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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUÇÃO EM NEUROLOGIA MESTRADO EM NEUROLOGIA
SONIA BATISTA SARAIVA
ALTERAÇÕES COGNITIVAS NA ESCLEROSE MÚLTIPLA E SUA ASSOCIAÇÃO COM O GENE APOE4: ESTUDO CASO-CONTROLE EM PACIENTES
DE UM CENTRO DE REFERÊNCIA NO RIO DE JANEIRO
RIO DE JANEIRO 2009
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SONIA BATISTA SARAIVA
ALTERAÇÕES COGNITIVAS NA ESCLEROSE MÚLTIPLA E SUA ASSOCIAÇÃO COM O GENE APOE4: ESTUDO CASO-CONTROLE EM PACIENTES
DE UM CENTRO DE REFERÊNCIA NO RIO DE JANEIRO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Neurologia do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Neurologia, área de concentração Neurociências. Orientadora: Profa. Dra. Regina Maria
Papais Alvarenga
RIO DE JANEIRO 2009
616.8 Saraiva, Sonia Batista, S243a Alterações cognitivas na esclerose múltipla e sua
associação com o gene Apoe4: estudo caso-controle em pacientes de um Centro de Referência no Rio de Janeiro. / Sonia Batista Saraiva - Rio de Janeiro, 2009.
62 f. Orientadora: Profª. Drª. Regina Maria Papais Alvarenga. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Estado do
Rio de Janeiro, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Mestrado em Neurologia, 2009.
1. esclerose múltipla. 2. APOE. 3. alterações cognitivas. I.
Alvarenga, Regina Maria Papais. II. Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro. III. Título.
SONIA BATISTA SARAIVA
ALTERAÇÕES COGNITIVAS NA ESCLEROSE MÚLTIPLA E SUA ASSOCIAÇÃO COM O GENE APOE4: ESTUDO CASO-CONTROLE EM PACIENTES
DE UM CENTRO DE REFERÊNCIA NO RIO DE JANEIRO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Neurologia do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Neurologia, área de concentração Neurociências.
Aprovado em: ___/___/___.
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________ Profª. Drª. Regina Maria Papais Alvarenga
Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro
______________________________________________ Prof. Dr. Helcio Alvarenga
Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro
______________________________________________ Profª. Drª. Vilma Duarte Câmara
Universidade Federal Fluminense Universidade Gama Filho
AGRADECIMENTOS
Os resultados alcançados na trajetória de nossas vidas estarão sempre
associados à contribuição de muitas pessoas. São por suas ações, de forma direta
ou indireta, que conseguimos vencer obstáculos e crescer de forma integral. Rendo
os seguintes agradecimentos:
A Deus, por ter me dado o dom de persistência, perseverança, pois esta é
mais uma etapa que venço orientada por sua vontade;
A meus pais, Salvador e Afra, pelo presente da vida e pela partilha de todos
estes momentos. Sempre vibrando com minhas vitórias e tornando mais amenos os
obstáculos;
A meus filhos Pedro, Flávia e Thaís, razão do meu viver, estímulo para que
me torne cada vez mais uma pessoa melhor. Participar de suas vidas e do seu
crescimento está sendo um privilégio, a felicidade de estar junto de vocês, me faz
crer que são presentes de Deus;
A meu marido, Paulo, pelos ensinamentos e pela sua forma de Ser, ao
considerar o próximo como a si mesmo. Sempre esteve ao meu lado em todos os
momentos me incentivando com seu carinho e felicidade contagiante;
A meus irmãos Alexandre, Sandra, Flávio e Marcus companheiros dos
melhores momentos de minha infância e hoje amigos de todas as horas;
A Escola de Saúde do Hospital Naval Marcilio Dias, onde fui aluna durante
dois anos em destaque para a realização desse trabalho;
Ao Prof. Dr. Hélcio Alvarenga, valendo-se do seu profundo conhecimento,
ajudou-me a crescer como neurologista, permitindo que me espelhasse em seu
exemplo. Sou grata por realmente ter me ensinado a arte neurológica. Obrigado
Mestre;
À Profª. Drª. Regina Alvarenga, por ter me recebido em seu curso de
mestrado, depositado sua confiança em mim, ter acreditado no meu potencial,
permitindo que eu explorasse e expandisse meus horizontes. Muito obrigado;
A todos os docentes da UNIRIO que conseguem ver alem das fronteiras com
grande senso, sabedoria e servem de bússola para tantos alunos. Agradeço todas
as aulas recebidas, pois serviram para que eu pudesse acumular conhecimentos e
realizar este trabalho;
Aos médicos do Hospital da Lagoa em especial a Drª. Claudia Vasconcelos,
Drª Claudia Miranda, Dr. Gutemberg e Drª. Solange por ter facilitado o acesso dos
pacientes incluídos neste estudo. Agradeço ainda aqueles que por um excesso de
zelo com seus pacientes, me deixaram distantes deles, mas sempre me trataram
cordialmente;
A Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ)
em nome de seu diretor cientifico Prof. Dr. Jerson Lima pelo auxílio financeiro a
pesquisa, sem o qual este projeto não se realizaria;
Às psicólogas Renata e Dora pelas avaliações neuropsicológicas deste
trabalho, pelas discussões científicas e pela agradável convivência profissional. Foi
um privilégio está ao lado de vocês acompanhando efetivamente todas as
avaliações neuropsicológicas;
Aos pacientes com Esclerose Múltipla, seus familiares e aos controles que
com espírito humanitário e boa vontade compareceram ao ambulatório para
avaliação e coleta de sangue, permitindo a realização do estudo;
Aos secretários Luiz Eduardo e Heleine pela amizade e apoio nesta trajetória.
Muito obrigado;
As bibliotecárias Mara e Janaina da Maternidade Escola da UFRJ. Agradeço
pela prontidão com que me enviava os artigos que necessitei para realizar este
trabalho;
Ao Laboratório Genomic pela análise genética das amostras de sangue;
Aos membros da Banca examinadora por terem aceitado o convite de
participação, pela prontidão na leitura, análise do trabalho e pelas valiosas
sugestões para o aprimoramento do mesmo;
Enfim, agradeço a todos àqueles que participaram, favorável ou
contrariamente, no processo desse Mestrado. Certamente, tiveram grande
importância na execução desta pesquisa.
“Ao longo da história da humanidade (e dos animais também) aqueles que foram mais eficazes em aprender a colaborar e a improvisar foram os que prevaleceram”. (Charles Darwin)
RESUMO
Introdução: Avaliações neuropsicológicas vêm identificando alta prevalência de alterações cognitivas (40 a 60%) na Esclerose Múltipla (EM). Apesar do genótipo APOE4 ser considerado fator de risco genético para a doença de Alzheimer (DA), resultados de estudos sobre seu papel na cognição em pacientes com EM são contraditórios e não há dados na população brasileira. Objetivos: Analisar os efeitos do polimorfismo do gene APOE na cognição de pacientes brasileiros com EM. Metodologia: 60 pacientes e 30 controles do Rio de Janeiro foram incluídos no estudo e submetidos à avaliação neuropsicológica por bateria breve composta dos seguintes testes: Rey Auditory Verbal Learning Test (RAVLT); Symbol Digit Modalities Test - (SDMT); Controlled Oral Word Association (COWAT); Inventário de Ansiedade Beck (BAI) e Inventário de Depressão de Beck (BDI). De acordo com o resultado dos testes neuropsicológicos os pacientes foram divididos em dois grupos: EM com exame neuropsicológico normal e EM com alterações cognitivas. Amostras de sangue de pacientes e controles foram coletadas e submetidas à análise do DNA genomico amplificado pela técnica de PCR (polimerase chain reaction) e genotipagem do alelo da APOE 4 pelo método de Donohoe. A freqüência da APOE 4 foi comparada entre pacientes e controles e entre pacientes com EM com ou sem alteração cognitiva. Resultado: A freqüência da APOE ε4 foi maior no grupo de pacientes com comprometimento cognitivo. (OR 3,76 IC 95% 1,04 - 13,65). Conclusão: Apoiando estudos prévios realizados em populações caucasianas comprovou-se associação do alelo APOE ε4 em pacientes do Rio de Janeiro com alterações cognitivas. Palavras-chave: Esclerose Múltipla, APOE, Alterações Cognitivas.
ABSTRACT
Background: neuropsychological evaluations may detect high prevalence of cognitive impairment (40 60%) in Multiple Sclerosis(MS) Although genotype APOE4 can be considered a genetic risk factor for the Alzheimer Disease (AD), its roll in the cognition of patients with MS is contradictory and it is unknown in the Brazilian population. Objectives: The aim of this study was to analyze the effect of APOE polymorphism in the cognition of Brazilian patients with MS. Methodology: 60 patients and 30 controls in Rio de Janeiro had been studied, including a neuropsychological evaluation for brief composed battery of the following tests: Rey Verbal Auditory Learning Test (RAVLT); Symbol Digit Modalities Test (SDMT); Controlled Oral Word Association (COWAT); Beck Anxiety Inventory (BAI) and Beck Depression Inventory (BDI). In accordance with the results of the neuropsychological evaluations, the patients had been divided in two groups: ME with normal neuropsychological evaluations and ME with cognitive impairment. Blood samples of the individuals in this study had been collected and submitted to genomic DNA analysis, that has amplified by the technique of PCR (polymerase chain reaction) and APOE genotyping for the method of Donohoe. The frequency of APOE 4 was compared between patients and controls and patients with ME with or without cognitive impairment. Result: The frequency of the APOE ε4 was higher in the group of patients with cognitive impairment. (OR 3, 76 IC 95% 1, 04 - 13, 65). Conclusion: Supporting findings in previous studies, considering the Caucasian population, there is a valid association of allele APOE ε4 and cognitive impairment in the studied population in Rio de Janeiro. Key-words: Multiple Sclerosis, APOE, Cognitive Impairment.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro 1 Critérios Diagnósticos para EMPP (THOMPSON et al., 2000) ......... 19Quadro 2 Critérios de RM do crânio. (BARKHOF et al., 1997; TINTORÉ et al.,
2000) …………………………………………………………………….... 20
Quadro 3 Critérios de McDonald e outros (2001) ............................................. 20Quadro 4 Critério diagnóstico de McDonald e outros (2001) para EM revisado
por Polman e outros (2005) ............................................................... 21
Quadro 5 Testes neuropsicológicos aplicados e funções cognitivas avaliadas ........................................................................................... 35
Quadro 6 Primers (DONOHOE et al., 1999) e outros componentes utilizados na PCR .............................................................................................. 36
Quadro 7 Reação de PCR duas reações [A e B] para cada amostra ............... 37Quadro 8 Processo de desnaturação ............................................................... 38Quadro 9 Detecção dos polimorfismos APOE em gel agarose ........................ 38Figura 1 Esquema do DNA amplificado .......................................................... 38
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Características demográficas da amostra (n=90) .............................. 40Tabela 2 Distribuição e freqüência do alelo e genótipo APOE ........................ 42Tabela 3 Variáveis clinicas da EM e alteração cognitiva entre pacientes de
acordo com o estado APOE4 ............................................................ 42
Tabela 4 Freqüência dos testes alterados de acordo com a presença do alelo ε4 .............................................................................................. 43
Tabela 5 Comparação dos grupos entre o resultado dos testes e a presença dos alelos ε4 ...................................................................................... 43
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AC Alterações Cognitivas
APOE Gene da apolipoproteína E
Apo E Apolipoproteína E
APOE4 Alelo 4 do gene APOE
BECRT Enchanced Cued Recall Test-Buschke
BOC Bandas Oligoclonais
BRB-N Brief Repeatable Battery of Neuropsychological Test
CBTT Corsi Block Tapping Task
CCSS Cognitive Composite Standard Score
CD Copping of Drawings
CDL Copping Drawing With Landmarks Test
CLTR Consistent Long Term Retrievel
CVLT California Verbal Learning Test
COWAT Controled Oral Word Association Test
DA Doença de Alzheimer
DSMT Digit Symbol Modalities Tests
EM Esclerose Múltipla
EMB Esclerose Múltipla Benigna
EMCD Esclerose Múltipla Clinicamente Definida
EMCP Esclerose Múltipla Clinicamente Provável
EMDLA Esclerose Múltipla Definida laboratorialmente Apoiada
EMPLA Esclerose Múltipla Provável laboratorialmente Apoiada
EMPP Esclerose Múltipla Progressiva Primária
EMPS Esclerose Múltipla Progressiva Secundária
EMPSU Esclerose Múltipla Progressiva Surto
EMRR Esclerose Múltipla Remitente Recorrente
HDL Lipoproteínas de densidade alta
HDS Hamilton Psychiatric Rating Scale for Depression
HLA Antígeno de Histocompatibilidade Leucocitária
IBGE Instituto Brasileiro Geografia e Estatística
IDL Lipoproteínas de densidade intermediária
Ig G Imunoglobulinas G
LCR Líquido Cefalorraquiano
LDL Lipoproteínas de densidade baixa
LTS Long Term Storage
MDB Mental Deterioration Battery
MMSE Mini Mental Station Examination
NSBMS Neuropsychological Screening Battery for MS
PASAT Paced Auditory Serial Addition Test
PCR Reação em Cadeia de Polimerase
PE Potenciais Evocados
PEV Potencial Evocado Visual
PM’47 Raven’s 47 Progressive Colored Matrices test
Raven Raven progressive matrices test
RAVLT Rey Auditory Verbal Learning Test
RM Ressonância Magnética
SDMT Digit Symbol Modalities Test
SNC Sistema Nervoso Central
SPART 10/36 Spatial Recall Test
SRT Seletive Remind Test
TOL Tower of London
VIM Visual Immediate Memory
VLDL Lipoproteínas de densidades muito baixa
VPI Velocidade de Processamento da Informação
WLG Word List Generation Test
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................ 142 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................. 152.1 DEFINIÇÃO E DADOS EPIDEMIOLOGICOS ........................................ 152.2 ETIOLOGIA E PATOGÊNESE ................................................................ 152.3 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS ............................................................. 172.4 CRITÉRIOS DIAGNÓSTICOS ................................................................ 182.5 COGNIÇÃO NA ESCLEROSE MULTIPLA ............................................. 212.6 APOLIPOPROTEÍNA E ........................................................................... 242.7 INFLUÊNCIAS DO POLIMORFISMO APOE NA PROGRESSÃO E
GRAVIDADE DA ESCLEROSE MÚLTIPLA........................................... 252.8 INFLUÊNCIAS DO POLIMORFISMO APOE NA COGNIÇÃO DA
ESCLEROSE MULTIPLA ........................................................................ 25
2.9 INFLUÊNCIAS DO POLIMORFISMO APOE EM OUTRAS DOENÇAS NEUROLÓGICAS ................................................................................... 29
3 OBJETIVOS ............................................................................................ 303.1 OBJETIVO GERAL ............................................................................. 303.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................... 304 METODOLOGIA DA PESQUISA ........................................................... 314.1 APROVAÇÃO PELO COMITÊ DE ÉTICA .............................................. 314.2 DESENHO DO ESTUDO ........................................................................ 314.3 SUJEITOS E MÉTODOS ........................................................................ 314.3.1 Critérios de inclusão ............................................................................. 324.3.2 Critérios de exclusão ............................................................................ 324.4 PROCEDIMENTOS ................................................................................ 334.4.1 Testes neuropsicológicos utilizados na amostra .............................. 344.4.2 Teste genético analisado na amostra ................................................. 364.5 ANÁLISE ESTATÍSCA ............................................................................ 395 RESULTADOS........................................................................................ 405.1 DADOS DEMOGRÁFICOS E CLÍNICOS ............................................... 405.2 GENOTIPAGEM ..................................................................................... 416 DISCUSSÃO............................................................................................ 457 CONCLUSÃO.......................................................................................... 49 REFERÊNCIAS ...................................................................................... 50
APÊNDICE A - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido .......... 59 ANEXO A - Aprovação do CEP-HUGG ................................................ 61 ANEXO B - Protocolo de Solicitação para Envio de Marcadores
Genéticos ............................................................................................... 62
14
1 INTRODUÇÃO
A Esclerose múltipla (EM) é a mais freqüente doença inflamatória
desmielinizante idiopática do sistema nervoso central (SNC). Apesar do grande
número de estudos descrevendo as etapas fisiopatológicas de ativação do sistema
imune que resultam na agressão aos oligodendrócitos, muitas questões ainda
necessitam ser esclarecidas em especial quanto à influência de fatores genéticos e
ambientais em sua gênese, curso clínico e prognóstico. Isto se deve possivelmente
às características heterogêneas da doença (THOMPSON et al., 2000).
Clinicamente apresenta-se como uma doença crônica destacando-se três
principais formas: Esclerose Múltipla Remitente Recorrente (EMRR), Esclerose
Múltipla Progressiva Primária (EMPP) e Esclerose Múltipla Progressiva Secundária
(EMPS) (LUBLIN; REINGOLD, 1996). Compromete o SNC agindo na mielina
normalmente constituída, determinando sinais e sintomas motores, sensitivos,
cerebelares, esfincterianos, visuais e de tronco cerebral, além dos sintomas
cognitivos e afetivos (KURTZKE, 1983).
As investigações cognitivas na EM apontam alta prevalência de alterações
cognitivas, que afetam a qualidade de vida desses pacientes (RAO et al., 1991). O
perfil cognitivo na EM, é comparável ao da demência subcortical, entretanto menos
que 10% evoluem para demência subcortical (RAO, 1996).
A prevalência da EM está atribuída as influências ambientais e genéticas. Os
fatores genéticos atuam na susceptibilidade e modulam o curso da doença
(DENNEY et al., 2004). Neste contexto destaca-se a associação do gene APOE4 as
alterações cognitivas em pacientes com EM que foi sugerida em alguns estudos
especialmente nos casos de grave comprometimento cognitivo (SAVETTIERI et al.,
2004; KOUTSIS et al., 2007; PARMENTER et al., 2007; SHI et al., 2008).
15
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 DEFINIÇÃO E DADOS EPIDEMIOLÓGICOS
A EM é uma doença neurodegenerativa do SNC que acomete adultos jovens
evoluindo comumente para graus variados de incapacidade neurológica crônica cuja
etiologia ainda permanece desconhecida. Foi descrita em 1868 por Charcot do ponto
de vista clinico e patológico como doença, da substância branca do SNC, afetando a
bainha de mielina e preservando o axônio (CHARCOT, 1868).
Apresenta uma distribuição geográfica bem determinada com predomínio
maior em países de latitude norte, podendo acometer os diferentes grupos raciais
com uma preponderância maior em brancos. No Rio de Janeiro, região de clima
tropical e população miscigenada a prevalência de EM foi estimada em 5/100.000
habitantes (PAPAIS-ALVARENGA et al., 2000). Entre oitenta e oito pacientes
atendidos no Hospital da Lagoa no período de 1990 a 1994 foi encontrada uma
freqüência de 30 % de afro-brasileiros (PAPAIS-ALVARENGA; ALVARENGA, 1995),
resultado do projeto Atlântico Sul, primeira pesquisa multicêntrica brasileira sobre o
perfil clinico da EM. Estes dados foram confirmados com exceção da região Sul.
Observou-se maior freqüência da doença no sexo feminino como descrito em séries
internacionais.
2.2 ETIOLOGIA E PATOGÊNESE
A EM tem uma etiologia possivelmente autoimune, e sua susceptibilidade é
determinada por fatores genéticos e influências ambientais (DYMENT et al., 2005).
A interação desses dois fatores determina uma variabilidade na apresentação da
sintomatologia, da gravidade e da progressão da doença (KANTARCI; DE
ANDRADE; WEINSKENKER, 2002).
A evidência que os fatores genéticos atuam como componentes chaves na
patogênese da EM foi fortalecida por estas três observações a seguir:
Aumento do risco de casos dentro da mesma família (COMPSTOM,1999).
Taxa de concordância maior em gêmeos monozigóticos em relação aos
dizigóticos (SPIELMAN; NATHANSON, 1982; EBERS; SADOVNICK, 1994).
16
Identificação de grupos resistentes a EM nas diferentes áreas de alto risco
(KALMAN; LUBLIN, 1999).
É provável que a susceptibilidade à EM esteja sobre a influência de vários
genes (SADOVINICK, 1994).
Pesquisas na área de genética mostraram a associação da susceptibilidade
para a EM com a região do Antígeno de Histocompatibilidade Leucocitária (HLA)
classe II do cromossoma 6q21. 1-21.3 (COMPSTON,1999). A grande maioria dessas
pesquisas foi realizada em caucasianos do norte da Europa evidenciando
associação com HLA classe II haplótipo DR2 e os alelos, DQA1*0102, DQB1*0602,
DRB1*1501, DRB5*0101 (FOGDELL et al., 1995). Apesar de expressarem
geneticamente a mesma região de susceptibilidade, ocorre uma marcada diferença
da expressão clinica entre os pacientes com EM (DYMENT, 2005). No Brasil com
uma amostra afro-descendente, Caballero e outros (1999) encontraram uma
associação com o alelo HLA-DQB1*0602 e em brancos foi encontrada a clássica
associação com o haplótipo DR2 (ALVES-LEON et al., 2007).
A influência genética na expressão clinica da doença, também, já foi descrita
por alguns autores. Estudos com gemelares mostraram que o grau de incapacidade
motora era similar em gêmeos pares (BRASSAT et al., 1999; CHATAWAY et al.,
2001). Entretanto, Hensiek e outros (2007) não reproduziram este achado.
Runmarker e Andersen (1993) associaram a idade de inicio da doença à gravidade
da doença.
Ramagopalan e outros (2008) fizeram uma revisão de vários estudos que
descreveram a associação dos genes implicados com o curso clínico da EM.
Observou que os resultados dos estudos são variáveis e conflitantes. Estudos em
gêmeos sugerem que influências genéticas estão associadas à incapacidade motora
durante o curso da doença.
17
2.3 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS
Os sintomas iniciais ocorrem entre vinte e quarenta anos de idade.
Raramente a doença incide abaixo dos quinze anos e acima dos cinqüenta anos,
mas algumas exceções são relatadas (LYNCH; PARMENTER; DENNEY, 2005).
As manifestações iniciais da EM dependem da localização e da extensão das
lesões, podendo manifestar-se por síndromes medulares, de tronco cerebral, neurite
óptica, motoras, sensitivas, cerebelares, esfincterianas e mentais (KURTZE, 1983).
Identificam-se dois cursos clínicos bem distintos, um de caráter recorrente
(85% dos casos) e outro progressivo (15% dos casos). Apresentam seis formas
clinicas que se distinguem entre si, segundo a classificação de Lublin e Reingold
(1996):
Esclerose Múltipla Remitente Recorrente (EMRR): é a forma mais freqüente.
Caracteriza-se pela presença de surtos. Aparecimento de sintomas com
duração maior que vinte e quatro horas, e recuperação parcial ou completa
posteriormente. No período entre os surtos, não existe progressão da doença.
Esclerose Múltipla Progressiva Primária (EMPP): existe progressão dos
sintomas desde o inicio do quadro, não havendo uma confirmação de surto
clinico.
Esclerose Múltipla Progressiva Secundária (EMPS): inicialmente apresenta
curso de surto remitente recorrente seguido de progressão com ou sem surtos
ocasionais e recuperações mínimas.
Esclerose Múltipla Progressiva-Surto (EMPSU): progressiva desde o início,
com claros surtos agudos, com ou sem recuperação total, períodos entre
surtos caracterizados por contínua progressão.
Esclerose Múltipla Benigna (EMB): permanece inteiramente funcional em
todos os sistemas neurológicos, mesmo depois de quinze anos de doença.
18
Esclerose Múltipla Maligna (EMM): curso breve e progressivo determinando
expressiva incapacidade em múltiplos sistemas neurológicos ou êxito letal em
curto espaço de tempo após o início da doença.
2.4 CRITÉRIOS DIAGNÓSTICOS
O diagnóstico da EM baseia-se em critérios clínicos e exames
complementares como: o exame do Líquido Cefalorraquidiano (LCR), os exames de
neuroimagem com ênfase para a Ressonância Magnética (RM) e os Potenciais
Evocados Visuais (PEV), Auditivos e Somatossensitivos, devendo ser excluídos
outras doenças de natureza inflamatória ou infecciosa.
Diferentes critérios diagnósticos como os de Schumacker e outros (1965);
Poser e outros (1983); Thompson e outros (2000); McDonald e outros (2001) foram
propostos, baseado nas características clínicas da doença e apoiando-se nos
resultados de exames complementares.
Desses critérios o mais utilizado nas últimas duas décadas foi o de Poser e
outros (1983) que define como surto o aparecimento de um ou mais sintomas de
alterações neurológicas com duração superior a vinte e quatro horas, com ou sem
confirmação objetiva. A análise do LCR com a finalidade de se observar a síntese
intratecal de Imunoglobulinas G (Ig G) e bandas oligoclonais (BOC), foi aceita como
apoio laboratorial para critério diagnóstico. Os resultados de exames
complementares como os Potenciais Evocados (PE) e RM foram considerados
evidencias paraclinicas.
Como os critérios definidos por Poser e outros (1983), não se apropriavam às
características evolutivas da EMPP, Thompson e outros (2000) definiram critérios
mais específicos para essa forma da doença. Sintomas com tempo de duração
mínima de doze meses, sem a presença de surtos. Os resultados dos exames
complementares (LCR, RM e PE) foram empregados como evidências de apoio ao
diagnóstico. Imprescindível a evidência de síntese intratecal de IgG, com presença
de BOC ou aumento do índice de IgG na relação sangue/LCR. As evidências da
neuroimagem foram determinadas pela RM do crânio, de medula espinhal ou
ambas. Quando a RM de crânio for a única a ser avaliada faz-se necessário a
presença de no mínimo nove lesões em T2 para que se possa apoiar o diagnóstico
19
(BARKHOF et al., 1997). Na RM de medula são necessárias apenas duas lesões em
níveis diferentes, para serem consideradas como apoio ao diagnóstico. Considera-
se também como diagnóstico a avaliação dos PE. O mais utilizado é o Potencial
Evocado Visual (PEV) que apresentando um alargamento da onda P100, passa a
ser considerado evidência para o diagnóstico da EM (NOSEWORTHY, 2000).
A partir dos critérios clínicos e laboratoriais descritos, foram formuladas três
categorias de EMPP: Definida, Provável e Possível (Quadro 1).
EMPP definida
Progressão clínica por no mínimo um ano Evidência de LCR positivo Evidência de RM positiva ou RM duvidosa e PEV prolongado
EMPP provável
Progressão clínica por no mínimo um ano e Evidência de LCR positivo e Evidência de RM duvidosa ou PEV prolongado ou Progressão clínica por no mínimo um ano e Evidência de RM positiva ou evidência de RM duvidosa e
PEV prolongado (LCR não investigado ou negativo)
EMPP possível
Progressão clínica por no mínimo um ano Evidência de RM duvidosa ou PEV prolongado
Quadro 1: Critérios Diagnósticos para EMPP (THOMPSON et al., 2000) EMPP - Esclerose múltipla progressiva primária; LCR - Líquido. Cefalorraquiano; RM - Ressonância Magnética; PEV - Potencial Evocado Visual.
McDonald e outros (2001) realizaram um painel para revisão dos critérios de
Poser. Novos critérios diagnósticos foram apresentados para a forma EMRR dando
um maior valor ao papel da RM como evidência da disseminação das lesões no
tempo e espaço, incorporando os critérios radiológicos de (BARKHOF et al., 1997) e
(TINTORÉ et al., 2000) (Quadro 2). Os critérios acima descritos para a forma EMPP
foram incluídos (THOMPSON et al., 2000).
20
Quadro 2: Critérios de RM do crânio. (BARKHOF et al., 1997; TINTORÉ et al., 2000)
1. Uma lesão realçada pelo gadolínio ou nove lesões hiperintensas em T2 se não houver lesão realçada pelo contraste 2. No mínimo uma lesão infratentorial 3. No mínimo uma lesão justacortical (envolvimento de fibras em “u” subcorticais) 4. No mínimo três lesões periventriculares
Nota: Uma lesão da medula espinhal pode ser substituída por uma lesão cerebral
De acordo com McDonald e outros (2001), as informações colhidas na história
são consideradas dados de suspeita para EM, e somente a confirmação objetiva dos
sinais neurológicos serão considerados surtos que são separados entre si por um
intervalo mínimo de trinta dias.
Surtos
Requisitos adicionais para o diagnóstico
Dois ou mais surtos; evidência clínica objetiva de 2 lesões ou mais lesões.
Nenhum teste adicional é requerido.
Dois ou mais ataques; evidência clínica objetiva de 1 lesão.
Disseminação no espaço, demonstrada pela RNM. Ou duas ou mais lesões detectadas pela RM compatível com EM mais LCR positivo. Ou aguardar um surto clínico adicional comprometendo um local diferente.
Um surto; evidência clínica objetiva de 2 ou mais lesões
Disseminação no tempo, demonstrada por RM. Ou segundo surto clínico.
Um surto; evidência clínica de 1 lesão (apresentação monossintomática).
Duas lesões ou mais detectadas pela RM compatíveis com EM, mais o LCR positivo e disseminação no tempo demonstrado pela RM. Ou segundo surto clínico.
Quadro 3: Critérios de McDonald e outros (2001)
A análise da RM, do LCR e dos PE podem auxiliar no diagnóstico, sobretudo
quando não existirem evidências clinicas suficientes para o diagnóstico da doença.
Destes exames a RM é considerada a mais sensível e específica na identificação de
21
lesões inflamatórias da substância branca. Positiva em 95% dos pacientes com EM
(PATY; MCFARLAND, 1998).
A presença de BOC ou aumento da produção de IgG podem ser observados
em 95% dos casos de EM (MCDONALD; RON, 1999).
Para demonstrar a disseminação no tempo McDonald e outros (2001)
adotaram como critério, a realização seriada de exame de RM com um intervalo
mínimo de três meses. Caso no primeiro exame de RM de encéfalo exista uma lesão
captante de contraste, que não corresponda à alteração clinica inicial, confirma-se a
evidência de disseminação no tempo. Se não houver lesão captante no primeiro
exame de RM está indicado à realização de outro exame de imagem em um
intervalo de tempo de três meses.
Os critérios de 2001 foram revisados por Polman e outros (2005) como
podem ser observados no quadro abaixo.
Requisito Central para o diagnóstico Progressão Neurológica Insidiosa sugestiva de EM acrescido de 1 ano de progressão da doença determinada retrospectivamente ou prospectivamente.
Requisito Adicional para o diagnóstico 1. RNM de crânio positiva (9 lesões em T2) e LCR positivo. ou 2. RNM de crânio positiva (no mínimo 4 lesões em T2 com PEV positivo) e LCR positivo. ou 3. RNM da medula espinhal positiva (2 lesões focais em T2) e LCR positivo. ou 4. RNM de crânio positiva (9 lesões ou no mínimo 4 em T2 com PEV positivo) e RNM da medula espinhal positiva (2 lesões focais em T2).
Quadro 4: Critério diagnóstico de McDonald e outros (2001) para EM revisado por Polman e outros (2005)
Fonte: Polman e outros (2005).
2.5 COGNIÇÃO NA ESCLEROSE MÚLTIPLA
A presença de alterações cognitivas na EM já havia sido descritas por
Charcot, desde o final do século XIX, mas foi somente no final do século XX, com a
implementação de avaliações neuropsicológicas mais sensíveis, que essas
alterações foram mais observadas e melhor analisadas.
22
Um dos trabalhos de maior relevância no estudo da cognição na EM foi o de
Rao e outros (1991) onde eles observaram uma taxa de freqüência das alterações
cognitivas de 43% no grupo de pacientes. Essas alterações apresentavam um
caráter de declínio cognitivo heterogêneo nas funções de atenção, memória,
velocidade de processamento da informação, função executiva e percepção visuo
espacial. Neste trabalho ele observou os quatro testes que eram mais sensíveis em
identificar as alterações e propôs a formação de uma bateria breve, na tentativa de
diminuir o tempo de aplicação da bateria, tornando mais viável o estudo da cognição
em pacientes com EM principalmente naqueles com fadiga. O estudo de Rao e
outros (1991) evidenciou uma sensibilidade de 71% e uma especificidade de 94%
em apontar as alterações cognitivas no grupo estudado.
Os estudos de Paes (2007) e Negreiros e outros (2008), utilizaram uma
bateria neuropsicológica extensa nas formas EMPP e EMRR respectivamente na
população do Rio de Janeiro. No estudo de Paes (2007), os testes mais sensíveis
foram o Rey Auditory Verbal Learning Test (RAVLT) na evocação após a leitura da
lista de interferência, a fluência verbal na fonêmica da letra “A” e o Teste de Memória
Codificada e auxiliada, o Enchanced Cued Recall Test - Buschke (BECRT).
Negreiros e outros (2008), utilizando bateria semelhante à utilizada por Paes (2007)
encontraram sensibilidade para os mesmos testes. No entanto, houve uma
sensibilidade maior na fonêmica da letra “S”, frutas na fluência semântica, evocação
tardia, reconhecimento e evocação não imediata.
O estudo conduzido por Negreiros e outros (2008) indicaram que uma bateria
breve composta pelo Controled Oral Word Association Test (COWAT) que avalia a
fluência verbal semântica na letra “S” e frutas, o BECRT e o RAVLT apresentavam
uma alta especificidade (73,6%) e sensibilidade (100%) em detectar as alterações
cognitivas em brasileiros com EMRR.
As fibras de substancia branca responsáveis pela conexão do córtex pré-
frontal com as áreas corticais de associação podem ser acometidas na EM
promovendo as alterações na cognição. (RAO, 1996; DE CASTRO et al., 2002).
Estima-se que 40% a 45% dos pacientes com EM apresentem alterações
cognitivas e quando se analisa pacientes de centros de referência para EM estes
valores passam a oscilar em torno de 50 a 65% (RAO et al., 1991, 1995; PAES,
2007; NEGREIROS et al., 2008).
23
Amato e outros (2001) acompanharam a evolução de pacientes com EM e
verificaram que após dez anos de doença a freqüência dos distúrbios cognitivos
aumentava de 24% para 66%.
A prevalência das alterações cognitivas na EM variam dependendo do
instrumento neuropsicológico aplicado, da função cognitiva avaliada e do curso
clinico da doença. Podem desenvolver-se em qualquer momento durante o curso da
doença, na presença ou não de alterações motoras, interferindo na qualidade de
vida destes pacientes (KOUTSIS et al., 2007). Os déficits cognitivos não apresentam
um caráter uniforme, existindo diferenças individuais significativas. Os sintomas
físicos da EM não estão correlacionados com as alterações cognitivas. ( WISHART;
SHARPE, 1997; PAES, 2007). Os domínios cognitivos mais comumente afetados
nos pacientes com EM são: memória, atenção, VPI e funções executivas (RAO,
2004).
O comprometimento na função da memória é a alteração cognitiva mais
comumente observada (THORNTON; RAZ, 1997). Contudo, esta função não é
afetada igualmente pela doença (BRASSINGTON; MARSH, 1998). Segundo Rao
(2004) a memória episódica e a memória de trabalho estão acometidas, enquanto a
memória semântica, a memória implícita e a memória a curto prazo parecem estar
preservadas.
No estudo conduzido por Benedict, Carone e Bakshi (2004) foi observado que
pacientes com EM apresentavam freqüentemente alteração na função da VPI
associada à depressão, e em menor grau a euforia.
Apesar das alterações cognitivas não serem usualmente marcantes, sua
presença pode ser incapacitante em algum grau, determinando um impacto em
muitos aspectos na qualidade de vida dos pacientes, independente do grau de
incapacidade física e da duração da doença (BOBHOLZ; RAO, 2003). Uma pequena
percentagem dos pacientes, cerca de 10%, apresentam alterações cognitivas de
grave intensidade; demência subcortical de curso insidioso (RAO, 1996).
A intensidade das alterações cognitivas varia significativamente,
possivelmente devido a diferenças peculiares destes pacientes, quanto às variáveis
como curso e duração da doença, número de lesões, regiões do SNC envolvidas e o
nível da incapacidade funcional. (DELOIRE et al., 2005; CALABRESE, 2006).
Podem surgir em qualquer estágio e em todas as formas clínicas da doença, sendo
mais freqüente na EMPS quando comparados a EMRR, com tendência a ser menos
24
freqüente na EMPP (AMATO; ZIPOLI; PORTACCIO, 2006; PAES, 2007). O estudo
cognitivo conduzido por Paes (2007) em pacientes com EMPP demonstrou uma taxa
de freqüência de 50% de alterações cognitivas que não foram proporcionais ao grau
de comprometimento motor avaliado pelo EDSS.
2.6 APOLIPOPROTEÍNA E
Os lipídeos são apolares e insolúveis em água, portanto para circularem no
plasma, precisam estar ligados as apolipoproteinas, que juntos são designados de
lipoproteínas. Estas lipoproteínas são qualificadas de acordo com a relação
lipídeo/proteína, em: quilomícrons, lipoproteínas de densidades muito baixa (VLDL),
lipoproteínas de densidade intermediária (IDL), lipoproteínas de densidade baixa
(LDL) e lipoproteínas de densidade alta (HDL). A apolipoproteina E (Apo E) é parte
integrante das lipoproteínas HDL, VLDL e dos quilomícrons. Foi identificada no inicio
da década de 1970 (SHORE; SHORE, 1973). A partir de sua identificação foi
bastante estudada, especialmente devido as suas funções na regulação do
metabolismo dos lipídeos e no transporte do colesterol e fosfolipídios para os
tecidos, através da alta afinidade para o receptor LDL (MAHLEY, 1988).
Exerce também uma importante função no transporte dos lipídeos, para o
interior do SNC. No sistema nervoso periférico coordena a mobilização e
redistribuição de colesterol exercendo um papel essencial na manutenção e no
reparo de neurônios (MAHLEY, 1988).
A principal fonte desta proteína é o fígado, seguido pelo cérebro. Os
astrócitos são os responsáveis pela produção de cerca de 1/3 da detectada pelo
fígado. A síntese também ocorre nos macrófagos e na musculatura lisa, em uma
quantidade bem menor do que nas células hepáticas e astrócitos (MAHLEY, 1988).
A ApoE é uma glicoproteína plasmática polimórfica que contém 299
aminoácidos. É codificada pelo gene APOE situado no braço longo do cromossoma
19 (19q13.2), cuja estrutura revela a presença de quatro exons e três íntrons
(MAHLEY, 1988). As mutações de ponta no exon quatro originam três alelos (ε2, ε3,
ε4) com freqüências polimórficas que codificam três formas distintas de proteínas,
pela alternância de cisteína e arginina nas posições 112 e 158. Determina a
expressão de seis genótipos: três genótipos homozigotos (E2/E2, E3/E3 e E4/E4) e
25
três genótipos heterozigotos. (E2/E3, E2/E4 e E3/E4). A ApoE 2 apresenta cisteína
nas posições 112 e 158, ApoE 3 possui a cisteína na posição 112 e a arginina na
posição 158, ApoE 4 possui arginina nas posições 112 e 158 (WEISGRABER;
RALL; MAHLEY, 1981). O polimorfismo do gene APOE modifica a proteína tanto na
sua estrutura quanto na sua função, bem como em suas implicações patológicas.
A freqüência de cada isoforma da apoE modifica com a raça, etnia e região
geográfica. Em geral o alelo ε3 é o mais freqüente na população geral (78%).
Seguido do alelo ε4 com uma freqüência de 15% enquanto que o alelo ε2 é o menos
prevalente (7%) (BALES et al., 2002).
2.7 INFLUÊNCIAS DO POLIMORFISMO APOE NA PROGRESSÃO E GRAVIDADE DA ESCLEROSE MÚLTIPLA
O número de publicações sobre estudos relacionando o polimorfismo do gene
APOE com as alterações cognitivas na EM é inferior quando comparados aos
estudos do alelo APOE ε4 como fator genético afetando a susceptibilidade,
severidade e progressão dos sintomas físicos da EM.
Estudos como os de Pirttilä e outros (2000) e Savettieri e outros (2003) não
evidenciaram associação do gene APOE ao curso da doença. A gravidade da
doença também não foi associada aos efeitos do alelo APOE ε4 (WEATHERBY et
al., 2000; SEDANO et al., 2006; KOUTSIS et al., 2007; GUERRERO et al., 2008).
Entretanto, Chapman e outros (2001) e Fazekas e outros (2001), observaram que o
alelo APOE4 aumenta a taxa de progressão da EM.
2.8 INFLUÊNCIAS DO POLIMORFISMO APOE NA COGNIÇÃO DA ESCLEROSE MÚLTIPLA
O impacto do polimorfismo do gene APOE na cognição das doenças
neurodegenerativas como a Doença de Alzheimer (DA), já está bem constituído
(CORDER et al., 1993). Entretanto na EM às influências do polimorfismo APOE
ainda não estão totalmente esclarecidos. Apenas cinco estudos (OLIVERI et al.,
1999; SAVETTIERI et al., 2004; KOUTSIS et al., 2007; PARMENTER et al., 2007;
26
SHI et al., 2008) avaliaram os efeito do alelo APOE ε4 na cognição de pacientes
com EM. Nestes estudos, a diferença na metodologia utilizada para a avaliação
neuropsicológica e os distintos critérios de inclusão empregados, bem como o
conceito que a magnitude das influências determinadas pelo polimorfismo APOE
difere de acordo com a população estudada, determinaram possivelmente
resultados diferentes, mas apontaram para uma associação do alelo ε4 com as
alterações das funções cognitivas observadas em quatro trabalhos (SAVETTIERI et
al., 2004; KOUTSIS et al., 2007; PARMENTER et al., 2007; SHI et al., 2008).
Oliveri e outros (1999) utilizaram uma amostra de oitenta e nove pacientes
com EMRR e EMPS e cento e sete controles, e submete-os a uma bateria de testes
neuropsicológicos, incluindo o Mini Mental Station Examination (MMSE), RAVLT,
Visual Immediate Memory (VIM), Corsi Block Tapping Task (CBTT), teste da
Fluência Verbal e o Raven progressive matrices test (Raven). Avaliaram também
índices de depressão com a Hamilton Psychiatric Rating Scale for Depression
(HDS). Analisaram as funções de memória, e o raciocínio abstrato e conceitual,
encontrando uma freqüência de alterações cognitivas em 66% dos pacientes. Os
testes mais sensíveis em detectar as alterações foram o RAVLT (52,5%) e o teste da
Fluência Verbal (52,5%). Toda a amostra foi submetida à coleta de sangue para a
avaliação do polimorfismo do gene APOE e do genótipo AA - 491 A/T da região
reguladora do polimorfismo APOE. Não encontraram significância estatística entre
as alterações cognitivas e o alelo ε4. Entretanto, verificaram que os homozigotos
(AA -491A/T) da região reguladora do polimorfismo APOE eram mais freqüentes no
grupo de pacientes comprometidos quando comparados aos não comprometidos e
que os efeitos na cognição eram independentes do polimorfismo APOE, sobretudo
nas funções de memória.
Parmenter e outros (2007) analisaram duzentos e sessenta e três pacientes
com EM e submeteram a amostra a uma avaliação neuropsicológica com os
seguintes testes: Tower of London (TOL), Califórnia Verbal Learning Test (CVLT-II) e
uma bateria para rastreamento de pacientes com EM, a Neuropsychological
Screening Battery for MS (NSBMS) constituída por três testes: Paced Auditory Serial
Addition Task (PASAT), Spatial Recall Task (SRT), and Controlled Oral Word
Association Task (COWAT). Com um ponto de corte representado por um desvio
padrão abaixo da média no Cognitive Composite Standard Score (CCSS). A
avaliação neuropsicológica revelou uma freqüência de 40% de alterações cognitivas.
27
Entretanto quando foi adotado um ponte de corte mais rigoroso, as freqüências das
alterações cognitivas da amostra diminuíram para 11%. Uma maior freqüência dos
pacientes com o alelo ε4 foi observada no grupo comprometido, somente quando foi
aplicado um ponte de corte mais rigoroso para os testes. Esse ponto de corte
consistia em alteração de pelo menos um desvio padrão abaixo da média em duas
ou mais medidas do CVLT-II, no PASAT e em dois ou mais testes da bateria
NSBMS.
Parmenter e outros (2007) encontraram uma associação entre o alelo ε4 e os
pacientes com grave comprometimento cognitivo. Fazendo uma re-análise dos
dados do estudo de Oliveri e outros (1999) com o mesmo ponto de corte que
utilizaram em seu estudo, encontraram a mesma associação. Entretanto ao utilizar
os pontos de corte do estudo de Oliveri e outros (1999) em sua amostra, não mais
acharam essa associação. Na análise das duas regiões promotoras do polimorfismo
APOE (_219 G/T e _491 A/T) encontraram resultados diferentes aos de Oliveri e
outros (1999) em relação ao genótipo AA -491 e o comprometimento cognitivo,
descrevendo uma falta de associação entre essas variáveis no grupo representado
pelo sexo feminino.
No estudo conduzido por Savettieri e outros (2003) foram incluídos
quinhentos e três pacientes com EM, que após avaliação com a Mental Deterioration
Battery, (MDB) apontaram uma freqüência de 55% para pacientes comprometidos.
Esta bateria foi composta por testes que avaliaram a memória através do Immediate
and Delayed Recall of Rey’s 15 words (Rey’s 15 words IR and DR) e do VIM. O
raciocínio abstrato e conceitual foi avaliado utilizando o Raven’s 47 Progressive
Colored Matrices (PM’47) test. As habilidades visuoespaciais foram analisadas
através do Freehand Copying of Drawings (CD) e do Copying Drawings with
Landmarks tests (CDL).
A análise da distribuição do alelo ε4 na amostra não revelou diferença
estatisticamente significativa entre os grupos, comprometidos e os não
comprometidos. A freqüência aumentada do sexo masculino no grupo com
comprometimento cognitivo levou Savettieri e outros (2004) a analisarem
separadamente cada gênero. A amostra masculina com alteração cognitiva foi
distribuída em dois grupos que se diferenciava pela intensidade das alterações em
leve e grave. Esta análise apontou diferenças entre os grupos nas variáveis: idade
do paciente, tempo de duração da doença, escolaridade, EDSS, presença do alelo
28
ε4. O grupo com grave comprometimento cognitivo apresentou idade mais elevada,
pontuação elevada no EDSS, tempo maior de duração da doença, baixo nível de
escolaridade e maior freqüência do alelo ε4. No grupo feminino o comprometimento
cognitivo surgiu independente de qualquer variável.
Koutsis e outros (2007) analisaram cento e vinte e cinco pacientes com EM
independente da forma clinica e quarenta e três controles. Utilizaram como
instrumento de avaliação neuropsicológica uma bateria breve (BRB-N) composta por
testes que avaliam o aprendizado verbal através do Long-Term Storage (LTS),
Consistent Long-Term Retrieval (CLTR) e SRT. A evocação tardia foi analisada pelo
Total Delayed Score (STRD) do SRT. O Aprendizado visuo espacial foi verificado
pela soma dos três índices imediatos (SPARTT) do 10/36 Spatial Recall Test
(SPART). A evocação tardia visuo espacial investigada pelo Delayed recall Trial
(SPARTD) do SPART. A atenção sustentada, o cálculo mental, e a VPI foram
avaliadas em três segundos e dois segundos no PASAT (PASAT3, PASAT2). A
exploração visual complexa e a VPI foram avaliadas pelo SDMT. A fluência verbal
semântica foi avaliada pela lista de palavras (WLG), usando a categoria frutas e
vegetais. O inventário de depressão de Beck foi aplicado em toda a amostra. A taxa
de freqüência das alterações cognitivas foi de 51%.
Koutsis e outros (2007) agruparam os pacientes classificando-os em alelo ε4+
(pacientes com pelo menos um alelo ε4) e alelo o ε4- (pacientes que não
apresentavam alelo ε4). Procederam com análise dos grupos comparando-os nas
variáveis: sexo, idade, escolaridade, idade de inicio e duração da doença, curso
clinico, EDSS, pontuação do inventário de Beck. Não encontraram diferenças entre
os grupos. Entretanto, ao analisar o aprendizado verbal encontraram uma diferença
significativa com um risco relativo aumentando em 6 vezes a probabilidade de
desenvolver alterações cognitivas no grupo alelo ε4+.
Não foram observadas uma influência significativa do alelo ε4 no risco relativo
em outros domínios cognitivos embora uma tendência para a fluência verbal
semântica pode ser registrada. Shi e outros (2008) analisaram cento e noventa e sete pacientes com EM,
cento e cinqüenta do gênero feminino e quarenta e sete do gênero masculino
agrupando-os, assim como Koutsis e outros (2007), em dois grupos de acordo com
a presença do alelo ε4: alelo ε4+ e alelo ε4-. Aplicaram a bateria breve BRB- N,
composta por 4 testes: SRT, PASAT2, 7/24 Spatial Recall Test, WLG e observaram
29
qual era a freqüência da alteração dos testes comparando os grupos. Analisaram
sete variáveis entre os grupos. O sexo, a etnia, a escolaridade, a idade de inicio da
doença e o EDSS não eram diferentes entre os grupos. Somente a variável idade
entre os grupos era diferente. Havia também, uma diferença no desempenho do
SRT entre os grupos. A disfunção da memória e do aprendizado foi mais freqüente
no grupo ε4+. Com SRT associado ao PASAT e ao 7/24 Spatial Recall Test essa
diferença continuava sendo observada. Entretanto quando associado ao WLG, não
observaram diferenças entre os grupos. Achado similar foi encontrado quando se
aplicava o PASAT, o 7/24 Spatial Recall Test e o WLG isoladamente.
2.9 INFLUÊNCIAS DO POLIMORFISMO APOE EM OUTRAS DOENÇAS NEUROLÓGICAS
O efeito do Alelo APOE ε4 na DA , já está completamente estabelecido
(STRITTMATTER et al., 1993). Sua associação com um pior desempenho em testes
cognitivos em idosos também foi relatado (BONDI et al., 1995). Crawford e outros
(2002) observaram uma associação do alelo APOE ε4 e alteração da função do
aprendizado verbal, naqueles pacientes com história de Traumatismo Craniano,
enquanto a Epilepsia do Lobo Temporal foi associada ao alelo APOE ε4 por
Gambardela e outros (2005).
30
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Estimar a associação entre o genótipo APOE 4 e as alterações cognitivas de
pacientes com Esclerose Múltipla atendidos em um Centro de Referência de
Doenças Desmielinizantes.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Estabelecer as freqüências alélicas do gene APOE na população estudada.
Estimar a freqüência das alterações nos testes neuropsicológicos do grupo
comprometido. Avaliar o tempo de execução dos testes em pacientes e controles.
31
4 METODOLOGIA DA PESQUISA
4.1 APROVAÇÃO PELO COMITÊ DE ÉTICA
Conforme decisão do Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário
Gaffrée e Guinle, em reunião realizada em 11 de outubro de 2007, o projeto foi
analisado e APROVADO, de acordo com a Resolução CNS nº 196/96 (ANEXO A).
4.2 DESENHO DO ESTUDO
Estudo de caso controle.
4.3 SUJEITOS E MÉTODOS
No período de outubro de 2007 a julho de 2008 foram avaliados pela
pesquisadora através do exame neurológico e análise de prontuário cem pacientes
pertencentes ao ambulatório do Centro de Referência de Doença Desmielinizante do
Hospital da Lagoa (Profª. Drª. Regina Maria Papais Alvarenga). O diagnóstico de EM
foi estabelecido pelos critérios de McDonald e outros (2001) e pelos critérios de
Thompson e outros (2000) para as formas progressivas. Desses cem pacientes,
sessenta pacientes preencheram os critérios de inclusão e exclusão e fizeram parte
deste estudo.
Dois estudos brasileiros, realizados no Rio de Janeiro em pacientes com
EMPP (PAES, 2007) e EMRR (NEGREIROS et al., 2008) contribuíram de forma
efetiva na escolha dos instrumentos utilizados na formação de uma bateria breve. A
bateria utilizada neste estudo foi desenvolvida por psicólogas vinculadas ao
programa de pós-graduação da Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro
(UNIRIO), para ser aplicada em curto intervalo de tempo e composta por testes que
já se mostraram sensíveis em identificar as alterações cognitivas comumente
afetadas na EM.
De acordo com os resultados da avaliação neuropsicológica esses sessenta
pacientes foram distribuídos em dois grupos distintos. No grupo A (EM/AC) foram
32
alocados trinta pacientes classificados pelos testes neuropsicológicos como
comprometidos e o grupo B (EM) foi formado por trinta pacientes que apresentaram
resultado normal no desempenho cognitivo. No grupo C (controle) foram alocados
indivíduos saudáveis com resultado normal no desempenho dos testes.
A categorização racial da amostra foi estudada, de acordo com a classificação
racial do IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística) que é aceita como
oficial desde 1991. A coleta de dados foi baseada na auto declaração da cor de pele
dos sujeitos sendo fornecidos cinco itens (branco, preto, pardo, amarelo e indígena)
a cada paciente ou controle. Estes escolhiam o item que mais lhe eram apropriados.
Posteriormente foram alocados dentro de dois grupos raciais: branco e afro-
brasileiros. No grupo racial afro-brasileiro foram alocados os que se declararam
como tendo a cor da pele parda ou preta (Tabela1).
4.3.1 Critérios de inclusão
Para compor o grupo A (EM/AC) e grupo B (EM) foram incluídos pacientes
com idade entre dezoito e cinqüenta e oito anos sem distinção de gênero,
escolaridade ou demais características sócio-demograficas. Com diagnóstico de EM
baseados nos critérios de MC Donald e outros (2001) para a forma EMRR e critérios
de Thompson e outros (2000) para as formas progressivas. Para compor o grupo C
foram incluídos indivíduos que apresentassem características sócio-demográficas
semelhantes aos grupos A (EM/AC) e B (EM).
4.3.2 Critérios de exclusão
Foram excluídos os pacientes que apresentassem história pregressa de
Traumatismo Cranioencefálico (TCE), usuário de drogas licitas e ilícitas, os que
apresentassem déficits visuais importantes, aqueles que concluíram a avaliação
neuropsicológica em um intervalo inferior a trinta dias do aparecimento dos surtos ou
do uso de corticóides, os que apresentassem pontuação igual ou superior a 8 na
Expanded Disability Status Scale (EDSS) e aqueles com histórico de doenças
neurológicas ou psiquiátricas ou que estivessem em tratamento de alguma outra
33
doença orgânica, para que não houvesse interferência desses fatores no
desempenho dos testes neuropsicológicos.
Foram excluídos do grupo C (controles), os sujeitos com histórico de doenças
neurológicas ou psiquiátricas ou que estivessem em vigência de tratamento de
alguma outra doença orgânica.
4.4 PROCEDIMENTOS
Todos os pacientes da amostra foram submetidos às seguintes etapas de
avaliação, após: assinarem um termo de consentimento livre e esclarecido para a
participação na pesquisa (APÊNDICE A).
Anamnese para verificação da pertinência aos critérios de inclusão e
exclusão da pesquisa e coleta dos dados sócio-demográficos.
Consulta ao prontuário para verificação das informações relativa à história
clinica da doença. (data do diagnóstico, tempo de duração da doença, forma
clinica, uso de corticóides, presença de antecedentes psiquiátricos, etc).
Exame neurológico completo, incluindo a aplicação da escala Expandida do
Estado de incapacidade - Expanded Disability Status Scale (EDSS). Baseia-
se na pontuação de elementos mensuráveis relacionados ao desempenho
das funções visual, piramidal, sensorial, cerebelar, controle esfincteriano,
cerebral, tronco encefálico e na capacidade de locomoção. O EDSS é uma
escala funcional com pontuação variando de 0 a 10, onde 0 é classificado
como normal e 10 é a morte devido a EM.
Aplicação dos Inventários de Beck para Ansiedade e Depressão (CUNHA,
2001) - validado para população brasileira. Questionários contendo vinte e um
itens cada um que podem ser aplicados de forma oral ou auto administrados.
O paciente deverá escolher a alternativa que descreve a melhor maneira com
que tem se sentido na última semana incluindo o dia da administração do
questionário, na tentativa de medir o perfil mais constante do avaliado.
Realizado no dia da avaliação neuropsicológica.
Aplicação da bateria breve pela equipe de psicólogos com treinamento
específico para a metodologia. Essas avaliações foram acompanhadas pela
pesquisadora e seus resultados foram decisivos na formação dos grupos: A
34
(EM/AC) e B (EM). Foi desenvolvida por psicólogas vinculadas Ao programa
de pós-graduação da UNIRIO, a partir dos resultados dos estudos de Paes
(2007) e Negreiros e outros (2008).
Esta bateria incluiu a avaliação das seguintes funções: memória verbal a
curto e longo prazo (RAVLT), habilidades lingüísticas (teste da Fluência
Verbal) e concentração e VPI (Digit Symbol Oral) (Quadro 5). Servindo no
presente estudo, como instrumento de rastreamento, separando os pacientes
de acordo com a classificação nos testes, em comprometidos e não
comprometidos. O critério de comprometimento dos testes cognitivos baseou-
se no desempenho do grupo controle. O déficit cognitivo foi classificado em
leve, moderado e grave de acordo com o número de testes alterados.
Alteração em dois testes indicava comprometimento leve. Em três testes
classificado como moderado e em quatro ou mais testes apontava para um
grave comprometimento cognitivo. Ao final da bateria, os pacientes foram
classificados como: normais ou comprometidos.
Realizada coleta de sangue periférico de pacientes e controles, na sala da
neurologia do HUGG ou na residência dos participantes por uma enfermeira
de nível técnico e pela autora respectivamente. Foi determinado o genótipo
APOE nos três grupos, através da coleta de 3 ml de sangue periférico em
tubo de coleta a vácuo com anticoagulante EDTA e enviado, via sedex em
recipiente de isopor a temperatura ambiente no mesmo dia da coleta, ao
laboratório Genomic Engenharia Molecular Ltda., situado em São Paulo. Para
cada amostra de sangue era preenchido pela autora um protocolo de
solicitação para exames de marcadores genéticos (ANEXO B).
4.4.1 Testes Neuropsicológicos utilizados na amostra
Rey Auditory Verbal Learning Test (RAVLT): elaborado por Rey (1964);
Lezak (1995) Spreen e Strauss (1998). Foi selecionado para avaliar a função
de memória, que é uma das funções mais avaliadas no estudo da cognição
em pacientes com EM. Avalia a memória de curto e longo prazo, afere a
capacidade de retenção do material apresentado e a curva de aprendizagem.
Consiste na análise da memória verbal através de um teste de aprendizagem
35
de lista de quinze palavras que não estão relacionadas entre si, apresentadas
aos participantes oralmente, com evocação a cada leitura independente da
ordem apresentada. Após quinze minutos realiza-se a etapa de evocação
tardia e reconhecimento.
Digit Symbol Modalities Test (Versão Oral - SMITH, 1982): mede a atenção, a
VPI e concentração. Baseado no equivalente gráfico da Bateria Wais III. A
forma oral permite eliminar o aspecto motor com um estimulo audiovisual e
uma resposta oral. Consiste em identificar os números de um a nove que
estão associados a desenhos geométricos. A pontuação é determinada pelo
número e itens completados dentro de um tempo limite de cento e vinte
segundos.
Fluência Verbal: Controlled Oral Word Association Test - COWAT (BENTON,
1976): Fluência Verbal: Controlled Oral Word Association Test - COWAT
(SPREEN; STRAUSS, 1998): Fluência semântica: animais e frutas e Fluência
fonêmica: palavras com as letras “F”, “A” e “S” dentro de um tempo
previamente estabelecido de um minuto para cada. Trata-se de um teste de
associação verbal oral controlada que é uma medida de Output verbal e
função executiva.
Quadro 5: Testes neuropsicológicos aplicados e funções cognitivas avaliadas
TESTES NEUROPSICOLÓGICOS FUNÇÕES COGNITIVAS
1. Digit Symbol Modalities Oral
2.Controlled Oral Word Association Test
(COWAT)
Semântica: Animais e Frutas
Fonêmica: F-A-S
3. Rey Auditory Verbal Learning Test
(RAVLT)
4.Inventário Beck de Ansiedade (BAI) e Depressão (BDI)
Atenção/Concentração/VPI
Fluência Verbal
Memória
Transtorno do Humor
36
4.4.2 Teste genético analisado na amostra
O DNA genomico foi extraído de três ml de sangue periférico fresco. Para
extração do DNA genômico utilizou-se o kit comercial Puregene da Gentra Systems.
Os segmentos polimórficos (primers) do gene para apo E foram amplificados pela
técnica de Reação em Cadeia Polimerase (PCR) e de eletroforese em gel de
agarose segundo método de Donohoe e outros (1999), que utiliza duas reações de
PCR.
A primeira etapa consistiu na extração do DNA genomico. As amostras
isoladas do DNA foram medidas pela espectrofotometria ultravioleta em 260
nanômetro e diluídas com água destilada a uma concentração final de 30 µL
(microlitros). No quadro 8 observamos os componentes utilizados na PCR.
- MEL_APOE-R (concentração 200 μM)
- MEL_APOE_C158-F (concentração 200 μM)
- MEL_APOE_C112-F (concentração 200 μM)
- MEL_APOE_R158-F (concentração 200 μM)
- MEL_APOE_R112-F (concentração 200 μM)
- DMSO 50%
- 10 x Taq Buffer Invitrogen
- 10 x dNTPs (2mM)
- MgCl2 (50 mM)
- Enzima Taq Invitrogen (5U/μl)
Nota: pares de primers diluídos para a concentração de 5 μM em água
Quadro 6: Primers (DONOHOE et al., 1999) e outros componentes utilizados na PCR μM = micrômetro.
Na segunda etapa, pelo método de Donohoe e outros (1999) existem duas
reações de PCR para cada amostra. Cada reação tem como volume final 30 μl
(Quadro 7).
37
Quadro 7: Reação de PCR duas reações [A e B] para cada amostra
Mistura Master 1 x
Primer R 2,0 μl
DMSO 50% 3,0 μl
10 x Taq Buffer 3,0 μl
10 x dNTPs 3,0 μl
MgCl2 1,5 μl
Enzima Taq 0,5 μl
Água 7,5 μl
Volume 20,5 μl
Mistura Master A 1 x
Primer C158-F 2,0 μl
Primer C112-F 1,5 μl
DNA (*) x μl
Água (*) y μl
Volume 9,5 μl
Volume final 30 μ
Mistura Master B 1 x
Primer R158-F 2,0 μl
Primer R112-F 1,5 μl
DNA (*) x μl
Água (*) y μl
Volume 9,5 μl
Volume final 30 μl
*a massa de DNA necessária é 60 ng e a soma dos volumes de DNA e água fica em 6 μl.
Após as reações A e B ocorre à terceira etapa pelo processo de desnaturação
(Quadro 8). Segue-se a quarta etapa que consiste na detecção dos polimorfismos
em gel agarose (Quadro 9). Na figura 1 observa-se um esquema mostrando o DNA
amplificado.
38
5º C 3 minutos
96º C 45 segundos
66º C 45 segundos 35 x
72º C 45 segundos
72º C 5 minutos
10º C Indeterminado
Quadro 8: Processo de desnaturação
- Gel de agarose 2%, Tampão 1 x TBE com brometo de etídio
- Misturar e aplicar 2 μl de tampão sacarose e 12 μl de amostra
- Aplicar 2 μl de padrão de peso molecular 50 pb diluído (**)
- Eletroforese na cuba horizontal
- 1 hora a 100 V
- Fotografar o gel no transiluminador Ultra Violeta Quadro 9: Detecção dos polimorfismos em gel agarose ** Diluição do padrão de peso molecular: - 2 μl de sacarose, 1 μg de padrão, completar o volume para 12 μl com TE.
Figura 1: Esquema do DNA amplificado
Fonte: Laboratório Genomic.
39
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As análises estatísticas foram realizadas com o aplicativo Statistical Package
for Social Sciences - SPSS versão 14.0 para Windows (Chicago, IL, USA). Foi
estabelecido como nível de significância para todos os testes um p-valor menor que
0,05.
As variáveis categóricas foram apresentadas como freqüências absolutas e
porcentagens e suas associações analisadas pelo teste qui-quadrado de Pearson ou
teste exato de Fischer quando apropriado. As variáveis contínuas foram
representadas por suas médias e desvios-padrão e as significâncias estatísticas das
suas diferenças foram aferidas pelo teste t de Student ou, quando analisadas para
os três grupos, por análise de variância (ANOVA). As Razões de Chances (OR) e os
respectivos Intervalos de Confiança de 95% (IC 95%) foram estimados por análises
univariadas de associação.
40
5 RESULTADOS
Sessenta pacientes com EM e trinta indivíduos saudáveis pareados pela
média da idade, sexo e anos de escolaridade concordaram em participar deste
estudo e concluíram as etapas de avaliação neuropsicológica e coleta de sangue
para o teste genético.
5.1 DADOS DEMOGRÁFICOS E CLÍNICOS
Os dados sócios demográficos estão dispostos na tabela 1. A amostra deste
estudo não apresentou diferenças entre os grupos, em sua composição nas
variáveis: sexo, idade, raça e escolaridade.
Tabela 1: Características demográficas da amostra (n=90)
Total Grupo A (EM/AC)
Grupo B (EM)
Grupo C (Controle) p valor
Sexo masculino, n (%) 29 (33,2) 10 (33,3) 8 (26,7) 11 (36,7) 0, 700a
Idade em anos, média (± DP) 36,4 (9,8) 39,2 (9,5)35,8
(10,1) 34,1 (9,3) 0, 114 b
Escolaridade em anos, média (± DP) 13 (3,2) 11,9 (3,1) 13,5 (3,5) 13,6 (2,6) 0, 065 b
Raça, n (%)
Branca 67 (74,4) 22 (73,3) 24 (80) 21 (70) 0, 664a
Afro-brasileira 23 (25,6) 8 (26,7) 6 (20) 9 (30)
Idade de início, média (± DP) 29,6 (9,7) 31,3 (9,9) 27,9 (9,2) - 0, 172c
Duração em anos, média (± DP) 7,8 (5,0) 8,0 (4,6) 7,6 (5,3) -
Curso clínico, n (%)
EMRR 45 (75) 20 (66,7) 25 (83,3) - 0, 329 a
EMPP 12 (20) 8 (26,7) 4 (13,3) -
EMPS 3 (5) 2 (6,7) 1 (3,3) -
Escore EDSS, média (± DP) 2,5 (2,3) 3,5 (2,2) 1,4 (1,8) - <0, 001c a Qui-quadrado de Pearson, b Anova, c Teste t de Student.
41
Os resultados indicam uma freqüência maior da EM no sexo feminino com
predomínio da raça branca.
Em relação ao numero de anos de escolaridade, não houve diferença
significativa entre os grupos, prevaleceram aqueles com escolaridade de nível médio
(11,9 a 13,6 anos).
A idade mínima e máxima da amostra foi de dezoito e cinqüenta e oito anos
respectivamente. Os testes estatísticos aplicados demonstraram não haver diferença
na idade entre os grupos (p = 0, 114).
Do total da amostra de sessenta pacientes a média da idade do inicio da
doença foi de 29,5 (DP ± 9,6) e a média da pontuação do EDSS foi de 2,5 (DP ± 2,3)
após média de duração da doença de 7,8 anos (DP ± 5,0). Não houve diferença
estatística entre os grupos A e B nas variáveis: idade de inicio da doença e tempo de
duração da doença. Entretanto a análise com o teste T de Student mostrou diferença
estatisticamente significativa para a variável EDSS entre os grupos A e B (p<0, 001),
com uma média maior de pontuação no EDSS para o grupo de pacientes com
alterações cognitivas (grupo A).
Quanto à forma clinica da doença observa-se freqüência maior para a forma
EMRR (75%), seguida das formas EMPP (20%) e EMPS (5%). Não foi observada
diferença estatística entre os grupos de pacientes com e sem alterações cognitivas.
5.2 GENOTIPAGEM
A distribuição do genótipo APOE e da freqüência dos alelos pode ser
observada em cada grupo e no total dos grupos na tabela 2. Não foi observada
diferença estatística entre os grupos.
42
Tabela 2: Distribuição e freqüência do alelo e genótipo APOE
Total A (EM/AC)
B (EM)
C (Controle) p valor
Alelos - nº (%)
ε2 9(5) 3(5) 3(5) 3(5) 0, 4252
ε3 149(82,8) 46(76,7) 53(88,3) 50(83,3)
ε4 22(12,2) 11(18,3) 4(6,7) 7(11,7)
Genótipo - nº (%)
ε2/ ε2 0, 264
ε2/ ε3 7(7,8) 1(3,3) 3(10) 3(10)
ε2/ ε4 2(2,2) 2(6,7) 0(0) 0(0)
ε3/ ε3 61(67,8) 18(60) 23(76,7) 20(66,7)
ε3/ ε4 20(22,2) 9(30) 4(13,3) 7(23,3)
ε4/ ε4 - - - -
EM - Esclerose Múltipla, AC - Alteração Cognitiva.
Quando as variáveis: idade de inicio da doença e pontuação do EDSS foram
comparadas com os grupos ε4+ (portadores do alelo ε4) e ε4- (não portadores do
alelo ε4) não se observou diferença entre os grupos (Tabela 3).
Tabela 3: Variáveis clinicas da EM e alteração cognitiva entre pacientes de acordo com o estado APOE4
ε4 + ε4 - p valor
Idade no início da doença - média (± DP) 29,27 (9,9) 29,69(± 9,7) 0,885*
EDSS - média (± DP) 3,0 (2,1) 2,3 (± 2,3) 0,263*
Comprometimento cognitivo - nº (%)
Normal 3 (20) 27 (60) 0,007**
Comprometidos 12(80) 18 (40)
* Teste t de Student, ** Teste qui-quadrado de Pearson.
Na tabela 4 foram comparados os três testes cognitivos (RAVLT, Digit Symbol
e COWAT) entre os pacientes ε4+ e ε4-, não houve diferença estatística, todos p’ >
43
0,3. Entretanto, quando o resultado final da bateria foi comparado entre pacientes
ε4+ e ε4-, foi observada uma diferença estatística entre os grupos A (EM/AC) e B
(EM) com p< 0, 007 (Tabela 3).
Tabela 4: Freqüência dos testes alterados de acordo com a presença do alelo ε4
Testes - nº (%) Grupo todo ε4 + ε4 - p valor
RAVLT 29 (96,7) 10 (90,9) 19 (100) 0, 367
SDMT 28 (93,3) 11 (100) 17 (89,5) 0, 520
COWAT 16 (53,3) 5 (45,5) 11 (57,9) 0, 707
O RAVLT foi o teste cognitivo que se mostrou mais alterado com uma
freqüência de 96,7%, seguido pelo Digit Symbol cuja freqüência foi calculada em
93,3%. O COWAT apresentou uma freqüência de alteração de 53,3%.
Na tabela 5 foi analisada a comparação dos grupos, entre os resultados dos
testes e a presença dos alelos APOE ε4. Se compararmos o grupo A com B,
observamos uma diferença estatisticamente significativa (p-valor 0.037 OR3, 37
(0.90-16.80). Se compararmos o grupo A com C ou B com C não observamos
diferença significativa entre esses grupos (p’> 0. 2).
Tabela 5: Comparação dos grupos entre o resultado dos testes e a presença dos alelos ε4 Grupos em relação à ε 4+ OR (IC 95%) p valor
Grupo A (EM/AC) x Grupo B (EM) 3,763 (1,04 – 13,65) 0,037
Grupo A x Grupo C 1,902 (0,61 – 5,86) 0,260
Grupo B x Grupo C 0,505 (0,13 – 1,95) 0,317
Grupo A+B x Grupo C 1,095 (0,39 – 3,06) 0,862
Grupo A - Esclerose Múltipla + pacientes com alterações cognitivas, Grupo B - Pacientes com Esclerose Múltipla sem alterações cognitivas, Grupo C - Controles.
Foi verificada uma correlação entre o tempo de duração da doença e o EDSS
para toda a amostra de pacientes (p=0,023). Ao estratificar por grupos, observa-se
44
que esta associação não é significativa no grupo A (p=0,301), mas é significativa
para o grupo B (p=0.049).
O transtorno do humor não interferiu nos resultados dos testes RAVLT
(p=0.757), DSTM (p=0.528) e COWAT (p=174).
A aplicação dos testes foi realizada em um tempo médio de 36,2 minutos para
os pacientes comprometidos, apresentando uma diferença estatística em relação ao
pacientes com cognição normal e grupo controle (p’<0, 004).
45
6 DISCUSSÃO
As baterias breves têm sido utilizadas como ferramenta de rastreamento em
vários estudos de cognição na EM com o objetivo de identificar, quantificar as
alterações cognitivas nas diferentes formas da EM e de buscar a redução do tempo
de sua aplicação. A existência de uma ampla variabilidade na composição das
baterias breves quanto ao tipo e número de testes utilizados para avaliar uma
mesma função cognitiva, tornou-se uma variável de limitação para comparação entre
os diversos estudos.
No presente estudo os testes neuropsicológicos foram sensíveis em identificar
alterações cognitivas independente do estado APOE. A bateria breve funcionou
como um instrumento de rastreamento útil na identificação das alterações cognitivas
nas várias formas da doença em um tempo reduzido.
A freqüência das alterações cognitivas varia de 45 a 65% (RAO et al., 1991;
BOBHOLZ; RAO, 2003),dado confirmado no presente estudo. Foi observada uma
taxa de freqüência de 50% de alteração cognitiva através da bateria breve nos
pacientes com EM, enquanto os controles foram considerados normais. Esses
dados foram concordantes com os de pesquisas anteriores que utilizaram baterias
neuropsicológicas extensas em pacientes com EM. (RAO et al., 1991; RAO, 1995;
PAES, 2007; NEGREIROS et al., 2008).
As freqüências genéticas relacionadas ao polimorfismo do gene APOE, são
variáveis em algumas populações, com destaque a freqüência do alelo ε4. Lucotte,
Loirat e Hazout (1997); Siest e outros (1995) observaram um gradiente norte sul na
freqüência do alelo ε4 ao comparar diferentes populações da Europa. A freqüência
do alelo e ε4 é maior ao norte do continente europeu.
Com relação às freqüências e distribuição dos alelos e do genótipo APOE
neste estudo não foi encontrado diferenças entre os pacientes e a população
normal, dado concordante com os resultados encontrados por Pinholt e outros
(2005) e Shi e outros (2008). A idade de inicio da doença, não foi afetada pela
presença do alelo ε4 em conformidade com outros estudos (PINHOLT et al., 2005;
SHI et al., 2008). Para Shi e outros (2008) este dado indica que APOE4 é mais um
fator de susceptibilidade para o desenvolvimento das alterações cognitivas do que
para os sintomas iniciais motores e sensitivos da EM.
46
Neste trabalho, foi encontrada uma associação do genótipo APOE4 ao grupo
de pacientes com alterações cognitivas. A probabilidade de desenvolver alterações
cognitivas aumentou em três vezes quando comparados aqueles sem o alelo ε4.
Outros quatros trabalhos também encontraram esta mesma associação
(SAVETTIERI et al., 2004; KOUTSIS et al., 2007; PARMANTER et al., 2007; SHI et
al., 2008). Não houve diferença estatística, quando o grupo de pacientes
comprometidos foi comparado ao grupo de controles saudáveis.
Koutsis e outros (2007) avaliando funções especificas da cognição
encontraram uma associação APOE4 na função do aprendizado verbal (OR 6.74, IC
95% 2.03 - 22.36, p =0.002) como um fator de predição associado ao alelo apoe4,
em virtude de não ter encontrado a mesma associação com outras funções
cognitivas. O autor comparou seus resultados com os estudos em populações
italianas de Oliveri e outros (1999) e Savettieri e outros (2004) que não apontaram
para esse dado, atribuindo essa diferença a metodologia distinta utilizada para
avaliação do aprendizado verbal. Klages, Fisk e Rockwood (2003) concluíram que o
SRT seria uma ferramenta mais sensível para avaliação dos efeitos do alelo e4 na
memória comparados ao RAVLT que foi utilizado nos estudos italianos. A diferença
nos critérios de inclusão e o efeito variável de alelo ε4 do gene APOE em diferentes
populações também foram discutidas por Koutsis e outros (2007) como explicação
para seus achados.
No presente estudo o RAVLT fez parte dos instrumentos da bateria
neuropsicológica para avaliação da memória e foi sensível em detectar as alterações
cognitivas independente do estado APOE (tabela 4). Com a ausência de
homozigotos na amostra, não foi possível apontar as influências de dois alelos ε4 na
cognição de pacientes com EM na amostra deste estudo. Entretanto, Koutsis e
outros (2007) com apenas homozigotos na amostra refere que seus resultados
refletem um efeito real do alelo e4 na cognição de pacientes com EM apoiado nos
resultados de um estudo de meta analise concretizado por Small e outros (2004),
que abordaram o efeito do alelo APOE ε4 na cognição de indivíduos normais.
Concluíram que havia uma associação entre alterações da memória episódica
apenas em homozigotos para o alelo ε4.
Savettieri e outros (2004) observaram que as alterações cognitivas eram mais
freqüentes na amostra representada por homens e estavam associadas às variáveis
clínicas como duração, curso da doença, EDSS e com a variável genética APOE4.
47
Nas mulheres a associação com as variáveis clinica e genética não ocorriam.
Diferentes achados foram encontrados no presente estudo. A amostra de pacientes
comprometidos foi maior em uma proporção 2:1 para o sexo feminino. Não houve
associação com duração e curso da doença, no entanto foi concordante em relação
ao EDSS e a variável genética estudada. Dos cinco estudos publicados relacionando
a relação dos efeitos da APOE4 sobre a cognição na EM, somente Savettieri e
outros (2004) encontraram uma maior prevalência no sexo masculino. Parmenter e
outros (2007) reproduziram o achado de Savettieri e outros (2004), quanto à maior
gravidade da doença no grupo onde prevaleceu a presença do alelo ε4.
Relacionaram a gravidade da alteração cognitiva à elevada pontuação do EDSS.
Achado relatado previamente por Rao e outros (1991).
No estudo de Oliveri e outros (1999) não foi encontrado associação do
comprometimento cognitivo ao genótipo APOE4. Encontraram uma associação das
alterações cognitivas, com a região reguladora do polimorfismo APOE (-491 A/T).
Sua metodologia diferiu em relação aos outros estudos principalmente no nível de
corte que adotou para cada teste neuropsicológico. Talvez esta seja a razão dos
resultados não concordantes com o presente estudo e com os outros quatro estudos
(SAVETTIERI et al., 2004; KOUTSIS et al., 2007; PARMANTER et al., 2007; SHI et
al., 2008).
Ressalto que o trabalho de Oliveri e outros (1999) foi o pioneiro relacionando
o gene APOE com o estudo da cognição na EM, em pacientes italianos. Parmenter e
outros (2007) conseguiram reproduzir a associação do gene APOE4 com distúrbio
cognitivo fazendo uma re-analise do trabalho de Oliveri com os mesmos pontos de
corte que utilizou em sua amostra para avaliação neuropsicológica. Contudo
utilizando os pontos de corte rigorosos de Oliveri e outros em sua amostra
encontraram resultados não favoráveis a associação previamente apontada.
Os poucos trabalhos publicados, a existência de distintos critérios de inclusão
e a ampla variabilidade de testes e pontos de corte utilizados na composição das
baterias, determinaram uma limitação para a comparação deste estudo com os
previamente publicados. Mas que não foram suficientes para comprometer o
resultado final de reproduzir na população brasileira, mesmo com uma amostra
menor, os achados anteriormente descritos pelos outros autores.
Trata-se de um trabalho inédito no Brasil, que estudou a influência de um fator
genético na cognição de pacientes com EM, na cidade do Rio de Janeiro, cujos
48
resultados contribuem para estimular novas pesquisas nessa área. Abrindo
perspectivas para abordagens terapêuticas precoces e diferenciadas na área da
cognição nas diferentes formas da doença.
Pesquisas futuras correlacionando o gene APOE ε4 a outras variáveis
clinicas da doença e as alterações de RM em pacientes brasileiros é sugerido.
49
7 CONCLUSÃO
A freqüência e a distribuição dos alelos e do genótipo APOE são variáveis entre
as populações. A freqüência e a distribuição dos alelos e do genótipo APOE foram similares
entre pacientes e controles neste estudo. A bateria breve adotada neste estudo como instrumento de rastreamento
cognitivo foi eficaz em identificar pacientes com alterações cognitivas em um curto
intervalo de tempo independente da presença do alelo APOE4. As freqüências de alterações nos testes neuropsicológicos revelaram para a
amostra de pacientes com alterações cognitivas, percentuais de 96,7% para o
RAVLT, 93,3% para SDMT e 53,3% para o COWAT independente do estado APOE.
A freqüência de alterações cognitivas neste estudo foi de 50% para amostra de
pacientes.
Neste trabalho, foi encontrada uma associação do alelo APOE4 ao grupo de
pacientes com alterações cognitivas quando comparados aqueles pacientes com
cognição normal. A probabilidade de desenvolver declínio cognitivo foi três vezes
maior para aquelas com a presença do alelo APOE4 quando comparados ao grupo
sem o alelo o alelo APOE4.
Estudos que relacionam os efeitos do genótipo APOE com a cognição em
paciente com EM são insuficientes e apresentam critérios de inclusão e metodologia
distintas, dificultando a comparação com a amostra brasileira. Entretanto não foram
suficientes, para comprometer o resultado final de reproduzir, mesmo com uma
amostra menor, os achados descritos previamente pelos outros autores. O presente trabalho é um precursor no Brasil e o sexto na literatura mundial.
50
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APÊNDICE A - Consentimento Livre e Esclarecido
UNIRIO - Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro
ESCOLA DE MEDICINA E CIRURGIA
NEUROLOGIA
CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Participação em dissertação de Mestrado
Eu, abaixo assinado, concordo em participar do estudo sobre Prejuízo
cognitivo em pacientes com Esclerose Múltipla e sua associação com o gene APOE4:
Estudo caso-controle em pacientes do Centro de Referência do Hospital da Lagoa, no
Rio de Janeiro.
Os procedimentos planejados foram a mim explicados pela médica pesquisadora,
Drª. Sonia Batista Saraiva e são os seguintes:
� Serei submetido (a) a exame Clínico e Neurológico.
� Serei avaliado (a) por bateria de testes neuropsicológicos com a equipe de
psicólogas.
� Será realizada coleta de amostra do meu sangue para análises laboratoriais em
data previamente marcada pela médica pesquisadora.
� Não terei gastos com os exames.
� Estou ciente que a pesquisa científica não tem fins lucrativos e, portanto não
serei remunerado (a).
� Ao participar desta pesquisa não terei nenhum benefício direto, estou ciente que
este estudo trará informações importantes, de forma que o conhecimento que será
construído a partir desta pesquisa possa colaborar para o desenvolvimento e avanços
60
terapêuticos apropriados e individualizados em pacientes com esclerose múltipla,
onde a pesquisadora compromete-se a divulgar os resultados obtidos.
� Autorizo a veiculação dos dados coletados no meu estudo em todos os tipos de
trabalhos científicos, sejam em aulas, encontros, simpósios, jornadas, congressos,
publicações, revistas e livros.
� Foi-me garantido que posso retirar meu consentimento a qualquer momento, sem
que isso leve a qualquer penalidade ou interrupção do meu
acompanhamento/assistência/tratamento.
A médica pesquisadora explicou-me que o Estudo será realizado em um grupo
de pacientes e controles. Decidimos conjuntamente que a minha inclusão no Estudo
tem caráter voluntário, não obrigatório, não remunerado, e estarei participando como
paciente ou como controle.
Certifico que este formulário foi me explicado e que o li ou que o mesmo foi lido
para mim e que entendi o seu conteúdo.
Data: ____/____/______Hora: __________
Nº. de registro: ______________________
Paciente ou responsável: ______________________________________________________
Nome: ____________________________________________________ RG: _____________
Testemunha:________________________________________________________________
Nome: ____________________________________________________ RG: _____________
61
ANEXO A - Aprovação do CEP-HUGG
62
ANEXO B - Protocolo de Solicitação para Exames Marcadores Genéticos Código de acesso junto a Genomic: Nome do Laboratório Requisitante: Médico Responsável: Nome completo do paciente: Data de nascimento: __/__/__ Nome do Exame solicitado: Médico solicitante: Data da coleta: Data de envio das amostras: Realizou transplante de medula? ( ) Sim ( ) Não Realizou transfusão de sangue nos últimos três meses? ( ) Sim ( ) Não Envio de Laudo: ( ) correio ( ) fax __________________ ( ) e-mail nosso cadastro ( ) outro e-mail ____________________________________________ Declaro ter ciência das recomendações de coleta, processamento e envio das amostras, conforme link de manual de coleta disponível na Área Restrita do site da Genomic. ________________________________ Nome do responsável
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