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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
MARIANA SANTANA SANTOS PEREIRA DA COSTA
POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE MACROALGAS
VERDES: CORRELAÇÃO COM PARÂMETROS AMBIENTAIS E
OBTENÇÃO DE GLUCOGALACTANAS SULFATADAS
ANTICOAGULANTES
NATAL/RN
2016
MARIANA SANTANA SANTOS PEREIRA DA COSTA
POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE MACROALGAS
VERDES: CORRELAÇÃO COM PARÂMETROS AMBIENTAIS E
OBTENÇÃO DE GLUCOGALACTANAS SULFATADAS
ANTICOAGULANTES
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Bioquímica. Orientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha Co-orientador: Leandro Silva Costa
NATAL/RN
2016
Dedico esta obra:
À minha mãe Fátima, exemplo de mulher e de mãe, por sua dedicação, apoio e amor, por
todos os sacrifícios que enfrentou para que eu pudesse chegar até aqui. Ao meu pai, Tadeu
(homenagem póstuma), por seu apoio, proteção, cuidado e amor, sei que hoje você estaria
muito orgulhoso por eu ter conseguido esta conquista. Obrigada por nãо medirem esforços
para qυе еυ chegasse аté esta etapa dе minha vida. Espero um dia ser, para os meus filhos,
exemplos de pais como vocês são para mim. Amo muito vocês!
Ao meu esposo Adaíres pelo companheirismo, compreensão, apoio, incentivo, paciência e
amor. Agradeço a Deus por ter colocado você em minha vida há 13 anos e por você estar hoje
presente ao meu lado de uma forma indispensável. Te amo muito!
Dedico esta obra:
Ao meu orientador, Prof. Dr. Hugo Rocha, por ser um grande professor e orientador, por
confiar no meu trabalho, pelo incentivo, por não ter desistido de mim, mesmo em meio as
minhas dificuldades e ausências; e por hoje servir de exemplo para minha vida como docente.
E ao meu amigo e padrinho Hugo, pelo apoio, preocupação, amizade, viagens, por estar
sempre presente em todos os momentos de minha vida acadêmica e pessoal.
A você, a minha eterna gratidão!!!
“O professor medíocre conta. O bom
professor explica. O professor superior
demonstra. O grande professor inspira.”
(William Arthur Ward)
AGRADECIMENTOS
A Deus por estar sempre ao meu lado, me guiando e ajudando a vencer todos os obstáculos que aparecem em meu caminho. “Ainda que eu ande pelo vale da sombra da morte, não
temerei mal nenhum, porque tu estás comigo” (Salmo 23:4).
Aos meus pais, Tadeu (homenagem póstuma) e Fátima, por todos os obstáculos que tiveram que superar para que hoje eu pudesse ser o que sou, por ficarem felizes com minhas
vitórias, por sempre estarem ao meu lado, me apoiando e incentivando. Amo muito vocês!
Ao meu esposo, Adaíres, que vem acompanhando de perto todas as fases da minha vida acadêmica desde a graduação, por estar ao meu lado em todos os momentos, pela força,
paciência, incentivo e amor. Muito obrigada, meu amor!
Aos meus irmãos, Thiago e João Neto, as minhas avós Conceição e Mãezinha (homenagem póstuma), as minhas cunhadas Flávia e Marilandy, a minha sobrinha Letícia, que veio para
alegrar ainda mais nossas vidas, obrigada pelo amor de vocês. E a todos os meus demais familiares pelo carinho, cuidado e apoio, em especial, ao meu Tio Eider (homenagem
póstuma) que hoje, com certeza, estaria muito orgulhoso por mais esta minha conquista; e as primas Rosa e Yasmim pelo carinho e admiração.
Ao meu orientador Prof. Hugo Rocha por há 12 anos ter confiado que eu seria capaz. Por seus ensinamentos, paciência, convívio e amizade. Obrigada!
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte por fornecer as condições necessárias para realização deste trabalho.
À CAPES e ao CNPq por financiarem este trabalho.
Ao professor Elizeu Antunes da UFRN e aos seus alunos Antônio, Anderson e Jonalson pela ajuda com o AKTA.
Á professora Suely Chavantes da UFRN e a sua aluna Lais Palhares pelo auxílio nos ensaios de inibição da trombina.
A Diego Sabry (Popó) por ceder o “kit” para o ensaio de trombina.
Ao professor Heitor Bruno do IFRN - Campus Macau pelo auxílio nas análises estatísticas.
Aos professores e funcionários do Departamento de Bioquímica da UFRN pelo convívio e ensinamentos desde a minha graduação.
Aos professores da banca de qualificação, Diego Sabry, Leandro Costa e Luciana Guimarães, por disponibilizarem seu tempo para lerem esta tese e por todas as contribuições que deram
para melhoria deste trabalho.
Aos professores da banca de defesa, Cinthia Telles, Giulianna Souza, Leandro Costa, Luciana Bertini e Kátia Scortecci, a contribuição de cada um de vocês foi muito válida e
enriquecedora.
Trabalhar com uma espécie de alga já é difícil, logo, trabalhar com várias espécies, durante 12 meses não foi fácil. Foram muitas coletas, muitas algas para lavar, secar, fazer
proteólise... Eu não teria conseguido chegar até aqui sem a ajuda de vários amigos que fazem parte do nosso querido BIOPOL, nesta tese há pedacinho de cada um de vocês. Ao Prof.
Hugo (por ter me dado a oportunidade de fazer parte do BIOPOL), Jailma, Ruth, Cinthia, Dayanne, Karol, Joana, Daniele (amigas muito queridas, obrigada pelo carinho, apoio, conversas, desabafos...), Leandro e Ivan (por terem sido os primeiros a me receberem no
laboratório e terem me ensinado muito do que hoje sei), Rafael, Leonardo, Gabriel, Moacir (por estarem sempre dispostos a ajudar), Raniere, Rony e Éder (muito obrigada por me
aguentar sempre aperreando pelas liofilizações de amostras), Vínicius (obrigada pela ajuda com o AKTA) e a Talita, Arthur, Mônica, Maíra, Marília, Monique, Almino, Fabiana, Jefferson, Larisse, Letícia, Pablo, Samanta, Lucas, Cauê, Carol, Socorro e Cintia pelo
convívio e carinho. Nunca vou esquecer vocês!!!
Quero agradecer, em especial, a Ruth e Maxsuel pela ajuda nos experimentos referentes a sazonalidade; Dayanne e Rayanara pelo auxílio nos experimentos da parte purificação dos
polissacarídeos; Leandro por me ajudar na finalização deste trabalho; e Jailma, Karol e Dayanne por todo o apoio na finalização deste trabalho, pelo carinho, ajuda nos ensaios, no
lanche... Eu não teria conseguido sem vocês! Meu muito obrigada!
“Um amigo fiel é uma poderosa proteção: quem o achou, descobriu um tesouro” (Eclesiástico 6:14). Sara e Jailma, vocês são tesouros que ganhei na UFRN. Jailma, a pessoa mais
prestativa e bondosa que conheço, obrigada por sempre estar disposta a me ajudar, pelo carinho, paciência e amizade; não sei o que seria dos meus slides e formatações sem você,
amiga. Sara, minha primeira companheira de bancada, uma amiga que posso contar em todas horas; obrigada por estar sempre por perto, desde a graduação e agora também na minha vida
profissional, pela amizade, incentivo, apoio, viagens, por ajudar nas minhas atividades do projeto do IFRN enquanto estou afastada... Meninas, obrigada por se alegrarem comigo nas
minhas vitórias e chorarem comigo nos momentos difícieis. Amo vocês!
Aos vários colegas de Departamento de Bioquímica da UFRN pela convivência, pelos sorrisos e conversas nos corredores do DBQ .
Aos professores do Grupo de Biologia do IFRN-Campus Macau (Lilian, Tarciana, Heitor, Sidney, Paulo Augusto, Daniel, Danielly, Maria Aparecida e Francinaide) e ao Diretor
Acadêmico Hudson Carlos por terem apoiado o meu afastamento das atividades acadêmicas do IFRN para poder finalizar o doutorado. Obrigada pelo apoio!
“A vida é em parte o que nós fazemos dela, e em parte o que é feito pelos amigos que nós escolhemos" (Tennessee Williams). Aos meus amigos de longos anos, Mileide, Ricardo, Jobson, Leila, Cybelle, Luciana e Rochele, pelo apoio e carinho. Aos meus amigos de
aventuras e viagens, Sara, Katia, Lourdinha, Maria da Paz, Hugo e Adriana, pela força. Já podemos marcar uma viagem para comemorar meu doutorado. Vocês são maravilhosos!
E a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
“Talvez não tenha conseguido fazer o
melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria ser, mas graças
a Deus, não sou o que era antes”. (Marthin Luther King)
RESUMO
Polissacarídeos de algas podem ter sua síntese, sua estrutura e propriedades
farmacológicas modificadas devido a alterações de fatores ambientais. Contudo, poucas algas já foram analisadas com essa ótica. A alga verde C. cupressoides var. flabellata Børgesen é uma alga abundante na costa do Rio Grande do Norte e já foi demostrado que esta alga coletada na mesma época, mas em praias com grau de salinidade diferentes, sintetizava polissacarídeos sulfatados (PS) com propriedades diferentes, inclusive atividade anticoagulante. Dessa forma, o objetivo do presente foi avaliar a influência do período de coleta e de parâmetros ambientais na composição química e atividade anticoagulante de PS obtidos de algas verdes do litoral potiguar, bem como obter e avaliar o potencial anticoagulante de PS purificados da alga C. cupressoides. Inicialmente, foram obtidos extratos ricos em polissacarídeos sulfatados (ERPS), por proteólise seguido por precipitação com metanol, da alga C. cupressoides coletada mensalmente, durante um ano na praia de Búzios, Nísia Floresta/RN. Observou-se que havia variações no rendimento da extração, composição química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. cupressoides de acordo com o mês de coleta, sendo o mês de março aquele em que se obteve ERPS com maior potencial anticoagulante, vale salientar que esta atividade foi maior que a do Clexane®, uma heparina de baixo peso molecular comercial. Ao se analisar a influência de fatores ambientais do local de coleta no rendimento, composição química e atividade anticoagulante observou-se que existe uma correlação positiva significativa (p < 0,05) entre o rendimento da extração dos ERPS e a salinidade da água do mar e a insolação; para a quantidade de sulfato observou-se uma correlação negativa significativa (p < 0,05) com a salinidade da água do mar. Já a quantidade de açúcares totais teve uma correlação negativa significativa (p < 0,05) com: sólidos totais, sódio, cloreto e insolação. Como o mês de março foi o mês com ERPS com maior potencial anticoagulante, resolveu-se purificar, caracterizar e avaliar o potencial anticoagulante de PS extraídos neste mês. Após proteólise e fracionamento com volumes crescentes de acetona obteve-se quatro frações polissacarídicas da C. cupressoides (CCB-0.3, CCB-0.5, CCB-1.0 e CCB-2.0), como a CCB-0.5 apresentou maior atividade anticoagulante, esta foi submetida a cromatografia de troca-iônica e eluída em duas novas frações (FI e FII), após eletroforese em gel de agarose, coloração da lâmina com azul de toluidina e descoloração, observou-se o aparecimento de uma única banda em ambas as subfrações, o que indica a presença de uma única população de PS, o que permite inferir que estes PS foram purificados. Análises por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) indicam que os PS FI e FII tratam-se de glucogalactanas. Estas glucogalactnas sulfatadas exibiram atividade anticoagulante pela via intrínseca (teste de aPTT), pela via extrínseca (teste PT) e pela via comum (teste TT) da cascata de coagulação. Um resultado interessante foi que a atividade no teste de aPTT das glucogalactanas sulfatadas foi similiar a atividade do Clexane®. Além disso, estes PS foram capazes de inibir parcialmente a trombina. Isto é indicativo que os PS da C. cupressoides podem estar agindo em diversas proteases da cascata de coagulação. Entretanto, mais estudos são necessários para explicar detalhadamente quais os alvos de ação destes polímeros. Por fim, analisou-se a influência do período de coleta e de fatores ambientais em ERPS de outras algas verdes do litoral do RN (Caulerpa prolifera, Caulerpa racemosa var. occidentalis, Caulerpa sertularioides e Codium isthmocladum) coletadas também mensalmente, durante um ano na praia de Búzios, Nísia Floresta/RN; e observou-se
que, da mesma forma da C. cupressoides, houve variações no rendimento, composição química e atividade anticoagulante para os ERPS algas verdes C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum. No entanto, um fato interessante é que cada alga responde de forma diferente as condições ambientais do local de coleta. Estes dados indicam que dependendo do período do ano que a alga é coletada, os PS extraídos destas espécies de algas podem ter suas estruturas químicas afetadas e, consequentemente, suas atividades biológicas poderão ser distintas. Estes tipos de estudos levam ao esclarecimento de quais seriam as melhores condições para se obter o PS com as características estruturais e biológicas de interesse, o que é fundamental para o uso destes polímeros na indústria.
PALAVRAS-CHAVE: algas marinhas. atividade anticoagulante. Caulerpa cupressoides var. flabellata. Chlorophyta. sazonalidade. período de coleta.
ABSTRACT
Polysaccharides of seaweeds can have their synthesis, structure and pharmacological properties modified due to changes in environmental factors. But few algae have been analyzed in this light. The green seaweed C. cupressoides var. flabellata Børgesen is an abundant alga in the coast of Rio Grande do Norte and it was already shown that this seaweed collected at the same time in beaches with different degree of salinity synthesized sulfated polysaccharides (PS) with different properties, including anticoagulant activity. Therefore the objective of this study was to obtain and characterize PS of green seaweed of the coast of Rio Grande do Norte evaluating the influence of the collection period and environmental parameters in the chemical composition and anticoagulant activity of PS as well as purify, characterize and evaluate the anticoagulant potential of at least one PS of the seaweed C. cupressoides. Initially, extracts rich in sulfated polysaccharides (ERPS) were obtained by proteolysis followed by precipitation with methanol of the seaweed C. cupressoides collected monthly for one year on the beach in Búzios, Nísia Floresta/RN. It was noted that there were variations in performance of extraction, chemical composition and anticoagulant activity of ERPS C. cupressoides according to the month of collection, with the month of March being the one in which they obtained more anticoagulant potential of ERPS. It is worth noting that this activity was greater than that of Clexane®, a low molecular weight commercial heparin. When analyzing the influence of environmental factors in the collection site in regards to performance, chemical composition and anticoagulant activity it has been observed that there is a significant positive correlation (p < 0.05) between the performance of the extraction of ERPS and salinity of sea water and insolation; for the amount of sulfate it was observed a significant negative correlation (p < 0.05) with the salinity of the seawater. The amount of total sugars had a significant negative correlation (p < 0.05) with: total solids, sodium, chloride and insolation. Since the month of March was the month with ERPS with more anticoagulant potential, it was decided to purify, characterize and evaluate the PS anticoagulant potential extracted on that month. After proteolysis and fractionation with increasing volumes of acetone four fractions of polysaccharide C. cupressoides (CCB-0.3, CCB-0.5, CCB-1.0 e CCB-2.0) were obtained. Since the CCB-0.5 had higher anticoagulant activity, it was submitted to a chromatography ion-exchange column and eluted in two new fractions (FI and FII) after agarose gel electrophoresis, slide staining with toluidine blue and discoloration it was observed the appearance of a single band on both SP which indicates the presence of a single population of PS, which allows inferring that these PS were purified. Analysis by high-performance liquid chromatography (HPLC) indicate that SP FI and FII are glucogalactanas. These sulfated glucogalactans exhibited by the intrinsic pathway anticoagulant activity (APTT assay) the extrinsic pathway (PT test) and common pathway (TT test) of the coagulation cascade. An interesting result was that activity in the aPTT test of sulfated glucogalactans was similiar activity of Clexane®. In addition, these PS were able to partially inhibit thrombin. This is an indicative that the PS C. cupressoides may be acting on various proteases of the coagulation cascade. But more studies are needed to explain in detail which are the targets of action of these polymers. Finally, we analyzed the influence of the period of collection and environmental factors in ERPS of other green seaweeds RN coast (Caulerpa prolifera, Caulerpa racemosa var. occidentalis, Caulerpa sertularioides and Codium isthmocladum) also collected monthly for one year on the beach of Búzios, Nísia Floresta/RN; and it was observed that, like the C. cupressoides, there were variations in the performance, chemical composition and anticoagulant
activity for ERPs green seaweeds C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides and C. isthmocladum. However, an interesting fact is that each alga responds differently to environmental conditions of the collection site. These data indicate that depending on the time of the year that the algae are collected, the PS extracted from these species of algae may have their chemical structures affected hence its biological activity may be different. These types of studies lead to the clarification of which would be the best conditions to obtain the PS with the structural and biological characteristics of interest, which is essential for the use of these polymers in the industry.
KEYWORDS: green seaweed. anticoagulant activity. Caulerpa cupressoides var. flabellata. Chlorophyta. seasonality. harvest season.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Gêneros de algas verdes utilizados como matérias básicas para se
extrair polissacarídeos sulfatados .....................................................
23
Figura 2 - Polissacarídeos encontrados na parede celular de algas da ordem
Ulvales ..............................................................................................
24
Figura 3 - Modelo clássico de coagulação sanguínea ...................................... 28
Figura 4 - Modelo de coagulação baseado em superfícies celulares ................ 29
Figura 5 - Mecanismos de ação anticoagulante dos polissacarídeos
sulfatados de algas marinhas ...........................................................
32
Figura 6 - Localização do ponto de coleta das algas na Praia de Búzios, litoral
Sul do Rio Grande do Norte ..............................................................
46
Figura 7 - Algas verdes utilizadas neste trabalho ............................................. 47
Figura 8 - Rendimento da extração dos ERPS da alga C. cupressoides de
acordo com o mês de coleta ............................................................
60
Figura 9 - Comportamento eletroforético dos PS da alga C. cupressoides ....... 61
Figura 10 - Quantidade de açúcares totais e sulfato dos ERPS da alga C.
cupressoides de acordo com mês de coleta ......................................
62
Figura 11 - Atividade anticoagulante pelo ensaio de aPTT dos ERPS da alga
C. cupressoides de acordo com o mês de coleta ...............................
63
Figura 12 - Comparação da variação anual do rendimento da extração dos
ERPS da C. cupressoides com parâmetros ambientais do local de
coleta (insolação e salinidade) ..........................................................
65
Figura 13 - Comparação da variação anual da quantidade de sulfato dos ERPS
da C. cupressoides a salinidade da água do mar ..............................
65
Figura 14 - Comparação da variação anual da quantidade de açúcares totais
dos ERPS da C. cupressoides com parâmetros ambientais do local
de coleta (sólidos totais, cloreto, sódio e insolação) ..........................
66
Figura 15 - Rendimento percentual do fracionamento com acetona ................... 69
Figura 16 - Perfil de eluição da fração CCB-0.5 em cromatografia de troca
aniônica em sistema FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography)
em equipamento AKTA .....................................................................
71
Figura 17 - Comportamento eletroforético dos PS da alga C. cupressoides ....... 72
Figura 18 - Efeito dos PS FI e FII da C. cupressoides na inativação da trombina
na presença do HCII .........................................................................
77
Figura 19 - Efeito dos PS FI e FII da C. cupressoides na inativação da trombina
na ausência do HCII e da AT .............................................................
77
Figura 20 - Rendimento da extração dos ERPS de acordo com o mês de coleta 78
Figura 21 - Comportamento eletroforético dos PS das algas C. prolifera, C.
racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum ................................
80
Figura 22 - Quantidade de açúcares totais (A) e sulfato (B) dos ERPS das algas
verdes de acordo com o período de coleta ........................................
81
Figura 23 - Atividade anticoagulante dos ERPS das algas verdes de acordo
com o período de coleta ....................................................................
83
Figura 24 - Coeficiente de correlação (n=12) para os parâmetros ambientais do
local de coleta que tiveram correlações significativas (p < 0,05) com
a quantidade de açúcares totais e atividade anticoagulante dos
ERPS da C. prolifera .........................................................................
87
Figura 25 - Coeficiente de correlação (n=11) para os parâmetros ambientais do
local de coleta que tiveram correlações significativas (p < 0,05) com
o rendimento, composição química e atividade anticoagulante dos
ERPS da C. racemosa ......................................................................
89
Figura 26 - Coeficiente de correlação (n=12) para os parâmetros ambientais do
local de coleta que tiveram correlações significativas (p < 0,05) com
o rendimento e composição química dos ERPS da C. sertularioides
91
Figura 27 - Coeficiente de correlação (n=10) para os parâmetros ambientais do
local de coleta que tiveram correlações significativas (p < 0,05) com
o rendimento e composição química dos ERPS da C. isthmocladum
93
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Atividades farmacológicas atribuídas aos polissacarídeos sulfatados
extraídos de algas marinhas verdes ..................................................
26
Tabela 2 - Resumo do atual modelo de coagulação baseado em superfícies
celulares ............................................................................................
30
Tabela 3 - Polissacarídeos sulfatados de algas verdes com atividade
anticoagulante ...................................................................................
38
Tabela 4 - Média e variação anual dos fatores ambientais da Praia de
Búzios/RN durante o período de estudo (média ± desvio padrão e
variação, n=12) ..................................................................................
63
Tabela 5 - Coeficiente de correlação (n=12) entre o rendimento, composição
química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. cupressoides e
os parâmetros ambientais do local de coleta .....................................
67
Tabela 6 - Atividade anticoagulante das frações polissacarídicas da C.
cupressoides .....................................................................................
70
Tabela 7 - Composição química do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS FI e FII
da alga C. cupressoides .....................................................................
73
Tabela 8 - Relação molar dos monossacarídeos ERPS, da fração CCB-0.5 e
dos PS FI e FII da alga C. cupressoides .............................................
73
Tabela 9 - Atividade anticoagulante no teste de aPPT do ERPS, da fração
CCB-0.5 e dos PS purificados FI e FII da C. cupressoides .................
74
Tabela 10 - Atividade anticoagulante no teste de PT do ERPS, da fração CCB-
0.5 e dos PS purificados FI e FII da C. cupressoides ..........................
75
Tabela 11 - Atividade anticoagulante no teste de TT da fração CCB-0.5 e dos
PS purificados FI e FII da C. cupressoides .........................................
76
Tabela 12 - Média e variação anual da quantidade de açúcar e sulfato dos ERPS
(média ± desvio padrão, n=12) e ANOVA (Razão-F e probabilidade)
82
Tabela 13 - Média e variação anual da atividade anticoagulante dos ERPS das
algas verdes (média ± desvio padrão, n=12) e ANOVA (Razão-F e
probabilidade) ....................................................................................
83
Tabela 14 - Coeficiente de correlação (n=12) entre o rendimento, composição
química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. prolifera e os
parâmetros ambientais do local de coleta ..........................................
86
Tabela 15 - Coeficiente de correlação (n=11) entre o rendimento, composição
química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. racemosa e os
parâmetros ambientais do local de coleta ..........................................
88
Tabela 16 - Coeficiente de correlação (n=12) entre o rendimento, composição
química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. sertularioides e
os parâmetros ambientais do local de coleta .....................................
90
Tabela 17 - Coeficiente de correlação (n=10) entre o rendimento, composição
química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. isthmocladum
e os parâmetros ambientais do local de coleta ...................................
92
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABS Absorbância
aPTT Tempo de tromboplastina parcial ativada
AT Antitrombina
BIOPOL Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais
CCB-0.3 Fração precipitada com 0,3 volumes de acetona da
C. cupressoides de Búzios
CCB-0.5 Fração precipitada com 0,5 volumes de acetona da
C. cupressoides de Búzios
CCB-1.0 Fração precipitada com 1,0 volumes de acetona da
C. cupressoides de Búzios
CCB-2.0 Fração precipitada com 2,0 volumes de acetona da
C. cupressoides de Búzios
CLAE Cromatografia líquida de alta eficiência
DEAE Dietilaminoetil
CETAVLON Brometo de cetiltrimetilamônio
EMPARN Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande
do Norte
ERPS Extrato rico em polissacarídeo sulfatado
FF Fast flow
FI PS proveniente da CCB-0.5 eluído na faixa de 0,48
- 0,65 M de NaCl
FII PS proveniente da CCB-0.5 eluído na faixa de 0,73
- 0,78 M de NaCl
FIIa Trombina
FIX Fator de Christmas
FPLC Fast Protein Liquid Chromatography
FT Fator tecidual
FUC Fucose
FV Pró-acelerina
FVII Pró-convertina
FVIII Anti-hemofílico
FX Fator de Stuart-Power
FXI Antecedente de tromboplastina
FXII Fator de Hageman
FXIII Fator estabilizante de Fibrina
GAG’s Glicosaminoglicanos
GAL Galactose
GLC Glicose
HCII Cofator II da heparina
MAN Manose
MIN. Minutos
ND Não determinado
NT Não detectado
PDA 1,3 diamino propano acetato
OS Polissacarídeo sulfatado
PT Tempo de protrombina
RHA Ramnose
RN Rio Grande do Norte
TFPI Inibidor da via do fator tecidual
TT Tempo de Trombina
XIL Xilose
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 22
1.1 Polissacarídeos sulfatados de algas marinhas .............................................. 22
1.2 Polissacarídeos sulfatados de algas verdes .................................................. 23
1.3 Atividade anticoagulante de polissacarídeos sulfatados de algas verdes .. 27
1.3.1 Coagulação sanguínea x anticoagulantes ........................................................ 27
1.3.2 Polissacarídeos sulfatados anticoagulantes de algas marinhas ....................... 31
1.4 Carboidratos x período de coleta da alga e parâmetros ambientais ............ 40
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 45
2.1 Objetivo geral .................................................................................................... 45
2.2 Objetivos específicos........................................................................................ 45
3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 46
3.1 Local de coleta .................................................................................................. 46
3.2 Materiais ............................................................................................................. 46
3.2.1 Material biológico ............................................................................................. 46
3.2.3 Outros materiais ............................................................................................... 48
3.2.4 Aparelhos ......................................................................................................... 48
3.3 Métodos .............................................................................................................. 50
3.3.1 Obtenção dos ERPS das algas verdes C. cupressoides, C. prolifera, C.
racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum ........................................................ 50
3.3.2 Obtenção das frações polissacarídicas da C. cupressoides ............................ 50
3.3.3 Obtenção dos PS purificados da C. cupressoides ........................................... 51
3.3.4 Caracterização físico-química das amostras .................................................... 51
3.3.4.1 Eletroforese em gel de agarose .................................................................... 51
3.3.4.3 Análises químicas ......................................................................................... 52
3.3.4.4 Composição monossacarídica ...................................................................... 53
3.3.5 Atividade anticoagulante das amostras ............................................................ 53
3.3.5.1 Ensaio de aPTT, PT e TT .............................................................................. 54
3.3.5.2 Inibição da trombina mediada pela AT .......................................................... 54
3.3.5.3 Inibição da trombina mediada pelo HCII........................................................ 55
3.3.5.4 Inibição direta da trombina ............................................................................ 55
3.3.6 Determinação dos parâmetros ambientais do local de coleta (Praia de Búzios,
Nísia Floresta/RN) ..................................................................................................... 55
3.3.6.1 Coleta da água do mar .................................................................................. 55
3.3.6.2 Obtenção dos dados de precipitação pluviométrica e insolação ................... 56
3.3.6.3 Determinação da salinidade e temperatura da água do mar ......................... 56
3.3.6.4 Determinação de outros parâmetros ambientais ........................................... 56
3.3.7 Análise estatística ............................................................................................ 57
4 RESULTADOS ....................................................................................................... 59
4.1 Parte I: Análise das possíveis mudanças na composição química/atividade
anticoagulante de ERPS da alga C. cupressoides de acordo com o período de
coleta ........................................................................................................................ 59
4.1.1 Rendimento da extração dos ERPS da alga C. cupressoides .......................... 59
4.1.2 Perfil eletroforético dos ERPS da alga C. cupressoides ................................... 60
4.1.3 Composição química dos ERPS da alga C. cupressoides ............................... 61
4.1.4 Atividade anticoagulante dos ERPS da alga C. cupressoides .......................... 62
4.1.5 Parâmetros ambientais do local de coleta ........................................................ 63
4.1.6 Correlações entre o rendimento, composição química e atividade anticoagulante
dos ERPS da C. cupressoides e os parâmetros ambientais do local de coleta ........ 64
4.2 Parte II: Purificação, caracterização e atividade anticoagulante de PS
purificados da alga C. cupressoides ..................................................................... 68
4.2.1 Obtenção das frações polissacarídicas da alga C. cupressoides ..................... 68
4.2.2 Atividade anticoagulante das frações polissacarídicas da alga C. cupressoides69
4.2.3 Purificação da fração CCB-0.5 da alga C. cupressoides .................................. 70
4.2.4 Eletroforese em gel de agarose dos PS FI e FII da alga C. cupressoides ....... 71
4.2.5 Composição química do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS purificados FI e FII
da alga C. cupressoides ............................................................................................ 72
4.2.6 Atividade anticoagulante do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS purificados FI e
FII da alga C. cupressoides ....................................................................................... 74
4.3 Parte III: Análise das possíveis mudanças na composição química/atividade
anticoagulante de ERPS de outras algas verdes de acordo com o período de
coleta ........................................................................................................................78
4.3.1 Rendimento anual e análises químicas dos ERPS das algas verdes .............. 78
4.3.2 Perfil eletroforético dos ERPS das algas verdes .............................................. 79
4.3.3 Composição química dos ERPS das algas verdes .......................................... 80
4.3.4 Atividade anticoagulante dos ERPS das algas verdes ..................................... 83
4.3.5 Correlações entre o rendimento, composição química e atividade anticoagulante
dos ERPS das algas verdes e os parâmetros ambientais do local de coleta ............ 84
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 94
5.1 Parte I: Análise das possíveis mudanças na composição química/atividade
anticoagulante de ERPS da alga C. cupressoides de acordo com o período de
coleta ........................................................................................................................ 94
5.2 Parte II: Purificação, caracterização e atividade anticoagulante dos PS
purificados da alga C. cupressoides ..................................................................... 98
5.3 Parte III: Análise das possíveis mudanças na composição química/atividade
anticoagulante de ERPS de outras algas verdes de acordo com o período de
coleta ......................................................................................................................103
6 CONCLUSÕES .................................................................................................... 110
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 112
APÊNDICE ............................................................................................................. 126
Introdução 22
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
1 INTRODUÇÃO
Os oceanos cobrem mais de 70% da superfície terrestre e são habitados por
uma enorme variedade de seres vivos. Fazem parte desse universo as macroalgas
marinhas que são importantes para a manutenção da estabilidade do ecossistema,
pois suas comunidades produzem nutrientes necessários para reprodução de outros
organismos (PINTO et al., 2002). Além disso, presume-se que por viverem num
ambiente tão hostil, com características únicas, como o ambiente marinho, são
capazes de sintetizar uma diversidade de compostos bioativos com interesse para a
humanidade (RAJAPAKSE; KIM, 2011).
Dentre estes biopolímeros, destacam-se os polissacarídeos, os quais possuem
grande importância para as indústrias alimentícia, cosmética e farmacêutica (AHMED
et al., 2014), como o ágar, carragenana e alginatos, que são bastantes utilizados
comercialmente devido a sua viscosidade e suas propriedades emulsificante e
gelificante (CARDOZO, 2007). Destacam-se também outros tipos de polissacarídeos,
como fucanas, fucoidans e diferentes tipos de homo e heteropolissacarídeos
sulfatados, que ainda não são utilizados comercialmente de forma correspondente ao
seu potencial, mas apresentam um grande apelo econômico devido ao elevado
número de atividades farmacológicas que possuem (NGO; KIM, 2013; JIAO et al.,
2011).
1.1 Polissacarídeos sulfatados de algas marinhas
Por definição os PS são polímeros formados por unidades repetidas de
açúcares e carregados negativamente devido a presença do grupo sulfato
(CARVALHO; GAMA, 2015), estes podem ocorrer na forma de homopolissacarídeos
ou heteropolissacarídeo, dependendo se é formado por um ou por mais de dois
monossaccarídeos diferentes, respectivamente (ROCHA, 2006).
Nas algas marinhas, estes PS se localizam na matriz mucilaginosa e sua
função biológica, nesses seres, ainda não está bem esclarecida, porém, devido ao
seu caráter altamente higroscópico, acredita-se que protejam a alga da desidratação
quando esta é submetida a longos períodos de exposição ao sol durante as marés
baixas. A natureza mucilaginosa destes compostos, também parece contribuir para
tornar a alga flexível o bastante para crescer em ambiente líquido e rígida o suficiente
Introdução 23
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para permanecer estendida, e assim, melhor captar a luz e os nutrientes existentes
(PERCIVAL; MCDOWELL, 1967).
Os PS de algas apresentam estruturas bastante diversas, variando de espécie
para espécie e, às vezes, em diferentes partes da mesma alga (DIETRICH et al., 1995;
ALVES, 2000). A seguir, serão descritos os principais dados da literatura relacionados
com a composição e atividades farmacológicas atribuídas a PS de algas verdes, uma
vez, que as espécies estudadas nesta tese fazem parte deste grupo.
1.2 Polissacarídeos sulfatados de algas verdes
De acordo com Wang e colaboradores (2014) cerca de 40 espécies de algas
verdes, pertencentes a oito famílias, foram globalmente usadas para extrair PS. Os
grupos com o maior número de espécies das quais PS foram extraídos e estudados
incluem os gêneros Ulva (38%), Enteromorpha (14%), Monostroma (14%), Codium
(16%) e Caulerpa (11%). Outros gêneros, inclui Capsosiphon, Chaetomorpha,
Bryopsis e Halimeda (7%) (Figura 1).
Figura 1 - Gêneros de algas verdes utilizados como matérias básicas para se extrair polissacarídeos sulfatados.
Fonte: Adaptado de WANG et al., 2014.
Os principais polissacarídeos encontrados na Ordem Ulvales, em especial nas
de espécies do gênero Ulva e Enteromorpha, são as ulvanas, as quais possuem como
principais constituintes sulfato, ramnose, xilose e ácido glucorônico ou idurônico
(LAHAYE; ROBIC, 2007; JIAO et al., 2011; WANG et al., 2014). Estes polímeros
sulfatados são um dos principais constituintes da parede celular dessas algas e
Introdução 24
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juntamente com a celulose, xiloglucanas e glucuronanas representam em torno de 38
- 54% do peso seco da alga (LAHAYE; ROBIC, 2007). A distribuição e associações
destes polissacarídeos na parede celular da Ulva é descrito esquematicamente no
modelo apresentado na Figura 2.
Figura 2 - Polissacarídeos encontrados na parede celular de algas da ordem Ulvales.
Fonte: Adaptado de LAHAYE; ROBIC, 2007.
Já as espécies do gênero Codium sintetizam arabinanas e arabinogalactanas
sulfatadas e, principalmente, galactanas sulfatadas, no entanto, estes polímeros são
mais heterogêneos e complexos do que as galactanas sulfatadas sintetizadas por
algas vermelhas (WANG et al., 2014). Por exemplo, da alga Codium isthmocladum
purificou-se uma galactana sulfatada composta preponderantemente de unidades -3)-
β-D-galactopiranose-(1-, sendo a maioria delas sulfatada em C4, esta galactana ainda
possue menores quantidades de unidades -3)β-D-galactopiranose(4,6-di-O-(SO4 )-(1,
ramificações -6)β-D-galactopiranose(4-mono-O-(SO4)-(1- e uma substituição
característica dos terminais não redutores, o resíduo 3,4-O-(1’-carboxi)-etilideno, cetal
cíclico com cinco membros (FARIAS, 2011). Outra galactana sulfatada, também
extraída de C. isthmocladum é formada por β-D-galactopiranoses unidas por ligações
β-1,6 (predominante) e β-1,3. Alguns resíduos de galactoses apresentam sulfatação
em C4 ou em C6, e algumas galactoses em posição não redutora apresentam
piruvatação na forma de 3,4-O-(1’-carboxi)-etilideno, cetal cíclico com cinco membros
(SABRY, 2010). Como exemplos de algas desse gênero que sintetizam outros PS que
não galactanas tem-se a alga C. dwarkense, de onde foram extraídas
Introdução 25
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arabinogalactanas sulfatadas (SIDDHANTA et al., 1999) e a C. latum de onde se
obteve arabinanas sulfatadas (UEHARA; TAKESHITA; MAEDA, 1992).
Os PS extraídos de espécies do gênero Caulerpa são mais heterogêneos do
que as espécies de algas das famílias Codiaceae e Ulvaceae. Estes
heteropolissacarídeos são constituídos por diferentes monossacarídeos, sendo a
galactose o açúcar principal e xilose, glicose, arabinose e manose os outros
componentes comuns (WANG et al., 2014). Este fato pode ser observado com os PS
da C. racemosa, a qual sintetiza uma xiloarabinogalactana sulfatada
(CHATTOPADHYAY et al., 2007) e para PS de duas espécies de Caulerpa que vem
sendo estudadas pelo grupo de pesquisa a qual está inserida esta tese, a C.
cupressoides var. flabellata (COSTA et al., 2012) e C. prolifera (CÂMARA, 2015),
ambas apresentam galactose como principal monossacarídeo, no entanto, as frações
polissacarídicas obtidas dessas algas também apresentam outros monossacarídeos
como: glicose, xilose, manose e fucose. Mas isso não é uma regra, pois a C.
sertularioides, estudada por Shevchenko e colaboradores (2009), sintetiza uma
homogalactana sulfatada que é composta por unidades de -3)β-D-galactopiranose-(1-
e -6)β-D-galactopiranose-(1- sulfatada em C2.
Por fim, do gênero Monostroma obtem-se predominantemente ramnanas
sulfatadas. Harada e Maeda (1998) extraíram da Monostroma nitidum uma ramnana
sulfada, constituída por resíduos de L-ramnose α-(1→3) ligados, alguns dos quais
foram substituídos com grupos sulfato, principalmente, na posição O-2. Já da M.
latissimum obteve-se uma ramnana sulfatada com resíduos α-(1→3)- e α-(1→2)-
ligados, com sulfatação na posição 3 dos resíduos α-(1→2)-ligados (LEE et al., 1998).
Diversas atividades farmacológicas vêm sendo atribuídas aos polissacarídeos
sulfatados de algas verdes. A Tabela 1 sumariza algumas destas atividades.
Introdução 26
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Tabela 1 - Atividades farmacológicas atribuídas aos polissacarídeos sulfatados extraídos de algas marinhas verdes.
ATIVIDADE ALGA REFERÊNCIA
Antiadesiva Ulva rotundata GADENNE et al., 2013
Antiadipogênica Caulerpa prolifera CAMARA, 2015
Antiangiogênica Codium cylindricum MATSUBARA et al., 2003
Antimicrobiana Caulerpa racemosa PIRES et al., 2013
Antinociceptiva
Caulerpa cupressoides
Caulerpa racemosa
Codium isthmocladum
RODRIGUES et al., 2012
RIBEIRO et al., 2014
CORDEIRO, 2013
Antioxidante
Caulerpa cupressoides
Caulerpa prolifera
Caulerpa sertularioides
Codium isthmocladum
Enteromorpha linza
Enteromorpha prolifera
Ulva fasciata
Ulva pertusa
COSTA et al., 2012
CAMARA, 2015
COSTA et al., 2010
COSTA et al., 2010
WANG et al., 2013
LI et al., 2013
SHAO et al., 2013
QI et al., 2005
Antitumoral
Caulerpa racemosa
Enteromorpha intestinalis
Monostroma nitidum
Ulva lactuca
Ulva fasciata
JI et al., 2008
JIAO et al., 2009
KARNJANAPRATUM; YOU, 2011
KAEFFER et al., 1999
SHAO et al., 2013
Imunomodulatória
/anti-inflamatória
Capsosiphon fulvescens
Caulerpa lentillifera
Caulerpa racemosa
Caulerpa cupressoides
Codium fragile
Monostroma nitidum
Ulva rigida
NA et al., 2010
MAEDA et al, 2012
RIBEIRO et al., 2014
RODRIGUES et al., 2012
LEE et al., 2010a
KARNJANAPRATUM; YOU, 2011
LEIRO et al., 2007
Introdução 27
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Antiviral
Caulerpa racemosa
Gayralia oxysperma
Monostroma latissimum
Monostroma nitidum
GHOSH et al., 2004;PUJOL et al., 2012
CASSOLATO et al., 2008
LEE et al., 1999
LEE et al., 2010b
Fonte: Autoria própria
1.3 Atividade anticoagulante de polissacarídeos sulfatados de algas verdes
1.3.1 Coagulação sanguínea x anticoagulantes
O entendimento sobre a bioquímica do processo de coagulação sanguínea
iniciou-se na década de 40, quando Paul Owren (1947) reconheceu que a diatese
hemorrágica, tendência a sangramento sem causa aparente, em uma jovem não
poderia ser explicado pelo conceito de 4 fatores de coagulação vigente na época,
sugerindo que ela teria perdido um quinto fator de coagulação de seu plasma.
Estudos sobre o processo de coagulação foram sendo ampliados ao longo das
décadas de 40 e 50 e vários outros fatores de coagulação foram sendo descobertos;
e estes fatores foram designados por algarismos romanos de acordo com sua
sequência de descoberta (RIDDEL et al., 2007; VINE, 2009).
No entanto, somente na década de 60 foi que se tornou claro como estes
múltiplos fatores interagem para converter a protrombina em trombina, resultando na
formação de um coágulo de fibrina. Estudos realizados por dois grupos independentes
de bioquímicos (o grupo de Macfarlane e o de Davie e Ratnoff) em 1964 investigaram
como estes múltiplos fatores interagiam e propuseram um modelo “cascata” e
“cachoeira” de coagulação, respectivamente. Em ambos os casos o processo de
coagulação se dava numa série de passos em que a ativação de cada um dos fatores
de coagulação leva à ativação de um outro, culminando na formação de trombina
(RIDDEL et al., 2007).
De acordo com estes modelos o mecanismo de coagulação é dividido
inicialmente em duas vias: via intrínseca, assim chamada porque todos os
componentes estão presentes no sangue; e via extrínseca, em que a proteína da
membrana das células subendoteliais, o fator tecidual (FT), é necessária, além de
componentes circulantes (Figura 3).
Introdução 28
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A via extrínseca é desencadeada pela formação do complexo Fator Tecidual
(FT): Fator VIIa (FVIIa) que resulta na ativação do fator X. Já a via intrínseca é iniciada
pela ativação do fator XII (FXII), quando o sangue entra em contato com qualquer
superfície contendo cargas negativas (ativação por contato), este processo requer
ainda a presença de outros componentes do plasma: pré-calicreína (uma serino-
protease) e cininogênio de alto peso molecular (um cofator não enzimático). O fator
XII ativo (FXIIa), desencadeia uma série de ativações proteicas, que culmina na
ativação do fator X (VINE, 2009).
O ponto de convergência das vias extrínseca e intrínseca é conhecido como
via comum da coagulação e é caracterizada pela ativação de fibrinogênio à fibrina
pela trombina, formando uma malha de fibrina que vai ser estabilizada pelo fator XIIIa
(FERREIRA et al., 2010).
Figura 3 - Modelo clássico de coagulação sanguínea. HMWK – cininogênio de alto peso molecular.
Fonte: Adaptado de RIDDEL, et al. 2007.
Introdução 29
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Embora o modelo de cascata da coagulação descreva as interações
bioquímicas dos fatores de coagulação e tenha sido um avanço significativo no
entendimento da coagulação, observações experimentais e clínicas demonstraram
que a hipótese da cascata não reflete completamente os eventos da hemostasia in
vivo. Por isto, um novo modelo de coagulação foi proposto e denominado de modelo
celular de coagulação ou modelo da coagulação com base na superfície celular
(Figura 4).
Figura 4 - Modelo de coagulação baseado em superfícies celulares. Representação do modelo da coagulação baseado em superfícies celulares compreendendo as fases de iniciação, amplificação e propagação. FT – Fator tecidual, a – ativado, FvW – Fator de von Willebrand).
Fonte: Adaptado de FERREIRA et al., 2010.
Este modelo enfatiza a interação entre os fatores solúveis, a membrana celular
e a célula, todos são considerados elementos essenciais para o processo de
coagulação. O novo modelo realça a importância de um complexo TF/FVIIIa na fase
de ativação do sistema e propõe a ativação do processo de coagulação sobre
Introdução 30
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
diferentes superfícies celulares em quatro fases que se sobrepõem: iniciação,
amplificação, propagação e finalização (VINE et al., 2009; FERREIRA et al., 2010).
Estas fases estão resumidas na Tabela 2.
Tabela 2 - Resumo do atual modelo de coagulação baseado em superfícies celulares. Fases da coagulação
Iniciação Amplificação Propagação Finalização
Endotélio vascular e
células sanguíneas
circulantes são
perturbados;
Interação do FVIIa
derivado do plasma
com o FT.
Trombina ativa
plaquetas, cofatores
V e VII, e fator XI na
superfície das
plaquetas.
Produção de grande
quantidade de
trombina, formação
de um tampão
estável no sítio da
lesão e interrupção
da perda sanguínea.
Processo da
coagulação é
limitado para evitar a
oclusão trombótica
ao redor das áreas
íntegras dos vasos.
Fonte: FERREIRA et al., 2010.
A coagulação sanguínea é controlada por anticoagulantes que sob condições
normais prevalecem sobre as forças procoagulantes (DAHLBACK; VILLOUTREIX,
2005). As reações bioquímicas da coagulação devem ser reguladas para evitar a
ativação excessiva, formação inadequada de fibrina e a oclusão vascular. Os
inibidores fisiológicos da coagulação (anticoagulantes naturais) de maior relevância
fisiológica são a AT, também chamada de antitrombina III pela literatura mais antiga;
TFPI (inibidor da via do fator tecidual); proteína C e proteína S (KUBIER; O’BRIEN,
2012).
Anticoagulantes têm sido amplamente utilizados para o tratamento de sangue
durante diálises e cirurgias; como fármacos em várias doenças, como coagulação
intravascular disseminada e trombose; e para testes sanguíneos in vitro (WANG et al.,
2010).
O principal fármaco anticoagulante, usado há mais de 80 anos, é a heparina,
um polissacarídeo sulfatado de origem animal, extraído de intestino de suínos e
pulmão de bovinos, constituído por unidades dissacarídicas repetitivas, onde um dos
resíduos é uma hexosamina (glucosamina); e o outro, um ácido urônico (L-idurônico
e D-glucurônico), a sulfatação pode ocorrer em vários pontos da molécula (NADER et
al., 2004). No entanto, o uso deste composto pode provocar algumas reações
adversas, como trombocitopenia decorrente do seu uso prolongado (FABRIS et al.,
Introdução 31
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
2000) e efeito hemorrágico residual, apresentado por fragmentos da heparina sem
atividade anticoagulante (NADER et al., 1979; 2004). Heparinas de baixo peso
molecular, obtidas a partir de hidrólise da heparina não fracionada também são
utilizadas como anticoagulante. A enoxaparina (que pode ter como nome comercial
Clexane®), é uma das heparinas de baixo peso molecular mais utilizada em uma
ampla variedade de doenças tromboembólicas e tem várias vantagens sobre a
heparina não fracionada (IQBAL; COHEN, 2011). No entanto, quadros de hemarragias
ainda são comuns em pacientes que fazem uso deste medicamento (CROWTHER;
WARKENTIN, 2008; NEVIASER et al., 2010).
Portanto, se faz necessário a busca por novos compostos anticoagulantes, que
apresentem menos reações adversas e que possam vir a substituir a heparina e/ou
as heparinas de baixo peso molecular, ou os seus usos em algumas situações
específicas.
1.3.2 Polissacarídeos sulfatados anticoagulantes de algas marinhas
Os PS de algas marinhas têm uma grande variedade de atividades biológicas,
mas a sua ação anticoagulante é a mais amplamente estudada (WANG et al., 2014).
Apesar do modelo de coagulação sanguínea em “cascata” (Figura 3, página
28) ter sido considerado inadequada do ponto vista fisiológico, a divisão do processo
de coagulação em vias, como propõem este modelo, ainda é utilizado para
interpretação de testes laboratoriais que avaliam a coagulação sanguínea. Por
conseguinte, a atividade anticoagulante dos PS é geralmente avaliada por esses
testes, como: tempo de protrombina (PT) e tempo de tromboplastina parcial ativada
(aPTT), que avaliam se o polissacarídeo age nas vias extrínseca e intrínseca da
coagulação, respectivamente; e pelo tempo de trombina (TT), que é o teste para a via
comum da coagulação, que avalia a formação de fibrina mediada por trombina
(CIANCIA; QUINTANA; CEREZO, 2010).
A ação anticoagulante dos polissacarídeos sulfatados reside, principalmente,
na potencialização dos inibidores naturais das proteases (trombina e fator Xa) do
plasma: antitrombina (AT) e cofator II da heparina (HCII). Esses PS podem agir por
dois mecanismos distintos: induzindo a mudança alostérica nas serpinas (AT e HCII)
ou a cadeia do PS pode atuar como uma ''ponte'', aproximando a protease à serpina
(NADER et al., 2004; CIANCIA; QUINTANA; CEREZO, 2010). No entanto, há casos
Introdução 32
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de PS que exibem um efeito anticoagulante independente de serpinas, por exemplo,
inibindo diretamente a atividade da trombina (MATSUBARA et al., 2001; MAO et al.,
2006). O mecanismo de ação dos PS sob as proteases trombina e fator Xa pode ser
avaliado por testes in vitro utilizando substratos cromogênicos na presença ou
ausência de serpinas (CIANCIA; QUINTANA; CEREZO, 2010).
A Figura 5 sumariza os mecanismos de ação anticoagulante dos PS de algas
marinhas.
Figura 5 - Mecanismos de ação anticoagulante dos polissacarídeos sulfatados de algas marinhas. PS – polissacarídeo sulfatado, X – fator X inativo, Xa – fator X ativo, Va – fator V ativo, AT – antitrombina, HCII – cofator II da heparina, TFPI – inibidor da via do fator tecidual, HS – heparan sulfato.
Fonte: Adaptado de Costa (2012).
Em 1936 foi feito o primeiro relato de um PS de alga anticoagulante, uma
galactana sulfatada extraída da alga vermelha Iridaea laminarioides (CHARGAFF;
BANCROFT; STANLEY-BROWN, 1936). A partir de então, foi crescente o interesse
em se estudar polissacarídeos sulfatados anticoagulantes de algas marinhas. Sendo
os mais bem estudados, os extraídos das algas marrons (ALBUQUERQUE et al.,
2004; SILVA et al., 2005; ATHUKORALA et al., 2007; MEDEIROS et al., 2008;
AZEVEDO et al., 2009) e vermelhas (FARIAS et al., 2000; ROCHA et al., 2006;
FONSECA et al., 2008; ALVES, 2015).
Apesar de o primeiro relato de polissacarídeos sulfatados anticoagulantes de
algas marinhas ter sido feito em 1936 (CHARGAFF; BANCROFT; STANLEY-BROWN,
Introdução 33
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
1936), só em 1985 verificou-se a presença de polissacarídeos sulfatados com
atividade anticoagulante em algas verdes (DEACON-SMITH; LEE-POTTER;
ROGERS, 1985).
Dentre as algas verdes, o gênero Codium é aquele que tem o maior número de
espécies com PS extraídos e avaliados quanto ao seu potencial anticoagulante.
Dentre as espécies de Codiaceae, a alga Codium fragile foi a que teve seus
polissacarídeos sulfatados anticoagulantes mais estudados, sendo extraídos por
metodologias diferentes por 4 grupos de pesquisadores (JURD et al., 1995;
HAYAKAWA et al. 2000; CIANCIA et al., 2007; ATHUKORALA et al., 2007), o que
proporcionou a obtenção de polímeros diferentes da mesma alga. Apesar de terem
sido obtidos através de métodos de extração distintos os PS obtidos apresentaram
mecanismo de ação anticoagulante similar, que foi a inibição da trombina, via
potencialização da ação HCII e da atividade da AT (JURD et al., 1995; HAYAKAWA
et al., 2000). Posteriormente em 2007, Ciancia e colaboradores e Athukorala e
colaboradores avaliaram a atividade anticoagulante dos PS da C. fragile pelos ensaios
anticoagulantes de aPTT, PT e TT; e verificaram que estes polímeros foram capazes
de prolongar o tempo de coagulação apenas nos ensaios de aPTT e TT, indicando
que agem na via intrínseca e/ou comum da coagulação (CIANCIA et al., 2007;
ATHUKORALA et al., 2007).
Das algas C. divaricatum, C. adhaerence e C. latum foram extraídos PS ricos
em arabinose que possuem a capacidade de inibição da trombina, via potencialização
da ação HCII e da atividade da AT. Estes autores também verificaram que os PS
destas algas eram capazes de interagir com o HCII em sítios distintos de onde interage
a heparina e o dermatan sulfato (HAYAKAWA et al., 2000).
Da alga Codium dwarkense foram purificadas por troca iônica, seguida por gel
filtração, arabinanas sulfatadas e arabinogalactanas sulfatadas, as quais
apresentaram excelente atividade nos diversos ensaios anticoagulante in vitro (aPTT,
PT e TT) (SIDDHANTA et al., 1999). Posteriormente, um outro PS, rico em galactose
e arabinose, foi obtido desta mesma alga e apresentou atividade anticoagulante pelo
teste de PT. Vale salientar que neste trabalho este foi o único teste anticoagulante
realizado (SHANMUGAM et al., 2002).
Extratos de PS das algas C. indicum, C. tomentosum e C. geppi também foram
avaliados por Shanmugam e colaboradores (2002) e como os da C. dwarkense,
Introdução 34
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
também apresentaram excelente atividade nos ensaios de PT (SHANMUGAM et al.,
2002). Contudo, os estudos com os PS dessas algas como agentes anticoagulantes
não foi continuado.
Matsubara e colaboradores (2001) demonstram que um PS rico em galactose
e com pequenas quantidades de glicose de C. cylindricum apresentou atividade nos
testes aPTT e TT, porém não teve atividade no teste de PT. Quando estes autores
analisaram o mecanismo de ação deste polímero, verificaram que o mesmo não teve
a capacidade de potencializar as serpinas AT e HCII e por isto os autores sugeriram
que o mecanismo de ação deste polímero é diretamente inibindo a polimerização da
fibrina ou inibindo a via intrínseca da coagulação sem agir na AT (MATSUBARA et al.,
2001). Contudo, os autores não apresentaram resultados que confirmasse ou
refutassem nenhumas dessas duas hipóteses.
Outra espécie estudada foi a Codium vermilara, que teve polissacarídeos
sulfatados anticoagulantes ativos nos testes de aPTT e TT, porém estes não
apresentaram atividade no ensaio de PT (CIANCIA et al., 2007). Neste caso, o
mecanismo de ação do PS não foi avaliado.
Já da alga Codium isthmocladum foram obtidas frações ricas em galactose,
manose e arabinose e sulfato que apresentaram atividade pelo ensaio de aPTT,
porém não apresentaram atividade quando submetidas ao teste de PT, uma destas
frações foi purificada por cromatografia de troca iônica, obtendo-se uma galactana
sulfatada também com potente ação anticoagulante pelo teste de aPTT (FARIAS,
2006).
O segundo gênero de algas verdes mais estudado em relação a PS
anticoagulantes é o gênero Monostroma. Uma atividade relativamente alta em inibir a
trombina foi encontrada para extratos de PS de M. nitidum (MAEDA et al., 1991). Um
polissacarídeo ativo destes extratos foi purificado por cromatografia de troca iônica e
gel filtração, obtendo-se um homopolissacarídeo (ramnana sulfatada), que foi capaz
de inibir a trombina de forma seis vezes mais potente que a heparina (HARADA;
MAEDA, 1998). Posteriormente, dois polissacarídeos sulfatados ricos em ramnose,
com pequenas quantidades de glicose e xilose, foram obtidos desta mesma alga por
Mao e colaboradores (2008), os mesmos apresentaram alta atividade anticoagulante
pelos testes de aPTT e TT e foram potentes inibidores da trombina mediado pelo HCII.
Introdução 35
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Estes PS também aceleraram a inibição da trombina e do factor Xa pela potenciação
AT, mas com menor eficácia.
Uma ramnana sulfatada anticoagulante também foi encontrada na alga M.
latissimum, este PS é formado por resíduos de ramnose 1,3- e 1,2-ligados, numa
razão de 3:2, o sulfato encontra-se, principalmente, na posição C3 ou C4 dos resíduos
de ramnose 1,2-ligados (LEE et al., 1998).
Zhang e colaboradores (2008) extraíram desta mesma alga outra ramnana, no
caso uma heteroramanana sulfatada com massa molecular de 725,4 kDa, e este foi
fragmentado por degradação com H2O2 em 5 fragmentos com massa molecular de
216,4; 123,7; 61,9; 26,0 e 10,6 kDa. Estes fragmentos apresentaram composição e
estrutura química similares entre si, sendo também ricos em ramnose. Os mesmos
tiveram atividade anticoagulante pelos testes de aPTT e TT. Os dados mais relevantes
desses autores foi demonstrar que os fragmentos de maior massa molecular
possuíam maior atividade anticoagulante em comparação com os de menor massa
molecular. Este foi um dos primeiros artigos que mostrou com correlação entre a
massa molecular de PS de algas verdes e atividade anticoagulante.
Nos anos seguintes, não houve mais referências a essa ramnana de alta massa
molecular, e este mesmo grupo de pesquisa passou a publicar trabalhos com
ramnanas de massa molecular menor extraídas de M. latissimum. Para tal, o grupo
submeteu extratos aquosos obtidos de M. latissimum a cromatografia de troca iônica
e obteve três frações de PS, as quais foram eluídas com 0,5; 2,0 e 3,0 M de NaCl
(MAO et al., 2009; LI et al., 2011). No primeiro trabalho do grupo a fração obtida com
0,5 M de NaCl foi submetida a cromatografia de gel filtração e assim obteve-se uma
ramnana sulfatada de 55 kDa, composta principalmente por resíduos de L-ramnose
1,2-ligados sulfatados em C3 e/ou C4, este PS apresentou atividade pelos testes de
aPTT e TT, além disso, os autores propuseram que o mecanismo de ação deste PS
era promovendo a inibição da trombina mediada pelo HCII (MAO et al., 2009). Apesar
da estrutura dessa ramnana se assemelhar com aquela descrita por Lee
colaboradores (1998), Mao e colaboradores (2009) não fazem referências a estes. Já
no trabalho de Li e colaboradores (2011), da fração de PS obtida com 2,0 M de NaCl,
após cromatografia de gel filtração, obteve-se outra ramnana sulfatada, com massa
molecular de 513 kDa, formada por resíduos de α-L-ramnose (1→3)-ligados, α-L-
ramnose (1→2)-ligados e resíduos de α-L-ramnose (1→2,3)-ligados, em uma razão
Introdução 36
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
molar de 4:1:1, podendo haver sulfatação em C2 dos resíduos de α-L-ramnose (1→3)-
ligados e em C3 de resíduos de α-L-ramnose (1→2)-ligados. Esta ramnana também
apresentou atividade nos testes de aPTT e PT, de acordo com os autores as
ramnanas obtidas foram mais potentes do que PS obtidos por Zhang e colaboradores
(2008) e Mao e colaboradores (2009) (LI et al., 2011). No entanto, o mecanismo de
ação desta nova ramnana não foi proposto por Li e colaboradores (2011).
Posteriormente, a ramnana sulfatada obtida por Li e colaboradores (2011), a
qual tinha massa molecular aproximadamente de 513 kDa, foi degrada por hidrólise
ácida e obteve-se um polissacarídeo de baixa massa molecular (aproximadamente
33,6 kDa), formada por resíduos α-L-ramnose 1,3-ligados, sulfatada parcialmente em
C2. Este PS também teve a capacidade de prolongar o tempo de coagulação no
ensaio de aPTT e foi potente inibidor da trombina mediada pelo HCII (LI et al., 2012).
Espécies de Ulva e Enteromorpha também vem tendo seus PS anticoagulantes
extraídos e avaliados. Por exemplo, PS ricos em ramnose extraídos da Ulva
conglobata agem inibindo diretamente a trombina ou potencializando a ação do HCII
(MAO et al., 2006). Já da alga E. clathrata foi extraída uma arabinana sulfatada,
formada principalmente por resíduos de α-L-ramnopiranose (1→4)-ligados,
parcialmente sulfatados em C3 (QI et al., 2012) e da alga E. linza foram extraídos
polissacarídeos ricos em ramnose e xilose (WANG et al. 2013), os polissacarídeos de
ambas as espécies tiveram ação anticoagulante quando submetidos aos ensaios de
aPTT e TT, porém não apresentaram atividade anticoagulante no ensaio de PT,
indicando que os mesmos agem na via intrínseca e/ou comum da coagulação.
O interesse por polissacarídeos anticoagulantes de espécies da família
Caulerpaceae também vem crescendo nos últimos anos, no entanto, diferente dos
trabalhos citados anteriormente para espécies de Monostroma e Codium, a maioria
dos trabalhos com espécies de Caulerpa se detem aos testes clássicos de atividade
anticoagulante (aPTT, PT e TT), não sendo o mecanismo de ação destes polímeros
explorados.
Caulerpa okamurai e Caulerpa brachypus possuem polissacarídeos sulfatados
anticoagulantes, os quais são ricos em galactose e têm um efeito específico na
inibição da trombina dependente do HCII (HAYAKAWA et al., 2000).
Costa e colaboradores 2010 estudaram a atividade anticoagulante de extratos
ricos em PS de 11 algas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte, destas 3 foram
Introdução 37
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Caulerpaceae (Caulerpa cupressoides var. flabellata, Caulerpa prolifera e Caulerpa
sertularioides). Todos os extratos obtidos das algas verdes apresentaram atividade
anticoagulante pelo teste de aPTT, e, interessantemente, das 11 espécies estudadas,
o extrato da C. cupressoides foi o único que teve a capacidade de prolongar o tempo
de coagulação no teste de PT (COSTA et al., 2010). Posteriormente, o extrato rico em
polissacarídeos de C. cupressoides foi fracionado e se obteve quatro frações ricas em
galactose denominadas de CCB-0.3, CCB-0.5, CCB-1.0 e CCB-2.0 todas
apresentaram atividade pelos testes de aPTT e PT de maneira dose-dependente,
além disso CCB-0.3, CCB-0.5 apresentaram atividade semelhante a Clexane®, uma
heparina de baixo peso molecular comercial (COSTA et al., 2012).
Um grupo do estado do Ceará também vem trabalhando com polissacarídeos
sulfatados anticoagulantes de C. cupressoides, porém da variedade lycopodium.
Dessa alga obteve-se um polissacarídeo anticoagulante por cromatografia de troca
iônica, seguida por gel filtração, com potente ação anticoagulante pelo teste de aPPT,
o qual age inibindo a trombina na presença da AT (RODRIGUES et al. 2011a;
RODRIGUES et al. 2011b).
Recentemente, a atividade anticoagulantes de extratos de PS de mais 3
espécies de algas verdes (Penicillus capitatus, Udotea flabellum e Halimeda opuntia)
foi avaliada. Todos os extratos são formados por heteropolissacarídeos sulfatados e
tiveram atividade anticoagulante pelos testes de aPTT e TT, no entanto, não tiveram
a capacidade de prolongar o tempo de coagulação no ensaio de PT. O extrato da P.
capitatus foi purificado e observou-se que a fração denominada de F1 também teve
atividade pelos testes de aPTT e TT e foi capaz de inibir a formação de fibrina (ARATA
et al., 2015).
A Tabela 3 sumariza os dados descritos acima a respeito da atividade
anticoagulante de PS de algas verdes.
Introdução 38
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Tabela 03 - Polissacarídeos sulfatados de algas verdes com atividade anticoagulante.
Família Espécie Composição química aPTT PT TT ATa HCIIb IIac Ref.d
Cod
iace
ae
C. adhaerence xiloglucoarabinana nd nd nd + + - 1
C. cylindricum glucogalactana + - + - - + 2
C. divaricatum xiloglucoarabinana nd nd nd + + - 1
C. dwarkense
arabinana/
arabinogalactana
galactoarabinana
+
nd
+
+
+
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
3
15
C. fragile
nd
xiloarabinana
glucoarabinogalactomanana
nd
+
nd
+
+
-
nd
-
-
+
nd
+
+
+
+
nd
nd
+
+
nd
nd
-
-
nd
nd
4
1
5
16
C. geppi nd nd + nd nd nd nd 15
C. isthmocladum arabinomanogalactanas /
galactanas + - nd nd nd nd 6
C. indicum nd nd + nd nd nd nd 15
C. latum arabinana
arabinana
nd
nd
nd
nd
nd
nd
nd
+
nd
+
+
-
7
1
C. pugniformes galactoarabinoglucana + - + + - + 17
C. tomentosum galactoarabinana nd + nd nd nd nd 15
C. vermilara glucoarabinogalactomanana + - + nd nd nd 5
Cau
lerp
acea
e
C. brachypus galactana nd nd nd - + - 1
C. cupressoides
var. flabellata
xiloglucomanogalactanas /
manogalactanas + + nd nd nd nd 20
C. cupressoides
var. lycopodium
nd
nd
+
nd
-
nd
nd
nd
nd
+
nd
nd
nd
nd
22
21
C. prolifera nd + - nd nd nd nd 23
C. sertularioides nd + - nd nd nd nd 23
C. okamurai manoxilogalactana nd nd nd - + - 1
Halim
edaceae
H. opuntia glucomanogalactanas + - + nd nd nd 26
Introdução 39
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
1 - HAYAKAWA et al., 2000. 2 - MATSUBARA et al., 2001. 3 - SIDDHANTA et al., 1999. 4 - JURD
et al., 1995. 5 - CIANCIA et al., 2007. 6 - FARIAS, 2006. 7 – UEHARA; TAKESHITA; MAEDA,
1992. 8 - LEE et al., 1998. 9 - ZHANG et al., 2008. 10 - MAO et al., 2009. 11 - MAEDA et al., 1991.
12 - HARADA; MAEDA, 1998. 13 - MAO et al., 2008. 14 – MAO et al., 2006. 15 - SHANMUGAN
et al., 2002. 16 - ATHUKORALA et al., 2007. 17 - MATSUBARA et al., 2000. 18 – QI et al., 2012.
19 – WANG et al., 2013. 20 – COSTA et al., 2012. 21 – RODRIGUES et al., 2011a. 22 –
RODRIGUES et al., 2011b. 23 – COSTA et al., 2010. 24 – LI et al., 2011. 25 – LI et al., 2012. 26
– ARATA et al., 2015. a Inibição da trombina via AT; b Inibição da trombina via HCII; c Inibição direta
da trombina; d Referências. + apresenta atividade, - não apresenta atividade, nd – não determinado
Fonte: Autoria própria.
A partir dos dados sumarizados na Tabela 3 observa-se que todos os PS que
foram avaliados pelo teste de aPTT e TT tiveram atividade anticoagulante. Além disso,
quando se observa os dados do teste de PT, dos 26 PS que foram avaliados por este
teste apenas 6, em sua maioria do gênero Codiaceae, tiveram atividade. Isso leva a
propor que, com poucas exceções, a via de ação PS anticoagulantes de algas verdes
se dá na via íntriseca e comum da cascata de coagulação. Ainda, pode-se perceber
que esses PS são potentes inibidores da trombina, principalmente, via serpinas HCII
e AT, visto que quando avaliados em testes específicos de inibição desta protease
Mo
nostr
om
ata
cea
e
M. latissimum
ramnana
glucuronoglucoxiloramnana
xiloglucoramnana
xiloglucoramnana
ramnana
ramnana
nd
nd
+
+
+
+
nd
nd
-
-
-
nd
nd
nd
+
+
+
nd
nd
+
nd
+
nd
+
nd
+
nd
+
nd
+
+
-
nd
-
nd
-
8
1
9
10
24
25
M. nitidum
glucuronoglucoramnana
ramnana
glucuronoglucoxiloramnana
sulfatada
xilogalactoglucoramnana
manoxiloglucoramnana
nd
nd
nd
+
+
nd
nd
nd
-
-
nd
nd
nd
+
+
nd
nd
+
+
+
nd
nd
+
+
+
+
+
-
+
+
11
12
1
13
13
Ulv
ace
ae
U. conglobata glucofucoramanas + nd nd + + + 14
E. clathrata arabinana + - + nd nd nd 18
E. linza xiloarabinana + - + nd nd nd 19
Udo
teace
ae
P. capitatus glucogalactanas /
galactoglucanas + - + nd nd nd 26
U. flabellum glucogalactanas + - + nd nd nd 26
Introdução 40
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
apresentaram significante capacidade de inibi-la via HCII (87,5% dos que foram
avaliados no teste) e via AT (82,4% dos que foram avaliados no teste).
1.4 Carboidratos x período de coleta da alga e parâmetros ambientais
As alterações nas estruturas dos polissacarídeos podem ocorrer em todos os
seres vivos. Por exemplo, com relação a animais, há trabalhos com mais de trinta
anos que já demonstram a influência de parâmetros ambientais na
composição/estrutura destes polímeros. Na década de 80, Nader e colaboradores
investigaram a correlação entre a quantidade de PS, conhecidos como
glicosaminoglicanos (GAG's), e a salinidade da água, para tanto, selecionaram
espécies semelhantes de três grupos de invertebrados (Crustacea, Pelecypoda e
Gastropoda) provenientes de habitat de diferentes salinidades e verificaram que há
correlação direta entre o logaritmo da concentração de GAG’s e o grau de salinidade
do habitat (NADER et al., 1983).
Um outro invertebrado que teve as mudanças em seus PS investigadas em
relação aos parâmetros ambientais do local de coleta foram os PS produzidos pelo
ouriço do mar Lytechinus variegatus. Cinelli e colaboradores (2007) demonstraram
que essa espécie produz uma fucana sulfatada durante todas as estações do ano,
denominada de P1, e que no inverno, além da P1, o ouriço produz outro tipo de fucana
sulfatada, a P2, ambas com estruturas distintas, de acordo com os autores,
aparentemente, há uma correlação entre temperatura da água do mar e a síntese da
P2.
Além disso, de acordo com Aquino e colaboradores (2005), a ocorrência de PS
de angiospermas marinhas resulta da adaptação fisiológica, devido à pressão
ambiental, principalmente da salinidade, uma vez que estão ausentes nas plantas
terrestres e de água doce. Fato este que foi também comprovado por Aquino, Grativol
e Mourão (2011), estes autores analisaram PS de halófitas (plantas resistem a
salinidade) artificialmente e naturalmente expostas a diferentes salinidades e
demostraram que a concentração de PS, bem como o grau em que estes compostos
foram sulfatados nas espécies de halófitas, foram correlacionados positivamente com
a salinidade. Além disso, quando cultivaram a planta Ruppia maritima na ausência de
salinidade, a mesma deixou de produzir PS, sugerindo, assim, que a sulfatação destes
polissacarídeos seja uma adaptação ao meio salino.
Introdução 41
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
No entanto, posteriormente, a presença de PS também foi descrita na planta
de água doce Eichhornia crassipes (DANTAS-SANTOS et al., 2012), estes autores
sugeriram que a produção de PS em plantas de água doce não está relacionado ao
estresse salino, e que outros fatores poderiam promover a sua produção, por exemplo
estresse hídrico. Indicando que os fatores que levam uma espécie vegetal a sintetizar
PS podem não ser os mesmos.
Em se tratando de algas marinhas, alguns estudos demonstram que a
composição química de certas espécies é afetada por parâmetros abióticos. Estudo
realizado durante um ano com algas vermelhas Grateloupia doryphora e
Gymnogongrus griffithsiae demonstrou que o conteúdo de carboidratos dessas
espécies aumenta gradualmente durante a primavera, tornando-se maior no verão;
período onde se observa os maiores valores de salinidade, temperatura e intensidade
luminosa (PERFETO, 1998). Esse resultado se assemelha ao obtido para as algas
Gracilaria gracilis e Gracilaria bursa pastoris, no qual o rendimento do ágar variou
significativamente de acordo com a sazonalidade, sendo os maiores rendimentos
obtidos na primavera e no verão, respectivamente. Além disso, essa variável também
foi correlacionada positivamente com a salinidade e temperatura da água do mar
(MARINHO-SORIANO; BOURRET, 2003).
Houve também uma correlação positiva entre a produção de carboidratos e a
temperatura e salinidade da água para alga vermelha Gracilaria cervicornis e entre o
conteúdo de carboidratos e a salinidade para alga marrom Sargassum vulgare
(MARINHO-SORIANO et al., 2006). Essas correlações entre a salinidade e
temperatura e o conteúdo de carboidratos totais e de ágar, sugere que esses dois
parâmetros ambientais podem influenciar no metabolismo de carboidratos.
Além disso, o teor de sulfato também pode ser influenciado por fatores
abióticos, por exemplo, a quantidade de sulfato do ágar das algas Gracilaria gracilis e
Gracilaria bursa pastoris foi correlacionado negativamente com salinidade
(MARINHO-SORIANO; BOURRET, 2003).
Com relação a PS de algas marinhas, que não o ágar, foi observado que a
sazonalidade pode ou não influenciar a composição/estrutura de PS. Galactofucanas
sulfatadas foram extraídas da alga marrom Saccharina longicruris em quatro períodos
(maio, agosto e novembro de 2005 e junho de 2006) e verificou-se que havia uma
diferença significativa no rendimento e composição monossacarídica entre maio 2005
Introdução 42
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
e junho 2006, além de haver também uma diferença significativa no teor de sulfato
das galactofucanas entre 2005 e 2006, no entanto, esta diferença não estava
correlacionada com a temperatura e salinidade da água, já que esses parâmetros se
mantiveram constantes durante o período de estudo (RIOUX; TURGEON; BEAULIEU,
2009).
Variações sazonais (de abril a outubro) no rendimento de extratos ricos em
fucanas obtidos da alga marrom Laminaria japonica foram observadas por Honya e
colaboradores (1999), estes autores verificaram um aumento gradual no rendimento
de abril a setembro e um aumento acentuado de setembro para outubro. De acordo
com os autores, este aumento no rendimento esta correlacionado com o crescimento
da alga, vale salientar que neste caso a alga foi cultivada e não coletada de ambientes
naturais.
Outra alga marrom que teve seus PS estudados em diferentes períodos do ano
foi a Costaria costata (IMBS et al., 2009). Estes autores coletaram a alga C. costata e
extraíram PS da mesma na primavera (abril, maio) e verão (junho e julho) e verificaram
que havia mudanças no rendimento, composição química, massa molecular e
conteúdo de sulfato dependendo da estação do ano. Na primavera foram extraídas
heterofucanas pouco sulfatadas, constituídas por fucose, galactose, manose e
ramnose, além de traços de xilose e glicose (Fuc:Gal:Man:Rha razão
1:0,27:0,38:0,19), com massa molecular de 200 - 800 kDa. Já no verão houve uma
diminuição significativa na quantidade dos monossacarídeos manose e ramnose e
não observou-se os traços de xilose e glicose (Fuc:Gal:Man:Rha
razão1:0,29:0,08:0,06), obtendo-se assim uma galactofucana com massa molecular
em torno de 20 - 300 kDa e que foi mais sulfatada que o polímero extraído na
primavera (IMBS et al., 2009).
Posteriormente, também foram vistas mudanças no rendimento, composição
monossacarídica e quantidade de sulfato do fucoidan (PS contendo α-L-fucose
extraídos de algas marrons) de alga marrom Padina pavonica coleta nos meses de
abril, maio, junho e julho de 2009. Observou-se que o rendimento da extração do
fucoidan foi 2 vezes maior em abril do que em maio e tendeu a aumentar de maio para
julho. Além disso, os fucoidans extraídos nos diferentes meses foram constituídos por
fucose, galactose, manose, xilose, ramnose e glicose, no entanto, de acordo com os
autores houve uma variação significativa apenas no conteúdo de ramnose e galactose
Introdução 43
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
durante o período de estudo, a quantidade destes monossacarídeos aumentaram de
abril a julho, houve também uma variação no conteúdo de sulfato de acordo com o
mês de coleta (MEN´SHOVA et al., 2012).
Variações sazonais (setembro a dezembro de 1995 e de janeiro a março de
1996) no rendimento, composição monossacarídica e quantidade de sulfato de
extratos de PS obtidos da alga verde Ulva fasciata foram observadas por Siddhanta e
colaboradores (2001). É importante mencionar que nestes quatro últimos trabalhos
citados, os autores não avaliaram os parâmetros ambientais do local de coleta, para
poder verificar se as mudanças na composição/estrutura destes PS estavam
correlacionadas com os fatores ambientais do local de coleta.
Já os PS obtidos da alga Delesseria sanguinea, coletada mensalmente durante
um ano, não tiveram sua composição monossacarídica, nem conteúdo de sulfato
alterado com sazonalidade (GRÜNEWALD; GROTH; ALBAN, 2009). No entanto, mais
uma vez os autores não avaliaram a influência de fatores abióticos, como a salinidade
e temperatura, sobre os PS produzidos por essas algas.
Estes dados indicam que dependendo do período do ano que a alga é coletada,
períodos estes em que os fatores ambientais do local de coleta podem ser distintos,
os PS extraídos destas espécies de algas podem ter suas estruturas químicas
afetadas e, consequentemente, suas atividades biológicas poderão ser distintas. No
entanto, como descrito acima, cada espécie de alga responde de forma diferente às
mudanças ambientais do local de coleta. Por isso, é de fundamental importância
estudos para se averiguar as possíveis mudanças na composição/estrutura de PS de
acordo com o período de coleta, bem como a influência de fatores ambientais sobre
estes PS, uma vez que PS distintos, apresentam atividades biológicas também
distintas. Estes tipos de estudos levariam ao esclarecimento de quais seriam as
melhores condições para se obter o PS com as características estruturais e biológicas
de interesse, o que é fundamental para o uso destes polímeros na indústria.
No litoral do estado do Rio Grande do Norte encontram-se mais de cem
espécies de algas marinhas e de várias destas espécies já foram obtidos PS com
pronunciadas atividades farmacológicas, no entanto, não há, até o momento, estudos
que demonstrem como o período de coleta poderia influenciar a estrutura e,
consequentemente, as atividades farmacológicas desses PS. Em relação a como
parâmetros ambientais poderiam afetar os PS de algas do litoral potiguar, há apenas
Introdução 44
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
um estudo, o qual foi realizado com a alga Caulerpa cupressoides var. flabellata,
estudo este realizado pelo grupo em que se insere esta tese. Neste trabalho foi
demonstrado que quando a C. cupressoides era coletada na mesma época, mas em
praias com grau de salinidade diferente, sintetizava PS com propriedades diferentes,
inclusive atividade anticoagulante (COSTA, 2010), o que indica que ela, e, por
conseguinte, seus PS são susceptíveis a fatores ambientais.
Daí a necessidade de se obter mais estudos que demonstrem como o período
de coleta e fatores ambientais poderiam afetar a composição de PS de espécies de
algas do litoral potiguar e, consequentemente, as propriedades farmacológicas destes
biopolímeros. E qual seria o melhor período para se coletar as algas para se obter PS
com as características de interesse.
Além disso, foi demostrando por Costa (2010) que a alga C. cupressoides
sintetiza frações ricas em PS com atividade anticoagulante, algumas delas com
atividade similar a do Clexane®, por isso, surge a necessidade de se purificar estes
polímeros e avaliar mais detalhamente a atividade anticoagulante dos mesmos.
Em suma, a alga Caulerpa cupressoides sintetiza PS anticoagulantes, estes
polissacarídeos apresentam atividades cuja a potência pode ser influenciada pela
salinidade. Portanto, para que esta alga venha a ser atrativa para uso comercial é
necessário, dentre outras coisas, que se determine que fatores ambientais são
importantes para que C. cupressoides sintetize a maior quantidade de PS com
atividade anticoagulante, para que esses possam ser utilizados futuramente pela
indústria que se forme ao redor do cultivo, extração e comercialização dos PS de C.
cupressoides.
Objetivos 45
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a influência do período de coleta e de parâmetros ambientais na
composição química e atividade anticoagulante de polissacarídeos sulfatados obtidos
de algas verdes do litoral potiguar, bem como obter e avaliar o potencial
anticoagulante de polissacarídeos sulfatados purificados da alga C. cupressoides.
2.2 Objetivos específicos
Obter extratos ricos em polissacarídeos sulfatados (ERPS) de cinco
macroalgas marinhas abundantes no litoral potiguar mensalmente durante um ano;
Realizar a caracterização química dos ERPS;
Analisar a atividade anticoagulante dos ERPS;
Determinar parâmetros ambientais do local de coleta mensalmente;
Correlacionar as possíveis mudanças no rendimento, composição e
atividade anticoagulante dos ERPS com os parâmetros ambientais do local de coleta;
Purificar pelo menos um PS da alga C. cupressoides;
Caracterizar através de métodos químicos e físico-químicos os PS
purificados da alga C. cupressoides;
Avaliar o potencial anticoagulante dos PS purificados e propor seu possível
mecanismo de ação anticoagulante.
Materiais e Métodos 46
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Local de coleta
A coleta das algas objetos de estudo deste trabalho foi realizada na Praia de
Búzios, litoral Sul do Rio Grande do Norte (Figura 6).
A praia de Búzios pertence ao município de Nísia Floresta, a 38 Km de Natal.
Está localizada a uma latitude sul 6°1'8.19" e longitude oeste 35°6'33.40". A praia é
relativamente rasa, de fundo arenoso, em muitos pontos cobertos por algas calcárias
e protegida do embate das ondas pelos arrecifes (FONSECA, 2001). Esta praia possui
uma vasta diversidade de algas marinhas com grande número de espécies dos Filos
Stramenopiles, Rhodophyceae e Chloroplastida, nova classificação dada por Adla e
colaboradores (2012) aos filos antigamente denominados de Phaeophyta,
Rhodophyta e Chlorophyta, respectivamente.
Figura 6 - Localização do ponto de coleta das algas na Praia de Búzios, litoral Sul do Rio Grande do Norte.
Fonte: Google Earth.
3.2 Materiais
3.2.1 Material biológico
Como objetos deste estudo foram escolhidas as algas verdes Caulerpa
cupressoides var. flabellata Børgesen, Caulerpa prolifera (Forsskal) J. V. Lamouroux,
Caulerpa racemosa var. occidentalis (J. Agardh) Børgesen, Caulerpa sertularioides
Materiais e Métodos 47
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(S.G. Gmelin) M Howe e Codium isthmocladum Vickers (Figura 7), devido serem
espécies facilmente encontradas e abundantes na praia de Búzios, além de serem de
fácil coleta. Os espécimes foram coletados na praia de Búzios durante o período de
um ano, de janeiro a dezembro de 2010, em períodos de maré baixa entre 0,0 - 0,2
metros.
Figura 7 - Algas verdes utilizadas neste trabalho. Caulerpa cupressoides var. flabellata (A), Caulerpa prolifera (B), Caulerpa racemosa var. occidentalis (C), Caulerpa sertularioides (D) e Codium isthmocladum (E).
Fonte: Autoria própria.
Após coleta, as algas foram acondicionadas em sacos de polietileno, levadas
ao laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais (BIOPOL) do Departamento de
Bioquímica da UFRN no mesmo dia da coleta, lavadas em água corrente, examinadas
cuidadosamente para que ficassem livres de epífitas, inclusões calcárias e sais e,
então, foram postas para secar em estufa aerada a 45 ºC. Em seguida, foram
trituradas, pesadas e guardadas em frascos hermeticamente fechados.
A B C
D E
Materiais e Métodos 48
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3.2.3 Outros materiais
- Acetona, ácido acético, ácido sulfúrico, álcool etílico, álcool metílico, azul de
toluidina, brometo de cetiltrimetilamônio P.A. (CETAVLON), citrato de sódio, cloreto
de bário, cloreto de sódio, coomasie brilliant blue R 250, hidróxido de sódio e sulfato
de sódio da CRQ (Diadema, SP, Brasil);
- Ácido clorídrico da Synth (Diadema, SP, Brasil);
- Albumina sérica bovina (BSA), azul de dimetilmetileno (DMB), 1,3 diamino propano
acetato, heparina, substrato cromogênico N-benzoyl-Phe-Val-Arg-p-
nitroamilidahydrochloride e cofator II da heparina da Sigma-Aldrich Brasil (São Paulo,
SP, Brasil);
- Agarose (Standart L’ow-MR) da BioRad Laboratories (Richmond, CA, EUA);
- Bacto-Getatina da Difco Laboratories (Detroit, MI, USA).
- Clexane® (enoxaparina sódica) da Sanofi Winthrop Industrie (Maisons, Alfort,
França);
- Fenol 80% da SRB Comércio e Produtos Farmacêuticos (Natal, RN, Brasil);
- L-fucose, D-xilose, D-galactose, D-manose, D-glucose, D-arabinose, D-ramnose e
ácido D-glucurônico da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA);
- “Kit” de tempo de tromboplastina parcial ativada e “kit” de tempo de protrombina da
Wiener Lab. (Rosario, Argentina);
- “Kit” de tempo de trombina da Instrumentation Laboratory (Bedford, MA, EUA);
- “Kit” Actichrome Heparin (Anti-FIIa) assay da Sekisui Diagnostics (Lexington, MA,
EUA)
- Prozima (preparação enzimática a base de protease alcalina PROLAV 750) da
Prozyn Biosolutions (São Paulo, SP, Brasil);
Todos os demais materiais e reagentes utilizados foram da melhor qualidade
disponível.
3.2.4 Aparelhos
Além dos aparelhos usuais do laboratório pode-se destacar:
- Agitador de tubos modelo 251 da FANEM (São Paulo, SP, Brasil);
- Agitador magnético modelo TE-0851 da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil);
Materiais e Métodos 49
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- Balança analítica modelo B-TEC-210A da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil);
- Balança de precisão modelo Mark 5000 da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil);
- Banho maria de temperatura ajustável modelo 100 da FANEM (São Paulo, SP,
Brasil);
- Bomba à vácuo modelo TE-058 da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil);
- Câmara para eletroforese em gel de agarose, modelo desenvolvido por Jaques e col.
(1968) da Técnica Permatron Ltda (São Paulo, SP, Brasil);
- Centrífuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co. Ltda (Tóquio, Japão);
- Centrifuga refrigerada 5804 R foi obtida da Eppendorf (São Paulo, SP, Brasil);
- Coagulômetro modelo Quick Timer da Drake (São Paulo, SP, Brasil).
- Cromatógrafo líquido Elite Lachrom da Hitachi (Tóquio, Japão);
- Destilador de água tipo pilsen modelo SL 71/10 da Solab (Piracicaba, SP, Brasil);
- Espectrofotômetro modelo 600S da FEMTO Ltda (São Paulo, SP, Brasil);
- Espectrofotômetro de microplacas Epoch™ da BioTek Instruments (Califórnia, EUA);
- Estufa modelo 002 CB da FANEM (São Paulo, SP, Brasil);
- Fontes de corrente contínua da BioAgency Biotecnologia Ltda. (São Paulo, SP,
Brasil);
- Liofilizador, FreeZone Plus 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System, da
Labconco (Kansas City, MO, EUA);
- Medidor de pH modelo TEC-5 da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil);
- Sistema de purificação de água BarnsteadTM NanopureTM – DISCONTINUED modelo
7155 da Thermo Scientific (Califórnia, EUA);
- Refratômetro portátil modelo RTS 101ATC da Instrutherm (Freguesia do Ó, SP,
Brasil);
- Sistema cromatográfico: Sistema FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography)
adaptado para cromatografia de troca iônica, com coluna de troca aniônica HiTrap
DEAE FF 5mL e com o equipamento ÄKTA Protein Purification Systems da empresa
GE Healthcare Life Sciences (Little Chalfont, Bucks, Reino Unido);
- Sonicador modelo Q1.8/40A da Eco-Sonics (Indaiatuba, SP, Brasil);
- Termômetro centígrado da Incoterm (Porto Alegre, RS, Brasil).
Materiais e Métodos 50
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3.3 Métodos
3.3.1 Obtenção dos ERPS das algas verdes C. cupressoides, C. prolifera, C.
racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum
Como já mencionado, as algas verdes C. cupressoides, C. prolifera, C.
racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum foram coletadas mensalmente, durante
um ano, e delas se obteve ERPS referente a cada mês de coleta.
A obtenção dos ERPS das algas verdes seguiu a metodologia aplicada pelo
grupo pesquisa que em está inserido esta tese (ROCHA et al., 2001) e mais
recentemente utilizada por Costa e colaboradores (2010) durante a obtenção de
ERPS de algas do litoral potiguar.
As algas secas e pulverizadas foram tratadas com dois volumes de etanol para
despigmentação e delipidação do material. A cada saturação do álcool, que foi
observada visualmente, realizava-se a troca deste reagente. Posteriormente, o
resíduo foi separado do álcool, e colocado para secar a temperatura ambiente, após
seco este material despigmentado foi utilizado para a obtenção dos ERPS.
Foram pesados 40 g do pó da alga depilidado e adicionado ao mesmo dois
volumes de NaCl 0,25 M, sendo o pH ajustado para 8,0. A este material, foi adicionada
a enzima proteolítica prozima (15 mg por grama de pó de alga delipidado), e o material
foi incubado a 60 ºC por 18h. A suspensão foi, em seguida, centrifugada a 8.000 x g
por 15 min. O precipitado foi desprezado e ao volume do sobrenadante foi adicionado
2 volumes de metanol, esta mistura foi deixada a 4 ºC durante 24h. Após esse período,
o material foi centrifugado (10.000 x g, durante 10 min. a 4 ºC). O sobrenadante foi
descartado e o precipitado, denominado ERPS, foi seco à pressão reduzida, pesado
e devidamente guardado.
3.3.2 Obtenção das frações polissacarídicas da C. cupressoides
O sobrenadante obtido após proteólise foi fracionado com volumes crescentes
de acetona. Este fracionamento foi realizado de acordo com a metodologia descrita
por Costa (2010). Os valores de acetona adicionados foram determinados pela
turvação da solução, que caracteriza a precipitação de polissacarídeos devido à
Materiais e Métodos 51
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adição desse solvente. Inicialmente, foi adicionado 0,3 volumes de acetona, sob
agitação leve, volume necessário para que se visualize uma turvação da solução, essa
solução foi mantida em repouso a 4 ºC durante 18h, o precipitado foi coletado por
centrifugação a 8.000 x g por 15 min. a 4 ºC e seco a pressão reduzida. Em seguida,
esse procedimento foi repetido utilizando-se 0,5, 1,0 e 2,0 volumes de acetona,
obtendo-se as quatro frações polissacarídicas, denominadas de CCB-0.3, CCB-0.5,
CCB-1.0 e CCB-2.0, de acordo com o volume de acetona acrescentado.
Para o cálculo do rendimento do fracionamento, a massa de cada fração obtida
após a precipitação em acetona foi determinada, posteriormente todos os valores
individuais foram somados e o valor obtido foi considerado 100%. Com este valor, o
percentual correspondente a cada fração foi determinado.
3.3.3 Obtenção dos PS purificados da C. cupressoides
A fração CCB-0.5, obtida após fracionamento com acetona, foi fracionada por
cromatografia de troca iônica em sistema FPLC no equipamento AKTA. Para tal, 1 mL
de solução desta fração a 5 mg/mL (em NaCl 0,25 M) foi aplicada em coluna de troca
iônica Hitrap DEAE FF 5 mL e eluída com gradiente linear de 0,25 - 3,0 M de NaCl. A
taxa de fluxo da coluna foi 2,0 mL/min. e frações de 0,5 mL foram coletadas. Este
procedimento foi realizado repetidas vezes até a obtenção de uma quantidade
satisfatória de amostra. O perfil de eluição dos PS foi monitorado por metacromasia
(FARNDALE; BUTTLE; BARRETT, 1986) e dosagem de açúcares totais (DUBOIS et
al., 1956). As frações contendo PS obtidas foram agrupadas, dialisadas contra água
destilada, utilizado membranas com limite de exclusão de 6 kDa; e, em seguida,
liofilizadas.
3.3.4 Caracterização físico-química das amostras
3.3.4.1 Eletroforese em gel de agarose
As amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose. O preparo
das lâminas passa pela pesagem do gel de agarose 0,6% (m/v) e diluição no
tampão 1,3 diamino propano acetato (PDA) 0,05 M, pH 9,0. Alíquotas de 5 μL de cada
Materiais e Métodos 52
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amostra na concentração de 10 μg/μL foram aplicadas em canaletas no gel e
submetidos à eletroforese em cuba resfriada a 4 ºC. Após a corrida eletroforética (a
100 Volts), os compostos foram precipitados com CETAVLON 0,1% por 2h, à
temperatura ambiente. Em seguida, o gel foi seco sob uma corrente de ar quente e
corado com azul de toluidina 0,1%, numa solução de ácido acético 1% e etanol 50%.
O excesso de corante foi removido utilizando-se uma solução de ácido acético 1% em
etanol 49% (solução descorante). A operação foi repetida até completo
descoloramento do fundo da lâmina. A seguir, o gel foi seco à temperatura ambiente
(DIETRICH; DIETRICH, 1976).
A revelação das bandas de migração foi feita pela atividade metacromática
característica de cada composto. Neste caso, os compostos ricos em sulfato
desenvolvem uma coloração roxa característica.
3.3.4.2 Densitometria das bandas de PS do gel de agarose
Foi feita densitometria da imagem digitalizada do gel de agarose com o uso do
software PhotoShop CS2 9.0 2005 (Adobe® Photoshop CS®).
3.3.4.3 Análises químicas
Açúcares totais
Para se verificar a quantidade de polissacarídeos nas amostras realizou-se a
determinação de açúcares totais pelo método fenol/ácido sulfúrico, utilizando-se a
galactose como padrão, sendo as leituras realizadas a 490 nm (DUBOIS et al., 1956).
Sulfato
A quantidade de sulfato nas amostras foi determinada após uma hidrólise ácida
(HCl 4 N, 6h, 100 ºC) e quantificada por turbimetria pelo método da gelatina-bário,
tendo-se como padrão o sulfato de sódio (DODGSON; PRICE, 1962).
Materiais e Métodos 53
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Proteína
O grau de contaminação proteíca nas amostras foi determinado utilizando o
reagente comercial de Bradford®, como descrito em Melo e colaboradores (2013). Um
total de 10 μL de cada uma das soluções das amostras (10 mg/mL) foi aplicada um
em microplaca de 96 poços e a estas foi acrescentado o reagente de Bradford® em
um volume pré-determinado (200 μL). Após 10 min. a temperatura ambiente (22 ºC),
a microplaca, contendo as amostras juntamente ao reagente, foi lida em
espectrofotômetro a 595 nm, tendo como padrão albumina sérica bovina (BSA).
3.3.4.4 Composição monossacarídica
As amostras foram hidrolisadas (HCl 2 N, 2h, 100 ºC) e os monossacarídeos
constituintes das frações foram determinados através de cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE), como descrito por Câmara (2015), utilizando-se a coluna
LiChroCART® 250-4 LiChrospher® 100 NH2 (10 μm), tendo como fase móvel
acetonitrila:água (80:20) em um fluxo de 1 mL/min. a 40 ºC . Usou-se como padrões
de açúcares: L-fucose, D-xilose, D-galactose, D-manose, D-glicose, D-arabinose, D-
ramnose e ácido D-glucurônico.
3.3.5 Atividade anticoagulante das amostras
A atividade anticoagulante das amosras foi avaliada pelos ensaios de tempo de
tromboplastina parcial ativada (aPTT), tempo de protrombina (PT) e tempo de
trombina (TT). O plasma citratado utilizado nestes ensaios foi obtido após a
centrifugação de sangue humano retirado de indivíduos adultos, sadios e de ambos
os sexos.
Para se averiguar o mecanismo de ação dos PS purificados foram realizados
ensaios de inibição direta da trombina e inibição da trombina mediada pelas serpinas,
AT e HCII, usando-se substratos cromogênicos.
Materiais e Métodos 54
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3.3.5.1 Ensaio de aPTT, PT e TT
Os ensaios de aPTT e PT foram realizados seguindo-se o protocolo fornecido
pelos “kits” comerciais adquiridos (Wiener Lab). Já o ensaio de TT realizou-se de
acordo com metodologia descrita por Sabry (2015).
Para o ensaio de aPTT o plasma humano citratado (90 µL) foi misturado com
10 µL de solução das amostras ou da clexane® (1,5 a 33 µg/mL). Em seguida, 100 µL
de cefalina foi adicionada a mistura e incubou-se por 3 min. a 37 ºC. Então, 100 µL de
CaCl2 0,025 M foram adicionados e o tempo de formação do coágulo foi registrado,
utilizando-se um coagulômetro automático da marca Drake.
Para o ensaio de PT o plasma humano citratado (90 µL) foi misturado com 10
µL de solução das amostras ou da heparina (67 a 333 µg/mL) e incubados por 2 min.
a 37 ºC. Em seguida, 200 µL do reagente do kit foi adicionado a mistura e incubada
por mais 2 min. a 37 ºC. Então, 100 µL de CaCl2 0,025 M foram adicionados e o tempo
de formação do coágulo foi registrado.
Para o teste de TT, o plasma humano citratado foi incubado juntamente com a
amostra (3 a 66 µg/mL) a 37 ºC, totalizando 75 µL, por 1 min., então, o reagente de
TT foi adicionado (75 µL) e o tempo de formação do coágulo foi registrado.
Todos os ensaios foram realizados em triplicata. Os resultados dos testes para
as frações e PS purificados foram apresentados em tempo de coagulação em
segundos. Para atividade anticoagulante dos ERPS das algas verdes os resultados
foram expressos como razão de aPTT, obtida pela divisão do tempo de coagulação
obtido com os ERPS (5 µg) pelo tempo de coagulação do controle.
3.3.5.2 Inibição da trombina mediada pela AT
O ensaio de inibição da trombina mediada pela AT foi realizado em microplaca
de 96 poços de acordo com as instruções do kit Actichrome Heparin (Anti-FIIa) assay
(Sekisui Diagnostics, ref: 820). 50 μL de trombina foram incubadas a 37 ºC por 2 min.
na presença de concentrações crescentes dos PS purificados (0,01; 0,1; 1 e 10
µg/mL), diluídos previamente em plasma humano citratado fresco e em seguida,
novamente diluídos em solução contendo AT. 50 μL de trombina bovina purificada
foram adicionados a cada poço, homogeneizados e incubados a 37 ºC por exatos 2
Materiais e Métodos 55
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min. Em seguida, 50 μL do substrato cromogênico para trombina foram adicionados,
homogeneizados e incubados a 37 °C por exatos 2 min. Após incubação, 50 μL de
ácido acético a 30% (v/v) foram adicionados para interromper a reação e a
absorbância foi mensurada a 405 nm.
3.3.5.3 Inibição da trombina mediada pelo HCII
O teste de inibição da trombina mediada pelo HCII na presença dos PS foi
realizado em microplaca de 96 poços com volume final de 100 µL de acordo com
Pavão e colaboradores (1995). Para ocorrência da reação 25 µL dos PS purificados
(0,001; 0,01; 0,1; 1,0 e 10 µg/mL) em tampão 0,02 M Tris/HCl, 0,15 M NaCl (pH 7,4)
e 25 µL de HCII (70 nM) foram incubados por 2 min a 37 ºC. Em seguida, foi adicionado
25 µL de trombina (48 nM) e incubados por 1 min a 37 ºC. Posteriormente, foi
adicionado 25 µL do substrato cromogênico N-benzoyl-Phe-Val-Arg-p-
nitroamilidahydrochloride (100 mM) e a mistura foi incubada por mais 1 min. a 37 ºC.
Após a incubação foi adicionado 25 µL de ácido acético a 30% para parar a reação. A
absorbância foi lida a 405 nm. O branco da amostra foi feito utilizando os mesmos
reagentes, no entanto o substrato somente foi adicionado após a reação ter sido
parada com o ácido acético a 30%. Para avaliar a atividade total da enzima (100% de
atividade enzimática), não foi adicionada a amostra teste.
3.3.5.4 Inibição direta da trombina
A inibição direta dos PS na trombina foi determinada usando a metodologia
descrita acima, no entanto, substitui-se o HCII por tampão 0,02 M Tris/HCl, 0,15 M
NaCl (pH 7,4).
3.3.6 Determinação dos parâmetros ambientais do local de coleta (Praia de Búzios,
Nísia Floresta/RN)
3.3.6.1 Coleta da água do mar
Materiais e Métodos 56
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Para coleta da água do mar seguiu-se procedimento recomendando pela norma
NBR 9898 (ABNT, 1987). Durante a coleta, segurou-se o frasco, previamente limpo,
pela parte de baixo, submergindo a uma profundidade de aproximadamente 20 cm, a
boca do frasco foi levemente inclinada para cima, direcionada contra a correnteza,
para retirada do ar e entrada do líquido. Após a coleta descartou-se parte do líquido,
deixando espaço para homogenização da amostra em laboratório, em seguida, o
frasco foi tampado com o papel protegendo o gargalo e devidamente identificado.
3.3.6.2 Obtenção dos dados de precipitação pluviométrica e insolação
Os dados de precipitação pluviométrica e a insolação solar foram obtidos na
estação meteorológica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
3.3.6.3 Determinação da salinidade e temperatura da água do mar
Os valores de salinidade (‰) e de temperatura (ºC) da água do mar foram
determinados mensalmente durante cada coleta. A salinidade foi determinada por
intermédio de um refratômetro portátil, modelo RTS 101ATC da Instrutherm e a
temperatura foi verificada com auxílio de um termômetro de mercúrio centígrado.
3.3.6.4 Determinação de outros parâmetros ambientais
Para determinação dos outros parâmetros ambientais, como pH, turbidez,
nitrogênio, potássio, sulfato, condutividade elétrica, sólidos totais e dissolvidos,
alcalinidade de carbonato e bicarbonato, sódio, ferro, bicarbonato, carbonato e cloreto
foi feita coleta de água do mar do local de coleta das algas mensalmente, e esta foi
enviada à Empresa de Pesquisa Agropecuária do Rio Grande do Norte (EMPARN)
para a determinação dos parâmetros citados. Os métodos de análises realizados pela
EMPARN seguiram o procedimento recomendado pelo Standand Methods for the
Examination of Water and Wastewater (1998).
Materiais e Métodos 57
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3.3.7 Análise estatística
Os dados referentes ao rendimento e atividade anticoagulante do ERPS, da
fração CCB-0.5 e dos PS purificados da C. cupressoides foram submetidos ao teste
estatístico ANOVA One-way, seguido do pós-teste de Student-Newman-Keuls usando
o GraphPad Prisma 5.01 (GraphPad Software). As diferenças estatísticas foram
consideradas significativas, quando o valor de p < 0,05.
Os dados relativos ao rendimento, composição química e atividade
anticoagulante do ERPS das algas verdes foram analisados por ANOVA one-way para
verificar se haveria diferenças estatísticas significativas (p < 0,05) nestes parâmetros
ao longo período de estudo e foram apresentados o valor de F e o seu respectivo valor
de p. A análise de variância, ou mais resumidamente ANOVA, refere-se, de maneira
ampla a um conjunto de situações experimentais e procedimentos estatísticos para
análise de respostas quantitativas de unidades experimentais. O ANOVA One-way
envolve a análise de dados de experimentos em que foram empregados mais de duas
populações (distribuições) ou dados de experimentos em que foram empregados mais
de dois tratamentos (DEVORE, 2006). O procedimento ANOVA se constrói em torno
de um teste de hipótese chamado de teste-F, que compara o quanto os grupos diferem
entre si em relação à quantidade de variabilidade dentro de cada grupo, sendo então
utilizado quando se precisa comparar diversas médias e se existe relação entre eles
(RUMSEY, 2014). O valor-p é a probabilidade de se obter uma estatística de teste
igual ou mais extrema que aquela observada em uma amostra, sob a hipótese nula.
Em termos gerais, um valor-p pequeno (aqui, p < 0,05) significa que a probabilidade
de obter um valor da estatística de teste como o observado é muito improvável,
levando assim à rejeição da hipótese nula (RUMSEY, 2014).
Para verificar possíveis relações entre rendimento da extração, composição
química e atividade anticoagulante e os parâmetros ambientais ao longo do período
de estudo foi realizado análise de coeficiente de correlação de Pearson (r). Usou-se o
software Dell Statistica 13 (Dell Inc. 2015). Segundo Rumsey (2014), o coeficiente de
Pearson mede o grau da correlação (e a direção dessa correlação - se positiva ou
negativa) entre duas variáveis de escala métrica (razão). Assim este coeficiente
assume apenas valores entre -1 e 1. Desse modo, quanto mais próximo de 1 mais as
variáveis são dependentes e têm forte relação linear; quanto mais próximo de zero
Materiais e Métodos 58
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significa que as variáveis são independentes e não tem relação linear; já quando a
variável é próxima de -1 significa que as variáveis são inversamente dependentes, ou
seja, quando uma das variáveis aumenta a outra diminui.
Resultados 59
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
4 RESULTADOS
Os resultados desta tese foram divididos em três partes para que haja um
melhor entendimento do andamento dos experimentos realizados durante a execução
do projeto de doutorado. A primeira parte contempla os resultados da análise das
possíveis mudanças na composição química/atividade anticoagulante dos PS da C.
cupressoides coletada mensalmente durante um ano, bem como a correlação da
composição química/atividade anticoagulante com parâmetros ambientais do local de
coleta; na segunda parte mostra-se as várias etapas de purificação de dois
polissacarídeos bioativos de C. cupressoides; já na terceira parte contempla-se os
resultados obtidos quando se verificou as possíveis mudanças na composição
química/atividade anticoagulante dos ERPS de acordo com o período de coleta de
outras algas verdes (C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum).
4.1 Parte I: Análise das possíveis mudanças na composição química/atividade
anticoagulante de ERPS da alga C. cupressoides de acordo com o período
de coleta
4.1.1 Rendimento da extração dos ERPS da alga C. cupressoides
O rendimento da extração dos ERPS (mg de extrato/g de alga seca) da alga C.
cupressoides coletada na Praia de Búzios/RN, no período de um ano está sumarizado
na Figura 8.
Observa-se que houve uma variação no rendimento da extração dos ERPS
obtidos da C. cupressoides de acordo com o mês de coleta, sendo o maior rendimento
observado no mês de novembro (42,80 mg de extrato/g da alga seca) e o menor no
mês de março (16,21 mg de extrato/g da alga seca). Além disso, a média anual do
rendimento foi de 26,48 ± 6,90 mg de extrato/g da alga seca.
Resultados 60
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Figura 8 - Rendimento da extração dos ERPS da alga C. cupressoides de acordo com o mês de coleta. Resultados são expressos em mg de extrato/g da alga seca.
4.1.2 Perfil eletroforético dos ERPS da alga C. cupressoides
A mobilidade eletroforética dos PS de ERPS em gel de agarose da C.
cupressoides, usando tampão PDA 0,05 M pH 9,0 é mostrada na Figura 9A.
Não houve diferenças no padrão de mobilidade das populações de PS da C.
cupressoides de acordo com o mês de coleta, já que os mesmos apresentaram padrão
de mobilidade de bandas semelhantes, no entanto, houve diferença na intensidade de
coloração destas bandas. Para comprovar, estas diferenças foram realizadas
densitometria das bandas características do PS (Figura 9B) e verificou-se diferenças
nos valores de densitometria das bandas eletroréticas dos PS de acordo com o mês
de coleta.
0
10
20
30
40
50
Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez
Rendim
ento
(mg d
e e
xtr
ato
/ g d
e a
lga s
eca)
Resultados 61
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
JAN FEV MAR ABR MAI JUN JUL AGO SET OUT NOV DEZ
Figura 9 - Comportamento eletroforético dos PS da alga C. cupressoides. Alíquotas de 5 µL (50 µg) dos extratos foram aplicados em lâminas de agarose em tampão PDA 0,05 M pH 9,0. Após precipitação com CETAVLON as lâminas foram corado com azul de toluidina (A). Densitometria das bandas eletroréticas dos PS de acordo com o mês de coleta (B). Or – origem, - Polo negativo, + Polo positivo.
4.1.3 Composição química dos ERPS da alga C. cupressoides
Os resultados das quantificações de açúcares totais e sulfato dos ERPS obtidos
da alga C. cupressoides são mostrados na Figura 10. Houve uma variação no
conteúdo de açúcares totais e sulfato dos ERPS durante o período de estudo. Para
se verificar se esta variação seria significativa realizou-se o teste estatístico de análise
de variância (ANOVA) e observou-se que esta variação anual era estatisticamente
significante.
Os ERPS da alga C. cupressoides apresentaram maior quantidade de açúcares
totais no mês de julho (77,00%) e a menor quantidade em novembro (40,05%) (F =
82,52, p < 0,001). Já a quantidade de sulfato foi maior no mês de junho (39,03%) e
menor em setembro (20,20%) (F = 39,17, p < 0,001). Apesar da tendência de se ter
mais carboidratos e sulfato em meses semelhantes ou próximos não foi observada
correlação significativa entre a quantidade de açúcares totais e a quantidade se sulfato
dos PS da C. cupressoides (Tabela 5).
+
_
Or -_
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Valo
r da d
ensitom
etr
ia
A B
Resultados 62
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Figura 10 - Quantidade de açúcares totais e sulfato dos ERPS da alga C. cupressoides de acordo com mês de coleta. Os dados são expressos
como média ± desvio padrão (n=3). ( ) açúcares totais (%), ( ) sulfato (%).
.
4.1.4 Atividade anticoagulante dos ERPS da alga C. cupressoides
A atividade anticoagulante dos ERPS da alga C. cupressoides foi avaliada pelo
ensaio de aPTT e foi expressa em razão de aPTT. Os ERPS obtidos em todos os
meses de coleta apresentaram capacidade de prolongar o tempo de coagulação do
plasma. Observa-se uma variação significativa na capacidade dos ERPS em
prolongar o tempo de coagulação (F = 80,99, p < 0,01), sendo a menor razão de aPTT
obtida de 3,00 (setembro) e a maior de 7,00 (março) (Figura 11).
Além disso, observou-se que o clexane®, composto usado como controle
positivo nesse teste, promoveu uma alteração no tempo de coagulação do plasma que
forneceu uma razão de aPTT igual a 6 (dados não mostrados). Portanto, vale salientar
que dois ERPS, os que são referentes aos meses de março (razão de aPTT igual 7)
e agosto (razão de aPTT igual 6), apresentaram valores de razão de aPTT maior e
igual do que o clexane®, respectivamente.
Vale salientar que não se observou correlações significativas (p < 0,05) entre a
atividade anticoagulante e a quantidade de açúcar ou sulfato dos ERPS da C.
cupressoides (Tabela 5).
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out NovDez
Sulfato
(%
)
Açúcare
s tota
is (
%)
Resultados 63
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Figura 11 - Atividade anticoagulante pelo ensaio de aPTT dos ERPS da alga C. cupressoides de acordo com o mês de coleta. Os dados são expressos como média ± desvio padrão (n=3). A atividade anticoagulante foi expressa como razão de aPTT, obtida pela divisão do tempo de coagulação obtido com os ERPS (5 µg) pelo tempo de coagulação do controle (29 ± 0,4 s).
4.1.5 Parâmetros ambientais do local de coleta
Simultaneamente, durante o período de coleta das algas foram analisados 19
parâmetros ambientais do local de coleta (Apêndice). Os dados referentes à média e
variação anual destes parâmetros ambientais estão sumarizados na Tabela 4.
Tabela 4 - Média e variação anual dos fatores ambientais da Praia de Búzios/RN durante o período de estudo (média ± desvio padrão e variação, n=12).
Parâmetros abióticos Média ± desvio padrão Variação anual
Salinidade (‰) 37,7 ± 1,12 (35,0 - 39,5)
Temperatura da água (ºC) 30,0 ± 3,22 (26,0 - 36,0)
Turbidez (UT) 0,80 ± 0,78 (0,0 - 2,2)
pH 8,2 ± 0,53 (6,7 - 8,5)
Nitrogênio amoniacal (mg/L) 0,1 ± 0,08 (0,0-0,3)
Potássio (mg/L) 461,9 ± 86,14 (375,0 - 666,6)
Sulfato (mg/L) 2763,3 ± 513,43 (1822,0 - 3389,4)
Condutividade elétrica (µS/cm) 49680,2 ± 4649,00 (44132,0 - 58300,0)
Sólidos totais (mg/L) 39257,1 ± 728,60 (37592,0 - 40444,0)
Sólidos dissolvidos totais (mg/L) 39257,1 ± 728,60 (37592,0 - 40444,0)
0
2
4
6
8
10
Jan Fev Mar Abr Mai Jun Jul Ago Set Out Nov Dez
Razão d
e a
PT
T
Resultados 64
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Alcalinidade de carbonato (mg/L) 10,9 ± 12,69 (0 - 31,1)
Alcalinidade de bicarbonato (mg/L) 111,9 ± 15,37 (85,3 - 131,9)
Sódio (mg/L) 10862,0 ± 810,80 (9714,4 – 12500,0)
Ferro (mg/L) 1,0 ± 0,22 (0,7 - 1,5)
Carbonato (mg/L) 6,6 ± 7,61 (0,0 - 18,7)
Bicarbonato (mg/L) 136,5 ± 18,77 (104,0 - 160,9)
Cloreto (mg/L) 20656 ± 1384,90 (18585,6 - 22988,4)
Precipitação pluviométrica (mm) 98,8 ± 77,30 (4,2 -262,6)
Insolação (h) 251,1 ± 43,86 (167,2 - 316,7)
4.1.6 Correlações entre o rendimento, composição química e atividade
anticoagulante dos ERPS da C. cupressoides e os parâmetros ambientais do local de
coleta
Ao se fazer estudos de correlações entre o rendimento, composição química e
atividade anticoagulante dos ERPS da C. cupressoides com os 19 parâmetros
ambientais analisados do local de coleta mensalmente (Tabela 5), evidenciou-se que
existe uma correlação positiva significativa (p < 0,05) entre o rendimento da extração
dos ERPS e a salinidade da água do mar (r = 0,59) e a insolação (r = 0,75) (Figura
12).
Para a quantidade de sulfato e açúcar só foram observadas correlações
significativas negativas com os parâmetros ambientais. Para a quantidade de sulfato
dos ERPS observou-se uma correlação negativa significativa (p < 0,05) com a
salinidade da água do mar (r = -0,58) (Figura 13).
Já a quantidade de açúcar dos ERPS desta alga teve uma correlação negativa
significativa (p < 0,05) com: sólidos totais (r = -0,87), sódio (r = -0,64), cloreto (r = -
0,70) e insolação (r = -0,80) (Figura 14).
Além disso, não foi observada correlações significativas entre a atividade
anticoagulante dos ERPS e os parâmetros ambientais (tabela 5).
Resultados 65
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Figura 12 - Comparação da variação anual do rendimento da extração dos ERPS da C. cupressoides com parâmetros ambientais do local de coleta (insolação e salinidade). r – coeficiente de correlação de Pearson (p < 0,05).
Figura 13 - Comparação da variação anual da quantidade de sulfato dos ERPS da C. cupressoides com a salinidade da água do mar. r – coeficiente de correlação de Pearson (p < 0,05).
Resultados 66
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Figura 14 - Comparação da variação anual da quantidade de açúcares totais dos ERPS da C. cupressoides com parâmetros ambientais do local de coleta (sólidos totais, cloreto, sódio e insolação). r – coeficiente de correlação de Pearson (p < 0,05).
Resultados 67
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Tabela 5 - Coeficiente de correlação (n=12) entre o rendimento, composição química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. cupressoides e os parâmetros ambientais do local de coleta.
Em vermelho valores para p < 0,05.
Sa
lin
ida
de
Te
mp
era
tura
Tu
rbid
ez
pH
Nitro
gê
nio
Po
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Su
lfa
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Alc
alin
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Alc
alin
ida
de
de
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arb
on
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Só
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Ca
rbo
na
to
Bic
arb
on
ato
Clo
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Su
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RP
S
Açú
ca
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os E
RP
S
Ativid
ad
e
an
tico
ag
ula
nte
do
s E
RP
S
Temperatura -0,30
Turbidez 0,01 -0,40
pH -0,14 0,34 -0,21
Nitrogênio 0,16 0,15 0,20 -0,27
Potássio -0,72 0,02 -0,07 0,29 -0,51
Sulfato -0,37 0,19 0,15 0,27 -0,71 0,33
Condutividade 0,26 0,62 -0,58 0,42 -0,03 -0,09 -0,07
Sólidos totais 0,33 0,07 -0,68 0,22 -0,55 0,05 0,11 0,63
Sólidos dissolvidos 0,33 0,07 -0,68 0,22 -0,55 0,05 0,11 0,63 1,00
Alcalinidade de carbonato 0,04 -0,11 -0,29 0,53 -0,39 0,18 0,18 -0,06 0,18 0,18
Alcalinidade de bicarbonato -0,32 0,33 0,04 -0,49 0,28 0,12 -0,12 0,01 -0,17 -0,17 -0,82
Sódio 0,55 0,02 -0,55 0,34 -0,20 -0,23 -0,06 0,64 0,70 0,70 0,33 -0,50
Ferro 0,41 -0,25 0,49 0,18 -0,22 -0,35 0,25 -0,08 -0,03 -0,03 0,00 -0,35 -0,03
Carbonato 0,04 -0,11 -0,29 0,53 -0,39 0,18 0,18 -0,06 0,18 0,18 1,00 -0,82 0,33 0,00
Bicarbonato -0,32 0,33 0,04 -0,49 0,28 0,12 -0,12 0,01 -0,17 -0,17 -0,82 1,00 -0,50 -0,35 -0,82
Cloreto 0,59 -0,02 -0,57 0,07 -0,33 -0,17 -0,08 0,60 0,81 0,81 0,14 -0,24 0,87 0,02 0,14 -0,24
Precipitação -0,33 0,33 -0,06 0,04 0,39 -0,26 0,06 -0,10 -0,19 -0,19 -0,09 0,05 -0,14 -0,16 -0,09 0,05 -0,35
Insolação 0,57 -0,50 -0,17 -0,06 -0,31 -0,20 -0,07 0,26 0,61 0,61 -0,01 -0,36 0,75 0,21 -0,01 -0,36 0,76 -0,28
Sulfato dos ERPS -0,58 0,52 -0,40 0,38 0,00 0,14 0,12 0,11 -0,14 -0,14 0,13 0,04 -0,20 -0,15 0,13 0,04 -0,35 0,36 -0,46
Açúcar dos ERPS -0,44 0,29 0,47 0,00 0,49 0,16 -0,04 -0,35 -0,87 -0,87 -0,08 0,26 -0,64 -0,13 -0,08 0,26 -0,70 0,13 -0,80 0,20
Atividade anticoagulante dos ERPS 0,12 0,10 -0,12 0,29 -0,23 -0,06 0,23 0,06 0,17 0,17 0,56 -0,36 0,01 0,01 0,56 -0,36 -0,15 -0,06 -0,26 0,09 -0,11
Rendimento da extração 0,59 -0,49 0,03 -0,07 0,01 -0,25 -0,38 0,27 0,45 0,45 -0,10 -0,32 0,48 0,26 -0,10 -0,32 0,44 -0,17 0,75 -0,52 -0,65 -0,07
Resultados 68
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4.2 Parte II: Purificação, caracterização e atividade anticoagulante de PS
purificados da alga C. cupressoides
Como foi observado que os ERPS obtidos da C. cupressoides coletada no mês
de março foram os extratos mais potentes em relação a atividade anticoagulante,
então, resolveu-se purificar os PS desta alga coletada neste mês, como descrito
abaixo.
4.2.1 Obtenção das frações polissacarídicas da alga C. cupressoides
Após o fracionamento com volumes crescentes de acetona obteve-se quatro
frações polissacarídicas da alga C. cupressoides, denominadas de CCB-0.3, CCB-
0.5, CCB-1.0 e CCB-2.0, de acordo com o volume de acetona acrescentado. Da
massa total obtida após a precipitação de todas as frações calculou-se o rendimento
do fracionamento.
Pôde-se observar que a quantidade de material obtido após cada passo de
fracionamento não foi semelhante. Observa-se que a menor quantidade de material
foi obtida com o acréscimo de 0,3 e 2,0 volumes de acetona, que correspondem as
frações a CCB-0.3 e a CCB-2.0, primeira e última fração, respectivamente.
Já a maior quantidade de material precipitado foi aquela que se obteve com o
acréscimo 1,0 volume de acetona, seguido pelo acréscimo de 0,5 volumes, que
correspondem as frações CCB-1.0 e CCB-0.5, respectivamente, no entanto, a
diferença entre a quantidade de material obtida entre estas frações não foi
estatisticamente significativa (p > 0,05) (Figura 15).
Resultados 69
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Figura 15 - Rendimento percentual do fracionamento com acetona: Após precipitação com acetona PA as frações foram centrifugadas (8.000 x g, 15 min., 4 ºC), secas sob pressão reduzida e pesadas. Da massa total obtida após a precipitação de todas as frações calculou-se o rendimento do fracionamento (n = 4). A,B Letras distintas indicam diferenças significativas entre as frações (p < 0,001).
4.2.2 Atividade anticoagulante das frações polissacarídicas da alga C. cupressoides
A atividade anticoagulante das frações polissacarídicas da C. cupressoides no
teste de aPTT, o qual avalia a via intrínseca da coagulação, está sumarizada na
Tabela 6. Observa-se que as frações CCB-0.3, CCB-0.5 e CCB-1.0 apresentaram
atividade anticoagulante de maneira dose-dependente. No entanto, em todas as
concentrações testadas (3,0 a 33,0 µg/mL) a fração CCB-0.5 foi a mais potente. Já
com o uso da fração CCB-2.0 não se observou a prolongação do tempo de
coagulação.
0
10
20
30
40
CCB-0.3 CCB-0.5 CCB-1.0 CCB-2.0
Rendim
ento
(%
)
Frações
A
B
A
B
Resultados 70
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Tabela 6 - Atividade anticoagulante das frações polissacarídicas da C. cupressoidesa
aPTT (s)b
Concentração (µg/mL)
3,0 8,0 16,5 33,0
CCB-0.3 38,2 ± 1,0AW 60,9 ± 1,1BV 103,1 ± 0,1CV Nd
CCB-0.5 50,5 ± 0,6AY 72,05 ± 1,8BW 120,0 ± 16,5CV > 240DX
CCB-1.0 31,0 ± 0,6AW 42,6 ± 0,2BY 79,5 ± 2,1CW 173,4 ± 3,5Dw
CCB-2.0 31,1 ± 0,2AW 32,6 ± 0,6AZ 32,0 ± 0,2AZ 32,4 ± 0,5AV
Clexane®c 74,7 ± 3,4BX 144,5 ± 2,1CX > 240DX > 240DX
a Os dados são expressos como a média ± desvio padrão (n=3). b aPTT: tempo de tromboplastina parcial ativada. Tempo de coagulação do controle 29,2 ± 0,7 s. c Clexane®: heparina de baixo peso molecular. Letras distintas (A-D) indicam diferença significativa entre as diferentes concentrações do mesmo PS (p < 0,001). Letras distintas (V-Z) indicam diferença significativa entre os PS na mesma concentração (p < 0,01). nd – não determinado.
4.2.3 Purificação da fração CCB-0.5 da alga C. cupressoides
Levando em consideração que a fração CCB-0.5 foi uma das frações em que
se obteve maior quantidade de material precipitado com acetona; e também que foi a
fração que apresentou maior atividade anticoagulante, escolheu-se a mesma para se
purificar PS com atividade anticoagulante. Assim, a fração CCB-0.5 foi submetida a
cromatografia de troca iônica. Na Figura 16 observa-se o perfil de eluição da
cromatografia da fração CCB-0.5. Após análise de açúcares totais e de metacromasia,
observou-se a presença de um pico único no eluato, porém com uma base larga, fato
este que permitiu divisão deste pico em dois, um eluído na faixa de 0,48 - 0,65 M de
NaCl (tubos de 22 a 35) e o outro eluído na faixa 0,73 - 0,78 M de NaCl (tubos de 41
a 45), estes foram denominados de PS FI e FII, respectivamente.
Após a liofilização da solução correspondente à FI e FII, o material resultante
foi pesado e verificou-se que eles corresponderam a 11,9 ± 3,6 % e 4,2 ± 1,3% da
quantidade de fração CCB-0.5 administrada à coluna, respectivamente.
Resultados 71
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Figura 16 - Perfil de eluição da fração CCB-0.5 em cromatografia de troca aniônica em sistema
FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) em equipamento AKTA. ( ) sulfato (525
nm). ( ) açúcar (490 nm). (-----) concentração de NaCl (M).
4.2.4 Eletroforese em gel de agarose dos PS FI e FII da alga C. cupressoides
Para se verificar se os PS FI e FII estavam purificados foi realizado uma
eletroforese em gel de agarose PDA 0,05 M pH 9,0. Após coloração da lâmina com
azul de toluidina e descoloração, observou-se o aparecimento de uma única banda
em ambas as amostras, o que indica a presença de uma única população de PS, o
que leva a inferir que estes PS foram purificados. O perfil eletroforético dos PS
purificados (FI e FII) é mostrado na Figura 17.
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
1 713
19
25
31
37
43
49
55
61
67
73
79
85
91
97
103
109
115
121
127
133
139
145
151
157
163
169
175
181
187
193
199
205
Concentr
ação d
e N
aC
l (M
)
AB
S 4
90 n
m
A
BS
525 n
m
Tubos
FI FII
Resultados 72
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Figura 17 - Comportamento eletroforético dos PS da alga C. cupressoides. Alíquotas de 5 µL do ERPS, da fração CCB-0.5 (50 µg) e dos PS FI e FII (25 µg) foram aplicados em lâmina de agarose em tampão PDA 0,05 M pH 9,0. Após precipitação com CETAVLON lâmina foi corado com azul de toluidina. Or – origem, - Polo negativo, + Polo positivo.
4.2.5 Composição química do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS purificados FI e
FII da alga C. cupressoides
Os resultados das análises químicas do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS
purificados FI e FII são mostrados na Tabela 7.
Verifica-se que os PS FI e FII são constituídos por diferentes percentuais de
açúcar, 58,9% e 50,7%, respectivamente. Percentuais estes, significativamente, mais
elevados que o do ERPS e da fração CCB-0.5. Observa-se, para o percentual de
sulfato fato semelhante, FI e FII apresentaram quantidade de sulfato de 33,4% e
36,4%, respectivamente, valores estes mais elevados que os observados para o
ERPS e para a fração CCB-0.5. A relação sulfato/açúcar variou de 0,20 a 0,72, sendo
a relação sulfato/açúcar do ERPS < CCB-0.5 < FI < FII.
ERPS CCB-0.5 FI FII
Or
+
_
Resultados 73
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Além disso, foi observada a ausência de contaminação por proteínas no ERPS
e nos PS FI e FII, já a fração CCB-0.5 encontrou-se uma baixa contaminação por
proteínas.
Tabela 7 - Composição químicaa do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS FI e FII da alga C. cupressoides.
Polissacarídeo Açúcares
totais (%)
Sulfato
(%)
Relação
sulfato/açúcar
(%)
Proteínas (%)
ERPS 40,1 ± 0,7 8,2 ± 0,1 0,20 nt
CCB-0.5 25,4 ± 0,4 13,9 ± 0,6 0,55 0,05
FI 58,9 ± 1,5 33,4 ± 0,8 0,57 nt
FII 50,7 ± 1,0 36,4 ± 1,0 0,72 nt
a O total de açúcares e sulfato dos polissacarídeos foi determinado pelos métodos de fenol/H2SO4 e gelatina/BaCl2, respectivamente. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3). nt – não detectado.
Com relação a análise da composição monossacarídica observa-se que o
ERPS e a fração CCB-0.5 são constituídos por galactose, glicose, manose e xilose.
Já os PS FI e FII são constituídos, predominantemente, por galactose e glicose. Além
disso, foram encontrados traços de manose e xilose no PS FII, já no FI estes
monossacarídeos não foram detectados (Tabela 8).
Tabela 8 - Relação molar dos monossacarídeos do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS FI e FII da alga C. cupressoides.
Polissacarídeo Composição monossacarídica (razão molar)a
Gal Glc Man Xil
ERPS 1,0 0,5 0,3 0,3
CCB-0.5 1,0 0,6 0,6 0,7
FI 1,0 0,6 nt nt
FII 1,0 0,5 tr tr
aA composição monossacarídica foi estimada por CLAE. Gal – Galactose, Glc – Glicose, Man – Manose, Xil – Xilose, nt – não detectado, tr – traços.
Resultados 74
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
4.2.6 Atividade anticoagulante do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS purificados FI
e FII da alga C. cupressoides
A atividade anticoagulante do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS purificados
FI e FII da alga C. cupressoides está sumarizada nas Tabelas 9 a 11.
No teste de aPTT, o qual avalia a via intrínseca da coagulação, todas as
amostras apresentaram atividade anticoagulante de maneira dose-dependente (1,5 a
33 µg/mL) (Tabela 9). Quando se compara a atividade destas amostras entre si
observa-se que FII foi a mais potente, seguida pela FI. Estas subfrações apresentaram
atividade anticoagulante similar (na concentração de 3 µg/mL) e maior (na
concentração de 8 µg/mL) que o Clexane®, uma heparina de baixo peso molecular
comercial (p < 0,01).
Além disso, observa-se uma correlação positiva ente a atividade anticoagulante
das amostras (8 µg/mL) e a quantidade de sulfato das mesmas (r = 0,96), bem como
a razão sulfato/açúcar (r = 0,75).
Tabela 9 - Atividade anticoagulante no teste de aPPT do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS purificados FI e FII da C. cupressoidesa
Polissacarídeo
aPTT (s)b
Concentração (µg/mL)
1,5 3,0 8,0 16,5 33,0
ERPS nd 47,4 ± 4,5Aw 75,4 ± 0,8AW 117,1 ± 22,6BW 211,8 ± 12,7CW
CCB-0.5 nd 50,5 ± 0,6Aw 72,05 ± 1,8BW 120,0 ± 16,5CW > 240DX
FI 40,2 ± 1,1Aw 70,3 ± 3,3Bx 176,7 ± 4,3CY > 240DX > 240DX
FII 39,7 ± 5,1Aw 75,1 ± 4,4Bx 232,7 ± 2,4CZ > 240CX > 240CX
Clexane®c 53,9 ± 1,5Ax 74,7 ± 3,4Bx 144,5 ± 2,1CX > 240DX > 240DX
a Os dados são expressos como a média ± desvio padrão (n=3). b aPTT: tempo de tromboplastina parcial ativada. Tempo de coagulação do controle 29 ± 0,5s. c Clexane®: heparina de baixo peso molecular. Letras distintas (A-D) indicam diferença significativa entre as diferentes concentrações do mesmo PS (p < 0,001). Letras distintas (W-Z) indicam diferença significativa entre os PS na mesma concentração (p < 0,01). nd – não determinado.
No teste de PT, o qual avalia a via extrínseca da coagulação, todas as amostras
apresentaram atividade anticoagulante de maneira dose-dependente (Tabela 10). No
entanto, foi necessário o uso de concentrações maiores (67 a 333 µg/mL) das mostras
Resultados 75
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
do que as utilizadas no teste de aPTT (1,5 a 33 µg/mL), para que as amostras
apresentassem atividade anticoagulante significativa.
Da mesma maneira que observado no teste aPTT, quando se compara a
atividade destas amostras entre si, observa-se que FII foi a mais potente.
Além disso, observa-se uma correlação positiva entre a atividade
anticoagulante das amostras (333 µg/mL) e a quantidade de sulfato das mesmas (r =
0,44), bem como a razão sulfato/açúcar (r = 0,61).
Tabela 10 - Atividade anticoagulante no teste de PT do ERPS, da fração CCB-0.5 e dos PS purificados FI e FII da C. cupressoidesa
Polissacarídeo
PT (s)b
Concentração (µg/mL)
67,0 133,0 267,0 333,0
ERPS nd 25,6 ± 0,4AW 33,8 ± 2,3BW 44,6 ± 1,0CW
CCB-0.5 18,7 ± 0,0AW 24,7 ± 0,6BW 32,0 ± 1,8BW 54,2 ± 3,7CX
FI 24,9 ± 1,4AX 41,2 + 0,4BX 35,3 ± 1,0CW 36,5 ± 0,6CY
FII 32,6 ± 1,3AY 40,0 ± 1,0BX 77,3 ± 0,4CX 90,6 ± 5,9CZ
Heparinac > 120 > 120 > 120 > 120
a Os dados são expressos como a média ± desvio padrão. b PT: tempo de protrombina. Tempo de coagulação do controle 14,9 ± 0,5 s. c Heparina: heparina não fracionada. Letras distintas (A-D) indicam diferença significativa entre as diferentes concentrações do mesmo PS (p < 0,05). Letras distintas (W-Z) indicam diferença significativa entre os PS na mesma concentração (p < 0,05). nd – não determinado.
Já no teste de TT, o qual avalia a via comum da coagulação, todas as amostras
também apresentaram atividade anticoagulante de maneira dose-dependente nas
concentrações de 3 a 16,5 µg/mL, concentrações semelhantes as utilizadas no teste
de aPTT. Vale salientar, que em concentrações maiores que 33 µg/mL, neste teste,
os PS precipitam provocando turvação da solução, o que interfere nos resultados do
teste, por isso, testou-se apenas até 33 µg/mL (Tabela 11).
Não houve diferença significativa entre as atividades anticoagulantes das
observada com o uso dos PS FI e FII, no entanto, estas duas foram superiores àquela
verificada na presença de CCB-0.5.
Resultados 76
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Além disso, observa-se uma correlação positiva entre a atividade
anticoagulante das amostras (33 µg/mL) e a quantidade de sulfato das mesmas (r =
1,0), bem como a razão sulfato/açúcar (r = 0,73).
Tabela 11 - Atividade anticoagulante no teste de TT da fração CCB-0.5 e dos PS purificados FI e FII da C. cupressoidesa
Polissacarídeo
TT (s)b
Concentração (µg/mL)
3,0 6,5 16,5 33,0
ERPS nd nd nd nd
CCB-0.5 nd 16,2 ± 0,4AW 29,2 ± 0,4BW 32,2 ± 1,5CW
FI 16,2 ± 0,6AX 24,4 ± 1,5BX 35,9 ± 2,2CX 36,5 ± 0,1CX
FII 16,4 ± 1,9AX 24,9 ± 0,8BX 37,4 ± 1,3CX 37,6 ± 2,3CX
a Os dados são expressos como a média ± desvio padrão (n=3). b TT: tempo de trombina. Tempo de coagulação do controle 13,1 ± 0,2 s. Letras distintas (A-C) indicam diferença significativa entre as diferentes concentrações do mesmo polissacarídeo sulfatado (p < 0,001). Letras distintas (W-Z) indicam diferença significativa entre os polissacarídeos sulfatados na mesma concentração (p < 0,05). nd – não determinado.
Para se esclarecer se o mecanismo de ação anticoagulante dos PS FI e FII
estava relacionado com a inibição da protease trombina, foi realizado ensaio de
inibição da trombina, na presença e ausência das serpinas AT e HCII, usando
substrato cromogênico. Utilizou-se as amostras até a concentração de 10 µg/mL, pois,
mais uma vez, em concentrações maiores os PS precipitavam interferindo nos
resultados do teste.
Os PS FI e FII, até a concentração testada, não foram capazes de inibir a
atividade da trombina na presença de AT (dados não mostrados). Já na presença do
HCII detectou-se que os PS purificados tiveram a capacidade de inibir da trombina
nas concentrações intermediárias testadas (Figura 18). Para os dois PS purificados,
a maior inibição da trombina mediada pelo HCII se deu na concentração de 1 µg/mL,
que foi de 35,1% e 37,8% para FI e FII, respectivamente.
Resultados 77
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Figura 18 - Efeito dos PS FI e FII da C. cupressoides na inativação da trombina na presença do HCII. Os dados são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).
Para se verificar se os PS tinham a capacidade de inibir diretamente a trombina,
realizou-se o teste de inibição desta protease na ausência das serpinas, na
concentração de 0,1 a 10 µg/mL. Começou-se o teste com a concentração de 0,1
µg/mL, tendo em vista que no experiento anterior os PS não tiveream atividade em
concentrações inferiores a esta. Observou-se uma inibição da trombina de 26,3% e
30,3% quando se utilizou os PS FI e FII na concentração intermediária (1 µg/mL),
respectivamente, efeito este que não foi observado quando se aumentou a
concentração dos compostos (Figura 19).
Figura 19 - Efeito dos PS FI e FII da C. cupressoides na inativação da trombina na ausência do HCII e da AT. Os dados são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).
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0,001 0,01 0,1 1 10
Ativid
ade d
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rom
bin
a (
%)
Concentração (µg/mL)
FIFIIHeparina
0
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100
120
0,1 1 10
Ativid
ade d
a t
rom
bin
a (
%)
Concentração (µg/mL)
FI
FII
Resultados 78
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
4.3 Parte III: Análise das possíveis mudanças na composição
química/atividade anticoagulante de ERPS de outras algas verdes de acordo
com o período de coleta
Como observou-se uma variação anual significativa no rendimento,
composição química e atividade anticoagulante de ERPS da alga verde C.
cupressoides, resolveu-se investigar as possíveis mudanças na composição e
atividade anticoagulante de ERPS de outras algas verdes (Caulerpa prolifera,
Caulerpa racemosa, Caulerpa sertularioides e Codium isthmocladum).
4.3.1 Rendimento anual e análises químicas dos ERPS das algas verdes
O rendimento da extração dos ERPS (mg de extrato/g de alga seca) das algas
verdes C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum coletadas
durante o período de um ano, na Praia de Búzios/RN está sumarizado na Figura 20.
Em setembro e outubro não se encontrou no local de coleta biomassa suficiente
da alga C. isthmocladum e no mês de dezembro biomassa da C. racemosa para que
fosse possível realizar a extração de ERPS, pois isso, os dados de rendimento dos
referidos meses sobre estas algas não aparecem nos resultados de rendimento, bem
como nos demais testes.
Figura 20 - Rendimento da extração dos ERPS de acordo com o mês de coleta. Resultados são expressos em mg de extrato/g da alga seca.
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Ja
n
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Mar
Abr
Mai
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Ju
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Ago
Set
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Ja
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Mar
Abr
Mai
Ju
n
Ju
l
Ago
Set
Ou
t
No
v
De
z
Ja
n
Fev
Mar
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Mai
Ju
n
Ju
l
Ago
No
v
De
z
C. prolifera C. racemosa C. sertularioides C. isthmocladum
Ren
dim
en
to(m
g d
e e
xtr
ato
/g d
e a
lga
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)
C. prolifera C. racemosa C. sertularioides C. isthmocladum
Resultados 79
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Comparando-se a média anual dos rendimentos dos ERPS das algas verdes
analisadas, observa-se que os maiores rendimentos da extração dos ERPS foram os
obtidos da C. isthmocladum, com média anual de 36,24 ± 17,82 mg de extrato/g da
alga seca, com maior rendimento no mês de dezembro (74,67 mg de extrato/g da alga
seca) e menor em março (17,68 mg de extrato/g da alga seca).
Já o rendimento da extração C. sertularioides teve média de 26,71 ± 10,16 mg
de extrato/g da alga seca. O mês no qual obteve-se um maior rendimento para C.
sertularioides foi o mês de fevereiro (41,19 mg de extrato/g da alga seca) e o menor
rendimento foi observado no mês de abril fevereiro (10,52 mg de extrato /g da alga
seca).
Os mais baixos rendimentos foram observados para os extratos provenientes
das algas C. racemosa e C. prolifera, que foram de 16,50 ± 5,77 e 16,02 ± 3,15 mg de
extrato/g da alga seca, respectivamente. O mês no qual obteve-se um maior
rendimento para C. racemosa foi o mês de outubro (29,27 mg de extrato/g da alga
seca) e o menor rendimento foi observado no mês de abril (10,64 mg de extrato/g da
alga seca). Já para C. prolifera o maior rendimento foi observado em agosto (20,05
mg de extrato/g da alga seca) e o menor em abril (11,06 mg de extrato/g da alga seca).
4.3.2 Perfil eletroforético dos ERPS das algas verdes
A mobilidade eletroforética dos PS das algas verdes C. prolifera, C. racemosa,
C. sertularioides e C. isthmocladum em gel de agarose, usando tampão PDA 0,05 M
pH 9,0 é mostrada na Figura 21. De acordo com as lâminas, observa-se que cada
alga sintetiza populações distintas de PS, o que é visto no padrão de mobilidade das
bandas coradas com o azul de toluidina.
De acordo com a técnica de eletroforese utilizada foi possível observar o
aparecimento duas bandas distintas coradas com o azul de toluidina nas lâminas dos
ERPS das algas C. prolifera, C. racemosa e C. isthmocladum, ou seja, uma população
de PS com baixa mobilidade e outra com alta mobilidade, indicando que estas algas
sintetizam duas populações de PS.
Já os PS da C. sertularioides são mais polidispersos que os extraídos das
demais algas, ou seja, não estão concentrados em um só ponto, ao contrário, se
Resultados 80
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
estendem desde a origem até quase o fim da lâmina (exceto os PS obtidos em
fevereiro).
Não houve diferenças no padrão de mobilidade das populações de
polissacarídeos de cada alga de acordo com o mês de coleta, já que os PS
apresentaram padrão de mobilidade de bandas semelhantes (exceto para C.
sertularioides), no entanto, houve diferença na intensidade de metacromasia destas
bandas para os PS extraídos de todas as algas.
Figura 21 - Comportamento eletroforético dos PS das algas C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides e C. isthmocladum. Alíquotas de 5 µL (50 µg) dos extratos foram aplicados em lâmiana de agarose em tampão PDA 0,05 M pH 9,0. Após precipitação com CETAVLON as lâminas foram coradas com azul de toluidina. Or – origem, - Polo negativo, + Polo positivo.
A - C. cupressoides;
4.3.3 Composição química dos ERPS das algas verdes
Os resultados das quantificações de açúcares totais e sulfato dos ERPS obtidos
das algas verdes são mostrados na Figura 22. Houve uma variação no conteúdo de
açúcares totais (Figura 22A) e sulfato (Figura 22B) dos ERPS obtidos de todas as
algas analisadas durante o período de estudo. Para se verificar se esta variação seria
JAN FEV MAR ABR MAI JUN JUL AGO SET OUT NOV DEZ
JAN FEV MAR ABR MAI JUN JUL AGO SET OUT NOV
+
_
+
_
+
_
+
_
Banda 2 _
Banda 1 _
Or _
Banda 2 _
Banda 1 _
Or _
Banda 2 _
Banda 1 _
Or _
Or _
JAN FEV MAR ABR MAI JUN JUL AGO SET OUT NOV DEZ
JAN FEV MAR ABR MAI JUN JUL AGO NOV DEZ
C. prolifera
C. racemosa C. sertularioides
C. isthmocladum
Resultados 81
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
significativa realizou-se o teste estatístico de análise de variância (ANOVA) e
observou-se que esta variação era estatisticamente significante (Tabela 12).
Não houve coincidência em relação aos meses em que os ERPS de cada alga
apresentou maior ou menor quantidade de açúcares totais e/ou sulfato.
Os ERPS da C. prolifera apresentaram maior quantidade de açúcares totais em
agosto (69,62%) e a menor em março (49,61%) (F = 39,45, p < 0,001). Para C.
racemosa a quantidade de açúcar variou de 46,34 em agosto a 77,16% em abril (F =
84,40, p < 0,001). Para C. sertularioides a variação foi de 56,76 em julho a 68,00%
em dezembro e janeiro (F = 26,22, p < 0,001). Já para C. isthmocladum a variação foi
de 39,08 (janeiro) a 80,03% (novembro) (F = 9,81, p < 0,001).
Já a quantidade de sulfato variou de 19,23 (março) a 31,08% (novembro) para
os ERPS de C. prolifera (F = 11,80, p < 0,001); 6,92 (novembro) a 41,82% (janeiro)
para os ERPS de C. racemosa (F = 42,91, p < 0,001); 26,57 (março) a 36,60%
(novembro) para os ERPS de C. sertularioides (F = 24,53, p < 0,001); e 21,73 (abril)
a 36,08% (agosto) para os ERSP de C. isthmocladum (F = 56,06, p < 0,001).
Figura 22 - Quantidade de açúcares totais (A) e sulfato (B) dos ERPS das algas verdes de acordo com o período de coleta. Os dados são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).
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Mar
Abr
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De
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C. prolifera C. racemosa C. sertularioides C. isthmocladum
Açú
ca
r (%
)
A
Resultados 82
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Tabela 12 - Média e variação anual da quantidade de açúcar e sulfato dos ERPS (média ± desvio padrão, n=12) e ANOVA (Razão-F e probabilidade).
Alga Composição Média ± DP Variação ANOVA
Razão-F Probabilidade
C. prolifera Açúcar 60,60 ± 6,00 (49,61 - 69,62) 39,45 <0,001
Sulfato 26,36 ± 3,28 (19,23 - 31,08) 11,80 <0,001
C. racemosa Açúcar 61,06 ± 9,12 (46,34 - 70,00) 84,40 <0,001
Sulfato 26,80 ± 8,82 (6,92 - 41,82) 42,91 <0,001
C. sertularioides Açúcar 63,05 ± 4,25 (56,76 - 68,00) 26,22 <0,001
Sulfato 33,44 ± 2,71 (26,57 - 36,00) 24,53 <0,001
C. isthmocladum Açúcar 65,42 ± 15,93 (39,08 - 80,03) 9,81 <0,001
Sulfato 28,20 ± 5,29 (21,73 - 36,08) 56,06 <0,001
A quantidade de açúcar e sulfato são expressos em %.
Foi realizado também a quantificação das proteínas totais e verificou-se uma
baixa contaminação protéica em todos os ERPS. A quantidade de proteínas nos
ERPS da alga C. prolifera variou de 0,18% (março) a 1,42% (junho); da C. racemosa
variou de 0,00% (janeiro, junho, julho, agosto e dezembro) a 0,67% (abril); da C.
sertularioides variou de 0,00% (fevereiro) a 1,06% (julho); da C. isthmocladum variou
de 0,20% (janeiro) a 1,07% (abril).
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Mar
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Ju
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Ago
No
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C. prolifera C. racemosa C. sertularioides C. isthmocladum
Su
lfa
to (
%)
B
Resultados 83
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
4.3.4 Atividade anticoagulante dos ERPS das algas verdes
A atividade anticoagulante dos ERPS das algas verdes está sumarizada na
Figura 23. Todos os ERPS apresentaram atividade no teste de aPTT. Além disso,
observa-se uma variação anual significativa para todos os ERPS (Tabela 13).
A atividade anticoagulante, expressa em razão de aPTT, variou de 1,31 a 3,70
para os ERPS de C. prolifera (F = 7,16, p < 0,01); 2,03 a 4,33 para os ERPS de C.
racemosa (F = 21,03, p < 0,01); 1,12 a 5,50 para os ERPS de C. sertularioides (F =
147,32, p < 0,01); e 1,57 a 2,60 para os ERSP de C. isthmocladum (F = 3,62, p <
0,01).
Figura 23 - Atividade anticoagulante dos ERPS das algas verdes de acordo com o período de coleta. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=3). A atividade anticoagulante foi expressa como razão de aPTT, obtida pela divisão do tempo de coagulação obtido com os ERPS (5 µg) pelo tempo de coagulação do controle (29,7 ± 0,3 s). * Clexane® heparina de baixo peso molecular.
Tabela 13 - Média e variação anual da atividade anticoagulante dos ERPS das algas verdes (média ± desvio padrão, n=12) e ANOVA (Razão-F e probabilidade).
Alga Média ± DP Variação ANOVA
Razão-F Probabilidade
C. prolifera 2,64 ± 0,66 (1,31 - 3,70) 7,16 <0,01
C. racemosa 3,21 ± 0,65 (2,03 - 4,33) 21,03 <0,01
C. sertularioides 4,08 ± 1,17 (1,12 - 5,56) 147,32 <0,01
C. isthmocladum 1,92 ± 0,32 (1,57 - 2,60) 3,62 <0,01
A atividade anticoagulante foi expressa como razão de aPTT, obtida pela divisão do tempo de coagulação obtido com os ERPS (5 µg) pelo tempo de coagulação do controle (29,7 ± 0,3 s).
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Ja
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Mar
Abr
Mai
Ju
nJu
lA
go
Set
Ou
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ov
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Ja
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Mar
Abr
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Ju
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C. prolifera C. racemosa C. sertularioides C. isthmocladum
razã
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PT
T
Resultados 84
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
4.3.5 Correlações entre o rendimento, composição química e atividade
anticoagulante dos ERPS das algas verdes e os parâmetros ambientais do local de
coleta
Foram feitas análises de correlação entre os parâmetros ambientais do local de
coleta (19 parâmetros) e o rendimento, composição química e atividade
anticoagulante dos ERPS das algas C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides e C.
isthmocladum. Os resultados destas análises de correlações estão sumarizados nas
Tabelas 14 a 17.
Como já mencionado, não se encontrou biomassa de C. racemosa no mês de
dezembro e de C. isthmocladum nos meses de setembro e outubro, por isso, os
valores dos parâmetros ambientais destes meses foram desconsiderados ao se
realizar as análises de correlações entre os parâmetros ambientais e o rendimento,
composição química e atividade anticoagulante dos ERPS obtidos da C. racemosa e
da C. isthmocladum (Tabela 15 e 17).
Para melhor visualização dos dados de correlação, nas Figuras de 24 a 27
expõem-se apenas aqueles parâmentos ambientais em que se identificou correlações
estatísticas significativas com o rendimento, composição química e atividade
anticoagulante dos ERPS.Observa-se que os parâmetros ambientais do local de
coleta podem afetar de forma distinta o rendimento, a composição química e a
atividade anticoagulante dos ERPS dependendo da espécie de alga, ou seja, cada
alga responde de forma diferente às condições ambientais do local de coleta.
Para os ERPS da C. prolifera evidenciou-se que existe uma correlação positiva
significativa (p < 0,05) entre a quantidade de açúcares totais e a turbidez (r= 0,61). O
tempo de coagulação foi correlacionado negativamente (p < 0,05) com a precipitação
pluviométrica do local de coleta (r= -0,59). Já o rendimento da extração e a quantidade
de sulfato dos ERPS não tiveram correlações significativas com nenhum parâmetro
ambiental analisado (Tabela 14, Figura 24).
Os ERPS da C. racemosa foram o que sofreram maior influência dos
parâmetros ambientais. Evidenciou-se que existe uma correlação positiva significativa
(p < 0,05) entre o rendimento da extração dos ERPS e salinidade da água do mar (r=
0,66), sódio (r= 0,68), cloreto (r=69) e insolação (r= 0,73) A quantidade de açúcares
totais foi correlacionada positivamente (p < 0,05) com a temperatura (r= 0,79),
alcalinidade de bicarbonato (r= 0,76) e bicarbonato (r= 0,76); e correlacionada
Resultados 85
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negativamente (p<0,05) com a salinidade (r= -0,70) e insolação (r= 0,59). Já a
quantidade de sulfato dos ERPS foi correlacionada negativamente com a
condutividade elétrica (r= -0,71). O tempo de coagulação foi correlacionado
positivamente (p < 0,05) com cloreto (r= 0,71) e insolação (r=0,63) (Tabela 15, Figura
25).
Já nos ERPS da C. sertularioides evidenciou-se que existe uma correlação
positiva significativa (p < 0,05) entre o rendimento da extração dos ERPS e o potássio
(r= 0,61), e negativa entre o rendimento e o nitrogênio (r= -0,58) e precipitação
pluviométrica (r= -0,75). A quantidade de açúcares totais foi correlacionada
negativamente (p < 0,05) com o nitrogênio (r= -0,64). Já a quantidade de sulfato dos
ERPS foi correlacionada positivamente com a insolação (r= 0,70). Não houve
correlação significativa entre tempo de coagulação dos ERPS e os parâmetros
ambientais (Tabela 16, Figura 26).
Por fim, para os ERPS da C. isthmocladum evidenciou-se que existe uma
correlação negativa significativa (p < 0,05) entre o rendimento da extração dos ERPS
e a temperatura da água do mar (r= -0,65). A quantidade de açúcar foi correlacionada
positivamente (p < 0,05) com a temperatura (r= 0,64) e condutividade elétrica, por
outro lado, estes dois fatores ambientais afetaram de forma inversa a quantidade de
sulfato dos ERPS, uma vez que, foi visto que a quantidade de sulfato dos ERPS foi
correlacionada negativamente com a temperatura (r= -0,71) e condutividade elétrica
(r= -0,65). Não houve correlação significativa entre tempo de coagulação dos ERPS e
os parâmetros ambientais (Tabela 17, Figura 27).
Resultados 86
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Tabela 14 - Coeficiente de correlação (n=12) entre o rendimento, composição química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. prolifera e os parâmetros ambientais do local de coleta.
Em vermelho valores para p < 0,05.
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PS
Ativid
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ag
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nte
do
s E
RP
S
Temperatura -0,30
Turbidez 0,01 -0,40
pH -0,14 0,34 -0,21
Nitrogênio 0,16 0,15 0,20 -0,27
Potássio -0,72 0,02 -0,07 0,29 -0,51
Sulfato -0,37 0,19 0,15 0,27 -0,71 0,33
Condutividade 0,26 0,62 -0,58 0,42 -0,03 -0,09 -0,07
Sólidos totais 0,33 0,07 -0,68 0,22 -0,55 0,05 0,11 0,63
Sólidos dissolvidos 0,33 0,07 -0,68 0,22 -0,55 0,05 0,11 0,63 1,00
Alcalinidade de carbonato 0,04 -0,11 -0,29 0,53 -0,39 0,18 0,18 -0,06 0,18 0,18
Alcalinidade de bicarbonato -0,32 0,33 0,04 -0,49 0,28 0,12 -0,12 0,01 -0,17 -0,17 -0,82
Sódio 0,55 0,02 -0,55 0,34 -0,20 -0,23 -0,06 0,64 0,70 0,70 0,33 -0,50
Ferro 0,41 -0,25 0,49 0,18 -0,22 -0,35 0,25 -0,08 -0,03 -0,03 0,00 -0,35 -0,03
Carbonato 0,04 -0,11 -0,29 0,53 -0,39 0,18 0,18 -0,06 0,18 0,18 1,00 -0,82 0,33 0,00
Bicarbonato -0,32 0,33 0,04 -0,49 0,28 0,12 -0,12 0,01 -0,17 -0,17 -0,82 1,00 -0,50 -0,35 -0,82
Cloreto 0,59 -0,02 -0,57 0,07 -0,33 -0,17 -0,08 0,60 0,81 0,81 0,14 -0,24 0,87 0,02 0,14 -0,24
Precipitação -0,33 0,33 -0,06 0,04 0,39 -0,26 0,06 -0,10 -0,19 -0,19 -0,09 0,05 -0,14 -0,16 -0,09 0,05 -0,35
Insolação 0,57 -0,50 -0,17 -0,06 -0,31 -0,20 -0,07 0,26 0,61 0,61 -0,01 -0,36 0,75 0,21 -0,01 -0,36 0,76 -0,28
Sulfato dos ERPS -0,11 -0,33 0,11 0,06 0,19 0,29 -0,33 0,09 -0,03 -0,03 -0,14 -0,12 0,19 -0,28 -0,14 -0,12 -0,02 -0,03 0,37
Açúcar dos ERPS -0,01 -0,47 0,61 0,21 -0,05 0,15 0,19 -0,30 -0,15 -0,15 0,09 -0,40 -0,01 0,32 0,09 -0,40 -0,22 0,20 0,24 0,52
Atividade anticoagulante dos ERPS 0,07 -0,38 0,14 0,08 0,03 0,18 -0,37 0,00 -0,12 -0,12 -0,14 0,01 -0,06 0,08 -0,14 0,01 -0,12 -0,59 0,18 0,48 -0,02
Rendimento da extração -0,15 -0,51 0,42 -0,24 -0,22 -0,05 0,26 -0,49 -0,25 -0,25 0,04 -0,36 -0,24 0,41 0,04 -0,36 -0,32 0,14 0,19 0,21 0,42 0,09
Resultados 87
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Figura 24 - Coeficiente de correlação (n=12) para os parâmetros ambientais do local de coleta que tiveram correlações significativas (p < 0,05) com a quantidade de açúcares totais e atividade anticoagulante dos ERPS da C. prolifera.
Resultados 88
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Tabela 15 - Coeficiente de correlação (n=11) entre o rendimento, composição química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. racemosa e os parâmetros ambientais do local de coleta.
Em vermelho valores para p < 0,05.
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Te
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tura
Tu
rbid
ez
pH
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gê
nio
Po
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Temperatura -0,30
Turbidez 0,02 -0,45
pH -0,13 0,02 -0,47
Nitrogênio 0,18 0,08 0,20 -0,91
Potássio -0,72 -0,03 -0,07 0,37 -0,55
Sulfato -0,37 0,22 0,15 0,57 -0,72 0,34
Condutividade 0,31 0,56 -0,64 0,21 -0,13 -0,15 -0,07
Sólidos totais 0,32 0,13 -0,69 0,62 -0,54 0,06 0,11 0,73
Sólidos dissolvidos 0,32 0,13 -0,69 0,62 -0,54 0,06 0,11 0,73 1,00
Alcalinidade de carbonato 0,06 -0,25 -0,31 0,61 -0,47 0,15 0,20 -0,18 0,22 0,22
Alcalinidade de bicarbonato -0,36 0,51 0,05 -0,48 0,37 0,17 -0,13 0,13 -0,21 -0,21 -0,80
Sódio 0,58 -0,06 -0,56 0,35 -0,25 -0,26 -0,06 0,63 0,74 0,74 0,29 -0,48
Ferro 0,42 -0,31 0,49 0,20 -0,24 -0,37 0,25 -0,13 -0,02 -0,02 -0,03 -0,34 -0,05
Carbonato 0,06 -0,25 -0,31 0,61 -0,47 0,15 0,20 -0,18 0,22 0,22 1,00 -0,80 0,29 -0,03
Bicarbonato -0,36 0,51 0,05 -0,48 0,37 0,17 -0,13 0,13 -0,21 -0,21 -0,80 1,00 -0,47 -0,34 -0,80
Cloreto 0,59 0,04 -0,57 0,36 -0,31 -0,16 -0,08 0,71 0,81 0,81 0,19 -0,29 0,92 0,04 0,19 -0,29
Precipitação -0,32 0,29 -0,06 -0,22 0,36 -0,28 0,06 -0,18 -0,17 -0,17 -0,14 0,11 -0,18 -0,18 -0,14 0,11 -0,34
Insolação 0,57 -0,46 -0,17 0,26 -0,27 -0,18 -0,07 0,37 0,60 0,60 0,05 -0,46 0,83 0,24 0,05 -0,46 0,75 -0,25
Sulfato dos ERPS -0,51 -0,21 0,23 -0,07 0,04 0,40 0,08 -0,71 -0,58 -0,58 0,39 -0,19 -0,40 -0,20 0,39 -0,19 -0,41 0,16 -0,40
Açúcar dos ERPS -0,70 0,79 -0,18 -0,20 0,14 0,36 0,22 0,20 -0,19 -0,19 -0,46 0,76 -0,39 -0,57 -0,46 0,76 -0,33 0,31 -0,59 0,05
Atividade anticoagulante dos ERPS 0,29 -0,21 -0,32 0,13 -0,17 0,20 -0,36 0,44 0,53 0,53 -0,12 0,01 0,51 0,01 -0,12 0,01 0,71 -0,45 0,63 -0,17 -0,25
Rendimento da extração 0,66 -0,25 0,01 0,10 -0,13 -0,31 -0,09 0,42 0,29 0,29 0,06 -0,45 0,68 0,43 0,06 -0,45 0,69 -0,52 0,73 -0,26 -0,53 0,55
Resultados 89
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Figura 25 - Coeficiente de correlação (n=11) para os parâmetros ambientais do local de coleta que tiveram correlações significativas (p < 0,05) com o rendimento, composição química e atividade
anticoagulante dos ERPS da C. racemosa.
Resultados 90
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Tabela 16 - Coeficiente de correlação (n=12) entre o rendimento, composição química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. sertularioides e os parâmetros ambientais do local de coleta.
Em vermelho valores para p < 0,05.
Sa
lin
ida
de
Te
mp
era
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Tu
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pH
Nitro
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nio
Po
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ag
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s E
RP
S
Temperatura -0,30
Turbidez 0,01 -0,40
pH -0,14 0,34 -0,21
Nitrogênio 0,16 0,15 0,20 -0,27
Potássio -0,72 0,02 -0,07 0,29 -0,51
Sulfato -0,37 0,19 0,15 0,27 -0,71 0,33
Condutividade 0,26 0,62 -0,58 0,42 -0,03 -0,09 -0,07
Sólidos totais 0,33 0,07 -0,68 0,22 -0,55 0,05 0,11 0,63
Sólidos dissolvidos 0,33 0,07 -0,68 0,22 -0,55 0,05 0,11 0,63 1,00
Alcalinidade de carbonato 0,04 -0,11 -0,29 0,53 -0,39 0,18 0,18 -0,06 0,18 0,18
Alcalinidade de bicarbonato -0,32 0,33 0,04 -0,49 0,28 0,12 -0,12 0,01 -0,17 -0,17 -0,82
Sódio 0,55 0,02 -0,55 0,34 -0,20 -0,23 -0,06 0,64 0,70 0,70 0,33 -0,50
Ferro 0,41 -0,25 0,49 0,18 -0,22 -0,35 0,25 -0,08 -0,03 -0,03 0,00 -0,35 -0,03
Carbonato 0,04 -0,11 -0,29 0,53 -0,39 0,18 0,18 -0,06 0,18 0,18 1,00 -0,82 0,33 0,00
Bicarbonato -0,32 0,33 0,04 -0,49 0,28 0,12 -0,12 0,01 -0,17 -0,17 -0,82 1,00 -0,50 -0,35 -0,82
Cloreto 0,59 -0,02 -0,57 0,07 -0,33 -0,17 -0,08 0,60 0,81 0,81 0,14 -0,24 0,87 0,02 0,14 -0,24
Precipitação -0,33 0,33 -0,06 0,04 0,39 -0,26 0,06 -0,10 -0,19 -0,19 -0,09 0,05 -0,14 -0,16 -0,09 0,05 -0,35
Insolação 0,57 -0,50 -0,17 -0,06 -0,31 -0,20 -0,07 0,26 0,61 0,61 -0,01 -0,36 0,75 0,21 -0,01 -0,36 0,76 -0,28
Sulfato dos ERPS 0,27 -0,43 0,14 -0,11 -0,11 -0,25 0,05 0,01 0,33 0,33 -0,17 -0,30 0,34 0,33 -0,17 -0,30 0,26 0,31 0,70
Açúcar dos ERPS 0,10 -0,39 0,02 -0,14 -0,64 0,30 0,24 -0,17 0,45 0,45 0,16 -0,10 -0,02 0,31 0,16 -0,10 0,32 -0,32 0,27 0,26
Atividade anticoagulante dos ERPS 0,03 -0,49 -0,27 0,14 -0,23 0,33 -0,23 -0,28 0,25 0,25 0,48 -0,30 0,23 -0,22 0,48 -0,30 0,28 -0,13 0,26 0,04 0,43
Rendimento da extração -0,06 -0,36 0,04 0,00 -0,58 0,61 0,08 0,08 0,33 0,33 -0,07 0,06 0,00 0,12 -0,07 0,06 0,24 -0,75 0,33 0,06 0,57 0,19
Resultados 91
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Figura 26 - Coeficiente de correlação (n=12) para os parâmetros ambientais do local de coleta que tiveram correlações significativas (p < 0,05) com o rendimento e composição química dos ERPS da C. sertularioides.
Resultados 92
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Tabela 17 - Coeficiente de correlação (n=10) entre o rendimento, composição química e atividade anticoagulante dos ERPS da C. isthmocladum e os parâmetros ambientais do local de coleta.
Em vermelho valores para p < 0,05.
Sa
lin
ida
de
Te
mp
era
tura
Tu
rbid
ez
pH
Nitro
gê
nio
Po
tássio
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PS
Ativid
ad
e
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tico
ag
ula
nte
do
s E
RP
S
Temperatura -0,30
Turbidez -0,08 -0,35
pH -0,22 0,36 -0,28
Nitrogênio 0,28 0,15 0,33 -0,22
Potássio -0,74 0,00 -0,04 0,31 -0,56
Sulfato -0,53 0,24 0,06 0,23 -0,68 0,38
Condutividade 0,24 0,62 -0,57 0,40 0,02 -0,10 -0,11
Sólidos totais 0,34 0,04 -0,74 0,21 -0,57 0,04 0,12 0,62
Sólidos dissolvidos 0,34 0,04 -0,74 0,21 -0,58 0,04 0,12 0,62 1,00
Alcalinidade de carbonato 0,02 -0,22 -0,11 0,55 -0,41 0,19 0,21 -0,25 0,12 0,12
Alcalinidade de bicarbonato -0,27 0,44 -0,11 -0,46 0,22 0,13 -0,05 0,20 -0,11 -0,11 -0,81
Sódio 0,60 -0,08 -0,56 0,29 -0,11 -0,29 -0,21 0,57 0,79 0,79 0,12 -0,32
Ferro 0,38 -0,16 0,16 0,17 -0,11 -0,47 0,08 0,05 0,08 0,08 0,33 -0,67 0,12
Carbonato 0,02 -0,22 -0,11 0,55 -0,41 0,19 0,21 -0,25 0,12 0,12 1,00 -0,81 0,12 0,33
Bicarbonato -0,27 0,44 -0,11 -0,46 0,22 0,13 -0,05 0,20 -0,11 -0,11 -0,81 1,00 -0,32 -0,67 -0,81
Cloreto 0,57 -0,06 -0,72 -0,06 -0,24 -0,18 -0,25 0,55 0,90 0,89 -0,03 0,00 0,84 -0,07 -0,03 0,00
Precipitação -0,21 0,36 0,01 0,16 0,30 -0,33 0,24 -0,01 -0,19 -0,19 -0,04 -0,13 0,10 0,08 -0,04 -0,13 -0,17
Insolação 0,52 -0,56 -0,23 -0,17 -0,22 -0,20 -0,21 0,17 0,64 0,64 -0,12 -0,24 0,75 0,16 -0,12 -0,24 0,70 -0,11
Sulfato dos ERPS 0,31 -0,71 0,55 -0,12 0,31 -0,16 -0,45 -0,65 -0,49 -0,49 0,43 -0,54 -0,18 0,22 0,43 -0,54 -0,32 -0,23 0,00
Açúcar dos ERPS -0,08 0,64 -0,47 0,47 0,03 -0,03 -0,04 0,83 0,34 0,34 -0,33 0,22 0,28 0,17 -0,33 0,22 0,19 0,10 0,02 -0,65
Atividade anticoagulante dos ERPS0,17 0,01 -0,14 -0,23 0,09 -0,58 -0,06 0,08 0,06 0,06 -0,32 -0,04 0,07 0,58 -0,32 -0,04 0,05 0,32 0,27 -0,20 0,40
Rendimento da extração 0,13 -0,65 -0,17 -0,58 -0,33 0,13 -0,21 -0,29 0,27 0,27 -0,23 0,19 0,06 -0,15 -0,23 0,19 0,37 -0,54 0,58 0,10 -0,25 0,21
Resultados 93
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Figura 27 - Coeficiente de correlação (n=10) para os parâmetros ambientais do local de coleta que tiveram correlações significativas (p < 0,05) com o rendimento e composição química dos ERPS da C.
isthmocladum.
Discussão 94
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
5 DISCUSSÃO
5.1 Parte I: Análise das possíveis mudanças na composição química/atividade
anticoagulante de ERPS da alga C. cupressoides de acordo com o período de
coleta
Os organismos marinhos, como as algas, são uma rica fonte de compostos com
atividades farmacológicas promissoras para uso pela indústria farmacêutica. Dentre
estes compostos destacam-se os PS, aos quais vem sendo atribuídas diversas
atividades farmacológicas, com destaque para a atividade anticoagulante.
No entanto, apesar destas promissoras atividades farmacológicas, não há até
o momento nenhum medicamento a base de PS. Provavelmente, isso se deve ao fato
da grande variabilidade estrutural destes polímeros, uma vez que variam de espécie
para espécie (DIETRICH et al., 1995; ALVES, 2000) e também pelo fato da estrutura
química destes polímeros poder ser modificada de acordo com o período de coleta
da alga (RIOUX; TURGEON; BEAULIEU, 2009; IMBS et al., 2009; MEN´SHOVA et
al., 2012), bem como por fatores ambientais do local de coleta. Apesar disso, poucos
são os estudos que analisam como fatores ambientais do local de coleta podem afetar
a composição química / atividades farmacológicas de PS de algas marinhas.
O grupo de pesquisa no qual está inserida esta tese demostrou que a alga C.
cupressoides var. flabellata coletada na mesma época, mas em praias com grau de
salinidade diferentes, sintetizava PS com propriedades diferentes, como também, PS
com atividades anticoagulantes diferentes (COSTA, 2010), o que indica que esta alga,
e, por conseguinte, seus PS são susceptíveis a fatores ambientais. Por isso, no
presente trabalho resolveu-se analisar de forma mais detalhada a influência do
período de coleta, bem como, das alterações de fatores ambientais que ocorreram
durante este período, no rendimento da extração, na composição e atividade
anticoagulante dos ERPS da C. cupressoides.
Observou-se que o rendimento da extração dos ERPS da C. cupressoides
variou durante o período de estudo, sendo a maior quantidade de ERPS obtida no
mês de novembro, seguido pelo mês de maio e agosto, respectivamente, e que dois
fatores influenciaram positivamente este aumento: insolação e salinidade. Variações
no rendimento de extrações, de acordo com o período de coleta, já foram observadas
para extratos ricos em PS obtidos algas marrons Saccharina longicruris (RIOUX;
Discussão 95
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
TURGEON; BEAULIEU, 2009), Costaria costata (IMBS et al., 2009), Padina pavonica
(MEN´SHOVA et al., 2012) e da alga verde Ulva fasciata (SIDDHANTA et al., 2001).
Destes estudos, apenas o primeiro avaliou também a influência de fatores ambientais
no rendimento da extração, como a salinidade, porém nenhuma correlação foi
observada, diferente do que aconteceu nesta tese.
Como dito, a insolação (quantidade de horas de exposição a luz solar de um
dado local) foi correlacionada positivamente com o rendimento dos ERPS de C.
cupressoides. Isto poderia ser explicado pelo fato de aumento de fotossíntese, ou
seja, quanto maior a insolação, maior a quantidade de horas de exposição a luz, por
conseguinte, maior a quantidade de fotossíntese, maior a quantidade de carboidratos
sintetizados, e maior seria o rendimento. Fonseca (2001) demonstrou correlação
semelhante entre esse parâmetro ambiental com a quantidade de carboidratos totais
da alga vermelha Gracilaria cervicornis, coletada também na praia de Búzios-RN. O
autor sugere que isso se deva, provavelmente, ao fato da insolação está relacionada
com o aumento da taxa de fotossíntese desta alga, aumentando, consequentemente,
a quantidade de carboidratos sintetizados por esta espécie.
Esta poderia ser uma justificativa para os resultados aqui descritos. Entretanto,
quando se fez a correlação entre açúcares totais e insolação, observou-se uma
correlação negativa (r = -0,80), o que descarta esta possibilidade. Outro fato que deve
ser observado, é que existe uma forte correlação negativa entre quantidade sólidos
totais e carboidratos (r = -0,87).
Os sólidos totais de uma dada amostra de água referem-se à quantidade de
sólidos em suspensão e aos sólidos dissolvidos contidos na mesma. Foi demonstrado
que os sólidos totais na água diminuem a eficiência da fotossíntese de algas, pois
bloqueiam a passagem de fótons (SILVA et al., 2008). Verificou-se aqui que há uma
forte correlação positiva entre a quantidade de sólidos totais e insolação (r = 0,61), ou
seja, nos meses que há um período maior de luz, há também mais sólidos bloqueando
a passagem dessa luz até as algas.
Estes dados em conjunto levam a observação de que nos meses em que se
obteve o maior rendimento da extração também seriam os meses que a fotossíntese
estaria mais prejudicada, por conseguinte o metabolismo de carboidratos também.
Portanto, acredita-se que esses maiores rendimentos das extrações nesses meses
Discussão 96
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
de maior insolação seriam decorrentes da presença de outras moléculas que não
carboidratos.
No que diz respeito à salinidade não se identificou nenhum estudo que
apontasse correlação entre salinidade e rendimento de extração. Porém, os dados
aqui apresentados mostram que o aumento da salinidade seria um fator que
promoveria o aumento no rendimento da extração e, provavelmente, o seu aumento
estaria, como a insolação, estimulando anabolismo de diferentes moléculas da alga.
Contudo, infelizmente, aqui neste estudo não foi possível identificar que moléculas
seriam essas.
Com relação as análises químicas dos ERPS da C. cupressoides observou-se
uma variação no conteúdo de açúcares totais e sulfato dos ERPS durante o período
de estudo. Dados semelhantes foram observados por Siddhanta e colaboradores
(2001) ao avaliarem o teor dessas moléculas em extratos obtidos da alga Ulva
fasciata.
A variação na quantidade de açúcares totais dos ERPS da C. cupressoides
teve uma correlação negativa significativa com a quantidade de sólidos totais (r = -
0,87) e sólidos dissolvidos (r = -0,87) na água do mar do local de coleta. Como já
mencionado, os sólidos totais de uma dada amostra de água referem-se à quantidade
de sólidos em suspensão e aos sólidos dissolvidos contidos na mesma, sendo que os
sólidos em suspensão são as partículas capazes de serem retidas por processos de
filtração, já os sólidos dissolvidos são compostos por partículas que continuam em
solução mesmo após a filtração (SILVA et al., 2008). Não foram encontrados relatos
da influência destes parâmetros na quantidade de açúcares em extratos de algas
marinhas, no entanto, já é descrito na literatura que a alta concentração de sólidos
totais pode reduzir a fotossíntese da vegetação enraizada submersa e de algas; e isso
pode, consequentemente, afetar negativamente a quantidade de açúcares totais
presentes nos ERPS.
Já com relação ao teor de sulfato, verificou-se que ele variou conforme o passar
dos meses. Só se identificou mais um artigo que quantificou sulfato de extratos de
alga, nesse caso, da alga U. fasciata (SIDDHANTA et al., 2001). E foi relatado que o
teor de sulfato nesse extrato também se alterava com o passar dos meses.
O parâmetro com maior correlação negativa com o teor de sulfato foi a
salinidade (r = -0,58). Em geral, se atribui um aumento na quantidade de sulfato dos
Discussão 97
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polissacarídeos em resposta ao aumento da salinidade. Por exemplo, Nader e
colaboradores (1983) observaram que havia um aumento na concentração de PS em
função do aumento da salinidade do habitat. Posteriormente, Aquino e colaboradores
(2011) analisaram PS de plantas artificialmente e naturalmente expostas a diferentes
salinidades e mostraram que o grau em que estes compostos foram sulfatados em
plantas halófitas aquáticas estava correlacionado positivamente com a salinidade,
sugerindo que a sulfatação destes polímeros seria uma adaptação ao meio salino, e
quando a planta estava num ambiente de salinidade zero, ela não produzia PS.
Posteriormente, foi demonstrado que a planta de água doce Eichhornia crassipes
(DANTAS-SANTOS et al., 2012), sintetiza PS, ou seja, uma planta em um ambiente
cuja a salinidade é zero, sintetiza PS. O que indica que a salinidade pode interferir ou
não na síntese de PS dependendo do organismo.
Em algas isto também parece acontecer, pois não foi visto correlação entre a
sulfatação dos polissacarídeos da alga S. longicruris e a salinidade da água do mar
(RIOUX; TURGEON; BEAULIEU, 2009). Enquanto que para a alga vermelha G.
gracilis foi visto uma correlação negativa significativa entre a salinidade e a quantidade
de sulfato do ágar produzido (MARINHO-SORIANO; BOURRET, 2003), semelhante
ao que foi observado para os ERPS da C. cupressoides.
Então, para se ter uma ideia se essa diminuição da quantidade sulfato estava
relacionado com uma menor quantidade de PS no ERPS, foi feita a densitometria das
lâminas de eletroforese em gel de agarose. Ao se observar os dados dessa
densitometria, verifica-se que a quantidade PS nos ERPS também varia com o passar
dos meses. E quando se fez uma correlação entre os valores de densitometria e
rendimento, observou-se uma correlação negativa (r = - 0,66), o que mostra que há
uma diminuição da quantidade de PS quando há um maior rendimento da extração.
Em suma, a salinidade afeta negativamente a quantidade de carboidratos no
ERPS, mas principalmente dos PS, por isso propõem-se que essa menor quantidade
de sulfato seja, então, uma consequência da menor produção de PS em relação a
quantidade de carboidratos totais.
Só se identificou mais um trabalho que fez correlação da síntese de PS com
parâmetros ambientais. No caso, a alga em estudo foi a Saccharina longicruris
(RIOUX; TURGEON; BEAULIEU, 2009), e neste não foram encontradas correlações
Discussão 98
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com os parâmetros ambientais analisados (salinidade e temperatura da água do mar)
com a sulfatação dos PS.
O que leva à proposição de que o mecanismo pelo qual cada espécie de alga
responde a um parâmetro abiótico é diferente. E, por conseguinte, estes dados
confirmam a importância de se estudar o efeito de diferentes parâmetros no
metabolismo de cada alga. Por fim, propõem-se que a insolação promove o aumento
da síntese de outras moléculas, que não carboidratos, o que, consequentemente,
levou a um aumento no rendimento de ERPS da C. cupressoides.
Além de se observar variações na composição química dos ERPS, observou-
se que a atividade anticoagulante também variou de acordo com o mês de coleta.
Apesar de não se ter observado correlações significativas entre as variações na
composição química e atividade anticoagulante dos ERPS, os parâmetros ambientais
podem ter causado sutis diferenças na estrutura química destes polímeros e
consequentemente na sua atividade anticoagulante, como por exemplo, na
distribuição dos grupos sulfatos. Porém, mais estudos são necessários para se
comprovar esta hipótese.
Em conjunto, estes dados (da tese e da literatura) mostram que cada espécie
de alga responde de forma diferente as condições ambientais as quais está
submetida. No caso da C. cupressoides, dependendo do que se pretende obter, esta
pode ser coletada em diferentes épocas do ano: Se o interesse é trabalhar apenas
com ERPS, tendo estes um alto rendimento, o ideal é se coletar a C. cupressoides
nos meses de maio, agosto e novembro (Figura 8). Porém, se o interesse for em obter
maior quantidade de PS tendo estes potente ação anticoagulante, o ideal é se coletar
essa alga nos meses do início do ano (janeiro a abril), meses estes em que, de acordo
com a densitometria (Figura 9B), se tem maior quantidade de PS, coincidindo com os
meses em que os ERPS apresentaram uma alta atividade anticoagulante, sendo a
mais pronunciada observada para ERPS obtido em março. Pretende-se, futuramente,
realizar outras análises a fim de se determinar os melhores períodos de coleta para
os PS com propriedades distintas, que não anticoagulante.
5.2 Parte II: Purificação, caracterização e atividade anticoagulante dos PS
purificados da alga C. cupressoides
Discussão 99
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O grupo em que se insere esta tese tem se focado, há mais de uma década,
em extrair, caracterizar e avaliar possíveis atividades farmacológicas de PS de algas
marinhas, incluindo a atividade anticoagulante (ROCHA et al., 2001; ALBUQUERQUE
et al., 2004; ROCHA et al., 2005a; ROCHA et al., 2005b; COSTA et al., 2010; COSTA
et al., 2012; FIDELIS et al., 2014) . Embora haja uma grande quantidade de trabalhos
disponíveis na literatura acerca de estudos de bioprospecção de PS anticoagulantes,
há ainda uma grande variedade de algas não estudadas, e que, portanto, não tiveram
seus PS avaliados quanto a seu potencial anticoagulante.
A escolha pela extração, purificação, caracterização de PS da alga C.
cupressoides se deu pela necessidade em dar continuidade ao trabalho realizado por
Costa (2010), que obteve diferentes PS com atividade anticoagulante, alguns com
atividade semelhante ao Clexane®.
Nesse contexto, espécimes da alga marinha verde C. cupressoides foram
coletados e após processo de extração descrito anteriormente, obteve-se quatro
frações (CCB-0.3, CCB-0.5, CCB-1.0 e CCB-2.0) que foram nomeados conforme o
volume de acetona necessário para precipitá-los em solução aquosa. Do material
extraído as menores quantidades foram obtidas nas frações CCB-0.3 e CCB-2.0, já
as maiores quantidades obtidas foram das frações intermediárias, a CCB-F0.5 e a
CCB-F1.0. Este perfil de rendimento obtido se assemelha ao obtido em trabalho
anterior realizado com esta mesma alga (COSTA, 2010) e com o de outros trabalhos
desenvolvidos pelo grupo do BIOPOL com algas verdes, como a Codium
isthmocladum (FARIAS, 2005; CORDEIRO, 2013) e a Caulerpa prolifera (CAMARA,
2015). Ou seja, nestes, as frações intermediárias foram obtidas em maior quantidade
do que a primeira e a última fração. Isto também já foi observado para as algas
marrons Dictyota menstrualis (ALBUQUERQUE, 2005) e Dictyopteris justii (MELO,
2013).
A atividade anticoagulante dessas frações polissacarídicas foi analisada e
observou-se que, semelhante ao trabalho de Costa (2010), a fração CCB-0.5
apresentou uma excelente atividade anticoagulante, por isso, esta fração foi
selecionada para passos posteriores de purificação de seus PS, uma vez que isto não
foi realizado no trabalho de Costa (2010).
Após cromatografia de troca iônica da CCB-0.5, obteve-se dois PS,
denominados de FI e FII, respectivamente.
Discussão 100
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Com o intuito de se averiguar se os PS FI e FII tratavam-se de PS purificados,
estes foram submetidos à eletroforese em gel de agarose e coradas com azul de
toluidina. Nesse sistema de eletroforese, o tampão utilizado apresenta em sua
constituição o 1,3-diaminopropano, que tem suas aminas protonadas em pH 9,0.
Esses grupamentos são capazes de se complexar com os grupos carregados
negativamente dos polissacarídeos, tais como o sulfato. Porém, tal complexação não
é simplesmente dependente da carga absoluta do PS, mas também da conformação
espacial que a molécula assume no sistema e de como esta favorece a exposição de
seus grupamentos carregados (DIETRICH; DIETRICH, 1976). Devido às
peculiaridades estruturais inerentes a cada polissacarídeo, esses assumem
conformações espaciais únicas, sendo possível individualiza-los com o uso da 1,3-
diaminopropano.
Ao se analisar a lâmina, no qual mostra-se a corrida eletroforética do ERPS, da
fração CCB-0.5 e dos PS FI e FII pode-se perceber que processo de purificação foi
efetivo, pois pode-se observar que durante os passos de purificação há uma
diminuição da polidispersão das bandas metacromáticas, que culminam na separação
de duas populações de PS (FI e FII).
Com relação à caracterização química dos PS FI e FII foi observado um alto
teor sulfato em FI e FII que foi de 33,4% e 36,4%, respectivamente; valores mais
elevados que o do ERPS e da fração CCB-0.5. Os PS FI e FII também apresentaram
quantidades de açúcares totais mais elevadas que os ERPS e a fração CCB-0.5, outro
fato que indica a purificação desses polímeros.
Não foi observada contaminação por proteínas nos PS FI e FII, a ausência
destes contaminantes também foram observados para frações de PS obtidos de
outras algas marinhas como a C. prolifera (CAMARA, 2015) e Hypnea musciformis
(ALVES, 2015), as quais foram extraídas utilizando-se o mesmo método de extração
do presente trabalho. Esses dados indicam que o uso de proteases como passo inicial
durante o processo de extração dos polissacarídeos, como utilizados neste trabalho,
é essencial para a obtenção de baixos níveis ou, até mesmo, eliminação dos
contaminantes protéicos.
A análise da composição monossacarídica dos PS FI e FII de C. cupressoides
demonstrou que tais moléculas são heteropolissacarídeos, tendo como principais
monossacarídeos constituintes a galactose, seguido da glicose, sendo assim
Discussão 101
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
consideradas como glucogalactanas. A obtenção de heteropolissacarídeos é comum
em algas verdes como evidenciado em C. cylindricum (MATSUBARA et al., 2001),
Ulva fasciata (SHAO et al., 2013), Enteromorpha intestinallis (WANG et al., 2014),
inclusive em espécies do gênero Caulerpa, como C. okamurai (HAYAKAWA et al.,
2000), C. racemosa (CHATTOPADHYAY et al., 2007), C. lentifera (MAEDA et al.,
2012) e C. prolifera (CAMARA, 2015).
No entanto, observa-se uma predominância de um monossacarídeo em
detrimento de outros monossacarídeos em certas famílias de algas. Por exemplo, os
PS de algas da família Codiaceae são compostos principalmente, de arabinose e
galactose, os da Ulvaceae e Monostromataceae são constituídos principalmente por
ramnose, já os da Caulerpaceae, como C. cupressoides, são compostos,
principalmente, por galactose (MAO et al, 2006; MAEDA et al., 2012, CAMARA, 2015).
No entanto, as evidências existentes são insuficientes para estabelecer uma relação
sistemática entre a estrutura, incluindo a composição monossacarídica, e a filogenia
das algas.
Apesar do modelo de coagulação em “cascata” estar ultrapassado, ele ainda
continua sendo usado na clínica para se avaliar distúrbios e/ou atuação de
determinados compostos, como os anticoagulantes, no processo de coagulação
sanguínea (CIANCIA; QUITANA; CEREZO, 2010). Em geral, a atividade
anticoagulante dos PS é mensurada pelos testes clássicos de coagulação sanguínea:
aPTT, PT e TT.
O teste de aPTT é utilizado para avaliar se um determinado composto é capaz
de atuar nos fatores da via intrínseca e/ou comum da coagulação, ou seja, se ele é
capaz de atuar nos fatores XII, XI, IX, VIII, X, II e/ou fibrinogênio. O teste de PT, é
utilizado para se averiguar se um determinado composto é capaz de atuar nos fatores
da via extrínseca e/ou comum da coagulação, ou seja, se é capaz de atuar nos fatores
VII, X, V, II e/ou fibrinogênio. Já o teste de TT avalia a capacidade de compostos em
atuar na última etapa da coagulação sanguínea, a chamada via comum da
coagulação, neste caso, a presença de substâncias que interferem na ação da
trombina sobre o fibrinogênio ou aquelas que bloqueiam a polimerização da fibrina
promovem um prolongamento do tempo de coagulação do plasma neste teste.
Para se ter ideia em qual via os PS da C. cupressoides poderiam agir,
inicialmente, estes PS foram submetidos aos testes de aPTT, PT e TT. Todos os
Discussão 102
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polissacarídeos tiverem a capacidade de prolongar o tempo de coagulação, nestes
três testes de maneira dose-dependente. Vale ressaltar, que o PS FII apresentou uma
melhor atividade nos testes de aPTT e PT que o PS FI, já no teste de TT ambas
tiveram atividade semelhantes.
Estes dados indicam que os PS da alga C. cupressoides possuem vários alvos
moleculares na cascata e coagulação, uma vez que se identificou a presença de
atividade nos testes de aPTT, PT e TT, ou seja, que foram capazes de agir na via
intrínseca, extrínseca e comum da coagulação.
Outra consideração, é que o grupo sulfato é importante para a atividade
anticoagulante, uma vez que, os PS FI e FII, que tiveram atividades anticoagulantes
mais elevadas, são mais sulfatados que a fração CCB-0.5 e o ERPS. Este resultado
corrobora com o de Azevedo e colaboradores (2009), que mostraram que quando os
PS eram desulfatados quimicamente, os mesmos perdiam a sua atividade
anticoagulante. No entanto, quando se compara a atividade de FI e FII, que possuem
quantidade de sulfato semelhante, observa-se que a atividade do FII é mais
pronunciada, o que corrobora com outros autores que afirmam que a atividade
anticoagulante parece não depender apenas da quantidade de sulfato encontrada nos
PS; e sim de outras características como a disposição desses grupamentos funcionais
na estrutura do polissacarídeo, bem como os tipos de resíduos de carboidratos que
constituem os polímeros (NGO et al., 2013; JIAO et al., 2011; CAMARA, 2015).
Em geral, são descritos na literatura que o mecanismo de ação dos PS de algas
é devido a inibição da trombina via AT e, principalmente, via HCII como é descrito para
os PS anticoagulantes das algas verdes Codium adhaerence e Codium divaricatum
(HAYAKAWA et al., 2000) ou agem apenas via HCII como os PS das algas Caulerpa
brachypus e Caulerpa okamurai (HAYAKAWA et al., 2000) ou ainda podem agir tanto
potencializando a ação das serpinas quanto diretamente na trombina como os PS da
Ulva conglobata (MAO et al., 2006).
Para se averiguar se o mecanismo de ação dos PS FI e FII era devido a inibição
desta protease da cascata de coagulação, realizou-se o ensaio de inibição da
trombina tanto na presença, como na ausência das serpinas AT e HCII, usando-se
substrato cromogênico. Observou-se que na ausência das serpinas os PS FI e FII
inibiram a atividade da trombina em 26,3% e 30,3%, respectivamente. Já na presença
Discussão 103
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do HCII a inibição foi de 35,1% e 37,8% para os PS FI e FII, respectivamente. Já na
presença da AT não foi observada inibição da atividade da trombina.
Por um lado, observou-se alta atividade anticoagulante para o teste de aPTT,
além de atividade no PT, porém, no ensaio de inibição da trombina esta atividade não
foi muito pronunciada, isso é indicativo que os PS podem estar agindo em diversas
proteases da cascata de coagulação. Porém, mais estudos são necessários para
explicar detalhadamente quais os alvos de ação destes polímeros.
5.3 Parte III: Análise das possíveis mudanças na composição química/atividade
anticoagulante de ERPS de outras algas verdes de acordo com o período de
coleta
Levando em consideração o que foi dito acima, avaliou-se também como os
fatores abióticos influenciavam outras algas verdes, também encontradas em Búzios-
RN, com relação ao rendimento de extração, teor de polissacarídeos e sulfato e
atividade anticoagulante.
Da mesma forma que se observou variações no rendimento, composição
química e atividade anticoagulante para os ERPS alga verde C. cupressoides.
Observou-se também variações nestes parâmetros para os ERPS das demais algas
verdes aqui estudadas (C. prolifera, C. racemosa, C. sertularioides e C.
isthmocladum). No entanto, um fato interessante é que cada alga responde de forma
diferente às condições ambientais do local de coleta.
Em geral, os parâmetros ambientais do local de coleta que afetaram os ERPS
da C. cupressoides afetam de forma similar os ERPS da C. racemosa. Houve uma
forte correlação positiva (r = 0,73) entre a insolação e o rendimento dos ERPS, no
entanto, quando se observa a correlação entre a insolação e a quantidade de açúcares
totais, observa-se correlação negativa (r = -0,59) o que pode indicar que nos meses
em que se obteve o maior rendimento da extração também seriam os meses que a
fotossíntese estaria mais prejudicada, por conseguinte o metabolismo de carboidratos
também. Logo, os maiores rendimentos das extrações, nos meses de maior insolação,
seriam decorrentes da presença de outras moléculas que não carboidratos.
Um outro fator que afetou de forma positiva o rendimento da extração das
ERPS da C. racemosa foi a salinidade da água do mar (r = 0,66), porém, quando se
Discussão 104
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observa a correlação entre a salinidade e a quantidade de açúcares totais observa-se
o inverso, ou seja, há uma forte correlação negativa entre estes dois parâmetros (r =
-0,70), o que indica, como visto para a alga C. cupressoides, que o aumento da
salinidade, estaria, juntamente com a insolação, estimulando anabolismo de
diferentes moléculas da alga C. racemosa, que não polissacarídeos.
Além disso, também houve correlação positiva significativa entre o rendimento
e a quantidade de sódio (r = 0,68) e cloreto (r = 0,69) da água do mar. Isto já era de
se esperar, uma vez que houve correlação positiva entre o rendimento e a salinidade;
e estes sais são os principais responsáveis pela salinidade da água.
A quantidade de açúcares totais dos ERPS da C. racemosa, além de ser
afetada pela salinidade da água do mar, também foi correlacionada com os
parâmetros alcalinidade de bicarbonato, bicarbonato e com a temperatura da água do
mar, porém esta correlação foi positiva.
A alcalinidade da água é uma medida de tamponamento da água (capacidade
de resistir às mudanças de pH), sendo esta atividade dependente, principalmente, de
íons carbonatos, bicarbonatos e hidróxidos (HAGEMANN, 2009; PIÉRRI, 2012). No
ambiente marinho, a quantidade de dióxido de carbono, por vezes, pode ser limitada,
prejudicando a fotossíntese dos seres que neste ambiente vivem, como as algas. No
entanto, estes seres tendem a desenvolver estratégias para sobreviver diante deste
fato, uma delas é a captação desses íons bicarbonatos, como fonte de carbono
inorgânico, os quais podem estar em quantidades mais elevadas na água do que o
dióxido de carbono (GRANBOM; PEDERSÉN, 1999; LARSSON; AXELSSON, 1999;
PIERINI; THOMAZ, 2004).
De acordo com os dados de correlações visto para a alga C. racemosa, essa
parece ser uma estratégia utilizada pela mesma, uma vez que se observou uma forte
correlação positiva entre a alcalinidade de bicarbonato (r = 0,76) e a quantidade de
açúcares totais dos ERPS desta alga, ou seja, quanto maior a alcalinidade de
bicarbonato, maior absorção deste íon pela alga, o que permitiria, então, a uma maior
síntese de açúcares, o que se refletiu em ERPS.
Outro fator correlacionado com a quantidade de açúcares totais dos ERPS da
C. racemosa foi a temperatura da água do mar (r = 0,79). Já foi observado, por outros
autores, correlação positiva entre temperatura da água do mar e a quantidade de
carboidratos totais das algas vermelhas Grateloupia doryphora e Gymnogongrus
Discussão 105
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griffithsiae (PERFETO, 1998), Gracilaria cervicornis (MARINHO-SORIANO et al.,
2006), Catenella repens (BANERJEE et al., 2009). De acordo com estes autores a
temperatura estaria afetando a fotossíntese dessas espécies, por isso, maior seria a
produção de carboidratos, no entanto, os mesmos não explicaram detalhadamente o
mecanismo pelo qual a temperatura agiria.
A quantidade de sulfato dos ERPS da C. racemosa foi correlacionada
negativamente com a condutividade elétrica (r = -0,71) e com a salinidade (r = -0,51).
Como a síntese de açúcares totais também foi correlacionada negativamente com
estes parâmetros, então acredita-se que essa menor quantidade de sulfato seja
decorrente da menor quantidade de PS.
A atividade anticoagulante dos ERPS de C. racemosa não foi afetada pelas
alterações nas quantidades dos compostos aqui estudados, já que não se identificou
correlação dessa atividade com quantidade de polissacarídeo e sulfato. Porém se
identificou uma correlação positiva desta atividade com a insolação (r = 0,63) e com a
quantidade de cloreto (r = 0,71). Essa foi a primeira vez que se identificou este tipo de
correlação, portanto não há relatos sobre este assunto, o que dificultou a proposição
de hipóteses que justificassem estes dados. Em vários trabalhos com PS purificados
de algas e que apresentam atividade anticoagulante, há relatos que a quantidade de
sulfato não é o único fator predominante para que os PS ajam como anticoagulantes,
e que a distribuição dos grupos sulfato pela molécula seriam, sim, um fator muito mais
importante (FONSECA et al., 2008; JIAO et al., 2011; NGO et al., 2013). As
glicosiltransferases, sulfotranferases e sulfatases são as enzimas responsáveis pela
síntese de polissacarídeos sulfatados (HO, 2015), e como todas as enzimas, suas
ações são afetadas por fatores como presença de íons e temperatura. Por exemplo,
há relatos que já mostram que o cloreto (125 mM) afeta a ação de sulfotransferases
de mamíferos (GLATT et al., 1993). Além disso, a síntese de polissacarídeos é bem
mais maleável do que de outras macromoléculas, pois não há um molde para se
seguir. Como também, não há um sistema de reparo da síntese de polissacarídeos.
Diante deste quadro, propõem-se que a insolação e a quantidade de cloreto estariam
afetando as enzimas de síntese de PS em C. racemosa, o que, por conseguinte,
levaria a síntese de PS com sutis diferenças estruturais que se refletiriam nas
diferentes atividades anticoagulantes dos ERPS aqui observadas. Espera-se no
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futuro, purificar estes PS produzidos mensalmente e avaliá-los estruturalmente afim
de se identificar estas diferenças.
O rendimento da extração dos ERPS da C. sertularioides foi correlacionado, de
forma significativa, negativamente com quantidade de nitrogênio na água (r = -0,58).
Além disso, a quantidade de nitrogênio foi o único fator a afetar a quantidade de
açúcares totais dos ERPS (r = -0,64), ou seja, foi observada uma maior quantidade de
carboidratos e, consequentemente maior rendimento dos ERPS, nos períodos com
menores valores de nitrogênio na água. Marinho-Soriano e Bourret (2003) estudando
fatores que afetam o rendimento da extração de ágar da alga Gracilaria bursa-pastoris
verificaram que também havia uma correlação negativa significativa entre este
rendimento e a quantidade de nitrogênio. De acordo com os autores isto se deve ao
fato da síntese de proteínas ter sido limitada a favor da síntese de polissacarídeos.
Correlação inversa entre a quantidade de nitrogênio e a quantidade de carboidratos
totais também foi observada para alga Catenella repens (BANERJEE et al., 2009),
estes autores justificaram este fato da mesma maneira explicada por Marinho-Soriano
e Bourret (2003) para a alga G. bursa-pastoris. Logo, propõem-se que isso também
possa estar acontecendo com a alga C. sertularioides.
Outro fator que teve correlação negativa com o rendimento foi a precipitação
pluviométrica. Inicialmente, esperava-se que houvesse uma correlação entre a
luminosidade e precipitação, o que poderia ajudar a explicar este achado. Todavia,
isso não ocorreu. Não se encontrou nenhum outro trabalho que relatasse algum tipo
de correlação da precipitação pluviométrica com o rendimento de extração de
polissacarídeos. Portanto, infelizmente, ainda não se tem uma hipótese razoável para
explicar este dado. Observou-se, ainda, uma correlação positiva do rendimento com
a quantidade de potássio (r = 0,61). Acredita-se que este íon esteja afetando a ação
das enzimas do metabolismo da alga e, assim, fazendo com esta aumente a síntese
de suas moléculas, por conseguinte, isso afetaria o rendimento da extração.
Outro dado interessante é a correlação positiva entre a quantidade de sulfato
dos ERPS e a insolação (r = 0,70). A alga em questão, dentre todas as estudadas, foi
a que foi encontrada mais próxima à praia, ou seja, os espécimes dessa alga ficavam
mais tempo expostos ao sol sem a proteção da água do mar. Portanto, estavam mais
propensas à desidratação do que as outras algas. Os PS e os grupos sulfatos neles
presentes, por serem higroscópicos, tem como uma das funções básicas, proteger as
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algas da desidratação (PERCIVAL; MCDOWELL, 1967; O’SULLIVAN et al., 2010).
Portanto, a alga deveria, nos meses de maior insolação, sintetizar mais
polissacarídeos, e isso aumentaria o rendimento da extração. Porém isso não ocorreu,
então, acredita-se que nos meses de maior insolação, essa alga responde a esse
fator, não sintetizando mais polissacarídeos, mas sim, aumentando o grau de
sulfatação de seus polissacarídeos.
Já em relação a atividade anticoagulante dos ERPS da C. sertularioides não foi
observada nenhuma correlação significativa entre este parâmetro e os parâmetros
ambientais do local de coleta, apesar de se ter observado uma variação significativa
desta atividade de acordo com o período de coleta. O que leva proposição de que,
assim como ocorreu com as outras algas, os parâmetros ambientais podem ter
causado sutis diferenças na estrutura química destes polímeros e consequentemente
na sua atividade anticoagulante. Desta forma, mais estudos são necessários para se
comprovar esta hipótese.
Para a alga C. prolifera observou-se variações significativas no rendimento da
extração, na composição química e atividade anticoagulante dos ERPS obtidos
mensalmente. Apesar disto, quando se analisa as correlações destes parâmetros com
os parâmetros ambientais poucas correlações foram observadas (açúcares totais e
turbidez; atividade anticoagulante e precipitação), o que indica que esta alga pode
estar sendo afetada por outros parâmetros os quais não foram analisados nesta tese.
Houve uma correlação positiva significativa entre a quantidade de açúcares
totais e a turbidez (r = 0,61). Contudo, se esperava o contrário, pois com maior
turbidez, menos luz chegaria a alga e ela faria menos fotossíntese, e
consequentemente, menos polissacarídeos. Porém, isso não ocorreu. Portanto, a
hipótese proposta para justificar esse dado é que com o aumento da turbidez, houve
o aumento de uma ou mais moléculas na água que funcionariam, para essa alga,
como estimuladores da síntese de polissacarídeos, fazendo com que a alga
sintetizasse mais estas moléculas.
Encontrou-se, também, uma correlação negativa entre a precipitação
pluviométrica e a atividade anticoagulante (r = -0,59). Porém, não se observou
correlação entre a precipitação e qualquer outro parâmetro avaliado. Então a hipótese
proposta é que a precipitação está afetando a concentração de um parâmetro que não
foi avaliado e este por sua vez, nessa alga, afeta a estrutura dos PS sintetizados pela
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alga, o que é confirmado pelas alterações das atividades anticoagulantes dos ERPS
dessa alga observadas durante o ano.
Para a alga C. isthmocladum observou-se uma correlação positiva forte entre a
temperatura da água do mar e a quantidade de açúcares totais dos ERPS (r = 0,64).
Neste caso, como observado também para C. racemosa, a temperatura da água
parece afetar a fotossíntese, aumentando, assim, a síntese de carboidratos. Contudo,
isto não se refletiu no rendimento da extração, pois houve uma correlação negativa
entre temperatura e rendimento (r = -0,65). Além disso, a temperatura também afetou
de forma negativa a quantidade de sulfato dos ERPS (r = -0,71). Correlação negativa
entre a quantidade de sulfato e a temperatura também foi observada para o ágar
extraído da G. bursa-pastoris (MARINHO-SORIANO E BOURRET, 2003), no entanto,
estes autores não explicaram por quais motivos isso ocorreria. A hipótese aqui
sugerida é que se tem uma maior síntese de carboidratos, mas essa não é
acompanhada pela síntese de PS, o que justificaria essa menor quantidade de sulfato.
Isso também ocorre quando se olha e condutividade elétrica e a quantidade de
açúcares totais (r = 0,83) e a quantidade de sulfato (r = -0,65). Outro detalhe
interessante é que há uma correlação positiva entre condutividade elétrica e
temperatura (r = 0,62), o que indica, que nessa alga, estes fatores estão atuando em
conjunto. Outro fato interessante, é que a condutividade elétrica faz correlação com
vários dos sais analisados, mas não se encontrou nenhuma correlação desses com a
quantidade de polissacarídeos e com a de sulfato, o que indica que eles precisam
atuar em conjunto para estimularem a síntese dos polissacarídeos nessa alga.
Já em relação a atividade anticoagulante dos ERPS da C. isthmocladum não
foi observada nenhuma correlação significativa entre este parâmetro e os parâmetros
ambientais do local de coleta, apesar de se ter observado uma variação significativa
desta atividade de acordo com o período de coleta. O que se leva a propor o mesmo
proposto para as algas C. cupressoides e C. sertularioides, ou seja, que os parâmetros
ambientais podem ter causado sutis diferenças na estrutura química destes
polissacarídeos e consequentemente na sua atividade anticoagulante.
Em suma, os dados apresentados nesta tese demonstram que cada espécie
de alga estudada responde de forma diferente as condições ambientais as quais está
submetida, apesar das algas aqui estudadas serem do mesmo Filo e, inclusive, 4
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delas serem do mesmo gênero (Caulerpa), ou seja, espécies relativamente
aparentadas.
Para C. racemosa os meses para se obter maior quantidade de material de
ERPS, ou seja, o período para coletar a C. racemosa e se ter melhor rendimento de
extração seria no final do ano (setembro a novembro), meses estes que também
coincidem com o período em que os ERPS tiveram maior atividade anticoagulante e
perfil eletroforético bastante similar.
Para a alga C. sertularioides o período de setembro a fevereiro, seria o melhor
período para se obter melhor rendimento de extração dos ERPS. O período de
setembro a janeiro foi o período em que os ERPS tiverem as mais altas atividades
anticoagulantes. No entanto, vale ressaltar que, em fevereiro, apesar de ser o mês em
que se observou maior rendimento da extração, foi justamente o mês em que se
obteve um PS com perfil eletroforético bastante distinto dos ERPS obtidos nos demais
meses, e isso parece ter se refletido na atividade anticoagulante do ERPS obtido em
fevereiro, uma vez que esta atividade diminuiu drasticamente.
Já para a alga C. prolifera o rendimento da extração, apesar de haver uma
variação significativa durante o ano, esta variação não foi tão pronunciada como visto
para demais algas. Os meses de março e abril foram os meses em que se obteve
menor rendimento. E também de acordo com o perfil eletroforético menor quantidade
de PS e isso pode ter se refletido na atividade anticoagulante, uma vez que nestes
meses foram observadas as menores atividades anticoagulantes, com exceção do
ERPS do mês de maio.
Por fim, para a alga C. isthmocladum os valores mais altos de rendimento da
extração foram observados nos ERPS obtidos de novembro a janeiro, com destaque
para o mês de dezembro. Com relação a atividade anticoagulante este foi a alga em
que os ERPS foram menos efetivos sendo a maior atividade observada em junho, por
isso, sugeri-se fazer prospecção de outras atividades farmacológicas para os PS
obtidos dessa alga.
Pretende-se, futuramente, realizar outras análises a fim de se determinar os
melhores períodos de coleta para os PS com propriedades distintas, que não
anticoagulante.
Conclusões 110
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6 CONCLUSÕES
Houve uma variação significativa no rendimento da extração dos ERPS da alga C.
cupressoides de acordo com o período de coleta, esta variação foi correlacionada
positivamente com os parâmetros ambientais: salinidade da água do mar e insolação.
Houve uma variação significativa na quantidade de açúcares totais e na quantidade
de sulfato dos ERPS da alga C. cupressoides de acordo com o período de coleta.
Sendo a quantidade de açúcares totais correlacionada negativamente com a
insolação, sólidos totais, quantidade de cloreto e de sódio da água do mar e a
quantidade de sulfato correlacionada negativamente com a salinidade da água do
mar.
Houve uma variação significativa na atividade anticoagulante dos ERPS da alga C.
cupressoides de acordo com o mês de coleta, sendo o mês de março o período no
qual de obteve ERPS com melhor atividade anticoagulante. Apesar de não se ter
observado correlações significativas entre as variações na composição química e
atividade anticoagulante dos ERPS, sugere-se que os parâmetros ambientais podem
ter causado sutis diferenças na estrutura química destes polímeros e,
consequentemente, na sua atividade anticoagulante, como por exemplo, na
distribuição dos grupos sulfatos.
A alga C. cupressoides sintetiza quatro frações ricas em polissacarídeos sulfatados
CCB-0.3, CCB-0.5, CCB-1.0 e CCB-2.0, sendo que a CCB-0.5 apresenta uma potente
ação anticoagulante pelo teste de aPTT.
Foram purificados dois polissacarídeos sulfatados da CCB-0.5 e as análises
químicas e de composição monossocarídica indicaram que se tratam de
glucogalactanas sulfatadas.
As glucogalactanas sulfatadas da C. cupressoides são potentes compostos
anticoagulantes e agem nas vias intrínseca, extrínseca e comum da coagulação.
Análises do mecanismo de ação destes polímeros indicaram que são capazes de inibir
a parcialmente a trombina.
Conclusões 111
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Houve variação significativa no rendimento, composição química e atividade
anticoagulante dos ERPS obtidos das algas verdes C. prolifera, C. racemosa, C.
sertularioides e C. isthmocladum de acordo com o mês de coleta. Além disso,
observou-se que cada alga responde de forma diferente às condições ambientais do
local de coleta. E por isso, podem ou não sintetizar PS com características químicas
diferentes de acordo com o período de coleta das mesmas e, consequentemente,
estes polímeros podem apresentar propriedades farmacológicas distintas.
Referências 112
Mariana Santana S. P. da Costa Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
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Apêndice 126
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APÊNDICE Média mensal de parâmetros ambientais do local de coleta (Praia de Búzios, Nísia Floresta/RN).
Jan 37,0 26,0 0,3 8,5 0,0 606,6 2478,0 44893,3 39530,0 39530,0 31,1 100,8 11052,5 0,7 18,7 122,9 21076,8 70,9 259,1
Fev 35,0 32,0 1,4 8,3 0,0 666,7 3389,4 49156,0 38697,0 38697,0 0,0 129,8 9714,4 0,8 0,0 158,3 18585,6 81,4 205,7
Mar 37,5 36,0 0,0 8,5 0,0 474,1 2887,2 53740,0 39532,4 39532,4 22,3 117,5 10357,1 1,0 13,4 143,3 20531,7 69,9 167,2
Abri 37,5 34,0 0,3 8,2 0,1 416,7 3094,1 52135,0 39540,0 39540,0 0,0 131,9 11250,0 0,7 0,0 160,9 20932,3 191,0 244,7
Mai 37,5 32,0 0,4 8,4 0,1 426,5 3012,1 53050,0 39964,0 39964,0 14,3 98,7 11500,0 1,1 8,6 120,4 21395,4 262,6 276,3
Jun 37,0 30,0 0,4 8,4 0,1 410,7 2393,5 48116,0 38750,0 38750,0 10,2 107,9 10500,0 1,1 6,1 131,6 19446,0 155,2 239,1
Jul 38,0 30,0 1,9 7,5 0,3 375,0 1822,0 45712,0 37592,0 37592,0 0,0 122,5 10000,0 0,8 0,0 149,5 18929,8 151,5 198,4
Ago 38,5 26,0 1,9 8,4 0,0 411,3 3186,4 44732,0 38928,0 38928,0 28,4 85,3 10714,3 1,2 17,1 104,0 19274,0 95,3 250,8
Set 38,5 28,0 2,2 8,3 0,0 442,9 3164,7 47296,0 38996,0 38996,0 0,0 115,4 10476,2 1,5 0,0 140,8 20864,1 38,5 269,9
Out 38,5 31,0 0,3 8,5 0,0 454,5 3063,3 54900,0 39588,0 39588,0 25,1 90,3 12500,0 1,0 15,1 110,2 22988,4 8,2 304,5
Nov 39,5 29,0 0,3 8,2 0,1 428,6 1876,8 58300,0 40444,0 40440,0 0,0 116,6 11909,1 1,0 0,0 142,2 22609,1 4,2 316,7
Dez 38,0 26,0 0,8 6,7 0,0 429,6 2792,0 44132,0 39523,2 39523,2 0,0 126,6 10370,0 0,9 0,0 154,4 21243,4 57,4 281,0
Ferro
(mg/L)
Carbonato
(mg/L)
Bicarbonato
(mg/L)
Cloreto
(mg/L)
Insolação
(h)pH
Nitrogênio
amoniacal
(mg/L)
Sódio
(mg/L)
Potássio
(mg/L)
Sulfato
(mg/L)
Condutividade
elétrica
Sólidos
totais
(mg/L)
Sólidos
dissolvidos
totais (mg/L)
Salinidade
(‰)
Temperatura
(ºC)
Turbidez
(UT)
Precipitação
pluviométrica
(mm)
Alcalinidade
de carbonato
(mg/L)
Alcalinidade de
bicarbonato
(mg/L)