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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIA ANIMAL
SIMONE REGINA BARROS DE MACÊDO
AVALIAÇÃO DO EFEITO ESTERILIZANTE DE SOLUÇÃO À BASE DE
GLUCONATO DE ZINCO EM TESTÍCULOS DE RATOS WISTAR
EM ASSOCIAÇÃO COM ANTI-INFLAMATÓRIOS E ANTIÁLGICO
RECIFE
2013
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIENCIA ANIMAL
SIMONE REGINA BARROS DE MACÊDO
AVALIAÇÃO DO EFEITO ESTERILIZANTE DE SOLUÇÃO À BASE DE
GLUCONATO DE ZINCO EM TESTÍCULOS DE RATOS WISTAR
EM ASSOCIAÇÃO COM ANTI-INFLAMATÓRIOS E ANTIÁLGICO
RECIFE
2013
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Biociência Animal: Área de Concentração em Morfofisiologia,
da Universidade Federal Rural de Pernambuco, como requisito
para a obtenção do grau de Mestre em Biociência Animal.
Orientador: Prof. Dr. Valdemiro Amaro da Silva Junior
Dedico esta conquista a Deus.
“O segredo do êxito não é encontrado nem em nossa
erudição, nem em nossa posição, nem em nosso número
ou nos talentos a nós confiados, nem na vontade do
homem. Cônscios de nossa deficiência devemos
contemplar a Cristo, e por Ele que é a força por
excelência, a expressão máxima do pensamento, o
voluntário e obediente obterá uma vitória após outra. ”
(Ellen White)
AGRADECIMENTOS
A Deus pela presença constante em minha vida. Obrigada por ser a minha rocha, a
minha cidadela, o meu libertador, o meu Deus, o meu rochedo em que me refugio, o meu
escudo, a força da minha salvação, o meu baluarte e por tornar possível diversas conquistas,
inclusive esta e, por guiar todos os meus passos e iluminar meu caminho.
Aos meus pais, Rivaldo Macêdo e Josefa Macêdo, pelo amor incondicional, pelo
exemplo de força, determinação, humildade e caráter. Obrigada pela dedicação e pela forma
como me ensinaram a superar as adversidades da vida.
Agradeço a minha irmã, Patrícia Macêdo, pelo apoio, companheirismo, aprendizado
constante e por acreditar em mim.
A toda minha família pelo amor, incentivo e por confiar em mim.
Ao meu orientador Prof. Valdemiro Amaro da Silva Junior pela confiança, por
acreditar na minha capacidade, pelo exemplo de profissionalismo, pelos preciosos
ensinamentos, pela orientação competente e por todas as contribuições ao longo do trabalho.
Aos meus amigos Sandra Maria e Luiz André pelo grande exemplo de amizade,
simpatia e prestatividade, pela companhia e dedicação em todas as fases desta pesquisa.
Aos meus amigos Cássia Regina e Vínícius Vasconcelos, os quais se disponibilizaram
a me ensinar e ajudar durante as realizações dos experimentos. Obrigada vocês foram
fundamentais para que este trabalho se concretizasse.
As minhas amigas Goretti Varejão e Géssica Silva pelo exemplo de superação,
coragem e determinação. Eulina Nery e Marília Bonelli pelo apoio, amizade e pelas
constantes demonstrações de sabedoria.
A todos os amigos do mestrado da Biociência Animal, por compartilharmos esse
momento especial de nossas vidas.
Ao professor Frederico Celso Lyra Maia, pelo incentivo e orientação nos experimentos
de análise histológica, pelo exemplo de profissionalismo, pelos ensinamentos e lições.
Aos demais professores do Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal por
terem contribuído para minha formação.
Ao funcionário do Biotério do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal da
Universidade Federal Rural de Pernambuco, André, pelo apoio durante o experimento.
Agradeço ainda, a todos com quem tive a oportunidade de conviver nestes últimos
anos e que contribuíram para que eu chegasse até aqui. Muito obrigada por tudo.
RESUMO
A esterilização química constitui uma alternativa eficiente, de baixo custo e adequada para
programas de esterilização em grande escala de animais domésticos. Acredita-se que a injeção
intratesticular da solução à base de zinco promove uma reação inflamatória e, esta reação
pode comprometer a espermatogênese, levando o animal à esterilidade. Em virtude de essa
reação inflamatória gerar desconforto aos animais, preconiza-se o uso de analgésicos e anti-
inflamatórios para minimizar efeitos colaterais indesejáveis. Contudo, a utilização desses
fármacos poderia inibir o efeito desejado do agente esterilizante. Portanto, o presente trabalho
teve por objetivo investigar se a administração de anti-inflamatórios esteroidais, não-
esteroidais inibem o efeito esterilizante da solução à base de gluconato de zinco sobre a
função testicular de ratos Wistar. Para tanto, 72 animais com 90 dias de idade foram mantidos
em condições de biotério no Departamento de Morfologia e Fisiologia da Universidade
Federal Rural de Pernambuco. Esses animais foram divididos em seis grupos experimentais:
controle/ solução salina (G1); controle/ DMSO + dipirona sódica (G2); dipirona sódica (G3);
Celecoxibe + dipirona sódica (G4); meloxicam + dipirona sódica + (G5); dexametasona +
dipirona sódica + (G6). Os animais foram anestesiados e submetidos à injeção intratesticular
de solução à base de gluconato de zinco (Infertile®). Os tratamentos com anti-inflamatórios e
antiálgico foram realizados através de uma dose única por dia, durante 7 dias consecutivos.
Após 7, 15 e 30 dias os animais foram heparinizados, anestesiados e perfundidos, sendo
coletados testículos e epidídimos para análise qualitativa das lesões e plasma sanguíneo para
dosagem de testosterona utilizando o método de ensaio imunoenzimático (ELISA). Com
relação às lesões histopatológicas, as mais frequentes nos testículos foram à presença de
processo inflamatório, necrose tubular, calcificação distrófica, congestão, degeneração tubular
e edema subcapsular e nos epidídimos atrofia de ducto, deposição de colágeno,
neovascularização e infiltrado inflamatório. Quanto aos animais que foram submetidos à
injeção intratesticular de gluconato de zinco, constatou-se redução média de 74, 66 e 53 %
dos níveis de testosterona nos respectivos períodos experimentais 7, 15 e 30 dias. Neste
sentido, Constatou-se que a injeção intratesticular de Infertile® foi eficiente em promover
esterilização mesmo após utilização de terapia anti-inflamatória. Assim anti-inflamatórios
esteroidais e não-esteroidais administrados, neste experimento, durante 7 dias pós-infiltração
testicular podem ser utilizados no protocolo de esterilização química para reduzir os efeitos
álgicos nos animais infiltrados. Contudo, o efeito anti-inflamatório da dexametasona interferiu
na ação desejada do Infertile® nos 15 primeiros dias. As associações meloxicam/dipirona ou
celecoxibe/dipirona podem ser a terapia antiálgica e anti-inflamatória de eleição dentre os
protocolos de esterilização química estudados.
Palavras-chave: Esterilização química. Espermatogênese. Degeneração testicular. Inflamação.
ABSTRACT
Chemical sterilization is an efficient, inexpensive and suitable for sterilization programs on a
large scale domestic animals. It is believed that the injection of intratesticular zinc-based
solution promotes an inflammatory reaction, and this reaction may affect spermatogenesis,
taking the animal sterility. By virtue of this inflammatory reaction cause discomfort to
animals, it is recommended the use of analgesics and anti-inflammatories to minimize
undesirable side effects. However, the use of these drugs may inhibit the desired sterilizing
agent. Therefore, the present study aimed to investigate whether the administration of anti-
inflammatory steroidal, non-steroidal inhibit the effect of sterilizing solution based zinc
gluconate on testicular function of rats. Therefore, 72 animals at 90 days of age were kept in
vivarium conditions at Department of Morphology and Physiology, Federal Rural University
of Pernambuco. These animals were divided into six groups: control / saline (G1), control /
DMSO + dipyrone (G2), dipyrone (G3); Celecoxib + dipyrone (G4), dipyrone, meloxicam +
+ (G5); dipyrone + dexamethasone + (G6). The animals were anesthetized and injected
intratesticular solution based on zinc gluconate (Infertile®). Treatment with anti-
inflammatories and anti pain were conducted using a single dose per day for 7 consecutive
days. After 7, 15 and 30 days the animals were heparinized, anesthetized and perfused testis
and epididymis were collected for qualitative analysis of the lesions and blood plasma for
testosterone measurement using the method of enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).
Regarding the histopathological lesions, the most frequent in the testes were the presence of
inflammation, tubular necrosis, dystrophic calcification, congestion, edema and subcapsular
tubular degeneration and atrophy of the epididymis duct, collagen deposition, and
neovascularization and inflammatory infiltrate. As for the animals that underwent
intratesticular injection of zinc gluconate, we found an average reduction of 74, 66 and 53%
of testosterone levels in the respective experimental periods 7, 15 and 30 days. In this sense,
found that intratesticular injection of Infertile® was effective on sterilization even after use of
anti-inflammatory therapy. Thus anti-inflammatory steroidal and non-steroidal administered
in this experiment for 7 days post-testicular infiltration can be used in chemical sterilization
protocol to reduce nociceptive effects in animals infiltrate. However, the anti-inflammatory
effect of dexamethasone interfered in action desired Infertile® in the first 15 days.
Associations meloxicam / dipyrone and celecoxib / dipyrone may be therapy and anti-
inflammatory analgesic of choice among the studied chemical sterilization protocols.
Keywords: Chemical sterilization. Spermatogenesis. Testicular degeneration. Inflammation.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Peso testicular (g) de ratos Wistar submetidos à injeção intratesticular
de solução à base de gluconato de zinco e tratados com anti-
inflamatórios avaliados com 7, 15 e 30 dias (Média ± desvio padrão). 30
Figura 2 Peso epididimário (g) de ratos Wistar submetidos à injeção
intratesticular de solução à base gluconato de zinco e tratados com
anti-inflamatórios avaliados com 7, 15 e 30 após o tratamento (Média
± desvio padrão) .......................................................................... 31
Figura 3 Peso da próstata (g) de ratos Wistar submetidos à injeção
intratesticular de solução à base de gluconato de zinco e tratados com
anti-inflamatórios avaliados com 7, 15 e 30 dias após o tratamento
(Média ± desvio padrão)................................................................. 33
Figura 4 Peso da glândula seminal (g) de ratos Wistar submetidos à injeção
intratesticular de solução à base de gluconato de zinco e tratados com
anti-inflamatórios avaliados com 7, 15 e 30 dias após o tratamento
(Média ± desvio padrão).................................................................. 34
Figura 5 Dosagem de testosterona plasmática (ng/mL) de ratos Wistar
submetidos à injeção intratesticular de solução à base de zinco e
tratados com anti-inflamatórios avaliados com 7, 15 e 30 dias após o
tratamento (Média ± desvio padrão) ............................................. 35
LISTA DE QUADRO
Quadro 1 Disposição dos grupos experimentais por tratamento, número de animais
e dias de coleta................................................................................. 25
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Volume da solução à base de gluconato de zinco (Infertile®) injetado
nos testículos de ratos Wistar segundo o diâmetro testicular. 26
Tabela 2 Peso testicular (g) de ratos Wistar submetidos à injeção
intratesticular de solução à base gluconato de zinco, tratados com
anti-inflamatórios e avaliados com 7, 15 e 30 após o tratamento
(Média ± desvio padrão).......................................................................
29
Tabela 3 Peso epididimário (g) de ratos Wistar submetidos à injeção
intratesticular de solução à base de gluconato de zinco e tratados com
anti-inflamatórios avaliados com 7, 15 e 30 após o tratamento (Média
± desvio padrão).......................................................................... 31
Tabela 4 Peso da próstata (g) de ratos Wistar submetidos à injeção
intratesticular de solução à base de gluconato de zinco e tratados com
anti-inflamatórios avaliados com 7, 15 e 30 dias após o tratamento
(Média ± desvio padrão)............................................................... 33
Tabela 5 Peso da glândula seminal (g) de ratos Wistar submetidos à injeção
intratesticular de solução à base de gluconato de zinco e tratados com
anti-inflamatórios avaliados com 7, 15 e 30 dias após o tratamento
(Média ± desvio padrão)............................................................... 33
Tabela 6 Dosagem de testosterona plasmática (ng/mL) de ratos Wistar
submetidos à injeção intratesticular de solução à base de gluconato
de zinco e tratados com anti-inflamatórios avaliados com 7, 15 e 30
dias após o tratamento (Média ± desvio padrão).................................. 34
Tabela 7 histopatológicas de testículos de ratos Wistar adultos avaliados aos 7
dias após injeção intratesticular com infertile®
em associação com
anti-inflamatórios........................................................................ 39
Tabela 8 histopatológicas de testículos de ratos Wistar adultos avaliados aos
15 dias após injeção intratesticular com infertile®
em associação com
anti-inflamatórios................................................................. 42
Tabela 9 Lesões histopatológicas de testículos de ratos Wistar adultos
avaliados aos 30 dias após injeção intratesticular com infertile® em
associação com anti-inflamatórios................................................ 45
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
AINES Anti-inflamatórios Não- Esteroidais
COX-1 Cicloxigenase tipo 1
COX-2 Cicloxigenase tipo 1
DMSO Dimetil sufóxido
DNA Ácido Desoxirribonucleico
DTH Diidrotestosterona
ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
FSH Hormônio Folículo Estimulante
G6P Glicose 6- Fosfato
G6PD Glicose 6- Fostato desidrogenase
GLC Globulina ligadora de corticosteroide
GnRH Hormônio liberador de gonadotrofinas
HRP Testosterone- horseradish Peroxidase
LH Hormônio Luteinizante
LIKA Laboratório de Imunopatologia Keiso Asami
NADPH Fosfato de Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo
P Nível de significância estatístico
PG Prostaglandinas
pH Potencial Hidrogênio iônico
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................. 13
2 REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................... 14
2.1 ESTRUTURA E FUNCIONAMENTO DO TESTÍCULO E
ESPERMATOGÊNESE .....................................................................................
14
2.2 EPIDÍDIMO ....................................................................................................... 16
2.3 CONTROLE DA FERTILIDADE DO MACHO ............................................. 16
2.3.1 Esterilização cirúrgica ......................................................................................... 17
2.3.2.1 Orquiectomia ....................................................................................................... 17
2.3.2.2 Vasectomia .......................................................................................................... 17
2.4 ESTERELIZAÇÃO QUÍMICA ......................................................................... 18
2.4.1 Agentes esclerosantes .......................................................................................... 18
2.4.1 Efeitos do zinco na reprodução do macho ........................................................... 18
2.4 REAÇÃO INFLAMATÓRIA ............................................................................ 19
2.5 ANTI-INFLAMATÓRIOS ................................................................................. 20
2.5.1 Anti-inflamatórios não-esteroidais ...................................................................... 20
2.5.1.1 Meloxicam ........................................................................................................... 20
2.5.2.2 Celacoxibe ........................................................................................................... 21
2.6.2 Anti-inflamatórios esteroidais – glicocorticosteroídes......................................... 21
2.6.2.1 Dexametasona ...................................................................................................... 22
2.7 DIMETIL SULFÓXIDO...................................................................................... 22
2.8 ANALGÉSICO NÃO OPIÓIDE ........................................................................ 23
2.8.1 DIPIRONA SÓDICA.......................................................................................... 23
3 OBJETIVOS ...................................................................................................... 24
3.1 GERAL ................................................................................................................ 24
3.2 ESPECÍFICOS .................................................................................................... 24
4 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 25
4.1 ANIMAIS ............................................................................................................ 25
4.2 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS .......................................................... 25
4.3 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA .............................................................. 25
4.4 DOSAGEM DE TESTOSTERONA PLASMÁTICA ........................................ 27
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................. 27
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................... 28
4.1 ACHADOS HISTOPATOLÓGICOS TESTICULARES .................................. 37
4.1.1 Achados histopatológicos aos sete dias ............................................................... 37
4.1.2 Achados histopatológicos aos quinze dias ........................................................... 40
4.1.3 Achados histopatológicos aos trinta dias ............................................................. 43
4.2 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA EPIDIDIMÁRIA ................................. 46
5 CONCLUSÕES ................................................................................................. 48
REFERÊNCIAS ............................................................................................... 49
APÊNDICES ...................................................................................................... 58
13
1 INTRODUÇÃO
A superpopulação de cães e gatos indesejados constitui um sério problema em diversas
cidades do mundo. Além de estarem sujeitos ao sofrimento, os animais podem ser
reservatórios de doenças transmissíveis ao homem e às espécies domésticas valiosas
economicamente (MAY, 1988) tornando-se um problema de saúde pública e de bem estar
animal (LENEY e REMFRY, 2001). Desta forma, o desenvolvimento de sistemas de
contenção de natalidade baseados no controle da reprodução tornam-se necessários (LOPEZ
et al., 2005), sendo a esterilização um método reconhecidamente eficaz para o controle de
populações animais (JANA e SAMANTHA, 2011).
A esterilização química é um método não cirúrgico de contracepção em animais do
sexo masculino, em que agentes químicos injetados nos ductos deferentes, nos epidídimos,
nos testículos causam infertilidade por indução de azoospermia, e têm sido proposta como
alternativa de baixo custo e adequada para grande escala de programas de esterilização tanto
em animais domésticos como selvagens (KUTZLER e WOOD, 2006).
Uma variedade de agentes químicos tem sido utilizada em cães com a finalidade de
promover a esterilização dos animais, porém, em ratos, dor e pirexia têm sido descritos
(LORENA et al., 2009). Dentre os agentes químicos utilizados, a esterilização com a
utilização de gluconato de zinco tem se mostrado um procedimento eficaz e seguro,
principalmente para animais jovens (BOWEN, 2008).
A exposição a altas concentrações de zinco no parênquima testicular promove
aumento dos leucócitos polimorfonucleares, macrófagos e linfócitos (TOXICOLOGICAL...,
Atlanta-EUA, 2005). Acredita-se que a injeção intratesticular da solução à base de zinco
resulte em uma alteração semelhante à observada na orquite autoimune, na qual o processo
inflamatório testicular produz anticorpos contra os próprios antígenos testiculares do
indivíduo e ocorre lesão no epitélio germinativo com consequente destruição dos
espermatócitos, espermátides e espermatozoides, o que resulta na esterilidade do animal
(MANN e LUTWAK-MANN, 1981). Em virtude dessa reação inflamatória, faz-se necessário
o uso de analgésicos e anti-inflamatórios para minimizar o desconforto dos animais após a
aplicação deste tratamento. O que nos leva a seguinte pergunta: a utilização dessas drogas
poderia interferir no mecanismo produzido pelo gluconato de zinco?
Dessa forma, o objetivo do presente trabalho foi verificar se a administração de anti-
inflamatórios esteroidais e não-esteroidais inibe o efeito esclerosante da solução à base de
gluconato de zinco sobre a função testicular de ratos Wistar.
14
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 ESTRUTURA E FUNCIONAMENTO DO TESTÍCULO E ESPERMATOGÊNESE
O testículo possui duas funções: a exócrina – relativa à espermatogênese – e a
endócrina – que se ocupa da produção hormonal responsável pela diferenciação sexual, pelas
características sexuais secundárias e pela libido (VARNER e JOHNSON, 2007).
A organização estrutural do testículo é composta pelo parênquima, envolto por uma
espessa cápsula composta de colágeno e fibras elásticas, células mioides e uma rede de vasos
sanguíneos, a túnica albugínea que se infiltra separando o órgão em diferentes lóbulos. O
parênquima testicular ocupa entre 80 e 90% da massa testicular total. Os túbulos seminíferos
representam aproximadamente 70% do parênquima. A porção intertubular é composta por
células de Leydig, vasos linfáticos e sanguíneos, tecido conjuntivo, fibroblastos, linfócitos e
mastócitos, (COSTA e PAULA, 2003).
O escroto penduloso aumenta a área de superfície que facilita a exposição do cone
vascular ao meio ambiente e permite que os testículos fiquem distantes do corpo do animal
(BLANCHARD et al., 1992). Fatores hormonais que estimulam e modulam a
espermatogênese se fazem necessários, particularmente para o testículo com localização
extra-abdominal, o controle da temperatura entre 2 e 6°C abaixo da temperatura corporal
(WAITES e SETCHELL, 1990; KASTELIC et al., 1995). A termorregulação testículo-
escrotal é um fenômeno complexo em que numerosos mecanismos locais desempenham papel
fundamental. O cone vascular, formado pelas veias do plexo pampiniforme circundando a
artéria testicular, permite a troca contracorrente de calor, a regulação do fluxo sanguíneo e a
perda de calor por irradiação (BARTH, 1993).
A espermatogênese é um processo cíclico extremamente organizado e complexo,
dependente de mecanismos que compreendem o código genético das células germinativas e
uma rede de comunicação entre essas células e as células somáticas que estão presentes no
testículo (VERHOEVEN et al., 2007). Esse processo é regulado por uma complexa e
interligada rede de interação endócrina, parácrina e autócrina entre diversos tipos celulares
(ROSER, 2008).
A espermatogênese no rato tem duração de 58 dias (FRANÇA et al., 1998, 2005).
A espermatogênese pode ser subdividida em três fases essenciais: (a) Fase proliferativa ou
espermatogonial, caracterizada por sucessivas divisões mitóticas das espermatogônias; (b)
15
fase meiótica ou espermatocitogênica, onde ocorre a duplicação do DNA, a recombinação
gênica e duas divisões que resultam na formação de células haploides denominadas
espermátides; (c) fase de diferenciação ou espermiogênica, na qual as espermátides sofrem
várias alterações morfofisiológicas, tais como a formação do acrossoma, do flagelo e
condensação nuclear, resultando na formação do espermatozóide (SHARPE, 1994; FRANÇA
et al., 2005).
As células de Sertoli estão localizadas nos túbulos seminíferos e possuem papel
fundamental na espermatogênese. Essas células formam barreiras denominadas junções de
oclusão, constituídas por desmossomos, junções do tipo “gap” e junções à base de actina (LUI
e CHENG, 2007). A junção de oclusão, também denominada barreira hematotesticular, divide
o epitélio seminífero em duas regiões distintas: o compartimento basal, onde se encontram as
espermatogônias e os espermatócitos primários na fase inicial da prófase meiótica e outro
denominado compartimento adlumial, onde se encontram os espermatócitos primários a partir
da fase de zigóteno, espermatócitos secundários e espermátides. As células de Sertoli também
são responsáveis pela sustentação e nutrição das células germinativas, mediação do hormônio
folículo estimulante (FSH) e da testosterona na espermatogênese. As células de Sertoli têm
participação ativa no fornecimento de nutrientes, no processo de espermiação (liberação das
espermátides para o lúmen tubular), na fagocitose dos corpos residuais (excesso de citoplasma
das células germinativas) e das células germinativas que sofrem apoptose (RUSSEL et al.,
1990).
As células de Leydig também possuem papel fundamental para a espermatogênese.
Localizadas no compartimento intertubular, elas possuem como principal função a produção
de andrógenos (VERHOEVEN et al., 2007) mediada por estímulos de LH (hormônio
luteinizante) e controlada através de um processo de retroalimentação negativa realizada pela
testosterona na adenohipófise e no hipotálamo (ROSER, 2008). Nas células de Sertoli, células
mioides, células musculares lisas dos vasos e nas próprias células de Leydig existem
receptores para andrógenos. Um dos principais andrógenos produzidos pelo organismo é a
testosterona, que também é responsável pela diferenciação do trato genital masculino e da
genitália externa na fase fetal, aparecimento dos caracteres sexuais secundários, manutenção
quantitativa da espermatogênese a partir da puberdade e manutenção funcional das glândulas
sexuais acessórias e do epidídimo (LUKE e COFFEY, 1994; SHARPE, 1994; ROSER, 2008).
Além destas células, também estão presentes no testículo outras células somáticas, tais como
as células endoteliais e os fibroblastos (FRANÇA et al., 2005).
Medidas testiculares estão associadas com produção espermática diária (OSINOWO
16
et al., 1992; SOUZA e COSTA, 1992), número de espermátides por células de Sertoli e área
dos túbulos seminíferos, além de apresentarem relação inversa com a taxa de degeneração de
células germinativas em touros (BERNDTSON et al., 1987; PALASZ et al., 1994; MOURA e
ERICKSON, 1997;). Assim, a diminuição na consistência do parênquima testicular está
associada à redução na produção de espermatozoides (COULTER e FOOTE, 1979) e aumento
do número de espermatócitos e espermátides degeneradas em todos os estágios do ciclo da
espermatogênese em touros (MULLER et al., 1992).
2.2 EPIDÍDIMO
Os epidídimos situam-se ao longo da porção lateral da face posterior dos testículos.
Estão envolvidos pela túnica albugínea e pela túnica vaginal. Morfologicamente, o órgão é
dividido em três regiões: cabeça, corpo e cauda (TURNER, 2003). A cabeça é a porção onde
os ductos eferentes fundem-se no ducto epididimário, e a cauda comporta a região mais distal
do ducto.
O epitélio do ducto epididimário é pseudoestratificado colunar, composto de células
basais arredondadas e colunares com estereocílios (JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2004).
Essas células exercem várias funções importantes que são necessárias para a função do
epidídimo como secreção de proteínas e absorção, endocitose, atividades secretoras de fluidos
responsáveis pela acidificação do lúmen, defesa imunológica, fagocitose e produção de
antioxidantes (COOPER, 1999; HERMO, 2002),
Além das células colunares com estereocílios e das células basais do epitélio
pseudoestratificado, é comum a presença de linfócito (HERMO 2002). As múltiplas funções
exercidas pelas células que revestem o epitélio do ducto, o epidídimo fornece um
microambiente altamente especializado responsável pelo transporte do espermatozoide,
maturação e armazenamento (FRANÇA et al., 2005).
2. 3 CONTROLE DA FERTILIDADE DO MACHO
As ações para o controle reprodutivo no macho são basicamente: esterilização
cirúrgica (orquiectomia e vasectomia), terapia medicamentosa realizada com auxílio de
hormônios esteroides (andrógenos, progestágenos, antiandrógenos) e agonistas do hormônio
liberador de gonadotrofinas (GnRH) (JOHNSTON et al., 2001), utilização de agentes
esclerosantes no testículo ou epidídimo, tais como, glicerol (IMMEGART e THRELFALL,
17
2000), tanato de zinco, gluconato de zinco (FAHIM et al., 1993), clorexidina, dimetil-
sulfóxido (PINEDA et al., 1977; PINEDA e DOOLEY, 1984) e ácido lático (NISHIMURA et
al., 1992). PURSWANI e TALWAR (2011) também descrevem como um método de
esterilização de numerosas espécies animais o uso de vacinas contra o hormônio liberador de
gonadotrofinas (GnRH).
2. 3.1 Esterelização cirúrgica
2.3.1.1 Orquiectomia
A orquiectomia é uma técnica clássica para a esteriliuzação masculina cujas indicações
incluem: a diminuição da superpopulação animal, a eliminação ou diminuição significativa de
muitos comportamentos censuráveis, tais como, a, a marcação territorial pela micção, monta e
agressividade (JOHNSTON et al., 2001; HEDLUND, 2007; BOWEN, 2008). Além de
preventiva, a orquiectomia é utilizada para o tratamento de patologias reprodutivas, como
neoplasias testiculares e escrotais, orquites, doenças prostáticas, trauma ou abscessos e
controle de alterações endócrinas (BLOOMBERG, 1996; CRANE, 1996; HOWE, 2006;
HEDLUND, 2007). Complicações na orquiectomia incluem inchaço, hemorragias e infecção
(BOOTHE, 2003).
2.3.1.2 Vasectomia
A vasectomia é um método simples e eficaz de contracepção, o qual consiste na
interrupção dos ductos deferentes e neste não ocorre alteração da estética testicular e nem a
ausência de produção de testosterona, pois os testículos se mantêm intactos (HOWE, 2006).
Os testículos continuam a produzir espematozóides, mas esses são absorvidos pelo organismo
(HOWE, 2006; HEALTHWISE, 2008). Porém, os comportamentos indesejados de macho
como demarcação pela urina, monta e agressividade permanecem, uma vez que a
esteroidogênese não é afetada (JOHNSTON et al., 2001).
18
2.4 ESTERILIZAÇÃO QUÍMICA
2.4.1 Agentes esclerosantes
Tratamentos intratesticulares com compostos químicos que causam degeneração
testicular e interrupção da espermatogênese têm sido utilizados como alternativa para a
orquiectomia. Quando injetados no parênquima testicular, esses agentes levam à atrofia
testicular e ao decréscimo da espermatogênese e da concentração de andrógenos. Isso faz com
que as alterações andrógeno-depedentes, tais como, doenças da próstata e alterações de
comportamento como demarcação pela urina, monta e agressividade diminuam (LEVY,
2008).
A aplicação desses agentes no testículo induz uma resposta sistêmica imune,
provocando não só uma ruptura da barreira de células de Sertoli como também inflamação
local com liberação de antígenos testiculares (JOHNSTON et al., 2001). Em contrapartida,
quando esses agentes são injetados no ducto deferente ou epidídimo induzem uma oclusão
fibrosa e subsequente azoospermia (PINEDA et al., 1977;. PINEDA e DOOLEY, 1984,.
FAHIM et al., 1993) . Contudo, há a possibilidade de surgimento de alterações andrógeno-
dependentes (BLOOMBERG, 1996).
2.4.1.1Efeitos do zinco na reprodução do macho
Nas células de mamíferos, o zinco é o segundo elemento de transição mais abundante ,
depois do ferro (SALGUEIRO et al., 2000; YU et al., 2007) sendo responsável por modular a
função de diversas proteínas regulatórias associadas a uma variedade de atividades celulares
(EOM et al., 2001), além de ser essencial para o crescimento, desenvolvimento, função
imunológica e reprodução (SUSKIND, 2009). Por sua vez, na esfera reprodutiva, as células
estão em rápido processo de divisão, crescimento ou síntese sendo particularmente afetadas
pela deficiência desse elemento (MERRELLS et al., 2009).
O papel do zinco na função testicular é promover a maturação das células
germinativas e prolongar a vida dos espermatozoides até o momento da ejaculação
(MERELLS et al., 2009). A importância desse elemento nos testículos é demonstrada pelas
graves consequências de sua deficiência no desenvolvimento desse testicular (MERELLS et
19
al., 2009), podendo afetar diretamente a função gonadal e a esteroidogênese (MARET e
SANDTEAD, 2006).
No epidídimo, níveis elevados de zinco são responsáveis pela estabilização das
membranas plasmáticas de suas células e pela manutenção dos espermatozoides em um estado
metabolicamente quiescente durante o armazenamento e a ejaculação (BEDWAL e
BAHUGUNA, 1994).
No entanto, seu excesso pode causar danos severos ao sistema reprodutor conforme
verificado em ratos que ingeriram grandes quantidades de zinco com dose de até 100 vezes
recomendada (5mg/dia) por um mês tornaram-se inférteis (UNITED STATES PUBLIC
HEALTH SERVICE, 1987).
Por mais de cinco décadas vêm sendo testadas injeções intratesticulares no intuito de
inibir a formação, produção e maturação de espermatozoides (KUTZLER e WOOD, 2006;
NAZ e TALWAR, 1981). Esse processo envolve a injeção de zinco, em quantidade pré-
determinada com base no diâmetro do testículo. O zinco é considerado não mutagênico, não
cancerígeno e não teratogênico (KUTZLER e WOOD, 2006; LEVY et al., 2008).
Recentemente foi lançado no Brasil o Infertile (Rhobifarma Indústria Farmacêutica Ltda.), um
esterilizante injetável que combina dimetil sulfóxido (DMSO) com gluconato de zinco
(26,2mg/mL) neutralizado pela arginina para castração de cães (GRIFFIN, 2012).
2.5 REAÇÃO INFLAMATÓRIA
Os processos inflamatórios que acometem os testículos podem reduzir ou inibir a
espermatogênese por um tempo prolongado ou para sempre. A inflamação pode ter origem
traumática ou infecciosa e ocorrer por via hematógena, retrógrada do duto deferente ou
epidídimo ou ainda por via direta através da pele (BALL et al., 1983).
A atrofia testicular pode ocorrer como sequela a qualquer inflamação aguda ou crônica
As alterações atróficas a uma orquite em processo de resolução consistem em áreas
irregulares ou difusas de fibrose, em substituição as áreas necrosadas do epitélio tubular e do
estroma (JONES, 2000).
A utilização de agentes esclerosantes no parênquima testicular, leva à atrofia testicular
e ao decréscimo da espermatogênese. A aplicação dessa droga no testículo leva a uma
resposta do sistema imune devido à ruptura da barreira de células de Sertoli, além de
inflamação local com liberação de antígenos testiculares (JOHNSTON et al., 2001). Essa
alteração assemelha-se à orquite autoimune, processo inflamatório testicular mediado por
20
formação de anticorpos, contra os próprios antígenos testiculares do indivíduo, causando
lesões no epitélio germinativo (OLIVEIRA, 1999).
2.6 ANTI-INFLAMATÓRIOS
2.6.1 Anti-inflamatórios não-esteroidais
Os anti-inflamatórios não-esteroidais (AINES) constituem um grupo heterogêneo de
substâncias, que em geral não estão relacionados quimicamente, e que apesar disso, têm em
comum certas ações terapêuticas, como atividade antipirética, analgésica e anti-inflamatória.
Isso porque atuam inibindo a biossíntese das prostaglandinas, agem diretamente na inibição
de enzimas da via cicloxigenase, mas não na via lipoxigenase. Comumente, essas substâncias
apresentam propriedades ácidas com valores de pKa entre 4 e 5 (HARVEY et al., 2001).
2.6.1.1. Meloxicam
O meloxicam é uma enolcarboxinamida relacionada com o piroxicam. Esse
medicamento inibe preferencialmente a cicloxigenase-2 (COX-2) em comparação com a
cicloxigenase-1 (COX-1). O meloxicam não é tão seletivo quanto os outros coxibes, e pode
ser considerado “preferencialmente” mais seletivo, a “altamente seletivo” (FURST e
MUNSTER, 2007). Baseando-se em estudos in vitro em seres humanos, sua seletividade
sobre a COX-2 foi somente cerca de 10 vezes maior do que a da COX-1, apresentando ainda
inibição de COX-1 (CARVALHO, 2006).
Esse fármaco é popular em vários países do mundo, inclusive na Europa para o
tratamento da maioria das doenças reumáticas. Os inibidores seletivos da COX-2 apresentam
efeitos analgésicos, antipiréticos e anti-inflamatórios similares aos AINES não seletivos, mas
com reduzido efeito adverso sobre o aparelho gastrointestinal (CARVALHO, 2006). Embora
se saiba que o meloxicam inibe a síntese de tromboxano A2, parece que, até mesmo em doses
supraterapêuticas, o bloqueio de tromboxano A2 não atinge níveis que resultam em
diminuição da função plaquetária in vivo (FURST E MUNSTER, 2007).
21
2.6.1.2 Celecoxibe
A descoberta de inibidores da isoforma COX-2 levou a obtenção da segunda geração
de anti-inflamatórios não esteroides, denominados coxibes. O primeiro composto a ser
aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) para uso nos Estados Unidos foi o
celecoxibe, em dezembro de 1998 (WHELTON, 2001).
O celecoxibe é um inibidor seletivo da COX-2, cerca de 10 a 20 vezes mais seletivo
para COX-2 do que para COX-1. Esse medicamento é tão efetivo quanto os outros anti-
inflamatórios. Em doses habituais, ele não interfere na agregação plaquetária. Em certas
ocasiões, interage com a varfarina conforme esperado de um fármaco metabolizado através do
citocromo P450 2C9 (FURST e MUNSTER, 2007).
Os inibidores seletivos de COX-2 foram desenvolvidos com a vantagem de inativar
especificamente a cicloxigenase induzível (COX-2) e preservar a cicloxigenase constitutiva
(COX-1). Inicialmente, os coxibes foram apresentados como anti-inflamatórios relativamente
tão eficazes quando comparado a outros AINES, e seguros no tratamento de processos
inflamatórios agudos e crônicos. No entanto, os seus efeitos tóxicos ainda não estão
totalmente documentados (SILVA et al., 2010).
2.6.2 Anti-inflamatórios esteroidais – glicocorticosteroides
Uma das mais importantes funções dos glicocorticoides é a resposta a agressões às
quais qualquer organismo vivo está exposto constantemente. Quando se administra um
glicocorticoide exógeno com intuito de obter ação anti-inflamatória e/ou imunossupressora
amplifica-se, em última análise, seus mecanismos de ação fisiológica (ANTI et al., 2008).
Os glicocorticoides previnem o início da cascata da reação inflamatória, o que levaria
à produção de certas prostaglandinas e leucotrienos, através da diminuição do ácido
araquidônico. Esse é liberado dos fosfolipídeos da membrana pela fosfolipase A2, que é
inibida por proteínas como a macrocortina e lipocortina. Essa inibição explica grande parte da
ação anti-inflamatória dos glicocorticoides, devido à importância do ácido araquidônico na
produção de mediadores humorais da inflamação (MACEDO, 2006).
A inibição da formação de leucotrienos é de suma importância, pois esses compostos
promovem quimiotaxia de neutrófilos, aderência ao local inflamatório e aumento da
permeabilidade vascular. O mecanismo dos corticoides se diferencia da ação dos anti-
22
inflamatórios não-hormonais, já que esses não interferem na produção de leucotrienos, sendo
agentes menos potentes, porque reduzem a formação apenas de prostaglandinas. A diminuição
dessas últimas é conseguida pela supressão da cicloxigenase (MACEDO, 2006).
2.6.2.1 Dexametasona
A Dexametasona, potente glicocorticoide análogo, possui baixo custo e é amplamente
utilizado, pois apresenta propriedades imunossupressoras e anti-inflamatórias (RHODUS,
2006). É um agente que pode ser administrado por diversas vias, sendo em sua maioria,
empregado pela via oral. Uma vez absorvidos, os glicocorticoides se ligam a globulina
ligadora de corticosteróide e penetram as células por difusão simples. Sua metabolização
ocorre no fígado (RANG et al., 2009).
A dexametasona possui potente ação anti-inflamatória capaz de inibir tanto os
fenômenos iniciais de inflamação quanto os tardios. A sua propriedade anti-inflamatória
parece fundamentar-se principalmente em sua capacidade de inibir a mobilização de
neutrófilos e macrófagos para a área afetada. Inibe a síntese da enzima responsável pela
formação da fibrolisina, substância que por hidrolisar a fibrina e outras proteínas, facilita a
entrada de leucócitos na área de inflamação. Induz a síntese de uma proteína inibidora da
fosfolipase A2, com consequente redução na liberação de ácido araquidônico a partir de
fosfolipídeos. Em decorrência, há diminuição na formação de prostaglandinas, leucotrienos e
tromboxanas, substâncias importantes para a quimiotaxia e para o processo inflamatório
(GROSSI et al., 2007).
2.7 DIMETIL SULFÓXIDO (DMSO)
Na Alemanha, entre os anos de 1866 e 1867, foi sintetizado o dimetil sulfóxido
(DMSO), através de um subproduto da destilação do petróleo e da degradação no
processamento da polpa da madeira, onde foi utilizado como solvente industrial na década de
quarenta e introduzida como medicinal em 1960 na concentração de 90% como veículo para
vários medicamentos (ALVES, 1997; DOMINGOS, 1999). O DMSO possui atividades anti-
inflamatórias, antimicrobianas e antifúngicas. Dentre todos os efeitos farmacológicos
conhecidos do fármaco, sob o ponto de vista terapêutico, ele possui capacidade de absorver,
penetrar ou atravessar a pele após a aplicação tópica em 5 minutos, sendo distribuído para os
23
demais tecidos decorridos 20 minutos. Ressalta-se que esse fármaco possui ainda
propriedades de carrear consigo substâncias de pequeno peso molecular (BOOTH, 1983).
2.8 ANALGÉSICO NÃO-OPIOIDE
1.8.1 Dipirona sódica
Os analgésicos não opioides têm propriedades analgésica, antitérmica e anti-
inflamatória relacionadas à inibição do sistema enzimático das COX-1 e COX-2 que
convertem o ácido araquidônico em prostaglandinas, especialmente a protaglandina-E2, e
sensibilizam os nocireceptores periféricos às ações da histamina e da bradicinina. A primeira
promove uma reação inflamatória local, e a última estimula as terminações nervosas, levando
à nocicepção. Dentre os analgésicos não opioides, sabe-se que a dipirona possui efeitos
analgésico e antitérmico, mas tem pouca eficácia como agente anti-inflamatório (GOODMAN
e GILMAN, 2007).
Estudo realizado por Paula (2010) para avaliação da dor pós-intervenção empregando
três métodos de esterilização de cães machos revelou a necessidade de analgesia após a
esterilização química com gluconato de zinco. Da mesma forma, as pesquisas conduzidas por
Tasaka ( 2000) e Imagawa (2006) verificaram que a administração de dipirona na dose de 25
mg∕kg a cada oito horas permitiu uma analgesia adequada.
24
3. OBJETIVOS
3. 1 GERAL
Avaliar o efeito da solução à base de gluconato de zinco (Infertile®
) sobre
parênquima testicular de ratos Wistar quando administrada em associação com
anti-inflamatórios e antiálgico.
3. 2 ESPECÍFICOS
Investigar os efeitos do processo inflamatório sobre a espermatogênese em ratos
submetidos à injeção intratesticular de gluconato de zinco, levando em
consideração os seguintes parâmetros:
- Histopatologia do parênquima testicular e epididimário aos 7, 15 e 30 dias
após injeção intratesticular.
- Dosagem de testosterona plasmática aos 7, 15 e 30 dias após injeção
intratesticular.
25
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 ANIMAIS
Foram utilizados 72 ratos Wistar (Rattus norvegicus, var. albinus), pertencentes ao
biotério da Área de Fisiologia do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal da
Universidade Federal Rural e Pernambuco, os quais foram mantidos na temperatura 23 1oC,
em ciclo claro-escuro de 12 horas, umidade de 55%. Água e comida foram oferecidas ad
libitum até o final do experimento.
4.2 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS
Os ratos com 90 dias de idade foram escolhidos e divididos em grupos de 12
indivíduos por amostragem não probabilística de conveniência e submetidos aos diversos
tratamentos, de acordo com os seguintes grupos experimentais: controle/ solução salina,
controle/ veículo Dimetil sufóxido (DMSO), dipirona sódica 20mg/kg; Infertile®/ celocoxibe
50mg/kg + dipirona sódica; Infertile®/ meloxicam 2mg/kg + dipirona sódica; Infertile
®/
dexametasona 2mg/kg + dipirona sódica, conforme o Quadro 1.
Quadro 1. Disposição dos grupos experimentais por tratamento, número de animais e dias de coleta.
Grupos experimentais Duração do tratamento
com anti-inflamatórios
(dias)
Dias de coleta pós-
tratamentos/número de animais
7 dias 15 dias 30 dias
(G1) Controle/ solução salina (n=12). 7 4 4 4
(G2) Controle DMSO/ dipirona (n=12). 7 4 4 4
(G3) Infertile®/ dipirona (n=12). 7 4 4 4
(G4) Infertile®/ celocoxibe, dipirona (n=12). 7 4 4 4
(G5) Infertile®/ meloxicam, dipirona (n=12). 7 4 4 4
(G6) Infertile®/ dexametasona, dipirona (n=12). 7 4 4 4
Fonte: Macêdo (2013).
Os animais foram anestesiados com quetamina (90mg/Kg) e xilazina (5mg/Kg)
intraperitonealmente. Posteriormente realizou-se antisepsia com solução de gluconato de
clorexidine a 2%. Foi utilizada seringa de insulina para injetar o volume de solução à base
gluconato de zinco em cada testículo do animal. A injeção foi realizada na região dorsocranial
do testículo, ao lado da cabeça do epidídimo (o mais próximo possível do ducto eferente) e
26
uma agulha com calibre de 12,7 mm x 0,3 mm foi inserida num plano paralelo em relação ao
testículo. O volume da solução à base de gluconato de zinco injetados nos testículos foi
calculado e ajustado de acordo com diâmetro testicular dos ratos conforme descrito por
Oliveira (2006) e exposto na tabela 1. Para calcular o diâmetro testicular utilizou-se de
paquímetro (Mitutoyo Stainless®).
Tabela 1. Volume da solução à base de gluconato de zinco (Infertile®) injetado nos testículos de ratos Wistar
segundo o diâmetro testicular.
Diâmetro do testículo
(mm)
Dose por testículo
mL mg de zinco
8-9 0,3 3,9
10-11 0,4 5,2
11-12 0,5 6,6
Fonte: Adaptado de Oliveira (2006).
Após o procedimento anestésico, os animais foram transferidos para caixas de
polipropileno e mantidos em temperatura ambiente até a recuperação da anestesia (LUE et al.,
1999). Os tratamentos com anti-inflamatórios e antiálgico foram realizados através de uma
dose única por dia, durante 7 dias consecutivos, administrados por via intraperitoneal com
exceção do celecoxibibe que foi administrado por gavagem.
Os animais de cada grupo foram analisados aos 7, 15 e 30 dias após os tratamentos
para avaliar o efeito temporal do processo inflamatório sobre o processo espermatogênico
assim como determinar a influência dos anti-inflamatórios sobre o parênquima testicular.
Para tal, cada animal foi heparinizado (heparina sódica 125 UI/100g de peso corporal)
e anestesiado por injeção intraperitoneal de tiopental sódico (50mg/kg; ROCHE®, Brasil).
Posteriormente foi realizada a coleta de sangue por punção no seio venoso (confluência das
veias cavas), centrifugação e acondicionamento de duas alíquotas de 1 mL de plasma
sanguíneo em eppendorfs e mantidos à -20°C para posterior dosagem de testosterona
plasmática. Após coleta de sangue foi feita perfusão intracardíaca com solução fisiológica de
NaCl a 0,9%, acrescida de heparina sódica (500 UI/L; AKZO ORGANON TEKNIKA) e
nitroprussiato (100mg/L; SIGMA®), por um período de tempo entre 5 e 10 minutos. Em
seguida, os animais foram perfundidos com solução fixadora de glutaraldeído (VETEC®,
Brasil) a 4%, em tampão fosfato de sódio, pH 7,2 e 0,01M, durante 25 minutos. Pelo menos
um animal de cada tempo experimental e de cada tratamento foi perfundido com solução de
formalina tamponada a 10%.
27
Após a perfusão com solução fixadora foram removidos e pesados: testículo esquerdo,
epidídimos, próstata e glândula seminal. Seccionou-se os testículos em fragmentos de até 2
mm de espessura, os quais foram submetidos à refixação na mesma solução de perfusão. Para
os estudos ao microscópio de luz, os fragmentos foram processados rotineiramente para
inclusão em parafina. Cortes histológicos de 4 µm de espessura foram feitos, posteriormente
corados em hematoxilina-eosina e analisados morfologicamente. As amostras coletadas após
30 dias também foram coradas em tricrômico de gomori.
4.3 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA
A avaliação histopatológica foi feita nos períodos de 7, 15 e 30 dias após a injeção
intratesticular da solução à base de gluconato de zinco descrevendo a presença de células
inflamatórias, reações vasculares, ativação de fibroblastos, lesão de células de Leydig no
intertúbulo testicular. Nos túbulos seminíferos foram avaliados: presença de descamação de
células germinativas, formação de células sinciciais, vacuolização de células de Sertoli,
espessamento de membrana basal de túnica própria, assim como, atrofia de túbulos
seminíferos.
4.4 DOSAGEM DE TESTOSTERONA PLASMÁTICA
A dosagem foi realizada pelo método de enzima-imuno-ensaio (ELISA - Enzyme
Linked ImmunoSorbent Assay) com leitura de absorbância em 405 nm, conforme descrito por
Brown et al. (2004). Para este ensaio inicialmente 66,7L do anticorpo (Polyclonal anti-
testosterona R156/7, Coralie Munro, University of California, Davis, USA.) foi diluído em 5
mL de tampão (coating buffer: Na2CO3, NaHCO3, H2O ultra pura, pH ajustado para 9,6).
Posteriormente 50L desta solução de anticorpo foi adicionado em cada poço da placa
(NUNC Immuno TM plates, Maxisorp). Após isso, a placa foi coberta com selador plástico e
mantida a 4 ºC por 12 horas no máximo.
Uma vez preparada a placa, preparou-se curva padrão, por meio de diluições seriadas
de 250L do padrão de concentração 600 pg/50L de testosterona (17-hydroxy-4-androsten-
3-one, Steraloids, Sigma A6950) até a concentração de 2,3 pg/50L, em 250L de solução de
ensaio de ELISA (NaH2PO4; Na2HPO4; NaCl; BSA - Sigma Aldrich, A7906; H2O ultra pura,
pH ajustado para 7,00). O hormônio conjugado com a enzima HRP (Testosterone-horseradish
Peroxidase) foi diluído (33,3L em 5 mL da solução de ensaio de ELISA).
28
Imediatamente antes de dar início ao ensaio, a placa foi lavada cinco vezes com a
solução (NaCl; Tween 20 – Sigma, P1379; H2O ultra pura) e o excesso de solução foi retirado
batendo-se a placa em papel toalha. Posteriormente, nos poços correspondentes foram
pipetados 50l dos padrões, controles e amostras e logo após 50L da HRP, com o cuidado
que não se ultrapassasse mais que 10 minutos neste processo. A placa foi novamente coberta
com o selador e deixada em incubação por exatamente uma hora, em temperatura ambiente.
Após esse período, repetiu-se o procedimento de lavagem.
Finalmente, preparou-se, imediatamente antes do uso, a solução de substrato para
ELISA combinando 40L 0,5M H2O2, 125l 40 mM ABTS (Calbiochem, ABTSTM
Chromophore, Diammonium Salt) e 12,5 mL de solução de substrato para ELISA (ácido
cítrico; H2O ultra pura, pH ajustado para 4,00). Foi adicionado 100L em todos os poços
contendo padrão, controle ou amostra. A placa foi coberta, para incubar em temperatura
ambiente e sob agitação (Multi-Pulse Vortexer; modelo 099A VB4, 50/60Hz – Glass-Col),
até que a densidade óptica dos poços zero ficasse entre 0.9 e 1. Procedeu-se então a leitura no
leitor de microplacas (TECAN®). Todas as amostras foram lidas em duplicata, com
coeficiente de variação intra e interrensaio menor do que 10%.
4.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram tratados por meio do teste estatístico Kruskall-Wallis e com post-
hoc de Dunn para comparações múltiplas, considerando p≤ 0,05.
29
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A injeção intratesticular de um agente esterilizante promove uma resposta imunológica
causada pela ruptura da barreira de hematotesticular com consequente inflamação local e
liberação de antígenos testiculares (WANG, 2002). A inflamação inibe a espermatogênese,
uma vez que a citocinas inflamatórias, espécies reativas de oxigênio e glucocorticoides têm
efeitos deletérios predominantemente sobre o epitélio seminífero (O'BRYAN et al, 2000;
HEDGER e MEINHARDT, 2003; REDDY et al., 2006; JANA e SAMANTA, 2011).
Na tabela 2 e figura 1 estão evidenciados os resultados do peso testicular (g) de ratos
Wistar submetidos à injeção intratesticular de solução à base de gluconato de zinco, tratados
com anti-inflamatórios e avaliados com 7, 15 e 30 dias. Aos 15 dias, constatou-se uma
redução de 60% no peso testicular do grupo (G4) em relação ao grupo (G1). Após 30 dias da
injeção da solução de gluconato de zinco, os animais do grupo (G3) e o grupo (G4)
apresentaram diminuição do peso testicular em 75% e 69% em relação ao grupo (G1),
respectivamente.
Tabela 2. Peso testicular (g) de ratos Wistar submetidos à injeção intratesticular de solução à base gluconato de
zinco, tratados com anti-inflamatórios e avaliados com 7, 15 e 30 após o tratamento (Média ± desvio
padrão).
Grupos Experimentais
Dias pós
Tratamento
G1
Controle
(Salina)
(n=4)
G2
Controle
(DMSO)
(n=4)
G3
Dipirona
(n=4)
G4
Celocoxibe
(n=4)
G5
Meloxicam
(n=4)
G6
Dexametasona
(n=4)
7
1,2 ± 0,2
0,9 ± 0,2
1,3 ± 0,1
1,2 ± 0,2
1,2 ± 0,1
1,6 ± 0,7
15 1,8 ± 0,5a 1,2 ± 0,2ab 1,0 ± 0,2ab 0,7 ± 0,04 b 1,0 ± 0,03ab 1,1 ± 0,2ab
30 1,6 ± 0,3a 0,7 ± 0,2ab 0,4 ± 0,1b 0,5 ± 0,06b 1,0 ± 0,4ab 0,6 ± 0,1ab
n = Número de animais. Letras distintas na mesma linha indicam p<0,05.
Fonte: Macêdo (2013).
30
Fonte: Macêdo (2013).
De acordo com França e Russell (1998), o peso testicular é altamente correlacionado
com a produção espermática e com parâmetros histométricos testiculares como diâmetro
tubular, altura do epitélio, comprimento total de túbulos seminíferos. Da mesma maneira,
medidas testiculares estão associadas com produção espermática diária (OSINOWO et al.,
1992; SOUZA e COSTA, 1992), número de espermátides por células de Sertoli e área dos
túbulos seminíferos, além de apresentarem relação inversa com a taxa de degeneração de
células germinativas em touros (BERNDTSON et al., 1987; PALASZ et al., 1994; MOURA e
ERICKSON, 1997). Assim, a diminuição na consistência do parênquima testicular está
associada à redução na produção de espermatozoides (COULTER e FOOTE, 1979) e aumento
do número de espermatócitos e espermátides degeneradas em todos os estágios do ciclo da
espermatogênese em touros (MULLER et al., 1992).
A redução do peso testicular observado nos animais tratados com diferentes tipos de
anti-inflamatórios em associação com dipirona ficou mais significativa aos 15 e 30 dias após a
infiltração intratesticular com Infertile®. Isso demonstrou que a utilização de protocolos com
diferentes anti-inflamatórios foram capazes de minimizar os efeitos pró-inflamatórios
desencadeados pelo gluconato de zinco nos primeiros sete dias.
Figura 1. Peso testicular (g) de ratos Wistar submetidos à injeção intratesticular de solução à
base de gluconato de zinco e tratados com anti-inflamatórios avaliados com 7, 15
e 30 dias (Média ± desvio padrão).
31
Tabela 3. Peso epididimário (g) de ratos Wistar submetidos à injeção intratesticular de solução à base de
gluconato de zinco e tratados com anti-inflamatórios avaliados com 7, 15 e 30 após o tratamento
(Média ± desvio padrão).
Grupos Experimentais
Dias pós
Tratamento
G1
(n=4)
G2
(n=4)
G3
(n=4)
G4
(n=4)
G5
(n=4)
G6
(n=4)
7
0,6 ± 0,1
0,7 ± 0,1
0,6 ± 0,4
0,6 ± 0,1
0,4 ± 0,2
0,7 ± 0,3
15 1,8 ± 1,0a 0,4 ± 0,1b 0,5 ± 0,06ab 0,7 ± 0,1ab 0,4 ± 0,2ab 0,4 ± 0,1ab
30 1,1 ± 0,2a 0,5 ± 0,1ab 0,4 ± 0,2ab 0,3 ± 0,1b 0,5 ± 0,1ab 0,2 ± 0,09b
n = Número de animais. Letras distintas na mesma linha indicam p<0,05.
Fonte: Macêdo (2013).
Figura 2. Peso epididimário (g) de ratos Wistar submetidos à injeção intratesticular de solução
à base gluconato de zinco e tratados com anti-inflamatórios avaliados com 7, 15 e 30
após o tratamento (Média ± desvio padrão).
Fonte: Macêdo (2013).
Temperaturas supra-escrotais decorrentes de reações inflamatórias podem alterar os
espermatozoides maduros durante o estágio final de desenvolvimento na região da cabeça do
epidídimo, ocorrendo alterações estruturais e metabólicas; esse gameta pode fertilizar, mas
ocorre a morte embrionária subsequente (GABALDI e WOLF, 2002).
Os dados referentes ao peso epididimário dos ratos Wistar submetidos à injeção
intratesticular de solução à base de gluconato de zinco, tratados com anti-inflamatórios e
avaliados com 7, 15 e 30 após o tratamento estão expostos na tabela 3 e figura 2. De acordo
com os resultados somente 15 dias após o ensaio experimental se constatou uma redução de
78% do peso deste órgão no grupo (G2) quando comparado com o grupo (G1). Aos 30 dias, o
32
grupo (G2) e o grupo (G6) apresentaram diminuição 73 e 82% do peso epididimário em
relação ao grupo (G1), respectivamente.
A redução do peso epididimário observado nos animais tratados com diferentes tipos
de anti-inflamatórios foi significativa aos 15 e 30 dias após a infiltração intratesticular com
Infertile®
. Isso demonstrou que a utilização de protocolos com diferentes anti-inflamatórios
foi capaz de minimizar os efeitos pró-inflamatórios desencadeados pelo gluconato de zinco
nos primeiros sete dias. De acordo com Creasy (2003), a redução do peso epididimário é
indicativa de diminuição da espermatogênese no testículo, e consequentemente da redução do
conteúdo epididimário.
A orquite e a epididimite são duas afecções que frequentemente estão associadas,
devido à proximidade anatômica e da continuidade do sistema ductal desses órgãos. Processos
infecciosos ou inflamatórios que atingem uma das estruturas vão provavelmente estender-se à
outra (FELDMAN e NELSON, 2004). Podem resultar também da destruição imunomediada
do tecido testicular e epididimário que desencadeia um processo inflamatório. Trata-se de um
processo com etiologia desconhecida e pode levar à infertilidade (JONES, et al., 1997;
FELDMAN e NELSON, 2004). Neste caso a reação imunomediada pode ter sido
desencadeada pela ação do gluconato de zinco como descrita por Wang (2002). Portanto, de
acordo com o nosso experimento a reação inflamatória testicular pode ter influenciado
diretamente no peso do epidídimo e nas suas funções.
Sabe-se que a atividade da próstata e da glândula seminal no indivíduo adulto possui
íntima correlação com os níveis de andrógenos, principalmente a testosterona testicular, uma
vez que a orquiectomia ou drogas com atividades farmacológicas antiandrogênicas promovem
atrofia dessas glândulas sexuais acessórias (LUKE e COFFEY, 1994). Por outro lado, o
aumento dos níveis séricos de testosterona e andrógenos de outras fontes pode produzir
hiperplasia ou hipertrofia desses órgãos (BRUENGGER et al., 1986; MCGINNIS et al.,
2002).
De acordo com os resultados da tabela 4 e figura 3 foi observada redução no peso
prostático em 82% no grupo (G3) quando comparado ao grupo (G2). Aos 30 dias, o peso
prostático dos animais tratados com Infertile® e que receberam terapia anti-inflamatória com
dexametasona+ dipirona teve redução de 94% neste parâmetro em relação ao grupo controle
(solução salina). Da mesma forma, nos animais que recebem meloxicam + dipirona após
tratamento de esterilização com Infertile® se constatou 88% de redução no peso prostático
quando comparados com o grupo controle.
33
Tabela 4. Peso da próstata (g) de ratos Wistar submetidos à injeção intratesticular de solução à base de gluconato
de zinco e tratados com anti-inflamatórios avaliados com 7, 15 e 30 dias após o tratamento (Média ±
desvio padrão).
Grupos Experimentais
Dias pós
Tratamento
G1
(n=4)
G2
(n=4)
G3
(n=4)
G4
(n=4)
G5
(n=4)
G6
(n=4)
7
0,6 ± 0,1ab
1,1 ± 0,2 b
0,2 ± 0,2a
0,6 ± 0,1ab
0,4 ± 0,2ab
0,4 ± 0,1ab
15
0,7 ± 0,2
0,7 ± 0,3
0,4 ± 0,08
0,2 ± 0,1
0,5 ± 0,3
0,3 ± 0,2
30
1,6 ± 0,5a
0,9 ± 0,1ab
0,4 ± 0,06ab
0,7 ± 0,2ab
0,1 ± 0,1b
0,2 ± 0,0b
n = Número de animais. Letras distintas na mesma linha indicam p<0,05.
Fonte: Macêdo (2013).
Fonte: Macêdo (2013)
Tabela 5. Peso da glândula seminal (g) de ratos Wistar submetidos à injeção intratesticular de solução à base de
gluconato de zinco e tratados com anti-inflamatórios avaliados com 7, 15 e 30 dias após o tratamento
(Média ± desvio padrão).
Grupos Experimentais
Dias pós
Tratamento
G1
(n=4)
G2
(n=4)
G3
(n=4)
G4
(n=4)
G5
(n=4)
G6
(n=4)
7
1,0 ± 0,04
1,1 ± 0,3
0,4 ± 0,2
0,4 ± 0,2
0,6 ± 0,2
0,8 ± 0,3
15
1,7 ± 0,4a
1,1 ± 0,5ab
0,6 ± 0,4 b
0,3 ± 0,05b
0,7 ± 0,5 ab
0,7 ± 0,7ab
30
1,7 ± 0,4
1,9 ± 0,4
0,1 ± 0,05
0,2 ± 0,2
1,7 ± 1,1
0,1 ± 0,05
n = Número de animais. Letras distintas na mesma linha indicam p<0,05.
Fonte: Macêdo (2013).
Figura 3. Peso da próstata (g) de ratos Wistar submetidos à injeção intratesticular de solução
à base de gluconato de zinco e tratados com anti-inflamatórios avaliados com 7,
15 e 30 dias após o tratamento (Média ± desvio padrão).
34
Fonte: Macêdo (2013)
Na tabela 5 e figura 4 constam os valores referentes ao peso da glândula seminal (g) de
ratos Wistar submetidos à injeção intratesticular de solução à base de zinco e tratados com a
associação anti-inflamatórios e avaliados com 7, 15 e 30 dias após o tratamento. Após 15 dias
do tratamento com Infertile®, constatou-se redução de 65% no grupo (G3) em relação ao
grupo (G1).
Tabela 6. Dosagem de testosterona plasmática (ng/mL) de ratos Wistar submetidos à injeção intratesticular de
solução à base de gluconato de zinco e tratados com anti-inflamatórios avaliados com 7, 15 e 30 dias
após o tratamento (Média ± desvio padrão).
Grupos Experimentais
Dias pós
Tratamento
G1
(n=4)
G2
(n=4)
G3
(n=4)
G4
(n=4)
G5
(n=4)
G6
(n=4)
7 1,11 ± 0,3a 1,36 ± 1,18a 0,21 ± 0,03 b 0,26 ± 0,09 ab 0,28 ± 0,14 ab 0,28 ± 0,08ab
15 1,03 ± 0,3a 1,60 ± 0,78a 0,23 ± 0,03a 0,41 ± 0,30a 0,49 ± 0,53a 0,23 ± 0,07a
30 0,88 ± 0,28ab 2,09 ± 0,34b 0,31 ± 0,24 ab 1,10 ± 1,07 ab 0,24 ± 0,05 ab 0,21 ± 0,08a
n = Número de animais. Letras distintas na mesma linha indicam p<0,05.
Fonte: Macêdo (2013).
Figura 4. Peso da glândula seminal (g) de ratos Wistar submetidos à injeção intratesticular
de solução à base de gluconato de zinco e tratados com anti-inflamatórios
avaliados com 7, 15 e 30 dias após o tratamento (Média ± desvio padrão).
35
Fonte: Macêdo (2013)
De acordo com a tabela 6, Figura 5 não houve diferença significativa quanto ao nível
de testosterona plasmática do grupo G2, nos diferentes tempos experimentais, em relação ao
grupo G1, ou seja, a utilização intratesticular de apenas dimetil sulfóxido não foi suficiente
para promover redução do nível plasmático de testosterona e diminuição no volume das
glândulas sexuais acessórias. Paradoxalmente, nos animais que foram submetidos à injeção
intratesticular de gluconato de zinco, constatou-se redução média de 74, 66 e 53 % dos níveis
de testosterona nos respectivos períodos experimentais 7, 15 e 30 dias. Os grupos que tiveram
redução mais expressiva foram o grupo G3 com redução de 80% quando comparada ao grupo
G1 sete dias após da injúria testicular e o grupo G6 com redução de 89% em relação ao grupo
G2 avaliado aos 30 dias. Este decréscimo dos níveis plasmáticos de testosterona se refletiu na
evidente diminuição dos pesos da próstata e da vesícula seminal. Isto pode ser justificado pela
manutenção estrutural e funcional das células de Leydig observada nos animais submetidos à
injeção intratesticular de dimetil sufóxido.
Estudos da Food And Drug Administration (FDA) demonstraram que um composto de
zinco (gluconato de zinco neutralizado pela arginina) induz a redução, mas não elimina a
produção de testosterona, e seus efeitos sobre as doenças hormônio-dependentes e
comportamentos não foram estabelecidos (GRIFFIN, 2012). No entanto, os estudos revelaram
uma diminuição significativa do tamanho da próstata em cães submetidos à injeção
intratesticular de gluconato de zinco em relação ao grupo controle (WANG, 2002). De acordo
Figura 5- Dosagem de testosterona plasmática (ng/mL) de ratos Wistar submetidos à injeção
intratesticular de solução à base de zinco e tratados com anti-inflamatórios avaliados
com 7, 15 e 30 dias após o tratamento (Média ± desvio padrão).
36
com Oliveira et al. (2006) a aplicação intratesticular de gluconato de zinco em cães promoveu
redução nos níveis de testosterona entre 40 e 80%, contudo os valores permaneceram acima
daqueles observados em cães orquiectomizados. Os nossos resultados mostram que o
Infertile®
promove redução dos níveis séricos de testosterona, o que está compatível com
redução de pesos de próstata e glândula seminal.
A testosterona está relacionada a expressão comportamental e sexual dos machos
(PACHECO e QUIRINO, 2010) e o que se deseja nos processo de esteriliação química, além
da infertilidade dos machos é a redução deste comportamento e da agressividade (OLIVEIRA
et al., 2011). Neste experimento, a esterilização química com Infertile® foi capaz de reduzir
significativamente a atividade das células de Leydig aos 30 dias. Contudo, é bastante provável
que a análise da testosterona plasmática em períodos superiores aos estudados poderia
oferecer resultados mais satisfatórios.
5.1 ACHADOS HISTOPATOLÓGICOS TESTICULARES
Na avaliação do parênquima testicular, aos 7, 15 e 30 dias, do grupo controle (solução
salina) observou-se a presença de túbulos seminíferos normais e grande quantidade de
espermatozoides.
5.1.1 Achados histopatológicos aos sete dias
Os animais que receberam apenas injeção intratesticular do veículo (DMSO) e
dipirona 20mg/Kg (G2) possuíam espessamento da túnica albugínea, edema subcapsular
intenso com deposição de fibrina e congestão, vacuolização de células de Sertoli, além de
reação inflamatória e tecido reacional com fibroblastos ativos na região subcapsular e vasos
neoformados. No parênquima testicular constatou-se processo inflamatório peritubular, áreas
de calcificação difusa intertubular, necrose e hialinização de vasos. Os túbulos seminíferos
continham extensa degeneração, necrose e hialinização. O intertúbulo continha células de
Leydig dentro dos padrões de normalidade contrastando com áreas de células necrosadas. As
lesões ocasionadas pelo dimetil sulfóxido foram menos intensas do que as causadas pelo
Infertile®
mesmo em associação com anti-inflamatórios, ou seja, a presença do gluconato de
zinco se faz necessária para causar lesão testicular esterilizante (Tabela 7).
Sabe-se que a exposição à concentração elevada de zinco leva ao aumento dos
leucócitos polimorfonucleares, macrófagos e linfócitos estimulados pela presença do mineral
37
(BOGDEN et al., 1988). Acredita-se que a injeção intratesticular da solução à base gluconato
de zinco leva a uma alteração semelhante à observada na orquite autoimune, processo
inflamatório testicular mediado por formação de anticorpos contra os próprios antígenos
testiculares do indivíduo (MANN e LUTWAK-MANN, 1981). Oliveira et al. (2007), ao
avaliarem o efeito da injeção intratesticular de gluconato de zinco em cães, seis meses após o
procedimento, observaram lesão no epitélio germinativo com consequente destruição dos
espermatócitos, espermátides e ausência de espermatozoides, o que resultou na esterilidade do
animal.
No parênquima testicular dos ratos submetidos à injeção intratesticular com Infertile®
e tratados somente com dipirona (G3) foi possível notar que a intensidade das lesões foi maior
quando comparada aos grupos anteriormente descritos. Neste grupo experimental ainda se
constatou presença de alguns túbulos com baixa celularidade do epitélio germinativo
contendo células germinativas basais. No entanto, a maioria os túbulos seminíferos
encontravam-se degenerados com presença de restos celulares no lúmen tubular (Figura 6C).
Outros achados tais como: congestão, hialinização de vasos intersticiais, calcificação
distrófica difusa e infiltrado inflamatório foram bastante intensos na região intertubular neste
período de avaliação. Além disso, espessamento da túnica albugínea, infiltrado inflamatório
na região subcapsular e áreas com neovascularização intersticial também foram achados
frequentes. Esses achados patológicos caracterizam a degeneração testicular (Tabela 7).
Portanto, infere-se que a dipirona não foi capaz de suprimir a resposta inflamatória local
causada após a injeção intratesticular de gluconato de zinco, conforme observado por Oliveira
et al. ( 2012).
Em estudo realizado por Paula (2010) para avaliação da dor pós-intervenção de três
métodos de esterilização de cães machos, revelou a necessidade de analgesia após a
esterilização química com gluconato de zinco. A dipirona sódica possui efeito analgésico,
antitérmico e anti-inflamatório, (AMARAL et al., 2009; FERREIRA et al., 2009; SANTOS et
al., 2009) relacionadas à inibição do sistema enzimático das cicloxigenases (COX 1 e COX
2), mas tem pouca eficácia como anti-inflamatório (GOODMAN e GILMAN, 2007).
Inicialmente, os animais submetidos à injeção intratesticular com Infertile® foram
tratados durante sete dias com celocoxibe em associação com dipirona (G4). Ao final desse
período, realizou-se avaliação qualitativa do parênquima testicular no qual se pôde observar
uma discreta degeneração do epitélio seminífero, presença de aglomerados de células
germinativas e restos celulares no lúmen tubular, necrose intersticial e de células de Leydig.
Contudo, alguns túbulos possuíam sua estrutura preservada, com a presença de células
38
germinativas - espermatócitos I na fase de paquíteno (Tabela 7). É importante salientar que foi
observado nesses animais um processo inflamatório subcapsular, peritubular (Figura 6D) e
espessamento da túnica albugínea. No entanto o celocoxibe, inicialmente, foi capaz de reduzir
o processo inflamatório, uma vez que ao agir como inibidor seletivo da COX-2 (CLEMENT e
GOA, 2000) inibe as respostas a estímulos nocivos, consequentemente a síntese e acúmulo de
prostanóides inflamatórios, em particular prostaglandinas E2 que induzem a inflamação,
edema e dor (BAKHLE; BOTTING, VANE 1998).
Os animais submetidos à esterilização química com Infertile® e que receberam a
associação de meloxicam + dipirona (G5) tiveram lesões testiculares compatíveis com
utilização de agente esterilizante tais como: degeneração e necrose do epitélio germinativo
com perda de seu arranjo celular (Figura EC), degeneração das células de Leydig e de outros
componentes do intertúbulo. É importante destacar que esses animais apresentaram
espessamento intenso da túnica albugínea, com neovascularização e infiltrado inflamatório
neutrofílico nas regiões subcapsular e intertubular, além de calcificação distrófica intertubular
(Tabela 7). Contudo, foi constatada a presença de túbulos seminíferos com vestígio de
espermatogênese. No entanto, as lesões neste grupo foram mais severas, ou seja, mesmo
possuindo potente ação analgésica, anti-inflamatória e antipirética (CARVALHO et al., 2006)
via inibição de COX2 (FURST e MUNSTER 2007), a administração de meloxicam não
reduziu a capacidade do gluconato de zinco em causar degeneração e necrose estimulando a
reação inflamatória.
A injeção intratesticular de Infertile® e a administração da associação dexametasona +
dipirona (G6) por sete dias não proporcionou uma homogeneidade nas alterações estruturais
do parênquima testicular. A princípio, constatou-se considerável espessamento da túnica
albugínea com intenso processo inflamatório polimorfonuclear neutrofílico. Em alguns
túbulos seminíferos, verificou-se necrose de células germinativas e hialinização tubular com
presença de calcificação distrófica.
Por outro lado, não se observaram infiltrado inflamatório peritubular, congestão e
hialinização vascular. Além disso, a associação dexametasona + dipirona por sete dias
preservou a estrutura na maioria dos túbulos seminíferos e as células germinativas nos
compartimentos basal e adluminal (Figura 6F). Observando-se que os túbulos seminíferos não
possuíam alterações compatíveis com degeneração testicular. No intertúbulo foi constatada a
presença de células de Leydig com preservação estrutural e ausência de alterações correlatas à
degeneração ou necrose. A explicação mais provável estaria relacionada à capacidade da
dexametasona em reduzir a liberação de fatores essenciais à geração de inflamação, como
39
redução de fatores vasoativos e quimiotáxicos, redução da secreção de enzimas lipolíticas,
estabilização das membranas lisossomais dos leucócitos, menor produção de leucotrienos para
a área de lesão e por fim, fibrose diminuída (SCHIMMER e PARKER, 2006; MARCHIONNI
et al., 2006).
Tabela 7. Lesões histopatológicas de testículos de ratos Wistar adultos avaliados aos 7 dias após injeção
intratesticular com infertile® em associação com anti-inflamatórios.
Lesões encontradas
Amostras Total
G1
(n=4)
G2
(n=4)
G3
(n=4)
G4
(n=4)
G5
(n=4)
G6
(n=4)
FA FR
(%)
Espessamento de túnica
albugínea -
4
(100%)
4
(100%)
4
(100%)
4
(100%)
4
(100%) 20 83,3
Proliferação de fibroblasto - 4
(100%) - - -
3
(75%) 7 29,1
Processo inflamatório - 4
(100%)
4
(100%)
2
(50%)
3
(75%)
3
(75%) 16 66,6
Necrose tubular - 4
(100%)
4
(100%)
4
(100%)
3
(75%)
4
(100%) 19 79,1
Calcificação distrófica difusa - 2 4
(100%) -
3
(75%)
3
(75%) 12 50,0
Neovascularização - - - - - - - -
Degeneração tubular - 3
(75%)
4
(100%)
4
(100%)
2
(50%) - 13 54,1
Congestão - 2 3
(75%) -
3
(75%) - 8 33,3
Edema subcapsular - 1 - - - - 1 4,16
Total de animais 4 4 4 4 4 4 24 -
FA - Frequência absoluta; FR - Frequência relativa.
Fonte: Macêdo (2013).
5.1.2 Achados histopatológicos aos 15 dias.
No parênquima testicular dos animais do grupo (G2), observou-se a presença túbulos
seminíferos necrosados com descamação do epitélio germinativo, presença de células gigantes
e vacuolização de células de Sertoli. No intertúbulo, notou-se reatividade de tecido conjuntivo
com presença de vasos e fibroblastos ativos. No entanto, constataram-se áreas do parênquima
testicular com proliferação de células de germinativas e a presença de células de Leydig. Na
tabela 8 constam frequências relativas das lesões induzidas somente pelo DMSO. A reação
inflamatória e a degeneração testicular ocorreram em 75 e 100% dos animais infiltrados,
respectivamente. Porém, as lesões testiculares foram mais pronunciadas nos testículos dos
animais do grupo (G3) uma vez que a calcificação distrófica (50%) e a necrose (100%) foram
40
os achados mais frequentes. Isso demonstra que o DMSO pode lesionar o testículo, porém o
grau de severidade dessas lesões podem não conduzir os animais à esterilização.
Os animais do grupo G3 apresentaram em seu parênquima testicular necrose de
coagulação dos túbulos seminíferos, neovascularização, hemorragia subcapsular intensa,
depósitos de lipofucsina e hialinização da artéria testicular. Observaram-se ainda necrose
intertubular assim como infiltrado inflamatório constituído de polimorfonucleares e
macrófagos (Figura 7C) Além desses achados, notaram-se áreas com proliferação de tecido
conjuntivo e calcificação. No entanto, pode-se verificar a existência de túbulos com células
germinativas - espermatócitos tipo II e espermátides alongadas - muito embora em estado de
desorganização. Além disso, constatou-se espessamento da túnica albugínea. De acordo com
os resultados mostrados na tabela 7 constata-se a eficiência do Infertile® como agente
esterilizante aos 15 dias visto que 100% dos animais estudados neste grupo possuíam necrose
e degeneração tubular. Portanto, a dipirona, com já discutido anteriormente, não retardou o
processo inflamatório.
Os animais do grupo G4 possuíam túbulos seminíferos com presença de células
necróticas e espermátides alongadas na borda do lúmen. Constatou-se a presença de congestão
vascular intensa na região subcapsular e edema peritubular, células gigantes sinciciais e
discretos infiltrados inflamatórios crônicos com proliferação de fibroblastos. Pode-se observar
a presença de túbulos contendo células germinativas em diferentes estágios de recuperação
(Figura 7D). De acordo com os dados da tabela 7 foi possível constatar que o inibidor seletivo
da COX-2, celecoxibe, foi capaz de amenizar os danos testiculares induzidos pela aplicação
intratesticular do Infertile® haja vista que 50% dos animais possuíam reação inflamatória
discreta, porém, sem calcificação distrófica. Por outro lado, a necrose foi descrita em 100%
dos animais, contudo, não atingiu todos os túbulos seminíferos. A ação do inibidor de COX-2
administrado via oral durante sete dias após aplicação do Infertile®
parece ter retardado o
desencadear da reação inflamatória por indução do gluconato de zinco. Essa ação pode estar
relacionada às propriedades anti-inflamatórias do celocoxibe. De acordo com Castilho et al.
(2008), o celecoxibe demonstrou resultados superiores ao rofecoxib e ibuprofeno na redução
de reação inflamatória induzida em polpa dentária de ratos.Todos os inibidores da COX-2
foram superiores ao diclofenaco de sódio no experimento descrito anteriormente. O que
também foi observado neste grupo experimental em relação ao grupo tratado somente com
dipirona.
No parênquima testicular dos animais do grupo G5, verificou-se a presença de um
processo inflamatório peritubular, proliferação de fibroblastos, edema discreto, congestão
41
vascular e hemorragia nas regiões intertubulares, além de neovascularização e hialinização
dos vasos. Observou-se ainda, necrose tubular (Figura 7E), áreas de calcificação distrófica
peritubular, presença de túbulos seminíferos desprovidos de células germinativas, grande
quantidade de macrófagos ativos e intenso espessamento da túnica albugínea.
Nos processos degenerativos testiculares ocorre espessamento da túnica própria,
caracterizada por estímulo a deposição da matriz extracelular. Em testículos criptorquídicos,
por exemplo, observa-se com frequência espessamento elétron-denso homogêneo da lâmina
basal dos túbulos seminíferos, fibrose da túnica própria e do tecido conjuntivo intertubular
(TRISTÃO, 1986). Nos testículos avaliados neste período as lesões induzidas pelo Infertile®
foram intensas e frequentes em 100% dos animais estudados (Tabela 7). Portanto, o
meloxicam não interferiu na ação do gluconato de zinco presente no Infertile® sobre o
parênquima testicular 15 dias após a infiltração testicular. O meloxicam é um inibidor de
COX-1 e 2, porém com mais seletividade para a segunda cicloxigenase, porém menos potente
do que os inibidores seletivos da COX-2 (coxibes) (HILÁRIO et al., 2006). Os resultados
anteriormente descritos para o grupo G4 confirmam o potencial anti-inflamatório superior do
celecoxibe em relação ao meloxicam.
Nos animais do grupo G6 verificou-se espessamento da túnica albugínea. No
parênquima testicular notou-se necrose tubular, entretanto havia alguns túbulos seminíferos
com células germinativas e espermátides alongadas. No intertúbulo verificou-se a presença de
células de Leydig funcionais e ausência de processo inflamatório (Figura 7F). Provavelmente
pela ação da dexametasona, a mobilização de neutrófilos e macrófagos foi inibida para a área
afetada. De acordo com Grossi et al. (2007), a dexametasona por inibir a formação de
prostaglandinas, leucotrienos e tromboxanas, substâncias importantes para a quimiotaxia e
desencadeamento do processo inflamatório. Na tabela 7 pode constatar que o uso de
dexametasona reduziu a incidência de reação inflamatória em 75% dos animais que
receberam o gluconato de zinco. Entretanto, necrose (100%), degeneração tubular (75%) e
calcificação distrófica (75%) foram frequentes, porém discretas em todos os animais.
42
Tabela 8: Lesões histopatológicas de testículos de ratos Wistar adultos avaliados aos 15 dias após injeção
intratesticular com infertile® em associação com anti-inflamatórios.
Lesões encontradas
Amostras Total
G1
(n=4)
G2
(n=4)
G3
(n=4)
G4
(n=4)
G5
(n=4)
G6
(n=4)
FA FR
(%)
Espessamento de túnica
albugínea -
3
(75%)
2
(50%)
2
(50%)
4
(100%)
4
(100%) 15 62,5
Proliferação de fibroblasto - 4
(100%)
2
(50%)
1
(25%)
4
(100%) - 11 45,8
Processo inflamatório - 3
(75%)
3
(75%)
2
(50%)
4
(100%)
1
(25%) 13 54,1
Necrose tubular - 3
(75%)
4
(100%)
4
(100%)
4
(100%)
4
(100%) 19 79,1
Calcificação distrófica difusa - - 2
(50%) -
4
(100%)
3
(75%) 9 37,5
Neovascularização - - 2
(50%) - - - 2 8,33
Degeneração tubular - 4
(100%)
4
(100%)
3
(75%)
4
(100%)
3
(75%) 18 75,0
Congestão - - - 2
(50%)
4
(100%) - 6 25,0
Edema subcapsular - - - - 1
(25%) - 1 4,16
Total de animais 4 4 4 4 4 3 23 -
FA - Frequência absoluta; FR - Frequência relativa.
Fonte: Macêdo (2013)
5.1.3 Achados histopatológicos aos 30 dias
Na avaliação do parênquima testicular dos animais do grupo (G2), constatou-se reação
vascular no tecido conjuntivo (Figura 8C), vasos hialinizados na região intertubular. Foram
observados túbulos seminíferos necrosados e túbulos contendo espermátides em alongamento
na borda, embora o epitélio não estivesse íntegro. Observou-se a presença de macrófagos com
pigmentos de hemossiderina, áreas de calcificação distrófica, um aumento no número de
células de Leydig, vacuolização de células de Sertoli (Figura 8C) e extensa deposição de
matriz extracelular no intertúbulo (Figura 12A). Verificou-se também edema subcapsular e
espessamento da cápsula albugínea (Tabela 8).
A ação anti-inflamatória do DMSO tem a característica de reduzir o grau e extensão da
inflamação tecidual e também exerce alguma ação analgésica, atribuível ao fármaco no local
da inflamação, onde, aparentemente, deprime a condução de impulsos nervosos aferentes
provenientes da área inflamada, também reduz a agregação plaquetária, protege o endotélio
vascular, diminuindo a formação de trombos, entre outros (BOOTHE, 2003). Os dados
referentes ao peso testicular, ao peso epididimário e aos achados histopatológicos do testículo
demonstram que o DMSO exerceu efeito danoso sobre o parênquima pelo menos até 30 dias
43
após sua utilização. Entretanto, os níveis séricos de testosterona apontam para o bom
funcionamento das células de Leydig durante todos os períodos analisadas. Portanto, é
possível que as lesões produzidas pelo DMSO sejam reversíveis quanto à função do epitélio
germinativo. Desta forma, não deve ser aconselhado a utilização do DMSO com agente
esterilizante.
Animais do grupo (G3) possuíam no parênquima testicular necrose extensa dos
túbulos seminíferos (Figura 8F) com presença de espemátides alongadas, reação inflamatória
subaguda, deposição de hemossiderina nos macrófagos e hialinização da parede da artéria
testicular. Foi evidenciada discreta fibrose, ausência de células germinativas, células de
Sertoli, e de células de Leydig (Figura 12C, Tabela 8). O que foi exposto anteriormente para o
grupo tratado apenas com DMSO em associação com dipirona demonstra que o gluconato de
zinco é fundamental para produzir as lesões testiculares desejadas que levem a esterilidade.
De acordo com a literatura, o gluconato de zinco intratesticular causa danos
testiculares irreversíveis, os quais se relacionam inicialmente, com forte reação inflamatória
seguida por degeneração e fibroplasia testicular. Embora as lesões tubulares sejam variáveis
no parênquima testicular devido à presença de túbulos com células germinativas e túbulos
completamente atróficos e hialinizados, animais tratados com gluconato de zinco
apresentaram azoospermia após 180 dias de tratamento (OLIVEIRA, 2006; OLIVEIRA et al.,
2007).
Um agente esclerosante à base de zinco (Testoblock, BioRelease Technologies,
Birmingham, AL, USA) vem sendo estudado para ser utilizado na esterilização de machos
caninos por meio de injeção intratesticular. Sua eficácia foi avaliada em animais entre oito
meses e 10 anos de idade (OLIVEIRA, 2006; OLIVEIRA et al., 2007). Os resultados
encontrados por Oliveira (2006), em estudo realizado por um período de seis meses, indicam
que a solução à base de zinco (Testoblock®) é eficaz em bloquear a espermatogênese.
Observou-se azoospermia aos 60 dias após a injeção de zinco, e o grau de dano celular
encontrado à avaliação histológica e ultraestrutural dos testículos sugeriu a irreversibilidade
do processo. Em estudo realizado por um período de um ano, Muller et al. (2010) relataram
que a azoospermia dos cães observada aos 60 dias foi mantida durante todo o período de
monitoramento dos animais, confirmando a irreversibilidade e a eficácia do medicamento em
longo prazo.
O Infertile® (Rhobifarma), cuja base também é o gluconato de zinco foi testado em
cães machos adultos jovens, porém não promoveu à azoospermia. No entanto foi observada
diminuição da motilidade e da concentração espermática 12 meses após a injeção
44
intratesticular da droga. Na avaliação histológica testicular foram observadas degeneração
testicular, diminuição do número de células germinativas, atrofia, ruptura da arquitetura dos
túbulos seminíferos e perda das células de Sertoli. Porém, não se avaliou a concentração de
testosterona, esta não foi avaliada (SOTO et al., 2009). No presente experimento o Infertile®
foi eficiente na produção das lesões testiculares relacionadas com a esterilização química.
Além disso, promoveu redução na produção de testosterona no grupo (G3), principalmente
sete dias após a infiltração testicular.
A descoberta de inibidores da isoforma COX-2 levou à obtenção da segunda geração
de anti-inflamatórios não esteroides, denominados coxibes. O primeiro composto a ser
aprovado pela Food and Drug Administration (FDA) para uso nos Estados Unidos foi o
celecoxibe, em dezembro de 1998 (WHELTON, 2001). Os animais do grupo (G4)
apresentaram espessamento da túnica albugínea, desorganização dos túbulos seminíferos,
presença de infiltrado inflamatório peritubular e intratubular, proliferação fibroblástica
(Figura 8G, Figura 12D) e hialinização vascular. A presença de macrófagos espumosos ativos
na região intertubular foi um achado bastante relevante neste grupo. De maneira geral, os
inibidores de COX-2 não são indicados para lesões testiculares sendo utilizados em patologias
relacionadas ao sistema locomotor com artrites, artroses e osteopatias. Silva et al. (2010). A
utilização deste inibidor na orquite quimicamente induzida não foi descrito anteriormente.
Contudo, foi demonstrado que este inibidor de COX-2 não suprimiu o efeito esterilizante do
gluconato de zinco.
As lesões mais frequentes observadas nos animais do grupo (G5) foram: espessamento
da túnica albugínea, proliferação de fibroblastos na região intertubular, deposição de colágeno
(Figura 12E) e neovascularização. Verificou-se a presença túbulos seminíferos necrosados
(Figura 8E) circundados por macrófagos, alguns contendo células descamadas no lúmen
tubular e outros com ausência de células germinativas (Tabela 9). Estes achados demonstram
que o meloxicam associado à dipirona não exerceu efeitos anti-inflamatórios satisfatórios
sendo incapaz de interferir no efeito esterilizante do gluconato de zinco no parênquima
testicular de ratos.
A orquite aguda decorrente de traumatismos ou torções testiculares é caracterizada por
reação inflamatória aguda que podem ser minimizadas pelo de anti-inflamatórios AINES e
não AINES inibidores de COX-2 (JESUS, 2000). Desta forma, a utilização de anti-
inflamatórios da classe do meloxicam deve ser considerada apenas como medidas antálgicas e
antipiréticas evitando o desconforto e proporcionando bem estar aos animais submetidos à
esterilização química, uma vez que, o ele não interfere no mecanismo proposto pelo Infertile®.
45
Nos animais do grupo (G6) se constatou uma forte reação inflamatória na região
intertubular (Figura 12F) acompanhada por necrose tubular extensa (Figura 8D), presença de
calcificação distrófica e hialinização vascular. Na túnica albugínea, notou-se espessamento e
neovascularização além de macrófagos ativos na região subcapsular e intertubular (Tabela 9).
A resposta anti-inflamatória ocorre por ação local, tanto na fase precoce (edema,
dilatação capilar, migração de leucócitos, atividade fagocitária) quanto na fase tardia do
processo inflamatório (proliferação capilar e de fibroblastos, deposição de colágeno e
cicatrização). Alguns mecanismos explicam a inibição deste processo: 1) Redução da
exsudação dos leucócitos e outros constituintes celulares do plasma, reduzindo assim o
edema; 2) Manutenção da membrana celular, evitando assim edema intracelular com
consequente destruição da célula; 3) estabilidade dos lisossomos, evitando assim a liberação
de enzimas que digeririam os constituintes celulares, prolongando a resposta anti-inflamatória
(DAMIANI et al., 2001). A ação prolongada da dexametasona não foi capaz de reduzir a
reação inflamatória induzida pelo gluconato de zinco nos animais aos 30 dias. Contudo, a
ação deste fármaco na dosagem de 2mg/Kg nos sete primeiro dias, em associação com a
dipirona retardou o processo inflamatório testicular em 15 dias.
Tabela 9: Lesões histopatológicas de testículos de ratos Wistar adultos avaliados aos 30 dias após injeção
intratesticular com infertile® em associação com anti-inflamatórios.
Lesões encontradas
Amostras Total
G1
(n=4)
G2
(n=4)
G3
(n=4)
G4
(n=4)
G5
(n=4)
G6
(n=4)
FA FR
(%)
Espessamento de túnica
albugínea
- 3
(75%) 1
(25%) 4
(50%) 4
(50%) - 12 50,0
Proliferação de fibroblasto
- 4
(100%) 4
(100%) 2
(50%) 4
(100%) 3
(75%) 17 70,8
Processo inflamatório
- 1
(25%) 2
(50%) 4
(50%) 4
(50%) 4
(100%) 15 62,5
Necrose tubular
- 4
(100%) 4
(50%) 3
(75%) 2
(50%) 4
(100%) 17 70,8
Calcificação distrófica difusa
- 1
2 (50%)
-
- 2
(50%) 5 20,8
Neovascularização
-
-
-
- 2
(50%)
- 2 8,33
Degeneração tubular - 4
(100%) 3
(75%) 4
(100%) -
4 (100%)
11 45,8
Congestão - 2
(50%) -
1 (25%)
1 (25%)
- 4 16,6
Edema subcapsular - 1
(25%) - - - - 1 4,16
Total de animais 4 4 4 4 4 3 23 -
FA - Frequência absoluta; FR - Frequência relativa.
Fonte: Macêdo (2013).
5.2 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA DE EPIDÍDIMO
46
O grupo (G1) não teve alteração no parênquima epididimário nos diferentes períodos
experimentais (Figura 9A). Os achados histológicos do epidídimo no 7° dia pós-aplicação da
solução de gluconato de zinco por via intratesticular nos grupos experimentais (G2) ao (G6)
foram semelhantes com relação: à atrofia do ducto epididimário (Figura 9B); discreto
infiltrado mononuclear-linfocitário; deposição de tecido conjuntivo entre o ducto; proliferação
e ativação fibroblastos; deposição de colágeno; neovascularização, dilatação ductal. Também
foram visualizados no interior do ducto material proteináceo, restos celulares e de
espermatozoides (Figura 9E). Além dos achados descritos anteriormente, os animais do grupo
G4 apresentaram redução dos estereocílios no polo apical das células epididimárias (Figura
9D). No grupo(G4) e (G5) foi constatada presença de infiltrado eosinofílico moderado no
tecido conjuntivo. No grupo (G6) havia hiperplasia da camada muscular (Figura 9F). Os
animais que receberam Infertile® e foram tratados por 7 dias com dipirona tiveram grande
quantidade de macrófagos periductal e intraductal (Figura 9C). Nesses animais, o interior do
ducto epididimário continha macrófagos em diversos estágios de ativação e degeneração,
assim como plasmócitos.
As lesões histopatológicas que caracterizam uma epididimite apresentam-se associadas
à orquite devido à proximidade anatômica entre esses órgãos (VALE et al., 2008). Agentes
infecciosos com tropismo pelo parênquima testicular e que causam intensa reação
inflamatória como a Burkholderia mallei, ocasionam orquite e epididimite severa com
presença de células germinativas de descamação no lume do ducto (SILVA et al., 2005).
Insulação escrotal, cujo principio de degeneração testicular se baseia no aumento da
temperatura escrotal, promove o aparecimento dos mesmos achados no epidídimo, porém sem
reação inflamatória deste (MOREIRA et al., 2001). A utilização de diferentes classes de anti-
inflamatórios não impediu que a reação inflamatória promovida pelo gluconato de zinco nos
testículos se disseminasse para o parênquima epididimário. Contudo, as lesões inflamatórias
não foram intensas neste período avaliado nos animais tratados com celocoxibe, meloxicam e
dexametasona. Por outro lado, os animais que receberam apenas dipirona após a injeção com
gluconato de zinco possuíam lesões mais extensas as quais foram compatíveis com as
observadas no testículo.
Quinze dias após infiltração testicular do Infertile® verificou-se nos grupos G2, G3,
G4, G5 e G6 as seguintes lesões em comum: 1) diminuição do diâmetro e lume do ducto
epididimário (Figura 10C), porém sem atrofia do epitélio; 2) proliferação de fibroblastos,
deposição de colágeno e neovascularização; 3) presença de infiltrado inflamatório discreto
(Figura 10D), assim como, ductos com massa espermática eosinofílica degenerada (Figura
A B
47
10F). Entretanto, o grupo (G2) possuía no parênquima áreas com massa eosinofílica
intraductal constituída por espermatozoides degenerados e debris celulares (Figura 10B). Os
animais que receberam do grupo (G4) durante os 7 dias após a infiltração com gluconato de
zinco e foram avaliados no 15° dia pós-infiltração continham escassos espermatozoides na
massa eosinofílica e maior número de debris celulares (células germinativas). Nos epidídimos
oriundos dos grupos G3, G4 e G6 constatou-se um afastamento importante da camada
muscular lisa hiperplásica do epitélio graças à deposição mais acentuada de colágenos. No
grupo G5 não continha massa espermática no lúmen do ducto epididimário. Neste período, 15
dias após a injeção intratesticular, todos os epidídimos, exceto no do grupo (G5), possuíam
um forte indicativo do efeito positivo da ação do Infertile®, a presença de massa espermática
degenerada entremeada por macrófagos e células germinativas necrosadas.
No final do período experimental (30 dias), observou-se em todos os tratamentos: 1)
presença de fibroblastos ativos com deposição de colágeno e neoformação vascular na região
intersticial entre o ducto epididimário; 2) redução do diâmetro e lume do ducto com a
preservação da altura do epitélio (Figura 11C); 3) ducto da porção caudata do epidídimo
possuía variado grau de dilatação; 4) ducto com lume vazio e outros com materiais
proteináceos amorfos e debris celulares foram achados bastantes comuns (Figura 11F); 5)
infiltrado monuclear-linfocitário (Figura 11E).
Nos animais do grupo (G4) durante os 7 dias após infiltração com gluconato de zinco
e foram avaliados no 30° dia pós-infiltração, pôde-se observar células de descamação e
espermatozoides no lume epididimário e ainda migração transepitelial de macrófagos (Figura
11D). Os grupos G3 e G6 apresentaram hiperplasia de músculo liso ao redor do ducto
epididimário e o grupo (G2) diferenciou-se dos demais tratamentos por conter atrofia epitélio
epididimário, macrófagos e plasmócitos no lume formando massa eosinofílica com células
germinativas, espermatozoides necróticos e células sinciciais descamadas do epitélio
germinativo testicular (Figura 11B). A ausência de espermatozoides no lúmen do ducto
epididimário evidencia a eficácia do tratamento com zinco e também foi relatada por Fahim et
al. (1993).
5. CONCLUSÕES
A
B
C D
E F
B
48
1. A injeção intratesticular de Infertile® foi eficiente em promover esterilização mesmo
após utilização de terapia anti-inflamatória.
2. O emprego de anti-inflamatórios esteroidais (AIES) e não-esteroidais (AINES) por 7
dias pós-infiltração testicular podem ser utilizados no protocolo de esterilização
química para reduzir os efeitos inflamatórios nos animais infiltrados.
3. O efeito anti-inflamatório prolongado da dexametasona interferiu na ação desejada do
Infertile nos 15 primeiros dias®
4. As associações meloxicam/dipirona ou celocoxibe/dipirona são a terapia antiálgica e
anti-inflamatória de eleição nos protocolos testados de esterilização química.
5. A injeção intratesticular de Infertile® foi eficiente em promover redução na
concentração de testosterona plasmática.
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58
APÊNDICES
TS TS
VII
EIT
59
Figura 6: Fotomicrografias de testículos de ratos Wistar adultos submetidos à injeção intratesticular com
gluconato de zinco, em dose única, e tratados com diferentes anti-inflamatórios durante sete dias e avaliados
aos 7 dias.
Figura 6A – Grupo controle: detalhe do túbulo seminífero (TS) no estágio de VII do ciclo do epitélio seminífero e
espaço intertubular (EIT). HE.
Figura 6B – Grupo DMSO: parênquima testicular. Túbulos seminíferos (TS) em secção transversal aumento do
espaço intertubular (EIT) com presença de debris celulares, células inflamatórias e vaso sanguíneo (seta). HE.
Figura 6C – Grupo dipirona: detalhe do túbulo seminífero (TS) em corte transversal. Espaço intertubular (EIT)
aumentado com presença de debris celulares. HE.
Figura 6D – Grupo celocoxibe: detalhe do túbulo seminífero (TS) em corte transversal. Observar espaço intertubular
(EIT) aumentado com presença de debris celulares e células inflamatórias. HE.
Figura 6E – Grupo meloxicam: parênquima testicular. Túbulo seminífero (TS) necrosado em secção transversal e
espaço intertubular (EIT) aumentado com presença de infiltrdo inflamatório e debris celulares (estrela). HE.
Figura 6F – Grupo dexametasona: detalhe do túbulo seminífero (TS) e espaço intertubular (EIT) aumentado e com
presença de vasos sanguíneos (estrelas). HE.
60
Figura 7 Fotomicrografias de testículos de ratos Wistar adultos submetidos à injeção intratesticular com
gluconato de zinco, em dose única, e tratados com diferentes anti-inflamatórios durante sete dias e avaliados
aos 15 dias.
Figura 7A – Grupo controle: detalhe do túbulo seminífero (TS) no estágio de VII do ciclo do epitélio seminífero e
espaço intertubular (EIT). HE.
Figura 7B – Grupo DMSO: túbulo seminífero (TS) degenerado com presença de célula gigante sincicial (cabeça de
seta) e vacuolização de Sertoli (seta preta). Observar espaço intertubular (EIT) aumentado com presença de vasos
sanguíneos (estrela). HE.
Figura 7C – Grupo dipirona: túbulo seminífero (TS) necrosado em corte transversal. Há aumento do espaço
intertubular (EIT) com presença de infiltrado inflamatório (estrela).
Figura 7D – Grupo celocoxibe: detalhe de túbulos seminíferos (TS) contendo células germinativas em corte
transversal. (EIT). HE.
Figura 7E – Grupo meloxicam: parênquima testicular. Túbulo seminífero (TS) necrosado em secção transversal e
aumento do espaço intertubular (EIT) com presença de vasos sanguíneos. HE.
Figura 7F –Grupo dexametasona: detalhe do túbulo seminífero (TS) em corte transversal. Observar espaço
intertubular (EIT) ausência de infiltrado inflamatório. HE.
40 µm 40 µm
40 µm
40 µm 40 µm
200 µm
61
Figura 8: Fotomicrografias de testículos de ratos Wistar adultos submetidos à injeção intratesticular com
gluconato de zinco, em dose única, e tratados com diferentes anti-inflamatórios durante sete dias e avaliados
aos 30 dias. Figura 8A – Detalhe do túbulo seminífero (TS) no estágio de VII do ciclo do epitélio seminífero e espaço
intertubular (EIT) do grupo controle. HE.
Figura 8B – Parênquima testicular de animais do grupo tratado com dimetil sulfóxido (DMSO). Túbulos
seminíferos (TS) em secção transversal, aumento do espaço intertubular (EIT) com células sinciciais (seta). HE.
Figura 8C – Detalhe do túbulo seminífero (TS) necrosado em corte transversal do grupo tratado com dipirona
sódica. Espaço intertubular (EIT) aumentado com presença de infiltrado inflamatório e debris celulares (estrela).
HE.
Figura 8D – Detalhe do túbulo seminífero (TS) necrosado em corte transversal do grupo tratado com celocoxibe.
Observar espaço intertubular (EIT) aumentado com presença de células inflamatórias e de debris celulares. HE.
Figura 8E – Parênquima testicular de animais do grupo tratado com meloxican. Túbulo seminífero (TS) necrosado
em secção transversal e espaço intertubular (EIT) com presença de vários vasos sanguíneos (estrela). HE.
Figura 8F – Detalhe do grupo tratado com dexametasona com túbulo seminífero (TS) necrosado com
polimorfonucleares intratubular (seta), (EIT) aumentado.
14 µm
40 µm
40 µm 40 µm
40 µm 40 µm
62
Figura 9- Fotomicrografias de epidídimos de ratos Wistar submetidos à injeção intratesticular com
gluconato de zinco, em dose única, e tratados com diferentes anti-inflamatórios e avaliados após 7 dias após
tratamento.
Figura 9A – Grupo controle: presença de grande volume de massa espermática ao longo dos ductos epididimários
(estrela). HE.
Figura 9B – Grupo DMSO: redução do diâmetro dos ductos, porém com preservação dos estereocílios (seta). HE.
Figura 9C – Grupo dipirona: presença de grande número de macrófagos embebidos em material proteináceo
(setas). HE.
Figura 9D – Grupo celocoxibe: redução dos estereocílios na superfície dos ductos epididimários (seta) e infiltrado
inflamatório mononuclear discreto (estrela). HE.
Figura 9E – Grupo meloxicam: massa eosinofílica constituída por espermatozoides degenerados com debris
celulares (estrela). HE.
Figura 9F – Grupo dexametasona: hiperplasia de células musculares lisas (estrela). HE.
200 µm 40 µm
40 µm 40 µm
40 µm 40 µm
63
Figura 10- Fotomicrografias de epidídimos de ratos Wistar submetidos à injeção intratesticular com
gluconato de zinco, em dose única, e tratados com diferentes anti-inflamatórios e avaliados após 15 dias após
tratamento.
Figura 10A – Grupo controle: presença de grande volume de massa espermática ao longo dos ductos epididimários
(seta). HE.
Figura 10B – Grupo DMSO: massa eosinofílica constituída por espermatozoides degenerados com debris celulares
(estrela) e células germinativas necróticas (seta). HE.
Figura 10C – Grupo dipirona: atrofia dos ductos epididimários (seta) com infiltrado inflamatório mononuclear
discreto (estrela). HE.
Figura 10D – Grupo celocoxibe: discreto infiltrado inflamatório entre os ductos epididimários (estrela). HE.
Figura 10E – Grupo meloxicam: transmigação epitelial de macrófagos (seta). HE.
Figura 10F – Grupo deaxametasona: massa espermática eosinofílica (estrela). HE.
200 µm
200 µm
200 µm
40 µm
40 µm
14 µm
64
Figura 11 - Fotomicrografias de epidídimos de ratos Wistar submetidos à injeção intratesticular com
gluconato de zinco, em dose única, e tratados com diferentes anti-inflamatórios e avaliados após 30 dias após
tratamento.
Figura 11A – Grupo Controle: presença de grande volume de massa espermática ao longo dos ductos epididimários
(estrela). HE.
Figura 11B – Grupo DMSO: massa eosinofílica constituída por espermatozoides degenerados (seta vermelha),
macrófagos (cabeça de seta) e células sinciciais gigantes (seta). HE.
Figura 11C – Grupo dipirona: discreto infiltrado inflamatório mononuclear (estrela) com atrofia dos ductos
epididimários (seta). Observar ausência de conteúdo luminal. HE.
Figura 11D – Grupo celocoxibe: epitélio do ducto do epidídimo mantém os estereocílios (cabeça de seta) e
apresenta macrófagos com migração transepitelial (seta). HE.
Figura 11E – Grupo meloxicam: discreto infiltrado inflamatório mononuclear entre os ductos epididimários
(estrela). HE.
Figura 11F – Grupo dexametasona: lúmen do ducto epididimário com material proteináceo e debris celulares
(estrela). HE.
14 µm
200 µm
200 µm
200 µm
40 µm
14 µm
65
Figura 12- Fotomicrografias de testículos de ratos Wistar adultos submetidos à injeção intratesticular com
gluconato de zinco, em dose única, tratados com diferentes anti-inflamatórios durante sete dias e avaliados
após 30 dias após tratamento.
Figura 12A – Grupo controle: detalhe do túbulo seminífero no estágio de VII do ciclo do epitélio seminífero e
espaço intertubular. Tricrômico de Gomori
Figura 12B – Grupo DMSO: parênquima testicular. Túbulo seminífero (TS) necrosado em secção transversal e
espaço intertubular (EIT) aumentado com deposição de colágeno (seta) e espessamento da cápsula (estrela).
Tricrômico de Gomori.
Figura 12C – Grupo dipirona: parênquima testicular. Túbulos seminíferos em secção transversal necrosados com
aumento do espaço intertubular (EIT) e deposição de colágeno. Tricrômico de Gomori.
Figura 12D– Grupo celocoxibe: parênquima testicular. Túbulo seminífero (TS) necrosado em secção transversal e
espaço intertubular (EIT) aumentado com deposição de colágeno e espessamento da túnica albugínea (estrela).
Tricrômico de Gomori.
Figura 12E– Grupo meloxicam: parênquima testicular. Túbulos seminíferos em secção transversal com aumento do
espaço intertubular (EIT) e deposição de colágeno (estrela). Tricrômico de Gomori.
Figura 12F– Grupo dexametasona: parênquima testicular. Túbulo seminífero (TS) necrosado em secção transversal
e espaço intertubular (EIT) com infiltrado inflamatório (estrela) e espessamento da túnica albugínea (seta).
Tricrômico de Gomori.
40 µm
200 µm 200 µm
200 µm 200 µm
40 µm
