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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE – UFF
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS
A PRODUTOS PARA SAÚDE – PPG-CAPS
MAYARA MALHADO
PERFIL FARMACOCINÉTICO DE NANOPARTÍCULAS DE POLI
(METIL METACRILATO) CONTENDO PRAZIQUANTEL
Niterói
2015
MAYARA MALHADO
PERFIL FARMACOCINÉTICO DE NANOPARTÍCULAS DE
POLI (METIL METACRILATO) CONTENDO PRAZIQUANTEL
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a
Produtos para Saúde da Universidade
Federal Fluminense, como Requisito parcial
para a obtenção do Grau de Mestre.
Área de concentração: Interdisciplinar.
Orientadora: Prof
a. Dr
a. Sabrina Calil Elias
Niterói
2015
MAYARA MALHADO
PERFIL FARMACOCINÉTICO DE NANOPARTÍCULAS DE
POLI (METIL METACRILATO) CONTENDO PRAZIQUANTEL
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a
Produtos para Saúde da Universidade
Federal Fluminense, como Requisito parcial
para a obtenção do Grau de Mestre.
Área de concentração: Interdisciplinar.
Apresentada em 31 de março de 2015
BANCA EXAMINADORA
Dra. Sabrina Calil Elias – UFF
Orientadora
Dra. Sandra Aurora Chavez Perez Rodrigues – FioCruz
Dr. Marcelo Cossenza Pettezzoni de Almeida – UFF
Dra. Carla Valéria Vieira Guilarducci Ferraz – UFF
Niterói
2015
M249
Malhado, Mayara
Perfil farmacocinético de nanopartículas de poli
(metil metacrilato) contendo Praziquantel / Mayara
Malhado; orientadora: Sabrina Calil Elias – Niterói,
2015.
83 f.
Dissertação (Mestrado)- Universidade Federal
Fluminense, 2015.
1. Farmacocinética 2. Praziquantel 3. Nanopartículas
4. Esquistossomose I. Calil-Elias, Sabrina. II.
Título.
COD 615.7
DEDICATÓRIA
A Deus, a minha mãe Maria Helena, ao meu
namorado Gabriel, aos meus amigos e aos
alunos e professores do Laboratório de
Farmacologia da Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal Fluminense.
AGRADECIMENTOS
A Deus pelo dom da vida. Por sua graça e amor que excede todo entendimento.
Pelo renovar das forças a cada manhã, pelas oportunidades, pela saúde e por tudo que
tenho e sou.
A minha mãe Maria Helena, pelo amor incondicional. Pelo exemplo de força, fé,
coragem e perseverança. Por me incentivar a buscar meus sonhos. Pela compreensão,
pelo cuidado, pela dedicação. Por se fazer presente, mesmo fisicamente distante.
Ao meu namorado Gabriel Lowenthal pelo amor, carinho, cuidado e proteção.
Pela companhia nas longas horas de experimento. Pelos abraços e sorrisos que
acalentam o coração.
A minha orientadora, professora Dra. Sabrina Calil Elias pela oportunidade,
dedicação e confiança. Por me ensinar a não desistir e por incentivar meu crescimento
profissional
A Tabita Melo e Fernanda Ribeiro, por serem minhas irmãs de alma. Pela
compreensão, carinho, orações e apoio. Por compreenderem minha ausência. Pela
amizade e companheirismo em todos os momentos.
Aos doutores José Carlos Pinto, Laís Bastos da Fonseca e Alessandra Lifsitch
Viçosa e pela oportunidade de participar desse projeto. Por disponibilizarem recursos
para o desenvolvimento dos experimentos.
A equipe do Laboratório de Farmacocinética da Fundação Oswaldo Cruz pelo
apoio e recepção. Em especial ao Douglas Pinto e Aline Campos pelo ensino e auxílio
no desenvolvimento das técnicas dos ensaios analíticos e ao Gabriel Silveira pela
dedicação, paciência e colaboração com as análises.
A professora Dra. Déborah Quintaninha Falcão pela revisão do trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Farmacologia da Faculdade de Farmácia (UFF),
por me agregar valores de companheirismo e desenvolvimento de trabalho em equipe.
Pelo incentivo, pelas conversas e risadas, mesmo em situações adversas.
A Angélica Silveira e Rafaela Gomes pelo auxílio na execução dos
experimentos; a Mara Ribeiro, pela disponibilidade e orientação; Thaisa Amorin,
Paula Borges, Wilian Spudeit, Tiago Leite e Tarciana Lima pela companhia, suporte e
trocas de experiência e as alunas de iniciação científica Juliana Peixoto, Paula L.
Marotta, Tainá Garcia e Thaís Bravo pela dedicação e profissionalismo.
Ao apoio financeiro da COPPE, CNPQ e CAPES, que subsidiaram o
desenvolvimento do trabalho.
“Escolha um trabalho que você ame e não terás que trabalhar um único dia
da sua vida.”
Confúncio
RESUMO
Praziquantel (PZQ) é o fármaco recomendado pela Organização Mundial de Saúde para
o tratamento da esquistossomose. No Brasil é comercializado apenas sob a forma de
comprimido, o que complica o tratamento de crianças tanto devido à dificuldade de
adequação da dose, como pelo sabor extremamente amargo. Nesse sentido,
Nanopartículas de Poli (Metil Metacrilato) contendo PZQ (PMMA-PZQ) foram
desenvolvidas pelo grupo de pesquisa do Laboratório de Engenharia de Polimerização
da COPPE-UFRJ, visando a elaboração de suspensão de PZQ. O presente estudo
objetivou avaliar o perfil farmacocinético de PZQ administrado em nanopartículas
(PZQ-NP) e compará-lo ao perfil farmacocinético de PZQ administrado na forma livre
(PZQ-L), como fase pré-clínica do desenvolvimento de nova formulação farmacêutica.
Foram utilizados ratos Wistar, fêmeas, com peso entre 200 e 300 g. O sangue foi
coletado nos tempos 0, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min, 1 h, 1:30 h, 2 h, 4 h, 8 h,
10 h, 12 h e 24 h após a administração por via oral, em dose única, de 60 mg/ kg de
PZQ suspendido em 1 mL de água com 2% de Cremophor® (grupos PZQ-NP e PZQ-L)
ou 1 mL de veículo (grupo controle). A manipulação e os procedimentos com os
animais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade
Federal Fluminense. O PZQ foi extraído do plasma utilizando extração líquido-líquido
com terc-butil-metil éter. O diazepam foi utilizado como padrão interno e a análise das
amostras foi realizada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acomplada a
Espectrometria de Massas. Os valores obtidos para Concentração máxima (Cmáx) e Área
Sob a Curva (ASC0-t e ASC0-∞) do grupo PZQ-NP foram aproximadamente 3 vezes
menor comparado ao grupo PZQ-L. No entanto, o tempo para atingir a concentração
máxima (Tmáx), a constante de eliminação (Ke) e o tempo de meia vida de eliminação (T
1/2β) não apresentaram valores estatísticamente diferentes. Estes resultados sugerem que
a absorção é possivelmente a etapa limitante para obtenção de melhores parâmetros
farmacocinéticos de PZQ adminstrado em nanopartículas de PMMA. Assim, são
necessários mais estudos visando a compreensão dos mecanismos de absorção das
nanopartículas de PMMA-PZQ e do processo de liberação do fármaco a partir matriz
polimérica in vivo para que o nanosistema seja aprimorado e o produto disponibilizado
para uso clínico.
Palavras chaves: Praziquantel, Nanopartículas de Poli (metil metacrilato),
farmacocinética.
ABSTRACT
Praziquantel (PZQ) is the drug recommended by the World Health Organization for the
treatment of schistosomiasis. In Brazil it is comercialised only in tablet, which
complicates the treatment of children because of the difficulty of adapting the dose , and
its extremely bitter taste. In this way, PZQ loaded in Poly(methyl methacrylate)
Nanoparticle (PMMA-NP) were developed at Laboratório de Engenharia de
Polimerização (COPPE –UFRJ), in order to develop PZQ suspension. This study aimed
to evaluate the pharmacokinetic profile of PZQ loaded in nanoparticles ( PZQ -NP ) and
compare it to the pharmacokinetic profile of PZQ administered in free form ( PZQ -L ) ,
as pre- clinical phase of the new pharmaceutical formulation development. Wistar rats,
femeles, weighing nearby 300 g were used, was the experimental model employed.
Blood was collected at 0, 5 min, 10 min , 15 min, 20 min, 30 min , 1 h 1:30 h , 2 h , 4 h,
8 h , 10 h , 12 h and 24 h after orally administration at a single dose of 60 mg / kg PZQ
suspended in 1 ml of water containing 2% Cremophor® ( NP - PZQ groups and PZQ -
L) or 1 ml of vehicle (control group). The handling and procedures with animals were
approved by the Ethics Committee on Animal Use of Universidade Federal Fluminense.
PZQ was extracted from plasma by liquid-liquid extraction with terc-butyl methyl ether.
Diazepam was used as internal standard and the analysis of samples was performed by
High Performance Liquid Chromatography Efficiency tandem Mass Spectrometry. The
values obtained for Maximum Concentration (Cmax) and Area Under Curve (ASC0-t and
ASC0 0-∞ ) for group PZQ-NP were about 3 times lower compared to PZQ-L group .
However , the time for achieving maximum concentration ( Tmax ), the elimination
constant (Ke) and the half-life time of elimination (T 1/2β) were not statistically
different. These results suggest that the absorption is probably the rate-limiting step for
obtaining better pharmacokinetic parameters of PZQ administrated on PMMA
nanoparticles. Thus, further studies are needed to understand both the PMMA – PZQ
absorption mechanisms, as the process of drug release through polymer matrix in vivo,
in order to enhanced the nanosystem and then the product to become available for
clinical use.
Palavras chaves: Praziquantel, Poly (methyl methacrilate) Nanoparticle,
pharmacokinetic.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO, p.17
2. REFERENCIAL TEÓRICO, p. 20
2.1 Esquistossomose, p. 20
2.1.1 Tratamento, p. 21
2.2 Praziquantel, p. 22
2.2.1 Farmacodinâmica, p. 23
2.2.2 Farmacocinética, p. 24
2.3 Nanotecnologia e nanopartículas, p. 25
2.3.1 Nanoparticulas poliméricas, p.26
2.4 Cinética das nanopartículas in vivo, p.8
2.4.1 Absorção, p. 28
2.4.1.1 Internalização celular de nanopartículas, p. 29
2.4.1.2 Destino intracelular e escape do endossoma, p.31
2.4.2 Distribuição, p. 32
2.4.3 Biotransformação e eliminação, p. 33
2.5 Toxicidade, p.34
2.6 Farmacocinética pré-clínica, p. 35
3. OBJETIVOS, p.36
3.1 Objetivo geral, p. 36
3.2 Objetivos específicos, p. 36
4. MATERIAIS E MÉTODOS, p. 37
4.1 Equipamentos e instrumentos de uso geral, p. 37
4.1.1 Componentes e equipamentos utilizado para a análise e identificação das amostras, p. 37
4.1.2 Padrões, p. 37
4.1.3 Solventes, reagentes e soluções, p. 38
4.2 Animais, p.38
4.3 Dose e esquema de administração, p. 38
4.4 Preparo da gavage, p. 39
4.4.1 Grupo controle, p. 39
4.4.2 Grupo PZQ-L e grupo PZQ-NP, p. 39
4.5 Coleta das amostras, p. 40
4.6 Coleta de branco de plasma normal (BPN), p. 40
4.7 Eutanásia, p. 40
4.8 Metodologia analítica, p. 41
4.8.1 Apresentação do método, p. 41
4.8.2 Preparo das soluções mestre e soluções de trabalho, p. 41
4.8.3 Extração de Praziquantel e do padrão interno das amostras , p. 42
4.8.4 Condições cromatográficas, p. 43
4.8.4.1 Tempos de retenção, p.43
4.8.5 Condições do espectômetro de massas, p. 44
4.8.6 Curva de calibração, p.45
4.9 Validação do método analítico, p.45
4.9.1 Teste de quantificação inicial (TQI), p. 46
4.9.2 Teste de estabilidade curta de soluções de trabalho (TEBCST), p. 46
4.9.3 Teste de estabilidade longa de soluções de trabalho (TEBLST), p. 47
4.9.4 Teste de estabilidade curta em plasma (TEBCP), p. 47
4.9.5 Teste de estabilidade pós-processamento (TEBPP), p. 48
4.9.6 Teste de estabilidade pós-ciclo de congelamento e descongelamento (TEBCD), p. 49
4.9.7 Precisão e exatidão, p. 49
4.10 Análise das amostras, p. 50
4.11 Análise estatística, p. 50
5. RESULTADOS, p. 51
5.1 Desenvolvimento do método analítico, p. 51
5.2 Validação do método analítico, p. 53
5.2.1 Teste de quantificação inicial (TQI), p. 53
5.2.2 Teste de estabilidade curta de soluções de trabalho (TEBCST), p. 53
5.2.3 Teste de estabilidade longa de soluções de trabalho (TEBLST), p. 53
5.2.4 Teste de estabilidade curta em plasma (TEBCP), p. 54
5.2.5 Teste de estabilidade pós-processamento (TEBPP), p. 54
5.2.6 Teste de estabilidade pós-ciclo de congelamento e descongelamento (TEBCD), p. 55
5.2.7 Precisão e exatidão, p. 55
5.2.7.1 Precisão e exatidão intracorrida, p. 54
5.2.7.2 Precisão e exatidão intercorridas, p. 56
5.3 Avaliação farmacocinética, p. 58
6. DISCUSSÃO, p. 61
7. CONCLUSÃO, p. 66
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS, p. 67
9. ANEXOS, p. 74
LISTA DE FIGURAS, TABELAS E QUADROS
Figura 1: Fórmula estrutural do praziquantel, f. 22
Figura 2: Fórmula estrutural do diazepam, f. 41
Quadro 1: Condições cromatográficas para análise, f. 43
Quadro 2: Tempos de retenção, f. 44
Quadro 3: Parâmetros individuais dos íons monitorados, f. 44
Quadro 4: Pressão dos gases e temperatura do gás de secagem, f. 45
Figura 3: Curva de calibração da corrida analítica, f. 51
Figura 4: Cromatogramas obtidos para branco de plasma e para uma amostra
desconhecida, f.52
Tabela 1: Resultado obtido para o teste de precisão e exatidão intercorridas, f. 56
Figura 5: Curva de concentração plasmática média de Praziquantel em função de tempo, f. 58
Figura 6: Parâmetros farmacocinéticos de Praziquantel após administração de PZQ-L
(n = 7) e PZQ-NP (n = 5) em ratos, f. 59
Tabela 2: Parâmetros farmacocinéticos de Praziquantel administrado por via oral na
forma livre e em nanopartículas de PMMA, f. 60
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ASC0-∞ - Área Sob a Curva do tempo 0 até o infinito
ASC0-t - Área Sob a Curva do tempo 0 até 24h
BPN - Branco do Plasma Normal
BPZ – Branco de Plasma Normal fortificado com Diazepam
C – Controle
CAD – gás de colisão
CCAL - Curva de Calibração
CE – energia de colisão
CEUA - Comissão de Ética no Uso de Animais
Cl – Clearance
CLAE-EM - Cromotografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrometria de Massa
Cmáx – Concentração Máxima
COPPE – Coordenação de Programas de Pós-Graduação em Engenharia
Cp – Concentração Plasmática
CQ - Controle de Qualidade
CQA - Controle de qualidade de Alta Concentração
CQB - Controle de Qualidade de Baixa Concentração
CQD - Controle de Qualidade de Diluição
CQLIQ - Controle de Qualidade do Limite Inferior de Quantificação
CQM – Controle de Qualidade de Média Concentração
CUR – gás de interface
CV - Coeficiente de Variação
CXP – potencial de saída
DP – potencial de desaglomeração
DPR - Desvio Padrão Relativo
DZP – Diazepam
E – Acurácia
EDGMA – Dimetacrilato de etilenoglicol
EMC - Endocitose mediada por Clatrina
EMCv - Endocitose Mediada por Caveolina
EP – potencial de entrada
EPR - Erro Padrão Relativo
ESI+
- eletronebulização positiva
FioCruz - Fundação Oswaldo cruz
Fr – Biodisponibilidade Relativa
g – Grama
GS1 – gás de nebulização
GS2 – gás secante
h – Hora
HPLC - High-Performance Liquid Chromatographic
INCQS – Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
Ke – Constante de Eliminação
Kg – Kilograma
L – Litro
LAB.SEFAR- Laboratório da Farmacocinética
m/z – razão massa/carga
µg – micrograma
min – minuto
mL – mililitro
mm – milímetro
MRM - Monitoramento de Reações Múltiplas
ms – milissegundos
NAL – Núcleo de Animais de Laboratório
ng – Nanograma
NP – nanopartícula
OMS - Organização Mundial de Saúde
PEG - Poli Etileno Glicol
PI – Padrão Interno
PK - Farmacocinética
PMMA - Poli Metil Metacrilato
PMMA-NP-PZQ - Nanopartícula de Poli (metil metaacrilado) contendo Praziquantel
PZQ - Praziquantel
PZQ-L - Praziquantel Livre
PZQ-NP - Praziquantel em Nanopartículas
r = Coeficiente de Correlação Linear
RDC – Resolução de Diretoria Colegiada
rpm – Rotação por Minuto
SI – Sistema Internacional
SME-DZP - Solução Mestre de Diazepam
SME-PZQ - Solução Mestre do Praziquantel
SRP - Solução Recém Preparadas
STB01-PZQ - Solução de Trabalho do Praziquantel
STBI - Solução de Trabalho do Padrão Interno
T – Temperatura
T ½ β – Tempo de meia-vida de eliminação
TBME - Metil - t- butil – éter
TEBCD - Teste de Estabilidade após Ciclos de Congelamento e Descongelamentos
TEBCP - Teste de Estabilidade Curta em Plasma
TEBCST - Teste de Estabilidade Curta de Soluções de Trabalho
TEBLDP - Teste de Estabilidade de Longa Duração em Plasma
TEBLST - Teste de Estabilidade Longa de Soluções de Trabalho
TEBPP - Teste de Estabilidade Pós- Processamento
Tmáx – Tempo para alcançar a Concentração Máxima
TQI - Teste de Quantificação Inicial
UFF – Universidade Federal Fluminense
UFRJ – Universidade Federal Fluminense
UI – Unidade Internacional
V – Voltz
Vd – Volume de distribuição
LISTA DE ANEXOS E APÊNDICES
ANEXO I: Certificado Padrão de Referência do Praziquantel – USP, p. 75
ANEXO II: Certificado Padrão de Referência do Diazepam – INCQS, p. 77
ANEXO III: Parecer consubstanciado do CEUA – UFF, p. 79
APÊNDICE I: Espectro de Massas do íon precursor do analito, p. 80
APÊNDICE II: Espectro de Massas do íon produto do analito, p. 81
APÊNDICE III: Espectro de Massas do íon precursor do padrão interno, p. 82
APÊNDICE IV: Espectro de Massas do íon precursor do padrão interno, p. 83
17
INTRODUÇÃO
A esquistossomose é uma doença parasitária que, de acordo com a Organização
Mundial de Saúde (OMS), é o principal problema de saúde pública associada com
mortalidade e morbidade severa (WHO, 2011). Estima-se que aproximadamente 240 milhões
de pessoas estejam afetadas por esta doença no mundo e mais de 700 milhões vivem em áreas
endêmicas (WHO, 2013). Nas áreas tropicais e subtropicais, a esquistossomose é a segunda
doença mais importante em termos sócio-econômicos, sendo superada apenas pela malária
(WHO, 2006). No Brasil, em 2011 foram confirmados 64.811 casos positivos dessa doença,
com 524 mortes (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2013).
A estratégia para o controle dessa doença visa prevenir a morbidade através de
tratamento regular com Praziquantel, que atualmente é o único medicamento recomendado
(WHO, 2013). Embora o exato mecanismo de ação do Praziquantel contra as larvas de
esquistossoma seja ainda desconhecido, sua eficácia é julgada pela cessação da excreção de
ovos do parasito pelas fezes e/ou urina (STOTHARD, SOUSA-FIGUEIREDO e
NAVARATNAM, 2013).
O Praziquantel é um fármaco de classe II, isto é, apresenta baixa solubilidade aquosa e
alta permeabilidade pelas membranas do trato gastrointestinal. Esses fatores são fundamentais
no processo de absorção e, consequentemente, na biodisponibilidade do fármaco
(LINDENBERG et al., 2004). No entanto, apesar de apresentar boa absorção sofre rápido
efeito de primeira passagem, o que diminui sua biodisponibilidade. Esse fato tem sido
apontado como a causa das falhas no tratamento da esquistossomose (MOURÃO et al., 2005).
Muitos esforços têm sido feitos para contornar esta questão, por exemplo, a
administração concomitante com cimetidina ou alimento (para aumentar os níveis plasmáticos
do fármaco), uso de adjuntantes como β-ciclodextrinas e polivinilpirrolidinas (para aumento
da taxa de dissolução) e o uso de lipossomas (para aumentar a efetividade do medicamento)
(YANG et al., 2009).
No Brasil, o Praziquantel é comercializado apenas sob a forma de comprimido e não
existe formulação pediátrica, apesar de muitas crianças se infectarem por Schistosoma
mansoni, Schistosoma haematobium e Schistosoma japonicum, principais espécies
18
responsáveis por infecções em humanos (BARRY et al., 2013). Dessa forma, o tratamento
dessa população é especialmente complicado, devido tanto a dificuldade de adequação da
dose (a dose recomendada é de 40 mg/kg) com a não adesão à terapia pelo sabor
extremamente amargo do fármaco, que se torna mais evidente quando o comprimido é
macerado (FONSECA et al., 2013b). O desenvolvimento de outras formas farmacêuticas
contendo Praziquantel como princípio ativo é difícil devido a hidrofobicidade do fármaco.
Uma alternativa promissora para o desenvolvimento de fármacos com baixa
hidrossolubilidade é a preparação em nanopartículas poliméricas (FONSECA et al., 2013b).
Por apresentarem estabilidade coloidal, resistência química e serem de fácil produção, as
nanopartículas têm ocupado posição de destaque entre os sistemas de liberação de fármacos
atualmente disponíveis (LANDFESTER, MUSYANOVYCH e MAILANDER, 2010).
Além do potencial incremento das propriedades de dissolução de fármacos
hidrofóbicos, as nanopartículas aumentam a biodisponibilidade, melhoram a
proporcionalidade de doses, reduzem a variabilidade em indivíduos alimentados ou em jejum,
reduzem a variabilidade inter-pacientes, melhoram a taxa de absorção e permitem o
mascaramento do sabor (FONSECA et al., 2013a; MÜLLER, JACOBS e KAYSER, 2001).
Neste sentido, nanopartículas poliméricas de poli (metil metacrilato) contendo
Praziquantel (PMMA-PZQ-NP) foram sintetizadas pelo grupo de pesquisa do Laboratório de
Engenharia de Polimerização da COPPE/UFRJ, utilizando a técnica de polimerização por
miniemulsão em etapa única (in situ). A miniemulsão foi preparada pela mistura da fase
orgânica composta por monômero, óleo mineral, Praziquantel e agente reticulante
dimetacrilato de etilenoglicol (EGDMA) e uma fase aquosa composta por água, lauril sulfato
de sódio e bicarbonato de sódio. As fases foram misturadas utilizando homogeneizador de alta
pressão, com temperatura de reação de 90°C. As nanopartículas sintetizadas apresentaram
diâmetro médio de 98,7 nm e teor de Praziquantel em torno de 10 % em relação a massa do
polímero (100 mg de PZQ/ g de NP), com perfil de liberação in vitro do fármaco de 85 % em
15 min (FONSECA et al., 2013b).
A avaliação da farmacocinética em modelos animais dessa forma farmacêutica se
insere no desenvolvimento pré-clínico de medicamentos (PANCHAGNULA e THOMAS,
2000) e é importante na decisão de continuidade do desenvolvimento, tanto de novos
19
fármacos, como de novas formulações (MASIMIREMBWA, BREDBERG e ANDERSSON,
2003; TANG, LU, 2009). A farmacocinética tem validade preditiva na construção de regimes
posológicos para estudos clínicos e possui estreita relação com a farmacodinâmica e com a
toxicodinâmica (ASSUMPÇÃO, 2011).
Assim, o presente estudo visa a avaliação do perfil farmacocinético de PMMA-PZQ-
NP em ratos, utilizando Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrometria
de Massas (CLAE-EM/EM).
20
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1. ESQUISTOSSOMOSE
A esquistossomose é uma das doenças tropicais mais importantes com milhões de
pessoas infectadas ou em risco de infecção ao redor do mundo (WHO, 2013). É uma infecção
parasitária fluvial que dá origem a uma resposta inflamatória crônica, tipificada por lesões
imunopatológicas ao redor dos ovos do parasita presos dentro do tecido do hospedeiro
(STOTHARD, SOUSA-FIGUEIREDO e NAVARATNAM, 2013). É a mais importante
infecção helmíntica em termos de mortalidade e morbidade no mundo (KING, 2010).
A esquistossomose é causada por trematódeos digenéticos no sangue. As três
principais espécies que infectam os seres humanos são Schistosoma haematobium, S.
japonicum e S. mansoni (BARRY et al., 2013; FRIEDMAN et al., 2007). Além disso, outras
espécies de esquistossomas, que parasitam as aves e os mamíferos, podem causar dermatite
cercariana em seres humanos (COLLEY et al., 2014).
Há uma interdependência (como parte do ciclo de vida do parasita) com caramujos
aquáticos e condições específicas de baixo saneamento básico e condições de tratamento da
água (STOTHARD, SOUSA-FIGUEIREDO e NAVARATNAM, 2013).
Os ovos dos parasitas são eliminados com as fezes ou urina. Sob condições ideais, os
ovos eclodem e ocorre a liberação de miracídios, que nadam e penetram nos caramujos
hospedeiros intermediários específicos. Os estágios no caramujo incluem duas gerações de
esporocistos e a produção de cercárias. Após a liberação do caracol, a cercária infecciosa
penetra na pele do hospedeiro humano, perdendo a sua cauda bifurcada, tornando-se
esquistossômulos. Na circulação sanguínea, os esquistossômulos migram por vários tecidos e
estágios. Vermes adultos nos seres humanos residem nas vênulas mesentéricas em diversos
locais, que parecem ser específicas para cada espécie (COLLEY et al., 2014).
Fêmeas dos vermes adultos de S. japonicum e S. mansoni são encontrados nas veias
mesentéricas, gerando inflamação granulomatosa e fibrose em resposta aos ovos depositados
e aprisionados nos sinusóides hepáticos, resultando em doença hepatoesplênica, febre de
Katayama, granulomas hepáticos perisinusoidais e hipertensão portal. Além disso, os ovos
21
danificam a submucosa intestinal durante sua migração através da parede intestinal para ser
eliminado nas fezes (COLLEY et al., 2014; FRIEDMAN et al., 2007).
Schistosoma haematobium reside no plexo venoso que rodeia o trato urinário. A
doença é causada pela inflamação crônica e cicatrizes da bexiga e do trato urogenital, uma vez
que os ovos não atravessam a bexiga para serem eliminados na urina (FRIEDMAN et al.,
2007). Schistosoma haematobium também pode ser encontrada nas vênulas retais e sua
doença também inclui hematúria, calcificação e carcinoma de células escamosas. Além disso,
ocasionais granulomas ovo-embólicos no cérebro ou na medula espinhal podem ocorrer pela
infecção das três espécies de Schistosoma: S. mansoni, S. haematobium e S.japonicum
(COLLEY et al., 2014).
Esquistossomose crônica reduz a capacidade de trabalhar e, em alguns casos, resulta
em morte. Em crianças, causa anemia, nanismo e redução da capacidade de aprendizado
(WHO, 2013). Há evidência que a infecção na infância aumenta a morbidade da doença
(BARRY et al., 2013).
Crianças e adolescentes estão sendo cada vez mais reconhecidos como importantes
fatores na transmissão ambiental, pois estas populações infectadas liberam grande número de
ovos do parasita e têm frequentemente contato com fontes de água não tratada (durante o
banho e recreação, por exemplo) (BARRY et al., 2013).
2.1.1. Tratamento
Atualmente, o tratamento de humanos infectados com esquistossoma é primariamente
focado na quimioterapia com praziquantel (PQZ) (QI e CUI, 2013). PQZ é o principal
fármaco disponível para o tratamento de pacientes individuais e particularmente para o
controle da morbidade da esquistossomose de uma população, devido ao seu amplo espectro
de atividade, perfil de segurança, facilidade de administração e custo (QI e CUI, 2013; WHO,
2011; UTZINGER et al., 2011).
Outros fármacos anti-esquistossômicos, Metrifonato e Oxamniquine, são
caracterizados por deficiências no perfil terapêutico. Metrifonato é ativo apenas contra S.
haematobium enquanto Oxamniquine mostra atividade apenas contra S. manoni (UTZINGER
22
et al., 2011; CIOLI e PICA-MATTOCCIA, 2003). Adicionalmente, esses medicamentos não
têm sido usados contra esquistossomose e tem se tornado de difícil obtenção (UTZINGER et
al., 2011), o que torna o Praziquantel efetivamente o fármaco de escolha para o tratamento
dessa doença. PZQ também é indicado para o tratamento de teníase, cisticercose e infecções
por Diphyllobothrium spp e Hymenolepis nana e faz parte da lista de fármacos essenciais da
OMS (WHO, 2006).
No Brasil, para uso em humanos, Praziquantel é comercializado apenas sob a forma de
comprimidos de 150, 500 e 600 mg. Sua posologia é feita de acordo com a massa corporal do
paciente (ANVISA, 2015).
2.2. PRAZIQUANTEL
Praziquantel é o nome genérico para (±)-2ciclo-hexilcarbonil-1,2,3,6,7,11b-hexa-
hidro-4H-pirazino[2,1-a]isoquinolin-4-ona (THE MERCK INDEX, 2001) (figura 1).
O composto é estável em condições normais de armazenamento e é comercializado
como mistura racêmica (1:1 na mistura de enântiomeros), mas apenas o R-(-)-enantiômero
apresenta atividade antiesquistossomicida (DOENHOFF, CIOLI e UTZINGER, 2008) e
ambos os isômeros têm toxicidade (UTZINGER et al., 2011).O Praziquantel apresenta-se
como pó branco ou praticamente branco, cristalino, fotossensível, higroscópico, de sabor
amargo, inodoro ou com leve odor. É praticamente insolúvel em água, mas bastante solúvel
álcool e outros solventes orgânicos (THE MERCK INDEX, 2001).
Figura 1: Fórmula estrutural do Praziquantel.
23
2.2.1. Farmacodinâmica
O exato mecanismo de ação do Praziquantel ainda não foi determinado. Há evidência
experimental de que PZQ aumenta a permeabilidade das membranas do parasita ao íon cálcio,
unindo-se aos locais de ligação reconhecidos da proteína quinase C, em uma subunidade β
dos canais de Ca2+
controlados por voltagem do esquistossomo. Portanto, o fármaco induz a
contração do parasita resultando em paralisia no estado contraído. Os parasitos mortos são
desalojados do seu local de ação no organismo hospedeiro e entram na circulação sistêmica
ou são destruídos pelo sistema imune do hospedeiro (por fagocitose), uma vez que um dos
efeitos do PQZ é aumentar a exposição de antígenos na superfície da larva, o que torna o
parasita mais suscetível ao ataque por anticorpos (DOENHOFF, CIOLI e UTZINGER, 2008;
ALI, 2006).
Por ser um fármaco de baixa toxicidade, é considerado seguro e os efeitos adversos
são mínimos. Quando ocorrem, os efeitos indesejáveis são leves, transitórios e de rara
importância clínica. Os efeitos indiretos, como febre, prurido, urticária, erupções, artralgia e
mialgia são encontrados ocasionalmente e estão relacionados com a carga parasitária (RIDI e
TALLIMA, 2013).
Para o tratamento da esquistossomose, a dose recomendada é de 40-60 mg/Kg de peso
corporal em dose única, ou 3 doses de 20 mg/Kg em intervalo de 8h por um dia
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2005).
Em áreas endêmicas, as intervenções são voltadas para a administração em massa de
uma única dose de Praziquantel (PZQ) de 40 mg/kg de peso, de acordo com as
recomendações internacionais para a quimioterapia preventiva (STOTHARD, SOUSA-
FIGUEIREDO e NAVARATNAM, 2013).
O Praziquantel não foi formalmente testado em gestantes e lactantes e é, portanto,
classificado como Categoria B, ou seja, é um fármaco presumidamente seguro, baseado em
estudos em animais (CIOLI e PICA-MATTOCCIA, 2003). O risco benefício deve ser
avaliado para administração neste grupo de pacientes.
24
2.2.2. Farmacocinética
Praziquantel administrado oralmente é absorvido pelo trato gastrointestinal, com nível
sanguíneo mensurável após 15 min (CIOLI e PICA-MATTOCCIA, 2003). A farmacocinética
do PZQ é dependente da dose e seu pico plasmático é alcançado 1 a 2 horas após sua
administração em voluntários normais. ((RIDI e TALLIMA, 2013, ALI, 2006). A
concentração plasmática após uma dose padrão de 40 mg/Kg mostra ampla variação inter-
indivíduo em uma taxa de 200–2.000 ng/ml (CIOLI e PICA-MATTOCCIA, 2003).
É amplamente distribuído pelo organismo e atravessa a parede do trato gastrointestinal
e a membrana hemato-encefálica, alcançando o Sistema Nervoso Central. Seu volume de
distribuição não foi determinado (ALI, 2006). A porcentagem de ligação à proteínas
plasmáticas é de 80% (CIOLI e PICA-MATTOCCIA, 2003).
O Praziquantel sofre intenso efeito de primeira passagem pelo fígado, com formação
de muitos derivados hidroxilados e conjugados inativos, diminuindo sua biodisponibilidade, o
que resulta em concentrações plasmáticas desses metabólitos no mínimo 100 vezes maiores
que a do PZQ (ALI, 2006).
É estereoseletivamente biotransformado no fígado pelas enzimas do citocromo P40,
particularmente pelas isoformas 2B1 e 3A (ALI, 2006; CIOLI e PICA-MATTOCCIA, 2003).
Os principais metabóltitos são os compostos cis e trans-4-hidroxilpraziquantel. Outros
metabólitos foram identificados e isolados, mas as estruturas permanecem desconhecidas
(ALI, 2006).
A biodisponibilidade do Praziquantel é aumentada pela administração simultânea de
substâncias que inibem a atividade do citocromo P450 (CIOLI e PICA-MATTOCCIA, 2003).
Por exemplo, cimetidina aumenta a biodisponibilidade do PQZ e pode ser associada ao
tratamento de neurocisticercose, em que altas concentrações do PZQ são requeridas (CIOLI e
PICA-MATTOCCIA, 2003; JUNG et al., 1997).
Sua meia-vida plasmática é de 0,8-3 h, em comparação com as 4-6 h dos seus
metabólitos. Em torno de 70% da dose oral de PZQ pode ser recuperada na forma de seus
metabólitos na urina durante as primeiras 24 h (CIOLI e PICA-MATTOCCIA, 2003). Em
humanos, metabólitos são completamente eliminados em aproximadamente 4 dias após a
25
ingestão por via oral (ALI, 2006). Tanto PQZ quanto seus metabólitos são excretados no leite
(CIOLI e PICA-MATTOCCIA, 2003).
O Praziquantel é classificado pelo Sistema de Classificação Biofarmacêutica como um
fármaco Classe II, ou seja, possui baixa solubilidade aquosa e alta absorção no trato
gastrointestinal (YANG et al., 2009). Essa hidrofobicidade dificulta o desenvolvimento de
formulações farmacêuticas diferentes de comprimido (ZHANG, et al., 2011; MULLER,
JACOBS e KAYSER, 2001).
Diversos fatores têm sido apontados como responsáveis pela falha do tratamento da
esquistossomose. Entre eles: a baixa biodisponibilidade do PZQ (devido a sua baixa
hidrossolubilidade e extensa conversão em compostos inativos ou menos potentes após
absorção oral), seu sabor extremamente amargo (que provoca a não adesão de crianças ao
tratamento) e a inexistência de formulações que permitam a administração da dose correta
para eliminação do parasito (como as soluções ou suspensões) (FONSECA et al., 2013a;
YANG et al., 2009; XIE et al., 2011).
Nesse sentido, novas estratégias têm sido desenvolvidas, como comprimidos de
liberação sustentada (CHOI et al., 2006), formulações lipossomais (FREZZA et al., 2013),
complexação com ciclodextrinas (MARAGOS et. al., 2009), entre outras (SOUZA et al.,
2012; XIE et al., 2011; YANG et al., 2009). No entanto, sistemas nanoparticulados tem se
destacado como excelente alternativa (FONSECA et al., 2013b; DAS e CHAUDHURY,
2011).
2.3. NANOTECNOLOGIA E NANOPARTÍCULAS
O prefixo “nano” vem do Grego antigo νάνος, que em Latim significa “anão”. Com a
convenção do Sistema Internacional (SI), esse termo é usado para indicar um fator de redução
de 109 vezes (RANJIT e BAQUEE, 2013).
Nanotecnologia envolve o desenho, desenvolvimento, caracterização e aplicação de
materiais em nanoescala (10-9
m) e tem sido extensivamente estudada para aplicação na área
médica (CHEN et al., 2013; UKAN, 2012; LANDFESTER, MUSYANVYCH e
MAILANDER, 2010; ZHANG et al., 2010). Engloba a compreensão e o controle de materiais
26
em escala manométrica que apresentam propriedades físico-químicas únicas, incluindo
tamanho ultra pequeno, alta superfície de contato em relação a massa, alta reatividade e
interações únicas com sistemas biológicos (ZHANG, et al., 2011; ZHANG et al., 2010).
Para aplicação na área farmacêutica, a grande área de superfície de sistemas em escala
nanométrica pode permitir a liberação do fármaco de forma mais rápida e, portanto, menor
tempo é necessário para alcançar concentração elevada no sítio de absorção (ZHANG et al.,
2011). Este efeito é mais proeminente para substâncias com baixa solubilidade aquosa, como
os fármacos categorizados como Classe II e IV pelo Sistema de Classificação
Biofarmacêutica (ZHANG, et al., 2011; LINDENBERG et al., 2004).
Muitas vantagens baseadas nesses sistemas de liberação são reconhecidas, incluindo a
melhoria da solubilidade plasmática do fármaco, prolongando o tempo de circulação
sistêmica; liberação do fármaco de maneira sustentada e controlada, além da possibilidade de
conter múltiplos fármacos, facilitando a terapia combinada e proteção de moléculas que são
degradadas bioquimicamente no organismo, como proteínas e ácidos nucleicos e o
mascaramento do sabor (CHEN et al., 2013; ZHANG et al., 2010).
Assim, ao inserir fármacos em nanosistemas (através de encapsulação física, adsorção
ou por conjugação química), a farmacocinética e o índice terapêutico do fármaco podem ser
melhorados significativamente, em comparação com os sistemas de liberação convencionais
(ZHANG et al., 2010). No entanto, a utilização dessa tecnologia pode provocar efeitos
adversos severos, como citotoxicidade e autoimunidade. Esses efeitos necessitam ser
reduzidos até que fármacos nanoparticulados sejam seguros para a utilização clínica (CHEN
et al., 2013).
2.3.1 Nanopartículas Poliméricas
Nanopartícula polimérica é um termo geral para qualquer polímero nanoparticulado.
São partículas sólidas, coloidais, com tamanho inferior a 1000 nm, composta por materiais
naturais, como proteínas e polissacarídeos ou por polímeros sintéticos ou semi-sintéticos
(RANJIT e BAQUEE, 2013; RAO e GECKELER, 2011). O fármaco pode ser dissolvido,
27
aprisionado, encapsulado, ou ligado a uma matriz (RANJIT e BAQUEE, 2013;
MAHAPATRO e SINGH, 2011; ZHANG et al., 2010).
Dependendo do método de preparação, as nanopartículas podem ser classificadas
como nanoesferas ou nanocápsulas (RANJIT e BAQUEE, 2013; ZHANG et al., 2010).
Nanoesferas são sistemas matriciais em que o fármaco é fisicamente e uniformemente
dispersado, enquanto nanocápsulas são sistemas em que o fármaco é envolvido por uma única
membrana polimérica (RANJIT e BAQUEE, 2013; RAO e GECKELER, 2011).
A natureza das nanopartículas pode apresentar desafios significantes no processo de
desenvolvimento da formulação (ZHANG et al., 2011). A seleção da matriz inerte do
material depende de vários fatores, entre eles: tamanho final da nanopartícula, solubilidade e
estabilidade do fármaco, carga superficial, permeabilidade, biocompatibilidade, toxicidade,
perfil de liberação do fármaco desejado e grau de biodegradabilidade (RANJIT e BAQUEE,
2013; MAHAPATRO e SINGH, 2011).
Polímeros como Poli Etileno Glicol, Poli Vinil Pirrolidona, Ácido poli láctico-co-
glicólico, Poliestireno, Policaprolactona, Ácido Poli Lático e Poli (metil metacrilato)
(PMMA) são polímeros sintéticos comumente utilizados na produção de nanopartículas
(FONSECA et al., 2013a; MAHAPATRO e SINGH, 2011; RAO e GECKELER, 2011).
Vale ressaltar que polímeros que sejam simultaneamente biocompatíveis e
biodegradáveis são desejáveis, a fim de diminuir o impacto da matriz no organismo (BOEGH
et al., 2013).
Por apresentar biocompatibilidade bastante conhecida, o polímero Poli (metil
metacrilato) tem sido frequentemente utilizado no desenvolvimento de sistemas para
aplicação farmacêutica e biomédica (FONSECA et al., 2013a). Apresenta ainda boa
estabilidade dimensional, resistência a fatores externos e adequada performance vítrea (CHEN
et. al., 2010).
28
2.4. CINÉTICA DAS NANOPARTÍCULAS IN VIVO
2.4.1. Absorção
Como sistemas de liberação de fármacos, nanopartículas têm sido desenvolvidas e
estudadas para uma variedade de vias de administração, incluindo via oral, intravenosa,
transdérmica, ocular e pulmonar (ZHANG et al., 2011).
A via oral é a preferida, pois é indolor, tem boa aceitação, permite facilmente a auto-
administração e apresenta baixo custo de produção (BOEGH et al., 2013; PLAPIED et al.,
2011; McCONNELL, FADDA e BASIT, 2008).
A camada de muco que recobre o epitélio do trato gastrointestinal é a primeira barreira
para a absorção de fármacos (e dos sistemas de liberação de fármacos) (BOEGH et al., 2013;
PLAPIED et al., 2011; McCONNELL, FADDA e BASIT, 2008). O muco contém
aproximadamente 95% (p/p) de água, 2-5% (p/v) de mucina e uma pequena quantidade de
proteínas, lipídeos, DNA e eletrólitos. Sua função é lubrificar e proteger o tecido subjacente
(BOEGH et al., 2013). É, portanto, um importante mecanismo de remoção de nanopartículas
do TGI (PLAPIED et al., 2011).
Diversos estudos mostraram que a mucoadesão de nanopartículas pode aumentar o
tempo de permanência do nanosistema no intestino, consequentemente aumenta as interações
com as células epiteliais, aumentando sua absorção (BOEGH et al., 2013; REINEKE et al.,
2013; PLAPIED et al., 2011). Nesse sentido, uma estratégia para aumentar a absorção (e a
biodisponibilidade) de fármacos contidos em nanopartículas é a utilização de polímeros
bioadesivos como matriz (REINEKE et al., 2013).
Apesar da mucoadesão aumentar o tempo de residência no intestino, a difusão de
nanopartículas através do muco é fundamental. Logo, informações quantitativas e qualitativas
da taxa de difusão, viscoelasticidade, velocidade, direção e transporte de nanopartículas no
muco devem ser rigorosamente estudados (PLAPIED et al., 2011).
É importante destacar que um equilíbrio entre a mucoadesão e muco penetração é
crucial para um sistema de liberação de fármaco eficiente. Nanopartículas devem ter tamanho
29
suficiente para evitar inibição estérica pelas fibras de mucina, ao mesmo tempo em que devem
ser mucoadesivas para aumentar o tempo de retenção e o contato com a mucosa intestinal
(PLAPIED et al., 2011).
Uma vez atravessada a camada de muco, outra importante barreira é o epitélio do TGI,
através do qual o composto pode permear por diferentes mecanismos (BOEGH et al., 2013).
A absorção através do epitélio intestinal pode envolver tanto a via paracelular como rotas
transcelulares. No entanto, a via paracelular é limitada porque utiliza menos que 1% da área
superficial da mucosa. Além disso, complexos juncionais (junções aderentes ou de oclusão)
restringem ou bloqueiam a passagem de moléculas ou partículas maiores que 1 nm. Portanto,
admite-se que nanocarreadores poliméricos não são absorvidos por essa via (BOEGH et al.,
2013; PLAPIED et al., 2011).
A internalização de nanopartículas no epitélio intestinal ocorre principalmente através
da endocitose (via transcelular) mediada principalmente por células M ou enterócitos
(BOEGH et al., 2013). No entanto, o exato mecanismo de internalização celular depende de
parâmetros celulares específicos, como tipo celular e fase do ciclo celular e das propriedades
da nanopartícula, como tamanho, forma, porosidade, composição da matriz inerte, da
funcionalidade do revestimento e da carga superficial (DING e MA, 2014; SHANG et al.,
2014; KETTINGER et al., 2013).
Diversos outros fatores da fisiologia do TGI podem influenciar a absorção de
nanopartículas, como volume e composição do fluído, pH, trânsito e tempo de esvaziamento
intestinal e microflora (BOEGH et al., 2013; McCONNELL, FADDA e BASIT, 2008).
2.4.1.1. Internalização celular de nanopartículas
A maioria dos nanomateriais são ativamente incorporados na célula via diferentes
mecanismos de endocitose, compreendendo tanto a fagocitose como a pinocitose. A
pinocitose pode ainda ser dividida em endocitose mediada por Clatrina (EMC), endocitose
mediada por Caveolina (EMCv), macropinocitose e por mecanismos que não envolvem
Clatrina ou Caveolina (SHANG et al., 2014; DING e MA, 2014; KETTINGER et al., 2013;
30
SHANN et al., 2012). O transporte vesicular resultante difere em relação ao tamanho,
composição e destino do material engolfado (KETTINGER et al., 2013).
Fagocitose ocorre predominantemente por células especializadas do sistema imune
(macrófagos, monócitos, neutrófilos e células dendríticas) para remover partículas maiores
que 500 nm do organismo, principalmente por processos mediados por receptores do sistema
complemento, da superfamília das imunoglobulinas e de receptores de manose/fucose
(KETTINGER et al., 2013).
Pinocitose ocorre em quase todos os tipos celulares para uma ampla variedade de
tamanho de nanopartículas (SHANG et al., 2014; KETTINGER et al., 2013). Os grupos
funcionais na superfície das nanopartículas interagem com os receptores de superfície celular
e ativa o mecanismo de captação. Dependendo dos detalhes da interação, proteínas adsorvidas
nas nanopartículas podem aumentar ou diminuir sua internalização (BRUN e SICARD, 2014;
SHANG et al., 2014).
Nanopartículas de 120-150 nm são internalizadas via endociotose mediada por
Clatrina, sendo 200 nm o maior tamanho para captação de partículas por essa via. A
endocitose mediada por Caveolina ocorre principalmente na porção basolateral das células
endoteliais, sendo uma importante rota para internalização de nanomateriais, principalmente
com tamanho entre 20 – 40 nm (DING e MA, 2014; KETTINGER et al., 2013; SHANN et
al., 2012).
A macropinocitose contribui para a internalização de uma grande quantidade de
nanomateriais, embora de maneira inespecífica e em conjunto com outras vias. A grande
capacidade de captação por essa via é muito alta, sugerindo uma possibilidade para sistemas
de liberação farmacêutica (KETTINGER et al., 2013).
Vias alternativas, independente de Clatrina ou Caveolina, têm sido descritas para vias
dependentes de regulação por proteínas específicas como membros da família RAS
(KETTINGER et al., 2013).
Existe ainda algumas outras vias, em que pequenas partículas ou moléculas atravessam
a membrana celular passivamente, através de canais proteicos. No entanto, não é uma via
comum de captação de nanopartículas quando comparado com a endocitose (DING e MA,
2014).
31
A interação de nanosistemas com as células é bastante complexa e depende tanto do
conjunto das propriedades físico-químicas das nanopartículas como dos constituintes dos
fluidos biológicos. Além isso, resultados obtidos para um tipo celular não podem ser
extrapolados para outro, uma vez que linhagens celulares diferentes podem interagir
diferentemente com nanopartículas idênticas (KETTINGER et al., 2013). Assim, permanece
um desafio predizer o exato mecanismo de captação celular de uma nanopartícula específica.
2.4.1.2. Destino intracelular e escape do endossoma
A via da endocitose é composta por vesículas conhecidas como endossomas, que
apresentam pH interno em torno de 5. No citosol, essas vesículas são gradativamente
acidificadas, formando endossomas maduros. Estes se fundem às organelas celulares
chamadas lisossomas que contêm proteases, hidrolases e outras enzimas digestivas, resultando
na degradação do conteúdo internalizado. Assim, nanopartículas internalizadas por essa via
precisam escapar do endossoma para realizar sua função (DING e MA, 2014; KETTINGER
et al., 2013, VARKOUTHI et al., 2011).
Uma vez que o escape lisossomal pode ser induzido ativamente, diversos mecanismos
para a liberação de nanopartículas têm sido descritos, como abertura de poros na membrana
da vesícula do endo/lisossoma, seu rompimento por indução de inchaço osmótico (fenômeno
conhecido com “efeito próton-esponja”) ou através de reação fotoquímica (DING e MA,
2014; KETTINGER et al., 2013, VARKOUTHI et al., 2011).
O efeito próton esponja é mediado por agentes com alta capacidade de tamponação e
flexibilidade para inchar quando protonados. A protonação induz a um extenso influxo de
íons e água para dentro do endo/lisossoma (inchaço osmótico) que consequentemente resulta
no rompimento da membrana da vesícula, liberando os componentes aprisionados
(KETTINGER et al., 2013; VARKOUTHI et al., 2011). Grupos aminas contendo cadeias
hidrofílicas são exemplos de revestimentos para esse fim (VARKOUTHI et al., 2011).
Alternativamente, o rompimento fotoquímico tem sido apontado como estratégia de
escape lisossomal, pois peptídeos fossensibilizadores estão localizados na membrana dos
endo/lisossomas e a incidência de luz sobre eles pode desencadear a formação de espécies
32
reativas de oxigênio, resultando na destruição da bicamada lipídica da membrana do
endo/lisossoma (VARKOUTHI et al., 2011).
No citosol, nanopartículas também podem induzir a produção de espécies reativas de
oxigêniio e provocar estresse oxidativo em organelas e no núcleo, um potencial fator para
toxicidade de nanosistemas (KETTINGER et al., 2013).
2.4.2. Distribuição
Uma vez difundidas no citosol, nanopartículas podem ser descarregadas no espaço
serosal para ganhar acesso ao sistema linfático mesentérico ou ao sangue (PLAPIED et al.,
2011).
Na corrente sanguínea, nanopartículas são submetidas a interações que podem afetar
sua performance, tais como digestão enzimática, estresse mecânico devido ao rápido fluxo de
sangue, corrosão e ligações a biomoléculas. A interação com biomoléculas, como proteínas,
pode ocorrer em larga escala, devido a sua enorme área superficial (BRUN e SICARD, 2014).
A adsorção de proteínas plasmáticas na superfície dos nanosistemas é de particular
importância, pois além de determinar a identidade biológica das nanopartículas (e
consequentemente o modo como irão interagir com as células), as tornam mais visíveis às
células do sistema fagocitário – fenômeno conhecido como opsonização (DING e MA, 2014;
SHANG et al., 2014; KETTINGER et al., 2013). Além disso, pode influenciar no processo
de inflamação, acumulação, degradação e clearance das nanopartículas (SAPTARSHI,
DUSCHL e LOPATA, 2013).
No entanto, a composição da proteína adsorvida não é constante, ocorrendo contínua
associação e dissociação de diferentes proteínas com o decorrer do tempo. São as
propriedades superficiais das nanopartículas que determinam a composição da proteína
adsorvida (KETTINGER et al., 2013; SAPTARSHI, DUSCHL e LOPATA, 2013).
Entre as diversas propriedades físico-químicas das nanopartículas que influenciam na
absorção e distribuição, a dimensão pode ser um dos fatores mais importantes, pois são
33
distribuídas através da corrente sanguínea e extravasam desse sistema de transporte de acordo
com o seu tamanho (LEE et al., 2014b; SHANG et al., 2014).
Esse mecanismo é restrito a tecidos específicos de acordo com a presença de
fenestrações nos vasos sanguíneos. Vale destacar que essas fenestrações variam de órgão a
órgão e podem ter diferentes dimensões em diferentes espécies, além de serem alterados por
determinadas doenças (KETTINGER et al., 2013).
Nanopartículas têm sido encontradas no fígado, medula óssea, baço, rim, sistema
linfático, pulmão, coração, cérebro, músculo e trato gastrointestinal (LEE et al., 2014b ;
SHANG et al., 2014; SHINDE et al., 2012). A distribuição para esses órgãos é seguida de
uma rápida depuração do sistema circulatório, predominantemente por ação dos macrófagos
hepáticos e esplênicos (SHINDE et al., 2012).
A grande presença de nanomateriais geralmente encontradas no fígado pode ser
devido às células endoteliais sinusoidais e células de Kupffer, que são as principais
responsáveis pela retirada de corpos estranhos da circulação (LEE et al., 2014b; SHANG et
al., 2014). Adicionalmente, alguns sistemas nanoparticulados podem ser acumulados no
fígado durante o metabolismo de primeira passagem (SHINDE et al., 2012).
Nanopartículas podem atravessar tanto a membrana hemato-encefálica como a
membrana placentária, podendo afetar o desenvolvimento do feto e até causar sua morte
(SHINDE et al., 2012).
2.4.3. Biotransformação e Eliminação
Nanopartículas podem ser biotransformadas através de múltiplos processos como
erosão, desaglomeração, desintegração ou degradação química da partícula. A via de
biotransformação e consequentemente de eliminação, no entanto, depende da reatividade
química e da composição do nanomaterial (KETTINGER et al., 2013).
Por exemplo, nanopartículas de sílica porosa são degradadas gerando ácido sílico que
são eliminados nas fezes e na urina; óxidos metálicos são biotransformados por
34
metalotioneínas abundantemente expressas nos rins e fígado, favorecendo o processo de
excreção; nanopartículas poliméricas podem ser degradadas por hidrólise ou digestão
enzimática, enquanto materiais com pobre solubilidade podem permanecer no organismo por
várias semanas ou meses, o que aumenta o risco de toxicidade (KETTINGER et al., 2013;
CHEN, ZHANG e GU, 2012; PARK et al.; 2009; AKAGI et al., 2006).
As principais vias de eliminação de nanopartículas são urinária e fecal, mas estudos
demonstraram que também pode ocorrer através do trato biliar (LEE et al., 2014a; FU et al.,
2013; EMOND, 2011).
O tamanho do nanossistema parece exercer importante papel na via e velocidade de
eliminação. Por exemplo, nanopartículas de 20 nm são secretadas mais rapidamente quando
comparadas com as mesmas nanopartículas com 100 nm, possivelmente por serem mais
facilmente decompostas (LEE et al., 2014a).
No entanto, após múltiplas administrações, nanopartículas podem acumular nas
células do Sistema Mononuclear Fagocitário e causar danos severos. Logo, considerando a
aplicação de nanopartículas como sistemas de liberação de fármacos, sua via de
biodegradação e excreção devem ser muito bem conhecidas (KETTINGER et al., 2013).
2. 5. TOXICIDADE DE NANOPARTÍCULAS
A interação de nanomateriais com sistemas biológicos pode provocar efeitos adversos
severos, incluindo morte celular (KETTINGER et al., 2013; SHINDE et al., 2012).
O principal mecanismo de toxicidade induzida por nanopartículas envolve a produção
de espécies reativas de oxigênio e radicais livres, resultando em estresse oxidativo e
consequente dano para proteínas, membranas e DNA (SHINDE et al., 2012). Hemólise,
agregação trombocítica, ativação do sistema complemento e embolismo potencialmente fatal
pela aglomeração de nanopartículas também têm sido descritos (KETTINGER et al., 2013).
Assim, durante o desenvolvimento de sistemas de liberação de fármacos, é importante
conhecer como essas partículas se comportam no organismo, afim de desenhar modelos que
sejam eficazes e seguros (LEE et al., 2014b; SHINDE et al., 2012).
35
2.6. FARMACOCINÉTICA PRÉ-CLÍNICA
Farmacocinética (PK) é definida como a relação da evolução temporal da
concentração de um fármaco, e seus metabólitos ativos, obtidos em diferentes regiões do
organismo após a administração de uma dose (TOZER e ROWLAND, 2009). Sua avaliação
envolve princípios fundamentais de cinética química, fisiologia e biologia (HOFFMAN,
2011).
O conhecimento da farmacocinética é essencial para o desenvolvimento de fármacos,
pois permite a compreensão da toxicidade, da farmacologia e a construção de regime
apropriado de doses nos cruciais estudos clínicos de fase III (SINGH, 2006).
Um candidato viável deveria ser absorvido, permanecer na corrente sanguínea e ser
eliminado sem produzir efeitos adversos (SINGH, 2006). No entanto, propriedades
farmacocinéticas inadequadas são frequentemente observadas. Essa é a principal razão para o
fracasso no desenvolvimento de medicamentos, sendo responsável por 40% das falhas dos
compostos/formulações em estudos de Fase Clínica 1 (PANCHAGNULA e THOMAS,
2000).
As agências regulatórias exigem informações detalhadas sobre a farmacocinética e
metabolismo do fármaco (ANVISA, 2006; LIN e LU, 1997). Apesar do grande avanço da
tecnologia, que permite sofisticados estudos por meio de softwares, com boa aproximação de
resultados in vivo, estudos em animais são necessários, uma vez que compostos com alta
atividade in vitro podem ser inativos ou tóxicos in vivo (HOFFMAN, 2011; LIN e LU, 1997).
Além disso, proporciona uma indicação precoce de que se o composto pode ser aplicado em
animais, poderá ser utilizado em humanos (SINGH, 2006).
Vale ressaltar que fatores ligados às propriedades físico-químicas da substância, dos
excipientes utilizados e do próprio processo de fabricação, têm sido considerados
responsáveis por alterações no efeito dos medicamentos, uma vez que podem afetar a
biodisponibilidade dos fármacos (HOFFMAN, 2011). Dessa forma, novas formulações de
medicamentos comercializados devem ser submetidas a novos estudos farmacocinéticos.
36
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar o perfil farmacocinético de nanopartículas de poli (metil metacrilato) contendo
Praziquantel.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
✓ Desenvolver e validar metodologia para a análise de Praziquantel em plasma de rato
utilizando Cromatografia Líquida e Alta Eficiência Acoplada a Espectometria de
Massas (CLAE-EM/EM).
✓ Determinar os parâmetros farmacocinéticos (Cmáx, Tmáx, ASC0-t, ASC0-∞, t 1/2β e
Ke) do Praziquantel administrado em nanopartículas de poli (metil metacrilato).
✓ Comparar o perfil farmacocinético de Praziquantel administrado por via oral em
nanopartículas de poli (metil metacrilato) com o perfil farmacocinético de
Praziquantel administrado na sua forma livre (substância referência).
37
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. EQUIPAMENTOS E INSTRUMENTOS DE USO GERAL
Para a realização do estudo, foram utilizados os seguintes instrumentos e
equipamentos: Pipetas P100, P200, P1000, P5000 (Gilson®), Ponteiras P100, P200, P1000,
P5000 (Gilson®), Agitador de tubos Thermomixer (Eppendorf
®), Comfort Balança de
precisão 0.0001g AG 200 (Gehaka®), Q-POD ZMQSP0D01 (Millipore
®), Milli-Q Integral 10
(Millipore®), Reservatório de água destilada Tank PE 030 (Millipore
®), Ultrassom USC2800-
A (Unique®), Microcentrífuga Refrigerada NT-805 (Novatécnica
®), Micro Centrífuga MCD-
2000 (HT®), Agitador de soluções AP56 (Phoenix Luferco
®), Evaporador DB-3D (Techne
®),
Balança Analítica Eletrônica JK-EAB-2204N (JKI®
), Refrigerador Compacto 120 (Consul®),
Freezer – 70º C MDF-U54VC (Sanyo®), Contensor para Rato EB 285P (Insight
®), Cânula de
gavagem para ratos IC810 (Insight®), Seringa Hipodérmica Descartável 1 mL (Embramac®)
e Agulhas Hipodérmica Descartáveis 0,55x20mm (BD®).
4.1.1. Componentes e equipamentos utilizados para a análise e identificação das amostras
Para a identificação e análise das amostras, foram utilizados os seguintes
equipamentos e componentes: Espectrômetros de Massas QTRAP 5500 LC/MS/MS
(ABSCIEX), Software 1.6.1 (Analyst), Coluna Analítica Omnisphere C18 5.0 μ 4.6 X 150.0
mm (Agilent Technologies), Bombas de CLAE ultraLC 100 (Eksigent ekspertTM), Injetores
automáticos ultraLC 100-XL (Eksigent ekspertTM ), Degaseificador Acoplado a bomba de
CLAE (Eksigent), Fornos de coluna ultraLC 100 (Eksigent ekspertTM).
4.1.2 Padrões
Foram utilizados os seguintes padrões de referência: Praziquantel (Fornecedor: USP -
Lote: HOJ029) e Diazepam (Fornecedor: INCQS – Lote: 1055). Os certificados de Padrão de
referência estão em anexo (Anexo I, Anexo II).
38
4.1.3. Solventes, reagentes e soluções
Foram utilizados os seguintes reagentes, solventes e soluções: Acetonitrila grau HPLC
(J.T.Baker®), Ácido Fórmico 96% P.A. ACS (Impex
®), Água Tipo I (Milli-Q), Metanol grau
HPLC (J.T.Baker®
), Metil-t-butil-éter (TBME) grau HPLC (Tedia®), Heparina sódica 5.000
U.I./ mL (Blausiegel Ind. e Com. Ltda®
), Isoflurano 100% (Cristália®), Crempophor EL
(Sigma-Aldrich®
).
4.2. ANIMAIS
Foram utilizados ratos da linhagem Wistar, fêmeas adultas, idade entre 12 e 17
semanas e peso entre 200 e 300 g, provenientes do Núcleo de Animais de Laboratório (NAL)
da Universidade Federal Fluminense (UFF). Os animais foram mantidos no Biotério da
Faculdade de Farmácia da UFF, em condições ambientais controladas: ciclo claro/escuro de
12 h e temperatura de 22 ± 2 °C, alojados em gaiolas de polipropileno com capacidade para
até 4 ratos/caixa, com acesso a água e alimento livre.
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com os protocolos de
experimentação animal da Universidade Federal Fluminense. O uso de animais foi aprovado
pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA-UFF) sob o número 378/2012 (Anexo
III).
4.3. DOSE E ESQUEMA DE ADMINISTRAÇÃO
A administração de Praziquantel na forma livre e em nanopartículas foi realizada por
via oral através de gavage. Para tanto os animais permaneceram em jejum de ração (2h) e
água (1h) antes e após a administração dos produtos.
Os animais foram divididos em 3 grupos experimentais:
Grupo Controle (C): n = 4
Grupo Praziquantel Livre (PZQ-L): n = 9
Grupo Nanopartículas de PMMA contendo Praziquantel (PZQ-NP): n = 6
39
Os animais do grupo C receberam 1 mL de veículo, administrada por via oral
(gavage). O veículo foi constituído de solução aquosa com 2% de Cremophor®.
Os animais do grupo PZQ-L receberam 60 mg/Kg de Praziquantel na forma livre
(substância pura, conforme Certificado de Padrão de Referência USP), suspendido em 1mL
de veículo, em dose única.
Os animais do grupo PZQ-NP receberam 60 mg/Kg de Praziquantel na forma de
PMMA-PZQ-NP suspendidas em 1 mL de veículo, em dose única.
4.4. PREPARO DA GAVAGE
4.4.1 Grupo Controle (C)
À um gral, previamente limpo e seco, foram adicionados 0,04 g de Cremophor® e 2
mL de água filtrada. Após a solubilização do tensoativo, 1 mL da solução resultante foi
transferida para uma seringa descartável, com a cânula de gavage previamente acoplada, para
correção do volume. A solução foi administrada por via oral imediatamente.
4.4.2 Grupo PZQ-L e Grupo PZQ-NP
O dobro da massa equivalente a 60 mg/kg de Praziquantel da substância de referência
(Grupo PZQ-L) ou de Nanopartículas de PMMA contendo Praziquantel (Grupo PZQ-NP) foi
pesada e transferida para um gral. Então, 0,04 g de Cremophor® foi adicionado. O conteúdo
do gral foi macerado até a obtenção de uma pasta homogênea. Em seguida, 2 mL de água
filtrada foi acrescentado e o conteúdo misturado até a formação de uma suspensão que então
foi transferida para uma seringa descartável, com a cânula de gavage previamente acoplada
para correção do volume. A suspensão foi administrada imediatamente.
A suspensão para a administração foi preparada em dobro devido a possibilidade de
perda de volume durante a transferência para a seringa.
40
4.5. COLETA DAS AMOSTRAS
Os animais foram alocados em contensor e volume de 150 µL de sangue de cada
animal foi coletado nos tempos 0, 5 min, 10 min, 20min, 30 min, 1h, 1:30 h, 2 h, 4 h, 8 h, 10
h, 12 h e 24 h após a administração por via oral.
As coletas foram realizadas através da veia caudal, utilizando seringa descartável
contendo 5 µL de Heparina Sódica 5.000 UI/mL como anticoagulante e agulha descartável
0,55x20 mm. A veia caudal foi dilatada com fonte de calor por aproximadamente 2 minutos
antes da coleta.
O sangue coletado foi transferido para tubos de 1,5 mL que em seguida foram
centrifugados a 4.000 rpm por 10 minutos. O plasma obtido após centrifugação foi transferido
para microtubo de 0,5 mL e armazenado a - 20 ºC até o momento da análise.
4.6. COLETA DE BRANCO DE PLASMA NORMAL (BPN)
Para os ensaios de validação do método analítico, foi necessário coletar amostras de
plasma branco, ou seja, plasma de animal que não recebeu nenhum tipo de tratamento. Para
tal, foram utilizados 8 animais. Estes foram sacrificados com overdose de Isoflurano e a
coleta foi realizada imediatamente por punção intracardíaca. O sangue foi transferido para
tubos de 1,5 mL contendo 10µL de Heparina Sódica 5.000 UI/mL como anticoagulante e
centrifugado a 4.000 rpm por 10 minutos. O plasma obtido após centrifugação foi armazenado
a - 20 ºC até o momento da análise.
4.7. EUTANÁSIA
Após a conclusão dos experimentos a eutanásia dos animais foi realizada por overdose
de Isoflurano. As carcaças dos animais foram mantidas no freezer, em sacos plásticos brancos
leitosos e posteriormente recolhidas pela equipe da Universidade Federal Fluminense para
serem encaminhadas para firma especializada, onde são incineradas.
41
4.8. METODOLOGIA ANALÍTICA
O método foi desenvolvido e validado e as amostras desconhecidas foram analisadas
no Laboratório de Farmacocinética (LAB-SEFAR) da Fundação Oswaldo Cruz (FioCruz).
4.8.1. Apresentação do método
Diazepam (DZP) (figura 2) foi adicionado em cada amostra como padrão interno.
Praziquantel e o padrão interno Diazepam foram extraídos do plasma de rato por extração
líquido/líquido empregando como solução de extração TBME (100%). Foram analisados por
Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria de Massas com ionização por
eletronebulização positiva usando o modo de MRM (Monitoramento de Reações Múltiplas).
4.8.2. Preparo das soluções mestre e soluções de trabalho
Para o preparo da solução mestre do analito (SME-PZQ), foram pesadas 10,0 mg de
PZQ em um balão volumétrico de 10 mL. A esta massa foi adicionada uma quantidade
suficiente de solução de metanol/água (50:50 - v/v), seguido de agitação vigorosa em agitador
tipo vortex. Após a completa dissolução do padrão analítico, o balão volumétrico foi aferido
até a marca de referência com a mesma solução inicial, originando uma solução de
concentração equivalente a 1 mg/mL de Praziquantel.
Figura 2: Fórmula estrutural do Diazepam (DZP)
42
A seguir, foram realizadas diluições sucessivas para a obtenção das soluções de
trabalho, utilizando como diluente metanol/água (50:50 –v/v), até concentrações finais de
1000 ng/mL, 800 ng/mL, 400 ng/mL, 100 ng/mL, 10 ng/mL, 5 ng/mL, 2,5 ng/mL e 1 ng/mL.
Similarmente, foi preparada solução mestre de Diazepam 1 mg/mL (SME-DZP) em
metanol/água (50:50 –v/v) para uso como padrão interno (PI). Esta solução foi diluída com o
mesmo diluente até concentração final de 500 ng/mL para utilização como solução de
trabalho do padrão interno.
4.8.3. Extração de Praziquantel e do Padrão Interno das amostras
O PZQ e DZP das amostras de plasma foram extraídos segundo o seguinte protocolo:
Em um microtubo para centrífuga de 2 mL contendo 25 µL de plasma foi adicionado 25 µL
de solução de trabalho do padrão interno Diazepam (DZP) (500 ng/mL). Após agitação em
vortex por 10 segundos, foi adicionado 1000 μL de solução de extração TBME (100%). A
amostra foi então agitada por 1 minuto em agitador manual e centrifugada a 14400 rpm a -
10°C durante 5 minutos. Após extração e centrifugação, 900 μL da fase orgânica obtida foi
transferida para um microtubo de polipropileno limpo. Este foi colocado sob fluxo de
nitrogênio para evaporação da amostra. Em seguida, a amostra foi ressuspendida com 400 μL
de fase móvel (metanol/água tipo I contendo ácido fórmico 0,1% - 60:40 – v/v). Após
agitação em vortex por 10 segundos, uma alíquota de 400 μL foi transferida para o vial
contendo insert e 10 μL foram injetados e analisados por CLAE-EM/EM.
Para as amostras da curva de calibração, branco de plasma com e sem adição de
padrão interno e controles de qualidade, uma alíquota de 25 μL de plasma branco foi
acrescida de 25 μL de solução contendo o fármaco (PZQ) na concentração desejada e de 25
μL de solução de trabalho do padrão interno (DZP) (500 ng/mL). A extração foi realizada
conforme descrito acima para as amostras desconhecidas.
Os controles de qualidade (CQ) consistiram de: CLIQ = Controle de Qualidade do
Limite Inferior de Quantificação (1,0 ng/mL); CQB = Controle de Qualidade de Baixa
Concentração (2,5 ng/mL); CQM = Controle de Qualidade de Média Concentração (400
ng/mL); CQA = Controle de Qualidade de Alta Concentração (800 ng/mL) e CQD = Controle
43
de Qualidade de Diluíção (800 ng/mL). Todos os CQ foram fortificados com concentração
fixa do Padrão Interno (500 ng/mL).
4.8.4. Condições Cromatográficas
As análises foram realizadas por CLAE-EM/EM com ionização por eletronebulização
positiva usando o modo de MRM (Monitoramento de Reações Múltiplas). As condições
cromatográficas empregadas durante a realização das análises estão discriminadas no Quadro
1.
Quadro 1: Condições cromatográficas para a análise
Condições analíticas
Coluna analítica Omnisphere C18 4,6 x 150 mm, 5,0 µm
Fase móvel Fase móvel: 15% - A e 85 % - B
Fluxo 0,800 mL /min
Pressão do sistema 111 - 135 Kgf / cm2
Temperatura do forno da coluna 40 °C
Temperatura do autosampler 10 °C
Volume de injeção 10 µL
Tempo de corrida 4 min
Temperatura do laboratório (°C) 22 ± 2°C
Umidade relativa do ar 45%
* Fase móvel: (A) água tipo I contendo ácido fórmico 0,1%; (B) metanol.
4.8.4.1. Tempos de retenção
O tempo de retenção do analito (PZQ) e padrão interno (DZP) durante a corrida
cromatográfica estão detalhados no Quadro 2.
44
Quadro 2: Tempos de retenção
Substância Transição utilizada (MRM) Tempo de retenção
Praziquantel 313,18 > 20,10 2,78 min
Diazepam 285,31 >193,00 2,94 min
4.8.5. Condições do Espectômetro de Massas
O instrumento foi operado em modo de eletronebulização positiva (ESI+). Os íons
foram monitorados pelo modo de MRM. As transições iônicas e os parâmetros individuais
dos compostos, incluindo o potencial de desagregação (DP), potencial de entrada (EP),
energia de colisão (CE), potencial da célula de saída (CXP) e a corrente do elétron
multiplicador (EM), estão resumidos no quadro 3. O tempo de varredura para ambos os
compostos foi de 300 ms.
Quadro 3: Parâmetos individuais dos íons monitorados.
Co
mpostos
Íon
precursor (m/z)
Íon
produto
(m/z)
DP
(V)
C
E
(V)
E
P
(V)
C
XP
(V)
E
M
(V)
PZ
Q 313,18
203,1
0
1
30
1
5
1
0
2
0
1
900
DZP 385,31
193,0
0
9
1
3
6
1
0
1
2
1
900
Legenda: m/z: razão massa/carga; V: Volts
Os parâmetros da fonte de ionização (gás de interface (CUR), gás de colisão (CAD),
gás de nebulização (GS1), gás secante (GS2) e temperatura do gás de secagem) estão
resumidos no quadro 4.
45
Quadro 4: Pressões dos gases e temperatura do gás de secagem
Gases Pressão (Psi) T (°C)
CAD Média
500 CUR 25
GS1 60
GS2 60
4.8.6. Curva de Calibração
As curvas de calibração (CCAL) foram realizadas com 8 níveis de concentração de
Praziquantel em plasma de rato (1000, 800, 400, 100, 10, 5, 2,5 e 1 ng/mL) com concentração
de padrão interno fixa (500 ng/mL), branco de plasma normal (BPN) e branco de plasma
normal fortificado com 500 ng/mL de padrão interno (BPZ). As amostras foram analisadas
em duplicatas, preparadas e analisadas conforme descrito anteriormente.
4.9. VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO
A validação do método analítico foi realizada baseada nos critérios estabelecidos pela
Resolução RDC n°. 27, de 17 de maio de 2012 (ANVISA, 2012). A corrida analítica é
aprovada se:
I. A curva de calibração apresentar bom coeficiente de correlação (r).
II. Os valores obtidos para os padrões de calibração apresentarem desvio inferior a
15% (exceto para o LIQ, para o qual são admitidos valores de desvio de até 20%).
III. No mínimo 75% dos padrões de calibração e, no mínimo, 6 padrões de calibração
de concentrações diferentes, incluindo os limites inferior e superior de
quantificação forem aprovados conforme os critérios anteriores.
A acurácia ou exatidão (expressão como desvio - D %) e a precisão (expressa como o
coeficiente de variação - CV %), são calculados conforme as equações a seguir.
46
4.9.1. Teste de Quantificação Inicial (TQI)
O teste de quantificação inicial tem por finalidade garantir a exatidão das
concentrações das soluções de trabalho. É realizado antes dos testes de estabilidade.
Para o teste de quantificação inicial, amostras de branco de plasma normal (BPN)
foram fortificadas com duas concentrações do analito: 2,5 ng/mL e 800 ng/mL , ambas com
concentração fixa de 500 ng/mL de DZP. Estas foram denominadas de CQB-PZQ+DZP e
CQA-PZQ+DZP, respectivamente.
Oito replicatas dessas amostras, juntamente com a curva de calibração, foram
processadas e analisadas conforme metodologia previamente descrita. A quantificação é
estabelecida se os valores dos controles de qualidade apresentarem coeficiente de variação
inferior a 15% e desvio entre ± 15% do valor nominal.
4.9.2. Teste de Estabilidade Curta de Soluções de Trabalho (TEBCST)
O teste de estabilidade curta de soluções de trabalho tem por objetivo validar o período
máximo em que as soluções de trabalho preparadas podem permanecer na bancada para serem
utilizadas nas análises.
Para este teste, foram preparadas Solução Mestre do Analito (SME – PZQ: 100000
ng/mL – diluída para 1000 ng/mL), Solução de Trabalho 01 (STB01 – PZQ: 1,0 ng/mL);
Solução Mestre de Diazepam (SME – DZP: 1000000 ng/mL – diluída para 5000 ng/mL) e
CV = Desvio Padrão x 100
Concentração média experimental
D = Concentração média experimental – Valor Nominal x 100
Valor Nominal
47
Solução de Trabalho do Padrão Interno (STBIS: 500 ng/mL). Estas soluções foram deixadas
na bancada de trabalho por 18 h e 47 min.
Após determinando período, soluções contendo essas mesmas concentrações foram
preparadas novamente (Soluções Recém Preparadas – SRP).
As soluções em repouso sobre a bancada e as SRP foram injetadas no cromatógrafo,
conforme procedimento previamente descrito. A estabilidade é demonstrada se não se
observar desvio superior a 10% da média das concentrações obtidas com relação ao valor
nominal. O cálculo do período de estabilidade foi determinado pelo tempo decorrido entre o
início do preparo das soluções que ficaram em repouso até o término do preparo das SRP.
4.9.3. Teste de Estabilidade Longa de Soluções de Trabalho (TEBLST)
O teste de estabilidade longa de soluções tem por objetivo determinar a validade das
soluções de trabalho. Para este teste, as mesmas soluções utilizadas para o TEBCST foram
novamente preparadas e então armazenadas a -70 °C por 407 h e 56 min. Após determinado
período, novas soluções foram preparadas (SRP).
As soluções armazenadas em refrigeração e as SRP foram injetadas no cromatógrafo,
conforme procedimento previamente descrito. A estabilidade longa de soluções foi
determinada obedecendo aos mesmos critérios descritos anteriormente para o TEBSRP. O
cálculo do período de estabilidade foi determinado pelo tempo decorrido entre o início do
preparo das soluções que foram armazenadas até o término do preparo das SRP.
4.9.4.Teste de Estabilidade Curta em Plasma (TEBCP)
Este teste tem por finalidade determinar o tempo máximo em que as amostras
desconhecidas devem ser analisadas. Amostras de branco de plasma normal foram fortificadas
com duas concentrações do analito: CQB-PZQ: 2,5 ng/mL e CQA-PZQ: 800 ng/mL. Estas
48
amostras permaneceram a temperatura ambiente em repouso sobre a bancada por 17 h e 54
min.
Após determinado período de tempo, foi preparada a curva de calibração, conforme
descrito anteriormente. O padrão interno foi adicionado nas amostras de plasma em repouso
somente no momento em que também foram adicionados nas amostras da curva de calibração,
garantindo que ambos estivessem sob as mesmas condições.
O analito e o padrão interno foram extraídos do plasma e as amostras foram
analisadas. A estabilidade curta em plasma foi calculada pelo período de tempo decorrido
entre a adição do analito no plasma até a adição do padrão interno. A estabilidade é
demonstrada se não se observar coeficiente de variação e desvio superiores a 15% da média
das concentrações obtidas com relação ao valor nominal.
4.9.5. Teste de Estabilidade Pós-Processamento (TEBPP)
Este teste tem por finalidade determinar o tempo máximo em que as amostras
desconhecidas, após serem submetidas aos processos de extração, devem ser injetadas no
cromatógrafo.
Para o TEBPP, amostras de BPN foram fortificadas com as soluções previamente
aprovadas no TQI (CQB-PZQ+DZP e CQA-PZQ+DZP) e foram, então, armazenadas no
RACK do injetor do cromatógrafo por 47 h e 55 min.
Após determinado período de tempo, foi preparada a curva de calibração. A
estabilidade pós-processamento foi calculada pelo tempo decorrido entre o final da extração
das amostras de controle (CQB-PZQ+DZP e CQA-PZQ+DZP) e o final da extração das
amostras da curva de calibração recém preparada.
Amostras da curva de calibração, e amostras de controle foram injetadas no
cromatógrafo juntas, garantido que fossem submetidas às mesmas condições de corrida. A
49
estabilidade é demonstrada se não se observar coeficiente de variação e desvio superiores a
15% da média das concentrações obtidas com relação ao valor nominal.
4.9.6. Teste de Estabilidade após Ciclos de Congelamento e Descongelamento (TEBCD)
Este teste tem por finalidade determinar o número de vezes que as amostras
desconhecidas podem ser descongeladas antes de serem analisadas.
Para o TEBCD, amostras de plasma fortificadas com os controles (CQB-PZQ+DZP e
CQA-PZQ+DPZ), sofreram 8 ciclos de congelamento e descongelamento, ou seja, foram 8
vezes congeladas até - 70°C por no mínimo 12 h e descongeladas em temperatura de 22 ±
2°C. A estabilidade após ciclos de congelamento e descongelamento foi calculada pelo tempo
decorrido entre o início do primeiro congelamento até o final do último descongelamento.
Amostras da curva de calibração recém preparadas e as amostras de controles foram
injetadas no cromatógrafo juntas, garantido que fossem submetidas às mesmas condições de
corrida. A estabilidade é demonstrada se não se observar coeficiente de variação e desvio
superiores a 15% da média das concentrações obtidas com relação ao valor nominal.
4.9.7. Precisão e Exatidão
A precisão e exatidão de método baseadas na repetitividade (precisão / exatidão
intracorrida) foram determinadas pela análise de oito replicatas de amostras de plasma de rato
fortificadas com cinco concentrações de Praziquantel: LIQ (1,0 ng/mL), CQB (2,5 ng/mL),
CQM (400 ng/mL), CQA (800 ng/mL) e CQD (SME-PZQ: 1000000 ng/mL – diluída para
800 ng/mL) e concentração fixa do padrão interno DZP (500 ng/mL) e analisadas junto com a
curva de calibração recém preparada.
A precisão / exatidão intermediárias (intercorridas) foi determinada usando o mesmo
número de replicatas e concentrações de plasma descritas acima, em três corridas diferentes
realizadas em dias distintos.
50
A precisão é estabelecida se as concentrações experimentais dos controles de
qualidade apresentarem coeficiente de variação (CV) inferior a 15% (exceto para o LIQ, para
o qual são admitidos valores de desvio até 20%). A exatidão é estabelecida se as
concentrações experimentais dos controles de qualidade apresentarem desvio (D) entre 85-
115% da concentração nominal, exceto para o LIQ, para o qual são admitidos valores entre
80-120%.
4.10. ANÁLISE DAS AMOSTRAS
As amostras foram analisadas no Laboratório de Farmacocinética (LAB-SEFAR) da
Fundação Oswaldo Cruz por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a
Espectrometria de Massas (CLAE-EM/EM), utilizando cromatógrafo EKSPERTTM
ULTRA
LC 100 e Espectofotômetro de Massas Q TRAP 5500.
Foram utilizados os Testes de Dixon, Teste de Chauvenete e Teste da Razão Q para a
identificação e exclusão de Outliers. O perfil farmacocinético de PZQ livre e em
nanopartículas foi calculado através do Software Phoenix WinNonlin versão 6.3
(Pharmasight®, USA) utilizando análise não-compartimental, em que os parâmetros Cmáx,
Tmáx são extraídos diretamente da curva de concentração plasmática (Cp) versus tempo; Ke é
obtida através do cálculo da inclinação da fase de decaimento do gráfico ln (Cp) versus
tempo, t ½ β é calculado através da equação: t ½ β = 0,693/Ke, ASC 0-t é calculada pelo
método trapezoidal; ASC0-∞ (área sob a curva de concentração do fármaco versus tempo, do
tempo 0 (zero) extrapolada ao infinito) é calculada como ASC 0-∞ = ASC 0-t + Ct / Ke, em que
Ct é a última concentração determinada acima do limite de quantificação.
4.11. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os gráficos foram construídos no Software GraphPad Prism® (versão 5.0 para
Windows, USA). Para a análise estatística foi empregado Teste T de Mann-Whitnney para a
comparação entre dois grupos de dados. Os resultados foram expressos como a média ± erro
padrão e foram considerados estatisticamente significativos quando P < 0,05.
51
5. RESULTADOS
5.1. DESENVOLVIMENTO DO MÉTODO ANALÍTICO
Os espectros de massas obtidos para o íon precursor e íon produto do analito (PZQ) e
para o íon percursor e produto do padrão interno (DZP) estão demonstrados nos Apêndices I,
II, III e IV, respectivamente.
Os limites de quantificação inferior e superior do analito foram 1,0 ng/mL e 1000
ng/mL, respectivamente. As curvas de calibração, apresentaram excelente linearidade,
conforme exemplo demostrado na figura 3.
Figura 3: Curva de Calibração da Corrida Analítica. Nota: Composta por 8 níveis de concentração de
PZQ (1000, 800, 400, 100, 10, 5, 2,5 e 1 ng/mL) com concentração de P.I. fixa (500 ng/mL), preparadas em
duplicata.
O tempo total de corrida analítica foi de 4 minutos. A metodologia de extração
líquido-líquido do analito e PI do plasma foi eficiente. Os cromatogramas obtidos
apresentaram boa resolução e separação de picos, com tempos de retenção de 2,78 min para o
PZQ e 2,94 minutos para o DZP. Exemplos de cromatogramas de branco de plasma
fortificado com PZQ e P.I. e de uma amostra desconhecida estão demonstrados na figura 4.
y = 0,9115304x + 0,001885
r = 0,995
52
Figura 4: Cromatogramas obtidos para (A) branco de plasma fortificado com PZQ e DZP (10 ng/mL e 500 ng/
mL, respectivamente), (B) amostra de plasma de rato obtida após 0,05h da administração oral de 60 mg/Kg de
PZQ encapsulado em PMMA-NP com P.I. (11,52 ng/mL e ng/mL, respectivamente)
Time (min)
Inte
nsi
ty
Inte
nsi
ty
Time (min)
2.80
PZQ
2.97
DZP
A 2.2 e 4 1.0 e 6
Time (min)
Inte
nsi
ty
Inte
nsi
ty
Time (min)
2.84
PZQ
3.01
DPZ
B 6400 1.0 e 6
53
5.2. VALIDAÇÃO DO MÉTODO ANALÍTICO
5.2.1. Teste de Quantificação Inicial (TQI)
A curva de calibração (y = 1.08x + 0,00113) do TQI apresentou excelente linearidade,
com coeficiente de correlação r = 0,9993 e nenhum valor foi desconsiderado. O Controle de
Qualidade de Baixa Concentração (CQB) apresentou CV = 7,06% e D = 4%, ou seja, exatidão
entre 96-104%. O Controle de Qualidade de Alta Concentração (CQA) apresentou CV = 2,9%
e exatidão de 98-102% (D = 1,63%).
Esses resultados demonstram que os valores estabelecidos para os Controles de
Qualidade são confiáveis e estes podem, então, ser utilizados em testes de estabilidade em que
sejam aplicáveis.
5.2.2. Teste de Estabilidade Curta de Soluções de Trabalho (TEBCST)
As soluções de trabalho em teste ficaram em repouso por 18 h e 47 min. Durante este
período, apresentaram desvio (D) inferior a 10% em relação às soluções recém-preparadas
(DPZQ-STB = 6,0 %; DPZQ-SME = 2,4 %; DDZP-STB = 0,1 %; DDZP-SME = 6,7 %).
Estes resultados demonstram que as soluções de trabalho, durante 18 h e 47 min
permanecem estáveis a temperatura ambiente. Logo, durante a realização dos experimentos,
essas permaneceram na bancada por período inferior ao estabelecido por este ensaio.
5.2.3. Teste de Estabilidade Longa de Soluções de Trabalho (TEBLST)
As soluções de trabalho em teste ficaram sob refrigeração por 407 h e 56 min. Durante
este período, apresentaram desvio (D) inferior a 10 % em relação às soluções de trabalho
recém-preparadas (DPZQ-STB = 4,4 %; DPZQ-SME = 4,4 %; DDZP-STB = 2,4 %; DDZP-SME = 0,4 %).
Estes resultados demonstram que as soluções de trabalho, durante 407 h e 56 min
permanecem estáveis se armazenadas em refrigerador (– 70o
C). Logo, durante a realização
54
dos experimentos, as soluções de trabalho não foram armazenadas por período superior ao
estabelecido por este ensaio. Após esse período, novas soluções foram preparadas.
5.2.4. Teste de Estabilidade Curta em Plasma (TEBCP)
A curva de calibração (y = 1,15x + 0,00135) obtida no ensaio de estabilidade de curta
duração do analito em plasma apresentou excelente linearidade (r = 0,9984). O tempo
decorrido entre a adição do PZQ no branco de plasma normal para a preparação dos controles
de qualidade CQB-PZQ e CQA-PZQ e a adição do PI foi de 17 h:54 min. Após este período,
a precisão (CV %) desses controles não excedeu 7,5% e apresentaram desvio inferior a 6,5%
da média das concentrações obtidas com relação ao valor nominal (CQB: CV = 4,6% e D =
6,5% e CQA: CV = 7,5% e D = 1,59%).
Estes resultados demonstram que, em um período de 17 h e 54 min, o PZQ permanece
estável em plasma em temperatura ambiente. Assim as amostras desconhecidas foram
processadas e analisadas em tempo inferior ao estabelecido por este teste.
5.2.5. Teste de Estabilidade Pós-Processamento (TEBPP)
A curva de calibração (y = 1,12x + 0,00133) obtida para o ensaio de estabilidade pós-
processamento em plasma de rato apresentou excelente linearidade (r = 0,9967). O tempo
decorrido entre o final da extração das amostras de controle (CQB-PZQ+DZP e CQA-
PZQ+DZP) e o final da extração das amostras da curva recém preparada foi de 47 h e 55 min.
Após este período, coeficiente de variação e desvio dos controles de qualidade apresentaram
valores inferiores a 15% (CQB: CV = 9,9% e D = - 3,5% e CQA: CV = 6,0% e D = - 8,8%).
Estes resultados demonstram que 47 h e 55 min após ser extraído da matriz biológica,
o PZQ permanece estável. Assim, após serem submetidas aos procedimentos de extração, as
amostras desconhecidas foram analisadas em tempo inferior ao estabelecido por este teste.
55
5.2.6. Teste de Estabilidade após Ciclos de Congelamento e Descongelamento (TEBCD)
A curva de calibração (y = 0,968x + 0,00116) obtida para o ensaio de estabilidade
após ciclos de congelamento e descongelamento apresentou excelente linearidade (r =
0,9985). O tempo decorrido entre o primeiro congelamento das amostras TQI e o ultimo
descongelamento das mesmas foi de 305 h e 52 min. Após serem submetidas aos ciclos,
CQB-PZQ+DZP e CQA-PZQ+DZP apresentaram coeficiente de variação e desvio inferiores
a 15% (CQB = CV = 5,8% e D = -0,3 e CQA: CV = 2,6% e D = 6,7%).
Estes resultados demonstram que após 8 etapas de congelamento e descongelamento, o
PZQ permanece estável na matriz biológica. Assim, as amostras desconhecidas não foram
submetidas a processos de congelamento e descongelamento por mais de 8 vezes antes de
serem analisadas.
5.2.7. Precisão e Extatidão
5.2.7.1. Precisão e extatidão intracorrida
Para a construção da curva de calibração do ensaio de precisão e exatidão intracorrida,
foram desconsiderados 1 amostra de concentração: PZQ: 5,0 ng/mL + DPZ 500 mg/mL e 1
amostra de concentração: PZQ:10,0 ng/mL + DPZ = 500 ng/mL, por apresentarem desvio
superior a 15% do valor nominal. A curva resultante (y = 1.01x + 0,0011) apresentou
excelente linearidade (r = 0,9970).
A repetibilidade intracorrida foi considerada precisa, uma vez que os controles de
qualidade apresentaram CV inferior a 15% da média das concentrações obtidas em relação ao
valor nominal (CVLIQ = 9,5%, CVCQB = 4,4%; CVCQM = 1,5%, CVCQA = 2,6% e CVCQD =
4,26).
Este método foi considerado exato, pois a média para cada controle de qualidade
empregado apresentou desvio (D) inferior a 15% em relação ao valor nominal (DLIQ = 8,8%,
DCQB = 4,3%; DCQM = 6,6%, DCQA = 9,3% e DCQD = 10,43).
56
5.2.7.2. Precisão e extatidão intercorrida
As curvas de calibração obtidas para o ensaio de precisão e exatidão intercorridas
apresentaram excelente linearidade, com coeficientes de correlação r > 0,99, conforme
detalhado a seguir:
y = 1.01x + 0,0011 (r = 0,9970)
y = 0,919x + 0,00167 (r = 0,9960)
y = 0,888x + 0,00101 (r = 0,990)
A precisão e exatidão intercorrida foram determinadas a partir da média das
concentrações obtidas para cada controle de qualidade, nos três dias de ensaio, de acordo com
os critérios estabelecidos pela Resolução RDC n°. 27, de 17 de maio de 2012 (ANVISA,
2012). O resultado está demonstrado na tabela 1.
Tabela 1: Resultado obtido para o Teste de Precisão e Exatidão Intercorridas
NOTA: TPE 1 = Teste de Precisão e Exatidão no dia 1; TPE2 = Teste de Precisão e Exatidão no dia 2; TPE 3 =
Teste de Precisão e Exatidão no dia 3. CV = Coeficiente de Variação (%); D = Desvio (%); CLIQ = Controle de
Qualidade do Limite Inferior de Quantificação (1,0 ng/mL); CQB = Controle de Qualidade de Baixa
Concentração (2,5 ng/mL); CQM = Controle de Qualidade de Média Concentração (400 ng/mL); CQA =
Controle de Qualidade de Alta Concentração (800 ng/mL) e CQD = Controle de Qualidade de Diluição (800
ng/mL). OBS: Todos os Controles de Qualidade foram fortificados com concentração fixa do Padrão Interno
(500 ng/mL).
Este resultado demonstra que o método analítico empregado apresenta
reprodutibilidade e acurácia aceitáveis, uma vez que não foram observados valores de CV e
EPR superior a 15%.
LIQ CQB CQM CQA CQD
TPE 1 1,0888 2,2325 373,7575 725,1250 716,5213
TPE 2 1,1975 2,2788 388,8000 708,6338 817,9925
TPE 3 0,9663 2,2075 362,3788 713,7100 721,1025
CV 10,7 1,6 3,5 1,2 7,6
DESVIO 8,42 -10,42 -6,26 -10,52 -6,02
TESTEConcentração média dos Controles de Qualidade (ng/mL)
57
5.3. AVALIAÇÃO FARMACOCINÉTICA
O presente estudo demonstrou que o Praziquantel é liberado das nanopartículas de
PMMA in vivo e é absorvido no trato gastrointestinal após administração por via oral em
ratos.
Os resultados obtidos para os parâmetros farmacocinéticos de cada animal foram
submetidos aos Testes de Dixon, Chauvente e Teste da Razão Q para a identificação de
valores discrepantes. Após essas análises, foram excluídos 2 animais do grupo PZQ-L e 1
animal do grupo PZQ-NP, conforme os critérios estabelecidos por estes testes.
Concentrações plasmáticas de PZQ foram detectadas 5 minutos e até 24 horas após a
administração por via oral, nos grupos PZQ-NP e PZQ-L. No grupo Controle, não foi
detectado concentrações plasmáticas de PZQ em nenhum tempo analisado, demonstrando que
o veículo utilizado (água com 2% de Cremophor®) não continha fármaco. As curvas de
concentração plasmática de Praziquantel versus tempo obtidas após administração oral de
uma única dose (60 mg/ Kg) de PZQ livre (PZQ-L) ou PZQ carreado em nanopartículas de
PMMA (PZQ-NP) em ratos estão demonstradas na figura 5.
58
Figura 5: Curva de concentração plasmática média de PZQ em função do tempo após administração oral de
60mg/ Kg de PZQ nos grupo PZQ-L (n = 7) e PZQ-NP (n = 5). O grupo C (n = 4) recebeu 1 mL de veículo.
Resultados são expressos como média ± erro padrão. Destaque: Concentração plasmática média de PZQ nos
grupos supra citados até 1h.
A concentração plasmática máxima de PZQ (Cmáx) no grupo PZQ-L foi
aproximadamente 3 vezes maior que Cmáx do grupo PZQ-NP, diferença estatisticamente
significativa. O mesmo foi observado para Área Sob a Curva do tempo 0 até 24h (ASC0-t) e
Área Sob a Curva do tempo ao infinito (ASC0-∞). Esses resultados estão demonstrados na
figura 6 (A, B e C, respectivamente).
59
Figura 6: Parâmetros farmacocinéticos de Praziquantel após administração oral de PZQ-L (n = 7) e PZQ-NP (n
= 5) em ratos ( 60 mg / kg). Resultados são expressos como média ± erro padrão. (A) C máx, (B) ASC 0-t, (C)
ASC 0-∞, (D), T máx, (E) Ke, (F) t ½ β. *P < 0,05 versus PZQ-L.
A fim de avaliar essa significativa diferença de ASC entre os grupos estudados, foi
calculada a biodisponibilidade relativa (FR) de PZQ no grupo PZQ-NP em relação a
biodisponibilidade de PQZ no grupo PZQ-L, de acordo com a equação a seguir:
FR = (ASC 0-∞ _NP / ASC 0-∞ _ L) x (Q_L /Q_NP)
FR = (19086,28 / 63344,48) x (15,03/15,72)
FR = 0,2881 ou 28,81%
NOTA: ASC 0-∞ _ NP: biodisponibilidade do tempo zero ao infinito calculada pra o grupo PZQ_NP; ASC 0-∞ _ L:
biodisponibilidade do tempo zero ao infinito calculada pra o grupo PZQ_L; Q_L: quantidade média (mg) de
PZQ administrada ao grupo PZQ_L; Q_NP: quantidade média (mg) de PZQ administrada ao grupo PZQ_NP.
*
A
AU
C
0-t
(µ
g.h
/L)
B
*
C m
áx
(µ
g/L
)A
UC
0
-∞ (
µg
.h/L
)
C
* T m
áx (
h)
D
Ke
(h-1
)
T 1
/2β
(h
)
E F
60
Ou seja, as nanopartículas de PMMA tornaram biodisponível somente 28,81% do PZQ
que é biodisponibilizado pela suspensão de PZQ livre.
Não foi encontrada diferença estatística significativa no tempo para atingir a
concentração plasmática máxima de PZQ (Tmáx) entre os grupos PZQ-L e PZQ-NP, sugerindo
que a nanopartícula de PMMA não tem efeito de liberação retardada (Figura 6 – D).
A taxa de eliminação (Ke) nos grupos PZQ-L e PZQ-NP foi semelhante (Figura 6 –
E), demonstrando que aproximadamente 27% do fármaco foi eliminado do organismo por
hora, tanto na forma livre como em nanopartículas.
A meia vida de eliminação (T1/2β) no grupo PZQ-L foi estatisticamente semelhante
ao do grupo PZQ-NP, em que a concentração do fármaco presente no organismo em ambos os
grupos foi reduzida à metade em aproximadamente 3 horas (Figura 6 – F ).
.
Os resultados obtidos para os parâmetros farmacocinéticos de PZQ livre e em
nanopartículas de PMMA estão resumidos na tabela 2.
Tabela 2: Parâmetros farmacocinéticos de PZQ administrado na forma livre (PZQ-L) e em
nanopartículas de PMMA ( PZQ-NP) por via oral.
Nota: Dose de PZQ: 60 mg/Kg de PZQ, Grupos: PZQ-L ( n = 7) e PZQ-NP (n = 5). Os resultados foram
expressos como média ± erro padrão. *P < 0,05 versus PZQ-L.
Abreviações: PZQ-L: Praziquantel livre; PZQ-NP: Praziquantel em nanopartículas de PMMAs; Cmáx:
concentração máxima; Tmáx: tempo de Cmáx; Ke: constante de eliminação; T 1/2β: tempo de meia-vida de
eliminação, ASC0-t: área sob a curva (0-24h); AUC 0-∞: área sob a curva (0-infinito); Cl: clearance; Vd: volume
de distribuição.
Cmáx Tmáx ASC0-t ASC0-∞ Ke T1/2β
{µg/L} {h} {µg.h/L} {µg.h/L} {1/h} {h}
PZQ-L554,23 ±
94,19
0,33 ±
0,04
1112,22 ±
195,29
1125,31 ±
196, 21
0,2703 ±
0,0428
2,91 ±
0,46
PZQ-NP172,09 ±
43,84 *
0,38 ±
0,08
326,81 ±
35,54 *
336,11 ±
34,62 *
0,2703 ±
0,0428
2,85 ±
0,47
GRUPO
61
6. DISCUSSÃO
Estudos farmacocinéticos foram realizados a fim de determinar o perfil de absorção,
biodisponibilidade e eliminação de Praziquantel administrado em nanopartículas de PMMA,
por via oral em dose única, e compará-las com o perfil farmacocinético obtido para o PZQ
administrado em sua forma livre. Para tal, foi desenvolvida e validada metodologia utilizando
Cromatografia Líquida de Alta Performance acoplada a Espectrometria de Massas (CLAE-
EM/EM). O método analítico desenvolvido mostrou-se rápido, sensível, acurado, reprodutível
e simples (com o processo de preparo de amostras realizado em uma única etapa), sendo boa
metodologia para a análise de Praziquantel em plasma. Apesar de alguns parâmetros terem
sido significativamente diferentes entre os grupos PZQ-NP e PZQ-L, o perfil farmacocinético
de PZQ foi semelhante entre os grupos, porém em proporções aproximadamente três vezes
inferiores para o PZQ-NP.
Diehl e colaboradores (2001) demonstraram que até 15% do volume de sangue pode
ser removido em 24 h sem perturbação significativa para a fisiologia do animal, desde que
sejam realizadas coletas múltiplas de pequenos volumes. De acordo com o mesmo autor, ratos
possuem volume sanguíneo de 64 mL/Kg. Logo, o volume de amostras coletados para este
estudo não apresentou risco de choque hipovolêmico nos animais.
Nos ensaios realizados por Bonato e colaboradores (2007) e Hanpitakpong e
colaboradores (2004) para a análise de plasma em ratos utilizando CLAE, as técnicas
apresentaram limite de quantificação de 5,0 ng/mL e foram empregados volumes de amostra
de 1 mL. No entanto, no presente estudo, o método analítico apresentou limite de
quantificação de 1,0 ng/mL a 1000 ng/mL, e permitiu a utilização de 25 µL de plasma de
amostra, o que é uma grande vantagem para experimentos em que são necessárias diversas
coletas de sangue em pequeno intervalo de tempo e que ocorre ampla variação de
concentração, como nos experimentos de farmacocinética.
A validação do método analítico foi baseada nos critérios estabelecidos pela ANVISA
e os resultados mostraram que o método desenvolvido é confiável. Os ensaios de
seletividade, efeito residual e efeito matriz não foram realizados por dificuldade de aquisição
de plasma lipêmico. Quatro animais foram tratados durante 60 dias com dieta hiperlipídica
(CORREIA-SANTOS et al., 2012), mas não houve aumento dos valores de triglicerídeos e
62
colesterol (resultados não mostrados), impossibilitando os ensaios de validação citados
anteriormente. No entanto, a aplicação da Espectometria de Massas permite garantir a
seletividade e especificidade do método, uma vez que essa técnica monitora fragmentos de
razão massa/carga (m/z) extremamente específicos.
Por apresentar elevada hidrofobicidade, PZQ não é facilmente removido das vidrarias
e materiais utilizados para análise e foi detectado sua presença no porta cone das pipetas, o
que dificulta os ensaios devido a contaminação das amostras. No entanto, a limpeza com os
solventes acetonitrila, acetona PA e metanol mostrou-se eficaz para remoção de resíduos do
fármaco das vidrarias e materiais (resultados não mostrados). A utilização de ponteiras com
filtros e a limpeza da cânula de gavage e do porta cone das pipetas com os solventes supra
citados é uma alternativa para evitar a contaminação. Esses procedimentos, no entanto, podem
elevar o custo da pesquisa, bem como aumentar o tempo para a realização do estudo.
O Praziquantel na forma livre bem como aprisionado em nanopartículas foi
rapidamente absorvido pelo trato gastrointestinal, sendo detectado no plasma cinco minutos
após administração. No entanto, a concentração plasmática neste tempo foi aproximadamente
três vezes menor no grupo PZQ-NP. Por ser altamente lipofílico, PZQ atravessa rapidamente,
por difusão passiva, as membranas do trato gastrointestinal alcançando a corrente sanguínea
(ALI, 2006). A diferença nas concentrações pode ser explicada pelo fato de que a absorção de
PZQ encapsulado em nanopartículas é dependente da difusão do fármaco através do polímero
da matriz (REFERENCIAR)
Apesar da concentração plasmática máxima de PZQ (Cmáx) ter sido significativamente
menor no grupo PZQ-NP em comparação com o grupo PZQ-L, são necessários mais estudos
a fim de avaliar se as concentrações plasmáticas de PZQ em PMMA-NP atingem a margem
terapêutica, na dose desejada, bem como avaliar sua eficácia.
A biodisponibilidade (ASC0-t e ASC0-∞) no grupo PZQ-NP foi significativamente
menor comparado ao grupo PZQ-L. Esses resultados diferem dos encontrados por Xie e
colaboradores (2011) e Yang e colaboradores (2009) em que Nanopartículas Sólidas Lipídicas
aumentaram a ASC de PZQ quando comparado a sua forma livre e ao comprimido referência,
respectivamente. No entanto, sabe-se que e o processo de absorção (e consequente
biodisponibilidade) é dependente das propriedades físico-químicas das partículas (DING e
63
MA, 2014; SHANG et al., 2014; KETTINGER et al., 2013) e o polímero utilizados neste
estudo e os utilizados por esses autores são diferentes.
Contudo, ao avaliar a biodisponibilidade relativa de PZQ no grupo PZQ-NP,
observou-se que nanopartículas de PMMA tornaram biodisponível somente 28,81% do PZQ
que é biodisponibilizado pela suspensão de PZQ livre. Interessantemente tanto Cmáx como
ASC0-t e ASC 0-∞ do grupo PZQ-NP foram aproximadamente 30 % dos valores obtidos para o
grupo PZQ-L. Estes resultados sugerem uma aparente proporcionalidade entre as suspensões
estudadas no que diz respeito a farmacocinética do Praziquantel, uma vez que reduções
observadas nos parâmetros Cmáx e ASC do grupo PZQ-NP estão relacionadas a redução na
mesma proporção da quantidade de fármaco biodisponível neste grupo.
Estudos demonstraram que nanosistemas podem melhorar biodisponibilidade de
fármacos por aumentar o tempo de residência no trato gastrointestinal através da bioadesão,
por aumentar a captação celular (por exemplo nas Placas de Peyer e células M), por impedir a
degradação enzimática e não enzimática no TGI e ainda por diminuir o efeito de primeira-
passagem no fígado (KADAM, BOURNE e KOMPELLA, 2012; ARAÚJO et al., 1999).
Segundo Boegh e colaboradores (2013) nanopartículas sintetizadas com polímeros
bioaderentes resultam em maior absorção do fármaco por aumentar as interações do sistema
carreador com as células intestinais. No entanto, o polímero utilizado como matriz para o
desenvolvimento da nanopartícula em estudo, o PMMA, não é bioadesivo (REINEKE et al.,
2013), podendo ser esse o motivo dele não ter favorecido o aumento da biodisponibilidade do
PZQ. Neste sentido, estudo para a determinação da taxa de difusão, viscoelasticidade,
velocidade, direção e transporte de nanopartículas de PMMA no muco necessitam ser
realizados. Apesar de não ser bioaderente, PMMA têm sido amplamente utilizado na área
farmacêutica e biomédica devido a sua conhecida biocompatibilidade, estabilidade
dimensional e resistência (CHEN et al., 2010), fatores muito importantes para o
desenvolvimento de formulações farmacêuticas, além do baixo custo e facilidade para
produção em escala industrial.
Adicionalmente, foi necessário o uso de Cremophor® para aumentar a solubilidade
aquosa das nanopartículas, uma vez que estas suspendidas somente com água obstruíam a
cânula de gavage, impossibilitando a administração. O Cremophor® é um agente
solubilizante e emulsificante usado pela indústria farmacêutica para preparações aquosas de
64
ingredientes farmacêuticos ativos hidrofóbicos. Diferentes estudos utilizaram Praziquantel
livre ou o comprimido referência solubilizado em 2% Cremophor® (EL-LAKKANY et al.,
2011; BARROS et al., 2009; BOTROS et al., 2008) e não foi relatado qualquer interferência
na farmacocinética e/ou farmacodinâmica do fármaco, motivo pelo qual foi escolhido para o
presente ensaio. Contudo, não foram encontrados estudos sobre a interação de PMMA com
Cremophor®. Logo, uma hipótese é que a adição desse agente solubilizante pode ter
provocado alterações na superfície das nanopartículas que impossibilitaram a completa
liberação do fármaco da matriz polimérica. No estudo realizado por Fonseca e colaboradores
(2013b), foi demonstrado que o perfil de liberação in vitro de PZQ a partir das nanopartículas
de PMMA foi de aproximadamente 85% em 15 minutos, tanto em meio gástrico simulado
(pH 1,2), como em meio entérico simulado (pH 6,8), não justificando os resultados de
biodisponibilidade obtidos por este estudo. No entanto, este ensaio foi realizado in vitro, sem
a presença de Cremophor® e não foi realizado estudo em pH sanguíneo (7,4).
Sabe-se ainda que a captação celular de nanopartículas depende de suas propriedades
de superfície (DING e MA, 2014; SHANG et al., 2014). Então, outra hipótese para a baixa
biodisponibilidade de PZQ encontrada para o grupo PZQ-NP é que a adição de Cremophor®
pode ter alterado as propriedades de superfície das nanopartículas de modo a dificultar sua
interação com as células absortivas do TGI. É importante ressaltar que essas alterações podem
ocorrer apenas após contato com os complexos fluídos biológicos (KETTINGER et al.,
2013), impossibilitando a previsão com estudos in vitro.
Nanopartículas têm demonstrado proteger as moléculas do efeito de primeira
passagem no fígado (KADAM, BOURNE e KOMPELLA, 2012; ITALIA et al., 2007).
Contudo, no presente estudo não foi possível avaliar a influência das nanopartículas na
biotransformação do PZQ por dificuldade na aquisição dos padrões de cis e trans-4-
hidroxilpraziquantel, principais produtos de biotransformação de PZQ relatado na literatura
(ALI, 2006). Assim, pesquisas são necessárias a fim de determinar qualitativamente e
quantitativamente os produtos de biotransformação provenientes de PZQ contidos em
nanopartículas de PMMA e se essas moléculas possuem atividade anti-helmíntica.
Não foi observada diferença estatística significativa no tempo em que a concentração
máxima de PZQ é atingida (Tmáx) entre os grupos, sugerindo que o nanosistema estudado não
possui efeito de liberação retardada. Resultado semelhante foi encontrado por Xie e
65
colaboradores (2011) para nanopartículas sólidas lipídicas contendo PZQ. Ao contrário,
Zhang e colaboradores (2014) demonstraram que nanosuspensões lipídicas aumentaram
significativamente o T máx do fármaco carreado. Novamente ressalta-se a importância das
características químicas e físicas do material utilizado como matriz para a nanopartícula no
processo de absorção do fármaco, uma vez que os nanosistemas do presente estudo são
diferentes dos utilizados pelos autores supra citados.
O tempo de meia-vida de eliminação (T1/2β) do PZQ livre foi aproximadamente 10
vezes menor do que o encontrado por Xie e colaboradores (2011). Esses autores, no entanto,
realizaram o estudo em cães, e foram administrados PZQ, por via subcutânea, na dose de
5mg/kg. Isto demonstra que a cinética do PZQ pode variar consideravelmente de acordo com
as espécies utilizadas.
Os resultados obtidos para a taxa de eliminação (Ke) sugerem que não há saturação do
processo de eliminação, pois embora a ASC0-∞ do grupo PZQ-NP tenha sido
aproximadamente três vezes maior, Ke foi semelhante entre os grupos.
Os valores obtidos para o Clearance (Cl) e Volume de distribuição (Vd) foram
desconsiderados, pois o software empregado para calcular esses parâmetros considera que Cl
é o quociente entre a quantidade de fármaco administrada e a ASC0-∞, ou seja, para determinar
esse parâmetro, considera que a dose administrada é totalmente absorvida, o que não é
verdade para uma administração extravascular. Como o Vd é uma função do Cl (Vd = Cl x
Ke), a precisão de um resulta na imprecisão do outro. Logo, ambos foram descartados.
66
7. CONCLUSÃO
Os resultados obtidos no presente estudo sugerem qua a baixa concentração plasmática
de PZQ no grupo tratado com nanopartículas de PMMA pode ser tanto devido a incompleta
liberação do PZQ da matriz polimérica in vivo como por menor taxa de internalização das
nanopartículas pelas células do trato gastrointestinal. Em ambos os casos, são necessários
mais estudos para a compreensão do comportamento destas nanopartículas no organismo e
dos mecanismos envolvidos na absorção do PZQ carreado por esse sistema para que o
processo de desenvolvimento desse nanossistema seja aprimorado. Paralelamente, ensaios
devem ser realizados a fim de avaliar se PZQ administrado em PMMA-NP atinge a faixa
terapêutica e se é eficaz no tratamento da esquistossomose.
67
8. REFEÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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74
ANEXOS E APÊNDICES
75
ANEXO I: Certificado Padrão de Referência do Praziquantel – USP
76
77
ANEXO II: Certificado Padrão de Referência do Diazepam – INCQS
78
79
ANEXO III: Parecer consubstanciado do CEUA – UFF
80
APÊNCIDE I: Espectro de Massas do íon precursor do analito
2.1
e7 Intensity, cps
m/z
, D
a
31
3.2
31
4.0
81
APÊNCIDE II: Espectro de Massas do íon produto do analito
1.8
e7 Intensity, cps
m/z
, D
a
85.1
55
.0
203.1
17
4.1
17
5.2
13
2.1
81
.083
.1
57.0
82
AÊNCIDE III: Espectro de Massas do íon precursor do padrão interno
83
APÊNCIDE IV: Espectro de Massas do íon precursor do padrão interno
1.4
e 6
Intensity, cps
m/z
, D
a
89
.01
65
.0
16
2.0
152.0
91
.0
15
4.0
167.1
193.0
![Pharmacokinetic Comparison of Seven Major Bio-Active ... · Pharmacokinetic studieson these components havebeen partly demonstrated [4–6]. However, there arefew reports about the](https://img.pdfslide.tips/doc/110x75/5fd8e9f938a2704453267115/pharmacokinetic-comparison-of-seven-major-bio-active-pharmacokinetic-studieson.jpg)
