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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
KARLA SAMARA ROCHA SOARES
OBTENÇÃO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL IMUNOADJUVANTE DE NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA NA PRODUÇÃO DE ANTISSOROS CONTRA VENENOS DE SERPENTES E ESCORPIÕES
NATAL
2016
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KARLA SAMARA ROCHA SOARES
OBTENÇÃO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL IMUNOADJUVANTE DE NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA NA PRODUÇÃO DE ANTISSOROS CONTRA VENENOS DE SERPENTES E ESCORPIÕES
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Doutora em Bioquímica.
Orientador: Prof. Dr. Matheus de Freitas Fernandes Pedrosa.
Co-orientador: Prof. Dr. Arnóbio Antônio Silva Júnior.
NATAL 2016
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Dedico este trabalho aos meus pais José Soares e Maria de Fátima, que com
todo amor e dedicação, sempre me apoiaram, me incentivaram e fizeram o
possível e o impossível para tornar realidade mais esta etapa vencida em
minha vida.
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AGRADECIMENTOS
À Deus e Nossa Senhora, por toda proteção, sustentação e graças alcançadas.
Aos meus pais José Soares e Maria de Fátima, pelo incentivo constante, apoio,
amor incondicional e compreensão sempre a mim dedicados.
Ao meu esposo e grande amigo Renan, por todo amor, paciência, amizade e
parceria, estando sempre presente me apoiando em cada decisão e nunca me
deixando desistir.
Ao meu irmão Paulo, pelo carinho, amor, amizade e horas de conversas,
incentivando-me a continuar.
Ao Prof.Dr. Matheus de Freitas pela oportunidade concedida, confiança, estimulo,
paciência, orientação constante e conhecimentos passados, durante esses anos.
Ao Prof.Dr. Arnóbio Silva, pela confiança e co-orientação, a qual foi de fundamental
importância, estando sempre disposto a transmitir conhecimentos e discutir os
resultados obtidos.
Às queridas alunas e amigas, Alessandra Daniele e Fiamma Gláucia, pela dedicação
e auxilio em todas as etapas do trabalho desenvolvido.
Aos amigos e colegas adquiridos no laboratório TecBioFar pela agradável
convivência, auxilio em algumas etapas do trabalho, troca de conhecimentos e
momentos alegres e de descontração.
Aos demais colegas e laboratórios deste Programa de Pós-Graduação, que me
prestaram algum auxílio e contribuíram para a realização deste trabalho.
À CAPES pela provisão da bolsa de Doutorado.
A todos que de alguma maneira colaboraram para a realização deste trabalho.
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“Até aqui nos ajudou o Senhor.” (1 Samuel 7:12)
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RESUMO
Acidentes com animais peçonhentos representam um sério problema de saúde pública em diversos países, destacando-se os acidentes ofídicos e escorpiônicos. No Brasil, as serpentes do gênero Bothrops e os escorpiões pertencentes ao gênero Tityus, são as de maior relevância clínica. O tratamento para o envenenamento consiste em administração de soros antiofídico e antiescorpiônico. Vacinas que utilizam antígenos puros e vias de administração alternativa requerem o uso de adjuvantes potentes e um sistema de entrega de antígeno eficaz. Nanossistemas vêm sendo investigados como sistemas de liberação para macromoléculas terapêuticas. A quitosana, devido as suas propriedades, tem sido extensivamente investigada na formulação de nanocarreadores, particularmente de genes e proteínas. Este estudo teve como objetivo a obtenção de nanopartículas de quitosana (CNP) com base na gelificação iônica para carrear proteínas/peptídeos terapêuticos utilizados na imunoterapia e avaliação do potencial imunoadjuvante dessas nanopartículas na produção de soros antivenenos. CNP foram obtidas por gelificação iônica, com tamanho médio de 160 nm, caracterizadas físico-quimicamente e o perfil de liberação avaliado, demonstrando se tratar de um sistema de liberação modificado. A estabilidade dos sistemas foi avaliada por 7 semanas, observando-se uma maior estabilidade dos sistemas associados aos venenos. Animais experimentais foram imunizados durante 6 semanas com 100 µL de veneno das serpentes através injeções subcutâneas, em diferentes concentrações (5,0 ou 10,0%), encapsuladas em CNP ou associados ao hidróxido de alumínio (HA). Os resultados demonstram que os títulos de anticorpos obtidos para os animais vacinados com os nanossistemas foram equivalentes ou maiores aos obtidos para os animais vacinados com o HA, com a vantagem desses serem menos inflamatórios que o HA, exigindo uma menor quantidade de antígeno a ser administrada, por se tratar de um sistema de libertação modificada, revelando a obtenção de um novo sistema nanoparticulado com potencial aplicação na soroterapia. Palavras-chave: Sistemas de liberação modificados, Biopolímeros, Quitosana, Veneno, Imunoterapia.
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ABSTRACT
Accidents with venomous animals represent a serious public health problem in many countries of the world, with emphasis to snake and scorpion accidents. In Brazil, Bothrops snakes are the most clinically relevant. Regarding scorpions, the genus Tityus includes the species of higher medical importance. Treatment for envenomation consists mainly in the administration of antivenom sera. Vaccines using pure antigens in alternative administration routes require the use of potent adjuvants and an effective antigen delivery system. Nanosystems are being investigated as delivery systems for therapeutic macromolecules. Chitosan, due to its properties, has been extensively investigated in nanocarriers formulations, particularly for genes and proteins. This study aimed to obtain chitosan nanoparticles (CNP) based on ionic gelation for the delivery of therapeutic proteins/peptides used in immunotherapy, as well as to evaluate the immunoadjuvant potential of these nanoparticles in the production of antivenom serums. CNP were obtained by ionic gelation, with an average size of 160 nm. Physicochemical characterization and evaluation of the release profile demonstrated that it is a modified release system. The stability of different systems was evaluated for 7 weeks, observing a greater stability of the systems associated with venoms. Experimental animals were immunized subcutaneously for 6 weeks with 100 uL snake venoms at different concentrations (5.0 or 10.0%), either encapsulated in CNP or associated with aluminum hydroxide (AH). The results demonstrate that the antibody titers observed for animals vaccinated with the studied nanosystems were equivalent or higher than those observed for animals vaccinated with HA. Further advantages of the nanosystems were to be less inflammatory, and to require smaller amounts of antigen to be administered, because it is a modified-release system, with potential application in anti-venom serum therapy. Keywords: Nanosystems, chitosan nanoparticles, venom, immunotherapy.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Serpente Bothrops jararaca ....................................................................... 20 Figura 2. Serpente Bothrops erythromelas. ............................................................... 22 Figura 3. Escorpião Tityus serrulatus. ....................................................................... 24
Figura 4. Representação esquemática da quitosana. Grau de desacetilação (x) variável.. .................................................................................................................... 32 Figura 5. Representação esquemática da estrutura molecular do TPP (Tripolifosfato de Sódio) ................................................................................................................... 34 Figura 6. Esquema de representação das interações químicas formadas entre CH e TPP na formação das nanopartículas via gelificação iônica. .................................... 35 Figura 7. Métodos de incorporação de proteínas às nanopartículas de quitosana. .. 36
Figura 8. Solução de quitosana 0,1% m/v em ácido acético (A) e ............................ 48 Figura 9. Imagens de MEV das nanopartículas de quitosana (A), das nanopartículas contendo peçonha de B. erythromelas (B), de B. jararaca (C) ou Tityus serrulatus (D). ............................................................................................................................ 51 Figura 10. Imagens de AFM das nanopartículas de quitosana (CNP), das nanopartículas contendo peçonha de B. jararaca (CNP/BJ), de B. erythromelas (CNP/BE). Escala de 10 µm. ..................................................................................... 52 Figura 11. FTIR da Quitosana, TPP, Nanopartículas e Nanopartículas associadas aos venenos de serpentes e escorpião. CH (quitosana), CNP (nanopartículas de quitosana) e TPP (A), BSA (B), VTS (veneno de T.serrulatus) (C) e BJ (veneno de B. jararaca), BE (veneno de B. erythromelas) (D). ........................................................ 53 Figura 12. Determinação do perfil eletroforético do veneno das serpentes B. jararaca e B. erythromelas e das nanopartículas com as proteínas do veneno de B. jararaca (CNP+BJ 5 e 10%) e B. erythromelas (CNP+BE 5 e 10%). Gel corado em solução de “Commassie Brillant Blue” R-250. ............................................................................. 55 Figura 13. Determinação do perfil eletroforético do veneno do escorpião T. serrulatus (VTS), do BSA e das nanopartículas com as proteínas do veneno do escorpião (CNP+VTS 5 e 10%) e BSA (CNP+BSA 5 e 10%). Gel corado em solução de Prata. .................................................................................................................................. 56 Figura 14. Estabilidade física das nanopartículas puras e contendo veneno das serpentes nas concentrações 5 e 10% (n=3). ........................................................... 57 Figura 15. Perfil de liberação in vitro de BSA e veneno de T. serrulatus em diferentes concentrações (5 e 10%). ......................................................................... 59
Figura 16. Avaliação dos títulos de anticorpos obtidos a partir de animais imunizados com os adjuvantes hidróxido de alumínio (HA) e nanopartículas de quitosana (CNP) associados aos venenos de B. jararaca e B. erythromelas ***p <0,05 comparando HA/BE 10% e CNP/BE 10%, +++p<0,05 comparando CNP/BE10% com CNP/BE 5% (B). Títulos de anticorpos obtidos do soro de animais imunizados com o veneno de B. jararaca (C), B. erythromelas (D), após diluições seriadas. .................................. 62
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Características físico-químicas das nanopartículas antes e após a
incorporação dos diferentes venenos. CNP (nanopartículas de quitosana), BJ
(veneno de B. jararaca), BE (veneno de B. erythromelas), VTS (veneno de
T.serrulatus). ............................................................................................................. 50
Tabela 2. Valores de coeficiente de determinação (r2), para avaliar o ajuste de
diferentes modelos matemáticos aplicados na cinética de liberação das proteínas. . 60
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LISTA DE ABREVIATURAS
AFM: Microscopia de Força Atômica
BJ: Veneno da serpente Bothrops jararaca
BE: Veneno da serpente Bothrops erythromelas
BCA: Ácido bicinconínico
BSA: Albumina de soro bovino
CNP: Nanopartículas de Quitosana
CH: Quitosana
DP: Desvio padrão
EIP: Eficiência de incorporação de proteínas
ELISA: Ensaio de imunoabsorção enzimática
FDA: Food and Drug Administration
FTIR: Infravermelho por transformada de Fourier
HA: Hidróxido de alumínio
IgG: Imunoglobulina G
IPD: Índice de polidispersão
MEV: Microscopia eletrônica de varredura
NPs: Nanopartículas
OMS: Organização Mundial da Saúde
PBS: Tampão fosfato-salino
SDS-PAGE: Eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio
SLFs: Sistemas de liberação de fármacos
TPP: Tripolifosfato de sódio
VTS: Veneno do escorpião Tityus serrulatus
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 14 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ......................................................................... 18 2.1 ACIDENTES OFÍDICOS .................................................................................. 18 2.1.1 Bothrops jararaca ......................................................................................... 19 2.1.2 Bothrops erythromelas ................................................................................. 21
2.2 ESCORPIONISMO .......................................................................................... 22 2.2.1 Tityus serrulatus ............................................................................................... 23
2.3 SOROTERAPIA ............................................................................................... 25
2.4 NANOPARTÍCULAS ........................................................................................ 28 2.5 QUITOSANA (CH) ........................................................................................... 31 3 OBJETIVOS ....................................................................................................... 37 3.1 OBJETIVO GERAL .......................................................................................... 37
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................... 37 4 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 38 4.1 MATERIAL....................................................................................................... 38
4.2 MÉTODOS ...................................................................................................... 40 4.2.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS ........................................................................ 40 4.2.2 OBTENÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA ........................... 40 4.2.3 INCORPORAÇÃO DAS PROTEÍNAS ÀS NANOPARTÍCULAS .................. 40
4.2.4 ASPECTOS FÍSICO-QUÍMICOS DAS NANOPARTÍCULAS ....................... 41 4.2.4.1 MEDIDAS DE POTENCIAL ZETA E TAMANHO DE PARTÍCULA ............... 41
4.2.4.2 ANÁLISE DE ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO .... 41 4.2.4.3 ESTUDO DA FORMA E DA SUPERFÍCIE DAS NANOPARTÍCULAS .......... 42 4.2.4.4 ENSAIO DE ESTABILIDADE FÍSICA DAS NANOPARTÍCULAS .................. 42
4.2.5 EFICIÊNCIA DE INCORPORAÇÃO ............................................................. 42
4.2.6 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA ..................................... 43 4.2.7 ENSAIO DE LIBERAÇÃO IN VITRO ............................................................ 43
4.2.8 PRODUÇÃO DE ANTICORPOS .................................................................. 44
4.2.9 OBTENÇÃO DOS SOROS .......................................................................... 44 4.2.10 AVALIAÇÃO DOS TÍTULOS DE ANTICORPOS POR ELISA .................. 45
4.2.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................ 45 5 RESULTADOS .................................................................................................. 46
5.1. OBTENÇÃO E ANÁLISE DOS ASPECTOS FÍSICO-QUÍMICOS DAS NANOPARTÍCULAS ................................................................................................. 46 5.2. ENSAIO DE ESTABILIDADE FÍSICA DAS NANOPARTÍCULAS .................... 56 5.3. ENSAIO DE LIBERAÇÃO IN VITRO ............................................................... 58
5.4. AVALIAÇÃO DOS TÍTULOS DE ANTICORPOS NO SORO ........................... 60
6 DISCUSSÃO ...................................................................................................... 64
7 CONCLUSÃO .................................................................................................... 72
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 73 ANEXOS ................................................................................................................... 87
14 1 INTRODUÇÃO
Acidentes com animais peçonhentos representam um sério problema de saúde
pública em diversos países do mundo, destacando-se os acidentes escorpiônicos e
ofídicos. Animais peçonhentos são aqueles que produzem substâncias tóxicas, cuja
atividade farmacológica pode, potencialmente, interferir na sobrevivência de outros
animais (ESPINO-SOLIS et al., 2009), e apresentam um aparelho especializado para
inoculação desta, que passam ativamente através de glândulas que se comunicam
com dentes ocos ou ferrões ou aguilhões (CARDOSO et al., 2003).
Com relação aos acidentes ofídicos, estima-se que 2,4 milhões de
envenenamentos ocorrem a cada ano no mundo, principalmente na Ásia, África e
América Latina, com 94 a 120 mil mortes (GUTIERREZ et al., 2014;
KASTURIRATNE et al., 2008). Serpentes do gênero Bothrops são responsáveis por
90% dos acidentes ofídicos notificados anualmente no Brasil (20-30000 mil), sendo
as serpentes B. jararaca (Sul e Sudeste), B. moojeni (Centro-Oeste), B. atrox (Norte)
e B. erythromelas (Nordeste) responsáveis pela maior parte destes acidentes
(FENWICK et al., 2012; GONÇALVES-MACHADO et al., 2015; JORGE et al., 2015;
OLIVEIRA et al., 2010). Apesar desses acidentes causarem graves sequelas físicas
e psicológicas afetando a qualidade de vida dos acidentados, estes não tem
recebido a devida importância, sendo considerada uma doença tropical
negligenciada (GUTIERREZ et al., 2014).
Acidentes escorpiônicos possuem grande importância médico hospitalar em
virtude de sua incidência e da potencialidade do veneno de algumas espécies que
podem provocar casos clínicos graves e, às vezes fatais, principalmente em crianças
(ZULIANI et al., 2013). No Brasil, acidentes causados por picadas de escorpiões são
a principal causa de envenenamento por animais peçonhentos. Dados do Ministério
da Saúde do Brasil de 2013, indicam que, 114.037 casos de envenenamento por
animais peçonhentos foram notificados, em 2012, dos quais 64.233 (56,3%) foram
15 picadas de escorpião, com 92 mortes registradas, o que corresponde a uma taxa
anual de 32 casos/100.000 habitantes (BUCARETCHI et al., 2014). As espécies de
escorpiões de maior relevância médica no Brasil são do gênero Tityus, entre as
quais destacam-se Tityus serrulatus, Tityus stigmurus e Tityus bahiensis, sendo o
escorpião T. serrulatus o principal causador dos acidentes de maior gravidade
(BUCARETCHI et al., 2014; CHIPPAUX &GOYFFON, 2008; PUCCA et al., 2015).
O tratamento mais eficaz para os pacientes de acidentes ofídicos é a
administração parenteral do soro antiofídico. Este, por sua vez, neutraliza de forma
eficaz o efeito sistêmico do envenenamento, mas não os efeitos locais, que em caso
de acidente botrópico e laquético, observa-se um forte processo inflamatório
(GUTIERREZ et al., 2014; OGUIURA et al., 2014). Para acidentes escorpiônicos
graves, a soro terapia é o tratamento comumente utilizado principalmente em
crianças e em adultos com problemas de saúde anteriores, como doenças
cardiovasculares e hipertensão (AYARI-RIABI et al., 2016; BUCARETCHI et al.,
2014; PUCCA et al., 2015).
Os soros antivenenos rotineiramente produzidos são seguros e eficazes no
tratamento dos acidentes, o uso de imunoadjuvantes nessas formulações é de
grande importância, sendo estes substâncias capazes de potencializar a resposta
imunológica a um antígeno, podendo ser compostos naturais ou sintéticos (LI et al.,
2014; RESENDE et al., 2004). Os adjuvantes contendo sais de alumínio são os
principais utilizados nessas formulações e são aprovados para uso em humanos
pela Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos, sendo o hidróxido de
alumínio e fosfato de alumínio os mais utilizados (LI et al., 2014). No entanto, apesar
de serem aprovados para uso em humanos, estudos recentes trazem preocupações
sobre a toxicidade envolvida com o efeito cumulativo de sais de alumínio (BANSAL
et al., 2014; GUPTA et al., 2000; ROCHA SOARES et al., 2012), além da elevada
16 afinidade desses sais pelos antígenos, podendo reduzir a quantidade desses
disponíveis, resultando em uma resposta imunológica branda (LI et al., 2014).
Nesse contexto, novos imunoadjuvantes a base de biopolímeros vêm sendo
desenvolvidos a fim de maximizar a eficácia de vacinas e soros, reduzir os efeitos
secundários e a toxicidade em comparação com as formulações convencionais
(BANSAL et al., 2014; BORGES et al., 2008). Nanopartículas poliméricas têm
recebido muita atenção como sistemas de entrega de peptídeos, proteínas,
antígenos e genes terapêuticos por várias vias de administração, incluindo
intravenosa e transmucosa oral. Entre os polímeros utilizados para este fim, a
quitosana e os seus derivados têm demonstrado propriedades interessantes para
uso como sistema de liberação e/ou adjuvante para vacinas (AMIDI et al., 2010;
BORGES et al., 2008; RAMPINO et al., 2013; XU & DU, 2003). Dentre estas
propriedades podemos destacar a capacidade de adquirir carga positiva, conferindo-
lhe capacidade de muco-adesão, o que promove uma intensificação da absorção
das proteínas, podendo ainda proporcionar maior estabilidade da substância
encapsulada, capacidade de forte interação eletrostática com peptídeos, proteínas e
ácidos nucleicos também otimizando a estabilidade (RAMESH KUMAR et al., 2016;
TAVARES et al., 2012), e capacidade de imunoestimuladora (AMIDI et al., 2010;
BORGES et al., 2008; RAMPINO et al., 2013).
A aplicação da quitosana como adjuvante em vacinas para imunização pode
proporcionar uma resposta imune consideravelmente mais eficaz, por se tratar de
um sistema de liberação modificado e pela propriedade imunoestimuladora da
quitosana, podendo promover a produção de um título maior de anticorpos em
comparação com formulações convencionais que utilizam o hidróxido de alumínio
como imunoadjuvante, requerendo uma quantidade menor de antígenos a serem
administrados. Esta hipótese foi estabelecida com base em um estudo anterior
realizado por nosso grupo de pesquisa, em que a eficácia das nanopartículas de
17 quitosana foi confirmada na produção do soro contra o veneno do escorpião T.
serrulatus e comparada com o imunoadjuvante tradicional (ROCHA SOARES et al.,
2012). Estudos semelhantes foram desenvolvidos com foco na aplicação da
quitosana como adjuvante de imunização em vacinas contra o Helicobacter pylori
(XIE et al., 2007) e difteria (ZHIMING et al., 2005) e em ambos chegou-se a
conclusão que a associação com quitosana proporciona uma resposta imune
consideravelmente mais eficaz.
Um estudo mais detalhado do emprego da quitosana como adjuvante de
imunização e sistema de liberação modificada na forma nanoparticulada para
veiculação do veneno de animais peçonhentos será de grande importância em
saúde pública, podendo servir de base para a formulação de um novo soro contra as
toxinas do veneno de serpentes e escorpiões.
18 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 ACIDENTES OFÍDICOS
Acidentes ofídicos são um importante problema de saúde pública devido à
sua incidência, morbidade e mortalidade, sendo de grande importância em países
tropicais devido à sua alta incidência, gravidade e pós-efeito (STRAPAZZON et al.,
2015). São considerados também um grande problema de saúde ocupacional, por
ser um motivo constante de morte ou incapacidade crônica para muitos jovens
ativos, especialmente aqueles que estão envolvidos em trabalhos rurais, em várias
partes do mundo (DHARMADASA et al., 2016). Em geral, os acidentes ofídicos são
mais comuns em áreas tropicais e subtropicais, podendo também ocorrer em regiões
com clima temperado (KARABUVA et al., 2016).
No Brasil, as serpentes peçonhentas de interesse em saúde pública são
representadas por quatro gêneros da Família Viperidae: Serpentes do gênero
Bothrops (jararaca, jararacuçu, urutu, caiçaca, comboia), o qual, atualmente, está
agrupado em dois gêneros Bothrops e Botrocophias, Crotalus (cascavel),
Lachesis (surucucu-pico-de-jaca), Micrurus e Leptomicrurus (coral-verdadeira)
(Ministério da Saúde do Brasil, 2014), sendo as serpentes do gênero Bothrops as
responsáveis por 90% dos acidentes ofídicos notificados anualmente no Brasil (20-
30000 mil) (GONÇALVES-MACHADO et al., 2015;. JORGE et al., 2015; FENWICK
et al., 2012).
Os venenos de serpentes constituem uma mistura complexa de componentes
potencialmente tóxicos e não tóxicos, que têm uma gama de efeitos patológicos
sobre as funções vitais. Os venenos das serpentes do gênero Bothrops causam dor
intensa local, hemorragia, necrose de tecidos e inflamação, gerados por uma
complexa variedade de componentes tóxicos que atuam principalmente no sistema
hemostático, causando agregação plaquetária, indução de apoptose, hemorragia e
citotoxicidade. Uma mistura complexa de proteínas tóxicas e as enzimas envolvidas
19 no processo inflamatório, muitas vezes resultam numa resposta crônica, onde
metaloproteinases, anticoagulantes, fosfolipases, L-aminoácidos oxidases e
miotoxinas têm um papel importante na ação do veneno (CARDOSO et al., 2003;
IZIDORO et al., 2014; STRAPAZZON et al., 2015).
2.1.1 Bothrops jararaca
A espécie Bothrops jararaca (Figura1), é uma serpente de hábitos semi-
arborícolas, endêmica de áreas do sul do Brasil, norte da Argentina e nordeste do
Paraguai, distribuindo-se no Brasil nos estados do Espírito Santo, Minas Gerais, Rio
de Janeiro, São Paulo, leste do Mato Grosso, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande
do Sul, sendo esta a principal espécie de serpente causadora de acidentes na região
sudeste do Brasil. Encontra-se distribuída em diversos habitats, ocorrendo em
florestas tropicais decíduas e florestas de terra firme semitropical, a partir do nível do
mar próximo a mais de 1000 m de altitude (DE MOURA et al., 2015; GONÇALVES-
MACHADO et al., 2015; SAZIMA, 1992).
O tamanho médio dessas serpentes é de 100 cm, mas os maiores
exemplares observados apresentam até 150 cm, podendo atingir até 160 cm. Seu
padrão de coloração é bastante variável, com manchas marrons escuras dispostas
em faixas entremeadas por áreas claras, cinzas, oliváceas, amareladas e beges. As
manchas escuras de formas triangulares distribuem-se em ambos os lados do corpo,
de modo que os ápices dos triângulos fiquem sobre a linha média dorsal, dispondo-
se em posição total, parcial ou justaposto (GONÇALVES-MACHADO et al., 2015;
SAZIMA, 1992).
20
Figura 1. Serpente Bothrops jararaca Fonte: Adaptado de GONÇALVES-MACHADO et al.,2015.
Com relação ao veneno produzido por estas serpentes, dentre as substancias
que o compõem, podemos destacar as metaloproteases, que representam mais de
53% das proteínas transcritas em viperídeos, encontrando-se em grande quantidade
no veneno destas serpentes (CIDADE et al., 2006), desempenhando um papel
importante no envenenamento, causando hemorragia, necrose tecidual grave e
inibição da agregação de plaquetas no organismo da vítima (DE MOURA et al.,
2015; MARQUES-PORTO et al., 2008). Várias metaloproteases têm sido isoladas a
partir do veneno de Bothrops jararaca, como fator hemorrágico 3 (HF3), bothropasin
e jararhagin, sendo dentre estas a mais estudada a jararhagin que trata-se de uma
metaloprotease de 52 kDa, com atividade fibrinogenolítica e hemorrágica (DA SILVA
et al., 2012; LAING & MOURA-DA-SILVA, 2005).
A serpente B. jararaca produz, em média, 25 mg a 300 mg de veneno
altamente tóxico, cuja dose letal média (DL50) para camundongos é de 1,4 mg/kg
por via intraperitoneal, 1,2 mg/kg por via intravenosa, 3 mg/kg por via subcutânea
(GONÇALVES-MACHADO et al., 2015). O quadro clínico típico de envenenamento,
em humanos incluem inchaço local, petéquias, hematomas e bolhas no membro
afetado, hemorragia sistêmica espontânea em vários órgãos, hemorragia
subconjuntival e distúrbios de coagulação. Os sintomas sistêmicos podem ser
potencialmente fatais e podem envolver distúrbios na hemostasia, hemorragia
21 intracraniana, choque e insuficiência renal (CARDOSO et al., 2003; DE MOURA et
al., 2015; GONÇALVES-MACHADO et al., 2015; GUTIERREZ & LOMONTE, 2003).
2.1.2 Bothrops erythromelas
A serpente B. erythromelas (Figura 2) conhecida como jararaca-da seca ou
malha de cascavel, é uma serpente venenosa de pequeno porte, podendo atingir até
56 cm quando adulta. Seu padrão de coloração é marrom avermelhado, sendo sua
cabeça marrom e o dorso marrom avermelhado com uma dupla série de marcações
triangulares pretas e castanho-escuros, que podem ser alternadas (JORGE et al.,
2015). Abundante nas áreas litorâneas e úmidas da região Nordeste, encontra-se
amplamente distribuída desde o estado da Bahia até o Ceará, tem como habitat
natural a região da caatinga, sendo umas das principais serpentes responsáveis
pelos acidentes ofídicos na região Nordeste do Brasil (SANTOS, 2011; JORGE et
al., 2015).
Seu veneno assim como nos demais venenos botrópicos, possui atividades
coagulante, hemorrágica e proteolítica, porém, não apresenta em sua peçonha
toxinas tipo trombina-serino proteases, que atuam diretamente sobre a molécula de
fibrinogênio, encontradas em outros venenos botrópicos. A atividade coagulante
encontrada no veneno de B. erythromelas é devido à presença de toxinas pró-
coagulantes ativadoras do Fator II e X que levam a formação de trombina endógena
(MARUYAMA et al., 1992; JORGE et al., 2015).
22
Figura 2. Serpente Bothrops erythromelas. Fonte: Adaptado de JORGE et al., 2015.
2.2 ESCORPIONISMO
O termo escorpionismo refere-se ao quadro do envenenamento causado
pelas toxinas presentes na peçonha de espécies de escorpiões, diagnosticado e
decorrente de acidentes favorecidos por situações de risco como presença de
escorpiões no campo e em focos urbanos, lixo, desequilíbrio ambiental, ambientes
novos de dispersão e procriação, falta de infra-estrutura e consciência da população
a respeito do problema (ALBUQUERQUE et al., 2004). Este tipo de acidente pode
ter um grande impacto na perda de potencial humano e produtividade econômica
(AYARI-RIABI et al., 2015).
O envenenamento por picada de escorpião ainda representa grave problema
de saúde pública em países de clima tropical e subtropical. Aproximadamente cinco
milhões de acidentes escorpiônicos são registrados a cada ano no mundo
(principalmente na África, Ásia e América Latina, regiões subtropicais) (AYARI-RIABI
et al., 2015; RIBEIRO et al., 2010). No Brasil são notificados aproximadamente
10.000 acidentes por ano e 50% desses casos ocorrem nos estados de São Paulo e
Minas Gerais (RIBEIRO et al., 2010; ROCHA SOARES et al., 2012).
Mundialmente existem cerca de 2.069 espécies de escorpiões registrados,
subdivididos em 197 gêneros e 15 famílias (PUCCA et al., 2015a). A família
23 Buthidae apresenta cerca de 34 espécies consideradas potencialmente perigosas
para os seres humanos, incluindo espécies do gênero Tityus (CHIPPAUX &
GOYFFON, 2008). No Brasil, o principal escorpião relatado e de maior importância
médica é o Tityus serrulatus, que é hoje considerada a espécie de escorpião mais
perigosa e com uma ampla distribuição no país (BUCARETCHI et al., 2014; ROCHA
SOARES et al., 2012; PUCCA et al., 2015a).
2.2.1 Tityus serrulatus
A espécie T. serrulatus (Figura 3), conhecido popularmente como escorpião-
amarelo, é considerada a mais venenosa da América do Sul sendo responsável pela
maior parte dos eventos fatais notificados, especialmente em crianças (FIALHO et
al., 2011; TORRES et al., 2002; ZULIANI et al., 2013). Podem ser identificadas por
suas características morfológicas sendo as principais as pernas e cauda amarelo-
claras com o tronco escuro e a presença de uma serrilha nos 3º e 4º anéis da cauda.
O corpo do escorpião pode ser dividido anatomicamente em prosoma (cefalotórax),
mesosoma (abdómen) e metasoma (cauda), ligando o último segmento ao telson,
onde se encontram um par de glândulas secretoras de veneno, sendo este o
aparelho inoculador do veneno na presa. Medindo de 6 a 7 cm de comprimento
quando adulto, sua reprodução é partenogenética, o que junto com sua alta
adaptabilidade aos ambientes urbanos facilita sua alta disseminação e elevado
número de acidentes (BERGERON & BINGHAM, 2012; CHIPPAUX & GOYFFON,
2008; PUCCA et al., 2015a).
24
Figura 3. Escorpião Tityus serrulatus. Fonte: Adaptado de BUCARETCHI et al., 2014.
O veneno produzido pelo escorpião T. serrulatus é composto por uma mistura
de substâncias incluindo muco, sais inorgânicos, lipídeos, peptídeos
antimicrobianos, hialuronidases, peptídeos sem ligações dissulfeto com atividade
vascular, como hipotensinas e principalmente neurotoxinas de baixa massa
molecular (CERNI et al., 2014; COLOGNA et al., 2009; PUCCA et al., 2015a). As
neurotoxinas são os componentes do veneno do escorpião mais estudados devido à
sua relevância clínica, sendo os maiores responsáveis pela síndrome do
envenenamento, e ação farmacológica específica sobre os canais iônicos,
principalmente de sódio e potássio (COLOGNA et al., 2009; ORTIZ et al., 2014;
PUCCA et al., 2015a, 2015b; ZULIANI et al., 2013). Outras toxinas capazes de
reconhecer os canais de cálcio e cloro também são encontradas no veneno do
escorpião (ESPINO-SOLIS et al., 2009).
A ativação dos canais de sódio e/ou bloqueio dos canais de potássio têm
como consequência uma liberação excessiva de neurotransmissores nas vias de
transdução de sinais neuronais, essa ação sinérgica de várias toxinas resulta em
manifestações clínicas como dor, edema pulmonar, eritema, parestesia, vômitos e
diaforese (BATISTA et al., 2007). Alguns outros constituintes como enzimas
hialuronidases, proteases e fosfolipases presentes na peçonha, degradam os
constituintes da matriz extracelular e contribuem para a dispersão do veneno pelos
25 tecidos e demais sintomas associados ao envenenamento (CARMO et al., 2015). Os
acidentes escorpiônicos ocasionados por T. serrulatus provocam dor local, com
intensidade variável, podendo ser acompanhada por náuseas, suores, taquicardia,
febre, e agitação. O envenenamento moderado é caracterizado por sudorese, dor
epigástrica, obstrução pulmonar, cólicas, vômitos, hipotensão, diarreia, bradicardia e
dispneia. Já no envenenamento grave, que geralmente afeta as crianças e idosos, o
acidentado pode apresentar diversas complicações, tais como insuficiência
cardiorrespiratória, podendo ser letal (CHIPPAUX & GOYFFON, 2008; PUCCA et al.,
2015a; ZULIANI et al., 2013).
2.3 SOROTERAPIA
Ao longo dos anos vários estudos foram desenvolvidos na busca de soros e
vacinas eficazes. O resultado desses esforços forneceram ferramentas para obter
anticorpos humanos contra alvos específicos, fabricados por empresas
biotecnológicas dedicadas à produção de anticorpos terapêuticos. Os antivenenos
mais conhecidos disponíveis são aqueles dirigidos contra serpentes, escorpiões e
aranhas (ESPINO-SOLIS et al., 2009). A soroterapia convencional continua a ser o
único tratamento específico de envenenamento tanto para serpentes, escorpiões,
aranhas quanto para animais marinhos. Envolve basicamente a aplicação de
fragmentos de anticorpos para inativar e acelerar a depuração de componentes do
veneno relevantes no sistema da vítima (ALVARENGA et al., 2014).
O soro antiofídico é o tratamento atual mais eficaz para os pacientes de
acidentes com serpentes. Este, por sua vez, neutraliza muito bem o efeito sistêmico
do envenenamento, mas não os efeitos locais, que em caso de acidente botrópico e
laquético, observa-se um forte processo inflamatório (ESPINO-SOLIS et al., 2009;
GUTIÉRREZ et al., 2014; OGUIURA et al., 2014). Os antivenenos disponíveis às
vezes podem não neutralizar satisfatoriamente os efeitos causados pelo
envenenamento no paciente, fato este que pode ser explicado pela ideia de que o
26 antiveneno produzido pode não conter anticorpos específicos contra determinado
componente tóxico do veneno (ESPINO-SOLIS et al., 2009), o que vêm levando à
estudos mais aprofundados dos componentes do veneno através de técnicas e
estratégias para avaliação das toxinas que o compõem, "venomics", de forma direta
(por meio de análise proteômica) e indiretamente (através do transcriptoma da
glândula de veneno), sendo um estudo relevante para a produção de anticorpos com
maior especificidade e ação protetora (ESPINO-SOLIS et al., 2009; GONSALVES-
MACHADO et al., 2015; ALVARENGA et al., 2014).
Alguns antivenenos produzidos mundialmente são polivalentes, ou seja,
podem neutralizar o veneno de mais de uma espécie de serpentes; outros são
monovalentes, preparados usando o veneno de única espécie de serpente
(ESPINO-SOLIS et al., 2009). O tratamento para envenenamento botrópico, no
Brasil, envolve o uso de um soro antibotrópico equino polivalente (ou antibotrópico-
laquético) F(ab')2 preparado por imunizações em horários convencionais com um
pool de venenos de cinco espécies de serpentes do gênero Bothrops: B. jararaca, B.
jararacussu, B. moojeni, B. alternatus e B. neuwiedi (JORGE et al, 2015; OGUIURA
et al, 2014).
Com relação aos acidentes escorpiônicos, no Brasil, o tratamento utilizado
para casos leves baseia-se principalmente no alívio da dor pela administração de
lidocaína a 2% sem vasoconstritor no local da picada ou por administração de
analgésicos, por via oral ou parenteral. Nos casos de envenenamento grave a
administração do antiveneno por via intravenosa é obrigatória (PUCCA et al.,
2015a). No Brasil, o soro antiveneno de escorpião é rotineiramente produzido
imunizando-se cavalos. Embora este soro heterólogo tenha demonstrado ser eficaz
na redução da taxa de mortalidade em casos de acidentes, algumas complicações
graves podem acontecer com seu uso, como choque anafilático e doença do soro,
sendo assim estudos vêm sendo desenvolvidos avaliando a utilização de anticorpos
27 recombinantes para a produção desses antivenenos, o que poderia atenuar esses
efeitos colaterais. Alguns problemas também são relatados com relação a sua
produção, na obtenção de quantidades suficientes de veneno para o processo de
imunização e de amostras de soro com quantidade de anticorpos relevantes
(PUCCA et al., 2015a; RONCOLATO et al., 2015).
Enquanto a pesquisa por vacinas ainda estava em desenvolvimento, estudos
já reportavam que adicionando certos compostos a um inóculo poderia se elevar a
resposta imune obtida. Os adjuvantes são compostos que melhoram a resposta
imunológica contra um determinado antígeno, potencializando-a, podendo ser
compostos naturais ou sintéticos (AGUILAR & RODRIGUEZ, 2007; LI et al., 2014).
O uso de adjuvantes em vacinas é particularmente importante quando o
antígeno possui baixa imunogenicidade, no entanto muitos problemas são
encontrados no desenvolvimento e utilização de adjuvantes em vacinas,
principalmente em humanos (AGUILAR & RODRIGUEZ, 2007; ROCHA SOARES et
al., 2012; SCHERLIES et al., 2013). A escolha de um adjuvante para uma
determinada vacina deve ser associada ao poder adjuvante desta substância e ao
nível aceitável de efeitos adversos.
Vários mecanismos são propostos para explicar a eficiência dos adjuvantes e
como tais moléculas podem potencializar a resposta da vacina ao antígeno. Os
adjuvantes podem induzir inflamação local aumentando o contato do antígeno com
células adicionais que são atraídas para o local, formar um depósito de antígeno
liberando-o mais lentamente e prolongando assim sua interação com o macrófago,
podem também aumentar a velocidade e duração da resposta imune, modular a
avidez, a especificidade, estimular a imunidade mediada por células, e aumentar a
resposta imunológica em indivíduos imunologicamente imaturos ou senis
(RESENDE et al., 2004).
28
O principal adjuvante aprovado para uso em vacinas humanas é o hidróxido
de alumínio, que forma um depósito insolúvel no local da injeção, a partir de onde os
antígenos são solubilizados lentamente, sendo a eficiência de adsorção considerada
critica (AGUILAR & RODRIGUEZ, 2007; GUPTA et al., 2000; LI et al., 2014;
SCHERLIES et al., 2013). Relatos de incidências de toxicidade e efeitos colaterais
dos sais de alumínio têm levantado preocupações sobre sua segurança,
principalmente em vacinas infantis. Estes efeitos incluem reações locais menores,
como dor e eritema, nódulo no local da injeção, e sistêmicas que podem incluir febre,
mal-estar, calafrios, dores gerais e dor de cabeça (BANSAL et al., 2014; KIM &
KANG, 2008).
Nesse contexto, novas tecnologias vêm sendo adaptadas na busca de novos
imunoadjuvantes que possam potencializar a ação das vacinas e soros, minimizando
as reações adversas relacionadas ao uso dos adjuvantes tradicionais.
Nanocarreadores vêm sendo descritos na literatura por terem propriedades
adjuvantes, serem facilmente fagocitadas, protegerem o antígeno da degradação,
mantendo sua antigenicidade, garantindo uma apresentação ótima, com uma dose
controlada de forma segura e eficiente (AYARI-RIABI et al., 2015; KIM & KANG,
2008; SCHERLIES et al., 2013). Sendo assim, a utilização de biopolímeros, como a
quitosana, na forma nanoparticulada, vem sendo bastante estudados para essa
finalidade, sendo uma alternativa na busca de um novo adjuvante de imunização
mais eficiente e seguro.
2.4 NANOPARTÍCULAS
Nos últimos anos, esforços significativos vêm sendo dedicados a aplicação da
nanotecnologia no controle da liberação de fármacos e proteínas em sítios de ação
específicos, através da utilização de vetores capazes de permitir a otimização da
velocidade de liberação de substâncias, como fármacos e agentes bioativos. Sendo
assim, a nanotecnologia tem recebido muita atenção para aplicação em várias
29 áreas, tais como a indústria têxtil, agricultura, ciência forense e biomedicina (HAMIDI
et al., 2008; NAHAR et al., 2006; TAVARES et al., 2012). Na área farmacêutica, a
nanotecnologia concentra-se na formulação de agentes terapeuticamente ativos
biocompatíveis, tais como nanopartículas, sistemas micelares, lipossomas e
conjugados (HAMIDI et al.,2008).
O termo nanopartículas refere-se a partículas de tamanho variável, entre 10 e
1000 nm. As nanopartículas podem ser classificadas em nanoesferas e em
nanocápsulas, de acordo com a composição e organização estrutural (HAMIDI et
al.,2008; SAHOO & LABHASETWAR, 2003). As nanoesferas são constituídas de
uma densa matriz polimérica e o fármaco, portanto, encontra-se homogeneamente
disperso ou dissolvido em seu interior. Desta forma, obtém-se um sistema
monolítico, que não apresenta um núcleo definido. Já as nanocápsulas, são
denominadas de sistema tipo reservatório e, ao contrário do anterior, apresenta
núcleo bem definido. Este núcleo pode ser sólido ou líquido. Neste caso, a
substância encontra-se em um invólucro polimérico ao redor do núcleo de natureza
oleosa. Ou seja, a diferença morfológica entre a forma farmacêutica de nanoesferas
(sistema polimérico matricial) e nanocápsulas (sistema polimérico do tipo
reservatório) é o que classifica o sistema (HAMIDI et al., 2008; KUMARI et al., 2010;
RAO & GECKELER, 2011).
Sistemas baseados em biopolímeros têm sido estudados como produtos
farmacêuticos para obtenção de sistemas de liberação controlada devido as suas
potencialidades terapêuticas, como estabilidade no sangue e demais fluidos
biológicos, assim como durante o armazenamento e baixa toxicidade (HAMIDI et al.,
2008; NAHAR et al.,2006; SCHAFFAZICK et al., 2003; TAVARES et al., 2012).
Na liberação modificada de fármacos e/ou biomoléculas algumas vantagens
foram atribuídas ao desenvolvimento de nanopartículas poliméricas, entre elas, o
tamanho reduzido e consequente maior área de superfície, que resulta em aumento
30 da taxa de dissolução e biodisponibilidade. Outras vantagens incluem a diminuição
da dose administrada, redução da toxicidade, aumento da permeabilidade da
substância encapsulada e possibilidade de alterar a carga e a constituição de sua
superfície por meio de funcionalizações o que está diretamente relacionado com a
especificidade de sua interação com a membrana celular (KIM & KANG, 2008; LEE
et al., 2011; XU & DU, 2003). Alguns destes polímeros têm sido aprovados e
amplamente estudados, para administração em humanos, tais como Poli (L-Ácido
lático co-Glicólico) (PLGA), policaprolactona (PCL), gelatina, quitosana, Poli-DL
Ácido Lático (PDLLA) e polietilenoglicol (PEG) (AYARI-RIABI et al.,2015; BANSAL et
al., 2014; SON & KIM, 2010; TAVARES et al., 2012; WOITISKI et al., 2009).
Estudos utilizando alguns desses polímeros como sistemas de liberação e/ou
adjuvantes de imunização vêm sendo amplamente desenvolvidos, sendo obtidos
resultados favoráveis. Nanopartículas de PLGA, utilizadas como adjuvante de
imunização contra o veneno do escorpião Tityus serrulatus e de abelhas foram
desenvolvidas na busca de uma resposta imune mais eficaz (AYARI-RIABI et
al.,2015; TRINDADE et al., 2012), estudos também foram desenvolvidos utilizando
essas nanopartículas na gene terapia para encapsulação e transporte de DNA (SON
& KIM, 2010) e como sistema de liberação para a insulina (ANDREAS et al., 2011).
Nanoparticulas de quitosana demonstraram eficiência de encapsulação satisfatória
para o antígeno da Hepatite B e posteriormente foram utilizadas para imunização
intranasal e subcutanea (KIM & KANG, 2008; BORGES et al., 2008), e na gene
terapia recentemente utilizadas em estratégias de silenciamento de genes, para o
controle da proliferação do mosquito Aedes aegypti (KUMAR et al., 2016), também
foram estudadas para o desenvolvimento de vacinas de DNA contra o vírus da gripe
suina (ZHAO et al., 2011). Em um outro estudo nanopartículas de quitosana
conjugadas com PEG, foram desenvolvidas de forma satisfatória para encapsulação
da insulina, e posterior administração por via oral (WOITISKI et al., 2009).
31
Poucos são os trabalhos utilizando a quitosana como adjuvantes de vacinas
antivenenos, no entanto o veneno da serpente Naja naja oxiana foi encapsulado em
nanoparticulas de quitosana com uma alta eficiencia de encapsulação, no entanto
não foram realizados testes de imunização (MOHAMMADPOURDOUNIGHI et al.,
2010). Em um trabalho desenvolvido em nosso grupo de pesquisa o veneno do
escorpião Tytius serrulatus foi encapsulado à nanopartículas de quitosana, e estas
testadas como adjuvantes de imunização, sendo obtidos um titulo de anticorpos
consideravelmente mais elevados quando comparado aos obtidos na imunização
com o adjuvante convencional (ROCHA SOARES et al., 2012).
2.5 QUITOSANA (CH)
A quitosana, (1-4)2-amino-2-deoxi-b-D-glucana, biopolímero catiônico em
meio ácido, resultante da desacetilação da quitina, podendo ser encontrada em
alguns microrganismos como algas e fungos (ANTONIOU, et al., 2015; IEVA et al.,
2009; PAPADIMITRIOU et al., 2008; RAMPINO et al., 2013). Têm como uma das
principais características físico-químicas o percentual de grupos amina livres, que
interfere na solubilidade, e viscosidade, além de muitas das aplicações biológicas
(RAVI KUMAR, 2000; ANTONIOU et al., 2015). Sua natureza catiônica confere ao
polímero a capacidade de bioadesão e aumento da permeabilidade de membrana,
permitindo a passagem de grandes moléculas através da superfície da mucosa,
podendo aumentar a absorção da substância administrada (AMIDI et al., 2010;
PAPADIMITRIOU et al., 2008; XU & DU, 2003).
32
Figura 4. Representação esquemática da quitosana. Grau de desacetilação (x) variável. Adaptado de: AMIDI et al., 2010.
Esse biopolímero vem sendo amplamente utilizado na agricultura e nas
indústrias farmacêuticas, de cosméticos e de alimentos devido as suas propriedades
biológicas, dentre as quais podemos destacar a biocompatibilidade,
biodegradabilidade, atividade antimicrobiana, analgésica e cicatrizante, não
toxicidade e imunomodulação (ANTONIOU et al., 2015; BORGES et al., 2008; IEVA
et al., 2009; OKAMOTO et al., 2003; RAMPINO et al., 2013).
A natureza catiônica da quitosana tem sido explorada para o desenvolvimento
de sistemas particulados para liberação de medicamentos e proteínas.
Macromoléculas com carga negativa, tais como, peptídeos, proteínas, antígenos,
oligonucleotídeos, DNA e RNA podem ser eficientemente encapsulados às
nanopartículas de quitosana, devido ao seu caráter catiônico, estabelecendo uma
forte interação eletrostática com essas moléculas (ANTONIOU et al., 2015; GAN et
al., 2005; KOPPOLU et al., 2014; PAN et al., 2002; ROCHA SOARES et al., 2012;
VIMAL et al., 2013). Além disso, as nanopartículas de quitosana apresentam
capacidade para atravessar as barreiras biológicas, protegem as macromoléculas de
degradação em meios biológicos, e agem como sistemas de liberação controlada,
liberando macromoléculas num tecido ou célula alvo em uma taxa de liberação
desejada (IEVA et al., 2009; PAPADIMITRIOU et al., 2008).
A preparação das nanopartículas pode ser realizada utilizando métodos
diferentes, os quais podem envolver um ou dois tipos de associações entre as
33 moléculas de quitosana, como a reticulação covalente, com o auxilio de um agente
de reticulação (glutaraldeído, genipina, tripolifosfato), e interações físicas, onde as
nanopartículas são obtidas como resultado de uma diminuição da energia livre
proveniente da associação das moléculas de polímero (TAVARES et al., 2012).
Dentre os métodos de obtenção das nanopartículas de quitosana, podemos destacar
os seguintes: método de atomização por spray-drying, gelificação iônica,
complexação de polieletrólito, coacervação/precipitação, dessolvatação,
coalescência e emulsão com evaporação de solvente, apresentando cada método
suas vantagens e desvantagens (AGNIHOTRI et al., 2004; HAMIDI et al., 2008;
TAVARES et al., 2012).
A seleção do método de preparação de nanopartículas depende de diversos
fatores, tais como: o tamanho da nanopartícula que se pretende, a solubilidade do
fármaco utilizado, a estabilidade da substância a ser incorporada frente ao processo
de obtenção (por exemplo, ao aquecimento), o tipo de polímero empregado, a via de
administração escolhida e a toxicidade residual que provém principalmente dos
solventes envolvidos no processo de produção das nanopartículas (AGNIHOTRI et
al., 2004).
Quando o uso pretendido do sistema nanoparticulado em desenvolvimento é
a administração de fármacos/proteínas, é de grande importância a capacidade de
controlar as suas características físico-químicas, tais como tamanho de partícula,
distribuição de tamanho e carga de superfície, uma vez que estes fatores podem
influenciar significativamente a cinética de liberação. Estudos demonstram que
partículas de maior diâmetro, tendem a aumentar a taxa de liberação de fármacos e
proteínas encapsuladas (KOPPOLU et al., 2014).
A técnica de gelificação iônica é um método de obtenção de nanopartículas
de quitosana reticuladas extremamente vantajoso, pois se trata de um procedimento
simples, que não necessita de solventes orgânicos e gera partículas de tamanho
34 controlável com capacidade de encapsulamento satisfatória para fármacos e
macromoléculas como proteínas e peptídeos (PAPADIMITRIOU et al., 2008;
RAMPINO et al., 2013). Este processo de gelificação se dá pela formação de
ligações cruzadas inter e intramoleculares mediadas por poliânions que se
comportam como reticulantes. Dentre os agentes reticuladores empregados, o
tripolifosfato polianiônico (TPP) (Figura 5) é um dos mais utilizados devido a
biocompatibilidade, baixa toxicidade e alta reatividade química na gelificação
(ANTONIOU et al., 2015; GAN et al., 2005; PAPADIMITRIOU et al., 2008; SHU&
ZHU, 2000).
Figura 5. Representação esquemática da estrutura molecular do TPP (Tripolifosfato de Sódio) Adaptado de: PAPADIMITRIOU et al., 2008.
A formação das nanopartículas de quitosana reticuladas com TPP ocorre
através de interações iônicas, entre os grupos fosfato do TPP e os amínicos da
quitosana, formando ligações cruzadas entre as cadeias de quitosana, originando
assim moléculas com propriedades físico-químicas diferentes (GAN & WANG, 2007;
JANES et al., 2001; NASTI et al., 2009; RAMPINO et al., 2013). Este mecanismo
baseia-se no fato de que em meio ácido, as moléculas de TPP são dissociadas em
ânions P3O105−, e os grupamentos amina da quitosana ficam carregados
positivamente, ocorrendo assim o processo de reticulação, onde os ânions do TPP
estão completamente envolvidos no processo de reticulação estando na proporção
35 de 1 ânion de TPP para 5 grupamentos amina da quitosana (rPA=0,2), de acordo
com a figura 6 (YANG et al., 2007).
Figura 6. Esquema de representação das interações químicas formadas entre CH e TPP na formação das nanopartículas via gelificação iônica.
Adaptado de: YANG et al., 2007.
A incorporação das proteínas aos nanossistemas pode ser promovida por três
métodos diferentes: A proteína pode ser inserida ao sistema durante o processo de
formação das nanopartículas de diferentes formas: (i) podendo ser adicionada na
solução de quitosana ou (ii) na solução de TPP, (iii) como também pode ser feita
através da adição das proteínas ao sistema de nanopartículas já formado, mantendo
sob agitação magnética por um determinado tempo (KIM & KANG, 2008) (Figura 7).
A taxa de incorporação das proteínas pode variar dependendo do método
empregado e das características da proteína a ser incorporada.
36
Figura 7. Métodos de incorporação de proteínas às nanopartículas de quitosana. Adaptado de: KIM & KANG, 2008
Esses nanossistemas formados por nanopartículas de quitosana apresentam
algumas características que os tornam atrativos para a encapsulação e liberação de
macromoléculas. São vantajosos em comparação com outros sistemas de
nanopartículas, por formar partículas de tamanho homogêneo e ajustável, em
condições brandas (GAN et al., 2005), além do fato de que as partículas obtidas
apresentam uma carga de superfície positiva que pode ser facilmente modulada e,
ainda, possuem uma grande capacidade para a associação de peptídeos, proteínas,
oligonucleotiídeos e plasmídeos (SHU & ZHU, 2000; JANES et al., 2001).
Assim, um estudo mais detalhado da aplicação de nanopartículas de
quitosana obtidas por gelificação iônica, como um adjuvante em vacinas para
imunização na obtenção de soros antivenenos, pode ser de grande importância em
saúde pública podendo servir como base para a formulação de um novo soro
antiveneno.
37 3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Obtenção e caracterização de nanopartículas de quitosana e avaliação do
potencial imunoadjuvante na produção de antissoros contra os venenos das
serpentes Bothrops jararaca e Bothrops erythromelas e do escorpião Tityus
serrulatus.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Obter as nanopartículas de quitosana pela técnica de gelificação iônica e estudar
os parâmetros de encapsulação e liberação das proteínas/peptídeos que
compõem os venenos nos nanossistemas;
Determinar as características físico-químicas dos sistemas obtidos: Diâmetro
médio e distribuição do tamanho de partículas, potencial zeta, forma e superfície
das partículas por MEV e AFM, e avaliar a estabilidade física dos nanossistemas;
Imunizar animais de experimentação com os venenos das serpentes associados
aos adjuvantes: hidróxido de alumínio e nanopartículas de quitosana;
Obter amostras de soro dos animais (camundongos) imunizados e avaliar os
títulos de anticorpos pela técnica de ELISA.
38 4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 MATERIAL
Peçonha de escorpiões T. serrulatus e das serpentes B. jararaca, B.
erythromelas – Instituto Butantan; Patrimônio genético n°010843/2013-2.
Albumina de soro bovino (BSA) – Sigma-Aldrich (EUA);
Quitosana (80% desacetilada, massa molecular viscosimétrica de 5,2 x 105 g
mol-1) - Sigma-Aldrich (EUA);
Tripolifosfato de sódio - Sigma-Aldrich (EUA);
Padrão de albumina de soro bovino (BSA) – BioAgency (Brasil);
Minigel (Mini-ProteanTM II) – Bio-Rad Lab (EUA);
Acrilamida e Bisacrilamida – Biosystems (Brasil);
Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) – Biosystems (Brasil);
Tris-Hidrocloreto (Tris-HCl) – Biosystems (Brasil);
Persulfato de Amônio (PSA) – Biosystems (Brasil);
Tetrametiletilenodiamina (TEMED) – Biosystems (Brasil);
Marcador de massa molecular – Gibco/BRL Life Technologies (EUA);
Corante Commassie Brillant Blue R-250 – Bio-Rad Lab (EUA);
Kit de quantificação de proteínas BCA Protein Assay kit – Pierce
Biotechnology (EUA);
Sistema purificador de água por osmose reversa, modelo OS50 LX – Gehaka
(Brasil);
Analisador de potencial zeta e tamanho de partículas, ZetaPlus - Brookhaven
Instruments (EUA);
Microcentrífuga 5418R – Eppendorf (Alemanha);
Microscópio de Eletrônico de Varredura SSX550 – Shimadzu (Japão);
Microscópio de Força Atômica SPM-9700 – Shimadzu (Japão);
39
Leitora de microplaca Epoch™ Microplate Spectrophometer – BioTek (EUA);
Concentrador de amostras Centrivap Labconco – Kansas City (EUA);
Espectrofotômetro de FTIR, modelo IRPrestige-21 – Shimadzu (Japão).
40 4.2 MÉTODOS
4.2.1 ANIMAIS EXPERIMENTAIS
Foram utilizados camundongos BALB/c machos (25-35 g) de 6 a 8 semanas
de idade, provenientes do Biotério setorial do Centro de Ciências da Saúde da
UFRN. Os animais foram mantidos em condições de temperatura controlada (22 ± 2
°C), ciclo claro/escuro de 12 horas e com livre acesso a água e ração comercial. Os
animais foram mantidos na sala de experimento durante pelo menos uma hora antes
da realização dos testes, para adaptação. Os experimentos foram realizados de
acordo com as orientações para os cuidados com animais de laboratórios.
Os protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso
de Animais (CEUA) do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte sob o protocolo de número 003/2012.
4.2.2 OBTENÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA
As nanopartículas de quitosana para a incorporação do veneno de B.
erythromelas, B. jararaca e T. serrulatus foram obtidas através da técnica de
gelificação iônica. Para tanto, foram preparadas soluções de quitosana 0,1% em
solução de ácido acético 0,175%, (pH = 4,0), com um volume total de 5 mL, e
soluções de TPP 0,1% em água destilada (pH = 9,0). Dois mililitros da solução de
TPP foi vertida na solução de quitosana, por gotejamento, sob agitação constante
(700 rpm) e a temperatura ambiente, por 30 minutos, até se observar a formação de
uma dispersão opalescente com um volume total de 7 mL (pH = 5,0) (GAN & WANG,
2007).
Todos os experimentos foram efetuados em triplicata e os dados expressos
como média ± desvio padrão.
4.2.3 INCORPORAÇÃO DAS PROTEÍNAS ÀS NANOPARTÍCULAS
Os venenos do escorpião e das serpentes foi dissolvido em água estéril de
modo a se obter uma solução na concentração de 1 mg/mL. Desta solução inicial
41 foram retiradas alíquotas para compor soluções de veneno/TPP nas concentrações
5, 10 e 15% e mantidas a uma temperatura de 8 ± 2 ºC. As concentrações das
proteínas dos venenos incorporados às nanoparticulas foram estabelecidas com
relação à concentração de quitosana (0,1%) na formulação.
A solução de TPP/proteínas, foi gotejada na solução de quitosana e mantida
sob agitação magnética (700 rpm), por 30 minutos, até se observar a formação de
uma solução opalescente, seguindo a mesma metodologia de obtenção de
nanoparticulas descrita no item 4.2.2 (GAN & WANG, 2007; HAMIDI et al., 2008).
4.2.4 ASPECTOS FÍSICO-QUÍMICOS DAS NANOPARTÍCULAS
4.2.4.1 MEDIDAS DE POTENCIAL ZETA E TAMANHO DE PARTÍCULA
As medidas de potencial zeta, realizadas para investigar as interações
eletrostáticas na superfície das nanopartículas, foram obtidas com equipamento
Zeta Plus (Brookhaven Instruments, EUA) através do aparato ZetaPALS, com a
aplicação de um campo de força de 5,9 V.cm-1. Neste equipamento também está
acoplado um aparato 90 Plus/BI-MAS, o qual determina o diâmetro médio das
partículas através de uma análise de espalhamento de luz dinâmico. As análises
foram realizadas a 25 ºC em 659 nm, com ângulo de espalhamento 90º.
4.2.4.2 ANÁLISE DE ESPECTROSCOPIA NA REGIÃO DO INFRAVERMELHO
Os espectros de absorção no infravermelho (FTIR) foram obtidos através do
espectrofotómetro FT-IR, Prestige 21, (Shimadzu, Tóquio, Japão), a fim de estudar
a ocorrência das ligações intermoleculares entre os grupos fosfato do TPP e amina
da quitosana, comprovando a reticulação por gelificação iônica.
Espectros dos compostos individuais, veneno do escorpião T. serrulatus, das
serpentes B. erythromelas, B. jararaca, quitosana e TPP, e das nanopartículas de
quitosana com os venenos incorporados, foram comparados a fim de comprovar o
processo de reticulação. As amostras foram secas no concentrador a vácuo de
velocidade, Centrivap Labconco (Kansas City, EUA), em seguida, misturadas com
42 brometo de potássio (KBr) e comprimidas em prensa hidráulica. A proporção em
peso entre as amostras liofilizadas e o KBr foi de 1: 200.
4.2.4.3 ESTUDO DA FORMA E DA SUPERFÍCIE DAS NANOPARTÍCULAS
A forma e a superfície das nanopartículas de quitosana foram analisadas por
microscopia eletrônica de varredura (MEV) (SSX550, Shimadzu, Tóquio, Japão) e
por microscopia de força atômica (AFM) (SPM-9700 – Shimadzu, Japão), antes e
após a incorporação das proteínas dos venenos do escorpião e serpentes.
Para obtenção das imagens por MEV, as amostras foram preparadas
espalhando-se uma gota da dispersão de nanopartículas na lâmina de fita de
carbono do microscópio, mantidas em dessecador por 24 h. Para obtenção das
imagens por AFM, as amostras foram preparadas espalhando-se uma gota da
dispersão de nanopartículas na lâmina de microscópio, mantidas em dessecador por
24 h. As imagens foram obtidas com microscópio de força atômica com ponteira (tip)
de silício, operando na região atrativa em modo de não-contato do cantilever.
4.2.4.4 ENSAIO DE ESTABILIDADE FÍSICA DAS NANOPARTÍCULAS
As nanopartículas puras e contendo proteínas dos venenos das serpentes B.
erythromelas e B. jararaca foram acondicionadas a temperatura de 8 ± 2 ºC e
avaliadas quanto à sua estabilidade física. A cada cinco dias o tamanho de partícula
foi determinado por espalhamento de luz dinâmico em equipamento ZetaPlus,
durante 40 dias.
4.2.5 EFICIÊNCIA DE INCORPORAÇÃO
Amostras distintas de nanopartículas de quitosana reticuladas com proteínas
dos venenos incorporadas foram centrifugadas a 20.000 x g, 4 °C durante 30
minutos. A concentração proteica do sobrenadante das amostras foi estimada
utilizando o método do ácido bicinconínico pelo BCA Protein Assay kit (FERNANDES
PEDROSA et al., 2002). A eficiência de incorporação de proteínas (EIP%) foi
calculada usando a Equação 1 (GAN et al., 2005).
43
EIP%
(1)
4.2.6 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
O perfil eletroforético dos venenos de B. erythromelas, B. jararaca e T.
serrulatus, e da Albumina Soro Bovina (BSA), associados ou não às nanopartículas
de quitosana foi determinado por eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil
sulfato de sódio (SDS-PAGE), utilizando-se o sistema de minigel (Mini-ProteanTM
II) (LAEMMLI UK, 1970).
As amostras foram misturadas ao tampão de amostra 1x (Tris 0,0625 M pH=
6.8, glicerol 20 %, SDS 2 %, azul de bromofenol 0,01 %, β-mercaptoetanol 5 %)
SDS-PAGE em condições redutoras, fervidas durante 5 minutos e aplicadas aos
géis de eletroforese, com concentração de poliacrilamida 12% para o gel de corrida
e 4% para o gel de empacotamento. A eletroforese foi desenvolvida em sistema
vertical, em placas de dimensão 10,0 x 8,0 x 0,8cm, à 180V, 24 mA, durante 3
horas. A massa molecular relativa das proteínas foi determinada em gel de
poliacrilamida, por comparação da migração eletroforética de uma mistura protéica
padrão, obtida comercialmente.
Os géis foram corados em solução de “Commassie Brillant Blue” R-250 e/ou
pelo método de coloração por prata.
4.2.7 ENSAIO DE LIBERAÇÃO IN VITRO
Para determinar o perfil de liberação in vitro das proteínas, as nanopartículas
contendo o veneno do escorpião Tityus serrulatus e BSA foram incubadas em
solução tampão fosfato pH = 7,4 (KH2PO4 0,05 mol·L-1) e mantidas em banho
termostatizado à 37 ºC ± 0,2 ºC, em condição sink. Em intervalos de tempo pré-
determinados (30 minutos, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 126 e 144 horas), as
44 nanopartículas foram centrifugadas a 16.000 x g à 4 ºC por 30 min e o meio de
dissolução (sobrenadante) retirado para a dosagem de proteínas totais. Novo
volume de solução tampão foi adicionado aos tubos de dissolução, os quais foram
mantidos no banho termostatizado à 37 ºC ± 0,2 ºC até o próximo tempo de coleta. A
concentração de proteína foi analiticamente determinada pelo método do ácido
bicinconínico utilizando o BCA Protein Assay kit.
A massa percentual acumulada de proteínas foi plotada versus o tempo.
Diferentes modelos matemáticos (primeira ordem, Higushi, Korsmeyer-Peppas,
Blaskar e parabólico) foram utilizados para linearizar os dados experimentais. Como
critério de escolha do modelo que melhor explica o fenômeno de liberação das
proteínas das nanopartículas, foi selecionado o coeficiente de determinação (r2),
para avaliar o ajuste do modelo.
4.2.8 PRODUÇÃO DE ANTICORPOS
Os animais de experimentação foram imunizados por seis semanas com 100
µL de veneno das serpentes B. erythromelas, B. jararaca em diferentes
concentrações (5 e 10%) associados aos adjuvantes: hidróxido de alumínio e
nanopartículas de quitosana, com injeções subcutâneas semanais.
4.2.9 OBTENÇÃO DOS SOROS
Para obtenção dos soros, camundongos BALB/c machos normais foram
sangrados pelo plexo ocular. A sangria total dos animais, para análise da presença
de anticorpos contra os antígenos, foi realizada após seis inoculações semanais
(FERNANDES PEDROSA et al., 2002). Amostras de sangue, na ausência de
anticoagulante, foram incubadas a 37 °C por 30 minutos e posteriormente, a 4 °C
por 2 horas para retração do coágulo. Em seguida, as amostras foram centrifugadas
a 1500 rpm por 5 minutos a 4 °C, sendo o sobrenadante (soro) coletado e estocado
a -20 °C.
45 4.2.10 AVALIAÇÃO DOS TÍTULOS DE ANTICORPOS POR ELISA
Os títulos de anticorpos obtidos a partir das amostras dos soros de
camundongos imunizados foram determinados por ensaios de ELISA. Para tanto,
placas de poliestireno foram sensibilizadas com 100 µL de veneno específico (B.
erythromelas ou B. jararaca) em tampão PBS (10 µg/mL) e incubadas overnight a 4
°C. Após este período, as placas foram lavadas com PBS e incubadas por 2 h a 37
°C com a solução de bloqueio (PBS/BSA/ 5%) e, posteriormente, incubadas com
100 µL dos soros (soro de camundongo normal, soro de camundongo anti-veneno,
diluídas em PBS/BSA 0,1%, e incubadas a 37 °C por 1 h. As placas foram lavadas
com PBS/Tween 0,05% (três lavagens/ 5 min) e incubadas com o anticorpo
secundário (anti-IgG de camundongo) conjugado com peroxidase, diluído1:3.000,
por 1 h a 37 °C. As placas foram novamente lavadas com PBS/Tween 0,05% e as
reações reveladas pela adição de OPD (ortofenilenodiamina) e H2O2, e
interrompidas após 20 min. pela adição de H2SO4 2 M. As absorbâncias foram
determinadas a 492 nm em leitor de ELISA (TAMBOURGI et al., 2004).
4.2.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados experimentais foram apresentados como as médias dos valores
experimentais obtidos e seus respectivos desvios padrão, analisados pelo programa
GraphPad Prism 5. Inicialmente foi realizado o teste de normalidade, seguido do
teste t de Student para análises pareadas de duas médias ou da análise de variância
de uma entrada (ANOVA) quando aplicável, sendo considerados significativamente
diferentes os valores de P < 0,05.
46 5 RESULTADOS
5.1. OBTENÇÃO E ANÁLISE DOS ASPECTOS FÍSICO-QUÍMICOS DAS
NANOPARTÍCULAS
Diversos são os parâmetros que podem influenciar na obtenção e tamanho
das nanopartículas pela técnica de gelificação iônica, como concentração dos
reagentes, pH, volume das soluções, dentre outros, que foram previamente
estudados e otimizados. As partículas entre 150 e 200 nm foram preparadas usando
5 mL de solução aquosa (ácido acético 0,175% m/v) de quitosana a 0,1% m/v
(pH=4,0) e 2 mL de solução de solução aquosa TPP 0,1% m/v (pH=9,0).
A razão ( entre os ânions tripolifosfato da solução de TPP (P3O105-) e os
grupos amino da quitosana (NH2) foi determinada pela fórmula:
(2)
onde, ( ) e (
), correspondem ao número de mols de ânions de TPP e
grupos amina da quitosana em solução, respectivamente. Sendo obtida uma razão
rPA=0,2305, significando que nesse sistema obtido, a razão entre os ânions
tripolifosfato do TPP e os grupos amino da quitosana é de 1:5, estes dados estão de
acordo com os dados obtidos por YANG e colaboradores, 2007. Esta razão foi
obtida segundo os cálculos a seguir:
Cálculo do número de mols de ânions tripolifosfato da solução de TPP ( ):
(3)
47
Cálculo do número de mols de grupos amino da solução de quitosana ( ), onde
corresponde ao grau de desacetilação da quitosana utilizada (80%), Massa
molar da unidade desacetilada da quitosana e da unidade acetilada.
( ) (4)
(
( )
)
(
)
(
)
Então:
48
As nanopartículas de quitosana para a incorporação do veneno de B.
erythromelas, B. jararaca e T. serrulatus foram obtidas com sucesso através da
técnica de gelificação iônica, podendo ser observada a formação de uma dispersão
opalescente estável (pH=5,0), o que segundo a literatura caracteriza a obtenção dos
nanossistemas, como pode ser observado na Figura 8.
Figura 8. Solução de quitosana 0,1% m/v em ácido acético (A) e dispersão opalescente com nanopartículas de quitosana (B).
As nanopartículas de quitosana obtidas apresentaram tamanho médio de 152
nm, com potencial zeta (carga de superfície) positiva de +24,5 mV, com índice de
polidispersão 0,272. A medida do índice de dispersão demonstra a homogeneidade
do tamanho das partículas do sistema, o valor ideal para o índice de dispersão é
menor ou igual a 0,3.
Foram realizados testes de incorporação com a albumina soro bovina (BSA),
antes de serem iniciados os testes com os venenos. Após se obter uma eficiência de
incorporação de proteínas (EIP) satisfatória para o BSA em diferentes concentrações
(5 e 10%), acima de 60%, com tamanho de partícula 185 e 196 nm,
respectivamente, seguiram-se os testes com os venenos do escorpião e das
serpentes. As nanopartículas com o veneno da serpente B. jararaca incorporado nas
concentrações de 5, 10 e 15% apresentaram tamanho de 179, 174 e 187 nm
49 respectivamente, com o índice de polidispersão variando de 0,185 a 0,203. Essas
partículas apresentaram potencial zeta positivo para todas as concentrações
trabalhadas, sendo para a concentração de 5% e 10%, a carga obtida foi de +23,03
e +24,91 mV respectivamente. Uma pequena variação da carga das partículas foi
observada para as amostras que apresentaram 15% desse veneno incorporado,
sendo o potencial zeta obtido de +31,9 mV, o que pode está relacionado com o
discreto aumento das nanopartículas nessa concentração. A eficiência de
incorporação das nanopartículas para o veneno da serpente B. jararaca
correspondeu a 76,7%, 67,7% e 74,8%, para as concentrações de 5, 10 e 15% de
veneno incorporado, respectivamente (Tabela 1).
Nos sistemas envolvendo o veneno da serpente B. erythromelas incorporado
nas concentrações de 5, 10 e 15%, os resultados obtidos para o tamanho de
partícula e potencial zeta foram de 189nm com carga de +20,7 mV para a
concentração de 5%, já para a concentração de 10% de veneno incorporado, foram
obtidas partículas de 160nm com potencial zeta de +19 mV. Esta diminuição do
tamanho da partícula e da carga pode ocorrer devido a interações mais fortes entre
os grupamentos carregados da quitosana e algumas proteínas do veneno com carga
negativa. Quando 15% desse veneno foi incorporado às nanopartículas, o tamanho
médio obtido foi de 201nm, com potencial zeta +27,2 mV. O índice de polidispersão
obtido foi de aproximadamente 0,3 para as amostras com as concentrações de 5 e
10%, o que demonstrou que essas amostras apresentam tamanho de partículas
uniforme na solução, já para o sistema com 15% do veneno incorporado, o índice de
polidispersão foi de 0,328. A eficiência de incorporação obtida para esses sistemas
foi elevada, sendo maior que 80%, chegando a 97,16% para a concentração de 5%
de veneno. Estes resultados podem ser visualizados na Tabela1.
50 Tabela 1. Características físico-químicas das nanopartículas antes e após a incorporação dos diferentes venenos e BSA. CNP (nanopartículas de quitosana), BJ (veneno de B. jararaca), BE (veneno de B. erythromelas), VTS (veneno de T.serrulatus), BSA (Albumina Soro Bovina) (n=3).
Amostra Diâmetro ±
DP (nm) IPD± DP Potencial Zeta (mV) EIP (%)
CNP 152,6±2,2 0,272±0,00 24,50 -
CNP/BJ 5% 179,3±9,4 0,188±0,08 23,03 76,70
CNP/BJ 10% 174,7±5,0 0,203±0,07 24,91 67,70
CNP/BJ 15% 187,3±7,5 0,185±0,07 31,40 74,80
CNP/BE 5% 189,4±1,0 0,300±0,05 20,71 97,16
CNP/BE 10% 160,0±2,3 0,300±0,01 19,00 87,58
CNP/BE 15% 201,3±5,6 0,328±0,05 27,21 88,12
CNP/VTS 5% 149,6 ± 5,5 0,300±0,00 24,20 92,44
CNP/ VTS 10% 135,0 ± 2,7 0,128±0,06 21,75 89,22
CNP/ VTS 15% 169,0 ± 0,6 0,272±0,07 21,30 85,62
CNP/BSA5% 185,7±1,9 0,288±0,07 25,30 77,32
CNP/BSA10% 196,7±2,7 0,282±0,05 52,76 68,90
As nanopartículas obtidas após a incorporação do veneno do escorpião T.
serrulatus nas três diferentes concentrações testadas (5, 10 e 15%), apresentaram
tamanho médio de 149, 135 e 169 nm, com potencial zeta de +24,2, +21,7 e +21,3
mV, respectivamente. O índice de polidispersão variou de 0,128 a 0,3. As
nanopartículas apresentaram uma elevada capacidade de incorporação para as
proteínas desse veneno, sendo os valores da eficiência obtidos de 92,44%, 89,22%
e 85,62%, para os sistemas de 5, 10 e 15% de veneno incorporado,
respectivamente. Após a incorporação do BSA em concentrações 5 e 10% às
nanopartículas de quitosana, estas apresentaram um ligeiro aumento de diâmetro,
sendo 185 e 196 nm respectivamente, com um índice de polidispersão 0,28 e uma
eficiência de incorporação acima de 60% para ambas concentrações.
A forma e superfície das nanopartículas de quitosana contendo a peçonha do
escorpião ou das serpentes foram avaliadas por microscopia eletrônica de varredura
51 (MEV) e por microscopia de força atômica (AFM), antes e após a incorporação das
proteínas. As imagens de MEV mostraram que as nanopartículas obtidas
apresentam forma esférica e tamanho homogêneo em torno de 160 nm, estando de
acordo com os dados obtidos no ensaio de tamanho de partículas. Com a adição
dos venenos das serpentes B. erythromelas, B. jararaca e do escorpião Tityus
serrulatus ás nanopartículas na concentração de 15%, observou-se aumento do
diâmetro médio das nanopartículas de 152 nm para 201, 187 e 169 nm,
respectivamente (Figura 9).
Figura 9. Imagens de MEV das nanopartículas de quitosana (A), das nanopartículas contendo peçonha de B. erythromelas (B), de B. jararaca (C) ou Tityus serrulatus (D).
As imagens obtidas por AFM revelaram partículas de tamanho homogêneo e
esféricas, confirmando também os dados obtidos para o diâmetro médio das
nanopartículas que é de 152 nm, onde estas apresentaram um discreto aumento de
diâmetro após a adição dos venenos de serpentes B. erythromelas e B. jararaca,
para 160 e 174 nm, respectivamente (Figura 10).
52
Figura 10. Imagens de AFM das nanopartículas de quitosana (CNP), das nanopartículas contendo peçonha de B. jararaca (CNP/BJ10%), de B. erythromelas (CNP/BE10%). Escala de 10 µm.
Espectros de absorção na região do infravermelho foram obtidos para os
compostos isolados, quitosana, TPP, veneno do escorpião Tityus serrulatus, veneno
do escorpião incorporado às nanopartículas nas concentrações 5 e 10% e veneno
das serpentes B. jararaca e B. erythromelas incorporados às nanopartículas nas
concentrações de 10% (Figura 11).
53
Figura 11. Infravermelho da Quitosana, TPP, Nanopartículas e Nanopartículas associadas aos venenos de serpentes e escorpião. CH (quitosana), CNP (nanopartículas de quitosana) e TPP (A), BSA (B), VTS (veneno de T.serrulatus) (C) e BJ (veneno de B. jararaca), BE (veneno de B. erythromelas) (D).
No espectro da quitosana pura foi possível observar a banda de amina
primária em 3422 cm-1 (Figura 11A). Em 1649 cm-1 aparece a banda correspondente
ao grupamento N-H de amida primária e em 1561 cm-1 correspondente a amida
secundária. A banda presente em 1075 cm-1 é atribuída ao estiramento vibracional
do grupamento C–O. No espectro do TPP puro, as duas bandas correspondentes
aos grupamentos P=O e P-O-P foram observadas em 1162 cm-1 e 892 cm-1,
respectivamente. Nos espectros obtidos para as nanopartículas de quitosana
carregadas ou não com proteínas livres, foi possível observar bandas
correspondentes aos grupamentos C=O e N-H, relacionadas a amida primária, no
54 mesmo intervalo observado no espectro da quitosana pura, que no entanto
aparecem em uma intensidade elevada, devido as novas interações da amida,
ocasionadas pelo processo de obtenção das nanopartículas por gelificação iônica. O
mesmo pode ser observado para as bandas correspondentes aos grupamentos O-H
e N-H, presentes na amina primária, em 3422 cm-1. Este fato pode ser reforçado
pelo enfraquecimento da banda correspondente ao grupamento P=O em 1214 cm-1
e o alongamento da banda correspondente ao grupamento P-O-P em 892 cm-1.
Essas interações intermoleculares são características da formação de
nanopartículas de quitosana por gelificação iônica. (PAPADIMITRIOU et al., 2008;
RODRIGUES et al., 2012; ANTONIOU et al., 2015).
Nos espectros obtidos para as amostras de BSA e de nanopartículas com
BSA encapsulados (Figura 11B), bandas características dos grupamentos C=O
correspondentes aos grupos carboxila da amida primária, em 1657 cm-1, e
correspondente a amida secundária em 1536 cm-1 foram visualizadas, com
intensidades equivalentes a quantidade de BSA empregada no sistema, o que
segundo a literatura demonstra uma eficiente retenção da proteína na matriz
polimérica (MARUYAMA et al., 2001).
Para o espectro do veneno puro de T. serrulatus foram visualizadas bandas
correspondentes ao grupamento C=O da amida primária em 1651 cm-1 e a amida
secundária em 1540 e 1239 cm-1, respectivamente (Figura 11C). De acordo com a
Arêas et al.(1987), estão associadas com o formato α-helicoidal da estrutura
secundária do polipeptídio. Nos espectros de FTIR, dos venenos do escorpião e das
serpentes incorporados às nanopartículas, foram também observadas interações
dos grupos amina livres da quitosana com o grupo carboxila presente nos venenos.
Tal fato é caracterizado pelo aumento da intensidade da banda correspondente ao
grupamento amida, ocorrendo pelo mesmo mecanismo que para o BSA,
demonstrando uma forte retenção das proteínas ao polímero.
55
O perfil eletroforético do veneno das serpentes B. jararaca e B. erythromelas,
do escorpião T. serrulatus, do BSA, e das nanopartículas de quitosana com os
diferentes venenos incorporados nas concentrações de 5 e 10%, podem ser
observados nas Figuras 12.
Figura 12. Determinação do perfil eletroforético do veneno das serpentes B. jararaca e B. erythromelas e das nanopartículas com as proteínas do veneno de B. jararaca (CNP+BJ 5 e 10%) e B. erythromelas (CNP+BE 5 e 10%). Gel corado em solução de “Commassie Brillant Blue” R-250.
As proteínas que compõem os venenos das serpentes na faixa de 14 a 66,4
kDa, em 52 kDa podem ser observadas bandas que provavelmente são
correspondentes a metaloproteases. Na Figura 13, o perfil eletroforético das
proteínas que compõem o veneno do escorpião T. serrulatus mostrou que essas
encontram-se predominantemente na faixa de massa molecular entre 14 e 55 kDa e
o perfil da albumina soro bovina revela que as proteínas que a compõem estão
compreendidas entre 27 e 70 kDa, majoritariamente .
56
Figura 13. Determinação do perfil eletroforético do veneno do escorpião T. serrulatus (VTS), da BSA e das nanopartículas com as proteínas do veneno do escorpião (CNP+VTS 5 e 10%) e BSA (CNP+BSA 5 e 10%). Gel corado em solução de Prata.
Com o ensaio de retenção de proteínas no polímero de quitosana, realizado
com a obtenção do perfil eletroforético dos venenos e do BSA associados às
nanopartículas de quitosana, foi possível observar que as amostras de
nanopartículas contendo as proteínas dos venenos não apresentaram os mesmos
padrões de corrida das substâncias puras, indicando a associação total ou de uma
grande fração de proteínas às nanopartículas.
5.2. ENSAIO DE ESTABILIDADE FÍSICA DAS NANOPARTÍCULAS
As proteínas que constituem os venenos das serpentes e do escorpião
apresentam um padrão de massa molecular de média a baixa, o que foi evidenciado
na eletroforese desenvolvida (Figuras 12 e 13), além de apresentarem caráter
aniônico e perfil de incorporação semelhante (Tabela 1). Sendo assim, acreditou-se
que o perfil de liberação, assim como a estabilidade física das nanopartículas para
os três venenos será semelhante. Isto posto, o ensaio de estabilidade física das
57 nanopartículas foi desenvolvido com as nanopartículas com o veneno das serpentes
incorporado.
A estabilidade física das nanopartículas puras e contendo proteínas dos
venenos das serpentes B. erythromelas e B. jararaca foi verificada por 40 dias,
através de análises do diâmetro das partículas a cada cinco dias. Os resultados
demonstraram que as nanopartículas vazias se mantiveram estáveis durante cinco
dias, após esse período começaram a entumecer e aumentar de tamanho, com o
diâmetro variando de 164 a 255 nm, nos 40 dias de análise. As nanopartículas com
veneno das serpentes incorporado nas concentrações 5 e 10% apresentaram maior
estabilidade durante o período da análise (Figura 14).
Figura 14. Estabilidade física das nanopartículas puras e contendo veneno das serpentes B. jararaca e B. erythromelas nas concentrações 5 e 10% (n=3).
O diâmetro das nanopartículas de quitosana com o veneno da serpente B.
erythromelas na concentração de 5% variou de 153,2 a 171,6 nm, já na
58 concentração de 10% o diâmetro médio variou de 171,1 a 169,5 nm. Para as
amostras com o veneno das serpentes B. jararaca incorporado, nas mesmas
concentrações (5 e 10%), o diâmetro de partícula variou de 153,8 a 155,3 nm e
159,0 a 158,7 nm, respectivamente. Os resultados obtidos para as nanopartículas
com veneno incorporado, não apresentaram diferença estatística significante
(P>0,05) (Figura 14). O presente ensaio demonstrou o sucesso no design
experimental das nanopartículas para a liberação de proteínas de diferentes
peçonhas. Além de apresentarem o tamanho inferior a 200 nm, carga positiva e alta
eficiência de encapsulação, as partículas apresentaram estabilidade para o uso
pretendido. A maior estabilidade das partículas com veneno incorporado demonstra
a interação dessas proteínas com a quitosana com possível reticulação como
demonstrado nos ensaios de FT-IR.
5.3. ENSAIO DE LIBERAÇÃO IN VITRO
O perfil de liberação in vitro das proteínas a partir das nanopartículas de
quitosana foi avaliado analisando as nanopartículas contendo o veneno do escorpião
T. serrulatus e BSA. A Figura 15 exibe o perfil in vitro da liberação das proteínas do
veneno do escorpião T. serrulatus e BSA a partir de nanopartículas de quitosana, e
mostra que esse processo ocorreu em duas etapas. Após a liberação imediata das
proteínas na superfície das nanopartículas, conhecida como “efeito burst”, liberando
12–23 % da massa total de proteína, um estado de equilíbrio com liberação lenta foi
observado para os diferentes tipos de nanopartículas e de proteínas, caracterizando
um perfil de liberação sustentado.
Após 144 horas, as nanopartículas liberaram 88% e 62% da massa total de
proteína para as amostras contendo 5% e 10% de BSA, respectivamente.
Resultados semelhantes foram observados para as nanopartículas com veneno de
T. serrulatus incorporados, em que a massa total das proteínas liberadas foi de 87%
59 e 67% para as amostras contendo 5% e 10% de veneno, respectivamente. Este
resultado demonstrou que usando BSA como molécula molde, foi possível
estabelecer os parâmetros para incorporação das proteínas do veneno com êxito
(Figura 15).
Figura 15. Perfil de liberação in vitro de BSA e veneno de T. serrulatus em diferentes concentrações (5 e 10%).
O mecanismo de liberação do veneno e BSA a partir das nanopartículas de
quitosana foi estudado através do ajuste dos dados experimentais para diferentes
modelos matemáticos: primeira ordem, Higuchi, Korsmeyer-Peppas, Bhaskar e um
modelo parabólico de difusão (Tabela 2).
60 Tabela 2. Parâmetros de ajuste de diferentes modelos cinéticos para a liberação de proteínas a partir das nanopartículas de quitosana. CSN / BSA - Nanopartículas de quitosana contendo albumina do soro bovino; CSN / VTS - Nanopartículas de quitosana contendo veneno de T. serrulatus; Desvio padrão (SD).
Notas:
a Valores da constante de velocidade de liberação (k), expressa como média ± SD (n = 3);
b Coeficiente de correlação (r
2) expressos como a média ± SD (n = 3).
O coeficiente de correlação extraído (r2) mostrou que os modelos Higushi,
Korsmeyer-Peppas, e Bhaskar demonstraram ser inadequados para descrever o
mecanismo de liberação envolvido para todas as formulações testadas, pois
apresentou coeficiente de correlação menor que 0,9 para maior parte das amostras.
No entanto, o mecanismo de liberação das diferentes proteínas (BSA e T. serrulatus)
em concentrações diferentes (5% e 10%) pode ser confirmado pelos dois modelos
utilizados, primeira ordem e de difusão parabólica, que exibiu coeficientes de
correlação superiores a 0,9 (intervalo de 0,90 a 0,94).
5.4. AVALIAÇÃO DOS TÍTULOS DE ANTICORPOS NO SORO
Os títulos de anticorpos no soro foram avaliados uma semana após o último
reforço da vacinação, pela técnica de ELISA. Os resultados demonstram que houve
diferença significativa na produção de anticorpos específicos para cada veneno
(IgG), nos animais imunizados tanto com o veneno de B. jararaca, quanto como o
veneno de B. erythromelas (Figura 16).
Formulação Primeira ordema,b
Higuchi a,b
Korsmeyer-
Peppas a,b
Bhaskar a,b
Parabolic
modela,b
CSN/BSA 5% 0,0142 ± 0,0014 h-1
,
0,93 ± 0,03
6.71 ± 1.27 h0.5
,
0.91 ± 0.03
0.24 ± 0.04,
0.74 ± 0.05
-0.0317 ± 0.0092 h0.65
,
0.86 ± 0.06
0.33 ± 0.03 h-0.5
,
0.93 ± 0.02
CSN/BSA10% 0,0132 ± 0,007 h-1
,
0,92 ± 0,02
4.94 ± 0.41 h0.5
,
0.93 ± 0.01
0.32 ± 0.02,
0.79 ± 0.04
-0.0162 ± 0.0023 h0.65
,
0.94 ± 0.02
0.17 ± 0.01 h-0.5
,
0.92 ± 0.01
CSN/VTS 5% 0,0117 ± 0,0033 h-1
,
0,93 ± 0,04
5.44 ± 1.02 h0.5
,
0.77 ± 0.05
0.24 ± 0.08,
0.57 ± 0.09
-0.0231 ± 0.015 h0.65
,
0.69 ± 0.19
0.33 ± 0.15 h-0.5
,
0.92 ± 0.01
CSN/VTS10% 0,0096 ± 0,0014 h-1
,
0,94 ± 0.01
5.44 ± 0.13 h0.5
,
0.88 ± 0.04
0.20 ± 0.03,
0.68 ± 0.08
-0.0136 ± 0.0046 h0.65
,
0.82 ± 0.18
0.30 ± 0.04 h-0.5
,
0.93 ± 0.01
61
Para os animais imunizados com o veneno de B. jararaca, comparando-se os
grupos de animais vacinados com as nanopartículas de quitosana e hidróxido de
alumínio associado ao veneno na concentração de 5% não houve diferença
estatística para os títulos de anticorpos obtidos. Os títulos de anticorpos dos animais
vacinados com os dois adjuvantes associados ao veneno na concentração 10%,
também não mostraram diferença estatística (P>0,05). Quando foram comparados
os títulos de anticorpos dos animais vacinados com o adjuvante hidróxido de
alumínio associado com o veneno na concentração 10% e nanopartículas de
quitosana com veneno encapsulado na concentração de 5%, foi observada diferença
significativa (P<0,05).
Para ambas as concentrações de veneno de B. jararaca (5 ou 10%),
associados às nanopartículas, o titulo de anticorpos foi equivalente ao produzido
pelos animais imunizados com o hidróxido de alumínio associado ao veneno (Figura
16 A). Comportamento diferente apresentaram os animais vacinados com os
imunoadjuvantes associados ao veneno de B. erythromelas, apresentando os
animais imunizados com o veneno na concentração 10% incorporado as
nanopartículas de quitosana maiores títulos de anticorpos que os animais vacinados
com o veneno associado ao hidróxido de alumínio na mesma concentração
(#P<0,05), já os grupos experimentais vacinados com o veneno na concentração de
5%, apresentou títulos de anticorpos equivalentes (Figura 16 B).
62
Figura 16. Avaliação dos títulos de anticorpos obtidos a partir de animais imunizados com os adjuvantes hidróxido de alumínio (HA) e nanopartículas de quitosana (CNP) associados aos venenos de B. jararaca (A e C) e B. erythromelas (B e D)
***p <0,05 comparando HA/BE 10% e CNP/BE 10%,
+++p<0,05 comparando CNP/BE10% com CNP/BE 5%.
As amostras de soro foram submetidas a diluições seriadas com um diluente
padrão (PBS/BSA 0,1%), partindo de uma diluição 1:25 para 1: 204800, buscando
avaliar os títulos de anticorpos específicos em baixas concentrações. As Figuras
16C e 16D mostram os resultados para essas diluições, podendo-se observar que
até à diluição de 1:12800 foram detectados anticorpos no soro de animais
imunizados tanto com o veneno de B. jararaca quanto para os imunizados com o
veneno de B. erythromelas. Para os grupos imunizados com o veneno da serpente
B. jararaca, foi possível observar com este ensaio para ambas as concentrações
trabalhadas (5 e 10%), que os anticorpos obtidos apresentaram títulos equivalentes,
63 para ambos imunoadjuvantes. A partir da diluição 1:200 até a diluição 1:1600, foi
possível observar um aumento do título de anticorpos do grupo vacinado com as
nanopartículas de quitosana associado ao veneno em concentração 10% em
comparação ao título de anticorpos obtidos a partir do soro dos animais imunizado
com o HA associado ao veneno na concentração 10%. Para os títulos de anticorpos
obtidos a partir do soro dos animais imunizados com o veneno de B. erythromelas
associado à ambos imunoadjuvantes, estes se apresentaram equivalentes a partir
da diluição 1:100, para todos os grupos experimentais trabalhados. Nas diluições
1:25 e 1:50 os títulos de anticorpos foram distintos comparando os grupos das
nanopartículas de quitosana e HA associados ao veneno na concentração 10%.
64 6 DISCUSSÃO
As nanopartículas de quitosana, com diâmetro médio 152,6 nm, foram obtidas
espontaneamente por ligações intra e intermoleculares entre os grupos fosfato do
tripolifosfato polianiônico (TPP) e os grupos amina da quitosana pela técnica de
gelificação iônica, após o gotejamento de 2 mL da solução do agente reticulador
TPP, em 5mL da solução de quitosana, em meio ácido, sob condições previamente
otimizadas, observando-se a formação de uma dispersão final opalescente o que,
segundo a literatura, caracteriza a presença de nanopartículas (GAN & WANG,
2007). A partir do cálculo da razão entre os ânions tripolifosfato da solução de TPP
(P3O105-) e os grupos amino da quitosana (NH2), foi possível observar que o
nanossistema encontra-se em equilíbrio estequiométrico, corroborando com dados já
obtidos previamente na literatura (YANG et al., 2007).
A inclusão das proteínas nas nanopartículas foi realizada pela técnica de
incorporação durante a preparação dos nanossistemas, com as proteínas
solubilizadas na solução de TPP 0,1% nas concentrações 5, 10 e 15%, em relação à
concentração do polímero 0,1%. A formação de nanopartículas de quitosana
carregadas de veneno/proteínas ocorreu espontaneamente quando a solução de
TPP/proteína foi adicionada a solução de quitosana. As nanopartículas de quitosana
apresentaram grande capacidade de incorporação para as proteínas testadas,
mantendo-se na faixa de 200 nm. Os sistemas estudados apresentaram um
pequeno aumento de diâmetro médio de partículas sem a formação de agregados,
após a inclusão dos venenos ou BSA aos sistemas, sendo este fato de grande
importância, considerando-se que a distribuição e tamanho médio das partículas
estão relacionados com a estabilidade do sistema e são de grande importância para
a administração parenteral das substâncias.
A homogeneidade do tamanho das partículas do sistema pode ser avaliada
pela medida do índice de dispersão, o valor ideal para o índice de dispersão é menor
65 ou igual a 0,3. Os sistemas obtidos para as nanopartículas sem proteínas
incorporadas mostraram que se trata de um sistema com partículas de tamanho
homogêneo, o que é de grande importância para a aplicação dessas partículas em
formulações farmacêuticas, conferindo ao sistema estabilidade da dose a ser
administrada. O potencial de carga positiva apresentado por essas nanopartículas
confere grande capacidade de encapsulação e adsorção para proteínas e peptídeos
de carga negativa, assim como maior estabilidade ao sistema, diminuindo a
formação de agregados entre as nanopartículas, além de potencializar a capacidade
de muco adesão, facilitando a passagem das nanopartículas através das células
corporais.
A alta eficiência de incorporação para as proteínas do veneno do escorpião
Tityus serrulatus, atingindo 92,4%, pode ser explicada pela natureza das proteínas
que compõem esse veneno, sendo proteínas em sua maioria de baixa massa
molecular e de caráter aniônico. O veneno das serpentes também apresentou uma
alta eficiência de incorporação, sendo para a serpente B. erithromelas, maior que
para a serpente B. jararaca, chegando a 97,16% para a amostra de 5%, essa
eficiência de incorporação está relacionada a carga e tamanho das proteínas que
compõem o veneno das serpentes, que são proteínas em sua maioria de caráter
aniônico e de média a baixa massa molecular, o que pode ser observado no perfil
eletroforético dos venenos brutos (Figuras 12 e 13).
As pequenas variações na eficiência de incorporação entre os venenos das
serpentes podem ocorrer por uma pequena diferença que pode existir entre as
proteínas que os compõem. As nanopartículas obtidas nas concentrações 5 e 10%,
apresentaram distribuição do tamanho de partícula homogêneo (IPD ≤0,3), com
carga de superfície positiva. Essas características demonstram a grande capacidade
do nanossistema de incorporar e transportar proteínas através dos fluidos biológicos,
mantendo a estabilidade.
66
As nanopartículas, com veneno do escorpião nas concentrações 5 e 10%
incorporado, apresentaram menor diâmetro em relação às nanopartículas com o
veneno das serpentes, o que sugere uma maior competição das proteínas do
veneno do escorpião com o TPP pelos grupamentos catiônicos da quitosana, fato
este previamente elucidado na literatura (GAN & WANG, 2007; ANTONIO et al.,
2015). A alta eficiência de incorporação do BSA aos nanossistemas pode ser
explicada pelo fato do BSA se tratar de uma proteína globular com alto teor de
aminoácidos carregados (lisina, arginina, aspartato e glutamato) conhecida por
apresentar predominantemente carga negativa em água em pH 7,4 (ELZOGHBY et
al., 2012), podendo interagir iônicamente com o polímero.
O elevado percentual de incorporação de proteínas também foi confirmado
pelos perfis eletroforéticos em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) das nanopartículas
contendo venenos do escorpião T. Serrulatus, das serpentes B. jararaca e B.
erythromelas e dos venenos livres, e BSA (Figuras 12 e 13). As nanopartículas
contendo as proteínas não apresentam os mesmos padrões de corrida das
substâncias livres, indicando a associação/retenção total ou de uma grande fração
de proteínas nas nanopartículas.
Um nanocarreador polimérico eficaz deve apresentar a capacidade de
condensar DNA ou proteína para a proteção contra a degradação (SON & KIM,
2010). Essa capacidade pode ser observada através do ensaio de retenção das
proteínas no polímero, no qual não foi possível observar as proteínas, no gel de
eletroforese, quando associadas às nanopartículas, pela formação do complexo
polímero-proteína.
A forma e superfície das nanopartículas de quitosana contendo a peçonha do
escorpião e das serpentes antes e após a incorporação das proteínas podem ser
observadas nas imagens de MEV e AFM (Figura 9 e 10). As partículas apresentaram
forma esférica e diâmetro uniforme, com dados corroborando com os dados obtidos
67 por espalhamento dinâmico de luz. A uniformidade do tamanho de partícula não é
apenas importante para a estabilidade da formulação, mas também para a escolha
da via de administração do sistema. As vias intravenosa e intramuscular são muito
comuns para a administração de proteínas com atividade farmacológica, sendo bem
estabelecido que o tamanho de partícula/gotícula de formas farmacêuticas
destinadas a corrente sanguínea ou a circulação linfática deve variar em torno de
100 - 200 nm (SHEKUNOV et al., 2007).
Nos espectros de infravermelho obtidos, foi evidenciada a interação do
tripolifosfato com os grupamentos amino (NH3+) da quitosana, através do aumento
da intensidade das bandas presentes na quitosana, que também aparecem no
espectro das nanopartículas, em 1649 cm-1 e 1561 cm-1, correspondentes aos
grupamentos C=O e N-H, da amida primária, respectivamente. Com esse ensaio, foi
possível identificar a interação de grupamentos da quitosana com grupamentos
presentes nas proteínas, através do aumento da intensidade de bandas
características nessas substâncias, reforçando a hipótese, que ocorre uma nova
interação entre os grupamentos amida através da gelificação iônica. Esse resultado
é reforçado pela diminuição da intensidade das bandas associadas a interação do
TPP com a quitosana, o enfraquecimento da intensidade destas bandas nas
nanopartículas carregadas com proteína, pode ser explicada pela interação
intermolecular de grupos carboxila da proteína com grupos amina livres da
quitosana, como já foi demonstrado em estudos anteriores (MARUYAMA et al.,
2001; VANDANA & SAHOO, 2009).
Nas suspensões coloidais, com o tempo, pode ocorrer a aglomeração das
partículas e consequente sedimentação, podendo ser esse um fator limitante para a
sua aplicação. A estabilidade dos nanossistemas obtidos foi verificada, através da
analise do diâmetro das partículas, associadas ou não ao veneno das serpentes, por
40 dias. Os resultados apresentados demonstraram que as proteínas dos venenos
68 incorporadas conferiram maior estabilidade às nanopartículas. Os sistemas com os
venenos incorporados se mantiveram estáveis durante o tempo de análise, com
tamanho de partícula constante, não sendo apresentada diferença estatística
significante entre os diâmetros de partículas desses grupos.
A maior estabilidade apresentada pelas nanopartículas com veneno
associado pode ser explicada pela natureza aniônica das proteínas que compõem
os venenos, intensificando as interações eletrostáticas entre os grupamentos que
formam os nanossistemas e as proteínas dos venenos, essas interações podem ser
visualizadas através dos espectros de infravermelho obtidos. Após cinco dias de
análise, as nanopartículas vazias começaram a entumecer e apresentaram aumento
de diâmetro, não ultrapassando o diâmetro de 300 nm durante os 40 dias de análise.
Não foi observada separação de fases para nenhuma das formulações neste
período.
A atividade biológica de nanopartículas carregadas com substâncias
farmacologicamente ativas está diretamente relacionada com aspectos como forma
e superfície, devido à precisão e exatidão da taxa de fármaco que o sistema pode
fornecer. O perfil de liberação da substância depende principalmente do tamanho da
partícula, que afeta a dissolução do fármaco e, portanto, a sua biodisponibilidade.
Partículas pequenas têm uma maior área de superfície disponível para dissolução
proporcionando cinética de liberação mais rápida (SILVA-JUNIOR et al., 2007).
As nanopartículas de quitosana obtidas apresentaram um perfil de liberação
sustentada das proteínas, mantendo um estado de equilíbrio com liberação lenta,
após a liberação imediata das proteínas que estavam adsorvidas à superfície das
nanopartículas. Após esta fase inicial, a liberação da proteína segue por difusão
através da camada externa das partículas entumecidas. A presença de uma etapa
de liberação sustentada sugere que as proteínas não estão apenas adsorvidas à
69 superfície das nanopartículas, mas também interagem com os grupos positivos
dispersos dentro da matriz do polímero de quitosana.
O perfil de liberação prolongada das proteínas apresentado pelos
nanossistemas, pode ser mais um ponto positivo para o seu uso terapêutico,
podendo a quantidade inicial rapidamente liberada de proteína fornecer uma dose de
antígeno capaz de ativar a produção de anticorpos, seguindo-se uma liberação
sustentada que permite a manutenção desta dose por um longo período de tempo.
Esse comportamento de liberação torna as nanopartículas contendo os venenos,
candidatas ao desenvolvimento de um novo sistema de vacina para uso em
humanos no qual, uma menor quantidade de antígeno a ser administrada será
necessária.
O mecanismo de liberação das nanopartículas foi estudado através do ajuste
dos dados experimentais para diferentes modelos matemáticos. O primeiro modelo,
designado por modelo de primeira ordem expressa a taxa de liberação dependente
de carga de proteína nas nanopartículas (logQ1 = logQ0 + kt / 2.303). O modelo de
Higuchi têm abordado aspectos importantes envolvidos com difusão de liberação
controlada de moléculas retidas a partir de dispositivos planares (Mt / M∞ kH t = 0,5
+ b). O modelo Bhaskar descreve que a difusão da proteína através das partículas
limita a taxa de liberação (log (1-MT / M∞) kB = t 0,65 + b). O modelo Korsmeyer-
Peppas também é conhecido como o modelo de Freundlich modificado, descreve a
liberação de proteína a partir de uma superfície plana com os locais heterogéneos
baseados em um processo de difusão controlada (Mt / M∞ = KKP TN). Finalmente, o
modelo de difusão parabólico explica a liberação de proteína controlada por
processo de difusão, tal como a difusão intra-partícula ou superfície de difusão (Mt /
M∞ = 0,5 kP T + b) (PETROPOULOS; PAPADOKOSTAKI; SANOPOULOU, 2012).
O coeficiente de correlação extraído (r2) mostrou que o mecanismo de
liberação das diferentes proteínas (BSA e T. serrulatus) em concentrações diferentes
70 (5% e 10%) pode ser confirmado por dois modelos utilizados, primeira ordem e de
difusão parabólica, que exibiu coeficientes de correlação superiores a 0,9 (intervalo
de 0,92 a 0,94). Sendo assim, o modelo de primeira ordem demonstra que a taxa de
liberação da proteína ocorreu dependente da massa de proteína empregada em
cada nanopartícula, enquanto o modelo de difusão parabólico descreve que o
transporte de massa foi controlado por difusão (ABDUL LATIP et al., 2013; DELEON
et al., 2012). Estes mecanismos estão em conformidade com relatos sobre o efeito
da quantidade de proteína nas nanopartículas, bem como o processo de difusão por
intumescimento do polímero, já elucidados (MAKADIA & SIEGEL, 2011). O diferente
grau de interação entre as proteínas estudadas (BSA e veneno de T. serrulatus) com
as nanopartículas de quitosana, demonstrado nos espectros de infravermelho
obtidos, explica a diferença entre as taxas de liberação dessas proteínas.
Todas as vacinas eficazes precisam de um sistema de apresentação de
antígenos adequado (XIE et al., 2007), vários estudos vêm sendo desenvolvidos na
busca de adjuvantes menos tóxicos e que proporcionem uma resposta imune mais
eficaz. Após obter, caracterizar físico-quimicamente as nanopartículas de quitosana,
bem como avaliar o seu perfil de liberação, foi observado que esses nanossistemas
apresentam alguns atrativos para sua utilização como adjuvante de imunização.
O uso de adjuvantes em vacinas é particularmente importante quando o
antígeno a ser administrado possui baixa imunogenicidade e na administração de
baixas quantidades de antígenos, no entanto muitos problemas são encontrados no
desenvolvimento e utilização de adjuvantes em vacinas, principalmente em
humanos. A escolha de um adjuvante para uma determinada vacina deve ser
associada ao poder adjuvante desta substância e ao nível aceitável de efeitos
adversos.
Sendo assim visando avaliar o potencial imunoadjuvante das nanopartículas
de quitosana na produção de soros antivenenos, foram realizados ensaios de
71 imunização utilizando como imunoadjuvantes, as nanopartículas de quitosana e o
hidróxido de alumínio, por ser o adjuvante convencional mais utilizado, associados
aos venenos das serpentes, para tanto animais de experimentação foram
imunizados por seis semanas com o veneno das serpentes em diferentes
concentrações (5 e 10%) incorporados à nova formulação desenvolvida e
associados ao hidróxido de alumínio, para posterior análise dos títulos de anticorpos
pela técnica de ELISA.
Os resultados demonstraram que as nanopartículas de quitosana quando
aplicadas como adjuvante de imunização podem promover uma potencialização da
resposta imunológica, podendo-se observar a presença de anticorpos específicos
até à diluição de 1: 12800. Os títulos de anticorpos obtidos no soro, após análise,
para os animais imunizados com as nanopartículas de quitosana, foram equivalentes
ou superiores ao hidróxido de alumínio quando associados à mesma concentração
de veneno, para todas as formulações testadas na diluição 1:25. Esse resultado
reforça a hipótese de que as nanopartículas de quitosana podem ser consideradas
um potente imunoadjuvante, pelas características do polímero utilizado, conferindo-
as imunogenicidade, apresentando as vantagens de serem menos inflamatórias e
por se tratar de um sistema de liberação modificada, necessitando, portanto, de uma
menor quantidade de antígeno a ser administrado. Os títulos de anticorpos foram
avaliados em trabalho semelhante desenvolvido por nosso grupo de pesquisa, para
o veneno do escorpião T. serrulatus e os dados obtidos foram semelhantes aos
desse estudo (ROCHA SOARES et al., 2012), demonstrando o potencial
imunoadjuvante das nanopartículas de quitosana frente a produção de anticorpos
para diferentes venenos.
Este trabalho apresenta uma importante vertente na produção de produtos
biotecnológicos, especialmente na obtenção de soros em um novo nanossistema, no
tratamento com imunobiológicos envolvendo antivenenos.
72 7 CONCLUSÃO
As nanopartículas de quitosana foram obtidas pela técnica de gelificação
iônica apresentando diâmetro de partícula variando entre 150 e 200 nm, com
tamanho de partícula homogêneo. Foi observada uma alta eficiência de
encapsulação dos nanossistemas para os venenos do escorpião T. serrulatus e para
as serpentes B. jararaca e B. erythromelas. Essa eficiência foi comprovada pela
dosagem das proteínas livres no sistema, pelo ensaio de retenção das proteínas ao
polímero e ainda pelo infravermelho, que evidenciou as interações que ocorrem
entre os grupamentos que compõem a quitosana e as proteínas que foram
adicionadas ao sistema. Com a análise dos resultados obtidos no ensaio de
liberação, foi possível concluir, que o sistema obtido trata-se de um sistema de
liberação modificada, sendo bastante interessante sua utilização como adjuvante de
imunização. Os títulos de anticorpos obtidos, após a imunização dos animais com as
nanopartículas de quitosana, foram maiores ou iguais aos dos obtidos em animais
imunizados com o adjuvante convencional. Estas características conferem às
nanopartículas de quitosana a possibilidade de servir como base para a formulação
de um novo imunoadjuvante, que irá auxiliar na obtenção de um novo soro mais
eficaz, contra toxinas de venenos.
A obtenção, padronização e aplicação do nanossistemas como
imunoadjuvante na produção de soros e vacinas contra venenos de animais
peçonhentos proporcionou a produção de uma patente de inovação tecnológica, já
depositada e dois artigos científicos.
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ZYCHAR, B. C. et al. Contribution of metalloproteases, serine proteases and
phospholipases A2 to the inflammatory reaction induced by Bothrops jararaca crude
venom in mice. Toxicon, v. 55, n. 2-3, p. 227–234, 2010.
87 ANEXOS
- Patente depositada.
Sistemas nanoparticulados de quitosana aplicados como imunoadjuvante na
produção de soros contra venenos de animais peçonhentos.
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