UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE … · AÇÃO SACIETOGÊNICA DE UM INIBIDOR DE TRIPSINA DA SEMENTE DE ... Mário e Mari, por terem me apoiado nessa ... Dentre estas aplicações

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Joycellane Ribeiro Programa de Pós-Graduação em Bioquímica - UFRN

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

JOYCELLANE ALLINE DO NASCIMENTO CAMPOS RIBEIRO

AÇÃO SACIETOGÊNICA DE UM INIBIDOR DE TRIPSINA DA SEMENTE DE

TAMARINDO (Tamarindus indica L.)

NATAL/RN

2013

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JOYCELLANE ALLINE DO NASCIMENTO CAMPOS RIBEIRO

AÇÃO SACIETOGÊNICA DE UM INIBIDOR DE TRIPSINA DA SEMENTE DE

TAMARINDO (Tamarindus indica)

NATAL/RN

2013

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA AO

PROGRAMA DE PÓS-GRAUAÇÃO DO DEPARTAMENTO

DE BIOQUÍMICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO

GRANDE DO NORTE, COMO REQUISITO PARCIAL PARA

OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM BIOQUÍMICA.

ORIENTADOR: ELIZEU ANTUNES DOS SANTOS

CO-ORIENTADORA: ANA HELONEIDA ARAÚJO MORAIS

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Dedicatória

Ao meu pai, Pedro Alberto, por todo apoio e amor, com a certeza de que o

conhecimento é uma dádiva e não há bem maior.

À minha mãe, Alcinéa, por uma vida de amor incondicional, apoio e

incentivo. Pela força e presença constante na busca dos meus sonhos.

Ao meu marido, Ruston, por ser maravilhoso em toda essa jornada, por toda

compreensão e pelo amor diário, és uma pedra preciosa.

Aos meus irmãos, Fernando, Guilherme, Pedro Henrique, Ana Cristina,

por existirem, vocês são os meus tesouros.

As mais lindas avós, Helena e Marinalva, por me fazerem sentir um amor tão

imenso, por todo carinho e apoio.

Aos meus familiares, pelo incentivo e por compreender minha ausência.

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AGRADECIMENTOS

A Deus, pelo amor infinito, por todas as bênçãos concedidas, e por

ter colocado em meu caminho pessoas especiais que por mim fizeram

o “possível e impossível” quando tudo parecia difícil.

Ao professor Dr. Maurício Pereira Sales, por ter me dado a

oportunidade de fazer parte do grupo de pesquisa do LQFPB.

Ao professor Dr. Elizeu Antunes dos Santos, pelo incentivo e por sua

contribuição para realização deste trabalho.

À professora Dra. Ana Heloneida Morais: a principal necessidade

de nossas vidas é alguém que nos obrigue a fazer o que podemos

fazer, ensinando o caminho a ser traçado na busca do conhecimento.

À professora Dra. Adriana Uchôa, por toda contribuição e

preocupação para que tudo fosse concretizado.

Aos meus queridos tios, Mário e Mari, por terem me apoiado nessa

nova etapa, por todo apoio e vibração a cada conquista minha. Sem

vocês isso não seria possível. Vocês são uns amores.

À “pirralha” (Natália), Marília e Allynson, vocês foram essenciais,

obrigada por todos os momentos de alegria.

Aos demais professores, Selma, Hugo, Giuliana, Edda, Mateus, Suely,

Kátia, que foram de grande importância para minha formação.

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À toda equipe do LQFPB, que de alguma forma contribuiu para a

realização deste trabalho, seja na divisão do conhecimento ou nos

momentos de descontração.

À “turma da nutrição”, obrigada, Fabíola, Gabi, Amanda, Fabi,

Agnes, Marcela e aos demais, em especial Alexandre, por ter

dividido várias horas, inclusive finais de semana, para realização

do nosso trabalho.

À equipe da UNP, que nos ajudou em diversos momentos.

À banca de qualificação e defesa, professoras Adriana e Severina, e

professoras Jacira e Ilka, pelas valiosas contribuições e incentivos.

À queridíssima, Patrícia, amiga fiel e confidente durante toda essa

jornada, que sempre dispôs o seu tempo para me ensinar e me

ajudar a dar os “primeiros passos”, você foi simplesmente

fundamental.

À preciosa Robertinha, que sempre esteve a disposição pra me

ajudar, e durante toda a jornada, mesmo distante em parte dela,

não deixou de me incentivar.

À Socorro, por todo apoio em momentos cruciais, e por ser uma

excelente e descontraída amiga.

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As mais recentes incentivadoras, no entanto, não menos importante,

Dayse, Fernanda, Alessandra, Raquel, Hylarina, JJ, vocês fizeram

esse tempo bem mais “leve”.

E não poderia faltar, a minha turma de mestrado, turma ímpar,

obrigada pelos dias de descontração e por dividirem todas as

angústias e alegrias, Fernanda, Raquel, Luciana, Alexandre, Sara,

Jethe, Monique, “Joana” e Adilson. E em especial aos que

compuseram o trio: Daniel e Dupla (Paulo), vocês são ótimos,

obrigada pelas tardes de estudo e diversão.

Aos meus pais, pelo incentivo, pela compreensão da minha ausência,

e por todo amor demonstrado a cada dia, mesmo distantes.

Ao meu marido, por todo apoio e amor, pelos momentos de espera

durante os experimentos, mesmo nos finais de semana, e por me

ajudar nos experimentos quando foi necessário.

A todos aqueles que fazem parte do Departamento de Bioquímica,

que de alguma forma contribuíram para a realização deste

trabalho.

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O Caminho das Sementes

A semente não pode saber o que lhe vai acontecer, a semente jamais conheceu a flor. E a semente não pode nem mesmo acreditar que traga em si a potencialidade para

transformar-se em uma bela flor .

Longa é a jornada, e sempre será mais seguro não entrar nessa jornada, porque o percurso é desconhecido, e nada é garantido. Nada pode ser garantido.

Mil e uma são as incertezas da jornada, muitos são os imprevistos e a semente sente-se em segurança, escondida no interior de um caroço resistente. Ainda assim ela arrisca,

esforça-se; desfaz-se da carapaça dura que é a sua segurança, e começa a mover-se.

A luta começa no mesmo momento: a batalha com o solo, com as pedras, com a rocha. A

semente era muito resistente, mas a plantinha será muito, muito delicada, e os perigos serão muitos.

Não havia perigo para a semente, a semente poderia ter sobrevivido por milênios, mas

para a plantinha os perigos são muitos. O brotinho lança-se, porém, ao desconhecido, em direção ao sol, em direção à fonte de luz, sem saber para onde,

sem saber por quê.

Enorme é a cruz a ser carregada, mas a semente está tomada por um sonho, e segue em frente.

Semelhante é o caminho para o homem. É árduo. Muita coragem será necessária.

Existem pequenas flores silvestres que enfrentam o desafio das rochas, das pedras em

seu caminho, para aflorarem à luz do dia.

Envoltas em uma brilhante aura de luz dourada, elas exibem a majestade do seu pequenino ser. Sem nenhum constrangimento, equiparam-se ao

sol mais brilhante.

Quando nos defrontamos com uma situação muito difícil, há sempre uma escolha: podemos ficar repletos de ressentimentos e tentar encontrar alguém ou alguma

coisa em que pôr a culpa pelas nossas dificuldades, ou podemos enfrentar o desafio e crescer.

As flores nos mostram o caminho, na medida em que a sua paixão pela vida as conduz

para fora da escuridão, para o mundo da luz.

Não há nenhum sentido em se lutar contra os desafios da vida, ou tentar evitá-los ou negá-los. Eles estão aí, e se a semente deve transformar-se na flor, precisamos passar

por eles.

Seja corajoso o bastante para transformar-se na flor que você foi feito para ser.

Gilson Chveid Oen

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“Vi ainda debaixo do sol que não é dos

ligeiros o prêmio, nem dos valentes, a

vitória, nem tampouco dos sábios, o pão,

nem ainda dos prudentes, a riqueza, nem

dos inteligentes, o favor; porém tudo

depende do tempo e do acaso.”

Eclesiastes 9.11

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RESUMO

As sementes são excelentes fontes de inibidores de proteinases, e a estes têm

sido atribuído inúmeras aplicações. Dentre estas aplicações estão as com efeito

sobre o consumo alimentar e o ganho de peso que se destacam devido o

crescente aumento de indivíduos obesos. Esse estudo avaliou os efeitos do

inibidor de tripsina presente na semente de tamarindo (Tamarindus indica L.)

sobre o ganho de peso e parâmetros bioquímicos e morfohistológicos de órgãos

de ratos wistar. Para isso, foi parcialmente purificado um inibidor de tripsina de

semente de tamarindo (ITT2). Este na concentração de 25 mg/Kg de peso, num

período de 11 dias, foi capaz de reduzir o consumo alimentar de ratos em cerca

de 47%, ocasionando uma redução no ganho de peso de aproximadamente 70%

quando comparado com o grupo controle. Com a avaliação da digestibilidade

proteica in vivo foi possível demonstrar que os animais perderam peso devido à

saciedade, apresentada pela redução do consumo alimentar, visto que não houve

variações significativas da digestibilidade verdadeira entre o grupo controle

(90,7%) e o grupo tratado com inibidor (89,88%). Além disso, o sangue dos

animais foi coletado a fim de serem avaliados os efeitos do ITT2, sobre

parâmetros bioquímicos (glicose, triglicerídeos, colesterol total, lipoproteínas de

alta-densidade, lipoproteína de baixa-densidade, alanina amino transferase,

aspartato amino transferase, gama glutamil transferase, albumina, globulina,

proteínas totais e proteína C reativa) e estes não apresentaram variações

significativas. Os órgãos, fígado, estômago, intestino, além do pâncreas, não

apresentaram alterações. Para avaliar se o efeito do ITT2 sobre o consumo

alimentar devido à saciedade seria acompanhado pelo aumento de colecistocinina

(CCK), foram dosados os seus níveis plasmáticos, e observado que os níveis de

CCK nos animais que receberam ITT2 eram significativamente maiores (20 +

1,22) do que nos animais que receberam apenas caseína (10,14 + 2,9) ou água

(5,92 + 1,15). Dessa forma, os resultados obtidos, indicam que o ITT2 causou um

efeito sacietogênico, reduzindo o consumo alimentar, que por sua vez ocasionou

uma redução no ganho de peso nos animais, porém sem causar alterações

bioquímicas ou morfohistológicas, efeito este acompanhado pela elevação nos

níveis plasmáticos de CCK.

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Palavras-chave: Proteína bioativa, inibidor de tripsina, saciedade, obesidade,

colecistocinina

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ABSTRACT

The seeds are excellent sources of proteinase inhibitors and have been

highlighted owing to various applications. Among these applications are those in

effect on food intake and weight gain that stand out because of the increasing

number of obese individuals. This study evaluated the effects of trypsin inhibitor

present in the seed of tamarind (Tamarindus indica L.) reduction in weight gain,

biochemical and morphological alterations in Wistar rats. For this, we partially

purified a trypsin inhibitor tamarind seed. This inhibitor, ITT2 at a concentration of

25 mg / kg body weight, over a period of 14 days was able to reduce food intake in

rats (n = 6) by approximately 47%, causing a reduction in weight gain

approximately 70% when compared with the control group. With the evaluation of

the in vivo digestibility was demonstrated that the animals lost weight due to

satiety, presented by the reduction of food intake, since there were significant

differences between true digestibility for the control group (90.7%) and the group

treated with inhibitor (89.88%). Additionally, we checked the deeds of ITT2 on

biochemical parameters (glucose, triglycerides, total cholesterol, high-density

lipoprotein, low-density lipoprotein, glutamic-pyruvic transaminase, glutamic

oxaloacetic transaminase, gamma glutamyl transferase albumin, globulin, total

protein and C-reactive protein) and these, when assessed in the study groups

showed no statistically significant variations. We also evaluate the histology of

some organs, liver, stomach, intestine, and pancreas, and showed no changes.

And to evaluate the effect of trypsin inhibitor on food intake due to the satiety is

regulated by cholecystokinin (CCK) were measured plasma levels, and it was

observed that the levels of CCK in animals receiving ITT2 were significantly higher

( 20 + 1.22) than in animals receiving only solution with casein (10.14 + 2.9) or

water (5.92 + 1.15). Thus, the results indicate that the effect caused ITT2 satiety,

reducing food intake, which in turn caused a reduction in weight gain in animals

without causing morphological and biochemical changes, this effect caused by the

elevation of plasma levels CCK.

Keywords: bioactive protein, trypsin inhibitor, satiety, obesity, cholecystokinin

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 20

2. REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................ 22

2.1 OBESIDADE E SOBREPESO ...................................................................... 22

2.1.1 Conceito e diagnóstico .............................................................................. 22

2.1.2 Epidemiologia ............................................................................................ 22

2.1.3 Etiologia ...................................................................................................... 23

2.1.4 Riscos associados a obesidade .................................................................. 25

2.1.5 Custos e tratamentos .................................................................................. 26

2.1.5.1 Custos ...................................................................................................... 26

2.1.5.2 Tratamento clínico .................................................................................... 26

a) Tratamento não-farmacológico ........................................................................ 26

b) Tratamento farmacológico ............................................................................... 27

2.1.5.3 Tratamento cirúrgico ................................................................................ 28

2.1.5.4 Tratamento com fitoterápicos ................................................................... 28

2.1.6 CCK como sinalizador de apetite ................................................................ 30

2.2 PROTEASES ................................................................................................. 36

2.2.1 Serinoproteases .......................................................................................... 36

2.2.1.1 Tripsina .................................................................................................... 37

2.3 INIBIDORES DE PROTEASES ..................................................................... 38

2.3.1 Inibidores de serinoproteases ..................................................................... 38

2.3.2 Aplicações dos inibidores de proteases ...................................................... 40

2.3.3 Fontes de inibidores de proteases .............................................................. 43

2.4 TAMARINDO ................................................................................................. 43

3. OBJETIVOS ..................................................................................................... 46

3.1 OBJETIVO GERAL ........................................................................................ 46

3.2 OBEJTIVOS ESPECÍFICOS .......................................................................... 46

4. METODOLOGIA .............................................................................................. 47

4.1 MATERIAIS .................................................................................................... 47

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4.1.1 Sementes de tamarindo .............................................................................. 47

4.1.2 Animais ....................................................................................................... 47

4.1.3 Enzimas, reagentes e substratos ................................................................ 47

4.1.4 Equipamentos ............................................................................................. 47

4.2 MÉTODOS ..................................................................................................... 47

4.2.1 Purificação do inibidor de tripsina de tamarindo ......................................... 48

4.2.1.1 Obtenção da farinha ................................................................................. 49

4.2.1.2 Preparo do extrato bruto .......................................................................... 49

4.2.1.3 Fracionamento com sulfato de amônio e precipitação com acetona ........49

4.2.1.4 Determinação da concentração de proteínas .......................................... 49

4.2.1.5 Obtenção do retido em tripsina da fração PA por cromatografia de

afinidade em matriz de tripsina em sepharose 4B ............................................... 49

4.2.2 Avaliação do grau de pureza e estimativa da massa molecular dos inibidores

protéicos por eletroforese em gel de poliacrilamida descontínuo e desnaturante

(SDS-PAGE) ........................................................................................................ 50

4.2.3 Atividade anti-tríptica do extrato bruto e frações protéicas ......................... 50

4.2.4 Avaliação do consumo alimentar, ganho de peso, alterações bioquímicas e

histopatológicas em órgãos de ratos wistar submetidos à dieta rica em ITT2

(Experimento I) ..................................................................................................... 51

4.2.4.1 Dietas........................................................................................................ 51

4.2.4.2 Animais .................................................................................................... 52

4.2.4.3 Avaliação do consumo alimentar ............................................................. 52

4.2.4.4 Evolução do peso corporal ....................................................................... 53

4.2.4.5 Determinação da digestibilidade protéica in vivo ..................................... 53

4.2.4.6 Análises bioquímicas séricas I ..................................................................54

4.2.4.7 Análise histopatológica ............................................................................ 55

4.2.5 Avaliação do consumo alimentar em tempos específicos, das alterações

bioquímicas e de CCK em ratos wistar submetidos à dieta rica em ITT2

(Experimento II)..................................................................................................... 56

4.2.5.1 Dietas ....................................................................................................... 56

4.2.5.2 Animais .................................................................................................... 56

4.2.5.3 Avaliação do consumo alimentar ............................................................. 57

4.2.5.4 Avaliação bioquímica sérica II .................................................................. 57

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4.2.5.5 Dosagem de CCK .................................................................................... 57

a) Coleta do sangue ............................................................................................. 57

b) Extração do plasma ......................................................................................... 58

c) Imuno ensaio .................................................................................................... 58

4.2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................. 59

5. RESULTADOS ................................................................................................. 60

5.1 ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DO INIBIDOR DE TRIPSINA DE SEMENTE

DE Tamarindus indica .......................................................................................... 60

5.1.1 Determinação da atividade inibitória sobre a protease serínica tripsina nas

frações protéicas .................................................................................................. 60

5.1.2 Perfil protéico e de inibição do material retido na cromatografia de afinidade

tripsina-sepharose 4b e eletroforese em gel de poliacrilamida descontinuo e

desnaturante (SDS-PAGE) .................................................................................. 60

5.1.3 Grau de purificação do inibidor ................................................................... 61

5.2 AVALIAÇÃO DA MÉDIA DE GANHO DE PESO E CONSUMO ALIMENTAR

EM RATOS WISTAR ........................................................................................... 62

5.3 DIGESTIBILIDADE PROTEICA in vivo .......................................................... 64

5.4 AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA I .......................................................................... 65

5.5 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA ..................................................................... 68

5.6 CONSUMO ALIMENTAR EM 1, 2 E 24h APÓS A ADMINISTRAÇÃO DE

INIBIDOR DE TRIPSINA DE TAMARINDO ......................................................... 70

5.7 AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA II ......................................................................... 71

5.8 DOSAGEM DE CCK ...................................................................................... 76

6. DISCUSSÃO .................................................................................................... 78

7. CONCLUSÃO .................................................................................................. 94

REFERÊNCIAS .................................................................................................... 95

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LISTA DE ABREVIAÇÕES/SIGLAS

ALT – Alanina aminotransferase

ARC – Núcleo arqueado

AST – Aspartato aminotransferase

BApNA - N-α-benzoil-arginina-p-nitroanilida

BBIC – Concentrado de inibidor Bowman-Birc de soja

C – Caseína

CC – Circunferência da cintura

CCK – Colecistocinina

PPIC – Concentrado de inibidor de proteinase de batata

COL – Colesterol total

Da – Digestibilidade aparente

DBI – Inibidor de ligação de diazepam

DC – Dobras cutâneas

DEXA – Absorciometria por raios x de dupla anergia

DGPM – N-metil-4-(4-guanidino-benzililoxi)-fenil acetato de metano-sulfato

Dv – Digestibilidade verdadeira

EB – Extrato bruto

EDTA – Ácido etilenodiaminotetraacético

ENDEF – Estudo nacional da depesa familiar

F1 – Fração 1

FC – Grupo controle

FI – Grupo com inibidor

GGT – Gama glutamil transferase

GL – Glicose

GLP-1 – Peptídeo do tipo-glucagon 1

HDL – Lipoproteína de alta densidade

IMC – Índice de massa corpórea

IS – Inibidor de soja

IT – Inibidor de tripsina

ITT – Inibidor de tripsina de tamarindo

LCRF – Fator de liberação de CCK lumial

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LDL – Liproproteína de baixa densidade

NF – Nitrogênio fecal

NFa – Nitrogênio fecal de origem alimentar

NFe – Nitrogênio fecal de origem endógena

NI – Nitrogênio ingerido

NP – Dieta aprotéica

OMS – Organização Mundial de Saúde

P – Padrão

PA – Precipitado com acetona

PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida

PARs – Receptor ativado por proteases

PCR – Proteína C reativa

PGG – α-β-penta O galloyl-D-glucopiranose

PNSN – Pesquisa nacional de saúde e nutrição

POT II – Inibidor de proteinase de batata

PPA – Pico do precipitado com acetona

PPV – Pesquisa sobre padrões de vida

PYY – Peptídeo YY

RCQ – Relação cintura quadril

S – Dieta padrão

SBTI – Inibidor de tripsina de soja

SDS – Dodecil sulfato de sódio

SG – Dieta mais água por gavagem

SKTI – Inibidor de tripsina tipo Kunitz de soja

SNC – Sistema nervoso central

TG – Triglicerídeo

TMB – Substrato de peroxidase

VBC – Verde de bromocresol

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Principais sinalizadores do apetite, locais de produção e característica:

anorexígena ou orexígena ................................................................................... 32

Tabela 2. Composições das dietas utilizadas na avaliação do consumo alimentar

em ratos Wistar oferecidas durante 14 dias ......................................................... 52

Tabela 3. Parâmetros bioquímicos de ratos Wistar machos de diferentes fontes,

para padrões de referência .................................................................................. 55

Tabela 4. Tabela de purificação do inibidor de tripsina de semente de tamarindo

(ITT2) .................................................................................................................... 62

Tabela 5. Digestibilidade proteica Verdadeira (Dv) e Aparente (Da) em ratos

wistar submetidos à dieta com inibidor de tripsina de semente de tamarindo ..... 63

Tabela 6. Avaliação da proteína C reativa após administração de inibidor de

tripsina de sementes de tamarindo em ratos Wistar ............................................ 76

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Modelo causal de obesidade ............................................................... 24

Figura 2. Ação do peptídeo inibidor no mecanismo de feedback negativo no

controle de secreção de tripsina pelo pâncreas ................................................... 34

Figura 3. Fruto, polpa, sementes e sementes descascadas de tamarindo

(Tamarindus indica L.) ......................................................................................... 43

Figura 4. Organograma com fases do delineamento experimental .................... 48

Figura 5. Percentual de atividade inibitória de tripsina do extrato bruto e das

frações protéicas .................................................................................................. 60

Figura 6. Cromatografia de afinidade em Tripsina Sepharose 4B e SDS-PAGE do

ITT2 ........................................................................................................................ 61

Figura 7. Evolução do peso corporal médio de ratos Wistar submetidos à dieta

com inibidor de tripsina de semente de tamarindo .............................................. 63

Figura 8. Consumo alimentar médio de ratos Wistar submetidos à dieta com

inibidor de tripsina de semente de tamarindo ...................................................... 64

Figura 9. Níveis de glicose mg/dL em ratos Wistar submetidos à dieta com


Figura 10. Perfil lipídico em ratos Wistar submetidos à dieta com inibidor de

tripsina de semente de tamarindo......................................................................... 66

Figura 11. Níveis de ALT e AST U/L em ratos Wistar submetidos à dieta com


Figura 12. Análise histopatológica de órgãos em ratos Wistar submetidos à dieta

com inibidor de tripsina de semente de tamarindo durante 14

dias........................................................................................................................ 69

Figura 13. Percentual de redução do consumo alimentar em ratos Wistar após 1

h, 2 h e 16 h da administração de dieta com inibidor de tripsina de semente de

tamarindo.............................................................................................................. 71

Figura 14. Níveis de glicose mg/dL em ratos Wistar submetidos à dieta com


Figura 15. Perfil lipídico em ratos Wistar submetidos à dieta com inibidor de

tripsina de semente de tamarindo ........................................................................ 73

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Figura 16. Níveis de ALT, AST e GGT U/L em ratos Wistar submetidos à dieta

com inibidor de tripsina de semente de tamarindo .............................................. 74

Figura 17. Níveis de proteínas séricas em ratos Wistar submetidos à dieta com


Figura 18. Níveis de CCK plasmático em ratos Wistar submetidos à dieta com


Figura 19. Modelo preliminar para explicar o mecanismo pelo qual o inibidor de

tripsina pode promover a saciedade .................................................................... 92

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1. INTRODUÇÃO

A crescente prevalência da obesidade tem aumentado a busca por novos

métodos de combatê-la, pois além dos riscos ocasionados aos indivíduos, o custo

para o tratamento da mesma é bastante elevado (PORTO et al., 2007; WHO,

2012), tendo sido investido bastante em prevenção e no uso de produtos naturais.

Os avanços no conhecimento técnico científico que envolve qualidade,

segurança e eficácia, inerentes aos medicamentos a base de plantas, nos últimos

anos, têm colocado a área de produtos naturais bioativos, em posição de grande

destaque. No tratamento da obesidade, devido não só a fatores como o alto custo

dos medicamentos, mas também de seus efeitos colaterais, como os

apresentados pelos anorexígenos alopáticos, tem aumentado a procura por

produtos naturais, derivados de plantas, com ação emagrecedora (VERA-CRUZ

et al., 2010; BERNARDI et al., 2011).

A adição de inibidores de proteinase na alimentação animal e humana tem

sido investigada, demonstrando que reduz o consumo de energia e/ou alimentos.

Estas descobertas confirmam que os inibidores de protease podem ter potencial

terapêutico para reduzir o consumo de alimentos por estimular o aumento

plasmático de colecistocinina (CCK), considerando que a CCK endógena é

importante no controle do consumo alimentar (HILL et al., 1990; NAKAJIMA et al.,

2011; CHEN et al., 2012).

A fruta tamarindo (Tamarindus indica L.) se destaca na medicina popular e

praticamente todas as suas partes têm uso e apresentam inúmeras aplicações

terapêuticas em humanos, dentre elas: laxante, digestivo, terapia do diabetes e

outros (GURJÃO, 2006).

Araújo e colaboradores (2005) mostraram que as sementes de tamarindo

apresentavam proteínas bioativas, com atividade anti-tripsina, capazes de inibir

enzimas digestórias de larvas de insetos pragas, bem como interferir no

crescimento larval de diversos insetos. Além disso, as sementes de tamarindo já

tiveram suas propriedades funcionais, nutricionais e químicas bem caracterizadas

(BHATTACHARYA et al., 1993; BHATTACHARYA et al., 1994)

Assim, destaca-se a importância de se estudar o inibidor de tripsina de

tamarindo, anteriormente purificado, pela possibilidade de ser um potencial

candidato para o desenvolvimento de fitoterápico visando prevenção e/ou

21


tratamento da obesidade, pelo aumento da secreção de CCK, ocasionando uma

redução do consumo alimentar, acompanhada de uma redução no ganho de

peso.

22


2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1 OBESIDADE E SOBREPESO

2.1.1. Conceito e diagnóstico

A obesidade é considerada atualmente uma desordem nutricional comumente

presente em todo o mundo e apresentando diversos efeitos clínicos, sociais,

psicológicos e econômicos que podem acarretar consequências importantes,

sendo, portanto, uma preocupação generalizada (CHAN & WOO, 2010; WHO,

2012).

O termo “obesidade” é originário do latim obesu que significa gordura. A

obesidade pode ser definida de forma resumida como o grau de armazenamento

de gordura no organismo associado a riscos para a saúde devido a sua relação

com várias complicações metabólicas. É uma síndrome multifatorial que consiste

em alterações fisiológicas, bioquímicas, metabólicas e anatômicas, além de

alterações psicológicas e sociais, sendo classificada como doença pela

Organização Mundial de Saúde (OMS), desde 1997. A base da doença é o

processo indesejável do balanço energético positivo, resultando em ganho de

peso (BRASIL, 2006; WHO, 1997).

Para o diagnóstico da obesidade, existem vários métodos indiretos que

permitem estimar com precisão a quantidade total de gordura corpórea, assim

como sua distribuição. Entre esses métodos destacam-se a impedância

bioelétrica, tomografia computadorizada, a absorciometria por raios X de dupla

energia (DEXA) e a ressonância magnética. Para a realização de estudos

epidemiológicos, entretanto, considera-se a simplicidade e os custos dos diversos

métodos e tem sido recomendada a utilização de índices antropométricos: O

índice de massa corporal (IMC), a relação cintura-quadril (RCQ) ou apenas a

circunferência da cintura (CC) e as dobras cutâneas (DC) (WHO, 1997; BRASIL,

2004).

2.1.2. Epidemiologia

A prevalência da obesidade está aumentando. Segundo a OMS, em 2008,

mais de 1,4 bilhão de adultos, 20 anos ou mais, estavam acima do peso. Destes

23


mais de 200 milhões de homens e quase 300 milhões de mulheres eram obesos.

Cerca de 65% da população mundial vive em países onde o sobrepeso e a

obesidade matam mais pessoas do que o baixo peso. Mais de 40 milhões de

crianças menores de cinco anos estavam acima do peso em 2010. Assim, a

obesidade é considerada, em países desenvolvidos e em vias de

desenvolvimento, um importante problema de saúde pública e, para a OMS, uma

epidemia global (ROMERO & ZANESCO, 2006; WHO, 2012).

O Brasil vem acompanhando a tendência mundial da prevalência de

sobrepeso e da obesidade para adultos. Uma vez que pela análise comparativa

de estudos populacionais realizados no Brasil, a exemplo do Estudo Nacional da

Despesa Familiar (ENDEF), da Pesquisa Nacional sobre Saúde e Nutrição

(PNSN) e da Pesquisa sobre Padrões de Vida (PPV), realizadas em 1974-1975,

1989 e 1996-1997, respectivamente, demonstra que, neste período, o sobrepeso

e a obesidade aumentaram na população adulta brasileira (IBGE, 1977; INAN,

1990; IBGE, 1998).

O mais recente levantamento realizado pelo Ministério da Saúde (BRASIL,

2012a) aponta que o excesso de peso e a obesidade continuam aumentando nos

últimos anos no Brasil. De acordo com o estudo, a proporção de pessoas acima

do peso no Brasil avançou de 42,7%, em 2006, para 48,5%, em 2011. No mesmo

período, o percentual de obesos subiu de 11,4% para 15,8%. O aumento das

porcentagens de pessoas obesas e com excesso de peso atinge tanto a

população masculina quanto a feminina. Em 2006, 47,2% dos homens e 38,5%

das mulheres estavam acima do peso ideal. Agora, as proporções subiram para

52,6% e 44,7%, respectivamente. Sendo assim, a obesidade, também no Brasil,

uma doença epidêmica seguindo a tendência mundial (BRASIL, 2012b).

2.1.3. Etiologia

A crescente epidemia da obesidade representa as mudanças negativas no

estilo de vida dentro do contexto da sociedade moderna. Fatores ambientais,

comportamentais, como diminuição da atividade física, associado a um elevado

consumo de alimentos ricos em gordura e calorias, promovem o aumento da

obesidade a índices elevados (CORMICK & CLARKE, 2004; NGUYEN & EL-

SERAG, 2010).

24


A obesidade de origem endógena, ou seja, hereditária/congênita,

psicogênica, medicamentosa, neurológica e endócrina representam 5% ou menos

dos casos na atualidade, ao passo que a obesidade de origem exógena

(obesidade originada de fatores ambientais, culturais, sociais e emocionais, e,

principalmente, devido a hipoatividade: sedentarismo; e aos maus hábitos

alimentares: inadequação entre qualidade, quantidade e alto consumo de fast-

food) representa cerca de 95% dos casos (FRANCISCHI et al., 2000; DÂMASO,

2001; WILDING, 2011).

Devido a sua etiologia multifatorial, é difícil mensurar a força que cada uma

das variáveis envolvidas, exerce no processo de ganho excessivo de peso.

Embora os excessos alimentares e o sedentarismo estejam implicados no

aumento global da prevalência da obesidade, há muitas evidências de que a

genética contribui substancialmente para a regulação do peso corporal,

(RODRIGUES; BOGUSZEWSKI, 1999), estando a rede de vias neuroquímicas

hipotalâmicas, que controla o consumo alimentar e o gasto energético, por trás

desta base genética da obesidade (SCHWARTZ et al., 2000). A Figura 1 ilustra

um modelo causal para a obesidade.

Figura 1. Modelo casual de obesidade (BALABAN & SILVA, 2004).

25


2.1.4. Riscos associados à obesidade

A obesidade está associada a alterações metabólicas importantes, que são

dependentes de sua duração e de sua gravidade e cujas consequências ocorrem

mais no adulto. Entretanto, a criança obesa já apresenta maior risco para algumas

doenças, e os distúrbios psicossociais, provocados pelo estigma da obesidade,

são de grande relevância nesta fase de estruturação da personalidade (MUST,

1996; NADERALI, 2009). A obesidade pode ser causa de sofrimento, depressão,

fúria e de comportamentos de esquiva social, os quais prejudicam a qualidade de

vida e podem provocar até redução da expectativa de vida (ADES & KERBAUY,

2002; MICCIOLO et al., 2010).

As doenças cardiovasculares se manifestarão décadas mais tarde, mas

estudos demonstram que a doença aterosclerótica pode se iniciar precocemente

em adolescentes e crianças obesas (LI et al., 2003; DYSON, 2010).

Existe também uma associação entre obesidade e alterações

degenerativas osteoarticulares. Pode provocar artrite, gota e deterioração das

articulações dos joelhos, bem como lesões nos discos intervertebrais. De tal

forma que, quem sofre de excesso de peso, pode também desenvolver infecções

dérmicas, bacterianas e fúngicas (QUEIRÓS, 2006; DYSON 2010). Além destas,

de ocorrência relacionada com a obesidade estão o refluxo gastroesofágico, a

fibromialgia, as enxaquecas, o processo de envelhecimento precoce, as

dislipidemias, a hipertensão, a resistência à insulina, o diabetes, e diversas

complicações respiratórias, como apneia do sono, doença pulmonar obstrutiva

crônica e asma, além de amenorreia e doença da vesícula biliar (BRUCE &

BYRNE, 2009; DYSON, 2010; GRAVES, 2010; NGUYEN & EL SERAG, 2010)

A adiposidade excessiva, particularmente a visceral, é um dos mais bem

estabelecido fator para o desenvolvimento de diabetes tipo 2 (MALIK & HU,

2012). Estudos demonstram que a prevalência de hipertensão é cerca de 50%

maior nos indivíduos obesos (MARCHI-ALVES et al., 2010).

A Síndrome Metabólica, decorrente da obesidade, é proveniente de uma

série de desordens metabólicas e complicações vasculares, podendo, ser

denominada também como Síndrome X, síndrome da resistência à insulina,

quarteto mortal ou síndrome plurimetabólica. Essa síndrome é caracterizada pelo

agrupamento de fatores de risco cardiovascular como hipertensão arterial,

26


resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância a glicose/diabetes tipo 2,

obesidade central e dislipidemia (LDL - colesterol alto, triglicérides alto e HDL -

colesterol baixo) (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HIPERTENSÃO, 2005).

Sendo assim, a obesidade é uma doença de difícil controle, com altos

percentuais de insucessos terapêuticos e de recidivas, podendo apresentar sérias

repercussões orgânicas e psicossociais, especialmente nas formas mais graves

(BERNARDI et al., 2005), como as citadas acima.

2.1.5. Custos e Tratamento

2.1.5.1. Custos

Pesquisa realizada em 2011 revelou que os custos totais estimados em um

ano com todas as doenças relacionadas ao excesso de peso e a obesidade são

2,1 bilhões de dólares, 1,4 bilhão de dólares (68,4% do custo total) devido às

internações e 679 milhões de dólares devido a procedimentos ambulatoriais.

Aproximadamente 10% destes custos são atribuíveis ao sobrepeso e à

obesidade. Dessa forma, é gasto atualmente no Brasil mais de 3,5 bilhões de

reais com o sobrepeso, obesidade e doenças relacionadas a ela (BAHIA et al.,

2012).

A ênfase no tratamento da obesidade deve ser a redução da gordura

corporal por meio da reversão do quadro de balanço energético positivo, condição

na qual o gasto energético supera o armazenamento diário. A reversão pode ser

obtida utilizando-se dietas restritivas, aumento do gasto energético, fármacos

anorexígenos, cirurgias bariátricas e, mais recentemente, o uso de fitoterápicos

(COLE et al., 2009; KLOET & WOODS, 2010).

2.1.5.2. Tratamento clínico

a. Tratamento não-farmacológico

Atualmente, o tratamento nutricional recomendado vai além das dietas

tradicionais, que frequentemente fracassavam em manter a perda de peso; está

baseado principalmente em um planejamento de educação alimentar, ao mesmo

tempo em que enfatiza cada vez mais a importância da atividade física. Além

27


disso, tendo em vista fatores cognitivos e emocionais associados ao aumento do

consumo de alimentos, as técnicas de terapia cognitivo-comportamental foram

consideravelmente fundamentais, contribuindo hoje de forma mais efetiva para a

mudança dos hábitos de vida do paciente obeso. (COLE et al., 2009; DYSON,

2010; GRAVES, 2010).

Os componentes de um programa de mudança comportamental incluem:

educação sobre a etiologia e a fisiopatologia da obesidade; educação alimentar e

nutricional e novas técnicas dietéticas; educação através da fisiologia do

exercício, estratégias, técnicas e monitoramento da atividade física; conhecimento

de estratégias para evitar o ganho de gordura novamente; apoio familiar, social e

acompanhamento de uma equipe multidisciplinar de profissionais de saúde

(COLE et al., 2009; DYSON, 2010; GRAVES, 2010).

b. Tratamento farmacológico

A farmacoterapia para perda de peso só é recomendada para doentes

obesos que não conseguem atingir as metas de perda de peso com dietas e/ou

atividade física, além de possuírem IMC ≥ 30 kg/m2 ou IMC ≥ 27 kg/m2

associados a fatores de riscos. Além disso, deve ser considerado o fator

etiológico, a resposta terapêutica, a dose adequada, as interações

medicamentosas e a contra indicação médica e psiquiátrica (CARRASCO et al.,

2009; GRAVES, 2010; POWELL & KHERA, 2010).

A terapia medicamentosa é bastante arriscada pela falta de estudos a

respeito dos efeitos dos medicamentos em longo prazo e, também, pelos seus

possíveis efeitos colaterais: sonolência, nervosismo e distúrbios no trato

gastrintestinal. Em razão disso, o uso de farmacológicos para emagrecer sempre

foi alvo de críticas, principalmente por ocorrerem muitos erros no uso racional,

generalização na prescrição dos medicamentos e abusos na comercialização de

produtos (BARBIERI, 2001).

O tratamento farmacológico da obesidade não cura a obesidade, e quando

não há continuidade ocorre novamente o ganho de peso. As medicações devem

ser utilizadas sob supervisão profissional contínua, e o tratamento e a escolha

medicamentosa devem ser individuais. Os riscos associados ao uso de uma

droga devem ser avaliados em relação aos riscos da persistência da obesidade e

28


o tratamento deve ser mantido apenas quando considerado seguro e efetivo para

o paciente. O uso de agentes farmacológicos não é recomendado para crianças,

pois não há estudos suficientes nessa faixa etária (BARBIERI, 2001).

Pode-se, didaticamente, dividir os fármacos para o tratamento da

obesidade em três grupos básicos: 1) Medicamentos que afetam a absorção de

nutrientes; 2) Medicamentos termogênicos, e, 3) Medicamentos anorexígenos de

ação central (COLE et al., 2009).

2.1.5.3. Tratamento Cirúrgico

O tratamento cirúrgico, denominado cirurgia bariátrica, promove a perda de

peso em indivíduos com obesidade por meio de um procedimento cirúrgico que

possibilita, além da diminuição do peso, a redução ou mesmo tratamento de

comorbidades associadas à obesidade. Porém é necessário ponderação, pois

existem riscos associados. Para a realização da cirurgia é necessário que o

indivíduo tenha um IMC maior que 40 kg/m2 ou maior que 35 kg/m2 associado à

comorbidades e em que a perda de peso falhou com tentativas sob supervisão

médica (REEDY, 2009; KHWAJA & BONANOMI, 2010).

Atualmente, existem dois tipos principais de cirurgias: restritivas e

operações que associam restrição gástrica com desvio gastrintestinal do trânsito

alimentar (COLE et al., 2009).

2.1.5.4. Tratamento com Fitoterápicos

A Fitoterapia é na atualidade, uma área em desenvolvimento, com

reconhecimento legal e importante repercussão na saúde pública (BERNARDI et

al., 2011).

Especial atenção tem sido centrada sobre os amido-bloqueadores.

Estes suplementos são baseados em grande parte na proteína de concentrados

de Phaseolus vulgaris ou feijão-comum, que são conhecidas por conter níveis

elevados de um inibidor da alfa-amilase também conhecido como phaseolamina.

Teoricamente, com a inibição da α-amilase, ocorre a perda de peso por interferir

na repartição dos hidratos de carbono complexos, anulando ou pelo menos

reduzindo a sua digestão pelo trato gastrointestinal inferior e consequentemente a

sua absorção. No entanto, além do inibidor-amilase, nestes extratos de feijão

29


podem conter níveis significativos de fatores antinutricionais como lectinas e os

inibidores da tripsina (BONIGLIA et al., 2008).

Além dos amido-bloqueadores, vários estudos têm demonstrado que o chá

verde, obtido por meio das folhas frescas da erva Camellia sinensis, tem uma alta

quantidade de flavonóides conhecidos como catequinas, capazes de promover a

diminuição de peso corporal, gordura corporal e auxiliar na prevenção e

tratamento da obesidade e de doenças associadas como diabetes, doenças

cardiovasculares e dislipidemias (FREITAS & NAVARRO, 2007).

Arçari et al., (2009), também relatam que o uso de erva-mate demonstrou

uma atividade antiobesidade em camundongos e que depois de submetidos à

dieta hiperlipídica por 8 semanas, recebendo o extrato aquoso de Ilex

paraguariensis (chá-mate), também apresentaram efeito modulador na expressão

de vários genes relacionados com o processo de obesidade.

O extrato da fruta do macaco, nome popular de uma planta do gênero

Garcinia da família Clusiaceae, também apresentou atividade como agente

supressor do apetite devido à presença do ácido cítrico hidroxilo. Este auxilia na

queima de calorias, reduzindo o excesso de gordura armazenada e promove

termogênese (MISHRA et al., 2012).

Lagerstroemia speciosa é uma espécie de planta que contém o alfa e beta-

penta-O-galloyl-D-glucopiranose (PGG) e derivados do ácido tânico que também

apresentam relatos como responsáveis pela ação antiobesidade (MISHRA et al.,

2012).

Já o Cyperus rotundus tem recebido atenção pelos múltiplos benefícios à

saúde e foi relatada a atividade antiobesidade do extrato dos tubérculos do C.

rotundus para o controle de peso corporal em modelo com ratos (BERNARDI et

al., 2011).

Quanto à espécie Japonicus panax, esta tem sido amplamente utilizada e

investigada. Muitos resultados dos estudos dos efeitos antiobesidade de

saponinas isoladas de rizomas de Japonicus panax foram comprovados por

vários grupos de pesquisa. Provas abundantes sugerem que saponinas

conseguem evitar o aumento do peso do corpo e do peso do tecido adiposo em

ratos (PARK et al., 2001).

30


Em experimentos também com ratos, que receberam inibidor de tripsina de

feijão de corda (Vigna unguiculata Walp.), juntamente com dieta semi-sintética de

alta qualidade com base na lactoalbumina, na relação de 10 g de inibidor/kg,

houve uma redução moderada no ganho de peso quando comparado com o

grupo controle, apesar do consumo idêntico de alimentos nos dois grupos. A taxa

de redução foi cerca de 20% numa base de peso vivo (PUSZTAI et al., 1992).

Ainda com inibidores de proteinases é relatado que a administração oral de

CIPP (Preparação de concentrado de inibidores de proteinase da batata) reduziu

o consumo de alimentos durante as primeiras duas horas após o experimento, o

esvaziamento gástrico foi retardado e houve diminuição da atividade proteolítica

no duodeno. Repetida a administração oral de CIPP, houve redução do ganho de

peso em ratos machos e elevação significativa dos níveis plasmáticos de CCK.

Embora os níveis de mRNA de CCK da mucosas duodenais tenha aumentado em

resposta à administração de CIPP, a mudança da concentração não elevou a

expressão CCK ou liberação em células STC-1 (linha de células enteroendócrinas

que expressa mRNA de CCK e secreta biologicamente o peptídeo ativo, CCK-8)

(KOMARNYTSKY et al., 2011).

Assim, o uso de fitoterápicos é um campo promissor no tratamento da

obesidade, e seu papel tem sido cada vez mais esclarecido, tornando possível a

compreensão da sua atuação no organismo. Assim, dentre os fitoterápicos,

merecem destaque os inibidores de proteases, que apresentam aplicação em

diversas enfermidades e têm apresentado bons efeitos no consumo alimentar.

2.1.6. Colecistocinina (CCK) como sinalizador do apetite

A obesidade se caracteriza pelo aumento do armazenamento de gordura e

este é feito pelo tecido adiposo, por meio de dois tipos de tecidos, o tecido

adiposo branco, que é o mais abundante e é localizado preferencialmente nas

regiões subcutâneas e em órgãos internos, armazenando energia e sendo

responsável pela liberação de adipocinas (adiponectinas, leptinas, entre outras) e

o tecido adiposo castanho, que funciona como um órgão termogênico

(MARCELIN & CHUA, 2010).

O Sistema Nervoso Central (SNC) influencia o balanço energético e o peso

corporal por meio de três mecanismos: (1) efeitos no comportamento, incluindo

31


alimentação e atividade física; (2) efeitos na ativação do Sistema Nervoso

Autônomo, que regula a energia gasta e outros aspectos do metabolismo; (3)

efeitos no sistema neuroendócrino, incluindo a secreção de hormônios, como: do

hormônio do crescimento, da tireoide, o cortisol, a insulina e outros esteróides. O

núcleo arqueado (ARC) constitui-se, dentro do hipotálamo, no maior sítio de

integração entre os diversos sinais oriundos da periferia e do tronco cerebral,

determinando ações que visam adequar o balanço energético do organismo

(DAMIANI & FILHO, 2010). Portanto, existem vários fatores que atuam e

interagem na regulação do consumo de alimentos, e no armazenamento de

energia, contribuindo para o aparecimento e manutenção da obesidade; entre

eles, fatores neuronais, endócrinos e adipocitários, bem como fatores intestinais

(TIRAPEGUI et al., 2004).

O sistema de balanço energético envolve sinais aferentes em longo prazo,

do tecido adiposo (leptina) e das células beta do pâncreas (insulina), e sinais

aferentes em curto prazo, do intestino, relacionados com as refeições, incluindo

inibidores do apetite (PYY (peptídeo YY), GPL-1 (glucagon-like peptide 1) e CCK)

e estimulantes do apetite (grelina). Estes inputs são integrados no nível do

sistema nervoso e outputs eferentes regulam o apetite, o gasto energético, o

crescimento, a reprodução, entre outras funções. O controle em curto prazo

envolve o início e o fim das refeições. O principal determinante do tamanho da

refeição é a saciedade, uma resposta a fatores neuronais e endócrinos, tais como

a distensão e a liberação da CCK no intestino, gerada durante a refeição

(SPIEGELMAN & FLIER, 2001; FLIER, 2004). Dessa forma, pode-se observar

que existem diferentes sinalizadores do apetite, produzidos em locais diferentes e

com ações variadas (Tabela 1).

Dentre os sinalizados do apetite existe o peptídeo CCK e ele é liberado no

intestino delgado estimulado pelos ácidos graxos e proteínas que atuam

provavelmente diretamente sobre células-I intestinais. Dietas ricas em proteínas

inicialmente aumentam a liberação de CCK e aumentam a capacidade de

secreção pancreática de protease. Quando a secreção pancreática de protease é

suficiente para satisfazer as exigências digestivas de proteínas, o estímulo para a

secreção de CCK é reduzido e o CCK plasmático retorna ao normal, exercendo

um feedback negativo e, completando, assim, o ciclo de ação desse hormônio

32


(GREEN et al., 1986; RODRIGUES et al., 2005). Tendo as proteases

pancreaticas, especialmente a tripsina, forte influência na secreção de CCK.

Tabela 1. Principais sinalizadores do apetite, locais de produção e característica

de ação: anorexígena ou orexígena.

SINALIZADOR PRODUZIDO PRINCIPALMENTE AÇÃO

Adiponectina Adipócito Anorexígena

Amilina Pâncreas Anorexígena

CART Hipotálamo Anorexígena

CCK Intestino Anorexígena

Enterostatina Intestino Anorexígena

Glicossensores portais Veia porta Anorexígena

GLP-1 Íleo, cólon e reto Anorexígena

Insulina Pâncreas Anorexígena

Leptina Adipócitos e estômago Anorexígena

MSH Hipófise Anorexígena

Oxintomodulina Porção final do jejuno e íleo Anorexígena

POMC Hipotálamo Anorexígena

PYY (3-36) Íleo e cólon Anorexígena

AgPR Hipotálamo Orexígena

Anandamida e 2AG Intestinal e cerebral Orexígena

Grelina Estômago e hipotálamo Orexígena

NPY Hipotálamo Orexígena

Opióides (endorfina) Cérebro e tronco encefálico Orexígena

PYY (1-36) Íleo e cólon Orexígena

Resistina Células mononucleares, adipócitos

e pâncreas

Orexígena

Fonte: SPIEGELMAN & FLIER, 2001

Em estudos realizados por Rackis & Gubmann (1982) foram observadas

alterações no pâncreas de ratos alimentados com inibidores de tripsina, e estes

propuseram um mecanismo de feedback negativo no controle da secreção

33


pancreática de tripsina, ou seja, a secreção desta enzima pelo pâncreas seria

inversamente relacionada ao seu nível no intestino delgado. Assim, quando o

nível de tripsina no intestino fosse reduzido, como ocorre na complexação

tripsina-inibidor, o pâncreas responderia de uma maneira compensatória,

produzindo mais enzima, podendo provocar hiperplasia e hipertrofia das suas

células e dependendo da dose, estas alterações que normalmente são transitórias

poderiam conduzir a uma série de problemas patológicos, inclusive câncer. O

agente mediador entre a tripsina e o pâncreas é o hormônio CCK, o qual é

liberado das células endócrinas do jejuno quando o nível de tripsina no intestino

está diminuído. A relação entre tripsina, inibidor de tripsina, CCK e o pâncreas é

ilustrada na Figura 2.

Inicialmente não se sabia como a inativação da tripsina pelo inibidor

estimulava a produção de CCK. Para tanto, foi isolado do suco pancreático de

ratos, um “peptídeo monitor”, ou seja, um peptídeo sensível à tripsina, que contém

61 resíduos de aminoácidos e exibe similaridade significativa com a família de

inibidores da tripsina secretória pancreática. Este peptídeo age como um sinal

para liberação do hormônio CCK na mucosa intestinal. O desvio de suco

pancreático ou a administração intraduodenal de inibidores de protease, como já

citado, resultam em uma redução da atividade tríptica no duodeno, e aumenta a

secreção de enzimas pancreáticas estimuladas por CCK. Por outro lado, CCK é

inibida pela infusão de tripsina, mostrando uma relação de feedback negativo,

porém, quando a tripsina está complexada com o inibidor, o peptídeo está livre

para induzir a liberação de CCK, consequentemente o peptídeo inibidor (inibidor

de tripsina) parece funcionar como um estímulo específico de feedback

intraluminal positivo, mecanismo este mostrado na Figura 2 (LIENER, 1994;

KARL-HEINZ, 1998).

Ainda na procura de um fator de liberação da CCK, foi isolado e

sequenciado um inibidor de ligação a diazepam (DBI) da mucosa intestinal suína,

consistindo de 86 aminoácidos e massa molecular de 9810 Daltons. DBI foi

isolado pela primeira vez a partir de cérebro de rato em 1983 e denominado de

acordo com a sua capacidade para deslocar o diazepam do receptor A do ácido

aminobutírico-γ. Subsequentemente, DBI foi detectado num certo número de

órgãos fora do SNC, com a concentração mais elevada no fígado, duodeno,

34


testículos, rins e glândulas supra-renais. DBI tem sido relatado por funcionar com

elevada afinidade por uma proteína de ligação de acetil coenzima A no fígado,

para estimular a esteroidogênese em células supra-renais, para atuar como um

regulador autócrino / parácrino no funcionamento das células de Leydig, e para

inibir a libertação de insulina estimulada por glicose. Por imunoreatividade, DBI foi

detectado no pâncreas endócrino, e nas células epiteliais secretoras do intestin.

Além disso, foi observado que a infusão intraduodenal de DBI sintético em ratos

estimula significativamente a saída de amilase pancreática e a liberação de CCK.

Assim, postulou-se que o DBI secretado intraduodenalmente aumenta CCK e

pode ser o elo que faltava na regulação da secreção pancreática exócrina (KARL-

HEINZ, 1998).

Figura 2. Ação do “peptídeo monitor” no mecanismo de feedback negativo no controle da secreção

de tripsina pelo pâncreas. Fonte: LIENER, (1994).

Outro peptídeo liberador de CCK foi descrito, chamado de fator de

liberação de CCK lumial (LCRF), isolado a partir de perfusão jejunal em ratos. O

peptídeo tem massa de 8136 kDa e é composto por 70-75 aminoácidos. A

infusão intraduodenal deste peptídeo estimula, de maneira dose dependente, a

secreção do fluido pancreático e de proteínas concomitantemente com o aumento

dos níveis plasmáticos de CCK (KARL-HEINZ, 1998).

As ações biológicas de CCK são mediadas por receptores de superfície

celular de membrana em células alvo. Os receptores de CCK são difundidos no

trato gastrointestinal e, também, ocorrem nas células pancreáticas acinares, na

35


vesícula biliar e no cérebro. Foram identificados dois subtipos de receptores de

CCK com diferentes características farmacológicas, e distribuições de tecidos

diferentes na periferia e SNC: receptores CCK A (CCK 1, CCK 1R), que têm dois

estados de afinidade e receptores CCK B (CCK 2R). Não há nenhuma técnica

cirúrgica seletiva para a remoção de células secretoras de CCK intestinal, no

entanto, algumas mutações espontâneas do gene CCK 1R, indicam que podem

produzir um fenótipo de obesidade e cálculos biliares (GEARY, 2004).

Estudos ao longo de muitos anos têm contribuído para a ideia de que a

CCK liberada a partir do intestino delgado, atuando via receptor CCK A no trato

gastrointestinal age sobre neurônios vagais aferentes que encerram no núcleo do

trato solitário (NTS) e ativam vias ascendentes que controlam o comportamento

de consumo alimentar. A matriz de respostas humanas no SNC a CCK endógeno

já foi caracterizado por ressonância magnética funcional (fMRI), após

administração intragástrica de dodecanoato com ou sem o antagonista do

receptor de CCK 1, o dexloxiglumide. Em resposta a uma dose relativamente

baixa de dodecanoato, houve ativação do tronco cerebral e hipotálamo, e também

do córtex motor; as respostas foram praticamente abolidas por dexloxiglumide,

indicando a importância da CCK como um mediador da resposta humana no

SNC. A libertação de CCK por células-I intestinais em resposta a ácidos graxos e

aminoácidos envolve dois receptores de proteína G-acoplados: GPR40 e CaSR,

respectivamente (DAMIANI & FILHO, 2010; DOCKRAY, 2012).

A CCK bioativa possui diversos tamanhos e foi primariamente identificada

no extrato do intestino delgado de porco como um peptídeo carboxiaminado

contendo 33 resíduos de aminoácidos. Estudos subsequentes, mostraram que a

pro-CCK é processada como CCK-83, CCK-58, CCK-22 e CCK-8, dentre outras,

sendo esta última predominante em neurônios periféricos e centrais. Nas últimas

décadas tem sido descrito que a CCK-58 é a maior forma de CCK presente nos

plasma de mamíferos como o homem. Além disso, foi demonstrado que no

plasma as quantidades predominantes são de CCK-33, seguida pela CCK-22. Em

adição, sabe-se que enzimas têm sido indicadas como responsáveis pela

clivagem da CCK-33, sendo capazes de produzir CCK-8 e CCK-22 (BEINFELD,

2001; MANCINI & HALPERN, 2002; RUIZ, 2003).

36


2.2 PROTEASES

O termo protease é a denominação geral para todas as proteínas com

atividade proteolítica. As ações de proteases são extremamente seletivas, com

cada protease sendo responsável pela clivagem de muitas sequências

específicas de aminoácidos (CHOU & SHEN, 2008). As proteases somam 2% do

genoma humano e estão envolvidas em diversos processos fisiológicos, como

síntese e controle do tamanho de proteínas, liberação de hormônios, translocação

através de membranas, tunover de aminoácidos, digestão, sinalização celular,

coagulação sanguínea, fertilização, diferenciação e crescimento celular, resposta

imune, apoptose, invasão viral, controle da pressão sanguínea, oncogênese e

outros processos morfogênicos (POWERS et al., 2002; DASH et al., 2003; CHOU

& CAY, 2006).

As proteases incluem as endopeptidases e as exopeptidases, que

hidrolisam ligações peptídicas internas e N-terminais ou C-terminais,

respectivamente. Enquanto o termo proteinase é usado para descrever apenas

endopeptidases (SIMPSON, 2007; VAN DER HOORN, 2008). As proteases são

divididas de acordo com os seus mecanismos catalíticos (BOND & BUTLER,

1987). Entretanto, atualmente é sugerida uma classificação baseada no resíduo

de aminoácido das proteases ou presença de íon metálico no sítio catalítico da

enzima sendo classificadas como: serinoproteases, cisteinoproteases,

asparticoproteases, metaloproteases e mais recentes, glutamatoproteases e

treoninoprotease (RYAN, 1990; HEDSTROM, 2002; BARRET et al., 2004;

RAWLINGS et al., 2004; RAWLINGS et al., 2006). As serinoproteases constituem

o grupo de proteases melhor estudado e caracterizado (GETTINS, 2002).

2.2.1. Serinoproteases

As serinoproteases têm sítios catalíticos similares caracterizados pela

presença do resíduo de serina na posição 195. O seu sítio ativo é constituído por

uma tríade catalítica de serina, histidina e aspartato (Ser195, His57, e Asp102),

apesar de serem descritas recentemente novas tríades. Esta classe é dividida em

22 famílias (HEDSTROM, 2002; RAWLINGS et al., 2006).

A explicação mais aceita para a clivagem é a da dupla transferência:

ocorrendo a formação de um tetraedro intermediário durante a transferência de

37


prótons do resíduo Ser195 para o resíduo His57 e em seguida para o resíduo

Asp102. O resultado dessa transferência é a formação de uma carga negativa

parcial responsável pela catálise enzimática (WARSHEL et al., 1989). Os dois

passos básicos de catálise por este grupo de enzimas incluem: formação de um

éster entre o átomo de oxigênio e o grupo acil do substrato e o ataque da água ao

intermediário acil-enzima, que promove a quebra e a liberação do produto acídico,

retomando a forma não complexada da enzima (ANTÃO & MALCATA, 2005).

As massas moleculares das serinoproteases variam entre 19 e 110 kDa, mas

a maioria possui massa molecular entre 60 e 80 kDa. A atividade ótima dessas

enzimas ocorre em pH alcalino e em temperatura de 20 a 50o C (ANTÃO &

MALCATA, 2005).

As proteases serínicas são de longe a maior classe, compreendendo cerca de

1/3 do total de proteases, sendo reconhecidas como fatores importantes no

controle de vias múltiplas associadas com a coagulação, a fibrinólise, o volume de

tecido conjuntivo, a homeostase, a fertilização, a ativação do complemento e as

reações inflamatórias. Estas enzimas também estão envolvidas em muitas

doenças, sendo elas frequentemente alvos para intervenções terapêuticas

(POLANOWSKI et al., 2003).

As serinoproteases da família da tripsina são as mais versáteis e amplamente

estudadas (WU et al., 2005). Juntamente com a pepsina e a quimotripsina, a

tripsina é uma das três principais proteinases envolvidas no processo digestivo

(BONFADINI, 2003).

2.2.1.1.Tripsina

A tripsina é uma serinoprotease caracterizada por clivar especificamente a

ligação peptídica do lado C-terminal dos resíduos Lisina ou Arginina. É uma

enzima digestiva sintetizada no pâncreas exócrino e secretada como zimogênio

(forma inativa). Está presente em altas concentrações no trato gastrointestinal de

mamíferos (AMINO et al., 2001; BOYD et al., 2002).

Além da sua ação conhecida sobre a digestão intestinal, lise celular de

organismos invasores e coagulação sanguínea, as proteases pancreáticas têm

sido utilizadas, tanto na medicina de diagnóstico, como no tratamento de doenças

38


pancreáticas, além de atuar na sinalização celular agindo sobre receptores

ativados por proteases (PARs) (KONG et al., 1997).

A enzima na forma inativa é denominada tripsinogênio, e quando atinge o

duodeno se transforma em tripsina ativa devido a ação hidrolítica de uma

enteroquinase presente no suco intestinal e uma vez ativa realiza autólise.

Apresenta pH ótimo em torno de 8 e temperatura ótima de 37 oC (TAKAHASHI et

al., 2007).

Assim, as serinoproteases são indispensáveis para os processos fisiológicos

em animais, e devem ser mantidas sob controle estrito a fim de garantir a

homeostase do meio. O nível basal de controle é normalmente alcançado pela

expressão/secreção, pela ativação da pró-protease e pela degradação de

enzimas maduras. Contudo, quando não são controladas, podem representar um

risco em potencial, destruindo componentes proteicos celulares e teciduais. O

segundo nível de regulação, após a sua ativação, ocorre pela inibição de sua

atividade proteolítica por proteínas naturais existentes dentro e fora das células,

que são chamadas de inibidores de proteases (HOLZER & HEINRICH, 1980;

NEURATH, 1993; KHAN & JAMES, 1998; MÉTAYER et al., 2002).

2.3. INIBIDORES DE PROTEASES

Os inibidores de proteases são substâncias proteicas que interagem

específica e reversivelmente com diferentes enzimas proteolíticas, competindo

com o substrato pelo sítio ativo da enzima, formando um complexo estável que

limita ou inibe completamente a atividade proteolítica da protease

(RICHARDSON, 1991; GATEL, 1994; LIENER, 1994; LASKOWSKI & QASIM,

2000; TALYZINA & INGVARSSON, 2006; LINGARAJU & GOWDA, 2008). O

número de inibidores de proteinases isolados e identificados até agora é

extremamente grande. A maioria dos inibidores conhecidos e caracterizados está

relacionado com proteinases serínicas (PRAKASH & MURTHY, 1997; ARAÚJO et

al., 2005; KATUNUMA et al., 2003; SANO et al., 2005; ISHIHARA et al., 2006;

CHEVREUIL et al., 2011).

2.3.1. Inibidores de serinoproteases

39


Os inibidores de serinoproteases são os mais abundantes e amplamente

distribuídos em plantas (além de serem encontrados em animais e

microorganismos) e estão relacionados com a regulação das proteinases

endógenas durante a dormência das sementes, imobilização das proteínas de

reserva, proteção contra enzimas proteolíticas de parasitas e insetos e como

proteínas de reserva (XAVIER-FILHO & CAMPOS, 1989; HAQ et al., 2004; ZHAO

et al., 2005).

O provável papel dos inibidores de proteases na defesa vegetal foi

investigado em 1947, quando Michael & Standish observaram que as larvas de

certos insetos não eram capazes de se desenvolver normalmente sobre os

produtos de soja (MIGLIOLO et al., 2010).

Estudos de sequenciamento e cristalografia de raios-X têm mostrado que

esses inibidores apesar de não serem homólogos, em sua maioria, interagem por

um mesmo “mecanismo padrão” e compreendem pequenas proteínas de 29 a 190

aminoácidos e possuem um loop de ligação exposto em conformações bem

características (LASKOWSKI & KATO, 1980; BODE & HUBER, 1992).

Os inibidores de serinoproteases podem ser agrupados com base na

similaridade estrutural, primária e tridimensional, e são classificadas em pelo

menos 18 famílias; de origem animal: família Kunitz (BPTI), família Kazal, família

do inibidor de Ascaris, família antileucoproteinase/Queloniana, família das

serpinas, família hirudina; Vegetal: família Kunitz (STI), família Bowman-Birk,

família da batata 1, família da batata 2, família do inibidor de tripsina de centeio,

família do centeio; Microorganismos: família do inibidor de subtilisina

(LASKOWSKI & QASIM, 2000). Nos vegetais as famílias melhor caracterizadas

são Kunitz e Bowman-birk.

A família Kunitz apresenta uma ou duas cadeias polipeptídicas, em geral,

com massa molecular em torno de 18 a 24 kDa, correspondendo a

aproximadamente a 170 a 200 resíduos de aminoácidos, geralmente com quatro

resíduos de cisteína (Cys), que formam pontes dissulfeto, proporcionando

estabilidade a estrutura proteica. Em geral, estes inibidores possuem apenas um

sítio reativo. Devido a esta característica estrutural, eles são conhecidos como

inibidores de “uma cabeça”. Por outro lado, poucos representantes desta família

foram caracterizados como inibidores que têm dois locais para duas enzimas

40


diferentes (RICHARDSON, 1991; OLIVA, 2000; CARLINI & GROSSI-DE-AS,

2002; SANTOS et al., 2011).

A família Bowman-Birk são proteínas globulares solúveis caracterizadas

por possuírem massa molecular relativamente pequena, entre 8 e 9 kDa, com

cerca de 70 a 90 aminoácidos e um alto conteúdo de resíduos de Cys, formando

7 pontes dissulfeto. Os inibidores dessa família são geralmente do tipo “duas

cabeças”, ou seja, são capazes de formar complexos de estequiometria de 1:1

com diferentes proteases em sítios reativos independentes (RICHARDSON, 1991;

SANTOS et al., 2011).

Os inibidores de serinoproteases são específicos para a diversidade de

serinoproteases expressas nos organismos e de acordo com sua forma de

interação podem ser classificadas em: inibidores canônicos, os quais interagem

de forma fraca com a enzima, de maneira não covalente e bloqueiam diretamente

o sítio alvo, sem alterações conformacionais; inibidores não canônicos, que

constituem ligações fortes e específicas, inibindo o sítio ativo da enzima pela

ligação ao N-terminal do inibidor; inibidores da subfamília das serpinas, que

formam um complexo covalente acil-enzima, provocando uma forte alteração

conformacional no inibidor ocasionando a quebra do sítio ativo da protease

(KROWARSCH et al., 2003; OTLEWSKI et al., 2005; HWANG et al., 2009).

2.3.2. Aplicações dos inibidores de proteases

Nas plantas, como já descrito, os inibidores, apresentam papel de

proteção, envolvidos em processos de defesa contra ataque de pragas e/ou

patógenos e atuam também como proteínas de reserva e como reguladores de

enzimas endógenas (PARK et al., 2001; LAWRENCE & KOUDAL, 2000).

Devido a ampla ação em proteases do organismo, as proteínas com atividades

inibitórias são relevantes em diferentes processos fisiológicos e patológico, como

coagulação (OLIVA et al., 2000), distúrbios hemorrágicos e angiogênese (SHAH

& DINAPOLI, 2007), empregados em terapias anti-retroviral altamente ativa, o que

tem aumentado a expectativa de vida de pacientes com HIV (ASZTALOS et al.,

2006; YENI, 2006; MOLINA & HILL, 2007;) e supressão de eventos inflamatórios

(FOOK et al., 2005; RIBEIRO et al., 2010).

41


Na biologia da reprodução a função fisiológica e bioquímica dos inibidores

de serinoprotease é muito ampla, mas ao mesmo tempo não muito clara. Foi

reportada a existência de inibidores de proteases nas glândulas sexuais

acessórias como um protetor do tecido (LAI et al., 1991), na proteção da barreira

hematotesticular, no controle de enzimas proteolíticas (MÉTAYER et al., 2002),

nos mecanismos envolvidos no processo de fertilização: capacitação espermática,

controlando ação sobre os receptores de cálcio (Ca+2) (BHATTACHARYYA et al.,

1986).

Evidências epidemiológicas demonstram que a atividade de inibidores diminui

a incidência dos principais tipos de câncer em humanos, inclusive metástase,

quando esta população consome alimentos que os contenham (BARR et al.,

2007; MANELLO, 2006). Dessa forma, foi verificado que eles apresentam efeito

sobre a primeira etapa do processo de transformação em células tumorais.

Especialmente, os da família Bowman-Birk que podem atuar em diferentes

cânceres e carcinomas induzidos por agentes químicos e físicos (KENNEDY,

1998; KENNEDY & LITTLE, 1991; HUANG et al., 1999). Ainda, foi relatado efeitos

de um inibidor de protease Bowman-Birk, com atividade anti-tripsina e anti-

quimiotripsina - BTCI, purificado a partir de sementes de Vigna unguiculata, sobre

as células MCF-7 de câncer de mama, e este apresentou efeito anticarcinogênico

(JOANITTI et al., 2010).

Também foi visto que o concentrado de inibidor Bowman-Birk (BBIC), de

extrato de soja é eficaz no tratamento da colite em ratos e tem sido utilizado em

numerosos ensaios clínicos (LICHTENSTEN et al., 2008).

Para nutrição humana os inibidores de serinoproteases possuem muito bem

relatados na literatura uma relação estreita com a propriedade antinutricional,

provocando desnutrição proteica e alterações em órgãos envolvidos no processo

digestivo como intestino e pâncreas (RACKIS & GUBMANN; 1982; PEACE et al.,

1991; LIENER, 1994; BRUNE et al., 2010).

Apesar do estigma do inibidor proteico atuar como fator antinutricional,

dependendo da dose e tempo de uso avaliações do seu efeito a partir de

parâmetros bioquímicos como: (glicose (GL), triglicerídeos (TG), colesterol total

(CT), lipoproteínas de alta-densidade (HDL), lipoproteínas de baixa-densidade

(LDL), alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), gama

42


glutamil transferase (GGT), albumina, globulina, proteínas totais e proteína C

reativa) e testes que garantam a digestão normal e consequentemente o

aproveitamento proteico (ROY & SCHNEEMAN, 1981; SATO et al., 2002; HUANG

et al., 2008);

O inibidor de tripsina, tanto natural quanto sintético, também tem apresentado

papéis importantes, bem como induzindo a redução do ganho de peso em

animais e humanos por saciedade e não por desnutrição ou por prejudicar a

digestão normal (McLAUGHLIN, 1983; CALAM et al., 1987; HILL et al., 1990;

GARTHOFF et al., 2002; KOMARNYTSKY et al., 2011; NAKAJIMA et al., 2011;

CHEN et al., 2012).

Quanto ao efeito sobre o apetite, um inibidor sintético da tripsina [N, N-dimetil-

4 - (4-guanidino-benzililoxi)-fenil acetato de metano-sulfato (DGPM)] diminuiu o

consumo de alimentos diariamente de forma dose-dependente e ocasionou a

diminuição do tamanho médio de refeição em ratos magros e obesos, mas a

resposta foi maior nos ratos obesos (McLAUGHLIN, 1983).

Um extrato de batata (Potein) contendo 60% de carboidratos e 20% de

proteínas incluindo proteínas inibidoras de tripsina foi utilizado num estudo e

analisado em ratos em jejum. Potein suprimiu o consumo de alimentos por meio

da secreção de CCK induzida por estimulação direta sobre as células

enteroendócrinas e da inibição da tripsina luminal (NAKAJIMA et al., 2011). Em

2012, Potein®, como produto registrado (número 79075065), foi testado e

comparado com outras fontes proteicas, em ratos, para avaliar o consumo

alimentar e os níveis de CCK. A redução do consumo alimentos nos ratos com

uso de Potein® foi maior do que os que receberam caseína ou hidrolisado de soja

β-conglicinina. Os níveis de CCK foram aumentados após a administração de

Potein®. Este efeito supressor do apetite foi atenuado com a administração de

um antagonista do receptor de CCK (devazepide). Assim, os resultados indicam

que o Potein® suprimiu o consumo de alimentos em ratos e comprova que foi por

meio da secreção de CCK (CHEN et al., 2012).

Ainda a adição do inibidor de proteinase extraído de batata (POT II) na

alimentação de indivíduos reduziu significativamente a ingestão calórica em

17,5%. Associado a este efeito foi verificado o aumento dos níveis de CCK. Estas

descobertas sugerem que a CCK endógena podem ser importantes no controle

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?cmd=search&db=PubMed&term=%20Komarnytsky%20S%5Bauth%5D

43


do consumo de alimentos e que o inibidor de protease podem ter potencial

terapêutico para reduzir o consumo de alimentos (HILL et al., 1990).

2.3.3. Fontes de inibidores de serinoproteases

Os inibidores de serinoproteases são muito comuns no reino vegetal

(XAVIER-FILHO & CAMPOS, 1989). Podendo, além das plantas, ser encontrados

nos mais diversos organismos: microorganismos e animais. Nas plantas, podem

ser encontrados em tecidos de reservas, tais como sementes, tubérculos, folhas e

frutos (MELO et al,, 2002; ARAÚJO et al., 2004).

Um inibidor proteico com elevada atividade contra serinoprotease do tipo

tripsina foi purificado a partir de sementes de tamarindo (Tamarindus indica

L.)(ARAÚJO et al., 2005).

2.4. TAMARINDO

O tamarindo (Tamarindus indica L.) pertence à família Leguminosae

(leguminosas), também conhecida como Fabaceae e a subfamília

Caesalpinioideae, originário da África tropical, de onde se dispersou por todas as

regiões tropicais. É uma árvore frutífera e bastante decorativa, podendo chegar

aos 25 m de altura. Seu fruto é uma vagem alongada, com 5 a 15 cm de

comprimento, com tegumento pardo-escuro, lenhoso e quebradiço, contendo 3 a

8 sementes envolvidas por uma polpa parda e ácida, como mostrado na Figura 3

(DONADIO, 1988).

Figura 3. Fruto, polpa, sementes e sementes descascadas de Tamarindo (Tamarindus indica L.)

44


O fruto é constituído por semente (33,9%), celulose (55,0%) e outras fibras

(11,1%). Sementes de tamarindo têm muitas utilidades. Seu principal uso, no

entanto é industrial, em que o pó do núcleo da semente (TKP) é utilizado na

indústria têxtil.

O pó de TKP cru e torrado, desengordurados, foram utilizados para o

isolamento de proteínas. O rendimento de proteínas para o pó desengordurado foi

de 38,3, e 33,3% para o cru e o torrado, respectivamente. As sementes de

tamarindo são ricas em ácido glutâmico (18-5%), ácido aspártico (11,6%), glicina

(9,1%) e leucina (8-2%), mas deficiente em aminoácidos contendo enxofre

(metionina e cisteína totalizam apenas 0,63%). As percentuais de aminoácidos

hidrofóbicos (alanina, valina, leucina, isoleucina e fenilalanina) e aminoácidos

hidrofílicos (lisina, ácido aspártico, histidina, ácido glutâmico, e arginina) são

28,2% e 42,3%, respectivamente (BHATTACHARYA et al., 1994).

O pó é também recomendado como um recurso valioso na diarreia e

disenteria, para a alimentação de porcos, além de base nas indústrias cosmética

e farmacêutica, e como curativo contra reumatismo. As proteínas de TKP torrado

pode ser usado para preparar pão e biscoito fortificado. Outros possíveis usos da

proteína o núcleo da semente incluem o desenvolvimento para crescimento do

pão, preparações de bebidas, e gel de proteínas (BHATTACHARYA et al., 1994).

O tamarindeiro é uma espécie exótica, mas que se adaptou bem ao clima

do Nordeste e sua polpa é bastante utilizada no preparo de sucos, doces,

sorvetes e outros. Além disso, praticamente todas as outras partes da planta têm

uso na medicina popular e apresentam inúmeras aplicações terapêuticas em

humanos, dentre eles laxante, digestivo, terapia do diabetes e outros

(KOMUTARIN et al., 2004; FUNKE & MELZIG, 2006; GURJÃO 2006).

Em estudos in vitro demonstrou-se que diferentes plantas, especialmente

as tradicionalmente usadas na terapia comum de diabetes na África e na Europa,

são capazes de inibir a α-amilase, a qual é responsável pela quebra dos

oligossacarídeos em monossacarídeos, os quais são absorvidos, e quando em

excesso causam a hiperglicemia. Uma inibição de atividade de α-amilase da

ordem de 90% foi observada com o extrato das folhas de Tamarindus indica L.

Para quantificar o grau de inibição foi utilizado acarbose (IC50: 23,2 mM) (FUNKE

& MELZIG, 2006).

45


Ainda sobre o tamarindo é atribuída à ação laxativa, devido à presença

dos ácidos orgânicos e das pectinas (SOARES, 2008). Em experimentos in vivo

com ratos a eliminação de fezes mostrou-se aumentada nos grupos tratados com

cápsulas e geleias de Tamarilax® e Naturetti ®, com aumento da incidência de

fezes pastosas. Os resultados indicam que os dois fitoterápicos, Tamarilax ® e

Naturetti® contendo Tamarindus indica L., na forma de cápsulas e geleia

apresentam efeitos laxantes e/ou reeducadores intestinais semelhantes, o que

indica que são equivalentes (MELLO et al., 2006).

A partir de sementes de tamarindo um inibidor de tripsina (ITT2) foi isolado

e purificado. Este apresentou uma massa molecular de 20 kDa, um mecanismo

de inibição não-competitivo e rendimento de 2,24%. Com o ITT2 foram realizados

ensaios de inibição para as enzimas do sistema digestivo de insetos, mostrando

inibição para Rhyzopherta dominica, Anthonomus grandiss e Ceratitis capitata

não sendo detectada inibição para os extratos enzimáticos das larvas de Zabrotes

subfasciatus, Acantoscelides obtectus e Callosobruchus maculatus. Também

foram feitos ensaios de inibição para elastase, quimiotripsina (proteases

serínicas), papaína e bromelina (proteases cisteínicas), não sendo detectada

inibição para essas enzimas, mostrando alta especificidade do inibidor pela

tripsina bovina (ARAÚJO et al., 2002). Diante da alta especificidade e bom

rendimento, neste estudo o inibidor de tripsina de tamarindo foi novamente

purificado a fim de serem investigadas novas aplicações relacionadas ao

consumo alimentar e ganho de peso.

46


3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL

Avaliar os efeitos do inibidor de tripsina presente na semente de tamarindo

(Tamarindus indica L.) na redução do ganho de peso, alterações bioquímicas e

morfohistológicas em ratos wistar.

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Isolar e purificar o inibidor de tripsina presente em sementes de tamarindo;

Avaliar o consumo alimentar em ratos wistar submetidos à dieta rica em inibidor

de tripsina;

Verificar o ganho ponderal em ratos wistar submetidos à dieta rica em inibidor de

tripsina;

Investigar parâmetros bioquímicos em ratos wistar submetidos à dieta rica em

inibidor de tripsina;

Avaliar os efeitos histopatológicos em órgãos de ratos wistar submetidos à dieta

rica em inibidor de tripsina;

Avaliar o efeito da dieta rica em inibidor de tripsina sobre o nível plasmático de

CCK em ratos wistar .

47


4. METODOLOGIA

4.1. MATERIAIS

4.1.1. Sementes de tamarindo

As amostras dos frutos de tamarindo foram obtidas do comercio de Natal-

RN, para obtenção das sementes. Estas foram retiradas da polpa e descascadas

com o uso de estiletes. A qualidade e a maturidade dos frutos foram

consideradas no momento da escolha.

4.1.2. Animais

Ratos adultos jovens, machos da linhagem wistar (150 g – 180 g) em torno de

4 semanas foram obtidos e mantidos em gaiolas no biotério da Universidade

Potiguar, UNP, sob temperatura de (23 ± 2°C) e ciclo claro-escuro de 12 horas

controlados e umidade entre 45 a 55%. Todos os procedimentos experimentais

foram apreciados pelo Comitê de Ética para Uso de Animais (CEUA) da UFRN

(PROTOCOLO N.º 011/2010).

4.1.3. Reagentes

As soluções, substratos, enzimas, Kits e demais reagentes essenciais ao

desenvolvimento da pesquisa foram de grau analítico, obtidos e utilizados no

Laboratório de Química e Função de Proteínas Bioativas Prof. Mauricio Pereira de

Sales, do Departamento de Bioquímica da UFRN.

4.1.4. Equipamentos

Espectrofotômetro U-2000 (HITACHI®) Leitor de Elisa (BIO-TEK®)

Micro centrífuga 5410 (EPPENDORF); Banho-Maria Te 056 (TECNAL)

Microscópio biológico molecular E-100 (NIKON) Liofilizador L108 (TECNAL)

Balança analítica eletrônica AS 210 (SCIENTECH) pHmetro (PHTEK)

Agitador magnético TE-081 (TECNAL) Centrífuga CR 21 (HITACHI)

Sistema de eletroforese unidimensional (BIO-RAD®);

4.2 MÉTODOS

48


DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Foram realizados dois experimentos com animais para o desenvolvimento

das metodologias in vivo descritas, tendo como objetivo responder as perguntas

relacionadas ao efeito do ITT2 no ganho de peso, consumo alimentar, saciedade e

alterações sobre parâmetros bioquímicos, histomorfológicas e níveis de CCK,

visto no esquema abaixo (Figura 4).

Figura 4. Organograma com as fases do delineamento experimental

4.2.1. Purificação do inibidor de tripsina de sementes de tamarindo

49


4.2.1.1. Obtenção da farinha

As sementes foram trituradas em um moinho industrial refrigerado (6 oC) e

em seguida peneiradas para obtenção de uma farinha de granulação fina em

torno de 40 mesh.

4.2.1.2. Preparo do extrato bruto

As proteínas solúveis da farinha de semente de tamarindo foram extraídas

em tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, na proporção de 1:10 (g/mL), em agitação

constante por 2 horas à temperatura ambiente. Em seguida, o material foi

centrifugado a 8000 x g por 30 minutos a 4 oC. O precipitado foi descartado e o

sobrenadante (extrato bruto) submetido a um fracionamento com sulfato de

amônio.

4.2.1.3. Fracionamento com sulfato de amônio e precipitação com acetona

O extrato bruto foi submetido a um fracionamento com sulfato de amônio

na faixa de saturação de 0-30%. O precipitado resultante da saturação foi

denominado fração I e ressuspenso em Tris-HCl 50 mM contendo NaCl 150 mM e

dialisado durante 48 h, nas primeiras 24 h contra água destilada e, em seguida,

contra tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5. O sobrenadante, ou fração II, foi

submetido à precipitação com acetona 1:2 (v/v), sendo denominado de fração PA.

4.2.1.4. Determinação da concentração de proteínas

O teor de proteínas ao longo do processo de purificação foi determinado

pelo método de Bradford (1976), utilizando como padrão a albumina sérica

bovina.

4.2.1.5. Obtenção do retido em tripsina da fração PA por cromatografia de

afinidade em matriz de tripsina-sepharose 4B

7 mg da fração PA obtidos no item 4.2.1.3. foram submetidos a

cromatografia de afinidade em matriz deTripsina-Sepharose 4B. A coluna (10 cm

X 1,5 cm) foi equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5. As proteínas

adsorvidas na matriz foram eluídas com solução de HCl 5 mM e coletadas em

alíquotas de 3 mL a um fluxo de 0,5 mL/min. O perfil proteico foi acompanhado

50


por espectrometria a 280 nm. Após eluição do material retido, denominado RPA,

foi realizado ensaios de inibição de tripsina. RPA, após confirmação da inibição,

foi submetido à diálise. O inibidor purificado foi liofilizado, ressuspendido em água,

em um volume mínimo e denominado ITT2 (inibidor de tripsina de tamarindo).

4.2.2. Avaliação do grau de pureza e estimativa da massa molecular por

eletroforese em gel de poliacrilamida descontínuo e desnaturante (SDS-

PAGE)

20 µL (20 µg) de PA, 20 µL (5 µg) de RPA e 20 µL (10 µg) ITT2 foram

submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% em presença de SDS,

de acordo com a metodologia descrita por Laemmli (1970). O gel de separação foi

preparado com 1,25 mL de acrilamida-bisacrilamida 30%; 1,25 de tampão Tris-

HCl 1,5 M e pH 8,8; 2,425 mL de água destilada; 50 µL de dodecil sulfato de sódio

(SDS) 10%, 5 µL de TEMED concentrado e 25 µL de persulfato de amônio 30%.

O gel de concentração continha 0,33 mL de acrilamida-bisacrilamida; 30%; 625 µL

de tampão Tris-HCl 0,5 M e pH 6,8; 1,5 mL de água destilada; 25 µL de SDS

10%; 5 µL de TEMED concentrado e 12,5 µL de persulfato de amônio. O tampão

de corrida consistiu de Tris 0,025 M, glicina 192 mM e SDS 10%. Uma vez diluída

em tampão de amostra Tris 0,0625 M, SDS 2%, glicerol 10% v/v, 0,01% de azul

de bromofenol, num volume de 20 µL, PA, RPA, ITT2 foram aplicados no gel

(10x14 cm, com espaçadores de 0,75 mm), o qual foi submetido a uma corrente

constante de 20 mA por, aproximadamente 2 horas. O gel foi corado em solução

de Coomasie blue R 250 1%, etanol 40% e ácido acético 10% em água. As

bandas proteicas foram descoradas após a imersão do gel em solução

descorante (etanol 30% e ácido acético 10%) para visualizar o material purificado.

O marcador de massa molecular utilizado foi o Rainbow® Pharmacia (com

massas de 250, 160, 105, 75, 50, 35, 30, 25, 15 e 10 kDa).

4.2.3. Atividades anti-tripsina do extrato e frações proteicas

A atividade anti-tripsina das frações foram determinadas de acordo com

Kakade et al. (1974). Uma alíquota de 20 µL da solução de tripsina bovina (0,3

mg/mL HCl 2,5 mM) foi pré-incubada com 560 µL de tampão Tris-HCl 0,05 M, pH

51


7,5, 120 µL de HCl 2,5 mM e 100 µL de EB, PA, RPA, ITT2 por 15 minutos a 37oC.

Após esse período a reação foi iniciada adicionando-se 500 µL de solução de

substrato específico (BApNA 1,25 mM). A reação processou-se por mais 10

minutos nas mesmas condições de incubação, e em seguida foi interrompida

adicionando-se 120 µL de solução de ácido acético 30%. Todos os ensaios foram

feitos em triplicatas e provas em branco foram realizadas. A absorbância foi

medida a 410 nm. A unidade de inibição (UI) foi definida como a quantidade de

inibidor capaz de diminuir em 0,01 o valor de absorbância no ensaio anti-tríptico.

Os resultados foram expressos em UI/mg de proteína.

4.2.4. Avaliação do consumo alimentar, ganho de peso, alterações

bioquímicas e histopatológicas em órgãos de ratos wistar submetidos à

dieta rica em ITT2 (Experimento I)

4.2.4.1. Dietas

As dietas para os ratos no experimento I seguiram as recomendações da AIN-

93G de acordo com Reeves et al. (1993). Para melhor controle ainda foi realizado

um grupo com dieta AIN-93G mais água por gavagem, denominado SG, a fim de

estabelecer um controle da influência do processo da gavagem. Todas as dietas

AIN-93G foram oferecidas aos animais de todos os grupos por via oral, enquanto

que o ITT2 e a água, somente ao grupo SG, foram administrados por gavagem no

mesmo horário em que às dietas AIN-93G eram fornecidas oralmente. Para o

experimento, além da dieta padrão, foram utilizadas as dietas aprotéica e teste

(ITT2 25), como descritas na Tabela 2. O consumo das dietas e de água por via

oral foi controlado diariamente, assim como o ganho de peso por animal em todos

os grupos. A urina e as fezes foram coletas por animal, identificadas e mantidas

em freezer para posterior análise.

52


Tabela 2. Composições das dietas utilizadas na avaliação do consumo alimentar

em ratos wistar oferecidas durante 11 dias.

Dieta

Padrão (S)

Dieta

Padrão +

Água

(SG)

Dieta

Aprotéica

(NP)

Dieta

Teste

(ITT2 25)

Inibidor de tripsina (ITT2) por

gavagem -

-

-

25 mg/Kg do

animal

Água por gavagem - 1 mL - 1 mL

Amido 397.486 g 397.486 g 397.486 g

397,486 g

Amido dextrinizado 132 g 132 g 132 g 132 g

Bitartarato de colina 2,5 g 2,5 g 2,5 g 2,5 g

Caseína 200 g 200 g -

200 g

Celulose 50 g 50 g 50 g

50 g

L-Cistina 3,0 g 3,0 g -

3,0 g

Mix de Minerais 35 g 35 g 35 g

35 g

Mix de Vitaminas 10 g 10 g 10 g

10 g

Óleo de soja 70 g 70 g 70 g

70 g

Sacarose 100 g 100 g 100 g

100 g

Terc Butilhidroquinona 0,014 g 0,014 g 0,014 g

0,014 g

4.2.4.2. Animais

Depois de 3 dias de adaptação nas gaiolas metabólicas, consumindo dieta

padrão, seguindo as recomendações de Komarnytsky et al. (2011), os ratos no

experimento I foram distribuídos individualmente e casualmente em 4 lotes:

tratados com dieta padrão, AIN-93G (S; n = 6); dieta AIN-93G mais água por

gavagem (1mL/dia) (SG; n = 6); dieta aprotéica (NP; n = 6); e dieta AIN-93G mais

inibidor de tripsina de tamarindo 25 mg/kg por gavagem (1 mL/dia) (ITT2 25; n =

6). Oferecidas durante 11 dias aos ratos.

4.2.4.3. Avaliação do consumo alimentar


53


Depois de estabelecido o padrão de consumo alimentar habitual de cada

animal (quanto cada rato consome) durante os 3 dias de adaptação, os animais

foram submetidos aos testes. O consumo alimentar foi analisado pelo peso (g) da

dieta em balança calibrada, ou seja, era pesada a dieta oferecida ao animal e

posteriormente era pesado a sobra dessa dieta. Dessa forma foi obtida

diariamente a diferença entre a dieta fornecida (antes do consumo) e a dieta

consumida: Consumo Alimentar por dia (g) = Dieta Fornecida – Dieta restante e o

resultado foi expresso feita a média do consumo alimentar (g) de cada dia por

grupo, considerado o padrão de consumo alimentar habitual de cada animal.

4.2.4.4. Evolução do peso corporal

Os ratos foram pesados individualmente em balança calibrada, diariamente

por um período de 11 dias. Dessa forma, foi feita a média de peso (g) diariamente

para cada grupo de animal.

4.2.4.5. Determinação da digestibilidade proteica in vivo

Para a determinação da digestibilidade proteica, as dietas foram oferecidas

aos 24 ratos (6 dieta S, 6 dieta SG, 6 dieta NP e 6 dieta ITT2 25) em gaiolas

metabólicas. As fezes foram coletadas no 7o, no 10o e no 14o dia (final do

experimento), em recipientes individuais, e mantidas sob refrigeração.

Em seguida as fezes foram secas em estufa com circulação de ar a 105 oC,

por 24 h, logo resfriadas, pesadas e trituradas em multiprocessador para

determinação do teor de nitrogênio pelo método de Kjeldahl (1883), que se baseia

na degradação química da proteína e conversão do nitrogênio total a íon amônio.

A digestibilidade verdadeira foi calculada, medindo-se a quantidade de

nitrogênio ingerida na dieta, a quantia excretada nas fezes e a perda metabólica

no material fecal. Esta última foi estimada pelo montante de nitrogênio excretado

pelos ratos alimentados com dieta livre desta substância (AMAYA et al., 1991).

A digestibilidade aparente (Da) é calculada conforme a fórmula:

Da: NI – NF x 100 NI

NI: nitrogênio ingerido

54


NF: nitrogênio fecal

A digestibilidade verdadeira (Dv) é determinada pela medida do nitrogênio

ingerido com a dieta e nitrogênio eliminado nas fezes, levando-se em

consideração o nitrogênio proveniente do próprio animal que é excretado nas

fezes juntamente com a proteína de origem alimentar não digerida. Sendo

calculada da seguinte maneira:

Dv: NI – NFa x 100 NI

Onde:

Dv: digestibilidade verdadeira

NI: Nitrogênio ingerido

NFa: Nitrogênio fecal de origem alimentar = NF - NFe

NFe: Nitrogênio fecal de origem endógena

4.2.4.6. Análises bioquímicas séricas I

Ao término dos testes, os animais foram submetidos a jejum por 12 a 15

horas, e anestesiados com xilazina 2% e quetamina 5% e eutanasiados. O

sangue foi coletado por punção cardíaca e armazenado em tubos Falcon. O soro

foi separado por centrifugação a 3000 x g por 10 minutos e utilizado para as

determinações de glicose (GL), de triacilglicerol (TG), de colesterol total (CT), e de

lipoproteínas de alta-densidade (HDL). Todas as análises bioquímicas foram

realizadas no Laboratório de Análises Clínicas e Toxicológicas da Universidade

Potiguar, UNP. O método empregado nas dosagens foi o enzimático-colorimétrico

(Kit CELM®, São Paulo, Brasil). As lipoproteínas de baixa densidade (LDL) foram

calculadas segundo a fórmula de Friedwald (1972), LDL= COL-(HDL+VLDL),

sendo VLDL= triacilglicerol/5, quando TG menor ou igual a 400 mg/dL. Nas

concentrações de TG superiores a 400 mg/dL, as concentrações de VLDL foram

estimadas pelo valor médio do grupo em questão. As leituras

espectrofotométricas foram realizadas em espectrofotômetro U-2000 (HITACHI).

Amostras sanguíneas também foram submetidas aos ensaios enzimáticos

para alanina amino transferase (AST) e aspartato amino transferase (ALT)

(Labtest diagnostic kit transferases). Os resultados foram avaliados considerando

55


como referência os valores do grupo controle, entretanto estes valores

encontram-se dentro dos intervalos normais estabelecidos para ratos wistar em

outros biotérios citados na literatura (DANTAS et al., 2006, GIKNIS; CLIFFORD,

2008, MELO et al., 2012), como demonstrado na Tabela 3.

Tabela 3. Parâmetros bioquímicos de ratos Wistar machos de diferentes

fontes, para padrões de referência.

Padrão de

referência 1

Padrão de

referência 2

Padrão de

referência 3

Glicose (mg/dL) 150 – 207,5 79 – 144 79 – 144

Colesterol total (mg/dL) 98,9 – 110,1 37 – 85 55 – 79

Triglicerídeos (mg/dL) 110 – 178 42 – 160 42 – 160

Alanina aminotransferase (U/L) 74 – 143 36 – 58 36 – 58

Aspartato aminotransferase (U/L) 18 – 45 81 – 180 81 – 180

Albumina (mg/dL) 2,8 – 6,2 2,7 – 3,2 2,7 – 3,2

Fonte: DANTAS et al., (2006) (1), CLIFFORD & GIKNIS, (2008) (2), MELO et al., (2012) (3)

4.2.4.7. Análise histopatológica

Também ao término dos testes, depois que os animais foram anestesiados

com xilazina 2% e quetamina 5%, eutanasiados e o sangue coletado, a cavidade

tóraco-abdominal foi aberta e na sequência ocorreu a retirada dos órgãos

(intestino, pâncreas, estômago e fígado). Todas as análises histopatológicas

foram realizadas no Laboratório de Histologia do Departamento de Morfologia da

UFRN, sob a orientação e a responsabilidade do Prof. Dr. Raimundo F. de Araújo

Junior. Foram feitos cortes longitudinais de aproximadamente 5 mm de espessura

nos órgãos para posterior análises histológicas. Os órgãos foram fixados por 24 h

em solução de formol 10%, bouin, em um volume 20x o da peça.

Em seguida as peças passaram por um processamento, inicialmente

realizaram-se os seguintes passos, por 1h cada: desidratação com álcool 70o,

seguido de álcool 80o, álcool 90o, álcool absoluto, sendo esta última etapa

repetida mais duas vezes. Em seguida realizou-se a clarificação com banho em

solução de xilol por 1h, sendo repetido mais duas vezes. Posteriormente realizou-

se a impregnação com parafina por 1h, sendo repetido mais duas vezes.

56


Fez-se a inclusão de emblocamento, deixando-se a face de corte e depois

se fez uma microtomia, com corte de 3 a 5 µm. Após o corte, o material foi

colocado sobre a lâmina para coloração seguindo a sequência, na qual cada

processo foi realizado por 5 minutos: xilol, xilol, álcool absoluto, álcool 90o, álcool

800, álcool 70o, agua destilada, hematoxilina, água corrente, eosina, álcool 80o,

álcool 90o, álcool absoluto, álcool absoluto, álcool absoluto, xilol.

4.2.5. Avaliação do consumo alimentar em tempos específicos, das

alterações bioquímicas e de CCK em ratos wistar submetidos à dieta rica em

ITT2 (Experimento II)

4.2.5.1. Dietas

As dietas para os ratos no experimento II também seguiram as

recomendações da AIN-93G de acordo com Reeves et al., (1993), sendo

utilizada a Dieta SG (AIN-93G + 1mL de Água por gavagem); Dieta C (AIN-93G +

1mL de Caseína 25 mg/kg por gavagem); Dieta IS (AIN-93G + 1 mL de Inibidor de

Tripsina de Soja 25 mg/kg por gavagem); Dieta ITT2 25 (AIN-93G + 1 mL de

Inibidor de Tripsina de tamarindo 25 mg/kg por gavagem) e Dieta ITT2 50 (AIN-

93G + 1mL de Inibidor de Tripsina de tamarindo 50 mg/kg por gavagem). Todas

as dietas AIN-93G foram oferecidas aos animais de todos os grupos por via oral,

enquanto que o ITT2, o inibidor de tripsina de soja, a caseína, e a água, somente

ao grupo SG, foram administrados por gavagem no mesmo horário em que às

dietas AIN-93G eram fornecidas oralmente.

4.2.5.2. Animais

Para avaliação do consumo alimentar em tempos específicos, e para

verificar alterações bioquímicas e de CCK, no experimento II ratos wistar foram

distribuídos individualmente e casualmente em 5 lotes em gaiolas metabólicas.

Inicialmente os animais passaram por 3 dias de adaptação ambiental e alimentar,

e posteriormente foram submetidos as dietas: Dieta SG (n = 6); Dieta C (n = 6);

Dieta IS (n = 6); Dieta ITT2 25 (n = 6) e Dieta ITT2 50 (n = 6). O consumo das

dietas e de água por via oral foi controlado diariamente, assim como o ganho de

peso por animal em todos os grupos.

57


4.2.5.3. Avaliação do consumo alimentar

Depois de estabelecido o padrão de consumo alimentar habitual de cada

animal (quanto cada rato consome) durante os 3 dias de adaptação foi avaliada

as alterações no consumo alimentar 1, 2 e 16 horas, após a administração oral de

uma dose de cada teste, mantidos com 100 g da dieta padrão (AIN-93G), por um

período de 11 dias, conforme os grupos: Dieta SG ; Dieta C; Dieta IS; Dieta ITT2

25 e Dieta ITT2 50. Antes da administração oral das dietas, os animais ficaram de

jejum durante um período de 8 horas. Os cálculos foram realizados de acordo

com o mesmo protocolo descrito no item 4.2.4.3.

Os resultados foram expressos em percentual (%), sendo considerado

100% a média do padrão de consumo alimentar habitual dos ratos antes dos

testes (3 dias). Então, após os testes foram obtidas as percentagens de

diminuição do consumo em (%).

4.2.5.4. Análises bioquímicas séricas II

Após 1 hora da administração dos testes, no último dia do experimento

(14o), os ratos foram anestesiados com xilazina 2% e quetamina 5%, e

eutanasiados. O sangue foi coletado por punção cardíaca e armazenado em

tubos Falcon. Foram realizadas as mesmas determinações e as análises

seguiram os mesmos protocolos descritos no item 4.2.4.6.

A gama glutamil transferase foi avaliada por meio de dosagem sanguínea,

método de Szasz, (1969) modificado. Para dosagem de proteínas totais foi

utilizado método de biureto. Para a determinação de albumina foi utilizada reação

com verde de bromocresol (VBC). O teor de globulinas foi calculado por meio da

diferença entre os valores de proteínas totais e albumina, em seguida, a relação

albumina/globulina foi determinada. A Proteína C Reativa é detectada mediante

uma reação imunológica de aglutinação. Todas essas análises também foram

realizadas no Laboratório de Análises Clínicas e Toxicológicas da Universidade

Potiguar, UNP.

4.2.5.5. Dosagem de CCK

58


a. Coleta do sangue

Também após 1 hora da administração dos testes, no último dia do

experimento (14o), foi realizada a avaliação do nível plasmático de CCK com

alíquotas do sangue dos 30 ratos (6 dieta P, 6 dieta C, 6 dieta IS 25 mg/kg, 6

dieta ITT2 25 mg/Kg, 6 dieta ITT2 50 mg/kg) anestesiados com xilazina 2% e

quetamina 5% e eutanasiados. A coleta do sangue seguiu as especificações do

Enzyme Immunoassay Kit (Phoenix Pharmaceuticals Inc). Assim o sangue foi

coletado em tubos a vácuo com EDTA, centrifugado (1,600 x g por 15 minutos a

4oC) em tubos de centrifuga contendo (0.6 Aprotinina TIU/mL de sangue) e o

plasma coletado e mantido a -70oC.

b. Extração do plasma

A extração do plasma seguiu as especificações do Kit. O plasma foi

acificado com tampão A na proporção de 1:1 e centrifugado por 6,000 x g por 20

minutos a 4 oC. A coluna SEP contendo 200 mg de C18 foi lavada com tampão B

(1 mL uma única vez) e em seguida com tampão A (3 mL por 3 vezes).

O plasma foi adicionado à coluna SEP C18, o material não retido a coluna

foi eluído com Tampão A (3 mL, 2 vezes) e o CCK, presente nos plasmas

analisados, denominado de amostra de CCK dos testes com dietas, foi eluído

com tampão B (3 mL, 1 vez) e armazenados em tubo de polietileno.

c. Imuno ensaio

O Imuno ensaio seguiu as especificações do Kit. Todos os reagentes foram

ressuspendidos no tampão denominado “Tampão de ensaio 1 x”, após ser diluído

20 vezes. Foram adicionados 50 µl do peptídeo padrão (CCK), das amostras de

CCK dos testes com dietas e do peptídeo controle (CCK-26-33, não sulfatado;

ratos, camundongos e humanos) em cada poço e 25 µl do anticorpo primário, 25

µl do peptídeo biotinilado, sendo incubados a temperatura ambiente (20-23 oC)

por 2 horas.

Em seguida, os poços foram lavados 4 vezes com 350 µl com “Tampão de

ensaio 1 x”. Foram adicionados 100 µl em cada poço de solução de SA-HRP

59


(peroxidase de estreptavidina) e incubados a temperatura ambiente (20-23 oC)

por 1 horas e foram lavados 4 vezes com 350 µl com “Tampão de ensaio 1 x”.

Por fim, foram adicionados 100 µl de substrato TMB (substrato de

peroxidase) e incubados a temperatura ambiente (20-23 oC) por 1 hora.

Finalizada a reação foi adicionado 100 μl de HCl 2 N. A absorbância foi medida a

450nm e os resultados foram calculados também de acordo com as

especificações do Enzyme Immunoassay Kit (Phoenix Pharmaceuticals Inc).

4.2.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados foram analisados utilizando o software Statistica 7 (Stat Soft,

Tulsa, OK, EUA), inicialmente quanto à normalidade e homocedasticidade por

meio do teste de Kolmogorov-Smirnov e Levene, respectivamente. Os dados que

não se adequaram às premissas do teste foram transformados (log 10, ln, e raiz

quadrada). O peso, eficiência alimentar, consumo alimentar, CCK e parâmetros

bioquímicos (Glicose, Colesterol total, Colesterol HDL, Colesterol LDL, VLDL,

Triglicerídeos, ALT, AST, GGT, albumina, globulina e proteínas totais) foram

analisados utilizando a ANOVA one-way para constatação de possíveis

diferenças entre os grupos ao longo do experimento. Quando diferenças

significativas foram detectadas, o teste post-hoc de Tukey foi utilizado (p<0,05).

Para o consumo alimentar em tempos específicos utilizando a ANOVA two-way

para constatação de possíveis diferenças entre os grupos ao longo do

experimento. Quando diferenças significativas foram detectadas, o teste post-

hoc de Tukey também foi utilizado (p<0,05).

60


5. RESULTADOS

5.1. ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DO INIBIDOR DE TRIPSINA DAS

SEMENTES DE Tamarindus indica L.

5.1.1. Determinação da atividade inibitória nas frações proteicas sobre a

protease serínica tripsina

O extrato da farinha de semente de tamarindo (EB) foi fracionado

inicialmente com sulfato de amônio com saturação de 0-30% (F1) e o

sobrenadante foi precipitado com acetona (PA). Foi avaliada a atividade inibitória

sobre a tripsina no extrato bruto e suas frações, observando-se que o extrato

bruto apresentou inibição de 70,33% + 1,52 e a fração PA apresentou a maior

atividade inibitória de 88,66% + 2,08. (Figura 5) A fração PA foi utilizada para

posterior purificação.

Figura 5. Percentual da atividade inibitória para tripsina pelo extrato bruto e frações proteicas (FI,

saturada com sulfato de amônio nas faixas de 0-30%; PA, precipitado com acetona 1:2 (v/v)).

Inibição utilizando 100 µL de cada fração e BApNA como substrato.

5.1.2. Perfil proteico e de inibição do material retido na cromatografia de

afinidade Tripsina-Sepharoe 4B e eletroforese em gel de poliacrilamida

descontínuo e desnaturante (SDS-PAGE)

A fração PA, após diálise em Tris-HCl 50 mM pH 7,5 foi submetida a

cromatografia de afinidade Tripsina-Sepharose 4B. Após a cromatografia de

61


afinidade, foi avaliada a presença do inibidor de tripsina no material retido a

coluna eluído com HCl 5 mM. Assim, na figura 06, observou-se um pico (RPA)

com atividade anti-tríptica apresentando 99,8% de inibição da atividade catalítica

da tripsina. Esse pico foi submetido a posterior diálise. As etapas de purificação

do inibidor de sementes de tamarindo foram analisadas por eletroforese em

condições desnaturantes (SDS-PAGE 12%) corado com Comassie blue (Figura

6). Uma única banda majoritária foi visualizada, referente ao ITT2 revelando que o

inibidor foi parcialmente purificado.

Figura 6. Cromatografia de afinidade em Tripsina-Sepharose CL 4B e SDS-PAGE do ITT2. A)

Perfil de eluição de PA de sementes de tamarindo em coluna de afinidade de tripsina-sepharose.

Foram aplicados aproximadamente 7 mg de proteína. A coluna foi previamente equilibrada com

tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5. Proteínas adsorvidas foram eluídas com HCl 5mM e as frações

proteicas (3 mL/tubo) monitoradas a 280 nm. A atividade inibitória sobre a tripsina foi realizada

usando 100 μL do material retido e BApNA como substrato. B) Eletroforese em gel de

poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) a 12% da fração retida em tripsina-Sepharose (RPA) e

após diálise (ITT2), corada com Coomasie blue R 250. As setas indicam as bandas proteicas.

5.1.3. Grau de purificação do inibidor

As frações obtidas nas diferentes etapas de purificação (EB, PA, PPA, ITT2)

foram submetidas a ensaio de inibição contra tripsina, no qual o extrato bruto foi

utilizado como parâmetro, com um rendimento de 100% e valor de purificação 1,

para as demais frações foram estimadas o rendimento e grau de purificação.

Segundo a Tabela 4 é possível observar que o inibidor de tripsina da semente de

62


tamarindo obteve um grau de purificação de 619,28 vezes e seu rendimento foi de

2,2%.

Tabela 4. Tabela de purificação do inibidor de tripsina de semente de tamarindo

(ITT2)

Frações Proteína Total

(mg)

Atividade inibitória

total (UI)

Atividade

específica (UI/mg

de proteína)

Purificação

(Vezes)

Rendimento

(% UI)

EB 1122,00 186530 166,24 1 100

PA 89,00 36820 413,70 2,48 19,74

RPA 0,07 5743 82042,85 493,52 3,07

ITT2 0,04 4118 102950 619,28 2,20

Atividade específica é obtida pela relação da atividade inibitória total pela proteína total; o índice

de purificação é a relação da atividade específica de cada fração pela atividade específica do

extrato bruto; o rendimento é a relação entre a atividade inibitória total de cada fração pela

atividade inibitória total do extrato bruto. EB - extrato bruto, PA - precipitado com acetona 1:2

(v/v), RPA material retido na coluna de afinidade de tripsina, ITT2 inibidor de tripsina parcialmente

purificado de tamarindo.

5.2. AVALIAÇÃO DA MÉDIA DE GANHO DE PESO E DO CONSUMO

ALIMENTAR (EXPERIMENTO I)

O inibidor de tripsina purificado das sementes de Tamarindus indica L. foi

testado a fim de avaliar o ganho de peso em ratos machos da linhagem wistar

(150 g – 180 g). A média do ganho de peso, num período de 14 dias está

representada na Figura 7. O ganho de peso para os grupos controle e controle

com gavagem se apresentaram de forma semelhante (24,8 g + 2,5 e 21 g + 2,6),

ou seja, a água administrada por gavagem não interferiu no ganho de peso, no

entanto o grupo aprotéico e o grupo que recebeu inibidor tiveram uma redução

significativa no ganho de peso, sendo este ganho de 18,56 g + 1,05 e 7,37 g +

0,14, respectivamente. Assim, a dieta isenta de proteínas causou uma redução no

ganho de peso e o inibidor de tripsina provocou ganho ponderal ainda menor,

quando comparado aos demais grupos.

63


Figura 7. Evolução do peso corporal médio em gramas (g) de ratos wistar submetidos à dieta com

inibidor de tripsina de semente de tamarindo. Dieta S (AIN-93G), Dieta SG (AIN-93G mais água

por gavagem), Dieta NP (Aprotéica) e Dieta ITT2 25 (AIN-93G mais inibidor de tripsina de

tamarindo 25 mg/kg por gavagem (1 mL/dia)) durante 11 dias. Dados expressos em média ±

desvio-padrão de grupo de animais (Grupos; n= 06). Os resultados são expressos com média ±

SEM. Letras diferentes indicam diferença significativa entre os grupos com p<0.05. ANOVA one-

way com teste post-hoc de Tukey.

O consumo alimentar dos animais, representado na Figura 8 corrobora com

os respectivos ganhos de peso demonstrados na Figura 7. Os animais do grupo

controle e da gavagem com água apresentam consumo alimentar crescente, com

algumas variações. Observando o quanto foi consumido, percebe-se que o grupo

controle alimentou-se inicialmente de 9,88 g + 1,25 gramas da dieta AIN-93G e ao

final o consumo foi de 12,64 g + 1,09 gramas, o grupo controle com gavagem

manteve um padrão semelhante iniciando com 7,58 g + 0,98 e ao final do

experimento consumindo 12,58 g + 1,57. No entanto, o grupo aprotéico e com

inibidor de tripsina de tamarindo (25 mg/kg por gavagem) apresentaram o

consumo diferenciado. O grupo aprotéico iniciou com consumo de 8,53 g + 0,95 e

o grupo ITT2 com 8,21 g + 0,96, entretanto ao decorrer dos dias, o consumo do

grupo aprotéico (7,45 g + 1,03) e do grupo ITT2 (5,03 g + 0,87) reduziu

significativamente. Dessa forma, fazendo um comparativo entre consumo

alimentar e ganho de peso pode ser observado que os grupos, no decorrer do

64


experimento, que foram submetidos a uma dieta restrita em proteínas e que

receberam inibidor de tripsina (ITT2), apresentaram um declínio no ganho de peso

associado a uma manutenção ou redução no consumo de alimentos,

respectivamente.

Figura 8. Consumo alimentar médio em gramas por dia (g/dia) de ratos wistar submetidos à dieta

com inibidor de tripsina de semente de tamarindo. Dieta S (AIN-93G), Dieta SG (AIN-93G mais

água por gavagem), Dieta NP (Aproteica) e Dieta ITT2 25 (AIN-93G mais inibidor de tripsina de

tamarindo 25 mg/kg por gavagem (1 mL/dia). Dados expressos em média ± desvio-padrão de

grupo de animais (Grupo; n = 6). Letras diferentes indicam diferença significativa entre os grupos

com p<0.05. ANOVA one-way com teste post-hoc de Tukey.

5.3. DIGESTIBILIDADE PROTEICA in vivo

De acordo com a tabela 5 observa-se que não há variação significativa (p<

0,05) entre os grupos para digestibilidade verdadeira e digestibilidade aparente,

ou seja, o inibidor não ocasionou diferenças significativas no processo de

digestibilidade das proteínas.

Tabela 5. Digestibilidade proteica Verdadeira (Dv) e Aparente (Da) em ratos wistar

submetidos à dieta com inibidor de tripsina de semente de tamarindo.

Tratamento N Urina (%) N fecal(%) Dv (%) Da (%)

Dieta Controle 1,12 1,75 90,70 + 1,22a 96,36 + 0,91

a

Dieta Controle gavagem 1,15 1,69 91,10 + 1,02a 96,68 + 2,03

a

65


Dieta Controle (AIN-93G), Dieta Controle gavagem (AIN-93G mais água por gavagem) e Dieta

Inibidor (AIN-93G mais inibidor de tripsina de tamarindo- ITT2 25 mg/kg por gavagem (1 mL/dia)

Dados expressos em média ± SEM de grupo de animais (Grupos; n= 06). Letras diferentes

indicam diferença estatística entre os grupos com p<0.05. ANOVA one-way com teste post-hoc de

Tukey.

5.4. AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA I

Para avaliar os efeitos da dieta sobre os animais foram realizados exames

bioquímicos. A Figura 9 mostra o parâmetro da glicose (mg/mL) analisada para os

quatro grupos. Dentre estes se observa que apenas o grupo que foi submetido a

dieta aprotéica, apresentaram uma queda no nível de glicose, sendo que esta

manteve-se no grupo com uma média de 93 mg/dL ± 1,0, ou seja, reduziu em 38,

5% os níveis de glicose, diferindo significativamente dos demais grupos. Os

grupos controle, gavagem e ITT2 apresentam médias semelhantes para a glicose

sanguínea, sendo 151,2 mg/dL + 7,2; 162,3 mg/dL + 6,7 e 158,1 mg/dL + 9,8,

respectivamente. Dessa forma, o inibidor de tripsina de semente de tamarindo

(ITT2) mesmo ocasionando uma redução do consumo alimentar, não alterou os

níveis glicêmicos.

Figura 9. Níveis de glicose em ratos wistar submetidos à dieta com inibidor de tripsina de semente

de tamarindo. Dieta S (AIN-93G), Dieta SG (AIN-93G mais água por gavagem), Dieta NP

(Aprotéica) e Dieta ITT2 25 (AIN-93G mais inibidor de tripsina de tamarindo 25 mg/kg por gavagem

(1 mL/dia)) durante 11 dias. Os resultados são expressos em mg/dL com média ± SEM (Grupos;

n= 06). Letras diferentes indicam diferença significativa entre os grupos com p<0.05, f = 64,89.

ANOVA one-way com teste post-hoc de Tukey.

Dieta Inibidor 1,18 1,68 89,88 + 0,94a

95,28 + 1,38a

Dieta aprotéica 0,18 0,39 - -

66


O perfil lipídico (nível do colesterol total, LDL e HDL) também foi avaliado.

A partir da Figura 10A é possível inferir que não houve diferença significativa nos

níveis de colesterol total entre o grupo controle (51,4 mg/dL + 6,2), gavagem (59,7

mg/dL + 4,3) e ITT2 25 mg/Kg (54 mg/dL + 6,0), no entanto esses grupos diferiram

significativamente com o grupo aprotéico que apresentou média de 41 mg/dL +

3,0.

Figura 10. Perfil lipídico em ratos wistar submetidos à dieta com inibidor de tripsina de semente de

tamarindo. Dieta S (AIN-93G), Dieta SG (AIN-93G mais água por gavagem), Dieta NP (Aprotéica)

e Dieta ITT2 25 (AIN-93G mais inibidor de tripsina de tamarindo 25 mg/kg por gavagem (1 mL/dia).

Os resultados são expressos em mg/dL com média ± SEM (Grupos; n= 06). Letras diferentes

indicam diferença significativa entre os grupos com p<0.05. Colesterol total (A) (f = 10,46), LDL (B)

(f= 7,244), HDL (C) (f= 7,002), Triglicerídeos (D) (f= 2,278). ANOVA one-way com teste post-

hoc de Tukey.

67


Os níveis das frações de colesterol, LDL, HDL, indicaram que para LDL

(Figura 10B) o grupo aprotéico (18 mg/dL + 3,0) diferiu significativamente do

grupo que recebeu água por gavagem (32,7 mg/dL + 3,3), enquanto os outros,

controle (19,8 mg/dL + 6,2) e ITT2 (24,3 mg/dL + 3,5) não apresentaram

diferenças. Observando a Figura 10C, novamente, percebe-se que apenas o

grupo aprotéico (20 mg/dL ± 0,8) apresenta diferença significativa quando

comparados com os demais grupos, controle, gavagem e ITT2, que apresentaram

médias de 24,2 mg/dL + 2,2; 23,8 mg/dL + 0,8 e 24,6 mg/dL + 1,2,

respectivamente. A dosagem de triglicerídeos (Figura 10D) revelou que entre os

grupos não houve variações significativas, onde o controle apresentou média de

26,6 mg/dL + 1,4 e o ITT2 21,3 mg/dL + 4,7.

A fim de avaliar os efeitos da administração do inibidor sobre o fígado

foram dosadas as enzimas ALT e AST. Os níveis de ALT (Figura 11A)

demonstram que apenas o grupo aprotéico (13,7 U/L + 0,3) teve uma redução

significativa, em contraposição aos valores apresentados pelos grupos controle,

gavagem e ITT2, 24,4 U/L + 4,6; 26,8 U/L + 5,1 e 21,0 U/L + 1, respectivamente.

Quando observado o nível de AST (Figura 11B) percebe-se que o grupo aprotéico

(102,0 U/L + 7) tem uma média superior aos outros grupos, 82 + 8; 91,0 U/L + 7,1

e 79,0 U/L + 6,2). Dessa forma é verificado que o ITT2 não ocasionou alterações

nos níveis de ALT e AST.

Figura 11. Níveis de alanina aminotransferase (ALT) (A) e aspartato aminotransferase (AST) (B)

em ratos wistar submetidos à dieta com inibidor de tripsina de semente de tamarindo. Dieta S

68


(AIN-93G), Dieta SG (AIN-93G mais água por gavagem), Dieta NP (Aprotéica) e Dieta ITT2 25

(AIN-93G mais inibidor de tripsina de tamarindo 25 mg/kg por gavagem (1 mL/dia)) durante 11

dias. Os resultados são expressos em U/L com média ± SEM (n = 6). Letras diferentes indicam

diferença significativa entre os grupos com p<0.05. ALT (A) (f= 16,79) e AST (B) (f= 8,392) ANOVA

one-way com teste post-hoc de Tukey.

5.5. ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA

Lâminas dos tecidos hepáticos, pancreáticos, intestinais e estomacais

foram submetidas à análise histopatológica. Secções dos órgãos dos animais

submetidos à dieta controle e os pertencentes ao grupo no qual foi administrado

inibidor de tripsina de tamarindo (ITT2 25mg/kg) foram coradas e analisadas por

microscopia óptica (Figuras 12)

As secções hepáticas podem ser observadas na Figura 12, o fígado do

grupo controle (12-A1) e o fígado do grupo tratado com inibidor ITT2 (12-A2)

apresentaram parênquima hepático normal, mostrando estruturas (arteríolas,

vênulas, capilares) repletas de hemácias; estroma manteve-se preservado;

mantendo-se preservada as membranas e o núcleo em quase todo o tecido e nas

células foi observada ausência de morte celular, no entanto na periferia foi

observada a presença de hepatócitos espumosos, variando de 25 a 50% do

tecido.

Observando-se as secções do estômago (Figura 12-B1 e B2) no mesmo

grupo, observa-se que a mucosa apresenta-se normal, com glândulas gástricas

íntegras, sem infiltrações inflamatórias, além da submucosa, muscular e serosa

íntegra.

O pâncreas (Figura 12-C1 e C2), também do grupo tratado com ITT2,

apresentou-se íntegro, as ilhotas de Langerhans e tecido conjuntivo pancreático

não demonstraram alterações morfológicas não sendo verificada alteração no

tamanho e nem distorção da citoarquitetura.

Analisando-se as secções intestinais (12-D1 e D2) ainda no grupo tratado,

verifica-se que as mesmas encontram-se íntegras, com arquitetura normal, sem

infiltrações inflamatórias, e as camadas, mucosa, submucosa, muscular e serosa

não apresentaram alterações.

Portanto, em nenhum dos órgãos analisados o ITT2 provocou alterações

morfológicas nas condições em que foram realizados os experimentos.

69


CONTROLE

A1 B1 C1 D1

ITT2

A2 B2 C2 D2

Figura 12. Análise histopatológica de órgãos em ratos wister submetidos à dieta com inibidor de tripsina de semente de tamarindo. Secções hepáticas A1

e A2 com aumento de 40x; Secções do estômago B1 e B2 com aumento de 10x; Secções do pâncreas C1 e C2 com aumento de 10x; Secções do

intestino D1 e D2, com aumento de 10x; Dieta S (AIN-93G) e Dieta ITT2 25 (AIN-93G mais inibidor de tripsina de tamarindo- ITT2 25 mg/kg por gavagem

(1mL/dia).

70


5.6. CONSUMO ALIMENTAR EM 1, 2 E 16 h APÓS ADMINISTRAÇÃO DO

INIBIDOR DE TRIPSINA DE TAMARINDO (EXPERIMENTO II)

O consumo alimentar dos animais, após a administração do inibidor de

tripsina de tamarindo, foi reduzido. Na primeira hora (Figura 13) após a

administração do ITT2 25 mg/kg de peso, e do ITT2 50 mg/kg de peso, o consumo

alimentar foi significativamente reduzido em 68,87% + 1,80 e 56,8% + 4,80,

respectivamente, quando comparados com o grupo controle em 26,41% + 2,86 e

com o grupo caseína em 46,3% + 3,27. A redução ocasionada pelo inibidor de

tripsina de soja (66,17% + 4,40) não diferiu estatisticamente do grupo ITT2 25

mg/Kg de peso.

Após a segunda hora (Figura 13) de administração dos inibidores, o

consumo alimentar foi novamente avaliado e verificou-se que os grupos tratados

com inibidor apresentaram redução do consumo alimentar, a redução do grupo

tratado com ITT2 50 mg/kg (54,5% + 1,32) e ITT2 25 mg/Kg (52,9% + 4,39) foi

estatisticamente significante quando comparado ao grupo controle (18,86% +

0,54) e grupo caseína, (25,47% + 1,00), mas não diferiram entre si. E mais, o

grupo ITT2 25 mg/Kg e ITT2 50 mg/kg apresentaram diferença significativa

quando comparados com o grupo IS 25mg/Kg (39,57% + 1,78).

Avaliando o consumo após 16 h (Figura 13), observa-se novamente,

uma redução do consumo alimentar, nos animais que receberam inibidores de

tripsina de tamarindo. Foi significante a redução causada pela administração do

ITT2 25 mg/kg de peso (21,17% + 0,89), comparada a redução causada no grupo

controle (3,89% + 1,29), caseína (13,67% + 1,25) e inibidor de soja (9,89% +

1,11). O ITT2 50 mg/Kg de peso (17,04% + 2,5 ) não apresentou diferença

significativa apenas para o grupo caseína. Dessa forma verifica-se que o inibidor

de tripsina de tamarindo, nas doses analisadas, causou redução no consumo

alimentar, na primeira e na segunda hora, e essa redução se estende até 16 h

após a sua administração.

Comparando a redução do consumo alimentar entre os grupos de acordo

com a hora analisada, percebe-se que a redução do consumo para todos os

grupos é menor na primeira hora, e que esta é estatisticamente maior do que a

redução do consumo na segunda hora, onde apenas o ITT 50 mg/Kg de peso não

difere significativamente entre a primeira e segunda hora. Após 16 h observa-se

71


que há redução do consumo alimentar, no entanto estatisticamente inferior a

primeira e a segunda hora.

Figura 13. Percentual (%) de redução do consumo alimentar em ratos wister após 1 h, 2 h e 16 h

da administração de dieta com inibidor de tripsina de semente de tamarindo. Dieta SG (AIN-93G),

Dieta C (AIN-93G mais caseína 25mg/kg por gavagem 1mL/dia), Dieta IS (AIN-93G mais inibidor

de tripsina de soja 25mg/kg por gavagem 1 mL/dia), Dieta ITT2 25 (AIN-93G mais inibidor de

tripsina de tamarindo- ITT2 25 mg/kg por gavagem 1 mL/dia) e Dieta ITT2 50 (AIN-93G mais

inibidor de tripsina de tamarindo- ITT2 50 mg/kg por gavagem 1 mL/dia). Os resultados são

expressos com média ± SEM Grupos; n= 06). Letras diferentes indicam diferença significativa

entre os grupos com p<0.05. ANOVA two-way com teste post-hoc de Tukey.

5.7. AVALIAÇÃO BIOQUÍMICA II

O nível de glicose sanguíneo (Figura 14) também foi avaliado para esse

novo grupo de animais e verificou-se que não houve diferença significativa entres

os grupos controle (212,00 mg/dL ± 35,9), caseína (212,25 mg/dL ± 64,8), inibidor

de soja (219,75 mg/dL ± 38, 2), inibidor de tripsina de tamarindo 25 mg/Kg (212

mg/dL ± 58,0) e inibidor de tripsina de tamarindo 50 mg/Kg (204,5 mg/dL ± 57,5).

72


Figura 14. Nível de glicose em ratos wistar submetidos à dieta com inibidor de tripsina de semente

de tamarindo. Dieta SG (AIN-93G), Dieta C (AIN-93G mais caseína 25mg/kg por gavagem

1mL/dia), Dieta IS (AIN-93G mais inibidor de tripsina de soja 25mg/kg por gavagem 1 mL/dia),

Dieta ITT2 25 (AIN-93G mais inibidor de tripsina de tamarindo- ITT2 25 mg/kg por gavagem 1

mL/dia) e Dieta ITT2 50 (AIN-93G mais inibidor de tripsina de tamarindo- ITT2 50 mg/kg por

gavagem 1 mL/dia). Os resultados são expressos em mg/dL com média ± SEM (Grupos; n= 06).

Letras diferentes indicam diferença significativa entre os grupos com p<0.05, f = 1,174. ANOVA


Para avaliar o perfil lipídico os níveis de colesterol total, suas frações (LDL,

HDL, VLDL - lipoproteína de muito baixa densidade) e triglicerídeos foram

analisados. De acordo com a figura 15 referente ao colesterol total, suas frações e

triglicerídeos é possível afirmar que não há diferença significativa entre os grupos

controle, caseína, inibidor de soja e os que receberam inibidor de tripsina de

semente de tamarindo (ITT2). Para os níveis de colesterol total as médias foram

para ITT2 25 mg/kg de 76,2 mg/dL + 2,1; ITT2 50 mg/kg de 83,5 mg/dL + 8,4.

Para os níveis de LDL as médias foram para ITT2 25 mg/kg de 32,3 mg/dL + 9,3;

ITT2 50 mg/kg de 40,3 mg/dL + 6,7. Para HDL foram para ITT2 25 mg/kg de 27,6

mg/dL + 3,3; ITT2 50 mg/kg de 34,0 mg/dL + 2,1. Para triglicerídeos foram para

ITT2 25 mg/kg 59 + 25,5; ITT2 50 mg/kg 64,7 + 25,1.

73


Figura 15. Perfil lipídico em ratos wistar submetidos à dieta com inibidor de tripsina de semente de

tamarindo. Dieta SG (AIN-93G), Dieta C (AIN-93G mais caseína 25 mg/kg por gavagem 1mL/dia),

Dieta IS (AIN-93G mais inibidor de tripsina de soja 25 mg/kg por gavagem 1 mL/dia), Dieta ITT2 25

(AIN-93G mais inibidor de tripsina de tamarindo- ITT2 25 mg/kg por gavagem 1 mL/dia) e Dieta ITT2

50 (AIN-93G mais inibidor de tripsina de tamarindo- ITT2 50 mg/kg por gavagem 1 mL/dia). Os

resultados são expressos em mg/dL com média ± SEM (Grupos; n= 06). Letras diferentes indicam

diferença significativa entre os grupos com p<0.05. Colesterol (A) (f= 1,969), LDL (B) (f= 0,02324),

HDL (C) (f= 3,322) e triglicerídeos (D) (f= 1,360). ANOVA one-way com teste post-hoc de Tukey.

De acordo com as Figuras 16-A e 16-B verificou-se que não houve

diferença estatística para AST e ALT entre os grupos, dentre os quais, o controle,

a caseína, o IS, o ITT2 25 mg/kg e ITT2 50 mg/kg apresentam médias

semelhantes. Para ALT de 57,5 U/L + 9,8; 59,7 U/L + 5,6 e para AST de 149,6

U/L + 36,4; 154 U/L + 49,4, para os grupos ITT2 25 mg/kg e ITT2 50 mg/kg

respectivamente. Ainda para avaliar as funções hepáticas foi dosado a GGT.

a

74


Segundo a Figura 16-C não se observa diferença significativa entres os grupos,

as médias do grupo ITT2 25 mg/Kg foi de 9,7 U/L + 3,5 e do grupo ITT2 50 mg/kg

de 8,9 U/L + 2,8.

Figura 16. Níveis de alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST) e Gama

Glutamil Transferase (GGT) em ratos wistar submetidos à dieta com inibidor de tripsina de

semente de tamarindo. Dieta SG (AIN-93G), Dieta C (AIN-93G mais caseína 25 mg/kg por

gavagem 1mL/dia), Dieta IS (AIN-93G mais inibidor de tripsina de soja 25 mg/kg por gavagem 1

mL/dia), Dieta ITT2 25 (AIN-93G mais inibidor de tripsina de tamarindo- ITT2 25 mg/kg por

gavagem 1 mL/dia) e Dieta ITT2 50 (AIN-93G mais inibidor de tripsina de tamarindo- ITT2 50 mg/kg

por gavagem 1 mL/dia). Os resultados são expressos em U/L com média ± SEM (Grupos; n= 06).

Letras diferentes indicam diferença significativa entre os grupos com p<0.05. ALT (A) (f= 2,959),

AST (B) (f= 1,150 ) e GGT (C) (f = 4,024). ANOVA one-way com teste post-hoc de Tukey.

As proteínas séricas totais refletem a quantidade total de albumina e de

globulinas no soro. De acordo com a Figura 17-A é possível observar que não há

diferenças significativas nos níveis de albumina entre os grupos, e as médias se

mantém semelhantes: controle de 4,48 g/dL + 0,3; caseína de 4,58 g/dL + 0,4; IS

de 4,96 g/dL + 0,5; ITT2 25 mg/kg de 4,48 g/dL + 0,1 e ITT2 50 mg/kg de 4,55 g/dL

+ 0,1. Observando a Figura 17-B, os níveis de globulinas apresentam pequenas

diferenças entre os grupos, sendo esta diferença significativa entre o grupo

controle, que apresentou média de 4,16 g/dL + 0,07, e o grupo que recebeu

caseína, o qual tem média de 3,3 g/dL + 0,78; e entre o grupo controle e o grupo

de ITT2 50 mg/Kg, de média 3,1 g/dL + 0,2.

A partir dos dados obtidos com a albumina e a globulina foi calculada a

relação albumina/globulina, representada pela Figura 17-C. Diante das diferenças

significativas apresentadas no gráfico dos níveis de globulinas, na relação

albumina/globulina essa diferença se repete. Portanto entre o grupo controle,

75


média de 1,09 g/dL + 0,07, e caseína, média de 1,4 g/dL + 0,2, houve diferença

significativa e entre o grupo controle e o ITT2 50 mg/Kg, média de 1,47 g/dL +

0,03. Observando a Figura 17-D pode-se inferir que os níveis de proteínas totais

mantêm-se semelhantes, com diferença significativa apenas entre os grupos IS,

média de 8,86 g/dL + 0,4 e ITT2 50 mg/Kg, com média de 7,6 g/dL + 0,3.

Figura 17. Níveis de proteínas séricas em ratos wistar submetidos à dieta com inibidor de tripsina

de semente de tamarindo. Dieta SG (AIN-93G), Dieta C (AIN-93G mais caseína 25 mg/kg por

gavagem 1 mL/dia), Dieta IS (AIN-93G mais inibidor de tripsina de soja 25 mg/kg por gavagem 1


gavagem 1 mL/dia) e Dieta ITT2 50 (AIN-93G mais inibidor de tripsina de tamarindo- ITT2 50

mg/kg por gavagem 1 mL/dia). Os resultados são expressos em g/dL com média ± SEM (Grupos;

n= 06). Letras diferentes indicam diferença significativa entre os grupos com p<0.05. Albumina (A)

(f= 2,644), globulina (B) (f= 3,141), relação albumina/globulina (C) (f= 3,472) e proteínas totais

g/dL (D) (f= 2,771). ANOVA one-way com teste post-hoc de Tukey.

76


Com base na Tabela 6 é possível sugerir que não houve alteração nos

níveis de proteína C reativa em nenhum dos grupos.

Tabela 6. Avaliação da proteína C reativa em ratos wistar submetidos à dieta com

inibidor de tripsina de semente de tamarindo.

PARÂMETRO

GRUPOS

PROTEÍNA C

REATIVA

CONTROLE Não reagente

CASEÍNA Não reagente

IS 25 mg/Kg Não reagente

ITT 25 mg/Kg Não reagente

ITT 50 mg/Kg Não reagente

Dieta Controle (AIN-93G), Dieta Caseína (AIN-93G mais caseína 25 mg/kg por gavagem 1

mL/dia), Dieta IS (AIN-93G mais inibidor de tripsina de soja 25 mg/kg por gavagem 1 mL/dia),

Dieta ITT2 25 (AIN-93G mais inibidor de tripsina de tamarindo- ITT2 25 mg/kg por gavagem 1

mL/dia) e Dieta ITT2 50 (AIN-93G mais inibidor de tripsina de tamarindo- ITT2 50 mg/kg por

gavagem 1 mL/dia).

5.8. DOSAGEM DE CCK

O nível de CCK plasmático foi afetado significativamente pela

administração de inibidores de tripsina quando comparado com grupos que não

receberam os mesmos. De acordo com a Figura 18, é possível notar que a

dosagem de CCK no grupo controle (5,92 pmol/L + 1,15) e o grupo que recebeu

caseína (10,14 pmol/L + 2,90), apresentaram valores significativamente menores

do que os demais grupos. Dentre os grupos que receberam inibidores, o ITT2 50

mg/Kg foi o que elevou o maior nível de CCK plasmático, 20,00 pmol/L + 1,22,

valor este que não é significativamente diferente para do ITT2 25 mg/kg (17,41

pmol/L + 1,60), mas que é estatisticamente maior que IS 25 mg/Kg (15,51 pmol/L

+ 1,82), um reconhecido inibidor de tripsina com efeito sacietogênico.

77


Figura 18. Níveis de CCK plasmático em ratos wistar submetidos à dieta com inibidor de tripsina

de semente de tamarindo. Dieta SG (AIN-93G), Dieta C (AIN-93G mais caseína 25 mg/kg por

gavagem 1 mL/dia), Dieta IS (AIN-93G mais inibidor de tripsina de soja 25 mg/kg por gavagem 1


gavagem 1 mL/dia) e Dieta ITT2 50 (AIN-93G mais inibidor de tripsina de tamarindo- ITT2 50 mg/kg

por gavagem 1 mL/dia). Os resultados são expressos em pmol/L de CCK plasmático com média ±

SEM (n = 6). Letras diferentes indicam diferença significativa entre os grupos com p<0.05. ANOVA


78


6. DISCUSSÃO

Nas sementes da família Leguminosae foram identificadas várias proteínas,

com aplicações nos mais diversos processos biológicos, dentre estas proteínas,

os inibidores de protease destacam-se como importantes alvos de estudos, já

tendo sido vários deles isolados, purificados caracterizados e seus efeitos in vitro

e in vivo contra pragas e patógenos, assim como várias aplicações terapêuticas

verificadas.

Neste estudo o inibidor de tripsina de sementes de tamarindo foi isolado e

purificado parcialmente, tendo sido previamente purificado por Araújo et al.,

(2005), e avaliado quanto a atividades que ainda não haviam sido analisadas em

outros estudos. Para isso, no isolamento do inibidor, a farinha da semente de

tamarindo passou por um processo de extração proteíca, fracionamento com

sulfato de amônio (0-30%), precipitação com acetona (v/v) e separação em coluna

de afinidade de Tripsina Sepharose 4B, sendo obtido o ITT2 que apresentou

atividade anti-tríptica de 102950 UI/mg de proteína (Tabela 4). Ao analisar o ITT2

em SDS PAGE 12% foi visualizado uma banca proteica predominante com massa

molecular de aproximadamente 20 kDa, confirmando assim a purificação parcial

do ITT2, já relatado na literatura, mesmo não havendo sido seguido os mesmos

passos de purificação adotados por Araújo et al., (2002).

Observando a Tabela 4 verifica-se que o inibidor de tripsina de tamarindo

parcialmente purificado apresentou bom rendimento de 2,2% e foi purificado na

ordem de 619,28 vezes, resultado importante no que diz respeito ao grau de

pureza deste inibidor. Utilizando os passos de purificação adotados por Araújo et

al. (2002), o ITT2 havia apresentado o mesmo rendimento de 2,24%.

Comparado com o rendimento de dois outros inibidores recentemente

purificados, o ITT2 apresentou rendimento superior, uma vez que o inibidor de

tripsina do tipo Kunitz (SKTI) de sementes da leguminosa Acacia victoriae

Bentham purificado por meio de precipitação com sal, troca iônica e gel filtração,

com 11,3 kDa, atividade inibitória específica de 138,99 (UIT/mg), apresentou

rendimento 0,48% e o potente inibidor de proteinase serínica isolado e

caracterizado a partir das sementes de Derris trifoliata (DtTCI) por precipitação

com sulfato de amônio, cromatografia de troca iônica e cromatografia de gel

79


filtração, massa molecular aproximada de 20 kDa, atividade inibitória específica

de 12,5 UIT/mg, apresentou rendimento de 0,2% (EE et al., 2009;

BHATTACHARYYA & BABU, 2009).

Com o ITT2 parcialmente purificado foi avaliado o seu efeito no ganho de

peso de ratos wistar. Neste experimento foram analisadas as digestibilidades

proteicas aparente e verdadeira, bem como a evolução no ganho de peso destes

animais, alterações morfohistológicas em órgãos e avaliados alguns parâmetros

bioquímicos plasmáticos. A digestibilidade proteica é a medida da percentagem

das proteínas que são hidrolisadas pelas enzimas digestivas e absorvidas na

forma de aminoácidos ou de qualquer outro composto nitrogenado pelo

organismo. O aspecto qualitativo das proteínas, isto é, seu valor nutricional,

depende da composição, digestibilidade, biodisponibilidade de aminoácidos,

fonte, efeitos do processamento, e presença ou ausência de toxicidade e fatores

anti-nutricionais (MONTEIRO et al., 2004; MESQUITA et al., 2007). Assim, tornou-

se importante verificar se o inibidor de tripsina de tamarindo tinha algum efeito

sobre a digestibilidade proteica dos animais, uma vez que é reconhecido

classicamente na literatura como um antinutriente. Apesar do ITT2 ter provocado

menor ganho de peso nos ratos que o receberam por gavagem comparando com

o grupo que não o recebeu, não foram identificadas diferenças significativas entre

os grupos caseina e ITT2 na digestibilidade verdadeira e aparente. Dessa

maneira, o ITT2 não influenciou negativamente o aproveitamento das proteínas

oferecidas pela dieta.

No trabalho realizado por Sgarbieri (1979), ratos alimentados com dietas

contendo 10% de caseína mais 1% de inibidor de tripsina purificado a partir de

feijão Rosinha G2 (Phaseolus vulgaris L.) apresentaram digestibilidade aparente,

no valor de 91,5%, e esta não diferiu significativamente do grupo que recebeu

apenas a dieta contendo 10% de caseína, que apresentou 92,3% de

digestibilidade. Isso mostra que a presença do inibidor não levou a diminuição

significativa na digestibilidade proteica. Dados estes que se assemelham ao

estudo em questão, quando se observa a Tabela 5, em que a adição do inibidor

de tripsina de tamarindo (89,88%) não afetou significativamente a digestibilidade

proteica nos animais (controle 90,70%), sendo a diferença da digestibilidade

verdadeira de apenas 0,82% entre o grupo controle e o grupo ITT2.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0031942209001393


80


Segundo Peace et al. (1991), ratos da linhagem wistar alimentados com

inibidor de tripsina de soja (SBTI) apresentaram uma redução no ganho de peso,

na eficiência alimentar, entretanto reduziram também a digestibilidade proteica

quando comparados com um grupo controle que recebia caseína. O ganho de

peso representou apenas 20, 64, e 51% do ganho de peso do grupo controle, na

primeira, segunda e terceira semana respectivamente.

Também em outros estudos investigando os efeitos de inibidor da tripsina,

Mclaughlin et al., (1983) analisaram o efeito do inibidor sintético de tripsina, o

DGPM, sobre a alimentação padrão em ratos zucker obesos e magros. A

administração de DGPM (25 a 200 mg / kg) em ratos que permaneceram 6 h em

jejum diminuiu o consumo de alimentos diário de forma dose-dependente e houve

diminuição do tamanho médio de refeição em ratos magros e obesos, mas a

resposta foi maior nos ratos obesos. A administração de 100 mg /kg duas vezes

por dia durante 7 dias diminuiu o consumo de alimentos e o peso corporal em

ratos obesos, mas não em magros.

Num estudo recente, após a administração oral por gavagem de

concentrado de inibidores de proteases de batata (PPIC), inibidor de protease de

batata II (PPI) e caseína nas concentrações de 100 mg/kg em ratos wistar (180-

200 g) foi avaliado o consumo alimentar e o ganho de peso após 10 dias.

Observou-se uma redução significativa no consumo de alimentos entre o grupo

PPIC e caseína (controle negativo), tendo sido PPI purificado usado como

controle positivo. Durante o experimento, o consumo alimentar dos animais que

receberam PPIC, teve uma significativa redução em torno de 7%, quando

comparada com o grupo controle. Após 10 dias de experimento com PPIC (100

mg/kg por dia), o peso corporal inicial dos ratos aumentou em 36,9%, enquanto

que o peso corporal dos ratos do grupo controle que recebeu 100 mg/kg de

caseína aumentou em 48,2%, sugerindo que a administração de PPI foi

associada a 11,3% de diminuição do ganho de peso corporal (KOMARNYTSKY et

al., 2011).

Resultados estes que corroboram com o encontrado para o inibidor de

tripsina de semente de tamarindo (ITT2). Entretanto, considerando que o ITT2 foi

administrado em uma concentração 4 vezes menor (25 mg/kg) quando

comparado com PPI (100 mg/Kg) durante o período de 10 dias, os animais


81


apresentaram uma redução no consumo alimentar de cerca de 47%, superando

em 6 vezes a eficiência na redução do consumo alimentar obtido com uso do PPI.

Avaliando o ganho de peso, a administração do ITT2 foi associada a uma redução

de cerca de 70% do ganho de peso nos animais. O que também reflete uma

redução 6 vezes maior corroborando com a menor ingestão de alimentos.

Ainda relacionado aos resultados do ganho de peso, os animais

alimentados com dietas deficientes em proteínas (aproteico) apresentaram uma

acentuada redução no consumo de ração, comportamento esse que pode

explicar, em grande parte, a intensa perda de massa corpórea dos animais. O

tecido muscular esquelético é sensível à deficiência protéica por ser um

reservatório de proteína no organismo e dessa forma, quando há deficiência

protéica na dieta esse tecido torna-se alvo de depleção, ocasionando significativa

perda de massa muscular e, consequentemente, corporal. Por outro lado, estudos

mostram que tanto o metabolismo de carboidratos quanto o de proteínas sofrem

influência da carência de proteínas na dieta, apresentando redução dos estoques

de glicogênio e proteínas musculares e hepáticas, fatos esses que podem ser

responsáveis pela rápida diminuição da massa corpórea diante de uma situação

de deficiência de proteínas na dieta (MALAFAIA et al., 2009).

Quanto aos parâmetros bioquímicos analisados em nenhum deles foi

observado alterações no grupo de animais tratados com ITT2.

Entretanto, no grupo de animais que foram tratados com dieta aproteica foi

possível detectar algumas alterações como na dosagem de glicose. Em geral, a

má nutrição, e em particular a restrição protéica, tanto em humanos quanto em

animais, leva a baixos níveis de insulina basal frente a uma sobrecarga de

glicose, aumento na sensibilidade da insulina em tecidos periféricos, contudo,

baixos níveis plasmáticos de glicose (COSTA, 2000). As variações dos níveis

glicêmicos ocorrem devido à maior produção de glicose a partir de outras vias

metabólicas, redução da síntese de insulina, estímulo à produção do glucagon e

aumento da epinefrina circulante. Como os estoques de glicogênio são

consumidos rapidamente, o organismo passa a produzir glicose por meio de

aminoácidos livres e glicerol proveniente dos ácidos graxos, aumentando a

neoglicogênese. Com a intensificação dessas vias alternativas de produção de

glicose e a redução crescente dos estoques de macronutrientes, torna-se difícil a

82


manutenção adequada dos níveis séricos de glicose, levando a um quadro de

hipoglicemia (LIMA et al., 2010).

Garthoff et al., (2002) realizaram experimentos com suínos, para modelar

humanos devido semelhanças na fisiologia digestiva e anatômica, em que estes

receberam uma preparação parcialmente purificada de inibidor de tripsina

extraído da farinha de soja, com 511mg/100g de matéria seca da dieta, enquanto

que o grupo controle recebia alimentação sem inibidor e os grupos não

apresentaram diferenças entre os níveis de glicose.

Segundo Komarnytsky et al. (2011) ratos tratados com 0, 33, 66, 133 e 266

mg/kg de peso de inibidor de tripsina de batata, administrados por gavagem por

14 dias também não apresentaram diferenças significativa entre os níveis de

glicose quando comparado ao controle. O que sugere que a administração de

inibidores de tripsina não interfere nos níveis de glicose plasmática.

Ainda relacionado aos parâmetros bioquímicos avaliados, em um trabalho

desenvolvido por Roy & Schneeman (1981) camundongos foram alimentados com

dietas colesterolêmica de diferentes fontes de proteína e teores de inibidor de

tripsina (IT): caseína, proteína de soja isolada ou caseína + TI durante 4 semanas

e verificaram que o inibidor de tripsina não ocasionou alteração no metabolismo

lipídico, não alterando os níveis de colesterol sanguíneo e no fígado, bem como

observado com os animais alimentados com ITT2.

Ademais, ratos da linhagem wistar alimentados com inibidor de tripsina de

soja (SBTI), também não apresentaram modificação nos níveis de colesterol e

triglicerídeos quando comparados com o grupo controle que recebeu apenas

caseína (PEACE et al., 1991). Também suínos que receberam extrato com

inibidor de tripsina de soja parcialmente purificado de farinha de soja, quando

comparados a um grupo controle que não havia recebido inibidor, não apresentou

diferenças nos níveis de colesterol e triglicerídeos (GARTHOFF et al., 2002).

E finalmente os estudos realizado por Huang et al., (2008) que utilizaram

vinte camundongos aleatoriamente divididos em quatro grupos e alimentados com

inibidor de tripsina de batata doce em diferentes concentrações (10, 50 e 100 mg

kg-1) como teste e com solução salina como controle, além de dieta padrão. Após

35 dias os níveis referentes ao perfil lipídico foram avaliados, sendo então

concluído que não houve diferença significativa na concentração de lipoproteína


83


de baixa densidade (LDL)-colesterol, mas lipoproteína de alta densidade (HDL)-

colesterol, de triglicéridos, (TG) e colesterol total tenderam a diminuir. Os

resultados desse experimento não coincidem com o realizado com ITT2, no

entanto deve ser levado em consideração que o período de administração do

inibidor de batata doce foi superior ao do ITT2, podendo então ser, que um uso

prolongado do inibidor possa ocasionar essa alteração do perfil lipídico observado

para o inibidor de batata doce. Também, ratos wistar, que além da alimentação

padrão, receberam inibidor de tripsina de batata em várias concentrações, por 14

dias consecutivos, não apresentaram variações nos níveis de colesterol e

triglicerídeos (KOMARNYTSKY et al., 2011).

Quanto à AST, ALT e GGT sabe-se que elas possuem funções similares e

sua elevação no soro sanguíneo tem sido amplamente utilizada como indicativo

de hepatotoxicidade ou injúria hepatocelular (CAMPELLO et al., 2009). A enzima

AST é uma enzima encontrada em maior quantidade nas mitocôndrias, cerca de

80%, e não é liberada tão rápido como a ALT, que é uma enzima puramente

citosólica. A AST está presente em altas concentrações em um grande número de

tecidos como coração, fígado, músculo esquelético, rins e pâncreas. A ALT é

primariamente limitada ao citosol dos hepatócitos e é considerada um indicador

altamente sensível de dano hepatocelular e, dentro de certos limites, pode

fornecer uma taxa quantitativa do grau de danificação sofrido pelo fígado (MELO

et al., 2008). Já a GGT, esta é uma enzima presente nas membranas celulares e

nas frações microssômicas envolvidas no transporte de aminoácidos através da

membrana celular, bem como no metabolismo da glutationa. Os níveis

plasmáticos de GGT são principalmente de origem hepática, dessa forma, permite

avaliar também disfunção hepática e alterações na vesícula e metabolismo de

sais biliares. Nas análises realizadas neste estudo nenhuma das enzimas citadas

acima estiveram alteradas nos animais alimentados com o ITT2.

Testes realizados em suínos que tiveram acrescido a sua dieta o inibidor

de tripsina de soja parcialmente purificado, quando comparados com o grupo

controle, também não apresentaram variações nos níveis de ALT e AST

(GARTHOFF et al., 2002). Assim como, a alimentação de ratos wistar, acrescida

de inibidor de tripsina de batata não provou variações significativas nos níveis de

AST e ALT (KOMARNYTSKY et al., 2011) e ainda, ensaio realizado por Ribeiro et



84


al., (2010) injetando em via subcutânea 100 µL de salina (controle) e inibidor de

tripsina de soja na concentração de 100 µg/kg a 1 mg/kg em camundongos swiss

em intervalos de 24 h por 7 dias não demonstrou alterações significativas nos

níveis de AST e ALT.

Assim, observando-se os parâmetros supracitados, observa-se que o ITT2

reduz o ganho de peso, mas não altera os parâmetros bioquímicos, o que ocorre

com os animais que não recebem proteína na dieta. Dessa forma, o ITT2 não

apresentou um efeito antinutricional.

Para GGT, Garthoff et al. (2002) realizaram experimentos com suínos que

receberam uma preparação parcialmente purificada de inibidor de tripsina,

observaram que os níveis de GGT não se alteraram.

Na literatura não foi encontrado teste semelhante que avaliasse a dosagem

de GGT após a administração de inibidores de tripsina em ratos. No entanto em

outros experimentos, com ratos wistar em condições semelhantes e que tiveram

os níveis de GGT avaliados, segundo Orlandini (2012), a média do nível de GGT

para o grupo controle foi de 10,9 U/L ± 3,8 U/L, onde o valor mínimo foi 2,5 U/L e

o máximo de 17,8 U/L, média esta que é semelhante às encontradas no

experimento em questão.

Neste estudo também foram avaliadas proteínas como albumina e

globulina. A albumina é sintetizada pelo fígado, utilizando proteína dietética. A sua

presença no plasma cria uma força osmótica que mantém o volume de líquido

dentro do espaço vascular e é um bom indicador de saúde. As globulinas são

proteínas que incluem gamaglobulinas (anticorpos) e uma variedade de enzimas

e de transportadoras (GONZÁLEZ, 2009).

Garthoff et al. (2002), nos ensaios já citados acima, também avaliaram

globulina, proteínas totais e relação albumina/globulina e os resultados não

apresentaram diferenças significativas entre o grupo tratado com o inibidor de

tripsina e o grupo controle, no entanto, os níveis de albumina nos animais que

receberam inibidor foram ligeiramente mais baixos que no grupo controle.

Segundo Komarnytsky et al. (2011), a administração, por gavagem, de um

outro inibidor de tripsina em ratos wistar, por um período de 14 dias, quando

comparados ao grupo que não havia recebido inibidor, manteve os níveis de

proteínas totais, albumina e globulina sem alterações significativas.


85


Os dados da literatura se assemelham aos do experimento para os níveis

de albumina, pois os mesmo não apresentaram variações significativas. No

entanto, uma pequena redução no nível de globulina foi observada no grupo que

recebeu caseína por gavagem e inibidor de tripsina de tamarindo ITT2 50 mg/kg

de peso, o que ocasionou uma pequena elevação na relação albumina/globulina

nos respectivos grupos, e também o que ocasionou uma redução no conteúdo de

proteínas totais do grupo ITT2 50 mg/kg quando comparado com o grupo inibidor

de soja (IS).

As globulinas podem ser divididas em três tipos, α, β e γ, identificadas

mediante eletroforese. Elas têm funções no transporte de metais, lipídeos e

bilirrubina, bem como papel na imunidade (fração gama). As globulinas são

indicadores limitados do metabolismo proteico, tendo mais importância como

indicadores de processos inflamatórios. Existe uma correlação negativa entre a

concentração de albumina e de globulinas; assim, um aumento nas globulinas

devido a estados infecciosos, inibe a síntese de albumina no fígado como

mecanismo compensatório para manter constante o nível proteico total e,

portanto, a pressão osmótica sanguínea. Por outra parte, na disfunção hepática, o

nível de albumina cai e o de globulinas aumenta. Desnutrição e deficiência

imunológica congênita pode causar uma diminuição nas globulinas totais devida à

diminuição da síntese. Além disso, mudanças nos níveis das globulinas podem

ser usadas para avaliar estados de adaptação ao estresse. Animais adaptados

tendem a ter níveis normais, enquanto os não adaptados têm os níveis

aumentados (WALKER et al., 1990; GONZÁLEZ, 2009).

Dessa maneira, com apenas uma pequena alteração no nível de globulina

não é possível predizer o que de fato afetou os grupos que tiveram essa redução,

no entanto todos os animais estavam sob ambiente estressante, devido à

administração das proteínas por gavagem, e possivelmente, no grupo caseína e

ITT2 50 mg/kg, adaptados ao estresse, não houve uma alteração nos níveis de

globulina, enquanto os grupos que receberam gavagem com água, inibidor de

soja e inibidor de tripsina de tamarindo 25 mg/kg, possivelmente não adaptados

ao ambiente estressante, tiveram os níveis de globulina aumentados, o que se

torna aceitável, pois a caseína, proteína que faz parte da dieta desses animais, e

86


a água, não ocasionam nenhuma alteração no padrão de proteínas plasmáticas,

não podendo então, este efeito ser atribuído aos inibidores de tripsina.

Para a proteína C reativa, um dos tipos de proteína da fase aguda

produzida pelo fígado, considerada um marcador biológico inflamatório que se

eleva durante processos infecciosos e/ou inflamatórios (EISENHARD et al., 2009),

é possível notar que não houve alteração nos níveis de proteína C reativa em

nenhum dos grupos (Tabela 04). Esse parâmetro não foi avaliado em testes

semelhantes a estes.

Quanto às análises histológicas não foram observadas alterações nos

órgãos analisados dos animais que receberam ITT2 quando comparado aos

grupos controles. Ainda no estudo realizado por Garthoff et al. (2002), observaram

que o grupo que recebia IT (inibidor de tripsina) quando comparado com o grupo

controle que tiveram as amostras de tecido do pâncreas, fígado, duodeno, pele,

testículos, glândulas supra-renais, pituitária e tiróide, tomadas tanto em 6 como

em 39 semanas de necropsias, apresentaram as análises dentro dos limites

normais, por meio de exame tanto macro e quanto microscópico. De particular

interesse, não houve evidência de aumento da atividade mitótica, hiperplasia ou

hipertrofia do pâncreas em qualquer grupo.

Sato et al., (2002), também não observaram efeitos patológicos por exame

histológico em pâncreas de camundongos que receberam o inibidor de tripsina

sintético, camostat, após 14 dias de experimento, utilizando 0,1% de inibidor na

dieta padrão.

Estudos laboratoriais têm relatado a ocorrência de danos na mucosa

intestinal de animais alimentados com soja in natura, os quais são atribuídos a

compostos tóxicos, como as lectinas. Ao contrário das lectinas, os inibidores de

tripsina não interagem com as células da mucosa intestinal (BRUNE et al., 2010).

Diante da redução de peso apresentada pelos ratos tratados com o ITT2 e

menor consumo alimentar quando comparados com o gurpo controle; ausências

de alterações para os parâmetros bioquímicos e histológico órgãos analisados,

além da falta de indícios de comprometimento do estado nutricional condicionada

pelo consumo do ITT2; acredita-se que a redução do ganho de peso seja devido a

saciedade.

87


O principal determinante do volume da refeição é o estabelecimento da

saciedade, um estado biológico induzido por sinais gerados durante o consumo

de alimentos que leva à cessação da refeição. Várias linhas de evidência

suportam a noção de que o controle do tamanho da refeição é um componente da

resposta de alimentação. A informação de saciedade gerada durante o consumo

de alimentos é em grande parte transportada para o cérebro posterior, por meio

de fibras aferentes do nervo vago a partir do trato gastrointestinal superior. Isso

converge informações no núcleo do trato solitário (NTS), uma área do tronco

cerebral que integra a informação sensorial a partir do trato gastrointestinal, bem

como informações de sabor da cavidade oral. Os sinais de saciedade induzida

que alcançam os NTS são iniciados por estimulação mecânica ou química do

estômago e do intestino delgado durante o consumo de alimentos. Os

mecanismos envolvidos incluem sinais humorais provocados por CCK ou GLP-1,

que são liberadas após a estimulação, por nutriente, de células neuroendócrinas

que revestem o lúmen intestinal (DEGEN et al., 2001).

E para avaliar se o ITT2 influência na saciedade quando administrado aos

animais, no estudo em questão foi dosado CCK plasmático, uma vez que essa

condição pode ser explicada pelo mecanismo por meio da sinalização por

feedback positivo entre o inibidor de tripsina e o hormônio sacietogênico CCK, já

que o hormônio atua no núcleo arqueado produzindo um efeito supressor da

fome. Dessa maneira, foi possível detectar um aumento significativo de CCK

plasmático em ratos suplementados com ITT2 em concentração de 25 mg/Kg e de

50 mg/Kg quando comparado com os grupos controles, Caseína e Inibidor de

Tripsina de Soja (SBTI) que é um conhecido inibidor de tripsina com ação

sacietogênica (McLAUGHLIN, 1983; GARTHOFF et al., 2002; NAKAJIMA et al.,

2011), mostrando que o ITT2 é uma proteína com potencial efeito sacietogênico.

O efeito da infusão exógena de CCK em suprimir o consumo de alimentos

no homem foi descrita pela primeira vez por Kissileff et al., em 1981. Os autores

relataram que uma dose relativamente elevada, de infusão de CCK ocasionava

uma diminuição do consumo de refeição líquida em voluntários humanos.

Ballinger et al. (1995) descreveram uma diminuição de 20% no consumo de

calorias após a infusão de uma concentração fisiológica de CCK-8. Num outro

estudo, os efeitos sacietogênicos de concentrações fisiológicas de CCK-33 foram

88


observados em indivíduos magros e obesos. As infusões de CCK induziram

diminuições significativas na sensação de fome e não foram relatadas diferenças

claras entre indivíduos magros e obesos, mas os dados fornecem apoio adicional

para um papel de CCK na saciedade.

Liddle et al. (1984) observaram que a média dos níveis plasmáticos de

CCK de ratos em jejum era de 0,31 pmol + 0,5 e quando estes eram alimentados

passava para 6,2 pmol + 1,8. E quando a estes animais eram administrados

inibidor de tripsina de soja de forma intra-gastrica, os níveis de CCK aumentaram

cerca de 30 vezes.

Estudos realizados por Weller et al., (1992) utilizaram ratos para avaliar os

níveis de CCK após administração de inibidor de tripsina de soja (230 mg/ mL de

salina) e comparando com o grupo controle que recebeu apenas a salina,

observaram que a infusão intra-gastrica do STI produziu um aumento significativo

na concentração plasmática de CCK (9,9 pmol + 0,9), quando comparados com

grupo que recebeu uma infusão intra-gastrica de igual volume de salina (5,3 pmol

+ 1,3). A partir desses dados, verificou-se que o STI aumentou os níveis de CCK

em 87%.

Potein (extrato de batata incluindo proteínas inibidoras de tripsina), foi

avaliado a fim de verificar se suprimia o consumo de alimentos em ratos e se

estimulava diretamente a secreção de CCK em células enteroendócrinas,

utilizando inibidor de tripsina de soja como controle positivo e para controle

negativo, apenas água. Em ratos em jejum, o consumo de alimento foi medido até

6 h após a administração oral de Potein ou inibidor de tripsina de soja (SBTI). De

1 e 3 h após a administração oral de Potein (0,1 g), o consumo de alimento foi

significativamente diminuída em comparação com a administração de água

(controle) e a administração oral de SBTI (0,1g), suprimindo significativamente o

consumo de alimento até 6 h, em comparação com o controle. O aumento da

quantidade de Potein (0,2 e 0,4 g / rato) reduziu o consumo de alimentos de uma

forma dose-dependente. Uma redução significativa no consumo alimentar, foi

observada até 3 e 6 h após a administração oral de 0,2 e 0,4 g de Potein,

respectivamente. Ainda avaliando os efeitos do Potein sobre a liberação de CCK

por células STC-1 produtoras de CCK, verificaram que mesmo o Potein possuindo

um menor potencial inibitório, 1/20 da inibição do inibidor de tripsina de soja –

89


SBTI, 0,2g de Potein reduziu o consumo alimentar no mesmo grau que 0,1 g de

SBTI. Essa redução do consumo alimentar promovido pela administração de

Potein pode ser ocasionada devido à elevada potência do Potein de estimular a

secreção de CCK pelas células produtoras de CCK. A exposição de Potein (1-20

mg/mL) induziu o aumento de CCK de forma dose-dependente, enquanto o SBTI

não ocasionou alterações nos níveis de CCK. A atividade de liberação de CCK

por Potein foi quase equivalente ao do controle positivo (peptona β – conglicinina

de soja) (NAKAJIMA et al., 2011).

Chen et al. (2012) também testaram o Potein®, e analisaram o consumo

alimentar, em ratos, após 1, 2, 3 e 6 horas da administração orogástrica de

diferentes doses do extrato. O consumo de alimentos em ratos que tinham sido

pré-tratados com 1.5 g/Kg do extrato de batata tendeu a ser mais baixo do que

em ratos controle, de 1h a 3h após a administração, esta diferença foi significativa

após 6 h da administração. A dose mais baixa do extrato de batata (1 g/kg) teve

efeito semelhante ao obtido com a dose de 1,5 g/kg. Em outro ensaio, antes da

administração orogástrica do extrato, os ratos receberam, por via intraperitoneal,

500 ug/kg do antagonista do receptor de CCK, devazepide, ou apenas veículo de

administração do antagonista. Observaram, que o extrato reduziu

significativamente a ingestão de alimentos 2 e 3 horas após a administração,

quando comparados com a água tratada com veículo. No entanto, quando os

ratos foram tratados com devazepide, nenhuma redução signifcativa foi aparente

após administração do extrato. Além disso, para analisar o efeito do extrato na

secreção de CCK, este foi diretamente administrado no duodeno dos animais,

assim, foi verificado que os níveis de CCK no controle foi de 45,7 pmol/L ± 8,7 ,

enquanto no grupo tratado com Potein®, foi de 56,1 pmol/L ± 9,2, correspondendo

a um aumento de 25% no nível de CCK.

Komarnystky et al. (2011) também avaliaram a administração de um

concentrado de inibidores de tripsina de batata (PPIC - 100 mg/kg de peso), em

ratos wistar, quando comparados com um grupo controle que recebeu 100 mg/Kg

de peso de caseína, observou que no último dia (10o) da administração dos

inibidores, o nível de CCK no grupo controle era de 0,96 pmol/L, e não era

significativamente diferente dos animais teste, no entanto após 15 minutos da

administração dos inibidores ou caseína, os níveis e CCK plasmático aumentaram

90


significativamente entre os grupos, os quais apresentaram, grupo controle, níveis

próximos a 2 pmol/L e grupo teste, 4 pmol/L. Também foram dosados os níveis

de mRNA para CCK na mucosa duodenal, que se apresentou 2,4 vezes mais

elevado no grupo tratado com PPIC. Além disso, para verificar se PPIC aumenta

os níveis de CCK diretamente ou por um mecanismo tripsina-dependente,

preservando o fator intestinal de liberação de CCK tripsina-dependente, foi

analisado a expressão e liberação de CCK em linhagens de células

enteroendócrinas STC-1 de murinos, que secretam biologicamente a forma ativa

do peptídeo, CCK-8, assim, não houve diferença significativa nos níveis de mRNA

de CCK e liberação de CCK nas células tratadas com PPIC nas dosagens de 0,1

a 100 µg/mL, sugerindo que o PPIC não estimula diretamente a expressão de

CCK e a liberação in vitro. Estes dados sugerem que o PPIC aumenta a resposta

de CCK primariamente por inibição da atividade proteolítica de tripsina no

intestino delgado, e não por estimulação direta de células produtoras de CCK.

Em adição, em um estudo com 11 indivíduos normais (24-37 anos), em que

estes jejuavam durante a noite e no dia seguinte recebiam juntamente com 40 g

de suco de maçã (sopa), 5 g de farinha de soja, a cada 30 minutos e após a

segunda porção desta mistura, os indivíduos recebiam o café da manhã, foi

avaliado o efeito do inibidor de tripsina de soja presente na farinha de soja. Este

protocolo foi utilizado para fornecer inibidor fresco durante toda digestão da

refeição, devido à inativação tempo-dependente do inibidor de tripsina de soja

pelo suco gástrico. Cada indivíduo foi avaliado duas vezes, uma utilizando a

farinha de soja bruta e outra tratada termicamente. A quantidade do inibidor de

tripsina nessas farinhas foi de 34 mg e de 3 mg respectivamente. A cada dia eram

dosados os níveis de CCK plasmática e foi observado que esses níveis eram

aumentados e mais prolongados quando a refeição era dada com farinha de soja

bruta do que quando esta era dada com a tratada termicamente. Além disso,

foram dosados os níveis de gastrina e neurotensina, e a liberação destas

permaneceu inalterada, sugerindo que não houve mudança generalizada na

liberação de hormônios intestinais (CALAM et al., 1987).

Também em humanos, o efeito de um inibidor de proteinase extraído de batata

(POT II), o qual aumenta a liberação de CCK, foi avaliado sobre o consumo de

alimentos em 11 indivíduos magros. Eles receberam 1,5 g POT II em uma sopa

91


rica em proteínas (70 kcal), apenas a sopa ou um controle que não recebia sopa,

e era apresentado cinco minuto antes do almoço, de acordo com um estudo

duplo-cego. Aqueles que consumiram a sopa sozinha conduziram a uma redução

não significativa de 3% no consumo de energia. A adição de 1,5 g POT II na sopa

reduziu significativamente o consumo de energia em 17,5% (HILL et al., 1990).

Dados esses que corroboram com os resultados apresentados com a

administração do inibidor de tripsina parcialmente purificados de sementes de

tamarindo (ITT2) que ocasionou a redução no ganho ponderal e aumento de CCK

plasmático (50 mg/Kg de peso de inibidor de tripsina) de 5,92 pmol/L + 1,15, do

grupo controle, para 20 pmol/L + 1,22, do grupo tratado com (50 mg/Kg de peso

de inibidor de tripsina), como demonstrado na Figura 18, podendo ser observado

nesse caso um aumento de quase 240% nos níveis de CCK plasmática.

Confirmando esse inibidor no rol dos inibidores com potencial sacietogênico,

recentemente demonstrados na literatura (KOMARNYTSKY; COOK; RASKIN,

2011; NAKAJIMA et al., 2011; CHEN et al., 2012).

Dessa forma, o inibidor de tripsina de tamarindo demonstrou ter um

excelente efeito sacietogênico, mediado por CCK, não apresentando toxicidade,

alterações histológicas bioquímicas significativas. Assim, tornam-se necessários

mais estudos a fim de que sejam verificados os mecanismos pelos quais ocorre o

aumento da secreção de CCK, bem como suas vias de sinalização e relação com

outros hormônios anorexígenos, garantido assim, que o ITT2 tenha sua

promissora ação fitoterápica na prevenção e/ou tratamento da obesidade

compreendida e empregada. A partir dos resultados obtidos e dos dados

apresentados pela literatura, como o feedback negativo apresentado na Figura 2,

foi sugerido um modelo preliminar para explicar o mecanismo pelo qual o inibidor

de tripsina pode promover a saciedade de acordo com a Figura 19.

Assim, como demonstrado na figura 19, quando o alimento chega ao

duodeno, um estímulo via vagal aferente, informa a presença do mesmo ao

cérebro, que imediatamente envia uma resposta, via vagal eferente, para

ocasionar a secreção pancreática. Ao mesmo tempo, a presença desse alimento,

aminoácidos e ácidos graxos, no duodeno estimula liberação fator de liberação de

CCK lumial (FLCL), que possui receptores específicos nas células I, fazendo com

92


ALIMENTO

Estômago

Duodeno

Pâncreas

VIA VAGAL AFERENTE

Cérebro

VIA VAGAL EFERENTE

CCK

ÁCINO

CCK

CCKB

CCK

ENZIMAS

PEPTÍDEO MONITOR

OUTROS

TRIPSINA FATOR DE LIBERAÇÃO DE CCK LUMIAL (FLCL)

PEPTÍDEO MONITOR

PEPTÍDEO MONITOR

FLCL AMINOÁCIDOS

ÁCIDOS GRAXOS

CÉLULA I

Pâncreas

93


Figura 19.Mecanismo proposto.

CCK

Vasos sanguíneos

94


que a mesma promova a liberação de CCK , esta via corrente sanguínea chega

ao pâncreas e se liga a receptores específicos localizados na parede externa dos

ácinos. A ligação de CCK promove a liberação de enzimas, peptídeo monitor (PM)

e outros componentes da secreção pancreática. Ao chegar no duodeno a enzima

tripsina é ativada para promover a degradação de proteínas. O peptídeo monitor

também liberado no duodeno se liga a receptores específicos nas células I e

promove a liberação de mais CCK. A tripsina que antes era utilizada para clivar

proteínas, passa a clivar o FLCL e o PM a fim de que cesse o estímulo para

liberação de mais CCK, e por sua vez, cesse a secreção pancreática. No entanto,

quando há a presença do inibidor de tripsina, este se liga a tripsina, que não pode

ocasionar a clivagem do FLCL e do PM, e estes passam a estimular

continuamente a liberação de CCK, mantendo, assim, os níveis de CCK elevados

por um período mais prolongado.

95


7. CONCLUSÃO

A administração do inibidor de tripsina parcialmente purificado de sementes

de tamarindo, ITT2, em ratos wistar, provocou uma redução no consumo

alimentar; que, por conseguinte, ocasionou uma redução no ganho de peso. O

ITT2 não causou efeito citotóxico e/ou alterações morfohistológicas sobre o

fígado, estômago, intestino ou pâncreas e nem alterou os parâmetros bioquímicos

analisados. A redução do consumo alimentar pode ser mediada pela elevação

dos níveis de CCK acompanhada pela administração de ITT2, já que o inibidor não

provocou perda proteica, uma condição que mostra que os animais não estariam

perdendo peso por estarem desnutrindo devido ao efeito do inibidor.

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