vacina imunogênica,
segura, bem tolerada e que não apresentou nenhum relato de reação adversa
severa. Na fase I do teste dessa vacina, foi relatado que houve mais de 90% de
soroconversão e reconhecimento da proteína do esporozoíto pelos anticorpos e
que as regiões R foram mais bem reconhecidas por indivíduos de áreas
endêmicas do que as regiões N e C. Os peptídeos formulados em Montanide ISA
51 produziram um maior reconhecimento das proteínas do esporozoíto e
produção de IFN-γ quando comparadas às formuladas em Montanide ISA 720,
sugerindo que a escolha do adjuvante para a formulação dessa vacina é uma
variável que deve ser levada em conta (HERRERA et al., 2011).
Das vacinas que focam no bloqueio da infecção, a vacina candidata contra
a malária que está em estágio de desenvolvimento mais avançado (fase III) é
contra o P.falciparum. Essa vacina, a RTS,S/AS01, conhecida comercialmente
como MosquirixTM tem como alvo de ação a fase pré-eritrocítica do ciclo do
plasmódio e se baseia nos componentes antigênicos da proteína de superfície do
esporozoíto do P. falciparum (CSP). A RTS,S/AS01 é um antígeno candidato a
uma vacina recombinante, a qual é baseada em uma pseudopartícula, que
consiste em antígenos de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg) e um
fragmento grande de CSP, envolvendo a região central de repetição (R) e a
região C-Terminal da proteína CSP, que contém epítopos T, fundido com o
antígeno de superfície (S) do vírus da hepatite B. A fim de alcançar uma melhor
reatividade celular, essa proteína é formulada em AS01 (sistema adjuvante
lipossomal) (SOUZA, MACHADO e VENTURA, 2015).
Os estudos de eficácia com a vacina RTS,S/AS01 estão em andamento há
mais de cinco anos e embora ainda não seja considerada uma vacina altamente
eficaz, uma vez que não tenha sido observado nenhum resultado com taxas
elevadas de eficácia, os resultados são bastante promissores. Ensaios clínicos da
função biológica dos anticorpos induzidos pelo antígeno RTS,S/AS01, através de
um método que mede a atividade fagocítica mediada por anticorpos anti-CSP em
22
células T auxiliares do tipo 1 (THP-1), demonstraram que houve uma atividade
fagocítica bem robusta e repetitiva. Essa atividade fagocítica teve correlação com
o fragmento inteiro e com a região C-terminal do peptídeo CSP. Esta atividade
fagocítica, expressa como índice de opsonização, foi identificada como um
marcador de proteção induzido pela vacina RTS,S/AS01 e que a especificidade
do anticorpo está ligada a esse índice de opsonização (CHAUDHURY et al.,
2016).
Os primeiros resultados sobre a eficácia e segurança da fase III da
RTS,S/AS01, foram conduzidos durante 18 meses com 6.537 crianças de 6-11
semanas e 8.923 crianças de 5-17 meses em 11 locais de sete países do
continente africano (Burkina Faso, Gabão, Gana, Quênia, Malawi, Moçambique e
Tanzânia), onde há variação da intensidade de transmissão da malária. Foi
observado que a taxa de maior eficácia da vacina ocorreu nas áreas de menor
incidência da malária, o que pode indicar que a imunidade induzida por essa
vacina seja de curta duração (THE RTS,S CLINICAL TRIALS PARTNERSHIP,
2014). Com a primeira etapa desse estudo, pode-se concluir que a vacina em
teste proporcionou proteção contra a malária clínica e grave em crianças
africanas, uma vez que, nos 14 meses após a primeira dose de vacina, a
incidência de primeiros episódios de malária clínica nas primeiras 6000 crianças
de faixa etária mais avançada foi de 0,32 episódios/pessoa, apresentando uma
eficácia de 50,4%. Já a eficácia apresentada pela vacina contra a malária grave
foi de 45,1% (THE RTS,S CLINICAL TRIALS PARTNERSHIP, 2011). Em 2012,
foram publicados resultados da eficácia dessa candidata à vacina contra a malária
em crianças de 6 a 12 semanas. A vacinação foi realizada em conjunto com o
Programa de Imunização Expandido (PIE) em um esquema mensal de três doses.
Observou-se que a vacina RTS,S/AS01 co-administrada com vacinas do PIE
forneceu proteção modesta contra a malária clínica e grave em lactentes jovens
(THE RTS,S CLINICAL TRIALS PARTNERSHIP, 2012).
23
1.5.2 Bloqueio da doença (MSP, AMA-1, DBP)
As vacinas que têm como foco o estágio sanguíneo do parasito, além de
reduzirem essas formas de vida parasitárias, são capazes, também de reduzir a
transmissão. O foco desse tipo de vacina está nos antígenos de estágio
sanguíneo, que podem ser encontrados na superfície dos merozoítos e agem
induzindo respostas imunes que bloqueiam a invasão dos eritrócitos, prevenindo
ou reduzindo episódios clínicos (BOES et al., 2016). As primeiras tentativas de
desenvolvimento de vacina foram a partir da proteína de superfície do merozoíto
(MSP). A maioria dos estudos com proteínas em P. falciparum está voltada para a
MSP-1. Essa proteína de superfície é um importante alvo para o desenvolvimento
da vacina, pois faz uma ligação entre o hospedeiro e o agente patogênico.
Entretanto, outras proteínas de merozoíto são elencadas como potenciais
antígenos candidatos à vacina dentre elas as que fazem parte do processo de
invasão dos eritrócitos (MAZUMDAR et al., 2010).
A Proteína de ligação do antígeno Duffy (PvDBP) liga-se com o receptor de
antígeno Duffy de quimiocinas (DARC) presente em reticulócitos humanos,
facilitando a invasão dessas células por merozoítos do P. vivax. Essa ligação é
propiciada pela região II (PvDBPII) dessa proteína, que é uma região conservada
de 130 kDa e é onde se localiza o recepetor DARC (MUELLER et al., 2015;
SAMPATH et al., 2013). Anticorpos contra a PvDBPII seriam promissores
candidatos a vacinas de estágio sanguíneo, uma vez que o bloqueio do receptor
que promove essa interação oferece um potencial mecanismo de bloqueio de
invasão e, consequentemente, previne o desenvolvimento da malária vivax
(MUELLER et al., 2015).
O plasmódio, uma vez que faz parte do grupo Apicomplexa, possui uma
estrutura denominada complexo apical em determinadas fases da vida, a qual tem
função de fixar e penetrar nas células do hospedeiro, caracterizando o grupo. O
antígeno 1 de membrana apical (AMA-1), proteína de superfície bastante
polimórfica, é expressa durante o estágio assexual sanguíneo do ciclo de vida do
plasmódio, sendo encontrado na membrana do complexo apical do esquizonte de
estágio tardio. (THERA et al., 2016). Esse antígeno tem sido utilizado como alvo
para vacinas contra a malária com o intuito de prevenir que os indivíduos
24
desenvolvam a doença e até mesmo cheguem a óbito, induzindo anticorpos que
são capazes de bloquear a invasão parasitária na célula do hospedeiro. Existem
algumas vacinas que utilizam o AMA-1 como base e que estão em fase clínica de
desenvolvimento. Para o desenvolvimento destas vacinas, foram utilizadas duas
diferentes cepas do P. falciparum, a 3D7 e a FVO (TAKALA et al., 2009).
A PfAMA1-FVO, candidata à vacina contra a malária e que utiliza a cepa
FVO do P. falciparum, testada por Thera e colaboradores (2016), levou à
produção de altos níveis de anticorpos, que foram se elevando gradualmente até
atingir o limiar máximo no 84º após a vacinação. Entretanto, as repostas dos
anticorpos a essa vacina, não se mantiveram e retornaram aos níveis basais após
12 meses de aplicação da vacina. O teste foi realizado em indivíduos adultos que
habitam uma região africana em uma época de intensa transmissão de malária e
apesar de os níveis de anticorpos não terem sido mantidos, essa vacina foi
considerada segura e bem tolerada pelos indivíduos expostos à malária. Um
estudo realizado para verificar a segurança, imunogenicidade e reatogenicidade
da vacina baseada no AMA-1 do clone 3D7 em adultos expostos à malária
sazonal em Mali na África Ocidental, demonstrou que a vacina foi bem tolerada e
altamente imunogênica nestes indivíduos, uma vez que houve uma elevação
significativa de anticorpos anti-AMA-1 com um aumento de 6,4 vezes de
anticorpos nos indivíduos após três imunizações (THERA et al., 2008). Spring e
colaboradores (2009) realizaram a fase I do estudo para avaliar a
imunogenicidade e eficácia da vacina a partir do antígeno recombinante AMA-1,
utilizando a cepa 3D7 do P. falciparum e obtiveram que a vacina em teste reduziu
significativamente a carga parasitária e gerou uma forte imunogenicidade,
permanecendo uma candidata viável à vacina.
Dos antígenos de estágio sanguíneo de Plasmodium candidatos à vacina
de estágio eritrocítico, o MSP1 é um dos mais bem caracterizados, sendo que o
fragmento de 19 kDa da proteína de superfície do merozoíto do P. vivax
(PvMSP1) é considerado um dos mais promissores. A proteína PvMSP-1 contém
seis domínios polimórficos que são envoltos por sequências conservadas inter e
intra-específicas (SEPÚLVEDA et., 2016). Em Fonseca et al (2016), foi descrita
uma proteína recombinante baseada na MSP1, a PvRMC-MSP1. Essa proteína, a
25
qual é uma promissora candidata à vacina de estágio pré-eritrocítico, preservou
os elementos estruturais da PvMSP119 e levou a uma produção de respostas de
anticorpos, células T CD4+ e CD8+ capazes de reconhecer a PvMSP119. O
fragmento MSP119 é produzido a partir da divisão do fragmento C-terminal MSP1-
42kDa em MSP133 e MSP119, quando se inicia a invasão dos eritrócitos pelo
parasito. Uma vez que a função do fragmento MSP119 é permanecer na superfície
da célula enviando sinais ao parasito para que se inicie o desenvolvimento
intracelular, anticorpos contra o MSP1 e em particular contra o fragmento de
19kDa, podem ser capazes de bloquear a invasão do eritrócito e replicação,
protegendo o indivíduo contra a parasitemia (FONSECA et al., 2016). A proteína
quimérica PvRMC-MSP1 é capaz de induzir anticorpos que reconhecem a vacina
recombinante PvMSP19 e, também, a proteína nativa em eritrócitos infectados
pelo P. vivax (FONSECA et al., 2016). Em Sepúlveda et al (2016), foi observada
uma alta soro-prevalência de pacientes, diagnosticados com malária vivax, com
anticorpos contra a PvMSP119 (87,9%), contrastando com a baixa soro
prevalência dos antígenos restantes, os quais representam a região variável da
molécula. A MSP-1 tem sido considerada umas das moléculas mais promissoras
devido aos resultados apresentados, tendo grandes chances de ser incluída numa
vacina contra malária, mas sua grande diversidade alélica é um dos principais
fatores que contribuem para que os resultados não sejam satisfatórios
(SEPÚLVEDA et al., 2016).
Outro estudo com a proteína MSP-1 realizado por Storti-Melo (2011) em
regiões endêmicas maláricas no Brasil para avaliar a resposta imune do anticorpo
naturalmente adquirido ao fragmento N-terminal do P. vivax MSP-1 (Pv200L),
confirmou-se a alta prevalência de indivíduos maláricos da região amazônica
brasileira que desenvolvem anticorpos específicos ao Pv 200L do P. vivax MSP-1,
sendo o Pv200L um fragmento imunogênico da região N-terminal do P. vivax
MSP-1 em indivíduos naturalmente expostos.
26
1.5.3 Bloqueio da transmissão
As estratégias utilizadas para o bloqueio da transmissão têm como objetivo
eliminar o Plasmodium ainda dentro do intestino médio do mosquito ou até
mesmo prevenir a invasão do intestino médio e do epitélio da glândula salivar do
vetor, impedindo, dessa forma, que os mosquitos vetores se infectem e assim
prevenindo a propagação da doença (LAVAZEC e BOURGOUIN, 2008). Para que
o processo de bloqueio de transmissão seja bem sucedido, é necessário que uma
série de fatores tais como os antígenos utilizados como alvo, o tempo de
expressão do antígeno, a concentração do anticorpo e a ativação do
complemento em alguns casos, estejam todos bem determinados (ARÉVALO-
HERRERA et al., 2015).
Essa estratégia de imunidade é realizada através de anticorpos contra
proteínas de superfície dos gametócitos, os quais agem dentro do intestino do
mosquito ao realizar o repasto sanguíneo. É durante esse processo, cerca de 5 a
10 minutos após a ingestão, que os anticorpos agem, levando a não fertilização
ou até mesmo a destruição dos gametas. Em P. falciparum, esses antígenos são
divididos em duas classes. Os antígenos conhecidos como sendo de pré-
fertilização abrangem as maiores proteínas encontradas na superfície dos
gametas. Duas importantes proteínas que fazem parte da família das cisteínas
são Pfs48/45 e Pfs230. Os domínios de cisteína na Pfs48/45 estão relacionados
com a fertilidade do gameta masculino, sendo que essa proteína possui três
desses domínios e a Pfs230 possui 14 domínios de cisteína. Outros antígenos
candidatos para a vacina de bloqueio de transmissão são proteínas de superfície
expressas em zigotos e oocinetos, que são conhecidos como antígenos de pós-
fertilização. As principais proteínas desse grupo são a P25 e P28, que são
responsáveis pela sobrevivência do oocineto no intestino do vetor, pela
penetração no epitélio do inseto e sua transformação em oocisto (TSUBOI et al.,
2003).
Para proteína Pfs48/45 de P. falciparum, o modelo de expressão tem sido
baseado no sistema de Escherichia coli com caudas de histidina utilizadas para a
purificação da mesma (CHOWDHURY et al., 2009; OUTCHKOUROV et al., 2008)
27
e resultados promissores tem sido obtidos nos estudos com a proteína desta
espécie de plasmódio. Entretanto, o elevado número de casos de malária pelo P.
vivax nas Américas e a necessidade de encontrar formas de controle dessa
espécie, tem direcionado esforços para o desenvolvimento de antígenos de
gametócito homólogos no P. vivax. Diante disso, em 2015, Arévalo-Herrera e
colaboradores, descreveram a síntese da proteína Pvs48/45, que está localizada
na superfície do gametócito do P. vivax. Esse antígeno de superfície atua na
fecundação do parasito, representando um alvo potencial para o bloqueio de
transmissão e atividade antiparasitária. Uma avaliação preliminar da
antigenicidade e imunogenicidade mostrou o potencial deste antígeno, uma vez
que 63,3% dos soros humanos testados apresentavam anticorpos naturais anti-
Pvs48/45 (ARÉVALO-HERRERA et al., 2015). A Pvs48/45 foi expressa utilizando
um modelo baseado na tiorredoxina (TRX). O sistema TRX está presente em
todos os organismos, sendo responsável por regular vários processos
bioquímicos dentro da célula, como por exemplo, a manutenção do ambiente
redox celular. A TRX, proteína termoestável, de 12 kDa, que possui duas
cisteínas ativas (NAKAMATSU, 2012), representa uma pequena porção de
qualquer proteína de fusão e que tem tanto a região N, quanto a C-terminal na
superfície molecular, o que significa que estão localizadas em pontos estratégicos
para que a fusão de outras proteínas seja facilitada. A TRX é bastante utilizada
para a purificação de proteínas devido a algumas de suas características. A
estabilidade térmica da molécula de TRX permite que as etapas de tratamento
térmico da purificação ocorram sem que haja prejuízo da proteína. Outra
vantagem do uso da TRX na purificação de proteínas é a sua localização nas
zonas de adesão entre as membranas do envelope celular da E. coli, facilitando a
sua liberação para o exterior da célula, que pode ocorrer com apenas um choque
osmótico ou um passo de congelamento/descongelamento (LAVALLIE, 1993).
A vacina de bloqueio de transmissão (TBV) possui muitas vantagens
quando comparada às vacinas que focam em outros estágios do ciclo de vida do
parasito. O grande problema das vacinas de bloqueio de infecção e invasão, por
exemplo, é o polimorfismo de antígeno ligado à pressão de seleção imune do
hospedeiro humano. O que não acontece na TBV, pois os antígenos utilizados
como alvos têm pouca diversidade na sequência, o que pode ser explicado pelo
28
fato de as proteínas da fase esporogônica não serem sujeitas à pressão seletiva
no hospedeiro humano, como ocorre nos estágios sanguíneos (LAVAZEC e
BOURGOUIN, 2008).
2 JUSTIFICATIVA
Indivíduos que estão frequentemente expostos ao parasito, tem a
capacidade de desenvolver respostas imunes específicas, protegendo-os de
evoluir a uma infecção malárica grave. Além disso, o soro desses indivíduos pode
impossibilitar a fertilização dos gametas, impedindo o desenvolvimento parasitário
e, consequentemente, bloqueando a transmissão desse parasito de pacientes
infectados para os mosquitos. Essa exposição à endemicidade viabiliza uma
vacina de bloqueio de transmissão (ARÉVALO-HERRERA, 2011). Já foi
demonstrado experimentalmente que anticorpos específicos contra antígenos de
Plasmodium expressos em gametócitos podem bloquear a transmissão do
plasmódio do hospedeiro vertebrado para o mosquito vetor (ARÉVALO-
HERRERA, et al., 2005). Apesar de não impedir que o indivíduo adquira a
doença, essa estratégia vacinal interrompe a transmissão de indivíduos infectados
para indivíduos não infectados (ARÉVALO-HERRERA et al., 2011), como também
previne o surgimento de uma re-emergência de transmissão em áreas onde a
completa eliminação já tenha sido alcançada (MUELLER et al., 2015).
Diante disso, a avaliação de potenciais antígenos de gametócitos faz se
necessária para subsidiar os estudos de desenvolvimento de vacinas de bloqueio
de transmissão. A avaliação preliminar da antigenicidade, imunogenicidade e
atividade de bloqueio de transmissão da Pvs48/45 foi previamente realizada em
amostras da Colômbia. Os resultados dessa avaliação mostraram potencial
promissor deste antígeno, uma vez que 63,3% dos soros humanos testados
apresentavam anticorpos naturais anti-Pvs48/45. Entretanto, esta avaliação foi
feita com um número amostral reduzido (30 indivíduos colombianos) e aponta a
necessidade do desenvolvimento de um estudo mais amplo sobre a prevalência
29
de anticorpos naturalmente induzidos em áreas endêmicas para malária, para que
a eficácia dessa proteína no bloqueio da transmissão seja verificada.
Dessa forma, a avaliação da resposta de anticorpos adquiridos contra a
proteína Pvs48/45 em infecções naturais por P. vivax, em área endêmica para a
malária no Brasil, pode fornecer resultados que acrescentem e esclareçam ainda
mais o papel desses anticorpos e a relevância desse antígeno para o
desenvolvimento de vacinas.
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Avaliar a resposta de anticorpos contra a proteína Pvs48/45 adquiridos em
infecções naturais por Plasmodium vivax.
3.2 Objetivos Específicos
Verificar a antigenicidade da proteína Pvs48/45 em indivíduos naturalmente
expostos ao Plasmodium vivax na região amazônica brasileira.
Avaliar a presença de gametócitos e o nível de parasitemia em relação à
resposta imune humoral anti-Pvs48/45.
Determinar a antigenicidadede de 05 subfragmentos (C-Terminal, N-
Terminal, Central, C-Terminal + Central e N-Terminal + Central) da proteína
Pvs48/45.
30
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Objetos de Estudo
Para este estudo, foram incluídas 281 amostras coletadas em sete
diferentes cidades da região amazônica brasileira com intuito de ampliar a
abrangência de amostras para um estudo descritivo de antigenicidade. As
amostras são provenientes de Rio Branco/ Estado do Acre (n= 26, coletadas em
2003), Porto Velho/ Estado de Rondônia (n=26, coletadas em 2003), Belém (n=
25, coletadas em 2003), Goianésia do Pará (n= 20, coletadas em 2012) e Itaituba
(n= 19, coletadas em 2016) no Estado do Pará e nos municípios de Macapá (n=
16, coletadas em 2003) e Oiapoque (n= 150, coletadas em 2015), no Estado do
Amapá (Figura1). Em todos os pontos e esforços de coleta das amostras
utilizadas neste estudo, os pacientes foram selecionados de maneira aleatória
entre os que procuravam espontaneamente um centro de saúde público com
sintomas sugestivos de malária e que apresentaram resultado positivo para gota
espessa (CASSIANO et al., 2016; GOMES et al., 2015; STORTI-MELO et al.,
2011). Os indivíduos diagnosticados por meio da gota espessa foram confirmados
por PCR (reação em cadeia polimerase) (SNOUNOU et al., 1993). A confirmação
diagnóstica foi realizada na Seção de Parasitologia do Instituto Evandro Chagas.
O plasma foi separado e armazenado a -20ºC até o envio para Universidade
Federal de Sergipe.
Foram excluídos indivíduos com infecção concomitante crônica e
infecciosa. Doentes com infecção mista, malária severa ou complicada e
pacientes com relatos de reações a drogas, mulheres grávidas e os indivíduos
que não concordaram com o TCLE.
31
Figura 1: Cidades da região amazônica brasileira onde foram realizadas as coletas. Fontes: Geomapas e IBGE
4.2 Aspectos éticos
As amostras analisadas nesse projeto foram gentilmente cedidas pelo Dr.
Ricardo Luiz Dantas Machado da seção de Parasitologia do Instituto Evandro
Chagas (Anexo A). Este projeto foi submetido para apreciação do Comitê de Ética
da Universidade Federal de Sergipe para solicitar reutilização das amostras e
aprovado sob número 1.774.182. (Anexo B)
32
4.3 Análises Laboratoriais
4.3.1 Avaliação da resposta de anticorpos
As amostras de plasma sanguíneo foram analisadas em parceria com o Dr.
Sócrates Herrera e a Dra. Myrian Arévalo-Herrera do Centro de Investigação
Científica Caucaseco, em Cali, Colômbia. A avaliação de anticorpos naturais foi
realizada por Ensaio de absorção imunoenzimático (ELISA) como descrito em
Arévalo-Herrera et al. (2015), para verificar a presença de anticorpos
naturalmente adquiridos contra a proteína Pvs48/45 e seus cinco sub-fragmentos
(N-Terminal, C-Terminal, Central, N-Terminal + Central e C-Terminal + Central).
Todas as amostras foram analisadas em duplicata. Uma vez que a purificação da
proteína utilizou o sistema de Tiorredoxina, todas as amostras foram também
avaliadas por ELISA quanto à reatividade à tiorredoxina, sendo essa avaliação
realizada em paralelo com a proteína e os subfragmentos. Foram utilizadas
microplacas de 96 poços de fundo plano (Nunc-Immuno Plate, Maxisorp,
Roskilde, Denmark), revestidas com 50µL/poço da proteína recombinante
Pvs48/45 a 1,0µg/ml e incubadas a 4ºC durante a noite. As microplacas foram
lavadas 03 vezes e bloqueadas com 200µL por poço com PBS 1X, contendo
0,05% de Tween20 (PBS-T) e 5% de leite desnatado, durante duas horas à
temperatura ambiente. As amostras de soros foram pré-adsorvidas em 01 mg de
Acetona Powder de E.coli, em uma diluição de 1:10 em PBS1X, Tween 20 0,05%,
leite desnatado 2,5%, com agitação constante durante 30 min e ao final do tempo
de adsorção foram centrifugados a 1300 rpm durante 5 min. Uma alíquota do soro
adsorvido foi retirada para ser diluída a 1:200 em PBS1X, Tween 20 0,05%, leite
desnatado 2,5%. As placas foram lavadas 04 vezes com PBS1X, Tween 20
0,05% e incubadas por uma hora a temperatura ambiente com os soros a serem
avaliados (diluição 1:200), com prévia adsorção em Acetona Powder de E.coli.
Depois do tempo de incubação, as placas foram lavadas 05 vezes com solução
de lavado e adicionados 50µL/poço de conjugado anti-human IgG marcado com
fosfatase alcalina a uma diluição de 1:1000 preparada em solução (PBS1X,
Tween 20 0.05%, leite 2.5%) e incubada novamente por 1h. Por fim, as placas
foram lavadas 06 vezes e reveladas com substrato p-nitrofenil fosfato (p-NPP)
(Sigma, St. Louis, MO) durante 30 min e analisadas em um Espectrofotómetro a
33
uma longitude de onda de 405 nm (ELX800NB Biotek). O ponto de corte foi
estabelecido como sendo três desvios-padrão acima do valor médio de
absorbância dos controles negativos.
4.3.2 Produção da Pvs48/45
Arévalo-Herrera et al. (2015), realizaram primeiramente um alinhamento de
sequência, seguido da harmonização do códon, clonagem, expressão e, por fim, a
purificação para a obtenção da proteína Pvs48/45. Para o alinhamento de
sequência, foi utilizado o site PlasmoDB, que serviu como base de dados para a
obtenção da sequência genética da proteína e os perfis de expressão do genes e
sequências homólogas de P. falciparum (PF3D7_1346700), P. knowlesi
(PKH_120750), P. berghei (PBANKA_135960), P. chabaudi (PCHAS_136420) e
P. yoelii (PYYM_1361700), para a determinação da similaridade entre as
espécies. O passo seguinte, de harmonização do códon, serviu para que a
proteína pudesse ser produzida em E. coli e foi realizado com o auxílio de uma
ferramenta algorítmica no EuGene software v0.92. Os genes sintéticos foram
digeridos por AluI e BamHI e separados por eletroforese em gel de agarose. As
bandas que corresponderam à Pvs48/45 foram inseridas no plasmídeo pET32a e,
em seguida, o vetor de expressão foi purificado. O produto obtido foi transformado
em células de E. coli e plaqueado para que os controles positivos fossem
selecionados.
4.3.3 Titulação das amostras
As amostras que apresentaram uma resposta imune humoral contra a
Pvs48/45 foram tituladas. A titulação foi realizada em diluições seriadas de 1:200,
1:400, 1:800, 1:1600.
34
4.3.4 Interpretação dos Resultados
O resultado de cada amostra foi expresso pelo índice de reatividade (IR).
Este índice foi calculado pela divisão da média dos valores de absorbância de
cada amostra pelo valor do ponto de corte dos controles negativos utilizados
como referência em cada placa. O ponto de corte foi calculado pela soma da
média dos controles negativos com três vezes o desvio-padrão obtido. Dessa
forma as amostras positivas seriam aquelas que apresentaram um IR ≥ 1,0 e
negativas as que apresentarem um IR < 1,0. As amostras que apresentarem um
IR > 10 são consideradas de alta reatividade. As amostras que apresentaram
resultado positivo para a tiorredoxina foram consideradas falso-positivas, por a
mesma estar presente nos organismos, inclusive na E.coli, onde a proteína foi
expressa.
4.3.5 Análises Estatísticas
Foi aplicado o Teste Exato de Fisher no programa Bioestat 5.3 com nível
de significância de 95% para comparação dos índices de parasitemia e presença
de gametócitos com a frequência de resposta imune humoral e verificação da
antigenicidade da proteína Pvs48/45 e de seus subfragmentos.
5 RESULTADOS
5.1 Antigenicidade da proteína Pvs48/45 na Amazônia Brasileira
Das amostras analisadas para a resposta imune humoral contra a proteína
Pvs48/45, 63 (22,42%) amostras apresentaram uma resposta imune humoral
positiva e 20,28% das amostras reagiram também para a tiorredoxina além da
Pvs48/45. Os resultados obtidos para a prevalência das respostas de anticorpos
específicos anti-Pvs48/45, distribuídas por município, estão expressos na figura 2.
35
Os resultados mostram que o perfil de resposta de anticorpos contra o
antígeno Pvs48/45 é variável de uma região para outra. As amostras oriundas do
município de Rio Branco apresentaram o maior percentual de resposta imune
(38,5%) e em nenhuma amostra de indivíduos provenientes de Macapá a proteína
Pvs48/45 apresentou antigenicidade. Os pacientes com malária vivax de Itaituba,
Belém e Goianésia do Pará apresentaram percentuais semelhantes de amostras
com respostas imunes positivas (15,8%; 12,5% e 10,0%, respectivamente).
Figura 2: Distribuição da frequência de resposta imune humoral contra a Pvs48/45 de acordo com o município.
Dentre as 63 amostras positivas para a Pvs48/45, o valor máximo obtido
em índice de reatividade (IR) foi de 5,5 e o mínimo de 1,0 (limiar de reatividade
estimado). Como observado na figura 3, a dispersão dos índices de reatividade
mostra que os mesmos estão distribuídos próximos ao limiar de reatividade entre
1-2, com uma mediana de 1,3 (Média=1,5; SD=0,605).
Apenas uma amostra apresentou um IR > 5 e três apresentaram IR ≥ 2.
Como o IR é um valor que expressa quantas vezes a densidade óptica (DO) da
amostra é maior que o ponto de corte, a maioria apresentou-se pouco reativa.
0.0% 5.0% 10.0% 15.0% 20.0% 25.0% 30.0% 35.0% 40.0%
Rio Branco
Porto Velho
Belém
Goianésia
Itaituba
Macapá
Oiapoque
Frequência
36
Figura 3: Dispersão dos índices de reatividade das amostras em que foram encontradas respostas de anticorpos específicos anti-Pvs48/45.
As amostras que apresentaram uma resposta imune positiva foram tituladas
e a diluição máxima em que continuava sendo obtida uma resposta imune positiva
foi de 1:1600.
5.2 Índices de parasitemia e presença de gametócitos
Para avaliar a relação entre os índices de parasitemia e a presença de
gametócitos frente à resposta de anticorpos contra a Pvs48/45, foi utilizado um
subgrupo de amostras do município do Oiapoque, totalizando 96 amostras, nas
quais foram mensurados os gametócitos na gota espessa e os dados
epidemiológicos estavam completos.
Na tabela 1, pode-se observar que a média de idade dos pacientes era de
27 anos, com uma maior porcentagem de homens com 66,67%. Dentre as 96
amostras analisadas a presença de gametócitos foi observada em 88,3%. Os
dados de parasitemia revelaram uma média de 3.056 V/mm3. As amostras foram
classificadas como sendo presente ou ausente em relação aos gametócitos e a
parasitemia foi avaliada de acordo com o preconizado pelo Ministério da Saúde
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
0 50 100 150 200 250 300
Índ
ice
de
Re
ati
vid
ad
e
Amostras
Cut off
37
no Manual de Diagnóstico Laboratorial da Malária (2015), que considera baixa
parasitemia valores menores que 10.000 parasitos/mm³.
Tabela 1: Dados epidemiológicos das amostras do Oiapoque.
Gênero (%)
Idade (anos)
Parasitemia (V/mm3)
Presença de gametócitos
Feminino Masculino Mínima Média Máxima Mínima Média Máxima
88,3%
33,33 66,67 07 27 79 35 3.056 30.000
Em relação à parasitemia, 28,7% das amostras com baixos índices
parasitêmicos apresentaram resposta imune humoral positiva. Já nas amostras
que apresentaram um índice parasitêmico alto, o percentual de amostras com
resposta de anticorpos positiva foi de 22,2%, (p=0,5099). Esta diferença não foi
significativa, como se pode observar na tabela 2.
Tabela 2: Relação entre a resposta imune humoral e o índice de parasitemia.
RESPOSTA
IMUNE POSITVA
(%)
RESPOSTA
IMUNE
NEGATIVA (%) TOTAL
VALOR DE
P**
ALTA*
PARASITEMIA 2 (22,2%) 7 (77,8%) 9(10,5%)
0,5099 BAIXA*
PARASITEMIA 25 (28,7%) 62 (71,3%) 87 (90,6%)
TOTAL 27 69 96 *Alta parasitemia: ≥ 10.000parasitos/mm³; baixa parasitemia: < 10.000parasitos/mm³. ** Teste Exato de Fisher.
A resposta imune humoral foi avaliada em relação à presença de
gametócitos, sendo que em 25,3% das amostras com presença de gametócitos
apresentaram resposta imune humoral positiva para Pvs48/45. Já nas amostras
em que não foram encontrados gametócitos, o percentual de resposta imune
38
positiva foi de 46,2%, não sendo estatisticamente significativa esta diferença
(p=0,1128) (Tabela 3).
Tabela 3: Relação entre a resposta imune humoral e a presença de gametócitos.
RESPOSTA
IMUNE POSITVA
(%)
RESPOSTA IMUNE NEGATIVA
(%) TOTAL VALOR DE P*
PRESENÇA DE
GAMETÓCITOS 21 (25,3%) 62 (74,7%) 83 (86,5%)
0,1128 AUSÊNCIA DE
GAMETÓCITOS 6 (46,2%) 7 (53,8%) 13 (13,5%)
TOTAL 27 69 96 (100%) * Teste Exato de Fisher
5.3 Reatividade das amostras aos subfragmentos da Pvs48/45
Além da proteína inteira, foram expressos 05 subfragmentos
correspondentes às regiões: N-Terminal, C-Terminal, Central, N-Terminal +
Central e C-Terminal + Central. Um subgrupo da amostra investigado (n= 169),
distribuídas entre as sete áreas endêmicas, foi utilizado para avaliar a prevalência
de anticorpos contra essas regiões específicas da proteína e assim estimar
possíveis localizações de epítopos.
Na tabela 4, pode-se observar que o subfragmento recombinante C-
Terminal + Central foi o que apresentou maior percentual de reatividade (32%;
p=0,0565), apesar de estatisticamente não significativo. A região do peptídeo que
apresentou uma reatividade mais baixa foi a Central, com 17% (p=0,1645) das
amostras.
39
Tabela 4: Percentual de amostras processadas por peptídeo
PEPTÍDEO N RI POSITIVA
N (%) VALOR DE P*
Pvs48/45 281 63 (22,4%)
N-terminal 169 40 (23,7%) 0,4465
C-terminal 169 35 (20,7%) 0,4128
Central 169 29 (17,2%) 0,1645
N-terminal + Central 169 45 (26,6%) 0,2478
C-terminal + Central 169 54 (32,0%) 0,0565
* Teste Exato de Fisher
6 DISCUSSÃO
Diferentes estratégias vacinais que protegem o indivíduo de adquirir e
desenvolver a infecção malárica, utilizando diferentes antígenos do parasito, tem
sido avaliadas (BENNETT et al., 2016; YADAVA & WATERS, 2017). Entretanto,
resultados efetivos ainda não foram alcançados. A estratégia de bloqueio de
transmissão, apesar de não impedir que o indivíduo desenvolva a doença, tem a
capacidade de permitir que indivíduos contaminados, uma vez vacinados, não a
transmitam (ARÉVALO-HERRERA et al., 2015).
Neste estudo foram analisadas 281 amostras de soro de pacientes
maláricos naturalmente expostos da Amazônia brasileira. Destas, 63 (22,42%)
apresentaram uma resposta imune ao antígeno Pvs48/45. Embora a
soroprevalência tenha sido baixa, a confirmação dessa antigenicidade mostra
que há a produção de anticorpos anti-Pvs48/45 pelos indivíduos, após serem
expostos à infecção natural por P.vivax. O fato de esses anticorpos naturais
reconhecerem a proteína recombinante Pvs48/45 evidencia que pelo menos um
epítopo estava presente na proteína recombinante testada. Entretanto, a baixa
prevalência pode ser devido ao sistema de expressão utilizado, o qual se baseia
no modelo da tiorredoxina. O alto percentual de amostras que reagiram também
para a tiorredoxina além da Pvs48/45 (20,28%), fez com que uma considerável
40
parte das amostras tenha sido classificada como falso-positivo, levando a essa
baixa soroprevalência. Por outro lado, deve-se considerar o variável nível de
endemicidade destas regiões (MOURÃO et al., 2014), diferindo do perfil de
transmissão malárica em regiões colombianas (ARÉVALO-HERRERA et al.,
2015). Ademais, o passado malárico destes pacientes investigados na Amazônia
brasileira mostra que 34% eram primo-infectados, comprometendo na resposta a
esta proteína investigada. Por último, a população brasileira é bastante
miscigenada, devido à influência da colonização pelos portugueses, onde houve
cruzamentos que envolveram principalmente os europeus, africanos e americanos
nativos (FURINI et al., 2016), onde polimorfismos de moléculas do sistema imune
podem comprometer sua eficiência (CASSIANO et al., 2015).
De fato, indivíduos que habitam áreas endêmicas estão continuamente
expostos ao Plasmodium, e por manter um contato direto com o parasito, estão
mais propensos a desenvolver uma imunidade clínica, protegendo-os contra o
desenvolvimento de uma malária grave. Esses indivíduos não desenvolvem uma
imunidade estéril, uma vez que essa imunidade não é alcançada sob condições
naturais. Em uma infecção natural, indivíduos podem não apresentar altos títulos
de gametócitos, e embora, os gametócitos de P. vivax sejam encontrados na
maioria das infecções antes do aparecimento das manifestações clínicas
(MUELLER et al.,2015), a proporção em relação aos estágios assexuais não
alcança 10%. Além disso, esses gametócitos permanecem circulando na corrente
sanguínea durante 03 dias no máximo (OLLIARO et al., 2016). Essa talvez seja
outra explicação para o baixo percentual de resposta ao antígeno Pvs48/45
utilizado neste estudo. Nesse sentido, não se pode descartar a possibilidade de
que o antígeno testado seja pouco reconhecido por indivíduos que estão
naturalmente expostos ao plasmódio na região amazônica brasileira. Não
obstante, fica reforçada a importância de avaliar a efetividade dos anticorpos que
estão sendo produzidos por esses indivíduos, com a realização de testes de
imunogenicidade e de bloqueio de transmissão para verificar se essa proteína tem
a capacidade de bloquear o ciclo de vida do plasmódio.
Os resultados evidenciam que a presença ou ausência de gametócitos não
está relacionada com o desenvolvimento de resposta de anticorpos contra a
Pvs48/45 (tabela 3). Isso pode ser devido ao fato de que os gametócitos podem
41
não ter sido encontrados no exame de gota espessa, por estarem presentes em
baixas concentrações (OLLIARO et al., 2016), mas suficientes para garantir o
contato dos indivíduos com essas formas parasitárias. Esses resultados reforçam
a necessidade de maiores investimentos e estudos com o antígeno Pvs48/45
como candidato a uma vacina de bloqueio de transmissão, uma vez que os
anticorpos podem se desenvolver independentemente da presença elevada de
gametócitos na corrente sanguínea. Indivíduos que sofreram mais episódios de
malária apresentam parasitemia mais baixa que aqueles que reportaram menos
episódios maláricos (VÁSQUEZ-JIMÉNEZ et al., 2016). No presente estudo, tanto
os indivíduos com alta e baixa parasitemias, tiveram perfil de resposta de
anticorpos anti-Pvs 48/45 semelhante. Esses resultados podem indicar que a
proteína Pvs48/45 é antigênica em populações naturalmente expostas
independentemente dos baixos índices de parasitemia, comumente observados
em áreas endêmicas. Fato que talvez possa ser sustentado pela presença de
gametócitos logo nos estágio iniciais da infecção por P. vivax, mesmo que em
baixas parasitemias (OLLIARO, et al. 2016).
Ao analisar a antigenicidade do peptídeo recombinante C-terminal acrescido
da porção Central, verificou-se que essa região apresentou maior percentual de
antigenicidade, embora estatisticamente não significativo (32%), quando
comparado com a antigenicidade obtida com o antígeno completo (22,42%).
Estudos com a proteína homóloga Pfs48/45 de P. falciparum tem revelado que os
fragmentos amino-terminal (N-terminal) e carboxi-terminal (C-terminal) podem
induzir respostas de anticorpos capazes de bloquear a transmissão
(OUTCHKOUROV et al., 2008). Estudo com a proteína Pfs48/45 de P. falciparum
tem obtido progressos na identificação de epítopos conformacionais capazes de
induzir anticorpos bloqueadores. Foram identificados dois epítopos (I e II),
localizados na região C-terminal dessa proteína, como alvos altamente eficientes
por conterem domínios cruciais para o desenvolvimento de uma vacina de
bloqueio de transmissão (OUTCHKOUROV et al., 2007). A Pvs48/45 assim como
sua homóloga Pfs48/45 se enquadram no grupo das proteínas que possuem
domínio ricos em cisteína. Como mostrado previamente, os resíduos de cisteína
localizados nas regiões Central e C-terminal da Pfs48/45 são cruciais para a
apresentação dos epítopos que induzem anticorpos bloqueadores. Essa é uma
42
característica essencial para a efetividade de uma vacina de bloqueio de
transmissão (OUTCHKOUROV et al., 2007). Embora a expressão dessas
proteínas, que fazem parte da classe das cisteínas, na sua conformação
adequada tenha sido de extrema complexidade, alguns estudos alcançaram a
expressão de um fragmento da proteína em sua estrutura conformacional correta,
de maneira que o reconhecimento da proteína seja feito de maneira facilitada. O
fragmento C-terminal da proteína Pfs48/45 foi fundido a quatro catalisadores
(DsbA, DsbC, FkpA, e SurA) para a sua expressão e, com isso, foi sintetizada
uma proteína corretamente dobrada, gerando altos títulos de anticorpos
(OUTCHKOUROV et al., 2008). Essa pode representar uma estratégia para novos
estudos de expressão com a Pvs48/45, ou especificamente seu subfragmento C-
terminal, para futuros ensaios experimentais de imunogenicidade.
Finalmente, é de extrema importância conduzir estudos de eficácia adicionais
para determinar se os resultados obtidos até agora estão no caminho certo ou se
uma correção de curso é necessária. O sucesso de uma vacina contra P. vivax
pode ainda demorar, mas investimentos são necessários, visto que este parasito
da malária ainda negligenciado está difundido nas Américas e relatos de maiores
complicações clínicas começam a surgir (ALHO et al., 2017; DEMISSIE e
KETEMA, 2016; GELETA e KETEMA, 2016; GUPTA et al., 2016).
7 CONCLUSÃO E CONSIDERAÇÕES FINAIS
A proteína recombinante Pvs48/45 apresentou uma baixa resposta de
anticorpos naturalmente induzidos em indivíduos da Amazônia brasileira.
Apesar disso, os baixos índices de parasitemia observados na área endêmica
estudada não influenciaram o reconhecimento antigênico desta proteína.
A ausência de gametócitos circulantes identificados por microscopia também
não representa um fator limitante ao desenvolvimento de resposta de anticorpos
contra a Pvs48/45.
43
A otimização de estudos com utilização de um fragmento isolado pode gerar
resultados mais efetivos para o entendimento do potencial imunogênico deste
antígeno e do potencial dos epítopos localizados nessas regiões em induzir
anticorpos bloqueadores.
E, por fim, os modelos utilizados na expressão e purificação da proteína
devem ser levados em consideração, uma vez que essa parte do processo possa
estar interferindo nos dados de antigenicidade obtidos. Espera-se que os
resultados desse estudo possam ter contribuições significativas para o
desenvolvimento de uma vacina de bloqueio de transmissão eficiente contra a
proteína Pvs48/45 em ensaios futuros.
44
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ANEXO A
Declaração de doação das amostras
55
ANEXO B
Parecer Consubstanciado do CEP
56
APÊNDICE A
Artigo a ser submetido ao periódico Acta Tropica, ISSN: 0001-706X
Avaliação da Resposta Imune Humoral Anti-Pvs48/45 em Infecções Naturais por Plasmodium vivax da Amazônia
Brasileira
Tatiana M. S. Cisne Pessoa1; Myrela C. Santos de Jesus1 Rubens Alex de Oliveira Menezes2; Ricardo L. D. Machado3; Sócrates Herrera4; Luciane M.
Storti-Melo1
1Programa de Pós Graduação em Biologia Parasitária, Universidade Federal de Sergipe (UFS),
49100-000, São Cristóvão, SE, Brasil. 2Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes
Infecciosos e Parasitários da Universidade Federal do Pará; 3
Instituto Evandro Chagas/Serviço de
Vigilância em Saúde/Ministério da Saúde (IEC), Belém, PA, Brasil. 4Centro de Investigação
Científica Caucaseco, Cali, Colômbia
Resumo
A malária continua sendo responsável por grande morbidade e mortalidade em muitos países tropicais e subtropicais. Indivíduos que estão frequentemente expostos ao parasito da malária em áreas endêmicas desenvolvem respostas imunes específicas, levando a uma redução da carga parasitária e das manifestações clínicas. O soro desses indivíduos pode impossibilitar a fertilização dos gametas nos mosquitos, bloqueando a transmissão desse parasito para o vetor. A proteína Pvs48/45 é encontrada na superfície dos gametócitos e utilizada como alvo dos anticorpos viabilizando essa estratégia de uma vacina de bloqueio de transmissão. O objetivo desse estudo foi avaliar a resposta de anticorpos naturalmente adquirida em infecções por Plasmodium vivax contra a proteína Pvs48/45. A pesquisa de anticorpos IgG anti-Pvs48/45 foi realizada por ELISA no soro de 281 amostras de pacientes maláricos residentes na região amazônica brasileira. O ponto de corte foi estabelecido utilizando soro de voluntários que nunca tiveram contato com o plasmódio, estabelecendo a média da densidade óptica (DO) mais três desvios padrão. Dos 281soros analisados, em 22,4% foram encontradas respostas de anticorpos específicos anti-Pvs48/45 e os índices de parasitemia e a presença de gametócitos não influenciaram o reconhecimento antigênico desta proteína. Dentre os cinco subfragmentos analisados, a região recombinante C-Terminal + Central da Pvs48/45 foi a que apresentou maior reconhecimento antigênico na amostra em estudo (32%), apesar de não ser estatisticamente significativo. Estudos com a utilização de uma região isolada da proteína podem facilitar o entendimento do potencial imunogênico desse
57
antígeno. Esse estudo visa contribuir para o desenvolvimento de uma vacina de bloqueio de transmissão eficiente contra a proteína Pvs48/45 em ensaios futuros.
Palavras-chave: Pvs48/45; vacina; resposta imune; Malária.
Introdução
O Plasmodium vivax e os vetores envolvidos no ciclo biológico da malária têm várias características distintas que permitem a transmissão deste parasito, tanto em climas temperados como em áreas tropicais (VALLEJO et al., 2016). No entanto, nenhuma delas é tão particular como a capacidade desta espécie de plasmódio formar hipnozoítos, os quais reativam periodicamente e podem causar múltiplos episódios de malária e, que pode ser responsável por até 80% dos episódios clínicos (HOWES et al., 2016). Do número de casos de malária nas Américas, a América do Sul é responsável pela grande parte dos casos. Destes, 70% são do Brasil, onde aproximadamente 99% da transmissão da malária concentra-se na Região Amazônica, sendo que o P. vivax tem sido a espécie mais prevalente, responsável por aproximadamente 84% dos casos nesta região (GOMES et al., 2016; DOTRÁRIO et al., 2016). A manutenção do número de casos de malária, juntamente com o rápido desenvolvimento do P. vivax nos mosquitos vetores (OLLIARO et al., 2016) e o controle dificultado por métodos tradicionais em regiões endêmicas, tem mostrado a importância da identificação de técnicas efetivas e economicamente viáveis, que possam interromper a transmissão de malária em regiões endêmicas (MUELLER et al., 2015).
Indivíduos que estão frequentemente expostos ao parasito, tem a capacidade de desenvolver respostas imunes específicas, protegendo-os de evoluir a uma infecção malárica grave. Além disso, o soro desses indivíduos pode impossibilitar a fertilização dos gametas, impedindo o desenvolvimento parasitário e, consequentemente, bloqueando a transmissão desse parasito de pacientes infectados para os mosquitos (GREENWOD, et al., 2008). Essa exposição à endemicidade viabiliza uma vacina de bloqueio de transmissão (ARÉVALO-HERRERA, 2011). Já foi demonstrado experimentalmente que anticorpos específicos contra antígenos de Plasmodium expressos em gametócitos podem bloquear a transmissão do plasmódio do hospedeiro vertebrado para o mosquito vetor (ARÉVALO-HERRERA, et al., 2005). Apesar de não impedir que o indivíduo adquira a doença, essa estratégia vacinal interrompe a transmissão de indivíduos infectados para indivíduos não infectados (ARÉVALO-HERRERA et al., 2011; TSUBOI et al., 2003), como também previne o surgimento de uma re-emergência de transmissão em áreas onde a completa eliminação já tenha sido alcançada (MUELLER et al., 2015).
A proteína Pvs48/45 está localizada na superfície do gametócito do P.
vivax e atua na fecundação do parasito, representando um alvo potencial para o
58
bloqueio de transmissão e atividade anti-parasitária (ARÉVALO-HERRERA et al.,2015). Sua síntese foi descrita recentemente e a avaliação preliminar das suas propriedades imunológicas, como antigenicidade, imunogenicidade e atividade de bloqueio de transmissão foi realizada pela primeira vez em amostras de pacientes com malária vivax da Colômbia. Entretanto, esta investigação aponta a necessidade de avaliação mais ampla em áreas endêmicas para malária, para que a eficácia dessa proteína no bloqueio da transmissão seja verificada. Dessa forma, a estimativa da resposta de anticorpos adquiridos contra a proteína Pvs48/45 em infecções naturais por P. vivax, em área endêmica no Brasil, pode fornecer resultados que acrescentem e esclareçam ainda mais o papel desses anticorpos e a relevância desse antígeno para o desenvolvimento de vacinas.
Esta proteína, juntamente com os antígenos de pós-fertilização Pvs25 e Pvs28, apresentam uma sequência de polimorfismos altamente limitada e uma baixa diversidade de nucleotídeos, quando comparados aos antígenos de estágio sanguíneo (KANG et al., 2013). Essas características dão suporte ao potencial promissor desse antígeno no desenvolvimento de uma nova estratégia de vacina. Apresentamos aqui, pela primeira vez, a resposta imune humoral à proteína Pvs48/45, em amostras de pacientes maláricos da região Amazônica brasileira.
Materiais e métodos
Objetos de Estudo
Para este estudo, foram incluídas 281 amostras coletadas em sete diferentes cidades da região amazônica brasileira com intuito de ampliar a abrangência de amostras para um estudo descritivo de antigenicidade. As amostras são provenientes de Rio Branco/ Estado do Acre (n= 26, coletadas em 2003), Porto Velho/ Estado de Rondônia (n=26, coletadas em 2003), Belém (n= 25, coletadas em 2003), Goianésia do Pará (n= 20, coletadas em 2012) e Itaituba (n= 19, coletadas em 2016) no Estado do Pará e nos municípios de Macapá (n= 16, coletadas em 2003) e Oiapoque (n= 150, coletadas em 2015), no Estado do Amapá (Figura1). Em todos os pontos e esforços de coleta das amostras utilizadas neste estudo, os pacientes foram selecionados de maneira aleatória entre os que procuravam espontaneamente um centro de saúde público com sintomas sugestivos de malária e que apresentaram resultado positivo para gota espessa e confirmados como malária vivax por diagnóstico molecular (CASSIANO et al., 2016; GOMES et al., 2015; STORTI-MELO et al., 2011).
59
Figura 1: Cidades da região amazônica brasileira onde foram realizadas as coletas. Fonte: Geomapas e IBGE
Aspectos Éticos
Este projeto foi submetido para apreciação do Comitê de Ética da Universidade Federal de Sergipe para solicitar reutilização das amostras e aprovado sob número 1.774.182.
Análises Laboratoriais
As amostras de plasma sanguíneo foram analisadas no Centro de Investigação Científica Caucaseco, em Cali, Colômbia. A avaliação de anticorpos naturalmente adquiridos contra a proteína Pvs48/45 e seus cinco sub-fragmentos (N-Terminal, C-Terminal, Central, N-Terminal + Central e C-Terminal + Central) foi realizada por Ensaio de absorção imunoenzimático (ELISA) como descrito em Arévalo-Herrera et al. (2015). Todas as amostras foram analisadas em duplicata. Uma vez que a purificação da proteína utilizou o sistema de Tiorredoxina, todas as amostras foram também avaliadas por ELISA quanto à reatividade à
60
tiorredoxina, sendo essa avaliação realizada em paralelo com a proteína e os subfragmentos.
Titulação das amostras
As amostras que apresentaram uma resposta imune humoral contra a Pvs48/45 foram tituladas. A titulação foi realizada em diluições seriadas de 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600.
Interpretação dos Resultados
O resultado de cada amostra foi expresso pelo índice de reatividade (IR). Este índice foi calculado pela divisão da média dos valores de absorbância de cada amostra pelo valor do ponto de corte dos controles negativos utilizados como referência em cada placa. O ponto de corte foi calculado pela soma da média dos controles negativos com três vezes o desvio-padrão obtido. Dessa forma as amostras positivas seriam aquelas que apresentaram um IR ≥ 1,0 e negativas as que apresentarem um IR < 1,0. As amostras que apresentaram resultado positivo para a tiorredoxina foram consideradas falso-positivas, por a mesma estar presente nos organismos, inclusive na E.coli, onde a proteína foi expressa, como descrito em Arévalo-Herrera (2015).
Análises Estatísticas
Foi aplicado o Teste Exato de Fisher no programa Bioestat 5.3 com nível de significância de 95% para comparação dos índices de parasitemia e presença de gametócitos com a frequência de resposta imune humoral e verificação da antigenicidade da proteína Pvs48/45 e de seus subfragmentos.
Resultados
Antigenicidade da proteína Pvs48/45 na Amazônia brasileira
Das amostras analisadas para a resposta imune humoral contra a proteína Pvs48/45, 63 (22,42%) amostras apresentaram uma resposta imune humoral positiva (Figura 2) e 20,28% das amostras reagiram também para a tiorredoxina além da Pvs48/45.
Os resultados mostram que o perfil de resposta de anticorpos contra o antígeno Pvs48/45 é variável de uma região para outra. As amostras provenientes
61
do município de Rio Branco apresentaram um maior percentual de resposta imune positiva (38,5%) e em nenhuma amostra de indivíduos provenientes de Macapá a proteína Pvs48/45 apresentou antigenicidade. Os pacientes com malária vivax de Itaituba, Belém e Goianésia do Pará apresentaram percentuais semelhantes de amostras com respostas imunes positivas (15,8%; 12,5% e 10,0%, respectivamente).
Figura 2: Distribuição da frequência de resposta imune humoral contra a Pvs48/45 de acordo com o município.
Dentre as 63 amostras positivas para a Pvs48/45, o valor máximo obtido em índice de reatividade (IR) foi de 5,5 e o mínimo de 1,0 (limiar de reatividade estimado). A dispersão dos índices de reatividade (Figura 3) mostra que os mesmos estão distribuídos próximos ao limiar de reatividade entre 1-2, com uma mediana de 1,3 (Média=1,5; SD=0,605).
Apenas uma amostra apresentou um IR > 5 e três apresentaram IR ≥ 2. Como o IR é um valor que expressa quantas vezes a densidade óptica (DO) da amostra é maior que o ponto de corte, a maioria apresentou-se pouco reativa.
As amostras que apresentaram uma resposta imune positiva foram tituladas e a diluição máxima em que continuava sendo obtida uma resposta imune positiva foi de 1:1600.
0.0% 5.0% 10.0% 15.0% 20.0% 25.0% 30.0% 35.0% 40.0%
Rio Branco
Porto Velho
Belém
Goianésia
Itaituba
Macapá
Oiapoque
Frequência
62
Figura 3: Dispersão dos índices de reatividade das amostras em que foram encontradas respostas de anticorpos específicos anti-Pvs48/45.
Índices de parasitemia e presença de gametócitos
Para avaliar a relação entre os índices de parasitemia e a presença de gametócitos frente à resposta de anticorpos contra a Pvs48/45, foram utilizadas somente as amostras do município do Oiapoque, pois foram mensurados os gametócitos na gota espessa.
Os dados de parasitemia revelaram uma média de 3.056 parasitos/mm3. As amostras foram classificadas como sendo presente ou ausente em relação aos gametócitos e a parasitemia foi avaliada de acordo com o preconizado pelo Ministério da Saúde no Manual de Diagnóstico Laboratorial da Malária (2015), que considera baixa parasitemia valores menores que 10.000 parasitos/mm³. As amostras apresentaram 28,7% com baixa parasitemia e resposta imune humoral positiva. Já nas amostras que apresentaram altas parasitemias, a resposta de anticorpos positiva foi de 22,2%, (p=0,5099). Esta diferença não foi significativa (Tabela 1). Os resultados mostram que em 25,3% das amostras com presença de gametócitos a resposta imune humoral positiva para Pvs48/45. Já nas amostras em que não foram encontrados gametócitos, o percentual de resposta imune positiva foi de 46,2%, não sendo estatisticamente significativa esta diferença (p=0,1128) (Tabela 1).
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
0 50 100 150 200 250 300
Índ
ice
de
Re
ati
vid
ad
e
Amostras
Cut off
63
Tabela 1: Relação entre a resposta imune humoral e o índice de parasitemia.
RESPOSTA
IMUNE POSITVA
(%)
RESPOSTA
IMUNE
NEGATIVA (%) TOTAL
VALOR
DE P**
ALTA*
PARASITEMIA 2 (22,2%) 7 (77,8%) 9(10,5%)
0,5099 BAIXA*
PARASITEMIA 25 (28,7%) 62 (71,3%) 87 (90,6%)
TOTAL 27 69 96
PRESENÇA DE
GAMETÓCITOS 21 (25,3%) 62 (74,7%) 83 (86,5%)
0,1128 AUSÊNCIA DE
GAMETÓCITOS 6 (46,2%) 7 (53,8%) 13 (13,5%)
TOTAL 27 69 96 (100%) *Alta parasitemia: ≥ 10.000 parasitos/mm³; baixa parasitemia: < 10.000 parasitos/mm³. ** Teste Exato de Fisher.
Reatividade das amostras aos subfragmentos da Pvs48/45
Além da proteína inteira, foram expressos 05 subfragmentos correspondentes às regiões: N-Terminal, C-Terminal, Central, N-Terminal + Central e C-Terminal + Central. Um subgrupo da amostra investigado (n= 169), distribuídas entre as sete áreas endêmicas, foi utilizado para avaliar a prevalência de anticorpos contra essas regiões específicas da proteína e assim estimar possíveis localizações de epítopos.
Na tabela 2, pode-se observar que o subfragmento recombinante C-Terminal + Central foi o que apresentou um maior percentual de reatividade (32%; p=0,0565), embora não significativo estatisticamente. A região do peptídeo que apresentou uma reatividade mais baixa foi a Central, com 17% (p=0,1645) das amostras.
64
Tabela 2: Percentual de amostras processadas por peptídeo
PEPTÍDEO N RI POSITIVA
N (%) VALOR DE P*
Pvs48/45 281 63 (22,4%)
N-terminal 169 40 (23,7%) 0,4465
C-terminal 169 35 (20,7%) 0,4128
Central 169 29 (17,2%) 0,1645
N-terminal + Central 169 45 (26,6%) 0,2478
C-terminal + Central 169 54 (32,0%) 0,0565
* Teste Exato de Fisher
Discussão
Diferentes estratégias vacinais que protegem o indivíduo de adquirir e desenvolver a infecção malárica, utilizando diferentes antígenos do parasito, tem sido avaliadas (BENNETT et al., 2016; YADAVA & WATERS, 2017). Entretanto, resultados efetivos ainda não foram alcançados. A estratégia de bloqueio de transmissão, apesar de não impedir que o indivíduo desenvolva a doença, tem a capacidade de permitir que indivíduos infectados, uma vez vacinados, não a transmitam (ARÉVALO-HERRERA et al., 2015).
Neste estudo foram analisadas 281 amostras de soro de pacientes maláricos naturalmente expostos da Amazônia brasileira. Destas, 63 (22,42%) apresentaram uma resposta imune ao antígeno Pvs48/45. Embora a soroprevalência tenha sido baixa, a confirmação dessa antigenicidade mostra que há a produção de anticorpos anti-Pvs48/45 pelos indivíduos, após serem expostos à infecção natural por P.vivax. O fato de esses anticorpos naturais reconhecerem a proteína recombinante Pvs48/45 evidencia que pelo menos um epítopo estava presente na proteína recombinante testada. Entretanto, a baixa prevalência pode ser devido ao sistema de expressão utilizado, o qual se baseia no modelo da tiorredoxina. O alto percentual de amostras que reagiram também para a tiorredoxina além da Pvs48/45 (20,28%), fez com que uma considerável parte das amostras tenha sido classificada como falso-positivo, levando a essa baixa soroprevalência. Por outro lado, deve-se considerar o variável nível de endemicidade destas regiões (MOURÃO et al., 2014), diferindo do perfil de transmissão malárica em regiões colombianas (ARÉVALO-HERRERA et al., 2015). Ademais, o passado malárico destes pacientes investigados na Amazônia brasileira mostra que 34% eram primo-infectados, comprometendo na resposta a esta proteína investigada. Por último, a população brasileira é bastante miscigenada, devido à influência da colonização pelos portugueses, onde houve
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cruzamentos que envolveram principalmente os europeus, africanos e americanos nativos (FURINI et al., 2016), onde polimorfismos de moléculas do sistema imune podem comprometer sua eficiência (CASSIANO et al., 2015). A baixa titulação obtida é mais uma comprovação da baixa reatividade da Pvs48/45 em amostras de indivíduos infectados da Amazônia brasileira. Em estudo realizado na região Amazônica brasileira por Storti-Melo e colaboradores (2011), com outra proteína de P. vivax (Pv 200L – fragmento da P. vivax MSP- 1), obteve-se que dentre as cidades que estavam em estudo, Macapá foi a que mostrou a frequência e níveis de anticorpos mais baixos, o que se assemelha com o presente estudo, uma vez que nenhuma amostra proveniente de Macapá apresentou resposta imune contra a Pvs48/45. Isso possivelmente pode ser explicado pelo fato de que Macapá apresentou um baixo índice de parasitemia anual (6.0 em 2009), justificando essa ausência de resposta imune.
De fato, indivíduos que habitam áreas endêmicas estão continuamente expostos ao Plasmodium, e por manter um contato direto com o parasito, estão mais propensos a desenvolver uma imunidade clínica, protegendo-os contra o desenvolvimento de uma malária grave. Esses indivíduos não desenvolvem uma imunidade estéril, uma vez que essa imunidade não é alcançada sob condições naturais. Em uma infecção natural, indivíduos podem não apresentar altos títulos de gametócitos, e embora, os gametócitos de P. vivax sejam encontrados na maioria das infecções antes do aparecimento das manifestações clínicas (MUELLER et al.,2015), a proporção em relação aos estágios assexuais não alcança 10%. Além disso, esses gametócitos permanecem circulando na corrente sanguínea durante 03 dias no máximo (OLLIARO et al., 2016). Essa talvez seja outra explicação para o baixo percentual de resposta ao antígeno Pvs48/45 utilizado neste estudo. Nesse sentido, não se pode descartar a possibilidade de que o antígeno testado seja pouco reconhecido por indivíduos que estão naturalmente expostos ao plasmódio na região amazônica brasileira. Não obstante, fica reforçada a importância de avaliar a efetividade dos anticorpos que estão sendo produzidos por esses indivíduos, com a realização de testes de imunogenicidade e de bloqueio de transmissão para verificar se esse antígeno tem a capacidade de bloquear o ciclo de vida do plasmódio.
Os resultados evidenciam que a presença ou ausência de gametócitos não está relacionada com o desenvolvimento de resposta de anticorpos contra a Pvs48/45 (tabela 3). Isso pode ser devido ao fato de que os gametócitos podem não ter sido encontrados no exame de gota espessa, por estarem presentes em baixas concentrações (OLLIARO et al., 2016), mas suficientes para garantir o contato dos indivíduos com essas formas parasitárias. Esses resultados reforçam a necessidade de maiores investimentos e estudos com o antígeno Pvs48/45 como candidato a uma vacina de bloqueio de transmissão, uma vez que os anticorpos podem se desenvolver independentemente da presença elevada de gametócitos na corrente sanguínea. Indivíduos que sofreram mais episódios de
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malária apresentam parasitemia mais baixa que aqueles que reportaram menos episódios maláricos (VÁSQUEZ-JIMÉNEZ et al., 2016). No presente estudo, tanto os indivíduos com alta e baixa parasitemias, tiveram perfil de resposta de anticorpos anti-Pvs 48/45 semelhante. Esses resultados podem indicar que a proteína Pvs48/45 é antigênica em populações naturalmente expostas independentemente dos baixos índices de parasitemia, comumente observados em áreas endêmicas. Fato que talvez possa ser sustentado pela presença de gametócitos logo nos estágio iniciais da infecção por P. vivax, mesmo que em baixas parasitemias (OLLIARO et al., 2016).
Ao analisar a antigenicidade do peptídeo recombinante C-terminal acrescido da porção Central, verificou-se que essa região apresentou maior percentual de antigenicidade, embora estatisticamente não significativo (32%), quando comparado com a antigenicidade obtida com o antígeno completo (22,42%). Estudos com a proteína homóloga Pfs48/45 de P. falciparum tem revelado que os fragmentos amino-terminal (N-terminal) e carboxi-terminal (C-terminal) podem induzir respostas de anticorpos capazes de bloquear a transmissão (OUTCHKOUROV et al., 2008). Estudo com a proteína Pfs48/45 de P. falciparum tem obtido progressos na identificação de epítopos conformacionais capazes de induzir anticorpos bloqueadores. Foram identificados dois epítopos (I e II), localizados na região C-terminal dessa proteína, como alvos altamente eficientes por conterem domínios cruciais para o desenvolvimento de uma vacina de bloqueio de transmissão (OUTCHKOUROV et al., 2007). A Pvs48/45 assim como sua homóloga Pfs48/45 se enquadram no grupo das proteínas que possuem domínio ricos em cisteína. Como mostrado previamente, os resíduos de cisteína localizados nas regiões Central e C-terminal da Pfs48/45 são cruciais para a apresentação dos epítopos que induzem anticorpos bloqueadores. Essa é uma característica essencial para a efetividade de uma vacina de bloqueio de transmissão (OUTCHKOUROV et al., 2007). Embora a expressão dessas proteínas, que fazem parte da classe das cisteínas, na sua conformação adequada tenha sido de extrema complexidade, alguns estudos alcançaram a expressão de um fragmento da proteína em sua estrutura conformacional correta, de maneira que o reconhecimento da proteína seja feito de maneira facilitada. O fragmento C-terminal da proteína Pfs48/45 foi fundido a quatro catalisadores (DsbA, DsbC, FkpA, e SurA) para a sua expressão e, com isso, foi sintetizada uma proteína corretamente dobrada, gerando altos títulos de anticorpos (OUTCHKOUROV et al., 2008). Essa pode representar uma estratégia para novos estudos de expressão com a Pvs48/45, ou especificamente seu subfragmento C-terminal, para futuros ensaios experimentais de imunogenicidade.
Finalmente, é de extrema importância conduzir estudos de eficácia adicionais para determinar se os resultados obtidos até agora estão no caminho certo ou se uma correção de curso é necessária. O sucesso de uma vacina contra P. vivax pode ainda demorar, mas investimentos são necessários, visto que este
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parasito da malária ainda negligenciado está difundido nas Américas e relatos de maiores complicações clínicas começam a surgir (ALHO et al., 2017; DEMISSIE e KETEMA, 2016; GELETA e KETEMA, 2016; GUPTA et al., 2016).
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