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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA
SELEÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PEPTÍDEOS
RECOMBINANTES MIMÉTICOS DE ANTÍGENOS DO VÍRUS DA DENGUE POR “PHAGE DISPLAY”
Aluna: Paula de Souza Santos Orientador: Dr. Luiz Ricardo Goulart Filho
UBERLÂNDIA - MG 2006
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA
SELEÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PEPTÍDEOS
RECOMBINANTES MIMÉTICOS DE ANTÍGENOS DO VÍRUS DA DENGUE POR “PHAGE DISPLAY”
Aluna: Paula de Souza Santos Orientador: Dr. Luiz Ricardo Goulart Filho
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Uberlândia como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Genética e Bioquímica (Área Genética)
UBERLÂNDIA - MG 2006
iii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA
SELEÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PEPTÍDEOS RECOMBINANTES MIMÉTICOS DE ANTÍGENOS DO VÍRUS DA
DENGUE POR “PHAGE DISPLAY” Aluna: Paula de Souza Santos
COMISSÃO EXAMINADORA Presidente: Dr. Luiz Ricardo Goulart (Orientador) Examinadores: Dra. Andréa Thompsom da Poian Dr. Guilherme Oliveira Data da Defesa: 18 / 04 / 2006 As sugestões da Comissão Examinadora e as Normas PGGB para o formato da Dissertação foram contempladas
_____________________________ Dr. Luiz Ricardo Goulart
iv
“Pensar apenas ou desejar simplesmente, nunca levou ninguém a lugar nenhum. É
necessário também ação. Não há mal que sempre dure, nem bem que nunca termine.
Lamentar uma dor passada no presente é criar outro sofrimento novamente”
Antônio Carlos dos Santos
v
Dedico essa dissertação ao meu
querido pai, Antônio Carlos, pelo
amor e incentivo a mim sempre dados.
vi
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Antônio Carlos e Marlene, que iluminaram o caminho de minha
vida, e pela sólida formação que me foi dada, proporcionando a continuidade nos estudos
até a chegada a este mestrado.
À minha filha, Isabela, que traz tanta luz e gosto para minha vida, um amor
especial. Você é a lição mais profunda que vivi de amor...
Ao meu companheiro, Christian, pelo carinho e amor dedicados em todos os
momentos.
Às minhas irmãs, Carla e Roberta, pelo convívio afetivo.
Ao Luiz Ricardo, na qualidade de amigo e orientador, por sua disponibilidade,
ensinamentos e apoio, bem como o imenso carinho nos momentos de dificuldade e de dor.
Aos amigos do grupo Phage, Ana Paula, Juliana, Andréa, Renata, Guilherme,
Carlos, Rone e Fausto, que ajudaram com importantes trocas de informações, e também
nos cuidados com os animais utilizados no estudo. Em especial, à Ana Paula, Juliana, pela
amizade sempre presente.
Às amigas do laboratório, Paula e Karla, por estarem sempre ao meu lado em
momentos de dificuldades.
À todos os colegas do laboratório, que tornaram o ambiente de trabalho mais
agradável.
À professora Divina do Departamento de Virologia, pela ajuda na obtenção de
amostras e também nas informações sobre o assunto.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa, CNPq, pelo apoio financeiro durante a
realização deste trabalho.
E a todos que me incentivaram e, de alguma forma, contribuíram para realização
deste trabalho.
vii
ÍNDICE
Lista de Abreviaturas...............................................................................................ix
Lista de Abreviaturas dos Aminoácidos..................................................................xii
Lista de Tabelas.....................................................................................................xiii
Lista de Figuras......................................................................................................xiv
Resumo Geral...........................................................................................................1
Introdução Geral.......................................................................................................2
• Dengue..........................................................................................................3
- Epidemiologia..............................................................................................3
- Aspecto clínico e diagnóstico da doença.....................................................6
- Controle do vetor.........................................................................................8
- Caracterização estrutural e molecular do vírus...........................................9
- Caracterização antigênica do vírus............................................................15
• “Phage Display” ..........................................................................................18
Objetivos.................................................................................................................23
Referências Bibliográficas......................................................................................24
Capítulo Único........................................................................................................33
Resumo..................................................................................................................34
Abstract...................................................................................................................35
Introdução...............................................................................................................36
Material e Métodos.................................................................................................38
• Antígenos.....................................................................................................38
• Aves.............................................................................................................38
• Imunização...................................................................................................38
• Purificação e concentração dos anticorpos.................................................39
• Teste ELISA para confirmar a especificidade de IgY..................................40
• Biopannig – Seleção de peptídeos..............................................................40
• Amplificação de colônias de fagos em Deepwell.........................................42
• ELISA Pré-Sequenciamento........................................................................42
• Extração de DNA.........................................................................................43
• Seqüenciamento de DNA............................................................................44
viii
• Análise dos dados por bioinformática..........................................................44
• Teste ELISA dos clones contra soro humano específico............................45
Resultados e Discussão.........................................................................................47
• Antígenos.....................................................................................................47
• Aves.............................................................................................................47
• Purificação e concentração dos anticorpos.................................................47
• Teste ELISA para confirmar a especificidade de IgY..................................49
• Biopannig – Seleção de peptídeos..............................................................49
• ELISA Pré-Sequenciamento........................................................................51
• Seqüenciamento de DNA e Bioinformática..................................................51
• Teste ELISA dos clones contra soro humano específico............................65
Conclusões.............................................................................................................67
Referências Bibliográficas......................................................................................68
Anexo 1...................................................................................................................75
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
Å Angstrom
°C Graus Celsius
� Número provável de clones independentes na biblioteca
µg Microgramas
µL Microlitros
aa Aminoácido
AT Amplitude taxonômica
BSA Soroalbumina bovina
C Proteína estrutural do capsídeo
cryoEM Cryo-eletromicroscopia
DC Dengue clássica
DENV Vírus da dengue
DENV-1 Vírus da dengue tipo 1
DENV-2 Vírus da dengue tipo 2
DENV-3 Vírus da dengue tipo 3
DENV-4 Vírus da dengue tipo 4
DH Dengue hemorrágica
DNA Ácido Desoribonucleico
E Proteína estrutural do envelope
EDTA Etileno diamino tetra acetato
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
ER2537 E. coli Cepa ER2537
FE Probabilidade da Seqüência Randômica
FD Febre da dengue
FHD Febre hemorrágica da dengue
FO Freqüência observada
g Grama
IE Índice ELISA
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoglobulina M
x
IgY Imunoglobulina Y
IL Interleucina
I(m) Grau de informação
IPTG Isopropil α-D-tiogalactosise
kDa Quilodalton
L Litro
M Molar
M Proteína estrutural de membrana
mg Miligrama
mL Mililitro
mM Milimolar
M13 Vetor de clonagem de bacteriófagos filamentosos
Ng Nanogramas
nm Nanômetro
NS1 Proteína não estrutural 1
NS2a Proteína não estrutural 2ª
NS2b Proteína não estrutural 2b
NS3 Proteína não estrutural 3
NS4a Proteína não estrutural 4ª
NS4b Proteína não estrutural 4b
NS5 Proteína não estrutural 5
OD Densidade ótica
OMS Organização Mundial de Saúde
OPD O- Phenylenediamine dihydrochrloide
P Probabilidade de ocorrência randômica
PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida
PBS-T Fosfato de sódio com tween 20 0.5%
PCR Reação em cadeia da polimerase
PEG Polietileno glycol
Pfu Unidades formadoras de colônias
Ph Potencial Hidrogeniônico
Ph.D Bibliotecas de Phage display New England Biolabs
Ph.D- 7mer Biblioteca contendo 7 peptídeos randômicos
xi
PrM proteína estrutural precursora de membrana
PIII Proteína III capsídica de bacteriófagos filamentosos
PVIII Proteína VIII capsídica de bacteriófagos filamentosos
RELIC Contatos Ligantes de Receptores
RNA Ácido ribonucléico
rpm Rotações por minuto
SI Sítio de identificação
SDS Dodecil Sulfato de Sódio
sNS1 Forma secretada da proteína não estrutural 1
T CD4+ Linfócitos T CD4+
T CD8+ Linfócitos T CD8+
TNF Fator necrosante de tumores
V Volts
X-gal 5-Bromo-4-cloro-3indolil- α-D-galactosideo
xii
LISTA DE ABREVIATURA DE AMINOÁCIDOS
A Alanina
C Cisteína
D Ácido aspártico
E Ácido glutâmico
F Fenilalanina
G Glicina
H Histidina
I Isoleucina
K Lisina
L Leucina
M Metionina
N Asparagina
P Prolina
Q Glutamina
R Arginina
S Serina
T Treonina
V Valina
W Triptofano
Y Tirosina
xiii
LISTA DE TABELAS
Capítulo Único
Tabela 1: Absorbância e quantificação dos anticorpos obtidos após a
concentração e diálise....................................................................................Pág 48
Tabela 2: Títulos (em pfc: unidades formadoras de colônias) obtidos nos quatro
ciclos de seleção. ..........................................................................................Pág 50
Tabela 3: ELISA para teste de imunorreatividade dos clones selecionados contra
o anticorpo purificado obtido de galinhas imunizadas com proteína total do vírus
da dengue tipo 3.............................................................................................Pág 51
Tabela 4: Seqüências de aminoácidos, freqüências observada e esperada, e
amplificação dos peptídeos............................................................................Pág 53
Tabela 5: Freqüência de aminoácidos dos clones seqüenciados. Em vermelho
estão os aminoácidos que apresentam maior freqüência..............................Pág 54
Tabela 6: Alinhamento entre os peptídeos selecionados e proteínas de
DENV..............................................................................................................Pág 58
Tabela 7: Provável sítio de alinhamento dos motivos VxRN e LRN (em destaque)
na seqüência alvo do capsídeo dos tipos DENV-1, 2, 3 e
4......................................................................................................................Pág 63
Tabela 8: Peptídeos que apresentaram similaridades com proteínas de
comunidades biológicas previamente conhecidas.........................................Pág 63
xiv
LISTA DE FIGURAS
Introdução Geral
Figura 1: Estágios de desenvolvimento do Aedes aegypti: (1) larva, (2) pupa, (3)
indivíduo adulto [(1) http://www.arbovirus.health.nsw.gov.au/areas/arbovirus
/mosquit/photos; (2) http://fmel.ifas.ufl.edu/Key/aegyptipupa.htm; (3) http://www.
angelfire.com/electronic/bodhidharma/death.html].......................................... Pág 4
Figura 2: Sorotipos circulantes do vírus da dengue por Estado, Brasil, 2005
(Ministério da Saúde, 2005)............................................................................. Pág 5
Figura 3: Distribuição mundial da dengue no ano de 2005. Em amarelo,
encontram-se áreas infestadas com Aedes aegypti; em vermelho, áreas com
Aedes aegypt e atividade epidêmica da dengue
(http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/dengue/map-distribution-2005.htm)........... Pág 6
Figura 4: Esquema das proteínas virais arranjadas na poliproteína codificada pela
cadeia simples de RNA................................................................................. Pág 10
Figura 5: Representação de um corte central no vírus da dengue: 1- Proteína do
envelope; 2- ectodomínios da proteína M e hastes da glicoproteína E; 3-
bicamada lipídica; 4 e 5- Nucleocapsídeo ; 5- Ácido ribonucléico (RNA) (Kuhn et
al. 2002)..........................................................................................................Pág 11
Figura 6: Estrutura do vírus da dengue inteiro, mostrando cada monômero com
os domínios I, II e III em vermelho, amarelo e azul, respectivamente. A fusão dos
peptídeos é mostrada em verde (Kuhn et al. 2002)...................................... Pág 11
Figura 7: Diagrama do ectodomínio do vírus da dengue e proteínas do domínio
transmembrana: ectodomínio de um monômero E, em rosa (domínio I), amarelo
(domínio II) e lilás (domínio III); a alça e hélice de E e M estão em azul e laranja,
respectivamente (Zhang et al., 2003)............................................................ Pág 13
xv
Figura 8: Estrutura do fago M13 (http://www.theses.ulaval.ca/2003/21058
/ch01.html)..................................................................................................... Pág 19
Figura 9: Ciclo do “Biopannig” em placa. Em cada ciclo, os fagos reativos com o
alvo são selecionados por lavagens sucessivas, sendo os demais descartados.
Os fagos remanescentes são então amplificados e seguem um novo ciclo para a
maturação da afinidade de ligação ao alvo específico.................................. Pág 20
Capítulo Único
Figura 10: Perfil eletroforético (SDS-PAGE 16%) de IgYs purificadas de soros de
galinhas imunizadas com proteínas virais totais de dengue do tipo 3 (Canaleta 1 –
soro total; 2-8 – soro purificado; M – marcador de peso molecular)............. Pág 48
Figura 11 ELISA para teste de imunorreatividade do anticorpo purificado obtido
de galinhas imunizadas com proteína total do vírus da dengue tipo 3 contra
proteínas virais de dengue 1, 2 e 3............................................................... Pág 49
Figura 12: Exemplo de placas resultantes da titulação. As colônias azuis
representam a infecção de bactérias E.coli (ER2738) com fagos M13 carregando
o gene lacZ da β–galactosidase....................................................................Pág 50
Figura 13: Perfil eletroforético das amostras de DNA extraídas dos clones obtidos
no processo de seleção. M - marcador de peso molecular............................Pág 52
Figura 14: Alinhamento dos 14 peptídeos selecionados pelo programa Clustal W
18.1.................................................................................................................Pág 55
Figura 15: Índices de antigenicidade preditas para os peptídeos selecionados
gerados pelo programa Protean 4.0. Os números 1 a 7 representam a seqüência
de aminoácidos dos peptídeos mencionados à esquerda. Em destaque, os
peptídeos com domínios selecionados...........................................................Pág 57
xvi
Figura 16: Identificação dos prováveis motivos VxRN e LRN na estrutura terciária
da proteína do capsídeo de DENV-2, feito pelo programa Cn3D. Em amarelo, os
domínios encontram-se expostos na estrutura conformacional.....................Pág 62
Figura 17: Teste de imunorreatividade dos clones com soro de pacientes
contaminados com DENV-1 e 3, e com proteínas totais de DENV-1, 2 e
3......................................................................................................................Pág 66
1
RESUMO GERAL
SELEÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PEPTÍDEOS RECOMBINANTES
MIMÉTICOS DE ANTÍGENOS DO VÍRUS DA DENGUE POR “PHAGE
DISPLAY”
A dengue é uma doença infecciosa febril aguda, transmitida de uma
pessoa doente a uma pessoa sadia pela picada da fêmea contaminada de um
mosquito Aedes aegypti. A doença é causada por um arbovírus, membro da
família Flaviviridae e do gênero flavivirus. Existem quatro tipos de vírus da
dengue: Dengue 1, Dengue 2, Dengue 3 e Dengue 4, e há um grande espectro de
manifestações clínicas da doença, sendo as duas principais, a dengue clássica e
a dengue hemorrágica. O diagnóstico geralmente é baseado em sintomas, e
laboratorialmente é tardio, no entanto vários testes específicos para cada
sorotipo.
A tecnologia do “Phage Display” (exposição de biomoléculas em fagos) tem
sido amplamente utilizada no mapeamento de epítopos de diversos antígenos,
constituintes de vários agentes causadores de doenças.
Com o objetivo de selecionar peptídeos recombinantes expressos no
capsídeo de bacteriófagos produziu-se soro policlonal em galinhas previamente
sensibilizadas com proteínas totais do vírus da dengue tipo 3. Após 4 ciclos de
seleção de uma biblioteca de fagos com peptídeos recombinantes lineares de 7
resíduos contra a IgY policlonal, 14 fagos imunorreativos foram selecionados e
suas seqüências de ácidos nucléicos foram posteriormente analisadas por
bioinformática. Foi possível identificar domínios protéicos comuns entre os
peptídeos, sendo que o principal domínio mapeado foi VLRN.
Testes subseqüentes se fazem necessários para a melhor caracterização
destes peptídeos, incluindo possíveis aplicações diagnósticas e vacinais dos
peptídeos selecionados.
PALAVRAS-CHAVE: Dengue, “Phage Display”, anticorpo monoclonal.
2
INTRODUÇÃO GERAL
3
DENGUE
Epidemiologia
A dengue é uma doença febril aguda causada por um arbovírus, membro
da família Flaviviridae e do gênero flavivirus. A doença apresenta evolução
benigna, na forma clássica, e grave na forma hemorrágica. A dengue é hoje a
mais importante arbovirose que afeta o homem e constitui um sério problema de
saúde pública no mundo, especialmente nos países de clima tropical, onde as
condições do meio ambiente favorecem o desenvolvimento e a proliferação do
Aedes aegypti, principal transmissor da doença (Marques et al., 2004).
Quatro sorotipos antigenicamente semelhantes designados dengue vírus
tipo 1 (DENV-1), dengue vírus tipo 2 (DENV-2), dengue vírus tipo 3 (DENV-3) e
dengue vírus tipo 4 (DENV-4), foram descritos (Ligon, 2004). Os quatro sorotipos
do vírus do dengue têm antígenos muito similares, mas são suficientemente
diferentes para provocar proteção parcial contra os outros após infecção por um
deles. Após um período de incubação de 4-6 dias (mínimo de 3, máximo de 10), o
vírus está presente no sangue dos pacientes durante a fase aguda da doença
(WHO, 1997).
Os vetores são mosquitos do gênero Aedes, popularmente conhecido
como pernilongo da dengue. Ae. aegypti é um dos mosquitos vetores mais
eficientes para a transmissão de arboviroses porque é altamente antropológico e
vive nas proximidades de humanos. A transmissão da dengue tem também
outros vetores Ae. Albopictus, Ae polynesiensis e muitas espécies do complexo
Ae scutelleris. Cada uma dessas espécies tem uma distribuição geográfica
particular, no entanto, elas têm baixa eficiência epidêmica, quando comparada ao
Ae. aegypti (WHO, 1997).
O ciclo ovo-ovo pode durar cerca de 10 dias. Quando a larva do mosquito
nasce, ela passa por quatro estágios de crescimento, que podem durar oito dias
no total. Depois ela se transforma em pupa, estágio que dura dois dias,
aproximadamente. Depois de sair da pupa, o mosquito adulto já pode se
reproduzir e botar ovos, quando o ciclo se reinicia (Figura 1).
4
A fêmea do mosquito, suscetível, infecta-se com o vírus da dengue quando
se alimenta de um indivíduo infectante (no período de viremia). Após o período de
incubação extrínseca, que vai desde a ingestão do sangue infectado até o
momento em que é capaz de transmitir o vírus pela sua replicação nas glândulas
salivares, o mosquito permanece infectante até a sua morte. Este período pode
variar de 7 a 10 dias. Quando um mosquito infectante injeta o vírus da dengue no
hospedeiro suscetível durante o repasto sanguíneo, após um período de
incubação que varia, em média, de 4 a 6 dias (mínimo de 3 e máximo de 10 dias),
a dengue pode evoluir para forma assintomática, forma clássica com febre,
mialgias e artralgias, e para forma grave, conhecida como “dengue hemorrágica”,
que cursa com distúrbios da coagulação e choque, podendo levar à morte. A
duração dos sintomas varia usualmente de 3 a 7 dias e o período infeccioso
(viremia) dura apenas alguns dias, variando também de 3 a 7 dias.
Posteriormente, o indivíduo desenvolve imunidade específica de longa duração
(Yang, 2003).
(1) (2) (3)
Figura 1: Estágios de desenvolvimento do Aedes aegypti: (1) larva, (2) pupa, (3) indivíduo adulto [(1) http://www.arbovirus.health.nsw.gov.au/ areas/arbovirus/mosquit/photos; (2) http://fmel.ifas.ufl.edu/Key/aegyptipupa. htm; (3) http://www. angelfire.com/electronic/bodhidharma/death.html].
Durante as duas últimas décadas, a incidência da infecção pela dengue
tem crescido consideravelmente em áreas endêmicas, particularmente na região
as Américas, onde o vírus da dengue tem mostrado uma característica de
hiperendemicidade como resultado da circulação de múltiplos sorotipos em
muitos países do continente (de Simone et al., 2003).
Nas Américas, o vírus da dengue tem sido relatado há mais de 200 anos, e
no Brasil, há referências de epidemias em 1916, em São Paulo, e em 1923, em
5
Niterói, sem diagnóstico laboratorial. A primeira epidemia documentada clínica e
laboratorialmente ocorreu em 1981-1982, em Boa Vista – Roraima. A partir de
1986, foram registradas epidemias em diversos estados (http://portal.saude.gov.br/
portal/svs/visualizar_texto.cfm?idtxt=22207). Atualmente, a circulação dos
sorotipos 1, 2 e 3 do vírus foi identificada em 24 unidades federadas (Figura 2),
com mais de 200.000 casos notificados em 2005 (Ministério da Saúde, 2005).
Figura 2: Sorotipos circulantes do vírus da dengue por Estado, Brasil, 2005 (Ministério da Saúde, 2005).
Em 2005, a dengue foi considerada a mais importante doença transmitida
por mosquitos afetando humanos. Sua distribuição global é comparável à da
malária, e é estimado que 2,5 bilhões de pessoas vivam em áreas de risco para a
transmissão endêmica (Figura 3).
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), dois quintos da
população mundial corre o risco de ser infectada pela doença, e mais de cem
países foram atingidos por epidemias de dengue ou dengue hemorrágica. A OMS
estima que, anualmente, ocorrem mais de 50 milhões de casos de contágio de
dengue e dengue hemorrágica, dos quais meio milhão de são hospitalizados, com
cerca de 20 mil mortes (http://www.who.int/csr/disease/dengue/impact/en
/index.html).
6
Figura 3: Distribuição mundial da dengue no ano de 2005. Em amarelo, encontram-se áreas infestadas com Aedes aegypti; em vermelho, áreas com Aedes aegypt e atividade epidêmica da dengue (http://www.cdc.gov/ ncidod/dvbid/dengue/map-distribution-2005.htm).
Aspecto clínico e diagnóstico da doença
O processo infeccioso desencadeado pelo vírus da dengue possui um amplo
quadro clínico, podendo variar desde uma simples infecção inaparente
(assintomática), até quadros mais graves, nos quais se verificam hemorragias,
abrupto aumento da permeabilidade vascular e desenvolvimento de choque
hipovolêmico. A doença se manifesta clinicamente sob duas formas: dengue
clássica (DC), também descrita como febre da dengue (FD) e a dengue
hemorrágica (DH) ou febre hemorrágica da dengue (FHD) (Morais, 1998).
Segundo Simmons e colaboradores (2005), uma infecção primária com qualquer
um dos quatro sorotipos do vírus da dengue, tipicamente, resulta em alguma
doença assintomática ou então na febre do dengue. Estudos epidemiológicos
sugerem que indivíduos que foram infectados uma segunda vez com um diferente
sorotipo, o risco de desenvolver a febre da dengue hemorrágica é
significantemente maior.
As características clínicas do dengue freqüentemente dependem da idade
do paciente. Os lactentes e as crianças pequenas podem sofrer de febre não
diferenciada com erupção maculopapular. As crianças maiores e os adultos têm
uma síndrome de febre benigna ou a doença clássica incapacitante com início
7
abrupto e febre alta, cefaléia severa, dor retro-orbital, dores musculares e
articulares. A taxa de mortalidade de casos é extremamente baixa (Guzmán e
Kourí, 2002). Segundo os autores, muitas epidemias de dengue são
acompanhadas por complicações que envolvem sangramento, tais como
epistaxe, sangramento gengival, sangramento gastrointestinal, hematúria e
hipermenorrea. Em alguns casos, um sangramento singularmente severo pode
levar o paciente a óbito.
O tratamento para os sintomas da dengue clássica não é específico. A
medicação é apenas sintomática, com analgésicos e antitérmicos (paracetamol e
dipirona). Devem ser evitados os salicilatos (analgésicos a base de ácido acetil
salicílico), já que seu uso pode favorecer o aparecimento de manifestações
hemorrágicas e acidose (http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/dengue/resources/
DengueFactSheet.pdf).
Os casos típicos de Dengue Hemorrágico são caracterizados por quatro
manifestações clínicas principais: febre alta, fenômenos hemorrágicos,
hepatomegalia e, freqüentemente, insuficiência circulatória (Guzmán e Kourí,
2002). As autópsias de casos de dengue hemorrágica, em ordem de freqüência,
constatam-se hemorragias na pele e nos tecidos subcutâneos, nas mucosas do
trato gastrointestinal, e no coração e fígado. De maneira geral, é pouco freqüente
a ocorrência de hemorragias subaracnoidais ou cerebrais. O volume
hemorrágico, entretanto, não é excessivo. Efusão de soro com alto teor protéico
(principalmente albumina) é comum nas cavidades pleural e abdominal (WHO,
1997).
A OMS definiu um critério de classificação das formas de Febre
Hemorrágica do Dengue em 4 categorias, de acordo com o grau de gravidade
(WHO, 1997).
Grau 1 - febre acompanhada de sintomas inespecíficos, em que a única
manifestação hemorrágica é a prova do laço positiva.
Grau 2 - além das manifestações constantes do grau 1, somam-se hemorragias
espontâneas leves (sangramento de pele, epistaxe, gengivorragia e outros).
Grau 3 - colapso circulatório com pulso fraco e rápido, estreitamento da pressão
arterial ou hipotensão, pele pegajosa e fria e inquietação.
8
Grau 4 - choque profundo com ausência da pressão arterial e pressão de pulso
imperceptível.
Na ocorrência de febre hemorrágica da dengue, os pacientes devem ser
observados cuidadosamente para identificação dos primeiros sinais de choque. O
período crítico será durante a transição da fase febril para a afebril, que
geralmente ocorre após o terceiro dia da doença. Em casos menos graves,
quando os vômitos ameaçarem causar desidratação ou acidose, ou não houver
sinais de hemoconcentração, a reidratação do paciente pode ser feita em nível
ambulatorial (WHO, 1997).
Os quatro vírus da dengue são capazes de produzir casos de FDH, sendo
que DENV-2 e DENV-3 são mais freqüentemente associados à severa doença
(Guzmán e Kourí, 2002).
Os métodos comumente usados para confirmar a infecção pela dengue,
envolvem o isolamento do vírus, a detecção do antígeno ou RNA do vírus no
plasma ou soro ou tecidos, e a presença de anticorpos vírus-específicos no soro e
outros fluídos. Recentemente, várias técnicas têm sido desenvolvidas para um
diagnóstico laboratorial rápido do vírus da dengue: a amplificação para um
aumento na taxa de vírus isolado; o método de citometria de escoamento para
uma rápida detecção de vírus; detecção de ácido nucléico viral por PCR-
NESTED, RT-PCR, sequenciamento baseado na amplificação de ácido nucléico,
e PCR em tempo real, detectando antígenos virais livres, imunoglobulina M (IgM)
anti-vírus da dengue ou anticorpos IgG por ELISA (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay); diferenciação de uma infecção primária ou secundária
pelo vírus (Kao et al., 2005).
Controle do vetor
A OMS considera o controle e a prevenção da dengue uma das suas
prioridades. Atualmente, não existe uma vacina licenciada para o uso humano,
apesar de intensa pesquisa nesse campo nos últimos 30 anos (Silveira, 2002). O
controle dessa e de outras doenças causadas pelo Aedes aegypti baseia-se
principalmente no controle do vetor (Severson et al., 2004). Para isto, a
participação da comunidade é extremamente importante na erradicação dos
9
locais com água que sirvam como criadouros do mosquito: pneus velhos, pratos
ou vasos de plantas, garrafas, caixas d´água destampadas, e outros item que
acumulem água (Ligon, 2004). O uso de malathion a ultra baixo volume é indicado
para borrifação ambiental perifocal nos locais onde foram identificados casos de
dengue e/ou o vetor. Porém o inseticida somente age nas formas aladas do
mosquito e há relato de resistência nas Américas. Melhoria das condições
higiênico-sanitárias das habitações, coleta apropriada do lixo e fornecimento de
água encanada são medidas também importantes no controle do dengue. São,
portanto, necessárias campanhas de esclarecimento dos vários segmentos da
população, utilizando para isso os meios de comunicação existentes,
coordenados pelas autoridades sanitárias da região (http://www.who.int
/mediacentre/factsheets/fs117/en/).
Torna-se relevante o incremento da investigação da epidemiologia do
dengue e seus vetores por parte de grupos de pesquisa já constituídos, além do
incentivo à pesquisa operacional para responder de forma ágil questões
específicas dos programas de controle e avaliar o impacto dessas ações
(Donalísio e Glasser, 2002).
Caracterização estrutural e molecular do vírus
A microscopia eletrônica tem sido usada para visualizar toda a estrutura de
alguns flavivirus, até os vários estágios de seus ciclos de vida (Mukhopadhyay,
2005). A estrutura do vírus da dengue foi recentemente descrita pelo uso de cryo-
eletromicroscopia (cryoEM), que permite a visualização de certos componentes
da proteína viral (Kuhn et al. 2002).
O vírus da dengue é esférico com uma superfície relativamente lisa, exceto
nas regiões em que as moléculas de glicoproteína se associam. Apresenta um
diâmetro de aproximadamente 500 Å, e um capsídeo icosaédrico coberto por um
envelope lipídico. O RNA é de cadeia simples, com aproximadamente 10.700
nucleotídeos. O genoma tem 11 Kb e codifica 3 proteínas estruturais [Capsídeo
(C, 100 aminoácidos), Membrana (M, 75 aminoácidos) e Envelope (E, 495
aminoácidos)], sendo que as duas últimas estão na superfície do vírus. Além
disso, codifica também 7 proteínas não estruturais (NS1, NS2a, NS2b, NS3,
10
NS4a, NS4b, NS5) (Guzmán e Kouri, 2002; Kuhn et al. 2002). As regiões não
codificantes 3´ e 5´são importantes para a regulação da replicação viral. As
principais propriedades biológicas do vírus relacionam-se à proteína E, do
envelope: a ligação aos receptores, a aglutinação de eritrócitos, a indução de
anticorpos neutralizantes e a resposta imune protetora estão, todas relacionadas
à estrutura desta proteína (Guzmán e Kouri, 2002; Zhang et al., 2004).
Durante a replicação do vírus, a cadeia senso positiva do RNA genômico
viral é traduzida como uma poliproteína na ordem 5’-C-prM(M)-E-NS1-NS2a-
NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3’, como mostra a Figura 4. A prM representa a
proteína precursora de membrana (Wu et al., 2003; Chua et al., 2004).
Figura 4: Esquema das proteínas virais arranjadas na poliproteína codificada pela cadeia simples de RNA.
Uma distribuição radial do vírus observada por crioeletromicroscopia,
mostrou que a densidade deste pode ser dividida em uma série de camadas
concêntricas, como apresentado na Figura 5. No envelope estão inseridas as
proteínas de envelope (E) e a de membrana (M). A densidade mais alta ocorre no
escudo exterior, entre os raios de 220 e 245 Å, e representa a glicoproteína E. O
próximo escudo, entre os raios de 185 e 220 Å, representa os ectodomínios da
proteína M (38 aminoácidos) e hastes da glicoproteína E (52 aminoácidos).
Imediatamente abaixo, entre os raios de 140 e 185 Å, estão duas camadas
concêntricas, as bicamadas lipídicas. Internamente, encontra-se o nucleocapsídeo,
entre os raios de105 e 135 Å. A densidade do escudo no nucleocapsídeo tem
características globulares distintas representando as subunidades da proteína C.
Entre 105 e 135 Å, corresponde a região do nucleocapsídeo, e dentro de um raio
de 105 Å, a região do RNA do núcleo (Kuhn et al. 2002).
C prM E NS1 2a 2b NS3 4a 4b NS5 COOH NH2
11
Figura 5: Representação de um corte central no vírus da dengue: 1- Proteína do envelope; 2- ectodomínios da proteína M e hastes da glicoproteína E; 3- bicamada lipídica; 4 e 5- Nucleocapsídeo ; 5- Ácido ribonucléico (RNA) (Kuhn et al. 2002).
A estrutura do vírus da dengue (Figura 6) possui jogos de três dímeros,
quase paralelos, que dão forma a uma associação dominante, substituindo assim,
as interações entre monômeros individuais na partícula icosaédrica montada
(Kuhn et al. 2002).
Figura 6: Estrutura do vírus da dengue inteiro, mostrando cada monômero com os domínios I, II e III em vermelho, amarelo e azul, respectivamente. A fusão dos peptídeos é mostrada em verde (Kuhn et al. 2002).
A proteína E possuí peso molecular de 53 kDa, e contêm importantes
determinantes antigênicos. Os anticorpos, principalmente os que se ligam a
1
2 3
4
5
105 245 220 185 140
1 2 3 4 5
12
epítopos da proteína E, promovem lise do envelope ou bloqueio de seus
receptores, com conseqüente neutralização viral. A proteína E, localizada nas
espículas do envelope dos vírus do dengue é fundamental para a ligação viral ao
receptor de membrana e possui os mais importantes domínios antigênicos destes
microorganismos. Os epítopos de E definem a produção de anticorpos específicos
para o tipo viral e para o gênero dengue (Figueiredo, 1999). A estrutura da
proteína E consiste de três domínios: domínio I (DI), o domínio N-terminal, e
estruturalmente central; domínio II (DII), o domínio de fusão (ou dimerização)
contendo o peptídeo hidrofóbico de fusão (Alisson et al., 2001); e domínio III
(DIII), o suposto domínio ligante ao receptor (Bhardwaj et al., 2001).
O vírus da dengue entra na célula hospedeira quando a glicoproteína viral
do envelope E liga ao receptor e responde com rearranjo conformacional à
redução do pH. A mudança conformacional induz a fusão das membranas virais e
da célula do hospedeiro (Modis et al., 2004; Bressanelli et al., 2004). A
determinação da disposição de proteínas transmembrana mostra que o núcleo do
nucleocapsídeo e as proteínas do envelope não têm uma interação direta no vírus
maduro (Zhang et al., 2003).
Videa e colaboradores (2005) misturaram os quatro polipetídeos
recombinantes do vírus da dengue correspondendo a região N-terminal da
proteína do envelope de todos os sorotipos, fizeram um teste ELISA , e
encontraram 100% de concordância entre esses polipeptídeos, tornando-os
reagentes úteis e acessíveis para o diagnóstico sorológico da dengue em países
endêmicos.
As seqüências dos aminoácidos das proteínas E do DENV-2 e DENV-3 são
68% idênticas (Modis et al., 2004).
As regiões α -helicoidais da haste das moléculas de E, assim como a
porção N-terminal das proteínas de M, são enterradas no folheto exterior da
membrana viral. As regiões “âncora” das proteínas E e M, cada uma forma uma
α-hélice transmembrana antiparalela E-E e M-M, deixando a porção C-terminal no
exterior da membrana viral (Figura 7) (Zhang et al., 2003).
A proteína M é produzida pela clivagem da sua precursora, a glicoproteína
pre-M, durante a fase final de maturação viral (Kuhn et al., 2002 e Holbrook et al.,
2001). A proteína prM é clivada antes da liberação do vírus da célula, deixando a
13
pequena proteína estrutural M ancorada no envelope viral, e liberando o
segmento “pr” no meio extra celular (Westaway, 1987)
Figura 7: Diagrama do ectodomínio do vírus da dengue e proteínas do domínio transmembrana: ectodomínio de um monômero E, em rosa (domínio I), amarelo (domínio II) e azul (domínio III); a alça e hélice de E e M estão em azul e laranja, respectivamente (Zhang et al., 2003).
A proteína do capsídeo do vírus da dengue é essencial para a
encapsidação específica do RNA genômico, mas há pouca informação sobre ela.
O mecanismo de encapsidação não é compreendido, mas pode requerer a
participação de proteínas virais não estruturais como também da proteína C (Ma et
al., 2004).
A descrição da estrutura da proteína C da dengue revela uma dobra
alternada, e esta região sugere a interação com outros componentes virais na
partícula do vírus. Além disso, o modelo comprova a associação da porção C-
terminal da proteína do capsídeo com o RNA (Ma et al., 2004).
A proteína NS1 do vírus da dengue maduro contém 352 resíduos de
aminoácidos, em um polipeptídeo 40 kDa. Contém também 12 resíduos de
cisteína que são absolutamente conservados em todas as proteínas NS1 de
flavivirus, indicando a sua importância à estrutura e função (Wallis et al., 2004). A
NS1 é expressa em células de mamíferos infectados sob três formas diferentes:
intracelular, associada à membrana, essencial para a replicação viral; associada à
superfície da célula, envolvida na transdução do sinal; sob uma forma secretada
(sNS1), com propriedades biológicas ainda não elucidadas (Alcon-LePoder et al.,
2005). Os autores fizeram um estudo em camundongos adultos para determinar a
distribuição da proteína in vivo, e esta foi predominantemente encontrada
III I II
14
associada ao fígado, sendo que os hepatócitos eram as principais células-alvo. Em
humanos, NS1 foi eficientemente endocitada pelos hepatócitos in vitro. O estudo
demonstra também que o acúmulo de sNS1 no último compartimento endossomal
dos hepatócitos potencializa uma subseqüente infecção pelo vírus in vitro,
aumentando a possibilidade de que sNS1 possa contribuir para a propagação viral
in vivo.
Relacionada com o processamento da proteína NS1, a proteína NS2a é a
primeira de quatro pequenas proteínas hidrofóbicas. As proteínas NS2b, NS4a e
NS4b são pequenas tal como a NS2a e são pouco conservadas entre flavivirus.
Estas proteínas podem formar componentes de membrana nos complexos de
replicação viral e podem estar envolvidas na localização de membranas das
proteínas NS3 e NS5 via interação proteína-proteína (Chambers et al.1990;
Mackow et al., 1987; Lindenbach e Rice, 1999).
A proteína NS3 é a segunda maior (68-70 kDa) e também a segunda mais
altamente conservada proteína viral entre os flavivirus. Esta proteína não contém
longos trechos de aminoácidos hidrofóbicos, mas tem associação com a
membrana. (Chua et al., 2004). A proteína NS3 tem um papel crítico na
maturação e replicação da poliproteína, e sua ausência impede essas atividades
(Katzenmeier, 2004). A proteína NS3 é composta de 618 aminoácidos, sendo que
um terço da porção N-terminal (167 resíduos de aminoácidos) tem o domínio
serina protease que requer NS2b - proteína ativadora - para catalizar o
processamento das poliproteínas virais NS2a-NS2b, NS2b-NS3, NS3-NS4a e
NS4b-NS5. O NS3 restante da proteína forma sítio de ligação a nucleotídeos
trifosfatase (NTPase) e o sítio de ligação ao RNA. Previamente, um fragmento de
50 kDa truncado da região amino terminal de NS3 (designado NS3’) com um
potencial sítio de clivagem localizado no domínio helicase, foi encontrado em
células de mamíferos infectados com flavivirus, mas não em células infectadas de
mosquitos (Chao et al., 2005).
NS5, a maior das dez proteínas e a mais altamente conservada, com 104
kDa (900 resíduos de aminoácidos), é uma proteína de multidomínios, com pelo
menos dois domínios que contenham atividade enzimática que são cruciais para o
ciclo replicativo do vírus. A região N-terminal está associada com a reação de
encapsulação do RNA que coloca uma estrutura cap1 (7MeG5’-ppp5’-NMe) no
15
RNA de cadeia positiva do genoma. O sítio C-terminal contém oito motivos
altamente conservados (I a VIII) que têm sido reconhecidos em muitas RNA
polimerases RNA-dependendentes e inclui o tripeptídeo “GDD” encontrado em
todas as polimerases. Interessantemente, a atividade de encapsulação envolve
três passos enzimáticos envolvendo a RNA trifosfatase 5’-terminal, a
guanililtransferase, e a RNA metiltransferase (Baleotti et al., 2003 e Chao et al.,
2005).
Caracterização antigênica do vírus
Durante a infecção primária, o indivíduo desenvolve IgM após 5-6 dias e IgG
após 7-10 dias. Durante a infecção secundária, altos níveis de IgG são detectáveis
enquanto durar a fase aguda e aumentam consideravelmente até as próximas
duas semanas. Os níveis de IgM diminuem, e em alguns casos, é indetectável
durante a infecção secundária. Anticorpos IgM sugerem uma recente infecção, no
entanto, eles permanecem por 2-3 meses. Altos títulos de IgG são características
de infecção secundária (Guzmán e Kourí, 2002 e Chanama, 2004).
A glicoproteína E é um importante alvo de anticorpos contra DENV, e tem
sido mostrado que anticorpos contra E inibem a ligação viral às células, e
neutraliza a infectividade viral in vitro (Rothman, 2004). O domínio III da proteína E
é particularmente importante para o desenvolvimento de vacinas para sorotipos
específicos, pois a proteína possui múltiplas conformações que são sorotipo-
dependentes (Jaiswal, 2004).
A proteína NS1 é também um importante alvo de anticorpos contra DENV.
Anticorpos contra NS1 lisam células infectadas com o vírus in vitro e tem mostrado
proteção contra o DENV em camundongos. Um anticorpo monoclonal direcionado
contra a proteína prM também tem mostrado proteção contra o DENV em
camundongos (Rothman, 2004).
A proteína NS3 parece ser particularmente imunogênica, com uma
preponderância de epítopos de células T identificados. Essas células T
reconhecem os diferentes sorotipos do DENV, dependendo do grau de homologia
ao epítopo dado. No entanto, epítopos originários da proteína NS5, que é
altamente conservada entre sorotipos, podem apresentar reatividade cruzada,
16
comportamento contrário da proteína NS3, que reconhece sorotipos específicos de
DENV (Rothman, 2004). A proteína NS3 parece ser o principal alvo para células T
CD4+ e CD8+, no entanto, alguns epítopos de células T têm sido reconhecidos em
outras proteínas tais como envelope e capsídeo (Guzmán e Kourí, 2002).
Tem sido demonstrado que linfócitos T de memória respondem após a
infecção primária, e há a possibilidade de que durante a infecção secundária,
células T se tornem ativadas devido a iterações com monócitos infectados. A
rápida liberação de citocinas causada pela ativação de células T, e pela lise de
monócitos infectados mediada por linfócitos citotóxicos pode resultar no
extravasamento do plasma e hemorragia, como ocorre na FDH (WHO, 1997).
Citocinas que induzem o extravasamento plasmático, tais como as interferon γ,
interleucina (IL) 2 e fator necrosante de tumores (TNF) α são aumentadas nos
casos de FDH. Outras citocinas tais como IL-6, IL-8 e IL-10 também aumentam
(Guzmán e Kourí, 2002).
Antígenos da dengue têm sido detectados em células de Kuffer, macrófagos
alveolares, fagócitos mononucleares na pele e circulantes nos monócitos. O vírus
tem sido isolado ou detectado em órgãos como os linfonóides, fígado, baço, rim e
cérebro. Células imune efetoras, como monócitos e linfócitos T e células não-
imune, como hepatócitos, células endoteliais e células do cérebro, têm sido
noticiadas como potenciais hospedeiros (Guzmán e Kourí, 2002).
Uma infecção natural com o vírus da dengue induz uma imunidade protetora
somente ao mesmo sorotipo (homóloga), e uma proteção por curto período de
tempo (meses) contra um outro sorotipo (Rothman, 2004).
Uma vacina efetiva precisa proteger contra todos os quatro sorotipos da
dengue, ou seja, ser tetravalente (Rothman, 2004). Além disso, precisa ser segura
para uso humano, e ser economicamente viável (Halstead e Deen 2002). Para
esse objetivo uma série de técnicas vem sendo estudadas, incluindo vacinas com
vírus atenuados e vírus recombinantes, vacinas de subunidades recombinantes, e
vacinas de DNA (OMS, 2005). As vacinas tetravalentes contendo vírus vivos
atenuados parecem ser as mais adequadas para prevenir a doença, devido à
possibilidade de proteção para todos os sorotipos e por longos períodos de tempo.
As vacinas vivas têm a vantagem de estimular tanto a imunidade humoral (altos
títulos de anticorposneutralizantes), como a resposta celular (Bricks, 2004).
17
As proteínas NS1 e NS3 não estão associadas a partículas virais livres, e
não parecem induzir a formação de anticorpos facilitadores da infecção. Por esses
motivos são promissoras para o desenvolvimento de vacinas contra a dengue
(Bricks, 2004).
Enquanto se aguarda a vacina, a melhor medida para controlar a doença é
esclarecer a população sobre a forma de combate à proliferação dos mosquitos.
18
PHAGE DISPLAY
A metodologia do Phage Display, exposição de biomoléculas em fagos, foi
desenvolvida por Smith (1985), ao conseguir a expressão da enzima de restrição
EcoRI através da fusão com a proteína três (pIII) do capsídeo do fago.
Phage display permite a seleção de peptídeos e proteínas, incluindo
anticorpos, com alta afinidade e especificidade para vários alvos. A vantagem
crucial dessa tecnologia está na ligação direta que existe entre o fenótipo
experimental e o genótipo encapsulado, mostrando a evolução dos ligantes
selecionados até moléculas otimizadas (Azzazy e Highsmith, 2002).
Bacteriófagos, ou simplesmente fagos, são vírus que infectam uma
variedade de bactérias Gram-negativas usando o pilus sexual como receptor. As
partículas de fagos filamentosos (linhagens M13, f1 e fd) que infectam E. coli via
pilus F, consiste em uma fita simples de DNA que é envolta em uma cápsula
protéica. Um fago viável expressa aproximadamente 2.700 cópias da proteína
gene 8 (g8 ou pVIII, uma proteína de 50 resíduos de aminoácidos) e 3 a 5 cópias
do gene III (p3p ou pIII, proteína de 406 aminoácidos) (Russel, 1991).
A partícula viral esquematizada na Figura 8 é composta por cinco proteínas
estruturais, presentes no capsídeo: pIII, pVI, pVIII, pVII e pIX. A pVIII forma o corpo
cilíndrico do capsídeo. Nas extremidades desse capsídeo encontram-se de três a
cinco cópias das demais proteínas estruturais. A extremidade distal contém as
proteínas pVII e pIX, enquanto que a proximal é composta pelas proteínas
codificadas pelo gene 3 (pIII) e pela própria pVI. A incorporação de proteínas
exógenas na superfície dos fagos filamentosos faz-se fusionando esses peptídeos
a proteínas estruturais das partículas virais. As duas principais proteínas utilizadas
para esse fim são a proteína pVII e a pIII. A proteína 3, a maior das proteínas
estruturais, com cerca de 42 KDa, também é responsável pela adesão da
partícula viral ao pilus sexual (Brígido e Maranhão, 2002).
Foram identificados sítios potenciais para a inserção de peptídeos externos
na proteína principal de revestimento (pVIII) do M13. Todos sítios de inserção, que
foram usados com sucesso, ficam situados a 5 aminoácidos da porção N-terminal.
Já os virions com inserções maiores do que aproximadamente 6 aminoácidos, não
são incorporados ao mutante (Makowski, 1993).
19
Figura 8: Estrutura do fago M13 (http://www.theses. ulaval.ca/2003/21058/ch01.html)
O sistema phage display foi criado para a exposição de bibliotecas de
pequenos peptídeos (no máximo 30 aminoácidos). Isto porque o tamanho da
proteína inserida no vetor deve ser limitado, pois grandes proteínas interferem nas
funções das proteínas do capsídeo, tornando o fago pouco infectivo (Phizicky e
Fields, 1995).
Phage display tem provado ser uma técnica muito poderosa na obtenção de
bibliotecas contendo milhões ou até mesmo bilhões de diferentes peptídeos ou
proteínas. A metodologia de bibliotecas mais amplamente utilizada é baseada no
uso de fagos filamentosos (Smith 1985). As seqüências de DNA de interesse são
inseridas em uma localização no genoma de bacteriófagos filamentosos, de modo
que a proteína codificada é expressa na superfície do fago filamentoso como um
produto de fusão a uma das proteínas da superfície do fago (Azzay e Highsmith,
2002)
O peptídeo ou proteína expresso na superfície do fago possibilita a seleção
de seqüências baseada na afinidade de ligação para uma molécula alvo por um
processo de seleção in vitro denominado biopanning (Parmley e Smith, 1988).
DNA de fita simples (~6500 nucleotídeos)
pVII (~5 / 3,5 KDa)
pIX (~5 / 3,5 KDa)
Proteína de interesse fusionada à pIII
pIII (~ 5 / 42 Kda)
pVI (~5 / 12 Kda)
pVIII (~ 2700 / 5 Kda)
20
A seleção, ou biopanning, é realizada pela incubação da biblioteca de
peptídeos expostos em fagos contra o alvo. O alvo é imobilizado em um suporte
sólido tais como placas de ELISA, beads, resinas e membranas. Os fagos não
ligantes ao alvo são eliminados por lavagens sucessivas, e os fagos específicos
permanecem ligados para posterior eluição. O pool de fagos específicos é
amplificado para os ciclos posteriores de seleção biológica (ciclos de ligação,
eluição e amplificação) para o enriquecimento do conjunto de fagos com
seqüências específicas contra o alvo. Após três ou quatro passagens, os clones
individuais são caracterizados por seqüenciamento de DNA, western blotting ou
ELISA (Smith 1985), conforme mostrado na Figura 9.
Biblioteca de fagos
Amplificação
Seleção por
afinidade
Figura 9: Ciclo do “Biopannig” em placa. Em cada ciclo, os fagos reativos com o alvo são selecionados por lavagens sucessivas, sendo os demais descartados. Os fagos remanescentes são então amplificados e seguem um novo ciclo para a maturação da afinidade de ligação ao alvo específico.
Infectar E. coli
Lavar e eluir os
Fagos associados
21
Peptídeos selecionados contra um alvo particular que tem seqüência similar
têm um papel na identificação do motivo necessário para ligação (Stephen e Lane,
1992). Nos casos em que os peptídeos selecionados não se assemelham ao
peptídeo ligante natural, foram denominados mimotopos (Geysen, et al., 1986;
Smith e Scott, 1993).
Peptídeos que neutralizam imunoglobulinas podem ser empregados como
reagentes diagnósticos ou usados como agentes terapêuticos controlando
doenças auto-imunes (Blank et al., 1999). Bibliotecas de peptídeos randômicos
podem ser usadas para mapear epítopos de anticorpos policlonais e monoclonais,
identificando peptídeos ligantes, e desenvolvendo fagos que definem sítios para
diferentes enzimas (Mattheus e Wells, 1993; Ohkubo et al., 2001).
Apesar da técnica de phage display ter sido primeiramente introduzida há
aproximadamente 15 anos, as aplicações e desenvolvimento desta tecnologia
estão apenas começando a ser exploradas. Essa exploração da tecnologia de
phage display irá levar à produção de uma enorme gama de ligantes, incluindo
anticorpos recombinantes e peptídeos, com especificidades predefinidas. Além
disso, tecnologias emergentes baseadas em phage display irão beneficiar
diagnósticos através da produção de moléculas impossíveis de se obter por
métodos tradicionais. Especificamente, anticorpos recombinantes contra
antígenos tóxicos ou seqüências conservadas e carboidratos podem ser isolados
(Soderlind et al., 2000).
Os trabalhos com o uso da técnica phage display abrangem diversos
estudos a respeito de enfermidades humanas como a tuberculose (Jeong et al.,
2006), diabetes (Baltrusch et al., 2005), hepatite A (Kim et al., 2004), hepatite B
(Lu et al., 2004; Zhang et al., 2004) hepaptite C (Ferrieu-Weisbuch et al., 2006),
hepatite E (Gu et al, 2004), hanseníase (Yang et al., 2005), AIDS (Sticht et al.,
2005), mal de Parkinson (Gearhart et al., 2002), câncer (Zhang et al., 2005;
Dantas-Barbosa et al., 2005; Sharon et al., 2005), Dengue (Wu et al., 2001),
dentre outros.
Uma das grandes vantagens apresentadas pela técnica de Phage display
diz respeito a sua direta aplicação prática em teste de imunogenicidade. Fagos
são comumente utilizados como partículas imunogênicas para a geração de
anticorpos contra os peptídeos recombinantes expressos nas regiões N-terminais
22
de proteínas de superfícies e reagir cruzadamente com o alvo original, indicando
que mimotopos expressos poderiam ser utilizados como candidatos a
subunidades vacinais (Yang e Shiuan, 2003).
Durante os últimos 10 anos, exposição de anticorpos/antígenos em fagos
(phage display) tem se transformado em uma técnica bem aceita e, num pequeno
espaço de tempo tem gerado moléculas de altíssima qualidade.
Anticorpos/antígenos derivados por phage display têm provado sua segurança e
eficácia em testes clínicos. Processos de seleção adaptados à técnica, em
combinação com anticorpos/antígenos de fácil montagem, abrem amplamente as
portas para desenvolvimento sofisticado de anticorpos como medicamentos. Em
adição, estes anticorpos/antígenos selecionados por phage display oferecem
maiores vantagens em termos de velocidade e rendimento para pesquisa e
identificação/validação de alvos. Phage display já é parte de uma moderna forma
de descoberta de novas drogas (Kretzschmar e von Ruden, 2002).
23
OBJETIVOS
Os objetivos principais do presente trabalho foram:
1. Isolar peptídeos reativos com o soro anti-dengue a partir de bibliotecas de
peptídeos recombinantes (phage display).
2. Confirmar a imunorreatividade dos fagos recombinantes selecionados por
métodos imunoenzimáticos e caracterizá-los por sequenciamento e
bioinformática, determinando os prováveis epítopos funcionais das
proteínas virais.
24
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33
CAPÍTULO ÚNICO
SELEÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PEPTÍDEOS RECOMBINANTES
MIMÉTICOS DE ANTÍGENOS DO VÍRUS DA DENGUE POR “PHAGE
DISPLAY”
34
RESUMO
A dengue é causada por um arbovírus da família Flaviridae, transmitido de uma
pessoa à outra através de um hospedeiro intermediário, o mosquito Aedes
aegypti. É uma doença infecciosa tropical e subtropical caracterizada por febre e
dor intensa nas articulações, além de sangramentos intensos quando na sua
forma hemorrágica. Neste trabalho utilizou-se da tecnologia de exposição de
peptídeos randômicos em fagos, phage display, no intuito de identificar peptídeos
recombinantes com afinidade a anticorpos policlonais (IgY) gerados em galinhas
imunizadas com proteínas totais do vírus da dengue tipo 3. As IgYs dos animais
foram purificadas em coluna HiTrap e concentradas por diálise. As IgYs foram
imunorreativas contra todas as culturas de DENV, mas não foram tipo específico.
Os clones foram selecionados de uma biblioteca de fagos randômicos (PhD-7) por
quatro ciclos de seleção contra as IgYs. Os fagos selecionados foram
amplificados em placas deepwell e submetidos a testes ELISA. Clones
imunorreativos contra IgY foram seqüenciados, traduzidos e analisados por
bioinformática. Quatorze clones distintos foram selecionados e alinhados contra a
seqüência de dados do proteoma viral e entre todos eles. Três seqüências
consenso entre os clones foram detectadas: VLRN, APP e LPP. A procura por
prováveis seqüências protéicas do vírus da dengue no BLAST mostrou
similaridade a diversos sítios protéicos virais: poliproteína, envelope e as
proteínas não-estruturais NS1, NS2a, NS3 e NS5. Todas elas se alinharam com
as seqüências dos tipos DENV-1, -2, -3, e/ou -4, corroborando com a falta de
especificidade das IgYs. Considerando o motivo VLRN, as análises dos índices de
antigenicidade dos peptídeos similares demonstraram que estes índices são
altamente influenciados pelos resíduos vizinhos. Análise 3-D da proteína do
capsídeo viral do tipo DENV-2, com superposição do motivo VLRN, identificou
duas seqüências alvos, NRVSTVQQL e EIGRMLNILNRR, que estavam presentes
na poliproteína dos quatro tipos virais, os quais podem conter dois prováveis
domínios, VxRN e LRN, respectivamente. Domínios de fosforilação e glicosilação,
encontrados em vírus eucarióticos, foram similares às seqüências presentes em
cinco fagos recombinantes selecionados, o que não implica que estes motivos
sejam fisiologicamente ativos no vírus da dengue. Finalmente, os peptídeos foram
usados para detectar IgG e IgM humana. Testes ELISA foram realizados em dois
pacientes com infecções isoladas de DENV-1 ou DENV-3. A reatividade dos 14
clones foi superior àquela observada para antígenos totais obtidos das culturas,
embora não tenha sido específica.
35
ABSTRACT
Dengue fever is caused by an arbovirus of the Flaviridae family, transmitted from
person to another through an intermediate fly vector, Aedes aegypti. It is a tropical
and subtropical infectious disease characterized by fever and strong pain in joints,
which could also lead to bleeding in its hemorrhagic form. In this investigation,
Phage Display technology was used to identify recombinant peptides with affinity
to polyclonal antibodies (IgY) raised in immunized chickens with total proteins of
the DENV-3 culture. Animal sera was purified in a HiTrap column and
concentrated through dialysis. The IgY’s were immunoreactive against DENV
cultures, but were not type specific. Phage clones were selected from a random
peptide library (PhD-7) in four cycles of biopanning against IgY. Selected phages
were amplified in deepwell microtiter plates and submitted to ELISA tests.
Immunoreactive clones against IgY were sequenced, translated and analysed
through bioinformatics. Fourteen distinct clones were selected and aligned against
viral proteome sequences and among themselves. Three consensus sequences
among phage clones were detected: VLRN, APP and LPP. The peptide search in
BLASTp showed similarity to the following viral proteins: polyprotein, envelop, and
the nonstructural proteins NS1, NS2a, NS3 and NS5. All of them have matched
with DENV-1, -2, -3, and/or -4 sequences, corroborating with the lack of type
specificity of the raised IgY. Considering the VLRN motif, the analyses of
antigenicity indexes of similar peptides demonstrated that its antigenicity is highly
influenced by neighboring residues. Three-dimensional analysis of the DENV-2
capsid protein, with the alignment of the VLRN motif, have identified two target
sequences, NRVSTVQQL and EIGRMLNILNRR, that are present in the
polyprotein of all four viral types, which may contain the two possible domains
VxRN and LRN, respectively. Six selected phages have presented known protein
domains, and five of them presented specific phosphorylation and glycosylation
sites, similar to known eukaryotic viruses; however, they may not be
physiologically active sites in the dengue virus. Finally, the peptides were used to
detect human IgG and IgM. ELISA tests were performed in two patients with
isolated infections of DENV-1 or DENV-3. The reactivity of the 14 clones was
superior to total antigens obtained from cultures, but they were not type specific.
36
INTRODUÇÃO
A dengue é uma doença febril aguda transmitida pelo Aedes aegypti e
causada por um arbovírus, membro da família Flaviviridae e do gênero flavivirus
(Marques, et al., 2004). Quando um mosquito infectante injeta o vírus da dengue
no hospedeiro suscetível durante o repasto sanguíneo, a dengue pode apresentar
uma evolução benigna (forma clássica) ou grave (forma hemorrágica) (Yang,
2003).
O vírus da dengue é icosaédrico com um diâmetro de aproximadamente
500 Å, apresentando RNA de cadeia simples. O genoma codifica 3 proteínas
estruturais (Capsídeo, Membrana e Envelope), além de 7 proteínas não
estruturais (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5) (Guzmán e Kouri, 2002;
Kuhn et al. 2002).
A metodologia do Phage Display, desenvolvida por Smith (1985), tem sido
amplamente usada desde sua descrição. É uma forma de seleção em que uma
biblioteca de peptídeos ou proteínas com as seqüências randomizadas são
expressas no exterior da partícula viral, enquanto o material genético encontra-se
no genoma viral (Parmley e Smith, 1988). Bibliotecas de peptídeos fusionadas
em fagos têm despertado o interesse como fonte de grande número de epítopos e
têm sido vastamente utilizadas em estudo de interações de ligação entre
antígeno-anticorpo (Cortese, 1995). Phage Display é uma metodologia eficaz para
análise de epítopos lineares e conformacionais ou mimotopos, que geralmente
são difíceis de ser caracterizados (Thullier et al., 2001).
Na superfície viral foram expressos anticorpos (Barbas et al.,1992; Rader
et al., 1997), peptídeos (Noren e Noren, 2001), enzimas (Soumillion et al., 1994),
receptores de superfície celular (Robertson, 1993), entre outras estruturas. Por
um processo in vitro denominado biopanning (Parmley e Smith, 1988), o peptídeo
ou proteína expresso na superfície do fago é selecionado através da afinidade de
ligação com a molécula alvo.
Nosso grupo tem utilizado estas bibliotecas de fagos para a seleção de
peptídeos na identificação de epítopos imunorreativos contra: imunoglobulinas Y
anti-proteínas totais do vírus da Doença Infecciosa da Bursa de Fabrício (IBDV)
(Capparelli, 2005), imunoglobulinas G provenientes de soros de pacientes com
37
leishmaniose visceral (Almeida, 2005), imunoglobulinas Y anti-proteínas totais de
larvas de Boophilus microplus (Prudêncio et al., 2003), soro policlonal anti-
neuwiedase da peçonha bruta de Bothrops neuwiedi pauloensis em camundongos
(Cardoso, 2004) e na construção de biblioteca combinatorial de anticorpos (Lino
et al., 2003).
O presente trabalho consiste na aplicação da técnica de phage display para
a identificação e seleção de peptídeos específicos com o vírus da dengue,
determinando os prováveis epítopos funcionais das proteínas virais.
38
MATERIAL E MÉTODOS
Antígenos
Antígenos inativados do sorotipo DENV-3, produzidos em cérebros de
camundongos e extraídos pelo método sucrose–acetona foram cedidos pelo Setor
de Arboviroses do Instituto Evandro Chagas (Laboratório de Referência para
Dengue).
A dosagem de proteínas das amostras foi realizada pelo método descrito
por Bradford (1976). A partir daí foi feita uma curva de calibração da massa
molecular em relação à leitura espectrofotométrica, e determinou-se a quantidade
de antígeno a ser usada nas imunizações.
Aves
Utilizou-se de 4 galinhas da raça White Leghorn de três semanas de idade,
cedidas pela Granja Rezende de Uberlândia-MG.
Imunização
Antes do inicio da imunização, coletou-se o sangue dos animais para que
funcionasse como controle pré-imune.
O esquema de imunização foi o descrito por Barbas et al. (2001), com
algumas modificações. Seis aplicações intramusculares de proteínas virais totais
emulsionadas em adjuvante foram realizadas, sendo que na primeira imunização
a quantidade de proteína era de aproximadamente 200 µg, e as demais de 100
µg, com intervalos de 15 dias entre cada uma das imunizações. Na primeira dose
foi usado um adjuvante completo de Freund (Sigma Chemical Co, USA) e nas
doses subseqüentes o adjuvante incompleto de Freund (Sigma), sendo que em
ambas correspondiam a 50% do volume total da solução. Além do adjuvante,
também foi acrescido PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 12 mM, KH2PO4
1,2 mM, pH 7.4) para tamponar a solução. Foram imunizadas duas galinhas e
outras duas mantidas como controle (imunizadas somente com adjuvante e PBS).
39
Após 3 meses coletou-se o sangue, e o título de anticorpos específicos foi
monitorado por testes ELISA. O cut-off foi calculado pela soma das médias dos
animais controles mais 2 vezes o desvio padrão, e o índice ELISA pelo valor
obtido em cada diluição dividido pelo cut-off. Após a constatação do título
apropriado, os animais foram sacrificados por punção cardíaca.
Armazenou-se o sangue coletado em estufa à 37oC por 1 hora e, logo
após, em câmara fria à 4oC overnight, para obtenção do soro a ser purificado.
Purificação e concentração dos anticorpos
A purificação de IgY foi realizada com o uso da coluna HiTrap IgY
Purification HP, 5 mL (Amersham Biosciences). A bomba peristáltica foi
preenchida com tampão de eluição (Na2HPO4 20 mM, pH 7.5), e então conectada
à coluna. A coluna foi lavada com 5 volumes (25 mL) de cada tampão: ligação
(Na2HPO4 20 mM, K2SO4 0,5 M, pH 7.5), eluição e limpeza (Na2HPO4 20 mM, 30%
volume/volume de isopropanol, pH 7,5). Em seguida a coluna foi equilibrada com
5 volumes de tampão de ligação, e foi aplicada amostra (6 mL de soro). A coluna
foi lavada com 10 volumes da mesma (50 mL) de tampão de ligação. As IgY
foram então eluídas com 10 volumes da coluna de tampão de eluição, sendo
coletadas amostras de 1 mL que foram quantificadas no espectrofotômetro (280
nm). A coluna foi regenerada com 8 volumes (40 mL) de tampão de limpeza, e
reequilibrada com 5 volumes de tampão de ligação. À medida que as amostras
eram filtradas na coluna de purificação, as leituras ópticas das alíquotas (OD
280nm) eram obtidas.
Para diálise das amostras obtidas foi utilizada uma membrana de celulose
Fisherbrand (regenerated cellulose-DYALYSIS tubing). As amostras do soro
purificado foram colocadas em tubos de diálise (tubos 1 a 8), concentradas em
sacarose por 1 hora a 4ºC e em seguida dialisadas em PBS por 12 horas a 4ºC.
As amostras foram quantificadas no espectrofotômetro à 280nm.
A visualização das amostras foi realizada por SDS PAGE 16% (Anexo 1),
como descrito por Laemmli (1970). Para coloração do gel foi necessária uma
solução de Coomassie-blue R-250 como corante de proteínas, e solução
descorante logo após.
40
Teste ELISA para confirmar a especificidade de IgY
Após a obtenção do anticorpo purificado, foi necessário confirmar a
especificidade das IgY em relação aos demais tipos virais.
Foi sensibilizada uma placa de alta afinidade (NUNC) com 20 µg/mL de
proteínas totais de cada tipo viral, diluídos em 100 µL/poço de tampão carbonato
(NaHCO3 60 mM, pH 9,6) e incubada por 12 horas, sob agitação, à 4ºC.
Após 3 lavagens com PBS-T 0,05% (PBS + 0,05% volume/volume de
Tween 20), foram adicionados 250 µL de tampão de bloqueio (PBS-T 0,05% -
BSA 3%), sendo a placa incubada por 1 hora à temperatura ambiente. A placa foi
então lavada por mais 3 vezes e adicionados 100 µL de solução contendo soro
das galinhas imunizadas na concentração de 1:600, mais 50 µL de bloqueio (um
clone em cada poço). Após a incubação por 1 hora à 37ºC, realizou-se mais 6
lavagens. Foi adicionado o anticorpo Anti-IgY conjugado marcado com peroxidase
(Amersham Biosciences, 1:5000) diluído em solução de bloqueio, com incubação
por 1 hora à 37ºC. Em seguida, a placa foi lavada por mais 6 vezes, e então
revelada com 100 µL/poço de uma solução contendo OPD (O- Phenylenediamine
dihydrochrloide – Sigma Chemical), H2O2, e tampão citrato (0,1 M). A reação foi
interrompida pela adição de 10 µL de H2SO4 4 M. A leitura da absorbância foi feita
em leitor Multiscan Plus versão 2.03, com filtro 492nm.
Biopanning – Seleção de peptídeos
Para a seleção dos peptídeos (expressos na proteína III do capsídeo de
fagos filamentosos), reativos com os anticorpos acima descritos, utilizou-se uma
biblioteca randômica de peptídeos de 7 aminoácidos (“Ph.D -7 mer - New England
Biolabs”).
Foi adsorvido no poço de uma placa de microtitulação de 96 poços
(Maxisorp - NUNC) 150 µL de IgY purificada em coluna específica para IgY (100
µg/mL em NaHCO3 0,1 M, pH 8,6) e incubada overnight a 4°C em um recipiente
contendo papel toalha umidificado. A placa foi bloqueada com 150 µL de um
tampão de bloqueio (NaHCO3 0.1 M, pH 8,6, 5 mg/mL BSA) por 1h sob agitação a
4°C, e lavada seis vezes com TBST (TBS (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM,
41
água, 0,1% volume/volume de Tween 20). Foram acrescentados na placa 10 µL
da biblioteca de peptídeos diluída em 100 µL de TBST, e a placa foi mantida sob
agitação por 1 h a temperatura ambiente. Fagos não ligantes foram removidos
pela lavagem da placa por dez vezes com TBST. Os fagos ligantes foram eluídos
com 100 µL do tampão de eluição (glicina-HCl 0,2 M, pH 2,2, contendo 1 mg/mL
BSA) por 10 min à temperatura ambiente e imediatamente neutralizados com 15
µL do tampão de neutralização (Tris-HCl 1 M, pH 8,0). Alíquotas dos fagos
eluídos foram utilizadas para a determinação do título.
Uma pequena amostra deste eluato (10 µL) foi titulada e o tratante foi
utilizado para reamplificação, realizada em 20 mL de cultura de E. coli (ER2537)
em fase inicial de crescimento (OD600≤0,3), contendo tetraciclina, incubando-se a
cultura por 4-5 horas em agitador com temperatura a 37ºC, antes do
procedimento de precipitação dos fagos e posterior titulação.
A cultura foi transferida para um tubo Oakridge (Hitachi, 50 mL) e
centrifugada (10 min, 10.000 rpm). As células residuais foram descartadas e o
sobrenadante transferido para um tubo limpo e re-centrifugado. Foi pipetado 80%
do sobrenadante para um tubo esterilizado onde foi adicionado 20% do volume de
PEG/NaCl (20% peso/volume de Polietileno glicol-8000, NaCl 2,5M, água), e a
mistura permaneceu em repouso por 12 horas a 4oC.
No dia seguinte, a precipitação foi centrifugada 15 minutos a 10.000 rpm à
4oC. O sobrenadante foi descartado e o tubo foi centrifugado brevemente, para
que o sobrenadante residual pudesse ser removido. O precipitado foi
ressuspendido em 1 mL de TBS, transferido para um microtubo e centrifugado por
5 minutos, 10.000 rpm à 4oC para precipitar os resíduos celulares. O
sobrenadante foi transferido para um novo microtubo para a adição de PEG/NaCl
(1/6 do volume). A mistura foi incubada em gelo por 1 hora e então centrifugada
(10 min, 14.000 rpm, 4oC). O sobrenadante foi descartado, e a centrifugação foi
repetida para remoção de sobrenadante residual. O precipitado foi ressuspendido
em 200 µL de TBS, obtendo-se então o eluato amplificado, pronto para a
titulação.
Os fagos reamplificados a partir do primeiro ciclo de seleção foram
utilizados em um segundo ciclo e assim subseqüentemente, por um total de
quatro ciclos, sendo que a partir do segundo ciclo a estringência do tampão de
42
lavagem foi aumentada de 0,1% para 0,5% de Tween-20 em todas as lavagens.
Para todas as titulações foram utilizados 10 µL dos fagos, diluídos em 90
µL de meio de cultura LB. As diluições (10-1 a 10-4, para eluato não amplificado e
de 10-8 a 10-11, para fagos amplificados) foram incubadas com 200 µL de E. coli
(ER2738) em fase de crescimento inicial por 5 minutos e plaqueadas em meio LB
contendo IPTG (0,5 mM) e X-gal (40 µg/mL), juntamente com 3 mL de Agarose
Top (10 g de Bacto-Triptona, 5g de extrato de levedura, 5g de NaCl, 1 g de MgCl2
. 6H2O / litro).
Após a incubação em estufa por toda a noite à 37ºC, as colônias azuis
foram contadas para a obtenção dos títulos de entrada e saída para todos os
ciclos de seleção (número de colônias azuis x fator de diluição).
Amplificação de colônias de fagos em Deepwell
As colônias que apresentaram coloração azul, demonstrando a quebra do
substrato X-Gal e a expressão do gene da β-galactosidase dos fagos pelas
bactérias ER2738, foram reamplificadas separadamente em placas Deepwell para
o armazenamento dos clones selecionados. Para isso, cada colônia isolada obtida
do 4º ciclo não amplificado foi dispensada em um poço da Deepwell contendo 1
mL de meio de cultura com E. coli em fase de crescimento inicial. A placa foi
incubada por 12 horas à 37oC, sob agitação. A placa Deepwell foi centrifugada por
60 minutos a 3.700 rpm, para a retirada do sobrenadante da cultura. Seu
conteúdo foi transferido para uma outra placa Deepwell e então foi adicionado 1/6
do volume de PEG/NaCl (20% de polietileno glicol-8000, NaCl 2,5 M) incubando-a
por 12 horas à 4ºC. A placa foi centrifugada por 1 hora a 3.700 rpm, o
sobrenadante descartado, e o precipitado suspenso em 200 µL de PBS.
ELISA Pré-Sequenciamento
Testes de ELISA foram realizados para determinar a reatividade dos
peptídeos recombinantes (expressos nos fagos selecionados), contra os
anticorpos presentes no soro das galinhas imunizadas com proteínas virais totais
da dengue do tipo 3.
43
O procedimento seguiu, em linhas gerais, os mesmos parâmetros
mencionados para o ensaio anterior, com algumas modificações. A sensibilização
da placa foi feita com 1 µg/poço do anticorpo policlonal purificado IgY anti-dengue
diluído em bicarbonato de sódio. Após o bloqueio foram adicionados 100 µL de
solução contendo 50 µL do fago mais 50 µL de bloqueio (um fago em cada poço).
Para a detecção, utilizou-se o anticorpo conjugado anti-M13 marcado com
peroxidase (1:500).
O cut-off foi calculado pela soma das médias do controle negativo (fago
selvagem) mais 2 vezes o desvio padrão, e o índice ELISA pelo valor obtido em
cada diluição dividido pelo cut-off. Os clones selecionados foram aqueles que
apresentaram índice ELISA maior que 1.
Extração de DNA
Para a obtenção de DNA dos fagos, 10 µL dos fagos purificados em placa
Deepwell foram adicionados a 1 mL de cultura de ER2738 em fase de
crescimento inicial em tubos FALCON de 15 mL, onde permaneceram sob
agitação vigorosa por 6 horas à 37ºC. Após o crescimento, as culturas foram
transferidas para microtubos para a sedimentação das bactérias que foram
centrifugadas por 10 minutos a 4.000 rpm. 500 µL do sobrenadante foram
transferidos para outro tubo, e acrescidos a este, 200 µL de PEG-NaCl, incubando
o tubo em seguida à temperatura ambiente por 10 minutos. Após centrifugar por
10 minutos a 14.000 rpm, foi descartado o sobrenadante, e o precipitado foi
ressuspenso com em 100 µL de Tampão Iodeto (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM,
NaI 4 M), e então foi adicionados 250 µL de etanol absoluto, incubando o tubo
por 10-20 minutos à temperatura ambiente. O tubo foi centrifugado por 10 minutos
a 14.000 rpm, descartando o sobrenadante, e em seguida, foi lavado o precipitado
com 500 µl de etanol 70%, centrifugando mais uma vez por 10 minutos a 14.000
rpm. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado suspenso em 20 µl de água
ultra pura estéril.
A qualidade do DNA presente nas amostras foi verificada pela corrida
eletroforética em gel de agarose 0,8%.
44
Sequenciamento de DNA
O seqüenciamento foi realizado utilizando o Kit Big Dye Terminator
(Amersham Biosciences) e um seqüenciador automático MegaBace 1000
(Amersham Biosciences) do Laboratório de Genética Molecular (UFU). Para a
reação do seqüenciamento, foi utilizado o primer – 96 M13 – (5´-
HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG –3´- Amersham Biosciences), que amplifica a
região dos aminoácidos codificantes dos peptídeos randômicos fusionados nos
fagos M13 recombinantes.
A análise das seqüências de DNA provenientes do seqüenciador
automático foram processadas em software do próprio equipamento (Sequence
Analyser, BASE CALLER, Cimarron 3.12, Phred 15). Logo após esta pré-análise,
as seqüências dos vetores foram retiradas e somente aqueles insertos com 14
resíduos perfeitos foram então traduzidas.
Análise dos dados por bioinformática
As seqüências de DNA geradas pelo seqüenciamento foram analisadas
utilizando-se programas de bioinformática disponíveis on-line.
A tradução das seqüências de aminoácidos obtidas no seqüenciamento se
deu pelo programa DNA2PRO7. Este programa é designado para tradução de
seqüências de insertos tanto de bibliotecas da New England Biolabs (Ph.D.-7TM or
Ph.D.-C7CTM) quanto de outras bibliotecas de interesse que contiverem as
seqüências inicial e final do vetor (http://relic.bio.anl.gov/dna2pro7.aspx).
O cálculo da freqüência e da medida de informação de cada um dos
peptídeos dentro da biblioteca original de fagos foi feito pelo programa INFO
(https://relic.bio.anl.gov/info.aspx).
Realizou-se o cálculo da freqüência de aminoácidos dentro da população
de peptídeos pelo programa AAFREQ (http://relic.bio.anl.go v/aafreqs.aspx ).
Para análise do pareamento entre os peptídeos recombinantes
selecionados, foi utilizado o programa ClustalW versão 18.1
(www.ebi.ac.uk/clustalw/).
45
Os motivos protéicos gerados foram analisados quanto às homologias com
proteínas de dengue depositadas no “GENBANK” pelo programa BLAST – Basic
Local Alignment Search Tool (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
Para análise do índice de antigenicidade de cada peptídeo, fez-se uso do
programa DNASTAR 4.0 – Lasergene, subprograma PROTEAN.
A identificação motivos na estrutura terciária da proteína foi feito pelo
programa Cn3D versão 4.1 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/structure/CN3D
/cn3d.shtml).
Para encontrar os padrões protéicos e a linhagem taxonômica referindo-se
às famílias de proteínas e domínios comuns em espécies, gêneros ou táxons a
qual os peptídeos pertencem, foi utilizado o programa PROSCAN (PROSITE
SCAN). Este programa examina os peptídeos contra o PROSITE, um banco de
dados de famílias de proteínas e domínios que consiste de locais biologicamente
significantes, padrões e perfis que ajudam a identificar confiantemente a família
conhecida da proteína, caso exista uma (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-
bin/npsa_automat.pl?page=npsa_prosite.html).
Teste ELISA dos clones contra soro humano específico
Para confirmar a especificidade dos clones obtidos, realizou-se o teste
ELISA com soro de 2 pacientes contaminados individualmente com DENV-1 e
DENV-3. Esses soros foram previamente tipados por PCR e gentilmente cedidos
pelo Departamento de Doenças Infecciosas e Parasitarias, USP, São Paulo-SP.
Como controle negativo foi utilizado um poço sem fago e sem soro, e os controle
positivos foram os antígenos totais das culturas específicas para os tipos DENV-1,
-2, e -3.
Foram feitos 4 testes ELISA, sendo que em 2 foram utilizados soros humanos
com DENV-1, e nos outros 2, soros humanos com DENV-3. Em ambos tipos
virais, foi aplicado anticorpo anti-IgG em uma das placas, conjugado com
peroxidase e na outra, anticorpo anti- IgM, também conjugado com peroxidase.
No controle negativo utilizado, não foram colocados os fagos e o soro testado.
A sensibilização das placas foi feita com fagos, na concentração de 5x109, e
também com proteínas totais de DENV-1 e DENV-3, na concentração de 20
46
µg/mL, ambos diluídos em bicarbonato de sódio. Esta foi incubada por 12 horas,
sob agitação, à 4ºC.
Após 3 lavagens com PBS-T 0,05% (PBS + 0,05% volume/volume de Tween
20), foram adicionados 250 µL de tampão de bloqueio (PBS-T 0,05% - BSA 3%),
sendo a placa incubada por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram
então lavadas por mais 3 vezes e foram adicionados soros de pacientes
infectados com DENV-1 e DENV-3. Nas placas em que seriam aplicados anti-IgG,
conjugado com peroxidase, a concentração do soro foi de 1:500, e nas placas em
que seriam aplicados anti-IgM, conjugado com peroxidase, a concentração do
soro foi de 1:50. Após a incubação por 1 hora à 37ºC, realizou-se mais 6
lavagens. Foram adicionados os anticorpos Anti-IgG e Anti-IgM conjugados,
marcados com peroxidase (Amersham Biosciences, 1:5000) diluídos em solução
de bloqueio, com incubação por 1 hora à 37ºC. Em seguida, a placa foi lavada por
mais 6 vezes, e então revelada com 100µL/poço de uma solução contendo OPD
(O- Phenylenediamine dihydrochrloide – Sigma Chemical), H2O2, e tampão citrato
(0,1M). A reação foi interrompida pela adição de 10 µL de H2SO4 4 M. A leitura da
absorbância foi feita em leitor Multiscan Plus versão 2.03, com filtro 492nm.
47
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Antígenos
A leitura no espectrofotômetro do antígeno foi de 0,255 numa diluição de
2% (2 µl de antígeno : 98 µl de água). A concentração obtida do antígeno foi
estimada em 5,115 µg/ml, obtida através da equação y = 0,0286x – 0,0376 (onde
“y” representa a concentração protéica final estimada, e “x” representa a leitura
espectrofotométrica em densidade ótica à 595 nm), com qui-quadrado de 0,9774.
Aves
Ainda é pequeno o conhecimento da resposta humoral em galinhas para
antígenos da dengue. Segundo Lemamy e colaboradores (1999), aves têm
capacidade de produzirem anticorpos com alto título e grande persistência da
resposta imune para proteínas de bactérias e mamíferos. Além disso, os
anticorpos produzidos em galinhas possuem vantagens bioquímicas como
resistência a pH extremo (Lee et al.,2002), resistência à temperatura elevada
(Jensenius et al.,1988), grande afinidade (Ikemori et al.,1993) e avidez (Stuart et
al.,1988), motivo pela qual, têm sido usadas eficientemente em análises
imunológicas (Schade et al.,1996). Estas foram características essenciais para a
escolha de galinhas no desenvolvimento da resposta imune contra o vírus da
dengue.
Purificação e concentração dos anticorpos
Após a sexta imunização, o título encontrado foi de 1:1800, valor
considerado satisfatório para obtenção de anticorpos.
A purificação dos anticorpos foi considerada eficiente, pois houve uma
limpeza das amostras na coluna de purificação após a incubação do soro,
mostrado pelo decréscimo da densidade ótica (OD) nas frações coletadas. As
amostras que apresentaram OD semelhantes foram reunidas em um único tubo,
48
obtendo um total de 7 amostras. Os rendimentos protéicos das frações após a
concentração e diálise podem ser observados na Tabela 1.
Tabela 1: Absorbância e quantificação dos anticorpos obtidos após a concentração e diálise.
Amostra Absorbância (280 nm)
Quantificação (mg/mL)
1 0,420 3 2 0,366 2,6 3 0,445 3,18 4 1,290 9,2 5 1,000 7,14 6 0,220 1,57 7 0,186 1,33
As frações coletadas foram analisadas quanto ao perfil eletroforético (SDS-
PAGE 16%) demonstrando estar parcialmente livre de impurezas que pudessem
prejudicar o procedimento de seleção de peptídeos recombinantes, como mostra
a Figura 10. As bandas de IgY obtidas contém as seguintes massas moleculares:
~ 180 kDa (IgY inteira); ~ 66kDa (cadeia pesada) e ~ 25 kDa (cadeia leve). A
fração usada no biopanning é a da canaleta 4.
Figura 10: Perfil eletroforético (SDS-PAGE 16%) de IgYs purificadas de soros de galinhas imunizadas com proteínas virais totais de dengue do tipo 3 (Canaleta 1 – soro total; 2-8 – soro purificado; M – marcador de peso molecular
1 2 3 4 5 6 7 8 M 205 kDa
116 kDa 97,4 kDa 66 kDa
45 kDa
29 kDa
49
Teste ELISA para confirmar a especificidade de IgY
Foram testados soros de galinhas anteriormente imunizadas com proteínas
totais do vírus da dengue tipo 3, além de galinhas mantidas como controle,
imunizadas somente com adjuvante. Estes soros foram confrontados com
proteínas totais do vírus da dengue tipos 1, 2 e 3.
Como pode ser observado na Figura 11, não houve diferença significativa
entre os índices ELISA encontrados para os diferentes tipos virais, demonstrando
que o IgY obtido não foi específico para o dengue tipo 3.
Figura 11 ELISA para teste de imunorreatividade do anticorpo purificado obtido de galinhas imunizadas com proteína total do vírus da dengue tipo 3 contra proteínas virais de dengue 1, 2 e 3.
Biopanning – Seleção de peptídeos
As titulações realizadas foram eficientes em todos os ciclos de seleção de
peptídeos. As colônias apresentaram coloração azulada, demonstrando a quebra
do substrato X-Gal, e a expressão do gene da β-galactosidase dos fagos pelas
bactérias ER27308 (Barbas, 2001), como mostrado na Figura 12. Colônias
brancas não eram esperadas neste processo, pois somente a azuis sobrevivem
ao antibiótico. A presença de colônias brancas indicaria a contaminação do
experimento com fagos de origem selvagem.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
EL
ISA
DENV-1 DENV-2 DENV-3
Tipos Virais
IgY imune
IgY controle
50
Contava-se o rendimento das placas que apresentavam aproximadamente
100 colônias, para calcular a quantidade de eluato a utilizar nas etapas
subseqüentes. Os valores das titulações mostraram enriquecimento dos fagos
específicos, que ficavam retidos na placa, durante os processos de seleção
(Tabela 2).
Figura 12: Exemplo de placas resultantes da titulação. As colônias azuis representam a infecção de bactérias E.coli (ER2738) com fagos M13 carregando o gene lacZ da β–galactosidase.
Tabela 2: Títulos (em pfc: unidades formadoras de colônias) obtidos nos quatro ciclos de seleção.
Número de partículas de fagos Ciclo
Eluato não amplificado Eluato amplificado
Primeiro 1,3 x 103 4,2 x 107
Segundo 4,9 x 103 9,9 x 109
Terceiro 1,6 x 104 5,0 x 1010
Quarto 1,3 x 105 5,4 x 1010
51
ELISA Pré-Sequenciamento
Com a realização do teste de ELISA, foi possível observar que 51,61% dos
clones apresentaram reatividade acima do Índice ELISA (IE) calculado (Tabela 3).
A Tabela mostra em vermelho os clones positivos (IE ≥ 1), que foram utilizados no
sequenciamento, e em azul os controles negativos (fagos selvagem), que não
foram seqüenciados. Os clones marcados em preto também não foram
seqüenciados, por terem apresentado baixa reatividade.
Tabela 3: ELISA para teste de imunorreatividade* dos clones selecionados contra o anticorpo purificado obtido de galinhas imunizadas com proteína total do vírus da dengue tipo 3. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0,064 0,064 0,208 0,131 0,065 0,112 0,060 0,06 0,071 0,066 0,063 0,062 B 0,080 0,131 0,084 0,166 0,180 0,072 0,076 0,078 0,173 0,071 0,079 0,076 C 0,112 0,210 0,108 0,169 0,108 0,099 0,129 0,098 0,077 0,081 0,181 0,100 D 0,072 0,072 0,069 0,070 0,063 0,067 0,066 0,130 0,069 0,065 0,072 0,090 E 0,099 0,075 0,072 0,152 0,071 0,068 0,071 0,065 0,132 0,071 0,070 0,072 F 0,079 0,122 0,073 0,077 0,071 0,069 0,070 0,064 0,066 0,113 0,072 0,071 G 0,150 0,071 0,136 0,071 0,079 0,070 0,148 0,104 0,111 0,055 0,062 0,070 H 0,056 0,054 0,102 0,054 0,099 0,093 0,060 0,069 0,076 0,080 0,084 0,072
*Números em vermelho significam índice ELISA significantes. Os números em azul são os controles negativos (fago selvagem).
Sequenciamento de DNA e Bioinformática
A análise eletroforética do DNA obtido mostrou a ausência de degradação
ou de contaminantes, tais como RNA bacteriano (Figura 13).
As seqüências de DNA geradas foram visualizadas pelo programa
Sequence Analyser (MegaBace, Amersham Biosciences), para análise de sua
qualidade. A tradução destas seqüências de DNA em aminoácidos foi feita pelo
programa DNA2PRO7 (RELIC Softwares), específico para bibliotecas de 7
peptídeos da “New England Biolabs”. Este software gerou 25 seqüências de
aminoácidos, sendo 14 distintas entre si. A seqüência YQDSAKT repetiu-se por
12 vezes.
52
Figura 13: Perfil eletroforético das amostras de DNA extraídas dos clones obtidos no processo de seleção. M - marcador de peso molecular
A Tabela 4 apresenta diversos parâmetros para a indicação do sucesso de
seleção de cada peptídeo, conforme Rodi et al. (2002). Os seguintes parâmetros
são mostrados: seqüências de aminoácidos obtidas, juntamente com a freqüência
dos peptídeos expressos nos fagos selecionados a partir do quarto ciclo de
seleção. Além disso, a Tabela também mostra a amplificação dos peptídeos
decorrentes do processo de seleção em relação à freqüência esperada (FE) dos
peptídeos na biblioteca original. Na mesma Tabela, o grau de informação de cada
peptídeo foi calculado utilizando o log neperiano da probabilidade de ocorrência
ao acaso do fago na biblioteca, sendo que quanto maior o grau de informação,
melhor o peptídeo, ou seja, a seleção foi mais efetiva e, mais raro ele é na
biblioteca. Outro dado apresentado, foi o número provável de clones
independentes dentro da biblioteca (λ)
O peptídeo YQDSAKT foi o mais freqüente na seleção e o quarto com o
maior índice de informação, tornando-se um dos principais mimotopos
selecionados, especialmente quando se considera o número de clones
independentes previstos na biblioteca com esta mesma seqüência, ou seja, neste
caso espera-se somente um único clone. Contudo, o peptídeo com o maior índice
de informação foi o VLRNVHN, o qual apresenta o principal motivo protéico
VLRN. Peptídeos que exibem alto grau de informação são menos prováveis de
ocorrer ao acaso do que aqueles que possuem baixo nível de informação (Rodi et
al., 2002).
Os aminoácidos arginina e cisteína nas seqüências de peptídeos
randômicos atuam na secreção de Proteína III e podem interferir na infectividade
M
53
dos fagos. Conseqüentemente, clones com peptídeos contendo estes
aminoácidos podem ser menos freqüentes durante a seleção (Noren e Noren,
2001). De acordo com os resultados obtidos, nenhum peptídeo apresenta
cisteína (C), enquanto que 10 possuem arginina (R), demonstrando não só sua
importância nos motivos protéicos, quanto a sua baixa interferência na freqüência
de peptídeos com este aminoácido. Observou-se, ainda, que houve um grande
enriquecimento de todos os peptídeos selecionados em relação às suas
freqüências esperadas na biblioteca de fagos, sugerindo que os fagos são
específicos para dengue.
Tabela 4: Seqüências de aminoácidos, freqüências observada e esperada, e amplificação dos peptídeos e grau de informação.
Peptídeos Freqüência Observada
(FO)
Probabilidade da Seqüência Randômica (FE)*
Amplificação(FO/FE) I(m)** λ***
YQDSAKT 12/25 (48%) 5,72 x 10-10 8,39 x 109 21,282 1 ALYPARI 1/25 (4%) 2,13 x 10-9 1,87 x 108 19,966 4 TYKLPPP 1/25 (4%) 4,03 x 10-9 9,92 x 107 19,329 8 LLRNAST 1/25 (4%) 2,24 x 10-8 1,78 x 107 17,611 44 VLRNAPP 1/25 (4%) 7,12 x 10-9 5,61 x 107 18,759 14 VLRNSPT 1/25 (4%) 5,61 x 10-9 7,13 x 107 18,998 11 VLRNVHN 1/25 (4%) 2,62 x 10-11 1,54 x 1010 24,366 0,05 KLWNISS 1/25 (4%) 2,88 x 10-9 1,39 x 108 19,665 5 ALRNLGP 1/25 (4%) 5,30 x 10-10 7,55 x 108 21,358 1 VLRNMNP 1/25 (4%) 1,06 x 10-9 3,77 x 108 20,665 2 MLRNLPP 1/25 (4%) 4,86 x 10-9 8,23 x 109 19,142 9 ALRNYTS 1/25 (4%) 4,80 x 10-10 8,33 x 108 21,457 0,9 QLRNAPP 1/25 (4%) 7,12 x 10-9 5,62 x 107 18,759 14 KLFNANP 1/25 (4%) 1,06 x 10-7 3,77 x 106 16,051 212 *Probabilidade de sequência randômica = freqüência esperada na biblioteca (FE) **I(m) = grau de informação = -ln (probabilidade de seqüência randômica) ***λ = número provável de clones independentes na biblioteca = complexidade x
FE, onde: complexidade da biblioteca = ~ 2 x 109.
A freqüência de cada aminoácido dos clones seqüenciados foi apresentada
pelo programa AAFREQ. Os aminoácidos mais freqüentes foram L (16), N (14) e
P (14), como mostra a Tabela 5. O fato das bibliotecas serem de peptídeos
randômicos permite que vários clones possam compartilhar os mesmos motivos,
mas com resíduos em posições diferentes do peptídeo, fazendo com que certos
54
aminoácidos sejam mais freqüentes após a seleção e sequenciamento. Assim,
aqueles presentes resíduos mais freqüentes nas sete posições esperadas da
biblioteca, são alinhados e anotados como prováveis motivos. Logo, a alta
freqüência desses aminoácidos, nas referidas posições do peptídeo
recombinante, pode indicar um provável motivo não apresentado nos clones
selecionados, mas descoberto pela combinação de várias seqüências.
Nesta mesma tabela foi possível identificar o peptídeo consenso
(VLRNAPP) através dos aminoácidos que apresentaram maior freqüência. Pode-
se notar que o peptídeo consenso foi um dos peptídeos selecionados, no entanto
não se trata de um peptídeo com alto grau de informação, tornando-se mais
comum a sua ocorrência ao acaso.
Tabela 5: Freqüência de aminoácidos dos clones seqüenciados. Em vermelho estão os aminoácidos que apresentam maior freqüência.
AA 1 2 3 4 5 6 7 Total Freqüência A 3 0 0 0 6 0 0 9 0,0918 C 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0000 D 0 0 1 0 0 0 0 1 0,0102 E 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0000 F 0 0 1 0 0 0 0 1 0,0102 G 0 0 0 0 0 1 0 1 0,0102 H 0 0 0 0 0 1 0 1 0,0102 I 0 0 0 0 1 0 1 2 0,0204 K 2 0 1 0 0 1 0 4 0,0408 L 1 12 0 1 2 0 0 16 0,1633 M 1 0 0 0 1 0 0 2 0,0204 N 0 0 0 11 0 2 1 14 0,1429 P 0 0 0 1 1 5 7 14 0,1429 Q 1 1 0 0 0 0 0 2 0,0204 R 0 0 9 0 0 1 0 10 0,1020 S 0 0 0 1 1 2 2 6 0,0612 T 1 0 0 0 0 1 3 5 0,0510 V 4 0 0 0 1 0 0 5 0,0510 W 0 0 1 0 0 0 0 1 0,0102 X 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0000 Y 1 1 1 0 1 0 0 4 0,0408 98
Consenso V L R N A P P
A Figura 14, gerada pelo programa ClustalW 18.1, mostra o alinhamento
dos 14 clones selecionados, permitindo notar a presença de seqüências de
aminoácidos comuns. Nota-se a presença do motivo protéico VLRN repetido entre
55
os clones selecionados, mostrado em vermelho, sendo 4 clones com homologia
total, e 7 clones com homologia parcial. Os motivos APP e LPP, mostrados em
verde e cinza, respectivamente, compartilham os resíduos PP e apresentam 2
clones cada com homologia total, contudo o APP possui 4 clones parciais,
enquanto que o LPP possui 2 clones com homologia parcial.
O peptídeo consenso, obtido pela freqüência do aminoácido que mais
ocorreu, foi alinhado pelo programa Blast com as seqüências completas das
proteínas específicas para Dengue, depositadas em banco de dados (GeneBank),
com o objetivo de obter seqüências comuns entre ambos O resultado deste
alinhamento demonstrou que este peptídeo apresenta similaridades com o
precursor de poliproteína de DENV-4 (gi|11096033|gb|AAG30148.1|), pelo motivo
VLRN. Pode-se concluir, portanto, que o motivo consenso não é específico para
DENV-3.
seq1 KLWNISS-7 seq2 KLFNANP-7 seq9 LLRNAST-7 seq5 VLRNAPP-7 seq13 QLRNAPP-7 seq6 VLRNVHN-7 seq8 VLRNSPT-7 seq7 VLRNMNP-7 seq10 ALRNLGP-7 seq11 MLRNLPP-7 seq12 ALRNYTS-7 seq4 TYKLPPP-7
seq14 ALYPARI—7 seq3 YQDSAKT-7
Figura 14: Alinhamento dos 14 peptídeos selecionados pelo programa ClustalW 18.1.
O índice de antigenicidade foi calculado para cada um dos peptídeos pelo
programa Protean 4.0, gerando a Figura 15, onde se podem observar índices que
variam de 1,7 à –1,7, para os maiores e menores índices de antigenicidade,
respectivamente. Os números de 1 a 7 representam a seqüência de aminoácidos
dos peptídeos mencionados à esquerda. A antigenicidade dos peptídeos foi
56
predita para verificação da ocorrência de reconhecimento pelas imunoglobulinas.
Ainda, epítopos ausentes de homologias, assim como epítopos conformacionais,
poderiam ser relacionados como um provável alvo em função da observação dos
valores antigênicos.
O índice de antigenicidade de Jameson-Wolf (Jameson e Wolf, 1988) prediz
determinantes antigênicos potenciais combinando métodos de predição estrutural
de proteínas. Os resultados são mostrados com picos – determinantes antigênicos
potenciais. O algorítimo pode ser usado para predizer as características
topológicas da proteína, diretamente a partir da seqüência primária dos
aminoácidos. O programa gera valores para parâmetros de acessibilidade,
combina os valores obtidos para regiões flexíveis e prediz a estrutura secundária,
criando um perfil linear do contorno da proteína. A maioria dos picos antigênicos
das proteínas está localizada nas suas regiões expostas, sendo que o programa
oferece meios de predizer determinantes antigênicos potenciais.
Nota-se que a presença do motivo principal VLRN nos peptídeos, destacada
em vermelho, não determina o índice de antigenicidade, exceto para os clones 8 e
13, que apresentaram valores positivos apenas para o motivo parcial LRN. Estes
índices positivos são altamente influenciados por alguns resíduos vizinhos, pois
peptídeos semelhantes como as seqüências dos clones 5 e 13, mudam em
apenas um único resíduo (V x Q) determinando um comportamento totalmente
diferente quanto ao índice de antigenicidade. Os peptídeos contendo o motivo
LPP, destacado em cinza, apresentam índices de antigenicidade razoavelmente
altos na região correspondente à estes aminoácidos, assim como aqueles que
contêm o motivo APP, destacado em verde. Clones individuais, que não
apresentam homologia com outros fagos, também apresentaram altos índices,
como o de seqüência 3, e devem ser investigados quanto a sua especificidade e
localização protéica.
57
Peptídeos 1 2 3 4 5 6 7
Seq 1 KLWNISS
Seq 2 KLFNANP
Seq 3 YQDSAKT
Seq 4 TYKLPPP
Seq 5
VLRNAPP Seq 6
VLRNVHN Seq 7
VLRNMNP Seq 8
VLRNSPT Seq 9
LLRNAST Seq 10
ALRNLGP Seq 11
MLRNLPP
Seq 12 ALRNYTS
Seq 13 QLRNAPP
Seq 14
ALYPARI
Figura 15: Índices de antigenicidade preditas para os peptídeos selecionados gerados pelo programa Protean 4.0. Os números 1 a 7 representam a seqüência de aminoácidos dos peptídeos mencionados à esquerda. Em destaque, os peptídeos com domínios selecionados.
Os peptídeos obtidos no processo de seleção foram alinhados pelo
programa Blast com as seqüências completas das proteínas específicas para
58
Dengue, depositadas em banco de dados (GeneBank), com o propósito de avaliar
o grau de similaridade entre as seqüências (Tabela 6).
Tabela 6: Alinhamento entre os peptídeos selecionados e proteínas de DENV.
Peptídeo IE Proteínas Motivo KLWNISS 1,78 gi|26245725|gb|AAN77510.1| NS5 [DENV-2] WxxSS
KLFNANP 1,09 gi|33914246|gb|AAL99210.1| Proteína do envelope [DENV-3] LFxANP
YQDSAKT 1,08 gi|37545165|gb|AAM51546.1| Poliproteína [DENV-3] DSAK TYKLPPP 1,67 gi|22384959|gb|AAM96029.1| Poliproteína [DENV-2] YKxPP
VLRNAPP 2,27 gi|11096033|gb|AAG30148.1| Precursor de poliproteína [DENV-4] VLRN
VLRNVHN 2,47 gi|11096033|gb|AAG30148.1| Precursor de poliproteína [DENV-4] VLRN
gi|11096033|gb|AAG30148.1| Precursor de poliproteína [DENV-4] VLRN
gi|75706485|gb|ABA25791.1| Proteína do envelope [DENV-3] LRxM
gi|31376239|gb|AAN73071.1| Poliproteína [DENV-3] LRxM
VLRNMNP 2,37
gi|81301435|gb|ABB70563.1| Poliproteína [DENV-1] VLxxMN gi|11096033|gb|AAG30148.1| Precursor de poliproteína [DENV-4]
VLRN VLxxxPT
gi|18378364|gb|AAL68559.1| Proteína do envelope [DENV-2]
RNxPT
gi|40643331|emb|CAD31751.1| Poliproteína [DENV-2] LRxxPT
VLRNSPT 2,08
gi|38327270|gb|AAR17682.1| NS1 [DENV-2] LRxxPT
gi|37543958|gb|AAM51538.1| Poliproteína [DENV-3] LLRN LRxAS LLRNAST 2,85
gi|25992096|gb|AAN77049.1| NS2b [DENV-3] LLRN gi|30523272|gb|AAP31664.1| Anticorpo anti-DENV NLPP gi|40643331|emb|CAD31751.1| Poliproteína [DENV-2] LRxLP gi|14269098|gb|AAK58017.1| Precursor de poliproteína [DENV-4] LRxLP
gi|254054|gb|AAB22972.1| NS3 [DENV-1] LRxLP
MLRNLPP 1,55
gi|1407811|gb|AAB03620.1| NS3 [DENV-2] LRxLP
gi|58044290|gb|AAW64434.1| Poliproteína [DENV-1] ALRxxxxxxNL ALxNL
gi|4337013|gb|AAD18036.1| Poliproteína [DENV-2] LRxLG ALxNL
gi|54401699|gb|AAV34603.1| Poliproteína [DENV-3] ALxNL gi|57544910|gb|AAW51420.1| Poliproteína [DENV- 4] LRxLG gi|14269098|gb|AAK58017.1| Precursor de poliproteína [DENV-4]
LRxLG
gi|38327274|gb|AAR17684.1| NS1 [DENV-4] LRxLG
ALRNLGP 1,42
gi|27368030|gb|AAN03445.3| Glicoproteína do envelope [DENV-1]
ALxNL
gi|40643331|emb|CAD31751.1| Poliproteína [DENV-2] LRxxTS gi|37543958|gb|AAM51538.1| Poliproteína [DENV-3] LRxxTS gi|28171513|gb|AAN38633.1| NS2a [DENV-4] LRxxTS ALRNYTS 1,09 gi|14269098|gb|AAK58017.1| Precursor de poliproteína [DENV-4] LRxxTS
QLRNAPP 2,48 gi|37545165|gb|AAM51546.1| Poliproteína [DENV-3] QLxNA
59
Assim como ocorreu com o peptídeo consenso, o resultado destes
alinhamentos demonstrou que estes peptídeos apresentam similaridades com
proteínas relacionadas à dengue previamente depositadas em banco de dados, no
entanto, não é específica para DENV-3, sendo encontrados também em proteínas
dos demais tipos virais. O peptídeo ALYPARI não obteve nenhuma semelhança
significante com DENV, embora possua o motivo LxP, homólogo parcial ao LPP.
As seqüências obtidas alinharam com algumas proteínas do DENV. Em
virtude da representação conservada em determinadas regiões ao longo dos
peptídeos, os motivos poderiam representar importantes epítopos contínuos ou
descontínuos dos antígenos (Cortese et al.,1995; Yang e Shiuan, 2003).
Observando os resultados obtidos, nota-se a similaridade de alguns clones
com poliproteínas de DENV: VLRNMNP (DENV-1), TYKLPPP, MLRNLPP,
ALRNYTS (DENV-2), YQDSAKT, VLRNMNP, LLRNAST, ALRNLGP, ALRNYTS,
QLRNAPP (DENV-3) e ALRNLGP (DENV-4), pelas seqüências VLxxMN, YKxPP,
LRxLP, LRxxTS, DSAK, LRxM, LLRN (seqüência do peptídeo LLRNAST), LRxAS
(seqüência do peptídeo LLRNAST), ALxNL, LRxxTS e QLxNA, respectivamente.
Essas poliproteínas são codificadas pelo genoma do vírus e são processadas em
10 polipeptídeos, sendo 3 estruturais e 7 não estruturais.
Os peptídeos, com seus respectivos motivos, VLRNAPP (VLRN),
VLRNVHN (VLRN), VLRNMNP (VLRN), VLRNSPT (VLRN e VLxxxPT),
MLRNLPP (LRxLP), ALRNLGP (LRxLG) e ALRNYTS (LRxxTS) apresentam
similaridades com o precursor de poliproteína para DENV-4. Todas as proteínas
do vírus derivam de uma poliproteína precursora de grande tamanho, por
processamento proteolítico co-traducional e pós-traducional (Tibaire Montes,
2001), daí a importância dos peptídeos serem similares a esta poliproteína.
Os clones que apresentam similaridade com proteínas do envelope (E) de
diferentes tipos virais são: ALRNLGP (AlxNL), para glicoproteína do envelope do
DENV-1; VLRNSPT (RNxPT), para proteína do envelope do DENV-2; e KLFNANP
(LFxANP) e VLRNMNP (LRxM), para proteína do envelope do DENV-3. A proteína
E possui 53 kDa, e contêm importantes determinantes antigênicos (Alisson et al.,
2001). Provavelmente os peptídeos estão compartilhando similaridades
antigênicas, entre os motivos e talvez entre as proteínas. Thullier e colaboradores
(2001), usando um anticorpo monoclonal que neutraliza todos os sorotipos do
60
dengue, ligante à glicoproteína do envelope, identificaram o clone WSLFLNHAE
similar à seqüência da proteína. Segundo os autores, este é um segmento crítico
para a infectividade de todos os quatro sorotipos. Interessante observar que essa
seqüência crítica possui algumas similaridades em relação aos peptídeos
selecionados que se alinharam com a proteína do envelope, especificamente
considerando os motivos LN ou LF.
A proteína NS1 tem identidade com os peptídeos VLRNSPT (DENV-2) e
ALRNLGP (DENV-4), que têm motivos LRxxPT e LRxLG, respectivamente. A NS1,
com 40 KDa, possui atividade na maturação viral e é encontrada na superfície,
ligada à membrana da célula infectada, podendo também ser secretada. Essa
proteína tem capacidade imunizante, sendo que os anticorpos atuam como
mediadores de fenômenos de citotoxidade por linfócitos, através de seus
receptores para a porção Fc de imunoglobulinas (Figueiredo, 1999). Wu et al.
(2001), usando um anticorpo monoclonal sorotipo-específico de DENV-1,
identificaram um epítopo (célula B) de peptídeo randômico expresso em fago, com
motivo consenso HxYxW, que mimetiza a seqüência HKYSWK da proteína NS1 do
mesmo tipo viral. Em outro trabalho, os mesmos autores (2003), usando a mesma
metodologia com enfoque em DENV-2, confirmaram que o motivo HRL foi crucial
para a ligação peptídeo-anticorpo. Interessantemente, este motivo apresenta
identidade parcial às seqüências lineares LR observadas nos diversos clones
selecionados por nosso grupo.
O peptídeo ALRNYTS apresenta similaridade com a proteína NS2a de
DENV-4 apresentando o motivo LRxxTS. Já o clone LLRNAST, com o provável
motivo LLRN, apresenta similaridade com a proteína NS2b de DENV-3. Ambas
são proteínas pouco conhecidas no ponto de vista imunológico em DENV,
sugerindo mais estudos com estas proteínas.
O peptídeo MLRNLPP apresenta similaridade com proteína NS3 de DENV-
1 e DENV-2 através do motivo LRxLP. Esta proteína, com 69 kDa, é uma enzima
bifuncional, nucleotídea, trifosfatase/helicase viral. A NS3 que se apresenta em
contato com a superfície celular ou é secretada, possui capacidade imunizante. A
presença de NS3 estimula a destruição das células infectadas por linfócitos T
citóxicos (Figueiredo, 1999).
61
O peptídeo KLWNISS apresentou similaridade com a proteína NS5 de
DENV-2 pelo motivo WxxSS. Essa proteína é a maior das dez proteínas e a mais
altamente conservada, com 104 kDa. É uma proteína que possui domínios que
contêm atividade enzimática que são cruciais para o ciclo replicativo do vírus
(Chao et al., 2005). A similaridade deste peptídeo à proteína NS5 pode justificar a
ocorrência de reatividade cruzada dos demais peptídeos aos múltiplos sorotipos
virais (Rothman, 2004).
Os peptídeos VLRNSPT e ALRNLGP, similares a NS1; e MLRNLPP, similar
a NS3, podem se tornar importantes alvos vacinais, por serem altamente
imunogênicas e importantes alvos de anticorpos contra a dengue.
Epítopos podem ser classificados como conformacionais (seqüências
descontínuas) ou não conformacionais (seqüências lineares). Epítopos lineares
são curtos estiramentos da estrutura da proteína primária, composta de resíduos
contínuos de aminoácidos da seqüência primária. Epítopos conformacionais
consistem em muitos resíduos de aminoácidos, discretos na seqüência primária,
que montam determinantes antigênicos na forma da estrutura terciária das
proteínas (Barlow et al., 1986). Seqüências consenso podem não mostrar
nenhuma similaridade com a seqüência do antígeno natural (Felici et al., 1993).
Nesse caso, epítopos podem mimetizar epítopos naturais (mimotopos) ou
epítopos conformacionais. Essa pode ser a justificativa para que os prováveis
motivos não tenham sido encontrados na seqüência linear da proteína do
capsídeo.
Como os motivos VxRN e LRN não se alinharam na estrutura linear da
proteína do capsídeo, a busca motivos foi feita diretamente na estrutura terciária
da proteína, por superposição, pelo programa Cn3D (Figura 16).
Ma e colaboradores (2004) apresentaram a estrutura 3D da proteína do
capsídeo, de DENV-2 e encontraram uma dobra alternativa na proteína e esta
região sugere a interação com outros componentes virais na partícula do vírus.
Segundo eles, proteínas C de outros flavivirus podem ter uma dobra similar,
devido à sua seqüência ser conservada.
A proteína C apresenta duas seqüências alvo prováveis, NRVSTVQQL
(porção N-terminal em contato com a membrana viral) e EIGRMLNILNRR (porção
C-terminal em contato com o RNA viral), que possuem respectivamente os motivos
62
VxRN e LRN, ambos conformacionais e não lineares no fago. Todos os sorotipos
do vírus da dengue possuem as seqüências conservadas nas regiões alvo, como
mostra a Tabela 7.
A proteína C de DENV-2 é um dímero simétrico com quatro hélices (dois
pares antiparalelos) (Jones, 2003). Cada dímero possui uma das seqüências alvo
analisadas. Pode-se observar que ambos os motivos estão localizados na porção
mais externa da molécula, propiciando um maior contato de superfície, portanto
tornando-se uma região candidata para a localização de epítopos.
Figura 16: Identificação dos prováveis motivos VxRN e LRN na estrutura terciária da proteína do capsídeo de DENV-2, feito pelo programa Cn3D. Em amarelo, os domínios encontram-se expostos na estrutura conformacional.
N
R V
N R V
L N R
R N L
N R L
R
N L
N
R V
V
N
R
63
Tabela 7: Provável sítio de alinhamento dos motivos VxRN e LRN (em destaque) na seqüência alvo do capsídeo dos tipos DENV-1, 2, 3 e 4.
Seqüência Alvo Proteína Similaridade gi|53680707|gb|AAU89544.1| Poliproteína [DENV-1] EIxxMLNI+NRR gi|2909793|gb|AAC40836.1| Poliproteína [DENV-2] EIGRMLNILNRR gi|51850387|dbj|BAD42421.1| Poliproteína [DENV-3] EIxxML+I+NRR gi|53653753|gb|AAU89380.1| Poliproteína [DENV-4] EIGRMLNILNRR
EIGRMLNILNRR
gi|28171515|gb|AAN38635.1| Precursor de poliproteína [DENV-4] EIGRMLNILNxR
gi|37963458|gb|AAR05860.1| Poliproteína [DENV-1] NRVSTVxQL gi|21070437|gb|AAM34299.1| Poliproteína [DENV-2] NRVSTVQQL gi|37545169|gb|AAM51547.1| Poliproteína [DENV-3] NRVSTxxQL gi|61652905|gb|AAX48017.1| Poliproteína [DENV-4] NRVSTxQxL
NRVSTVQQL
gi|28171470|gb|AAN38615.1| Precursor de poliproteína [DENV-4]
NRVSTxQL
Dos 14 peptídeos selecionados, 6 apresentaram similaridades com
proteínas de comunidades biológicas previamente conhecidas e com
probabilidades de ocorrência ao acaso muito baixa (Tabela 8), sugerindo que os
fagos foram selecionados especificamente para os sítios alvos.
Tabela 8: Peptídeos que apresentaram similaridades com proteínas de comunidades biológicas previamente conhecidas.
Peptídeo SI* Função Padrão AT** P*** Acesso
YQDSAKT SAK
TYKLPPP TYK
Sítio de fosforilação
da proteína Kinase C
[ST]-x-[RK]
Vírus
eucarióticos 1,423 x 10-2 PS00005
ALRNYTS NYTS
LLRNAST NAST
KLWNISS NISS
Sítio de N-
glicosilação
N-{P}-[ST]-
{P}.
Vírus
eucarióticos 5,138 x 10-3 PS00001
ALYPARI ARI Alvo sinal C-terminal
de microcorpos
[STAGCN]-
[RKH]-
[LIVMAFY]
Eucariotos 1,733 x 10-2 PS00342
*SI: Sítio de identificação **AT: Amplitude taxonômica ***P: Probabilidade de ocorrência randômica
Os peptídeos YQDSAKT e TYKLPPP apresentam similaridades com o sítio
de fosforilação da proteína kinase C de vírus eucarióticos, através dos sítios de
identificação SAK e TYK, respectivamente, sendo S ou T o sítio de fosforilação. A
proteína kinase C, está envolvida em processos celulares incluindo secreção,
64
exocitose, expressão gênica, modulação da condução iônica, proliferação celular
e down-regulation de receptores extracelulares (Kapczinski et al., 2004). In vivo, a
proteína Kinase C exibe uma preferência pela fosforilação de resíduos de serina
ou de treonina, encontrados próximos a um resíduo básico C-terminal (Kishimoto
et al., 1985). A presença de resíduos básicos adicionais ao N ou C-terminal do
aminoácido alvo, aumenta a velocidade da reação de fosforilação.
Os peptídeos ALRNYTS, LLRNAST e KLWNISS apresentam similaridades
com o sítio de N-glicosilação dos vírus eucarióticos, através dos sítios de
identificação NYTS, NAST e NISS, respectivamente, sendo N o sítio de
glicosilação. A N-glicosilação é uma das principais modificações pós-traducionais,
sendo responsável por alterações na conformação, estabilidade e
conseqüentemente, na funcionalidade de proteínas em eucariotos (Maia e Leite,
2001). A seqüência de N-glicosilação foi determinada como sendo NxS/T (Asp-x-
Ser/Tre), onde x pode ser qualquer aminoácido, exceto prolina. Esse tripeptídeo,
em geral, faz parte de uma estrutura de folha pregueada (Miletti, 1997).
O peptídeo ALYPARI apresenta similaridade com o alvo sinal C-terminal de
microcorpos de eucariotos, através do sítio de identificação ARI. Microcorpos são
uma classe de organelas citoplasmáticas, a qual pertencem os peroxissomos e
glioxissomos. Proteínas de microcorpos são sintetizadas em polissomos livres e
importadas até as organelas (de Hoop e Ab, 1992). Tem sido experimentalmente
mostrado que, em algumas proteínas peroxissomais, o alvo sinal reside nos
últimos três aminoácidos do sítio C-terminal (Gould et al., 1988; Gould et al.,
1989; Gould et al., 1990). Esta seqüência consenso é conhecida como SKL (Ser-
Lis-Leu), no entanto, algumas variações são possíveis em todas as três posições.
A presença de domínios conhecidos de vírus eucarióticos/eurcariotos
sugere que os peptídeos selecionados possuem similaridade com o vírus da
dengue e podem estar associados ao processo de modulação do vírus no
hospedeiro. Aqueles peptídeos que não apresentaram semelhança com nenhuma
comunidade biológica previamente descrita podem estar associados a novos
sítios biológicos e que devem ser investigados posteriormente.
65
Testes ELISA para os clones contra soro humano específico
O teste ELISA (Figura 17) comprovou que os peptídeos não foram
específicos para DENV-3, uma vez que os clones deveriam reagir apenas com o
soro dos pacientes contaminados com esse tipo viral, bem como com a cultura
específica. Reatividade inesperada também foi observada com os antígenos
específicos para DENV-1, -2, e -3, com positividade significativa apenas para IgG
de DENV-2, embora os soros dos pacientes haviam sido identificados previamente
como IgM positivos, específicos para os tipos 1 e 3, conforme tipagem realizada
por RT-PCR. Portanto, a única explicação plausível para este resultado é que
ocorreu soroconversão dos pacientes de IgM para IgG e que provavelmente houve
erro na tipagem das amostras.
Com relação aos peptídeos selecionados, o ensaio demonstrou que os
clones também apresentaram reação cruzada com soro de pacientes
contaminados com DENV-1. Os peptídeos recombinantes foram superiores em
imunorreatividade em relação aos IE obtidos das proteínas totais da dengue.
Soros de pacientes com DENV-2 e DENV-4 e cultura do tipo 4 não foram
analisados nesse estudo. O fago de seqüência MLRNLPP (Seq 11) também não
foi analisado, por não ter sido previamente amplificado. Estes resultados
corroboram os testes ELISA prévios com IgY e culturas, bem como com os
resultados de bioinformática.
66
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
IE
Soro DENV-1 com clones e anti IgG
0
2
4
6
8
10
12
14
16
IE
Soro DENV-1 com clones e anti IgM
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
IE
Soro DENV-3 com clones e anti IgG
0
1
2
3
4
5
6
IE
Soro DENV-3 com clones e anti IgM
Figura 17: Teste de imunorreatividade dos clones com soro de pacientes contaminados com DENV-1 e 3, e com proteínas totais de DENV-1, 2 e 3.
Seq 1
Seq 2
Seq 3
Seq 4
Seq 5
Seq 6
Seq 7
Seq 8
Seq 9
Seq 10
Seq 12
Seq 13
Seq 14
DENV-1
DENV-2
DENV-3
Controle
67
CONCLUSÕES
• Embora as galinhas da raça White Leghorn tenham sido imunizadas com
antígenos totais do vírus da dengue tipo 3, a resposta imunológica foi
inespecífica para tipo viral, mas com alta sensibilidade ao vírus da
dengue, devendo ser testada contra os outros Flavivirus para determinar
sua especificidade.
• Dentre os 14 fagos recombinantes selecionados em 4 ciclos de seleção
por “Phage Display”, o motivo comum mais freqüente foi o VLRN,
apresentando alto índice de imunorreatividade, com reação cruzada entre
os tipos virais 1 e 3, conforme sorologia específica de indivíduos
infectados com DENV-1 e DENV-3
• Domínios de fosforilação e glicosilação, encontrados em vírus
eucarióticos, foram similares às seqüências presentes em cinco fagos
recombinantes selecionados, resultado este que suporta os outros
achados por sorologia e bioinformática, demonstrando que a seleção de
peptídeos reativos contra anticorpos anti-dengue foi relativamente eficaz,
o que não implica que estes motivos sejam fisiologicamente ativos no
vírus da dengue
68
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Anexo 1:
Reagentes para realização de gel SDS-PAGE (16%)
Soluções Reagentes Gel de separação: Tris-HCl 0,375 M pH 8,8 SDS 0,1% EDTA 2 mM Acrilamida/bis (29/1%) TEMED 0,125% Persulfato de Amônio 0,125% Gel de empilhamento: Tris-HCl 0,125 M pH 6,8 SDS 0,1%
EDTA 2mM Acrilamida/bis (29/1%) TEMED 0,125% Persulfato de Amônio 0,125% H2O Tampão Catodo: Tris 0,1 M Glicina 0,1 M SDS 0,1% H2O Tampão Anodo (pH 8,9): Tris-HCl 0,2 M Tampão da amostra: Tris-HCl 0,1 M pH 6,8 SDS 4% Glicerol 20% Azul de bromofenol 0,2% H2O Solução de Coomassie-blue 0,1% (coloração do gel)
Solução descorante Álcool Etílico 30% Acido Acético 10% H2O 60%
