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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A
PRODUTOS PARA A SAÚDE
CARACTERIZAÇÃO DE Pseudomonas aeruginosa ENCONTRADAS
COLONIZANDO E/OU INFECTANDO PACIENTES QUEIMADOS INTERNADOS
EM UM HOSPITAL PÚBLICO DA CIDADE DO RIO DE JANEIRO
KEILA DE CÁSSIA FERREIRA DE ALMEIDA SILVA
NITERÓI
2016
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A
PRODUTOS PARA A SAÚDE
CARACTERIZAÇÃO DE Pseudomonas aeruginosa ENCONTRADAS
COLONIZANDO E/OU INFECTANDO PACIENTES QUEIMADOS INTERNADOS
EM UM HOSPITAL PÚBLICO DA CIDADE DO RIO DE JANEIRO
KEILA DE CÁSSIA FERREIRA DE ALMEIDA SILVA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
graduação em Ciências Aplicadas a Produtos
para Saúde da Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal Fluminense para
obtenção do título de mestre.
Orientadora: Drª LENISE ARNEIRO TEIXEIRA
Coorientadores: Drª LUCIANA MARIA RAMIRES ESPER
Dr. GERALDO RENATO DE PAULA
NITERÓI
2016
S586c Silva, Keila de Cássia Ferreira de Almeida
Caracterização de Pseudomonas aeruginosa encontradas colonizando e/ou infectando pacientes queimados internados em um hospital público da cidade do Rio de Janeiro. / Keila de Cássia Ferreira de Almeida Silva. - Niterói, 2016.
85 f.Orientadora: Lenise Arneiro Teixeira
Co-orientadores: Luciana Maria Ramires Esper; Geraldo Renato de Paula
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Farmácia, Pós-graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para a Saúde, 2016.
1. P. aeruoginosa. 2. Biofilme. 3. Virulência. 4. Resistência. I. Teixeira, Lenise Arneiro, orient. II. Título .
CDD: 616.92
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KEILA DE CÁSSIA FERREIRA DE ALMEIDA SILVA
CARACTERIZAÇÃO DE Pseudomonas aeruginosa ENCONTRADAS
COLONIZANDO E/OU INFECTANDO PACIENTES QUEIMADOS INTERNADOS
EM UM HOSPITAL PÚBLICO DA CIDADE DO RIO DE JANEIRO
Aprovado em 22 de fevereiro de 2016
BANCA EXAMINADORA
Profª Drª Lenise Arneiro Teixeira – UFF
Orientadora
Profª Drª Maria Regina Branquinho – FIOCRUZ
Profª Drª Cláudia Rezende Vieira de Mendonça Souza – UFF
Revisora
Prof. Dr. Geraldo Renato de Paula – UFF
Coorientador
Profª Drª Luciana Maria Ramires Esper – UFF
Coorientadora
NITERÓI
2016
4
Dedico este trabalho:
Aos meus pais Josaphat e Zênia, pelo exemplo de amor, dedicação e ensinamentos de toda
uma vida;
Ao meu esposo Vander e minha filha Laura, pelo amor, paciência, compreensão e incentivo
em todos os momentos.
5
AGRADECIMENTOS
A Deus em primeiro lugar, por me capacitar a cada dia com seu Espírito Santo e me conduzir
a esta conquista;
À professora Dra. Lenise Arneiro Teixeira, que me acolheu após tantos anos afastada da vida
acadêmica, sendo sempre solícita, compreensiva e amiga durante esses dois anos de intenso
aprendizado;
Ao professor Dr. Geraldo Renato de Paula, por toda orientação, dedicação, paciência e
incentivo;
À professora Dra. Luciana Maria Ramires Esper, por toda orientação, recomendações e
sugestões;
À querida Patrícia Vollu, por todo o apoio, sugestões e amizade;
À querida Mariana Calomino, que tanto contribuiu com este trabalho;
Às queridas Bruna Barreto e Fernanda Pessanha, por serem sempre solícitas e parceiras;
À querida Gabriela Deutsch, por ter iniciado este estudo e me proporcionado dar continuidade
ao mesmo;
Ao Sr.Vilmar e Ozéias, por colaborarem na realização dos experimentos;
À professora Renata Picão, e Raphael Silva pelas sugestões e suporte experimental;
A todos os professores deste programa de pós-graduação, bem como a coordenadora
professora Dra. Kátia Lima, sempre muito atenciosa e dedicada;
À agência de fomento Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES),
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação Carlos
Chagas de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e Pró-reitoria de
6
Pesquisa, Pós-graduação e Inovação (PROPPi) da Universidade Federal Fluminense, pelo
incentivo à pesquisa;
E a todos que contribuíram direta ou indiretamente com este trabalho,
muito obrigada!!!!
7
“Tudo posso naquele que me fortalece”.
Filipenses: 4, 13.
“A falsa ciência cria os ateus; a verdadeira faz o
homem prostrar-se diante da divindade.”
Voltaire
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Categorias e agentes antimicrobianos propostos para caracterização dos isolados de
P. aeruginosa em MDR, XDR e PDR......................................................................................29
Tabela 2. Funções dos sete genes utilizados na tipificação de P. aeruginosa por
MLST........................................................................................................................................33
Tabela 3. Primers utilizados para detecção dos genes de resistência e virulência através da
PCR...........................................................................................................................................38
Tabela 4. Primers utilizados para amplificação e sequenciamento na tipificação por
MLST........................................................................................................................................45
Tabela 5. Perfil de resistência antimicrobiana, presença de genes de resistência e virulência,
formação de biofilme em placa (24h) e perfil PFGE de 35 cepas de P. aeruginosa coletadas de
pacientes queimados e mesa de balneoterapia..........................................................................50
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema gráfico do resultado do teste de atividade carbapenemase........................40
Figura 2. Percentual de cepas resistentes a diferentes agentes antimicrobianos.......................51
Figura 3. Resultados do teste de atividade carbapenemase após 4 horas de incubação............52
Figura 4. Formação de biofilme em cupom de aço inoxidável para 9 isolados de P.
aeruginosa.................................................................................................................................53
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LISTA DE ABREVIATURAS
AmpC β-lactamase que confere resistência às cefalosporinas e outros β-lactâmicos
ATCC American Type Culture Collection
CDC Centers for Disease Control and Prevention
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
CMI Concentração Mínima Inibitória
CTQ Centro de Tratamento de Queimados
CV Cristal de violeta
DNA Ácido desoxirribonucleico
eDNA Ácido desoxirribonucleico extracelular
DO Densidade ótica
ECDC European Centre for Disease Prevention and Control
EPS Exopolissacarídeo
ESBL β-Lactamases de amplo espectro
ExoS Exoenzima S
ExoU Exoenzima U
ExoT Exoenzima T
ExoY Exoenzima Y
FV Fator de Virulência
HFA Hospital Federal do Andaraí
HSL-A Homoserinas Lactonas Aciladas
IgG Imunoglobulina
IRAS Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde
LC-MS/MS Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial
LPS Lipopolissacarídeo
MBL Metalo-β-Lactamases
MDR Multidrug resistant
MLST Multilocus Sequence Typing
MYSTIC Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection
NNIS National Nosocomial Infections Surveillance System
OprD Proteína de membrana externa do tipo D
PBS Phosphate-buffered saline (salina tampão fosfato)
PCR Polymerase Chain Reaction
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PDR Pan-drug resistant
PFGE Pulsed-field Gel Electrophoresis
QRDRs Quinolone resistance-determining regions
QS Quorum sensing
RNAr Ácido ribonucleico ribossômico
RND Resistance-nodulation-cell division
SENTRY Antimicrobial Surveillance Program
TS Sequence type
T2SS Sistema de secreção tipo II
T3SS Sistema de secreção tipo III
TSA Trypticase Soy Agar
TSB Tryptic Soy Broth
UFC Unidade formadora de colônia
UTI Unidade de Tratamento Intensivo
VF Vermelho de fenol
XDR Extensively drug resistant
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RESUMO
Pseudomonas aeruginosa é um dos principais patógenos causadores de infecções graves em
pacientes queimados, estando associado a elevadas taxas de mortalidade e morbidade. A alta
plasticidade de seu genoma confere a este microrganismo a capacidade de tornar-se
multirresistente a antimicrobianos, dificultando o tratamento devido à redução de opções
terapêuticas. Este estudo teve como objetivo analisar 35 cepas de P. aeruginosa isoladas de
pacientes queimados e da mesa onde era realizada a balneoterapia em um centro de
tratamento de queimados (CTQ), determinando o perfil de resistência aos antimicrobianos, os
fatores genéticos relacionados à virulência e resistência antimicrobiana, a capacidade de
produzir biofilme e ação de biocidas sobre o mesmo, além de realizar tipificação molecular
das cepas envolvidas. A suscetibilidade antimicrobiana foi verificada utilizando o método de
disco-difusão, segundo os critérios do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). A
pesquisa de genes de resistência que codificassem β-lactamases (blaPER-1, blaCTX-M, blaOXA-10,
blaGES-1, blaVIM, blaIMP, blaSPM-1, blaKPC, blaNDM e blaSIM) e dos genes de virulência exoS e
exoU, foi realizada através da técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR). O teste
fenotípico Carba NP, foi utilizado com a finalidade de detectar atividade hidrolítica
enzimática à carbapenemas. A capacidade de formação de biofilme foi avaliada em placa para
microtitulação e em cupom de aço inoxidável, sendo este último utilizado para verificar a
eficácia de três agentes biocidas (hipoclorito de sódio 1%, peróxido de hidrogênio 5% e
clorexidina 4%) na remoção dos biofilmes formados. As cepas foram tipificadas através da
técnica de Multilocus Sequence Typing (MLST). De acordo com o teste de suscetibilidade
antimicrobiana, foi observado um elevado padrão de resistência, com 71,5% (25/35) das cepas
sendo resistentes a multidrogas (MDR). O maior percentual de resistência foi para o
ciprofloxacino (94,3%; 33/35), seguido da gentamicina (88,6%; 31/35). Também foi
observada resistência aos β-lactâmicos, inclusive à carbapenemas (22,9%; 8/35). Com relação
aos genes de resistência pesquisados foi encontrado em 34,3% (12/35) das cepas o blaGES-1 e
em uma única cepa o blaCTX-M. Nenhum gene codificador de carbapenemases pesquisado foi
encontrado. Da mesma forma, nenhuma atividade hidrolítica enzimática ao imipenem foi
detectada através do teste Carba NP, sugerindo que outros mecanismos de resistência possam
estar envolvidos, como superexpressão de bomba e perda de porina de membrana externa
(OprD). O gene de virulência exoS foi o mais prevalente estando presente em 71,4% (25/35)
das cepas, enquanto o gene exoU foi detectado em 14,3% (5/35), porém todas as cepas que
abrigavam este gene eram carbapenemas resistentes. Onze (31,4%) das 35 cepas, foram
formadoras de biofilme utilizando a placa de microtitulação, sendo estas em sua maioria
(81,8%) pertencentes ao clone A (obtido através de tipificação por PFGE em estudo prévio), o
qual era o mais prevalente infectando/colonizando pacientes e contaminando a mesa de
balneoterapia. A remoção do biofilme formado em superfície de cupom de aço inoxidável foi
eficaz para os três biocidas testados (hipoclorito de sódio 1%, peróxido de hidrogênio 5% e
clorexidina 4%), não havendo contagem de células viáveis das cepas analisadas após contato
com os mesmos. A tipificação por MLST originou dois tipos de sequenciamentos novos,
ST2236 e ST2237. Conclui-se com este estudo, que a redução de opções terapêuticas
associada à presença de genes de virulência, pode agravar a situação destes pacientes. Assim
como a presença de genes como blaGES-1 e blaCTX-M é preocupante, pois podem ser difundidas
entre as demais cepas por transmissão horizontal, se não houver um controle adequado.
Entretanto, o teste de remoção dos biofilmes mostrou que se a desinfecção for realizada de
maneira correta, a contaminação cruzada entre pacientes pode ser evitada.
Palavras chave: P. aeruginosa, biofilme, MLST, virulência, resistência
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ABSTRACT
Pseudomonas aeruginosa is major causative pathogens of serious infections in burn patients
and is associated with high mortality and morbidity rates. The high plasticity of its genome
confers to this organism the ability to become multiresistant to antibiotics, difficulting the
threathment due to reduced therapeutic options. This study aimed to analyze 35 strains of P.
aeruginosa isolated from burn patients and the tank where balneotherapy was held in a burn
treatment center (BTC), determining the resistance profile to antimicrobial agents, genetic
factors related to virulence and antimicrobial resistance, the ability to produce biofilms and
biocide action thereon and perform molecular typing of the strains involved. Antimicrobial
susceptibility was assessed using the disk diffusion method, according to the criteria of the
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). The research for resistance genes
encoding β-lactamases (blaPER-1, blaCTX-M, blaOXA-10, blaGES-1, blaVIM, blaIMP, blaSPM-1, blaKPC,
blaNDM and blaSIM) and the virulence genes exoS and exoU was performed using the
Polymerase Chain Reaction (PCR). The phenotypic test Carba NP, was used in order to detect
enzymatic hydrolytic activity to carbapenems. Biofilm formation ability was evaluated
through plate for microtitration and stainless steel coupon, the latter being used to verify the
efficacy of three biocides (sodium hypochlorite 1%, hydrogen peroxide 5% and chlorhexidine
4%) to remove formed biofilms. The strains were typed by Multilocus Sequence Typing
technique (MLST). According to the antimicrobial susceptibility test, a high resistance pattern
was observed in which 71.5% (25/35) of strains were multidrug resistant (MDR). The highest
percentage of resistance was to ciprofloxacin (94.3%; 33/35), followed by gentamicin (88.6%;
31/35). It was also observed resistance to β-lactams antibiotics, including the carbapenems
(22.9%; 8/35). Regarding the resistance genes investigated were found the blaGES-1 in 34,3%
(12/35) of the strains and the blaCTX-M in a single strain. None of the searched genes encoding
carbapenemases was found. Similarly, no enzymatic hydrolytic activity to imipenem was
detected by Carba NP test, suggesting that other resistance mechanisms may be involved,
such as pump over expression and loss of outer membrane porin (OprD). The exoS virulence
gen was the most prevalent being present in 71.4% (25/35) of the strains, while exoU was
detected in 14.3% (5/35), however all strains that harbored this gene were carbapenems
resistant. Eleven (31.4%) of 35 isolates were biofilm formers using the plate for
microtitration, which mostly (81.8%) belonging to clone A (obtained in a previous study by
PFGE) that was the most prevalent infecting/ colonizing patients and contaminating
balneotherapy tank. Removal of biofilm formed in stainless steel coupon surface was effective
for all three biocides tested (sodium hypochlorite 1%, hydrogen peroxide 5% and
chlorhexidine 4%), with no viable cell count after contact with biocides solutions. The MLST
originated two new sequencing types, ST2236 and ST2237. It is concluded from this study
that the reduction of therapeutic options associated with the presence of virulence genes, can
aggravate the situation of these patients. As well as the presence of genes as blaGES-1 and
blaCTX-M is worrying as they may be spread among the other strains by horizontal
transmission, if there is no adequate control. However, the removal test of biofilms showed
that, if the disinfection is carried out in a correct way, cross-contamination between patients
can be avoided.
Keywords: P. aeruginosa, biofilm, MLST, virulence, resistance
14
SUMÁRIO
1. Introdução …………………………………………………………………………...
15
2. Revisão da Literatura ……………………………………………………………….
17
3. Objetivo …………………………………………………………………………….
35
3.1 Objetivo Geral ………………………………………………………………….. 35
3.2 Objetivos Específicos …………………………………………………………..
35
4. Materiais e Métodos ………………………………………………………………..
36
4.1 Cenário de estudo ………………………………………………………………. 36
4.2 Cepas bacterianas ………………………………………………………………. 36
4.3 Teste de Susceptibilidade Antimicrobiana …………………………………….. 36
4.4 Detecção dos genes de resistência e virulência .................................................... 37
4.4.1 Extração do DNA bacteriano ...................................................................... 37
4.4.2 Polymerase Chain Reaction (PCR) ............................................................. 37
4.5 Teste de atividade carbapenemase ....................................................................... 39
4.6 Avaliação da capacidade de formação de biofilme .............................................. 41
4.6.1 Formação de biofilme em placa de microtitulação ..................................... 41
4.6.2 Formação de biofilme em cupom de aço inoxidável ................................... 42
4.6.3Avaliação da eficácia de agentes biocidas na remoção de biofilmes em
superfície de aço inoxidável .......................................................................................
43
4.7 Tipificação por MLST .......................................................................................... 44
4.8 Análise Estatística ................................................................................................
46
5. Resultados ..................................................................................................................
47
5.1 Teste de Susceptibilidade Antimicrobiana ……………………………………... 47
5.2 Detecção dos genes de resistência ........................................................................ 47
5.3 Detecção dos genes de virulência ......................................................................... 47
5.4 Teste de atividade carbapenemase ....................................................................... 48
5.5 Avaliação da capacidade de formação de biofilme .............................................. 48
5.5.1 Formação de biofilme em placa de microtitulação ..................................... 48
5.5.2 Formação de biofilme em cupom de aço inoxidável e remoção do mesmo
com agentes biocidas ..................................................................................................
48
5.6 Tipificação por MLST ..........................................................................................
49
6 . Discussão ...................................................................................................................
54
7. Conclusão ...................................................................................................................
63
8. Anexos ........................................................................................................................
64
9. Referências Bibliográficas ......................................................................................... 65
15
1 INTRODUÇÃO
Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista que causa doenças em
indivíduos imunocomprometidos e submetido a procedimentos invasivos. Acredita-se que tal
fato ocorra pela alta capacidade adaptativa deste patógeno. Além disso, essa bactéria Gram
negativa é comumente encontrada no solo, na água e em ambientes úmidos (GOMILA et al.,
2013), sendo um dos mais frequentes microrganismos colonizadores e causadores de
infecções em pacientes queimados (JAPONI et al, 2014).
Uma importante propriedade encontrada em P. aeruginosa é sua capacidade de
formar biofilmes, fato esse que auxilia sua permanência em superfícies orgânicas ou
inorgânicas possibilitando a colonização e infecção de pacientes sujeitos à balneoterapia.
Biofilmes consistem em microcolônias bacterianas envoltas por uma matriz orgânica de
polímeros e componentes celulares que possibilitam a aderência da bactéria a superfícies e são
de difícil remoção, interferindo até mesmo no tratamento de infecções uma vez que dificultam
a ação antimicrobiana (HOGARDT et al., 2004).
Outra importante característica de P. aeruginosa é sua capacidade de tornar-se
resistente a antibióticos e biocidas, devido à alta plasticidade de seu genoma (MESAROS et
al., 2007). Mutações em genes cromossomiais que conduzem a desrepressão da beta-
lactamase tipo AmpC, repressão ou inativação de porinas tipo OprD e superexpressão de
bombas de efluxo, responsáveis pelo transporte ativo de substratos como antibióticos para o
exterior da célula bacteriana estão entre os principais mecanismos de resistência a
antimicrobianos encontrados nessas bactérias (LISTER, WOLTER E HANSON, 2009;
PICOLI, 2008). No entanto, esse patógeno também é capaz de adquirir outros determinantes
de resistência por transferência horizontal de elementos genéticos móveis (VIEDMA et al.,
2012). Assim, infecções causadas por P. aeruginosa podem ser de difícil tratamento
principalmente por este microrganismo apresentar genes que codificam várias enzimas do tipo
β-lactamases e enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (LIVERMORE, 2002). Dentre as
β-lactamases pode-se destacar as de classes A - β-lactamases de espectro estendido (ESBL) e
de classe B - Metalo-β-lactamases (MBL), sendo esta última capaz de hidrolisar todos os β-
lactâmicos, exceto o aztreonam (QUEENAN and BUSH, 2007; SACHA et al., 2008).
Somando-se às altas taxas de resistência a antimicrobianos, está o fato deste
patógeno apresentar fatores de virulência incluindo elastase, exotoxina A, fosfolipase, entre
16
outros. Semelhante a outros bacilos Gram negativos, esta bactéria apresenta um sistema de
secreção tipo III (T3SS) que é considerado um determinante importante do processo de
invasão e citotoxicidade, na qual P. aeruginosa libera várias proteínas efetoras dentro do
citoplasma da célula hospedeira (MAÂTALLAH et al., 2013).
Esses fatos demonstram que vigilância contínua é necessária para a detecção e estudo
desses microrganismos, a fim de se prevenir colonizações-contaminações de pacientes
queimados evitando com isso infecção e impedindo propagação de genes de resistência e
virulência.
17
2 REVISÃO DA LITERATURA
Pseudomonas aeruginosa é um bacilo Gram negativo, não fermentador, que
apresenta tolerância a uma ampla variedade de condições físicas, associada a pouca exigência
nutricional. Sua natureza ubíqua e seu metabolismo versátil permite que este microrganismo
se desenvolva em diversos ambientes, inclusive no ambiente hospitalar, tornando-o um dos
principais patógenos nosocomiais (GOMILA et al., 2013; VIEDMA et al., 2012).
Embora este microrganismo raramente cause infecção em indivíduos saudáveis, em
pacientes imunocomprometidos pode infectar qualquer tecido, podendo ocasionar infecção
generalizada. Devido a este fato é considerado um patógeno oportunista ou secundário e
desempenha um papel de grande importância nas infecções relacionadas ao cuidado com a
saúde (MESAROS et al., 2007).
Este patógeno apresenta um dos maiores genomas do mundo procariota, o qual
codifica extraordinariamente uma alta proporção de proteínas envolvidas na regulação,
transporte e em funções de virulência, o que explica sua alta versatilidade e capacidade
adaptativa, fazendo com que o mesmo seja um difícil alvo para a terapia antimicrobiana
(MESAROS et al., 2007).
2.1 FATORES DE VIRULÊNCIA
A patogenicidade da P. aeruginosa é conferida a numerosos fatores de virulência
(FV) que podem ser estruturais ou produzidos e secretados para o meio. Dentre os estruturais
destacam-se: a) fímbrias ou pili que são apêndices superficiais e conferem aderência a
receptores presentes nas células epiteliais do hospedeiro; b) flagelo, o qual confere
motilidade; c) cápsula polissacarídica com ação anti-fagocítica, a qual favorece evasão à
resposta imune do hospedeiro; d) lipopolissacarídeo (LPS), presente na membrana externa, o
qual é responsável por manifestações sistêmicas (BONE, 1993; PIMENTA, DI MARTINO e
BLIGHT, 2006).
Sabe-se que este patógeno possui vários sistemas de secreção de proteínas, dos quais
o Sistema de Secreção Tipo II (T2SS) e o Sistema de Secreção Tipo III (T3SS) são
responsáveis pela secreção da maioria das toxinas descritas na literatura (SAWA et al, 2014).
18
Dentre as toxinas secretadas pelo T2SS podemos citar: a) exotoxina A, a qual atua inibindo a
biossíntese de proteínas na célula eucariótica levando a necrose; b) protease LasA, a qual
possui fraca atividade elastolítica e tem como função tornar a elastina mais susceptível à
clivagem pela LasB; c) protease LasB, a qual possui atividade proteolítica sobre tecido
conectivo incluindo elastina, colágeno, bem como sobre moléculas relacionadas ao sistema
imunológico do hospedeiro como fibrina, mucina gástrica, transferrina, IgG, inibidores de α-1
proteinase, dentre outros (BRADBURY et al., 2010; JAFFAR-BANDJEE et al., 1995;
NIKBIN et al., 2012).
O T3SS é responsável pela secreção de pelo menos 4 enzimas efetoras: exoenzima S
(ExoS), exoenzima T (ExoT), exoenzima U (ExoU) e exoenzima Y (ExoY) diretamente
dentro da célula hospedeira. O mesmo é ativado quando entra em contato com membranas de
células eucarióticas, causando interferência no sinal de transdução, morte celular e alterações
na resposta imune do hospedeiro. Este sistema secretor consiste em várias proteínas que
formam um complexo macromolecular que abrange a membrana interna bacteriana, o espaço
periplasmático, a camada peptideoglicana, a membrana externa bacteriana, o espaço
extracelular e a membrana da célula hospedeira (GALLE, CARPENTIER e BEYAERT,
2012).
Embora, todas as cepas de P. aeruginosa abriguem os genes que codificam o
maquinário de translocação do sistema secretor tipo III somente poucas são capazes de
expressar este sistema, e por sua vez secretar as proteínas efetoras (FELTMAN et al., 2001).
Entretanto, quando expresso, o T3SS é um notável marcador de cepas associadas a um
desfecho clínico ruim em pacientes infectados por P. aeruginosa (EL-SOLH et al., 2012).
ExoS e ExoT são proteínas semelhantes estruturalmente e bifuncionais, por
apresentarem dois domínios ativos, um (C-terminal) com atividade ADP-ribosiltransferase e
outro (N-terminal) atuando como proteína ativadora de RhoGTPase (GAP), a qual está
envolvida na regulação de diversas funções celulares, incluindo eventos relacionados ao
citoesqueleto e transcrição de genes (MOON e ZHENG, 2003). Entretanto, ExoT apresenta
somente 0,2% da atividade de ExoS (ENGEL, 2003 apud BRADBURY, et al., 2010). ExoY é
uma adenilato ciclase, enquanto ExoU apresenta atividade fosfolipase A2 (CHO et al., 2014).
Os genes exoT e exoY, os quais codificam as exoenzimas T e Y respectivamente,
estão presentes em aproximadamente 100% dos isolados clínicos, enquanto os genes exoS e
exoU estão distribuídos variavelmente, e são mutuamente exclusivos na maioria das cepas,
19
sendo o exoS mais prevalente (AGNELLO e WONG-BERINGER, 2012; GAREY et al.,
2008).
As toxinas efetoras ExoT e ExoY têm menor efeito na virulência, quando
comparados à ExoS e ExoU (FELTMAN et al., 2001; SATO e FRANK, 2004). A
patogenicidade da toxina ExoS é atribuída à ruptura da actina, causando rearranjos no
citoesqueleto e inibindo a migração celular e fagocitose, como é demonstrado pela diminuição
da internalização bacteriana por determinados tipos de células eucarióticas (VANCE,
RIETSCH e MEKALANOS, 2005). ExoS também inibe a síntese de DNA e induz à apoptose
(ENGEL, 2003 apud BRADBURY, et al., 2010; VANCE et al., 2005). Todavia, a
translocação da ExoU induz à morte celular, devido destruição da membrana celular via
atividade fosfolipase A2 (SAWA et al., 2014). Esta exoenzima é responsável por
citotoxicidade aguda em células epiteliais e macrófagos (FINCK-BARBANCON et al., 1997;
HAUSER e ENGEL, 1999), sendo também relatada a destruição de neutrófilos no caso de
doenças infecciosas graves (DIAZ et al., 2008). Lee e colaboradores (2005), relataram que sua
citotoxicidade é 100 vezes maior que ExoS, estando associada a choque séptico e aumento da
gravidade da doença e mortalidade em pacientes com pneumonia (SHAVER e HAUSER,
2004; SHULERT et al., 2003; VANCE, RIETSCH e MEKALANOS, 2005).
Além dos efeitos citotóxicos, isolados exoU positivos são mais propensos a
apresentarem multirresistência a antimicrobianos como cefepima, ceftazidima,
piperacilina/tazobactam, carbapenemas e gentamicina (GAREY et al., 2008), bem como a
fluoroquinolonas, exibindo tanto mutações em gyrA, quanto superexpressão de bombas de
efluxo (WONG-BERINGER et al., 2008).
A capacidade de modular a resposta imune do hospedeiro, associada à habilidade de
induzir danos teciduais extensos justifica porque ExoU juntamente com ExoS, desempenham
papel de grande importância na patogenicidade da P. aeruginosa (GALLE, CARPENTIER e
BEYAERT, 2012).
20
2.2 FORMAÇÃO DE BIOFILME
Além dos fatores de virulência acima descritos, acredita-se que a capacidade desse
patógeno causar infecções está associada à sua habilidade de formar biofilmes (GOODMAN
et al., 2004; LASKOWSKI e KASMIERCZAK, 2006; PETROVA e SAUER, 2010;
PETROVA e SAUER, 2011; VENTRE et al., 2006).
Biofilmes consistem em grupos de células bacterianas aderidas a uma superfície e
envoltos por uma matriz extracelular autoproduzida (COSTERTON, 1999). O crescimento
bacteriano sob a forma de biofilme, o qual é característico de infecções crônicas, fornece uma
população microbiana com propriedades fisiológicas e estruturais diferenciadas que
aumentam a capacidade de resistência à terapia antimicrobiana (COSTERTON, STEWART e
GREENBERG, 1999; HØIBY et al., 2010).
A formação de biofilme apresenta 4 estágios. O primeiro se inicia com a adesão
bacteriana à superfície (i), seguido da formação de microcolônias (ii), e maturação do
biofilme (iii), onde há formação da matriz exopolissacarídica (EPS). O último estágio é
conhecido como dispersão (iv), no qual as células microbianas deixam a forma de biofilme
(células sésseis), passando para forma de vida livre (células planctônicas), a fim de
contaminar outras superfícies (ABDALLAH et al., 2014).
A etapa de adesão à superfície é considerada reversível, e parece ser facilitada por
diversas interações químicas, físicas e biológicas (RENNER e WEIBEL, 2011). Apêndices
bacterianos como os flagelos, podem ser considerados estruturas de grande importância neste
estágio. Conforme relatado por Karatan e Watnick (2009), a interação do flagelo na superfície
desencadeia um sinal que induz a expressão de genes envolvidos na formação do biofilme e
reprime a síntese de flagelos, favorecendo a inibição da motilidade.
No segundo estágio de formação do biofilme, as células começam a formar
microcolônias e a adesão torna-se irreversível, principalmente devido à secreção de
substâncias poliméricas como: polissacarídeos, proteínas, lipídeos e ácidos nucleicos, os quais
constituem a matriz extracelular (FLEMMING e WINGENDER, 2010). É nesta etapa que se
inicia a maturação do biofilme, a qual se completa com as células envoltas em uma matriz
extracelular de arquitetura complexa, a qual atua como um esqueleto na estabilização da
estrutura tridimensional do biofilme (DUNNE, 2002).
21
Sabe-se que a formação de biofilme está sob controle de vários sinais ambientais
como temperatura e disponibilidade de nutrientes (KARATAN e WATNICK, 2009). Em P.
aeruginosa a percepção destes sinais ocorre através de reguladores de resposta/ sensor
quinase, tais como LadS, RetS e GacS, os quais regulam a expressão de exopolissacarídeos:
alginato, Pel (Pellicle Formation) e Psl (Polysaccharide Synthesis Locus) (HARMSEN et al.,
2010). Alginatos são exopolissacarídeos polianiônicos lineares compostos de ácidos urônicos
(REMMINGHORST, HAY e REHM, 2009) os quais encapsulam a célula bacteriana
contribuindo para diminuição da suscetibilidade da bactéria que constitui o biofilme a
tratamentos com antimicrobianos, e protegendo as mesmas dos mecanismos de defesa do
hospedeiro (NIVENS et al., 2001; PIER et al., 2001). Psl é um polissacarídeo rico em
manose, ramnose e glicose, e encontra-se envolvido na etapa de aderência inicial e maturação
do biofilme. Sua produção ocorre durante o crescimento planctônico, mediando aderência a
superfícies e contribuindo para formação de microcolônias (MA et al., 2009). Já o Pel é rico
em glicose e é essencial para formação de uma película na interface ar-líquido; aumenta a
estabilidade estrutural das microcolônias e desempenha um papel de grande importância na
proteção dos biofilmes contra agentes antimicrobianos (FRIEDMAN e KOLTER, 2004;
YANG et al., 2011).
Outro mecanismo que também regula a formação de biofilme é a comunicação célula
a célula ou quorum sensing (QS). Este processo depende da produção, liberação e detecção de
moléculas sinalizadoras denominadas auto-indutoras, que no caso da P. aeruginosa são 2
homoserinas lactonas aciladas (HSL-A), Las e Rhl, as quais regulam positivamente a
biossíntese de exopolissacarídeos (ABDALLAH et al., 2014; O’LOUGHLIN et al., 2013).
O último estágio do biofilme é a dispersão, onde as células sésseis se desprendem e
passam para forma planctônica. Esta etapa pode ser ocasionada por vários fatores ambientais
como alterações na disponibilidade de nutrientes, diminuição de oxigênio, ou condições de
estresse que possam induzir a expressão de genes envolvidos na dispersão (McDOUGALD et
al., 2011).
Além de desempenharem função importante na formação do biofilme, pois
constituem aproximadamente 50-90% de sua matéria orgânica, as substâncias exopoliméricas:
polissacarídeos, lipídeos, proteínas e DNA extracelular (eDNA), têm importante papel na
resistência do biofilme à agentes antimicrobianos, dificultando sua penetração através do
mesmo (ABDALLAH et al., 2014). Consequentemente, a erradicação do biofilme é difícil,
22
sendo este responsável por até 60% das infecções em humanos (ABDI-ALI, MOHAMMADI-
MEHR e ALAEI, 2006; COSTERTON, MONTANARO e ARCIOLA, 2005).
Ao contrário dos antibióticos, os quais afetam um processo fisiológico específico, os
desinfetantes apresentam um mecanismo de ação que não está limitado ao metabolismo
bacteriano, tornando-os valiosos agentes antibiofilme (GILBERT, ALLISON e McBAIN,
2002; McDONNELL e RUSSELL, 1999). Biocidas como quaternários de amônio, fenóis,
biguanidas e alcoóis tem como principal alvo a membrana citoplasmática, podendo promover
precipitação do material celular. Já desinfetantes como peróxido de hidrogênio, ozônio, ácido
peracético penetra nas células e interagem com constituintes celulares como: proteínas, ácido
nucleico, enzimas, levando à morte celular (McDONNELL e RUSSELL, 1999).
A atividade dos biocidas contra os biofilmes está associada a diversos fatores dentre
os quais podemos destacar: a concentração, o tempo de contato, a temperatura, e o pH. Um
aumento na concentração do biocida e no tempo de contato, normalmente aumenta a eficácia
dos desinfetantes (GROBE, ZAHLLER e STEWART, 2002; SURDEAU et al., 2006).
As diretrizes clínicas para uso de biocidas, em geral foram desenvolvidas para
microrganismos planctônicos (CERF, CARPENTIER e SANDERS, 2010). Entretanto, a
maioria dos microrganismos vive como comunidade de células aderidas a uma superfície
(biofilme), a qual pode ser até 1000 vezes mais resistentes aos biocidas que as células
planctônicas (BONEZ et al, 2013; GROBE, ZAHLLER e STEWART, 2002). Portanto, os
desinfetantes comercializados podem ser eficazes contra células planctônicas, e não contra
biofilmes.
Toté e colaboradores (2010) demonstraram que somente agentes oxidantes fortes
como peróxido de hidrogênio a 5% e hipoclorito de sódio a 1% foram ativos contra biofilmes
de P. aeruginosa. Em estudos realizados por Bonez e colaboradores (2013), a clorexidina,
amplamente utilizada como antisséptico em ambientes hospitalares, demonstrou atividade
biocida excelente para alguns patógenos, inclusive P. aeruginosa, em sua forma livre (células
planctônicas), porém foi menos efetiva contra os biofilmes. Este resultado também foi
previamente relatado por Smith e Hunter (2008).
A alta tolerância das células sésseis aos biocidas aumenta mais o risco de falhas no
processo de desinfecção, se tornando um grande obstáculo no controle da infecção hospitalar,
ocasionando sérios problemas de saúde e perdas econômicas.
23
2.3 RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA
P. aeruginosa apresenta uma notável resistência a antimicrobianos. Podendo esta ser
intrínseca, devido à expressão constitutiva de β-lactamases e bombas de efluxo, combinada à
baixa permeabilidade da membrana externa; ou adquirida através da aquisição de genes de
resistência (genes codificadores de β-lactamases ou enzimas inativadoras de
aminoglicosídeos) e mutações no alvo dos antimicrobianos (MESAROS et al., 2007). Muitos
mecanismos de resistência antimicrobiana em P. aeruginosa resultam de mudanças genéticas,
como mutações em porinas (diminuição de OprD) combinada a desrepressão do gene ampC
cromossomial e superexpressão de bombas de efluxo (DUMAS et al., 2006).
As porinas de membrana externa são proteínas que formam canais que permitem a
difusão passiva de solutos hidrofílicos (inclusive antibióticos) para o interior da célula
bacteriana (NIKAIDO, 1994). Diferentes porinas podem ser encontradas em P. aeruginosa,
porém a de maior relevância clínica é a OprD, também denominada D2, uma vez que sua
ausência e/ou expressão reduzida está relacionada à resistência aos carbapenemas, em
especial ao imipenem (LIVERMORE, 2001; NEVES et al., 2011).
AmpC (cefalosporinase) é uma enzima inativadora de antibióticos, que na cepa
selvagem é produzida em um nível basal baixo, o qual confere susceptibilidade à penicilina,
penicilina + inibidores de β-lactamases, cefalosporinas e carbapenemas. Entretanto, quando a
produção de AmpC é aumentada, devido a não repressão de seu gene codificador ampC, P.
aeruginosa desenvolve resistência a todos o β-lactâmicos, exceto aos carbapenemas
(SANDERS e SANDERS, 1986).
Outro mecanismo de resistência apresentado por este microrganismo é a bomba de
efluxo. Esta se localiza através da membrana citoplasmática bacteriana, e remove por
transporte ativo substâncias tóxicas à bactéria, como por exemplo, antibióticos e biocidas, de
dentro da célula bacteriana. O fato de este sistema atuar em diversos substratos faz com que
estas estruturas sejam de grande importância no desenvolvimento de multirresistência
bacteriana. As bombas de efluxo não somente aumentam a concentração mínima inibitória
(CMI) para uma dada bactéria, como também reduzem a concentração do antibiótico no
interior da célula bacteriana, fazendo com que estas concentrações subinibitórias levem ao
desenvolvimento de cepas mutantes resistentes (SAIER e PAULSEN, 2001). Em P.
aeruginosa, este sistema multidroga resistente (MDR), pertence em sua maioria à família
24
resistance-nodulation-cell division (RND) (SCHAIBLE, TAYLOR e SHAFFER, 2012). A
família RND é composta de transportadores ativos secundários, ou seja, obtém energia
necessária à extrusão do substrato através da força motriz de prótons. Bombas tipo RND
constituem um sistema tripartite, o qual consiste em uma proteína de fusão da membrana
periplasmática (MFP), um fator de membrana externa (OMF) e um transportador de
membrana citoplasmática (RND). Este complexo forma um canal que abrange toda
membrana, permitindo o transporte de drogas lipofílicas e anfifílicas do citoplasma bacteriano
para o meio extracelular (LISTER, WOLTER e HANSON, 2009).
Dentre as 10 bombas de efluxo RND descritas em P. aeruginosa, podemos destacar 4
sistemas de maior relevância clínica: MexAB-OprM, MexCD-OprJ, MexEF-OprN e MexXY-
OprM, os quais conferem resistência a vários antibióticos (AESCHLIMANN, 2003).
MexAB-OprM foi o primeiro sistema de efluxo descoberto. O mesmo faz parte da
resistência intrínseca deste microrganismo, através de sua produção constitutiva em cepas
selvagens (POOL e SRIKUMAR, 2001); sendo capaz de exportar diferentes classes de
antibióticos: fluoroquinolonas, tetraciclinas, clorafenicol, β-lactâmicos e inibidores de β-
lactamases, macrolídeos, novobiocina, trimetropima e sulfonamidas. Este sistema apresenta o
mais amplo perfil de substratos para a classe dos β-lactâmicos, com atividade sobre
carboxipenicilinas, aztreonam, cefalosporinas de amplo espectro (ceftazidima e cefotaxima) e
carbapenemas (meropenem, exceto imipenem) (LISTER, WOLTER e HANSON, 2009).
O sistema MexCD-OprJ apresenta um alto grau de homologia com MexAB-OprM,
conferindo resistência praticamente às mesmas classes de antibióticos. Porém ao contrário de
MexAB-OprM, este sistema não possui amplo perfil de substratos para os β-lactâmicos, mas
por sua vez exporta cefalosporinas de quarta geração: cefepima, cefepiroma e cefozopram
(MASUDA et al., 1996; POOLE et al., 1996).
O sistema MexEF-OprN reconhece e exporta substratos como: fluoroquinolonas,
clorafenicol e trimetropima, porém não apresenta afinidade para com os β-lactâmicos
(KOHLER et al., 1997). Sua expressão foi detectada em baixos níveis em cepas do tipo
selvagem com fenótipos susceptíveis (LI, BARRE e POOLE, 2000), porém foi comprovado
que este sistema não faz parte da resistência intrínseca deste microrganismo (KOHLER et al.,
1997).
25
MexXY-OprM apresenta como substratos: fluoroquinolonas, β-lactâmicos
específicos (como por exemplo a cefepima), aminoglicosídeos, tetraciclina, clorafenicol e
eritromicina (MORITA, TOMIDA KAWAMURA, 2012; POOLE, 2002; SCHWEIZER,
2003). É importante destacar que é a única bomba envolvida no efluxo de aminoglicosídeos
(KUMARI et al., 2014).
A inativação enzimática de antibióticos tem sido relatada para β-lactâmicos e
aminoglicosídeos (MESAROS et al, 2007). Dentre os β-lactâmicos comumente utilizados no
tratamento de infecções por P. aeruginosa, podemos destacar: penicilinas (ticarcilina,
piperacilina), cefalosporinas (ceftazidima, cefepima), monobactams (aztreonam) e
carbapenemas (imipenem, meropenem e dorapenem) (MORITA, TOMIDA e KAWAMURA,
2014). A atividade antimicrobiana desta classe de antibióticos está diretamente ligada à
presença do anel β-lactâmico, através do qual ocorre ligação às transpeptidases da parede
celular bacteriana (penicillin binding proteins – PBP), impedindo a transpeptidação que
ancora de forma rígida o peptideoglicano (POOLE, 2004). O anel β-lactâmico é alvo de
enzimas bacterianas denominadas β-lactamases, as quais hidrolisam esta estrutura e inativam
o antibiótico, conferindo resistência ao mesmo.
A produção de β-lactamases foi o primeiro mecanismo de resistência bacteriana aos
β-lactâmicos reconhecido, e ainda permanece como principal causa de resistência a estes
antibióticos em patógenos Gram-negativos (FARSHADZADEH et al., 2014; JACOBY e
MUNOZ-PRICE, 2005; LUCENA et al., 2014). Vários esquemas de classificação foram
propostos para agrupar estas enzimas de acordo com suas características bioquímicas e
estruturas moleculares (BUSH, 1989, 2001; LIVERMORE, 1995). Ambler, em 1980, dividiu
as β-lactamases de acordo com suas estruturas primárias em quatro classes: classe A - β-
lactamases de amplo espectro (ESBL), classe B – metalo-β-lactamases (MBLs), classe C –
cefalosporinases e classe D – oxacilinases. De acordo com diferenças em seus mecanismos
catalíticos, estas classes podem ser divididas em dois grupos: serina-β-lactamases (classes A,
C e D) e metalo-β-lactamases (classe B) (AMBLER, 1980; BUSH, 1995; ROSSOLINI,
2005).
As β-lactamases são normalmente codificadas por genes associados a elementos
genéticos móveis, o que é motivo de grande preocupação no que diz respeito ao futuro da
terapia antimicrobiana, devido à sua notável capacidade de disseminação (BUSH, 2001). As
β-lactamases de amplo espectro (ESBL) geralmente conferem resistência a todos os β-
26
lactâmicos, exceto as carbapenemas (embora tenha sido relatado atividade carbapenemase em
enzimas ESBL do tipo GES-2 e GES-5). Enquanto as metalo- β-lactamases inativam todas as
subclasses dos β-lactâmicos, exceto os monobactans. (MESAROS et al, 2007; XAVIER et al.,
2010).
As ESBL relatadas para P. aeruginosa são do tipo: SHV, TEM, PER, VEB, BEL,
GES, OXA e mais recentemente CTX-M (AL NAIEMI, DUIM e BART, 2006; DUBOIS et
al., 2002, 2005; FARSHADZADEH et al., 2014; NAAS et al., 1999; PELLEGRINO et al,
2006; POIREL et al., 1999, 2005). Entretanto, as enzimas tipo GES, a partir do momento que
sofrem alterações em sítios ativos de aminoácidos, podem estender sua atividade hidrolítica
aos carbapenemas (POIREL et al., 2001; VOURLI et al., 2004).
Em um estudo realizado no Irã por Neyestanaki e colaboradores (2014), com P.
aeruginosa isoladas de pacientes queimados, os genes ESBL prevalentes foram: blaOXA-10,
blaTEM e blaPER. Em outro estudo, Farshadzadeh e colaboradores (2014) analisaram 176
isolados deste patógeno, também coletados de feridas de pacientes queimados, onde foi
observado que 96 eram produtores de ESBL, com 100% de resistência a ofloxacina e
cefalexina, 97,6% ao aztreonam e 91,6% a ceftriaxona. Através da técnica de PCR foram
detectados os seguintes genes blaPER-1, blaOXA-10 e blaCTX-M em 54,16%, 68,75% e 1,04% dos
isolados respectivamente.
No Brasil, as ESBL mais descritas em estudos envolvendo isolados clínicos de P.
aeruginosa são do tipo GES e CTX-M (PELLEGRINO et al, 2006; PICÃO et al., 2009;
XAVIER et al., 2010). Polloto e colaboradores (2012), identificaram a presença do gene
blaCTX-M-2 em 19,6% (11/56) das cepas resistentes à ceftazidima, imipenem e/ou meropenem,
em um hospital de cuidados terciários no estado de São Paulo. Neste mesmo estudo, também
foi encontrado uma cepa portadora do gene blaGES-1 e uma outra do blaGES-5. Em 43 isolados
ceftazidima-resistentes, causadores de infecções em corrente sanguínea, Picão e colaboradores
(2009) detectaram blaGES , incluindo os subtipos blaGES-1 e blaGES-5 em 13,9% dos isolados,
também em um hospital de São Paulo. Em outro estudo realizado por Rizek e colaboradores
(2014), blaGES-5 foi encontrado em 3 cepas carbapenemas resistentes em uma unidade
intensiva de tratamento de queimados em um hospital de São Paulo.
As carbapenemases são enzimas de grande relevância clínica por sua capacidade de
hidrolisar carbapenemas. Os carbapenemas, por apresentarem amplo espectro de atividade,
constituem a terapia de escolha para pacientes com infecções hospitalares graves ou para
27
aquelas infecções causadas por microrganismos produtores de ESBL (BERTONCHELI e
HÖRNER, 2008), sendo considerado um dos últimos recursos terapêuticos para tratamento de
infecções por P. aeruginosa multirresistentes (POIREL, COLLET e NORDMANN, 2000;
SAAVEDRA et al., 2014).
Dentre as MBL descritas para P. aeruginosa, pode-se destacar os seguintes tipos:
IMP, VIM, SPM, GIM, SIM e NDM (CORNAGLIA, GIAMARELLOU e RUSSOLINI,
2011; WALSH et al., 2005). Estudos no Brasil, descreveram a presença de genes blaIMP,
blaVIM , e blaSPM-1 em isolados deste patógeno (POLLOTO et al., 2012; RIZEK et al., 2014),
com prevalência do gene blaSPM-1, associada a elevadas taxas de mortalidade (PICOLI, 2008).
Um estudo realizado por Lucena e colaboradores (2014) demonstrou que cepas de P.
aeruginosa carbapenemas resistentes, produtoras de MBL foram significantemente mais
resistentes que as cepas não produtoras de MBL; e que fatores de risco como estadia em
unidades de tratamento intensivo (UTI) e infecção do trato urinário estavam associados a
infecções pelas cepas produtoras de MBL. Neste estudo também foi demonstrado que das 93
cepas produtoras de MBL, 91 abrigavam o gene blaSPM-1, enquanto os genes blaIMP-1 e blaIMP-
16 foram encontrados em apenas uma cepa cada. Também ficou constatado que as infecções
causadas por essas cepas MBL apresentavam início mais curto e uma progressão mais rápida
para óbito.
Ferreira e colaboradores (2015) relataram que de 56 cepas de P. aeruginosa
carbapenemas resistentes, isoladas de sangue de pacientes com bacteremia em um hospital
universitário em Minas Gerias, 9 (16,1%) eram produtoras de MBL; das quais seis carreavam
o gene blaSPM-1 e três o gene blaVIM.
Além das MBL, carbapenemases como KPC apresentam atividade hidrolítica sobre
antibióticos carbapenemas. A presença de KPC em P. aeruginosa é rara e ocorre
principalmente no continente Americano (CORREA et al., 2012; CUZON et al., 2011;
GARCIA RAMÍREZ et al., 2013; JÁCOME et al., 2012; MARTÍNEZ et al., 2012). O
primeiro relato de KPC em P. aeruginosa no Brasil ocorreu em 2010, na cidade de Recife,
Pernambuco. O gene blaKPC foi detectado em duas cepas de P. aeruginosa, isoladas de dois
pacientes distintos da unidade de tratamento intensivo (UTI) de um hospital terciário. Estas
cepas apresentavam o mesmo perfil molecular e eram resistentes à amicacina, ciprofloxacino,
ticarcilina-clavulanato, aztreonam, cefems, ceftazidima, imipenem e meropenem. Sendo
susceptível somente à gentamicina e polimixina B (JÁCOME et al., 2012).
28
Rizek e colaboradores (2014) relataram pela primeira vez cepas de P. aeruginosa
carbapenemas resistentes, abrigando simultaneamente os genes blaSPM e blaKPC, e pela
primeira vez no Brasil a presença de um isolado carregando os três genes: blaSPM-1, blaKPC-2 e
blaVIM-2.
A produção de MBL constitui o principal mecanismo de resistência aos
carbapenemas (SADER et al., 2005). Os genes que codificam as MBL, são geralmente
codificados em integrons de classe 1, juntamente com outros determinantes de resistência
como enzimas modificadoras de aminoglicosídeos. Os integrons são frequentemente
encontrados em plasmídeos ou transposons, o que contribui para a disseminação por
transferência horizontal e propagação global do mecanismo de resistência (VIEDMA et al.,
2012).
As enzimas que conferem resistência aos aminoglicosídeos atuam modificando a
estrutura química do antibiótico, antes que ele se ligue a seu alvo, mediante processos de O-
fosforilação ou O-adenilação por fosfotransferases (APH) e nucleotidiltransferases (ANT)
dependentes de ATP ou ainda por meio de um processo de N-acetilação por acetiltransferases
(AAC) dependentes de acetil coenzima A (acetil-coA). Deste grupo, as mais frequentes em
isolados de P. aeruginosa são AAC(6’), ANT(2’’) e APH(3’). As metilases RNAr 16S,
também conferem resistência aos aminoglicosídeos mediada pela metilação sítio-específica do
RNA ribossômico (NEVES et al., 2011).
Em relação às quinolonas, mutações em regiões determinantes de resistência
(quinolone resistance-determining regions – QRDRs) especialmente em genes que codificam
DNA gyrase (gyrA) e topoisomerase IV (parC) são os principais contribuintes para resistência
à fluoroquinolona em bactérias Gram negativas (HIGGINS et al., 2003; LEE et al., 2005). Tal
resistência tem apresentado prevalência alta e atualmente representa a maior taxa de
resistência em países da América Latina (ANDRADE et al., 2006; SADER et al.,2001).
A capacidade de apresentar mecanismos de resistência antimicrobiana
simultaneamente confere a este microrganismo um fenótipo multirresistente, limitando as
opções terapêuticas para tratamento das infecções por ela causadas.
O conceito de multirresistência era amplamente utilizado pelos cientistas, porém não
havia uma padronização para o que seria uma cepa multidrug- resistant (MDR). No intuito de
se obter uma harmonização internacional para tal definição, o European Centre for Disease
29
Prevention and Control (ECDC) e Centers for Disease Control and Prevention (CDC),
organizaram um encontro com especialistas da área a fim de criar definições para bactérias
altamente resistentes e multidroga resistentes, associadas a infecções relacionadas à saúde.
Magiorakos e colaboradores (2012) definiram como: (i) cepas multirresistentes a drogas
(multidrug-resistant - MDR) como sendo aquelas não susceptíveis a um ou mais agente
antimicrobiano em três ou mais categorias testadas; (ii) cepas de resistência extensiva
(extensively drug resistant - XDR), como aqueles não susceptíveis a um ou mais agente
antimicrobiano em todas as categorias, mas sensíveis a duas ou menos categorias de
antimicrobianos (ou seja, a cepa permanece susceptível a somente uma ou duas categorias); e
(iii) cepas pan-resistentes (pandrug resistant - PDR) - não susceptíveis a todos os agentes em
todas as categorias antimicrobianas (tabela 1).
Tabela 1. Categorias e agentes antimicrobianos propostos para caracterização dos isolados de
P. aeruginosa em MDR, XDR e PDR
Categorias antimicrobianas Agentes antimicrobianos
Aminoglicosídeos Gentamicina, tobramicina, amicacina,
netilmicina
Carbapenemas Imipenem, meropenem, doripenem
Cefalosporinas Ceftazidima, cefepima
Fluoroquinolonas Ciprofloxacino, levofloxacino
Penicilinas/ inibidores β-lactamases Ticarcilina/ ácido clavulânico,
piperacilina/ tazobactam
Monobactans Aztreonam
Ácidos fosfônicos Fosfomicina
Polimixinas Colistina, polimixina B
Fonte: MAGIORAKOS et al., 2012.
O uso inadequado de terapias antimicrobianas, juntamente com fatores inerentes à
espécie bacteriana tem contribuído para o aumento nos índices de resistência. Um estudo do
Antimicrobial Surveillance Program (SENTRY) em hospitais brasileiros demonstrou 49% de
cepas de P. aeruginosa resistentes ao imipenem e 49,8% a ceftazidima. Enquanto o programa
Meropenem Yearly Susceptibility Test Information Collection (MYSTIC) realizado em 20
hospitais brasileiros apresentou taxas de resistência de 64% para o meropenem, 63,8% para
30
piperaciclina/tazobactam, 63,4% para amicacina e 55,8% para ceftazidima, para esse
patógeno (KIFFER, HSIUNG e OPLUSTIL, 2005).
2.4 EPIDEMIOLOGIA DAS INFECÇÕES CAUSADAS POR P. aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa tem sido uma das bactérias Gram negativas mais
frequentes em infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS) estando entre as principais
causa de morbidade e mortalidade em pacientes imunologicamente comprometidos, como é o
caso de pacientes queimados, com câncer, submetidos a procedimentos invasivos, entre
outros. Sendo assim, esta bactéria assume importante papel como patógeno oportunista na
etiologia das IRAS (JAPONI et al, 2014; PIRES et al., 2009).
Nas últimas quatro décadas, este microrganismo foi responsável por 10% de todos
os casos de infecções nosocomiais relatados (ANDRADE, LEOPOLDO e HAAS, 2006;
FIGUEIREDO-MENDES et al., 2005; HOBAN et al., 2003).
Durante os primeiros 4 anos do Antimicrobial Surveillance Program (SENTRY)
foram levantados dados de centros médicos na América Latina, onde foi observado que P.
aeruginosa foi o microrganismo mais frequente em pacientes hospitalizados com pneumonia
(GALES, SADER e JONES, 2002). Estudo realizado pelo National Nosocomial Infections
Surveillance System (NNIS) nos Estados Unidos em 2003, relatou infecções em pacientes de
unidades de tratamento intensivo por esse patógeno contabilizando 18,1% dos casos de
pneumonia, 9,5% de infecções em feridas cirúrgicas e 16,3% de infecções urinárias
(GAYNES, EDWARDS e NNIS, 2005).
Em estudo realizado no nordeste do Brasil verificou-se taxa de mortalidade de 51,1%
relacionada à pacientes infectados por P. aeruginosa (PINHEIRO et al., 2008). Em pacientes
queimados esse microrganismo aparece como causa comum de infecções graves, com
incidência de 38,7% (REMPEL, TIZZOT e VASCO, 2011). Nos Estados Unidos, um estudo
em unidades de tratamentos de queimados demonstrou que 44% destas unidades identificaram
P. aeruginosa como a bactéria Gram negativa mais prevalente causando infecções nestes
pacientes, seguido de Acinetobacter baumannii e Enterococcus spp. (HODLE, RITCHER e
THOMPSON, 2006).
31
A alta incidência de P. aeruginosa infectando pacientes queimados está associada à
preferência deste patógeno por ambientes quentes e úmidos, como é o caso das injúrias
térmicas. Sua ação nesses pacientes vai desde pneumonias até bacteremias, e representam
uma das principais causas de óbito (GALLAGHER, WILLIAMS-BOUYER e
VILLARREAL, 2007; OLIVEIRA e SERRA, 2011; REMPEL, TIZZOT e VASCO, 2011).
2.5 TIPIFICAÇÃO MOLECULAR
Tipificação consiste em identificar diferentes tipos de organismos dentro de uma
espécie. Os sistemas de tipificação tradicionais baseados em características fenotípicas, tais
como: sorotipo, biotipo, fagotipo e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos, foram
utilizados durante muitos anos. Entretanto, com as facilidades de manipulação do DNA, as
técnicas de tipificação a nível molecular revolucionaram a habilidade de diferenciação entre
tipos (ou subtipos) bacterianos (SABAT AJ et al., 2013).
Desde então, várias técnicas moleculares têm sido desenvolvidas para análise de
patógenos bacterianos, a fim de fornecer informações importantes para o estabelecimento de
relação genética entre isolados, com o propósito de estudos epidemiológicos de longo prazo
e/ou investigação de surtos. O estabelecimento da inter-relação genética entre cepas permite:
identificar a fonte de contaminação (ambiental/ pessoal), detectar disseminação local, regional
e global, além de distinguir entre falha terapêutica e reinfecção (PFALLER, 2001).
Em P. aeruginosa, os métodos de tipificação molecular incluem ribotipagem, pulsed-
field gel electrophoresis (PFGE), multilocus sequence typing (MLST) entre outros (GOMILA
et al., 2013). A escolha do método está associada ao do tipo de problema que se deseja
solucionar, e ao contexto epidemiológico no qual o método será utilizado, bem como o tempo
e escala geográfica de seu uso. No caso de investigações de surtos, o método de tipificação
deve ter um poder discriminatório necessário para distinguir todas as cepas não relacionadas
epidemiologicamente; bem como, ter o poder de discriminar cepas intimamente relacionadas,
a fim de revelar transmissão pessoa a pessoa, a qual é de extrema importância no
desenvolvimento de estratégias que previnam sua propagação. Ao mesmo tempo, deve ser
rápido, de baixo custo, altamente reprodutível, de fácil execução e interpretação
32
(STRUELENS, 1996; VAN BELKUN et al., 2007). Neste caso o método mais utilizado e
considerado padrão ouro é o PFGE (TOSH et al., 2011; YU et al., 2012).
Quando a tipificação é aplicada para vigilância contínua, o respectivo método deve
fornecer resultados estáveis ao longo do tempo, a fim de permitir implementações de medidas
eficientes no controle da infecção. Além disso, um método que consiste na criação de um
banco de dados, o qual será usado em redes internacionais, deve produzir dados móveis,
facilmente transferíveis entre diferentes sistemas, e que possa ser facilmente acessado via uma
base de dados na internet (SABAT AJ et al., 2013). É o caso dos estudos epidemiológicos,
geográficos e/ou evolucionários, onde o MLST é a ferramenta de escolha (MAÂTALLAH et
al., 2013).
A caracterização de isolados por MLST produz aproximadamente 450 pares de bases
(pb) de sequência de nucleotídeos para fragmentos internos de sete genes, denominados
house-keeping, devido ao fato dos mesmos estarem envolvidos em funções metabólicas
essenciais do microrganismo. Para as diferentes sequências em cada fragmento de gene, são
atribuídos diferentes números de alelos e cada cepa é definida pelos alelos nos sete genes
(perfil alélico). A cada único perfil alélico (genótipo) é atribuído um tipo de sequenciamento
(ST), o qual é característico da cepa (ou clone) (FEIL et al., 2004).
O sequenciamento dos sete genes e em alguns casos até oito genes, produzem
aproximadamente 3.500 a 4.000 pb para serem analisados para cada cepa, o que levaria a um
resultado demorado. Porém com avanços da bioinformática, a qual dispõe de programas que
realizam o alinhamento das sequências de nucleotídeos, este tempo é reduzido. Estes
programas baseiam-se na análise do alinhamento da sequência de nucleotídeos, para realizar
um agrupamento (clusters).
Curran e colaboradores (2004) desenvolveram a técnica de MLST que permite a
discriminação de isolados de P. aeruginosa através da diferença na sequência de sete genes:
acsA, aroE, guaA, mutL, nuoD, ppsA e trpE (tabela 2), fornecendo uma base de dados que
permite a comparação dos resultados obtidos.
33
Tabela 2. Funções dos sete genes utilizados na tipificação de P. aeruginosa por MLST
Gene Função
acsA Acetil coenzima A sintetase
aroE Siquimato desidrogenase
guaA GMP sintetase
mutL Proteína de reparo de erros no DNA
nuoD Cadeia C,D da NADH desidrogenase I
ppsA Fosfoenolpiruvato sintetase
trpE Componente I da antralinato sintetase
Fonte: CURRAN et al., 2004.
MLST é uma metodologia que apresenta elevado poder discriminatório, resultados
intercambiáveis e é altamente padronizável.
Estudos vêm sendo realizados a fim de se determinar a relação entre clones
endêmicos e seus antecessores. No Brasil, Silva e colaboradores (2010), analisaram 50 cepas
de P. aeruginosa, coletadas de onze cidades diferentes, e produtoras de SPM-1, as quais
exibiam cinco perfis PFGE distintos e onze diferentes ribogrupos. Eles verificaram que todas
as cepas, exceto uma, pertenciam a um mesmo ST (ST277). Neste mesmo estudo também
foram incluídos três cepas de P. aeruginosa produtoras de IMP-1 e duas cepas não produtoras
de MBL, como controle. As três cepas produtoras de IMP-1 foram classificadas como
pertencendo ao ST593, enquanto as cepas não produtoras de MBL apresentaram dois ST
distintos: ST594 e ST595.
Um estudo na Espanha realizado por Viedma et al. (2012) entre 2007-2010,
demonstrou que 56,8% dos isolados de P. aeruginosa pertenciam a um único e principal
clone (clone B), o qual foi identificado através do MLST como ST175. Análises de PCR
nestes clones demonstraram a presença do gene blaVIM-2 em todos os isolados, e apenas um
continha o gene blaIMP-22.
Em cinco países do Mediterrâneo, o mais comum e frequente ST é o ST235, o qual
demonstrou multirresistência e genótipo de virulência exoU (MAÂTALLAH et al., 2011).
34
Assim, para uma melhor compreensão da história evolutiva, da dinâmica das
populações, e dos padrões de disseminação dos microrganismos, a tipificação por MLST é de
grande importância.
35
3 OBJETIVO
3.1 OBJETIVO GERAL
O objetivo geral desse estudo foi avaliar 35 cepas de P. aeruginosa obtidas do Centro
de Tratamento de Queimados (CTQ) do Hospital Federal do Andaraí (HFA) determinando os
fatores genéticos relacionados à virulência e resistência a antimicrobianos; a capacidade de
produzir biofilme e ação de biocidas sobre eles e realizar tipificação molecular das cepas
envolvidas.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Determinar o perfil de resistência antimicrobiana através de teste de disco-difusão;
- Detectar os genes de virulência exoS e exoU; e os principais genes de resistência a
β-lactâmicos (blaPER-1, blaCTX-M, blaOXA-10, blaGES-1, blaVIM, blaIMP, blaSPM-1, blaKPC, blaNDM e
blaSIM), utilizando PCR;
- Detectar a presença de carbapenemases, através do teste fenotípico Carba NP;
- Avaliar as cepas quanto à capacidade de formação de biofilmes em superfícies de
poliestireno, através de placas para microtitulação;
- Avaliar a capacidade de formação de biofilmes em cupom de aço inoxidável, bem
como a eficácia na utilização de agentes biocidas para remoção dos mesmos;
- Determinar o tipo molecular utilizando a técnica Multilocus Sequence Typing
(MLST).
36
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 CENÁRIO DO ESTUDO
Trata-se de um estudo descritivo que faz parte do projeto “Aspectos microbiológicos
relacionados às infecções bacterianas ocorridas em pacientes internados em um centro de
tratamento de queimados de um hospital de grande porte da cidade do Rio de Janeiro, RJ” o
qual foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal Fluminense com o número
do parecer 68538. O projeto foi iniciado em 2012, com a coleta de amostras das feridas dos
pacientes queimados e da mesa de balneoterapia, onde 39 cepas de P. aeruginosa foram
detectadas e identificadas nos dois ambientes (DEUTSCH, 2014). Nesse mesmo período, a
tipificação molecular através de Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) foi realizada e 21
cepas foram classificadas como pertencentes ao clone A, 12 cepas pertenciam a clones
esporádicos, duas não foram tipificadas pelo método utilizado e quatro cepas foram perdidas.
4.2 CEPAS BACTERIANAS
Assim, as 35 cepas (27 coletadas de pacientes e 8 da mesa de balneoterapia) de P.
aeruginosa que se encontravam estocadas a -80°C em meio Tryptic Soy Broth (TSB)
contendo 20% de glicerol (v/v) foram ativadas em meio de TSB, posteriormente semeadas em
Tryptic Soy Agar (TSA) para a constatação da pureza das mesmas e uma alíquota de cada
cepa foi armazenada a -20°C para o prosseguimento do estudo.
4.3 TESTE DE SUSCETIBILIDADE ANTIMICROBIANA
O teste de susceptibilidade a antimicrobianos utilizados para direcionamento da
terapia contra infecções por P. aeruginosa foi realizado de acordo com as normas do Clinical
and Laboratory Standards Institute (CLSI; 2014), utilizando-se o teste de disco-difusão.
As 35 cepas foram semeadas em TSA e incubadas por aproximadamente 24 h/36o C.
Colônias isoladas foram transferidas para tubos contendo 2 mL de solução salina 0,9% até
atingirem uma turvação correspondente a escala 0,5 de McFarland. Com swab, a suspensão
foi semeada em placa contendo ágar Mueller-Hinton. Discos de antimicrobianos (Cecon®)
foram colocados sobre a superfície da placa com uma leve pressão. Foram utilizados os
37
seguintes discos de antimicrobianos: Piperacilina + Tazobactam - 100/10 µg, Ceftazidima - 30
µg, Imipenem - 10 µg, Meropenem - 10 µg, Aztreonam - 30 µg, Gentamicina - 10 µg,
Polimixina B - 30 UI e Ciprofloxacino - 5 µg.
A cepa de P. aeruginosa ATCC 27853 foi utilizada como controle para este teste.
4.4 DETECÇÃO DOS GENES DE RESISTÊNCIA E VIRULÊNCIA
4.4.1 Extração do DNA bacteriano
O DNA bacteriano foi extraído através de lise térmica, onde uma colônia obtida de
cultura de 24h/36°C em TSA de cada cepa foi transferida para um Eppendorf® contendo
100μL de água Milli-Q estéril e submetida a banho-maria fervente por 10 minutos. Após este
período, cada tubo contendo a solução foi acondicionado em banho de gelo por 5 minutos
para posterior centrifugação (20x100 g) por 5 minutos. Cinquenta microlitros do sobrenadante
contendo o material genético foram transferidos para novos tubos e armazenados a -20o C para
uso como template (DNA molde) na pesquisa dos genes procurados.
4.4.2 Polymerase Chain Reaction (PCR)
Os primers específicos para detecção dos genes avaliados, bem como as condições
das reações de PCR, estão descritos na tabela 3. A amplificação por PCR destes genes foi
realizada em 25µL de mistura de reação contendo 0,2 mM de dNTP, 0,8µM de cada primer
(gene alvo), 0,8µM de cada primer 16SrRNA (controle interno da reação), 1X Tampão
contendo MgCl2 (1,6mM), 1,5U de Taq DNA polymerase e 3,0 µL de DNA template obtido
conforme descrito no item 5.4.1. Cada gene foi amplificado separadamente em termociclador
(Veriti®; Applied Biosystems; Massachusetts, EUA).
Os produtos das reações de PCR foram submetidos à eletroforese com gel de agarose
1% em solução tampão TBE (TRIS 0,89M; Ácido Bórico 0,89M; EDTA 0,25M, pH 8,0)
0,5X, a 90V por 1 hora e 30 minutos. Posteriormente o gel foi impregnado com brometo de
38
etídio 0,5% por 15 minutos e visualizado em foto documentador L-Pix Chemi-Molecular
Imaging (Loccus Biotecnologia; São Paulo, Brasil).
Tabela 3. Primers utilizados para detecção dos genes de resistência e virulência através de PCR.
Desnaturação inicial = Di; Desnaturação = D; Anelamento = A; Extensão = E; Extensão final = Ef
Gene
alvo
Sequência dos primers (5’-3’) Condições das reações
de PCR
Tamanho do
amplicon
(pb)
Referência
blaCTX-M
F: CGCTTTGCGATGTGCAG
R: ACCGCGATATCGTTGGT
Di=95°C/ 5min; D= 94°C/
1min; A = 55° C/ 1min; E=
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 5min; 30
ciclos
552 Farshadzadeh et
al, 2014
blaOXA-10
F: TCAACAAATCGCCAGAGAAG
R: TCCCACACCAGAAAAACCAG
Di=95°C/ 5min; D= 95°C/
1min; A = 56° C/ 1min; E=
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 5min; 30
ciclos
276 Neyestanaki et
al, 2014
blaPER-1
F: ATGAATGTCATTATAAAAGC
R: TTAATTTGGGCTTAGGG
Di=95°C/ 5min; D= 94°C/
1min; A = 48° C/ 1min; E=
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 5min; 30
ciclos
927 Farshadzadeh et
al, 2014
blaGES-1 F: ATGCGCTTCATTCACGCAC
R: CTATTTGTCCGTGCTCAGG
Di=95°C/ 5min; D= 95°C/
1min; A = 50° C/ 1min; E=
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 5min; 35
ciclos
864 Poirel et al.,
2000
blaIMP
F: GTTTGAAGAAGTTAACGGGTGG
R : ATAATTTGGCGGACTTTGGC
Di=94°C/ 4min; D= 94°C/
1min; A = 61° C/ 1min; E=
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 10min;
35 ciclos
459 Aghamiri
et al, 2014
blaSPM-1 F: CCTACAATCTAACGGCGACC
R: TCGCCGTGTCCAGGTATAAC
Di=94°C/ 5min; D= 94°C/
1min; A = 42° C/ 1min; E=
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 7min; 30
ciclos
648 Toleman et al.,
2002
blaVIM F: TGGTGTTTGGTCGCATATCG
R: GAGCAAGTCTAGACCGCCCG
Di=94°C/ 4min; D= 94°C/
1min; A = 62° C/ 1min; E=
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 10min;
35 ciclos
595 Aghamiri
et al, 2014
blaKPC F: ATGTCACTGTATCGCCGTCT
R: TTTTCAGAGCCTTACTGCCC
Di=95°C/ 5min; D= 95°C/
1min; A = 55° C/ 1min; E=
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 5min; 35
ciclos
892 Bradford et al.,
2004
blaNDM F: GGTTTGGCGATCTGGTTTTC
R: CGGAATGGCTCATCACGATC
Di=95°C/ 5min; D= 95°C/
1min; A = 58° C/ 1min; E=
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 5min; 30
ciclos
620 Neyestanaki et
al, 2014
blaSIM F: TACAAGGGATTCGGCATCG
R: TAATGGCCTGTTCCCATGTG
Di=95°C/ 5min; D= 95°C/
1min; A = 61° C/ 1min; E=
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 5min; 30
ciclos
570 Neyestanaki et
al, 2014
exoS F:TCAGGTACCCGGCATTCACTACGCGG
R:TCACTGCAGGTTCGTGACGTCTTTCTTTTA
Di=94°C/ 3min; D= 94°C/ 40
seg; A = 55° C/ 30 seg; E=
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 5min; 40
ciclos
572 Jabalameli et al,
2012
exoU F: CCTTAGCCATCTCAACGGTAGTC
R: GAGGGCGAAGCTGGGGAGGTA
Di=94°C/ 3min; D= 94°C/ 40
seg; A = 64° C/ 30 seg; E=
72°C/ 1min; Ef= 72°C/ 5min; 40
ciclos
911 Jabalameli et al,
2012
16SrRNA F: ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT
R: TATTACCGCGGCTGCTGGC
Di=94°C/ 1min; D= 94°C/ 30
seg; A = 63° C/ 30 seg; E=
72°C/ 30 seg; Ef= 72°C/ 1min;
40 ciclos
180 Clifford et al,
2012
39
4.5 TESTE DE ATIVIDADE CARBAPENEMASE
O teste de atividade carbapenemase - Carba NP Test (DORTET, POIREL e
NORDMANN, 2012) foi realizado nas 8 cepas resistentes aos carbapenemas (cepas 2, 3, 4, 5,
9, 24, 31 e 32), a fim de avaliar sua capacidade de hidrólise ao imipenem.
As cepas carbapenemas resistentes foram semeadas em placas contendo ágar
Mueller-Hinton acrescido de 1µg/mL de imipenem, e incubadas por 24h a 36°C. Em paralelo
foram semeadas duas cepas controles positivas: uma cepa produtora de KPC (serino-
carbapenemase positiva; KPC+), uma produtora de NDM (metalo-β-lactamase positiva;
NDM+), e uma cepa não produtora de carbapenemases (J53), utilizada como controle
negativo. Inóculo pesado do crescimento bacteriano foi suspenso em 500µL de solução TRIS-
HCl (20mM; pH 7,5) em tubo de 1,5mL (Eppendorf®). Os tubos contendo as suspensões
bacterianas foram homogeneizados em vortex (QL-901 Vortex – Vertex; Brasil) e
posteriormente submetidos à sonicação em banho (47 kHz. ± 6%/ 60W) por 30 minutos.
Em placa para microtitulação (Nunclon®; Nunc), foram inoculados 30µL da
suspensão sonicada (parte superior da suspensão) em 100µL de vermelho de fenol (VF) + 0,1
mM ZnSO4 no primeiro poço da placa. Em seguida, 30µL da suspensão foram inoculados em
100µL de VF + 0,1 mM ZnSO4 + 3 mg/mL de imipenem no segundo poço, e no terceiro poço
foram inoculados 30µL da suspensão em 100µL de VF + 3 mg/mL de imipenem + 0,006M
EDTA. A placa foi incubada a 36°C, sendo a primeira leitura realizada após duas horas de
incubação e a segunda após quatro horas de incubação. A hidrólise do imipenem acidifica o
pH do meio, e o indicador VF, muda de cor do vermelho para o amarelo (figura 1).
40
amostra 1
amostra 2
controle -
Figura 1. Esquema gráfico do resultado do teste de atividade carbapenemase. Quando a amostra é
produtora de serino-carbapenemase ou oxa-carbapenemase, ocorre hidrólise do imipenem tanto na presença de
VF + ZnSO4, quanto na ausência de ZnSO4, ou seja, na presença de VF+ EDTA. Já uma metalo-β-lactamase, a
qual necessita da presença do cátion Zn++
como cofator enzimático para hidrolisar o imipenem, tem sua atividade
inibida pela ação do EDTA, que é um agente quelante.
Serino-carbapenemase ou Oxa-carbapenemase
Metalo-β-lactamase
VF
+ Z
nS
O4
VF
+ I
mip
enem
+ Z
nS
o4
VF
+ I
mip
enem
+ E
DT
A
41
4.6 AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE FORMAÇÃO DE BIOFILME
4.6.1 Formação de biofilme em placa para microtitulação
Foram repicadas 3 a 4 colônias de cada uma das 35 cepas de P. aeruginosa para 5
mL de TSB e incubadas a 36ºC por 24 horas. O mesmo foi realizado com a cepa de P.
aeruginosa ATCC 27853, a qual foi utilizada como controle positivo.
A cultura obtida foi diluída 1:100 em TSB. Em seguida, 100µL de cada cultura
diluída foram transferidos para um poço da placa para microtitulação (Nunclon®; Nunc) e
incubadas a 36 ºC por 4 e 24 horas. O teste foi realizado em quadriplicata para cada cepa,
utilizando uma placa para cada tempo de incubação (MERRIT, KADOURI e O’TOOLE,
2011 modificado).
Após incubação, o conteúdo de cada poço foi aspirado com pipeta de microdiluição e
descartado. Cada poço foi lavado com 100 µL de solução tampão salina fosfato (PBS; pH 7,4)
por três vezes, a fim de remover as células planctônicas. Após última lavagem, a solução foi
aspirada e a placa foi seca a temperatura ambiente. Foram adicionados 100 µL de cristal de
violeta (CV) 0,1% em cada poço, deixando corar por 10 minutos a temperatura ambiente.
Após este período, o corante foi removido e cada poço foi lavado novamente com 100 µL de
PBS por três vezes. A placa foi seca a temperatura ambiente e 200 µL de etanol 95% foi
adicionado a cada poço a fim de solubilizar o CV impregnado na biomassa formada. A placa
foi submetida a um espectrofotômetro (UV-2600-UV-VIS-Spectrophotometer, SHIMADZU;
Kyoto, Japão) e a absorbância da solução etanólica foi medida em 570 nm e expressa em
densidade óptica (DO).
As cepas cuja DO570 foi superior à DO570 da cepa controle (ATCC 27853) foram
consideradas formadoras de biofilme, enquanto as cepas que apresentaram DO570 inferior à
cepa controle foram consideradas não formadoras (SANCHEZ et al., 2013).
42
4.6.2 Formação de biofilme em cupom de aço inoxidável
Foram utilizados neste teste, cupons de aço inoxidável American Iron and Steel
Institute (AISI) 304 com acabamento número 4 (#4) e rugosidade de 0,36 μm com 1,0 cm x
1,0 cm. A limpeza dos cupons foi realizada manualmente com auxílio de esponja de
poliuretano, água e detergente neutro, seguida de enxágue com água destilada. Após enxágue,
os mesmos foram imersos em álcool etílico 70% (v/v) por 1 hora a temperatura ambiente e
esterilizados em autoclave (Spectru – Instrumental Científica Ltda; Brasil) a 121ºC por 15
minutos.
O preparo do inóculo foi realizado repicando 3 a 4 colônias das cepas de P.
aeruginosa em TSA para 5 mL de TSB, seguido de incubação a 36ºC por 24 horas. Diluições
sucessivas (1:10) do inóculo em água peptonada 0,1% foram realizadas a fim de se obter a
concentração inicial desejada (102
a 103
UFC/mL). Essa concentração foi confirmada por
semeadura de 0,1 mL das diluições em placas contendo TSA. Após obtenção da concentração
inicial desejada do inóculo, foi adicionado 1 mL do mesmo em 9 mL de TSB, seguido da
adição do cupom em tubo (Falcon®) de 15 mL estéril. Em seguida os tubos, cada qual
contendo uma cepa em contato com um cupom, foram incubados por 24 horas a 36ºC.
Após o término do período de incubação, os cupons de aço inoxidável foram
retirados dos meios de cultivo, com o auxílio de uma pinça estéril e imersos em tubo
(Falcon®) contendo 10 mL de PBS por 1 minuto, a fim de remover as células planctônicas.
Em seguida foram retirados desta solução e imersos em tubos (Falcon®) contendo 5 mL de
PBS e agitados em vortex (QL-901 Vortex – Vertex; Brasil) por 2 minutos para remoção das
células sésseis (PARIZZI et al., 2004 modificado). Alíquotas de 0,1 mL das diluições seriadas
(1:10) em água peptonada 0,1% da solução de PBS pós-vortex foram transferidas para placas
de Petri contendo TSA, a fim de se determinar o número de unidades formadoras de colônia
(UFC)/cm2. Todo o experimento foi realizado em triplicata. Neste ensaio foram utilizadas
nove cepas clínicas: cepa 1 (clone A, coletada de paciente, sensível aos carbapenemas), cepa 2
(clone D, coletada de paciente, resistente aos carbapenemas), cepa 3 (clone A, coletada de
paciente, resistente aos carbapenemas), cepa 4 (clone E, coletada de mesa, resistente aos
carbapenemas), cepa 5 (não tipada, coletada de paciente, resistentes aos carbapenemas) cepa 9
(clone A, coletada de paciente, resistente aos carbapenemas), cepa 24 (clone A, coletada de
43
mesa, resistente aos carbapenemas) cepa 31 (clone C, coletada de paciente, resistente aos
carbapenemas) e cepa 32 (não tipada, coletada de paciente, resistente aos carbapenemas).
Realizou-se o cálculo do nº de UFC/cm2, considerando a área do cupom e os
volumes utilizados.
UFC/cm2= (VD / VA) x M x D
A
Onde:
VD = volume de diluente utilizado na rinsagem do cupom (5mL);
VA= volume da alíquota utilizada no plaqueamento (0,1mL);
M= média das contagens obtidas nas placas (UFC);
D= diluição realizada
A= área do cupom (2cm2)
4.6.3 Avaliação da eficácia de agentes biocidas na remoção de biofilmes em
superfície de aço inoxidável
As soluções biocidas foram obtidas através de diluições com água MilliQ estéril das
seguintes soluções obtidas comercialmente: Hipoclorito de sódio 44,99% (Sigma-Aldrich®),
Peróxido de hidrogênio 30% (Isofar®) e Clorexidina 20% (Sigma-Aldrich®), a fim de se
obter uma concentração final de hipoclorito de sódio 1%, peróxido de hidrogênio 5% (TOTÉ
et al., 2010) e clorexidina 4%, que embora estudos tenham relatado sua pouca eficácia contra
biofilmes, continua sendo amplamente utilizada em ambientes hospitalares (BONEZ et al.,
2013; SMITH e HUNTER, 2008).
O preparo dos cupons e formação do biofilme foi realizado de acordo com
procedimento descrito no item 4.6.2, com alterações a partir da fase após lavagem do cupom
em 10 mL de PBS por 1 minuto, o mesmo foi retirado desta solução com pinça estéril e
imerso em 10 mL de cada solução biocida por 15 minutos. Após este tempo o cupom foi
transferido para tubo contendo 5mL de PBS adicionado de agente neutralizante para
inativação do biocida. Para inativar o hipoclorito de sódio 1% foi adicionado à solução de
44
PBS, tiossulfato de sódio a 1% e para inativar a clorexidina 4% foi utilizado Tween 80 a 1%.
A solução de peróxido de hidrogênio 5% não precisa ser inativada, pois se degrada
rapidamente. Os tubos foram agitados em vortex por 2 minutos para remoção das células
sésseis (PARIZZI et al., 2004 modificado). As soluções de PBS pós-vortex, foram diluídas
em série (1:10) em água peptonada 0,1%. Alíquotas de 0,1 mL das diluições seriadas foram
transferidas para placas de Petri contendo TSA, a fim de se determinar o número de unidades
formadoras de colônia (UFC)/cm2. Todo o experimento foi realizado em triplicata. Neste
ensaio foram analisadas as mesmas nove cepas clínicas utilizadas no ensaio anterior. O
cálculo do nº de UFC/cm2 foi realizado conforme descrito no item 4.6.2.
4.7 TIPIFICAÇÃO POR MLST
A tipificação por MLST foi realizada em 10 cepas: cepa 1 (isolada de paciente,
sensível à carbapenemas e clone A1), cepas 3 e 9 (isoladas de paciente, carbapenemas
resistentes e clone A2), cepa 2 ( isolada de paciente, carbapenemas resistente e clone D), cepa
4 (isolada de mesa, carbapenemas resistente, clone E), cepa 24 (isolada de mesa,
carbapenemas resistente, clone A1), cepa 26 (isolada de mesa, sensível à carbapenemas, clone
A1), cepas 5 e 32 (isoladas de paciente, carbapenemas resistentes e não tipificadas pelo
PFGE) e a cepa 31 (isolada de paciente, carbapenemas resistente, clone C).
Conforme protocolo de Curran e colaboradores (2004), foram utilizados primers para
as reações de PCR, os quais estão descritos na tabela 4. A mistura de reação foi composta de
aproximadamente 10ng de DNA cromossomial, 1µM de cada primer, 1x PCR buffer, 1,5 mM
MgCl2, 2 mM de cada deoxinucleosídeo trifosfato, e 2,5 U de Taq DNA polymerase, para um
volume final de 50 µL. As condições de reação foram as mesmas para todos os genes:
desnaturação a 96ºC por 1 min., anelamento de primer a 55ºC por 1 min., e extensão a 72ºC
por 1 min. Para 35 ciclos.
Cada gene foi amplificado separadamente. Os produtos de amplificação de cada gene
foram purificados com o kit Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification® (GE
Healthcare Life Sciences; Little Chalfont, Reino Unido) de acordo com os protocolos dos
fabricantes. A sequência de nucleotídeos foi determinada pelo uso de 1,2 µL de cada um dos
primers (tabela 4) a 3,0 pmol, 6,3 µL de DNA na faixa de 10-100 ng/µL (dosado previamente
45
em Nanodrop 2000 Spectrophotometer®; Termo Scientific – Massachusetts, EUA) e 2 µL de
Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit® (Applied Biosystems; Massachusetts,
EUA), com condições de sequenciamento padrão de acordo com protocolo do fabricante. As
terminações de corantes não incorporadas, foram removidas por precipitação com isopropanol
75%. Os produtos de reação foram separados e detectados pelo 3130 Genetic Analyser®
(Applied Biosystems HITACHI; Califórnia, EUA).
Os resultados foram analisados com a utilização do programa DNAstar 7.2.1 e
BioEdit (Ibis Biosciences), e então submetidos à comparação com a base de dados para P.
aeruginosa MLST (http://pubmlst.org/paeruginosa) a fim de atribuir números de alelos e tipos
de sequência (ST).
Tabela 4. Primers utilizados para amplificação e sequenciamento na tipificação por MLST
Gene
alvo
Sequência de nucleotídeos dos primers (5’ – 3’)
Forward Reverse
Tamanho do
amplicon
(pb) acsA
amplificação
sequenciamento
ACCTGGTGTACGCCTCGCTGAC
GCCACACCTACATCGTCTAT
GACATAGATGCCCTGCCCCTTGAT
AGGTTGCCGAGGTTGTCCAC
842
390
aroE
amplificação
sequenciamento
TGGGGCTATGACTGGAAACC
ATGTCACCGTGCCGTTCAAG
TAACCCGGTTTTGTGATTCCTACA
TGAAGGCAGTCGGTTCCTTG
825
495
guaA
amplificação
sequenciamento
CGGCCTCGACGTGTGGATGA
AGGTCGGTTCCTCCAAGGTC
GAACGCCTGGCTGGTCTTGTGGTA
GACGTTGTGGTGCGACTTGA
940
372
mutL
amplificação
sequenciamento
CCAGATCGCCGCCGGTGAGGTG
AGAAGACCGAGTTCGACCAT
CAGGGTGCCATAGAGGAAGTC
GGTGCCATAGAGGAAGTCAT
940
441
nuoD
amplificação
sequenciamento
ACCGCCACCCGTACTG
ACGGCGAGAACGAGGACTAC
TCTCGCCCATCTTGACCA
TGGCGGTCGGTGAAGGTGAA
1042
366
ppsA
amplificação
sequenciamento
GGTCGCTCGGTCAAGGTAGTGG
GGTGACGACGGCAAGCTGTA
GGGTTCTCTTCTTCCGGCTCGTAG
GTATCGCCTTCGGCACAGGA
989
369
trpE
amplificação
sequenciamento
GCGGCCCAGGGTCGTGAG
TTCAACTTCGGCGACTTCCA
CCCGGCGCTTGTTGATGGTT
GGTGTCCATGTTGCCGTTCC
811
441
Fonte: CURRAN et al., 2004.
46
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para obtenção da distribuição normal na avaliação da capacidade de formação de
biofilme em cupom de aço inoxidável, os dados reais das contagens de UFC/cm2 foram
colocados em logaritmo na base 10 para uniformização dos mesmos. Nesta avaliação, foram
realizados três experimentos independentes tendo sido o tratamento estatístico dos resultados
obtido pela análise de variância (ANOVA) em delineamento inteiramente casualizado, com
nível de significância de 5% (p<0,05). Para comparação entre as médias foi utilizado o teste
de comparação múltipla de Tukey. Para tal, foi utilizado o programa GraphPad Prism
, versão
5.01.
47
5 RESULTADOS
5.1 TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE ANTIMICROBIANA
O teste de susceptibilidade antimicrobiana demonstrou que 71,4% (25/35) das cepas
analisadas eram resistentes a multidrogas (MDR, multidrug-resistant), e 28,6% (10/35) não
eram resistentes a multidrogas (não-MDR multidrug-resistant). Das cepas não-MDR, somente
uma foi susceptível a todos os agentes antimicrobianos testados (tabela 5). O maior percentual
de resistência encontrado foi para o ciprofloxacino, contabilizando 94,3% (33/35) das cepas
analisadas; seguido de 88,6% (31/35) de resistência à gentamicina.
Resistência à ceftazidima e aztreonam foi detectada em 57,1% (20/35) e 54,3%
(19/35) das cepas respectivamente. Também foi observado resistência a carbapenemas em
22,9% (8/35) dos isolados, dos quais 6 isolados eram resistentes tanto ao imipenem quanto ao
meropenem, enquanto os outros dois restantes, um era resistente ao imipenem e o outro ao
meropenen. Todas as cepas estudadas foram susceptíveis à piperacilina + tazobactam e
polimixina B (figura 2).
5.2 DETECÇÃO DE GENES DE RESISTÊNCIA
O alto percentual de resistência a beta-lactâmicos sugeriu a presença de genes
codificadores de beta-lactamases (ESBL e MBL). Entretanto, dos genes pesquisados, foram
encontrados o blaGES-1 em 34,3% (12/35) dos isolados e o blaCTX-M em apenas 2,9% (1/35). Os
demais genes não foram encontrados.
Dos 12 isolados que continham o gene blaGES-1, 10 (83,3%) pertenciam ao clone A e
seus subtipos, principalmente os subtipos A1 e A2 (tabela 5).
5.3 DETECÇÃO DE GENES DE VIRULÊNCIA
O gene de virulência exoS foi o mais prevalente, estando presente em 71,4% (25/35)
das cepas analisadas, enquanto o gene exoU foi detectado em 14,3% (5/35) das cepas. Este
mesmo percentual, ou seja, 14,3% das cepas não abrigavam nem o gene exoS, nem o exoU.
48
Das 25 cepas que carregavam o gene exoS, 18 (72%) pertenciam ao clone A e seus
subtipos. O gene exoU estava distribuído em clones distintos: C, D e E (tabela 5). Porém, foi
observado que todas as cepas que continham este gene também eram resistentes aos
carbapenemas.
5.4 TESTE DE ATIVIDADE CARBAPENEMASE
Nenhuma das amostras carbapenemas resistentes testadas, apresentaram atividade
carbapenemase, ou seja, atividade hidrolítica enzimática ao imipenem, não havendo alteração
da cor do indicador VF após os tempos de incubação de 2 e 4 horas (figura 3).
5.5 AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE FORMAÇÃO DE BIOFILME
5.5.1Formação de biofilme em placa de microtitulação
Quanto à formação de biofilme em placa de microtitulação, houve um maior
percentual de cepas formadoras com tempo de incubação de 4 horas, ou seja, das 35 cepas
analisadas, 29 (82,9%) formaram biofilme. Entretanto, quando se aumentou o tempo de
incubação para 24 horas esse percentual diminuiu, resultando em 31,4% (11/35) das cepas.
Observou-se também que as cepas formadoras de biofilme pertenciam, em sua
maioria, ao clone A (81,8%), principalmente ao subtipo A1 (36,4%), o qual é o mais
prevalente entre os isolados (tabela 5).
5.5.2 Formação de biofilme em cupom de aço inoxidável e remoção do mesmo com
agentes biocidas
Os resultados para a formação de biofilmes em cupons de aço inoxidável estão
representados na figura 4. A contagem de células sésseis (log10 UFC/cm2) foi maior na cepa
32 (6,1), destacando-se das demais analisadas, que apresentaram contagens semelhantes.
Exceto para a cepa 31, a qual apresentou menor contagem de células sésseis (4,7). Baseado
49
neste resultado a cepa 32 foi considerada maior formadora de biofilme, seguida das cepas 2 e
4 ambas com contagem de 5,8 log10 UFC/cm2 e da cepa 24 com 5,7 log10 UFC/cm
2.
É importante ressaltar que as cepas 32, 2 e 4, as quais foram as maiores formadoras
de biofilme em cupom, também são carbapenemas resistentes e carregam o gene exoU. Sendo
a cepa 4, isolada da mesa onde a balneoterapia era realizada. Entretanto a cepa 24, que
também foi isolada da mesa e foi classificada como a terceira maior formadora de biofilme,
também é carbapenema resistente, mas carrega o gene exoS.
A análise estatística demonstrou que os biofilmes formados não diferiram
significativamente entre si (p<0,05).
Não houve contagens de células viáveis após contato com os 3 biocidas testados
(hipoclorito de sódio 1%, peróxido de hidrogênio 5% e clorexidina 4%).
5.6 TIPIFICAÇÃO POR MLST
A tipificação molecular utilizando a técnica de MLST forneceu dois tipos de
sequenciamento (ST) novos, ou seja, apresentou perfis alélicos até então não depositados no
banco de dados para P. aeruginosa MLST (http://pubmlst.org/paeruginosa). Atendendo aos
requisitos solicitados pelo site previamente mencionado, dados das cepas tipificadas foram
enviados e novos ST foram gerados.
As cepas 1, 3, 9, 24 e 26, as quais pertenciam ao clone A (A1 e A2) apresentaram o
mesmo perfil alélico que gerou o ST2236 (anexo I). Por outro lado, as cepas 2, 4, 5, 31 e 32,
que pertenciam a clones distintos, apresentaram um único perfil alélico, que quando
submetido gerou o ST2237 (anexo II).
50
Tabela 5. Perfil de resistência antimicrobiana, presença de genes de resistência e virulência, formação
de biofilme em placa (24h) e perfil PFGE de 35 cepas de P. aeruginosa coletadas de pacientes
queimados e mesa de balneoterapia.
Cepas Origen Resistência
antimicrobiana
Padrão de
resistência
Genes de
resistência
Genes de
virulência
Biofilme
24h
Perfil
PFGE
1 P CAZ, ATM, GEN, CIP MDR blaGES-1 - F A1
2 P CAZ, ATM, IMP,
MER,GEN, CIP
MDR - exoU NF D
3 P CAZ, ATM, IMP,
MER,GEN, CIP
MDR blaGES-1 - NF A2
4 M ATM, IMP, MER,GEN,
CIP
MDR - exoU NF E
5 P ATM, IMP, MER,GEN,
CIP
MDR - exoU NF NT
6 P CAZ, ATM, GEN, CIP MDR blaGES-1 exoS NF A2
7 P CAZ, ATM, GEN, CIP MDR blaGES-1 exoS NF F
8 P ATM, GEN, CIP MDR - exoS NF A2
9 P CAZ, ATM, MER, GEN,
CIP
MDR blaGES-1 exoS F A2
10 P GEN, CIP não-MDR - exoS NF A5
11 P CAZ, ATM, GEN, CIP MDR - exoS F A6
12 P CAZ, ATM, GEN, CIP MDR blaGES-1 exoS F A6
13 P CAZ, ATM, GEN, CIP MDR blaGES-1 exoS NF G
14 P ATM, GEN, CIP MDR - exoS NF H
15 P CAZ, ATM, GEN, CIP MDR blaGES-1 exoS NF A1
16 P GEN, CIP não-MDR - exoS NF I
17 P GEN, CIP não-MDR - exoS NF A4
18 P CAZ, GEN, CIP MDR blaGES-1 exoS NF A4
19 P ---------------------------- não-MDR - exoS F H
20 P CIP não-MDR - exoS F A7
21 P GEN, CIP não-MDR blaGES-1 exoS F A1
23 M CAZ, GEN, CIP MDR - - NF A1
24 M CAZ, IMP, GEN, CIP MDR - exoS NF A1
26 M GEN, CIP não-MDR blaGES-1 exoS F A1
27 M CAZ, ATM, GEN, CIP MDR blaGES-1 exoS NF A2
28 M CAZ, GEN, CIP MDR - exoS NF A1
29 P GEN, CIP não-MDR - - NF B
31 P ATM, IMP, MER,GEN,
CIP
MDR - exoU NF C
32 P ATM, IMP, MER,GEN,
CIP
MDR - exoU NF NT
33 P CAZ, GEN, CIP MDR - exoS F A1
34 P CAZ, ATM, GEN, CIP MDR blaCTX-M exoS F A3
35 P CAZ, ATM, GEN, CIP MDR - exoS NF A3
37 P CAZ, GEN não-MDR - exoS F F
38 M CIP não-MDR - - NF J
39 M CAZ, GEN, CIP MDR - exoS NF F
P= paciente; M= mesa onde era realizada a balneoterapia; CAZ= ceftazidima; ATM= aztreonam; GEN=
gentamicina; IMP= imipenem; MER= meropenem; CIP= ciprofloxacino; --------- = suscetível a todos os agentes
antimicrobianos; MDR= multidrug resistant; não-MDR= não multidrug resistant; - = negativo; F= formadora de
biofilme; NF= não formadora de biofilme; NT= não tipado.
51
Figura 2. Percentual de cepas resistentes a diferentes agentes antimicrobianos
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
100
0 0
20 20
54,3 57,1
88,6 94,3
% d
e ce
pas
resi
sten
tes
Antimicrobianos testados
52
1 2 3 4 5 6
A
B
C
D
E
F
G
H
VF
+ Z
nS
O4
VF
+ I
mip
enem
+ Z
nS
o4
VF
+ I
mip
enem
+ E
DT
A
VF
+ Z
nS
O4
VF
+ I
mip
enem
+ Z
nS
o4
VF
+ I
mip
enem
+ E
DT
A
A1, A2 e A3= cepa KPC positiva;
B1, B2 e B3= cepa NDM positiva;
C1, C2 e C3= cepa J53(controle negativo);
D1, D2 e D3= cepa 2;
E1, E2 e E3= cepa 3;
F1, F2 e F3= cepa 4;
G1, G2 e G3= cepa 5;
H1, H2 e H3= cepa 9;
A4, A5 e A6= cepa 24;
B4, B5 e B6= cepa 31;
C4, C5 e C6= cepa 32;
Amostras carbapenemas
resistentes
Figura 3. Resultados do teste de atividade carbapenemase após 4 horas de incubação.
Os demais poços não mencionados acima, referem-se a cepas que não fazem parte deste estudo.
53
Figura 4. Formação de biofilme em cupom de aço inoxidável para 9 isolados de P. aeruginosa.
5,4 5,8
5,3 5,8
5,4 5,5 5,7
4,7
6,1
0
1
2
3
4
5
6
7
PA1 PA2 PA3 PA4 PA5 PA9 PA24 PA31 PA32
log10 U
FC
/cm
2
cepas de P. aeruginosa (PA)
sensível a carbapenem; exoU-; exoS-
carbapenens resistentes; exoU+; exoS-
carbapenens resistentes; exoU-; exoS+
carbapenem resistente; exoU-; exoS-
54
6. DISCUSSÃO
O aumento da disseminação de P. aeruginosa multirresistentes em ambientes
hospitalares tem se tornado um grave problema de saúde pública. Este patógeno apresenta
vários mecanismos de resistência, os quais permitem que o mesmo sobreviva à ação dos
antimicrobianos e biocidas, permanecendo infectando pacientes e contaminando ambientes.
Este fato ainda se torna mais agravante quando se trata de pacientes queimados, os
quais apresentam sua imunidade comprometida e são geralmente submetidos à hospitalização
prolongada e terapias invasivas.
O presente estudo demonstrou elevada taxa de multirresistência antimicrobiana
(71,4%), o que é de grande relevância, pois a detecção de cepas resistentes a vários agentes
antimicrobianos, as quais são responsáveis pelo surgimento de surtos hospitalares, é um fator
muito importante na epidemiologia das infecções nosocomiais (MOOLENAR et al., 2000).
O maior percentual de resistência encontrada neste estudo foi para o ciprofloxacino
(94,3%), um agente antimicrobiano que pertence à categoria das fluoroquinolonas. Conforme
descrito em estudos anteriores, esta categoria representa a maior taxa de resistência em países
da América Latina (ANDRADE et al., 2006; SADER et al.,2001). Este fato pode ser atribuído
ao uso indiscriminado deste antimicrobiano, muitas das vezes prescritos empiricamente não
respeitando critérios científicos para seu uso.
A gentamicina, um aminoglicosídeo, apresentou a segunda maior taxa de resistência
(88,6%). O aumento da resistência à gentamicina tem sido relatado em outros estudos
(HERMES et al., 2013; YAYAN, GHEBREMEDHIN e RASHE, 2015). Geralmente este
agente é utilizado em combinação com β-lactâmicos para tratamentos de pneumonias graves
causadas por P. aeruginosa (TAM et al., 2006). Entretanto, nesta unidade hospitalar tanto
ciprofloxacino, quanto gentamicina devem ser evitados devido a suas elevadas taxas de
resistência.
A resistência aos β-lactâmicos foi elevada para ceftazidima (57,1%) e aztreonam
(54,3%). Enquanto as carbapenemas apresentaram percentual de resistência equivalente a
22,9%.
Devido a seu amplo espectro de atividade, carbapenemas constituem a terapia de
escolha para pacientes com infecções hospitalares graves (BERTONCHELI e HÖRNER,
55
2008), sendo considerados um dos últimos recursos terapêuticos para tratamento de infecções
causadas por P. aeruginosa multirresistentes (POIREL, COLLET e NORDMANN, 2000;
SAAVEDRA et al., 2014).
Os únicos agentes antimicrobianos testados, os quais todas as cepas estudadas
apresentaram suscetibilidade foram piperacilina + tazobactam e polimixina B. Entretanto,
apesar de sua toxicidade, a polimixina B permanece como opção terapêutica para tratamento
de infecções causadas por P. aeruginosa carbapenemas resistentes (ZAVASCKI et al., 2007).
A alta prevalência de cepas MDR (25/35) encontradas neste estudo, induz à pesquisa
de mecanismos que justifiquem tal resistência. Por isso, a pesquisa de genes que codifiquem
β-lactamases, foi a escolha para este trabalho. Estes genes estão em sua maioria presentes em
elementos genéticos móveis, o que promove a disseminação da resistência por transmissão
horizontal (VIEDMA et al., 2012), além do fato dos β-lactâmicos, os quais são alvos das β-
lactamases, constituírem uma das principais classes de antimicrobianos utilizados em
infecções nosocomiais, incluindo os carbapenemas.
Dentre os genes pesquisados, o blaGES-1 e o blaCTX-M foram detectados em 34,3%
(12/35) e 2,9% (1/35) das cepas respectivamente, enquanto os demais genes investigados não
foram encontrados. As cepas que abrigavam o gene blaGES-1 eram em sua maioria resistentes à
ceftazidima e aztreonam. A produção de GES beta-lactamase tem sido associada à resistência
de cefalosporinas de espectro extendido, incluindo a ceftazidima (POIREL et al., 2000). No
presente estudo, 10 (83,3%) das 12 cepas que carregavam o gene blaGES-1, eram resistentes à
ceftazidima.
Estudo realizado em isolados clínicos de P. aeruginosa resistentes à ceftazidima,
imipenem e/ou meropenem em um hospital no Brasil, demonstrou a presença dos genes
blaCTX-M-2 em 19,6% (11/56) dos isolados e blaGES-1 em apenas um isolado (POLLOTO et al.,
2012). Outros estudos no Brasil vêm destacando a presença destes genes em isolados de P.
aeruginosa, como descrito por Picão e colaboradores (2009), onde blaGES-1 e o blaCTX-M foram
identificados em 16,3% e 4,6% das cepas ceftazidima resistentes respectivamente.
A detecção de genes como blaGES-1 e o blaCTX-M confirma o recente surgimento
dessas ESBL em P. aeruginosa no Brasil, como resultado da grande capacidade de
disseminação destes genes através de elementos genéticos móveis (POLOTTO et al., 2012).
Segundo Picão e colaboradores (2009), o ambiente genético em torno destes genes em P.
56
aeruginosa, era idêntico ao encontrado na família Enterobacteriaceae, destacando sua origem
comum. Sendo provável que a localização destes genes em P. aeruginosa, seja resultante da
transferência horizontal com microrganismos desta família.
O gene blaGES-1, por sua vez estava associado ao clone A e seus subtipos. Dez cepas
das doze que abrigavam este gene pertenciam ao clone A. Assim sendo, a prevalência deste
clone em pacientes e na mesa onde a balneoterapia era realizada pode ser explicada também
pela capacidade que estas cepas têm de expressar este gene, conferindo resistência das
mesmas aos antimicrobianos β-lactâmicos, com exceção dos carbapenemas.
Em virtude de não serem encontrados os genes testados que codificassem
carbapenemases, o que justificaria a resistência encontrada aos carbapenemas, foi realizado o
teste de atividade carbapenemase (Carba NP). Este teste teve por finalidade investigar outras
enzimas com atividade hidrolítica aos carbapenemas. É um teste altamente específico,
sensível e rápido. Entretanto, deve ser considerado como limitação para o mesmo, a ausência
de detecção de carbapenemases tipo GES, principalmente em regiões geográficas com alta
prevalência para esta enzima, como é o caso do Brasil e África do Sul (DORTET, POIREL e
NORDMANN, 2012). As carbapenemases tipo GES são análogos mutantes pontuais da
ESBL GES-1, as quais possuem atividade carbapenemase adicional, porém bastante fraca
(KOTSAKIS et al., 2010), o que dificulta sua detecção. Sendo a melhor ferramenta para sua
identificação o uso de técnicas de biologia molecular (PCR e sequenciamento).
O teste Carba NP não identificou presença de atividade hidrolítica enzimática nas
cepas estudadas, sugerindo que outros mecanismos de resistência possam estar envolvidos.
Tais mecanismos incluem redução de expressão de porina de membrana externa (OprD) e
superexpressão de bombas de efluxo (XAVIER et al., 2010).
Assim, embora um dos mecanismos mais frequentes relatados em P. aeruginosa
carbapenemas resistentes, seja a presença de genes que codifiquem carbapenemases (RIZECK
et al., 2014; SADER et al., 2005), este não foi encontrado no presente estudo. Ferreira e
colaboradores (2015), estudando 29 cepas carbapenemas resistentes isoladas de pacientes com
pneumonia, também não detectaram genes MBL, com exceção de uma cepa que abrigava o
gene blaIMP.
Em relação aos genes de virulência, o percentual de cepas que carregavam o gene
exoS foi igual a 71,4% (25/35), enquanto a do gene exoU foi de 14,3% (5/35). A alta
57
prevalência do gene exoS em relação ao exoU, vem sendo descrita em alguns estudos
(BRADBURY et al., 2010; FERREIRA et al., 2015; GAREY et al., 2008). Os genes exoT,
exoY e exoS, são cromossomiais, enquanto o gene exoU apareceu posteriormente adquirido
via transmissão horizontal através de plasmídeos e integrado ao genoma bacteriano. Este fato,
justifica a baixa prevalência do gene exoU no genoma da P. aeruginosa, quando comparado
aos outros genes de virulência (BRADBURY et al., 2010; KULASEKARA et al., 2006).
A coexistência dos genes exoS e exoU em uma mesma cepa, não foi observada neste
estudo. Tal ocorrência vem a confirmar relatos de estudos anteriores, que demonstraram que
estes genes aparentam ser mutuamente exclusivos na maioria dos isolados (AGNELLO e
WONG-BERINGER, 2012; LEE et al., 2005).
Com relação ao padrão de resistência antimicrobiana, todas as 5 (100%) cepas que
abrigavam o gene exoU, foram MDR. Enquanto das 25 cepas que carregavam o gene exoS,
68% (17/25) apresentaram este padrão de resistência, sendo as demais não-MDR.
Um estudo realizado por Cho e colaboradores (2014) demonstrou que 93% de cepas
exoU positivas estavam associadas à resistência a fluoroquinolona, enquanto 45% de cepas
exoS positivas apresentaram este perfil de resistência. Wong-Beringer e colaboradores (2008),
também relataram que cepas exoU positivas eram mais propensas a serem resistentes a
fluoroquinolonas. No presente estudo, a resistência à fluoroquinolona, representada pelo
agente antimicrobiano ciprofloxacino, foi verificada em 100% das cepas exoU positivas, e
92% das cepas exoS positivas; não demonstrando muita diferença deste fenótipo de resistência
entre os genes de virulência estudados.
Entretanto, as cepas exoU positivas, apresentaram uma característica fenotípica de
resistência antimicrobiana muito importante. Todas as 05 (100%) cepas que abrigavam o gene
exoU, foram resistentes aos carbapenemas. Porém, apenas 02 (8%) das 25 cepas exoS
positivas apresentaram este fenótipo de resistência. De acordo com Garey e colaboradores
(2008), cepas de P. aeruginosa que contêm o gene exoU estão mais propensas à
multirresistência, incluindo carbapenemas.
A enzima ExoU tem sido associada a choque séptico, aumento da gravidade da
doença e mortalidade em pacientes com pneumonia causada por P. aeruginosa (ENGEL,
2003; WONG-BERINGER et al., 2008). De acordo com El- Solh e colaboradores (2012),
quase todas as cepas exoU positivas secretam a enzima ExoU, o que pode conduzir a um
58
desfecho clínico ruim para os pacientes internados nesta unidade hospitalar, devido à redução
de opções terapêuticas para estes pacientes, uma vez que o presente estudo demosntrou que as
cepas exoU positivas, também são multirresistentes, inclusive aos carbapenemas.
Outro tópico abordado neste estudo foi a capacidade de formação de biofilme entre
as cepas analisadas. A formação de biofilme é um mecanismo de defesa do próprio
microrganismo contra o ambiente, o que aumenta sua resistência aos antimicrobianos. Sua
formação pode ocorrer em superfícies bióticas e abióticas (GANDER, 1996; GILBERT,
ALLISON e MCBAIN, 2002; O’TOOLE, 2002). Muitas bactérias patogênicas existem
predominantemente sob a forma de biofilme em ambientes naturais e dentro de tecidos
infectados como comunidades polimicrobianas. Em pacientes queimados, fatores como
desvitalização da pele e dos tecidos, comprometimento da circulação e consequente
diminuição da resposta imune, favorecem a colonização e infecção das feridas por bactérias.
No presente estudo a capacidade de formação de biofilme das cepas de P. aeruginosa
foi avaliada em placa para microtitulação, utilizando dois tempos de incubação: 4 e 24 horas.
Porém, foi observado que o percentual de cepas formadoras de biofilme no tempo de
incubação de 4 horas (82,9%), foi maior que o percentual de cepas formadoras com tempo de
incubação de 24 h (31,4%).
Muitos fatores como escassez de nutrientes, nível de oxigênio, pH do meio, secreção
de enzimas que degradam a matriz exopolissacarídica (EPS), dentre outros, podem estar
associados a esta queda no percentual de cepas formadoras de biofilme em 24 horas de
incubação. Todavia, estudos prévios (TOTÉ et al., 2010), relatam que o biofilme de P.
aeruginosa só atinge a fase de maturação após 24 horas. Por esta razão, só foram consideradas
formadoras de biofilmes, as cepas cujos resultados foram obtidos após este tempo de
incubação.
A formação de biofilme e a secreção do tipo III tem se mostrado reciprocamente
regulada, através de dois sistemas sensores quinases: LadS e RetS, que atuam de maneiras
opostas. LadS reprime a expressão de genes do T3SS, enquanto favorece a formação do
biofilme. Através da sinalização do RetS, P. aeruginosa pode captar sinais ambientais e
responder por ativação da expressão dos genes de virulência, requisitados pela infecção
aguda, enquanto reprime genes que promovem a formação de biofilme (VENTRE et al.,
2006).
59
Entretanto, a relação do modo de crescimento bacteriano e a virulência durante a
infecção, permanece não muito esclarecido na maioria dos casos (MIKKELSEN et al., 2009).
Schaber e colaboradores (2007) relataram que biofilme de P. aeruginosa pode se formar
rapidamente durante infecção aguda em ratos com lesões térmicas, sugerindo que infecções
agudas e biofilmes não são mutuamente exclusivos em todas as condições.
Mikkelsen e colaboradores (2009), a fim de investigar se proteínas relacionadas ao
T3SS poderiam ser detectadas no efluente do biofilme (sistema de fluxo contínuo) e no
sobrenadante de células planctônicas, analisou o secretoma do biofilme de 3 dias de
crescimento e de células planctônicas de fase estacionária (~ 9 h de crescimento) através da
técnica de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC-
MS/MS). Foram então, detectadas no secretoma de todas as amostras de biofilmes analisadas,
as proteínas efetoras do T3SS: ExoS e ExoT. Todavia, nenhuma proteína do T3SS foi
identificada no secretoma dos sobrenadantes das células planctônicas. Com esses resultados,
Mikkelsen e colaboradores, demonstraram que biofilmes e sistema de secreção tipo III, não
são, portanto, mutuamente exclusivos em P. aeruginosa. Assim sendo, os biofilmes podem
desempenhar um papel ainda mais ativo na virulência do que se esperava.
No presente estudo, das 11 cepas produtoras de biofilme (24 h), 10 carregavam o
gene exoS, o qual pode vir a ser expresso por estas cepas. Neste caso, além da formação de
biofilme, a secreção da exoenzima ExoS pelo mesmo, contribui para um aumento da
patogenicidade.
Outro agravante à patogenicidade dos biofilmes é a susceptibilidade reduzida dos
mesmos aos antimicrobianos. Isto se deve em grande parte, à limitação da penetração dos
antibióticos até seus substratos, a qual pode ser retardada devido à resistência destes agentes
para se difundir através do biofilme. Acredita-se que os antimicrobianos possam ser
consumidos, desativados e adsorvidos pela matriz EPS do biofilme (MULCAHY, ISABELLA
e LEWIS, 2014).
Um estudo realizado por Corehtash e colaboradores (2015) em P. aeruginosa
isoladas de pacientes queimados, demonstrou que a produção de biofilme em isolados MDR
era significantemente maior do que em isolados não-MDR. Este fato também foi observado
por Abidi e colaboradores (2013), quando analisaram P. aeruginosa isoladas de lentes de
contato.
60
Em nosso estudo foi observado que das 11 cepas formadoras de biofilme, 6 (54,5%)
eram MDR, e 5 (45,5%) não-MDR. Este resultado contraria os descritos anteriormente, onde
é relatado que a produção de biofilmes é significantemente maior em isolados MDR.
Entretanto, as cepas produtoras de biofilme, segundo a tipificação por PFGE, pertenciam em
sua maioria ao clone A, o qual era o mais prevalente, incluindo isolados de pacientes e
isolados da mesa de balneoterapia. Das 11 cepas formadoras de biofilme, 09 (81,8%)
pertenciam ao clone A e seus subtipos. Destas 09 cepas (formadoras de biofilme e clone A),
06 (66,7%) eram MDR. O que pode por sua vez, justificar a prevalência deste clone nos
pacientes e no ambiente.
Além da avaliação da capacidade de formação de biofilme em placa de
microtitulação, esta também foi avaliada em cupons de aço inoxidável, com a finalidade de
mimetizar a superfície dos tanques onde era realizada a balneoterapia nos pacientes
queimados.
Foram selecionadas 9 cepas para este teste das quais 8 eram carbapenemas
resistentes. Todas as cepas formaram biofilme, com pouca variação entre os resultados. A
resistência à carbapenemas, e a presença e/ou ausência de genes de virulência, foi analisada
concomitantemente à produção de biofilme, sendo observado um discreto aumento na
capacidade de formação de biofilme, nas cepas carbapenemas resistentes que carreavam um
dos genes de virulência: exoS ou exoU (figura 4).
Ressalta-se que das 9 cepas analisadas no método de cupom, apenas duas (1 e 9)
foram consideradas formadoras de biofilmes pelo método de microplaca. Das 7 cepas
restantes (2, 3, 4, 5, 24, 31 e 32) que pelo método de microplacas foram consideradas não
formadoras de biofilmes, apresentaram contagens que variaram de 4,7 a 6,1 UFC/cm2
de
células sésseis na metodologia de formação de biofilmes em cupons de aço inoxidável (figura
4). Estes resultados alertam para a importância da utilização da superfície de interesse e
comprovam a influência da mesma no estudo de formação de biofilmes microbianos.
A formação do biofilme em cupons de aço inoxidável teve como função principal a
análise da remoção dos mesmos utilizando soluções biocidas. Devido ao fato, de serem
encontradas cepas com o mesmo perfil PFGE, em sua maioria tipo A (A1 e A2)
infectando/colonizando pacientes e contaminando a mesa de balneoterapia, era sugestivo que
61
estava havendo falha no processo de desinfecção da mesa, o que estaria acarretando a
contaminação cruzada entre pacientes.
A desinfecção é uma etapa crucial no controle das IRAS, as quais têm sido
responsáveis por significantes morbidades e mortalidades em ambientes hospitalares. O
aumento do uso de desinfetantes a baixas concentrações, menores do que as recomendadas
pelo fabricante, compromete a eficácia do processo de desinfecção, bem como favorece o
surgimento de resistência microbiana aos biocidas. Além disso, o ambiente hospitalar
constitui um reservatório de bactérias que apresentam alta tolerância a produtos desinfetantes,
devido à má utilização dos mesmos (MARINO et al., 2011; ROMAO et al., 2005).
Já está estabelecido, que a matriz EPS é a parte do biofilme que confere resistência
aos biocidas (ABDALLAH et al., 2014). Sendo assim, mesmo que o desinfetante reduza
completamente a contagem de células sésseis viáveis, muitos biocidas deixam a matriz
intacta, podendo esta vir a ser recolonizada (TOTÉ et al.,2010).
Um estudo realizado por Toté e colaboradores (2010), demonstrou que somente
agentes oxidantes fortes como peróxido de hidrogênio a 5% e hipoclorito de sódio a 1% foram
ativos contra ambos, massa viável e matriz em biofilmes de P. aeruginosa. Sendo este, o
motivo para escolha destes biocidas para análise da remoção dos biofilmes em cupons de aço
inoxidável.
Apesar da metodologia aplicada no presente estudo, não avaliar redução da matriz
EPS, a contagem de células sésseis foi analisada. De acordo com os resultados obtidos por
Toté e colaboradores (2010), em nosso estudo, estes biocidas também demonstraram-se
eficazes, não havendo contagem de células sésseis viáveis em todos os biofilmes analisados,
após o tempo de contato de 15 minutos.
Outro biocida que teve sua atividade avaliada neste estudo foi a clorexidina 4%.
Alguns relatos sobre este biocida confirmaram sua eficácia sobre células planctônicas, porém
não sobre biofilmes (BONEZ et al., 2013; SMITH e HUNTER, 2008). O amplo uso deste
agente em ambientes hospitalares, fez com que este também fosse selecionado para o estudo.
Ao contrário dos resultados obtidos nos trabalhos anteriormente citados, a
clorexidina 4% foi eficaz na remoção de todos os biofilmes avaliados, não havendo contagem
de células sésseis viáveis após o tempo de contato previamente estabelecido.
62
Para finalizarmos o estudo de caracterização das cepas de P. aeruginosa encontradas
em ambiente e em pacientes queimados foi realizada a tipificação molecular utilizando a
técnica de MLST em 10 dessas cepas. Estas mesmas cepas haviam sido tipificadas em estudo
prévio pela técnica de PFGE. Assim, foram escolhidas 05 cepas pertencentes ao clone A
(subtipos A1 e A2) as quais apresentaram o mesmo perfil alélico, que por sua vez gerou um
novo ST, denominado ST2236. Este resultado sugere que as cepas pertencentes ao clone A,
tiveram origem em um mesmo ancestral. Todavia, as outras 5 cepas que pertenciam a clones
não-A (C, D e E), inclusive duas que não foram tipificadas (NT) pela técnica de PFGE,
também apresentaram o mesmo perfil alélico, gerando outro novo ST, o qual foi denominado
ST2237.
Devido a poucos estudos envolvendo MLST em P. aeruginosa no Brasil, não se pode
afirmar que os dois novos ST gerados sejam restritos a esta unidade hospitalar. Existe um
ST1560 depositado no banco de dados (http://pubmlst.org/paeruginosa) pelo Instituto
Oswaldo Cruz/ FIOCRUZ – Rio de Janeiro, que difere do ST2236 em apenas um único alelo
(aroE= 8), com mutação em um único nucleotídeo, o qual se refere a duas cepas isoladas de
infecções do trato urinário, em épocas distintas, uma em 1999 e outra em 2010.
O ST2236 demonstrou não ter sofrido muitas modificações ao longo de sua
evolução, mantendo-se praticamente indistinguível, quando avaliado pelo PFGE. Podendo ser
esta estabilidade, um dos motivos de sua prevalência colonizando/infectando pacientes e
contaminando ambiente (mesa de balneoterapia). Já o ST2237, o qual contém isolados de
perfis PFGE variados, demonstra que ao longo de sua evolução, modificações ocorreram,
fazendo com que estes isolados diferenciassem entre si. Entretanto, este ST foi associado à
resistência a carbapenemas e presença do gene de virulência exoU, nas amostras analisadas
neste estudo.
Todos os resultados aqui encontrados vieram a confirmar a necessidade de vigilância
e controle das infecções associadas a P. aeruginosa nesta unidade hospitalar. Os pacientes
queimados que por sua vez apresentam a pele e tecidos destruídos pelas injúrias térmicas
estão altamente suscetíveis a infecções, que segundo Oliveira e Serra (2011) são as principais
causas de óbito para os mesmos.
63
7. CONCLUSÃO
- Os agentes antimicrobianos ciprofloxacino e gentamicina devem ser evitados nesta
unidade hospitalar devido seu alto percentual de resistência.
- As cepas estudadas eram em sua maioria multirresistentes, reduzindo as opções
terapêuticas de tratamento. A presença dos genes blaGES-1 e blaCTX-M codificadores de β-
lactamases de amplo espectro (ESBL), confirmou o surgimento destas enzimas em isolados de
P. aeruginosa no Brasil, o que é preocupante devido sua capacidade de disseminação por
transmissão horizontal.
- A ausência dos genes pesquisados que codificassem carbapenemases, bem como a
não detecção de atividade hidrolítica enzimática nas cepas carbapenemas resistentes, são
possíveis indicadores que outros mecanismos de resistência como redução de porinas de
membrana externa (OprD) e superexpressão de bombas de efluxo possam estar envolvidos.
- A presença do gene exoU em cepas multirresistentes, inclusive aos carbapenemas, é
de grande relevância devido à elevada citotoxicidade da ExoU em pacientes altamente
suscetíveis à infecção e com reduzida opção terapêutica.
- As cepas formadoras de biofilme eram em sua maioria pertencentes ao clone A, o
que pode ser uma das causas da persistência deste clone infectando pacientes e contaminado a
mesa onde era realizada a balneoterapia.
- A remoção de biofilme em cupom de aço inoxidável demonstrou-se eficaz, com
todas as soluções biocidas testadas (hipoclorito de sódio 1%, peróxido de hidrogênio 5% e
clorexidina 4%). Indicando que estava havendo falha no processo de desinfecção nesta
unidade hospitalar, pois foi detectado pelo PFGE um mesmo clone infectando paciente e
contaminando a mesa de balneoterapia. Se a desinfecção for realizada corretamente, a
contaminação cruzada entre pacientes pode ser evitada.
- A tipificação por MLST resultou em dois novos tipos de sequenciamento: ST2236 e
ST2237. As cinco cepas pertencentes ao clone A (A1 e A2) geraram um mesmo ST(2236), o
que sugere ancestralidade comum. Já o ST2237, continha cepas de clones variados (C, D e E),
estando associado à resistência a carbapenemas e presença do gene exoU, sugerindo cepas
melhor adaptadas para causar infecção.
64
8. ANEXOS
Anexo I – ST 2236 gerado de acordo com novo perfil alélico obtido através da técnica de MLST.
Anexo II - ST 2237 gerado de acordo com novo perfil alélico obtido através da técnica de MLST.
65
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![TUH Journal online Volume 3 No. 1 January – April 2018 · บทความวิจยั [TUH Journal online Volume 3 No. 2 May - August 2018]40 Abstract Background : Carbapenemases](https://img.pdfslide.tips/doc/110x75/5fc76ea935059622f15853da/tuh-journal-online-volume-3-no-1-january-a-april-2018-aaaaaaaaaaa.jpg)
![Jorge Luiz Mello Sampaio - USP€¦ · blaVEB, blaBEL, blaTLA e blaSFO [14]. As carbapenemases mais prevalentes em enterobactérias são codificadas por genes dos grupos bla KPC ,](https://img.pdfslide.tips/doc/110x75/5f9757415ededf4cb6423ad2/jorge-luiz-mello-sampaio-blaveb-blabel-blatla-e-blasfo-14-as-carbapenemases.jpg)
