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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS CURSO DE BIOMEDICINA
JOHN LENON DE SOUZA SANTOS
PROTEOMA COMPARATIVO ENTRE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS HUMANAS COM CARIÓTIPO NORMAL E INVERTIDO
Natal - RN
Dezembro de 2016
PROTEOMA COMPARATIVO ENTRE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS HUMANAS COM CARIÓTIPO NORMAL E INVERTIDO
por
John Lenon de Souza Santos
Monografia apresentada à Coordenação do Curso de Biomedicina da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Biomedicina.
Orientadora: Prof.ª Drª Sílvia Regina Batistuzzo de Medeiros
Natal - RN
Dezembro de 2016
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de Biociências - CB
Santos, John Lenon de Souza.
PROTEOMA COMPARATIVO ENTRE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS
HUMANAS COM CARIÓTIPO NORMAL E INVERTIDO / John Lenon de Souza Santos. - Natal, 2016.
62 f.: il.
Monografia (Graduação) - Universidade Federal do Rio Grande
do Norte. Centro de Biociências. Curso de Biomedicina. Orientadora: Profa. Dra. Silvia Regina Batistuzzo de
Medeiros.
1. Células-tronco - Monografia. 2. Bioinformática - Monografia. 3. Proteoma - Monografia. I. Medeiros, Silvia Regina
Batistuzzo de. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 602.9
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais por terem me dado o suporte basal, pois sem isso não
teria conseguido realizar as atividades ao longo da minha trajetória acadêmica. Em
especial à minha mãe, sem ela eu não teria o acesso as oportunidades mínimas.
Apesar das grandes barreiras em todos os sentidos que a vida a impôs, ela fez de
tudo para que as nossas origens humildes não me impedissem de crescer.
Aos meus amigos que estão comigo nessa jornada há 4,5 anos, que tentam me
dar suporte na medida do possível. Com certeza sem eles a caminhada até aqui teria
sido bem mais tortuosa. Obrigado Paulinha, Karol, Alan e Thais por todo apoio!
A Válber, seu apoio nos últimos meses tem sido excepcional e eu só tenho a
agradecer independentemente de qualquer situação!
Aos meus amigos de laboratório, Kamilla e Fábio (obrigado pela ajuda na
formatação do trabalho). Especialmente à Jéssyca Tamyres, pelo apoio emocional
irrestrito que tem me dado, você tem sido muito especial nessa minha caminhada por
ser essa pessoa humilde, caridosa, tão boa que parece que come flores! Meus
sinceros agradecimentos!
A Leorik pelas orientações acadêmicas e por ser uma pessoa maravilhosa, seja
dentro ou fora do mundo acadêmico e por aceitar fazer parte da minha banca.
Ao professor Jonathas Santos pela disponibilidade de fazer parte da minha
banca.
À Ana Rocha, ou simplesmente Ana! Sem você eu jamais teria conseguido
realizar esse trabalho, seria impensável sem você. Obrigado pela disponibilidade, pela
cooperação, por ter me abraçado naquele laboratório quando eu pensava que não iria
conseguir ajuda, por ser essa pessoa simplesmente maravilhosa, que apesar de todas
as suas batalhas pessoais me ajudou sempre que possível. Além de trabalho,
compartilhamos nossas histórias e demos forças um para o outro. Houveram tristezas,
mas também houveram muitos sorrisos e gargalhadas! A você minha imensa gratidão,
não apenas pela sua competência acadêmica, mas simplesmente por existir e
proporcionar mais luz a esse mundo cada vez mais sombrio!!
IV
RESUMO
As Células-tronco mesenquimais humanas (CTMH) têm sido alvo de estudos na área
da medicina regenerativa devido à duas características principais, sua capacidade de
autorrenovação e de diferenciação em outros tipos celulares mediante fatores de
crescimento específicos. O cordão umbilical humano tem sido uma fonte interessante
de obtenção deste tipo celular por ser um tecido descartável e de fácil acesso, todavia,
análises citogenéticas realizadas por nosso grupo de pesquisa revelaram que um dos
cordões analisados possuem uma alteração cromossômica constitutiva. O presente
trabalho teve como objetivo geral analisar o perfil proteico de expressão de CTMH
com diferentes cariótipos. Os dados brutos oriundos da espectrometria de massas
previamente realizada foram extraídos utilizando software Scaffold, com ele foi
possível descobrir a quantidade de proteínas presentes nas células com os cariótipos
distintos, além da expressão comparativa de proteínas entre as células. Além disso,
foram utilizadas ferramentas de bioinformática para se descobrir os processos
biológicos e as funções moleculares relacionados a essas proteínas, além da
construção da rede de interação proteína-proteína para se descobrir as proteínas
principais de grupos de proteínas distintos. Foi possível constatar que as células que
possuem a inversão sofreram alterações que levaram a produção de proteínas
relacionadas ao estresse celular, além disso, há possibilidade dessas células se
transformarem em células cancerígenas. Essas análises corroboram para a
importância de se realizar estudos relacionados a instabilidade genética de CTMH,
tendo como parâmetro o perfil proteico de expressão dessas células.
Palavras-chave: Células-tronco; Proteoma; Cordão umbilical; Inversão; Instabilidade
genética.
V
ABSTRACT
Human mesenchymal stem cells (hMSCs) have been the subject of studies in the field
of regenerative medicine due to its two main characteristics: self-renewal capacity and
the ability to differentiate into other cell types through specific growth factors. Human
umbilical cord has been an interesting source for obtaining these cells for being a
disposable tissue and easily accessible. However, cytogenetic analysis made by our
research group showed that one of the strands have analyzed revealed a
chromosomal change constitutive. The present study had as general objective to
analyze the protein profile of hMSCs expression with different karyotypes. The data
from mass spectrometry were performed using Scaffold software, with it was possible
to discover the amount of protein present in cells with distinct karyotypes, beyond the
comparative expression of proteins between cells. In addition, were used other
bioinformatic tools for discover biological processes and molecular functions related to
these proteins, besides the construction of the protein-protein interaction network to
discover the main proteins of different protein groups. It was possible to verify that the
cells that have an inversion underwent alteration that led to a production of proteins
associated to the cellular stress, in addition, there are possibilities for cells to turn into
cancer cells. These analyzes corroborate the importance of carrying out studies related
to the genetic instability of hMSCs, having as parameter the protein expression profile
of these cells.
Keywords: Stem cells; Proteomic; Umbilical cord; Inversion; Genetic instability.
VI
LISTA DE ABREVIAÇÕES
APC – Adenomatous Polyposis Coli
ATM – Ataxia-telangectasia mutado
BER – Reparo por excisão de bases
CI – Cariótipo invertido
CN – Cariótipo normal
CT – Células-tronco
CT-adultas – Células-tronco adultas
CT-embrionárias – Células-tronco embrionárias
CT-fetais – Células-tronco fetais
CT-hematopoiéticas – Células-tronco hematopoiéticas
CTM – Células-tronco mensenquimais
CTMH – Células-tronco mesenquimais humanas
CTMs-CUh – Células-tronco mesenquimais oriundas do cordão umbilical humano
FMs – Funções moleculares
GSH – Glutationa
MHL1 – MutL Homolog 1
MO – Medula óssea
NAD – Nicotinamida adenina dinucleotídeo
NER – Reparo por excisão de nucleotídeos
PAF – Polipose adenomatosa familiar
PBs – Processos biológicos
RAM – Região de agrupamento de mutação
VCL – Vinculin
VHL – Von Hippel-Lindau supressor de tumor
VII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Fluxograma da metodologia realizada ....................................................... 21
Figura 2: Diagrama de Venn evidenciando a quantificação das proteínas expressas.
..................................................................................................................................22
Figura 3: Quantidade de proteínas de cada grupo relacionado aos processos
biológicos encontrados ao se fazer a comparação entre as proteínas exclusivas das
células com CI com as exclusivas das células com CN. ........................................... 23
Figura 4: Quantidade de proteínas de cada grupo relacionado as funções moleculares
encontradas ao se fazer a comparação entre as proteínas exclusivas das células com
CI com as exclusivas das células com CN. ............................................................... 23
Figura 5: Quantidade de proteínas de cada grupo de processo biológico encontrado
ao se fazer a comparação entre as proteínas up reguladas das células com CI e das
células com CN. ........................................................................................................ 24
Figura 6: Quantidade de proteínas de cada grupo de processo biológico encontrado
ao se fazer a comparação entre as proteínas down reguladas das células com CI e
das células com CN. ................................................................................................. 25
Figura 7: Quantidade de proteínas de cada grupo relacionada as funções moleculares
encontradas ao se fazer a comparação entre as proteínas up reguladas das células
com CI e das células com CN. .................................................................................. 26
Figura 8: Quantidade de proteínas de cada grupo relacionada as funções moleculares
encontradas ao se fazer a comparação entre as proteínas down reguladas das células
com CI e das células com CN. .................................................................................. 26
Figura 9: Rede de interação proteica das proteínas exclusivas das células com CI
evidenciando a proteína central. Colorações mais próximas de azul indicam valores
menores de degree, enquanto colorações mais próximas de vermelho indicam valores
maiores. Círculos menores indicam valores menores de betweenness, enquanto
círculos maiores indicam valores maiores. ................................................................ 27
Figura 10: Medida de centralidade das proteínas exclusivas das células com CI
evidenciando a proteína com maior valor de degree e betwenness .......................... 27
Figura 11: Rede de interação proteica das proteínas exclusivas das células com CN
evidenciando a proteína central. Colorações mais próximas de azul indicam valores
menores de degree, enquanto colorações mais próximas de vermelho indicam valores
VIII
maiores. Círculos menores indicam valores menores de betweenness, enquanto
círculos maiores indicam valores maiores. ................................................................ 28
Figura 12: Medida de centralidade das proteínas exclusivas das células com CN
evidenciando a proteína com maior valor de degree e betwenness .......................... 28
Figura 13: Rede de interação proteica das proteínas up reguladas das células com CI
evidenciando a proteína central. Colorações mais próximas de azul indicam valores
menores de degree, enquanto colorações mais próximas de vermelho indicam valores
maiores. Círculos menores indicam valores menores de betweenness, enquanto
círculos maiores indicam valores maiores. ................................................................ 29
Figura 14: Medida de centralidade das proteínas up reguladas das células com CI
evidenciando as proteínas com maiores valores de degree e betweenness............. 29
Figura 15: Rede de interação proteica das proteínas up reguladas das células com CN
evidenciandos as proteínas centrais. Colorações mais próximas de azul indicam
valores menores de degree, enquanto colorações mais próximas de vermelho indicam
valores maiores. Círculos menores indicam valores menores de betweenness,
enquanto círculos maiores indicam valores maiores ................................................. 30
Figura 16: Medida de centralidade das proteínas up reguladas das células com CN
evidenciando as proteínas com maiores valores de degree e betwenness............... 30
Figura 17: Rede de interação proteica das proteínas down reguladas das células com
CI evidenciando a proteína gargalo. Colorações mais próximas de azul indicam
valores menores de degree, enquanto colorações mais próximas de vermelho indicam
valores maiores. Círculos menores indicam valores menores de betweenness,
enquanto círculos maiores indicam valores maiores ................................................. 31
Figura 18: Medida de centralidade das proteínas down reguladas das células com CI
evidenciando a proteína com maior valor de degree e betweenness ........................ 31
Figura 19: Rede de interação proteica das proteínas down reguladas das células com
CN evidenciando a proteína principal. Colorações mais próximas de azul indicam
valores menores de degree, enquanto colorações mais próximas de vermelho indicam
valores maiores. Círculos menores indicam valores menores de betweenness,
enquanto círculos maiores indicam valores maiores ................................................. 32
Figura 20: Medida de centralidade das proteínas down reguladas das células com CN
evidenciando a proteína com maior valor de degree e betweenness ........................ 32
IX
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Proteínas exclusivas das células com cariótipo invertido .......................... 43
Tabela 2: Proteínas exclusivas das células com cariótipo normal. ............................ 44
Tabela 3: Proteínas presentes nas células com cariótipo invertido e normal
(interseção). .............................................................................................................. 47
SUMÁRIO
RESUMO .............................................................................................................................................. IV
ABSTRACT ........................................................................................................................................... V
LISTA DE ABREVIAÇÕES ............................................................................................................... VI
LISTA DE FIGURAS .......................................................................................................................... VII
1 – INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 11
1.1 – Células-tronco mesenquimais humanas – breve abordagem ................................ 11
1.2 – Cordão umbilical humano como fonte de células-tronco ....................................... 12
1.3 – Instabilidade genética ....................................................................................................... 13
1.4 – Genes relacionados ao reparo do DNA e supressores tumorais - breves
considerações ............................................................................................................................... 14
1.5 – Proteoma e Biologia de sistemas .................................................................................. 16
2 – OBJETIVOS ................................................................................................................................. 18
2.1 – Objetivos Específicos ....................................................................................................... 18
3 – METODOLOGIA .......................................................................................................................... 19
3.1 – Determinação das proteínas diferencialmente expressas .................................... 19
3.1.2 – Classes funcionais das proteínas ......................................................................... 19
4 – RESULTADOS ............................................................................................................................. 22
4.1 – Análise quantitativa e qualitativa da expressão proteica ...................................... 22
4.2 – Classes funcionais........................................................................................................... 22
4.3 – Biologia de sistemas ....................................................................................................... 27
5 – DISCUSSÃO ....................................................................................................................................... 33
6 – CONCLUSÃO .............................................................................................................................. 37
7 – REFERÊNCIAS............................................................................................................................ 38
8 – APÊNDICE ................................................................................................................................... 43
11
1 – INTRODUÇÃO
1.1 – Células-tronco mesenquimais humanas – breve abordagem
As células-tronco (CT) podem ser definidas segundo três propriedades: auto-
renovação, ou seja, capacidade de originar outra CT com características idênticas;
habilidade de se diferenciar em mais de uma linhagem celular; e capacidade de
originar células funcionais nos tecidos derivados da mesma linhagem. As CT são
células indiferenciadas capazes de se diferenciar originando progenitores maduros,
bem como células efetoras completamente diferenciadas. Além disso, as CT podem
ser classificadas segundo sua potencialidade em toti, pluri ou multipotentes. São
chamadas de totipotentes as células capazes de gerar todos os tipos celulares
embrionários e extra-embrionários; as pluripotentes podem originar todas as células
que formam um embrião (propriamente dito) e são provenientes da massa interna do
blastocisto (CT-embrionárias); são classificadas como multipotentes as células que
originam apenas um subgrupo de linhagens celulares, por exemplo, as CT-
mesenquimais (CTM) e neurais (Revisado por Schwindt et al., 2005).
Pode-se dividir as fontes de CT em três classes: embrionária, fetal e adulta. As
CT-embrionárias (CTE) são derivadas da massa interna do blastocisto cinco dias após
fertilização (em humanos). O uso dos fatores tróficos é essencial, visto que, na sua
ausência, as CTE se diferenciam espontaneamente em todos os tipos de tecidos.
Tem-se as CT-adultas que, ao contrário das CTE, não são capazes de manter suas
propriedades por longos períodos em cultura e podem ser induzidas à diferenciação
com a administração de fatores de crescimento apropriados ou outros sinais externos.
Uma das fontes mais utilizadas para extração de CT-adultas é a medula óssea,
amplamente estudada face ao uso clínico em transplantes. Nesse tecido,
encontramos dois tipos de CT: as hematopoiéticas e as mesenquimais. As CT-
hematopoiéticas são responsáveis por toda progênie granulocítica e mielocítica. Além
da medula óssea, vários outros tecidos possuem suas próprias CTM, como sangue
periférico, tecido adiposo e sangue de cordão umbilical, entre outros. Ao que concerne
as CT-fetais, assim como as adultas, não se diferenciam espontaneamente e ainda
apresentam outras vantagens: estão presentes em abundância por todo o organismo
em desenvolvimento e possuem maior potencial de autorrenovação. Teoricamente,
pode-se isolar CT-fetais de qualquer tecido, desde que a extração ocorra durante a
12
formação destes tecidos no período fetal. No entanto, há importantes questões éticas
envolvidas na extração de tais células de humanos (Revisado por Schwindt et al.,
2005).
Ao que concerne às CTM, é sabido que a existência delas foi inicialmente
sugerida por Cohnheim, há mais de 130 anos. No entanto, foi com os achados de
Friedenstein et al., em meados de 1970, que essa teoria veio a ser comprovada. Eles
encontraram, em uma cultura de células da medula óssea, uma população de células
aderidas ao plástico em forma de fuso, semelhantes a fibroblastos. Observaram
também que essas células possuíam capacidade para se diferenciar em colônias que
lembravam pequenos depósitos de osso ou cartilagem (Revisado por Schwindt et al.,
2005). As CTM são uma linhagem de células-tronco somáticas residentes em regiões
perivasculares de todos os tecidos desenvolvidos (adultos), incluindo a medula óssea
(MO), o tecido adiposo, o tecido muscular, entre outros. Essas células são
multipotentes e capazes de se diferenciar e produzir vários tipos de linhagens
celulares necessárias num processo de reparação, como osteoblastos, condroblastos,
hepatócitos, neurônios, entre outras (Revisado por Monteiro et al., 2010). Por esses
motivos, as células-tronco mesenquimais humanas (CTMH) têm sido alvo de estudos
na área da medicina regenerativa devido à sua capacidade de diferenciação em
diversos tipos celulares e de autorrenovação (Lemischka IR et al., 2005).
1.2 – Cordão umbilical humano como fonte de células-tronco
O cordão umbilical humano tem sido tratado como um resíduo de risco biológico
após o nascimento. Todavia, a literatura tem evidenciado que esse tipo de tecido é
uma fonte mais rica de células-tronco mesenquimais ao se comparar com o sangue
(Revisado por Yun et al., 2016). Além disso, essas células provenientes do cordão
umbilical humano (CTMs-CUh) podem ser usadas sem levantar nenhum problema
ético, já que trata-se de um tecido extraembrionário geralmente descartado. Outros
pontos positivos são que as CTMs-CUh possuem um potencial de diferenciação
multipotente, estreita relação ontogenética com as células-tronco embrionárias e
proliferam mais rapidamente do que as células-tronco mesenquimais adultas
(Revisado por He et al., 2016). Então, por esses motivos, entre outros, o cordão
umbilical humano é uma excelente fonte para se obter células-tronco mesenquimais
que podem ser usadas na área da medicina regenerativa, por exemplo.
13
1.3 – Instabilidade genética
Dados prévios obtidos a partir de uma análise citogenética por bandeamento G
que foi realizada pelo nosso grupo de pesquisa, técnica relevante para detectar
alterações cromossômicas, revelaram uma inversão paracêntrica no braço curto do
cromossomo 3 (3p25–26) das CTMH oriundas de um cordão umbilical.
Inversões cromossômicas podem levar a instabilidade genética. Uma inversão
ocorre quando um único cromossomo sofre duas quebras e é reconstituído com este
mesmo segmento entre os pontos de quebra invertido. As inversões não afetam o
indivíduo fenotipicamente, entretanto, o portador de cada tipo de inversão apresenta
o risco de produzir gametas anormais que podem levar a uma prole desbalanceada,
tanto com a duplicação quanto deficiência de segmentos de cromossomo invertido
(Revisado por Vieira & Ferrari, 2011)
Entre as inversões, há as inversões paracêntricas, que são rearranjos
cromossômicos balanceados envolvendo 2 quebras no mesmo braço cromossômico
seguidos de uma rotação de 180° do segmento cromossômico e sua re-inserção.
Considera-se que a maioria das inversões tem pontos de interrupção únicos. A
incidência em seres humanos é considerada rara, sendo estimada em 0,1-0,5 / 1.000
na população. Em geral, as inversões paracêntricas mais aparentemente balanceadas
parecem ser inofensivas. Entretanto, infertilidade, abortos espontâneos e retardo
mental também foram relatados em alguns portadores desse tipo de inversão.
Portanto, são necessários métodos moleculares citogenéticos para detectar ou
descartar a presença de uma alteração cromossômica desbalanceada, principalmente
quando se trata de células-tronco mesenquimais utilizadas em terapias gênicas. A
maioria das inversões aparentemente balanceadas são geralmente clinicamente
assintomáticas, pois não envolvem uma variação quantitativa do material genético. As
inversões paracêntricas foram descritas em todos os cromossomos humanos, mas
são mais comuns nos cromossomos 1, 3, 5, 6, 7, 11 e 14 (Rigola et al., 2015).
14
1.4 – Genes relacionados ao reparo do DNA e supressores tumorais - breves
considerações
Nosso genoma está exposto continuamente a uma infinidade de agentes que
podem danificar o DNA. As vias de reparo do DNA fazem parte de uma das linhsa de
defesa contra lesões citotóxicas e mutagênicas que ocorrem no DNA. A fim de manter
a integridade do genoma, a maquinaria de reparo do DNA deve ser muito eficiente e
precisa e para tanto, para reconhecer os diferentes tipos de lesões, existem diversas
vias de reparo nomeadas de Mismatch repair, Reparo por excisão de bases (BER),
Reparo por excisão de nucleotídeos (NER), Reparo direto e Reparo por
recombinação. Além disso, deve fazê-lo em uma variedade enorme de diferentes
contextos genômicos, desde atuar dentro da heterocromatina altamente compactada
à lesões expostas na cadeia molde de um gene ativamente transcrito. Falhas nesse
sistema de reparação nesses contextos pode dar origem a mutações que contribuem
para o desenvolvimento de câncer e de outras doenças humanas (Wyrick & Roberts,
2015).
Câncer é uma doença em que as células com alterações genéticas crescem de
forma anormal, invadindo outros tecidos e perdendo sua função original. As causas
primárias ainda não estão muito bem esclarecidas, mas as neoplasias surgem devido
às mutações genéticas espontâneas ou induzidas por agentes patogênicos como
metais, radiações, radicais livres do oxigênio, inflamações crônicas e xenobióticos
(tabaco, álcool, pesticidas, por exemplo) entre outros que promovem desordem no
ciclo celular, ocorrendo excesso na taxa de proliferação e deficiência nas taxas de
morte celular. Este processo culmina com a formação de agrupamentos de clones de
células neoplásicas, ou seja, tumores (Revisado por Fernandes & Mafra, 2005). Os
genes envolvidos com o desenvolvimento câncer são: Ataxia-telangectasia
mutado (ATM) – principal regulador da via de reparo da quebra da cadeia dupla de
DNA após estresse genotóxico (Zhao Y, et al., 2014) –, BRCA – Este gene codifica
uma fosfoproteína nuclear que desempenha um papel na manutenção da estabilidade
genômica, além de atuar como um supressor de tumor –, MutL Homolog 1 (MHL1) –
É um homólogo humano do gene mutL responsável pela reparação do DNA de E.coli,
– XPA – Responsável pelo reconhecimento e reparo de dano do DNA –, APC
(Adenomatous Polyposis Coli) – Este gene codifica uma proteína supressora de
tumor. Também está envolvido em outros processos, incluindo migração celular e
15
adesão, ativação transcricional e apoptose –, RB – A proteína codificada por este gene
é um regulador negativo do ciclo celular e foi o primeiro gene supressor tumoral
encontrado. Os defeitos neste gene são uma das causas do câncer retinoblastoma na
infância –, TP53 (P53 Supressor de tumor) – Este gene codifica uma proteína
supressora de tumor contendo domínios de ativação transcricional, ligação ao DNA e
oligomerização -, VHL (Von Hippel-Lindau supressor de tumor) – Defeitos neste gene
causam a polipose adenomatosa familiar (PAF), uma doença pré-maligna
autossômica dominante que geralmente progride para malignidade. As mutações
associadas à doença tendem a ser agrupadas numa pequena região designada região
de agrupamento de mutação (MCR) e resultam numa proteína truncada
(http://www.genecards.org).
Ao que concerne ao desenvolvimento de tumores, o que ocorre é que nas
células cancerosas há o silenciamento dos genes supressores de tumor. Ocorrem
mutações de perda de função no locus onde há esses genes supressores de tumor.
As deleções, inserções, mutações nonsense (quando um códon de resíduo de
aminoácido é substituído por um códon de terminação) mutações frame-shift (inserção
ou a deleção de pares de nucleótideos), mutações missense (substituição de
nucleotídeo que resulta em troca de aminoácido) ou alterações epigenéticas (O termo
epigenética significa “em adição à informação genética codificada no DNA” e é
utilizado para definir alterações que ocorrem na expressão gênica sem, no entanto,
ocorrer nenhuma alteração na sequência do código genético) (Revisado por Costa, E.
B. O.; Pacheco, C. 2013) que inativam a atividade funcional de uma proteína são todas
observadas em genes supressores de tumor. Na maioria dos genes supressores de
tumor, tais como RB, ambos os alelos do gene devem ser inativados para ocorrer a
tumorigênese. Em outros genes supressores de tumor, tais como TP53 e PTEN, uma
mutação num único alelo pode ser suficiente para dar origem a um fenótipo celular
alterado, resultando em diminuição da função supressora de tumor, acarretando no
desenvolvimento e progressão de tumores (Liu et al., 2012). Portando, modificações
tanto nos genes relacionados ao reparo do DNA quanto alterações ligadas aos genes
supressores de tumor, podem levar ao desenvolvimento de patologias nos indivíduos
que as portam. Na região da inversão encontrada nas CTMH do cordão umbilical,
estão presentes genes relacionados com o reparo do DNA e os genes supressores
de tumor.
16
1.5 – Proteoma e Biologia de sistemas
Proteoma não é apenas a soma dos produtos traduzidos a partir das
sequências genômicas, mas inclui também proteínas resultantes de processos pós-
transcricionais e pós-traducionais, bem como complexos formados por essas
biomoléculas. Além de sua grande complexidade, o proteoma é dinâmico e seu perfil
se altera de acordo com o status fisiológico e as fases da diferenciação celular.
Algumas estimativas sugerem que mais de um milhão de diferentes tipos de proteínas
estão presentes nas células, nos tecidos e nos fluidos corporais em condições e/ou
momentos distintos. O termo proteômica refere-se ao estudo do conjunto dessas
moléculas, que são responsáveis direta ou indiretamente pelo controle de todos ou
quase todos os processos biológicos (Revisado por Barbosa et al., 2012). A
proteômica estuda de forma descritiva e quantitativa desde o conjunto de proteínas
de uma organela subcelular até aquelas de um ecossistema, suas variações na
população, mudanças em resposta a um ambiente ou decorrentes do
desenvolvimento normal ou alterado, e modificações e interações com outras
proteínas (Valledor & Jorrin, 2011).
Para se realizar o estudo da proteômica, pode-se consultar as anotações de
proteínas com dados da literatura que estão acessíveis através da base de dados de
proteínas Uniprot (www.uniprot.org) e as suas funções respectivas podem ser
acessadas na base sistemática de proteínas Gene Ontology (GO)
(www.geneontology.org) (The-Gene-Ontology-Consortium, 2015) (Revisado porr
Palmfeldt & Bross, 2016).
Numa análise proteômica quantitativa do perfil de expressão diferencial de
proteínas de superfície de CTMH comerciais submetidas à diferenciação em
osteoblastos, foi encontrado um total de 463 proteínas (Foster et al., 2005). Em outro
experimento no qual também foi realizada a análise quantitativa de proteínas de
superfícies, todavia utilizando CTMH oriundas da medula óssea, foi encontrado um
total de 1,001 proteínas (Lee et al., 2013). Em outro experimento no qual também foi
realizada uma análise proteômica tendo CTMH oriundas da medula óssea e do tecido
nervoso como fontes, verificou-se um total 1664 – 607 oriundas das CT da MO e 1052
proteínas oriundas das CT do tecido nervoso (Bryukhovetskiy et al., 2014).
A Biologia de Sistemas é uma ferramenta que permite através da construção
de modelos matemáticos, simulações e técnicas de processamento de dados, a
17
integração de informações das ciências ômicas e dados clínico-epidemiológicos de
forma que se consiga um maior entendimento das interações entre os componentes
dos sistemas vivos e de seus processos biológicos (Revisado por Mesquita et al.,
2013). Na proteômica, a Biologia de sistemas é uma ferramenta utilizada para se
construir a rede de interação proteína-proteína com o objetivo de se entender
justamente as interações existentes entre essas moléculas.
Portanto, para a análise dos possíveis efeitos da inversão paracêntrica
apresentada nas CTMH do cordão umbilical, em nível proteico, foi utilizada a
proteômica aliada à biologia de sistemas.
18
2 – OBJETIVOS
O presente trabalho teve como objetivo geral analisar o perfil de expressão de
células-tronco mesenquimais humanas com diferentes cariótipos.
2.1 – Objetivos Específicos
Identificar, a partir de dados de Espectrometria de Massas, o perfil proteico de
células-tronco mesenquimais oriundas da veia do cordão umbilical humano
com cariótipo invertido e com cariótipo normal;
Identificar as proteínas “up” e “down” reguladas;
Identificar as classes funcionais das proteínas;
Realizar uma análise de Biologia de Sistemas.
19
3 – METODOLOGIA
3.1 – Determinação das proteínas diferencialmente expressas
O cultivo das células com cariótipo normal e invertido, extração proteica,
caracterização em gel de acrilamida (SDS-PAGE) foram realizados previamente no
LBMG/UFRN. O extrato proteico foi enviado ao Laboratório de Espectrometria de
Massas do Laboratório Nacional de Biociências, CNPEM-ABTLuS da UNICAMP, para
a análise de espectrometria de massas pelo espectrômetro Q-Tof.
Os dados gerados pela espectrometria de massas foram então usados no
presente trabalho.
Para averiguar a expressão das proteínas foi utilizado o software Scaffold
(http://www.proteomesoftware.com/products/scaffold/). Com essa ferramenta, é
possível ler os dados brutos oriundos da espectrometria de massas. Ele gera uma
lista com a quantidade e com os nomes das proteínas e o valor de Fold Change. Este
valor revela o aumento na expressão de uma determinada proteína – de um tipo
celular em relação ao outro. Portanto, foi possível observar quais e quantas proteínas
foram expressas nos dois tipos celulares analisados (células com cariótipo normal
(CN), células com cariótipo invertido (CI) de forma exclusiva ou em ambas). Além
disso, o software em questão atribui um número de identifcação próprio (gi number ou
IDs) para cada proteína.
3.1.2 – Classes funcionais das proteínas
Por meio da lista gerada pelo software Scaffold, foram selecionados os IDs das
proteínas exclusivas das células com CN, juntamente com os IDs das proteínas up
reguladas dessas mesmas células (grupo de proteínas utilizado para se descobrir as
funções moleculares (FMs) e os processos biológicos (PBs) das proteínas up
reguladas das células com CN). Também foram selecionados os IDs das proteínas
exclusivas das células com CN com os IDs das proteínas down reguladas dessas
mesmas células (grupo de proteínas utilizado para se descobrir as FMs e os PBs das
proteínas down reguladas das células com CN). Esses mesmos passos foram
repetidos para as células com CI. Também foram selecionados os IDs exclusivos das
20
células com CI, assim como os IDs exclusivos das células com CN para se fazer a
comparação entre esses dois grupos de proteínas.
Os IDs foram convertidos pela ferramenta de conversão de IDs em Uniprot
(http://www.uniprot.org/uploadlists/) para a conversão dos números de identificação
gerados pelo Scaffold para números de identificação compatíveis com a ferramenta
String
Para se descobrir as classes funcionais das proteínas pela ferramenta String
(http://string-db.org/cgi/input.pl), primeiramente foi utilizada a ferramenta de
conversão de IDs em Uniprot (http://www.uniprot.org/uploadlists/) para a conversão
dos números de identificação gerados pelo Scaffold para números de identificação
compatíveis com a ferramenta String. Esse processo levou a formação de 6 listas –
proteínas up e down reguladas das células com CI e proteínas up e down reguladas
das células com CN, além da lista das proteínas exclusivas das células com CI e
exclusivas das células com CN.
As 6 listas geradas com os dados de identificação compatíveis foram
importadas para a ferramenta String, onde se acessaram os PBs e as FMs das
proteínas envolvidas. Para cada lista foram geradas mais duas com os dados dos PBs
e das FMs, portanto, 12 listas.
Em seguida, foi utilizada a ferramenta REVIGO (http://revigo.irb.hr/) para filtrar
os termos redundantes das listas e para se poder visualizar os grupos de proteínas
mais expressos. Com os dados gerados pela ferramenta, foi feita a comparação dos
PBs e das FMs existentes entre as proteínas up reguladas das células com CI e CN,
além das proteínas down reguladas e entre as proteínas exclusivas das células com
CI e as exclusivas das células com CN.
Por fim, foi feito o estudo da Biologia de Sistemas. As redes geradas na
ferramenta String foram exportadas para a ferramenta Cytoscape
(http://www.cytoscape.org/) para a identificação das medidas de centralidade –
quando a proteína apresenta os maiores valores de betweenness (quantidade de
caminhos mais curtos que passam pela proteína) e degree (quantidade de conexões
que a proteína faz com as outras) – e com isso identificar as proteínas centrais ou
proteínas gargalo, que são justamente as proteínas com maiores valores de
centralidade.
21
Figura 1: Fluxograma da metodologia realizada.
.
22
4 – RESULTADOS
4.1 – Análise quantitativa e qualitativa da expressão proteica
Foi encontrado um total de 324 proteínas expressas, sendo que 15 foram
expressas apenas nas células com CI (Apêndice, Tabela 1), 43 foram expressas
apenas nas células com CN (Apêndice, Tabela 2) e 266 foram expressas em ambas
as células (Apêndice, Tabela 3) (Fig. 2). Além disso, das 266 proteínas da interseção,
156 proteínas foram suberexpressas nas células com CI comparando-se às células
com CN e 91 foram superxpressas fazendo a mesma comparação.
Figura 2: Diagrama de Venn evidenciando a quantificação das proteínas expressas.
4.2 – Classes funcionais
Ao se fazer a comparação dos PBs e das FMs entre os grupos de proteínas
exclusivas das células com CI com as exclusivas das com CN, foram observados dois
PBs centrais: organização do citoesqueleto – processo encontrado nas células com
CI – e organização do citoesqueleto – processo encontrado nas células com CN –
(Fig. 3). Quando foi realizada a comparação das FMs, também foram encontrados
apenas dois grupos: constituição do citoesqueleto – função encontrada nas células
com CI – e ligação ao RNA – função encontrada nas células com CN – (Fig. 4).
CI CN
15 266 43
23
Processos Biológicos
CN
CI
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Organização do citoesqueleto Transporte intracelular
Figura 3: Quantidade de proteínas de cada grupo relacionado aos processos biológicos encontrados
ao se fazer a comparação entre as proteínas exclusivas das células com CI com as exclusivas das
células com CN.
Figura 4: Quantidade de proteínas de cada grupo relacionado as funções moleculares encontradas ao
se fazer a comparação entre as proteínas exclusivas das células com CI com as exclusivas das células
com CN.
Ao se fazer a comparação entre as proteínas up reguladas das células com CI
e CN encontradas, levando em consideração os PBs, foram observados apenas
processos gerais as quais as proteínas estavam relacionadas. Foram encontrados
grupos de proteínas relacionados a regulação negativa dos processos biológicos,
regulação negativa dos processos celulares, regulação da qualidade dos processos
biológicos, regulação dos processos apoptóticos, resposta ao estresse e resposta a
estímulos. Sendo estes encontrados apenas nas células com CI. Além desses, foram
encontrados os seguintes PBs: inibição da tradução, regulação da morte celular,
Funções Moleculares
CN
CI
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Ligação ao RNA Constituição do citoesqueleto
24
regeneração teidual, resposta a lesão tecidual e regulação dos fluidos corporais.
Processos estes encontrados apenas nas células com CN (Fig. 5).
Figura 5: Quantidade de proteínas de cada grupo de processo biológico encontrado ao se fazer a
comparação entre as proteínas up reguladas das células com CI e das células com CN.
Ao se fazer uma comparação similar, todavia dos grupos de proteínas down
reguladas, também foram encontrados processos muito gerais. Os PBs relacionados
a resposta a lesão tecidual, regenaração tecidual e proteínas de ligação foram
encontrados apenas nas células com CI. Já os processos relacionados a resposta a
estímulos, regulação negativa dos processos biológicos, regulação dos fluidos
corporais, regulação dos processos do sistema imune e regulação da qualidade
biológica foram encontrados apenas nas células com CN. Dos 10 processos
biológicos encontrados nas proteinas down reguladas, apenas 2 são comuns aos dois
tipos celulares, processos de regulação negativa dos processos celulares e regulação
dos processos apoptóticos. Sendo que há uma quantidade maior de proteínas nas
células com CI que estão relacionadas a esses processos aos se comparar as
proteínas presentes nas células com CN (Fig. 6).
Processos Biológicos - UP
Regulação negativa dos processos biológicos
Regulação negativa dos processos celulares
Regulação da qualidade do processos biológicos
Regulação dos processos apoptóticos
Resposta ao estresse
Resposta a estímulos
Inibição da tradução
Regulação da morte celular
Regeneração tecidual
Resposta a lesão tecidual
Regulação dos fluidos corporais
0 10 20 30 40 50 60
CN CI
25
Figura 6: Quantidade de proteínas de cada grupo de processo biológico encontrado ao se fazer a
comparação entre as proteínas down reguladas das células com CI e das células com CN.
Ao que concerne as FMs, também foram encontrados grupos de proteínas com
funções bem gerais, seja quando se faz a comparação das proteínas up ou down
reguladas.
Ao fazer a comparação das FMs encontradas das proteínas up reguladas,
foram encontrados grupos de proteínas relacionados a ativação de moléculas
estruturais e constituintes do citoesqueleto apenas nas células com cariótipo CI e um
grupo de enzimas de ligação apenas nas células com CN. Também foi possível
observar que há uma quantidade maior de proteínas de ligação ao RNA de maneira
geral nas células com CN ao se comparar às células com CI, havendo mais do que o
dobro de proteínas relacionadas a essas funções nas células com CN (Fig. 7).
Processos Biológicos - Down
Resposta a lesão tecidual
Regeneração tecidual
Proteinas de ligação
Resposta a estímulos
Regulação negativa dos processos biológicos
Regulação negativa dos processos celulares
Regulação dos fluidos corporais
Regulação dos processos do sistema imune
Regulação da qualidade biológica
Regulação dos processos apoptóticos
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
CI CN
26
Figura 7: Quantidade de proteínas de cada grupo relacionada as funções moleculares encontradas ao
se fazer a comparação entre as proteínas up reguladas das células com CI e das células com CN.
Já ao se comparar os grupos de proteínas down reguladas encontrados
relacionados as FMs, observou-se uma ativação de moléculas estruturais apenas nas
células com CN. Além disso, observou-se uma quantidade maior de de proteínas de
ligação ao RNA nas células com CI ao se comparar às células com CN (Fig. 8).
Figura 8: Quantidade de proteínas de cada grupo relacionada as funções moleculares encontradas ao
se fazer a comparação entre as proteínas down reguladas das células com CI e das células com CN.
Não foi encontrado nenhum grupo de proteínas que indicasse que houve
alguma alteração na supressão tumoral ou no reparo de DNA (região do cromossomo
3 onde houve a inversão) em nenhuma das comparações realizadas, nem no cenário
de comparação entre as proteínas up ou down reguladas.
Função Molecular - UP
Ativação de moléculas estruturais
Constituintes estruturais do citoesqueleto
Enzimas de ligação
Ligação ao cauda poly (A) RNA
Ligação ao RNA
0 10 20 30 40 50 60 70
CI CN
Função Molecular - DOWN
Ligação a cauda poly (A) RNA
Ligação ao RNA
Moléculas estruturais ativadas
0 10 20 30 40 50 60
CI CN
27
4.3 – Biologia de sistemas
Quando se construiu a rede de interação proteica das proteínas exclusivas das
células com CI, a proteína KRT16 foi constatada como a principal da rede (Fig. 9), fato
confirmado pelo gráfico de medida de centralidade, que levou em consideração os
maiores valores de degree (quantidade de conexões que a proteína faz com as outras)
e betweennes (quantidade de caminhos mais curtos que passam pela proteína), (Fig.
10).
Figura 9: Rede de interação proteica das proteínas exclusivas das células com CI evidenciando a
proteína central. Colorações mais próximas de azul indicam valores menores de degree, enquanto
colorações mais próximas de vermelho indicam valores maiores. Círculos menores indicam valores
menores de betweenness, enquanto círculos maiores indicam valores maiores.
Figura 10: Medida de centralidade das proteínas exclusivas das células com CI evidenciando a
proteína com maior valor de degree e betwenness.
Degree
Beetweenness
28
Ao se construir a rede de interação proteica das proteínas exclusivas das
células com CN, a proteína RHOA foi observada como a principal da rede (Fig. 11),
fato confirmado pelo gráfico de medida de centralidade (Fig. 12).
Figura 11: Rede de interação proteica das proteínas exclusivas das células com CN evidenciando a
proteína central. Colorações mais próximas de azul indicam valores menores de degree, enquanto
colorações mais próximas de vermelho indicam valores maiores. Círculos menores indicam valores
menores de betweenness, enquanto círculos maiores indicam valores maiores.
Figura 12: Medida de centralidade das proteínas exclusivas das células com CN evidenciando a
proteína com maior valor de degree e betwenness.
Degree
Beetweenness
29
Ao se fazer a construção da rede das proteínas up reguladas das células com
CI foi observada uma proteína (GAPDH) em destaque com maior centralidade, além
proteína VCL, todavia com menor centralidade (Fig. 13) e no gráfico de medida de
centralidade foi possível confirmá-la como uma proteína gargalo (Fig. 14).
Figura 13: Rede de interação proteica das proteínas up reguladas das células com CI evidenciando
a proteína central. Colorações mais próximas de azul indicam valores menores de degree, enquanto
colorações mais próximas de vermelho indicam valores maiores. Círculos menores indicam valores
menores de betweenness, enquanto círculos maiores indicam valores maiores.
Figura 14: Medida de centralidade das proteínas up reguladas das células com CI evidenciando as
proteínas com maiores valores de degree e betweenness.
Degree
Beetweenness
VCL
30
Ao se fazer a construção da rede das proteínas up reguladas das células com
CN, foram observadas duas proteínas com maior centralidade: CCT3 e DECR1 (Fig.
15). Com a construção do gráfico de medida de centralidade foi possível confirmar
essas proteínas como centrais ou proteínas gargalo da rede de interação (Fig. 16).
Figura 15: Rede de interação proteica das proteínas up reguladas das células com CN evidenciandos
as proteínas centrais. Colorações mais próximas de azul indicam valores menores de degree, enquanto
colorações mais próximas de vermelho indicam valores maiores. Círculos menores indicam valores
menores de betweenness, enquanto círculos maiores indicam valores maiores.
Figura 16: Medida de centralidade das proteínas up reguladas das células com CN evidenciando as
proteínas com maiores valores de degree e betwenness.
Foi observada na rede de interações das proteínas down reguladas das células
com CI que a proteína UBC é a central da rede (Fig. 17) e que possui os maiores
valores de degree e betweenness (Fig. 18).
Degree
Beetweenness
31
Figura 17: Rede de interação proteica das proteínas down reguladas das células com CI evidenciando
a proteína gargalo. Colorações mais próximas de azul indicam valores menores de degree, enquanto
colorações mais próximas de vermelho indicam valores maiores. Círculos menores indicam valores
menores de betweenness, enquanto círculos maiores indicam valores maiores.
Figura 18: Medida de centralidade das proteínas down reguladas das células com CI evidenciando a
proteína com maior valor de degree e betweenness.
Por fim, na rede de interações das proteínas down reguladas das células com
CN, também foi encontrada a proteína GAPDH como proteína gargalo (Fig.19), fato
evidenciado no gráfico de medida de centralidade (Fig. 20).
Degree
Beetweenness
32
Figura 19: Rede de interação proteica das proteínas down reguladas das células com CN evidenciando
a proteína principal. Colorações mais próximas de azul indicam valores menores de degree, enquanto
colorações mais próximas de vermelho indicam valores maiores. Círculos menores indicam valores
menores de betweenness, enquanto círculos maiores indicam valores maiores.
Figura 20: Medida de centralidade das proteínas down reguladas das células com CN evidenciando a
proteína com maior valor de degree e betweenness.
Degree
Beetweenness
33
5 – DISCUSSÃO
Ao se comparar a quantidade de proteínas encontrada no presente trabalho
com os dados da literatura, observou-se que mesmo quando se realizou a proteômica
apenas das proteínas de superfície de CTMH, a quantidade de proteínas detectada
em outros trabalhos foi maior, como nos trabalhos de Foster e colaboradores (2005)
– 463 proteínas – e Lee e colaboradores (2013) – 1,001 proteínas. Em um trabalho
realizado por Bryukhovetskiy e colaboradores (2014), foi feita a proteômica das células
como um todo de duas fontes de obtenção diferentes e as quantidades de proteínas
encontradas também foram maiores – 607 (proteínas de CT da MO) e 1052 (proteínas
de CT do tecido nervoso). Todavia, para cada experimento desse foi utilizado um
espectrômetro distinto com fontes de ionização diferentes. Provavelmente, esse fato
justifica a quantidade menor de proteínas encontrada na presente análise, pois os
espectrômetros distintos possuem poder de resolução também diferentes.
A organização do citoesqueleto (principal processo biológico encontrado ao se
analisar as proteínas exclusivas das CT com CI) e a constituição do citoesqueleto
(principal função molecular das proteínas exclusivas das CT com CI) provavelmente
indicam as alterações na expressão gênica que ocorrem nas CT para que elas possam
dar origem a uma linhagem celular completamente diferente. Uma das maneiras disso
ocorrer é quando há a transdiferenciação direta, que é quando a célula altera seu
citoesqueleto e sua síntese proteica para rediferenciar-se em outro tipo celular
específico (Revisado por Monteiro et al., 2010). Apesar desse fato, a função e o
processo que foram citados são comuns a todas às CT, independentemente desse
tipo de célula ter o CI ou CN.
Ao se consultar a tabela das proteínas exclusivas das CT com CI, verifica-se a
presença do antígeno 1 do carcinoma de células escamosas (SCC1). O SCC1 foi
encontrado superexpresso em tumores epiteliais de alguns órgãos, incluindo língua,
esôfago, colo uterino e pele, por exemplo (Revisado por J. Liu et al., 2015). Há a
possibilidade dessas CT terem começado a se diferenciar em CT tumorais devido a
inversão.
O principal processo biológico encontrado ao se analisar o grupo de proteínas
exclusivas das CT com CN foi o transporte celular. As proteínas sintetizadas que vão
auxiliar no processo de diferenciação celular das CT, por exemplo, precisam ser
transportadas para esse que elas atuem no RNA (Tsai et al., 2015). O que está de
34
acordo com a principal função molecular das proteínas exclusivas dessas células
(ligação ao RNA). Provavelmente, isso indica o processo de diferenciação celular, pois
há várias proteínas que se ligam ao RNA das CT com a finalidade de levar a produção
de proteínas que vão ocasionar nessa ação (Kwon et al., 2013).
Provavelmente, devido ao número de proteínas encontrado, não se pode
verificar grupos de proteínas com funções mais específicas, pois nos diferentes
cenários – comparação entre as proteínas up ou down reguladas – foram observados
de maneira geral PBs e FMs que são normalmente presentes em qualquer célula.
Apesar disso, foram encontrados PBs relacionados a regeneração celular e a lesão
tecidual em ambos os tipos de células e a resposta ao estresse celular apenas nas
células com CI, indicando assim, que essas células foram submetidas a um estresse
bem maior ao se comparar às células com CN.
Na análise de Biologia de Sistemas das proteínas exclusivas das células com
CI foi observado que a proteína KRT16 foi a principal. A proteína codificada pelo gene
KRT16 é um membro da família de genes da queratina. As queratinas são filamentos
intermediários de proteínas responsáveis pela integridade estrutural das células
epiteliais e são são subdivididas em citoqueratinas e queratinas capilares
(http://www.genecards.org). Provavelmente a presença dessa proteína nas análises
foi devido a contaminação.
Já ao se analisar a rede de interação das proteínas exclusivas das células com
CN, verificou-se que a proteina principal é a RHOA. Essa proteína é um membro da
família Rho GTPase. Ela tem sido relatada como uma reguladora de várias atividades
biológicas, incluindo a formação de fibras de estresse, transcrição gênica, transporte
de membrana e adesões, por exemplo (Revisado por Li, Chen & Xu, 2011). Esse fato
indica que as células-tronco estavam exercendo suas atividades normalmente.
Provavelmente estava havendo transcrição gênica para ocorrer a síntese de proteínas
necessárias para o desenvolvimento e sobrevivências dessas células. Essas células
aderem umas as outras com facilidade, o que também justifica a proteína RHOA como
gargalo dessa rede.
Ao se realizar a análise tanto do grupo de proteínas up reguladas das células
com CI e down reguladas das células com CN, foi verificado que a proteína gargalo
dessas duas redes de interação é a GAPDH. Essa proteína é uma enzima que possui
papel importante na glicólise. No metabolismo da glicose, ela catalisa a fosforilação
de gliceraldeído-3-fosfato a 1,3-bisfosfoglicerato utilizando nicotinamida adenina
35
dinucleotídeo (NAD) como um cofator. Evidências experimentais recentes sugerem
que para além das funções glicolíticas, GAPDH é na realidade uma proteína
multifuncional que tem sido relatada com tais funções: regula a expressão/transcrição
de genes, possui atividade de quinase/fosfotransferase, facilita o transporte vesicular,
bem como interage com um número de pequenas moléculas-chave, incluindo
ribozimas, glutationa (GSH), p53 e óxido nítrico, por exemplo (Revisado por El Kadmiri
et al., 2014). A outra proteína de destaque da rede de interação das proteínas up
reguladas das células com CI é a VCL (Vinculin). VCL é uma proteína que se liga à
actina, além disso está associada à membrana e é encontrada nas junções célula-
célula e célula-matriz. Uma das principais características de VCL é a sua capacidade
de montar o citoesqueleto de actina e o ancorar à membrana celular através de
integrinas (Revisado por Zemljic-Harpf et al., 2014). Isso indica justamente a atividade
de adesão que há entre as células-tronco e dessas células com a matriz extracelular.
Já ao se realizar a análise da rede de interação das proteínas up reguladas das
células com CN, as proteínas CCT3 e DECR1 foram caracterizadas como proteínas
gargalos. CCT3 é uma subnunidade proteíca que faz parte do grupo dois de
chaperoninas, essas estão presentes nas células de eucariotos. Chaperoninas
utilizam a energia de hidrólise de ATP para aumentar a eficiência das reações que
ajudam as proteínas a atingirem as respectivas conformações funcionais. O grupo de
chaperoninas no qual está incluída a subunidade CCT3 possui papel especializado in
vivo na dobra da actina, da tubulina, e de outras proteínas essenciais, incluindo as
reguladores da divisão celular e da formação do citoesqueleto (Revisado por Nadler-
Holly et al., 2012). Uma das doenças envolvidas com a proteína em questão inclui a
Ataxia espinocerebelar.
A proteína gargalo DECR1 é uma enzima chave envolvida na via auxiliar da
oxidação de ácidos graxos. DECR 1 catalisa a etapa que limita a velocidade em um
processo que prepara os ácidos graxos poli-insaturados para serem utilizados como
substratos para a beta oxidação. A deficiência de DECR1 em seres humanos é letal,
devido ao acúmulo de intermediários de ácidos graxos por causa da beta oxidação
incompleta (Revisado por Ursini-Siegel et al., 2007).
Por fim, a proteína UBC foi constatada como a proteína gargalo da rede de
interações das proteínas down reguladas das células com CI. Trabalhos da literatura
indicam que o gene UBC é o principal contribuinte na produção de ubiquitina extra
durante situações de estresse celular e que a perda da sua função não pode ser
36
compensada pela indução dos outros genes Ub. A indução da transcrição do gene da
ubiquitina durante o estresse ocorre para proporcionar uma fonte extra de ubiquitina
necessária para remover as proteínas danificadas (Revisado por Crinelli et al., 2015).
A diminuição de ubiquitina leva a consequente diminuição da destruição de proteínas
que não exercem mais função ou que são defeituosas ou que são codificadas por
vírus, por exemplo, pelas proteases.
Recentes estudos relataram aberrações cromossômicas, imortalização e
transformação maligna de CTM frescas isoladas de humanos e ratos, por exemplo,
após um período considerável de expansão in vitro (Revisado por Duarte et al., 2012).
37
6 – CONCLUSÃO
Os resultados mostraram que a inversão paracêntrica induziu algum tipo de
estresse nas CTMH, devido a quantidade de proteínas up reguladas nas células com
CI relacionadas a resposta ao estresse. Somando-se a isso, há a presença do
antígeno 1 do carcinoma de células escamosas (SCC1) produzido apenas nesse tipo
de célula. Portanto, há indícios de que a inversão ocasionou uma instabilidade
genética, fazendo com que as células que a possuem produzam proteínas
necessárias para que sobrevivam ao estresse gerado pela instabilidade, além disso,
essa instabilidade talvez aumente a possibilidade dessas células de se tornarem
cancerígenas. Outro ponto relevante, é a diminuição da quantidade da proteína que
leva a marcação de proteínas defeituosas, isso pode ser um indicativo de dano nas
atividades das células com a inversão.
Esses dados podem auxiliar futuros estudos que tenham como objetivo a
análise da estabilidade genética de CTMH tendo como referência o perfil proteico
dessas células.
38
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43
8 – APÊNDICE
Tabela 1: Proteínas exclusivas das células com cariótipo invertido.
Protein Accession Number CI Specters CN Specters Fold Change
retinal dehydrogenase 1 21361176 20 0 0
squamous cell carcinoma antigen-1 193792580 14 0 0
keratin 16 1195531 28 0 0
Keratin 14 12803709 24 0 0
FAM129B 32425737 2 0 0
desmoplakin I 1147813 8 0 0
heat shock 119582699 7 0 0
hPA28 1008915 1 0 0
threonine-protein 114576744 2 0 0
Ras-GTPase-activating protein 119582065 4 0 0
PRO2619 11493459 4 0 0
JUP protein 15080189 5 0 0
Calmodulin-Like Skin Protein C Terminal Domain 109157166 5 0 0
band-6-protein 535015 2 0 0
metalloproteinases-3 1304484 2 0 0
44
Tabela 2: Proteínas exclusivas das células com cariótipo normal.
Protein name Accession Number CI Specters CN Specters Fold Change
NME1-NME2 protein 66392203 0 6 0
Procathepsin B At 3.2 157833437 0 6 0
plasminogen activator inhibitor 1 10835159 0 4 0
arginine 119624305 0 3 0
unnamed protein product 194388432 0 3 0
CAPNS1 protein 15080279 0 3 0
HYOU1 protein 116283339 0 2 0
unnamed protein product 189065537 0 3 0
ATP synthase 51479152 0 3 0
neprilysin 116256327 0 6 0
26S protease regulatory subunit 6B isoform 2 24430155 0 3 0
Pyrroline5-Carboxylate Reductase 114794869 0 5 0
reticulon 4 119620534 0 5 0
tat-associated protein 1096067 0 3 0
AHNAK 61743954 0 6 0
40S ribosomal protein S17 4506693 0 4 0
RecName 143811408 0 2 0
45
Protein name Accession Number CI Specters CN Specters Fold Change
dihydrolipoamide S-acetyltransferase 119587578 0 3 0
Physiological Dimer Hpp Precursor 2098347 0 3 0
leucine 119579268 0 3 0
ribosomal protein L3 119580717 0 5 0
poly(rC)-binding protein 14141166 0 1 0
unnamed protein product 194375834 0 3 0
cytochrome b-c1 l 163644321 0 1 0
glycosyltransferase 119605027 0 1 0
cyclooxygenase2 181254 0 3 0
hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase 119621106 0 3 0
GDP dissociation inhibitor 2 119606836 0 1 0
guanine nucleotide-binding protein 11055998 0 2 0
hCG2016877 119594653 0 1 0
unnamed protein product 189065417 0 2 0
cysteine and glycine-rich protein 2 4503101 0 2 0
proteasome 195539356 0 1 0
hCG39912 119576757 0 1 0
glycoprotein 1 112380628 0 2 0
46
Protein name Accession Number CI Specters CN Specters Fold Change
glutaminase 114582297 0 2 0
aconitase 2 123228108 0 3 0
unnamed protein product 193786545 0 2 0
RuvB 119599729 0 1 0
SUB1 homolog (S. cerevisiae) 16307067 0 1 0
ubiquinone 115387094 0 2 0
RNA binding protein 119626277 0 2 0
47
Tabela 3: Proteínas presentes nas células com cariótipo invertido e normal (interseção).
Protein Accession Number CI Specters CN Specters Fold Change
ribonucleoprotein M 119589327 1 15 0,08
Procollagen-lysine 1 16741721 1 9 0,1
Superoxide Dismutase 110590806 2 16 0,1
Rab5C 41393545 1 8 0,2
glucosidase 119594451 5 30 0,2
plectin 1477646 1 7 0,2
unnamed protein product 158254970 1 7 0,2
cytochrome b5 119593674 1 7 0,2
proteasome 54696300 1 6 0,2
Rab11B 14249144 1 6 0,2
unnamed protein product 194381290 8 41 0,2
unnamed protein product 158255378 2 10 0,2
ribosomal protein L9 119613332 1 5 0,2
transmembrane emp24 119605373 1 5 0,2
Hmtssb 126030307 1 5 0,2
SYNCRIP protein 116283697 2 9 0,3
unnamed protein product 158261055 1 4 0,3
prohibitin 2 119609105 2 9 0,3
48
Protein Accession Number CI Specters CN Specters Fold Change
ribonucleoprotein M 119589327 1 15 0,08
Procollagen-lysine 1 16741721 1 9 0,1
Superoxide Dismutase 110590806 2 16 0,1
Rab5C 41393545 1 8 0,2
glucosidase 119594451 5 30 0,2
plectin 1477646 1 7 0,2
unnamed protein product 158254970 1 7 0,2
cytochrome b5 119593674 1 7 0,2
proteasome 54696300 1 6 0,2
Rab11B 14249144 1 6 0,2
unnamed protein product 194381290 8 41 0,2
unnamed protein product 158255378 2 10 0,2
ribosomal protein L9 119613332 1 5 0,2
transmembrane emp24 119605373 1 5 0,2
Hmtssb 126030307 1 5 0,2
SYNCRIP protein 116283697 2 9 0,3
unnamed protein product 158261055 1 4 0,3
prohibitin 2 119609105 2 9 0,3
49
Protein Accession Number CI Specters CN Specters Fold Change
fibronectin 1 119590943 64 224 0,3
Rab7 1174149 5 16 0,3
trifunctional enzyme 20127408 4 12 0,3
Chaperonin containing TCP1 14124984 4 12 0,3
unnamed protein product 37138 6 20 0,3
splicing factor proline 119627830 2 8 0,3
ribosomal protein S19 16924231 4 11 0,3
Unknown 12804225 5 14 0,4
matrin-3 21626466 4 10 0,4
hCG1994130 119570641 4 10 0,4
electron transfer flavoprotein 189181759 2 7 0,4
ribonucleoproteins C1/C2-like 109082737 4 10 0,4
EPB72 119578798 1 3 0,4
Peroxiredoxin 4 149243259 1 3 0,4
2,4-dienoyl-CoA reductase 1575000 1 3 0,4
Proteasome 4506181 1 3 0,4
50
Protein Accession Number CI Specters CN Specters Fold Change
polypyrimidine 119581557 6 16 0,4
ribonucleoproteins B1 14043072 5 13 0,4
glycyl-tRNA synthetase 116805340 4 9 0,4
calreticulin 119604736 10 25 0,4
myosin-Ic 124494238 2 6 0,4
hCG2043289 119575627 2 6 0,4
hCG1640785 119569329 2 6 0,4
unnamed protein product 158256826 8 21 0,4
ribosomal protein S24 119575003 6 14 0,4
unnamed protein product 189054446 6 14 0,4
hCG1745306 119606268 2 5 0,5
proteasome 119567805 2 5 0,5
Nucleosome Structure 296863426 1 3 0,5
signal recognition particle 197099116 2 5 0,5
SH3 119628236 1 3 0,5
transferrin receptor 119574056 1 3 0,5
endoplasmin precursor 4507677 31 67 0,5
mitochondrial precursor 4502303 4 8 0,5
51
Protein Accession Number CI Specters CN Specters Fold Change
40S ribosomal protein S12 14277700 4 8 0,5
unnamed protein product 189055102 10 20 0,5
2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2 119599346 6 12 0,5
protein disulfide 20070125 23 45 0,5
lamin A 119573381 38 76 0,5
voltage-dependent anion channel 2 119574954 10 19 0,5
Human Galectin1 42542977 28 54 0,5
X-ray 169145200 4 7 0,5
3'-phosphoadenosine 5'-phosphosulfate synthase 2 119570566 4 7 0,5
T-plastin polypeptide 190028 10 18 0,5
heat shock protein 153792590 25 47 0,5
ribosomal protein 337518 6 11 0,5
histone H2A type 1-B/E 10645195 19 34 0,6
ribosomal protein S18 119624101 7 13 0,6
Chain B 157879202 5 9 0,6
hCG2013819 119603728 2 4 0,6
unnamed protein product 194380796 2 4 0,6
52
Protein
Accession Number
CI Specters
CN Specters
Fold Change
far upstream element 119626762 2 4 0,6
unnamed protein product 194375608 2 4 0,6
TapasinERP57 220702506 26 46 0,6
ubiquitin 23510338 11 19 0,6
mitochondrial F1 complex 127798841 11 19 0,6
glucose-regulated protein 16507237 59 99 0,6
Initiation Factor Eif5a 183448388 4 6 0,6
Rab18 10880989 4 6 0,6
Heat shock 12653415 26 44 0,6
ATP-dependent RNA helicase DDX17 148613856 5 8 0,6
tropomyosin beta 47519616 30 48 0,6
unnamed protein product 194386896 32 51 0,6
protein L13 15431295 6 9 0,6
mitochondrial precursor 32189394 48 75 0,6
calnexin precursor 10716563 17 26 0,7
cytoskeleton-associated protein 4 19263767 38 57 0,7
tropomyosin alpha1 27597085 26 39 0,7
53
Protein
Accession Number
CI Specters
CN Specters
Fold Change
alpha1(E)-catenin 1172426 5 7 0,7
phosphoprotein P1 31979223 5 7 0,7
L18a 11415026 2 3 0,7
PSMA7 protein 116283481 4 5 0,7
myoferlin 119570458 2 3 0,7
fructose-bisphosphate 119600342 1 2 0,7
spectrin 112382250 2 3 0,7
unnamed protein product 189065399 1 2 0,7
Sec23A 109083408 2 3 0,7
unnamed protein product 189053683 2 3 0,7
protein 1 141797011 1 2 0,7
unnamed protein product 14042058 1 2 0,7
hCG2028724 119601423 8 12 0,7
hCG21078 119568094 6 9 0,7
drebrin 1 119605395 6 9 0,7
protein 5 1710248 29 40 0,7
54
Protein Accession Number CI Specters CN Specters Fold Change
ribosomal protein SA 119584991 8 10 0,8
ribosomal protein S8 119627428 12 15 0,8
heat shock protein 4504517 36 44 0,8
Cyclosporin 1310882 28 33 0,8
actin related protein 2/3 complex 119618319 4 4 0,8
hexokinase 1 119574708 7 9 0,8
unnamed protein product 194382308 4 4 0,8
glycoprotein 2 169790833 4 4 0,8
alpha-actinin4 12025678 108 128 0,8
Profilin I 157833469 20 24 0,9
unnamed protein product 194380758 13 15 0,9
ribosomal protein S16 119577296 13 15 0,9
malate dehydrogenase 21735621 19 22 0,9
major vault protein 19913410 25 29 0,9
alpha-actinin1 194097350 160 184 0,9
non-erythrocytic 1 119608213 6 7 0,9
ribosomal protein L30 119612175 8 9 0,9
55
Protein Accession Number CI Specters CN Specters Fold Change
unnamed protein product
158254664
122
137
0,9
RAB1A 119620329 19 21 0,9
heat shock cognate 5729877 88 95 0,9
histone 1 119575932 35 38 0,9
nucleophosmin 10835063 19 21 0,9
peroxiredoxin6 4758638 12 13 0,9
ribosomal protein L18 119572744 10 10 0,9
40S ribosomal protein S14 5032051 2 3 0,9
WD repeat domain 1 119613093 2 3 0,9
Strongylocentrotus purpuratus 119607750 2 3 0,9
EIF3A protein 116283747 2 3 0,9
unnamed protein product 193783525 2 3 0,9
unnamed protein product 31092 34 36 0,9
Vdac1 198443050 17 18 0,9
60S acidic ribosomal protein P2 4506671 14 15 0,9
40S ribosomal protein S9 14141193 7 8 0,9
Dehydrogenase 13786847 7 8 0,9
MYL6 protein 113812151 23 24 1
56
Protein Accession Number CI Specters CN Specters Fold Change
60S ribosomal protein L12 4506597 13 14 1
serpin H1 precursor 32454741 53 54 1
40S ribosomal protein 114647215 8 9 1
hCG1983058 119619436 8 9 1
Rap-Rapgap 169791854 6 6 1
Rab2A 336391093 6 6 1
Triosephosphate isomerase 1 17389815 18 18 1
ribonucleoprotein A1 14043070 18 18 1
ribonucleoprotein K 119583080 16 15 1
ribosomal protein S10 119624187 10 9 1
pyruvate kinase 119598292 46 45 1
ADP-ribosylation factor 4 4502205 13 13 1
ribosomal protein S5 119592989 13 13 1
Hsp70 Atpase 166007012 13 13 1
actin 4501887 275 267 1
elongation factor 2 4503483 83 81 1
histone H2B 10800138 59 57 1
tubulin beta6 27754056 61 58 1,1
57
Protein Accession Number CI Specters CN Specters Fold Change
Protein-Disulfide 192987144 4 3 1,1
adaptor-related protein complex 1 119580203 4 3 1,1
histone H2B 10800140 60 57 1,1
Ran-like 109099257 8 8 1,1
tubulin 119608775 114 105 1,1
importin 119615215 18 16 1,1
beta-tubulin 1297274 88 79 1,1
phosphoglycerate mutase 1 297302419 5 4 1,1
filamin-B 105990514 30 27 1,1
keratin 8 119617057 108 93 1,2
Tubulin 18088719 140 121 1,2
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 31645 78 67 1,2
Vinculin 24657579 30 26 1,2
ribonucleoprotein U 14141161 12 10 1,2
T-complex protein 1 261399877 6 5 1,2
chaperonin 119620390 6 5 1,2
calelectrin 179976 49 41 1,2
myosin 15809016 26 21 1,2
58
Protein Accession Number CI Specters CN Specters Fold Change
Chain A 157831404 62 51 1,2
translocon-associated protein subunit delta isoform 1 precursor 325301072 11 9 1,3
keratin, type I cytoskeletal 19 24234699 23 18 1,3
Adp-Ribosylation Factor 1 1065361 12 9 1,3
G protein 119574079 36 28 1,3
moesin, 119625804 25 20 1,3
14-3-3 protein epsilon 114665591 42 33 1,3
unnamed protein product 193786502 90 69 1,3
cofilin1 5031635 44 33 1,3
KIAA1027 protein 20521736 68 51 1,3
Keratin 18 12653819 24 18 1,3
Glutathione Transferase P11 11514451 22 15 1,4
ribosomal protein L23a 119571516 11 8 1,4
ubiquitin thiolesterase 119613388 10 7 1,4
hCG37214 119622042 10 7 1,4
zyxin 119572233 7 5 1,4
cytoplasmic 1 119612225 5 3 1,4
59
Protein Accession Number CI Specters CN Specters Fold Change
hCG33299 119597983 2 2 1,4
hCG1985370 119610462 1 1 1,4
unnamed protein product 221045376 4 3 1,4
ribosomal protein L10 119593144 1 1 1,4
KH 119627980 1 1 1,4
C-type mannose receptor 2 110624774 4 3 1,4
Eukaryotic translation elongation factor 1 gamma 15530265 5 3 1,4
flavoprotein 119571367 2 2 1,4
coactosin-like protein 21624607 2 2 1,4
ATP synthase 16877071 4 3 1,4
protein B 181486 1 1 1,4
26S proteasome subunit p97 1060888 1 1 1,4
integrin beta 4 binding protein 119596626 1 1 1,4
ribonucleoprotein H1 119574194 8 6 1,4
pyrroline 5-carboxylate synthetase 1304314 6 4 1,4
Phosphorylation Independent Interactions Between 14-3-3 161172138 62 43 1,5
60
Protein Accession Number CI Specters CN Specters Fold Change
ribosomal protein S4 119592221 18 12 1,5
unnamed protein product 194390460 14 9 1,5
TSA 1617118 13 9 1,5
myosin-9 12667788 207 134 1,5
tyrosine 3-monooxygenase 54696890 38 25 1,5
chloride intracellular channel protein 1 14251209 12 8 1,6
tubulin alpha1A 6755901 84 54 1,6
14-3-3 protein beta/alpha 4507949 24 15 1,6
prohibitin 46360168 11 7 1,6
L-Lactate Dehydrogenase 13786849 10 6 1,6
Annexin A2 18645167 139 87 1,6
transgelin 119587704 136 81 1,7
clathrin 119614801 7 4 1,7
unnamed protein product 189053923 7 4 1,7
Calcium-Calmodulin 16974825 11 6 1,8
unnamed protein product 193785841 31 17 1,8
peroxiredoxin 1 119627382 25 14 1,8
keratin 9 119581148 14 8 1,9
61
Protein Accession Number CI Specters CN Specters Fold Change
filamin-C 116805322 50 26 2
transgelin2-like 297663020 64 32 2
hCG1783090 119582155 22 10 2,1
unnamed protein product 194387966 4 2 2,1
unnamed protein product 10438296 4 2 2,1
phosphatidylinositol binding clathrin assembly protein 119595524 4 2 2,1
annexin A1 119582950 56 25 2,3
Rhogdi K113a 14278162 6 3 2,3
Unknown 13097759 25 10 2,5
keratin 47132620 56 21 2,7
unnamed protein product 189054048 7 3 2,8
unknown 1531594 7 3 2,8
Similar to cysteine and glycine-rich protein 1 13279065 7 3 2,8
proteasome 8394076 2 1 2,8
HuR RNA binding protein 1022961 8 3 3,3
keratin 1 11935049 192 54 3,6
ribosomal protein L14 17932938 10 3 3,7
RecName 1703319 5 1 5,6
hCG1995701
Ed4f2hc
RAN binding protein 5
keratin 10
119584408
145579147
119629383
119581085
7
7
7
161
1
1
1
11
8,4
8,4
8,4
14
62