Université Abderahmane Mira de Béjaia Département des

Ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique Université Abderahmane Mira de Béjaia

Département des Sciences Biologiques de l’Environnement

Chargée du module: Mme AYOUNI. Z

Cours n°06: Module: Techniques de laboratoire 1I:

2

Plan

DÉFINITION

Le terme chromatographie vient du grec

(chroma : couleur ; graphein : écrire).

Ce terme désigne un ensemble de méthodes d'analyse physico-

chimique, qui sépare des constituants présents dans des mélanges variés par

entraînement d’une phase mobile (liquide ou gaz) le long d’une phase

stationnaire (solide ou liquide fixé).

Chaque soluté est donc soumis à une force de rétention (exercée

par la phase stationnaire) et une force de mobilité (due à la phase mobile).

GENERALITES

Les différentes techniques chromatographiques sont classées en fonction de leur

Phase mobile et leur phase stationnaire.

a.chromatographie gaz-liquide;

b.chromatographie liquide-liquide.

en spécifiant la nature des interactions principales entre la phase stationnaire et les

substances à séparer: si la force de rétention est de nature ionique, la technique de

séparation est appelée chromatographie par échange d'ions alors que si elle est

due à l'adsorption des molécules de soluté sur la phase stationnaire solide, on

parle de chromatographie d'adsorption. Les autres types sont : par exclusion sur

gel, d’affinité et de partage.

Selon le support utilisé, on parle de :

a) Chromatographie sur colonne : le support est un tube étroit.

b) Chromatographie sur couche mince : le support est une plaque ;

c) Chromatographie sur papier : le support est une feuille de papier.

Les différents composants de l'échantillon ont généralement une

vitesse caractéristique qui permet de les séparer, voire de les

identifier. Cette vitesse de séparation est fortement dépendante de la

nature de la phase mobile et de la phase stationnaire. Souvent,

l'échantillon est analysé par comparaison avec des substances déjà

connues dans l'échantillon ou par comparaison avec les résultats de

l'analyse d'une solution-étalon (solution commerciale contenant des

substances connues, à des concentrations bien connues).

PRINCIPE

TYPES DE CHROMATOGRAPHIES

1/CHROMATOGRAPHIE SUR PAPIER (C. DE PARTAGE)

Composants :

o Une enceinte en verre étanche : appelée cuve de chromatographie

o Support : feuilles en papier-filtre maintenues verticalement dans l’enceinte ;

o Phase stationnaire : humidité présente dans la feuille de papier ;

o Phase mobile: solvants organiques(butanol/acide acétique/alcool t-

amylique/pyridine, …) ;

Principe :

Une goutte (5-10 µl) de l’échantillon à analyser est déposée sur le papier (à l’aide d’une

pipette pasteur par exemple) ;

On dépose de la même façon des échantillons de substances pures connues qui vont

servir de témoins Le passage du solvant réalise un partage des substances à séparer entre

les deux phases ; Une fois que le passage du solvant est terminé :

On sort le papier (représente le chromatogramme) ; On le sèche ;

On le révèle (on fait apparaitre les diverses molécules qui ont été séparées sous forme de

tâches).



Terminologie :

La ligne supérieure d’imbibition du papier : front

Le passage du solvant à travers le papier : développement du chromatogramme

(dure de 15 à 25 heures selon la nature du solvant et la taille des feuilles) ;

Conditions :

Température thermostatée aux alentours de 20°C ;

Diamètre de la tâche de l’échantillon déposée doit être un cercle aussi régulier que

possible (ou une ligne horizontale linéaire lorsqu’on dépose un volume important) ;

Types

Ascendante : La phase mobile disposée à la base ; Monte par capillarité.

Descendante :La phase mobile disposée près du sommet dans une augette ;

S’écoule progressivement du haut en bas.


- Les dépôts doivent être à distance respectable pour éviter leur

fusion.

-Après les dépôts, la feuille de papier doit être séchée

intégralement par ventilation sous hotte ou séchage à l’étuve à

60° .

- La placer dans la cuve sans qu’elle soit en contact avec le

solvant pour qu’elle s’équilibre avec les vapeurs qui saturent

l’atmosphère (la cuve doit être étanche).

-Au bout de quelques heures, immerger, sur 1 cm au moins, le

bord inférieur (ch. Ascendante) ou supérieur (ch. Descendante)

dans le solvant.


Types selon la dimension : a. Monodimensionnelle : Lorsque le solvant va dans une seule direction : de bas en haut ou de haut en bas b. Bi-dimensionnelle :

o L’échantillon est déposé dans un angle de la feuille ;

o La feuille est mise en contact d’un premier solvant qui fait migrer les

composants de l’échantillon dans le sens vertical ;

o Le chromatogramme obtenu est séché ; Il est tourné de 90° ;

o Et il est soumis à un deuxième solvant : les tâches obtenues dans le premier

chromatogramme vont être mise en contact avec ce 2e solvant (comme une

ligne de dépôt) ;

o Le développement permet une séparation sur une 2e dimension. Avantages de la ch. Bidimensionnelle :

Permet d’obtenir beaucoup plus de tâches que la monodimensionnelle : elle est beaucoup plus sélective. Inconvénients de la ch. Bidimensionnelle : Difficile à interpréter (absence de témoins) ;


Chromatographie bidimentionnelle

Chromatographie unidimentionnelle


Révélation :

Pulvériser un réactif convenable qui fait apparaitre les substances cherchées sous

forme de tâches colorées ou fluorescentes.

Si les tâches sont colorées, on examine le papier par Trans-illumination pour les

voir.

a. Réactifs révélateurs :

Ninhydrine pour les acides aminés ; Aniline pour les oses ;

Le vert de bromocrésol (indicateur de pH) pour les acides organiques (apparaissent

comme des tâches jaunes).

b. Interpréter le chromatogramme :

Comparer les caractéristiques du déplacement des substances séparées

(correspondant aux tâches révélées) par rapport à celles d’un témoin de même

nature.

Le rapport frontal (Rf) d’une substance a :

Est le rapport entre :

La distance parcourue par la tâche (distance entre le point de dépôt et le milieu de la

tâche) ;Et la distance parcourue par le solvant (distance de la ligne de dépôt au front du

solvant).


Identification de la substance a :

Comparer Rfa (qui est le rapport frontale de cette substance a) au Rf d’un témoin

connu dans 3 chromatogrammes obtenus avec 3 systèmes de solvants différents.

Applications :

La chromatographie sur papier permet de séparer efficacement avec un

équipement rudimentaire, des petites molécules (exemples : acides aminés,

oligopeptides, nucléotides, les oligonucléotides…) en fonction de leurs solubilités

.

Vérifier la pureté des produits ..


Exemple de chromatographie sur papier (Séparation des acides aminés)

Papier Whatman


2/CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE

Composants :

Elle diffère de la

chromatographie sur papier par le fait

que le papier est substitué par une

plaque sur laquelle se fixe la couche de

phase stationnaire.

La phase stationnaire est

appelée : adsorbant ou couche

adsorbante (peut être un gel, un

échangeur d’ion, de la cellulose…)

Elle se fixe sur une plaque de

verre, de plastique…(le support)


Composés analysés

Phase stationnaire=Silice

Phase mobile= Eluant

Migration

Principe : La séparation des différents composés repose sur la différence d’affinité de ces

composés l’égard des deux phase (stationnaire et mobile)


Procédés de révélation :

On peut révéler les tâches directement, sans élution, par fluorimétrie

On peut localiser les tâches par leur couleur ou leur fluorescence, sous la lampe

de Wood ;

On peut les gratter avec une spatule, obtenir une poudre, l’agiter dans un

solvant convenable et les analyser par fluorimétrie, spectrophotométrie

Dimensions des plaques : 20X20 cm ; 20X10 cm, 5X5 cm

Epaisseur de la couche adsorbante : 0,10 à 1,5 mm

Durée du développement : généralement entre 1,30 à 2 heures.

La phase mobile est choisie selon la nature de l’adsorbant et celle de

l’échantillon à séparer.


3/CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE EN PHASE LIQUIDE(Ch.Liquide-liquide)

Support :

Cylindre (colonne) en verre, en

plastique, ou en métal placé

verticalement, muni à sa base

d’un filtre adéquat et d’un

robinet

Taille de la colonne :

2 mètre de haut, 20 cm de

diamètre : industries

Quelques centimètres de haut :

microquantités Colonnes

capillaires (diamètre <0,1 mm) : E

luti

on

ve

rs l

e b

as

par

gra

vit

é


Principe général :

On dépose dans la colonne le support

(l’adsorbant = phase stationnaire) équilibré

avec un solvant adéquat ;

On dépose l’échantillon à séparer au

sommet de la colonne ;

On fait couler à travers la colonne un

solvant (l’éluant= phase mobile) avec un débit

lent et constant ;

Les Substances sont fixées sur l'adsorbant

puis entrainées (éluées) les unes après les

autres par le solvant (l’éluant) en fonction de

leur nature chimique.

Conseil! Avant de procéder a la chromatographie sur colonne, il faut faire les chromatographies

préparatoires sur couche mince afin de choisir un éluant adapté. Aussi après recupération des fractions issues de chromatographie sur colonne on doit leurs subir une CCM

pour séparer les composés


Détection des substances séparées : Séparer les molécules constitue la 1e étape de la chromatographie ;

Une fois que l’éluant (le liquide qui sort au bas de la colonne) est récupéré, on

passe à la 2e étape : la détection des substances séparées ;

Propriétés physiques utilisées pour la détection : Absorbance ; Fluorescence ; Radioactivité ; Variation de masse ; Variation de

l’indice de réfraction


4/CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE (Par Échange D’ions)

C’est une technique de séparation

des molécules basée sur leur

différence de charge

Elle s’applique uniquement au

groupe de protides = acides aminés

peptides et protéines car les autres

biomolécules ne présentent pas de

propriétés ioniques.


Echangeurs d’ions (Substances hautement polymérisées )

Ce sont des ions énormes, insolubles. Des ions plus petits, de signe

opposé, viennent se fixer sur eux et qui peuvent être échangé avec l’éluant.

On distingue 3 types d’échangeurs d’ions :

o Naturels (zéolithes),

o Résines échangeuses d’ions

o Les échangeurs d’ions doux portés par des dérivés de cellulose

(polymères glucidiques comme le séphadex, gel d’agarose..etc).


La purification des protéines, leur séparation en fonction de leurs charges :

Exemples :

Le DEAE-cellulose est faiblement basique, utilisé pour séparer les protéines

acides des neutres ;

Le CM-cellulose est faiblement acide, utilisé pour séparer les protéines

basiques des neutres ;

Exemple d’applications de la chromatographie par échange d’ions :

Qu’est ce qui se passe pendant la purification des protéines par chromatographie par échange

d’ions ?????


Lors de l'application du mélange de protéines sur la phase stationnaire

(l’échangeur d’ion dans une colonne), les protéines de charge opposée à celle de

l’échangeur d’ion sont adsorbées et remplacent les ions tampons qui permettent

d’équilibrer la charge des groupements fonctionnels.

L'adsorption de ces protéines est réversible et se produit en compétition

continue pour les sites de liaison entre les protéines de même signe chargées et les

ions tampons du solvant d’élution.(en changeant le pH du milieu)


5/CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE (Par exclusion Sur Gel)

Composants et terminologie: Séparation selon la taille et la forme

Phase stationnaire : billes substance hydratée spongiforme ;

Pores des billes : zone étroite de dimensions moléculaires

Les grosses molécules ne peuvent pas entrer dans les billes par les pores. Elles sont

exclues du volume du solvant qui se trouve à l’intérieur des billes.

Elles traversent la colonne rapidement avec un volume d’éluant plus réduit par

rapport aux molécules de petites tailles. Limite d’exclusion du gel : la masse

moléculaire des plus petites molécules incapables de pénétrer dans les pores des

billes d’un gel


La forme des molécules :

Les molécules allongées ont moins de chance de pénétrer par rapport aux

molécules de formes sphériques de même masse moléculaire.

Les molécules ayant des masses moléculaires au-dessous de la limite d’exclusion

seront éluées du gel dans l’ordre de leur masse moléculaires : les plus grandes

éluées en premier.

Estimation des masses moléculaires :

Notion de volume d’élution relatif : rapport(Ve/ V0 )

Ve : volume d’élution d’un soluté donné

V0 : Volume mort d’une colonne. Le volume d’élution d’un soluté dont la masse moléculaire est supérieure à la limite d’exclusion. On peut déterminer la masse moléculaire (MM) d’une substance inconnue sur une courbe : logMM = f(Ve/ V0 ) à partir de sa position par rapport à d’autres substances de MM connues ayant subi une chromatographie dans les mêmes conditions (même gel, même colonne…)

Les gels utilisés :

Dextran : polymère de glucose synthétisé par la bactérie Leuconostoc

mesenteroïdes, limite d’exclusion : 0,7-600 kD Agarose : polymère linéaire de D-

galactose + 3,6 –anhydro-L-galactose (algue rouge) limite d’exclusion : 0 jusqu’à 150

000 kD

Polyacrylamide : limite d’exclusion : 0,2-400 kD

Combinaison chromatographie par filtration /chromatographie échangeuse

d’ion :

On peut greffer sur les gels de dextran ou d’agarose des groupements ionisables

(DEAE, CM) : échangeurs d’ions La séparation se fera selon la charge, la taille et la

forme.



o Définitions et principe :

Elle se fait avec une résine sur

laquelle on trouve une molécule (le ligand)

qui a la propriété de se lier spécifiquement à

la molécule qu’on veut isoler.

Le ligand peut, rarement, être présent

naturellement sur la résine (lectine –

concavaline sur le séphadex)

Fréquemment, le ligand est fixé

artificiellement sur la résine (la résine n’a

aucune affinité pour la molécule d’intérêt).

6/CHROMATOGRAPHIE D’AFFINITÉ (Sur Colonne Ou En Batch)

Exemple: Le ligand peut être un anticorps ayant une affinité pour un antigène = molécule d’intérêt

substrat-enzyme; métal-métalloprotéine; sucre-lectine; hormone-recepteur


La molécule d’intérêt va être adsorbée par le ligand présent/fixé sur la

résine. Lorsqu’on met en présence un mélange contenant la molécule d’intérêt

et la résine munie du ligand, dans des conditions favorables à la liaison «

ligand – molécule d’intérêt », les autres molécules du mélange (n’ayant pas une

affinité pour le ligand) ne se fixeront pas et vont être éluées par un éluant et

seront éliminées .Les molécules d’intérêt restent fixées après cette élution.

On procède, ensuite, à la désorption de ces molécules d’intérêt en exposant le

complexe « ligand – molécule d’intérêt » à des conditions qui rendent cette

liaison moins stable :

Par modification de la composition de l’éluant (solvant de désorption);

Par ajout d’un ligand compétiteur

Les molécules se détacheront de la résine par élution dans le solvant de désorption et, après leur

récupération, elles peuvent être dosées.

o Applications :

Isolement d’enzymes :

Isolement de glycoprotéines :

Isolement de lectines :

Isolement de protéines kinases :

Isolement de protéines déshydrogénases :

Isolement d’acides nucéiques :ARNm


o Couplage du ligand sur la résine : coupling ; La résine à laquelle le ligand est couplé ne doit pas avoir d’affinité à la molécule

d’intérêt. Le couplage ne doit pas dénaturer le ligand (ce dernier doit garder son affinité) Le couplage se fait sur un gel (coupling gel)


Sur colonne : • Montage de la colonne : résine + ligand ; • Dépôt du mélange (échantillon) ; • Adsorption des molécules d’intérêt ; Elution des molécules contaminantes ; • Désorption de la molécule d’intérêt avec un solvant qui déstabilise la réaction

gel-molécule d’intérêt ; Recueil de la molécule dans le flux du solvant ; • L’analyser (la doser) ;

Méthodes sur colonne /en batch :


En batch • Réunir le gel (résine + ligand) et l’échantillon contenant la molécule d’intérêt

dans un bécher ; • Les brasser ensemble avec un agitateur magnétique durant un certain temps

jusqu’à adsorption complète de la molécule d’intérêt ;

• Récupérer, par centrifugation, les complexes : résine – ligand – molécule d’intérêt (le culot) en éliminant le surnageant (contenant les molécules non adsorbées = contaminantes) ;

• Désorber la molécule d’intérêt (par ajout d’un solvant déstabilisant, ligand compétiteur, …) sur colonne ou en batch;

R! La méthode en batch a l’avantage de pouvoir séparer des grands volumes

d’échantillon par rapport à la méthode sur colonne qui a notamment l’inconvénient de la lenteur du débit.

(Btach=Lot= àl’echelle industrielle):

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