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UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ
Caroline Pereira Duarte
PREVALÊNCIA DE MASTITE E ELABORAÇÃO DE BACTERINA
CONTRA Staphylococcus aureus EM UM REBANHO LEITEIRO DA
REGIÃO SUL DO PARANÁ
CURITIBA
2011
15
PREVALÊNCIA DE MASTITE E ELABORAÇÃO DE BACTERINA
CONTRA Staphylococcus aureus EM UM REBANHO LEITEIRO DA
REGIÃO SUL DO PARANÁ
CURITIBA
2011
Caroline Pereira Duarte
PREVALÊNCIA DE MASTITE E ELABORAÇÃO DE BACTERINA
CONTRA Staphylococcus aureus EM UM REBANHO LEITEIRO DA
REGIÃO SUL DO PARANÁ
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Medicina Veterinária da Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná para a obtenção do grau de Médico Veterinário.
Orientadora: Elza Maria Galvão Ciffoni.
Curitiba
2011
TERMO DE APROVAÇÃO
Caroline Pereira Duarte
PREVALÊNCIA DE MASTITE E ELABORAÇÃO DE BACTERINA
CONTRA Staphylococcus aureus EM UM REBANHO LEITEIRO DA
REGIÃO SUL DO PARANÁ
Este Trabalho de Conclusão de Curso foi julgado e aprovado para a obtenção do
título de graduação de Médico Veterinário no Curso de Medicina Veterinária da
Universidade Tuiuti do Paraná
Curitiba, 08 de dezembro de 2011
_______________________________________________
Medicina Veterinária
Universidade Tuiuti do Paraná
Orientador: Profa. MSc. Elza Maria Galvão Ciffoni.
Prof.MSc. Manoel Lucas Javorouski
Prof. Dr. Uriel Vinícius Cotarelli Andrade
AGRADECIMENTOS
A Deus, por todas as bênçãos e pelo dom de amar, proteger e cuidar dos
animais.
Aos meus pais Nilso e Vera pela dedicação e oportunidade de me ajudar a
realizar o meu sonho, por todo apoio, paciência e conselhos durante esses cinco
anos. Aos meus irmãos Carlos Eduardo e Cristiane e a todos que sempre
acreditaram e apoiaram a minha profissão. Muito obrigada.
Ao Luiz Felipe que me acompanhou nessa trajetória e esteve ao meu lado
nas horas alegres e tristes. Você foi meu porto seguro durante todo esse tempo, e
se mostrou tão apaixonado pelos animais quanto eu.
Aos meus colegas de turma por todos esses anos de muito estudo,
dedicação, dificuldades, risadas. Agradeço especialmente minhas amigas
Lilliam, Diana e Lys pela amizade verdadeira e companheirismo, foi uma longa
caminhada até aqui, mas podemos nos orgulhar de cada passo, cada hora de
estudo, e cada momento de diversão que tivemos juntas. À minha amiga
Janaínapor todos os conselhos e pela grande amizade construída durante o
período de estagio curricular. Guardarei tudo como lembrança dos melhores
anos da minha vida. Amo todos vocês.
Agradeço a Dra. Kátia pela confiança, oportunidade e paciência de me
ensinar tudo o que sabe. Todos esses anos na ZooMed me fizeram aprender
muito e me tornaram uma pessoa preparada para exercer minha profissão.
A todos os meus mestres por serem essenciais na minha formação e por
todo conhecimento compartilhado durante a graduação. É por vocês que hoje eu
me torno Médica Veterinária. Muito obrigada, especialmente ao Professor
WeligtonHartmann e a ProfessoraElza Maria Galvão Ciffoni, Uriel Vinícius
Cotarelli Andrade, vocês foram maravilhosos!
Aos animais por serem obras lindas de Deus, razão de todo meu estudo e
dedicação!
LISTA DE ABREVIATURAS
AD- Anterior direito
AE- Anterior esquerdo
AMO- Amoxicilina
APCBRH- Associação Paranaense de Criadores de Bovinos da Raça Holandesa
BHI- Brain Heart Infusion
CMT- CaliforniaMastitis Test
CCS- Contagem de Células Somáticas
CTB- Contagem Total de Bactérias
ECC- Escore corporal
EST- Estreptomicina
ENO- Enrofloxacina
FPS- Fazenda Pé da Serra
HV- Hospital Veterinário
IgA- Imunoglobulina A
IgG- Imunoglobulina G
15
IgM- Imunoglobulina M
mL- mililitros
m²- metro quadrado
OPG- Ovos por grama
PD- Posterior direito
PE- Posterior esquerdo
PEN- Penicilina
TET- Tetraciclina
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Ordenhadeira mecanizada do tipo espinha de peixe 2 x 6 localizada na sala de ordenha da FPS-UTP
18
Figura 2. Sala de ordenha equipada com tanque resfriador para armazenar o leite proveniente da ordenha mecanizada
18
Figura 3. Baias de internamento, borregos e tronco de contenção do HV-UTP
20
Figura 4. Baias de internamento do HV-UTP
20
Figura 5. Realização dopré-dipping antes da colheita das amostras
45
Figura 6. Coleta das amostras para microbiologia 46
Figura 7. Frascos plásticos contendo as amostras de leite; placas de Petri para semeadura
47
Figura 8. Semeadura em Placa contendo Agar Mueller Hinton
47
Figura 9. Frascos identificados contendo BHI 48
Figura 10. Frascos de BHI semeados com colônias 48
15
Figura 11. Coloração de Gram em lâminas 49
Figura 12. Frasco Erlenmeyer com a mistura de caldos BHI 50
Figura 13. Dois tubos com caldo Thioglicolato; dois tubos com caldo Sabouraud
52
Figura 14. Placas contendo Agar Sangue de carneiro e Agar Manitol; frasco com bacterina
53
Figura 15. Cobaias utilizadas para teste da vacina. Inoculadas 0,3mL de vacina em três animais e 0,2mL de vacina em outros três animais
53
Figura 16. Realização do CMT antes da segunda aplicação da vacina
54
Figura 17. Resultado do CMT e observação de reação gelatinosa indicado três cruzes
55
Figura 18. Preparação da vaca e de 3,0mL vacina para ser aplicado via subcutânea
55
Figura 19. Aplicação de 3,0mL da vacina no subcutâneo
próximo ao úbere
56
Figura 20. Antibiograma e formação de halos como reação aos
princípios ativos
58
Figura 21. Staphylococcus aureus 58
Figura 22. Staphylococcus aureus (amarelo-ouro); Staphylococcusspp (vermelho)
60
Figura 23. Sensibilidade de Staphylococcus aureus aos
antibióticos testados
61
Figura 24. Caldo Thioglicolato apresentando turgidez devido ao crescimento bacteriano
63
Figura 25. Crescimento bacteriano no primeiro teste de sensibilidade em placa
64
Figura 26. Segundo teste de pureza confiável, sem crescimento bacteriano
64
Figura 27. Caldo Thioglicolato translúcido sem crescimento
bacteriano
65
Figura 28. Caldo Sabouraud sem crescimento bacteriano 65
Figura 29. Vacina pronta com 25mL de Hidróxido de alumínio
como adjuvante vacinal
66
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Casuística de Clínica Médica e Cirúrgica de Bovinos no HV-UTP no período de 08 de agosto a 08 de outubro de 2011
21
Tabela 2. Casuística de Clínica Médica de Ovinos no HV-UTP no período de 08 de agosto a 08 de outubro de 2011
22
Tabela 3. Casuística de Clínica Médica de Equinos no HV-UTP no período de 08 de agosto a 08 de outubro de 2011
22
Tabela 4. Casuística de Clínica Médica e Cães no HV-UTP no período de 08 de agosto a 08 de outubro de 2011
22
Tabela 5. Exames clínicos e patológicos realizados nos laboratórios do HV-UTP no período de 08 de agosto a 08 de outubro de 2011
23
Tabela 6. Leitura das reações das placas em testes de CMT e relação com CCS
57
Tabela 7. Classificação quanto a resistência do microrganismo frente aos antibióticos
59
Tabela 8. Identificação do patógeno isolado de mastite bovina do rebanho de animais da FPS-UTP
62
Tabela 9. Resultado do CMT antes da primeira aplicação davacina
67
Tabela 10. Resultado CMT antes da segunda aplicação da vacina (Segunda semana)
68
Tabela 11. Resultado CMT depois da terceira aplicação da vacina (Terceira semana)
68
Tabela 12. Resultados obtidos no CMT da primeira e terceira semana do experimento
69
15
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Esquema de vacinação contra E.coli em novilhas 43
SUMÁRIO
1. Apresentação ..........................................................................................16
2. Descrição do local do estágio.......................................................... 17 a 20
3. Descrição das atividades desenvolvidas no estágio........................ 21 a 26
4. Prevalência de mastite e elaboração de bacterina contra Staphyloccocus
aureus em um rebanho leiteiro da região sul do
Paraná................................................................................................... 27 a 70
5. Referências Bibliográficas ............................................................. 70 a 75
6. Conclusão do Estagio............................................................................. 76
RESUMO
O estágio curricular de Caroline Pereira Duarte referente à conclusão do curso
de Medicina Veterinária foi realizado no período de 08 de agosto de 2011 a 08
de outubro de 2011, na Fazenda Pé da Serra pertencente à UniversidadeTuiuti
do Paraná, localizada no município de São José dos Pinhais, estado do Paraná
sob orientação profissional do Professor Dr. Welington Hartmann e orientação
acadêmica da Professora Dra. Elza Maria Galvão Ciffoni. As atividades
desenvolvidas proporcionaram relacionar o aprendizado teórico obtido em sala
de aula com a prática desenvolvida a campo de trabalho, incluindo atendimento
hospitalar, laboratorial, cirúrgico e de manejo de bovinos leiteiros. O estudo
realizado e praticado teve sua ênfase referente à mastite, proporcionando a
realização de exames para identificação do agente infeccioso, tratamento
adequado com antibioticoterapia, elaboração e uso de vacina.
Palavras-chave: TCC, bovinocultura leiteira, mastite, vacina
16
1. APRESENTAÇÃO
O seguinte trabalho descreve as atividades desenvolvidas durante o
Estágio Curricularrealizado no Hospital Veterinário – Fazenda Pé da Serra
pertencente à Universidade Tuiuti do Paraná. O estágio realizou-se no período
de 08 de agosto de 2011 a 08 de outubro de 2011, com carga horária de 450
horas.
Durante esse período foi realizado um estudo sobre mastite bovina,
envolvendo exames, diagnóstico e tratamento das vacas, visando diminuir a
prevalência da doença no rebanho leiteiro da Fazenda Pé da Serra.
17
2. DESCRIÇÃO DO LOCAL DE ESTÁGIO
O estágio curricular foi realizado na Fazenda Pé da Serra (FPS-UTP),
localizada na Estrada do Taquaral Queimado em São José dos Pinhais,
pertencente àUniversidade Tuiuti do Paraná, a qual possui o Hospital
Veterinário de Grandes Animais. O estágio foi supervisionado pelo Médico
Veterinário Dr. Welignton Hartmann- Professor de Bovinocultura e Clínica
Médica de Bovinos, e acompanhado pelos Médicos Veterinários
ResidentesLiédge Camila Simioni e Fernando Cella.
Fazenda Pé da Serra
A FPS-UTP tem um rebanho leiteiro de 129 animais entre vacas e
bezerros, sob o manejo semi-intensivo, totalizando 48 vacas em produção, 36
bezerros sendo 14 machos e 22 fêmeas; 22 novilhas a partir de 8 meses de idade.
As vacas em produção são ordenhadas na ordem de novilhas, vacas que não
apresentam CMT alto e vacas mais velhas que apresentam quadro de mastite,
duas vezes ao dia com o sistema de ordenhadeira mecânica do tipo espinha de
peixe 2x6 (fig.1). O leite é armazenado em um tanque resfriador até ser
transportado (fig. 2).
18
Figura 1. Ordenhadeira mecanizada do tipo espinha de peixe 2 x 6
localizada na sala de ordenha da FPS-UTP, 2011
Figura 2. Sala de ordenha equipada com tanque resfriador para armazenar
o leite proveniente da ordenha mecanizada da FPS-UTP, 2011
19
Atualmente, o manejo dos animais é realizado por seis funcionários, cada
um com uma função determinada para o bom funcionamento da rotina.A
Fazenda dispõe de atividades relacionadas a várias áreas da Medicina
Veterinária, sendo inclusos a suinocultura (com 88 leitões, 19 matrizes e dois
cachaços), caprinocultura (com três machos e três fêmeas adultos), ovinocultura
(58 fêmeas adultas, 11 fêmeas jovens, seis machos adultos e 22 borregos),
estrutiocutura (com 17 animais), equideocultura (26 animais entre machos e
fêmeas) e bovinocultura de leite (129 animais entre fêmeas e bezerros).
Hospital Veterinário da Universidade Tuiuti do Paraná (HV-UTP)
O HV-UTP localizado na FPS-UTP tem plantão 24 horas, para
atendimento de pequenos, médios e grandes animais. Conta no corpo clínico
com o trabalho de dois médicos veterinários residentes (Liédge Camila Simioni
e Fernando Cella) e professores do corpo docente do Curso de Medicina
Veterinária da UTP.
São realizados atendimentos internos e externos, inclusive aos produtores
da região, assim como um projeto direcionado a castração dos animais
vinculados à prefeitura do município de Quatro Barras, o qual tem por objetivo
minimizar a população de cães nas ruas e também para facilitar o entendimento
dos proprietários sobre a saúde animal e posse responsável.
20
O HV-UTPconta com uma infra-estrutura de 1.100 m², divididos em áreas
como laboratório clínico e de reprodução, sala de raios-X e ultrassonografia,
centro cirúrgico, baias de internamento, ambulatório de pequenos animais,
quarentena e salas de aula.
Figura 3. Baias de internamento, borregos e tronco de contenção do HV-UTP.
Novembro de 2011
Figura 4. Baias de internamento do HV-UTP
21
3. DESCRIÇÃO DAS ATIVIDADES REALIZADAS NO ESTÁGIO
O estágio foi realizado na área de Clinica Médica de Grandes animais
onde foi possível relacionar a teoria com a prática, facilitando o aprendizado e o
conhecimento de todas as espécies e objetivando experiência na profissão.
Foram atendidos 565 casos e exames durante o período. Dentre as atividades,
foram acompanhados 47casos de clínica médica e cirúrgica de bovinos (tab. 1).
Tabela 1. Clínica Médica e Cirúrgica de Bovinos do Rebanho da Fazenda Pé da
Serra, no período de 08 de agosto a 08 de outubro de 2011
TOTAL 47 100%
CLINICA MÉDICAE CIRÚRGICA DE BOVINOS
N de casos Percentual (%)
BEZERROS
Fratura 1 2,1
Hiperreflexia de tendão 1 2,1
Abcesso umbilical em novilha 1 2,1
Babesiose 1 2,1
Miíase umbilical 1 2,1
Pneumonia 1 2,1
Curativo umbilical 1 2,1
Mochaçãoà ferro 8 17
BOVINOS ADULTOS 1 2,1
Ruminorrafia 1 2,1
Descorna cirúrgica 3 6,3
Claudicação 2 4,2
Curativo e medicação descorna 3 6,3
Artrite 1 2,1
Prescrição de antibióticospara vacas com mastite 20 42
Aborto 1 2,1
22
Tabela 2. Clínica Médica de Ovinos da Fazenda Pé da Serra, no período de 08
de agosto a 08 de outubro de 2011
CLÍNICA MÉDICADE OVINOS
N de casos Percentual %
Miíase 1 1,9
Trauma em MPD de borrego 1 1,9
Claudicação 3 1,5
Timpanismo 1 1,9
Avaliação clínica (Famacha/ECC) 92 48,4
TOTAL 98 100%
Tabela 3. Clínica Médica de Equinos no HV-UTP, no período de 08 de agosto a
08 de outubro de 2011
CLÍNICA MÉDICA DE EQUINOS
N de casos Percentual %
Vermifugação/ resenha 26 86,6
Aborto Infeccioso 1 3,33
Óbito 1 3,33
Aborto natural 2 6,6
TOTAL 30 100%
Tabela 4. Clínica Médica e Cirúrgica de Cães no HV-UTP, no período de 08 de
agosto a 08 de outubro de 2011
CLÍNICA MÉDICA E CIRÚRGICA DE CÃES
N de casos Percentual %
Exerese deHemangiosarcoma 1 3,3
OvárioSalpingoHisterectomia 15 50
Piometra 5 16,6
Orquiectomia 8 26,6
Insuficiência Renal Crônica 1 3,3
TOTAL 30 100%
23
Tabela 5. Exames clínicos e patológicosrealizados nos laboratórios do HV-
UTPno período de 08 de agosto a 8 de outubro de 2011
EXAMES CLINICOS E PATOLÓGICOS
Espécie N de casos Percentual (%)
BOVINOS
Hemograma 2 0,5
RX em bezerro 1 0,2
OPG novilhas 20 5,5
Coleta de sêmen 1 0,2
CMT 20 5,5
OVINOS
Exame andrológico 4 11,1
Hemograma 1 0,2
Citologia vaginal 18 5
OPG 272 75,5
Ultrassonografia 14 3,8
Necropsia borrego 1 0,2
EQUINOS
Necropsia 2 0,5
CÂES
Ultrassonografia 2 0,5
Raio X 2 0,5
TOTAL 360 100%
Dentre as práticas de manejo acompanhadas:
Reprodução de lagomorfos e pesquisas com ovinos apresentadas na X
Semana de Iniciação Científica da UTP:
• Etograma de cordeiros desmamados submetidos ao tratamento
homeopático anti-estresse
VIDA, Janaína J. M.; DUARTE, Caroline; SIMIONI, Liédge C.; CIFFONI, Elza
M.G.
24
Resumo: O presente experimento teve por objetivo a avaliação do uso de
produto homeopático (Camomila CH30 e Ignatia CH30) em cordeiros
desmamados, para avaliar sua ação anti-estresse e sua influência no
comportamento dos cordeiros. Foram utilizados dois grupos de 16 animais
cada, onde um grupo recebeu 10 gramas do produto homeopático por animal,
diluído em água e administrado via oral. O outro grupo recebeu 10 g de
sacarose por animal, diluída em água, administrada da mesma forma. A
administração foi feita uma vez por dia, no período da manhã. Os animais
foram observados três vezes por dia para a realização de um etograma,
durante 30 dias. O resultado observado foi que os animais do grupo 1
permaneceram mais tempo deitados e mais tempo se alimentando, isso como
conseqüência do uso do produto homeopático o qual causou a diminuição do
estresse dos animais e aumentou o hábito ingestivo dos mesmos. Já os
animais do grupo 2 permaneceram mais tempo em pé. Estes não receberam o
produto homeopático e assim não houve a diminuição do estresse.
Palavras-chave: cordeiros, desmame, etograma, homeopatia
25
• Influência do tratamento homeopático anti-estresse no controle parasitário
de cordeiros desmamados
VIDA, Janaína J. M.; DUARTE, Caroline; SIMIONI, Liédge C.; CIFFONI, Elza
M.G.
Resumo: O projeto de pesquisa foi realizado na Fazenda Experimental da
Universidade Tuiuti do Paraná, com o objetivo de avaliar o uso de um produto
homeopático (Camomila CH30 e Ignatia CH30 e sacarose) em cordeiros
desmamados. Esse produto tem ação anti-estresse e como conseqüência exerce
influencia sobre o escore de condição corporal (ECC), peso corporal, índice
FAMACHA e contagem de ovos por grama (opg) de fezes dos animais.Foram
utilizados dois grupos de 16 animais cada, onde um grupo recebeu 10 gramas do
produto homeopático misturado em água e administrado via oral, para cada
animal. O outro grupo recebeu 10 g de sacarose por animal, misturada em água,
que será administrada da mesma forma. A administração foi feita uma vez por
dia, no período da manhã.Os animais foram observados três vezes por dia para
que seja feito um etograma, durante 30 dias. Uma vez por semana foi feita a
pesagem dos cordeiros, avaliação do ECC e índice FAMACHA, e a colheita de
fezes para a contagem de opg. Os dados foram avaliados estatisticamente pelo
método dos Quadrados Mínimos.O projeto foi desenvolvido no período de 1º de
agosto a 1º de setembro de 2011.
Palavras-chave: controle parasitário, cordeiros, desmame, homeopático
26
A seguir, será apresentado na forma de artigo científico o experimento com
mastite bovina: PREVALÊNCIA DE MASTITE E ELABORAÇÃO DE
BACTERINA CONTRA Staphyloccocus aureus EM UM REBANHO
LEITEIRO DA REGIÃO SUL DO PARANÁ.
27
4. PREVALÊNCIA DE MASTITE E ELABORAÇÃO DE
BACTERINA CONTRA Staphyloccous aureus EM UM REANHO
LEITEIRO DA REGIÃO SUL DO PARANÁ
Caroline Pereira Duarte, Welington Hartmann, Uriel Vinícius Cotarelli
Andrade
Resumo: A mastite é uma doença que vem causando um grande impacto tanto
econômico, quanto de criação nos rebanhos leiteiros. É uma doença infecciosa,
facilmente transmitida entre os animais, causada na maioria das vezes por
Staphylococcus aureus. Sua principal forma clínica é de difícil detecção, sendo
necessários, isolar o agente infeccioso e instituir tratamento adequado para o
controle da doença no rebanho. A elaboração e aplicação de 3,0mL da vacina
promoveram o tratamento semanal de vacas lactantes com mastite crônica.
Palavras- chave: doença, mastite, vacas, vacina
INTRODUÇÃO
Dentre todas as doenças, a que tem maior relevância e acomete o gado
leiteiro é a mastite. A mastite é uma infecção da glândula mamária, causada em
sua maior partepela bactéria Staphylococcus aureus, a qual éfacilmente
transmitida dentro de um rebanho. São cocos Gram-positivos, imóveis,
arrumados em cachos de uva (BARBALHO& MORA, 2001).Dentre as fontes
28
mais comuns de infecção está a má higiene do ambiente onde os animais são
mantidos, dos equipamentos de ordenha, das mãos do ordenhador e das lesões
nas tetas das vacas.
A glândula mamária biologicamente é destinada à alimentação do
neonato(PEREIRA NETO, 2010). Mesmo assim, os produtores buscando visar
fins comerciais vêm cada vez mais investindo em melhoramento genético,
buscando maior desempenho da vaca e sua efetiva produtividade de leite.
O Brasil é o sexto maior país produtor de leite, produzindo
aproximadamente 27 bilhões de litros por ano e o alto crescimento nos últimos
anos explica-se pela necessidade de atender a uma demanda interna também
crescente (SEBRAE, 2010).
A mastite vem causando muito impacto econômico para os produtores
pela dificuldade do tratamento, resistência bacteriana, difícil controle e rápida
disseminação, queda na produção de leite, perda de qualidade do leite, perda do
tecido mamário (fibrose), maior custo de produção, descarte prematuro e morte
das vacascomo principais consequênciasda mastite.
A principal forma de mastite é a subclínica, dificilmente observada pelos
produtores devido à ausência de sinais clínicos evidentes. O isolamento
bacteriano é a forma mais rápida de diagnóstico, com bons resultados a fim de
se destinar o melhor tratamento usando antimicrobianos específicos. A produção
de vacinas para mastite tem se tornado uma forma eficaz no tratamento de vacas
29
com casos recidivantes. O seu efeito é mais rápido, sendo necessárias aplicações
semanais para um efetivo controle no rebanhoondepode ser utilizada tanto para
profilaxia quanto para tratamento.
O objetivo deste trabalho foi estabelecer a prevalência de mastite no
rebanho, isolar o agente infeccioso, instituir tratamento com antibióticos
específicos e utilizar a vacina produzida.
REVISÃO DE LITERATURA
A glândula mamária é uma glândula cutânea, evoluída de uma glândula
sudorípara com características comuns: desenvolvimento por meio de
invaginação da ectoderme e epitélio de camada dupla de célulassecretoras
internas e células mioepiteliais externas as quais, por meio de contração,
promovem o fluxo de leite dos alvéolos periféricos para os ductos principais
(ANDREWS et al,.2008). A função da glândula mamária é fornecer ao neonato
imunidade e nutrição.
Segundo a descrição de Andrews et al,.(2008), a glândula mamária da
vaca contém quatro quartos, cada um representando uma glândula mamária
individual drenada por um único teto. As quatro glândulas secretoras são
estruturalmente separadas e funcionam de forma independente, sem fluxo de
leite entre elas. O grande fluxo de sangue e o armazenamento em geral conferem
à glândula mamária lactante um peso de 50 a 60 Kg. A sustentação desse alto
30
peso fica por conta dos ligamentos suspensores de denso tecido fibroso,
inseridos no interior da pelve, e dos tendões da paredeabdominal.Cada teta
possui um canal estreito que se abre dorsalmente em uma cisterna mais larga e
revestida por epitélio de camada dupla. Normalmente, o canal da teta é mantido
fechado pelo esfíncter de tecido muscular liso e tecido elástico circundante.
Os constituintes do leite são sintetizados principalmente a partir de
pequenas moléculas absorvidas do sangue, com provável auxílio de sistemas
transportadores específicos para sua entrada nas células secretoras. O
suprimento sanguíneo propicia não apenas não apenas precursores para a síntese
láctea, mas também substratos para produção de energia necessária para acionar
os mecanismos de síntese. O leite é composto por lactose numa concentração de
aproximadamente (4,8%), gordura (3,2%), sais minerais, água (86%), caseína
representando a proteína (ANDREWS et al.2008).
A imunologia da glândula mamária e do teto pode ser compreendida por dois
tipos de mecanismos: inespecíficos e específicos.
• Inespecífico
Segundo Andrewset al. (2008) e Rebhun (2000), é a primeira linha de defesa
contra a invasão de um patógeno, frequentemente capaz de impedir que vários
microrganismos infecciosos penetrem na glândula mamária. O teto é uma
barreira importante contra infecções, por possuir sua superfície externa em
31
contato com o ambiente. O canal da teta funciona como uma barreira
mecânicacomposta de uma rede de ceratina originada de células superficiais do
epitélio escamoso estratificado e forma uma rede no lúmen, aprisionando e
impedindo que microrganismos invadam a glândula, através de um sistema
defesa químico composto de lipídeos e proteínas antimicrobianas (REBHUN,
2000). Substâncias antimicrobianas no canal do teto participam da defesa da
glândula mamária, entre eles estão os ácidos graxos mirístico, palmitoléico e
linoleico que são insaturados e com alta capacidade de inibição de
microrganismos.
• Específicos
É exercida pela presença de linfócitos, representantes de 1 a 2% da
população de células do leite. Os linfócitos compreendem linfócitos T e
linfócitos B, juntamente com uma população de células linfóides, que não
possuem constantemente marcadores de linfócitos T ou B; na secreção mamária
em período seco a porcentagem de linfócitos B se eleva de forma discreta
(ANDREWS et al.2008).
O leite contém a maior parte das classes de imunoglobulinas em diferentes
teores, que variam durante a lactação. A IgG está presente em maior
concentração, e passa do sangue para o leite por meio de um processo de
transferência seletiva. Durante a inflamação da glândula mamária a IgG e outras
proteínas são transferidas do sangue para o leite. Algumas imunoglobulinas
32
como IgM e a IgA, são produzidas localmente a partir de células da série
linfoblástica-plasmocitária, localizadas próximas ao epitélio glandular em varias
partes da glândula mamária.
O sistema mais efetivo de defesa da glândula mamária contra patógenos
invasores é a fagocitose pelos neutrófilos. Em geral, há uma pequena quantidade
dessas células no leite, com predomínio de macrófagos e linfócitos no leite de
vacas saudáveis. Quando uma infecção se inicia, o numero de neutrófilos
aumenta, estimulado pela presença de bactérias e produtos bacterianos que
induzem a liberação de mediadores inflamatórios endógenos. Esses mediadores
ocasionam a adesão de neutrófilos na parede dos capilares, provocam
relaxamento das junções das células endoteliais e permitem diapedese de
neutrófilos aos tecidos conjuntivos subepiteliais adjacente (ANDREWS et
al.2008).
As células epiteliais, neutrófilos (aparecem 90% em casos de infecção da
glândula) e macrófagos, são os principais representantes de células somáticas do
leite. Os neutrófilos sofrem uma significativa diminuição em número no leite,
em comparação com o sangue, se faz necessário um numero grande de
neutrófilos para combater uma infecção. A contagem de células somáticas
aumenta em quartos não infectados no período seco, e vem a cair no período
periparto (REBHUN, 2000). A resposta neutrofílica traz benefícios no controle
da infecção por Staphylococcus aureus, dificultando uma forma mais grave da
33
mastite. A infecção subclínica persiste pela dificuldade de remoção completa do
microrganismo.
A mastite bovina é causada por muitos agentes infecciosos diferentes,
geralmenteclassificados em dois grandes grupos: os causadores de mastite
contagiosa, que se disseminam de um quarto infectado para outro quarto ou
vaca, e os promotores de mastites ambientais, geralmente presentes no meio
ambiente da vaca e que a partir dessa fonte alcançam a teta (BLOOD &
RADOSTITS, 2000).Assim sendo, a glândula mamária e os tetos representam o
reservatório da infecção. A transmissão ocorre durante a ordenha ou a
preparação do úbere com as mãos, toalhas de pano e copos da ordenhadeira
contaminados. A infecção se instala na superfície do canal da teta. Em seguida,
as bactérias podem penetrar na glândula mamária. A maior parte das infecções é
subclínica e resulta em alta contagem de células somáticas no leite (ANDREWS
et al,.2008).
Peleja et al,. (2006), descreveram que a forma clínica cursa com sinais
evidentes, tais como,edema, hipertermia, endurecimento e dor da glândula
mamária e/ouaparecimento de grumos, pus ou outras alterações das
características do leite. Éum processo inflamatório visível e pode ser
diagnosticado por exame físico. A diminuição da secreção do leite e perda de
função também caracterizam essa forma de mastite, que ocorre geralmente após
o pico de lactação.
34
A forma mais comum é a da mastite subclínica, mais difícil de ser
diagnosticada pela ausência de sinais clínicos evidentes. Todos os rebanhos
leiteiros do Brasil apresentam mastite subclínica em maior ou menos grau
(MACHADO et al. 2000). O agente etiológico encontrado com freqüência nesse
tipo de infecção é o Staphylococcus aureus, bactéria Gram-positiva presente na
pele, com capacidade de invadir outros tecidos, preferencialmente da glândula
mamária. A mastite por Staphylococcus aureus geralmente evolui para infecções
moderadas de caráter persistente, diferentemente dos processos causados por
coliformes (RADOSTITS et al. 2000).
A forma crônica se apresenta com menos reação e os focosde infecção,
começam nos ductos coletores com início agudo e proliferação bacteriana.
Segundo Blood & Radostits (1991), na mastite aguda, os pequenos ductos são
rapidamente bloqueados por grumos de fibrina, levando a um envolvimento
mais grave da área obstruída. Na mastite crônica, a inflamação se restringe ao
epitélio dos ductos, essa inflamação cessa em poucos dias e é substituída por
proliferações de tecido conjuntivo em volta dos ductos levando a seu bloqueio a
atrofia da área por eles drenada.
As perdas significativas estão relacionadas à mastite crônica (50%). Os
quartos acometidos podem se apresentar endurecidos (fibrose), perder a função e
o leite se apresenta com grumos e a contagem de células somáticas aumenta.
35
Na mastite ambiental ao contrário da mastite contagiosa, a maioria das
novas infecções ocorre durante o período entre as ordenhas, embora também
haja ocorrência de novos casos dentro do manejo de ordenha, especialmente em
situações nas quais há problemas de funcionamento do sistema de ordenha.
Além disso, dada a grande disseminação dessas bactérias ambientais na fazenda,
todas as categorias animais estão sob risco: vacas em lactação, vacas secas e
novilhas (MALUF et al, 2009). Bactérias que habitam o ambiente da vaca são
responsáveis por essa forma de mastite e são patógenos dificilmente
diagnosticados pela Contagem de Células Somáticas, causando casos clínicos
agudos com curta duração de até 10 dias. A bactéria coliforme incriminada com
mais frequência como causa de mastite ambiental é a Escherichia coli,embora
outras espécies, incluindoEnterobacteraerogenes, Pseudomonasaeruginosa,
Enterobacter oxytoca, Klebisiella pneumoniae, e Citrobacter spp (ANDREWS
et al. 2008).
Segundo Blood & Radostits (1991) é mais comum que a doença ocorra
poucos dias após o parto e em rebanhos que concentram os partos num período
curto. Podem ocorrer surtos de doença acometendo, em poucas semanas, mais
de 25% das vacas recém-paridas. Todos os componentes ambientais que entrem
em contato com o úbere da vaca são considerados fontes potenciais do
microrganismo. As bactérias coliformes são consideradas oportunistas, sendo
provável que a contaminação primária da pele do úbere e das tetas ocorra entre
as ordenhas, quando a vaca está em contato com a cama contaminada, ao invés
36
de ocorrer durante a ordenha. As fezes são consideradas fonte de E.coli e
contaminam facilmente o períneo e o úbere através da cama, toalhas utilizadas
na limpeza das tetas antes da ordenha, ordenhadeira e mãos do ordenhador. A
E.coli não coloniza a pele do úbere sobre o ducto da teta.
Blood & Radostits (1991) descreveram quea taxa de novas infecções
intramamárias é mais elevada durante as transições da glândula mamária da
lactação para a involução e durante o período de produção de colostro para a
lactação.
Quando a bactéria se insere na glândula mamária, produz uma endotoxina
que altera a permeabilidade vascular causando edema e mobilizando neutrófilos
para controlar o numero de microrganismos presentes. Vacas que pariram
recentemente tendem a ser refratarias a presença de irritantes, como a
endotoxina, sendo, portanto lentas para mobilizar os mecanismos de defesa
depois da infecção (RADOSTITS et al.1991).
Os microrganismos não eliminados podem ficar em latência dentro dos
neutrófilos e podem reaparecer depois de 40 (quarenta) dias causando uma
recidiva da mastite.
Blood & Radostits (1991) argumentaram que a vaca pode estar
gravemente toxêmica, febril e ter diarréia antes de apresentar alterações visíveis
37
na glândula mamária ou no leite. Quartos mamários podem se apresentar
edemaciados e quentes, mas não de forma muito visível para diagnóstico.
O momento da ordenha é um fator predisponente paraa transmissão e
infecção da glândula mamária. A carga de microrganismos aumenta
rapidamente, havendo influência nas condições de higiene dos equipamentos e
instalações, higiene e sanidade animal e do ordenhador, seja ordenha mecânica
ou manual (COELHO & ARENALES, 2002). Durante e após a ordenha é
quando ocorre o maior nível de infecções, já que nesta faze o esfíncter dos tetos
se encontram relaxados e totalmente propícios à incidência de microrganismos
(GANDARA & SOUZA, 2010). As vacas infectadas contaminam a superfície
das teteiras com resíduos de leite, as quais passam a atuar como carreador de
patógenos para a pele da teta de vacas sadias durante a ordenha. Teteiras velhas,
que ultrapassaram a sua vida útil, desenvolvem rachaduras, nas quais ocorrem
acúmulos de bactérias patogênicas. Além disso, a preparação inadequada do
úbere antes da ordenha, pelo uso de toalhas de uso múltiplo ou pelas mãos dos
ordenhadores, também pode atuar na transmissão de agentes causadores de
mastite (SANTOS 2004). A demora em se colocar as teteiras, freqüência do
pulsador muito alta, vácuo desregulado, e bomba de vácuo mal dimensionado
propicia também a contaminação dos animais.
Os métodos diagnósticos de mastite podem ser executados de acordo com
o tipo da doença. Em casos clínicos, um diagnóstico provisório, usualmente, é
38
baseado nos sinais e no conhecimento dos patógenos predominantes no rebanho,
mas ele deve ser confirmado por cultura e testes de sensibilidade (AMSTUTZ et
al. 1991). O diagnóstico da mastite clinica pode ser realizado pelo Teste da
Caneca Telada no inicio da ordenha, em que o primeiro jato de leite do quarto
acometido é desprezado na caneca, podendo obter formação de grumos
característicos da inflamação. Outras alterações como odor, coloração, pus,
presença de sangue e consistência podem ser observados no teste (BLOOD&
RADOSTITS, 2000).
O California Mastitis Test (CMT) desenvolvido por Schalm & Noorlander
em 1957, constitui-se num método indireto de avaliação da quantidade de
células somáticas no leite, o qual baseia-se na atuação de um detergente
aniônico sobre a membrana celular, causando ruptura da mesma e formação de
um gel na interação dos ácidos nucléicos com o detergente (BARBALHO &
MORA, 2001). É um exame de baixo custo e rápido de ser executado para
avaliar o grau de infecção de cada quarto mamário. De acordo com a intensidade
da reação classifica-se em: negativa (0), reação leve (+), moderada (++) e
intensa (+++) (RIBEIRO et al., 2003).
A Contagem de Células Somáticas é um método eficaz para diagnóstico
de mastite subclínica, pois se baseia na avaliação dos leucócitos que compõem o
leite juntamente com células epiteliais que revestem o tecido da glândula
mamária, mensura o padrão de qualidade do leite cru, e é indicador das
39
condições de higiene do rebanho. Esta técnica foi introduzida em 1991, pela
Associação Paranaense de Criadores de Bovinos da Raça Holandesa, varia de
acordo com o controle do rebanho e de fatores genéticos, sendo a herdabilidade
retratada para CCS baixa (0,06 a 0,14), ou seja, há uma maior influência de
fatores ambientais a genéticos, um úbere normal sem infecção pode apresentar
até 200 mil células/mL, sendo que um úbere com infecção apresenta
inicialmente 500mil células/mL.
Segundo Andrews et al. (2008), uma das respostas básicas do hospedeiro
à infecção bacteriana é a migração de leucócitos do sangue para a glândula
mamaria e são eles que protegem o organismo contra patógenos.
O estágio e o número de lactações influenciam na contagem de células
somáticas, as quais aumentam na primeira semana de lactação e gradativamente
diminuem nas próximas semanas, voltando ao seu pico até o final da lactação. O
número de leucócitos polimorfonucleares aumenta dependendo do número de
lactações, pois já houve uma extensão da inflamação nos ductos (ANDREWS et
al., 2008).
O exame microbiológico de amostras de leite colhidas assepticamente é
considerado o método padrão para determinação da saúde do úbere e para o
diagnóstico de mastite bovina (BRITO et al., 1999). Em geral as bactérias que
provocam mastite bovina crescem em Agar sangue em condições de
40
anaerobiose. As vantagens do exame é a possibilidade de identificar o
microrganismo causador e realizar o teste de sensibilidade antimicrobiana.
O antibiograma um exame que permite a identificação de microrganismos
causadores de uma determinada doença, testando a sensibilidade antimicrobiana.
Segundo Andrews (2008), o microrganismo em teste é geralmente classificado
como sensível intermediário ou resistente ao antimicrobiano específico.
O uso indiscriminado de antibióticos é um fator desencadeante da
resistência bacteriana, as concentrações terapêuticas usadas no tratamento de
alguns pacientes resultam em uma alteração da microflora do hospedeiro. As
cepas mais sensíveis são eliminadas rapidamente, permanecendo as que são
resistentes e facilitando sua multiplicação e tratamento. A resistência que se
transfere às drogas tem grande importância, e pode ser determinada na forma de
plasmídeos ou tranpósons, transferidas para cepas sensíveis. Segundo Andrews
et al.(2008), os plasmídeos correspondem a material
genéticoextracromossômico que pode se replicar independentemente do
cromossomo. Esses plasmídeos podem ser transferidos por meio de ligação,
dentro ou entre espécies bacterianas, e também podem atuar como vetores de
transpósons. Isso permite atransferência de resistência a um ou vários
antibióticos únicos, originando várias bactérias resistentes.
Segundo Radostits et al,(2002), para as infecções mastísticas em geral, a
sensibilidade e especificidade da CCS variam entre 15-40% e 92-99%,
41
respectivamente. Para a detecção de vacas com o Staphylcoccus aureus, a CCS
das amostras compostas de leite apesenta sensibilidade que varia de 31-54%.
Na maioria dos casos de mastite clínica, o tratamento de infusão
intramamária com antibióticos, sempre acompanhada pela esgota do quarto
infectado com o uso de ocitocina. Para o tratamento da mastite por
Staphyloccocus aureus é aconselhável o uso de antibiótico sistêmico, pela
dificuldade de eliminação do agente infeccioso. O tratamento da vaca seca tem
por finalidade eliminar as infecções intramamárias já existentes no período seco,
prevenindo novas infecções. Atualmente, as principais alternativas para o
tratamento da mastite subclínica crônica ocasionada por estes agentes
contagiosos são: a terapia combinada, o uso combinado de vacinação e
tratamento intramamário e a terapia estendida. Essas novas alternativas, ainda
que impliquem maiores custos, podem ser viáveis em situações nas quais os
rebanhos apresentam alta prevalência de infecções crônicas (RADOSTITS et al.
2000).
Andrews (2008) descreveu vacina ou bacterinas, como uma suspensão de
microrganismos atenuados ou mortos administrados com a finalidade de
prevenir uma doença infecciosa. Na bovinocultura, a vacina deve ter a
capacidade de induzir resistência da vaca aos microrganismos causadores de
doenças infecciosas do rebanho, a fim de diminuir os impactos econômicos para
os produtores no tratamento. A vacinação tem por objetivo aumentar as
42
concentrações de anticorpos no sangue e no leite frente ao microrganismo
especifico, deste modo fornecendo imunidade pela inibição do crescimento
bacteriano e da produção de toxinas (ALBERTON et al., 2001).
Vacinas Inativadas
São vacinas mortas, o agente infeccioso é inativado, mas retém suas
propriedades antigênicas, embora frequentemente em menor grau do que as
vacinas vivas. É comum inativar as bactérias com formaldeído e incorporá-las
com adjuvantes de alume ou de hidróxido de alumínio. Os adjuvantes
combinados com antígeno são utilizados para garantir uma memória em longo
prazo contra alguns antígenos insolúveis. A eliminação de um antígeno é
retardada pelo uso de adjuvantes que formam um depósito, potencializando uma
resposta imune primaria (TIZARD, 1998).
Andrews (2008) relatou o uso de vacina contra Escherichia coli, principal
patógeno encontrado nos casos de mastite ambiental, em 1990 nos Estados
Unidos, como um grande avanço no controle de mastite causada por coliformes.
São preconizadas três doses da vacina para novilhas, no pescoço por via
subcutânea (quadro 1.) e as vacas podem receber no momento da secagem.
43
Quadro 1. Esquema de vacinação contra E.coli em novilhas
1ª dose:
dois meses antes da
parição
2ª dose:
quatro semanas depois
da primeira aplicação
3ª dose:
duas semanas pós-parto
FONTE: adaptado de Andrews et al, 2008
Segundo Alberton et al(2001), a vacina deve ser aplicada o mais próximo
possível do linfonodo mamário por via subcutânea logo após a ordenha, sendo
que ela auxilia no controle, mas nunca substituirá o bom manejo do rebanho.
A avaliação de métodos imunológicos com o intuito de aumentar a
resistência da vaca leiteira aos patógenos que causam mastite tem avançado ao
longo de quase um século, envolvendo duas linhas de pensamentos propostas
por alguns pesquisadores. Um primeiro grupo defende que não é possível
induzir imunidade mamária, e que prevenção contra microrganismos deve ser
feita através do manejo, antibioticoterapia e seleção genética do rebanho. Outro
grupo afirma que a vacinação contribui para o controle de mastite, desde que
sejam identificados os agentes causadores (ANDREWS et al., 2008).
A profilaxia consiste em um manejo adequado do rebanho, das
instalações, dos equipamentos de ordenha, da higienização dos tetos antes e após
a ordenha (pré e pós dipping), antibioticoterapia e vacinação.
44
Um programa de seis pontos pode ser utilizado como referência na
profilaxia:
• 1- Bom funcionamento do equipamento de ordenha
• 2- Adequadarotina de ordenha
• 3- Tratamentos imediatos de todos os casos clínicos
• 4- Tratamentos das vacas secas
• 5- Descarte de vacas commastite crônica
• 6-Propiciar ambiente adequado
O uso de vacina temse tornado uma medida profilática e de tratamento.
Alberton et al. (2001), demonstrou resultados significativos no experimento de
aplicação de bacterina contra Staphylococcus aureus semanalmente em um
rebanho de 45 vacas, divididas em 3 grupos contendo 15 (quinze) animais.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram selecionadas 19 vacas da Raça Holandesa preta e branca de um
rebanho de 48 vacas em lactação, da Fazenda Pé da Serra localizada em São
José dos Pinhais-PR. A ordenha era mecanizada do tipo espinha de peixe 2 x 6,
e o sistema de manejo é semi-intensivo. Antes da realização das colheitas de
amostras, as tetas foram desinfetadas com solução de iodo 3% diluído em água
(fig.5), e secadas com papel toalha. O primeiro jato foi descartado, e a
amostrapara o CMT (California Mastitis Test), foi homogeneizada na placa com
45
2mL de solução reagente em cada orifício da placa para obter reações, avaliadas
para cada grau de mastitepositivo (+, ++, +++) ou negativo (-), pela observação
de formação gelatinosa na placa.
Figura 5. Realização do pré-dippingantes da colheita das amostras
Em seguida foram colhidas duas amostras de leite, sendo destinadas a:
1) laboratório de microbiologia (fig.6)
2) contagem de células somáticas.
As amostras1 foram colhidas em frascos plásticos estéreis com capacidade
para 10mL (fig.7),e mantidas refrigeradas até serem semeadas em placa de Petri
(fig.8) contendo Agar Mueller Hinton e incubadas em estufa a 37ºC por 24
horas. As colônias formadas foram transportadas para caldo BHI (fig.9 e 10) e
permaneceram incubadas a 37º por 48 horas (NADER et al.,2007). Desse caldo
foram semeadas novas placas com Agar Mueller Hinton testando a sensibilidade
46
dos antibióticos. A amostra 2 foi colhida em frascos estéreis de 10 mL contendo
um comprimido conservante Bronopol. Essas amostras ficaram em temperatura
ambiente e foram conduzidas ao Laboratório do Programa de Análise de
Rebanhos Leiteiros da Associação Paranaense de Criadores de Bovinos da Raça
Holandesa, para realização da Contagem de Células Somáticas (CCS) no
equipamento Somacount 500.
Figura 6. Colheita das amostras de leite para microbiologia
47
Figura 7. Frascos plásticos contendo as amostras de leite e placas de
Petripara semeadura
Figura 8. Semeadura em Placa contendo Agar Mueller Hinton
48
Figura 9. Frascos identificados contendo BHI
Figura 10. Frascos de BHI semeados com colônias
Foram testados cinco princípios ativos: Enrofloxacina (ENO O5),
Tetraciclina (TET 30), Amoxicilina (AMO 10), Penicilina G (PEN G 10) e
Estreptomicina (EST 10), segundo a técnica de Kirby-Bauer que é o método
mais comumente utilizado de teste de sensibilidade por difusão em disco
(RADOSTITS, 2002). Após a incubação em estufa bacteriológica à 37ºC por 24
49
horas, o diâmetro dos halos foram analisados e medidos com um paquímetro
(fig.20).
Com uma alça metálica, foram coletadas colônias ao redor dos halos de
cada placa e foram semeadas em uma gota d’água em lâminas, para coloração de
Gram (fig.11) (FREITAS & PICOLI, 2007).
Figura 11. Coloração de Gram em lâminas
As cepas identificadas como coliformes foram semeadas em Placa de
Petri contendo Ágar MacConkey (meio de cultura destinado ao crescimento de
bactérias Gram negativas), colocadas em estufa à 37ºC pelo período de 24 horas.
Cepas identificadas como Gram positivas foram semeadas em onze placas
de Petri, contendo Ágar Manitol (meio de cultura utilizado para isolamento de
Staphylococcus patogênicos), colocadas em estufa à 37ºC por 24 horas.O
crescimento bacteriano resultou em amostras com duas colorações diferentes.
50
Depois de identificadas as cepas de Staphylococcus spp, utilizou-se o
meio BHI já cultivado com as bactérias para fazer uma nova replicação em um
meio BHI estéril, contendo em seu total8mL. Foram adicionados 1mL do BHI
antigo para o novo frasco, combinado com 1 (uma) gota de glicose (meio de
energia para replicação das bactérias). O novo cultivo foi para estufa à 37ºC pelo
período de 24 horas, sendo retirados da estufa após esse período e mantidos
refrigerados em geladeira.
Os tubos com bactériasrecém replicadas foram devidamente identificados
quanto à cepa presente (Staphylococcus aureus e Staphylococcus spp), e
dispensados em um tubo Erlenmeyer esterilizado com capacidade para 125 mL
(fig.12). O frasco foi vedado com papel alumínio e identificado, ficou sob
agitação contínua por cinco dias à 37ºC no equipamento denominado de Shaker.
Figura 12. Frasco Erlenmeyer com a mistura de caldos BHI
51
Decorrentes cinco dias, o frasco permaneceu sob refrigeração, sendo
realizado em seguida um teste de pureza para vacina com o objetivo de
identificar apenas bactérias do gênero Staphylococcus. Com swab, foram
semeadas amostras do caldo em placa contendo Agar Sangue e outra com Ágar
Manitol. As placas ficaram por 24 horas à 37ºC na estufa.
ELABORAÇÃO DA VACINA
A vacina foi elaborada no Laboratório de Microbiologia da Universidade
Tuiuti do Paraná. No caldo bacteriano foi adicionado 1mL de formalina 10%, o
qual foi incubado a 37ºC com a finalidade de inativar as bactérias. Após esse
procedimento, três novos tipos de cultura foram feitos para testar a esterilidade
da vacina, os quais são:
1) Cultura em placa:para observação de possível crescimento bacteriano,
foram utilizadas duas placas de Petri; uma placa contendo Ágar sangue de
Carneiro, e uma placa com Ágar Manitol, que seguiram para a estufa por
48 horas à 37ºC;
2) Cultura em caldo Thioglicolato: utilizando dois tubos contendo o caldo,
foi adicionado 10 mL em tubo grande, e 5mL em um tubo pequeno.
Sendo o Thioglicolato um meio nutritivo para crescimento de bactérias,
ficou em estufa por 72 horas à 37ºC (fig.14).
3) Cultura em caldo Sabouraud:utilizando dois tubos contendo o caldo, foi
adicionado 10mL em tubo grande, e 5mL em um tubo pequeno. Sendo o
52
Sabouraud um meio líquido para controle de esterilidade, ficou em estufa
à 21ºC por 10-15 dias (Fig. 13).
Figura 13. Dois tubos com caldo Thioglicolato; dois tubos com caldo
Sabouraud.
O caldo bacteriano foi levado ao congelador para inativação das bactérias
pelo período de 72 horas, em seguida sofreu um processo de descongelamento,
onde foi adicionado mais 5mL de formalina 10%, e levado a estufa à 37ºC pelo
período de 48horas. Depois de retirado da estufa, novos testes de pureza
foramrealizados seguindo o protocolo (fig. 14).
1) Cultura em placa: semeadura em placa de Petri contendo Ágar Sangue;
semeadura em placa de Petri contendo Ágar Manitol;
2) Cultura em caldo Thioglicolato: foram adicionados 5mL de bacterina
tubo do caldo usado como meio de crescimento de bactérias;
53
3) Cultura em caldo Sabouraud: foram adicionados 5mL de bacterina no
tubo do caldo usado também como meio de crescimento de bactérias.
Figura 14. Placas contendo Agar Sangue de carneiro e Agar Manitol e frasco
com bacterina
A vacina foi testada em seis cobaias (fig.15) na dose de 0,3 mL no grupo 1, e
2mL no grupo 2 por via subcutânea (protocolo do CEUA-UTP 008/2011p).
Figura 15. Cobaias utilizadas para teste da vacina. Inoculadas 0,3mL de
vacina em três animais e 0,2ml de vacina em outros três animais
54
Para a administração da vacina foram selecionadas seis vacas com mastite
crônica, as tetas foram higienizadas, foi realizado o CMT (fig.16) para
comparativa após uma semana de sua aplicação.
Os animais passaram por desinfecção dos tetos, sendo na sequência realizado
o CMT (fig. 17) e a aplicação de 3,0 mL de bacterina subcutânea (fig.18)
próximos ao úbere (fig.19). Decorridos cinco dias do procedimento, o mesmo
foi realizado para obtenção de novos resultados.
Figura16. Realização do CMT antes da segunda aplicação da vacina
55
Figura 17. Resultado do CMT e observação de reação gelatinosa indicando três
cruzes
Figura 18. Preparação da vaca e de 3,0mL vacina para ser aplicado via
subcutânea
56
Figura 19. Aplicação de 3,0mL da vacina no subcutâneo próximo ao úbere
RESULTADOS E DISCUSSAO
Os resultados referentes e as reações obtidas em placa de CMT e CCS
estão descritas na (tab. 6), especificando que a Soma CMT 1: é a soma da
quantidade de cruzes dos quartos mamários, em que os valores podem variar de
0 a 12, e a Soma CMT 2:é o número de cruzes de cada quarto mamário, elevado
a 2 (n²). O resultado é calculado em regra de três, sendo: uma cruz (+)=
100;duas cruzes (++)= 400; três cruzes (+++)= 900.
57
Tabela 6. Leitura das reações das placas em testes de CMT e relação com CCS.
TOTAL 68
*AD: anterior direito; AE:anterior esquerdo; PD: posterior direito; PE: posterior esquerdo.
** CMT: CaliforniaMastitis Test; *** CCS: Contagem de Células Somáticas
Após a incubação em estufa bacteriológica à 37ºC por 24 horas, o
diâmetro dos halos foram analisados e medidos com um paquímetro (fig. 20).
N da vaca
CMT SOMA CMT (1)
CCS ( x 1000)
Soma CMT (2)
AD AE PD PE 367 ++ - +++ - 5 3298 1300 478 - - - - 0 97 0 447 - - ++ ++ 4 105 800 505 + + - + 3 684 300 468 - + ++ + 4 109 600 503 - - - - 0 40 0 419 + ++ +++ + 7 1683 1500 446 - - + - 1 105 100 35 V + + - + 3 27 300 378 - ++ +++ + 6 6000 1400 474 + ++ + ++ 6 542 1000 506 - - - - 0 11 0 459 +++ + +++ ++ 9 4381 2300 496 - + - - 1 72 100 481 - - + + 2 95 200 380 - + ++ - 3 166 500 500 - - + - 1 24 100 409 +++ ++ +++ - 8 2744 2200 427 - + - +++ 4 45 1000 32 V + + + + 4 119 400
58
Figura 20. Antibiograma e formação de halos como reação aos princípios ativos
Depois de coradas as lâminas, a grande maioria das cepas foi
identificada como Cocos Gram positivos (80%) (fig.20); duas
lâminasidentificadas como bacilos (10%), e outras duas como coliformes (10%).
Figura 21. Staphylococcus aureus
59
Os resultados obtidos no antibiograma podem ser descritos de acordo com
a resistência e sensibilidade (tab.7).
Tabela 7. Classificação quanto à resistência do microrganismo frente aos
antibióticos
Nº
VACA
TETRACICLINA ENROFLOXACINA AMOXICILINA ESTREPTOMICINA PENICILINA
459 2,2* 2,5* 2,3* 1,2** Ø***
32 v 1,9** 2,3* 1,1** 1,5** 1***
468 1,7** 2,8* 2,5* 1,7** 1,3**
506 2,3* 2,2* 1,8** 0,9*** Ø***
378 0,4*** 1,9** 2,4* 0,2** Ø***
478 2* 2,4* 2,5* 1,5** 1***
505 1,2** 2* 0,4*** 1,7** Ø***
472 2* 2,3* 2,2* 1,4** 1,2**
35 v 2,2* 1,8** 2,3* 1,4** 1,2**
367 1,9** 2* 2,2* 1,4** 1,3**
474 2,3* 2,1* 1,7** 1,9** 1,8**
446 Ø*** 1,9** 2,3* 0,5*** 1***
409 2,6* 2,4* 3,5* 2* 2,5*
424 1,6** 2,9* 2,1* 1,6** 1,8**
503 2,1* 2* 1,6** 1,5** 0,8***
500 0,4*** 2,1* 2* 0,5*** 1,1**
496 2,2* 1,5** 3* 1,1** 2*
447 1,7** 2,1* Ø*** 1,7* Ø***
380 2,4* 2,2* 2,4* 1,6** 1,4**
*Sensível; **Intermediário; ***Resistente
Valores de halos inibitórios esperados para Staphylococcus aureus, segundo
Laborclin, 2011.
Enrofloxacina: Resistente:14mm, Intermediário: 15-17mm, Sensível :18mm
Tetraciclina: Resistente:14mm, Intermediário:15-18mm, Sensível :19mm
60
Amoxicilina:Resistente:19mm, Intermediário: -, Sensível:20mm
Estreptomicina: não observado
Penicilina: Resistente:28mm, Intermediário: - , Sensível:29mm
O Staphylococcus aureus é uma bactéria coagulasepositiva,que em meio
de cultivo Ágar manitol, apresentou coloração amarelo
ouro.OsStaphyloccocusspp foram identificados como coagulase negativos,
eapresentaramcoloração vermelha (fig.22); (tab.8).
Figura 22. Staphylococcus aureus (amarelo-ouro); Staphylococcus spp
(vermelho)
61
Figura 23. Sensibilidade de Staphylococcus aureus aos antibióticos testados
Em sete amostras dos 19 animais analisados, foram isoladas cepas de
Staphylococcus aureus e Staphylococcusspp(tab.8). A enrofloxacina demonstrou
maior de sensibilidade em79% (fig.23), pertence ao grupo das quinolonas,
constituído por agentes microbianos bactericidas de amplo espectro. São
consideradas de terceira geração e apresentaram maior sensibilidade em relação
aos outros princípios, sendo relatada no estudo de Langoni et al.,( 2000), o qual
obteve 72% de sensibilidade.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
sensível
intermediária
resistente
62
Quanto à estreptomicina, verificou-se apenas 5%de sensibilidade, estando
este resultado de acordo com Radostits (2002).
A sensibilidade da amoxicilina foi de 68%. As cefalosporinas de 1ª
geração são mais ativas contra cocos Gram. positivos, possuindo a grande
vantagem de serem bastante ativas contra Staphylococcus spp (FERREIRA,
1997).
A sensibilidade à tetraciclina foi de 52% sendo essa classe de antibióticos
bacteriostáticos de amplo espectro (ANDRADE, 2008).
A sensibilidade à penicilina foi de 10%, diferente de Andrade et al,.
(2001) que encontrou 25% de sensibilidade em seu experimento. As penicilinas
naturais são inativadas por enzimas denominadas β- lactamases. Praticamente
100% das linhagens S. aureus e de 80% de Staphylococcus spp. são produtoras
de β- lactamases (ANDRADE et al, 2008).
Tabela 8. Identificação do patógeno isolado de mastite bovina do rebanho da
FPS-UTP no período de 08 de agosto a 8 de outubro de 2011
Agente
Número da vaca* Staphylococcus aureus Staphylococcusspp
500 447
378 380
468 496
503 428
367 424
440 32v
409
63
Após a retirada das placas e observação do crescimento de bactérias,
realizou-se a Contagem Total de Bactérias, encontrando-se 1,3x 10³ UFC/mL.
Os resultados obtidos do primeiro teste de pureza foram: o crescimento de
colônias nas duas placas; o meio líquido ficou turvo, ou seja, houve crescimento
de bactérias (fig.24). Concluindo-se que a quantidade de formalina utilizada para
inativar as bactérias não foi suficiente, visto que, outro procedimento foi
elaborado em seguida.
Figura 24. Caldo Thioglicolato apresentando turgidez devido ao crescimento
bacteriano
64
Figura 25. Crescimento bacteriano no primeiro teste de sensibilidade em placa
Os resultados do segundo procedimento foram satisfatórios, não havendo
crescimento bacteriano em nenhum dos quatro testes de pureza. Em seguida,
foram adicionados 25mL de Hidróxido de Alumínio como adjuvante vacinal,
depois mantida refrigerada (fig.29).
Figura 26. Segundo teste de pureza confiável, sem crescimento bacteriano
65
Figura 27. Caldo Thioglicolato translúcido sem crescimento bacteriano
Figura 28. Caldo Sabouraud sem crescimento bacteriano
66
Figura 29. Vacina pronta com 25mL de Hidróxido de alumínio como adjuvante
vacinal
Depois de inoculada a vacina nas cobaias, decorridos cinco dias, nenhum
animal apresentou reação para o composto da vacina, tanto quanto para o
adjuvante vacinal.
Para a primeira aplicação da vacina foram selecionadas seis vacas com
histórico de mastite crônica, as quais tiveram as tetas higienizadas para
realização do CMT antes da primeira aplicação da vacina. As vacas receberam
3,0mL de vacina subcutânea próximo ao úbere e segundo Alberton et al. (2001),
é questionável a influencia do local da aplicação das vacinas na resposta
imunitária do paciente. Isto é, questiona-sea aplicação da vacina nas
proximidades da mama e do linfonodo mamário induziriam melhores respostas
do que a aplicação no tecido subcutâneo de qualquer outra região corporal.
67
Nickerson (1998) citado por Tizard (1998) afirmou que a deposição de antígeno
na região próxima do linfonodo mamário resultaria em uma maior proliferação
de células de defesa e maior produção de imunoglobulinas. Nesse experimento
aparentemente, houve boa resposta, porém não se pode concluir quanto à
proliferação de imunoglobulinas. Esse experimento teve duração de cinco
semanas, em que as vacas foram vacinadas antes da segunda ordenha do dia por
permanecerem em pé por mais tempo.
Tabela 9. Resultado do CMT antes da primeira aplicação da vacina
N VACA AD AE PD PE TOTAL
378 Seco + +++ _ 5
459 _ ++ +++ + 6
482 _ + + +++ 5
472 + + Seco ++ 4
428 + ++ +++ ++ 8
32v ++ + + + 4
TOTAL 32
*AD: anterior direito; AE:anterior esquerdo; PD: posterior direito; PE: posterior esquerdo.
Uma semana após a primeira aplicação (tab.9) os animais passaram por
CMT para coleta de dados sobre melhora dos quartos acometidos. Em seguida,
foi feita a segunda aplicação de 3,0mL da vacina, mesmo algumas vacas tendo
apresentado aumento de cruzes no resultado do CMT (tab.10).
68
Tabela 10. Resultado CMT antes da segunda aplicação da vacina
N VACA AD AE PD PE TOTAL
378 Seco +++ +++ + 7
459 ++ _ +++ + 6
482 + ++ + +++ 7
472 ++ + Seco _ 3
428 +++ + +++ _ 7
32v ++ + _ + 4
TOTAL 34
*AD: anterior direito; AE:anterior esquerdo; PD: posterior direito; PE: posterior esquerdo.
Na semana seguinte o CMT foi feito novamente para avaliar o grau de
mastite de cada quarto mamário, seguido pela aplicação da terceira dose de
vacina (tab.10).
Tabela 11.Resultado CMT depois da terceira aplicação da vacina
N VACA AD AE PD PE TOTAL
378 Seco +++ +++ ++ 8
459 _ ++ +++ + 6
482 _ _ _ +++ 3
472 _ ++ Seco _ 2
428 +++ ++ +++ + 9
32v + + _ _ 2
TOTAL 30
*AD: anterior direito; AE:anterior esquerdo; PD: posterior direito; PE: posterior esquerdo.
Analisando isoladamente cada quarto mamário, observou-se que houve
melhora, apesar de o ambiente e o manejo influenciarem no resultado. Do grupo
de vacas estudadas, após a terceira administração semanal da vacina, 50%
apresentaram diminuição na infecção da glândula mamária, observada através
dos resultados do CMT (tab.12).
69
Tabela 12. Resultados obtidos no CMT da primeira e terceira semana do
experimento.
Antes da aplicação
(valor em nº de cruzes)
1ª aplicação
(valor em nº de cruzes)
3ª aplicação
(valor em nº de cruzes)
378 5 7 8
459 6 6 6
482 5 7 3
472 4 3 2
428 8 7 9
32v 4 4 2
As unidades experimentais que não apresentaram regressão da infecção
mamária (50%), provavelmente apresentavam importante comprometimento no
tecido secretor, lesões e perda de função (FONSECA & SANTOS, 2000).
Segundo Radostits et al.,(2002), apesar de presentes no sangue das vacas
infectadas, os anticorpos contra estafilococos parecem fornecer pouca proteção
contra as mastites provocadas pelo Staphylococcus aureus, o que pode ser
consequência do baixo nível título de anticorpos no leite. O desenvolvimento
e/ou persistência da mastite estafilocócica dependem da interação entre a
bactéria invasora e o sistema de defesa do hospedeiro, principalmente as células
somáticas presentes em uma glândula infectada, constituídas, principalmente,
por polimorfonucleares, que são > que 95%. A incapacidade relativa de células
polimorfonucleares em matar bactérias no período de baixa CCS pode explicar a
fonte de reinfecção.
70
Nas duas semanas seguintes, as vacas que tinham mantido o quadro e as
que não tinham apresentando melhora, mostraram no resultado do CMT melhora
significativa de todos s quartos não apresentando mais o grau três(+++).
CONCLUSÃO
Com base nos resultados, foi possível comprovar o êxito da terapia das
vacas com mastite crônica, utilizando a vacina contra Staphylococcus aureus. A
facilidade de armazenamento e aplicação da vacina tornou esse procedimento
fácil de ser adotado e realizado como medida profilática e de tratamento semanal
para o controle da doença no rebanho, juntamente com bom manejo, higiene e
regulagem dos equipamentos de ordenha. A mastite é uma doença comum e
difícil de ser erradicada dos rebanhos leiteiros, causada geralmente por
Staphylococcus aureus na sua forma subclínica. A elaboração e utilização da
vacina contra mastite demonstrou ser uma importante medida de profilaxia da
doença.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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72097n.aspx. Acesso em 18nov.2011
76
6. CONCLUSÃO DO ESTÁGIO
Durante o estágio realizado na Fazenda Experimental Pé da Serra da
Universidade Tuiuti do Paraná foi possível acompanhar a rotina hospitalar e de
campo, manejo e tratamento dos animais, relacionamento em equipe, agregando
o conhecimento obtido em toda graduação com a parte práticae experiência na
profissão.
