Université d'Oran 1 Ahmed Ben Bella - FACULTE DES SCIENCES … · 2015-05-05 · D’autres personnes: Nadia, Fatiha, Fatima, Maysaloune, Ahmed, Abdelkader, Imane, Samir, Mohammed,

KHELOUFI A., 2006 : Induction de la callogenèse chez quelques variétés de pois chiche (Cicer arietinum L.).

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIREMINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR

ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUEUNIVERSITE D’ORAN –ES SENIA-

FACULTE DES SCIENCESDEPARTEMENT DE BIOLOGIE

LABORATOIRE DE PHYSIOLOGIE VEGETALE

MEMOIRE

Présenté par

Mr KHELOUFI Abdenour

Pour obtenir

LE DIPLÔME DE MAGISTERSpécialité : Physiologie végétaleOption : Ecophysiologie végétale

Intitulé :

Induction de la callogenèse chez quelques variétés

de pois chiche (Cicer arietinum L.)

Soutenue le :

Devant le jury composé de :

Mr AOUES A. Président Professeur Université d’OranMr BELKHODJA M. Examinateur Professeur Université d’OranMme BENNACEUR M. Examinatrice Maître de conférences Université d’OranMelle BOUABDALLAH L. Rapporteur Maître de conférences Université d’Oran

Année universitaire 2006/2007


Je dédie ce travail à :

Ma tendre mère ( ).

Mon cher père.

Mes deux chers frères,

Toute la famille Kheloufi et Guesbaoui.

Ma Femme.

Abdenour


Remerciements

Je tiens à exprimer mes remerciements à :

Madame Bouabdallah L., directrice de ce mémoire pour son accueil au sein de son laboratoire

et pour sa généreuse aide scientifique et matériel pour l’élaboration de ce travail. Je la remercie

également de m’avoir permis de profiter de ses connaissances et de ses compétences.

Monsieur le Professeur Belkhodja M., d’avoir accepté d’examiner ce travail. Je tiens à le

remercier vivement pour sa confiance, sa générosité et pour m’avoir accueilli au sein de son

laboratoire en me donnant le goût de la recherche sans cesser de m’encourager. Je lui renouvelle

mes sincères remerciements pour son aide précieuse dans le suivi de mon dossier administratif,

pour sa sympathie et sa disponibilité.

Madame le Docteur Bennaceur M., d’avoir l’amabilité d’accepter d’examiner ce mémoire

ainsi que pour l’intérêt accordé à mon travail par ses encouragements.

Monsieur le Professeur Aoues A., qui a bien voulu honorer ce jury en le présidant.

Madame Khouaidjia M., pour ses précieux conseils scientifiques ainsi que pour ses

encouragements permanents.

Madame Ighilhariz Z., pour ses précieux conseils scientifiques ainsi que pour ses

encouragements permanents.

Madame le Professeur El Kébir F., d’avoir la gentillesse et la générosité de nous avoir permis

d’utiliser la hotte à flux laminaire.

D’autres personnes : Nadia, Fatiha, Fatima, Maysaloune, Ahmed, Abdelkader, Imane,

Samir, Mohammed, Farid et Asmaa.

Tous ceux qui de près ou de loin m’ont aidé et m’ont soutenu pour la réalisation de ce travail.


SUMMARY

Chick pea (Cicer arietinum L.) is an important energetic food which gives proteins to

man. This leguminous plant participates to the soil fertility by enriching it with azote.

Being given its importance, it is interesting to apply the tools of biotechnologies to

improve it qualitatively and quantitatively and to select resistant varieties to certain diseases and

some abiotic factors (dryness, salinity...).

The aim of our research is callus induction and studying the influence of biotic (variety

and organs) and abiotic factors (hormones medium) which control callus production.

Explants (leaflets and internodes) coming from testing varieties are disinfected and

cultivated on MS media supplemented with various hormones (2,4D, AIA, Kin and BAP).

These explants are exposed to a temperature between 22°C and 25°C and a photoperiod of 16

hours.

The results show that:

- Callus production has been induced in chickpea (Cicer arietinum L.).

- Callus production is influenced by biotic (variety and organs) and abiotic factors (hormones

medium):

A high percentage of callus is obtained with stems with a high concentration of 2,4D and

a low concentration of kinetin. The internodes gave 95% of callus with Flip97/567 at 1,5mg/l of

2,4D and 0,5mg/l of kinetin and concerning the variety ILC199 with other concentrations

1,5mg/l of 2,4D and 0,25mg/l of kinetin.

- The three sorts of callus (cream and friable, green and compact, brown and friable) could be

produced according to the variety and hormonal combination.

Key words:

Cicer arietinum L., callus, hormones, in vitro culture, culture medium.


RESUME

Le pois chiche (Cicer arietinum L.) est cultivé pour son importance alimentaire en

fournissant un aliment protéique et énergétique pour l’homme. Cette plante est une légumineuse

qui participe à la fertilité des sols en les enrichissant d’azote fixé par les bactéries des nodosités

de leurs racines.

Etant donné son importance, il est intéressant de lui appliquer les outils de la

biotechnologie pour l’améliorer qualitativement et quantitativement et pour sélectionner des

variétés résistantes à certaines maladies et certains facteurs écologiques (sécheresse, salinité…).

Le but de notre recherche est l’induction des cals (callogenèse) chez Cicer arietinum L.

et l’étude de l’influence des facteurs biotiques (variété et organe) et abiotiques (hormones) qui

contrôlent ce phénomène physiologique de callogenèse.

Les explants (folioles et entre n uds) provenant des variétés à tester sont désinfectés et

mis en culture sur milieu MS contenant différents types d’hormones (2,4D, AIA, Kin et BAP).

Ces explants sont exposés à une température entre 22°C et 25°C et une photopériode de 16

heures.

Les résultats obtenus montrent que :

- La callogenèse a pu être initiée chez le pois chiche (Cicer arietinum L.).

- L’expression de ce phénomène physiologique de callogenèse est sous le contrôle de facteurs

liés à la variété, à la nature de l’organe et aux hormones :

Un fort pourcentage de cals est obtenu avec les tiges en présence d’une forte

concentration de 2,4D et d’une plus faible concentration de kinétine. Les entre n uds ont donné

95% de cals chez la variété Flip97/657 en présence de 1,5mg/l de 2,4D et de 0,5mg/l de kinétine

et chez la variété ILC199 avec d’autres concentrations 1,5mg/l de 2,4D et 0,25mg/l de kinétine.

- Les trois types de cals (beiges et friables, verts et compacts, bruns et friables) ont pu être

produits selon la variété et la combinaison hormonale.

Mots clés:

Cicer arietinum L., callogenèse, hormones, culture in vitro, milieu de culture.


(Cicer arietinum L. ).

.

.

(Cicer arietinum L.)) () (

.

MS AIA , Kin, 2,4D) (BAP .2225

16.

:

-(Cicer arietinum L.).-

.

(95%)Flip97/6572,4D1.5/ kinétine0.5/

ILC199,51/2,4D0,25/kinétine.

-)( .

Cicer arietinum L


SOMMAIRE

I. Introduction………………………………………………………………………………...1

I.1. La culture des tissus in vitro des plantes…………………………………………………..1

I.1.1. Définition………………………………………………………………......…….1

I.1.2. Fondements………………………………………………………………………1

I.1.3. Méthodes…………………………………………………………………………1

I.1.4. Avantages et inconvénients des techniques de culture de tissus in vitro ………..1

I.2. But de travail……………………………………………………...……………………….3

I.3. Pois chiche (Cicer arietinum L.)…………………………………………………………..3

I.3.1. Historique………………………………………………………………………..3

I.3.2. Systématique et description……………………………………………………...4

I.3.3. Cycle physiologique et conditions de culture…………………………………….6

I.3.4. L’azote et le pois chiche………………………………………………………….7

I.3.5. Importance nutritive du pois chiche……………………………………………...7

I.3.6. Production………………………………………………………………………...8

I.3.7. Zones de culture et de production de pois chiche en Algérie………………….....8

II. Matériel et méthodes……………………………………………………………………...9

II.1. Matériel………………………………………………………………………………...…9

II.1.1 Matériel végétal…………………………………………………………………..9

II.1.2. Milieu de culture………………………………………………………………...9

II.2. Méthodes……………………………………………………………………………….. 10

II.2.1. Obtention des plantules………………………………………………………...10

II.2.2. Induction de la callogenèse…………………………………………………….10

III. Résultats-discussion………………………………………………………………….....11

III.1. Résultats……………………………………………………………………………….. 11

III.1.1. Influence de la nature de l’explant et de la variété sur la callogenèse chez Cicer arietinum L…………………………………………11

III.1.2. Influence de la nature et de la concentration d’hormones sur la callogenèse chez Cicer arietinum L………………………………………..14

III.1.3. Influence des concentrations d’hormones sur la callogenèse issue de tiges chez Cicer arietinum L……………………………………………….15

III.1.4. Influence du type d’organe sur la callogenèse chez Cicer arietinum L………15

III.1.5. Influence de la variété sur la callogenèse issue de tiges chez Cicer arietinum.16

III. 2. Discussion……………………………………………………………………………...16

IV. Conclusion……………………………………………………………………………….19


Références bibliographiques………………………………………………………………..20

Annexe………………………………………………………………………………………..23


INTRODUCTION


I. INTRODUCTION

I. 1. La culture des tissus in vitro des plantes

I. 1. 1. Définition

La culture de tissus végétaux in vitro correspond à la mise en culture d'explants (racines,

tiges, feuilles, pétiole…), d’embryons, des ovules, des anthères ou de tissus (apex ou

méristèmes) de plantes sur un milieu synthétique et à les exposer à des conditions contrôlées de

température et de photopériode. Les buts visés sont multiples (micropropagation, embryogenèse

somatique et production de cellules isolées et de protoplastes).

I. 1. 2. Fondements

Les fondements de la culture de tissus in vitro reposent sur le principe suivant : Toute

cellule a l’information génétique de reproduire un individu identique à la plante mère; ceci

correspond à la totipotence cellulaire. Elle correspond du point de vue morphogène à une

dédifférenciation (état juvénile), c'est-à-dire à un retour à des structures cellulaires

méristèmatiques ou embryonnaires capables d’évoluer pour donner une plante entière. De

nombreux travaux ont mis en évidence cette propriété de totipotence chez les cellules végétales

par l’obtention d’embryons à partir de cellules somatiques.

I. 1. 3. Méthodes

Les principales méthodes se répartissent en deux groupes :

Les méthodes qui permettent de maintenir l’homogénéité génétique des plantes, c’est le cas de

la micropropagation (culture de méristèmes, apex …).

Les méthodes qui entraînent des modifications du matériel génétique créant ainsi une

certaine variabilité qui se traduit par l’apparition de caractères nouveaux. C’est le cas d’un

passage par cal, de la fusion des protoplastes et de la transgenèse.

I. 1. 4. Avantages et inconvénients des techniques de culture de tissus in vitro

Les techniques de culture de tissus in vitro offrent de nombreux avantages qui peuvent

se résumer ainsi :

- Possibilité d’obtenir un nombre considérable de plantules à partir d’un fragment de tissu de

quelques millimètres, dans un espace plus réduit, pendant une durée plus courte et donc à un

coût plus faible :

• Un m² de culture peut produire plus de 10.000 plantules par an.

• Un bourgeon de rosier par exemple peut produire entre 200.000 et 400.000 descendants

en une année par contre comparer aux méthodes classiques comme le greffage, il ne peut

donner qu’une quarantaine de pieds (Kumar et al., 2005).


• Il faut compter 2 à 3 ans pour voir fleurir une plante issue de culture in vitro, alors que 7

à 10 ans pour les plantes de semis.

• Le bananier, plante tropicale la plus multipliée in vitro avec plus de 75 millions de plants

par an dans le monde (Mateille et Foncelle, 1989).

- Sélection de plantes résistantes aux différents facteurs abiotiques et biotiques :

• Des lignées cellulaires tolérantes à la salinité ont été sélectionnées chez le colza (Jain et

al., 1990) et le citrus (Kochba et al., 1982).

• Des plants tolérants aux herbicides chez le colza (Michaud et al., 2005).

- Propagation végétative (clonage in vitro) des espèces multipliées par graines sous forme de

semences hybrides (tomate, poivron, maïs, aubergine…) sauf que les prix de vente sont élevés

et en plus elles sont sujettes à une perte de la vigueur hybride (Frédéric, 2002).

- Multiplication possible d’espèces dont les semences sont rares et pour lesquelles, les

techniques de bouturage ou de greffage par les méthodes classiques sont difficiles.

- La qualité des plantes reproduites in vitro est généralement supérieure à celle des plantes

obtenues par les techniques traditionnelles.

- Sélection phytosanitaire qui permet de produire des plantes indemnes de viroses par la culture

d’apex (El Hamouni, 1999).

- Production de semences artificielles à partir d’embryons somatiques. L'équipe de Vincent

Pétiard (1985) avait obtenu en fermenteur une production de 70.000 embryons somatiques de

carotte par jour et par litre de milieu de culture.

- Possibilité de produire des plantes en dehors de leur saison et en toute saison en conditions

artificielles permettant la disponibilité de la culture toute l’année.

- Amélioration de la qualité des productions végétales par la fusion de protoplastes et la

transgenèse qui permettent l’introduction d’un caractère nouveau chez les plantes.

La culture in vitro peut manifester certaines contraintes telles que :

- L’obtention de plantes non-conformes.

- Les limites pour l’application de ces techniques à toutes les plantes car les connaissances sur

les mécanismes physiologiques et biochimiques du déclenchement de la callogenèse ou de

l’embryogenèse sont encore mal définies.

- La diminution de la diversité génétique des variétés peut limiter les caractères recherchés

(résistance, qualité, production).


I. 2. But de travail

Le pois chiche est une plante qui peut fournir un aliment riche en protéines (10 à 15%)

mais il est déficient en méthionine (acide aminé essentiel). Il est à signaler malheureusement

que cette culture rencontre de nombreux problèmes affectant la qualité des grains et les

rendements. Parmi ces problèmes, on peut citer :

- Insuffisance de précipitations ce qui entraîne une faible disponibilité en eau (sécheresse).

- Salinité des sols liée à cette sécheresse.

- Problèmes phytosanitaires (maladies).

L’utilisation des outils de la biotechnologie telle que la culture de tissus in vitro

permettent :

- La sélection de plantes résistantes ou tolérantes à certains facteurs de l’environnement :

sécheresse, salinité et aux attaques parasitaires.

- L’amélioration qualitative et quantitative des grains (teneur en protéines et nature des acides

aminés).

Le but de notre travail est l’induction de la callogenèse chez le pois chiche (Cicer

arietinum L.), ensuite l’étude des différents facteurs qui la contrôlent pour déterminer les

conditions optimales pour l’expression d’une callogenèse maximale et reproductible.

Les différents facteurs étudiés sont ceux qui influencent les phénomènes physiologiques,

Ils se rapportent au génotype, à la nature de l’explant (tiges, folioles…) et aux hormones (nature

et concentration).

I. 3. Pois chiche (Cicer arietinum L.)

I. 3. 1. Historique

Le terme «pois chiche», qui est apparu dans la langue française en 1244 est une

altération du latin cicer ou de l'italien cece, ce terme veut dire ‘corne de bélier’. Contrairement à

ce que l'on pourrait croire, l'étymologie de ce mot n'a rien à voir avec celle de son homonyme

«chiche» qui est emprunté au grec kikkon, et qui veut dire «un rien» (Dauzat et al., 1971).

Cette plante est connue depuis l’antiquité (VIIe millénaire avant J.C.). Des restes

carbonisés découverts au Proche-Orient indiquent que le pois chiche était cultivé au

VIIe millénaire avant notre ère avec les céréales, le pois et la lentille. On a longtemps cru que le

pois chiche venait du sud-ouest asiatique, mais la découverte relativement récente d'un de ses

ancêtres sauvages (Cicer reticulatum) en Turquie a permis de déterminer qu'il était originaire du

Proche-Orient et qu’il y était consommé il y a des milliers d’années.


Il existe deux types de pois chiche :

Le pois chiche kabuli (aussi appelé garbanzo), grain plus gros, de couleur crème et il est

recouvert d’un tégument mince. La production de pois chiche de type kabuli se subdivise en

deux groupes:

- Le gros kabuli ayant un diamètre de 8-9 mm et un poids aux 1.000 graines de 410-

490 g.

- Le petit kabuli, dont les graines sont plus uniformes avec un diamètre de 7 mm environ

et un poids de 1.000 graines d’environ 265 g.

Le pois chiche desi, à grains noirs ou bruns plus petits et sont au moins trois ou quatre fois plus

petits que les grains de type kabuli. Il est recouvert d’un tégument épais.

Les rendements des pois chiches de type desi et petit kabuli sont près de 20 % supérieurs

à ceux du gros kabuli qui représente 25% de la production mondiale.

Les variétés de l’Inde, du reste de l'Asie, de certaines parties de l'Afrique et de

l’Australie sont de type desi qui représente 75% de la production mondiale de pois chiche. Les

variétés cultivées en Europe et en Amérique sont du type kabuli, alors que le Canada produit à

la fois du desi et du kabuli.

I. 3. 2. Systématique et description

a. Sytématique

Le pois chiche appartient à :

Embranchement : Spermaphytes

S/ embranchement : Angiospermes

Classe : Dicotylédones

Série : Dialypétales

Ordre : Rosales

Famille : Légumineuses

S/famille : Papilionacées

Genre : Cicer

Nom binomial : Cicer arietinum L.

b. Description

Racines : Un système racinaire pivotant de 60 cm de longueur mais il peut atteindre 2m de

profondeur (planche I, fig.2)

Tige : Elle est anguleuse et peut atteindre une hauteur de 20 à 100 cm (planche I, fig.1).

Feuilles : Elles sont composées de 7 à 10 folioles ovales et dentées (planche I, fig.3).


Planche I. Description générale de pois chiche (Cicer arietinum L.)

Fig.1. Port général de Cicer arietinum L. Fig.2. Système racinaire de Cicer arietinum L. portant des nodules.

Fig.3. Feuille et foliole de Cicer arietinum L. Fig.4. Fleur de Cicer arietinum L.

Fig.5. Gousses et graines de pois chiche (Cicer arietinum L.).


Fleurs : Elles sont blanches (planche I, fig.4), bleues ou violettes, axillaires, solitaires et avec un

pédoncule.

Gousses : Elles sont rhomboïdes ou ovales, renflées et contiennent 1 à 2 grains ronds selon les

variétés (planche I, fig.5).

I. 3. 3. Cycle physiologique et conditions de culture

a. Cycle physiologique

Le cycle physiologique du pois chiche comprend cinq phases :

Germination et levée

C’est le passage de la graine de la vie ralentie à la vie active affectant ainsi la sortie des racines

séminales et le coléoptile qui pousse vers la surface.

Croissance et ramification

Les pieds commencent à se ramifier et les bourgeons qui vont en même temps que la tige

principale se développent et donnent naissance à des pédoncules floraux.

Floraison

Cette phase est marquée par l’apparition et le développement des ébauches florales suivi par un

effectif élevé en fleurs et un rendement en gousse appréciable.

Fécondation

Quand les étamines arrivent à maturité et deviennent déhiscents, le pollen est libéré pour la

pollinisation des fleurs.

Maturation

Cette phase se caractérise par un jaunissement des gousses accompagné d’une chute des folioles

et d’un durcissement des graines.

b. Conditions de culture

La durée de la maturation de la culture de pois chiche dépend de la chaleur et de

l’humidité disponible. Elle est de 95 à 115 jours. Elle varie entre 95 et 105 jours pour le pois

chiche desi et entre 110 et 115 jours pour le pois chiche kabuli (Labdi, 1991).

Le pois chiche se développe à des températures variant entre 21 et 29°C le jour et proche

de 20°C la nuit (Ayadi, 1986). Les fortes températures entraînent une diminution du potentiel de

production du pois chiche (Saxena et al., 1987).

Dans le bassin méditerranéen, cette espèce est traditionnellement semée au printemps

(mars-avril), quand les réserves en eau du sol sont à leur maximum (Keating et Cooper, 1983).

Le pois chiche est adapté de façon optimale aux zones de sols bruns et bruns foncés.

Cette espèce résiste bien à la sécheresse en raison de son système racinaire pivotant mais par


contre, le pois chiche n’est pas bien adapté aux zones de grande humidité, aux sols salins et aux

sols gorgés d’eau. Il tolère des pH allant de 6 à 9 (Bihya et Bamouh, 1997).

I. 3. 4. L’azote et le pois chiche

Le pois chiche est une plante qui appartient à la famille des légumineuses connues

principalement pour leur capacité à fixer l’azote atmosphérique grâce à leur nodosité et leur

association avec les bactéries du sol. Elle a donc un intérêt agricole et écologique. En effet, cette

capacité à utiliser de l’azote lui permet de réduire les coûts de sa production, d’une part, et de

limiter la pollution des nappes phréatiques par les nitrates des engrais, d’autre part.

Cette culture a des effets fertilisants dans les rotations culturales car la fixation

symbiotique de l’azote atmosphérique peut servir aux cultures suivantes et améliorer la structure

du sol.

I. 3. 5. Importance nutritive du pois chiche

Tableau 1: Composition biochimique du pois chiche (valeur pour 100 gr de pois frais)(Desaulniers et Dubost, 2003)

Elément Quantité

Eau 60 g

Lipides 2.6 g

Fibres 8.6 g

Protéines 8.9 g

Glucides 27.4 g

Magnésium 53 mg

Phosphore 132 mg

Potassium 335 mg

Calcium 56 mg

Vitamine B1 0.1 mg

Vitamine E 1.2 mg

Le pois chiche, comme toutes les légumineuses, est un aliment naturellement riche en

glucides, en protéines végétales (9 à15%), en plusieurs vitamines (groupe B, E …), en sels

minéraux (potassium, calcium …) et en fibres alimentaires. De plus, il est faible en matières

grasses (2 ,6 %) (tableau 1).


I. 3. 6. Production

D’après les statistiques de la FAO 2006, au cours des 10 dernières années, la production

mondiale a connu des hauts et des bas, allant de 6,76 Mt (millions de tonnes) en 2000-2001 à

9,56 Mt en 1998-1999, sans qu’il n’y ait de tendance à la baisse ou à la hausse. Durant cette

période, l’Inde représentait de 60 % à 70 % de la production mondiale.

Les deux types de pois chiches produits à l’échelle commerciale sont le desi et le kabuli :

- Les pays du sous-continent indien, ainsi que l’Australie, produisent surtout du pois

chiche desi.

- Le Canada produit à la fois du desi et du kabuli.

- Les autres pays produisent surtout du kabuli.

La production mondiale est constituée à 75 % de desi et à 25 % de kabuli. La production

de kabuli est plus dispersée, donc moins variable que celle du pois desi.

Au cours des dix dernières années, l’Inde a été le plus grand importateur de pois chiches,

mais ses importations ont fluctué beaucoup en fonction des cours et du volume de la production

intérieure.

L’Inde et les pays voisins importent surtout du pois desi, tandis que les pays d’Amérique

du Nord et du Sud, d’Europe, du Moyen-Orient et de l’Afrique du Nord importent surtout du

kabuli (FAO, 2006).

I. 3. 7. Zones de culture et de production de pois chiche en Algérie

L'Algérie est un pays considéré gros consommateur de pois chiche, soit 2,2 kg par

personne et par an (Kali, 2006).

En Algérie, les légumineuses étaient cultivées depuis bien longtemps surtout dans les

régions du Nord où les conditions agro-climatiques étaient favorables. Malgré l’extension

sensible de la culture des légumes secs au cours des années 80 (de 100.000 ha à 150.000 ha), les

superficies emblavées représentaient 2.3 % de la superficie utilisée (Labdi, 1991).

La culture du pois chiche est située dans les zones littorales avec 46.3% de surfaces

cultivées et dans les plaines intérieures avec 41.6% de la superficie totale cultivée en Algérie

(Maatougui et al., 1994). Selon ces mêmes auteurs, au cours de la période de 1993, deux

grandes régions en Algérie sont les plus occupées en cette culture: la région 1 couvre les zones

de Skikda, Guelma et Mila à l’Est ; la région 2 s’étend dans l’Ouest avec Tlemcen, Relizane,

Mascara, Aïn Temouchent, Sidi Bel Abbes, Chlef et Mostaganem.

Selon des sources nouvelles de l’INRA ‘Alger’ en 2006, les besoins annuels sont de

l'ordre de 70.000 t (tonnes), ce qui entraîne 50.000 t en importation.


MATERIELET

METHODES


II. Matériel et méthodes

II. 1. Matériel

II. 1.1 Matériel végétal

Les différentes variétés de pois chiche (Cicer arietinum L.) utilisées pour cette étude ont

été fournies par l’INRA (Institut National de la Recherche Agronomique) de Sidi Bel Abbès.

Elles sont indiquées dans le tableau 2.

Tableau 2: Les différentes variétés de pois chiche testées.

Variétés Réaction à l’anthracnose

ILC1929ILC263Twist

Aïn témouchentILC4107ILC3996ILC3279ILC199

Flip 87/5Flip 97/657

SensibleSensibleSensibleSensible

RésistanteRésistanteToléranteToléranteRésistanteSensible

II. 1. 2. Milieu de culture

Le milieu de culture de l’induction de la callogenèse est celui de MS (Murashige et

Skoog (annexe). Il est additionné par des régulateurs de croissance (hormones végétales) dont la

nature et les concentrations sont précisées dans les tableaux 3 et 4.

Tableau 3: Nature des hormones végétales testées.

Régulateurs Solvant

1. AuxinesAcide indol-3-acétique (AIA)

Acide 2,4 dichlorophénoxyacétique (2.4-D)1N NaOH

2. CytokininesKinétine (Kin)

6-benzylaminopurine (BAP)1N NaOH


Tableau 4: Combinaisons et concentrations hormonales ajoutées au milieu MS et testées pour l’induction de la callogenèse du pois chiche (Cicer arietinum L.).

Milieu I Milieu H Milieu K

AIA(mg/l)

Kin(mg/l)

AIA(mg/l)

BAP(mg/l)

2,4D(mg/l)

Kin(mg/l)

I1 1 1 H1 1 0.5 K1 1,5 0.25

I2 0.5 0.5 H2 1 1 K2 1.5 0,5

I3 0 1 H3 1 1.5 K3 1 0.5

I4 1 0 H4 1 2 K4 2 0.5

I5 0.5 0.25 H5 1 2.5 K5 1 1

AIA: acide indol-3-acétique. Kin: kinétine. BAP : 6-benzylaminopurine. 2,4D : acide 2,4-dichlorophénoxyacétique.

II. 2. Méthodes

II. 2. 1. Obtention des plantules

Les graines des différentes variétés de pois chiche sont désinfectées avec de

l’hypochlorite de sodium à 2% pendant 5 minutes. Elles sont mises en culture dans des pots

contenant de la tourbe stérilisée. Les pots sont installés dans une serre.

II. 2. 2. Induction de la callogenèse

Les cals sont initiés à partir de tiges (fragment d’entre-n uds de 0.5cm de longueur) et

de folioles. Les deux types d’explants proviennent de mêmes plantes de pois chiche (Cicer

arietinum L.) âgées de 30 jours.

Les deux types d’explants sont préalablement désinfectés ainsi :

- Trempage des explants dans l’éthanol à 70% pendant 5 minutes.

- Transfert des explants dans une solution d’hypochlorite de sodium à 5% durant 3 minutes.

- 5 rinçages successifs à l’eau distillée stérile, séchage des fragments avec du papier filtre stérile

et ensuite leur mise en culture.

Nous avons pris 30 explants par organe (fragments d’entre n uds ou folioles), répartis à

raison de 10 fragments par boite de Pétri. Les boites sont exposées à une température entre 22

°C et 25 °C et une photopériode de 16 heures.


RESULTATSET

DISCUSSION


III. Résultats-discussion

III. I. Résultats

Après quelques jours de mise en culture, la callogenèse s’est manifestée par un

gonflement de l’explant suivi d’une prolifération importante et anarchique de ses cellules

recouvrant complètement l’explant qui devient méconnaissable : On obtient ainsi un amas de

cellules appelé cal (planche II, fig.3 et Planche III, fig.3). Ce cal correspond à la reprise de la

division cellulaire (mitose) et à l’amorce de la dédifférenciation qui aboutit à la production de ce

cal. C’est un tissu homogène et inorganisé. Cette callogenèse semble être influencée par un

certain nombre de facteurs liés à la plante et aux hormones utilisées.

Dans notre cas, les deux types d’explants (tiges et folioles) ont réagi aux différentes

combinaisons hormonales testées en donnant une diversité de cals dont l’aspect, la couleur et la

consistance varient en fonction de la variété et de la composition hormonale (nature et

concentration). Nous avons obtenu des cals beiges et friables, d’autres verts et compacts et un

faible résultat de cals bruns.

III. 1. 1. Influence de la nature de l’explant et de la variété sur la callogenèse chez Cicerarietinum L.

Tableau 5: Nature des cals obtenus en fonction des variétés de Cicer arietinum L. en utilisant la kinétine et l’AIA.

CallogénèseVariété ConcentrationHormonale (mg/l) folioles tiges

ILC1929ILC3996ILC199

MS + 1 AIA

+ 1 Kin

CB- -- -

CBCBrCB


MS + 0.5 AIA

+ 0.5 Kin

- -CB- -

CBrCBCV

ILC1929ILC263 MS + 1 Kin - -

CB- -CB


MS + 1 AIA- -CB- -

CBCBCB


MS + 0.5 AIA

+ 0.25 Kin

CB- -CV

CB- -- -

MS : milieu Murashige et Skoog CB : cals beiges et friables Kin : kinétine. CBr : cals bruns AIA : acide indol-3-acétique CV : cals verts et compacts

Les cals beiges et friables ont été obtenus en utilisant comme cytokinine ‘la kinétine’ et

comme auxine ‘l’acide indol-3-acétique’ (AIA) quelque soit leur concentration, principalement

chez les tiges (entre n uds) des variétés ILC1929, ILC4107, ILC263 et ILC3279 (tableau 5).


Planche II. Les différents stades de formation de cals chez les tiges (fragments d’entre n uds)de pois chiche (Cicer arietinum L.)

Fig.1. Fragments d’entre n uds de Cicer arietinum L.misen culture sur milieu MS additionné à des hormones végétales.

Fig. 2. Début de gonflement de l’explant et divisiondes cellules après deux semaines de mise en culture.

Fig.3. Cals issus de tige chez Cicer arietinum L.après un mois de mise en culture.


Planche III. Les différents stades de formation de cals chez les folioles de pois chiche(Cicer arietinum L.)

Fig.1. Folioles de Cicer arietinum L. mises en culture surmilieu MS additionné à des hormones végétales.

Fig.2. Début de la division cellulaire chez une foliole deCicer arietinum L. après deux semaines de mise en culture.

Fig.3. Cals issus de foliole chez Cicer arietinum L.aprèsun mois de mise en culture.


Les folioles ont pu donner ces cals beiges chez les mêmes variétés ILC 1929, ILC263,

ILC3279 et ILC4107 mais en présence de MS et certaines combinaisons hormonales seulement.

Les cals verts et compacts (tableau 5) ont été initiés à partir des deux sortes d’organes

‘tiges et folioles’ chez la même variété ILC199 et avec la même combinaison hormonale d’AIA

et de kinétine : une concentration similaire (0,5mg/l) pour chaque hormones est favorable à la

callogenèse uniquement chez les tiges ; par contre quand la concentration de la kinétine est

réduite de moitié (0,25mg/l), seules les folioles donnent des cals.

Les cals de couleur brunâtre sont produits seulement à partir des explants tiges (entre

uds) chez la variété ILC3996 en présence des compositions hormonales telles que l’AIA et la

kinétine à raison de 1mg/l pour chaque hormone ou avec une concentration réduite de moitié

(0,5mg/l).

III. 1. 2. Influence de la nature et de la concentration des hormones sur la callogenèse chezCicer arietinum L.

Tableau 6: Nature des cals obtenus en fonction des hormones testées (AIA et BAP) chez quelques variétés de Cicer arietinum L.

CallogénèseConcentrationHormonale (mg/l) Variété

folioles tiges

MS + 1 AIA

+ 0,5 BAP

ILC4107ILC199Twist

Aïn Témouchent

- -CVCBCB

CB- -CBCB

MS + 1 AIA + 1 BAP

ILC3996Twist

Aïn Témouchent

- -- -CB

CBrCB- -

MS + 1 AIA + 1,5 BAP

ILC4107ILC199

CB

- -- -CB

MS + 1 AIA + 2 BAP

Twist - - CB

MS : milieu Murashige et Skoog CB : cals beiges et friables BAP : 6-benzylaminopurine CBr : cals bruns AIA : Acide indol-3-acétique CV : cals verts et compacts

L’emploi d’une combinaison hormonale regroupant une auxine faible AIA (acide indol-

3-acétique) et une cytokinine BAP (6-benzyl-aminopurine) aux concentrations testées (tableau

6) a permis d’obtenir beaucoup plus des cals beiges et friables ; à l’exception de la combinaison

renfermant 1mg/l d’AIA et 0,5mg/l de BAP qui nous a donné l’autre type de cals verts et

compacts à partir de folioles chez la variété ILC199.


Un autre résultat exceptionnel qui mérite d’être signalé, c’est l’obtention de cals bruns à

partir d’un autre type d’organe tel que les tiges (entre n uds) chez la variété ILC3996 en

présence de 1mg/l d’AIA et 1mg/l de BAP.

III. 1. 3. Influence des concentrations d’hormones sur la callogenèse issue de tiges chezCicer arietinum L. (variété ILC3279).

Le pourcentage le plus élevé (80%) de cals (tableau 7) a été induit chez les tiges de la

variété ILC3279 en présence d’une forte auxine le 2,4D à une concentration moyenne de 1mg/l

additionnée d’une concentration plus faible de kinétine (0,5mg/l).

Il est à signaler qu’un résultat aussi important 70% a été obtenu lors de l’augmentation

de la concentration initiale de 2mg/l de 2,4D avec le maintien de la concentration de la kinétine

à raison de 0,5mg/l.

Le résultat relativement faible de 30% de cals est obtenu lors de l’utilisation des deux

hormones (2,4D et kinétine) à la même concentration de 1mg/l.

Tableau 7: Influence des concentrations d’hormones sur la callogenèse issue de folioles chez Cicer arietinum L. (variété ILC3279).

ConcentrationHormonale (mg/) Pourcentage de cals (%)

MS +1 2,4D +0,25 Kin 40

MS +1,5 2,4D +0,25 Kin 60

MS +1 2,4-D +0,5 Kin 80

MS +2 2,4D +0,5 Kin 70

MS +1 2,4D +1 Kin 30

III. 1. 4. Influence du type d’organe sur la callogenèse chez Cicer arietinum L. (variétéILC199).

Tableau 8: Pourcentages de cals obtenus en fonction du type d’organes chez Cicer arietinum L. (variété ILC199).

ConcentrationHormonale (mg/l)

Cas des tiges (%) Cas des folioles (%)

MS +1,5 2,4D +0,25 Kin

95 60

MS +1 2,4D +0,5 Kin

50 80

MS +1 2,4D +1 Kin

60 30

Les tiges (entre n uds) provenant de la variété ILC199 ont donné le pourcentage le plus

élevé de cals 95% (tableau 8) en utilisant une forte concentration de 2,4D (1,5m/l) en


combinaison avec une faible quantité de kinétine (0,25mg/l). Avec les mêmes concentrations,

60% de cals ont été initiés à partir de folioles.

80% de cals issus de folioles ont été obtenu avec 1mg/l de 2,4D additionné d’une

concentration réduite de moitié en kinétine (0,5mg/l).

III. 1. 5. Influence de la variété sur la callogenèse issus de tiges chez Cicer arietinum L.

Tableau 9: Influence de la variété sur le pourcentage de cals issusde tiges de Cicer arietinum L.

ConcentrationHormonale (mg/l)

Pourcentage decals flip87/5 (%)

Pourcentage de calsflip97/657 (%)

MS +1,5 2,4D +0,5 Kin 60 95

MS +1 2,4D +0.5 Kin 60 90

MS +2 2,4D +0.5 Kin 70 80

MS +1 2,4D +1 Kin 30 90

Les tiges (entre n uds) de la variété Flip97/657 ont donné les pourcentages les plus

importants de cals (80%, 90% et 95%) (tableau 9) par rapport aux tiges de la variété Flip87/5

qui ont donné des pourcentages (30% à 70%) avec les différentes concentrations en 2,4D et en

kinétine. Ce résultat confirme l’influence de la variété car pour un même organe (tige), nous

avons eu des résultats différents. C’est la variété Flip97/657 qui s’est révélée la plus

intéressante.

III. 2. Discussion

Le passage par formation de cal (callogenèse) est une étape primordiale de sélection in

vitro. Ce tissu végétal est une source importante de variabilité génétique (variation somaclonale)

et peut être considéré comme un stock de matériel génétique.

Cette callogenèse a pu être initiée chez Cicer arietinum L. lors de notre recherche. De

nombreux travaux ont signalé cette production de cals chez la même plante (Singh et al., 1982 ;

Anil et al., 1986 ; Riazuddin et al., 1988 ; Rao et Chopra,1989 ; Iqbal et al., 1991 ; Bansal et

Shrivastava,1992 ; Shivankar et al., 2002 ; Batra et al., 2004 et Anju et Chawla, 2005).

L’induction de cette callogenèse semble être influencée par certains facteurs qui sont liés

à la plante (variété, âge, organe, taille…) et aux hormones (nature et concentration).

L’initiation de cals chez Cicer arietinum L. est aussi influencée par la source des

explants qui correspond à la variété (organes et leur nature: racines, tiges, feuilles, pétioles…).

L’emploi d’une même combinaison hormonale et l’utilisation d’explants provenant de variétés

différentes ne donnent toujours pas les mêmes résultats. Ceci est dû à l’effet variétal qui peut


affecter le taux de cals formés, leur importance (vitesse de croissance) et leurs caractéristiques

(aspect, consistance, couleur…).

L’effet de la variété sur l’aptitude à la production de cals chez le pois chiche a été signalé

clairement par de nombreux auteurs lors de leurs travaux.

Chez le même type d’explant (folioles) et en présence de concentrations similaires de

2,4-D et de kinétine, le taux de cals est de 95% chez les tiges (entre n uds) de Flip87/5 mais de

60% pour Flip97/657. Ceci démontre clairement l’effet variétal sur la callogenèse.

Les travaux de Rao et Chopa (1987) ont montré que la variété desi donne de plus gros

cals que la kabuli pour le même fragment et les mêmes facteurs de croissance.

Sangvan et choudhary (1989) ont montré que cette callogenèse peut ne pas s’exprimer

chez toutes les variétés de pois chiche, ils constatent que seule la variété Gaudav qui donne des

cals parmi les trois testées pour le même explant pris et les mêmes hormones testées.

Sagare et al (1993), en testant quelques variétés de pois chiche vis à vis de leur capacité

à produire des cals, ils constatent que seule la variété PG12 qui donne des cals vigoureux. Les

travaux de Vani et Reddy (1996) ont signalé une callogenèse chez des hypocotyles de la variétés

JG- G2 mais une absence pour les autres variétés C235 et PGC. Sagare et al. (1993) ont pu

obtenir des cals issus de cotylédons que chez la variété C235 parmi les cinq étudiées.

Les résultats de notre recherche ont montré que la nature de l’explant (organe, sa taille,

son âge) semble affectée l’induction des cals au sein d’une même variété. Lors de l’utilisation

d’une même composition hormonale chez la même variété, ce sont les tiges (entre n uds) qui

ont donné plus de cals et plus rapidement que les folioles. Les travaux sur le pois chiche

confirment l’importance de la nature de l’explant sur l’expression de la callogenèse sont assez

nombreux.

Les résultats des travaux de Kiran et al. (2005) rejoignent les nôtres car ils ont obtenu

plus de cals à partir de tiges que les autres organes testés. Shivantar et al. (2002) ont induit des

cals plus importants avec des tiges qu’avec les autres organes tels que les cotylédons, folioles et

apex. Islam et Rafiul (2006) ont eu un taux de cals plus élevé chez les tiges par rapport aux

cotylédons et aux folioles.

La callogenèse, ce phénomène physiologique peut être contrôlé par d’autres facteurs

outre que l’influence du génotype. En effet, il existe des facteurs abiotiques tels que la

composition du milieu de culture en facteurs de croissance (hormones) qui influence

considérablement l’initiation des cals. Dans ce cas, nos résultats vont dans ce sens, pour le

même organe issu de la même variété mais en présence de diverses combinaisons hormonales, le


nombre de cals formés ainsi que leurs caractéristiques varient en fonction de la nature et de la

concentration des hormones étudiées.

Toutes les combinaisons hormonales testées (auxines : 2,4D ou AIA) combinées avec

une cytokinine (BAP ou Kin) à certaines doses ont donné des cals de manière variable. Le

maximum de cals est produit avec l’emploi d’une auxine forte 2,4D additionnée avec une

cytokinine à faible concentration.

Chez la variété ILC199, en présence de 1,5 mg/l de 2,4D et 0,25 mg/l de kinétine, le taux

de callogenèse est de 95% pour les fragments d’entre n uds mais il est plus faible pour les

autres combinaisons d’hormones. De nombreux travaux effectués par d’autres auteurs sont en

accord avec nos résultats.

Le 2,4D est une auxine indispensable dans le milieu de callogenèse. Cette auxine agit

comme un signal inductif pour le déclenchement de l’activité prolifératrice de l’explant mis en

culture qui donne naissance par la suite, à un cal. Chez le pois chiche, le 2,4D ainsi que l’AIA

sont tous les deux connus pour la formation de cal.

Les cytokinines telles que le BAP et la kinétine ont été utilisés pour la formation des cals

chez le pois chiche (Morjane et Harrabi, 1993).

Les travaux signalant l’influence des facteurs de croissance sur la production de cals

chez Cicer arietinum L. sont assez nombreux. La plus part d’entre eux mettent en évidence

l’importance de la nature et de la concentration des hormones sur le pourcentage de cals formés

et sur leurs caractéristiques. Anju et Chawla (2005) ont remarqué lors de leurs travaux que

l’ajout d’une autre auxine au 2,4D peut améliorer le pourcentage de cals formés. Ils obtiennent

95% de cals à partir de cotylédons lorsqu’il utilise les deux auxines (NAA et 2,4D) par contre le

NAA (acide naphtalène acétique) a donné 90% de cals.

Anil et al. (1986) ont constaté qu’un milieu contenant une concentration relativement

élevée de NAA (2mg/l) additionnée à une faible dose de cytokinine BAP (0,5 mg/l) donnent

100% de cals chez des racines de la variété H208 mais un taux assez bas (10%) en présence

d’une autre combinaison hormonale associant la kinétine à l’AIA.

D’autres recherches signalent qu’il est possible de produire des cals avec de faibles

teneurs d’hormones. Rao et Chopra (1989) ont initié des cals en présence de BAP et de 2,4D à

0,5mg/l pour chaque hormone chez des folioles de pois chiche. Les mêmes auteurs ont constaté

que parfois l’emploi de l’auxine seule à des doses élevées de 2,4D (1 à 3 mg/l) donne des cals

chez tous les explants (tiges, cotylédons….) quelle que soit la variété mais l’utilisation de doses

excessives de 2,4D (5 à 10 mg/l) est défavorable à la callogénèse chez tous les explants.


CONCLUSION


IV. CONCLUSION

Lors de notre étude sur la culture in vitro de tissu de pois chiche (Cicer arietinum L.),

nous avons pu induire la callogenèse chez cette plante. Les résultats obtenus montrent que le

déclenchement de ce phénomène physiologique de callogenèse est influencé par des facteurs

biotiques liés à la variété et à la nature de l’explant et abiotiques qui se rapportent à la

composition hormonale du milieu (nature et concentration). Ces facteurs contrôlent le

déclenchement de la formation des cals, leur importance (pourcentage et taille) et leurs

caractéristiques (aspects, consistance et couleur).

Nous avons remarqué que les résultats sont toujours l’expression des interactions entre la

variété, la nature du fragment végétal et de la combinaison des facteurs de croissance :

- Un fort pourcentage de cals est obtenu avec les tiges (entre n uds) en présence d’une

forte concentration de 2,4D et d’une plus faible concentration de kinétine. Les tiges de la

variété Flip97/567 ont donné 95% de cals en présence de 1,5mg/l de 2,4D et de 0,5mg/l de

kinétine et chez la variété ILC199 avec d’autres concentrations 1,5mg/l de 2,4D et 0,25 mg/l de

kinétine.

- La callogenèse a pu être initiée chez les variétés (Flip87/5, Flip97/657, ILC263,

ILC3996, ILC4107, ILC1929 et ILC199) avec les deux organes testés (tige et foliole) et en

présence des hormones (auxine : 2,4D ou AIA associée avec une cytokinine comme kinétine ou

BAP).

- Les trois sortes de cals (beiges et friables, verts et nodulaires, bruns et friables) ont pu

être produits selon la variété et la combinaison hormonale :

*Des cals beiges sont obtenus avec les tiges chez les quatre variétés testées en présence

de la composition hormonale AIA et kinétine.

*Les cals verts sont obtenus avec les tiges et les folioles chez la variété ILC199 en

présence de kinétine et d’AIA à des concentrations variables.

*Les cals bruns ne sont signalés que chez la variété ILC3996 avec les mêmes hormones

mais à des doses différentes (1mg/l d’AIA et 0,5 mg/l de kinétine).


REFERENCESBIBLIOGRAPHIQUES


REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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ANNEXE


Tableau 10: Composition du milieu de culture Murashige et Skoog (1962)(pour un litre de solution).

Nitrate d’ammonium NH4NO3 1,650 g.Nitrate de potassium KNO3 1,9 g.Chlorure de calcium CaCl2 , H2O 0,44 g.Sulfate de magnésium MgSO4 , 7H2O 0,370 g.

Macroéléments:

Phosphate monopotassique KH2PO4 0,170 g.Acide borique H3BO3 6,2 mg.Sulfate de manganèse MnSO4 , 4H2O 22,3 mg.Sulfate de zinc ZnSO4 7 H2O 8,6 mg.Iodure de potassium Kl 0,83 mg.Molybdate de sodium Na2MoO4 , H2O 0,25 mg.Sulfate de cuivre CuSO4 , 5H2O 0,025 mg.

Microéléments :

Chlorure de cobalt CoCl2 , 6H2O 0,025 mg.Sulfate de fer FeSO4 , 7H2O 2,78 g. Fer :EDTA dissodique Na2 , EDTA 3,73 g.Pyridoxine B6 0,1 mg.Aneurine thiamine-HCl 0,1 mg. Vitamines :Acide nicotinique C6H5NO2 0.5 mg.

Agar : 10 g. pH 5,8


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Université d'Oran 1 Ahmed Ben Bella - FACULTE DES SCIENCES … · 2015-05-05 · D’autres personnes: Nadia, Fatiha, Fatima, Maysaloune, Ahmed, Abdelkader, Imane, Samir, Mohammed,