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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
Werônica de Souza Rocha
Vacina contendo isolados de Corynebacterium pseudotuberculosis
para avaliação da resposta imunológica em fêmeas ovinas
Petrolina/PE
2016
UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
Werônica de Souza Rocha
Vacina contendo isolados de Corynebacterium pseudotuberculosis
para avaliação da resposta imunológica em fêmeas ovinas
Petrolina/PE
2016
Trabalho apresentado a Universidade
Federal do Vale do São Francisco –
UNIVASF, Campus Ciências Agrárias,
como requisito parcial para obtenção do
título de Mestre em Ciência Animal.
Orientador: Prof. Dr. Mateus Matiuzzi da
Costa
Rocha, Werônica
R672v
Vacina contendo isolados de Corynebacterium pseudotuberculosis para avaliação da resposta imunológica em fêmeas ovinas/Werônica de
Souza Rocha. -- Petrolina, 2016. X; 54f.: il. 16 cm. Dissertação de Mestrado (Curso de Pós-Graduação em Ciência
Animal) - Universidade Federal do Vale do São Francisco, Campus Ciências Agrárias, Petrolina, 2016.
Orientador: Prof. Dr. Mateus Matiuzzi da Costa. Referências.
1. Corynebacterium pseudotuberculosis x. 2. Vacina. 3.
Lectina. I. Título. II. Universidade Federal do Vale do São Francisco
CDD 615.372
Ficha catalográfica elaborada pelo Sistema Integrado de Biblioteca SIBI/UNIVASF
AGRADECIMENTOS
À Deus por me permitir alcançar mais um objetivo, me dando vida e saúde
para tornar tudo isso possível.
Minha família por me dar sempre o apoio necessário, pelos ensinamentos
constantes e por todo amor. Meu esposo pelo apoio, atenção e paciência. Meus
amigos que fizeram dessa caminhada mais leve.
Agradeço ainda ao meu orientador prof. Mateus Matiuzzi pelos
ensinamentos e orientação, ao prof. Rodolfo Peixoto e prof. Wagner Félix pela
dedicação em meu auxílio.
Sou imensamente grata a todos os meus amigos, os de perto, os de longe e
especialmente aos amigos do Laboratório de Microbiologia pela amizade, auxilio e
descontrações do dia a dia.
Agradeço a UNIVASF por ceder o espaço para realização do meu trabalho,
à FACEPE pela concessão da bolsa, ao CNPq pelo auxílio financeiro para o
desenvolvimento do projeto, ao Laboratório de Bioquímica do CCA da UNIVASF e
à UFBA, na pessoa de Maria da Conceição (Ceiça), pelo auxilio no
desenvolvimento de atividades.
Gostaria ainda de agradecer a secretária do CPGCA Rosangela (Rosinha)
pelo carinho, cuidados e prestatividade de sempre.
Muito obrigada a todos que de alguma forma contribuíram para realização
desse trabalho.
RESUMO
A ovino-caprinocultura é uma área que vem apresentando um forte crescimento
no Brasil nas últimas décadas, com um rebanho constituído por 17.668.063 e
9.386.316 cabeças, respectivamente. Com o crescimento dos rebanhos, vem
aumentando também a incidência das doenças bacterianas. Para o combate a
essas enfermidades, tem-se estudado a utilização de vacinas. A constituição destas
vacinas podem variar entre DNA, células bacterianas mortas, as bacterinas, e
células bacterianas vivas, pela toxina inativada, os toxóides, do Corynebacterium
pseudotuberculosis, ou pela associação destes componentes, utilizando ou não
algum tipo de adjuvante. Diante disso, o objetivo do presente trabalho foi elaborar
uma vacina à base de células bacterianas de C. pseudotuberculosis, avaliar a
resposta imunológica com base na técnica da atividade bactericida do soro de
fêmeas ovinas vacinadas, avaliando ainda a atividade hemaglutinante no extrato
de C. pseudotuberculosis. Para o alcance desses objetivos foram utilizadas as
seguintes metodologias: os isolados utilizados para elaboração da vacina foram
isolados de caprinos pertencentes as cidades de Petrolândia e Jatobá, PE, isolados
e cultivados na bacterioteca do laboratório de microbiologia e imunologia animal da
Univasf. Os animais após vacinados, passaram por coletas de sangue semanais e
com o soro obtido através destas coletas foi realizada a atividade bactericida. O
extrato obtido dos três isolados, foi colocado em contato com hemácias de coelho
para avaliar a atividade hemaglutinante no extrato, a qual foi avaliada visualmente.
Foi possível observar que após a vacinação, o sistema imunológico dos animais
respondeu de forma positiva, sendo possível observar do aumento da atividade
bactericida do soro desses animais, diminuindo a contagem de UFC/mL com o
passar das coletas, fato este que está relacionado com a ativação do sistema de
defesa dos animais, conhecido como sistema complemento. O ensaio de
hemaglutinação utilizando hemácias de coelho foi positivo para função biológica da
proteína com o extrato proteico, indicando presença de lectinas no conjunto de
proteínas do C. pseudotuberculosis.
Palavras-Chave: Corynebacterium pseudotuberculosis, vacina, lectina.
ABSTRACT
The sheep-goat is an area that has shown strong growth in Brazil in recent decades,
with a herd consisting of 17,668,063 and 9,386,316 heads, respectively. With the
growth of herds, it has also increased the incidence of bacterial diseases. To combat
these diseases, we have studied the use of vaccines. The constitution of these
vaccines may vary between DNA killed bacterial cells, bacterins, and live bacterial
cells, the inactivated toxin toxoids of Corynebacterium pseudotuberculosis, or the
combination of these components, with or without some type of adjuvant. Thus, the
objective of this study was to develop a vaccine based on bacterial cells of C.
pseudotuberculosis, evaluate the immune response based on the technique of
bactericidal activity of serum from vaccinated sheep females still evaluating the
hemagglutination activity in extract C. pseudotuberculosis. To achieve these
objectives, the following methodologies were used: the isolates used for the
preparation of the vaccine were isolated from goats belonging to the towns of
Petrolândia and Jatoba, PE, isolated and cultured in bacterioteca microbiology
laboratory animal and Immunology UNIVASF. The animals vaccinated after,
underwent weekly blood samples and serum obtained through these collections was
held bactericidal activity. The extract obtained from three isolated, was put in contact
with rabbit red blood cells to evaluate the hemagglutination activity in the extract,
which was assessed visually. It was observed that after vaccination, the immune
system of animals responded positively and are recording increased bactericidal
activity of the serum of these animals, reducing the CFU / mL count over the
collections, a fact that is related to activation of the animal defense system known
as the complement system. The hemagglutination assay using rabbit erythrocytes
was positive for biological function of the protein with the protein extract, indicating
the presence of lectins on the set proteins of C. pseudotuberculosis.
Keywords: Corynebacterium pseudotuberculosis, vaccine, lectin.
LISTA DE GRÁFICOS E FIGURAS
Gráfico 1. Média de contagem de UFC/mL na avaliação da atividade
bactericida do soro de fêmeas ovinas vacinadas com bacterina preparada
com C. pseudotuberculosis – Soro tratado termicamente, A. Soro não
tratado termicamente, B................................................................................
34
Figura 1. Visualização da atividade hemaglutinante na presença do
extrato proteico de C. pseudotuberculosis e hemácias de coelho................
38
Figura 2. Cromatografia de afinidade de lectina extraída de C.
pseudotuberculosis......................................................................................
39
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Médias obtidas para UFC/mL (x106) na avaliação da atividade bactericida
do soro de fêmeas ovinas vacinadas e não vacinadas com bacterina preparada com
isolados de C. pseudotuberculosis.........................................................................35
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BHI- Brain Heart Infusion
g- grama
h- hora
kDa- QuiloDalton
kHz- Quilodalton
L- Litro
M- Molar
mg- Miligrama
min- Minuto
mL- Mililitro
nm- Nanomêtro
OD- Densidade óptica
rpm- Rotação por minuto
TSA- Tryptic Soy Agar
TSB- Tryptic Soy Broth
UFC- Unidade Formadora de Colônia
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...............................................................................................10
2. REVISÃO DE LITERATURA..........................................................................12
2.1 Importância econômica da criação de caprinos e ovinos............................12
2.2 Linfadenite caseosa.....................................................................................13
2.2.1 Etiologia e aspectos epidemiológicos ......................................................13
2.2.2 Patogenia..................................................................................................15
2.2.4 Mecanismos de defesa contra linfadenite caseosa..................................16
2.2.5 Sinais clínicos...........................................................................................17
2.2.6 Controle e profilaxia..................................................................................18
2.2.7 Utilização de vacinas no controle da linfadenite caseosa.........................19
2.2.8 Utilização de cromatografia de afinidade..................................................21
3. OBJETIVOS...................................................................................................23
3.1 Objetivo geral...............................................................................................23
3.2 Objetivos específicos...................................................................................23
4. MATERIAL E MÉTODOS...............................................................................24
4.1 Ensaio imunoenzimático (ELISA) para detecção de resposta contra C.
pseudotuberculosis .................................................................................24
4.2 Animais utilizados .............................................................................24
4.3 Seleção dos isolados a serem utilizados no preparo das vacinas........24
4.4 Preparo das vacinas..............................................................................24
4.5 Vacinação dos ovinos............................................................................25
4.6 Avaliação clínica dos animais................................................................26
4.7 Extração de proteínas de C. pseudotuberculosis..................................26
4.8 Atividade hemaglutinante......................................................................26
4.8.1 Coleta e preparo das hemácias..........................................................26
4.8.2 Detecção de atividade hemaglutinante no extrato..............................27
4.9 Atividade bactericida do soro.................................................................27
4.10 Cromatografia de afinidade.................................................................28
4.10.1 Extração de proteínas de C. pseudotuberculosis.............................28
4.10.2 Purificação da lectina por cromatografia de afinidade......................29
5. ANÁLISE ESTÍSTICA....................................................................................30
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................31
6.1 Teste de ELISA........................................................................................31
6.2 Vacinação ...............................................................................................31
6.3 Atividade bactericida do soro...................................................................32
6.4 Atividade hemaglutinante.........................................................................36
6.5 Cromatografia de afinidade em coluna D-manose ligante.......................37
7.CONCLUSÃO..................................................................................................41
8. ANEXOS.........................................................................................................42
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................................43
10
1- INTRODUÇÃO
A ovino-caprinocultura é uma área que vem apresentando um forte
crescimento no Brasil nas últimas décadas, com um rebanho constituído por
17.668.063 e 9.386.316 cabeças, respectivamente. Enquanto que no Nordeste o
número desses animais é de cerca de 8.109.672 caprinos e 10.126.799 ovinos,
destacando-se no submédio do São Francisco, os Estados da Bahia e Pernambuco
apresentam-se como grandes produtores. Os munincípios de Casa Nova, Uauá,
remanso e Juazeiro no Estado da Bahia, destacam-se por sua produção, já no
Estado de Pernambuco, as cidades de Floresta, Custódia, Sertânia e Petrolina
também possuem números significativos do rebanho do estado (IBGE, 2014).
Reconhecida como uma atividade de extrema importância para a economia
brasileira e em plena expansão, a caprino-ovinocultura participa do
desenvolvimento socioeconômico do Nordeste e em especial da região Semiárida.
Nos últimos anos mudanças no sentido de melhorar e consolidar a cadeia produtiva
têm sido realizadas, visto que o semiárido possui em sua essência criações
voltadas para a subsistência. Apesar de existirem alguns entraves para o seu
crescimento associados em grande parte às condições climáticas, essa atividade
vem despertando a atenção de governantes, técnicos e produtores, com aumento
de pesquisas na área de produção animal até o beneficiamento dos seus produtos,
melhorando a organização dos produtores, as tecnologias de manejo nutricional,
reprodutivo e genético, para aumentar a demanda e principalmente a qualidade do
negócio como um todo (SEBRAE, 2005; VIDAL et al., 2006).
Apesar do tamanho dos rebanhos nessas regiões e de sua participação na
renda familiar, a sua produtividade ainda é baixa, devido a diversos fatores, como
a irregularidade das chuvas, causando escassez de alimentos e manejo sanitário
inadequado ou ausente. No entanto, nos últimos anos ressalta-se melhoria nos
sistemas de criação dos pequenos ruminantes em função do aumento da demanda
de carne e leite pelo mercado consumidor (PEDROSA et al., 2003).
11
Sá et al., 2013, observaram uma elevada incidência de lesões características
de linfadenite caseosa e consequente isolamento de Corynebacterium
pseudotuberculosis em ovinos e caprinos provenientes dos abatedouros das
cidades de Petrolina / PE e Juazeiro / BA, Brasil. Nesse mesmo estudo, destacaram
a comum ocorrência de lesões generalizadas características da linfadenite caseosa
que acomete os animais desta região.
Dentre as enfermidades que ocorrem por falta de adoção do manejo
sanitário, destaca-se a Linfadenite Caseosa (LC) popularmente conhecida como
mal do caroço. Esta enfermidade crônica é causada pelo agente Corynebacterium
pseudotuberculosis e caracteriza-se por abscessos externos e internos. Como
consequência da infecção, o animal apresenta enfraquecimento geral e baixa
produção de carne e leite, chegando a causar a morte. Cerca de 90% das
propriedades caprinas do sertão do estado de Pernambuco apresentam a forma
clínica da doença (ALENCAR, 2010). O Corynebacterium pseudotuberculosis é o
agente causador da linfadenite caseosa em caprinos e ovinos, sendo responsável
por significativas perdas econômicas na ovinocaprinocultura mundialmente,
podendo acometer também a espécie equina (GUEDES, et a., 2015).
O objetivo do presente trabalho foi elaborar uma vacina à base de células
bacterianas de C. pseudotuberculosis, avaliar a resposta imunológica com base na
técnica da atividade bactericida do soro de fêmeas ovinas vacinadas, avaliando
ainda a atividade hemaglutinante no extrato de C. pseudotuberculosis.
12
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Importância econômica da criação de caprinos e ovinos
Ao longo de décadas, a caprinovinocultura foi considerada uma atividade
marginal ou de subsistência na região Nordeste do Brasil, normalmente com baixa
produtividade e realizada por produtores desprovidos de capital financeiro e de
recursos tecnológicos. Entretanto, atualmente, a produção destes pequenos
ruminantes caracteriza-se como uma atividade de grande importância cultural,
social e econômica para a região, desempenhando um papel crucial no
desenvolvimento do Nordeste (COSTA, R. G. et al., 2008).
A produtividade dos sistemas de criação é de extrema importância e nesse
contexto é necessário pesquisar formas de aumentar os índices produtivos da
caprino-ovinocultura (BOUTONNET, 1999; MORRIS, 2009).
De acordo com Moraes Neto et al. (2003), a caprinovinocultura representa
uma boa alternativa de trabalho e renda, visto a produção de alimentos de alto valor
nutricional (leite, carne e vísceras), bem como de pele de excelente qualidade, além
da adaptabilidade dos animais aos ecossistemas locais. Embora, segundo os
autores, em virtude do elevado grau de incertezas e riscos, a pecuária nordestina
torna-se dependente de uma reformulação dos modelos tradicionais de
planejamento e administração. Logo, torna-se necessário, inicialmente, um
conhecimento prévio dos sistemas de produção, atualmente utilizados no
Semiárido nordestino, de maneira a verificar os principais problemas existentes, e
numa etapa posterior solucioná-los, permitindo um desenvolvimento sustentável da
atividade na região (Castel et al., 2003).
Segundo Souza et al., (2015), a escolha certa da raça para criação variando
entre regiões, depende de vários fatores, tais como a finalidade, o mercado, a
localização, o clima, as características de adaptação dos animais e o nível
tecnológico adotado pelos produtores.
13
Segundo Filgueira (2009), o manejo sanitário dos caprinos e ovinos é
precário, a mortalidade de animais, independente do regime de criação é alta,
principalmente de jovens. Mesmo em propriedades destinadas a produção de leite,
muitas vezes, não existe uma preocupação rigorosa quanto a higiene e qualidade
do leite, aumentando as perdas por problemas sanitários.
Para a transição e consolidação da caprino-ovinocultura como agronegócio,
é necessário buscar o ganho coletivo, sensibilizar os envolvidos nos diferentes
segmentos da cadeia produtiva. Organizar, articular e integrar satisfatoriamente
todos esses segmentos, objetivando fornecer ao consumidor final uma carne de
qualidade, com regularidade de oferta através da produção em escala a um preço
competitivo, evitando o aparecimento de doenças infecciosas (SAMPAIO et al.,
2009).
2.2 Linfadenite caseosa
2.2.1 Etiologia e aspectos epidemiológicos
A linfadenite caseosa é distribuída em todo o mundo tendo sua distribuição
entre rebanhos de caprinos e ovinos, embora em algumas regiões a sua
prevalência pode estar sub notificada. A disseminação desta enfermidade em todo
o mundo provavelmente ocorreu por meio da importação de animais infectados
(GUIMARÃES et al., 2011).
Distribuída em grande parte do mundo, a LC é encontrada na América do
Norte e América do Sul, Austrália, Nova Zelândia, Europa, Ásia e África
(ARSENAULT et al., 2003). Souza et al. (2011), observaram a prevalência e a
distribuição de lesões da LC em ovinos no município de Mulungu (Paraíba) e
encontraram 15,9% de lesões macroscópicas semelhantes à LC. Em estudo no
sertão de Pernambuco, Alencar et al. (2010) visitaram 150 propriedades,
observando a presença de abscessos cutâneos, sugestivos de LC em 92,5% das
propriedades estudadas. No estado do Ceará, Pinheiro et al. (2000), analisaram
127 propriedades, verificando que a ocorrência de LC é de 66,9%.
14
O agente causador desta enfermidade é a bactéria C. pseudotuberculosis,
que foi descrita pela primeira vez por Nocard em 1888, em um caso de linfangite
bovina. Este microrganismo além de causar a linfadenite caseosa, tem sido relatado
em outras enfermidade por ele produzidas em diversas espécies, tais como a
linfangite ulcerativa dos equinos, abscessos superficiais em bovinos, suínos, cervos
e animais de laboratório. O patógeno também já foi isolado de búfalos, veados,
porco espinho, lhamas e camelos (DORELLA et al., 2006).
O C. pseudotuberculosis caracteriza-se como um bacilo Gram-positivo
pleomórfico, pequeno, irregular, imóvel, aeróbico, intracelular facultativo de
macrófagos, fermentativo e não formador de esporos. As colônias possuem
aspecto esbranquiçado e são rodeadas por zona estreita de hemólise completa,
medindo 0,5 a 0,6 μm por 1 a 3 μm, podendo apresentar aspecto cocóide, de clavas
ou bacilos, mostrando-se isolado ou formando grupamentos irregulares. Em
esfregaços, aparecem corados individualmente, em pares ou em paliçadas e em
grupos angulares semelhantes a letras chinesas (HOLT et al., 1994; QUINN et al.,
1994).
Os abscessos quando rompidos drenam conteúdo caseoso, espesso de
coloração branca, ou esverdeada, com consistência pastosa, que contém grande
quantidade de microrganismos viáveis, podendo sobreviver por meses no ambiente
(BELCHIOR, 2006; MCKEAN et al., 2007).
Peel et a., (1997), relataram dez casos de linfadenite caseosa em pacientes
humanos na Austrália. Em todos os casos os pacientes mantinham contato com
pequenos ruminantes, estes, por sua vez, eram portadores da enfermidade,
afirmando assim seu caráter zoonótico. Uma das formas que selecionaram para
controlar essa transmissão foi a vacinação dos animais que consequentemente
diminuiria a transmissão para os seres humanos.
15
2.2.2 Patogenia
A partir da infecção por via oral, respiratória e ou contaminação de feridas, a
bactéria sofre a fagocitose, por intermédio dos neutrófilos e macrófagos (PATON et
al., 2003). Um dos fatores que favorecem a infecção por C. pseudotuberculosis é
o tipo de vegetação existente onde as plantas atuam como causadoras de
ferimentos na pele de caprinos e ovinos (Riet et al., 2007).
Após a fagocitose o microrganismo mantém-se viável no interior celular e é
sequestrado principalmente para os linfonodos regionais, principalmente os pré-
crurais, pré-escapulares ou sub-mandibulares, induzindo a formação de múltiplos
piogranulomas (SMITH, 2003 e PUGH, 2004), que podem coalescer e formar
grandes abscessos (PATON et al., 2003). A disseminação do microrganismo do
linfonodo regional para outros órgãos e tecidos depende da virulência da linhagem,
da carga bacteriana infectante e quadro clínico do animal (BELCHIOR, 2006). A
bactéria atinge outros órgãos alvo incluindo pulmão, fígado, rins e encéfalo,
determinando a forma visceral grave da doença através da disseminação via linfo-
hemática (MCKEAN et al., 2007).
Existe uma camada lipídica no C. pseudotuberculosis que representa uma
proteção contra a ação degradativa das enzimas presentes em fagolisossomos,
permitindo também aderência dos microrganismos promovendo uma citotoxicidade
local (Radostits et al., 2002). Além disso, esta camada permite a sobrevivência da
bactéria por longos períodos no meio ambiente (Baird e Fontaine, 2007).
A produção de uma exotoxina denominada fosfolipase D (pld), também está
ligada a virulência desse microrganismo. Sabe-se que, nos estágios iniciais de
infecção, ela aumenta a sobrevivência e a multiplicação do C. pseudotuberculosis
(QUINN et al., 1994; MEYER et al., 2002). A enzima fosfolipase D (pld), que possui
ação de exotoxina glicoproteica ou citotoxina capaz de hidrolisar a esfingomielina,
atua no enfraquecimento das membranas celulares (HODGSON et al., 1999). Com
isso, acredita-se que a produção dessa toxina está intimamente ligada à
capacidade de disseminação bacteriana no hospedeiro, além de atuar no auxílio a
16
bactéria no escape da fagocitose por neutrófilos (D’AFONSECA et al., 2008;
YOZWIAK & SONGER, 1993).
Sá et al. (2013) em um dos seus estudos, observaram que dos 168 isolados
de C. pseudotuberculosis provenientes de caprinos e ovinos, utilizando a técnica
de PCR, confirmaram a presença do gene da fosfolipase D (PLD) em todas as
amostras.
A fosfolipase D é uma exotoxina responsável pela disseminação do
patógeno dentro do hospedeiro, além de atuar no aumento da permeabilidade
vascular local (CARNE; ONON, 1978). Seu papel na virulência foi confirmado
quando uma cepa modificada geneticamente para exotoxina mostrou-se incapaz
de causar a linfadenite caseosa (WALKER et al., 1994; SIMMONS; HODGSON;
STRUGNELL, 1997; SIMMONS et al., 1998).
O aumento da adaptabilidade das cepas em diferentes hospedeiros, podem
ser influenciados pelas ilhas de patogenicidade e fatores de virulência. Esta
característica está associada à absorção de ferro, carbono e magnésio atenuando
as condições de sobrevivência das bactérias sob condições de estresse (RUIZ et
al., 2011).
2.2.3 Mecanismos de defesa contra linfadenite caseosa
Em resposta a infecções, o sistema imune inato responde rapidamente à
invasão de algum agente patogênico. Um importante componente dessa resposta
imediata é o sistema complemento. Este, é composto por uma complexa rede de
comunicação no qual há uma interação entre proteínas de reconhecimento de
padrões, proteases, proteínas séricas, receptores e reguladores (TIZARD, 2014).
Por meio de diferentes vias, as proteínas do sistema complemento podem
ser ativadas, fazendo com que algumas dessas moléculas se liguem de forma
covalente à superfície de microorganismos invasores, estas, uma vez ligadas,
podem levar à lise celular. Em animais saudáveis não infectados, o sistema
complemento permanece inativo, sendo ativado por meio de padrões moleculares
associados a patógenos na superfície de agentes infecciosos ou por anticorpos
ligados a antígenos (TIZARD, 2014).
17
O C. pseudotuberculosis tem a capacidade de estimular a imunidade celular
por conta da sua natureza intracelular facultativa, assim como a imunidade humoral,
que é principalmente devido à produção do PLD (STING et al., 2012).
Pode haver padrões anormais da ativação do sistema caso haja deficiência
de qualquer componente proteico. Enquanto que a ausência de um dos
componentes iniciais das diferentes vias ou dos componentes formadores do
complexo lítico de membrana (MAC) pode levar a ativação deficiente, a ativação
exacerbada do complemento em local e momento indesejados, incrementando o
processo inflamatório, pode ser causada pela deficiência dos componentes
regulatórios (ABBAS, A.K. et al., 2000).
Em resposta a estímulos anormais, como microrganismos persistentes,
anticorpos contra antígenos próprios ou complexos imunes depositados em tecidos,
o sistema complemento também pode ser ativado. Os efeitos inflamatórios ou líticos
do complemento nestas doenças infecciosas ou autoimunes, podem contribuir
significantemente para a patogenia da doença, sendo que, a ativação do
complemento se dá por três vias principais: clássica, alternativa e das lectinas
(ABBAS, A.K. et al., 2000; PRODINGER, W.M. et al., 2003).
Para ativação da via das lectinas, há o envolvimento de moléculas de
reconhecimento de padrões solúveis que reconhecem carboidratos na superfície
de microorganismos. Essas lectinas, por se ligarem aos microorganismos, ativam
as proteases, que por sua vez, ativam o sistema complemento (TIZARD, 2014).
2.2.4 Sinais clínicos
A linfadenite caseosa é marcada por um processo inflamatório nos linfonodos,
caracterizado pela formação de abscessos com conteúdo purulento, de aspecto
caseoso e amarelado. Os linfonodos aumentam de volume, que com a evolução,
tornam-se flutuantes. Os pré-parotídeos e pré-escapulares, são os linfonodos
acometidos com maior frequência, sendo que, os linfonodos bronquiais e
mediastínicos também podem apresentar abcessos. Quando a LC acomete os
pulmões, causa quadros respiratórios como tosse crônica, quando nos linfonodos
18
mesentéricos leva ao emagrecimento progressivo do animal (SANTA ROSA, 1996;
RIBEIRO, 1997).
Al-Gaabary et al. (2009) no estudo realizado, observaram que os sinais
clínicos de linfadenite caseosa em ovinos e caprinos se manifestaram em forma de
abscessos dos gânglios linfáticos superficiais com tamanhos variáveis e em locais
diferentes, tanto abscessos fechados quanto abertos com conteúdo purulento,
algumas lesões apresentavam queda de pelo no local. Alguns animais infectados
mostraram emagrecimento progressivo.
Nos casos crônicos com lesões viscerais, o animal apresenta
hipoproteinemia e anemia e estes abscessos podem ser localizados em qualquer
órgão. A forma da doença que possui maior gravidade, é a visceral, visto que o
diagnóstico clínico é muito difícil. Esta forma clínica da LC muitas vezes leva à
debilidade do animal, disseminação de abscessos no organismo, condenação de
vísceras e carcaças, podendo levar ainda o animal à morte (SANTA ROSA, 1996).
A doença causa a redução no rendimento da carne, lã, leite, pele, diminuição
da eficiência reprodutiva, atraso no crescimento, menor ganho de peso, descarte
precoce de animais e comercialização dos animais por valor inferior ao praticado
no mercado, além de ser caracterizada pela formação de lesões necróticas
encapsuladas caseosa (SOUZA et al., 2011).
2.2.5 Controle e profilaxia
Um dos métodos de controle da linfadenite caseosa mais eficientes até o
momento em pequenos ruminantes são a identificação dos animais infectados e
sua remoção do rebanho (BINNS, 2002). Deve-se evitar dentro dos estábulos
objetos que possam provocar lesões cutâneas (VALE, 2003). Deve-se proceder a
higienização e desinfecção de agulhas, material cirúrgico, alicates de tatuagem e
todo objeto utilizado no manejo dos animais (WILLIAMSON, 2001). Todos os
animais que apresentarem lesões cutâneas deverão ser isolados até que tenham
seu diagnóstico elucidado (SENTURK, 2006).
19
Além de todos os cuidados tomados com desinfecção do ambiente e
segregação de animais infectados, a cuidadosa seleção na aquisição de novos
animais para o plantel, são medidas importantes na profilaxia da doença em ovinos
e caprinos (BINNS, 2007). In vitro, o C. pseudotuberculosis é sensível a vários
antimicrobianos usados na rotina veterinária, incluindo fármacos dos grupos dos
beta-lactâmicos e derivados (MOURA, 2010; QUINN, 1994). Porém, o
microrganismo é refratário no tratamento in vivo (MOURA, 2010; VALLI, 2007).
Este fato está relacionado com a espessa cápsula de tecido conjuntivo que reveste
os abscessos (WILLIAMSON, 2001) além do denso conteúdo caseoso presente no
interior dos piogranulomas dificultando a ação dos antimicrobianos (BAIRD, 2007).
Por se apresentar como um microrganismo intracelular obrigatório, sua viabilidade
intracelular é outro fator de virulência que limita a ação dos antimicrobianos
convencionais (RADOSTITS, 2006). Como parte do tratamento, é sugerida a
extirpação cirúrgica dos abscessos e ou linfonodos externos (VALE, 2003).
Contudo, é necessário o estabelecimento de medidas profiláticas como a
adoção de medidas sanitárias que permitam manter a prevalência da LC em níveis
aceitáveis, além de um rigoroso controle da introdução de animais na propriedade
(GUIMARÃES et al., 2011).
2.2.6 Utilização de vacinas no controle da linfadenite
Existem duas formas de imunização de animal contra infecções. A
imunização passiva que se dá por meio da administração de anticorpos pré-
produzidos em um animal saudável fornecendo proteção imediata, apesar de
resultar em uma imunidade de curta, e a outra forma é a imunização ativa, que se
utiliza de vacinas compostas por organismos vivos ou inativados, produzindo
também a imunidade, apesar do desenvolvimento lento, apresenta uma longa
duração (TIZARD, 2014).
Em sua grande maioria, as vacinas vivas estimulam uma resposta imune
mais eficaz quando comparadas com as vacinas compostas por organismos
inativados. Porém, as elaboradas com microorganismos inativados tentem a maior
20
seguridade. Tanto em humanos quanto em animais, a vacinação é a forma mais
segura e eficaz para o controle das doenças infecciosas (TIZARD, 2014).
Com o intuito de aumentar a eficiência de algumas vacinas, principalmente
as que são compostas por organismos inativados que possuem baixa
antigenicidade ou antígenos purificados, frequentemente tem-se adicionado
substâncias conhecidas como adjuvantes vacinais. Estes, tem a capacidade de
aumentar a velocidade ou a intensidade de resposta do corpo às vacinas,
permitindo reduções na quantidade de antígenos injetados, sendo também
essenciais no estabelecimento de uma memória prolongada contra antígenos
solúveis (TIZARD, 2014).
Moussa et al. (2016) observaram que a vacinação experimental de ovinos
contra linfadenite caseosa, composta de rPLD e células inativadas de C.
pseudotuberculosis, diminuiu claramente a prevalência e número de abscessos que
se formou secundário a infecção experimental por C. pseudotuberculosis nos
animais. Quando comparados os grupos de animais vacinados e não vacinados, o
primeiro grupo mostrou uma diferença entre 80-87% na redução do aparecimento
de abscessos.
Droppa et al. (2016) desenvolveu em seu estudo uma vacina à base de
proteína recombinante CP40 (rCP40) com um adjuvante (completo de Freund ou
saponina) e realizou o ensaio de imunização em modelos de rato fêmea, avaliando
sua eficácia. Os resultados indicaram que a proteína CP40 recombinante induziu
uma resposta imunológica especifica em ratos que foi capaz de proporcionar uma
proteção após desafio, independentemente do adjuvante usado na formulação.
Segundo Eggleton (1991) o controle desta enfermidade deve ser feito
principalmente através do diagnóstico precoce e pela utilização de vacinas. A
constituição destas vacinas podem variar entre DNA, células bacterianas mortas,
as bacterinas, e células bacterianas vivas, pela toxina inativada, os toxóides, do C.
pseudotuberculosis, ou pela associação destes componentes, utilizando ou não
algum tipo de adjuvante (FONTAINE et al., 2006; COSTA et al., 2011).
Em 1972 foram iniciados os primeiros experimentos que avaliaram a eficácia
das vacinas (CAMERON et al., 1969). O pesquisador Jolly em 1995, iniciou os
21
estudos sobre proteção dos animais contra o agente causador da linfadenite
caseosa, mostrando o envolvimento de toxóide na proteção.
Através de uma cepa atenuada de C. pseudotuberculosis, Ribeiro et al.,
(1991) produziram uma vacina que quando utilizada sem adjuvante mostrou
resultados significantes em caprinos, vindo a ter 83% de imunoproteção. Eggleton
et al., (1991) utilizando toxóide purificado obteve um nível semelhante de proteção
com antígenos derivados de sobrenadante de cultura.
Hodgson et al. (1992) mostraram que a infecção de ovelhas com cepas
avirulentas de C. pseudotuberculosis com a retirada do gene da fosfolipase D,
também teve a capacidade de induzir a imunidade o que demonstra a evidência de
que além da fosfolipase, outros antígenos também contribuem para a proteção.
Walker et al. (1994) observou que era possível obter células produtoras de
anticorpos no local da infecção, sendo possível identificar antígenos importantes
para a produção de vacinas. Estes pesquisadores isolaram uma proteína secretada
de 40kDa, que, usada como vacina associada a hidróxido de alumínio, estabeleceu
uma resposta protetora em 82% dos ovinos vacinados e reduziu em 98% as lesões
nos pulmões.
No período de 1992-1996 Stanford et al., (1998), realizaram um estudo com
o objetivo de avaliar a eficácia de uma vacina contendo células de C.
pseudotuberculosis associado a um dipeptídeo muramil (MDP), sendo ele um
imunoadjuvante originalmente isolado a partir de fragmentos da parede celular
bacteriana. Essa vacina mostrou manter os títulos de anticorpos elevados em
relação aos cordeiros do grupo controle por um período de 12 meses.
Por apresentar atividade intracelular, o C. pseudotuberculosis, faz com que
vacinas forneçam baixa proteção ao rebanho que, para se proteger dessa bactéria
a imunidade deve ser celular (COLLETT, 1994).
2.2.7 Utilização da cromatografia de afinidade
Em 1903, a cromatografia entra nos métodos de separação e seu posterior
desenvolvimento e evolução ocorre em 1930. Uma técnica que tem a finalidade de
separar compostos como, por exemplo, proteínas, que tem a capacidade de se ligar
22
não covalentemente e reversivelmente a moléculas especificas conhecidas como
ligantes, é a cromatografia de afinidade. Diferindo-se das técnicas de cromatografia
clássica, este método consegue separar a proteína com base em uma única
propriedade bioquímica. Nesse tipo de cromatografia, o ligante está ligado
covalentemente a matriz, devendo ele ser quimicamente inerte. A depender da
proteína a ser purificada, várias matrizes e ligantes podem ser usadas (VOET E
VOET, 1995).
Existe um grupo de proteínas que possui como característica principal a
capacidade especial de ligar-se a carboidratos, que atua na primeira linha de defesa
contra agentes patogênicos, este grupo é conhecido como lectinas. Atuando nas
funções biológicas básicas, incluindo regulamentar, adesivar, defesa contra
patógenos, prevenção da autoimunidade e muitos outros, eles estão presentes em
cada organismo (JUN, 2014).
Em um organismo, um número de diferentes lectinas está normalmente
presente em várias isoformas, chamadas isolectinas (VAN DAMME et al., 1998).
As lectinas, em seus diferentes tipos, distinguem-se de acordo com a sua estrutura
geral. Merolectinas contém um único domínio de ligação de carboidrato,
hololectinas são compostos de dois ou mais domínios de tais e chimerolectinas
contém domínios adicionais, não-lectina, geralmente tem função catalítica
(Peumans & Van Damme, 1995). Todos os organismos produzem lectinas que
atuam com várias funções biológicas e que podem reconhecer e ligar-se a
carboidratos específicos de forma reversível (JUN, 2014).
A maioria das lectinas tem múltiplos sítios de ligação que podem ser uteis
em associações de entrecruzamento com glicoreceptores específicos na superfície
da célula. Possuindo ainda um papel de moléculas de reconhecimento e interações
de molécula-célula, célula-célula e estão envolvidas em processos celulares,
incluindo adesão, migração, diferenciação, proliferação e apoptose. Além de que,
muitas lectinas induzem respostas fisiológicas diversas em vários organismos e
possuem propriedades de imunomoduladores (Perillo et al., 1998; Sharon & Lis,
1989).
23
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Caracterizar aspectos relacionados à estímulos imunológicos mediante
vacinação de ovelhas contra C. pseudotuberculosis, bem como determinar o papel
destes fatores na implementação de medidas de controle envolvendo a vacinação
dos animais.
3.2 Objetivos específicos
- Elaborar e avaliar o efeito de uma vacina de células bacterianas de C.
pseudotuberculosis em fêmeas ovinas SRD;
- Avaliar a atividade bactericida do soro dos animais vacinados;
- Determinar a atividade hemaglutinante no extrato de proteínas de C.
pseudotuberculosis.
24
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.2 Ensaio imunoenzimático (ELISA) para detecção de resposta contra C.
pseudotuberculosis
O teste de ELISA para detecção da reposta frente à infecção por C.
pseudotuberculosis, foi realizado como um teste de triagem para a escolha dos
animais a serem utilizados no desenvolvimento do experimento. Esse teste seguiu
descrições de Vale et al. (2003) e Binns et al. (2007).
4.1 Animais utilizados
Foram utilizadas 12 fêmeas ovinas da raça Santa Inês. Formou-se dois grupos,
sendo G1 (n=06): ovinos positivos para a presença de anticorpos contra C.
pseudotuberculosis no teste de ELISA e G2 (n=06): ovinos negativos para presença
de anticorpos contra C. pseudotuberculosis, também através do teste de ELISA. A
utilização dos animais foi aprovada junto ao comitê de ética (anexo 1).
4.3 Seleção dos isolados a serem utilizados no preparo das vacinas
Os isolados de C. pseudotuberculosis (n=3) a serem utilizados no preparo
das vacinas, foram escolhidos de acordo com o resultado da eletroforese em gel
de poliacrilamida com condições desnaturantes (SDSPAGE, 12%) das proteínas
extraídas (AMANSO, 2015). Essa metodologia seguiu descrições de Laemmli
(1970).
4.4. Preparo das Vacinas
Com base nos perfis eletroforéticos apresentado pelos isolados na SDS-
PAGE 12% em estudo anterior, foi possível selecionar três isolados para o preparo
25
da vacina. Inicialmente, as cepas de C. pseudotuberculosis foram cultivadas em
meio AS a 37ºC por 48h. Após o crescimento, uma suspensão das colônias em
solução salina (NaCl 0,15M) esterilizada foi preparada e a quantidade de bactérias
foi estimada em unidades formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL)
comparando-se uma diluição da suspensão com a escala 4 de Mac Farland, por
método turbidimétrico. Além deste método, determinou-se a concentração
bacteriana por espectrofotometria, no comprimento de onda 580nm, com densidade
óptica de 1,730 nm. Em seguida, foi adicionado 10% desta suspensão bacteriana
em solução salina em 100mL de BHI caldo para cultivo em shaker (180 rpm) a 37ºC
por 24 h.
Posteriormente, foi adicionado 0,6 % de formol na cultura vacinal para
inativação e novamente foi colocada em shaker (180 rpm) a 37ºC overnight. Uma
alíquota da cultura tratada foi semeada em meio BHI e Tioglicolato e incubadas à
37ºC por 48h para confirmar a inativação das células bacterianas. Após
confirmação da inativação, foi adicionada a bacterina 15% de hidróxido de alumínio
como adjuvante. Posteriormente, a bacterina foi semeada em placa de Petri
contendo meio de cultura BHI e incubada a 37ºC por 48 horas para verificar a sua
seguridade. Logo após, a bacterina foi mantida a 4ºC, conforme metodologia de
Grabowski et al. (2004).
4.5. Vacinação dos ovinos
Dos dois grupos G1 (n=06): ovinos positivos para a presença de anticorpos
contra C. pseudotuberculosis no teste de ELISA e G2 (n=06): ovinos negativos para
o mesmo teste, apenas os animais do G2 foram vacinados, os animais do G1, foram
utilizados como controles positivos e também foram avaliados quanto a atividade
bactericida do soro. A vacinação foi feita no primeiro dia do início do experimento,
momento 1 (M1) e repetida 30 dias após. As coletas iniciaram no primeiro dia do
experimento (M1) e as demais foram feitas semanalmente até que se completasse
um total de nove semanas (M1- M9). Os animais pertencentes ao grupo 2 foram
vacinados com duas doses de 1mL da bacterina produzida, por via subcutânea no
26
lado direito do pescoço. Este experimento seguiu descrições de Fontaine et al.
(2006).
4.6. Avaliação clínica dos animais
A avaliação clínica dos animais seguiu descrições de Vale et al. (2003) e Baird
& Malone (2010). O exame envolveu a palpação e inspeção visual dos linfonodos
superficiais na cabeça, pescoço e corpo.
4.7 Extração de proteínas de C. pseudotuberculosis
Os isolados bacterianos foram cultivados em 200mL de BHI (Brain Heart
infusion) e incubados a 37ºC por 72 h, sob agitação em shaker (150 rpm). As células
foram coletadas por centrifugação (5.000 rpm por 30 min, 7ºC). Foram
ressuspendidas com 10mL de NaCl (0,15 M) gelado, levando a centrifugação
(4.000 rpm por 5 min), o sobrenadante foi descartado e o precipitado foi utilizado.
Em tubo falcon, para cada 1mL do sobrenadante foram utilizados 20mL da solução
(NaCl 0,15M e 1% de SDS), deixando-o sob agitação lenta durante 4 h. Após este
período, realizou centrifugação (5.000 rpm por 30 min a 7ºC). Após esta etapa, o
precipitado foi descartado e realizada a diálise do sobrenadante com intuito de
retirar o excesso de SDS. Logo após, as proteínas foram armazenadas para
posterior utilização no teste de atividade hemaglutinante (PODGORSKYI, et al.,
2011).
4.8 Atividade hemaglutinante
4.8.1 Coleta e preparo das hemácias
As amostras de sangue foram coletadas assepticamente de coelho branco
da raça Nova Zelândia. As hemácias foram lavadas em NaCl (0,15 M) por quatro
vezes (1000 x g, 4ºC, 20 minutos). O sobrenadante foi descartado e o precipitado
(polpa de hemácias) foi utilizado para preparar a solução de hemácias a 2%.
27
4.8.2 Detecção de atividade hemaglutinante no extrato
Os ensaios de atividade hemaglutinante foram realizados em placas de
microtitulação de 96 poços. Em cada poço foi adicionado 50 μL de NaCl 0,15 M,
sendo ainda acrescidos 50 μL de extrato total apenas no primeiro poço, para
realizar a diluição seriada nos poços seguintes. Após diluição, adicionou-se, em
todos os poços, 50 μL da suspensão de eritrócitos 2% de coelho. O controle
negativo consistiu de 50 μL da solução NaCl 0,15 M mais 50 μL da solução de
hemácias 2%, sendo o controle positivo, composto por 50 μL da solução de NaCl
0,15 M mais 50 μL da solução de hemácias e 50 μL de Jacalina (lectina da
Artocarpus heterophyllus). Após 1h de repouso à 25ºC, a atividade hemaglutinante
foi avaliada visualmente, sendo o título expresso em Unidade de Hemaglutinação
(UH.mL-1), que corresponde ao inverso da maior diluição da amostra que
apresente nítida aglutinação (MOREIRA, 1977).
4.9 Atividade bactericida do soro
Os soros de animais vacinados e infectados naturalmente por C.
pseudotuberculosis foram obtidos por coleta asséptica do sangue em tubos
vacutiner sem anticoagulante. As amostras foram centrifugados (4.000 rpm por 10
min) e o soro obtido foi armazenado a 4ºC até sua posterior utilização.
As bactérias utilizadas na atividade foram provenientes da bacterioteca do
Laboratório de Microbiologia e Imunologia Animal da UNIVASF, sendo os mesmos
isolados utilizados para elaboração da vacina. Foram cultivados em caldo BHI a
37°C, durante 24h de incubação. Após este período, a suspensão bacteriana foi
lavada e centrifugada a 5000 rpm durante três minutos em solução de tampão
fosfato estéril (PBS), com pH 7,4, três vezes até à remoção completa do BHI. A
suspensão bacteriana foi diluída em PBS estéril a uma concentração de 1x108 UFC,
de acordo com a escala 0,5 de Mc Farland. Observando ainda a DO num
comprimento de onda de 546nm, obtendo-se um valor de 0,065 (Vandepitte et al.,
1993).
28
Foram utilizados dois grupos dos “pools” dos soros de cada momento, um
grupo com soro descomplementado, no qual passou por um tratamento térmico à
56ºC por 30 min e outro grupo com soro sem tratamento térmico. Aos soros de
ambos os grupo contidos em microtubos, numa alíquota de 500µL, foram
acrescentados 500µL da suspensão bacteriana na concentração de 1x108 UFC,
posteriormente, essa solução foi levada à estufa à 37ºC por 1h. Após o período na
estufa, foram feitas diluições seriadas, retirando o conteúdo de cada microtubo
transferindo-o para um tubo de ensaio com 9 mL de solução salina. Estas diluições
iniciaram na concentração de 10-1 até alcançar a 10-5. Feitas as diluições, foram
retirados 1mL de cada tudo e adicionados à placas de Petri, que por sua vez
receberam o meio BHI ágar, estando ele morno, sendo realizada a técnica de “pour-
plate”, procedimento realizado em duplicata. As placas foram levadas à estufa 37ºC
por 48h e posteriormente foi feita a contagem de colônias e dado o valor de
UFC/mL. No grupo controle, foi plaqueada a solução de bactéria com solução salina
(RAO et al., 2006 – Modificado).
4.10 Cromatografia de afinidade
4.10.1 Extração de proteínas de C. pseudotuberculosis
Os isolados utilizados na vacina foram semeados em BHI caldo e incubados
à 37ºC por 72h. Durante o período de incubação, foi feita a espectrofotometria do
cultivo de 12 em 12 horas para observar o pico de crescimento dos microrganismos.
Após este período, as células foram coletadas por centrifugação nas
condições de 500rpm por 15 min à 4ºC, em tubos de 50mL. Após a centrifugação,
o sobrenadante foi desprezado e o precipitado foi ressuspendido em tampão citrato
fosfato pH 6,5, 0,1M com NaCl 0,5M. Obtendo um volume final de 20mL. Foi
adicionado 3% de Tween 80, agitado vagarosamente deixando-o em contato com
a amostra durante 30 min. Após esse tempo, foi realizado o choque térmico
mergulhando a amostra durante 1 min no nitrogênio líquido e posteriormente
imergindo-a em banho maria 37ºC até o descongelamento da amostra. Esse
29
procedimento foi repetido por 5 vezes. Em seguida, foram adicionadas micro
pérolas de vidro e realizado o processo de hight speed friction em 10 sessões de 1
min cada, com intervalo de 30 segundos entre cada uma delas em banho de gelo.
Após esse processo, adicionou-se 10% de glicerol à amostra. Após a adição, as
células foram expostas ao banho ultrassônico com frequência ultrassônica de 42
kHz durante 5 ciclos de 1,5 minutos, adicionando gelo à cuba. Posteriormente, foi
adicionado a lisozima 20µg/mL deixando em contato por 4 horas e posterior
centrifugação por 30 minutos à 4ºC em uma velocidade de 13.000 g. Sendo então
alaborada uma nova metodologia para extração de proteínas de C.
pseudotuberculosis. Após a centrifugação, o sobrenadante foi coletado e
armazenado para posterior utilização na cromatografia.
4.10.2 Purificação da lectina por cromatografia de afinidade
A lectina foi isolada a partir da extração de proteínas das bactérias, utilizando
um procedimento de cromatografia em dois passos. Antes de dar início ao
processo, a coluna cromatográfica foi equilibrada com tampão PBS 0,1M com pH
7,4.
Para iniciar o processo, a amostra foi filtrada em micromembrana (0,22µm). O
conteúdo foi colocado em recirculação durante 2 horas com o auxílio da bomba
peristáltica nas seguintes condições: velocidade de 3,0 rpm, coletor 4,5 minutos e
1,5 mL por tubo. Após o período de recirculação, adicionou-se o tampão de eluição
PBS pH 7,4, 0,1 M para remover quaisquer proteínas que não se ligam
especificamente à manose, obtendo então o pico 1 (P1). Foi feita a leitura da DO
dessa eluição em espectrofotômetro num comprimento de onda de 280 nm. Em
seguida, para obtenção da concentração de lectina purificada adicionou-se o
tampão de eluição glicina pH 2,6, 0,1M. Com a adição da glicina, a lectina que
estava ligada à coluna foi desfeita sua ligação, coletada e também observada a DO
num comprimento de onda de 280 nm, obtendo então o pico 2 (P2).
30
5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
A normalidade dos dados foi confirmada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Os
valores obtidos de UFC/mL foram comparados entre os grupos (soro tratado e não
tratado termicamente – soro de animais vacinados e não vacinados), utilizando-se
o teste T para amostras independentes e entre os tempos experimentais pela
análise de variância para medidas repetidas. Para análise dos dados, foi utilizado
o programa Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) versão 20.0
para Windows.
31
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 Teste de ELISA
Dos 24 animais avaliados no teste de ELISA, 16 mostraram-se positivos para
presença de anticorpos anti-C.pseudotuberculosis (66%). Dos 16 animais positivos
ao teste, 6 foram selecionados para compor o grupo positivo (G1) e, dos demais
animais negativos ao teste, num total de 8, 6 foram selecionados para compor o
grupo negativo (G2).
6.2 Vacinação
A bacterina produzida com os três isolados de C. pseudotuberculosis, foi
devidamente elaborada e aplicada aos animais negativos ao teste de ELISA
conforme proposto na metodologia. Os animais não apresentaram reações
adversas no local da vacinação. A cada semana do experimento, foram coletadas
amostras de sangue dos animais em estudo, de forma asséptica, com as quais, ao
avaliar a resposta imunológica dos animais, foram obtidos resultados satisfatórios.
Em 1988, Ribeiro et al. formularam uma vacina inativada a partir de uma cepa
tendo como adjuvante o gel de fosfato de alumínio. Foram observados nesse
estudo, valores de proteção de 50 a 77%, onde a recomendação era vacinar os
animais depois de quatro meses de idade, pois antes disso os anticorpos advindos
do colostro inativariam a vacina.
Através de uma cepa atenuada de C. pseudotuberculosis, Ribeiro et al., (1991)
produziram uma vacina que quando utilizada sem adjuvante mostrou resultados
significantes em caprinos, vindo a ter 83% de imunoproteção. Enquanto Eggleton
et al., (1991) utilizando toxóide purificado obtiveram dados semelhantes de
proteção com antígenos derivados de sobrenadante de cultura. Porém, outros
estudos levaram pesquisadores a observarem que para uma ideal proteção contra
linfadenite caseosa, era necessária a associação de sobrenadante de cultura e
32
fragmentos celulares, toxóides associados com células, para ótima proteção
(BURRELL, D. H. 1983)
6.3 Atividade bactericida do soro
O aumento da atividade bactericida do soro detectado após a vacinação,
com consequente diminuição da contagem de UFC/mL (Gráfico1 - 1a e 1b), mostra
o aumento de proteínas séricas de proteção que normalmente ocorre após uma
infecção natural, tais como em surtos de doenças, ou em infecções artificiais, tais
como após a vacinação e desafio (BILLER-TAKAHASHI, J. D. et al., 2013). Pode-
se observar que houve uma maior atividade bactericida no grupo quando utilizado
o soro não tratado termicamente quando comparado com o soro tratado (P < 0,05).
Essa diferença entre os dois grupos pode ser observada a partir do momento 5
(M5), que por sua vez, está relacionada com uma semana após a segunda dose da
vacina. O mesmo se repete para avaliação dentro do grupo do soro não tratado
termicamente ao longo dos 9 momentos de coleta (M1-9), no qual a partir do M5,
houve um aumento da atividade bactericida do soro (P< 0,05). Não houve diferença
significativa entre o grupo do soro tratado termicamente ao longo dos nove
momentos (M1-9). Das 5 diluições, foi selecionada a 10-3 para a análise estatística,
visto que, esta diluição apresentou as melhores contagens de UFC/mL, entre 30 e
300.
Isso está relacionado ao fato de o soro tratado não possuir mais o
complemento que antes havia, pois, com o tratamento térmico há a
descomplementação do soro. Concordando com o que disse Collett (1994), para
se proteger dessa bactéria a imunidade deve ser celular. Em geral, quando uma
vacina é aplicada em várias doses significa que, a cada dose, há um aumento
progressivo da defesa do organismo. Afirmando o que disse Eggleton (1991), o
controle desta enfermidade deve ser feito principalmente através do diagnóstico
precoce e pela utilização de vacinas.
Comparando os dois grupos de soro de animais vacinados com animais não
vacinados, porém infectados naturalmente, também observou-se que houve
diferença significativa (P<0,05) entre os dois grupos a partir do M5, sendo que o
33
soro dos animais vacinados apresentou maior atividade bactericida (Tabela 2).
Afirmando o que disse Baird e Fontaine (2007), a vacinação é considerada também
como ação de profilaxia e reduz a ocorrência de linfadenite caseosa e abscessos
no rebanho em até 70%.
Gráfico 1. Média de contagem de UFC/mL na avaliação da atividade bactericida do soro de
fêmeas ovinas vacinadas com bacterina preparada com C. pseudotuberculosis – Soro tratado
termicamente, A. Soro não tratado termicamente, B.
Momentos de coleta – Nº de semanas
Méd
ia d
e U
FC/m
L
0
30
60
90
120
150
180
210
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Momentos de coleta – Nº de semanas
Méd
ia d
e U
FC/m
L
0
30
60
90
120
150
180
210
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Méd
ia d
e U
FC/m
L
A B
34
Tabela 1. Médias obtidas para UFC/mL (x106) na avaliação da atividade bactericida
do soro de fêmeas ovinas vacinadas e não vacinadas com bacterina preparada com
isolados de C. pseudotuberculosis
Animais vacinados – soro não tratado termicamente
Animais vacinados – soro tratado termicamente
Médias UFC/mL Médias UFC/mL
M1 0,198Aa 0,152Aa
M2 0,168Aa 0,109Aa
M3 0,093Aa 0,102Aa
M4 0,079Aa 0,093Aa
M5 0,061Aab 0,079Aab
M6 0,057Aab 0,066Aab
M7 0,051Aab 0,066Aab
M8 0,047Aab 0,062Aab
M9 0,045Aab 0,061Aab
Animais não vacinados – soro não tratado termicamente
Animais não vacinados – soro tratado termicamente
Médias UFC/mL Médias UFC/mL
0,168 Aab 0,181 Aab A letra M significa os momentos semanais de coleta;
Para cada momento, valores seguidos por letras maiúsculas iguais não diferem entre si (P > 0,05);
Para cada grupo, valores seguidos por letras minúsculas iguais não diferem entre si (P > 0,05);
As respostas imunológicas também podem ser controladas pela ação dos
linfócitos T reguladores (Treg). Citocinas como interleucina 10 (IL-10) e fator de
crescimento β (TGF-β) são secretados pelos Tregs (TIZARD, 2014).
O agente patogênico pode influenciar na libertação de citosinas inflamatórias
tais como a interleucina 1 (IL-1), interleucina 6 e Fator α (IL-6) e, que são proteínas
sintetizadas pelo fígado, encéfalo ou células do sistema imunológico que atuam em
reparação de tecidos, homeostase e modulação da atividade do sistema de defesa
inato e adquirido (Bayne e Gerwick, 2001; Magnadottir et al, 2011).
Existe ainda o sistema imune adaptativo, que é um sistema sofisticado que
pode reconhecer invasores, responder à sua invasão, de forma que, num próximo
contato com o microorganismo invasor, a sua resposta seja mais rápida e eficaz,
havendo a ativação de diversas vias intracelulares no desencadeamento da
resposta imune inata pelo reconhecimento de receptores de reconhecimento
35
padrão. A ativação dessas vias pode influenciar a capacidade do animal de montar
respostas imunes adaptativas (TIZARD, 2014).
Regulador da inflamação pela secreção de uma citocina chamada IL-17, os
linfócitos Th17 também compõe outra subpopulação de linfócitos T. Os linfócitos T
CD4+ diferenciam-se em linfócitos Th17 quando são expostos a IL-6 mais TGF-β.
Os linfócitos Th17 são potentes indutores da inflamação aguda e desempenham
um papel importante na defesa do hospedeiro. Eles são linfócitos convencionais
pequenos que são abundantes da superfície das mucosas. A presença desses
linfócitos nesses tecidos da superfície é regulada pela microbiota intestinal. As
células dendríticas e os macrófagos ativados por PAMPs microbianos através de
TLR2 secretam IL-23. A IL-23 promove a sobrevivência e a ativação de linfócitos
Th17. Estes secretam IL-17 e IL-22. O IFN-γ suprime o desenvolvimento de
linfócitos Th17 inibindo a inflamação mediada por IL-17 (TIZARD, 2014).
Existem seis membros na família do IL-17 (IL-17A a IL-17F), sendo que, o
IL-17A e IL-17F são os mais importantes membros da família. A IL-17A está
envolvida no desenvolvimento de autoimunidade, inflamação e alguns tumores, já
a IL-17F está envolvida, principalmente, na defesa da mucosa. A IL-17A é um
homodímero de 35 kDa produzida pelos linfócitos Th17. As células endoteliais e os
macrófagos parecem ser os principais alvos dessas citocinas, uma vez que a IL-
17A ou IL-17F mais TNF-α podem estimulá-los a produzir moléculas pró-
inflamatórias. Isso inclui quimiocinas CXC, G-CSF, GM-CSF, IL-1 e IL-6,
mediadores inflamatórios, tais como proteínas de fase aguda e proteínas do
sistema complemento, e defensinas antibacterianas (TIZARD, 2014).
A IL-17 atua na regulação do acúmulo de neutrófilos na inflamação aguda
sendo crucial para coordenar as defesas do hospedeiro contra muitos fungos e
bactérias. Os linfócitos Th17, por exemplo, exercem um papel importante na defesa
contra patógenos como Klebsiella pneumoniae, Citrobacter rodentium, Salmonella
enterica, Mycobacterium tuberculosis e Candida albicans. Acredita-se que os
linfócitos Th17 ajam desencadeando a inflamação e recrutando células
inflamatórias precocemente na infecção, levando à rápida erradicação do patógeno
(TIZARD, 2014).
36
Existem vários protocolos para avaliar a atividade bactericida do soro, porém,
o procedimento adotado neste trabalho se mostrou eficiente e de menor
complexidade quando comparado com outros trabalhos. A metodologia utilizada
por Chen e Ainsworth (1992) para avaliar a morte bacteriana, utilizou uma
suspensão de macrófagos em vez de soro, onde as células atuaram da mesma
maneira como o soro, reduzindo a quantidade de UFC e promovendo a redução em
seus números nas placas. A vantagem deste estudo é devido ao uso de soro como
um agente para a destruição das UFC, dado que todo o processo de preparação
de células é trabalhoso e delicado.
6.4 Atividade hemaglutinante
Com relação a detecção e caraterização da presença de lectinas nas células
de C. pseudotuberculosis, o ensaio de hemaglutinação foi positivo. Isto indica a
função biológica da proteína no extrato proteico, apontando a presença de lectinas
em C. pseudotuberculosis. Nas linhagens bacterianas, as lectinas estão envolvidas
na fixação destes microrganismos aos tecidos dos hospedeiros e nos mecanismos
de infecção (INOUE et al., 2003).
O ensaio de hemaglutinação é um método simples e fácil de obter dados semi-
quantitativos sobre a ligação de açúcar e especificidade de uma lectina. Uma lectina
ativa, aglutina eritrócitos por reconhecer um hidrato de carbono na superfície celular
e a formação de uma rede de ligação cruzada em suspensão (JUN, 2014)
Um composto presente no extrato, apresentou capacidade de aglutinar células
e precipitar glicoconjugados, que é uma característica exclusiva das lectinas. A
atividade hemaglutinante nos eritrócitos foi detectada visualmente através da
formação, após uma hora de incubação, de uma malha ou rede de hemácias que
cobria o fundo e os lados dos poços (figura 1). Por outro lado, foram considerados
negativos os poços onde se visualizava um botão compacto de células no fundo do
poço.
37
AH – Amostra + hemácias; CP – Controle positivo; CN – Controle negativo
Figura 1. Visualização da atividade hemaglutinante na presença do extrato
proteico de C. pseudotuberculosis e hemácias de coelho.
Os resultados obtidos demonstram a presença de proteína com capacidade
de hemaglutinar eritrócitos nos isolados de C. pseudotuberculosis. A capacidade
de uma proteína de se ligar a carboidratos e aglutinar eritrócitos se constitui na
característica fundamental para que esta seja definida como lectina (SHARON &
LIS, 1990). Sendo assim, concluímos que nos isolados de C. pseudotuberculosis
utilizados neste experimento, existem proteínas capazes de reconhecer os
receptores presentes na membrana dos eritrócitos de coelho ligando-se a estes e
promovendo a aglutinação celular.
6.5 Cromatografia de afinidade em coluna D-manose ligante
Após confirmar a presença de lectina pelo teste da HA, foram extraídas as
proteínas totais dos isolados e utilizada técnica de cromatográfica para o
isolamento de lectina a partir do extrato bruto de acordo com a afinidade específica
de ligação a carboidratos, neste caso, lectina que se liga à D-manose, no
cromatograma pode-se observar a presença de dois picos, o P1 que representa
38
todas as proteínas que não se ligaram manose, e o P2 que representa a lectina que
antes ligada a D-manose, foi eluida (gráfico 3).
Figura 2. Cromatografia de afinidade de lectina extraída de C.
pseudotuberculosis
A cromatografia de afinidade, técnica mais comumente utilizada, baseia-se
na habilidade das lectinas se ligarem especificamente a suportes polissacarídicos
através dos seus sítios específicos para ligações não covalentes. A proteína
desejada pode ser obtida com alto grau de pureza (YE e NG, 2002) pela eluição
com uma solução contendo um competidor (OLIVEIRA et al., 2002). As matrizes de
afinidade podem ser selecionadas de acordo com a especificidade da lectina a
carboidratos.
As lectinas são componentes do sistema complemento, que, quando
estimulada, sua via é ativada. Existem 3 vias de ativação: a via Clássica,
dependente de anticorpo; a via das Lectinas e a via Alternativa, ambas
independentes de anticorpo (TIZARD, 2014).
A Lectina ligante da manose (MBL) e as ficolinas, compões as lectinas
ativadoras dessa via. Não se ligando às glicoproteínas de mamíferos, as MBL tem
a capacidade de ligar-se a bactérias, fungos, protozoários parasitas e vírus pela
ligação com a manose ou N-acetilglucosamina presente na parede das células
Ab
sorb
ânci
a 2
80
nm
P1
P2
P1
P2
Frações- (mL)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
2 6 10 14 17 20 24 28 32 36 40 44 48 51 53 55
P2
P1
39
microbianas. Uma vez que estabelecida essa ligação, a MBL ativa a MASP-2, uma
protease sérica, sendo ela associada à MBL. Consequentemente, a MASP-2 irá
agir no componente C4 do complemento, clivando-o em C4a e C4, originando um
grupo carbonil reativo, este, liga o C4b de maneira covalente à superfície do
microorganismo.C2, outro componente do sistema complemento, se liga ao C4b
para formar o complexo C4b2, o C2 ligado anteriormente é clivado MASP-2 para
gerar C4b2b. O C4b2b ligado à superfície microbiana é uma protease que atua na
quebra o C3 para gerar C3a e C3b expondo o grupo tioéster no C3b. A ativação do
C3b pelo C4b2b é o passo principal pois cada complexo C4b2b pode gerar até 200
moléculas de C3b. Uma vez que estas reações são geralmente confinadas ao
microambiente próximo das superfícies microbianas, o C3b recentemente formado,
diferentemente, irá se ligar aos microorganismos próximos. A ligação do C3b então
liga o C5 e o cliva em C5a e C5b. Essa cascata do complemento poderá então
continuar a eliminar microorganismos com os complexos terminais do
complemento. Sendo que, os anticorpos, isoladamente, opsonizam as bactérias.
Os anticorpos e os componentes do sistema complemento podem realizar a
opsonização das bactérias ou destruí-las diretamente por meio do complexo
terminal (TIZARD, 2014).
Lectinas são proteínas amplamente versáteis e quando purificadas, devido a
sua especificidade de ligação a carboidratos, têm demonstrado um papel
interessante em modelos médicos e biológicos, sendo assim consideradas
importantes ferramentas na compreensão da sinalização e modulação da resposta
biológica (GOSH et al., 1999; CECHINEL el al., 2001; LOPES et al., 2005; DAS et
al., 2007; KHIL et., al 2007; SONG, et al., 2007).
Farrokhi et al. (2016) em um dos seus estudos, avaliaram os níveis séricos
de MBL em pacientes com distúrbios neurológicos auto-imunes, incluindo:
esclerose múltipla, síndrome de Guillain-Barre e miastenia gravis, avaliando a
correlação entre a concentração sérica média de MBL com a gravidade e outras
características clínicas dos pacientes. No qual observaram que o nível plasmático
de MBL aumentou significativamente em pacientes com as enfermidades avaliadas
em comparação com o grupo controle, composto por pessoas saudáveis. Além
40
disso, o nível plasmático de MBL estava diretamente correlacionado com a
gravidade destas doenças neurológicas autoimunes. Os resultados sugeriram que
a ativação do complemento mediado por MBL contribuiu com a gravidade da
patogenia das enfermidades, sugerindo que a via da lectina pode estar envolvida
em várias fases da resposta imunológica.
Por ativarem o sistema complemento dos indivíduos, o uso dessas lectinas
na elaboração de vacinas vem sendo estudado há algum tempo em diversas áreas
da saúde e se faz necessário maior ampliação destes estudos e aplicações desta
técnica para elucidar seus mecanismos e avaliar sua eficácia.
ANDERSEN (1994), avaliou o efeito de uma vacina produzida à partir de
proteínas extraídas do Mycobacterium tuberculosis. Camundongos foram
vacinados e posteriormente desafiados com uma suspenção do M. tuberculosis.
Foi então avaliada a sua resposta imunológica e observado que a vacina conferiu
proteção significativa para os animais vacinados em questão.
NOGUEIRA et al. (2010), demonstram a existência de uma nova lectina
secretada a partir de M. tuberculosis, que é encontrada em pacientes durante a
infecção ativa pela tuberculose. Estas observações sugeriram que a SMTL-13,
lectina estudada, foi caracterizada como um potencial biomarcador eficaz no
diagnóstico / tratamento, bem como alvo de imunização. A este respeito, nota-se
que os antígenos segregados podem ser utilizados como testes de diagnóstico,
bem como serem candidatos a potenciais vacinas e utilizados em ensaios clínicos
recorrentes.
Esse foi o primeiro estudo que conseguiu realizar com sucesso a extração
de proteínas do C. pseudotuberculosis, isolados estes que foram utilizados na
elaboração de uma vacina, e demonstrou a presença da proteína lectina, isolando-
a através da técnica de cromatografia de afinidade, a qual será utilizada em estudos
futuros como base para elaboração de métodos de imunização.
41
6 . CONCLUSÃO
A vacina elaborada foi capaz de conferir proteção nos animais testados devido
a atividade bactericida do soro desses animais. Os isolados de C.
pseudotuberculosis utilizados apresentam lectina, que é capaz de estimular o
sistema imunológico dos animais.
42
8. ANEXOS
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