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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA E RECURSOS NATURAIS
VALÉRIA MARIA ARAÚJO SILVA
FACILITAÇÃO PODE INCREMENTAR A CAPACIDADE DE ADAPTAÇÃO DE
ACTINOBACTÉRIAS E RIZÓBIOS “IN VITRO”
FORTALEZA
2016
VALÉRIA MARIA ARAÚJO SILVA
FACILITAÇÃO PODE INCREMENTAR A CAPACIDADE DE ADAPTAÇÃO DE
ACTINOBACTÉRIAS E RIZÓBIOS “IN VITRO”
FORTALEZA
2016
Dissertação submetida à Coordenação do
Programa de Pós-Graduação em Ecologia e
Recursos Naturais da Universidade Federal do
Ceará como requisito parcial para obtenção do
título de Mestre em Ecologia e Recursos
Naturais.
Orientadora: Profª. Drª. Suzana Claudia
Silveira Martins
Co-orientadora: Profª. Drª. Claudia Miranda
Martins
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Federal do Ceará
Biblioteca de Ciências e Tecnologia
S578f Silva, Valéria Maria Araújo.
Facilitação pode incrementar a capacidade de adaptação de actinobactérias e
rizóbios “in vitro” / Valéria Maria Araújo Silva – 2016. 88 f.: il., color.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências,
Departamento de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Ecologia e Recursos
Naturais, Fortaleza, 2016.
Área de Concentração: Ecologia Microbiana.
Orientação: Profa. Dra. Suzana Cláudia Silveira Martins.
Coorientação: Profa. Dra. Claudia Miranda Martins.
1. Solos. 2. Rizosfera. 3. Micro-organismos. I. Título.
CDD 577
VALÉRIA MARIA ARAÚJO SILVA
FACILITAÇÃO PODE INCREMENTAR A CAPACIDADE DE ADAPTAÇÃO DE
ACTINOBACTÉRIAS E RIZÓBIOS “IN VITRO”
Dissertação submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em
Ecologia e Recursos Naturais, da Universidade Federal do Ceará, como requisito
parcial para obtenção do grau de Mestre em Ecologia e Recursos Naturais, Área de
concentração de Ecologia Microbiana.
Aprovada em 18/02/2016
BANCA EXAMINADORA
Profª. Drª. Suzana Cláudia Silveira Martins (Orientador) Universidade Federal do Ceará-UFC
Prof. Dr. Rogério Parentoni Martins Universidade Federal do Ceará
Profª. Drª Oscarina Viana de Sousa Universidade Federal do Ceará
AGRADECIMENTOS
À Deus, pelo dom da vida e pela oportunidade de chegar até aqui.
Ao Governo do Estado do Ceará, através da SEDUC pela minha liberação das
atividades como docente para realização dessa tão sonhada formação acadêmica.
À UFC e ao PPGERN, pela oportunidade e zelo na formação de seus estudantes.
Agradeço as professoras: orientadora Drª. Suzana Cláudia Silveira Martins e a co-
orientadora Drª. Claudia Miranda Martins pela excelente orientação, auxílio,
paciência, dedicação, carinho, conhecimento, intervenção, apoio e exemplo de
profissionais comprometidas com a formação de seus orientandos. Muito obrigada.
Ao professor Dr. Rogério Parentoni Martins, pelas contribuições ecológicas.
As professoras Drª Oscarina Viana Sousa e Drª Regine Helena Silva dos Fernandes
Vieira, pelas excelentes contribuições na produção do projeto e execução da
pesquisa.
A minha família, pela presença e apoio em todos os momentos da minha vida.
A meus pais, pelo seu amor imensurável e dedicação na formação de suas filhas.
A minhas irmãs, meus anjos na terra, as quais amo infinitamente.
Aos meus tios, Antônio José e Raimunda, pelo apoio durante todo o mestrado.
A família LAMAB, Vínícius, Airlane, Karoline (Karol), Clarice, Fernando, Marcelo,
Mayara, Érika, Larissa (Lari), Andreia, Lucas, Ana Caroline, Juliani, Rhonyele,
Kássia, pessoas especiais que tive a honra de conviver e que muito me ajudaram
durante toda a pesquisa, auxiliando e ensinando. Muito obrigada a todos.
As minhas amigas em Jaguaruana, que me apoiaram durante os momentos críticos,
incentivando e possibilitando momentos de alegria.
Ao Grasiano, pelo apoio, carinho e motivação.
A todos que fizeram parte desse desafio.
RESUMO
O ambiente natural é marcado por uma intrincada rede de interações bióticas que
moldam a estrutura das comunidades ecológicas. A presença de interações
ecológicas positivas entre populações microbianas em solos de regiões semiáridas,
possui grande relevância na estruturação da microbiota do solo local. Neste
trabalho, cepas de actinobactérias e rizóbios oriundas de solo rizosférico do Parque
Nacional de Ubajara-CE, foram avaliadas quanto à capacidade de crescerem
através de mecanismos metabólicos cooperativos. Das 27 actinobactérias avaliadas,
22 apresentaram compatibilidade com rizóbios. As cepas UB-05, UB-07, UB-08, UB-
11 e UB-21, destacaram-se nos ensaios de facilitação para amilase e celulase. A
atividade metabólica de actinobactérias auxiliou o desenvolvimento das cepas de
rizóbios.
Palavras-chave: Interações metabólicas, valor adaptativo, semiárido, micro-
organismos.
ABSTRACT
The natural environment is marked by an intricate network of biotic interactions that
shape the structure of ecological communities. The presence of positive ecological
interactions between microbial populations in soils semiarid regions, has great
importance in structuring the local soil microbiota. In this work, actinomycetes strains
of rhizobia and coming from rhizosphere of Park National Ubajara-CE, were
evaluated for the ability to grow through cooperative metabolic mechanisms. Of the
27 evaluated actinomycetes, 22 showed compatibility with rhizobia. The strains UB-
05, UB-07, UB-08, UB-11 and UB-21 stood out in facilitating tests for amylase and
cellulase. The metabolic activity of actinomycetes helped the development of rhizobia
strains.
Keywords: Metabolic interactions, adaptive value, semiarid, microorganisms.
Sumário
1. Introdução ............................................................................................................... 9
2. Revisão bibliográfica ............................................................................................ 11
2.1 Solo ................................................................................................................. 11
2.2 Rizosfera ......................................................................................................... 13
2.3 Interações Positivas ........................................................................................ 15
2.4 Facilitação e Fitness microbiano: mecanismos de coexistência...................... 17
2.5 Actinobactérias ................................................................................................ 19
2.6 Rizóbios .......................................................................................................... 21
3. Material e Métodos ............................................................................................... 24
3.1 Declaração de Ética ........................................................................................ 24
3.2.1 Procedência das cepas de actinobactérias e rizóbios ............................... 24
3.3 Amostragem .................................................................................................... 25
3.4 Caracterização do Solo ................................................................................... 26
3.5 Rizóbios .......................................................................................................... 26
3.6 Actinobactérias ................................................................................................ 26
3.6.1 Isolamento ................................................................................................ 26
3.6.2 Caracterização cultural ............................................................................. 27
3.7 Caracterização enzimática .............................................................................. 28
3.7.1 Atividade celulolítica .................................................................................. 28
3.7.2 Atividade amilolítica .................................................................................. 29
3.7.3 Determinação do perfil enzimático ............................................................ 29
3.8 Análises estatísticas ........................................................................................ 29
3.9 Seleção de Isolados ........................................................................................ 30
3.10 Facilitação ..................................................................................................... 30
3.10.1 Amido ...................................................................................................... 30
3.10.2 Celulose .................................................................................................. 31
3.11 Seleção de actinobactérias compatíveis com as cepas de rizóbio ................ 31
3.11.1 Caracterização morfológica e micromorfológica das cepas de
actinobactérias compatíveis com rizóbios .......................................................... 31
3.11.2 Análise micromorfológica ........................................................................ 31
3.11.3 Caracterização Fisiológica ...................................................................... 32
4. Resultados ............................................................................................................ 33
4.1 Caracterização cultural .................................................................................... 33
4.2 Caracterização enzimática .............................................................................. 37
4.2.1 Atividade celulolítica .................................................................................. 37
4.2.2 Atividade Amilolítica .................................................................................. 40
4.2.3 Perfil Comparativo da Atividade Enzimática de Actinobactérias e Rizóbios
........................................................................................................................... 43
4.3 Uso de Compostos Metabolizados por Actinobactérias como Fonte de Carbono
para Bactérias Diazotróficas ................................................................................. 46
4.3.1 Teste de Facilitação .................................................................................. 47
4.4 Caracterização Morfológica e Micromorfológica.............................................. 50
4.5 Caracterização Fisiológica .............................................................................. 53
4.5.1 Tolerância a salinidade ............................................................................. 53
4.5.2 Crescimento em diferentes pHs ................................................................ 54
4.5.3 Tolerância a elevadas temperaturas ......................................................... 55
5. Discussão ............................................................................................................. 57
6. Conclusões ........................................................................................................... 69
7. Referências .......................................................................................................... 70
Considerações finais ................................................................................................ 87
Perspectivas Futuras ................................................................................................ 88
9
1. Introdução
O ambiente natural é caracterizado por uma intrincada rede de interações
bióticas que moldam a estrutura das comunidades ecológicas. Essas interações
podem ser positivas ou negativas (Faust; Raes, 2012). Durante muito tempo, os
ecologistas interessados em interações entre espécies direcionaram seus estudos
exclusivamente na competição e predação (Bronstein, 2009; Holmgren; Scheffer,
2010). No entanto, nas últimas décadas, a importância das interações positivas na
organização das comunidades tem sido amplamente reconhecida (Stachowicz,
2001; He; Bertness; Altieri, 2013; He; Bertness, 2014).
Num cenário de interações positivas, a facilitação, definida como um
mecanismo de melhoria de condições ambientais extremas e limitantes constitui um
possível mecanismo de coexistência, tendo em vista que a mesma pode modificar
as condições locais de um ambiente desfavorável, tornando-o propício para outros
seres vivos (Bronstein, 2009). No entanto, a maioria das pesquisas avaliam este tipo
de interação em grupos vegetais (Brooker et al., 2008), desconsiderando assim, a
possibilidade deste tipo de relação ecológica em outras escalas de vida, como a
microbiana.
O solo constitui palco de interações positivas, sobretudo, quanto à facilitação,
uma vez que abriga uma grande variedade de micro-organismos que desempenham
funções críticas no ecossistema e que estabelecem interações cooperativas
derivadas do seu metabolismo (Freilich et al., 2011; Aislabie; Deslippe, 2013). Neste
ambiente heterogêneo, a rizosfera representa um nicho ecológico exclusivo do solo,
apresentando alto teor de nutrientes e composto por numerosos e diversos
organismos microbianos (Adegboye; Babalola, 2012). Fazendo parte dessa distinta
microbiota rizosférica, encontram-se organismos de grande relevância econômica e
ecológica, como actinobactérias e rizóbios.
Actinobactérias representam um dos mais diversos grupos de bactérias
filamentosas, capazes de sobreviver em ambientes de condições e recursos
diferentes devido a sua diversidade metabólica (Suneetha; Karthick; Prathusha,
2011; Mansour; Abdel-Azeem; Abo-Deraz, 2015), já os rizóbios, são bactérias
diazotróficas importantes por sua capacidade de fixar nitrogênio atmosférico através
da simbiose estabelecida entre estes micro-organismos e raízes de plantas ou sua
10
estrutura caulinar (Sabino et al., 2012; Longatti; Marra; Moreira, 2013; Martins, C. et
al., 2015).
Os solos de regiões semiáridas, em geral, apresentam reduzida
disponibilidade de nutrientes e predominância de condições abióticas limitantes,
como intensa radiação solar, baixos índices pluviométricos e elevadas temperaturas
(Zanella, 2014). Essas condições extremas influenciam negativamente o
desenvolvimento das diferentes populações microbianas no referido habitat. No
entanto, actinobactérias e rizóbios constituem dois representativos grupos de
bactérias detectados nos solos destas regiões (Lima et al., 2014; Pinheiro et al.,
2014; Sousa et al., 2014; Silva et al., 2015), onde exercem importante papel
funcional para o equilíbrio ecológico do referido ecossistema.
Diante do exposto, e tendo em vista os raros estudos para compreensão das
interações entre esses dois importantes grupos microbianos em solos de regiões do
semiárido nordestino, o presente trabalho teve como objetivo geral avaliar in vitro, a
ocorrência de facilitação metabólica entre populações de actinobactérias e rizóbios
oriundos de uma região do semiárido do nordeste brasileiro, partindo-se da hipótese
que possíveis interações facilitadoras são importantes para a ampliação do fitness,
permitindo a coexistência estável entre esses organismos e contribuindo para
manutenção da diversidade microbiológica dos solos de regiões semiáridas.
Como objetivos específicos foram considerados: (1) isolar e caracterizar
culturalmente cepas de actinobactérias do solo rizosférico do Parque Nacional de
Ubajara (PNU); (2) determinar o Índice Enzimático (IE), celulolítico e amilolítico das
cepas de actinobactérias previamente caracterizadas e de cepas de rizóbios
originários da mesma região, pertencentes ao acervo microbiológico do Laboratório
de Microbiologia Ambiental (LAMAB); (3) investigar a capacidade co-metabólica
entre cepas de actinobactérias com IE mais significativo e de rizóbios deficientes nas
enzimas avaliadas e (4) selecionar e caracterizar sob os aspectos morfológicos e
fisiológicos as cepas de actinobactérias que apresentarem atividade cooperativa
com cepas de rizóbios.
11
2. Revisão bibliográfica
2.1 Solo
O solo é uma estrutura heterogênea e descontínua constituído de frações
orgânicas e inorgânicas formadas a partir de um complexo processo de forças
físicas, químicas e biológicas que interagem continuamente (Atlas; Bartha, 1997;
Nannipieri et al., 2003; Andreola; Fernandes, 2007). Essas interações permitem que
as partículas de rochas sejam quebradas e transformadas em argila, silte e outros
minerais, compondo um habitat natural bastante diversificado, contendo
comunidades biológicas de elevada complexidade (Siqueira et al., 1994; Barrios,
2007).
Considerado um sistema biológico dinâmico, complexo e essencial para o
funcionamento do ecossistema (Nannipieri et al., 2003; Araújo; Monteiro, 2007), o
solo representa um habitat favorável para inúmeras espécies de organismos
incluindo procariotos e eucariotos (Hinsinger et al., 2009). Esses organismos são
extremamente diversos e essenciais para manutenção da sustentabilidade de
ecossistemas naturais e manejados (Barrios, 2007). Sua população inclui
macrofauna, mesofauna, microfauna e microflora (Scow; Werner, 1998; Nannipieri et
al., 2003), sendo a população microbiana a mais abundante e diversa, chegando a
apresentar mais de 1016 procariotos por tonelada de solo (Curtis; Sloan, 2005; Nazir
et al., 2010; Previati et al., 2012)
Além de constituírem parte integral do solo, as populações microbianas
possuem funções fundamentais para manutenção da estrutura e funcionamento
deste ecossistema por disponibilização de nutrientes para as plantas, decomposição
da matéria orgânica e participação nos processos de ciclagem de nutrientes (Schow;
Werner, 1998; Barrios, 2007; Vinhal-Freitas et al., 2010; Brussaard, 2012; Verastegui
et al., 2014). Segundo Nannipieri et al. (2003) os micro-organismos, principalmente
bactérias e fungos, são os responsáveis por cerca de 80% a 90% dos processos
bióticos que ocorrem neste ambiente.
Cumpre destacar, que apesar da comunidade microbiana representar parcela
preponderante de organismos no solo, menos de 5% do seu espaço poroso é
ocupado por eles (Andreola; Fernandes, 2007), o que ressalta a importância das
condições ambientais nos diferentes micro-habitats. Dentre os fatores que podem
afetar a ecologia, a atividade e a dinâmica das populações microbianas no solo
destacam-se fatores físicos, químicos e biológicos como, fonte de carbono, energia,
12
nutrientes minerais, disponibilidade de água, temperatura, pressão, pH, relações
espaciais e genética dos micro-organismos, dentre outros (Nannipieri et al., 2003;
Gorlach-Lira; Coutinho, 2007; Hinsinger et al., 2009; Prashar; Kapoor; Sachdeva,
2014). Como os micro-organismos são sensíveis a essas variações, oferecendo
respostas rápidas a mudanças na sua estrutura, os mesmos constituem bons
indicadores da qualidade do solo (Araújo; Monteiro, 2007).
Estudos apontam que a qualidade do solo e sua funcionalidade estejam
diretamente relacionadas com a diversidade e abundancia microbiana (Araújo;
Monteiro, 2007; Chaer et al., 2009; Fierer et al., 2009; Previati et al., 2012). Para
O’Donnel et al. (2001), a biodiversidade é função da diversidade genética dos
organismos, sua estrutura, função e por último dos serviços ecossistêmicos por eles
desempenhados. Os mesmos autores salientam que o conhecimento da diversidade
microbiana deve estar associado à diversidade funcional no tempo e espaço, assim
como na influência dos fatores externos, como a gestão, mudanças no clima e no
uso do solo.
Embora estudos mostrem a importância da diversidade microbiana para o
funcionamento dos solos, pouco ainda se conhece sobre essa biodiversidade (Zhou
et al., 2002; Nannipieri et al., 2003; Barrios, 2007). É possível que as variações
ambientais, decorrentes de atividades naturais e antropogênicas, seja um dos
fatores determinantes para referida situação.
O semiárido brasileiro é uma região com ampla variedade de ambientes,
apresentando uma heterogeneidade na vegetação, clima e condições edáficas, com
plantas com adaptações, amplitudes térmicas elevadas e solos com pouca umidade
e oligotróficos (Kavamura, 2012). Essas condições são impostas em especial, pelas
variações pluviométricas baixas, geralmente abaixo de 800 mm anuais e
concentradas durante apenas três ou quatro meses consecutivos, associadas com
uma forte intensidade luminosa recebida pela região (Araújo, 2011; Pagano;
Zandavalli; Araújo, 2013). Essas condições são desfavoráveis para o crescimento
microbiano do solo, a diversidade e atividade microbiana (Gorlach-Lira; Coutinho,
2007).
Na maior parte da região semiárida do nordeste brasileiro os solos não
conseguem absorver a água totalmente devido a presença de um horizonte B
textural, argiloso, que impermeabiliza o solo (Araújo, 2011). Além disso, as elevadas
temperaturas e a evapotranspiração somadas com processos recorrentes de
13
degradação deste ambiente, cumulam em perdas biológicas importantes para
sustentabilidade e manutenção do ecossistema.
Araújo et al. (2014), realizando estudos em região semiárida do Piauí para
comparar a estrutura e diversidade da comunidade microbiana dos solos em uma
região degradada e outra de ambiente restaurado, verificaram que a diversidade foi
menor na área em processo de degradação, enquanto que na região restaurada os
índices de diversidade foram comparáveis a de ambientes de terra nativa.
Apesar dos avanços significativos nos processos de degradação,
desmatamento e contaminação dos solos na região semiárida do nordeste brasileiro
(Araújo, 2011), e da importância da diversidade estrutural e funcional da microbiota
do solo para manutenção do equilíbrio desse ambiente, constata-se que ainda são
raros os estudos sobre essas propriedades. Assim, faz-se pertinente o
desenvolvimento de pesquisas que avaliem esses parâmetros com o intuito de
compreender e auxiliar nas práticas de conservação deste importante ecossistema.
2.2 Rizosfera
O termo rizosfera foi definido por Hiltner em 1904 como a porção do solo que
recebe a influência direta das raízes e com características distintas que suporta
elevada diversidade microbiana (Cardoso; Nogueira, 2007; Prashar; Kappor;
Sachdeva, 2014; Haichar et al., 2014).
Além de representar uma zona ecológica única do solo (Prashar; Kappor;
Sachdeva, 2014), a rizosfera constitui um habitat mutável e dinâmico, uma vez que
sofre influência direta da estrutura vegetal e suas dimensões são determinadas pelo
tipo, composição e umidade do solo (Pereira, 2000; Moreira; Siqueira, 2006; Dantas
et al., 2009; Hinsinger et al., 2009). Essas características permitem que este
ecossistema seja altamente especializado e possibilite a sobrevivência de um
expressivo número de micro-organismos, principalmente bactérias e fungos (Dantas
et al., 2009).
Neste ambiente as raízes liberam secreções, também denominados de
exsudados que se classificam de acordo com suas propriedades químicas e o local
de origem (Nannipieri et al., 2007), que atuam no crescimento de bactérias e fungos
que colonizam a rizosfera (Cardoso; Nogueira, 2007). Os exsudados radiculares
podem ser de baixo ou de alto peso molecular, neles estão inclusos aminoácidos,
14
ácidos orgânicos, açúcares, vitaminas, peptídeos, enzimas, proteínas, dentre outros
(Nannipieri et al., 2007; Jesus, 2013; Haichar et al., 2014; Prashar; Kappor;
Sachdeva, 2014).
Esses exsudados tornam este ambiente altamente rico em nutrientes em
relação ao restante do solo, atuando também como mensageiros que se
comunicam, contribuindo para ocorrência de interações físicas e biológicas entre
raízes e organismos do solo (Walker et al., 2003; Prashar; Kappor; Sachdeva, 2014),
as quais podem ser positivas ou negativas (Badri; Vivanco, 2009).
Pouco se conhece sobre a capacidade de dispersão dos micro-organismos
(Classen et al., 2015), principalmente em relação ao solo. No entanto, estima-se que
cerca de 4% a 10% da superfície radicular seja colonizada por eles (Moreira;
Siqueira, 2006), representando uma maior concentração na rizosfera do que em solo
não rizosférico (Cardoso; Nogueira, 2007).
Prashar; Kappor; Sachdeva (2014), afirmam que a rizosfera possui um grande
pool de micro-organismos do solo, sendo considerada como ponto chave para
colonização e atividade microbiana. Isso se deve principalmente à abundância de
nutrientes e a capacidade de utilização de diversos substratos por bactérias,
permitindo que maiores populações bacterianas possam ser encontradas na
rizosfera, em comparação com outros micro-organismos do solo.
A maior parte dos gêneros bacterianos encontrados na rizosfera incluem,
Pseudomonas, Bacillus, Arthrobacter, Rhizobia, Agrobacterium, Alacaligenes,
Azobacter, Mycobacterium, Flavobacter, Cellulomonas e Micrococcus, sendo
também um nicho favorável para alguns gêneros de actinobactérias como
Streptomyces e Nocardia (Dantas et al., 2009; Prashar; Kappor; Sachdeva, 2014).
Ao mesmo tempo que a atividade microbiana na rizosfera altera os processos
e padrões da exsudação radicular, assim também, a rizodeposição influencia
fortemente tanto a estrutura como os aspectos funcionais das comunidades
microbianas na rizosfera (Prashar; Kappor; Sachdeva, 2014), pois uma vez que este
processo aumenta o fluxo de carbono disponível, acaba favorecendo uma intensa
atividade metabólica das populações, influenciando direta e positivamente o tempo
de geração microbiano (Moreira; Siqueira, 2006).
De acordo com Pereira (2000), a comunidade reflete seu habitat, sendo
assim, a densidade da população microbiana na rizosfera aumenta até encontrar
limitações de natureza biótica ou abiótica (Hinsinger et al., 2009; Philippot et al.,
15
2013). Os exsudados secretados pelas raízes influenciam o crescimento de
bactérias e fungos. Dados sugerem um aumento de mais de 50 vezes da atividade
microbiana em solo rizosférico em relação ao não-rizosférico (Prashar; Kappor;
Sachdeva, 2014).
Dentro da diversidade microbiana no solo rizosférico, é possível destacar a
presença de organismos r-estrategistas, como bactérias que apresentam elevada
taxa de crescimento e o consumo de substratos simples, assim como, comunidades
bacterianas com baixa taxa de crescimento, porém com capacidade para degradar
substratos complexos, comportando-se como organismos k-estrategistas (Dantas et
al., 2009; Prashar; Kappor; Sachdeva, 2014).
As características descritas nos parágrafos anteriores ressaltam a importância
ecológica da rizosfera, assim como, a necessidade de melhor compreensão sobre
os diversos fatores que regulam este ambiente altamente diverso e essencial para
manutenção de inúmeros processos biológicos.
2.3 Interações Positivas
Os seres vivos estabelecem vários tipos de interações bióticas que podem ser
classificadas como negativas ou positivas. As negativas produzem mecanismos que
podem limitar a densidade da população (Odum, 2012), já as positivas promovem a
sobrevivência das populações que interagem em um mesmo habitat (Atlas; Bartha,
1997). Ao contrário das interações negativas, que podem gerar extinções ou diminuir
a diversidade, as interações positivas podem manter a diversidade em ambientes
hostis, onde as espécies dependem umas das outras para persistir (He; Bertness;
Altieri, 2013).
Durante muito tempo os estudos ecológicos estavam interessados na
importância das interações negativas como elementos estruturadores das
comunidades, no entanto, pesquisas recentes demonstram que as interações
positivas possuem importância equivalente no processo de estruturação de
comunidades e também na diversidade, merecendo assim, a atenção dos ecólogos
(Bertness; Callaway, 1994; Bertness; Leonard, 1997; Filotas et al., 2010; Odum,
2012; He; Bertness, 2014).
As interações positivas podem ser consideradas como aquelas na qual pelo
menos uma das espécies envolvidas se beneficia sem causar danos a nenhum dos
16
participantes, afetando positivamente o crescimento ou reprodução de um ou mais
organismos (Bertness; Leonard, 1997; Stachowicz, 2001; Odum, 2012). Estas
relações incluem mutualismo facultativo ou obrigatório e facilitação, interações
tróficas e não-tróficas, bem como diretas e indiretas, além do comensalismo e da
protocooperação (Bertness; Leonard, 1997; Filotas et al., 2010; Odum, 2012).
Muitas interações positivas têm emergido como importantes na composição
das comunidades biológicas, uma vez que elas podem modificar o habitat alterando
as condições locais e oferecendo um ambiente mais favorável para outras espécies
(Stachowicz, 2001). Essas interações também contribuem para expansão da
distribuição de espécies, por meio da melhoria das condições resultantes de
estresses físicos e biológicos (Crotty; Bertness, 2015).
Estudos apontam que as interações positivas podem ocorrer quando um
organismo faz com que o ambiente local se torne mais favorável para outro, quer por
mecanismos diretos, como pela redução térmica, suplementação de água ou
nutrientes, ou através de simbioses nutricionais, ou indiretos, através da remoção de
concorrentes predadores (Bruno; Stachowicz; Bertness, 2003). Este tipo de contato
positivo se torna crucial para sobrevivência de muitos organismos em diversos
ambientes com níveis distintos de estresse abiótico (Travis; Brooker; Dytham, 2005).
Embora os estudos das interações positivas tenham apresentado avanços
significativos nos últimos anos, é possível constatar que em relação aos micro-
organismos estas análises ainda são incipientes, uma vez que pouco se conhece
sobre a dinâmica de interações que ocorre no universo microbiano.
Segundo Barberán; Casamayor; Fierer (2014), muitos dos conceitos que
conduzem a prática e a investigação dos estudos ecológicos foram desenvolvidos
sem considerar os micro-organismos, mesmo sendo estes os representantes da
maior diversidade filogenética e funcional da terra. Tendo em vista a
representatividade do mundo microbiano em diferentes escalas temporais, espaciais
e funcionais é relevante a realização de estudos que possam colaborar na
compreensão das relações estabelecidas entre micro-organismos e o ambiente
físico e biológico que o integra.
17
2.4 Facilitação e Fitness microbiano: mecanismos de coexistência
A facilitação tem sido definida como uma interação positiva na qual uma
espécie altera o ambiente e permite o crescimento, sobrevivência ou reprodução de
uma segunda espécie (Stachowicz, 2001; Bronstein, 2009). Esse tipo de relação tem
sido bastante documentada para comunidades vegetais (Bertness; Leonard, 1997;
Maestre et al., 2009; Hart; Marshall, 2013; He; Bertness; Altieri, 2013; He; Bertness,
2014).
De modo especial a facilitação tem sido observada em ambientes com
elevados níveis de estresses abióticos, nos quais a presença de espécies-chave que
possuem a capacidade de modificar as condições físicas locais permite a existência
de outras espécies na comunidade. Esse tipo de interação é, pois, fundamental para
manutenção desses ecossistemas (Stachowicz, 2001; Bruno; Stachowicz; Bertness,
2003; Maestre et al., 2009; He; Bertness; Altieri, 2013).
Tilman (2000), afirma que os processos que permitem que espécies interajam
e coexistam em um ecossistema influencia a produtividade, a dinâmica de nutrientes
e a estabilidade desse ecossistema, sendo, portanto, de grande relevância para os
processos fundamentais de composição e manutenção das atividades biológicas.
A presença dos micro-organismos em todas as partes da biosfera, inclusive
em ambientes com elevado nível de estresse, está associada à reconhecida
diversidade funcional desse grupo (Gudelj et al., 2010; Barberán; Casamayor; Fierer,
2014). Referida característica, contribui para o metabolismo dos mais diferentes e
complexos substratos, modifica as condições ambientais e permite a interação
metabólica entre outros organismos. Esses eventos, ampliam o nicho microbiano e
melhoram o valor adaptativo de outras espécies por mecanismos de coexistência
(Pande et al., 2014).
As interações metabólicas entre micro-organismos conhecidas como cross-
feeding (Gerlee; Lundh, 2010; Pande et al., 2014) se caracterizam pelo intercâmbio
recíproco de determinados metabólitos, que envolve a produção metabólica de uma
espécie a ser utilizada como fonte de energia por outra espécie (Turner; Souza;
Lenski, 1996; Schink, 2002; Bull; Harcombe, 2009; Pande et al., 2014).
De acordo com Gerlee; Lundh (2010) o mecanismo de cross-feeding amplia a
diversidade microbiana, uma vez que uma cepa degrada parcialmente o recurso
limitante em um metabólito secundário que é então usado por uma segunda cepa.
Este processo nas comunidades microbianas colabora para o mecanismo de
18
coexistência entre as espécies, ampliando o fitness bacteriano (Giacomini, 2007;
Porcher; Tenaillon; Godelle, 2001), uma vez que há registros de aumento da taxa de
crescimento de espécies participantes através desse tipo de interação (Goel et al.,
2012).
O principal mecanismo envolvido no cross-feeding que favorece a
coexistência é a produção e secreção de um recurso secundário, este, portanto,
fornece um segundo nicho ecológico, onde um genótipo com capacidade inferior
para crescer no recurso principal pode ser capaz de persistir se é melhor
concorrente para o recurso secundário (Ribeck; Lenski, 2015).
Um dos primeiros relatos sobre a utilização de substratos metabolizados por
cepas diferentes foram em experimentos usando mutantes de Escherichia coli.
Cepas deficientes na produção de triptofano foram capazes de crescer em co-cultura
de Salmonella typhi que conseguia produzir o referido metabólito (Fildes, 1956).
Outros estudos também usando genótipos de E. coli demonstraram interação
metabólica, mostrando crescimento significativo por cooperação entre as cepas
(Turner; Souza; Lenski, 1996; Wintermute; Silver, 2010).
Porcher; Tenaillon; Godelle (2001), afirmam que o metabolismo é o principal
componente do fitness, dessa forma a relação entre fitness bacteriano e
metabolismo com a coexistência das espécies no mesmo habitat se torna importante
para manutenção da diversidade. Segundo Wintermute; Silver (2010) as interações
metabólicas podem alterar radicalmente os fenótipos bioquímicos das estirpes
participantes, favorecendo dessa forma, a presença de processos adaptativos.
De acordo com Phelan et al. (2013), a coexistência de micro-organismos em
comunidades mistas estáveis pode ser atribuída a aspectos metabólicos, uma vez
que a nutrição é a maior força modeladora de comunidades microbianas.
Interações metabólicas cross-feeding constituem, pois, um poderoso
mecanismo ecológico que pode levar a coexistência estável de diferentes espécies
dentro de uma comunidade bacteriana, e assim, ajudar a manter a diversidade
genética através da relação entre fitness e atividade enzimática (Porcher; Tenaillon;
Godelle 2001; Pande et al., 2014).
De acordo com Goel et al. (2012) a modelagem metabólica em multi-espécies
é um campo emergente que visa quantificar as interações metabólicas e
compreender como o impacto da disponibilidade de determinado substrato pode
influenciar na dinâmica e abundância das espécies na comunidade. Essa
19
emergência é ainda mais perceptível na microbiologia, onde a complexidade das
interações contribui para os raros trabalhos disponíveis neste âmbito.
Embora os micro-organismos sejam produtores críticos em ambientes
terrestres áridos (Li et al., 2013), ainda são escassos os registros sobre a dinâmica
metabólica desses organismos, assim como sobre quais fatores podem estar
envolvidos na manutenção e organização ecológica dos mesmos no referido
ambiente. Assim, estudos para avaliar as ferramentas usadas pelos organismos na
manutenção da sua diversidade genética em ambientes áridos são de extrema
importância.
2.5 Actinobactérias
As actinobactérias são bactérias Gram-positivas com elevada concentração
de G + C (guanina, citosina), cerca de 55% no DNA, formam filamentos ramificados
ou hifas e esporos assexuais (Sharna; David, 2012; Ventura et al., 2007; Barreto et
al., 2008; Cwala; Igbinosa; Okon, 2011; Rao et al., 2012; Adegboye; Babalola, 2012;
Sharma, 2014). Assemelham-se estreitamente com fungos na sua morfologia geral,
sendo essa semelhança uma possível característica adaptativa do grupo ao mesmo
habitat (Sharma, 2014).
A maioria é de vida livre e estão distribuídos na natureza, podendo ser
encontrados em ambientes terrestre e aquático, mas de modo particular são
abundantes no solo (Semêdo et al., 2001; Adegboye; Babalola, 2012; Silva et al.,
2012; Velayudham; Murungan, 2012; Lima, 2013; Mansour; Abdel-Azeem; Abo-
Deraz, 2015), sendo também produtoras de compostos terpenóides como a
geosmina, responsáveis pelo odor característico de solo recém arado (Adegboye;
Babalola, 2012; Oliveira et al., 2014; Sharma, 2014).
Isolados a partir de diversos tipos de solos e localizações, como ambientes
áridos, florestas tropicais, pântanos, regiões de mangue, desertos e savanas
(Adegboye; Babalola, 2012; Mangamuri et al., 2012; Lima et al., 2014; Martins et al.,
2014; Silva et al., 2015), estudos apontam que actinobactérias são componentes
importantes da população microbiana na maioria dos solos e, em alguns solos são
mais numerosos do que outras bactérias (Jayasinghe; Parkinson, 2008).
De acordo com Arifuzzaman; Khatun; Raham (2010), o número e tipo de
actinobactérias em uma amostra de solo particular é fortemente influenciada pela
20
localização geográfica, temperatura do solo, pH, concentração de matéria orgânica,
aeração e teor de umidade. Para Ventura et al. (2007), essa característica é
responsável pela diversidade morfológica, fisiológica e metabólica desses micro-
organismos.
A variedade morfológica e as características biológicas do grupo, incluindo os
mecanismos reprodutivos, como a esporulação, constitui um aspecto vantajoso para
dispersão à longa distância, contribuindo para reprodução e distribuição em diversos
ambientes, inclusive habitats secos, tendo em vista a presença de esporos
resistentes a dessecação, como esporangiósporos e conidiósporos (Eisenlord; Zak;
Upchurch, 2012; Oliveira et al., 2014).
Actinobactérias são capazes de crescer em locais que apresentem condições
ambientais hostis e antropizados (Lima, 2013) como é o caso da região do semiárido
nordestino. Alguns estudos em regiões da Caatinga demonstraram predominância
de actinobactérias em relação a outros micro-organismos do solo, como fungos
(Kavamura, 2012; Martins, S. et al., 2014; Martins, C. et al., 2014), principalmente no
período de menor pluviosidade. A abundância de actinobactérias tende a ser menor
em solos úmidos e maior em solos oligotróficos (Fierer et al., 2007).
Entre as actinobactérias, o gênero Streptomyces é o mais comum no solo,
seguido dos gêneros Nocardia, Microsbispora, Micromonospora, Actinomyces,
Actinoplanes e Streptosporangium (Sêmedo et al., 2001; Adegboye; Babalola, 2012).
Embora o solo seja um habitat preferencial das actinobactérias, o filo também inclui
outros gêneros com estilos de vida diversos, dentre os quais é possível mencionar
agentes patogênicos (Mycobacterium spp.), comensais de plantas (Leifsonia spp.)
além de habitantes do trato gastrointestinal (Bifidobacterium spp.) (Ventura et al.,
2007).
Além de desempenharem papel vital na decomposição da matéria orgânica,
reabastecendo o solo de nutrientes (LeBlanc; Gonçalves; Mohn, 2008; Mabrouk;
Saleh, 2014), as actinobactérias representam um dos mais diversos grupos de
bactérias filamentosas capazes de sobreviver em um amplo número de nichos
ecológicos, graças ao seu reconhecido potencial bioativo (Mansour; Abdel-Azeem;
Abo-Deraz, 2015).
De acordo com Lam (2006), as actinobactérias são os procariotos
economicamente mais valiosos para a biotecnologia, isso se deve principalmente
pelo fato do grupo ser reconhecido pela produção de inúmeros compostos bioativos,
21
dentre os quais se destacam as substâncias com ação antibiótica, que representam
o principal foco de estudos do grupo (Mansour; Abdel-Azeem; Abo-Deraz, 2015).
Cerca de 80% das substâncias antibióticas produzidas por actinobactérias são
provenientes da atividade metabólica de espécies do gênero Streptomyces (Barreto
et al., 2008; Anzai et al., 2008; Arifuzzaman; Khatun; Rahman, 2010; Duraipandiyan
et al., 2010; Miyauchi, 2012).
Importantes ecologicamente na reciclagem e mineralização de nutrientes no
solo (Adegboye; Babalola, 2012), as actinobactérias produzem várias enzimas
extracelulares responsáveis pela degradação de moléculas complexas como
lignocelulose, celulose, proteínas, amido, quitina, húmus, dentre outras (Abdulla; El-
Shatoury, 2007; Minnoto et al., 2014; Sharma, 2014). Estas enzimas hidrolisam as
macromoléculas disponibilizando nutrientes para o solo e seus diversos organismos.
A heterogeneidade bioquímica, diversidade ecológica e capacidade
excepcional das actinobactérias para produção de metabólitos secundários
demonstram a importância de estudos ecológicos sobre suas populações
(Adegboye; Babalola, 2012; Previati et al., 2012). Embora existam poucos relatos
para o potencial enzimático do grupo, as actinobactérias constituem uma fonte
promissora de enzimas (Mansour; Abdel-Azeem; Abo-Deraz, 2015).
Uma vez que as actinobactérias estão presentes juntamente com outros
micro-organismos em vários habitats e conhecendo seu potencial para produção de
enzimas extracelulares capazes de hidrolisar substratos complexos no solo
(Abdelmahsen et al., 2015), se torna relevante compreender como os mecanismos
metabólicos deste grupo particular podem interagir positivamente no solo com outros
organismos, facilitando assim, a coexistência e manutenção da diversidade
microbiana neste ecossistema.
2.6 Rizóbios
As bactérias que possuem a enzima nitrogenase são capazes de realizar um
processo de grande importância ecológica que é a conversão do nitrogênio
atmosférico em formas disponíveis as plantas e as demais formas de vida do
planeta, essas bactérias são conhecidas como diazotróficas (Leite, 2011). Esses
micro-organismos podem viver no solo, associadas a espécies vegetais, tanto na
rizosfera quanto endofiticamente, bem como formar simbioses com leguminosas
(Sabino et al., 2012)
22
Os rizóbios são bactérias diazotróficas Gram-negativas, aeróbias e não
esporulantes que habitam o solo, em especial a região rizosférica, onde possuem a
habilidade de induzir a formação de nódulos nas raízes e também no caule de
plantas leguminosas, sendo responsáveis pelo processo de conversão do nitrogênio
atmosférico em formas utilizáveis pela planta (Zakhia; Lajudie, 2001; Goi; Souza,
2006; Freitas et al., 2007; Hoffmann, 2007; Vieira, 2007; Parmar; Dufresne, 2011;
Barbosa; 2013; Shankar; Sunutha, 2013; Singh; Ramteke; Shulka, 2013; Martins C.
et al., 2015).
A fixação de nitrogênio pelas bactérias diazotróficas é um processo natural
eficiente e de extrema relevância para o ambiente e também para a agricultura
(Zakhia; Lajudie, 2001; Fernades Júnior et al., 2012), uma vez que através dessa
interação (planta-rizóbio) o nitrogênio molecular passa a fazer parte dos processos
biológicos e a compor moléculas importantes dos organismos vivos, como as
proteínas.
Para Moreira et al. (2010) a incorporação de nitrogênio atmosférico pela
planta através da interação de rizóbios com as raízes, é um processo evoluído que
minimiza as perdas do nitrogênio fixado por interferência de fatores químicos, físicos
e biológicos que interagem na complexidade e dinâmica do sistema edáfico.
Além da capacidade saprofítica dos rizóbios, estes constituem um grupo de
micro-organismos bastante diverso fenotipicamente e com ampla distribuição pelo
mundo (Fernandes Júnior et al., 2012a; Barbosa, 2013). De acordo com Chagas
Júnior et al. (2009), a diversidade de rizóbios em ambiente natural se deve a rápida
reprodução, variações, mutações e aos processos naturais de transferência
genética. As características culturais, morfológicas e fisiológicas do grupo é uma
prova dessa diversidade (Barbosa, 2013), e também mostra a adaptabilidade
ecológica de diferentes cepas às condições ambientais predominantes no
ecossistema (Stroschein, 2007).
No entanto, mudanças na estrutura e característica do solo, podem provocar
impactos na diversidade da simbiose entre rizóbio e planta. Alterações no pH do
solo, assim como a presença de alumínio tóxico, podem ocasionar diminuição da
diversidade de rizóbios (Andrade; Murphy; Giller, 2002; Chagas Júnior; Oliveira;
Oliveira, 2012).
Entre os possíveis mecanismos adaptativos de sobrevivência dos rizóbios a
condições abióticas estressantes, destaca-se a produção de exopolissacarídeos
23
(Freitas et al., 2007). É possível que essas substâncias desempenhe um papel
relevante para a maior frequência de rizóbios reportada por Barbosa (2013) em
regiões de clima tropical e temperado, onde predominam temperaturas elevadas,
umidade e níveis distintos de salinidade, que poderiam limitar o crescimento
microbiano.
Parte significativa dos trabalhos desenvolvidos com rizóbios avalia a relação
simbionte do grupo com as leguminosas (Fernandes; Fernandes, 2000; Longatti;
Marra; Moreira, 2013; Sabino et al., 2012; Singh; Ramteke; Shulka, 2013), em geral,
objetivando a busca por inoculantes que possam viabilizar culturas de vegetais mais
eficientes na incorporação de nitrogênio e, portanto, com aumento na produção de
biomassa, suprindo assim, a cadeia produtiva de alimento.
Rizóbios também são reconhecidos por sua capacidade em produzir enzimas,
como a nitrogenase e a hidrogenase que auxiliam no processo de fixação de
nitrogênio (Oliveira et al., 2006; Kumari; Ram; Mallaiah, 2010). No entanto, estudos
como o de Kumari, Ram, Mallaiah (2010), registraram um elevado percentual de
cepas incapazes de sintetizar amilase e principalmente celulase. Tendo em vista a
disponibilidade dos substratos amido e celulose no solo, essa incapacidade pode ser
considerada uma condição limitante para o crescimento destes organismos, que
necessitam de outros mecanismos que possibilitem o uso dos citados substratos
como fonte de carbono e energia.
A dinâmica ecológica dos rizóbios vai além da simbiose mutualística na
fixação de nitrogênio. Aspectos como os tipos de relações entre estes micro-
organismos e os demais organismos que habitam a região rizosférica do solo, são
importantes para manutenção de sua diversidade e de suas funções ecológicas.
Assim, estudos que contribuam para compreensão dos mecanismos que envolvem
as interações ecológicas, distribuição e sobrevivência em diferentes habitats sob
diferentes condições bióticas e abióticas são de extrema relevância.
24
3. Material e Métodos
3.1 Declaração de Ética
Este projeto foi realizado com a autorização do Instituto Chico Mendes de
Conservação da Biodiversidade (ICMBio) número do processo 32890-3 e não
envolveu riscos ou espécies protegidas.
3.2 Área de estudos
3.2.1 Procedência das cepas de actinobactérias e rizóbios
As cepas de actinobactérias e de rizóbios avaliadas neste estudo foram
isoladas a partir de amostras de solo rizosférico do Parque Nacional de Ubajara
(PNU). Esta unidade de conservação federal de proteção integral localiza-se no
planalto da Ibiapaba, na região norte do Estado do Ceará a 320 km de Fortaleza,
limitando-se com o Estado do Piauí (ICMBio, 2016). A área do parque é de 6.288
hectares e abrange os municípios de Tianguá, Ubajara e Frecheirinha estando
compreendida entre a latitude 3º46’ S e longitude 40º 54’ W com altitudes que
variam de 800 a 1.100 m (Cunha; Araújo, 2014; ICMBio, 2016). A temperatura média
varia de 20 a 22ºC no planalto da Ibiapaba, ficando entorno de 24 a 26ºC nas
regiões de baixada. O parque apresenta duas variações climáticas anuais: no
primeiro semestre do ano, mais chuvoso e frio e o segundo semestre quase sem
chuvas e com temperaturas mais elevadas. A média pluviométrica fica em torno de
1.463,3 mm por ano (IBAMA, 2006).
Figura 3.1: Localização geográfica do Parque Nacional e Ubajara (PNU) no estado do Ceará, Brasil. Fonte: www.ipece.ce.gov.br
25
3.3 Amostragem
Amostras de solo foram coletadas no segundo semestre de 2012, portanto, no
período seco. Na área experimental, de aproximadamente 400 m2, foram
selecionadas aleatoriamente 12 arbóreas/leguminosas da família Fabaceae (Tabela
3.1). Foram coletadas amostras de solo rizosférico de cada leguminosa na
profundidade de 0-20 cm. Cada amostra foi composta de três sub-amostras de 300
gramas cada, tomadas na projeção da copa ao redor da árvore utilizando-se uma
enxada de jardinagem (Lucena et al., 2013). Cada conjunto (três pontos/leguminosa)
constituiu uma amostra composta, que foram acondicionadas em sacos plásticos
etiquetados, conservados em caixas de isopor com gelo e encaminhados para o
Laboratório de Microbiologia Ambiental (LAMAB) do Departamento de Biologia da
Universidade Federal do Ceará (UFC).
Amostras Leguminosas
Nome científico Nome vulgar
1 Centrosema spp Centrosema
2 Crateagus monogyna Espinheiro branco
3 Acácia plephella Espinheiro preto
4 Stryphnodendron puclcherrimum Camunze
5 Hymenaea courbari Jatobá
6 Senna spectabilis Besouro
7 Inga spp Ingá
8 Caesalpinia spp Jucá
9 Bauhinia spp Mororó
10 Piptadenia stipulacea Jurema branca
11 Anadenanthera macrocarpa Angico
12 Mimosa caesalpiniifolia Sabiá
TABELA 3.1: Leguminosas da família Fabaceae selecionadas para coleta de
amostras de solo rizosférico do Parque Nacional de Ubajara, no Estado do Ceará.
26
3.4 Caracterização do Solo
O solo da área de amostragem foi avaliado segundo a classificação do
Sistema Brasileiro de Classificação de Solos (EMBRAPA, 2006), e foi descrito com o
seguinte perfil geral: cambissolo háplico Tb distrófico típico, característicos de
relevos fortemente ondulados ou montanhosos como é o caso da região da serra da
Ibiapaba, local onde se encontra o PNU. A presença de argila de baixa atividade e a
baixa fertilidade deste solo, associado a um relevo com declives acentuados,
pequena profundidade e a presença de pedras na massa do solo, tornam este tipo
de terreno pouco favorável para o desenvolvimento vegetal.
3.5 Rizóbios
As 26 cepas de rizóbios isoladas das amostras de solo rizosférico do PNU,
foram previamente autenticadas e caracterizadas fenotipicamente por Pinheiro et al.
(2014). Essas cepas foram denominadas (LAMAB-83, LAMAB-84, LAMAB-85,
LAMAB-86, LAMAB-87, LAMAB-89, LAMAB-90, LAMAB-91, LAMAB-92, LAMAB-93,
LAMAB-94, LAMAB-95, LAMAB-96, LAMAB-97, LAMAB-98, LAMAB-99, LAMAB-
100, LAMAB-101, LAMAB-102, LAMAB-103, LAMAB-104, LAMAB-105, LAMAB-
107, LAMAB-108, LAMAB-109, LAMAB-110) e são mantidas em tubos inclinados
com meio “yeast manitol agar” (YMA) a 4°C no Laboratório de Microbiologia
Ambiental (LAMAB) do Departamento de Biologia da Universidade Federal do
Ceará, compondo coleção de bactérias diazotróficas oriundas do semiárido do
nordeste brasileiro.
3.6 Actinobactérias
3.6.1 Isolamento
Volumes de 100 µL de amostras do solo rizosférico previamente diluídas (10-
3, 10-4 e 10-5) foram inoculados pela técnica do spread-plate em placas contendo
Caseína Dextrose Ágar (CDA) com a seguinte composição por litro: K2HPO4 (0,5 g),
MgSO4.7H2O (0,2 g), glicose (10 g), caseína (0,2 g) e nistatina (0,05 mg) (Kuster;
Williams, 1964, Arifuzzaman; Khatun; Rahman, 2010). O meio foi distribuído em
placas de Petri estéreis e 100 µL das diluições 10-1 até 10-5 foram espalhados em
triplicatas sobre a superfície das placas com alça de Drigalski e foram incubadas a
27
28 ± 2 °C por 10 dias (Shaikh et al., 2013). Após incubação as colônias foram
purificadas por inoculação em estrias nos mesmos meios de cultura e condições de
cultivo do isolamento.
3.6.2 Caracterização cultural
A partir do crescimento no meio CDA foi feita uma avaliação das
características das colônias sendo selecionadas para a pesquisa as culturas com
características diversas, totalizando 27 cepas, que foram designadas com a sigla UB
seguida de sua respectiva numeração (UB01, UB02, UB03, UB04, UB05, UB07,
UB08, UB09, UB10, UB11, UB12, UB13, UB14, UB15, UB16, UB17, UB18, UB19,
UB20, UB21, UB22, UB23, UB24, UB25, UB26, UB27, UB28).
3.6.2.1 Coloração de Gram
A coloração de Gram foi realizada conforme Kern; Blewins (1999), para
verificar a pureza das culturas. Por meio de esfregaço, uma gota da cepa de cada
actinobactéria cultivada em caldo CDA foi depositada sobre uma lâmina e feito um
esfregaço com auxílio de alça. Após os esfregaços ficarem ao ar em uma superfície
plana, foram então passados três vezes pela chama.
Logo após esfriar, o esfregaço foi coberto durante um minuto com solução
fenicada de cristal violeta. Escorreu-se o corante e cobriu-se o esfregaço com
solução de lugol durante um minuto. Em seguida, lavou-se em água corrente e
descorou-se com álcool 95º GL. Por fim, foi adicionado ao esfregaço a solução de
fucsina básica por 30 segundos. As lâminas de Gram foram visualizadas em
microscópio óptico Zeiss Axioplan em aumento de 1000x.
3.6.2.2 Cor da massa aérea e micélio reverso
Cada cepa foi inoculada por estrias em placas de Petri, após purificação,
contendo o meio seletivo CDA para actinobactérias. Em seguida as placas foram
incubadas em estufa B.O.D a 28 ± 2 °C por 15 dias. Para descrição das
características culturais foram avaliadas as cores do micélio aéreo e reverso das
colônias conforme descrito por WINK (2012), baseada na carta de cores (RAL color
charts).
28
3.6.2.3 Pigmentos melanóides
A produção de pigmentos melanóides foi identificada conforme Shinobu
(1958), as colônias foram inoculadas em meio com a seguinte composição por litro:
15g de glicerol (11,9 mL), 0,5g de L-Tirosina, 0,5g de K2HPO4, 0,5g de MgSO4.H2O,
0,5g de NaCl, 0,01g de FeSO4.H2O, 1 mL de solução traços de sais (0,1g
FeSO4.7H2O, 0,1g MnCl2.4H2O, 0,1g ZnSO4.7H2O, 100 mL de água destilada), 15g
de ágar e pH 7,2-7,4. As placas foram incubadas por 5 a 7 dias em B.O.D. a 28°C.
Foram produzidos dois meios, um contendo tirosina e outro sem. A produção de
pigmentos melanóides foi evidenciada pelo escurecimento do meio contendo
tirosina. O escurecimento dos dois tipos de meio de cultivo pelas cepas consistiu em
evidencia de não produção de melanina.
3.6.2.4 Agrupamentos de dados culturais
Os resultados foram convertidos em uma matriz numérica. Esses dados foram
utilizados para construir uma matriz de similaridade utilizando o aplicativo
computacional PAST (Hammer; Harper; Ryan, 2001), que permite o agrupamento de
isolados semelhantes. Foi aplicado o algoritmo de média não ponderada (UPGMA),
a partir do coeficiente de Jaccard, e estes foram transformados em distância
Euclidiana, que é a distância entre dois pontos. Quanto maior este valor, maior será
a dissimilaridade. O resultado desse processo foi representado na forma de
dendrograma.
3.7 Caracterização enzimática
3.7.1 Atividade celulolítica
As cepas de actinobactérias e rizóbios foram inoculados na forma de spots e
em quadruplicata, no meio de cultivo conforme Couri; Farias (1995) com a seguinte
composição por litro: MgSO4 (0,5 g), KCl (0,5 g), NaNO3 (3,0 g), FeSO4.7H2O (0,01
g), K2HPO4 (1,0 g), ágar (15,0 g), carboximetilcelulose sal sódico (5,0 g) e pH 6,0. As
placas foram incubadas em câmara de crescimento B.O.D. a 28 ± 2ºC por 10 dias.
Após a incubação, foram adicionados 10 mL de solução de vermelho congo a 0,5%
em cada placa, deixando-se agir por 15 minutos a temperatura ambiente.
29
Posteriormente, o excesso da solução foi drenado e 10 mL de solução de NaCl (2M)
foram adicionados em cada placa, deixando-se agir por 30 minutos a temperatura
ambiente. Após a remoção do excesso de solução salina, foi feita a observação de
zonas de hidrólise em torno das colônias (Hankin; Anagnostakis, 1977).
3.7.2 Atividade amilolítica
A produção de amilase foi determinada segundo metodologia de Alariya et al.
(2013). As cepas de actinobactérias e rizóbios foram inoculadas na forma de spots e
em quadruplicata no meio de cultura ágar-amido com a seguinte composição por
litro: peptona (10,0 g), extrato de carne (3,0 g), NaCl (5,0 g), amido solúvel (2,0 g),
ágar (15,0 g) e pH 6,5. Posteriormente, as culturas foram incubadas em câmara de
crescimento B.O.D. a 28 ± 2ºC por 10 dias. Após o crescimento das colônias, foram
adicionados 10 mL de solução de lugol nas placas. A produção da enzima amilase
foi detectada pela descoloração do meio em torno da colônia, devido à hidrólise do
amido.
3.7.3 Determinação do perfil enzimático
As cepas de actinobactérias foram caracterizadas quanto à determinação do
índice enzimático (IE) de amilase e celulase utilizando-se a seguinte equação: IE=
Dh/Dc. Sendo Dh o diâmetro em mm do halo de hidrólise e Dc o diâmetro em mm da
colônia dos rizóbios e das actinobactérias (Hankin; Anagnostakis, 1975).
3.8 Análises estatísticas
As análises estatísticas foram realizadas utilizando a versão GraphPad Prism
5,00 (GraphPad Software*, San Diego, CA). Cada ensaio enzimático ocorreu em
quadruplicada seguido de duas repetições. A análise de variância dos dados ocorreu
de acordo com o perfil dos resultados obtidos a partir das médias de cada conjunto
de dados. Para cada conjunto de dados do ensaio enzimático foi realizado o teste de
normalidade Shapiro-Wilk. Os dados que seguiram o padrão de distribuição normal
foram analisados através de uma ANOVA fator único, enquanto que os dados que
não seguiram uma distribuição normal foram avaliados pelo teste não paramétrico
30
Kruskal-Wallis. Ambos os testes foram utilizados para comparar as médias dos IE
dos grupos bacterianos.
3.9 Seleção de Isolados
As cepas de actinobactérias que apresentaram IE≥2,0 para amilase e
celulase, foram selecionadas para ensaio de facilitação com as cepas de rizóbios,
também avaliadas para as mesmas atividades, mas que não apresentaram as
referidas enzimas.
3.10 Facilitação
As cepas de rizóbios incapazes de degradar celulose e amido foram testadas
separadamente, quanto à capacidade de seu crescimento em meios contendo amido
e celulose como única fonte de carbono, inicialmente cultivados com cepas de
actinobactérias capazes de utilizar esses substratos.
3.10.1 Amido
As cepas de actinobactéria com IE≥2,0 foram inoculadas na forma de spots e
em quadruplicada no meio de cultura ágar-amido. Posteriormente, essas culturas
foram incubadas em câmara de crescimento tipo B.O.D., a 28 ± 2ºC por 10 dias.
Após os 10 dias de incubação das actinobactérias em meio de cultura ágar-amido,
um mililitro de culturas das cepas de rizóbios cultivadas previamente em meio de
cultura líquido YMA com a seguinte composição, manitol (10g), K2HPO4 (0,5g),
extrato de levedura (0,5g), MgSO4.7H2O (0,2g), NaCl (0,1g), adicionado de 1000 mL
de água destilada (Vicent, 1970), foram transferidos para microtubos com
capacidade de 1,5 mL. O material foi centrifugado (12.000 rpm por 10 minutos) e o
pellet obtido foi ressuspenso por agitação em vortex em 100 μL de água destilada
esterilizada. Este procedimento foi repetido por duas vezes para eliminação de
resíduos de meio de cultura. Logo após, sob fluxo laminar, gotículas de 3 μL do
volume final das culturas de rizóbios foram distribuídas em redor das colônias das
actinobactérias a 0,5 e 2,0 cm de distância de cada colônia. A distribuição das
gotículas foi feita em duplicata e a maior multiplicação das cepas de rizóbios nas
31
regiões mais próximas as colônias de actinobactérias, foi o parâmetro para
diagnosticar a ocorrência de interação metabólica positiva (Döbereiner; Baldani;
Baldani, 1995).
3.10.2 Celulose
Mesmo procedimento descrito no item 3.10.1 substituindo o substrato amido
pela carboximetilcelulose.
3.11 Seleção de actinobactérias compatíveis com as cepas de rizóbio
As cepas de actinobactérias que apresentaram resultado positivo nos testes
de facilitação para amido ou celulose com as cepas de rizóbios, foram selecionadas
para realização da caracterização fenotípica e fisiológica.
3.11.1 Caracterização morfológica e micromorfológica das cepas de
actinobactérias compatíveis com rizóbios
3.11.2 Análise micromorfológica
Para o microcultivo foram utilizadas placas de Petri esterilizadas, contendo
em seu interior uma lâmina e um pedaço de algodão umedecido, com água
destilada. Um cubo de aproximadamente 1 cm³ de meio de cultura CDA foi cortado e
colocado sobre uma lâmina contida no interior da placa. Cada isolado foi inoculado
nos lados do cubo, o qual foi coberto por uma lamínula estéril. Posteriormente, foi
colocado algodão umedecido na placa, que foi então fechada e incubada em estufa
B.O.D. por 7 a 14 dias, a 28ºC. Após esse período, a lamínula foi retirada e disposta
sobre outra lâmina limpa contendo uma gota de Lactofenol de Amann, em seguida
as bordas foram vedadas com esmalte incolor. As lâminas preparadas foram
observadas ao microscópio óptico Zeiss Axioplan em aumento de 40x (Kern;
Blewins, 1999). Características como: ramificação do micélio sobre o substrato,
estruturação do micélio aéreo, bem como a sua fragmentação ou produção de
esporos foram registradas e comparadas com as descritas por Holt; Krieg; Sneath
(2004). As cepas de actinobactérias foram classificadas a nível de gênero através da
32
comparação das características morfológicas, como tipos de hifas e esporos (Brito et
al., 2015).
3.11.3 Caracterização Fisiológica
3.11.3.1 Tolerância a salinidade
Diferentes concentrações de cloreto de sódio (0, 5, 10, 15, 20, 25 e 35%)
foram adicionadas em meio 5339 com a seguinte composição para 1000 mL:
caseína peptonada (10,0 g), extrato de levedura (5,0 g), ágar (20,0 g) e pH 7,0
(Wink, 2012) para verificar a tolerância ao cloreto de sódio. As cepas de
actinobactérias foram inoculadas na forma de spots nas concentrações de NaCl
especificadas e incubadas em B.O.D. a 28 °C durante 7-15 dias. Cada ensaio foi
realizado em quadruplicada com duas repetições. A presença ou ausência de
crescimento foi registrada no sétimo dia em diante.
3.11.3.2 Capacidade para crescer em diferentes pHs
Para avaliar a capacidade de crescimento em diferentes pHs das 22
actinobactérias foi utilizado o meio de cultura YMD (Yeast Malt Dextrose) com a
seguinte composição para 1000 mL: extrato de levedura (4,0 g), extrato de malte
(10,0 g), dextrose (4,0 g), ágar (20,0 g). O pH foi ajustado para 5, 6, 7, 8, 9 e 10 e
foram preparadas triplicatas para cada cepa. Após a incubação a 28 ºC em B.O.D.
por 10-12 dias as leituras foram registradas para cada cepa em termos da presença
ou ausência de crescimento (Kishore, 2012).
3.11.3.3 Tolerância a elevadas temperaturas
Para avaliar a capacidade de crescimento nas temperaturas de 39°C, 41°C,
43ºC e 45°C, as 22 cepas de actinobactérias foram inoculadas na forma de spots em
placas de Petri contendo meio de cultura CDA. Em seguida foram incubadas em
B.O.D. nas respectivas temperaturas a serem testadas por 7 dias. Após esse
período foi observada a presença ou ausência de crescimento. Os ensaios foram
realizados em quadruplicada seguidos de duas repetições (Kishore, 2012).
33
4. Resultados
4.1 Caracterização cultural
Os aspectos morfológicos relacionados a cor da massa aérea dos micélios,
assim como a pigmentação do micélio reverso nas culturas de actinobactérias estão
apresentados na Tabela 4.1.
CEPAS COR DO MICÉLIO
AÉREO
COR DO MICÉLIO
REVERSO
UB-01 Branca (RAL 9003) Branca (RAL 9003)
UB-02 Cinza (RAL 7044) Cinza (RAL 7044)
UB-03 Cinza (RAL 7042) Cinza (RAL 7042)
UB-04 Cinza (RAL 7042) Cinza (RAL 7042)
UB-05 Laranja (RAL 2004) Laranja (RAL 2004)
UB-07 Creme (RAL 9001) Creme (RAL 9001)
UB-08 Cinza (RAL 7040) Cinza (RAL 7040)
UB-09 Branca (RAL 9003) Branca (RAL 9003)
UB-10 Creme (RAL 9001) Creme (RAL 9001)
UB-11 Creme (RAL 9001) Creme (RAL 9001)
UB-12 Verde oliva (RAL 6006) Verde (RAL 6007)
UB-13 Branca (RAL 9003) Branca (RAL 9003)
UB-14 Marrom (RAL 8019) Cinza (RAL 7035)
UB-15 Marrom (RAL 8025) Cinza (RAL 7040)
UB-16 Branca (RAL 9003) Amarelo (RAL 1018)
UB-17 Marrom (RAL 8028) Azul (RAL 5014)
UB-18 Marrom (RAL 8028) Azul (RAL 5014)
UB-19 Marrom (RAL 8028) Azul (RAL 5014)
UB-20 Marrom (RAL 8025) Marrom (RAL 8025)
UB-21 Preto (RAL 9011) Cinza (RAL 7004)
UB-22 Branca (RAL 9003) Branca (RAL 9003)
UB-23 Cinza (RAL 7047) Creme (RAL 9001)
UB-24 Cinza (RAL 7040) Cinza (RAL 7040)
UB-25 Creme (RAL 9001) Creme (RAL 9001)
UB-26 Marrom (RAL 8028) Cinza (RAL 7024)
UB-27 Cinza (RAL 7047) Marrom (RAL 8024)
UB-28 Branca (RAL 9003) Branca (RAL 9003)
Em todas as cepas avaliadas foi confirmado o caráter Gram-positivo,
característica típica desse grupo bacteriano (Goodfellow; Willians, 1983).
Em relação ao micélio aéreo observou-se que as cores predominantes foram
cinza, marrom e branco correspondendo a 25,93%, 25,93% e 22,22%,
respectivamente. Algumas cepas apresentaram micélio aéreo creme (14,92%),
laranja (3,70%), verde (3,70%) e preto (3,70%) (Figuras 4.1 e 4.2).
TABELA 4.1: Caracterização cromogênica dos micélios das cepas de
actinobactérias isoladas de amostras de solo rizosférico do Parque Nacional de
Ubajara, no Estado do Ceará, de acordo com carta de cores (RAL color charts).
34
Quanto a cor do micélio reverso, as cepas também apresentaram variedade,
sendo que o maior percentual (33,34%) apresentou a cor cinza, seguida das cores
branco e creme, ambas presentes em 18,52% das actinobactérias observadas.
Cores como azul (11,12%), marrom (7,4%), além de amarelo, laranja e verde,
ambas observadas em 3,7% dos isolados, também foram identificadas (Figura 4.3).
[]
[];[]
[]
[];
[] []
Cinza
Marrom
Branco
Creme
Verde
Laranja
Preto
A B C D
Figura 4.1: Percentual de actinobactérias isoladas do solo rizosférico do Parque
Nacional de Ubajara, no Ceará, quanto a cor do micélio aéreo. Fonte: acervo do
autor.
Figura 4.2: Características culturais do micélio aéreo de actinobactérias isoladas de
solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará (A) UB-
08, (B) UB-12, (C) UB-14, (D) UB-16. Fonte: acervo do autor.
C D
35
FALT
A produção de pigmentos melanóides foi registrada nas cepas (UB02, UB03,
UB07, UB08, UB09, UB10, UB12, UB13, UB14, UB17, UB18, UB19, UB21, UB22,
UB24, UB26, UB27, UB28) correspondendo a 64,2% das cepas (Figura 4.4).
33,34%
18,52%18,52%
11,12%
7,40%
3,70%
3,70% 3,70%
Cinza
Branco
Creme
Azul
Marrom
Amarelo
Laranja
Verde
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
(%)
Acti
no
bacté
rias
Actinobactérias
Produtoras
Não Produtoras
Figura 4.4: Percentual de cepas de actinobactérias isoladas do solo rizosférico de
leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará, produtoras e não
produtoras de pigmentos melanóides. Fonte: acervo do autor.
Figura 4.3: Percentual de cepas actinobactérias isoladas do solo rizosférico de
leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará, quanto à cor do micélio
reverso. Fonte: acervo do autor.
36
A partir das características culturais apresentadas na Tabela 4.1 e da
produção de pigmentos melanóides, foram identificados 16 grupos de
actinobactérias (Figura 4.5).
As características culturais transformadas em uma matriz numérica
permitiram identificar grupos com maior similaridade e diversidade, nos quais se
destacaram os grupos 1 (UB-09; UB-13; UB-22; UB-28) e 2 (UB-24; UB-02; UB-03;
UB-08). Esses grupos mostraram cores semelhantes nas estruturas miceliais, além
de serem produtoras de pigmentos melanóides. A análise do dendrograma acima
mostra que dos 16 grupos formados, nove deles são constituídos por representantes
únicos, o que indica a diversidade cultural das cepas de actinobactérias oriundas do
solo rizosférico do PNU.
1
Figura 4.5: Dendrograma das características culturais das actinobactérias isoladas
de região rizosférica de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará.
Fonte: acervo do autor.
37
4.2 Caracterização enzimática
4.2.1 Atividade celulolítica
Das 27 cepas de actinobactérias testadas quanto à capacidade de crescer em
meio suplementado com carboximetilcelulose, 18 cepas (66,6%) foram capazes de
crescer e gerar halo de hidrólise, como a cepa UB05 (Figura 4.6), enquanto que
nove cepas (33,4%) não apresentaram atividade celulolítica (UB-03; UB-04; UB-08;
UB-09; UB-15; UB-22; UB-23; UB-27; UB-28).
O índice enzimático correspondente a atividade celulolítica das cepas de
actinobactérias variou de 1,24 mm (UB-02) a 5,21 mm (UB-19) (Figura 4.7).
O teste de Kruskal-Wallis demonstrou diferença significativa (p<0,05) entre as
médias dos índices enzimáticos das cepas de actinobactérias com atividade
celulolítica, as cepas UB-11, UB-14, UB-17, UB-18, UB-19, UB-21 e UB-26,
destacaram-se com índices enzimáticos superiores a 3,0 mm e com variações
estatísticas significativas entre as demais cepas avaliadas (Figura 4.7).
Figura 4.6: Atividade celulolítica da cepa UB-05 isolada do solo rizosférico de
leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará. A seta indica a presença de
halo de hidrólise ao redor da colônia. Fonte: acervo do autor.
38
O perfil de hidrólise enzimática da carboximetilcelulose permitiu classificar
11,1% das cepas de actinobactérias como fracamente produtoras (UB-01; UB-02;
UB-24), (1,0≤IE<1,5), 7,5% (UB-16; UB-20), moderadamente produtoras (1,5≤IE<2)
e 48,1% fortemente produtoras (IE≥2,0) (Figura 4.8).
O índice celulolítico das cepas de rizóbios variou de 1,66 mm a 1,78 mm
(LAMAB-84, LAMAB-91 e LAMAB-96) (Figura 4.9).
0
1
2
3
4
5
6
7
8IE
(Ø
h/Ø
c)
Actinobactérias
0
10
20
30
40
50
60
(%)
Ce
pa
s d
e
Ac
tin
ob
ac
téri
as
Nível de Produção de Celulase
Fortemente produtoras
Não produtoras
Fracamente produtoras
Moderadamente produtoras
Figura 4.7: Perfil da atividade celulolítica das cepas de actinobactérias isoladas do
solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará. Fonte:
acervo do autor.
Figura: Perfil da atividade celulolítica de actinobactérias isoladas de região rizosférica do
Parque Nacional de Ubajara.
Figura 4.8: Classificação quanto à intensidade de produção de celulase das cepas
de actinobactérias isoladas do solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional
de Ubajara, no Ceará. Fonte: acervo do autor.
39
Quanto à atividade celulolítica das 26 cepas de rizóbios analisadas, verificou-
se que 23 (85,1%) não foram capazes de crescer em meio suplementado com
carboximetilcelulose, sendo classificadas como não produtoras de celulase.
Somente as cepas LAMAB-84, LAMAB-91 e LAMAB-96 (14,9%) demonstraram
atividade celulolítica, e foram classificadas como moderadamente produtoras
(1,5≤IE<2). Estes resultados demonstram a limitação das cepas de rizóbios na
degradação do substrato celulose (Figura 4.10).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
L83
L84
L85
L86
L87
L89
L90
L91
L92
L93
L94
L95
L96
L97
L98
L99
L10
0
L10
1
L10
2
L10
3
L10
4
L10
5
L10
7
L10
8
L10
9
L11
0
IE (
Øh
/Øc)
Rizóbios
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
(%)
Ce
pa
s d
e R
izó
bio
s
Nível de Produção de Celulase
Não produtoras
Moderadamente produtoras
Figura 4.9: Perfil da atividade celulolítica de rizóbios isolados de região rizosférica
de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará. Fonte: acervo do autor.
Figura 4.10: Classificação quanto à intensidade de produção de celulase das cepas
de rizóbios isoladas do solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional de
Ubajara, no Ceará. Fonte: acervo do autor.
40
Assim como para as actinobactérias, o teste de Kruskal-Wallis evidenciou
diferença significativa (p<0,05) entre as médias dos índices enzimático das cepas de
rizóbios produtoras de celulase.
4.2.2 Atividade Amilolítica
Em relação à capacidade de degradação de compostos amilolíticos, as cepas
de actinobactérias e rizóbios avaliadas apresentaram bom desempenho na hidrólise
de amido, como visto na Figura 4.11 (A e B) para cepa de rizóbio LAMAB-101 e para
cepa de actinobactéria UB-04.
Das 27 cepas de actinobactérias analisadas, somente em quatro (15%), não
foi evidente atividade amilolítica. Entre as 23 cepas amilase positiva (85%), o índice
enzimático variou de 1,16 mm para UB-01 a 5,47 mm para UB-05 (Figura 4.12).
As cepas UB-04, UB-05, UB-08, UB-11, UB-14, UB-20, UB-23 e UB-24
apresentaram índice enzimático superior a 3,0. Estes resultados indicam o potencial
enzimático destas cepas para produção de amilase (Figura 4.12).
Figura 4.11: Atividade amilolítica de cepas de rizóbio LAMAB 101 (A) e de
actinobactéria UB-04 (B) isoladas do solo rizosférico de leguminosa do Parque
Nacional de Ubajara, no Ceará. As setas nas zonas claras ao redor da colônia são
indicativas de atividade hidrolítica. Fonte: acervo do autor.
A B
41
De acordo com os critérios utilizados para categorização das actinobactérias
em relação ao seu potencial enzimático para degradação do amido, observou-se
que das cepas testadas, cerca de 70,3% apresentaram IE≥2, sendo consideradas
como fortemente produtoras de amilase (UB-02, UB-03, UB-04, UB-05, UB-07, UB-
08, UB-11, UB-12, UB-14, UB-15, UB-17, UB-18, UB-19, UB-20, UB-21, UB-23, UB-
24, UB-26 e UB-27). As cepas UB-01, UB-09 e UB-13 (11%) foram classificadas
como fracamente produtoras, 1≤IE<1,5, enquanto a cepa UB-16 apresentou IE de
1,95 mm, sendo a única considerada como moderadamente produtora. As cepas
UB-10, UB-22, UB-25 e UB-28 não apresentaram atividade amilolítica (Figura 4.13).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
UB
-01
UB
-02
UB
-03
UB
-04
UB
-05
UB
-07
UB
-08
UB
-09
UB
-10
UB
-11
UB
-12
UB
-13
UB
-14
UB
-15
UB
-16
UB
-17
UB
-18
UB
-19
UB
-20
UB
-21
UB
-22
UB
-23
UB
-24
UB
-25
UB
-26
UB
-27
UB
-28
IE (
Øh
/Øc)
Actinobactérias
0
10
20
30
40
50
60
70
80
(%)
Ce
pa
s d
e
Ac
tin
ob
ac
téri
as
Nível de Produção de Amilase
Fortemente produtoras
Não produtoras
Fracamente produtoras
Moderadamente produtoras
Figura 4.13: Classificação quanto à intensidade de produção de amilase das cepas
de actinobactérias isoladas do solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional
de Ubajara, no Ceará. Fonte: acervo do autor.
Figura 4.12: Perfil da atividade amilolítica de actinobactérias isoladas de região
rizosférica de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará. Fonte:
acervo do autor.
42
A análise de variância (ANOVA) das médias mostrou que houve diferença
significativa (p<0,05) entre as médias do índice enzimático das cepas de
actinobactérias amilase positiva. As cepas UB-04, UB-05, UB-08, UB-11, UB-14, UB-
20, UB-23 e UB-24, além de apresentarem índice enzimático superior a 3,0, também
exibiram diferenças estatísticas dentre os índices enzimáticos das demais cepas
avaliadas.
O índice enzimático para atividade amilolítica dos rizóbios variou de 1,71 mm
para a cepa LAMAB-90 a 4,98 mm para a LAMAB-101. Aproximadamente 17 (66%)
foram capazes de formar halo de hidrólise indicativa da presença de enzimas
amilolíticas. Dentre os rizóbios que apresentaram índices enzimáticos superiores a
3,0 mm, destacaram-se as cepas LAMAB-85, LAMAB-89, LAMAB-95 e LAMAB-101
(Figura 4.14).
Entre as cepas de rizóbios avaliadas, 30,8% foram classificadas como
fortemente produtoras (IE≥2), neste grupo estão as cepas LAMAB-83, LAMAB-85,
LAMAB-89, LAMAB-94, LAMAB-95, LAMAB-97, LAMAB-101 e LAMAB-110. As
cepas LAMAB-87, LAMAB-90, LAMAB-92, LAMAB-102, LAMAB-103, LAMAB-104,
LAMAB-105, LAMAB-108 e LAMAB-109 foram consideradas moderadamente
produtoras, pois apresentaram 1,5≤IE<2. Nenhuma das cepas analisadas foi
0
1
2
3
4
5
6
IE (
Øh
/Øc)
Rizóbios
Figura 4.14: Perfil da atividade amilolítica de cepas de rizóbios isolados de região
rizosférica de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará. Fonte: acervo
do autor.
43
classificada como fracamente produtoras. No entanto, em nove cepas de rizóbios
(34,6%) não foi possível evidenciar atividade amilolítica (Figura 4.15).
O teste de Kruskal-Wallis apontou diferença significativa (p<0,05) entre as
médias dos índices enzimáticos das cepas de rizóbios produtoras de amilase, em
especial nas que apresentaram índice enzimático maior que 2,0 mm (LAMAB-83,
LAMAB-85, LAMAB-89, LAMAB-94, LAMAB-97 e LAMAB-101).
4.2.3 Perfil Comparativo da Atividade Enzimática de Actinobactérias e Rizóbios
A maior parte das cepas de actinobactérias (59,3%) demonstrou atividade
amilolítica e celulolítica, enquanto que apenas 7,4% não foram capazes de produzir
as enzimas avaliadas (Figura 4.16). Aproximadamente 25,9% das cepas apresentou
apenas atividade amilolítica, resultado que superou o percentual de cepas
produtoras apenas de celulase, que correspondeu a somente 7,4% das cepas.
0
5
10
15
20
25
30
35
40(%
) C
ep
as
de R
izó
bio
s
Nível de Produção de Amilase
Não produtoras
Moderadamente produtoras
Fortemente produtoras
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
(%)
Ac
tin
ob
ac
téri
as
Atividade Enzimática
Apenas amilase
Apenas celulase
Amilase e Celulase
Sem produção
Figura 4.15: Classificação quanto à intensidade de produção de amilase das cepas
de rizóbios isolados do solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional de
Ubajara, no Ceará. Fonte: acervo do autor.
Figura 4.16: Percentual de actinobactérias com atividade celulolítica e amilolítica
isoladas de solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no
Ceará. Fonte: acervo do autor.
44
Atividade enzimática é um atributo importante na qualidade do solo. As cepas
UB-05, UB-07, UB-11, UB-12, UB-14, UB-17, UB-18, UB-19, UB-21 e UB-26,
destacaram-se com valores de IE celulolíticos e/ou amilolíticos superiores a 3,0.
Algumas cepas apresentaram a produção de apenas uma das enzimas testadas, no
entanto, mostraram ótimos resultados quanto ao IE, como foi verificado para UB-08
e UB-23 que mostraram IE para amilase de 5,41 e 4,74, respectivamente. Já as
cepas UB-10 e UB-25 foram produtoras apenas de celulose e apresentaram IE de
2,49 e 2,29, respectivamente. As cepas UB-17, UB-19, UB-21 e UB-26
apresentaram resultados significativos para ambos os IE, porém destacaram-se com
a presença de índices celulolíticos de 3,93, 5,21, 4,39 e 3,88, respectivamente
(Figura 4.17).
Os IEs amilolíticos e celulolíticos das cepas de actinobactérias foram
significativamente maiores que os das cepas de rizóbios.
0 1 2 3 4 5 6
UB-01
UB-02
UB-03
UB-04
UB-05
UB-07
UB-08
UB-09
UB-10
UB-11
UB-12
UB-13
UB-14
UB-15
UB-16
UB-17
UB-18
UB-19
UB-20
UB-21
UB-22
UB-23
UB-24
UB-25
UB-26
UB-27
UB-28
IE (Øh/Øc)
Acti
no
bacté
rias
Amilolítica
Celulolítica
Figura 4.17: Perfil comparativo de atividade celulolítica e amilolítica de cepas de
actinobactérias isoladas do solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional
de Ubajara, no Ceará. Fonte: acervo do autor.
45
Enquanto 16 cepas de actinobactérias (57%) foram capazes de produzir tanto
amilase quanto celulase (Figura 4.16), nenhum dos rizóbios testados foi capaz de
produzir ambas as enzimas. O percentual de cepas de rizóbios não produtoras das
enzimas avaliadas foi de 23,2%. No entanto, 65,3% das cepas de rizóbios
apresentaram somente atividade amilolítica (Figura 4.18), já a atividade celulolítica
foi evidenciada em apenas três cepas, correspondente a 11,5% do total de rizóbios
testados (Figura 4.19).
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
(%)
Riz
ób
ios
Atividade Enzimática
Apenas amilase
Apenas celulase
Sem produção
Figura 4.18: Percentual de rizóbios com atividade celulolítica e amilolítica
isoladas do solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no
Ceará. Fonte: acervo do autor.
46
4.3 Uso de Compostos Metabolizados por Actinobactérias como Fonte de
Carbono para Bactérias Diazotróficas
O crescimento por cooperação metabólica foi evidenciado pela ocorrência da
multiplicação de cepas de rizóbios ao redor das colônias de actinobactérias
conforme observado na Figura 4.20 (A e B).
0 1 2 3 4 5 6
L83L84L85L86L87L89L90L91L92L93L94L95L96L97L98L99
L100L101L102L103L104L105L107L108L109L110
IE (Øh/Øc)
Riz
ób
ios
Amilolítica
Celulolítica
Figura 4.19: Perfil comparativo da atividade celulolítica e amilolítica de cepas de
rizóbios isolados do solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional de
Ubajara, no Ceará. Fonte: acervo do autor.
Figura 4.20: (A) Teste facilitação celulase UB-11 e LAMAB-97. (B) Teste facilitação
amilase UB-04 e LAMAB-98. As setas indicam as regiões de multiplicação das
colônias de rizóbios. Fonte: acervo do autor.
47
4.3.1 Teste de Facilitação
4.3.1.1 Amilase
As cepas de rizóbios LAMAB-84, LAMAB-86, LAMAB-91, LAMAB-93, LAMAB-
96, LAMAB-98, LAMAB-99, LAMAB-100 e LAMAB-107 que não apresentaram
atividade amilolítica nos testes enzimáticos foram inoculadas separadamente com
as actinobactérias UB-02, UB-03, UB-04, UB-05, UB-07, UB-08, UB-11, UB-14, UB-
15, UB-17, UB-18, UB-19, UB-20, UB-21, UB-23, UB-24, UB-26 e UB-27 com IE≥2
para amilase.
Somente a cepa LAMAB-84 não apresentou crescimento com nenhuma das
cepas de actinobactérias usadas no teste de facilitação (Figura 4.21). As cepas
LAMAB-96 e LAMAB-98 se destacaram, apresentando crescimento com 63,15% das
cepas de actinobactérias, já a cepa LAMAB-91 obteve crescimento com apenas
duas cepas de actinobactérias (10,50%).
Dentre as actinobactérias que apresentaram melhor resultado quanto a
capacidade de auxiliar no crescimento de rizóbios deficientes na produção de
amilase, destacaram-se a UB-07 e UB-08, ambas apresentaram crescimento
conjunto com oito e sete cepas diferentes de rizóbios, respectivamente (Figura 4.22).
Estas cepas tiveram IE maiores do que dois, sendo que a UB-08 apresentou um dos
maiores IE, igual a 5,41.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
L-84 L-86 L-91 L-93 L-96 L-98 L-99 L-100 L-101
(%)
Ce
pa
s C
om
patí
ve
is
Rizóbios
Figura 4.21: Percentual de actinobactérias compatíveis com cepas de rizóbios em
teste de facilitação amilase. Fonte: acervo do autor.
48
As cepas UB-14, UB-17, UB-18, UB-19, UB-21, UB-23, UB-24, UB-26 e UB-
27, apresentaram crescimento conjunto com apenas duas ou uma cepa de rizóbio
testada (Figura 4.22). Apesar do IE das referidas cepas ter sido maior que 2,0 as
mesmas não se destacaram no teste de facilitação. Estes resultados também podem
estar relacionados a alguma dificuldade, por parte dos rizóbios, de assimilar os
compostos alterados por actinobactérias, uma vez que as referidas cepas foram
capazes de formar halo de hidrólise ao redor das colônias.
4.3.1.2 Celulase
As cepas de actinobactérias UB-05, UB-07, UB-10, UB-11, UB,12, UB-13, UB-
14, UB-17, UB-18, UB-19, UB-21, UB-25 e UB-26 que apresentaram IE≥2,0 foram
inoculadas em meio de cultivo contendo carboximetilcelulose como única fonte de
carbono. Após 10 dias foram inoculadas em mesma placa contendo as referidas
bactérias, as cepas de rizóbios (LAMAB-83, LAMAB-84, LAMAB-86, LAMAB-89,
LAMAB-90, LAMAB-92, LAMAB-93, LAMAB-94, LAMAB-95, LAMAB-97, LAMAB-98,
LAMAB-99, LAMAB-100, LAMAB-101, LAMAB-102, LAMAB-103, LAMAB-104,
LAMAB-105, LAMAB-107, LAMAB-108, LAMAB-109 e LAMAB-110) que não
apresentaram atividade enzimática para o referido substrato.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Nº
de R
izó
bio
s C
om
patí
ve
is c
om
A
cti
no
bac
téri
as
Actinobactérias
L-107
L-100
L-99
L-98
L-96
L-93
L-91
L-86
L-84
Figura 4.22: Cepas de actinobactérias compatíveis com rizóbios em teste de
facilitação amilase. Fonte: acervo do autor.
49
Todos os rizóbios testados foram capazes de crescer com pelo menos uma
cepa de actinobactéria. A cepa LAMAB-87 se destacou por apresentar crescimento
com as 13 cepas de actinobactérias testadas (Figura 4.23). Alguns rizóbios
apresentaram baixo perfil de compatibilidade com actinobactérias, sendo capazes de
crescer com apenas duas a quatro das cepas testadas, neste grupo estão inclusos
LAMAB-83, LAMAB-85, LAMAB-89, LAMAB-94, LAMAB-95, LAMAB-97, LAMAB-98,
LAMAB-99, LAMAB-100 e LAMAB-107.
Aproximadamente 48% dos rizóbios foram capazes de crescer com mais de
50% das actinobactérias testadas. Este resultado demonstra a eficácia destes
isolados na facilitação das cepas de rizóbios avaliadas quanto a assimilação de
compostos celulolíticos disponibilizados pelo metabolismo de actinobactérias.
Dentre as actinobactérias testadas no co-cultivo com rizóbios, foi possível
destacar a UB-05, UB-10, UB-11, UB-14, UB-17, UB-19, UB-21 e UB-25, sendo
capazes de permitir o crescimento de mais de 10 cepas de rizóbios deficientes na
capacidade de degradar a celulose (Figura 4.24). Ressaltando que as cepas UB-11,
UB-14, UB-17, UB-19 e UB-21, apresentaram IE>3.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
(%)
Ce
pa
s C
om
pa
tíve
is
Rizóbios
Figura 4.23: Percentual de actinobactérias compatíveis com cepas de rizóbios em
teste de facilitação celulase. Fonte: acervo do autor.
50
4.4 Caracterização Morfológica e Micromorfológica
As actinobactérias UB-02, UB-03, UB-04, UB-05, UB-07, UB-08, UB-10, UB-
11, UB-12, UB-13, UB-14, UB-15, UB-17, UB-18, UB-19, UB-20, UB-21, UB-23, UB-
24, UB-25, UB-26 e UB-27, apresentaram resultado positivo para facilitação in vitro
com pelo menos uma cepa de rizóbio e foram selecionadas para caracterização
morfológica e micromorfológica. Os resultados permitiram classificar as cepas de
actinobactérias dentro de gêneros de acordo com Willians; Sharpe; Holt (1989). Os
gêneros identificados foram Streptomyces, Terrabacter, Nocardia e Micromonospora
(Tabela 4.2 ) e (Figura 4.25).
0
2
4
6
8
10
12
14
L-8
3
L-8
5
L-8
6
L-8
7
L-8
9
L-9
0
L-9
2
L-9
3
L-9
4
L-9
5
L-9
7
L-9
8
L-9
9
L-1
00
L-1
01
L-1
02
L-1
03
L-1
04
L-1
05
L-1
07
L-1
08
L-1
09
L-1
10
Nº
de A
cti
no
bac
téri
as
Co
mp
atí
ve
is c
om
Riz
ób
ios
Rizóbios
UB-26
UB-25
UB-21
UB-19
UB-18
UB-17
UB-14
UB-13
UB-12
UB-11
UB-10
UB-07
UB-05
Figura 4.24: Cepas de actinobactérias compatíveis com cepas de rizóbios em teste
de facilitação celulase. Fonte: acervo do autor.
51
Cepa Morfologia Micromorfologia Provável Gênero Micélio Estruturas Microscópicas
UB-02 Forma filamentosa Aéreo e ramificação sob o substrato
Esporos em cadeias de espirais
Streptomyces
UB-03 Cocos soltos Ausência de micélio aéreo
Esporos únicos Micromonospora
UB-04 Cocos e bastonetes Aéreo e ramificação sob o substrato
Fragmentações em formas bacilares e esféricas
Terrabacter
UB-05 Forma filamentosa Aéreo e ramificação sob o substrato
Hifas ramificadas e onduladas
Streptomyces
UB-07 Forma filamentosa Aéreo e ramificação sob o substrato
Hifas ramificadas e onduladas
Streptomyces
UB-08 Forma filamentosa Aéreo e ramificação sob o substrato
Hifas ramificadas e onduladas
Streptomyces
UB-10 Formas bacilar e esférica. Presença de finos filamentos
Aéreo e ramificação sob o substrato
Fragmentações em formas bacilares e esféricas
Terrabacter
UB-11 Forma filamentosa, presença de formas bacilares
Aéreo e ramificação sob o substrato
Esporos em cadeias de espirais
Streptomyces
UB-12 Formas bacilar e esférica. Presença de finos filamentos
Aéreo e ramificação sob o substrato
Cadeia de esporos Fragmentações em formas bacilares e esféricas.
Streptomyces
UB-13 Forma filamentosa, presença de formas bacilares
Aéreo e ramificação sob o substrato
Fragmentações em formas bacilares e esféricas
Terrabacter
UB-14 Forma filamentosa Aéreo e ramificação sob o substrato
Fragmentações em formas bacilares e esféricas.
Terrabacter
UB-15 Forma filamentosa Aéreo e ramificação sob o substrato
Esporos em cadeias de espirais
Streptomyces
UB-17 Presença de bacilos e cocobacilos
Apenas ramificação sob o substrato
Fragmentações em formas bacilares e esféricas
Nocardia
UB-18 Presença de bacilos e cocobacilos
Apenas ramificação sob o substrato
Fragmentações em formas bacilares e esféricas
Nocardia
UB-19 Presença de bacilos e cocobacilos
Apenas ramificação sob o substrato
Fragmentações em formas bacilares e esféricas
Nocardia
UB-20 Forma filamentosa Aéreo e ramificação sob o substrato
Hifas ramificadas e onduladas
Streptomyces
UB-21 Bastonetes Apenas ramificação sob o substrato
Hifas ramificadas e esporos circulares
Nocardia
UB-23 Cocobacilos. Emaranhado de finos filamentos
Aéreo e ramificação sob o substrato
Hifas ramificadas e esporos circulares
Streptomyces
UB-24 Cocobacilos. Emaranhado de finos filamentos
Aéreo e ramificação sob o substrato
Hifas ramificadas e esporos circulares
Terrabacter
UB-25 Forma filamentosa Aéreo e ramificação sob o substrato
Hifas ramificadas e onduladas
Streptomyces
UB-26 Forma filamentosa Aéreo e ramificação sob o substrato
Hifas ramificadas e onduladas
Streptomyces
UB-27 Forma filamentosa Aéreo e ramificação sob o substrato
Esporos em cadeias de espirais
Streptomyces
TABELA 4.2: Caracterização morfológica das cepas de actinobactérias isoladas do solo
rizosférico de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará.
52
Dentre os quatro gêneros de actinobactérias identificados com base nas
características micromorfológicas, como o tipo de micélio e a estrutura das hifas, se
destacaram com maior predominância o gênero Streptomyces (54,55%), seguido
dos gêneros Terrabacter (22,72%), Nocardia (18,18%) e Micromonospora (4,55%)
(Figura 4.26).
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
(%)
Ce
pa
s
Gêneros de Actinobactérias
Streptomyces
Terrabacter
Nocardia
Micromonospora
Figura 4.26: Percentual de gêneros das cepas de actinobactérias isoladas de
região rizosférica de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará.
Fonte: acervo do autor.
Figura 4.25: Caracterização morfológica e micromorfológica de actinobactérias
isoladas de solo rizosférico de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara-CE. (A)
UB-05; (B) UB-08; (C) UB-12. Fonte: acervo do autor.
53
4.5 Caracterização Fisiológica
As actinobactérias compatíveis com os rizóbios na interação de faciltação
metabólica foram caracterizadas fisiologicamente. Os aspectos fisiológicos avaliados
foram a tolerância a salinidade, pH e temperaturas elevadas.
4.5.1 Tolerância a salinidade
Todas as cepas de actinobactérias cresceram na presença de 25% de NaCl e
19 cepas (86,4%) ainda cresceram a 35% de NaCl (Figura 4.27).
Vale ressaltar que com exceção das cepas UB-07, UB-17 e UB-21, as demais
apresentaram crescimento em todas as concentrações de NaCl (Figura 4.28).
Importante destacar que apenas a cepa UB-10 apresentou o mesmo tamanho das
colônias em todas as concentrações de NaCl, nas demais cepas o tamanho da
colônia diminuiu a proporção que ocorreu o aumento de NaCl, sugestivo de redução
celular (Figura 4.29).
75%
80%
85%
90%
95%
100%
0% 5 10 15 20 25 35
(%)
Ac
tin
ob
ac
téri
as
Concentração de NaCl(%)
Figura 4.27: Percentual de cepas de actinobactérias isoladas do solo rizosférico de
leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará, com crescimento em
diferentes concentrações de NaCl. Fonte: acervo do autor.
54
4.5.2 Crescimento em diferentes pHs
Em relação a capacidade de crescimento em diferentes potenciais
hidrogeniônicos, foi possível constatar que 95,5% das cepas de actinobactérias
apresentaram crescimento nos pHs 4, 5, 6, 7 e 8 e 91% no pH 9 (Figura 4.30).
Apenas as cepas UB-07, UB-18 e UB-26 não apresentaram crescimento em alguns
pHs, sendo observado que a actinobactéria UB-26 demonstrou desenvolvimento em
0
1
2
3
4
5
6
7
8N
º d
e C
on
cen
tra
çõ
es
de N
aC
l
Cepas de Actinobactérias
35%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
Figura 4.28: Perfil de crescimento das cepas de actinobactérias do solo rizosférico
de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará, em diferentes
concentrações de NaCl. Fonte: acervo do autor.
Figura 4.29: Crescimento da cepa de actinobactéria UB-10 isolada do solo
rizosférico de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará, em diferentes
concentrações de NaCl. Fonte: acervo do autor.
55
pHs extremos (pH 4 e 9), enquanto que, a UB-18 manifestou crescimento apenas
em pHs mais ácidos (pH 5 e 6) (Figura 4.31).
4.5.3 Tolerância a elevadas temperaturas
Quanto a capacidade para crescer sob elevadas temperaturas, foi possível
identificar que as actinobactérias testadas apresentaram na sua maioria bom
desenvolvimento, sendo que as temperaturas de 39°C e 41°C exibiram melhor
potencial para crescimento das referidas cepas, considerando um percentual de
86%
88%
90%
92%
94%
96%
98%
100%
pH 4 pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9
(%)
Ac
tin
ob
ac
téri
as
pH
0
1
2
3
4
5
6
7
Nº
de p
Hs
Actinobactérias
pH 9
pH 8
pH 7
pH 6
pH 5
pH 4
Figura 4.30: Percentual de cepas de actinobactérias isoladas do solo rizosférico de
leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará, com crescimento em
diferentes pHs. Fonte: acervo do autor.
Figura 4.31: Perfil de crescimento das cepas de actinobactérias do solo rizosférico
de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará, em diferentes pHs.
Fonte: acervo do autor.
56
72,72% para ambas as temperaturas (Figura 4.32). Nas temperaturas de 43°C e
45°C foi possivel evidenciar crescimento de 59 e 50%, respectivamente.
As cepas UB-02, UB-03, UB-04, UB-05, UB-07 e UB-12 não exibiram
desenvolvimento nas temperaturas testadas, enquanto as cepas UB-08, UB-10 e
UB-27 não demonstraram crescimento em temperaturas mais elevadas de 43°C e
45°C. As cepas UB-11, UB-13, UB-14, UB-15, UB-16, UB-17, UB-18, UB-19, UB-20,
UB-23, UB-24 e UB-26 cresceram em todas as temperaturas avaliadas (Figura
4.33).
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
39°C 41°C 43°C 45°C
(%)
Ac
tin
ob
ac
téri
as
Temperaturas
0
1
2
3
4
Nº
de T
em
pera
tura
s
Actinobactérias
45°
43°
41°
39°
Figura 4.32: Percentual das cepas de actinobactérias isoladas do solo rizosférico
de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará, com crescimento em
diferentes temperaturas. Fonte: acervo do autor.
Figura 4.33: Perfil de crescimento das cepas de actinobactérias do solo rizosférico
de leguminosas do Parque Nacional de Ubajara, no Ceará, em diferentes
temperaturas. Fonte: acervo do autor.
57
5. Discussão
De acordo com Amal et al. (2011) e Amsaveni et al. (2015), assim como
ocorre com os fungos filamentosos, a produção de pigmentos retidos no micélio ou
dissolvidos no meio é uma característica primordial na identificação das
actinobactérias. Por esta razão, foi o primeiro parâmetro utilizado neste estudo para
caracterizar as colônias isoladas do solo rizosférico do PNU.
Silva (2013) ao estudar características macroscópicas de 36 cepas de
actinobactérias também isoladas do solo rizosférico de uma região do bioma
Caatinga, registrou a prevalência das cores cinza e branco, resultados semelhantes
aos apontados neste estudo. No entanto, as cepas de actinobactérias do presente
estudo apresentaram maior diversidade cromogênica, visto que, também foram
reportadas as cores marrom, creme, laranja, verde e preto. Silva et al. (2015),
analisando as características culturais de actinobactérias oriundas de uma região do
semiárido no Estado do Ceará (Perímetro Irrigado do Baixo Acaraú), reportaram as
mesmas cores predominantes deste estudo, além dos pigmentos amarelo, rosa,
verde e azul. Segundo Amal et al. (2011), a produção dos pigmentos, sofre
influência das condições ambientais, tais como: pH, temperatura e fonte de carbono
disponível, o que pode explicar a diversidade cromogênica registrada nas diferentes
áreas do semiárido.
Embora se tratando de outros ecossistemas e, portanto, condições ambientais
diferentes, Mabrouk; Salen (2014) também evidenciaram a predominância das cores
cinza e branco nos micélios de actinobactérias de quatro regiões do Egito, além de
pigmentos verde, amarelo e púrpura. Amsaveni et al. (2015) analisando as cores dos
micélios de 26 cepas de actinobactérias isoladas de solo de uma região da Índia
identificaram a predominância de cores branco, marrom e amarelo na massa
micelial, enquanto, Augustine et al. (2013) avaliando cepas de actinobactérias de
sedimentos marinhos, também reportaram o predomínio das cores branco e cinza na
massa de micélio das colônias.
Os parágrafos anteriores tornam evidente que mesmo em diferentes regiões,
as cores miceliais cinza e branco parecem ser uma característica dominante nas
actinobactérias. A quantidade de cepas com outras tonalidades variou entre os
ecossistemas estudados, possivelmente em função das diferenças ambientais nos
habitats avaliados.
58
Além de pigmentos carotenoides, as actinobactérias também podem sintetizar
e excretar pigmentos escuros de melanina ou melanóide (Bhasin; Cameotra; Modi,
2010; Mangamuri et al., 2012; Ahmed; Keyba; Moussa, 2014). Assim como outros
metabólitos secundários, essas susbtâncias não são indispensáveis à sobrevivência
da célula e, portanto, não são necessariamente produzidas. Embora a função
desses compostos e seus benefícios para a bactéria ainda não sejam plenamente
conhecidos (Cruz et al., 2015), estudos indicam uma associação entre os referidos
metabólitos com a resistência a fatores externos, como, por exemplo, a radiação
(Ahmed; Keyba; Moussa, 2014) e temperaturas extremas (Butler; Day, 1998). Dessa
forma, além de representar um aspecto cultural à identificação das actinobactérias,
os pigmentos melanóides se apresentam como potenciais mecanismos adaptativos
a condições ambientais estressantes (Zhu et al., 2007), o que de certa forma justifica
o percentual de cepas produtoras dos referidos pigmentos (64,2%) entre as cepas
de actinobactérias isoladas no presente estudo. De fato, esse percentual é bem
superior ao registrado por Janaki; Nayak; Ganeson (2014) que avaliando
actinobactérias oriundas de sedimento de mangue na Índia constataram que
somente 18% das culturas produziram pigmentos melanóides.
Importante destacar que as cepas de actinobactérias produtoras, tanto de
pigmentos carotenoides (azul, violeta, vermelho, rosa, amarelo, verde, cinza, creme),
como melanóides (polímeros de coloração marrom escura), contribuem para
sobrevivência dos mirco-organismos no solo (Sharma, 2014; Oliveira et al., 2014),
desempenhando importante papel ecológico no equilíbrio da comunidade
microbiana. Ainda sob o ponto de vista ecológico, alguns pigmentos apresentam
atividade antimicrobiana atuando direta e/ou indiretamente na promoção de
crescimento de plantas (Miyauchi, 2012).
Assim como observado neste estudo, Silva et al. (2015) ao avaliarem as
características culturais de actinobactérias isoladas de Acaraú, região semiárida do
Ceará, registraram 17 grupos, o que confirma a diversidade desse grupo microbiano
em regiões semiáridas. De acordo com Berry; Widder (2014), a estrutura da
comunidade de qualquer habitat é “imprimida” pelas interações entre espécies.
Dessa forma, a diversidade influencia a composição biológica do solo e se constitui
um caráter ecológico primordial para manutenção de todo e qualquer ecossistema.
Assim, o grau de diversidade cultural representado pelos 16 grupos cromogênicos
59
identificados no presente estudo, reforça a importância desse grupo de bactérias no
funcionamento e na sustentabilidade no solo rizosférico do PNU.
Além do potencial para produção de pigmentos naturais, as actinobactérias
possuem outras peculiaridades de grande interesse econômico e ecológico. Neste
sentido, a reconhecida capacidade de produção de metabólitos secundários, é
responsável por pesquisas em vários ecossistemas, como deserto, manguezais e
ambientes marinhos (Anzai et al., 2008; Mangamuri et al., 2012; Bull; Asenjo, 2013;
Priyadharsini; Dhanasekaren, 2015).
Dentre os metabólitos secundários produzidos por actinobactérias, de modo
particular para representantes do gênero Streptomyces, compostos bioativos com
ação antibiótica e a produção de enzimas extracelulares, são os mais pesquisados
(Lam, 2006; Ventura et al., 2007; Duraipandiyan et al., 2010; Priyadharsini;
Dhanasekaran, 2015).
As enzimas extracelulares sintetizadas pelas actinobactérias são capazes de
hidrolisar macromoléculas complexas, como proteínas, amido, quitina, húmus,
celulose, lignocelulose e xilana, além de compostos recalcitrantes presentes no solo
(Tuncer et al., 1999; Bhasin; Modi; 2013; Minnoto et al., 2014). Para Priyadharsini;
Dhanasekaran (2015), a produção dessas enzimas facilita a sobrevivência de
vegetais pela degradação de diversos substratos complexos no solo, além de
auxiliar no controle de fitopatógenos.
Entre os substratos disponíveis no solo, a celulose constitui cerca de metade
do peso seco da biomassa da Terra (Kumar; Bisht; Gusain, 2013), sendo o
polissacarídeo de maior ocorrência natural, representando o principal componente
dos vegetais (Bernades; Santos, 2006). É um carboidrato complexo de estrutura
cristalina, insolúvel em água e muito resistente a ação de enzimas e reagentes
químicos (Kumar; Bisht; Gusain, 2013).
Na presente pesquisa, a maioria das cepas de actinobactérias (66,6%)
demonstraram atividade enzimática para celulose, sendo que deste total, 70,3%,
apresentaram IEs superiores a 2,0. Estudos descritos por Abdulla; El-Shatoury,
(2007); Bhasin; Cameotra; Modi, (2010); Meignanalakshmi et al., (2013); Das;
Solanki; Khanna, (2014); Minnoto et al., (2014) apontam atividade celulolítica em
actinobactérias isoladas de amostras de solo de diferentes ambientes do Egito, da
Índia e do sul do Brasil. Um dos raros trabalhos sobre atividade celulolítica de
actinobactérias do semiárido nordestino, mais precisamente cepas isoladas de solos
60
da Bahia, foi realizado por Bispo (2010), que ao avaliar 80 cepas de actinobactérias,
reportou a presença de atividade celulolítica em 33% das mesmas. Segundo Sadhu;
Maiti (2013), estirpes bacterianas que produzem enzimas celulolíticas são
extremamente resistentes à estresses ambientais, constituindo assim, grupos de
extrema relevância para manutenção de outras espécies de seres vivos nestes
ambientes de condições relativamente hostis, reforçando a importância biológica e
ecológica desse grupo no semiárido brasileiro.
Embora os raros estudos sobre o potencial celulolítico de actinobactérias no
semiárido brasileiro reforcem a importância do presente estudo, dificulta a
comparação de resultados. Assim, a partir da literatura consultada, foram
selecionados alguns trabalhos com atividade celulolítica de actinobactérias
provenientes de outros ecossistemas. Minnotto et al. (2014) identificaram que 30%
das cepas de actinobactérias isoladas de amostras de solo da cidade de Pelotas,
Rio Grande do Sul no Brasil, foram capazes de degradar a carboximetilcelulose. O
percentual duas vezes maior de cepas celulolíticas do presente estudo (66,4%), é
sugestivo do efeito das condições estressantes no semiárido para produção da
enzima celulase por cepas de actinobactérias.
Jaradat et al. (2008) estudando 340 cepas de actinobactérias isoladas de
amostras de solo de uma região do Iraque, observaram que 94% dos isolados
apresentaram halos de degradação da celulose. No entanto, apenas três cepas
(1%), exibiram diâmetro na faixa de 20 mm e 25 mm, com a cepa J2 exibindo o
maior halo de inibição (22 mm). No presente estudo, 16 cepas (59%) mostraram
diâmetros de halo de inibição entre 20 mm a 32 mm, ressaltando que, a cepa UB-04,
que apresentou o maior halo de inibição (32 mm), não exibiu o maior IE. Esta
constatação ressalta o descrito por Silva et al. (2015a) de que somente a medida do
halo de inibição é insuficiente como medida da atividade enzimática.
As cepas de rizóbios utilizadas neste trabalho foram oriundas das mesmas
amostras de solo rizosférico de leguminosas do PNU, mas somente três (14,9%)
apresentaram atividade celulolítica, indicando a deficiência dessa enzima na
população de rizóbios da referida área. Esse grupo de bactéria desempenha a
importante função de fixar o nitrogênio atmosférico (N2), transformando-o em NH3,
que é utilizado pelas plantas. Segundo Robledo et al. (2008) o principal evento no
desenvolvimento da simbiose rizóbio-leguminosa é a degradação da parede celular
da planta para a passagem da bactéria. Portanto, nesse processo infeccioso,
61
enzimas capazes de degradar celulose são de fundamental importância. Oliveira et
al. (2006); Kumari; Ram; Mallaiah (2010) reportam que a excreção de enzimas
degradadoras da celulose no solo disponibiliza nutrientes para a comunidade
microbiana em geral e, em particular para os rizóbios deficientes dessa enzima.
Resultado semelhante ao do presente estudo foi reportado por Oliveira et al.
(2006a) que ao estudarem 67 cepas de rizóbios isoladas da Amazônia central
observaram atividade celulolítica em apenas seis cepas (9%). Estudos também
exibiram resultados pouco significativos para produção extracelular de celulose por
cepas de rizóbios isolados de solo da Índia (Singh; Kaur; Singh, 2008). Os dados
sugerem que este grupo presente na região rizosférica, é deficiente na degradação
desse substrato abundante no solo, não possuindo complexos enzimáticos capazes
de solubilizá-lo.
De acordo com Bernades; Santos (2006) em solos úmidos, os fungos são os
principais decompositores da celulose, ao passo que em solos de regiões
semiáridas, as bactérias predominam. Desse modo, a presença de grupos
bacterianos potencialmente decompositores de celulose em regiões de solos
semiáridos, como as actinobactérias, constitui ferramenta importante na reciclagem
de matéria orgânica, e, por conseguinte, na disponibilização de carbono para as
demais espécies. De fato, Martins et al. (2014) em estudo nessa mesma região do
PNU, registraram que a população de actinobactérias do solo foi significativamente
maior que a de fungos.
Além da celulose, outros carboidratos também apresentam grande relevância
para atividade microbiana no solo. O amido, principal reserva dos vegetais e sua
fonte principal de energia, é um carboidrato complexo e bastante comum no solo,
constituído por amilase e amilopectina, sendo decomposto por fungos e bactérias
(Mishra; Behera, 2008; Cuzzi et al., 2011; Alariya et al., 2013).
Estudos indicam a presença de atividade amilolítica por actinobactérias e
rizóbios (Oliveira et al., 2006a; Augustine et al., 2013; Jaralla et al., 2014). Mansour;
Abdel-Azeem; Abo-Deraz (2015) ao avaliarem a atividade amilolítica de 35 cepas de
actinobactérias de amostras de solo de Al-Aqsa Mosque em Jerusalém, Israel,
verificaram que todas as cepas apresentaram atividade amilolítica. Minotto et al.
(2014) ao observarem a atividade enzimática para amilase sob diferentes
temperaturas de 23 actinobactérias endofíticas obtidas de raízes de plantas de
tomate (Lycopersicon esculentum) em solo do Rio Grande do Sul, também
62
constataram atividade amilolítica em todas as cepas. Estudo desenvolvido na Índia,
por Singh; Kumar; Kapoor (2014) a partir de amostras de solo rizosférico de
morango, também apontaram significativa atividade amilolítica em cepas de
actinobactérias. No presente estudo, foi possível evidenciar a atividade amilolítica
em 85% das cepas analisadas, sendo que as actinobactérias UB-04, UB-05, UB-08,
UB-11, UB-14, UB-20, UB-23 e UB-24, apresentaram IEs superiores a 3,0, exibindo
expressivo potencial para produção dessa enzima.
A cepa UB-05 apresentou maior IE para amilase (5,45), demonstrando
crescimento em vários pHs (4, 5, 6, 7, 8 e 9) e em concentrações de NaCl de até
35%, porém não mostrou desenvolvimento em temperaturas mais elevadas (39°C a
45°C). Já as actinobactérias UB-11, UB-15, UB-20 e UB 23 apresentaram IEs
superiores a 2,5 e demonstraram desenvolvimento em todos os pHs testados (4, 5,
6, 7, 8 e 9), em concentrações salinas de até 35%, e em temperaturas de até 45°C.
Meena et al. (2013), estudando a atividade enzimática de 26 actinobactérias
isoladas de ambiente marinho, observaram atividade amilolítica de 23 isolados
(88%), sendo a cepa NIOT-VKKMA02 selecionada pelo maior IE de 4,3, e em testes
fisiológicos a mesma apresentou maior desenvolvimento em pH 8 e em
concentrações de NaCl de 5-15%.
Zenova; Manucharova; Zvyagintsev (2011) ressaltam que as actinobactérias
são capazes de colonizar ambientes extremos, caracterizados por pHs ácidos ou
acalinos, temperaturas baixas ou elevadas, salinos, com elevados índices de
radiação, baixos níveis de umidade e também com poucos nutrientes. Segundo
Shivlata; Satyanarayana, (2015), a diversidade fisiológica e a grande flexibilidade
metabólica de actinobactérias extremofílicas/termotolerantes, é que permite a
sobrevivência desse grupo bacteriano em ambientes hostis e com condições
desfavoráveis. De fato, as cepas de actinobactérias avaliadas neste estudo
confirmaram essa versatilidade fisiológica, exibindo padrões importantes de
resistência para ambientes áridos.
Quanto a atividade amilolítica dos rizóbios, Oliveira et al. (2006a) estudando a
produção de enzimas hidrolíticas extracelulares de rizóbios nativos da Amazônia
central, observaram que de 67 isolados, 19 (32,8%) apresentaram produção de
amilase, sendo que destes, 7 (36,8%) exibiram IE≥2,1. Outros estudos também
conduzidos por Oliveira et al. (2006), constataram que de 64 isolados, foi possível
evidenciar atividade amilolítica em 29,7% das cepas de rizóbios. Estes resultados se
63
assemelham ao atual estudo, tendo em vista que das 26 cepas, 8 (30,8%) tiveram
IE≥2. Já Fernandes Júnior et al. (2012a), verificaram que de 27 isolados de rizóbios
da rizosfera de Guandu (Cajanus cajan) no Rio de Janeiro, quatro mostraram
elevada atividade amilolítica, quatro apresentaram capacidade intermediária, e 19
exibiram baixa capacidade hidrolítica. Resultados semelhantes também foram
obtidos por Nunes et al. (2013), ao avaliarem a produção de amilase em 10 cepas
de rizóbios oriundas de amostras de solo da Bahia, obtiveram resultado positivo em
quatro cepas (40%).
O maior percentual amilolítico de cepas de actinobactérias e rizóbios em
comparação com o celulolítico, pode ser função da menor complexidade estrutural
do amido em relação à celulose, o que torna o referido substrato mais acessível para
os micro-organismos.
Manivasagan et al. (2010) observaram que de 29 cepas de actinobactérias
isoladas de solo de uma região da Índia, 10 (34,4%) exibiram atividade enzimática
amilolítica e celulolítica, com destaque para a cepa GK22 que teve máxima atividade
em pH 7, concentração de NaCl de 2% e em temperaturas de 45°C. No presente
trabalho, 10 cepas (38,4%) também exibiram múltipla atividade enzimática (amilase
e celulase), sendo que as actinobactérias UB-11, UB-14, UB-17 e UB-26,
apresentaram IE>2 e demonstraram desenvolvimento em diferentes pHs (4, 5, 6, 7,
8 e 9), em concentrações salinas de até 35% e em temperaturas de até 45°C. Esses
resultados indicam que o solo do PNU, se constitui um reservatório de cepas de
actinobactérias com potencial biotecnológico para a produção de enzimas, bem
como para recuperação de solos em áreas com condições ambientais extremas.
Minotto et al. (2014), trabalhando com actinobactérias endofíticas em solo de
uma região de Porto Alegre, Rio Grande do Sul, constataram atividade enzimática
nas temperaturas de 25°C, 28°C e 30°C, sendo que a actinobactéria R(24),
destacou-se com IE>2 para amilase e celulase em todas as temperaturas testadas.
Comparando o efeito da temperatura limite desse estudo e da presente pesquisa,
constata-se o efeito da influência das condições ambientais, no caso a temperatura,
nas cepas isoladas do semiárido. Os dados do atual estudo reforçam a versatilidade
fisiológica desse grupo microbiano, sobretudo, em relação ao seu potencial
metabólico sobre condições abióticas estressantes.
A constatação de cepas de actinobactérias com capacidade de degradar
substratos amilolíticos e celulolíticos, como demonstrados neste estudo (59,3%),
64
configura-se como um indicativo da presença de enzimas hidrolíticas no solo do
PNU capazes de decompor moléculas complexas e altamente ricas em carbono. De
acordo com Gorlach-Lira; Coutinho (2007), a produção de enzimas hidrolíticas no
solo semiárido, caracterizados pela baixa disponibilidade de nutrientes, assim como
o efeito da própria rizosfera, pode contribuir significativamente para o crescimento e
sobrevivência de populações microbianas, influenciando assim, na estruturação da
microbiota local. Assim, a função da população microbiana nos solos, se torna
fundamental para recuperação de elementos essenciais, seja pela entrada de
matéria orgânica, ou pelo acúmulo dessa matéria no solo (Caldwell, 2005).
As actinobactérias vivem em colônias, juntamente com outros micro-
organismos em diversos ambientes. Assim, a interação entre este grupo com os
demais seres em mesmo habitat, pode ocorrer através de interações negativas,
como a competição e o antagonismo, ou por interações positivas, como a facilitação,
o mutualismo e o comensalismo. Segundo Tilman (2000), os processos que
permitem a interação entre espécies e sua coexistência influenciam não apenas a
produtividade e dinâmica de nutrientes, assim como também a estabilidade desse
ecossistema.
O presente estudo avaliou a interação metabólica cooperativa entre cepas de
actinobactérias produtoras de enzimas celulolíticas e amilolíticas com rizóbios não
produtores das referidas enzimas. Este procedimento visou observar a presença de
possíveis mecanismos metabólicos existentes em actinobactérias, que seriam
supostamente responsáveis por disponibilizar fontes de carbono para populações de
bactérias diazotróficas existentes em solo rizosférico, facilitando assim, a
sobrevivência de grupos bacterianos ineficientes na degradação de carboidratos
complexos, como o amido e a celulose, e, permitindo dessa forma, a coexistência
estável dessas populações microbianas em mesmo habitat. Os resultados
apresentados neste estudo sugerem crescimento das cepas de rizóbios em
substratos contendo os referidos carboidratos, metabolizados inicialmente por cepas
de actinobactérias. Em ambos os testes de facilitação, houve compatibilidade entre
rizóbios e actinobactérias, confirmando Tzamali et al. (2011), que afirmam que os
micro-organismos dependem de interações metabólicas para aumentar o suprimento
de nutrientes e para melhor explorar um determinado ambiente.
O tipo de interação avaliado no presente estudo tem sido reportado por Bull;
Harcombe, (2009); Tzamali et al., (2011); Pande et al., (2014); Ribeck; Lenski,
65
(2015), sendo denominado cross-feeding e identificada como uma troca de
nutrientes entre espécies de micro-organismos. Turner; Souza; Lenski (1996)
afirmam que este mecanismo é também responsável pela manutenção da
diversidade ecológica das bactérias.
Na presente pesquisa foi possível identificar crescimento de cepas de rizóbios
cultivadas com actinobactérias, sendo que alguns rizóbios apresentaram maior
compatibilidade (LAMAB-87, LAMAB-96 e LAMAB-98). Em estudos avaliando a
compatibilidade de nove cepas de actinobactérias com seis cepas de bactérias
diazotróficas, Jesus (2013) constatou que as estirpes diazotróficas VM10, Pal5,
RAM10 e HRCR54 oriundas do solo de Campos dos Goytacazes-RJ, apresentaram
maior número de interações positivas, destacando-se a RAM10 que foi compatível
com todas as cepas de actinobactérias testadas. Importante destacar que na
extensa revisão de literatura do presente trabalho, este foi o único trabalho a abordar
essa interação metabólica entre rizóbios e actinobactérias do solo. Martins et al.
(2016), avaliando in vivo mecanismos de facilitação para o crescimento de micro-
organismos sob diferentes níveis de fenol, constatou maior crescimento das
espécies consorciadas, do que quando cultivadas isoladamente, demonstrando que
a interação positiva entre as espécies aumentou o valor adaptativo (fitness) das
mesmas. Há poucos registros na literatura sobre o co-cultivo de actinobactérias com
outros micro-organismos (Abdelmohsen et al., 2015), principalmente avaliando-se
interações a nível ecológico quanto a mecanismos de facilitação. De acordo com
Pande et al. (2014), a maioria dos casos de co-cultura com interações cross-feeding
entre cepas mostra aumento do fitness Darwiniano. Para Gerlee; Lundh (2010), a
diversidade é facilitada através dessas interações metabólicas, uma vez que uma
estirpe degrada parcialmente um substrato que será utilizado como um recurso por
uma segunda estirpe. Assim, os resultados do atual estudo indicam que a
manutenção da diversidade microbiana do solo do PNU pode ser auxiliada por
interações cross-feeding que melhoram o fitness de comunidades bacterianas.
A maioria dos estudos registrados na literatura que avaliam interações
metabólicas cross-feeding entre micro-organismos se baseiam em cepas de
Escherichia coli, nos quais demonstram crescimento de comunidades de E. coli por
cooperação entre estirpes (Bull; Harcombe, 2009; Harcombe, 2010; Wintermute;
Silver, 2010; Tzamali et al., 2011). Phelan et al. (2013), afirmam que os micro-
organismos dedicam numerosos recursos para manter interações metabólicas, o
66
que demonstra a importância desses fatores metabólicos na sobrevivência de micro-
organismos individuais e no fitness da comunidade microbiana.
Embora o presente estudo não tenha quantificado o fitness (valor adaptativo)
das cepas de rizóbios que apresentaram crescimento no co-cultivo com
actinobactérias, foi possível observar que as actinobactérias que exibiram
crescimento com os rizóbios não apresentaram halo de inibição, o que aponta que
não houve reações antagônicas entre as cepas. Este fato corrobora os resultados
apresentados que indicam a existência de interações metabólicas de facilitação. De
acordo com Brostein (2009), a facilitação poderia ser definida como toda interação
positiva, em que pelo menos uma das espécies envolvidas é beneficiada, sendo
assim, a disponibilização de nutrientes limitantes por uma das partes constitui um
mecanismo de facilitação.
As actinobactérias que apresentaram maior número de interações positivas
para amilase (UB-07, UB-08) e celulase (UB-05, UB-10, UB-11, UB-14, UB-17, UB-
19, UB-21 e UB-25), exibiram na sua maioria crescimento em diversos pHs (4, 5, 6,
7, 8, 9), em várias concentrações salinas (5-35%), e em temperaturas elevadas
(39°C a 45°C). Esses dados corroboram com as observações feitas por Bertness;
Callaway (1994), que afirmam que as interações positivas aumentam à medida que
há aumento de estresses físicos. A presença das condições supostas neste estudo,
caracterizam as condições frequentemente encontradas em solos de região
semiárida. Segundo Goel et al. (2012), as restrições ambientais limitam a
distribuição dos micro-organismos, no entanto a presença de um comportamento
fisiológico adaptado a essas restrições, pode ser consequência de um processo
adaptivo que melhora seu fitness.
Os resultados dos testes fisiológicos das actinobactérias compatíveis nos
ensaios de facilitação demonstrou que as cepas apresentaram um perfil fisiológico
compatível com ambientes de condições estressantes, uma vez que a maioria
apresentou crescimento em vários pHs e salinidade extremas, e em temperaturas de
até 45°C, com exceção das cepas UB-02, UB-03, UB-04, UB-05, UB-07 e UB-12 que
não exibiram crescimento nas temperaturas testadas. As variações ambientais são
onipresentes, assim, compreender como as mudanças no ambiente influenciam as
interações entre espécies é crucial para predizer a dinâmica de populações e
comunidades (Hart; Marshall, 2013).
67
O gênero Streptomyces constitui um dos mais expressivos representantes
das actinobactérias, em parte, isso se deve a sua abundância no solo, além de ser
responsável por cerca de 75% dos compostos bioativos com ação antibiótica
produzidos pelo metabolismo secundário de actinobactérias (Bhasin; Modi, 2013).
Neste estudo, o gênero Streptomyces foi o mais abundante (54,55%) dentre os
isolados de actinobactérias que apresentaram compatibilidade com as cepas de
rizóbios, sendo importante ressaltar que a mesma predominância foi observada
quanto produção de enzimas amilolíticas e celulolíticas. Abdulla; El-Shatoury (2007),
ao avaliarem a atividade celulolítica de 42 actinobactérias, também constataram
predominância do gênero Streptomyces (65%). Estudos com 512 actinobactérias
isoladas de diferentes regiões da Índia, também revelaram predominância do gênero
Streptomyces (65,23%), sendo que outros gêneros como Nocardia (4,49%) e
Micromonospora (0,97%), apresentaram menor representatividade (Kumar; Bisht;
Gusain, 2013). Esses dados se assemelham ao do presente trabalho, uma vez que
os mesmos gêneros tiveram apenas quatro e um representante, respectivamente.
Apesar da menor prevalência desses gêneros nos isolados do PNU, os mesmos
apresentam características relevantes como a capacidade de sobreviver em
ambientes hostis e a produção de enzimas hidrolíticas (Adegboye; Babalola, 2012).
Segundo Shivlata; Satyanarayana (2015), as actinobactérias podem ser
poliextremófilas e poliextremotolerantes, existindo em ambientes com duas ou mais
condições extremas. Nesse sentido, pesquisas tem revelado potencial de
crescimento para este grupo bacteriano em temperaturas elevadas (Kurapova et al.,
2012), em regiões salinas (Mohamed; Al-Saedi; Sadik, 2013), assim como em
regiões extremamente ácidas (Zenova; Manucharova; Zvyagintsev, 2011) ou
bastante alcalinas (Shivlata; Satyanarayana, 2015). Essa diversidade fisiológica
facilita a colonização de actinobactérias nos mais variados ambientes em distintas
zonas topográficas (Shivlata; Satyanarayana, 2015). Assim, a presença de
actinobactérias com ampla variedade fisiológica e com reconhecido potencial
metabólico, indica a relevância desse grupo microbiano na constituição da
comunidade microbiana dos solos da região do PNU.
Interações metabólicas constituem elo importante entre a manutenção da
diversidade microbiana e a disponibilidade de recursos, especialmente no solo,
ambiente de grande heterogeneidade ambiental. Dessa forma, a presença de
mecanismos metabólicos cooperativos entre cepas de micro-organismos, como
68
evidenciados no presente trabalho, demonstram a importância dessas interações
nos mecanismos de facilitação microbiana, contribuindo para manutenção de
comunidades, sobretudo em áreas com condições abióticas limitantes, como regiões
semiáridas.
69
6. Conclusões
Cepas de rizóbios do PNU foram compatíveis com cepas de actinobactérias,
sendo capazes de crescer em substratos celulolíticos e amilolíticos metabolizados
por actinobactérias. As cepas UB-07 e UB-08 se destacaram nos ensaios de
facilitação de amilase, enquanto que as cepas UB-05, UB-11 e UB-21, foram
expressivas nos ensaios de facilitação de celulase. A atividade metabólica de
actinobactérias auxiliou o desenvolvimento de cepas de rizóbios, apresentando
também potencial para resistência a fatores abióticos limitantes.
70
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Considerações finais
Neste trabalho o objetivo principal foi avaliar in vitro a interação metabólica de
actinobactérias como um mecanismo de facilitação para coexistência estável de
rizóbios em solo do semiárido do Nordeste brasileiro. A presente pesquisa foi
importante para ampliar o conhecimento sobre bactérias do semiárido, sobretudo
quanto aos aspectos ecológicos relacionados a sua distribuição, já que nessa região
os estudos sobre componentes microbianos são escassos, de modo particular para
cepas de actinobactérias.
88
Perspectivas Futuras
Após os estudos realizados, recomenda-se continuar com as pesquisas para
ampliar o conhecimento sobre essas bactérias, sobretudo, quanto a influência direta
de fatores abióticos na sua atividade metabólica e das possíveis interferências
dessas variações na capacidade de interação entre as espécies, assim como,
quantificar o fitness das espécies com base nas interações estabelecidas sob
influência de fatores estressantes.