Upload
others
View
0
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE VALE DO RIO DOCE – UNIVALE
PROGRAMA DE MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
NÚCLEO DE PESQUISA EM IMUNOLOGIA
GABRIELLA FREITAS FERREIRA
AVALIAÇÃO DE FATORES IMUNOLÓGICOS NA OSTEOMIELITE
ESTAFILOCÓCICA CRÔNICA
GOVERNADOR VALADARES
2009
GABRIELLA FREITAS FERREIRA
AVALIAÇÃO DE FATORES IMUNOLÓGICOS NA OSTEOMIELITE
ESTAFILOCÓCICA CRÔNICA
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências Biológicas da Universidade Vale do Rio Doce, para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas na área de Imunopatologia das Doenças Infecciosas e Parasitárias.
Orientador: Dr. Luiz Cosme Cotta Malaquias
Co-orientadora: Dra Lúcia Alves de Oliveira Fraga
GOVERNADOR VALADARES
2009
Reconhecida pelo Parecer nº 16/92 CFE Portaria 1037/92 MEC
Mantenedora: FUNDAÇÃO PERCIVAL FARQUHAR
Ata da Banca Examinadora de Dissertação de Mestrado Intitulada:
“AVALIAÇÃO DE FATORES IMUNOLÓGICOS NA OSTEOMIELITE
ESTAFILOCÓCICA CRÔNICA”
Aos trinta e um dias do mês de março de 2009, às 13:00 hs, na sala 01 do edifício
Pioneiros no campus Antônio Rodrigues Coelho da Universidade Vale do Rio Doce,
reuniu-se a Comissão Examinadora da Dissertação de Mestrado da aluna Gabriella
Freitas Ferreira. A defesa da dissertação iniciou-se pela apresentação oral feita pela
candidata e, em seguida, argüição pelos membros da banca. Ao final, os membros da
banca examinadora reuniram-se e decidiram por
..................................................................................
Membros da Banca Examinadora:
____________________________________________ Prof. Dr. Luiz Cosme Cota Malaquias
Presidente
_____________________________________________ Examinador
____________________________________________
Examinadora
DATA DA DEFESA: 31/03/09
EXECUÇÃO DO TRABALHO:
Laboratório de Pesquisa em Imunologia da Universidade Vale do Rio Doce (UNIVALE),
Governador Valadares, MG.
COLABORADORES:
Universidade Vale do Rio Doce
Maria de Fátima da Silva
Marlucy Rodrigues Lima
Lilia Cardoso Pires
Ivanete dos Santos Nascimento
Centro de Pesquisas René Rachou
Drª Andréa Teixeira de Carvalho
Universidade Federal do Estado de Minas
Gerais
Drº Simeão do Carmo
Hospital Municipal de Governador
Valadares
Médico Ms Cícero Moraes
Enfermeiro Anízio Pereira Brito
ÓRGÃOS FI>A>CIADORES:
Universidade Vale do Rio Doce - UNIVALE
Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais – FAPEMIG
Dedico este trabalho
A Deus, Pai Onipotente, por tudo aquilo que me lega ao longo da vida.
AGRADECIME>TOS
Ao meu orientador, professor doutor Luiz Cosme Cotta Malaquias, cuja orientação permitiu a
realização deste estudo.
À minha co-orientadora, professora doutora Lúcia Alves de Oliveira Fraga, pelas informações
e ensinamentos concedidos. Além de mestre, foi para mim uma grande amiga.
Aos amigos do Laboratório de Pesquisa em Imunologia da UNIVALE, especialmente Lília,
Fátima e Marlucy, pelo constante apoio e incentivo.
À professora doutora Andréa Teixeira de Carvalho, pelo apoio técnico fornecido.
Aos professores do curso de Mestrado em Ciências Biológicas da UNIVALE, em especial a
professora doutora Alda Maria Soares Silveira, pelos ensinamentos que contribuíram
intensamente para minha formação.
Ao professor mestre Cícero Moraes e ao enfermeiro Anízio Pereira Brito pela especial
colaboração neste trabalho.
Aos meus pais, meu noivo e familiares, por sempre acreditarem em mim.
Ao Hospital Municipal de Governador Valadares, pelos dados fornecidos.
Àqueles participantes deste estudo, pela oportunidade de aprendizado.
E a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
RESUMO
A osteomielite, caracterizada por um processo infeccioso no tecido ósseo, tem como principal
agente etiológico o Staphylococcus aureus. O objetivo desse trabalho foi avaliar a resposta
imune de pacientes na fase crônica da osteomielite estafilocócica e comparar com a resposta
de indivíduos não portadores da doença. Este estudo incluiu 20 indivíduos portadores de
osteomielite crônica, residentes em Governador Valadares e região, e 20 indivíduos não
portadores da doença, sem história de infecção articular-óssea, como grupo controle. Os
critérios de inclusão de pacientes nesse estudo foram infecção por S. aureus, presença do
seqüestro ósseo e fístulas em um período menor ou igual a um ano. Células mononucleares
do sangue periférico (PBMC) foram estimuladas in vitro com a toxina estafilocócica A (SEA)
e com o mitógeno fitohematoglutinina A (PHA) e avaliadas quanto à proliferação celular e à
produção das citocinas interferon-gama (IFN-γ), fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α),
interleucina-2 (IL-2), IL-6, e IL-10 por citometria de fluxo. A concentração plasmática de
óxido nítrico (NO) foi determinada. Nossos resultados mostraram uma forte correlação
positiva entre IFN-γ, TNF-α e IL-10, e uma reduzida produção de IL-6 pelas PBMC dos
pacientes frente ao SEA. O estudo proposto sugere que os pacientes com osteomielite
estafilocócica crônica apresentam alterações na resposta imune relacionadas com a produção
das citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-10 e do NO. A presença de IL-10 nos sobrenadantes das
culturas de PBMC estimuladas pelo SEA poderia indicar um papel dessa citocina na
cronificação da doença, resultando na diminuição da IL-6 e do NO.
Palavras-chave: Osteomielite crônica. Staphylococcus aureus. Resposta imune.
ABSTRACT
Osteomyelitis is an inflammatory reaction in the bone accompanied by bone destruction.
Most of the cases are caused by Staphylococcus aureus. The aim of this study was to evaluate
the immune response of chronic osteomyelitis patients comparing to individuals without the
disease. This study included 20 chronic osteomyelitis patients and 20 normal individuals
without history of bone and joint infection as a control both from Governador Valadares,
Brazil. The inclusion criteria were the presence of S. aureus infection, bone sequestrum and
fistulous in less than a year. Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) were stimulated in
vitro by staphylococcal toxin A (SEA) and mitogen phytohemagglutinin A (PHA) and
evaluated the cellular proliferation and the production of the cytokines interferon-gama (IFN-
γ), tumor necrosis factors-alfa (TNF-α), interleukin-2 (IL-2), IL-6, e IL-10 by flow cytometry
technique. Also, the levels of nitric oxide (NO) in the plasma were determinate. Our results
showed a strong correlation among IFN-γ, TNF-α e IL-10, and low production of IL-6 by
PBMC from patients in presence of SEA. This study suggest that chronic osteomyelitis
patients has impairment of immune response associated with the cytokines IFN-γ, TNF-α, IL-
6, IL-10 production and of NO. The presence of IL-10 in the SEA-stimulated PBMC
supernatants could point out a role in the chronic disease, resulting in low IL-6 and NO
production.
Key-words: Chronic osteomyelitis. Staphylococcus aureus. Immune response.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Avaliação da concentração de estímulo utilizada para o teste de proliferação de
PBMC de pacientes com osteomielite e indivíduos do grupo controle estimuladas por SEA ou
PHA -------------------------------------------------------------------------------------------------------50
Figura 2 – Proliferação de PBMC de pacientes com osteomielite e indivíduos do grupo
controle estimuladas por SEA ou PHA ---------------------------------------------------------------28
Figura 3 – Produção de citocinas IFN-γ, TNF-α por PBMC de pacientes com osteomielite e
indivíduos controle---------------------------------------------------------------------------------------29
Figura 4 – Produção de citocinas IL-10. IL-2 por PBMC de pacientes com osteomielite e
indivíduos controle---------------------------------------------------------------------------------------30
Figura 5 - Produção de citocina IL-6 por PBMC de pacientes com osteomielite e indivíduos
controle----------------------------------------------------------------------------------------------------31
Figura 6– Níveis plasmáticos de NO em pacientes com osteomielite estafilocócica crônica e
indivíduos controle---------------------------------------------------------------------------------------33
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Perfil clínico dos pacientes com osteomielite estafilocócica crônica----------------26
Tabela 2 – Avaliação de parâmetros laboratoriais dos pacientes com osteomielite
estafilocócica crônica------------------------------------------------------------------------------------27
Tabela 3 – Correlação entre a produção de citocinas frente ao SEA------------------------------30
Tabela 4 - Freqüência de indivíduos alto e baixo produtores de IL-6 no grupo de pacientes e
de indivíduos controle-----------------------------------------------------------------------------------32
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µµµµg – micrograma
µµµµL – microlitro
µµµµM– micromolar
ºC – Graus centígrados
C3b – Fragmento do complemento 3b
CD4 – Cluster of differention 4 positivo
CD8 – Cluster of differention 8 positivo
CO2 – dióxido de carbono
DP – Desvio Padrão
ELISA – enzyme-linked immunosorbent
assay
FAD – Flavina Adenina Dinucleotídeo
FAPEMIG – Fundação de Amparo a
Pesquisa de Minas Gerais
FM> – Flavina Monocleotídeo
H3PO4 – Ácido Fosfórico
IgA - Imunoglobulina A
IgE – Imunoglobulina E
IgG – Imunoglobulina G
IgM – Imunoglobulina M
IL-1 – Interleucina 1
IL-2 - Interleucina 2
IL-4 - Interleucina 4
IL-6 - Interleucina 6
IL-10 - Interleucina 10
IL-12 - Interleucina 12
IL-12 p40 - Interleucina 12 p40
IL-12 p75 - Interleucina 12 p75
IL-2 - Interleucina 2
IL-6 - Interleucina 6
IL-4 - Interleucina 4
IL-10- Interleucina 10
IL-13 - Interleucina 13
I>F-γ– Interferon gama
>OS - Óxido Nítrico Sintase
c>OS – Óxido Nítrico Sintase constitutiva
i>OS - Óxido Nítrico Sintase indutiva
máx. – máximo
MEM – minimum essencial medium
MHC II - complexo de
histocompatibilidade principal classe II
min. – mínimo
mm - milímetro
mm3 - milímetro cúbico
mM - milimolar
>ADPH – Fosfato de Nicotinamida
Adenina Dinucleotídeo reduzido
nm - nanômetro
>O – Óxido Nítrico
>O-2 – Íon nitrito
>O-3 – Íon nitrato
>a>O2 – Nitrato de Sódio
PBMC - Células mononucleares do sangue
periférico
PHA - fitohematoglutinina A
PCR – Proteína C Reativa
Q1 - Primeiro quartil
Q3 - Terceiro quartil
RPM – Rotações por minuto
RPMI - Roswell Park Memorial Institute
medium
SEA - Toxina estafilocócica A
SEB - Toxina estafilocócica B
SEC - Toxina estafilocócica C
TCR - Receptor de linfócitos T
TH1– Resposta de linfócitos T helper tipo
1
TH2 –Resposta de linfócitos T helper tipo
2
TGF-β – Fator de Crescimento
Transformante
TSST-1 - Toxina da síndrome do choque
tóxico
T>F–α – Fator de necrose tumoral gama
U/mL – Unidade por mililitro
U>IVALE – Universidade do Vale do Rio
Doce
ZnSO4 – Sulfato de Zinco
SUMÁRIO
1. I>TRODUÇÃO ..............................................................................................................14
2. JUSTIFICATIVA...........................................................................................................20
3. OBJETIVO GERAL ......................................................................................................21
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................21
4. MATERIAIS E MÉTODOS..........................................................................................22
5. RESULTADOS...............................................................................................................26
5.1 PERFIL CLÍNICO-HEMATOLÓGICO E SÓCIO-DEMOGRÁFICO DOS INDIVÍDUOS
COM OSTEOMIELITE ESTAFILOCÓCICA CRÔNICA ....................................................26
5.2 AVALIAÇÃO DA RESPOSTA DE PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS
MONONUCLEARES DO SANGUE PERIFÉRICO ..............................................................29
5.3 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE CITOCINAS IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-2 e IL-6
............... ...................................................................................................................................30
5.4 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE NO .........................................................................34
6. DISCUSSÃO ...................................................................................................................35
7. CO>CLUSÃO.................................................................................................................41
8. REFERÊ>CIAS BIBLIOGRÁFICAS .........................................................................42
9. A>EXOS .........................................................................................................................50
1. I>TRODUÇÃO
A osteomielite, doença caracterizada por um processo infeccioso no osso, apresenta a
forma clínica aguda que pode evoluir para cura ou para a forma crônica ou até mesmo levar à
septicemia e morte. O tratamento e a resposta imunológica do paciente são fundamentais
nessa evolução, existindo uma maior ocorrência da forma aguda em crianças
imunodeprimidas (DORMANS & DRUMMOND, 1994; LAZZARINI et al., 2004).
Atualmente a osteomielite crônica representa a complicação mais séria dos traumas,
provavelmente devido ao aumento de acidentes com veículos motorizados. A prevalência da
osteomielite crônica é de 2 casos para cada 10.000 pessoas e 30% das osteomielites agudas se
transformam em crônicas (KLOSTERHALFEN et al., 1996; CIAMPOLINI & HARDING,
2000).
Historicamente, a osteomielite tem sido classificada de acordo com a forma clínica
apresentada pelo paciente: aguda, subaguda e crônica (CAREK et al., 2001; LAZZARINI et
al, 2004). Por causa da complexidade dessa infecção, vários sistemas de classificação
surgiram a partir das suas vertentes clínicas. A classificação proposta por WALDVOGEL et
al., (1970) divide a osteomielie em hematogênica, secundária a um foco adjacente de infecção
e crônica. Já a classificação proposta por CIERNY et al., (1985) divide a osteomielite em
quatro estágios e baseia-se na anatomia do osso infectado e nas condições clínicas do
paciente.
É importante ressaltar que não existe um critério claro que distingue a osteomielite aguda
da crônica. Alguns definem a osteomielite como crônica quando os sintomas permanecem por
mais de um mês, no entanto outros defendem um período maior de seis meses
(WALDVOGEL et al., 1970; WEILAND et al., 1984, DORMANS & DRUMMOND, 1999).
Do ponto de vista clínico, a primeira infecção é considerada aguda, e a recidiva é considerada
crônica (CAREK et al., 2001). A principal característica da osteomielite crônica é a presença
do osso morto, chamado de seqüestro. O invólucro (a formação de um tecido ósseo sobre o
seqüestro), a perda óssea local e a presença de pus persistente são outras características
comuns da osteomielite crônica. O paciente com osteomielite crônica normalmente apresenta
dor crônica, formação de um sinus com secreção purulenta e febre baixa ou ausente. Exames
laboratoriais indicativos de infecção como por exemplo, a dosagem de proteina C reativa,
apresenta-se ligeiramente elevada. Normalmente não ocorre leucocitose e alterações no
hemograma (CAREK et al., 2001; LAZZARINI et al., 2004; LEE & WALDOGEL, 2004).
O quadro clínico da osteomielite se caracteriza pelo aparecimento de sintomas típicos de
uma doença infecciosa aguda, geralmente um mês após a presença do microrganismo no osso.
Sintomas tais como febre alta, dor metafisária intensa e imobilidade do membro acometido
são comumente observados. Com a progressão da infecção, há uma trombose dos vasos
medulares comprometendo a mobilização das células de defesa imunológica.
Conseqüentemente um exsudato é formado na vizinhança levando a hiperemia, dor e
descalcificação do osso circundante. Há uma reação subperióstica que evolui para o seu
descolamento e necrose óssea. A forma crônica apresenta períodos de latência e reagudização
(MORREY & PETERSON, 1975; LEE & WALDOGEL, 2004; LAZZARINI et al., 2004;
SHEFF, 2005).
As formas mais habituais de infecção ocorrem por via hematogênica, onde um êmbolo
séptico penetra na artéria nutrícia indo se alojar nos capilares metafisários longos e de fluxo
lento, principalmente dos ossos longos. Por via de inoculação direta, a osteomielite se inicia
pela penetração de bactérias através de traumas e contaminações cirúrgicas. E finalmente, por
via indireta, o agente etiológico oriundo de infecções de partes moles vizinhas chega ao tecido
ósseo por meio de uma solução de continuidade (MORREY & PETERSON, 1975;
LAZZARINI et al., 2004).
Constituem os princípios básicos do tratamento da osteomielite a identificação do agente
etiológico, a seleção do antibacteriano apropriado e a cirurgia precoce nos quadros que não
melhoram nas primeiras 24 a 48 horas após tratamento com os antibacterianos (LEE &
WALDOGEL, 2004). O tratamento cirúrgico também deve ser adotado na fase crônica da
doença que consiste na drenagem do abscesso subperiosteal para remover todo o tecido
necrótico (GILMOUR, 1962; LEE & WALDOGEL, 2004).
O Staphylococcus aureus é o principal agente etiológico da osteomielite crônica, sendo
responsável por cerca de 80 a 90% dos casos. São cocos Gram positivos normalmente em
forma de cacho de uva, imóveis e não produzem esporos. Crescem na presença ou não de
oxigênio por respiração aeróbica ou fermentação. Pertencem à família Micrococccaceae e ao
gênero Staphylococcus. Dentro das espécies pode haver uma subdivisão em vários grupos
(NAIR et al., 2000; LEE & WALDOGEL, 2004).
O S. aureus está presente na microbiota normal de 20 a 50% da população mundial.
Estruturas como pele e mucosas funcionam como uma barreira para o S. aureus, prevenindo o
seu acesso a tecidos e órgãos internos. Para essa bactéria causar infecções ósseas, como a
osteomielite, algumas condições são necessárias, tais como: capacidade da cepa de se fixar no
tecido, de evadir as defesas do hospedeiro e de causar danos teciduais. Apesar dessas
condições dependerem em parte, das características intrínsecas do hospedeiro, elas estão
intimamente ligadas aos fatores de virulência produzidos pelo S. aureus. A presença dos
componentes moleculares da parede celular (polissacarídeos e peptideoglicanos) e a
capacidade de secretar proteínas, tais como as exotoxinas, são alguns exemplos desses fatores
de virulência (NAIR et al., 2000).
As exotoxinas estafilocócicas mais conhecidas compreendem três distintos grupos: toxina
da síndrome do choque tóxico (TSST-1) enterotoxinas e toxinas esfoliativas. As enterotoxinas
e a TSST-1 são consideradas superantígenos clássicos e são caracterizadas pela capacidade de
induzir febre alta e agir como mitógeno de células T (MARRACK & KAPPLER, 1990,
BALABAN & RASSOLY, 2000; THOMAS et al., 2007).
Vários estudos demonstraram que as cepas de S. aureus capazes de produzir as
enterotoxinas A, B, C, D ou TSST-1 são mais patogênicas nas infecções ósseas, como a
osteomielite (NAIR et al., 2000). UCHIYAMA et al. (1989) compararam a capacidade
mitogênica e a capacidade de induzir a produção de IL-2 das enterotoxinas A, B, C e TSST-1
a partir de culturas de linfócitos de camundongos e humanos. Os resultados mostraram que as
quatro exotoxinas são fortes ativadores policlonais de células T humanas. No entanto, o
TSST-1 e a enterotoxina estafilocócica A (SEA) foram mais potentes do que a enterotoxina
estafilocócica B (SEB) e a enterotoxina estafilocócica C (SEC). Dentre as enterotoxinas, a
SEA foi a melhor ativadora de células T, induzindo a proliferação dos linfócitos e produção
de IL-2 utilizando-se concentrações bem menores dessa toxina do que das outras exotoxinas.
Nesses experimentos foram utilizadas células esplênicas de camundongos e células
mononucleares do sangue periférico humano. Resultados similares também foram
encontrados por YOKOMIZO et al., (1995).
As enterotoxinas estafilocócicas, SEA, SEB, SEC e TSST-1 consideradas superantígenos,
têm a propriedade de estabelecer uma ligação química direta entre o domínio Vbeta do
receptor de linfócitos T (TCR) e o complexo de histocompatibilidade principal classe II
(MHC II) das células apresentadoras de antígenos (APC) sem requerer um processamento
prévio das enterotoxinas pelas APCs. Essa ligação química produz um sinal que induz a
proliferação policlonal de cerca de 10% a 30% do repertório de células T, sendo as células T
CD4 efetoras a população de células dominante (CALLAHAN et al., 1990; JOHNSON et al.,
1991). Segundo BAVARI & ULRICH (1995) as moléculas CD4 participam da estabilização
da ligação do superantígeno bacteriano, especialmente a SEA e a TSST-1, com o complexo
formado pelo receptor de célula T e a molécula MHC II. Essa ativação induz a produção das
citocinas IL-2, IFN-γ e TNF-α de maneira dose-dependente (YOKOMIZO et al. 1995).
UCHIYAMA et al., (1989) demonstraram que essas mesmas enterotoxinas, SEA e TSST-1,
induzem a proliferação de linfócitos T e secreção de IL-2 e IFN-γ, bem como produção de IL-
1 e TNF-α pelos monócitos. GROSSMAN et al. (1992) mostraram que a produção de TNF-α
pelos monócitos é diretamente proporcional a produção de IFN-γ pelos linfócitos T ativados
pelo SEA e SEB.
Segundo GOODGLICK & BRAUN (1994) a resposta induzida pelos superantígenos é
diminuída pela anergia ou apoptose das células que responderam ao contato inicial com o
superantígeno. A população anérgica é heterogênea e incluem tanto células que não
respondem mais aos superantígenos como também células T regulatórias (IVARS, 2007).
A interação S. aureus e hospedeiro na gênese e evolução da osteomielite têm sido
investigados. Entretanto, muitos dos aspectos imunológicos permanecem ainda pouco
esclarecidos (EID, 1980; ALVAREZ et al. 1992; WAGNER et al., 2003).
Fatores imunológicos, virulência das cepas ou presença de próteses interferem na
resposta do hospedeiro à osteomielite. Pacientes com doenças crônicas granulomatosas,
neutropenias, síndrome da hiper-IgE, deficiências na adesividade dos leucócitos, asplenia,
dentre outras enfermidades possuem maior suscetibilidade à infecções pelo S. aureus
(CARNEIRO-SAMPAIO & COUTINHO, 2007). O S. aureus expressa a proteína A que se
liga à porção Fc de IgG, interferindo na opsonização e na fagocitose dessa bactéria. O S.
aureus também pode escapar do sistema imune através da sua internalização pelo osteoblasto
(JEVON et al., 1999) ou pela formação dos biofilmes microbianos depositados nos sequestros
ósseos ou em próteses médicas, o que também difulta a chegada de antimicrobianos no local
da infecção (RIBEIRO & CONSOLARO, 1999). Os metais usados nas próteses estimulam a
produção de citocinas que interferem na atividade dos linfócitos. O cromo e o titâneo inibem a
capacidade dos linfócitos B e T responderem a mitógenos bem como a produção de IL-2 e
IFN-γ (TSUKAYAMA, 1999). Sem uma resposta imune eficiente, a bactéria não é eliminada
e o paciente passa a desenvolver a forma crônica da osteomielite.
Dada a escassez da literatura em relação à avaliação de fatores imunológicos na
osteomielite crônica humana causada pelo S. aureus, a maioria dos relatos provêm de estudos
realizados em modelos animais. Tem-se demonstrado a participação das citocinas IL-4, IL-6,
IL-10, IFN-γ e TNF-α em camundongos infectados com S. aureus (FERRANTE et al.,1993;
NAKANE et al., 1995). Estes autores demonstraram que TNF-α é importante na resistência
do hospedeiro, provavelmente devido à sua propriedade em aumentar a capacidade de
aderência, de fagocitose, de degranulação e de geração de superóxidos pelos neutrófilos.
Além disso, o TNF-α é capaz de induzir uma maior expressão de receptores para os
fragmentos 3 e 4 do complemento, contribuindo para a melhor eliminação dessa bactéria. Por
outro lado, observaram que o IFN-γ promove proteção apenas na primeira fase da infecção,
tendo um efeito deletério no decorrer da doença. As citocinas IL-4 e IL-10 apresentaram um
efeito protetor nos camundongos infectados pelo S. aureus, por regular a produção do IFN-γ e
a IL-6 não interferiu no curso da infecção.
YOON et al. (1999), demonstraram também em modelos animais, que a infecção óssea
pelo S. aureus poderia diminuir a resposta mediada por células T, diminuindo a produção das
citocinas IL-2 e IFN-γ, em comparação com as citocinas IL-1 e TNF-α. Esse fato poderia
aumentar a gravidade da infecção sistêmica e a destruição óssea na osteomielite hematogênica
aguda.
Tanto em humanos como em modelos animais, verificou-se que o S. aureus é
internalizado pelo osteoblasto (NICHOLSON & BENTO, 1999). Normalmente, a bactéria
vive livre no citoplasma e não interfere na diferenciação do osteoblasto para ostiócito. Os
osteoblastos infectados secretam IL-6, IL-12p40 e IL-12p75. Essas citocinas estimulam os
osteoclastos e inibem a produção da matriz celular, provocando a formação do sequestro
ósseo bem caracterizado na osteomielite crônica (BOST et al., 1999).
Na osteomielte estafilocócica crônica humana, SCHLUTER et al., (1991) mostraram que
os pacientes apresentavam menor resposta ao teste de hipersensibilidade cutânea e menor
proliferação dos linfócitos T frente à fitohemaglutina, em comparação com indivíduos não
portadores da doença. Entretanto, esses pacientes apresentavam proliferação normal dos
linfócitos B frente a um lisado de S. aureus, níveis normais de anticorpos IgG no soro e uma
diminuição na relação CD4+/CD8+. Além disso, quando induziram a produção de anticorpos
policlonais dependentes de células T in vitro, observaram uma reduzida produção de
anticorpos. Resultados semelhantes foram encontrados por ALVAREZ et al. (1992).
Nos casos de osteomielite crônica pós-traumática, tem-se observado alterações no
sistema imunológico relacionadas com uma menor atividade do sistema complemento,
decréscimo no potencial fagocitário e microbicida dos macrófagos e granulócitos bem como
diminuição da expressão de receptores C3b nos fagócitos (HIERHOLZER & HIERHOLZER,
1982; SCHLUTER et al., 1991).
A participação do óxido nítrico (NO) nos processos infecciosos causados pelo S. aureus
também tem sido relatada. O NO é um gás incolor à temperatura ambiente, pouco solúvel em
água e altamente reativo, que possui vida média de 5 a 30 segundos devido a sua rápida
oxidação, com conseqüente geração de nitritos (NO-2) e nitratos (NO-
3) (QUEIROZ &
BATISTA, 1998). A reação bioquímica envolvida na produção de NO é catalisada pela
enzima óxido nítrico sintase (!itric Oxide Sinthase – NOS), que pode ser constitutiva (cNOS)
ou induzida (iNOS) nos processos inflamatórios (MONCADA, 1992).
A atividade da NOS é inibida pelo próprio NO por um sistema de feedback negativo
(ISOBE & NAKASHIMA, 1992; ASSREUY et al., 1993). As citocinas IL-4, IL-10, IL-13 e
TGF-β também são inibidoras da produção de NO (NORMAN & LIEW, 1995). No grupo de
indutores, o IFN-γ, importante ativador de macrófagos, é o que possui a maior capacidade de
estimular a síntese de NO. Adicionalmente, observa-se marcada sinergia entre IFN-γ e outras
citocinas que por si só são incapazes de estimular a síntese de NO (TNF-α, TNF-β, IL-1, IL-2,
IL-6) (VESPA, 1994; NORMAN & LIEW, 1995).
Outros estudos sobre o papel do óxido nítrico em infecções causadas por S. aureus em
camundongos indicaram que o óxido nítrico tem um importante papel em diminuir a
mortalidade dos animais, mas não interfere na resistência do hospedeiro contra infecções
estafilocócicas (SASAKI et al.,1998).
Tendo em vista que na osteomielite estafilocócica crônica humana o padrão de resposta
imune frente a fatores de virulência bacterianos ainda não está bem caracterizado, definimos
para este estudo investigar a resposta de proliferação de células mononucleares do sangue
periférico frente à enterotoxina estafilocócica do tipo A, a produção de citocinas e a presença
do óxido nítrico no soro de indivíduos portadores dessa infecção.
2. JUSTIFICATIVA
A osteomielite representa uma importante causa de morbidade em todo o mundo com
uma alta incidência em nosso meio. Somente no Hospital Municipal de Governador
Valadares, nos anos de 2001 a 2006, foram identificados 352 casos de osteomielite, sendo
65% do sexo masculino e 35% do sexo feminino. Do total de internações, 59,67% foram
tratadas cirurgicamente e 40,33% com tratamento conservador utilizando antibioticoterapia.
Nesse período, constatou-se um tempo médio de internação dos pacientes de 13,4 dias com
mínimo de 01 e máximo de 133 dias, o que certamente onera o tratamento da osteomielite
para o Sistema Único de Saúde (dados coletados a partir dos prontuários do Hospital
Municipal de Governador Valadares).
As infecções por S. aureus são várias e freqüentes, acometendo cerca de 80 a 90% dos
pacientes com osteomielite. De um modo geral, essas infecções estão relacionadas com
desnutrição e resposta imune deficiente. Tais deficiências podem contribuir para o insucesso
do tratamento, cronificação da osteomielite e até mesmo levar a seqüelas irreversíveis como
deformidades e dificuldades de locomoção.
É importante ressaltar que o perfil imunológico de pacientes portadores de
osteomielite ainda não está bem definido, existindo lacunas sobre a evolução da doença da
forma aguda para a cura ou para a forma crônica.
Dentro deste contexto, o objetivo do trabalho foi avaliar a participação de fatores
imunológicos em indivíduos portadores da forma crônica da osteomielite causada por S.
aureus. Essa pesquisa se faz necessária em virtude da elevada ocorrência de osteomielite em
Governador Valadares, sua importância clínica e o impacto social desta doença na
comunidade.
3. OBJETIVO GERAL
• Avaliar a resposta imune de pacientes na fase crônica da osteomielite causada pelo S.
aureus.
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Caracterizar os parâmetros clínico-hematológicos e sócio-demográficos de pacientes
portadores de osteomielite estafilocócica crônica.
• Avaliar a resposta de proliferação de PBMC de pacientes portadores de osteomielite
estafilocócica crônica após estimulação in vitro com a toxina estafilocócica SEA ou
com o mitógeno PHA.
• Avaliar os níveis das citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-6 e IL-10 em sobrenadantes de
culturas de PBMC de pacientes portadores de osteomielite estafilocócica crônica após
estimulação in vitro com a toxina estafilocócica SEA ou com o mitógeno PHA.
• Avaliar os níveis de óxido nítrico (NO) no plasma de pacientes portadores de
osteomielite estafilocócica crônica.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
• Caracterização da população de estudo
Este estudo incluiu 20 indivíduos portadores de osteomielite crônica, residentes na cidade
de Governador Valadares e região. Os participantes foram selecionados entre os pacientes
atendidos no Hospital Municipal de Governador Valadares, de janeiro a setembro de 2006. Os
pacientes foram abordados e sua participação dependeu do seu consentimento por escrito.
Foram incluídos 20 indivíduos não portadores da doença, sem história de infecção articular-
óssea, com média de idade de 35 anos, sendo 14 homens e 6 mulheres, como grupo controle,
procedentes do campus da Universidade Vale do Rio Doce
O diagnóstico clínico e o tratamento foram realizados por equipe de médicos do corpo
clínico deste Hospital. A presença de infecção óssea por S. aureus, de fístulas em um período
menor ou igual um ano e do seqüestro ósseo (zona de osso morto) foram os critérios de
inclusão de pacientes nesse estudo. O exame microbiológico foi realizado através da prova da
coagulase positiva e do crescimento em meio de hipertônico manita, seletivo para S. aureus.
Todos os pacientes foram radiografados em pelo menos duas incidências na região acometida
pela doença. Os pacientes foram tratados de acordo com o protocolo previamente estabelecido
pelo profissional do corpo clínico do Hospital. Todo tratamento foi oferecido gratuitamente
pelo serviço de saúde do município, e consistiu na antibioticoterapia com oxaciclina e
drenagem cirúrgica somente nos casos que apresentassem formação de abscessos ósseos. É
importante ressaltar que os pacientes não recebiam terapia corticóide. O consentimento livre e
esclarecido foi obtido de todos os participantes. Em caso de menores, a inclusão somente foi
feita após assinatura do consentimento pelos pais ou guardião. A nenhum indivíduo foi
negado o tratamento, independente da participação no projeto. O projeto possui parecer
aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNIVALE (parecer nº 04/2003). Todos os
pacientes possuem uma ficha de atendimento própria do hospital.
• Coleta de sangue e separação de células mononucleares do sangue periférico
Foi coletado um volume de 30 mL de sangue venoso por paciente para extração do
plasma e células. O plasma foi armazenado a menos 20º C até o momento da análise. Foram
utilizados tubos heparinizados, estéreis a vácuo e descartáveis. A coleta foi realizada por
pessoal técnico qualificado, respeitando as técnicas de biossegurança, tais como uso de luvas,
material estéril e descartável.
A separação de células mononucleares do sangue periférico foi feita segundo
GAZZINELLI et al. (1983). O sangue heparinizado foi aplicado sobre uma mistura de ficoll-
diatrozoato (Ficcoll-Hypaque) e centrifugado a 1350 rpm por 40 minutos a 20o C. As células
mononucleares foram coletadas com uma pipeta de Pasteur e transferidas para um tubo falcon
de 50 mL graduado, de fundo cônico. As células foram ressuspendidas em meio de cultura
MEM – “minimum essencial medium” – (GIBCO, Grand Island, NY), centrifugadas a 1250
rpm 10 minutos a 4o C. Esse procedimento de lavagem das células foi repetido por mais duas
vezes. Em seguida as células foram contadas e diluídas para uma concentração de 8 x 106
células por mL em RPMI 1640.
• Ensaio de proliferação celular
O meio de cultura consistiu de RPMI 1640 contendo 1,6% de L-glutamina (200 mM), 3%
de uma mistura de antibiótico e antimicótico, (10000 U de penicilina, 10000 µg de fungizona
por mL, SIGMA) e 5% de soro humano normal inativado. As culturas foram feitas em placas
de fundo chato de 96 poços em triplicatas. Cada poço continha 150 µL de meio de cultura, 25
µL de suspensão de células diluídas em RPMI 1640 (8 x 106/mL) e 25 µL da toxina A de S.
aureus na concentração de 10-1 µg/mL ou do mitógeno PHA na concentração de 2,5 µg/mL ou
de meio. As placas de cultura foram preparadas em capela de fluxo laminar e depois
incubadas por três dias a 37oC com 5% de CO2 em ar úmido. Após o período de incubação as
placas foram marcadas com 1,0 µCi de timidina, por poço, diluída em RPMI 1640. As placas
foram reincubadas por seis horas e as células coletadas em papel de fibra de vidro com auxílio
de um coletor automático de células e a radioatividade incorporada foi determinada por
cintilografia líquida.
Nas culturas realizadas para a coleta de sobrenadantes para os ensaios de citocinas foram
feitas em placas de fundo chato de 24 poços. Cada poço continha 800 µL de meio de cultura,
100 µL de suspensão de células diluídas em RPMI 1640 (8 x 106/ml) e 100 µL da toxina A de
S. aureus na concentração de 100 µg/mL ou do mitógeno PHA na concentração de 2,5 µg/mL
ou de meio. As placas de cultura foram preparadas em capela de fluxo laminar e depois
incubadas por três dias a 37oC com 5% de CO2 em atmosfera úmida. Os sobrenadantes foram
coletados e estados a a -20oC para posterior análise em citômetro de fluxo.
É importante ressaltar que foi realizada uma curva para estabelecer a concentração de
superantígeno a ser utilizada nos ensaios de proliferação celular. Foram testadas as seguintes
concentrações do SEA 100, 10-1, 10-2 e 10-3 µg/mL, utilizando-se 200.000 PBMC de seis
pacientes, em placas de 96 poços (Figura 1 - anexo). Os resultados indicaram que a melhor
faixa da concentração SEA para a estimulação das células era de 100 a 10-1 µg/mL.
• Detecção de citocinas
A detecção de citocinas em sobrenadante de cultura foi realizada através do ensaio de
citometria de fluxo utilizando kits CBA (Citometric Bead Array Set System/BD). Foram
quantificadas as seguintes citocinas: IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-6 e IL-10. O ensaio consiste
basicamente em adicionar 25 µL do sobrenadante de cultura de PBMC de pacientes com
osteomielite e dos indivíduos do grupo controle com 25 µL da suspensão de beads do kit
CBA/BD. Posteriormente, adicionava-se 18 µL do reagente de detecção e incubava a
temperatura ambiente por 2 horas. A seguir, lavou-se com 500 µL da solução tampão e
centrifugou-se a 2.500 rpm, temperatura ambiente, por 10 minutos. O sobrenadante foi
aspirado e acrescentou-se 200 µL de solução tampão. Em seguida, os tubos foram lidos em
citômetro de fluxo e os níveis relativos das citocinas quantificados em programa fornecido
pelo fabricante. O ensaio foi realizado no Centro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ/MG
com a colaboração da Dra Andrea Teixeira de Carvalho.
• Antígeno de S. aureus
Nos experimentos foi utilizado a toxina A solúvel do S. aures (SEA). Este reagente foi
fornecido pelo Dr. Luiz Simeão do Carmo/UFMG, colaborador nesse projeto.
• Avaliação da produção de óxido nítrico (NO)
A avaliação das concentrações de NO foi realizada pela medida de nitritos (NO-2) e
nitratos (NO-3)
nos plasmas dos indivíduos selecionados, de acordo com uma vasta literatura
que recomenda o uso do plasma sanguíneo nessa avaliação (BENJAMIN & VALLACE et al.,
1994; CASTILLO et al., 1995; MOSHAGE et al., 1995; MOSHAGE et al., 1998). As
amostras foram descongeladas e alíquotas de 50 µL diluídas 4 vezes em água bidestilada em
triplicata. Para a conversão de nitratos em nitritos foram adicionados às amostras 30 µL de um
coquetel contendo 10 µL de FAD (Sigma®) (200 µM), 10 µL de NADPH (Sigma®) (6 mM) e
10 µL da enzima nitrato redutase na concentração de 1U/mL (Sigma®) conforme descrito por
SCHIMIDT et al. (1989). As amostras foram incubadas 24 horas a 37ºC. Um segundo
coquetel contendo 10 µL de piruvato (Sigma®) (100 mM) e 10 µL de lactato desidrogenase
(Sigma®) (5mg/mL), na quantidade de 20 µL foi adicionado às amostras, seguido de uma
incubação por 10 minutos a 37ºC para que o excesso de NADPH e FAD fosse oxidado. A
desproteinização foi feita através da adição de 10 µL sulfato de zinco (ZnSO4) (Sigma®)
(300g/L) seguida por 5 minutos de centrifugação a 5000 rpm.
Após esta etapa, foram pipetados 100 µL das amostras preparadas e 100 µL do reagente
de Griess em placas de 96 poços, em duplicata e incubados à temperatura ambiente por 10
minutos. A seguir foi determinada a absorbância a 540 nm em leitor de ELISA (GREEN et
al., 1982). Os resultados expressos em µM foram determinados após a extrapolação de
valores obtidos de uma curva padrão realizada com nitrito de sódio (NaNO2) nas
concentrações de 0,78 a 100 µM para cada placa.
O reagente de Griess foi preparado na hora do uso, homogeneizando partes iguais da
solução A - sulfanilamida 1% em H3PO4 2,5% (MERCK®) e da solução B - naftilenodiamina
0,1% em água bidestilada (GREEN et al, 1982).
• Análise estatística:
Foi realizada utilizando-se testes específicos para comparar os grupos estudados, com o
apoio instrumental dos softwares PRISMA 5.0. As variáveis quantitativas foram analisadas
por teste t para dados paramétricos e por teste de Mann-Whitney para os dados não-
paramétricos. Nas análises realizadas entre os grupos de indivíduos testados foram retirados
os out-liers, que foram definidos como aqueles pontos que se afastaram em mais que 1,5
vezes o terceiro quartil (Q3) menos o primeiro quartil (Q1), ou seja, se o valor for maior que
Q3+[1,5 vezes(Q3-Q1)] ou menor que Q1-[1,5 vezes(Q3-Q1)]. A relação entre as citocinas
foi examinada pelo teste de correlação de Pearson quando os dados eram paramétricos e pela
correlação de Spearman quando os dados eram não paramétricos.
5. RESULTADOS
5.1 PERFIL CLÍNICO-HEMATOLÓGICO E SÓCIO-DEMOGRÁFICO DOS
INDIVÍDUOS COM OSTEOMIELITE ESTAFILOCÓCICA CRÔNICA
Neste estudo foi observado que a maioria dos pacientes eram do sexo masculino e
possuiam em média 35 anos. O trauma foi o modo de infecção mais encontrado (19 em 20
casos) nos pacientes. Os ossos mais acometidos foram a tíbia seguida pelo fêmur, pois
também são os ossos frequentemente expostos a fraturas. O tempo médio de internação dos
pacientes estudados foi de 25 dias e o tempo médio de última reagudização (apresentação de
sinais e sintomas da fase aguda como febre, dor óssea intensa, presença de fístula e secreção
purulenta) foi de 5,2 meses (Tabela 1).
Foi realizada uma coleta de dados nos prontuários dos pacientes com osteomielite
estafilocócica crônica que ficaram internados. Verificou-se que 47% dos pacientes
apresentavam níveis elevados de proteína C reativa (PCR), que consiste em um exame
indicativo da existência de processos inflamatórios agudos. Já em relação à contagem
eritrocitária, a média dos resultados foi de 4,2 milhões/µL/mm e em relação ao leucograma a
média foi de 10173 células/µL/mm3 (Tabela 2).
Tabela 1 – Perfil clínico dos pacientes com osteomielite estafilocócica crônica
Características Nº % Sexo
Masculino 14 70 Feminino 6 30
20 100 Osso acometido
Tíbia 15 75 Fêmur 2 10 Outros* 3 15
20 100 Causa
Trauma 19 95 Infecção secundária 1 5
20 100 Tipo de tratamento
Cirúrgico 10 50 Antibioticoterapia 10 50
20 100 Idade (anos)
Média ± DP 35 ± 16,2 Mediana (Q1/Q3) 31,5 (24,0/48,0)
Min-Máx. 10,0-60,0 anos Tempo de última reagudização (em meses)
Média ± DP 5,2 ± 3,7 Mediana (Q1/Q3) 4,5 (2,0/7,8)
Min-Máx. 1,0-12,0 Tempo de internação (em dias)(1)(2)
Média ± DP 25,0 ± 14,3 Mediana (Q1/Q3) 25,0 (12,5/30,0)
Min-Máx. 0,0-58,0 (1) excluídas as fichas sem informação (2) n=16 Q1 = Primeiro quartil Q3= Terceiro quartil
Tabela 2 – Avaliação de parâmetros laboratoriais dos pacientes com osteomielite estafilocócica crônica
Parâmetros hematológicos Nº % Proteína C Reativa (1)
Igual ou menor que 6 8 53 Maior que 6 7 47
15 100 Contagem eritrocitária (milhões/µL/mm) (1)
Média ± DP 4,5 ± 0,9 Mediana (Q1/Q3) 4,6 (4,1/5,2)
Min-Máx. 2,6-5,6 Contagem leucocitária (células/µL/mm3) (1)
Média ± DP 10173 ± 5396 Mediana (Q1/Q3) 9200 (7200/10600)
Min-Máx. 6100-28700 (1) excluídas as fichas sem informação Valores de referência: Proteína C Reativa – igual ou menor que 6 / Contagem eritrocitária - 4,2-5,9 milhões/µL/mm / Contagem leucocitária – 4300 a 10800 células/µL/mm3 (SPRINGHOUSE, 2005) Q1 = Primeiro quartil Q3= Terceiro quartil
5.2 AVALIAÇÃO DA RESPOSTA DE PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS
MONONUCLEARES DO SANGUE PERIFÉRICO
A avaliação da proliferação de PBMC na ausência ou presença de estímulos SEA e PHA
foi realizada através do ensaio de proliferação celular. O objetivo deste teste é verificar se as
PBMC sofreram aterações em sua taxa de proliferação quando colocadas frente a um estímulo
e se essas alterações foram diferentes entre os grupos estudados. A Figura 2 mostra os valores
máximos e mínimos e os percentis 25, 50 e 75 da proliferação total da cultura de PBMC dos
pacientes e dos controles estimuladas na ausência ou presença de SEA ou PHA. O símbolo +
representa a média dos valores encontrados. Não houve diferenças significativas entre os
dados referentes aos pacientes e aos controles, indicando que as PBMC de pacientes e
controles responderam de maneira semelhante frente aos estímulos.
Figura 2 – Proliferação de PBMC de pacientes com osteomielite e indivíduos do grupo controle estimuladas por SEA ou PHA. 2 x 105 células/poço cultivadas na ausência ou presença de 0,1µg/mL de SEA e 2,5µg/mL de PHA (concentração final) 3 dias a 37ºC e 5% de CO2. Linhas horizontais representam percentis 25, 50 e 75, linhas verticais os valores máximos e mínimos e o símbolo + a média dos valores encontrados. Para dados paramétricos foi realizado o teste t e para não paramétricos o teste de Mann-Whitney.
0
10000
20000
30000
40000
MEIO SEA PHA
Grupo de indivíduos controle
Pacientes
CPM
5.3 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE CITOCINAS IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-2 e IL-6
As Figuras 3 e 4 mostram os valores máximos e mínimos e os percentis 25, 50 e 75,
dos níveis de citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-2 produzidas no sobrenadante de cultura de
células mononucleares do sangue periférico dos pacientes e dos indivíduos controle, na
ausência ou na presença dos estímulos de SEA ou PHA. O símbolo + representa a média dos
valores encontrados. Não foi observada diferença significativa nos níveis de IFN-γ, TNF-α,
IL-10, IL-2.
Figura 3 – Produção de citocinas IFN-γ, TNF-α por PBMC de pacientes com osteomielite e indivíduos controle. 2 x 105 células/poço cultivadas na presença de 1µg/mL de SEA e 2,5 µg/mL de PHA (concentração final) por 3 dias a 37C a 5% de CO2. Os sobrenadantes foram coletados e as citocinas foram analisadas por citometria de fluxo. Os resultados foram expressos em IMF (intensidade média de fluorescência). Linhas horizontais representam percentis 25, 50 e 75, linhas verticais os valores máximos e mínimos e o símbolo + a média dos valores encontrados. Para dados paramétricos foi realizado o teste t e para não paramétricos o teste de Mann-
Whitney.
0
2000
4000
6000
8000
MEIO SEA PHA
Grupo de indivíduos controle Pacientes
IFN- γγ γγ (IMF)
0
1500
3000
4500
6000
MEIO SEA PHA
TNF- αα αα (IMF)
Figura 4 – Produção de citocinas IL-10. IL-2 por PBMC de pacientes com osteomielite e indivíduos controle. 2 x 105 células/poço cultivadas na presença de 1µg/mL de SEA e 2,5 µg/mL de PHA (concentração final) por 3 dias a 37C a 5% de CO2. Os sobrenadantes foram coletados e as citocinas foram analisadas por citometria de fluxo. Os resultados foram expressos em IMF (intensidade média de fluorescência). Linhas horizontais representam percentis 25, 50 e 75, linhas verticais os valores máximos e mínimos e o símbolo + a média dos valores encontrados. Para dados paramétricos foi realizado o teste t e para não paramétricos o teste de Mann-Whitney.
Foram realizadas correlações entre as citocinas TNF-α, IFN-γ e IL-10 produzidas pelas
células mononucleares do sangue periférico estimuladas pelo SEA, como mostrado na tabela
3. Verificou-se que o grupo de pacientes apresentava forte correlação positiva entre as
citocinas IFN-γ e IL-10 (r=0,75/p=0,0009), o que não foi observado no grupo controle
(r=0,43/p=0,08). Também verificou-se forte correlação positiva entre as citocinas IFN-γ e
TNF-α nos dois grupos de indivíduos testados. Os pacientes apresentaram uma correlação
mais forte (r=0,94/p<0,0001) do que os indivíduos do grupo controle sem história de infecção
ósteo-articular (r=0,71/p=0,001). O mesmo aconteceu na correlação feita entre as citocinas
TNF-α e IL-10 (pacientes: r=0,83/p<0,0001; grupo controle: r=0,68/p=0,002).
Tabela 3 – Correlação entre a produção de citocinas frente ao SEA
A análise de correlação de Pearson para os dados com distribuição Normal e análise de Spearman(*) para os dados que não seguem distribuição Normal. NS = Não significativo
IL-10 TNF-α Pacientes (r/p) Controles (r/p) Pacientes (r/p) Controles (r/p) IFN-γ 0,75/0,0009 0,43/0,08 0,94/<0,0001 (*) 0,71/0,001 TNF-α 0,83/<0,0001 (*) 0,68/0,002 1 1
0
100
200
300
400
MEIO SEA PHA
Grupo de indivíduos controle Pacientes
IL-10 (IMF)
0
35
70
105
140
MEIO SEA PHA
IL-2 (IMF)
A Figura 5 mostra os valores máximos e mínimos e os percentis 25, 50 e 75, dos
níveis de citocina IL-6 produzida no sobrenadante de cultura de células mononucleares do
sangue periférico dos pacientes e dos indivíduos controle, na ausência ou na presença dos
estímulos de SEA ou PHA. O símbolo + representa a média dos valores encontrados.
Verificou-se que as PBMC dos pacientes com osteomielite estafilocócica crônica produziram
menores quantidades de IL-6 do que as PBMC dos indivíduos não portadores da doença
quando estimuladas pelo SEA (p=0,03) (Figura 5).
Figura 5 - Produção de citocina IL-6 por PBMC de pacientes com osteomielite e indivíduos controle. A figura 5 representa os dados expressos em IMF (intensidade média de fluorescência). 2 x 105 células/poço cultivadas na presença de 1µg/mL de SEA e 2,5 µg/mL de PHA (concentração final) por 3 dias a 37C a 5% de CO2. Os sobrenadantes foram coletados e as citocinas foram analisadas por citometria de fluxo. Os resultados foram expressos em IMF. Linhas horizontais representam percentis 25, 50 e 75, linhas verticais os valores máximos e mínimos e o símbolo + a média dos valores encontrados. Para dados paramétricos foi realizado o teste t e para não paramétricos o teste de Mann-Whitney. Valores significativos p< 0,05.
0
5000
10000
15000
p=0,03
Grupo de indivíduos controle
Pacientes
IL-6 (IMF)
A Tabela 4 compara a freqüência de indivíduos alto e baixo produtores de IL-6 dentro
dos grupos estudados. Usou-se como valor de referência para categorizar os 40 indivíduos a
mediana dos níveis de IL-6 de todos em conjunto. Observou-se uma diminuição na freqüência
de indivíduos altos produtores de IL-6 nos grupo de pacientes quando as PBMC foram
estimuladas pelo SEA (p=0,057).
Tabela 4 - Freqüência de indivíduos baixo e alto produtores de IL-6 no grupo de pacientes e de indivíduos controle.
Os indivíduos foram categorizados em baixo e alto produtores através da mediana dos níveis de IL-6 dos 40 indivíduos estudados. PBMC foram estimuladas por SEA e PHA.
SEA Número de indivíduos/Total de
indivíduos (%)
PHA Número de indivíduos/Total de
indivíduos (%) Citocinas Pacientes Controles p Pacientes Controles p
IL-6 Baixo 13/20 (65) 7/20 (35) 0,057 12/20 (60) 8/20 (40) 0,205 Alto 7/20 (35) 13/20 (65) 8/20 (40) 12/20 (60)
5.4 AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DE NO
A Figura 6 mostra os valores máximos e mínimos e os percentis 25, 50 e 75, dos níveis
de nitrito e nitrato, que indiretamente retratam os níveis de NO, no plasma dos pacientes e dos
indivíduos do grupo controle. O símbolo + representa a média dos valores encontrados.
Observou-se uma diferença significativa de p=0,04 entre os grupos testados, mostrando que o
grupo de indivíduos com osteomielite estafilocócca crônica apresentam uma menor produção
de NO.
Figura 6– Níveis plasmáticos de NO em pacientes com osteomielite estafilocócica crônica e indivíduos controle. Plasmas dos indivíduos foram tratados com a enzima nitrato redutase, e em seguida com o reagente de Griess. A concentração de nitrito foi avaliada em leitor de ELISA a 540 nm. Os resultados foram expressos em µM. Linhas horizontais representam percentis 25, 50 e 75, linhas verticais os valores máximos e mínimos e o símbolo + a média dos valores encontrados. Foi realizado o teste t. Valores significativos p< 0,05.
0
6
12
18
24p=0,04
Grupo de indivíduos controle
Pacientes
Nitrito + Nitrato (uM)
6. DISCUSSÃO
As formas clínicas da osteomielite, aguda e crônica, são diferenciadas pela persistência
da infecção e pelo desenvolvimento de uma zona de sequëstro ósseo (CAREK et al., 2001).
Em nosso estudo, os pacientes foram avaliados clinicamente por um médico ortopedista e
tiveram o seu diagnóstico de osteomielite estafilocócica crônica baseado em exames
laboratoriais, radiográficos (seqüestro ósseo) e microbiológicos (presença de S. aureus). Outro
ponto importante a ser ressaltado é que todos os pacientes apresentaram fístulas em um
período menor ou igual a um ano, o que confere ao estudo uma margem de segurança para
afirmar que os pacientes ainda não estavam curados (Tabela 1). Os indivíduos que
participaram do grupo controle eram saudáveis e não apresentavam história prévia de infecção
articular-óssea.
O modo de infecção mais freqüente da osteomielite aguda é por via hematogênica, e os
pacientes mais acometidos normalmente são crianças. Já a osteomielite crônica tem como
etiologia mais comum o trauma, o que explica a sua maior prevalência em homens jovens,
devido a clara associação entre traumas e acidentes automobilísticos (KLOSTERHALFEN et
al., 1996). Esse fato foi constatado em nosso estudo, uma vez que o modo de infecção mais
frequente foi através do trauma (19 em 20 casos). Os ossos mais acometidos foram a tíbia
seguida pelo fêmur, que são frequentemente expostos a fraturas. A maioria dos pacientes
eram do sexo masculino e tinham em média 35anos (Tabela 1).
Neste estudo, todos os pacientes receberam antibioticoterapia e 50% deles o tratamento
cirúrgico (Tabela 1). Entretanto, a literatura mostra que a maioria dos casos são submetidos a
osteotomia do sequestro ósseo seguida de antibioticoterapia endovenosa. (LEW &
WALDVOGEL, 2004; LAZZARINI et al., 2004).
O tempo médio de internação dos pacientes estudados foi de 25 dias (Tabela 1), resultado
semelhante ao trabalho realizado por GLOVER et al. (1982) que avaliaram 58 pacientes, e
cujo tempo de internação variava entre 2 a 133 dias com média de 32 dias. Além disso, os
dados referentes às variáveis tais como sexo, idade, osso acometido e tipo de tratamento
adotado, descritas em nosso estudo, corroboraram com o perfil epidemiológico dos pacientes
com osteomielite atendidos no Hospital Municipal de Governador Valadares, no período de
2001 a 2006 (MORAES, C. manuscrito em preparação).
Os resultados dos exames laboratoriais dos pacientes neste estudo foram compatíveis
com aqueles normalmente encontrados em pacientes com osteomielite crônica relatados na
literatura (FULLILOVE et al., 2000; LAZZARINI et al., 2004). Foi observada uma ligeira
anemia em 31,2% dos pacientes e 47% apresentou PCR levemente aumentado. Apenas um
paciente com leucograma elevado, indicando a presença de uma infecção persistente, mas não
agudizada (Tabela 2).
A avaliação da proliferação de PBMC na ausência ou presença dos estímulos SEA e PHA
mostrou que não houve diferença significativa entre a proliferação de PBMC dos pacientes e
do grupo controle (Figura 2). Entretanto SCHLUTER et al. (1991); ALVAREZ et al. (1992)
verificaram que o índice de estimulação de linfócitos frente ao PHA foi menor para pacientes
com osteomielite pós-traumática do que para indivíduos sadios. Por outro lado o índice de
estimulação frente a concavalina A foi semelhante entre os dois grupos de indivíduos. Tal
divergência pode ser explicada porque esses autores trabalharam com pacientes com infecção
por bactérias Gram positivas e Gram negativas e utilizaram apenas linfócitos e não PBMC em
seus ensaios.
Além da proliferação de PBMC, procurou-se investigar outros elementos da resposta
imune que poderiam estar alterados na osteomielite estafilocócica crônica. As citocinas
constituem importantes mediadores da resposta imune, seja ativando ou regulando a atividade
celular (CAMERON & KELVIN, 2003). Não foram encontradas diferenças estatisticamente
significativas nos níveis das citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-10, IL-2 produzidas no sobrenadante
de cultura de PBMC de pacientes comparado com indivíduos do grupo controle, na ausência
ou na presença dos estimulos SEA ou PHA (Figura 3 e 4). Todavia, foi observado que as
PBMC dos pacientes apresentavam uma tendência em produzir níveis mais elevados dessas
citocinas quando comparadas as PBMC de individuos do grupo controle, após estímulo com
SEA. Sendo assim, buscou-se avaliar a correlação entre as citocinas TNF-α, IFN-γ e IL-10
produzidas pelas PBMC estimuladas pelo SEA, como mostrado na tabela 3. Verificou-se que
no grupo de pacientes havia uma forte correlação positiva entre as citocinas IFN-γ e IL-10
(r=0,75/p=0,009), o que não foi visto no grupo de indivíduos do grupo controle (r=0,43/0,08).
Também foi observada uma forte correlação entre as citocinas TNF-α e IL-10 no grupo de
pacientes (r=0,83/p<0,0001) e de forma menos expressiva nos indivíduos do grupo controle
(r=0,68/p=0,002).
Sabe-se que o S. aureus pode tanto colonizar a matriz óssea através da formação dos
biofilmes (RIBEIRO & CONSOLARO, 1999) como também ser internalizado pelos
osteoblastos (JEVON et al., 1999). A forma de interação com os tecidos do hospedeiro pode
favorecer o escape da bacteria à resposta imune, bem como facilitar a liberação de toxinas
estafilocócicas, como o SEA, no decorrer da infecção. Após a estimulação antigênica e na
ausência de sinais co-estimulatórios, durante o processo infeccioso, as células T são induzidas
a anergia ou apoptose. (GOODGLICK & BRAUN, 1994). A população anérgica é
heterogênea e inclui células T regulatórias e células T efetoras (SUNDSTEDT et al., 1997;
IVARS, 2007). Dessa forma, o controle da infecção pode não ser restabelecido, e a doença
passa para a sua fase crônica.
A IL-10 é uma citocina imunossupressora que foi originalmente descrita como um
produto de macrófagos ativados e de células T auxiliares tipo 2 capaz de inibir a produção de
citocinas IFN-γ, IL-1, TFN-α, IL-6 (MOORE et al., 2001). Tem-se demonstrado que a IL-10
também é produzida por outras sub-populações de linfócitos T tais como células CD4+
Foxp3+ e recentemente, foi descrita a produção de IL-10 por células T auxilares do tipo 1
com atividade reguladora (JANKOVIC & TRINCHIERI, 2007). A IL-10 está envolvida em
diversos mecanismos de regulação da resposta inflamatória, de modo a proteger o hospedeiro
contra possíveis danos provocados pela resposta imune (CORRÊA-OLIVEIRA et al., 1998;
TRINCHIERI, 2007). Outros estudos mostraram ainda que linhagens de células T CD4+
produtoras de IL-10 possuem um papel importante na modulação de infecções crônicas.
JANKOVIC et al. (2007) demontraram que a sobrevivência de animais infectados pelo T.
gondii dependia do padrão de citocinas produzidas pelos linfócitos Th1 com perfil regulador.
Os animais que apresentavam linfócitos Th1 produtores de IL-10 e IFN-γ simultaneamente,
evoluiam para a forma crônica da doença. ANDERSON et al. (2007) verificaram que tanto os
linfócitos T CD4+ do tipo 1 como os linfócitos T CD4+ Foxp3+ oriundos de camundongos
com infecção por L. major eram capazes de produzir IL-10.
Evidências sobre o papel protetor da IL-10 produzida pelas células T regulatórias em
experimentos com animais infectados por Escherichia coli, H. hepaticus e Helicobacter pylori
têm sido descritas (MILLS et al., 2004).
A forte correlação positiva entre as citocinas IFN-γ e IL-10 demonstrada em nosso
estudo, sugere que as PBMC dos indivíduos com osteomielite estafilocócica crônica
estimuladas pelo SEA in viro possam estar produzindo simultaneamente ambas as citocinas.
Esse fato foi realçado pelos níveis significativamente mais elevados de IFN-γ detectados no
grupo de pacientes alto produtores de IL-10. Entretanto, nosso estudo não nos permite
concluir qual a fonte específica de produção de IFN-γ e IL-10, uma vez que as populações de
células tais como linfócitos T CD8+, linfócitos B, monócitos, além das células T CD4+
também produtoras de IL-10 estavam presentes nos ensaios de cultura in vitro. Estudos
futuros que envolvam a purificação de células T CD4+ do pool de PBMC dos pacientes com o
objetivo de melhor avaliar a produção dessas citocinas estão sendo planejados.
O TNF-α é um dos principais mediadores da resposta inflamatória aguda a agentes
infecciosos, produzido principalmente por linfócitos T e macrófagos. É responsável pelo
recrutamento de neutrófilos e monócitos para os locais de infecção. Normalmente, IFN-γ e
TNF-α agem em conjunto na resposta imune celular para a eliminação dos patógenos. A
produção de TNF-α pelo macrófago é dependente de IFN-γ (LOCKSLEY et al., 2001). Em
nosso estudo, observamos uma forte correlação positiva entre as citocinas IFN-γ e TNF-α nos
dois grupos de indivíduos testados. Entretanto, os pacientes apresentaram uma correlação
mais forte (r=0,94/p<0,0001) do que os indivíduos do grupo controle (r=0,71/p=0,001) sem
história de infecção articular-óssea.
A IL-2, produzida por linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD8+ é considerada um fator de
crescimento para linfócitos T (NELSON & WILLERFORD et al., 1998). CORNWELL &
ROGERS (1999) verificaram que SEA induziu a proliferação de célula Th1 de camundongos
em um período inicial da infecção que foi seguido de anergia profunda e diminuição dos
níveis da IL-2. Contudo esses pesquisadores sugerem que os eventos de transdução de sinal
que levam a ocorrência de anergia coincidem, mas não dependem da diminuição da produção
de IL-2 (JENKINS & SCHWARTZ, 1987; KANG et al., 1992). No presente estudo, não foi
encontrada diferença quanto a produção de IL-2 nos pacientes com osteomielite estafilocócica
crônica frente ao SEA e ao PHA.
A IL-6, produzida por fagócitos mononucleares, linfócitos T ativados, dentre outras
linhagens de céulas, parece ter um papel importante no desenvolvimento da osteomielite
(ISHIHARA & HIRANO, 2003). No início da infecção pelo S. aureus observa-se que há uma
produção significativa de mediadores inflamatórios, dentre eles TNF-α, IL-1-β, IL-6, e IL-8
(KLOSTERHALFEN et al., 1996) e sinais clínicos como febre alta, secreção de pus e dor
intensa, o que caracteriza a forma aguda da infecção (LEW & WALDVOGEL, 2004). No
presente estudo foi encontrada uma menor produção de IL-6 por PBMC dos pacientes frente
ao SEA quando comparada com a produção de IL-6 por PBMC dos indivíduos do grupo
controle (p=0,03) (Figura 5). KLOSTERHALFEN et al. (1996) não detectaram níveis
significativos de TNF-α, IL-1β, IL-6, e IL-8 em plasmas de pacientes com osteomielite
crônica. EVANS et al. (1998) e FULLILOVE et al. (2000) também observaram que não havia
diferença significativa na produção de IL-6, TNF-α e IL-8 quando sangue total de pacientes
com ostemielite bacteriana era estimulado com LPS e comparado com indivíduos do grupo
controle. Em nosso estudo, quando comparamos a freqüência de indivíduos alto e baixo
produtores de IL-6, observamos uma redução na freqüência de indivíduos alto produtores de
IL-6 nos grupos de pacientes quando as PBMC foram estimuladas pelo SEA (p=0,057)
(Tabela 4). A menor produção de IL-6 pelas PBMC dos pacientes com osteomielite
estafilocócica poderia interferir no desenvolvimento dos linfócitos B, e consequentemente,
com a produção de anticorpos, bem como afetar a sobrevivência dos fagócitos (ABBAS &
LICHTMAN, 2005). BANSAL et al. (1992) observaram que pacientes com osteomielite
apresentavam níveis reduzidos de IgG, IgA e IgM no soro.
Tem sido discutido na literatura, o papel do óxido nítrico em várias doenças causadas por
fungos (GRANGER et al., 1990), bactérias (SUMMERSGILL et al., 1992), protozoários
(VESPA, 1994) e helmintos (OLIVEIRA et al., 1998). Entretanto, a participação do óxido
nítrico no desenvolvimento da osteomielite estafilocócica crônica ainda não está
completamente elucidada. O NO parece estar envolvido com a eliminação do S. aureus
através da ativação de neutrófilos e macrófagos, fator importante na fisiopatologia dessa
doença (CHADHA et al., 1999). TSUKAYAMA (1999) relatou que pacientes com doença
crônica granulomatosa causada principalmente pelo S. aureus apresentavam neutrófilos
incapazes de produzir radical livre, contribuindo assim para o desenvolvimento da doença.
Nossos resultados mostraram que os pacientes com osteomielite estafilocócica crônica
apresentaram níveis plasmáticos de nitrito e nitrato menores que os indivíduos do grupo
controle (p=0,04) (Figura 6). Todavia, trabalhos realizados com outras doenças ósseas
mostraram que os níveis de óxido nítrico estavam mais elevados no grupo de paciente do que
na população sadia (VANT´HOF & RALSTON 2001).
Interessantemente, ASENSI et al. (2004) e OCANA et al. (2007) encontraram uma
correlação negativa entre níveis de IL-6 e apoptose dos neutrófilos de pacientes com
osteomielite. Uma menor sobrevida dos fagócitos causada pela deficiência de IL-6 sugere
uma diminuição na produção plasmática de NO nos pacientes com osteomielite estafilocócica
crônica (Figura 6). A presença de IL-10 nos sobrenadantes das culturas de PBMC estimuladas
pelo SEA poderia indicar a participação da IL-10 no processo de evolução da osteomielite
para a fase crônica da doença, resultando na diminuição da IL-6 e do NO (HUANG et al.,
2002). ROILIDES et al. (1998) demonstraram que a IL-10 reduz a atividade bactericida dos
monócitos humanos infectados pelo S. aureus, apesar de não reduzir a sua capacidade
fagocítica.
Finalmente, a forte correlação positiva entre IFN-γ, TNF-α e IL-10, descrita em nosso
estudo, bem como a reduzida produção de IL-6 pelas PBMC dos pacientes frente ao SEA,
aponta para um possível mecanismo de regulação da resposta imune pela infecção por S.
aureus na fase crônica da doença. A deficiência de IL-6 é sugestiva de uma menor produção
de anticorpos que normalmente é observada em pacientes com osteomielite crônica. A menor
sobrevida dos fagócitos e consequentemente a diminuição da produção de radicais livres
poderia comprometer a eliminação do S. aureus, contribuindo também para a cronificação da
doença. Embora nossos resultados tenham indicado alterações da resposta imune em pacientes
com osteomielite estafilocócica crônica, estudos complementares estão sendo planejados no
sentido de melhor avaliar a produção de citocinas por populações específicas de células T
CD4+ do pool de PBMC de pacientes.
7. CO>CLUSÃO
O estudo proposto sugere que pacientes com osteomielite estafilocócica crônica
apresentam alterações na resposta imune relacionadas com a produção das citocinas IFN-γ,
TNF-α, IL-6, IL-10 e do NO. A presença de IL-10 nos sobrenadantes das culturas de PBMC
estimuladas pelo SEA poderia indicar a participação da IL-10 no processo de evolução da
osteomielite para a fase crônica da doença, resultando na diminuição da IL-6 e do NO.
8. REFERÊ>CIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H. Imunologia Celular e Molecular. 5.ed. São Paulo: Elsevier, 2005. ALVAREZ, V.A. et al. Alteraciones inmunológicas en la osteomielitis crônica. Anales de
!edicina Interna, v.9, n. II, p.526-530, 1992. ANDERSON, C.F. et al. CD4(+)CD25(-)Foxp3(-) Th1 cells are the source of IL-10-mediated immune suppression in chronic cutaneous leishmaniasis. Journal. Experimental. Medicine. v.204, n.2, p.285-297, 2007. ASENSI, V. et al. In Vivo Interleukin-6 Protects Neutrophils from Apoptosis in Osteomyelitis. Infection and immunity, v. 72, n.7, p. 3823-3628, 2004. ASSREUY, J. et al. Feedback inhibition of nitric oxide syntheses activity by nitric oxide. Britanic. Journal Pharmacy, v.108, p.833-837, 1993. BALABAN, N.; RASOOLY, A. Staphylococcal enterotoxins. International Journal of Food
Microbiology, v. 61, n.1, p. 1-10, 2000. BANSAL, V.P.; MITTAL, P.K.; ASHOKRAJ, G. Humoral immune responses in osteomyelitis. International Orthopaedics, v.16, p.297-301, 1992. BAVARI, S.; ULRICH, R.G. Staphylococcal enterotoxin A and toxic shock syndrome toxin compete with CD4 for human major histocompatibility complex class II binding. Infection
and immunity, v.63, p.4937-4939, 1995. BENJAMIN, N.; WALLANCE, P. Plasma nitric as a marker of nitric oxide production. Lancet, v. 344, n.8927, p.960, 1994. BOST, K.L. et al. Staphylococcus aureus infection of mouse or human osteoblasts induces high levels of interleukin-6 and interleukin-12 production. Journal Infection Disease, v.180, n.6, p.1912-20, 1999. CALLAHAN, J.E. et al. Stimulation of B10.BR T cells with superantigenic staphylococcal toxins. Journal of Immunology., v.144, p.2473-2479, 1990.
CAMERON, M.J.; KELVIN, D.J. Cytokines and chemokines--their receptors and their genes: an overview. Advances in Experimental Medicine and Biology, v.20, p8-32, 2003. CAREK, P.J.; DICKERSON, L.M.; SACK, J.L. Diagnosis and management of osteomyelitis. Am. Fam. Physician., v.63, n.12, p.2413-2420, 2001. CARNEIRO-SAMPAIO, M.; COUTINHO, A. Immunity to Microbes: Lessons from Primary Immunodeficiencies. Infection and immunity, v.75, p. 1545-1555, 2007. CASTILLO, L. et al. Plasma arginine, citruline, and ornithine kinetics in adults, with observations on nitric oxide synthesis. American Journal of Physiology, v. 268, p.360-367, 1995. CIAMPOLINI, J.; HARDING, K.G. Pathophysiology of chronic bacterial osteomyelitis. Why do antibiotics fail so often? Postgraduate. Medical Journal, v.76, n.898, p.479-483, 2000. CIERNY G, MADER JT, PENNICK JJ. A clinical staging system for adult osteomyelitis. Contemporary. Orthopaedics., v.10, p.17-37, 1985. CORRÊA-OLIVEIRA, R. et al. Cytokines as determinants of resistance and pathology in human Schistosoma mansoni infection. Brazilian Journal of Medical and Biological
Research, v. 31, n.1, p.171-177, 1998. CORNWELL, W.D.; ROGERS, T. Role of interleukin-2 superantigen-induced T-cell anergy. Immunology, v.96, p.918-926, 1999. CHADHA, H.S. et al. Experimental acute hematogenous osteomyelitis in mice. I. Histopathological and immunological findings. J. Orthop. Res., v.17, n.3, p.376-81, 1999. DORMANS, J.P.; DRUMMOND, D.S. Pediatric Hematogenous osteomyelitis: New trends in presentation. Diagnosis and treatment. American Academy of Orthopaedic Surgeons, v.2, n.6, p.333-341, 1994. EID, A.M.; ISSA, H.; DEIF, A.I. Some immunological aspects of staphylococcal haematogenous osteomyelitis. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery, v. 96, n.3, p.221-224, 1980.
EVANS, C. A.W. et al. Tumor Necrosis Factor-α , Interleukin-6, and Interleukin-8 Secretion and the Acute-Phase Response in Patients with Bacterial and Tuberculous Osteomyelitis, Journal Infection Disease, v. 177, p. 1582-1587, 1998. FERRANTE, A. et al. Killing of Staphylococcus aureus by tumor necrosis factor-α-activated neutrophils. The role of serum opsonins, integrin receptors, respiratory burst, and degranulation. Journal of Immunology, v.151, p.4821–4828, 1993. FULLILOVE, S. et al. Local and systemic concentrations of tumour necrosis factor-a, interleukin-6 and interleukin-8 in bacterial osteomyelitis. Transactions of the royal society of
the tropical medicine and hygiene, vol. 94, pp. 221-224, 2000. GILMOUR, W.N. Acute haematogenous osteomyelitis. Journal Bone Joint Surgery, v. 44, p. 841-853, 1962. GLOVER, S C. et al. Acute osteomyelitis in a District General Hospital, Lancet, v.13, n.1, p.609-611, 1982. GOODGLICK, L.; BRAUN, J. Revenge of the microbes. Superantigens of the T and B Cell Lineage. American Journal of Pathology, v. 144, n.4, 1994. GRANGER, D.L. et al. Metabolic fate L-arginine in relation to microbiostatic capability of murine macrophages. Journal Clinical Investigation, v.85, p.264-273, 1990. GREEN, L.C. et al. Analyses of nitrate, nitrite and [15N]nitrate in biological fluids. Anal.
Biochemistry, v.126, p.131-138, 1982. GROSSMAN, D. et al. Dual roles of class II major histocompatibility complex molecules in staphylococcal enterotoxin-induced cytokine production and in vivo toxicity. Infection and
immunity, v. 63, n.6, p.2141-2146, 1992. HIERHOLZER, S.; HIERHOLZER, G. The unsucessful surgical management of port-traumatic chronic bone infection. What is the role of serum factors? Archives of Orthopaedic
and Trauma Surgery, v. 100, p. 67-68, 1982. HUANG, C. et al. Interleukin-10 Inhibition of Nitric Oxide Biosynthesis Involves Suppression of CAT-2 Transcription. !itric Oxide, v.6, n.1, p.79-84, 2002.
ISHIHARA, K.; HIRANO, T. IL-6 in autoimmune disease and chronic inflammatory proliferative disease. Cytokine Growth Factor Rev., v. 13, n.4-5, p. 357–368, 2003. ISOBE, K.; NAKASHIMA, I. Feedback Suppression of Staphylococcal Enterotoxin-Stimulated T-Lymphocyte Proliferation by Macrophages through Inductive Nitric Oxide Synthesis. Infection and Immunity, v.60, n.11, p. 4832-4837, 1992. IVARS, F. Superantigen-induced regulatory T cells in vivo. Chemistry Immunology Allergy. v. 97, p, 137-160, 2007. JANKOVIC, D. et al. Conventional T-bet(+)Foxp3(-) Th1 cells are the major source of host-protective regulatory IL-10 during intracellular protozoan infection. Journal Experimental
Medicine, v.204, p.273-283, 2007. JANKOVIC, D.; TRINCHIERI, G. IL-10 or not IL-10: that is the question. !ature
immunology, v. 8, n. 12, 2007. JENKINS, M.K.; SCHWARTZ, R.H. Antigen presentation by chemically modified splenocytes induces antigen-specific T cell unresponsiveness in vitro and in vivo. Jorunal
Experimental Medicine, v, 165, p.302, 1987. JEVON, M. et al. Mechanisms of Internalization of Staphylococcus aureus by Cultured Human Osteoblasts. Infection and immunity., v.67, n.5, p. 2677-2681, 1999. KANG, S.M. et al. Transactivation by AP-1 is a molecular target of T cell anergy. Science, v.257, p.1134, 1992. KLOSTERHALFEN, B. et al. Local and Systemic Inflammatory Mediator Release in Patients with Acute and Chronic Posttraumatic Osteomyelitis. Journal of trauma, v. 40, n.3, p.372-378, 1996. LAZZARINI, L.; MADER, J.T.; CALHOUN, J.H. Osteomyelitis in Long Bones. The journal
of bone and joint surgery., v. 86-A, n. 10, p.2305-2318, 2004. LEE, D. P.; WALDOGEL, F. A. Osteomyelitis. Lancet, v. 364, p. 369-379, 2004. LOCKSLEY, R.M.; KILLEEN, N.; LENARD, M.J. The TNF and TNF Receptor Superfamilies: Integrating Mammalian Biology. Cell, v.104, 487-501, 2001.
MARRACK, P.; KAPPLER, J. The staphylococcal enterotoxins and your relatives. Science, v. 248, p.705-711, 1990. MILLS, K.H.G. Regulatory T cells: Friend or foe in immunity to infection? !ature, v.4, p. 841-855, 2004. MONCADA, S. The L-arginine: nitric oxide pathway. Acta Physiologica Scandinavica, v.329, p.201-227, 1992. MOSHAGE, H. et al. Nitrite and nitrate determinations in plasma: a critical evaluation. Clinical Chemistry., v.41, p.892-896. 1995. MOSHAGE, H.; JANSEN, P.L.M. Adaptation of nitrite and Griess method for measurement of serum nitrate plus nitrite levels. Annual Clinical. Biochemistry, v.35, p.154-155, 1998. MOORE, K.W. et al. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor. Annual Review
Immunology, v.19, p. 683–765, 2001. MORREY, B. F.; PETERSON H. A. Hematogenous pyogenic osteomyelitis in children. Orthopedic Clinics of !orth America, v.6, n.4, p.935-951, 1975. NAIR, S.P.; WILLIAMS, R.J., HENDERSON, B. Advances in our understanding of the bone and joint infection pathology caused by Staphylococcus aureus infection. Rheumatology,
v.39, p.821-834, 2000. NAKANE, A. et al. Endogenous Gamma Interferon, Tumor Necrosis Factor, and Interleukin-6 in Staphylococcus aureus. Infection in Mice. Infection and immunity, v.63, p. 1165-1172, 1995. NELSON, B.H.; WILLEFORD, D.M. Biology of the interleukin-2 receptor. Advances in
Immunology, v.70, p.1-81, 1998. NICHOLSON, N.C.; BENTO J.L. Staphylococcus aureus infection of mouse or human osteoblasts induces high levels of interleukin-6 and interleukin-12 production. J. Infec. Dis.,
v.180, p.1912-20, 1999. NORMAN, J.E.; LIEW, F.Y. Nitric oxide. Molecular Medicine Today. Fourth International
Meeting on the Biology of !itric Oxide. p. 358, 1995.
OCANA, M.G. et al. Autoregulation mechanism of human neutrophil apoptosis during bacterial infection. Moecular. Immunology, v. 45, n.7, p.2087-2096, 2007. O’GARRA, A. et al. IL-10–producing and naturally occurring CD4+ Tregs: limiting collateral damage. The Journal of Clinical Investigation, v.114, n.10, p.1372-1378, 2004. OLIVEIRA, D.M. et al. Role of nitric oxide on human schistosomiasis mansoni: upregulation of in vitro granuloma formation by NΩ-nitro L-arginine methyl ester. Nitric Oxide. Biology
and Chemistry, v.2, n.1, p.57-65, 1998. PUDIL, R.; KARPAS, K.; HANOVCOVA, I. Basic indicators of cellular immunity in patients with chronic staphylococcal osteomyelitis. Acta chirurgiae orthopaedicae et
traumatologiae Cechoslovaca, v. 60, n.2, p.100-103, 1993 . QUEIROZ, S.L ; BATISTA, A.Z. Funções Biológicas do Óxido Nítrico. Química !ova, v.22, n.4, p.584-590, 1998. RIBEIRO, F. C.; CONSOLARO, A. Aspectos morfológicos dos biofilmes microbianos na osteomielite crônica superativa ortodôntica e parendodôntica. FOB, v. 7, n. ½, p. 41-47, 1999. ROILIDES, E. et al. Suppressive Effects of Interleukin-10 on Human Mononuclear Phagocyte Function against Candida albicans and Staphylococcus aureus. J. Infec. Dis, v. 178, p. 1734-1742, 1998. SASAKI, S. et al. Protective role of nitric oxide in Staphylococcus aureus infection in mice. Infection and Immunity, v.66, n.3, p.1017-1022, 1998. SCHIMIDT, H.H.W. et al. Enzymatic formation of nitrogen oxides from L-arginine in bovine brain cytosol. Biochemistry Biophysics Research Communications, v.165, p.284-291, 1989. SCHLUTER, B. et al. Impairment of specific host defense mechanisms in patients with chronic post-traumatic osteomyelitis. Journal Trauma, v.31, n.1, p. 68-73, 1991. SCHOLL, P.R.; GEHA, R.S. MHC II signaling in B-cell activation. Immunology Today, v. 15, p.418, 1994. SHEFF, E. K. Solving the mystery of the osteomyelitis. !ursing, v.35, n.7, p.1-3, 2005.
SPRINGHOUSE CORPORATION. Testes diagnósticos. 1. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005. SUMMERSGILL, J.T. et al. Killing of Legionella pneumophila by nitric oxide in gamma-interferon-activated macrophages. Journal Leuko. Biology, v.52, p.625-629, 1992. SUNDSTEDT, A. et al. Immunoregulatory role of IL-10 during superantigen-induced hyporesponsiveness in vivo. The Journal of Immunology, v.158, n.1, p.180-186, 1997. THOMAS, D. et al. Diversity in Staphylococcus aureus enterotoxins. Chemistry Immunology
Allergy, v. 93, p. 24-41, 2007.
TIEDMANN, R.E.; FRASER, J.D. Cross-linking of MHC II molecules by staphylococcal enterotoxin A is essencial f or antigen-presenting cell and T cell activation. Journal
Immunology, v.157, p.3958-3966, 1996. TSUKAYAMA, D. T. Pathophysiology of Posttraumatic Osteomyelitis. Clinical
Orthopaedics and Related Research, v. 360, p.22-29, 1999. TRINCHIERI, G. Interleukin-10 production by effector T cells: Th1 cells show self control. JEM, v. 204, n.2, p.239-243, 2007. UCHIYAMA, T. et al. Relative strength of the mitogenic and interieukin-2-production-inducing activities of staphylococcai exotoxins presumed to be causative exotoxins of toxic shock syndrome: toxic shock syndrome toxin-1 and enterotoxins A, B and C to murine and human T cells. Clinical experimental Immunology, v. 75, p.239-244, 1989. VANT´HOF, R.J.; RALSTON, S.H. Nitric oxide and bone. Immunology, v.103, p.225-261, 2001. VESPA, G.N.R. Papel do óxido nítrico na infecção experimental com Trypanossoma cruzi. 1994. (Tese, Doutorado em Imunologia Básica e Aplicada). Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto., p.116. WAGNER, C. et al. Post-traumatic osteomyelitis: analysis of inflammatory cells recruited into the site of infection. Shock, v. 20, p. 503-510, 2003.
WALDVOGEL, F.A.; MEDOFF, G.; SWARTZ, M.N. Osteomyelitis: a review of clinical features, therapeutic considerations and unusual aspects. The !ew England Journal
Medicine, v.282, n.4, p.198-206, 1970.
WEILAND, A.J.; MOORE, J.R.; DANIEL, R.K. The efficacy of free tissue transfer in the treatment of osteomyelitis. Journal Bone Joint Surgery American, v.66, n.2, p.181-193, 1984.
WEN, R. et al. Major histocompatibility complex class II-associated peptides control the presentation of bacterial superantigens to T cells. Journal Experimental Medicine, v.183, p. 1083-1092, 1996. WHITE, J. et al. The Vbeta-specific superantigen staphylococcal enterotoxin B: Stimulation of mature T cells and clonal deletion in neonatal mice. Cell, v.56, p.27-35, 1989. YOKOMIZO, Y. et al. Poliferative response and cytokine production of bovine peripheral blood mononuclear cells induced by the superantigens staphylococcal enterotoxins and toxic shock syndrome toxin-1. Journal Veterinary Medical Science, v. 57, n.2, p. 299-305, 1995. YOON, K.S. et al. Experimental acute hematogenous osteomyelitis in mice. II. Influence of Staphylococcus aureus infection on T-cell immunity. Journal Orthopedic Research, v.17, n.3, p. 382-91, 1999.
9. A>EXOS
Figura 1 – Avaliação da concentração de estímulo utilizada para o teste de proliferação de PBMC de pacientes com osteomielite e indivíduos do grupo controle estimuladas por SEA ou PHA. 2 x 105 células/poço cultivadas na ausência ou presença de 1µg/mL, 0,1µg/mL, 0,01µg/mL e 0,001µg/mL de SEA e 2,5µg/mL de PHA (concentração final) 3 dias a 37ºC e 5% de CO2. Linhas horizontais representam percentis 25, 50 e 75, linhas verticais os valores máximos e mínimos e o símbolo + a média dos valores encontrados. Para dados paramétricos foi realizado o teste t e para não paramétricos o teste de Mann-Whitney. Valores significativos p< 0,05.
Grupo de indivíduos controle
MEIO
g/mL
µµµµ
SEA 1
g/mL
µµµµ
SEA 0,1
g/mL
µµµµ
SEA 0,01
g/mL
µµµµ
SEA 0,001
g/mL
µµµµ
PHA 2,5
0
7500
15000
22500
30000
CPM
Pacientes
MEIO
g/mL
µµµµ
SEA 1
g/mL
µµµµ
SEA 0,1
g/mL
µµµµ
SEA 0,01
g/mL
µµµµ
SEA 0,001
PHA 2,5mg/mL
0
10000
20000
30000
40000
CPM