UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DELL’AQUILA

DIPARTIMENTO DI MEDICINA CLINICA, SANITÀ PUBBLICA,

SCIENZE DELLA VITA E DELL’AMBIENTE

LABORATORIO DI MICOLOGIA E SISTEMATICA MOLECOLARE

Identificazione di specie fungine mediante PCR diretta e DNA

barcode e analisi filogenetiche di base

Docenti: Dr. Mirco Iotti

Dr. Marco Leonardi

DNA barcoding

Il codice a barre del DNA (DNA barcoding) e' una sequenza di DNA che identifica in

modo univoco ogni specie vivente, proprio come il codice a barre di un prodotto

identifica ogni oggetto in vendita in un negozio. Il progetto prevede di utilizzare il

codice a barre del DNA di funghi per esplorarne la biodiversità (Fig. 1).

Figura 1 – Processo che porta all’identificazione di una specie fungina tramite DNA barcoding.

Stato dell’arte

La Tassonomia è la scienza che individua e organizza le specie in gruppi sulla base di

caratteristiche comuni. Fino a pochi anni fa la tassonomia classica relativa alle specie

appartenenti al regno dei funghi, si basava esclusivamente sulla valutazione dei

caratteri morfologici che caratterizzano le strutture riproduttive e si avvaleva di

esperti capaci di valutare soggettivamente le poche differenze tra due specie. Inoltre

per questi microrganismi il concetto di specie non è cosi definito come nel regno

degli animali e a volte ci sono incongruenze nella definizione di alcuni gruppi

Banche Dati

ITS1F

ITS4

Amplificazione DNA

Purificazione e

sequenziamento dei frammenti

amplificati

Analisi comparativa

tassonomici fra i diversi esperti. La situazione è radicalmente cambiata con l'avvento

del codice a barre del DNA, che permette di effettuare un’identificazione oggettiva di

una specie, basandosi sulla sequenza di opportuni geni "marcatori"

indipendentemente dalla fase del ciclo biologico in cui si trova la specie fungina e,

quindi, dalla presenza delle strutture riproduttive che sono presenti solo in

determinati periodi e per tempi relativamente brevi. I geni marcatori utilizzati per la

definizione del codice a barre di animali, piante e funghi hanno sequenze molto

conservate all’interno di una specie ma sufficientemente diverse tra specie e specie in

modo che ogni sequenza identificata possa essere univocamente attribuita ad una

unica specie di origine. Dal momento che, in molti geni, si osservano variazioni di

sequenza anche all'interno di una specie, la variazione tra specie diverse (variabilità

interspecifica) deve essere maggiore della variazione all'interno della stessa specie

(variabilità intraspecifica).

Il codice a barre del DNA (DNA barcoding) rapidamente diventato uno strumento

essenziale per gli studi tassonomici, ma trova applicazioni anche in altri campi, come

nel monitoraggio ambientale, nell'analisi della biodiversità di un ecosistema etc.

Il gene barcode selezionato per i funghi

I geni identificati come marcatori e attualmente utilizzati per la definizione del DNA

barcode sono diversi in funzione del gruppo di esseri viventi considerato: il gene

COX1 per gli animali, il gene rbcL per i vegetali, il gene 16S per i batteri e le regioni

ITS per i funghi. Avere identificato questi geni ha consentito di creare un catalogo

generale della diversità, di facile accesso per chiunque voglia rapidamente

identificare un organismo. Una stretta corrispondenza tra la sequenza di basi del

campione e una sequenza già presente nel database identifica un organismo a livello

di specie (se già conosciuto e ben studiato) o a livelli tassonomici superiori (genere,

famiglia, ordine). Codici a barre del tutto nuovi, consentono di immettere nuove

specie non ancora descritte.

Le regioni ITS (spazi di trascrizione interna) si trovano nel DNA ribosomiale fra i

geni 18S (o SSU, small sub-unit) e 28S (o LSU, large sub-unit) (Fig. 2) che sono

parte integrante del complesso ribosomiale dove avviene la sintesi proteica.

Figura 2 – struttura dei ribosomi.

Il DNA ribosomale (rDNA) presenta caratteristiche che lo rendono adatto per scopi di

DNA barcoding e filogenetici, in particolare:

• i geni del rDNA sono presenti in copie multiple (alcune centinaia)

essenzialmente identiche nel genoma;

• è organizzato in unità trascrizionali ripetute in tandem;

• è formato da regioni altamente conservate (trascritte) ed altre variabili per

taglia e sequenza (spaziatori interni e spaziatori intergenici);

• il grado di variabilità delle diverse regioni può essere utilizzato per

differenziare gli organismi secondo livelli tassonomici differenti;

• le banche dati sono estremamente ricche di sequenze di rDNA di diverse

provenienze e specie, utili per le finalità di DNA barcoding;

• in letteratura è disponibile una vasta gamma di coppie di primer PCR per

amplificare frammenti di rDNA in qualsiasi posizione e di qualsiasi taglia

(https://nature.berkeley.edu/brunslab/tour/primers.html);

Le regioni ITS sono due (ITS1 e ITS2) separate dal gene 5.8S (Fig. 3).

Figura 3 – struttura del DNA ribosomale.

Ambiti di utilizzo del DNA barcode

Il DNA barcoding costituisce un valido strumento per l’identificazione del livello di

biodiversità fungina e sua conservazione, nella diagnosi di patogeni fungini di

animali e piante, nel monitoraggio di specie invasive (quelle in grado di colonizzare

nuovi ambienti a scapito delle specie native), per individuare frodi alimentari in

prodotti freschi e conservati a base di funghi altrimenti non identificabili e in molti

altri campi della micologia.

Nonostante tutti i dati che confermano l'utilità del DNA barcode per l’identificazione

delle specie fungine, tale approccio molecolare non è ancora stato introdotto e

approvato per eseguire i test alimentari.

La PCR diretta

La PCR (reazione a catena della polimerasi) è una tecnica di biologia molecolare che

permette di amplificare (riprodurre) uno specifico frammento di DNA in centinaia di

milioni di copie. Solitamente tale tecnica viene preceduta dall’estrazione degli acidi

nucleici dai tessuti viventi tramite protocolli più o meno complessi in funzione della

matrice biologica oggetto d’indagine, della quantità e della purezza del materiale

genetico desiderati. La PCR diretta, al contrario, si basa sull’amplificazione del DNA

bersaglio direttamente da un microscopico frammento della matrice biologica oggetto

d’indagine che viene introdotto direttamente nei tubi di reazione. Questa tecnica

permette un risparmio di tempo e di risorse evitando il procedimento di estrazione del

DNA, oltre a ridurre l’impiego di sostanze tossiche per gli operatori durante il

processo di estrazione e ridurre il rischio di amplificare frammenti di DNA di specie

non bersaglio. Inoltre, la PCR diretta necessita di quantità minime di materiale

oggetto d’indagine, condizione spesso limitante per chi opera con microrganismi in

condizioni naturali. Il principale ostacolo all’amplificazione diretta del DNA

bersaglio da una matrice biologica è la presenza di sostanze cellulari (es. polifenoli)

che inibiscono l’attività enzimatica di polimerizzazione. Comunque, nel caso di

materiale fungino l’efficienza di amplificazione è generalmente paragonabile a quella

del DNA preventivamente estratto. A differenza di un’amplificazione PCR con DNA

estratto è necessario inserire nella miscela di reazione quantità elevate di albumina di

siero bovino (fino a 80 μg in reazioni da 50 μl a seconda del tipo di materiale

impiegato) allo scopo di bloccare l’azione inibente nei confronti della DNA

polimerasi. La PCR diretta è particolarmente indicata per il DNA barcode dei funghi

in cui non serve disporre di una riserva di DNA estratto, e la si può applicare in

diverse fasi del ciclo biologico di una specie (strutture riproduttive, simbiontiche o

vegetative).

Reagenti

Primers (forward and reverse, 10 μM

Taq DNA Polymerase enzima 5U/μl

Taq buffer 10x

dNTPs (10 mM)

Bovine Serum Albumine (25 mg/ml)

Agarosio

Buffer TAE

EuroSafe DNA Stain

Loading dye 6x

H2O distillata

ESTRAZIONE

DEL DNA

Amplificazione

delle regioni ITS

1-2x10-3

mm3

1-2x10-2

mm2

10-20 ife 1-2 mm

di lunghezza

• 100 mg di gleba

• 1-10 apici

micorrizzati

• 100 mg di

micelio da

coltura liquida

(purificazione o

aggiunta di

BSA alla

reazione

successiva)

Reagenti: • acqua ultrapura • buffer PCR • MgCl

2

• dNTP • Primer • DNA polimerasi

Norme di lavoro

•per chi ha i capelli lunghi: legarsi i capelli con un elastico

•prima di cominciare a lavorare, lavarsi le mani

•pulire il banco di lavoro con alcol etilico denaturato

•prima di cominciare l’esperimento, lo studente verrà familiarizzato con la

strumentazione che dovrà utilizzare, in modo particolare con le micropipette e con i

dispositivi di protezione individuale necessari per svolgere in sicurezza tutto il

programma di lavoro.

Reagenti e parametri delle reazione di PCR diretta

Mix PCR per 1 campione fungino Buffer 10x 5 μl

Primer ITS1F (for -10 μM) 2 μl

Primer ITS4 (rev -10 μM) 2 μl

dNTPs (10 mM) 1 μl

H2O 17,2 μl

DNA /

BSA (25 mg/ml) 1,5 μl

Taq polimerasi 5U/μl 0,3 μl

Totale 50 μl

Primer forward ITS1F: 5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’

Primer reverse ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

Parametri termici Den. iniziale 95 °C 10’

30 cicli

Denaturazione 95 °C

Appaiamento

primer

55 °C

Estensione 72 °C

Est. finale 72 °C 10’

Raffreddamento 4 °C

Analisi dei prodotti di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio

Preparazione del gel di agarosio

La concentrazione di agarosio del gel viene scelta dal ricercatore in base alle

dimensioni dei frammenti di DNA da separare e dalla qualità di visualizzazione delle

bande desiderata. Nel nostro caso, dovendo separare frammenti lineari di DNA

compresi tra 500 e 800 bp (base pairs, coppie di basi), si utilizza un gel di agarosio al

1.5%.

preparare la vaschetta per elettroforesi e verificare che il piano su cui si

appoggia la vaschetta per elettroforesi sia orizzontale

misurare 70 ml di tampone TAE 1x in un cilindro e versarli nella beuta di vetro

pirex che contiene già 1 g di agarosio; tapparla con pellicola all’estremità a cui

praticare dei fori di sfiato

sciogliere l’agarosio nel forno a microonde, agitando delicatamente di tanto in

tanto la soluzione

quando la soluzione si è un pò raffreddata (riuscite a tenerla in mano)

aggiungere 2,5 μl di Eurosafe

versare la soluzione di agarosio, evitando di formare bolle, nella vaschetta per

elettroforesi dove e gia stato inserito il pettine.

lasciare solidificare a temperatura ambiente per circa 15 min. Dopo che il gel si

è solidificato (diventa opaco), togliere il pettine delicatamente e mettere la

vaschetta nella cella elettroforetica contenente 250 ml di TAE 1x

Corsa elettroforetica

aggiungere 2 μl di loading dye (6x) ad un’aliquota di 10 μl di ciascun

campione di DNA

mescolare il colorante delicatamente tramite pipette

caricare lentamente ciascun campione nei singoli pozzetti

in un pozzetto laterale, caricare il marker di DNA a peso molecolare noto

chiudere il coperchio della cella elettroforetica

collegare i morsetti al generatore di corrente, fissare il voltaggio al valore

costante di 80 V e lasciare procedere la corsa elettroforetica per circa 30 min

osservare la migrazione del loading dye per valutare la migrazione del DNA,

che, essendo incolore, non si puo vedere. Il blu di bromofenolo migra alla

stessa velocita di un frammento di DNA a doppia elica di circa 300 bp, mentre

lo xilene cianolo migra alla stessa velocita di un frammento di circa 4.000 bp

alla fine della corsa elettroforetica, osservare il gel sul transilluminatore

Interpretazione dei risultati della corsa elettroforetica

Figura 4 - gel d’agarosio

Marcatore di peso molecolare (ogni banda nelle corsie laterali

differisce per una taglia di 100 bp)

Nelle corsie 1,2,3,4,7 si possono notare frammenti delle

regioni ITS amplificate con la coppia di primer ITS1F e ITS4

di diverse specie fungine, nella corsia 5 l’amplificazione è

fallita mentre nella corsia 6 è possibile notare una debole

amplificazione di un aspecifico

Purificazione dei frammenti amplificati

Le reazioni PCR che avranno fornito un risultato soddisfacente (presenza di un

amplificato ed assenza di frammenti aspecifici) saranno sottoposti a purificazione con

l’impiego del kit “DNA Cleand & Concentrator” (Aurogene), seguendo il protocollo

della ditta produttrice.

La purificazione si rende necessaria per eliminare tutte le molecole diverse dal

frammento amplificato (enzima, Sali minerali, dNTP non incorporati, ecc.) che

causerebbero il fallimento della reazione di sequenziamento.

I prodotti purificati saranno oggetto di quantificazione al nanodrop, per verificare la

concentrazione del DNA amplificato e la sua purezza.

Attività di Bioinformatica

Analisi delle sequenze di DNA fungine

Agli studenti saranno distribuiti alcuni elettroferogrammi (Fig. 5) di regioni ITS di

specie fungine precedentemente sequenziate, per imparare ad analizzare i dati ottenuti

dal sequenziamento del DNA.

Figura 5 – porzione di elettroferogramma di una sequenza ITS fungina

Le sequenze che saranno analizzate dagli studenti porteranno all’identificazione di

ciascuna specie fungina. Tale identificazione sarà effettuata tramite approccio

comparativo con le sequenze depositate presso GenBank

(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) utilizzando il software Blastn (Fig 6) che compara

una sequenza nucleotidica (query) con tutte le altre sequenze nucleotidiche depositate

nella stessa banca dati

Figura 6 – Pagina di caricamento della sequenza nucleotidica per confronto con il programma blastn

Analisi filogenetica

La filogenesi è la scienza che studia l’evoluzione e le relazioni evolutive degli

organismi attraverso l’analisi e il confronto di sequenze proteiche o nucleotidiche.

Dalle analisi filogenetiche si costruiscono alberi in cui si evidenziano le “affinità”

genetiche delle specie identificate.

Con le sequenze a disposizione ed altre scaricate da GenBank saranno costruiti alberi

utilizzando diversi approcci bioinformatici e spiegati nel modo più semplice possibile

i criteri che li supportano.