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UNIVERSITÉ DU QUÉBEC
Mémoire
présenté à l'Université du Québec à Trois-Rivières
Comme exigence p~ielle pour l'obtention du grade de
Maîtrise ès Sciences (Biophysique)
par
Thierry Le Bihan
Approche cinétique de la dénaturation thermique
de l'actine: Contributions expérimentale et théorique
Juin 1993
Université du Québec à Trois-Rivières
Service de la bibliothèque
Avertissement
L’auteur de ce mémoire ou de cette thèse a autorisé l’Université du Québec à Trois-Rivières à diffuser, à des fins non lucratives, une copie de son mémoire ou de sa thèse.
Cette diffusion n’entraîne pas une renonciation de la part de l’auteur à ses droits de propriété intellectuelle, incluant le droit d’auteur, sur ce mémoire ou cette thèse. Notamment, la reproduction ou la publication de la totalité ou d’une partie importante de ce mémoire ou de cette thèse requiert son autorisation.
~€V T11C ppOT€\aC, n" npOP11a€Ta\, ~P€VOC; T\
T€pJ..La TOÀJ..L11C l<a\ 8paaovC y€v11 a €Ta\.
Euripide, Hippolyte.
L'éternité c'est long, surtout vers la fin.
Citation tirée d'un hiéroglyphe d'une honorable
toilette de l'u.a.T.R.
ii
REMERCIEMENTS
Beaucoup de gens ont gravité autour de ce travail, entre autre, le célèbre
docteur Claude Gicquaud, que je remercie pour l'attention, le support ainsi que la
confiance qu'il a su m'accorder. Je tiens aussi à remercier mon père, Jean-Pierre
qui, en plus de m'avoir aidé pour la rédaction de ce mémoire, m'a épaulé pour la
composition d'affiches scientifiques et de publications antérieures. Il est une
personne avec qui il est scientifiquement enrichissant de discuter.
J'aimerais remercier également Bernard Larue, pour des conseils concernant
les transitions thermiques, Normand Beaudoin, pour la résolution de problèmes
électroniques et mathématiques ainsi que Pierre Lavigne à la fois pour ses
suggestions de lectures perspicaces et les discussions passionnées que l'on a pu
avoir sur la structure des protéines.
Je tiens aussi à me remercier, car sans moi ce travail, je n'aurais certainement
pas pu le faire *.
Finalement, je tiens particulièrement à rendre grâce à mes nombreux petits
amis(es) imaginaires; Jim Tordon, Smerf, Fernand F. Flibote Jr. et Joanna. Sans eux,
je crois que je serais complètement cinglé à l'heure qu'il est.
* N'y voyez pas là cher lecteur une forme d'égocentrisme aiguë mais simplement une prise de
conscience très tardive.
iii
RÉSUMÉ
L'analyse de la transition thermique d'une protéine, basée la plupart du temps
sur une approche d'équilibre thermodynamique est généralement effectuée dans le
but d'obtenir de l'information concernant la structure de cette protéine. L'obtention
de ce type d'information à l'aide d'outils théoriques basés sur des lois
thermodynamiques implique que cette transition thermique soit réversible, ce qui
n'est pas toujours le cas. L'actine est justement une protéine dont la dénaturation
est irréversible. Il en résulte que le comportement thermique de l'actine est en
contradiction avec certains aspects inhérents à l'approche thermodynamique. Le but
de ce travail est de caractériser la transition thermique de l'actine avec une approche
cinétique, plus compatible avec son comportement thermique.
Le volet expérimental de ce travail consiste en la caractérisation thermique de
l'actine G et F. Cette caractérisation est effectuée à l'aide de deux techniques
différentes soit la calorimétrie différentielle à balayage et la fluorescence, afin
d'obtenir des paramètres cinétiques les plus courants.
Concernant l'actine G, nous montrons clairement, à l'aide de ces deux
techniques que sa dénaturation est un phénomène cinétique. Il s'agit d'un
mécanisme d'ordre 1 dont la constante de vitesse varie en fonction de la
température selon une loi d'Arrhénius.
Concernant l'actine F, étudiée aussi à l'aide des deux techniques mentionnées
précédemment, nous montrons également que sa dénaturation peut être
caractérisée par des lois cinétiques. Dans ce cas, le phénomène de dénaturation
semble être un mécanisme d'ordre inférieur à l'unité. Un ordre de dénaturation
inférieur à l'unité est souvent associé à des phénomènes de dépolymérisation ou de
fragmentation.
Nous avons étudié l'effet de la phalloïdine sur l'actine. Une des propriétés de
la phalloïdine est de réduire la dépolymérisation, et probablement la fragmentation
du filament d'actine. Nous avons déterminé que la dénaturation thermique de l'actine
F, en présence de phalloïdine, est un mécanisme d'ordre 1. D'autre part, nous avons
iv
aussi montré que la phalloïdine pouvait interagir avec l'actine G. L'observation de la
dénaturation par calorimétrie différentielle à balayage nous a amené à émettre
certaines hypothèses sur cette interaction; la présence de phalloïdine diminue la
concentration critique de l'actine et l'augmentation lente de la température favorise
la polymérisation de l'actine qui peut alors interagir avec la phalloïdine.
L'utilisation de l'approche cinétique permet d'expliquer des comportements
thermiques de l'actine sur la base d'hypothèses moins contraignantes que
l'approche thermodynamique. Cette dernière approche est presque uniquement
utilisée, malgré tout, pour caractériser les transitions thermiques.
Nous concluons que la transition thermique de l'actine ne peut être
correctement décrite par un modèle d'équilibre thermodynamique et qu'il est
préférable d'utiliser des lois cinétiques pour décrire le comportement thermique de
l'actine.
v
REMERCIEMENTS ............................................................................................ ii
RÉSUMÉ .......................................................................................................... iii
TABLE DES MATIERES ................................................................................. v
LISTE DES FIGURES ..................................................................................... ix
LISTE DES TABLEAUX .................................................................................. xiii
LISTE DES PRINCIPAUX SYMBOLES ......................................................... xiv
1 INTRODUCTION ......................................................................................... 01
1.1 Description du problème ................................................................ 01
1.2 Buts fixés et limites du mémoire ................................................... 02
1.3 Organisation du mémoire ............................................................... 03
2 ÉTAT DES CONNAISSANCES ................................................................... 04
2.1 Dénaturation thermigue des protéines .......................................... 04
2.11 Effet de la température sur les protéines ................................... 05
2.12 Approche théorique de la dénaturation thermique des protéines 06
i) Phénomène réversible ............................................................ 06
ii) Phénomène irréversible .......................................................... 11
2.2 Matériel biologigue utilisé ............................................................... 16
2.21 Actine .......................................................................................... 16
2.22 Phalloïdine ................................................................................... 18
2.23 Interaction entre l'actine et la phalloïdine .................................... 20
vi
2.3 Études antérieures de la dénaturation thermique de l'actine ..... 20
2.31 Revue de la littérature ................................................................. 21
2.32 Analyse critique du modèle de Bertazzon ................................... 24
2.33 Dénaturation de l'actine en présence de phalloïdine ................... 29
3 MATÉRIEL ET MÉTHODES ....................................................................... 30
3.1 Matériel biologique .......................................................................... 30
3.11 Préparation de l'actine ................................................................ 30
3.12 Préparation de la phalloïdine ...................................................... 30
3.2 Calorimétrie différentielle à balayage ............................................ 30
3.21 Préparation des échantillons ...... ................................................ 32
3.22 Utilisation du calorimètre Microcal Mc-1 ..................................... 34
3.23 Utilisation du calorimètre Hart 7707 ............................................ 34
3.3 Variation d'intensité de fluorescence ............................................ 34
3.31 Préparation des échantillons d'actine G ..................................... 35
3.32 Préparation des échantillons d'actine F ...................................... 36
4 ANALYSE THÉORIQUE DE LA TRANSITION THERMIQUE ..................... 38
4.1 Calorimétrie différentielle à balayage ............................................ 38
4.11 Simulation de thermogramme ..................................................... 38
i) Ordre de la dénaturation n = 1 ...................................... .. ..... 39
ii) Ordre de la dénaturation n ~ 1 .............................................. 43
4.12 Méthodes de régression ............................................................. 45
i) Ordre de la dénaturation n = 1 ............................................. 46
ii) Ordre de la dénaturation n ~ 1 .............................................. 49
4.13 Évaluation de l'incertitude sur les coefficients ............................ 51
vii
4.2 Analyse des résultats obtenus par fluorescence ......................... 52
4.21 Ordre 1 .............................................. ......................................... 52
4.22 Ordre n .................................................. ........... ...... ..... . ....... ....... 53
4.3 Limitation des méthodes de calcul ................................................ 55
5 RÉSULTATS ET DISCUSSION ................................................................... 58
5.1 Dénaturation thermique de l'actine G ............................................ 58
5.11 Cinétique de dénaturation thermique observée par fluorescence 58
i) Effet de la température sur la cinétique de dénaturation ....... 58
ii) Effet de la concentration sur la cinétique de dénaturation .... 60
Hi) Relation d'Arrhénius ............................................................... 61
5.12 Dénaturation thermique observée par D.S.C. .. ...... ...... ............... 62
i) Méthode du thermogramme simple ....................................... 62
ii) Méthode des thermogrammes multiples ................................ 65
5.13 Comparaison des résultats obtenus ........................................... 67
5.2 Dénaturation thermique de l'actine F ............................................ 67
5.21 Cinétique de dénaturation thermique observée par fluorescence 67
i) Effet de la concentration sur la cinétique de dénaturation .... 68
ii) Effet de la température sur la cinétique de dénaturation ....... 70
Hi) Relation d'Arrhénius ............................................................... 71
5.22 Dénaturation thermique observée par D.S.C. ............................. 72
i) Méthode du thermogramme simple ....................................... 72
ii) Méthode des thermogrammes multiples ................................ 76
5.23 Comparaison des résultats obtenus ........................................... 78
5.3 Étude d'un cas: l'interaction entre l'actine et la phalloïdine ....... 79
5.31 Caractérisation qualitative de l'interaction .................................. 80
i) Effet de la phalloïdine sur la thermostabilité de /'actine F ..... 80
ii) Effet de la phalloïdine sur la thermostabilité de /'actine G.... 81
viii
5.32 Étude quantitative de l'interaction ............................................... 83
i) Méthode du thermogramme simple ........................................ 84
ii) Méthode des thermogrammes multiples ................................. 87
5.33 Modèle proposé .......................................................................... 89
5.4 Synthèse des observations ............................................................. 91
5.41 Actine G ....................................................................................... 91
5.42 Actine F ........................................ .............. ................................. 92
5.43 Actine en présence de phalloïdine .............................................. 93
5.5 Signification des paramètres cinétiques ....................................... 95
CONCLUSIONS ........................................... ................................................. 99
RÉFÉRENCES ................................................................................................ 102
ANNEXE
Annexe A Relation entre la température de transition et la vitesse de
balayage pour des ordres de dénaturation différents de
l'unité ..................................................................................... A1-A5
Annexe B Données brutes ................................................................... 81-817
ix
LISTE DES FIGURES
Figure 1
Figure 2
Figure 3
Figure 4
Figure 5
Figure 6
Figure 7
Figure 8
Figure 9
Figure de principe illustrant la dénaturation thermique d'une
protéine obéissant à une transition réversible entre deux états. 08
Figure de principe illustrant la dénaturation thermique d'une
protéine selon le modèle d'une transition irréversible entre
deux états. 13
Schéma illustrant certaines caractéristiques de l'actine G et F.
Structure du monomère d'actine (tiré de Kabsch, W. et
Vandekerckhove, J., 1992).
Principales phallotoxines provenant d'amanites.
Relation selon l'équation [16] entre la température de
transition (Tm) de l'actine G et la vitesse de balayage (v).
Tracé calorimétrique associé à la transition thermique de
l'actine G obtenu par A. Bertazzon et al (1990) et interprétation
thermodynamique du phénomène selon ces auteurs.
Interprétation cinétique du tracé calorimétrique associé à la
transition thermique de l'actine G obtenu par A. Bertazzon et al (1990).
Tracé calorimétrique associé à la transition thermique de
l'actine F obtenu par A. Bertazzon et al (1990) et interprétation
thermodynamique du phénomène selon ces auteurs.
16
17
19
23
25
26
27
Figure 10 Interprétation cinétique du tracé calorimétrique associé à la
transition thermique de l'actine F obtenu par A. Bertazzon et
x
al (1990). 28
Figure 11 Principaux types de calorimètres différentiels à balayage.
Figure 12 Spectres d'intensité de fluorescence intrinsèque de l'actine G
native et dénaturée.
Figure 13 Figure de principe illustrant l'effet de l'ordre de dénaturation
sur la variation de capacité calorifique en fonction de la
31
35
température. 56
Figure 14 Effet de la température sur la vitesse de dénaturation de
l'actine G.
Figure 15 Effet de la concentration d'actine G sur sa vitesse de
59
dénaturation. 60
Figure 16 Relation d'Arrhénius tracée à partir de courbes isothermales
obtenues par fluorescence intrinsèque. 62
Figure 17 Tracé calorimétrique associé à la dénaturation thermique de
l'actine G. 63
Figure 18 Relation d'Arrhénius tracée à partir du thermogramme de la
figure 17. 64
Figure 19 Effet de la vitesse de balayage sur la dénaturation thermique
de l'actine G. 65
xi
Figure 20 Relation entre la température de transition (Tm) de l'actine G
et la vitesse de balayage (v). 66
Figure 21
Figure 22
Figure 23
Figure 24
Figure 25
Figure 26
Figure 27
Figure 28
Figure 29
Figure 30
Effet de la concentration de l'actine F sur sa vitesse de
dénaturation.
Relation entre la concentration initiale d'actine F et le temps de
demi-vie.
Effet de la température sur la vitesse de dénaturation de
l'actine F.
Relation d'Arrhénius tracée à partir de courbes isothermales
obtenues par fluorescence intrinsèque.
Tracé calorimétrique associé à la dénaturation thermique de
l'actine F.
Graphique illustrant l'optimisation de l'intervalle par la relation
entre la température finale (Tf) et l'estimateur a € 2.
Effet de la vitesse de balayage sur la dénaturation thermique
de l'actine F.
Relation entre la température de transition (T m) de l'actine F et
la vitesse de balayage (v).
Effet de la concentration de phalloïdine sur la dénaturation
thermique de l'actine F.
Effet de la concentration de phalloïdine sur la dénaturation
thermique de l'actine G.
68
69
70
71
73
74
77
78
80
82
xii
Figure 31 Effet de la concentration de phalloïdine sur l'enthalpie
calorimétrique associée à la dénaturation thermique de l'actine
G et F. 83
Figure 32 Tracé calorimétrique associé à la dénaturation thermique de
l'actine F en présence de phalloïdine pour des rapports
molaires phalloïdine:actine proches de l'unité. 84
Figure 33 Graphique illustrant l'optimisation de l'intervalle par la relation
entre la température finale (Tf) et l'estimateur a € 2. 85
Figure 34 Effet de la vitesse de balayage sur la dénaturation thermique
de l'actine F en présence de phalloïdine pour des rapports
molaires phalloïdine:actine proches de l'unité. 87
Figure 35 Relation entre la température de transition (Tm) de l'actine Fen
présence de phalloïdine pour des rapports molaires
phalloïdine:actine proches de l'unité, et la vitesse de balayage
(v). 88
Figure 36 Schéma illustrant l'effet thermostabilisant de la phalloïdine sur
le filament d'actine. 90
Figure 37 Figure de principe illustrant l'effet de la variation de l'énergie
d'activation sur une simulation de thermogramme. 96
Figure 38 Figure de principe illustrant l'effet de la variation du facteur de
collision sur une simulation de thermogramme. 97
xiii
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 Comparaison des deux principaux modèles de dénaturation
thermique. 15
Tableau 2 Bref historique de l'étude de la dénaturation thermique de
l'actine G.
Tableau 3 Températures de transition de l'actine G obtenues par
différents auteurs.
Tableau 4 Paramètres thermodynamiques de la dénaturation thermique
22
23
de l'actine (valeurs utilisées par Bertazzon, A. et al (1990)). 24
Tableau 5 Solutions de travail. 33
Tableau 6 Paramètres cinétiques de la dénaturation thermique de l'actine
G évalués par différentes méthodes. 67
Tableau 7 Estimation des paramètres cinétiques en fonction de l'intervalle
considéré: cas de l'actine F.
Tableau 8 Paramètres cinétiques de la dénaturation thermique de l'actine
75
F évalués par différentes méthodes. 79
Tableau 9 Estimation des paramètres cinétiques en fonction de l'intervalle
considéré: cas de l'actine F en présence de phalloïdine. 86
Tableau 10 Paramètres cinétiques de la dénaturation thermique de l'actine
F en présence de phallo"idine évalués par différentes
m~~~. 00
xiv
LISTE DES PRINCIPAUX SYMBOLES
A
B
c C
Cp
o o [0]
âCp
âCPexp
âCPthéor âH
âHcal
âHvH âl
âP
âSj
âS
Ea ~
f
f(a)
FN(T) Tl
facteur de collision ((mg/ml)(1-n). S-1 )
fraction de protéine ayant réagi
fraction de protéine ayant réagi à T = Tm
matrice des éléments
concentration de protéine (mg· mr1)
paramètre de normalisation
variation de capacité calorifique molaire [utilisé par A. Bertazzon et al,
1990] (kCal· mole-1 . K"1)
état dénaturé de la protéine
paramètre de normalisation
concentration de l'état 0 (mg· mr1 ou mole · r1)
variation de capacité calorifique (kJ· K"1 ou J,LJ. K-1)
valeur de variation de capacité calorifique expérimentale (kJ· K"1 ou
J,LJ. K"1)
variation de capacité calorifique à la température de transition Tm (kJ· K"1 ou J,LJ. K-1)
valeur de variation de capacité calorifique théorique (kJ· K"1 ou J,LJ. K-1)
enthalpie molaire (kJ· mole-1)
enthalpie calorimétrique (kJ· mole-1)
enthalpie de Van't Hoff (kJ· mole-1)
variation d'intensité de fluorescence
différence de puissance entre deux cellules calorimétriques (J,LJ. S-1)
erreur-type du coefficient Sj
entropie molaire (kJ· mole-1 . K"1)
énergie d'activation (kJ· mole-1)
facteur de collision pondéré pour n ~ 1 (S-1)
facteur de normalisation
fonction de a
valeur normalisée de l'intensité de fluorescence à 320 nm au temps t
quantité de protéine impliquée dans le processus de dénaturation
(mole ou mg)
xv
kapp constante de vitesse: ((mg/ml)(1-n). S-1)
K constante d'équilibre
L(T) ligne de base sigmoïde (J,LJ' t(1 ou kJ· t(1)
n ordre du mécanisme de dénaturation
N nombre de données expérimentales utilisées pour la régression
N état natif de la protéine
[N] concentration de l'état N (mg' mr1 ou mole' r 1)
No concentration initiale de l'état natif avant dénaturation (mg' mr1 ou
mole ' r1) v vitesse de balayage (oC' h-1 ou K· S-1)
0 1 ordonné à l'origine de la variation de capacité calorifique avant
transition (J,LJ ' t(1 ou kJ· t(1)
O2 ordonné à l'origine de la variation de capacité calorifique après
transition (J,LJ' K-1 ou kJ· K-1)
P1 pente de la relation de la variation de capacité calorifique avant la
transition (J,LJ' K-2 ou kJ ' t(2)
P2 pente de la relation de la variation de capacité calorifique après la
transition (J,LJ' t(2 ou kJ ' t(2)
QT quantité totale de chaleur impliquée dans le processus de dénaturation
(J,LJ)
Q(T) quantité de chaleur impliquée dans le processus de dénaturation
jusqu'à une température T (J,LJ)
R constante des gaz parfaits (0.008314 kJ· mole-1 . t(1)
Sj élément du vecteur solution
S vecteur solution du système incompatible B · S = y
a E 2 estimateur non biaisé de la variance ou distance moyenne entre une
valeur expérimentale et théorique pour une même valeur en abscisse
t temps (s ou min)
t1/2 temps de demi-vie (s ou min)
T température (0 C ou K)
Tc température critique (0 C ou K)
Tf température finale (0 C ou K)
Ti température initiale (0 C ou K)
Tm température de transition (0 C ou K)
élément de la diagonale principale de la matrice V
matrice de variance-covariance
vecteur des constantes
xvi
1
1 INTRODUCTION
Étant donné l'aspect pluridisciplinaire et peu connu du sujet traité dans ce
travail, nous présenterons en premier lieu, la problématique ainsi que les objectifs.
Le lecteur sera alors en mesure de mieux comprendre le cheminement présenté par
la suite.
1.1 Description du problème
La plupart des études de dénaturation thermique des protéines sont effectuées
dans le but de mesurer certains changements moléculaires, de quantifier les forces
mises en jeu pour stabiliser la structure tertiaire des protéines, ou simplement de
vérifier les interactions possibles entres ligands et protéines. Ces types de mesures
ne sont concevables que si la transition thermique étudiée est réversible et obéit, de
ce fait, à des lois d'équilibre thermodynamique. La réversibilité de la transition
thermique des protéines n'est possible que pour certaines protéines et dans des
conditions bien spécifiques. Les protéines étudiées à l'aide de cette approche
thermique sont généralement simples et ont une forme globulaire compacte. L'actine
semblait, du moins à première vue, faire partie de ces protéines.
L'actine est une protéine impliquée dans plusieurs phénomènes de contraction
et de motilité. L'actine existe sous deux formes: la forme globulaire (actine G) et la
forme filamenteuse (actine F). Cette actine F consiste en un polymère hélicoïdal du
monomère d'actine. Plusieurs études de dénaturation thermique de l'actine ont déjà
été effectuées. Les résultats obtenus ne sont pas concordants et ont amené diverses
interprétations des phénomènes thermiques observés.
L'étude de la dénaturation thermique de l'actine par une approche purement
thermodynamique ne peut décrire de façon satisfaisante l'effet de la variation de
certains paramètres sur son comportement, et l'utilisation de lois cinétiques doit
donc être envisagée.
2
1.2 Buts fixés et limites du mémoire
Cette étude tentera de caractériser la dénaturation thermique de l'actine à l'aide
d'une approche différente en faisant intervenir, entre autres, des lois cinétiques. La
façon de procéder sera la suivante:
1er volet: Nous ferons le point sur l'ensemble des travaux concernant la
dénaturation thermique de l'actine, ainsi que sur les méthodes d'études
cinétiques de la dénaturation thermique des protéines. Nous en
profiterons à ce niveau pour évaluer la validité de l'approche cinétique
sur les résultats de quelques auteurs ayant déjà abordé le problème
de la dénaturation thermique de l'actine.
2ème volet: Nous mettrons au point des outils mathématiques permettant à la fois
de simuler des transitions thermiques ainsi que de traiter des résultats
expérimentaux obtenus dans cette étude. Nous serons alors en
mesure d'évaluer l'énergie d'activation, le facteur de collision ainsi que
l'ordre de la réaction des résultats obtenus soit par calorimétrie
différentielle à balayage soit par une méthode isothermale.
3ème volet: Le volet expérimental de ce travail sera présenté pour confirmer la
validité de l'approche cinétique de la dénaturation thermique de
différentes formes d'actine (actine G, actine F et actine en présence de
phalloïdine). Deux techniques complémentaires seront utilisées soit la
calorimétrie différentielle à balayage et une technique isothermale
(basée sur la variation d'intensité de fluorescence intrinsèque).
L'utilisation combinée des deux techniques a pour but de démontrer
l'hypothèse que la dénaturation thermique de l'actine est sous
dépendance cinétique. Nous ferons une synthèse des résultats et
vérifierons le lien entre les études calorimétriques et isothermales.
Quoiqu'il semble possible d'esquisser des lois qui régissent la dénaturation
thermique de l'actine, nous n'avons pas tenté de trouver les mécanismes
moléculaires responsables de ce type de dénaturation thermique irréversible.
3
1.3 Organisation du mémoire
Ce présent travail suit l'ordre suivant:
Le chapitre 2 présente:
Une synthèse des travaux antérieurs concernant des études générales de
dénaturation thermique des protéines.
Une description du matériel biologique utilisé lors de cette recherche soit:
l'actine et la phalloïdine.
Une analyse d'études antérieures sur la dénaturation thermique de l'actine
et l'interprétation des résultats selon l'approche cinétique.
Le chapitre 3 décrit les types d'appareils et les méthodologies utilisés, tandis
que la description du traitement mathématique fait l'objet du chapitre 4.
Les résultats obtenus et leur discussion sont présentés au chapitre 5 dans trois
parties distinctes soit:
Les données provenant de la dénaturation de l'actine G par calorimétrie
différentielle à balayage et par fluorescence.
Les données provenant de la dénaturation de l'actine F par calorimétrie
différentielle à balayage et par fluorescence.
Les données d'une étude de l'interaction entre la phalloïdine et l'actine.
Les conclusions sont regroupées au chapitre 6.
Les résultats bruts sont présentés en annexe sous forme de tableaux.
4
2 ÉTAT DES CONNAISSANCES
L'étude de la dénaturation thermique des protéines est relativement récente et
la littérature a mis en évidence certaines ambigu·,lés dans l'analyse du phénomène.
Pour cette raison, nous avons séparé la description des phénomènes et leurs
diverses interprétations.
2.1 Dénaturation thermique des protéines
La majorité des protéines naturelles adoptent une configuration tridimensionnelle
unique. Les nombreux acides aminés qui composent la protéine peuvent s'organiser
en une multitude de configurations possibles; toutefois la forme active des protéines,
souvent compacte, est généralement unique. La forme compacte est attribuée aux
forces autoassociatives (interactions hydrophobes). La structure unique serait due
à certaines propriétés des acides aminés qui composent la chaîne peptidique, entre
autres à des pontages hydrogènes spécifiques à l'intérieur de la protéine. D'autres
forces tout aussi importantes quant au maintien de la structure active de la protéine
peuvent être impliquées, tel la présence de cofacteur, d'ions particuliers, de pontage
disulfure, etc ... Une étude exhaustive de la structure des protéines est présentée par
Creighton, T. (1991).
Il est admis que les interactions physiques qui contribuent au maintien de la
structure tridimensionnelle de la protéine sont coopératives. Diminuer la stabilité de
l'une d'entre elles équivaut à diminuer globalement la stabilité des interactions. Le
processus de repliement ou de déploiement, une fois amorcé, se poursuit
généralement jusqu'à la fin (phénomène de coopérativité). Les protéines vont donc
exister sous un des deux états possibles, natif (forme fonctionnelle et compacte) ou
dénaturé (forme non fonctionnelle légèrement déployée ou totalement déployée).
Alors que la structure native et compacte de la protéine semble unique, les
configurations dénaturées, sont plus nombreuses.
Le phénomène d'autorepliement est associé à une base de repliement, ou
domaine. Une protéine peut donc être composée de plusieurs domaines qui
interagissent ou non entre eux.
5
L'étude des états dénaturés des protéines fait actuellement l'objet d'intenses
recherches. L'état dénaturé de la protéine est un état qui peut être facilement obtenu
et sert de référence pour l'étude des mécanismes de repliement et de stabilisation
de la forme native. La transition entre les états natif et dénaturé est souvent
caractérisée par des paramètres thermodynamiques (Privalov, P.L. et al, 1989). De
telles études de dénaturation servent entre autres:
à déterminer le nombre de domaines qui composent une protéine (Privalov,
P.L.,1979; Ramsay, G. et Freire, E.,1990; Freire, E. et al, 1992),
à quantifier des interactions possibles entre protéines et ligands quand la
plupart des méthodes usuelles de mesures d'équilibre ne donnent pas de
résultat (Brandts, J.F. et Lin, L.N., 1990).
2.11 Effet de la température sur les protéines
Les structures internes et externes des protéines peuvent être perturbées par
une modification de leur environnement. Le phénomène de dénaturation thermique
se produit lorsque les forces d'hydratation de résidus non polaires sont supérieures
aux forces stabilisantes, telles les interactions de Van der Waals et les ponts
hydrogènes qui semblent, selon Privalov, contribuer de façon comparable à la
stabilisation de la forme compacte (Privalov, P.L. et Gill, S.G., 1988). Le potentiel
d'hydratation des solutions augmente avec la température et, dans le cas des
protéines, ce seuil critique est relativement peu élevé, normalement en deçà de
100°C. Généralement, le passage de la forme native, à la forme dénaturée, est
réversible (Privalov, P.L., 1979) et peut donc être facilement caractérisé par une
approche thermodynamique du phénomène. Toutefois, il peut arriver que la forme
dénaturée de la protéine atteigne un état irréversible (Wetzel, R. et al, 1990). Une
des causes les plus probables de cette irréversibilité est l'agrégation permanente de
la protéine bien que Wetzel, R. et al (1990) suggèrent dans une étude exhaustive,
d'autres causes.
Pour les petites protéines, peu complexes, le passage de la forme native à la
forme dénaturée s'effectue de façon très coopérative et la population
d'intermédiaires demeure assez faible. Pour les grosses protéines, plus complexes,
il y aurait, au cours de la dénaturation, la coexistence d'états intermédiaires, en
6
raison de la présence de différents domaines.
Le passage d'un état compact à un état déployé peut s'observer en suivant
diverses modifications physiques. Le déploiement provoque l'exposition des résidus
non polaires internes à l'eau (ou autre solvant) ce qui provoque plusieurs
modifications. Entre autres:
augmentation de la capacité calorifique associée au transfert d'un composé
non polaire à l'eau (Privalov, P.L. et al, 1989),
effet bathochrome en intensité de fluorescence, associé au changement de
polarité de certains acides aminés (Kuznetsova, I.M. et al, 1988)
modification de la viscosité, de l'absorbance optique, de l'activité
enzymatique etc ...
2.12 Approche théorique de la dénaturation thermique des protéines
La transition de la forme native à la forme dénaturée induite par la chaleur peut
être traitée de deux façons très différentes selon que l'on considère que la transition
est réversible ou non.
i) . Phénomène réversible
La dénaturation thermique de beaucoup de petites protéines est réversible et
le passage de fa forme native à une forme dénaturée s'effectue avec très peu d'états
intermédiaires .. " est alors simple d'utiliser une approche thermodynamique pour
décrire le phénomène comme l'ont fait Chang, L-H. et al (1984). Le passage de la
forme native (N) à la forme dénaturée (D) s'observe par une modification d'une
propriété. Le degré de dénaturation (ex) sera directement relié à la variation de la
constante d'équilibre (K) entre les deux états.
K N .,. D
K = [D]/[N] [1 ]
N état natif de la protéine
7
o état dénaturé de la protéine K constante d'équilibre [N] concentration de l'état N (mole· r') [0] concentration de l'état 0 (mole ·1-')
A partir de la variation de la constante d'équilibre et de la température, plusieurs
autres relations thermodynamiques fondamentales peuvent être déduites, en
particulier:
K(T) = exp(-âHjRT) *exp(âSjR) [2]
K(T) constante d'équilibre T température (K) ~H enthalpie molaire (kJ · mole-') ~S entropie molaire (kJ . mole-' . K ') R constante des gaz parfaits (0.008314 kJ· mole-' . K')
Plusieurs propriétés physiques, chimiques ou enzymatiques permettent de
différencier la forme native de la forme dénaturée. Le paramètre observé peut être
directement relié au degré de dénaturation (ex) correspondant à la fraction de
protéine dénaturée:
ex = [0] j ([N] + [0]) [3]
ex = Kj(1 +K) [4]
K = exj(1-ex) [5]
où [N] + [0] est constant
Une des propriétés physiques qui est utilisée pour suivre la dénaturation
thermique des protéines est la variation de la capacité calorifique pouvant être
mesurée par calorimétrie différentielle à balayage. On peut déduire certains
paramètres par cette technique. A pression (p) constante, la variation de capacité
calorifique, â Cp, est directement reliée à la mesure de la quantité de chaleur aa(T)
requise pour augmenter la température de la protéine dans l'intervalle al:
8
âCp = [~(T)l. [6]
.::lCp variation de capacité calorifique Q(T) quantité de chaleur impliquée dans le processus de dénaturation
La quantité de chaleur, Q(T), impliquée dans le processus de dénaturation étant
proportionnelle au degré de dénaturation, a (Privalov, P.L., 1979) ÂCp est donc
proportionnel à da/dT selon l'équation [6]. Un exemple typique de tracé
calorimétrique est illustré à la figure 1. La transition observée correspond à la
dénaturation d'une protéine obéissant à des lois thermodynamiques simples. L'aire
totale sous la courbe, QT' représente la quantité de chaleur impliquée dans le
processus et la température de transition, Tm' correspond au maximum de la relation
ÂCp vs T.
Q) ::J .2' -.... 0 ~ 0
-Q) -0 ~ a. ~ 0 âCpmax Q) "C r:: ,2 -~ .... ~ TI
20 30 40 50 60 70 80
Température, T (OC)
Figure 1: Figure de principe illustrant la dénaturation thermique d'une protéine obéissant à une transition réversible entre deux états.
9
Un des avantages de la calorimétrie différentielle à balayage est qu'il est
possible d'en déduire l'enthalpie réelle (calorimétrique) du processus ainsi que
l'enthalpie de Vant'Hoff.
L'enthalpie calorimétrique est déterminée à partir de la courbe âCp en fonction
de la température (tracé calorimétrique) et correspond à l'aire totale sous la courbe,
QT' divisée par le nombre de moles de protéine impliquée.
[7]
~Hcal enthalpie calorimétrique (kJ . mole-1)
7J quantité de protéine impliquée dans le processus de dénaturation (mole)
TI limite inférieure de l'intervalle de température (oC ou K) Tf limite supérieure de l'intervalle de température (OC ou K)
L'enthalpie de Vant'Hoff s'obtient du tracé calorimétrique selon la relation
suivante (Privalov, P.L., 1979):
enthalpie de Vant'Hoff (kJ . mole-1)
température de transition (K) variation de la capacité calorifique à Tm (kJ . K1)
[8]
Une autre quantité souvent utilisée, le rapport de coopérativité, se définit comme
le rapport des deux types d'enthalpies soit: âHvH/ âHcal ' Cependant, certains auteurs
représentent le rapport de coopérativité comme étant l'inverse soit âHcal / âHvH (Privalov, P.L., 1979) ce qui peut introduire une certaine confusion quand à la
signification de cette valeur.
Plusieurs petites protéines globulaires ont un rapport de coopérativité
(âHvH/ âHcal) proche de l'unité (Privalov, P.L., 1979), ce qui signifie qu'il n'existe que
deux états possibles, l'état natif et l'état dénaturé, sans intermédiaire (modèle
binaire). La protéine constitue dans ce cas un domaine en soi, parfois nommé unité
10
coopérative de base.
Un rapport coopératif différent de l'unité reflète des écarts vis-à-vis du modèle
binaire de dénaturation. Un rapport coopératif supérieur à l'unité serait l'indice d'une
coopérativité entre les protéines ou entre les molécules considérées comme "unité
moléculaire". Un rapport inférieur à l'unité indiquerait que la protéine est composée
de domaines plus ou moins indépendants ou qu'il existe des états intermédiaires
entre la forme native et la forme dénaturée (Bertazzon, A. et al, 1990).
Les protéines se dénaturant selon un processus réversible et ayant un rapport
de coopérativité égal à l'unité (modèle binaire réversible) vont obéir à la relation
suivante (Chang, L.H. et al, 1984):
âCp(T) [9]
1'/ quantité de protéine impliquée dans le processus de dénaturation (mole) .:1H enthalpie molaire (kJ· mole-1
)
R constante des gaz parfaits (0.008314 kJ· mole-1 . K1) Tm température de transition (1<) .:1Cp variation de la capacité calorifique (kJ . K1) T température (K)
Il est à remarquer que, selon cette équation, Tm et â H sont les seuls paramètres
qui déterminent la forme de la transition. La relation âCp vs T, ainsi exprimée, est
indépendante de la vitesse de balayage. La relation est symétrique par rapport à la
température de transition. Cette symétrie est illustrée à la figure 1 qui utilise cette
équation [9]. Le rapport de coopérativité étant égal à l'unité, âH = âHcal = âHvH. Les
transitions réversibles plus complexes font souvent intervenir des variantes de cette
même équation.
11
ii) Phénomène irréversible
Le passage d'un état natif (N) à un état dénaturé de façon irréversible (1) et
obéissant à des lois cinétiques simples peut s'illustrer par:
kapp : constante de vitesse (S-1)
Cette expression est la simplification du phénomène suivant:
[10]
Lorque k3 > > > k2, la majorité des molécules dans l'état D sont converties en
état 1 au lieu de N, d'où l'absence d'équilibre entre les états N et D. Le processus
de dénaturation irréversible illustré par l'équation [10] montre assez bien que la
dénaturation irréversible d'une protéine n'est pas un processus complètement
différent d'un mécanisme réversible; cette irréversibilité n'est souvent qu'associée à une étape finale lors d'une transition thermique. Les causes de cette irréversibilité
sont nombreuses, mais on peut les regrouper en deux classes principales: soit un
processus covalent, ou bien une modification de la structure de la protéine. (Wetzel,
R. et al, 1990; Freire, E. et al, 1990).
Contrairement aux transitions réversibles, il y a peu de principes généraux
régissant l'interprétation des transitions irréversibles (Freire, E. et al, 1990), mais les
cas simples (Sanchez-Ruiz, J.M. et al, 1988) peuvent être décrits par:
1ère hypothèse: L'ordre (n) de la réaction est égal à l'unité.
dN = -k N n = k N app - app dt
[11 ]
~me hypothèse: La variation de la constante de vitesse (kapp) en fonction
de la température obéit à une loi d'Arrhénius.
12
( -Eal kapp (T) = A exp RT [12]
t temps (s) A facteur de collision (S-l) Ea énergie d'activation (kJ· mole-1)
kapp(t) constante de vitesse (S-l) T température (1<)
Des cas plus complexes ont été envisagés. Sanchez-Ruiz, J.M. (1992) a décrit
des réactions d'ordre (n) différents de l'unité. Galisteo, M.L. et al (1991) ont observé
que la relation entre kapp et T diffère parfois de la relation d'Arrhénius.
Lorsque la dénaturation est observée par la variation de capacité calorifique
(âCp), il est possible, en utilisant les équations [11] et [12] d'obtenir une relation
entre â Cp et T en applicant les deux hypothèses mentionnées plus haut:
â Cp(T) = fi A â Hcal exp [- Ea - A r exp [- Ea l dT 1 [13] v RT v~i RT
Conejero-Lara F. et al (1991) en intégrant cette équation [13] ont exprimé le
même comportement par la relation suivante:
âCp(T) = fi EaâHcalexp [EaâT] exp [-exp [EaâT]l [14] RT2 RT2 RT2
m m m
A
1/ p
Ea âHCal
Tm âT=T-Tm
facteur de collision (S-l) quantité initiale de protéine (mole) vitesse de balayage (K· S-l) énergie d'activation (kJ· mole-1)
enthalpie calorimétrique (kJ· mole-1)
température de transition (K)
13
Dans l'équation [14], la température de transition (Tm) regroupe certaines
variables cinétiques et masque l'influence de certains paramètres (l'effet de la vitesse
de balayage entre autres). Le passage de l'équation [13] à [14] amène également
les auteurs à des simplifications, limitant sa validité au voisinage de la température
de transition. Le graphique de cette équation [14] est montré à la figure 2. Cette
schématisation de la dénaturation selon un modèle binaire irréversible est nettement
différent du modèle de la figure 1 (modèle binaire réversible) par son asymétrie.
CI) :::l 0" -.... 0 cu 0 Or
oo(l)
/ -0 CU a. CU 0
T CI)
"'0
C 0 - â Cp(T) CU .... ~ TI Tf
20 30 40 50 60 70 80
Température, T (OC)
Figure 2: Figure de principe illustrant la dénaturation thermique d'une protéine selon le modèle d'une transition irréversible entre deux états.
L'obtention des paramètres cinétiques Ea et In(A), à partir de données
calorimétriques (modèle binaire irréversible) peut s'effectuer de deux façons selon
que l'on utilise a) un thermogramme simple b) des thermogrammes multiples
obtenus dans les mêmes conditions mais à des vitesses de balayage différentes.
Ces deux méthodes, ont été développées par Sanchez-Ruiz, J.M. et al (1988).
14
Thermogramme simple: A partir d'une seule transition thermique, il est possible
d'évaluer, à une température donnée, la constante de vitesse:
p
T
~Cp(T)
Or O(T)
vitesse de balayage (K· S·I) température quelconque (K) variation de capacité calorifique à une température T (}JJ . KI) aire sous la courbe (quantité de chaleur associée à la transition (}JJ)
[15]
aire sous la courbe jusqu'à une température T (quantité de chaleur associée à la
transition jusqu'à une température T) (}JJ) constante de vitesse (S·I)
La signification des termes est schématisée à la figure 2.
Les paramètres cinétiques Ea et In(A) sont obtenus par une solution graphique
simple de la loi d'Arrhénius.
Thermogrammes multiples: Lorsque l'on dispose de plusieurs thermogrammes
obtenus à des vitesses de balayage différentes, Sanchez-Ruiz, J.M. et al (1988)
utilisent l'équation [16]:
v = AR exp[- Ea 1 T 2 Ea RTm m
[16]
Les paramètres cinétiques Ea et In(A) sont obtenus par régression linéaire dans
l'espace graphique In(v jT m 2) vs 1 jT m' La pente de cette régression correspond à -EajR et l'ordonnée à l'origine à In(ARjEa).
Le tableau 1 résume les caractéristiques du modèle thermodynamique et du
modèle cinétique de dénaturation thermique.
15
Tableau 1
Comparaison des deux principaux modèles de dénaturation thermique: cas de la relation ACp en fonction de la température
Paramètres considérés
Réversibilité de la transition
Effet de la vitesse de balayage
Forme de la transition (transition simple)
Paramètres mesurés
Variables contrôlées modifiant la forme de transition 1
Modèle thermodynamique
réversible
aucun effet majeur
symétrique
la concentration2
Modèle cinétique
irréversible
modification de la température de transition
asymétrique
Ea, A, A Hcal
v, la concentration3
On exclut ici les variables telles: variation de pH, de force ionique, ajout de ligand etc. 2 La concentration de protéine peut avoir une influence sur la température de transition lors de
phénomène de dissociation ou d'agrégation réversible par exemple (Manly, S. et al, 1985).
3 La concentration de protéine a un effet sur les transitions pour des ordres de dénaturation différents de l'unité (Sanchez-Ruiz, J.M., 1992).
L'approche cinétique de la transition thermique est relativement récente dans
le domaine des protéines. Largement utilisée et documentée en chimie analytique
et en thermochimie, cette approche à partois fait l'objet de certaines critiques (Arnold
M. et al, 1979).
16
2.2 Matériel biologique utilisé
L'actine et la phalloïdine constituent les deux molécules utilisées dans cette
étude et sont décrites dans les sections suivantes.
2.21 Actine
L'actine est une protéine impliquée dans plusieurs phénomènes tels la
contraction musculaire ou la formation du cytosquelette. Cette protéine existe sous
deux aspects; la forme globulaire (actine G) et la forme filamenteuse (actine F).
extr'mlt6 de nette
polymérle.tlon (barbue)
actlne 0
exlr6mlt6 de nette
d6polym6rle.tlon (pointue) 5 .5 nm
7 .0 nm
T 37.5 nm
..1 1 T
Figure 3: Schéma illustrant certaines caractéristiques de l'actine G et F.
L'actine G est une protéine globulaire, son poids moléculaire est de 42,5 kOa.
Le monomère d'actine comprend 375 acides aminés (Korn, E., 1982). Le monomère
a une forme ovoïde d'environ 3.5 par 5.5 nm et une charge nette négative. Sa
structure, déterminée par diffraction des rayons X, est schématisée à la figure 4
(Kabsch, W. et al, 1990). L'actine G est composée de deux domaines; ses deux
extrémités (amino et carboxy terminal) sont historiquement situées dans le plus petit
domaine, bien que la figure 4 montre que les deux domaines semblent être de
mêmes dimensions. L'actine G possède normalement un nucléotide, l'ATP et un
cation divalent (généralement un ion calcium) à un site spécifique. Kabsch, W. et al
(1990) ont montré que le site ATP se situe entre les deux domaines de l'actine. Les
groupes phosphates du nucléotide interagissent avec la ser 14, gly 15 et leu 16 du
17
"petit" domaine tandis que la partie nucléoside interagit avec divers sites se situant
sur le "grand" domaine. Ces auteurs n'ont pu préciser la nature des liaisons des
interactions spécifiques entre les acides aminés et l'ATP (Kabsch, W. et al, 1990).
t 2 3 " S 6 10 1617 76103129 1S31S217620122S2602612n279287297299358J65
OEOETTClVtTVlNt.lVNTIAYINt.lTA
. 0001 AV .. CVYTWTlTO A lCFVTlSS
l' . E E E 1
Figure J Schematic representation of the structure of actin (51). A TP and Ca' ~ are located between the small (righ/) and large (Iefl) domain . Solid circles indicate the posItion of amlno acid differences bet",een mammalian cytoplasmic actins and rabbit skeletal muscle actln (120). The first residue is absent in the cytoplasmic acti ns.
Figure 4: Structure du monomère d'actine (tiré de Kabsch, W. et Vandekerckhove, J., 1992).
Le cation se trouve inséré profondément à l'intérieur d'une poche hydrophile
formée à la fois par les groupes phosphates du nucléotide ainsi que par les résidus
Asp 11 Gin 137 et Asp 154 de l'actine. Toutefois, ces résidus semblent n'avoir qu'un
rôle secondaire dans la coordination de l'ion Ca+2 car les distances séparant le Ca+2
de ces acides aminés sont relativement grandes. La présence de ce cation est
essentiel à la structure compacte de l'actine G (Valentin-Ranc, C. et Carlier, M.F. ,
1991). L'actine G a aussi des sites de faibles affinités pour des cations mono- di- et
trivalent. L'occupation de ces sites secondaires réduit la charge négative de l'actine
et induit la polymérisation.
18
L'actine F est un polymère de l'actine G. La polymérisation commence par une
phase de nucléation et se poursuit par une phase d'élongation du filament. La
croissance s'effectue aux deux extrémités, mais à des vitesses différentes. Une
molécule d'ATP est hydrolysée lors de la polymérisation.
La structure du filament illustrée à la figure 3 est semblable à deux brins
torsadés formant une double hélice, le pas de l'hélice est de 37.5 nm et contient 13
monomères distant de 5.5 nm (Korn E., 1982). Les monomères à l'intérieur du
filament interagissent entre eux par des liens hydrophobes et quelques ponts salins
semblent possibles (Holmes K.C. et al, 1990).
Le phénomène de polymérisation est dans une certaine mesure réversible.
Plusieurs facteurs interviennent et modifient l'équilibre entre la forme globulaire et la
forme filamenteuse de l'actine. La présence de cations est un des facteurs
prédominants. D'autres facteurs peuvent aussi intervenir tel la concentration d'actine,
la température, le type de solvant etc ... Kasai, M. et al, (1962) ont montré qu'au-delà
d'une concentration critique, la forme filamenteuse est favorisée. Ces mêmes auteurs
ont montré que l'augmentation de température diminue cette concentration critique
(du moins sur une plage de température de O°C à 20°C). La transition globulaire
à la forme filamenteuse est donc endothermique. A température plus élevée, la
concentration critique ne sera pas affectée de la même façon car l'actine peut se
dénaturer. Des études semblables ont été effectuées sur la flagelline, une protéine
qui, comme l'actine, polymérise. Ces études ont montré que dans le cas de la
flagelline, la vitesse de polymérisation maximale est atteinte aux environs de 25-27°C
(Oosawa, F. et Asakura, S. , 1975). Un comportement similaire peut être envisagé
pour l'actine F bien qu'il ne semble pas avoir été vérifié.
2.22 Phalloïdine
La phalloïdine est un des six heptapeptides bicycliques de la classe des
phallotoxines. Son poids moléculaire est de 789 Da. La figure 5 schématise la
structure moléculaire du groupe des phallotoxines. Ces toxines proviennent de
champignons mortels tels l'amanite phalloïde et l'amanite vireuse. La structure
bicyclique confère à la phalloïdine une configuration assez rigide plus
19
particulièrement dans la région Trp 6 et Cys 3. Cette région est essentielle à la
toxicité de la phalloïdine (Kessler, H. et Wein, T. , 1991). L'action toxique de la
phalloïdine se situe au niveau des hépatocytes. Elle provoque une polymérisation
massive de l'actine des hépatocytes ce qui entraîne une altération des fonctions
hépatiques (Wieland, Th., 1986).
H
3 Cys 4 hydroxy Pro
PHALLOTOXINES R,
Ph.llo 'idlne OH
Ph.llo ! n. H
Phaillaina OH
Phallac ldlne OH
Phall ine e H
R2 R3
H CH3
H CH.
OH CH.
H CH(CH 3 )z
H CH(CH.)2
Figure 5: Principales phallotoxines provenant d'amanites.
R, Rs
CH3 OH
CH. OH
CH. OH
COzH OH
CH. H
Cette propriété qu'a la phalloïdine de se lier à l'actine a permis de créer des
outils d'études qui ont contribué à élucider certains aspects fondamentaux de la
polymérisation de l'actine (Cooper, J., 1987). L'utilisation de la phalloïdine liée à la
rhodamine comme marqueur fluorescent a permis de mettre en évidence la
20
présence de filaments d'actine dans des cellules (Wieland, Th., 1986). La phalloïdine
a été aussi utilisée pour stabiliser la forme filamenteuse lors de l'étude
cristallographique du filament d'actine (Holmes, K. et al, 1990).
2.23 Interaction entre l'actine et la phalloïdine
L'action toxique de la phalloïdine est due en grande partie à sa capacité de se
lier à l'actine. La phalloïdine va se fixer plus spécifiquement à l'actine filamenteuse
(actine F) et ce, entre ses deux domaines, près du site ATP (Hegyi, G. et al, 1986).
Par contre, la phalloïdine ne se fixe pas sur l'actine G. Selon Thelestam, M. et Gross,
R. (1990), cette spécificité pour l'actine F indiquerait que certaines régions entres les
deux sous-unités ou domaines deviennent plus accessibles à la phalloïdine suite au
changement de conformation des monomères d'actine induit par la polymérisation
(de la forme G à la forme F). Selon ces mêmes auteurs, les rapports molaires de
l'interaction entre la phalloïdine et l'actine seraient de l'ordre de l'unité. Cependant,
Miyamoto, Y. et al (1986) mentionnent un rapport molaire phalloïdine:actine de 1 :2.
Cette interaction entre l'actine et la phallo·idine, en plus de diminuer la concentration
critique de l'actine, réduit de beaucoup la vitesse de dissociation du filament en
monomères (Sampath, P. et Pollard, T.D., 1991; Wendel, H. et Dancker, P., 1986).
Cette stabilisation protège le filament d'actine contre le clivage protéolytique
(Pollender, J. et Gruda, J., 1979; De Vries, 1 et Wieland, Th., 1978), contre la
dépolymérisation aux ultra-sons (Dancker, P. et al, 1975), la DNase 1 (Schâfer, A. et
al, 1975), la cytochalasine B (Law, 1. et al, 1975) ainsi que contre la dénaturation
thermique (De Vries, 1. et al, 1976; Le Bihan, T. et Gicquaud, C., 1991). Les
mécanismes d'interactions entre la phalloïdine et l'actine ne sont pas clairement
définis mais il semble que cette interaction (Kd = 10·sM) ne soit pas covalente
(Thelestam, M. et Gross, R., 1990).
2.3 Études antérieures de la dénaturation thermique de l'actine
Les premières études de dénaturation thermique de l'actine ont commencé au
début des années 70. De nombreux résultats ont été obtenus, mais sont très
variables, ce qui laisse place à de nombreuses interprétations.
21
2.31 Revue de la littérature
La dénaturation thermique de l'actine a surtout été étudiée avec l'actine G. Peu
de travaux ont été effectués sur l'actine F. La plupart des auteurs qui ont étudié la
dénaturation thermique de l'actine s'entendent pour dire que cette dénaturation est
irréversible (Lehrer, S. et Kerwar, G., 1972; Kuznetsova, I.M. et al, 1988; Bertazzon,
A. et al, 1990; Ikeuchi, Y. et al, 1990); par contre C.C. Contaxis et al (1977) ont
montré que l'actine G peut se dénaturer de façon réversible. Basé sur cette étude
de C.C. Contaxis, certains auteurs (Tatunashvili, L.V. et Privalov, P.L., 1984;
Bertazzon, A. et al, 1990) admettent que la dénaturation thermique de l'actine peut,
dans certaines conditions, se décrire par des paramètres purement
thermodynamiques. La réversibilité de la dénaturation de l'actine G est toutefois
sévèrement critiquée par Kuznetsova, I.M. et al (1988) .
La majorité des auteurs s'entendent pour dire que l'actine G se dénature
partiellement mais de façon irréversible lorsqu'elle est chauffée à haute température.
Ce même état partiellement dénaturé peut également être obtenu si on retire le
cation divalent (Ca+ 2) de l'actine (Bertazzon, A. et al, 1990). L'état complètement
dénaturé ou déployé peut être obtenu, sans apport calorifique, en présence de
chlorure de guanidium ou d'urée (Bertazzon, A. et al, 1990; Lehrer, S. et Kerwar, G. ,
1972).
Les chercheurs qui se sont penchés plus en détail sur les mécanismes de
dénaturation affirment que la dénaturation thermique de l'actine G n'obéit pas à un
mode de dénaturation binaire réversible (Tatunashvili, L.V. et Privalov, P.L., 1984;
Bertazzon, A. et al, 1990;) mais ils ont considéré malgré tout que cette transition
peut être décrite par des paramètres purement thermodynamiques. L.V. Tatunashvili
et Privalov, P.L. (1984) prétendent que l'actine G est composée de deux sous-unités
ou domaines interagissant entre eux tandis que A. Bertazzon et al (1990)
considèrent plutôt deux sous-unités non-interactives qui se dénaturent de façon
indépendante. Le tableau 2 présente, en ordre chronologique, une synthèse de ces
différents points de vue.
Les plus grandes divergences se situent surtout au niveau de l'évaluation des
22
températures de transition qui sont présentées au tableau 3. Ces études ont toutes
été effectuées par calorimétrie différentielle à balayage (D.S.C.). Certaines
recherches effectuées par spectrofluorométrie sont arrivées à la conclusion que
l'actine G n'aurait pas de température de transition (Lehrer, S. et Kerwar, G., 1972).
Ce dernier point, bien que surprenant, peut être l'indice que certaines lois cinétiques
puissent intervenir dans la dénaturation thermique de l'actine G.
Tableau 2
Bref historique de l'étude de la dénaturation thermique de l'actine G
Auteurs
Lehrer, S.S. et Kerwar, G. (1972)
Contaxis, C.C. et al (1977)
Fausnaugh, J.L. et al (1984)
Tatunashvili, L.V. et Privalov P.L. (1984)
Kuznetsova I.M. et al (1988)
Bertazzon, A. et al (1990)
Commentaires
-Montre par variation d'intensité de fluorescence que l'actine G n'a pas une Tm définie.
-L'actine G se dénature de façon réversible (étude par C.D. et U.V.). Tm = 57.1 oC; v non précisée.
-Étude par D.S.C., Tm = 80°C; v = 600°C/h.
-Étude par D.S.C., Tm = 66°C; v = 120°C/h. Montre que l'actine ne se dénature pas selon le modèle de dénaturation réversible en deux étapes. Suggère que les deux sous-unités interagissent entre elles.
-Étude par variation d'intensité de fluorescence. Montrent que la dénaturation est irréversible, Tm = 58-59°C; v inconnue. Contredit les travaux de Contaxis C.C. et al (1977).
-Montre l'irréversibilité de la dénaturation de l'actine G, mais considère une approche thermodynamique. Tm = 57.2°C, v = 30°C/h. L'actine est composée de sous-unités qui se dénaturent de façon indépendante.
23
L'approche thermodynamique ne peut expliquer les variations de la température
de transition de l'actine G (de 57 à 80°C au tableau 3). Une approche cinétique,
utilisant l'équation [16], associe la température de transition à la vitesse de balayage.
Cette relation, montrée à la figure 6 dans un espace graphique In(v /T m 2) vs 1 /T m'
est typique des phénomènes irréversibles sous dépendance de paramètres
cinétiques.
Tableau 3
Températures de transitions de l'actine G obtenues par différents auteurs
Auteurs
Bertazzon, A. et al (1990) Le Bihan T. et Gicquaud, C. (1991) Tatunashvili L.V. et Privalov, P.L. (1984) Fausnaugh J.L. et al (1984)
57.2 59.5 66 80
vitesse de balayage (v) (oC/h)
30 40 120 600
-13~----------------------------------------~ • Fausnaugh J.L. et al (1984)
-14 ~
-(\lE
t::,-15 ~ Tatunashvili. L.V . et Privalov, P.L. (1984).
~ -C
-16 .. Le Bihan T. et Gicquaud C. (1991) •
Berfazzon A. et al (1990).
-17~------~'~------~'~------~'--------~'------~ 2 .80 2.85 2.90 2.95 3.00 3.05
(1/T m) . 1000/K-1
Figure 6: Relation, selon l'équation [16], entre la température de transition (Tm) de l'actine G et la vitesse de balayage (v) . Les paramètres de base, provenant de différents auteurs, sont présentés au tableau 3.
24
Les études de dénaturation thermique de l'actine F sont peu nombreuses (Sano,
T. et al 1989; Ikeuchi, Y. et al, 1981; Bertazzon, A. et al, 1990; Le Bihan T. et
Gicquaud, C., 1991). Les auteurs s'accordent sur le fait que la structure filamenteuse
confère une plus grande thermostabilité à l'actine F (Bertazzon, A. et al, 1990; Le
Bihan, T. et Gicquaud, C., 1991). L'application de lois cinétiques à la dénaturation
thermique de l'actine F a été considérée par Y. Ikeuchi et al (1981).
Les travaux de A. Bertazzon et al (1990) sont les plus récents et les plus
approfondis et méritent d'être analysés en détail.
2.32 Analyse critique du modèle de Bertazzon
L'étude de Bertazzon, A. et al (1990) sur la dénaturation thermique de l'actine
mérite une attention particulière car elle est très récente et c'est une des rares
études qui tente de quantifier la dénaturation thermique de l'actine G. L'analyse que
nous présentons est basée sur l'article de ces auteurs paru dans la revue
Biochemistry 29, 291-298 (1990).
Les auteurs ont tout d'abord étudié la dénaturation thermique de l'actine G. Les
paramètres thermodynamiques utilisés sont présentés au tableau 4. Un rapport de
coopérativité de 0.7 a été mesuré et ce rapport est associé à l'indépendance de la
dénaturation des deux sous-unités de l'actine.
Tableau 4
Paramètres thermodynamiques de la dénaturation thermique de l'actine utilisés par Bertazzon, A. et al, 1990.
Actine G transition 1 transition 2
Actine F transition unique
52.3 56.7
67.2
âH kCal/mole1
44 107
180
Les unités de l'enthalpie molaire sont les unités utilisées par les auteurs
(1 calorie = 4.18 joules)
25
Les auteurs considèrent que les variations d'enthalpies associées à la
dénaturation de chaque sous-unité sont directement proportionnelles au poids
moléculaire de chacune de ces sous-unités, selon l'ordre de grandeur des poids
moléculaires proposés par Jacobson G.R. et Rosenbush, J.P. (1976). Bertazzon, A.
et al, considèrant que la grande sous-unité est au moins deux fois plus grosse que
la petite sous-unité, associent une enthalpie de dénaturation de 44 kCal/mole à la
petite sous-unité et une enthalpie de 107 kCal/mole à la grosse sous-unité.
La figure 7 montre les résultats expérimentaux et les régressions obtenues par
les auteurs en utilisant les paramètres du tableau 4 dans l'équation [9]. L'écart entre
les courbes 4CP1 et 4CP2 est directement associé à l'hypothèse d'indépendance des
deux sous-unité et aux poids moléculaires attribués à chaque sous-unité. La courbe
théorique cumulée (4CP1 + 4CP2) reproduit fidèlement le tracé expérimental au
voisinage des températures de transition mais s'en écarte légèrement pour des
températures inférieures à 50 0 C et supérieures à 60 0 C.
20p--------------------------------------------.
15 -~ o 10 E
-a. Q
courbe Tm 6 H
no (oC) (kCal/mole)
6 CP1 52.3
6 CP2 56.7
44
107
o valeurs expérim.
relation théor.
-5~--~--~--~----~--~--~--~----~--~--~ 25 30 35 40 45 50 55 60 65
Température,T (OC)
70 75
Figure 7: Tracé calorimétrique associé à la transition thermique de l'actine G obtenu par A. Bertazzon et al (1990) et interprétation thermodynamique du phénomène selon ces auteurs. Les paramètres indiqués sur la figure, fournissent par l'équation [9] , les valeurs de
~CP1 et ~CP2 illustrés graphiquement.
26
Les travaux de W. Kabsch et al (1990) ont montré depuis, que les poids
moléculaires proposés par Jacobson G.R. et Rosenbush, J.P. (1976) et utilisés par
Bertazzon, surestiment la différence entre les deux sous-unités; l'analyse structurale
poussée au niveau atomique ne montre en fait que très peu de différence entre les
tailles de ces sous-unités. Si cette observation n'infirme pas complètement les
hypothèses de base de la théorie de la dénaturation indépendante des sous-unités,
elle remet en question la répartition de l'enthalpie sur la base de leur poids
moléculaire.
L'approche cinétique de Conejero-Lara F. et al (1991), appliquée aux données
de Bertazzon permet d'obtenir, sans hypothèse contraignante, une reproduction
assez fidèle du tracé calorimétrique. La figure 8 compare la solution numérique de
l'équation [13] aux résultats expérimentaux de Bertazzon. Les paramètres cinétiques
ont été obtenus par la relation d'Arrhénius et ka pp a été évalué selon l'équation [15]
en utilisant la vitesse de balayage mentionnée par Bertazzon, soit: 30°Cjh.
L'asymétrie du tracé est parfaitement respectée sans faire intervenir l'hypothèse de
l'indépendance de la dénaturation des deux sous-unités.
20~-------------------------------------------,
ct! Ü 5 ~ -a. Ü
Energie d'activation, Ea : 273 kJ/mole
Facteur de collision, A : 4' 1040 S-1
o valeurs expérim.
- relation théor.
-5~--~--~--~----~--~--~--~----~------~ 25 30 35 40 45 50 55 60 65
Température,T (OC)
70 75
Figure 8: Interprétation cinétique du tracé calorimétrique associé à la transition thermique de l'actine G obtenu par A. Bertazzon et al (1990). Interprétation selon l'équation [13]. Les paramètres cinétiques sont obtenus d'une relation d'Arrhénius, kapp est calculée selon l'équation [15] .
27
Bertazzon, A. et al (1990) ont également tenté une approche thermodynamique
de la dénaturation de l'actine F présentée en figure 9. Les auteurs ont utilisé
l'équation [9] dont les hypothèses implicites sont celles du modèle binaire réversible.
La courbe théorique ne peut reproduire l'asymétrie des données expérimentales, car
dans le modèle de Bertazzon, cette asymétrie est associée à l'indépendance de la
dénaturation des sous-unités (indépendance non applicable à l'actine F).
-~ ........
0 E
........
«S () ~ -a. ()
50p---------------------------------------------~
0
Température de transition, Tm : 67.2 0 C Enthalpie molaire, /:,. H: 180 kCal/mole
DO
o
o valeurs expérim.
- relation théor.
DO
-10~------~----~~----~~----~------~------~ 50 55 60 65 70 75 80
Température,T (OC)
Figure 9: Tracé calorimétrique associé à la transition thermique de l'actine F obtenu par A. Bertazzon et al (1990) et interprétation thermodynamique du phénomène selon ces auteurs. La courbe en continue est obtenue par l'équation [9] et représente une transition réversible entre deux états.
28
L'application du modèle cinétique aux données de Bertazzon obtenues sur
l'actine F est montrée à la figure 10. La concordance entre la solution numérique de
l'équation [13] et les données expérimentales est quasi parfaite et l'asymétrie est
totalement respectée.
-~ "-
0 E "-ëij 0 ~ -c. 0
50~------------------------------------------~
0
Energie d'activation, Ea : 526 kJ/mole
Facteur de collision, A : 2.7.1078 S-1
DO
o valeurs expérim.
- relation théor.
-10~----~~----~--------------~------~----~ 50 55 60 65 70 75 80
Température,T (OC)
Figure 10: Interprétation cinétique du tracé calorimétrique associé à la transition thermique de l'actine F obtenu par A. Bertazzon et al (1990). Interprétation selon l'équation [13]. Les paramètres cinétiques sont obtenus d'une relation d 'Arrhénius, kapp est évalué selon l'équation [15] .
L'utilisation de lois cinétiques pour la description de la dénaturation thermique
de l'actine G et F peut expliquer des résultats à priori différents, et permet de mettre
en évidence l'importance de certaines variables jusqu'ici négligées. La justesse de
ces applications semble confirmer que la dénaturation thermique de l'actine G est
sous dépendance cinétique et explique l'influence de la vitesse de balayage sur la
température de transition mesurée en calorimétrie (influence montrée à la figure 6).
29
2.33 Dénaturation de l'actine en présence de phalloïdine
L'effet protecteur de la phalloïdine contre la dénaturation thermique de l'actine
est souvent mentionné dans la littérature mais n'a fait l'objet que de très peu de
recherches. De Vries, 1. et al (1976) ont fait une description qualitative du
phénomène en mesurant les différences de spectres d'absorbance de l'actine Fen
présence ou en absence de phalloïdine. Ces auteurs ont remarqué que l'actine Fen
présence de phalloïdine est protégée contre la dénaturation thermique à 70°C*.
Notre recherche bibliographique semble montrer que notre étude est une des rares
recherches quantitatives (sinon la seule) sur ce sujet. Certains éléments de cette
étude ont déjà été publiés (Le Bihan, T. et Gicquaud, C., 1991) et font l'objet d'une
section particulière au chapitre 5 qui présente les résultats obtenus ainsi que leur
discussion.
* Ces auteurs ont vérifié l'effet thermostabilisant de la phalloïdine sur l'actine F pour une période
de 3 minutes.
30
3 MATÉRIEL ET MÉTHODES
Ce chapitre se veut un reflet le plus fidèle possible de la méthodologie utilisée.
Afin d'alléger et de faciliter la compréhension des protocoles expérimentaux, certains
aspects particuliers seront présentés au chapitre 5 (résultats et discussion).
3.1 Matériel biologique
Dans cette section, nous détaillons la méthode de préparation et la purification
du matériel biologique utilisé. La préparation finale de chacun des échantillons
dépend de chaque type d'essai et est donc abordée dans les sections pertinentes.
3.11 Préparation de l'actine
L'actine du muscle strié de lapin a été purifiée à partir de la poudre acétonique
selon la méthode de Pardee et Spudich (Pardee, J. et Spudich, J., 1982). L'actine
a été maintenue dans le tampon suivant: Tris-HCI 2 mM, pH 8.0, ATP 0.2 mM, CaCI2
0.2 mM, ~-mercaptoéthanol 0.5 mM et azoture de sodium 0.02%. La concentration
de l'actine G a été déterminée par spectroscopie d'absorption U.V. visible (E1%290nm
= 6.3).
3.12 Préparation de la phalloïdine
La phalloïdine a été extraite du champignon Amanita virosa et elle a été purifiée
selon la méthode de Yocum (Yocum, RR et Simons, D.M., 1977) modifiée par
Turcotte (Tu rcotte , A., 1982).
3.2 Calorimétrie différentielle à balayage
Dans cette étude, deux types de calorimètres différentiels à balayage ont été
utilisés: soit un calorimètre à compensation de puissance, ainsi qu'un calorimètre à
conduction de chaleur. Le schéma de la figure 11 illustre le principe des deux types
de calorimètres.
DSC à compensation de puissance
ContrOle différentiel de la température
qui minimise la différence de température
entres ln 2 cellules
1 échantillon référence
t t Augmentation de la température
• un taux déterminé
Différence de puissance
DSC à conduction de chaleur
Signal enregistré (voltage) proportionnel
au flux de chaleur pauant de la source
thermique aux cellules
échantillon référence
t t Augmentation de la température
• un taux déterminé
Différence de flux de chaleur
Figure 11: Principaux types de calorimètres différentiels à balayage.
31
Le calorimètre à compensation de puissance est un appareil qui a
généralement deux cellules, une cellule échantillon qui contient la substance à étudier dans un tampon, et une cellule de référence qui ne contient que le tampon.
Ce type d'appareil fonctionne à partir de deux boucles de rétroaction. La première
boucle de rétroaction augmente la température de la cellule référence à une vitesse
déterminée. La deuxième boucle minimise la différence de température entre les
deux cellules en fournissant plus ou moins de puissance à la cellule échantillon. La
différence de puissance reflète directement la différence de capacité calorifique entre
les deux cellules selon la relation suivante:
ACp = AP [17] v
ÂCp variation de la capacité calorifique (jJJ . KI) ÂP différence de puissance entre les deux cellules (JlJ . S·I)
JI vitesse de balayage (K· S·I)
32
Le Microcal Mc-1 est un de ces types d'appareils. La principale qualité d'un tel
appareil est qu'il possède un temps de réponse très faible (entre 15 et 45 s). Des
temps de réponses élevés modifient les transitions thermiques mesurées qui doivent
alors être corrigées à l'aide d'algorithmes complexes.
Le calorimètre à conduction de chaleur est un appareil de construction plus
simple et peut donc être fabriqué à moindre frais (Ross, P. et Goldberg, R.N., 1974).
Sa simplicité augmente de beaucoup sa versatilité, par exemple, il est possible de
l'utiliser en mode isothermal ou en mode de titration calorimétrique (Bastos, M. et al, 1991). Les cellules échantillons et la cellule référence sont à l'intérieur d'un puits
thermique, généralement un bloc de métal. La température de ce bloc augmente de
façon linéaire en fonction du temps. Des senseurs thermiques, (thermopiles à multijonctions du type effet Peltier) isolent les cellules du puits thermique. La chaleur
passant de la source thermique aux cellules, le fait à travers de ces senseurs
thermiques. Le flux de chaleur passant du bloc de métal à une cellule est converti
en signal analogique par les senseurs thermiques. Ge signal est associé à la
capacité calorifique de la cellule d'intérêt par calibration. Le temps de réponse élevé
(entre 120 et 180 s), oblige à interpréter le signal à l'aide d'algorithmes élaborés, afin
de corriger la distorsion des données expérimentales.
3.21 Préparation des échantillons
Les solutions de travail les plus courantes sont présentées de façon succinte.
L'actine globulaire a été maintenue dans le tampon suivant:
Tampon G: - Tris-HGI 2 mM, pH 8.0
- ATP 0.2 mM
- CaCI2 0.2 mM
- ~-mercaptoéthanol 0.5 mM
- azoture de sodium 0.02%
La forme filamenteuse de l'actine a été obtenue par ajout d'un mélange de KCI
et de MgGI2 pour obtenir une concentration finale de KGI à 100 mM et de MgCI2 à 2 mM.
33
Solution saline: - 2.5 ml KCI 3 M
- 1.5 ml MgCI2 0.1 M
- 6 ml de tampon G
Pour l'étude de l'interaction entre la phalloïdine et l'actine, un tampon G deux
fois plus concentré a été préparé.
La phalloïdine a été diluée dans de l'eau distillée jusqu'à une concentration de
0.66 mg/ml.
Le tableau 5 présente les solutions de travail utilisées lors de l'étude de l'effet
de la phalloïdine sur la transition thermique de l'actine.
Tampon G: Tampon G 2X: Solution saline: Solution Ph/eau:
Tableau 5
Solutions de travail
Avec phalloïdine sin 1
1.1 ml 1 ml 1 ml 1 ml Ph
Sans phalloïdine sin 2
1.1 ml 1 ml 1 ml 1 ml eau
Les solutions de travail ont été obtenues en mélangeant dans des proportions
désirées les solutions sin 1 et sin 2 pour un volume total d'environ 2 ml. Ces
solutions de phalloïdine ont été mélangées par la suite à une solution d'actine. Dans
le cas de la préparation de solution d'actine G en présence de phalloïdine, on a
remplacé le volume de solution saline par un volume égal de tampon G.
Pour les essais calorimétriques, les échantillons ont tous été dégazés. Le
dégazage a été effectué avec la solution d'actine G. L'actine F était produite par
polymérisation de l'actine G dans des solutions salines également dégazées. Les
solutions d'actine F se sont révélées trop visqueuses pour un dégazage simple et
efficace. Dans le cas de l'actine F, une attente minimum de 20 min a été respectée
34
pour permettre la polymérisation complète, avant l'essai proprement dit. Les
échantillons ont été dégazés pendant 3 à 5 minutes. Les pertes dues à l'évaporation
ont été contrôlées en comparant la masse des solutions avant et après dégazage.
Généralement, la différence entre les deux pesées était négligeable, moins de 5% de
la masse de solution.
Dans le cas de l'actine G, en plus du protocole général, une centrifugation
supplémentaire de 2 heures à 40 000 rpm a permis d'éliminer d'éventuelles formes
polymérisées ou dénaturées.
3.22 Utilisation du calorimètre Microcal Mc-1
Les volumes utilisés ont été de 0.918 ml de solution d'actine pour une
concentration d'environ 3 mg/ml. La vitesse de balayage a été de 40°C/h pour tous
les essais réalisés avec ce type d'appareil. Les données calorimétriques ont été obtenues par un tracé graphique de la variation de capacité calorifique (~Cp) vs la
température (T). L'intégration de la surface sous la courbe a été effectuée par
découpage et pesée du tracé de la transition sur papier. La ligne de base des tracés
consistait dans ce cas, en une ligne droite reliant une température initiale et une
température finale de transition, déterminées visuellement.
3.23 Utilisation du calorimètre Hart 7707
Trois échantillons pouvaient être étudiés simultanément, la base de référence
a été obtenue par essais sur le tampon correspondant à chaque échantillon. La
masse des solutions, mesurée était de l'ordre de 0.50 ± 0.001 g. Tous les
thermogrammes ont été corrigés pour l'effet du temps de réponse de l'appareil selon
la méthode de Tian (Schwarz, F.P., 1989).
3.3 Variation d'intensité de fluorescence
La méthode utilisée est propre à notre étude et certaines adaptations ou
contraintes sont spécifiques au matériel biologique utilisé. La variation d'intensité de
fluorescence intrinsèque a été utilisée pour quantifier l'effet du temps sur la
35
dénaturation thermique de l'actine. Les protocoles de préparation sont spécifiques
à chaque type d'actine et sont présentés dans les sections suivantes. Tous les
essais ont été effectués avec un spectrofluorimètre Shimazu RF-540.
Le spectre d'intensité de fluorescence intrinsèque de l'actine G, tel qu'illustré à
la figure 12, est modifié lorsque l'actine est dénaturée (Kuznetsova, I.M. et al, 1988).
Le déplacement du pic d'émission de fluorescence vers de plus grandes longueurs
d'onde associé à la dénaturation thermique de l'actine permet de suivre l'évolution
de la dénaturation thermique à 320 nm, pour une exitation à 294 nm. Dans notre
étude, cette transformation a toujours été irréversible même au-delà de 2 jours.
100
Q) 0 c: Q) 0
État dénaturé CI) Q) "- 60 ;7 0 ;j -Q)
"0 40 -Q) -CI) c Q)
20 -c:
oL---~--~----~--~==~=-.. .J 300 325 350 375 400 425 450
Longueur d'onde, À. (nm)
Figure 12: Spectre d'intensité de fluorescence intrinsèque de l'actine G native et dénaturée.
3.31 Préparation des échantillons d'actine G
L'actine a été diluée dans le tampon G et distribuée dans une quinzaine de
tubes en verre scellés pour en réduire l'évaporation. Les tubes ont été immergés
dans un bain thermostaté (l'équilibre thermique des solutions a toujours été atteint
36
en l'espace de quelques secondes). Par la suite, ces tubes ont été retirés à des
temps prédéterminés et immergés dans un mélange d'eau et de glace. La mesure
d'intensité de fluorescence a été effectuée à 320 nm pour une excitation à 294 nm
et à la température fixe de 25°C. Les concentrations d'actine utilisées
correspondaient à une plage à l'intérieur de laquelle l'intensité de fluorescence est
proportionnelle à la concentration d'actine (environ de 0.02 à 0.1 mg/ml). Pour de
plus fortes concentrations d'actine, un certain volume d'actine G concentrée a été
prélevé, à des temps déterminés. Ce volume d'actine a été dilué 1 :100 dans le
tampon G avant d'en effectuer la mesure de variation d'intensité de fluorescence.
3.32 Préparation des échantillons d'actine F
La mesure de la dénaturation thermique de l'actine F est plus complexe, car la
dénaturation de cette forme d'actine produit des agrégats qui ne permettent plus
l'utilisation directe des méthodes optiques. L'absence de précédent et certaines
particularités de notre recherche nous ont obligé à développer notre propre
protocole.
On admet ici que l'actine F lorsqu'elle se dénature produit des agrégats qui
interagissent probablement entre eux mais n'ont pas d'interaction avec l'actine F
native encore en solution. La procédure adoptée était la suivante:
Préparation de 50 ml d'actine F à une concentration de 0.29 mg/ml.
Polymérisation de l'actine pendant 45 minutes à température ambiante.
Distribution de 1 ml d'actine F dans 12 groupes de 3 éprouvettes.
Immersion des éprouvettes dans un bain thermostaté à température fixe, T,
durant un temps prédéterminé, t.
Immersion des éprouvettes, dans un mélange d'eau et de glace.
Prélèvement d'un volume de 0.15 ml dans chaque éprouvette et
dilution avec 2.85 ml de tampon G (tube à ultracentrifugeuse).
Dépolymérisation durant une période de 12 à 18 heures au réfrigérateur.
Centrifugation d'une heure à 40 000 rpm pour séparer les agrégats d'actine
dénaturée et d'actine native.
La mesure de l'intensité de la fluorescence est effectuée à 324 nm avec une
37
excitation à 294 nm. Cette mesure est obtenue de la valeur moyenne du signal
d'intensité de fluorescence de trois échantillons immergés à la même température
(T) durant un même temps (t).
38
4 ANALYSE THÉORIQUE DE LA TRANSITION THERMIQUE
Dans ce chapitre, nous présentons les principales équations qui ont du être
développées pour interpréter, selon une approche cinétique, les résultats obtenus.
L'approche utilise la notion d'ordre de réaction, concept courant en cinétique
classique. Toutefois la signification de l'ordre de réaction en dénaturation thermique
n'est pas clairement établi et cet ordre est d'avantage utilisé comme facteur de
forme que comme concept fondamental. Les équations originales ont été
développées dans ce chapitre, tandis que les équations provenant d'autres
publications sont admises à priori.
4.1 Calorimétrie différentielle à balayage
Nous avons développé des équations permettant d'exprimer l'effet de certaines
variables sur la dépendance de la variation de capacité calorifique envers la
température. Les principales variables considérées sont la vitesse de balayage et la
concentration. Nous nous sommes limités à deux types de phénomènes cinétiques
de dénaturation irréversible soit:
pour un ordre de dénaturation égal à l'unité,
pour un ordre de dénaturation différent de l'unité.
Après avoir obtenu les équations permettant de bien simuler les différents types
de dénaturation irréversible, nous avons développé une façon simple d'obtenir des
paramètres cinétiques à partir de données expérimentales.
4.11 Simulation de thermogramme
Cette partie consiste en la simulation de transitions irréversibles obéissant à des
lois simples, soit la dépendance de la variation de la capacité calorifique envers la
température pour une vitesse de balayage constante (K· S-1) .
39
i) Ordre de la dénaturation n = 1
kapp : constante de vitesse (S·1 )
L'approche mathématique envisagée est semblable à celle de J.M. Sanchez-Ruiz et
al (1988) et de M. Arnold et al (1979) bien que l'expression finale soit différente.
Les hypothèses de bases sont les suivantes:
1- Réaction d'ordre 1.
2- Dépendance de la constante de vitesse envers la température selon
une loi d'Arrhénius.
La constante de vitesse se définit selon l'hypothèse 2 comme obéissant à la loi
d'Arrhénius, équation [12]:
( -Ea) kapp (T) = A· exp RT
A facteur de collision (S·1 ) Ea énergie d'activation (kJ· mole·1)
R constante des gaz parfaits (0.008314 kJ· mole·1 . K1) T température (K)
L'équation classique de la cinétique
dN = k . N n dt app
s'exprime pour un ordre de réaction égal à l'unité et les variables utilisées par:
t temps (s)
d(ca) = kapp· f(a) dt
a fraction de protéine ayant réagit
[18]
f(a) fonction de a c concentration de protéine (mg· ml"1)
La fraction de protéine ayant réagi peut se définir comme:
a =
[No] concentration initiale de la protéine (mg· mr1) [N(t)] concentration de la protéine dans l'état natif à un temps t (mg· ml"1)
Les conditions limites de a sont les suivantes:
à t = 0; a = 0
à t = 00; a = 1
En approche cinétique, f(a) peut s'exprimer par:
f(a) = (c-ca)n
n : ordre de la réaction
L'ordre de la réaction étant de 1, l'équation [18] peut s'écrire:
cda -- = kapp· c(1-a) dt
40
[19]
[20]
[21]
Considérant que la température augmente de façon linéaire en fonction du temps
(calorimétrie différentielle à balayage).
dT dt
p vitesse de balayage (K· S"1)
= v
dT = vdt
[22]
[23]
Sachant que dT / dt correspond à la vitesse de balayage (v) qui est admise constante
41
et en remplaçant la valeur de kapp de l'équation [21] par sa valeur provenant de la
relation d'Arrhénius (équation [12]) on peut donc exprimer l'équation [21] sous la
forme:
da A [-Ea) - = - exp - . (1 - a) dT " RT
[24]
En séparant les variables, on obtient l'équation différentielle suivante:
a T
J da = f A exp( -Ea)dT o 1- a Ti" RT
[25]
Dont la solution partielle permet d'isoler le terme (1-a):
-1 fT [ -Ea) In(1-a) = - Aexp - dT v Ti RT
[26]
(1-a) = exp[~ ITAexp[ -Ea)dT] "Ti RT
[27]
En introduisant cette expression de (1-a) de l'équation [27] dans l'équation [24], on
obtient:
[ T ] da A -Ea -1 -Ea
- = - exp(-) exp - f A exp(-)dT dT" RT "Ti RT
[28]
En admettant l'hypothèse peu contraignante de P.L. Privalov (1979) que l'aire sous
la courbe de la transition thermique obtenue par calorimétrie différentielle à balayage
est proportionnelle à la quantité de protéine impliquée dans le processus, on peut
concevoir la relation suivante entre la variation de la capacité calorifique, â Cp, et
da/dT (décrite également par l'équation [6]):
da âCp = a T-
dT
OT quantité de chaleur totale impliquée dans le processus (J.JJ) ~Cp variation de la capacité calorifique (J.JJ • K1)
42
[29]
On peut exprimer âCp à l'aide de paramètres cinétiques en substituant la valeur de
da/dT de l'équation [29 ] son expression selon [28].
âCp = AaT exp( -Ea) exp[ -A ITexp( -Ea)dT] v RT v Ti RT
[30a]
ou
âCp = ATl âHcalexp( -Ea) exp[ -A ITexp( -Ea)dT] [30b] v RT v Ti RT
L'équation [30a] a été présentée dans le chapitre 2: État des connaissances
(équation [13]). Bien que produite par un cheminement différent, cette équation
produit des résultats identiques à l'équation [14] proposée par Conejero-Lara F. et
al (1991)
Les équations [30a] et [30b] ont été utilisées pour la simulation de tracés
calorimétriques obéissant à un mécanisme d'ordre 1, en particulier les tracés
calorimétriques de Bertazzon, A. et al (1990) présentés aux figures 8 et 10.
L'intégrale d'Arrhénius ne peut être solutionnée que par méthode numérique. La
valeur de la borne inférieure de l'intégrale ,Ti' n'est vraiment pas critique car ce type
de fonction (équation [30a] et [30b]) converge rapidement, pourvu que la valeur de
Ti soit inférieure de 20-40 K à la température de transition.
ii) Ordre de la dénaturation n # 1
kapp nN -+ D
Les hypothèses de bases sont légèrement différentes du cas précédent:
1- cinétique d'ordre n .;. 1
43
2- dépendance de la constante de vitesse envers la température selon une
loi d'Arrhénius
Il s'agit de résoudre l'équation [18] pour un l'ordre différent de 1 et une
augmentation linéaire de la température en fonction du temps.
dca k ( )n -- = app C-Ca dt
[31]
cda k = app (c-ca)n dT v
[32]
da = kappc (n-1)(1_a)n dT v
[33]
kapp constante de vitesse pour n"t.1 «mg/ml)(1-n). S-1)
Peu importe l'ordre n, le facteur de collision (A) a les mêmes unités que la constante
de vitesse c'est à dire des (mg/ml)(l-n). S-l. Pour éclaircissement, voir l'équation [12].
En remplaçant la valeur de kapp de l'équation [12] et en séparant les variables, on
obtient l'équation différentielle suivante:
a T
I da J Ac(n-1) ( -Ea) = exp -- dT o (1-a)n Ti v RT
[34]
Dont la solution partielle permet d'isoler le terme (1-a):
1-(1 - a)(1 - n)
(1 - n)
T = Ac(n - 1) f exp( -Ea)dT
v Ti RT
(1 - a) [ Ac(n - 1) fT ( -Eal 1 (~) = 1 - (1 - n) exp - dT
v Ti RT
44
[35]
[36]
En utilisant cette expression de (1-a) dans l'équation différentielle [33] on obtient:
da Ac(n - 1) ( -Eal [ Ac(n - 1) fT ( -Eal 1 (A) [37] - = exp - 1 - (1 - n) exp - dT dT v RT v Ti RT
On peut voir de cette équation [37] que le terme (da/dT) est affecté par des
modifications de la concentration (c) au même titre que par une modification du
facteur de collision (A). Des simulations numériques effectuées avec différentes
valeurs de l'ordre n, ont montré que la relation entre âCp et da/dT exprimée avec
l'équation [29] reste inchangée quelle que soit la concentration.
Pour alléger l'expression, les termes A et c(n-1) ont été regroupés sous un
même paramètre, ç.
ç = Ac(n - 1) [38]
~ facteur de collision pondéré pour une réaction d'ordre n, (S-1 )
45
Les équations [37] et [33] peuvent alors se réécrire de la façon suivante:
da = 1 exp( -Ea) [ 1 _ (1 _ n) 1 IT
exp( -Ea)dT] C ~ n) [39] dT v RT v Ti RT
da = 1 exp[ -Ea) (1 _a)n dT v RT
[40]
L'utilisation du facteur de collision pondéré (~) simplifie le développement des
équations et l'évaluation des paramètres cinétiques à partir de courbes
expérimentales (méthode de régression présentée à l'item 4.12 ii).
âCp s'exprime en fonction de paramètres cinétiques classiques en substituant dans
l'équation [29] l'expression de da/dT de [39].
âCp = OT~ exp[ -Ea) [ 1 _ (1 _ n) 1. IT
exp[ -Ea)dT] C ~ n) [41] v RT v Ti RT
La solution numérique de cette équation [41] a été utilisée pour simuler la relation
entre âCp et T pour des paramètres cinétiques Ea, ç et n variables. On peut, bien
entendu, remplacer la valeur de OT par flâHcar (équation [7]).
4.12 Méthodes de régression
Cette partie consiste à évaluer les paramètres cinétiques à partir de courbes
calorimétriques et ce, à l'aide d'une méthode de régression matricielle. Nous ne
détaillerons pas la méthode qui est celle de J.M. Sanchez-Ruiz et al (1988). La
méthode que nous présentons est plus générale et demeure assez simple
permettant ainsi d'être utilisée à l'aide d'un chiffrier du genre OPRO, LOTUS, EXCEL
etc .. .
La première étape à accomplir consiste à soustraire du thermogramme
expérimental, la dépendance de la variation de la capacité calorifique envers la
46
température avant et après la transition thermique. Il n'y aura donc plus de
dépendance entre la variation de la capacité calorifique et la température autre que
la transition d'intérêt. La transition qui en résulte sera une valeur positive exprimée
en unité de capacité calorifique.
L'étape suivante consiste à effectuer le quotient des valeurs de la variation de
la capacité calorifique de la transition par QT' La courbe en résultant correspondra
à da/dT selon l'équation [29]. La valeur de a en fonction de la température sera
évaluée en intégrant numériquement da/dT pour un intervalle dT. Selon l'ordre de
la transition, on appliquera une des méthodes matricielles suivantes pour évaluer les
paramètres cinétiques.
i) Ordre de la dénaturation n = 1
Selon la méthode proposée, les valeurs de T, da/dT et a sont obtenues
expérimentalement et les paramètres Ea et A, qui simulent le mieux une transition
thermique irréversible, sont évalués par l'équation [24] .
da = A exp[ -Eal (1 - a) dT v RT
On linéarise l'équation [24] dans l'intervalle [Ti' Tf] dont les bornes, définies à l'équation de base [7] seront optimisées selon la méthode décrite en section 4.13.
In(~~) = In(~) - (~)~ + In(1 - a) [42]
On a donc à résoudre N = (Tf - TJ/dT équations qui correspondent au nombre de
points expérimentaux utilisés.
47
[43a]
[ da2] (A) (Ea) 1 ln dT - In(1 - ( 2) = ln -; - R T
2
[43b]
[ da3] [A] [Ea] 1 ln dT - In(1 - ( 3) = ln -; - R T3
[43c]
[ daN] (A] (Ea] 1 ln dT - In(1 - aN) = ln -; - R T N [43d]
Une fois linéarisé, on peut séparer les valeurs d'origine expérimentale:
In(da/dT), 1/T et In(1-a)
et les coefficients à évaluer:
In(A/v), -Ea/R
Il est alors possible d'exprimer ce système d'équations à l'aide d'une approche
matricielle:
48
1 1 In( ~~1) -In(1 - ( 1)
T1
1 1 In( :2) -In(1 T2
- ( 2)
1 1 In( ~ l In( :3) -In(1 T3 * = - ( 3) [44]
Ea -R
1
* =
C'est un système matriciel d'équations du genre B· S = y qui est incompatible
(contient plus d'équations que d'inconnus) mais pouvant être simplement résolu à l'aide de la méthode des moindres carrés linéaire de la façon suivante (Leroux, P.,
1983):
[45]
B matrice contenant les éléments 1 et 1 fT N Y vecteur contenant les éléments In(daNjdT) - In(1-aN) S vecteur solution (In(Ajv) et -EajR)
Dans ce cas, il est souvent préférable d'éliminer les valeurs extrêmes souvent
moins bien caractérisées mais ayant la même pondération que des valeurs plus
significatives.
49
ii) Ordre de la dénaturation n # 1
Selon les considérations précédentes, les paramètres suivants; T, da/dT, a sont
obtenus expérimentalement. Les paramètres Ea, ç et n qui simulent le mieux une
transition thermique irréversible seront évalués à partir de l'équation [40].
da = lexp( -Ea] (1 -a)n dT v RT
On linéarise l'équation [40] dans l'intervalle [Ti' Tf] dont les bornes, définies à l'équation de base [7] seront optimisées selon la méthode décrite en section 4.13.
ln da = In(l]- [Ea] + nln(1-a) dT v RT
[46]
On a donc à résoudre N = (Tf - TJ/dT équations qui correspondent au nombre de
points expérimentaux utilisés.
In[ :;'] = In[: ]- [~ ][ ~J + nln(1-a,l [47a]
[47b]
[47c]
[47d]
50
Une fois linéarisé, on peut séparer les valeurs d'origine expérimentale:
In(da/dT), 1/T, In(1-a)
et les coefficients à évaluer suivants:
In(~/\I), -Ea/R, n
Il est alors possible d'exprimer ce système d'équation à l'aide d'une approche
matricielle et de le résoudre de la même façon que mentionné dans le cas où n = 1.
1 1 In(1-a 1) In[~] T1
1 1 In(1-a2) In[d] T2
In[ ~l 1 1 In(1-a3) In[~] T3 * Ea = [48]
-R
n
1
* =
51
4.13 Évaluation de l'incertitude sur les coefficients
L'erreur sur les paramètres peut être évaluée à l'aide de la matrice de variance
covariance (V) détaillée par Brown, A. (Brown, A., 1975):
où l'estimateur a € 2 se définit par:
~CPJ exp ~CPJthéor QT N
2 0.
a; = i: [flCPi exp - flCPi théor]2 -.!. i=1 Or N
valeurs de variation de capacité calorifique expérimentale (;..lJ . K-t )
valeurs de la capacité calorifique théorique (;..lJ • Kt) quantité de chaleur impliquée dans tout le processus (;..lJ) nombre de données expérimentales utilisées pour la régression
estimateur non biaisé de la variance
[49]
[50]
On retient les paramètres cinétiques correspondant à l'intégration numérique
dans l'intervalle [Ti' Tf] qui fournit un estimateur a /, minimum. Un exemple
d'application est présenté au chapitre 5, section 5.22.
De plus, les éléments Vii de la diagonale principale de la matrice V, reflètent
l'erreur-type des coefficients Si' où Si correspond à In(ç/v) ou In(A/v), Ea/R et n
selon la valeur de j. L'erreur-type sur le coefficient Si (flsi) se définit comme:
[51]
~~ erreur type des coefficients Sj
Vjj élément de la diagonale principale de la matrice de variance covariance (V)
52
4.2 Analyse des résultats obtenus par fluorescence
Pour analyser les résultats obtenus par fluorescence, il est important de
déterminer l'ordre de la dénaturation thermique, et deux méthodes possibles ont été
utilisées:
1- Relation entre le temps de demi-vie (t1/ 2) et la concentration de l'espèce.
2- Évaluation de l'ordre de la dénaturation (n) à l'aide d'une seule courbe
isothermale par une méthode de régression.
Après utilisation, la première méthode semble beaucoup plus sensible que la
seconde. Une comparaison des deux méthodes est présentée au chapitre 5
présentant résultats et discussion.
La théorie concernant le traitement des données dans le cas de cinétique
isothermale a été détaillée dans la littérature (Capellos, C. et Bielski, B.H.J., 1972).
Pour ces raisons, nous ne présenterons que les équations finales utilisées dans cette
étude.
4.21 Ordre 1
Dans ce cas, lorsque l'ordre de la réaction est égal à l'unité (n = 1), il n'y a pas
de relation entre le temps de demi-vie et la concentration (Capellos, C. et Bielski,
B.H.J., 1972).
La relation entre la variation de la concentration d'une espèce donnée et le
temps, obéit à une loi exponentielle. La relation entre l'intensité de fluorescence à 320 nm et le temps pour la dénaturation thermique de l'actine G, s'exprime par:
âl320nm = C + Dexp( -kappt)
t temps (s) âl320nm intensité de fluorescence C et D paramètres de normalisation
Les termes C et D sont des paramètres de normalisation
pour t=O, âl320nm = C + D
pour t=oo, âl320nm = C
[52]
53
Pour simplifier les comparaisons, on utilise, lorsque nécessaire, un facteur
normalisé dont la valeur est comprise entre 0 (t=oo) et 1 (t=O).
(âl FN(t) = 320nm
D
C) [53]
FN(t) valeur normalisée de l'intensité de fluorescence à 320 nm au temps t
D'autres aspects seront développés lors de la présentation des résultats au
chapitre 5.
4.22 Ordre n
kapp nN -+ D
Une des façons de mesurer l'ordre de la réaction est de vérifier l'effet de la
concentration sur le temps de demi-vie (t1/ 2) (Capellos, C. et Bielski, B.H.J., 1972).
[
2(n-1) - 1 1 t1 2 =
/ (n - 1) kapp
[N]~n-1) [54]
[N]o concentration de l'état natif à t=O (mg· mr1) kapp constante de vitesse pour des n ~ 1 «mg/ml)(1.n). S·1)
Cette équation est valide pour n :f: 1. A l'aide de l'équation [54], on constate que
si n > 1, plus la concentration est élevée, plus le temps de demi-vie (t1/ 2) diminue
et vice versa.
On peut évaluer l'ordre de la réaction avec un minimum de deux courbes de
cinétique de dénaturation (courbe 1 et courbe 2) à des concentrations différentes
(on a deux inconnus qui sont kapp et n). On a donc deux relations t1/ 2 vs la
concentration. On suppose que kapp est indépendant de la concentration pour une
température donnée.
54
[55a]
[
2(n-1) - 1 1 t -2 1/2 - (n-1)
(n - 1) kapp [N2]o
[55b]
La valeur de kapp est isolée dans une des équations en fonction de n et de t21 / 2•
[
2(n-1) - 1 1 k =
app (n-1) (n -1)t21/ 2 [N2]o
[56]
La valeur de kapp de l'équation [56] est remplacée dans l'équation [55a].
2(n-1) - 1 = 0
[57]
[ 2(n-1) - 1 1 (n - 1) [N ](n-1)
(n-1) 1 0
(n - 1 )t2 1/2 [N2]o
Une fois simplifiée, l'équation [57] donne:
In(~l (n -1) = t2 1/2 =
-âln(t1/ 2)
In( [N2Jo 1 âln[N]o
[Ndo
[58]
Avec un minimun de deux courbes de dénaturation thermique à concentrations
différentes et effectuées à la même température, donc avec la même valeur de kapp'
on peut déduire l'ordre de la dénaturation à l'aide de l'équation [58]. Un graphique
de In(t1/ 2) vs In([N]o) fournit une droite dont la pente est de 1-n. Laidler, K.L. (1950)
obtient une relation similaire à l'équation [58] quoique cet auteur ne mentionne
55
aucunement de relation linéaire entre In(t1j2) vs In([N]o)'
Une autre méthode pour évaluer l'ordre de la dénaturation consiste à utiliser une
méthode de régression permettant d'évaluer kapp et n à l'aide de l'équation [59] qui
est la relation cinétique de base entre la concentration de l'état natif et le temps pour
un n différent de l'unité:
âl = f[ [N](1-n) - (1 -n)k t]C1 ~n)) 324nm 0 app
[59]
~1324nm intensité de fluorescence normalisée f facteur permettant la relation entre l'intensité de fluorescence et la concentration
On dispose donc de deux méthodes pour évaluer l'ordre de la dénaturation
thermique soit à l'aide de la méthode des moindres carrés non linéaires ( équation
[59]) soit à l'aide de la relation entre la concentration et le temps de demi-vie
(équation [58]).
4.3 Limitation des méthodes de calcul
L'approche cinétique de la dénaturation thermique, comme toutes les
simulations de phénomènes naturels, a ses limitations. Une de ces limitations, la plus
évidente, est reliée à l'utilisation de l'équation [59], obtenue d'une formulation
classique en cinétique (Capellos, C. et Bielski, B.H.J., 1972). La limite de d'utilisation
de cette équation est:
[N](1-n) > (1 -n)k t o - app
Lorsque cette condition n'est pas respectée, soit pour des valeurs de temps (t)
élevées, les racines de l'équation [59] peuvent être imaginaires, pour des valeurs
1/ (1-n) non entières.
La simulation de thermogramme par intégration numérique de l'équation [41]
est illustrée à la figure 13. Dans ce cas, la solution est toujours applicable pour des
valeurs de n égales ou supérieures à 1 (tracé continu et tangent aux extrémités)
56
mais, pour des valeurs de n inférieures à l'unité, il existe une brusque discontinuité
au voisinage d'une température critique, Tc, telle que:
n > 1 _ __-= ___ 1 ______ _ Tc
l J exp( -Ea)dT v Ti RT
Jusqu'au voisinage de cette température critique, Tc, la transition peut être décrite
par un modèle de dénaturation obéissant à des lois cinétiques, tandis que la fin de
la transition thermique peut être associée à un phénomène secondaire que nous
n'avons pas cherché à définir.
-L-
o CU o
-Q) -'0 CU 0. CU o Q) '0
c ,2 -CU L-
~
55
vite s se de balayage: 40 ° C/h
InCE) = 80
Ea = 250 kJ / mole
60 65 70 75 80 Température, T (OC)
85 90
Figure 13: Figure de principe illustrant l'effet de l'ordre de dénaturation sur la variation de la capacité calorifique versus la température. L'équation [41] a été utilisée pour les simulations. Les paramètres cinétiques nécessaires à la simulation sont indiqués sur la figure en question.
Dans la partie résultats et discussions (chapitre 5), nous proposons une
méthode simple qui consiste à évaluer les paramètres cinétiques d'une transition
57
jusqu'à une température critique,Tc' quelconque. Les paramètres cinétiques sont
retenus pour un estimateur non biaisé de la variance (équation [50]) minimum.
En résumé, lorsque l'on veut évaluer les paramètres cinétiques d'une transition
d'ordre inférieur à l'unité, on doit admettre que les valeurs de variation de capacité
calorifique non nulles, mais voisines de la température finale, n'obéissent pas à des
lois cinétiques simples et ne doivent pas être prises en compte lors de la
paramétrisation. Cette discontinuité de la capacité calorifique n'est pas particulière
à l'équation originale [41] mais est aussi présente dans l'expression proposée par
Sanchez-Ruiz, J.M. (1992) bien que cette limitation ne soit pas clairement exprimée.
58
5 RÉSULTATS ET DISCUSSION
Ce chapitre présente les principales observations expérimentales effectuées
dans le cadre de cette étude. Ce chapitre est divisé en trois parties:
1- Dénaturation thermique de l'actine G
2- Dénaturation thermique de l'actine F
3- Effet thermostabilisant de la phalloïdine sur la dénaturation
thermique de l'actine
Une description des résultats ainsi qu'un bref commentaire sur leur
interprétation cinétique est présenté pour chacun des groupes de résultats. Les
données brutes et un premier traitement est présenté en annexe B.
5.1 Dénaturation thermique de l'actine G
Les résultats de la dénaturation thermique de l'actine G sont groupés dans deux
sections distinctes mais complémentaires qui permettent de mettre en évidence la
dépendance cinétique de la dénaturation thermique de l'actine G. La première
section présente l'étude isothermale de la dénaturation thermique de l'actine G
mesurée par fluorescence intrinsèque, tandis que la seconde section présente
l'étude effectuée par calorimétrie différentielle à balayage (D.S.C.).
5.11 Cinétique de dénaturation thermique observée par fluorescence
Dans cette section, nous mettons l'emphase sur l'obtention de paramètres
cinétiques courants tels l'énergie d'activation et le facteur de collision par la méthode
d'Arrhénius. Toutefois, avant de faire des mesures quantitatives, nous avons vérifié
que la dénaturation thermique de l'actine G obéit à des lois cinétiques simples.
i) Effet de la température sur la cinétique de dénaturation
Résultats: La figure 14 présente la variation d'intensité de fluorescence en fonction
du temps obtenue avec l'actine G pour quatre différentes températures de
dénaturation comprises entre 51 .5 et 58.5°C. La mesure a été effectuée par variation
59
d'intensité de fluorescence à 320 nm pour une excitation à 294 nm. Chaque point
représente la mesure effectuée sur 3 ml d'actine G à une concentration 0.05 mg/ml,
selon la méthode décrite au chapitre 3, section 3.31. Le phénomène est monotone
et décroissant. Le niveau final d'intensité de fluorescence est le même pour toutes
les températures soit de l'ordre de 70 (unités relatives d'intensité de fluorescence).
Le niveau final est atteint plus rapidement pour les hautes températures que pour les
basses températures.
Commentaires: Sur cette figure, les courbes continues correspondent à une loi
exponentielle décroissante (équation [52]) typique des mécanismes d'ordre un. La
dénaturation thermique de l'actine G ne semble pas dépendre de la variation de la
constante d'équilibre entre les deux états étant donné le peu d'influence de la
température sur le niveau d'intensité final.
90
~ 85 o N (fi
<1
75
70
Température
• 58 .5 Oc o 55 .5 Oc • 54.5 oC • 51.5 oC
65~--~--~--~~--~--~--~----~--~--~--~ o 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Temps, t (min)
Figure 14: Effet de la température sur la vitesse de dénaturation de l'actine G. Les mesures ont été effectuées par variation d'intensité de fluorescence intrinsèque avec Àex = 294 nm et Àem = 320 nm. La concentration d'actine G est de 0.05 mg/ml. Les températures de dénaturation sont indiquées dans le coin supérieur droit de la figure. Les courbes en continu sont associées à l'équation [52].
60
ii) Effet de la concentration sur la cinétique de dénaturation
Résultats: La figure 15 présente l'effet de la concentration d'actine G sur sa
cinétique de dénaturation. Les données expérimentales ont été normalisées par
l'utilisation d'un facteur FN(t) pour éliminer la dépendance entre l'intensité de
fluorescence et la concentration (équation [53]). La concentration d'actine G se situe
entre 0.02 et 3.26 mg/ml. Les mesures ont été effectuées selon le protocole décrit
à la section 3.31. Les solutions d'actine à 3.26 et 1.63 mg/ml ont été diluées 100 fois
dans le tampon G avant la mesure de l'intensité de fluorescence à 320 nm. La
température de dénaturation, a été dans tous les cas, de 55.5°C. Le phénomène
normalisé est monotone décroissant et semble être indépendant de la concentration
d'actine.
1.2 --- 1.0 u.Z
c:: 0 ci)
0.8
c:: Q) 0 .6 E
"0 en 0.4 c:: «S en 0.2 ~
:l Q)
0.0 -0 «S
U. -0.2
-0.4 0 50
o
Concentration
0 3.26 mg/ml
Al .63 mg/ml
.0.0652 mg/ m l
0 0.0417 mg/ ml
.0.0209 mg/ m l
•
• o
100 150 200 250 300
Temps, t (min) 350
Figure 15: Effet de la concentration d'actine G sur sa vitesse de dénaturation. Les mesures ont été effectuées par fluorescence intrinsèque avec Àe. = 294 nm et Àem = 320 nm. La température de dénaturation a été de 55.5°C. Les concentrations d'actine G sont indiquées dans le coin supérieur droit de la figure. Les données expérimentales ont été normalisées
pour éliminer l'effet de la concentration sur l'intensité de fluorescence à l 'aide de l'équation [53] . Les courbes en continu sont associées à une exponentielle décroissante.
61
Commentaires: La figure 15 montre qu'il n'y a pas de modification de la cinétique
de dénaturation due à la concentration de l'actine. Le temps de demi-vie (t1/ 2) de la
transition thermique de l'actine est quasi-indépendant de la concentration, ce qui
confirme, dans une certaine mesure, que la dénaturation de l'actine G obéit à une
cinétique d'ordre un et justifie l'utilisation d'une exponentielle décroissante pour en
décrire le comportement thermique (Capellos, C. et Bielski, B.J., (1972).
De ces deux groupes d'essais, on peut déduire:
que la dénaturation est sous contrôle cinétique (figure 14),
que l'ordre de cette dénaturation est voisin de l'unité (figure 15).
Lors de la dénaturation thermique de l'actine, il ne semble pas y avoir d'équilibre
entre les états natif et dénaturé de la protéine.
Hi) Relation d'Arrhénius
La figure 16 est un graphique d'Arrhénius obtenu à partir des données des
courbes de variation d'intensité de fluorescence selon les équations [11] et [12]. La
pente de cette relation fournit une valeur de l'énergie d'activation de l'ordre de 230
kJ/mole, valeur comparable à celle obtenue pour d'autres protéines (Sanchez-Ruiz,
J.M. et al, 1988).
-6.5
• • Données de la f igure 14
-7.5
- -8.0 ,..... 1
U> .......... -8.5
Co Co al
~ -9.0 o -C -9.5
-10.0
-10.5
-11.0 3.00 3.03 3.06 3.09 3 .12 3.15
(1fT) • 1000 fK- 1
Figure 16: Relation d'Arrhénius effectuée à partir de courbes isothermales obtenues par
fluorescence intrinsèque. L'ensemble de ces courbes isothermales se retrouve en annexe.
5.12 Dénaturation thermique observée par D.S.C.
62
Dans cette section, les paramètres cinétiques Ea et In(A) sont évalués à l'aide
de la calorimétrie différentielle à balayage. L'évaluation de ces paramètres cinétiques
s'est effectuée selon deux méthodes:
1- à l'aide d'un seul thermogramme (interprétation basée sur la forme de la
transition),
2- à l'aide de plusieurs thermogrammes (relation entre la température de
transition, Tm' et la vitesse de balayage, \1).
i) Méthode du thermogramme simple
Résultats: La figure 17 est un thermogramme associé à la dénaturation de l'actine
G à une concentration de 3.43 mg/ml. La température de transition (Tm) obtenue est
de 60.BoC pour une vitesse de balayage de 37.5°C/h. La transition est d'allure
simple et est irréversible étant donné que le thermogramme est plat lorsqu'on balaie
63
une seconde fois le même intervalle de température (résultat non montré). La ligne
de base de la figure 17 est une sigmoïde correspondant à la répartition de la
dépendance linéaire de la variation de capacité calorifique de la protéine avant et
après la transition thermique. Le développement de cette relation est celui suggéré
par Takahashi, K. et Sturtevant, J.M. (1981):
[61]
0 1 ordonné à l'origine de la variation de capacité calorifique avant la transition P1 pente de la relation de la variation de capacité calorifique avant la transition 02 ordonné à l'origine de la variation de capacité calorifique après la transition P2 pente de la relation de la variation de capacité calorifique après la transition L(T) ligne de base sigmoïde
L'enthalpie calorimétrique est de 664 kJ/mole, et le rapport de coopérativité est
évalué à 0.70, valeur voisine de celles obtenues par A. Bertazzon et al (1990) et L.V.
Tatunashvili, L.V. et Privalov, P.L. (1984).
-... o ~ o
o ~ c. ~ o Q) '0 c .2 -~
35
f 1 mJ/K
1
--- ligne de base théorique ... données expérimentales - régression théorique
40 45 50 55 60 65 70
Température,T (OC) 75 80 85
Figure 17: Tracé calorimétrique associé à la dénaturation thermique de l'actine G. La concentration d'actine est de 3.43 mg/ml et la vitesse de balayage de 37.5°C/h. La courbe en continu est obtenue à partir de l'équation [30] et la ligne de base provient de l'application de l'équation [61].
64
La figure 18 présente, dans l'espace graphique d'Arrhénius, l'interprétation
cinétique du tracé calorimétrique de la figure 17. L'évaluation de la constante de
vitesse s'est effectuée à l'aide de l'équation [15] proposée par J.M. Sanchez-Ruiz
(1988). L'énergie d'activation ainsi évaluée est de l'ordre de 285 kJ/mole. La relation
d'Arrhénius est linéaire au voisinage de la température de transition, soit pour une
plage de température de 52 0 C à 65 0 C.
La courbe continue de la figure 17 est une simulation effectuée avec ces
paramètres cinétiques selon le modèle binaire irréversible d'ordre 1 représenté par
l'équation [30].
-4.5~----------------------------------------~ ~ données expérimentales
___ re lation d'Arrhénius
- 9.0 ..... ----..... ----...... ----..... ----....... ----...... ----..... ----....... 2.94 2.96 2.98 3.00 3.02 3.04 3.06 3.08
(1fT) . 1000 fK- 1
Figure 18: Relation d'Arrhénius évaluée à partir du thermogramme de la figure 17. Les constantes de vitesses ont été évaluées à chaque 0.1 oC selon l'équation [15] et seulement
dans la région de la transition thermique.
Commentaires: L'interprétation cinétique de la dénaturation thermique de l'actine
G par D.S.C. fournit des paramètres du même ordre de grandeur que ceux obtenus
par fluorescence. Cette similitude contribue à montrer la pertinence de l'application
de l'approche cinétique présentée au chapitre 4.
65
ii) Méthode des thermogrammes multiples
Résultats: La figure 19 montre l'effet de la vitesse de balayage sur la transition
thermique de l'actine G. La concentration d'actine a été, pour les quatre courbes,
de 3.43 mg/ml. La température de transition (Tm) de l'actine G augmente pour des
vitesses de balayage plus élevées. De faibles vitesses de balayage ont été utilisées
pour palier à toute modification des transitions dûe au temps de réponse de
l'appareil. Même après correction, la dépendance de la température de transition
envers la vitesse de balayage reste évidente.
Q) J ::J
C' 1 rnJ/K - 1 ... 0 al 0
.Q) -0 al C-al 0 Q) courbe no vitesse de "0 balayage t: CD 9.0 'C/h 0 - 0 27.8 'C/h al ... 0 37.5 'C/h al > 8) 67.3 'C/h
35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85
Température,T (OC)
Figure 19: Effet de la vitesse de balayage sur la dénaturation thermique de l'actine G. Les concentrations d'actine G sont de 3.43 mg/ml. Les vitesses de balayage sont indiquées dans le coin inférieur droit de la figure.
66
La figure 20 illustre, dans l'espace graphique d'Arrhénius défini par l'équation
[16] (Sanchez-Ruiz, J.M. et al, 1988), la dépendance entre la température de
transition et la vitesse de balayage des tracés calorimétriques de la figure 19. La
valeur de l'énergie d'activation évaluée par la pente de cette relation est de l'ordre
de 245 kJ/mole.
-C\l E ~
~ -C -
-15 .0~----------------------------------------~
-Ea/R -16.0
-17.0
courbe no vitesse de balayage
CD 9.0 'C/h o 27 .8 'C/h
® 37.5 'C/h
o 67 .3 'C/h
CD
-18.0~--------~----------~--------~--------~ 2.95 2.975 3.000 3.025 3 .050
(1fT m) • 1000 /K-1
Figure 20: Relation entre la température de transition (Tm) de l'actine G et la vitesse de balayage (v). La détermination des paramètres cinétiques, Ea et In(A), a été effectuée à partir d'une régression linéaire de In(vfT m2
) versus 1 fT m selon l'équation [16]. Les données de base proviennent des thermogrammes de la figure 19.
Commentaires: L'influence de la vitesse de balayage sur la température de
transition de l'actine G a déjà été montrée à la figure 6 avec des données obtenues
par d'autres auteurs. Cette méthode permet d'obtenir les paramètres cinétiques, à
partir de l'interprétation de plusieurs tracés calorimétriques et montre une fois de
plus, la dépendance cinétique de la dénaturation thermique de l'actine G. Les
paramètres provenant de la figure 20 sont du même ordre de grandeur que ceux
obtenus par des méthodes et des techniques différentes (technique isothermale et
thermogramme simple).
67
5.13 Comparaison des résultats obtenus
Le tableau 6 présente la synthèse des paramètres cinétiques obtenus sur
l'actine G par différentes techniques et méthodes. Les valeurs des paramètres
obtenus par fluorescence sont semblables aux valeurs obtenues par calorimétrie
différentielle à balayage. Ceci confirme qu'avec les deux techniques, on mesure le
même phénomène soit: le déploiement partiel de la protéine induit par une hausse
de température.
Tableau 6
Paramètres cinétiques de la dénaturation thermique de l'actine G évalués à l'aide de différentes méthodes
Technique
Intensité de fluorescence 1
Thermogramme simple (D.s.cl Thermogrammes multiples (D.s.cl
Ea kJ/mole
231 ± 17 285 ± 2 244 ± 50
76.8 ± 0.3 96.5 ± 0.5 81.8 ± 0.1
Paramètres cinétiques évalués à partir de la relation d'Arrhénius de la figure 16 2 Paramètres cinétiques évalués à partir de la relation d'Arrhénius de la figure 18 3 Paramètres cinétiques obtenus à l'aide de l'équation [16] sur le graphique de la figure 20
5.2 Dénaturation thermique de l'actine F
Les résultats de la dénaturation thermique de l'actine F ont été groupés dans
deux sections. Tout comme pour l'actine G, la première section présente une étude
isothermale par mesure de la fluorescence. Des modifications du protocole général
exposé au chapitre 3, section 3.32, sont décrites. La seconde section présente une
étude par calorimétrie différentielle à balayage.
5.21 Cinétique de dénaturation thermique observée par fluorescence
L'interprétation cinétique de la dénaturation thermique observée par
68
fluorescence est, dans le cas de l'actine F, plus complexe que pour l'actine G. Une
première interprétation, selon un modèle simple, a montré, en effet, que pour décrire
correctement le comportement thermique de l'actine F, l'introduction de la notion
d'ordre était quasi-indispensable. Cette constatation a contraint au développement
des solutions numériques pour des ordres n quelconques, solutions qui sont
présentées au chapitre 4, partie 4.1.
i) Effet de la concentration sur la cinétique de dénaturation
La figure 21 présente l'effet de la concentration d'actine F sur sa cinétique de
dénaturation. Lors de la dénaturation, les volumes d'actine F ont été de 0.1 ml pour
des concentrations de 3 mg/ml à 1 mg/ml et de 0.15 ml pour une concentration de
0.3 mg/ml.
60
40 E r::
• CIl (')
<J
20
Concentration
• 0 .3 mg/ml
... 1.0 mg/ml
• 3.0 mg/ml
o ~------~--------~------~--------~------~ o 50 100 150 200 250
Temps, t (min)
Figure 21: Effet de la concentration de l'actine F sur sa vitesse de dénaturation. La température de dénaturation est de 59°C, les concentrations respectives sont indiquées dans le coin supérieur droit de la figure. Les paramètres de fluorescence usuels sont: Àex
= 294 nm et Àem = 324 nm. Les courbes continues sont obtenues d'une exponentielle décroissante.
69
Dans tous les cas, la mesure de fluorescence s'est effectuée après dilution jusqu'à
une concentration de 0.015 mg/ml. Les mesures ont été effectuées par variation
d'intensité de fluorescence à 324 nm et excitation à 294 nm. La température de
dénaturation a été dans tous les cas de 59 0 C. Le phénomène est monotone et est
plus rapide à faible concentration.
Commentaires: Contrairement à l'actine G, le temps de demie-vie (t1/ 2) varie selon
la concentration initiale (voir figure 22), variation décrite par l'équation [54] qui
introduit la notion d'ordre n.
-C\I .....
[
2(n - 1) - 1 1 t1 2 =
/ (n - 1) kapp
[N]~n - 1)
5 .0r-------------------------------------------~
~4.0 -c:
3 .5
3 .0~------------~------~----~------~------~ -1 .5 - 1.0 -0.5 0.5 1.0 1.5
Figure 22: Relation entre la concentration initiale d'actine F et le temps de demi-vie. Cette relation est une application de l'équation [58] et permet d'évaluer facilement l'ordre de la dénaturation à partir de la pente.
70
Les temps de demi-vie, dans ce cas, sont respectivement de 82.4, 53.9 et 33.4 min
pour des concentrations de 3 mg/ml, 1 mg/ml et 0.3 mg/ml. L'ordre de la
dénaturation a été évalué à 0.61 par régression entre le temps de demie-vie et la
concentration initiale (équation [58]) tel qu'illustré à la figure 22.
ii) Effet de la température sur la cinétique de dénaturation
La figure 23 montre l'effet de la température sur la vitesse de dénaturation de
l'actine F. Les températures de dénaturation varient de 54 à 62°C. Les mesures ont
été effectuées par variation d'intensité de fluorescence à 324 nm et excitation à 294
nm. Dans tous les cas, la concentration d'actine F durant la dénaturation était de
0.29 mg/ml tandis que la mesure a été effectuée après dilution jusqu'à une
concentration de 0.015 mg/ml. Le phénomène est monotone mais nettement plus
rapide pour les températures élevées.
E c ~ C'I C')
<l
60 Température
• 62.0°C
0 58.0 oC .. 56.0 oC
• 54.0 oC 40
n = 1 n = 0 .61
n variable
20
•
o ~--~~--~----~----~----~----~----~--~ o 50 100 150 200 250
Temps, t (min) 300 350 400
Figure 23: Effet de la température sur la vitesse de dénaturation de l'actine F. La concentration de l'actine F est de 0.29 mg/ml, les températures de dénaturation sont indiquées dans le coin supérieur droit de la figure. Les paramètres de fluorescence sont: Àex = 294 nm et Àem = 324 nm. Concernant les types de régressions, se référer au texte.
71
Commentaires: Les simulations pour différents ordres sont présentées sur la figure
23. Ces simulations effectuées par les équations [59] pour des n ~ 1 et [52] pour
n = 1 qui respectent la condition limite expérimentale observée; c=o à t=oo. La
courbe n variable permet deux degrés de liberté (l'ordre n et la constante de
vitesse). Toutes ces simulations reproduisent les valeurs obtenues à l'intérieur de la
plage des erreurs expérimentales (les simulations se confondent en grande partie)
et montrent ainsi que la détermination d'un ordre n à partir de tels résultats est
hasardeuse. Cet ordre n peut être évalué par une méthode plus sensible telle la
relation entre le temps de demi-vie (t1/ 2) et la concentration initiale ([N]o)'
Hi) Relation d'Arrhénius
Résultats: Pour des ordres de réaction proches de l'unité, la relation entre la
constante de vitesse et la température est bien décrite par une loi d'Arrhénius
(Sanchez-Ruiz, J.M., 1992).
'7 -7.0 oS --E
....... Cl .§ fi) . a. ~-9.0
.::i!
C
• n = 1
•
-11.0'------------..... ----........ ------2.98 3.00 3.02 3.04 3.06
(1fT) • 1000 fK- 1
Figure 24: Relation d'Arrhénius évaluée à partir de courbes isothermales obtenues par fluorescence intrinsèque sur les 5 cinétiques de dénaturation de la figure 23 en considérant différents ordres de dénaturation possibles.
72
Les deux courbes de la figure 24 présentent les relations obtenues par interprétation
cinétique des données de la figure 23 pour des ordres n = 1 et n = 0.61.
Commentaires: L'énergie d'activation obtenue des pentes de ces courbes est
d'environ 250 kJ/mole quelque soit l'ordre (n) considéré. Ikeuchi et al (1981) ont
déduit par mesure de l'activité HMM ATPasique, une énergie d'activation de 180
kJ/mole pour l'actine F, une valeur qui diffère de 30% de la valeur déduite de la
variation d'intensité de fluorescence. Toutefois, Ikeuchi n'a pas tenté de vérifier la
relation entre la concentration initiale ([N]o) d'actine F et le temps de demi-vie (t1j2).
L'énergie d'activation de l'actine F peut être déduite des courbes isothermales
obtenues lors de la dénaturation à différentes températures. L'ordre de la réaction
ne peut pas être facilement déduit de courbes isothermales pour une même
concentration. Il semble préférable d'évaluer l'ordre de la dénaturation à partir de la
relation entre le temps de demi-vie et la concentration de l'espèce impliquée
(équation [58]) comme illustré à la figure 22. Dans notre cas, l'ordre (n) évalué selon
cette équation [58] est inférieur à l'unité, soit 0.61.
5.22 Dénaturation thermique observée par D.S.C.
Les paramètres cinétiques de dénaturation thermique ont également été évalués
par calorimétrie différentielle à balayage. Les résultats obtenus ont été traités par
deux méthodes différentes, soit:
par traitement d'un tracé calorimétrique unique (thermogramme simple),
par traitement de plusieurs tracés calorimétriques effectués à différentes
vitesses de balayage.
Contrairement à l'actine G, l'introduction d'un ordre de réaction différent de
l'unité rend l'interprétation des tracés calorimétriques plus complexe.
i) Méthode du thermogramme simple
Résultats: La figure 25 présente le tracé calorimétrique de la dénaturation thermique
de l'actine F à une concentration de 3.55 mg/ml pour une vitesse de balayage de
73
37.47°C/h. La température de transition (Tm) obtenue dans ces conditions est de
70.35°C. L'enthalpie calorimétrique est de 880 kJ/mole pour un rapport coopératif
de 0.89. La dénaturation est irréversible.
Q) :l t - ligne de base théorique
.2' -.... 2 mJ/K
1 - données expérimentales
tilt :. - régression théorique
0 tU 0
-a> -0 tU a. tU 0 Q) "0
C 0 -tU .... ~
50 55 60 65 70 75 80 85 90
Température,T (OC)
Figure 25: Tracé calorimétrique associé à la dénaturation thermique de l'actine F. La concentration d'actine est de 3.55 mg/ml et la vitesse de balayage est de 37.47°C/h. La courbe en continu est obtenue à partir de l'équation [41] et la ligne de base provient de l'application de l'équation [61] .
Commentaires: Comme pour l'actine G, la ligne de base de la figure 25 est une
sigmoïde correspondant à la répartition de la dépendance linéaire de la variation de
capacité calorifique de la protéine avant et après la transition thermique (équation
[61]).
Pour l'actine F, A. Bertazzon et al (1990) ont évalué, par D.S.C., une enthalpie
calorimétrique de 753 kJ/mole soit du même ordre de grandeur que la valeur
obtenue dans cette étude.
L'évaluation des paramètres cinétiques s'est effectuée avec la méthode
74
matricielle détaillée au chapitre 4, à l'item 4.12 ii, en utilisant les données
expérimentales dans un intervalle [Ti' Tf] variable. L'aspect très général de l'équation
[41] admet l'existence d'ordres différents de l'unité, et implicitement, une température
critique Tc (commentée au chapitre 4, partie 4.3) au-delà de laquelle la solution n'est
plus applicable. Avant toute interprétation, l'intervalle des données expérimentales
utilisables doit donc être défini afin d'éliminer l'influence des phénomènes
secondaires associés à la fin de la transition.
Le début de la transition est caractérisé par la convergence de toutes les
solutions (voir figure 13) et la définition de la limite inférieure de l'intervalle a peu
d'influence sur la paramétrisation. La méthode se borne donc à faire varier la limite
supérieure (Tf) et d'évaluer pour chaque intervalle ainsi défini, la justesse des
paramètres cinétiques par le biais d'un estimateur a/ défini par l'équation [50]. La
figure 26 présente l'optimisation de la borne supérieure Tf' en fonction de
l'estimateur a/.
4 ~------------------------------------------~
b3
-
..... (fJ 1 W
valeur de T,
considérée
o ~----~----~----~------~----~----~----~ 70 71 72 73 74 75 76 77
Limite supérieure de l'intervalle, Tf (OC)
Figure 26: Graphique illustrant l'optimisation de l'intervalle par la relation entre la température finale et l'estimateur. Données calorimétriques provenant de la figure 25.
75
Les paramètres cinétiques, Ea, In(~) et n, obtenus pour différentes valeurs de
Tf' caractérisant l'intervalle utilisé, sont présentés au tableau 7. La valeur minimum
de l'estimateur est obtenue pour l'intervalle correspondant à un Tf de 70.97°C. A cet
intervalle est associé une énergie d'activation de 390 kJ/mole et un ordre n, de
0.68.
Le tableau 7 montre la relation entre l'ordre de la réaction et l'allure de la
transition; ainsi les ordres n ~ 1 ne sont obtenus que pour des intervalles qui
incluent la partie concave de fin de transition (Tf ~ 73 ° C) tandis que le meilleur
estimateur (a/ = 0.66 pour Tf = 70.97°C) exclut complètement la fin de la
transition et correspond à un ordre n = 0.68. Ce tableau montre également la
variation des paramètres cinétiques en fonction du choix de l'intervalle; l'énergie
d'activation Ea et le facteur de collision pondéré In(~), sont peu influencés par le
choix de l'intervalle (±5% pour la plage utilisée) tandis que l'ordre de la réaction
varie presque d'un facteur 2 pour la même plage.
Tableau 7
Estimation des paramètres cinétiques en fonction de l'intervalle considéré: cas de l'actine F
76.56 75.53 74.49 73.46 72.42 71.38 71.18 70.97 70.76 70.56 70.35
Ea kJ/mole
411 440 436 425 412 394 391 390 390 392 395
138.741 148.983 147.562 143.822 138.895 132.448 131.552 131.082 131.177 131.774 132.789
n
1.131 3.09 1.267 3.66 1.236 3.67 1.142 3.28 0.989 2.47 0.740 0.95 0.699 0.74 0.676 0.66 0.681 0.68 0.714 0.74 0.774 0.79
L'évaluation de ces paramètres a été effectuée sur le tracé calorimétrique de la figure 25 pour une température initiale TI de l'intervalle [Ti' TI] de 58.0goC.
76
La courbe continue sur la figure 25 correspond à la solution numérique utilisant
les paramètres cinétiques correspondant à l'estimateur minimum. La température
critique (Tc) qui correspond à la limite d'utilisation de cette solution est de l'ordre de
73 0 C et la fin de la transition ne peut être reproduite par les paramètres utilisés.
ii) Méthode des thermogrammes multiples
L'évaluation de l'énergie d'activation et du facteur de collision selon la méthode
de Sanchez-Ruiz, J.M. et al (1988) est basée sur l'hypothèse d'un ordre de
dénaturation égal à l'unité. Toutefois, la figure 13 montre que différentes hypothèses
sur l'ordre de réaction ont très peu d'effet sur la température de transition et le
tableau 7 montre que l'énergie d'activation et le facteur de collision sont peu
influencés par l'incertitude de l'ordre de la réaction. L'application de l'équation [16]
est donc justifiée pour évaluer l'énergie d'activation et le facteur de collision, même
pour des ordres de réactions inférieurs à l'unité. Une analyse plus détaillée est
présentée en annexe A.
Résultats: La figure 27 illustre l'effet de la vitesse de balayage (v) sur la température
de transition (Tm). La concentration d'actine F a été de 3.55 mg/ml pour l'ensemble
des tracés calorimétriques. De faibles vitesses de balayage ont été utilisées pour
pallier à des modifications des transitions dues au temps de réponse de l'appareil.
Les paramètres cinétiques (Ea et In(A)) sont évalués en effectuant une régression
linéaire de In(v /T m 2) versus 1 /T m selon l'équation [16] illustrée à la figure 28.
L'énergie d'activation évaluée à l'aide de cette méthode est de 254 kJ/mole.
Q) t courbe no vitesse de ::::J balayage ,2' 2 mJ/K
18.33 °C/h - 1 "-
27.80 °C/h 0 CU
37.47 °C/h 0
-<1> .... 0 CU a. CU 0 Q) '0 c::: 0 .... ,~ "-CU >
50 55 60 65 70 75 80 85
Température,T (OC)
Figure 27: Effet de la vitesse de balayage sur la dénaturation thermique de l'actine F. Les concentrations d'actine F sont de 3.55 mg/ml. Les vitesses de balayage sont indiquées dans le coin supérieur droit de la figure.
77
Commentaires: Cette dépendance de la température de transition (f m) envers la
vitesse de balayage est spécifique des phénomènes cinétiques mais il est clair
qu'avec cette méthode, l'ordre (n) du mécanisme de dénaturation ne peut être
évalué.
-15.75r------------------------------------------,
-16.00
-t\I E -16.25
~
~ - -1650 c: .
-16.75
courbe no vitesse de balayage
CD 18.33 °C/h
® 27 .80 o C/h
(}) 37.47 °C/h
-Ea/R 8) 47 .3 ° C/h
Ci) 57.2° C/h
-17.00~--~----~----~--~----~----~----~--~
2.900 2.905 2.910 2.915 2.920 2.925 2.930 2.935 2.940
(1fT m) • 1000 /K-1
Figure 28: Relation entre la température de transition (Tm) de l'actine F et la vitesse de balayage (/1) . La détermination des paramètres cinétiques (Ea et In(A)) a été effectuée à partir d'une régression linéaire de In(/ljT m ~ versus 1jT m selon l'équation [16]. Les données de base proviennent des thermogrammes de la figure 27.
5.23 Comparaison des résultats obtenus
78
Les résultats obtenus sur l'actine F sont présentés au tableau 8. Ces résultats
sont moins homogènes que pour l'actine G. Quelle que soit la technique utilisée,
l'ordre n de dénaturation est inférieur à l'unité et quasi constant (0.6 à 0.7). L'énergie
d'activation obtenue par variation d'intensité de fluorescence coïncide assez bien
avec la valeur provenant de l'interprétation de thermogrammes multiples soit environ
250 kJjmole. L'énergie d'activation obtenue par l'interprétation d'un seul
thermogramme est par contre beaucoup plus élevée (390 kJjmole).
79
Tableau 8 Paramètres cinétiques de la dénaturation thermique de l'actine F évalués à l'aide
de différentes méthodes
Techniques
Intensité de fluorescence n imposé (n = 0.61) 1
n = 1
Thermogramme simple (D.s.c.l n = 0.677 ± 0.004
Ea kJ/mole
248 ± 17 258 ± 17
390 ± 50
Thermogrammes multiples (D.S.C.)3 n non évalué 255 ± 23
In(~/s-1) ou In[A' S· (mg/ml)(n-1)]
ln (A) 81.1 ± 0.1 85.3 ± 0.1
In(~)4 131 ± 0.2
In(~)5 83.3 ± 0.06
Les paramètres cinétiques ont été évalués à partir de la relation d'Arrhénius (figure 24) , la valeur de n est estimée à l'aide de l'équation [59] sur les courbes de la figure 22.
2 La relation entre kapp et la température est évaluée à l'aide de la méthode matricielle de l'item 4.12 iL
3 Paramètres cinétiques évalués avec l'aide de l'équation [16] sur les thermogrammes de la figure 26.
4 Étant donné que l'ordre n de la dénaturation est proche de l'unité, la valeur de In(~) est voisine de In(A) selon l'équation [38].
5 La valeur de In(~) est déterminée à partir de l'équation [A16] en considérant n = 0.677 et a m
= 0.5.
5.3 Étude d'un cas: l'interaction entre l'actine et la phalloïdine
Cette étude a été effectuée en deux étapes; la première étape a consisté en une
étude semi-quantitative de l'effet de la phalloïdine sur l'actine et a permis de décrire
certains aspects de leur interaction et la mise au point de cadres expérimentaux plus
formels. En seconde étape, il a ensuite été possible d'appliquer les outils
d'interprétations développés au chapitre 4. Toutefois, ces interprétations n'ont pas
permis de quantifier l'interaction phalloïdine/actine mais n'ont servi qu'à décrire le
comportement thermique du complexe actine-phalloïdine.
80
5.31 Caractérisation Qualitative de l'interaction
Dans cette partie, l'interaction entre l'actine et la phalloïdine est caractérisée
globalement par calorimétrie différentielle à balayage. Les résultats présentés ici ont
été obtenus sur un Microcal MC-1 à une vitesse de balayage fixe de 40°C/h et ont
déjà fait l'objet d'une publication (Le Bihan, T. et Gicquaud, C., 1991).
i) Effet de la phalloïdine sur la thermostabilité de /'actine F
Résultats: La figure 29 illustre 7 courbes de dénaturation thermique d'actine F à une
concentration fixe d'actine de 3 mg/ml et différentes concentrations de phalloïdine.
En absence de phalloïdine (rapport molaire phalloïdine:actine = 0.00), la température
de transition de l'actine F est de 69.5°C.
-L-
o tU o
-Q) -o tU Co tU o Cl) "0 1::
.2 -tU L-tU >
40
f 5 mJ/K
1
Rapport molaire Ph : Act
45 50 55 60 65 70 75 Température,T (OC)
80 85 90
Figure 29: Effet de la concentration de phalloïdine sur la dénaturation thermique de l'actine F. La concentration d'actine F est de 3 mg/ml et la vitesse de balayage de 40°Cjh. Les valeurs dans les rectangles indiquent le rapport molaire phalloïdine:actine.
81
Pour des rapports molaires phalloïdine:actine supérieurs ou égaux à 0.37, la
température de transition est quasi constante de l'ordre de 82°C. L'effet le plus
marqué est obtenu à des rapports molaires phalloïdine:actine se situant entre 0.02
et 0.37 alors que la température de transition varie de 69 à 82°C. A de faibles
rapports molaires (0.02 à 0.37), les transitions thermiques sont fortement modifiées
par la présence de la phalloïdine. Ces modifications consistent principalement en un
élargissement de la transition vers des températures plus élevées et l'apparition d'un
épaulement vers 80°C dont l'amplitude augmente au détriment du pic vers 70°C.
A des rapports molaires phalloïdine:actine voisins de l'unité, l'effet de la phalloïdine
est maximal, et un excès de phalloïdine ne modifie pas appréciablement le tracé
calorimétrique. La dénaturation de l'actine F reste irréversible même en présence de
phalloïdine.
Commentaires: L'examen de la figure 29 montre plusieurs aspects qui peuvent être
soulignés. Le comportement du complexe phalloïdine-actine pour des rapports
molaires intermédiaires (0.02 à 0.37) est trop complexe pour être modélisé car la
présence d'un épaulement secondaire peut être l'indice de la présence de
populations intermédiaires. Les formes des transitions obtenues à des rapports
molaires voisins de l'unité sont plus simples et sont modélisées dans la section 5.32.
L'actine F saturée en phalloïdine, en plus de montrer une thermostabilité accrue,
montre également une meilleure symétrie qu'en absence de phalloïdine. Cette
amélioration de la symétrie par ajout de phalloïdine serait l'indice d'une augmentation
de l'ordre de réaction.
ii) Effet de la phalloïdine sur la thermostabilité de l'actine G
Résultats: La figure 30 montre des thermogrammes de dénaturation thermique de
l'actine G en présence de différentes concentrations de phalloïdine. En absence de
phalloïdine, la transition thermique de l'actine G est caractérisée par une transition
majeure à 59.5°C. Le léger épaulement perceptible à 68°C même en absence de
phalloïdine est attribué à la présence d'une certaine quantité d'actine F étant donné
que cet épaulement coïncide avec la température de transition de l'actine F. En
présence de phalloïdine, l'amplitude de la transition à 59.5 ° C diminue rapidement
au profit de l'épaulement secondaire. Au-delà d'un rapport molaire de 0.63, l'effet
82
d'une augmentation de phalloïdine est moins perceptible et la température de
transition se stabilise au voisinage de 75°C; une transition secondaire apparaît à 78.5°C. La présence de phalloïdine ne modifie pas l'irréversibilité de la transition
thermique de l'actine G.
f Rapport molaire Ph : Act
Cl) 5 mJ/K
6- 1 -~ o (ij o
-Q) -o n3 0. n3 o Cl) "0
r:::: o -n3
40 45 50 55 60 65 70 75
Température,T (OC) 80 85 90
Figure 30: Effet de la concentration de phalloïdine sur la dénaturation thermique de l'actine G. La concentration d'actine G est de 3 mg/ml et la vitesse de balayage de 4Q°C/h. Les valeurs dans les rectangles indiquent le rapport molaire phalloïdine:actine.
Commentaires: La figure 30 illustre clairement que la dénaturation thermique de
l'actine G est modifiée par la présence de phalloïdine. Toutefois aucun rapport
molaire phalloïdine:actine n'a fourni des tracés suffisamment simples pour permettre
l'application des approches cinétiques détaillées au chapitre 4. Le léger épaulement
associé à la présence d'actine F a amené des modifications au protocole, soit
l'introduction d'une centrifugation supplémentaire afin d'éliminer l'éventuelle présence
de formes filamenteuses dans les solutions d'actine G.
83
L'influence du rapport molaire phalloïdine:actine sur l'enthalpie calorimétrique
de la dénaturation thermique est montrée à la figure 31 pour les deux types d'actine.
Cette influence est à toutes fins pratiques peu significative.
Q) (5
~ 800 ..., -= CI) ::J .~ 600 ... .--CI)
E Cs 400 cu o CI)
'0. 200 cu  actine G .s:::. .-
c::::: 0 actine F w 0 ~ ____________ ~ ____________ ~~ ____________ ~
o 0.5 1.0 1.5
Rapport molaire phalloïdine : actine
Figure 31: Effet de la concentration de phallo',oine sur l'enthalpie calorimétrique associée à la dénaturation thermique de l'actine G et F. Les transitions thermiques considérées sont celles des figures 29 et 30.
5.32 Étude quantitative de l'interaction
Il a été impossible de trouver une méthode isothermale simple permettant
d'évaluer les paramètres cinétiques de la dénaturation thermique de l'actine F en
présence de phalloïdine. Seule la calorimétrie différentielle à balayage a permis de
mesurer ces paramètres. L'étude quantitative de la dénaturation thermique de
l'actine F en présence de phalloïdine pour des rapports molaires phalloïdine:actine
proches de l'unité permet de clarifier certains aspects de la dénaturation thermique
de l'actine F.
Dans cette section, les paramètres cinétiques sont obtenus à l'aide des mêmes
84
techniques que celles utilisées pour l'actine F en l'absence de phalloïdine et décrites
au chapitre 4. Les résultats de cette section ont tous été obtenus avec un
calorimètre différentiel à balayage Hart 7707.
Les paramètres cinétiques Ea, In(ç) et n ont été évalués de la même façon
qu'en absence de phalloïdine (partie 5.2). La procédure a consisté à considérer un
intervalle qui optimise l'estimateur a E 2.
i) Méthode du thermogramme simple
Résultats: La figure 32 illustre la dénaturation thermique de l'actine F en présence
de phalloïdine dans un rapport molaire proche de l'unité. La concentration de l'actine
est de 3.55 mg/ml. La transition est irréversible et la température de transition est
de 84.4°C pour une vitesse de balayage de 37.47°C/h.
Q) ::l .2" -r-o cu o
-<1> -o CU Co CU o Q) "'0 t: o -CU
40
t - ligne de base théorique
2 mJ/K - données expérimentales .... 1 - régression théorique
50 60 70 80 90 100
Température,T (OC)
Figure 32: Tracé calorimétrique associé à la dénaturation thermique de l'actine F en présence de phalloïdine à des rapports molaires phalloïdine:actine proches de l'unité. La concentration d'actine est de 3.55 mg/ml et la vitesse de balayage est de 37.47°C. La courbe en continue est obtenue à partir de l'équation [41] et la ligne de base provient de l'application de l'équation [61] .
85
L'enthalpie calorimétrique est environ de 1000 kJ/mole pour un rapport coopératif
de 0.74. La ligne de base a été évaluée de la même façon que pour l'actine G et F
en utilisant l'équation [61]. L'évaluation des paramètres cinétiques pour décrire le
phénomène s'est effectuée avec la méthode matricielle détaillée au chapitre 4 à l'item
4.12 iL Une simulation du phénomène est effectuée avec les paramètres cinétiques
obtenus par l'équation [41]. Cette simulation se réfère à un modèle binaire
irréversible d'ordre n. Le choix des paramètres cinétiques a été déterminé au niveau
du tableau 9 et est associé à une valeur minimale de l'estimateur cr/pour l'interva''e
caractérisé par la température finale (Tf).
Le graphique de la figure 33 montre la relation entre l'estimateur, évalué à partir
de l'équation [50], et la température finale de l'interva''e utilisé pour cette régression.
Les mêmes échelles en ordonnée, que dans le cas de l'actine F, ont été utilisées
(figure 26), montrant ainsi que l'interva''e considéré ne modifie que très peu la qualité
de la régression.
4 P-------------------------------------------~
1,3 T""
C\I",
C -~ 2 ::::l <1> -«S E -(JJ 1 W
valeur de Tf
considérée
c----O~ ___ ~ _____ ry_~----
o ~----~~----~------~------~------~----~ 84 85 86 87 88 89
Limite supérieure de l'intervalle, Tf (OC)
90
Figure 33: Graphique illustrant l'optimisation de l'intervalle par la relation entre la température finale et l'estimateur. Données calorimétriques provenant de la figure 32.
86
Les valeurs utilisées pour la simulation de l'équation [41] sur la figure 32
correspondent à une température finale de 86.25°C, l'énergie d'activation évaluée
est de 491 kJ/mole, l'ordre du mécanisme selon le tableau 9 est indépendant de la
valeur de la température finale considérée (en caractère gras au tableau 9).
Commentaires: La qualité de la régression illustrée à la figure 33 montre bien que
la température finale ne modifie que très peu la valeur de l'estimateur. Il est probable
que la dénaturation thermique de l'actine F, en présence de phalloïdine, peut être
décrite (du moins pour la plage de température considérée ici) par des lois
cinétiques. Cette observation est valable pour les ordres (n) voisins ou supérieurs
à l'unité. Le tableau 9 montre que cet ordre oscille effectivement entre 1.1 et 1.3.
Tous les paramètres cinétiques illustrés au tableau 9 sont peu influencés par la
valeur de la température finale (Tf) considérée.
Tableau 9
Estimation des paramètres cinétiques en fonction de l'intervalle critique considéré: cas de l'actine F en présence de phalloïdine.
89.34 88.72 88.11 87.49 86.87 86.25 85.64 85.02 84.40
Ea kJ/mole
503 504 502 498 494 491 492 496 504
164.123 164.568 163.888 162.508 161.182 160.139 160.245 161.837 164.464
n
1.198 8.07 1.207 8.81 1.190 8.31 1.152 6.94 1.110 5.56 1.071 4.49 1.076 4.71 1.165 5.57 1.343 5.63
L'évaluation de ces paramètres a été effectuée sur le tracé calorimétrique de la figure 32 pour une température initiale TI de l'intervalle [TI,Tf] de 70.97°C.
87
ii) Méthode des thermogrammes multiples
Résultats: La figure 34 montre l'effet de la vitesse de balayage (v) sur la transition
thermique de l'actine F en présence de phalloïdine à des rapports molaires
phalloïdine:actine proches de l'unité. La concentration d'actine est de 3.55 mg/ml.
L'augmentation de la vitesse de balayage produit une hausse de la température de
transition. Les paramètres cinétiques Ea et In(A) sont évalués par une régression
linéaire In(v /T m 2) vs 1 /T m selon l'équation [16] détaillée par Sanchez-Ruiz, J.M. et
al (1988) et est illustrée à la figure 35. Les thermogrammes considérés sont ceux de
la figure 34. L'énergie d'activation évaluée à l'aide de cette méthode est de 545
kJ/mole.
-~ o as (,)
-0> -'0 as a. as (,)
0> '0
c::::: o
t 2 mJ/K
i
courbe no vitesse de balayage
CD 9.5 °C/h
® 18.6 0 C/h
o 27.9 0 C/h
(3) 37.2 0 C/h
® 46 .5 0 C/h
CD 55.9 °C/h
40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100
Température,T (OC)
Figure 34: Effet de la vitesse de balayage sur la dénaturation thermique de l'actine F en présence de phalloïdine à des rapports molaires phallo'loine:actine proches de l'unité. Les concentrations d'actine F sont de 3.55 mg/ml. Les vitesses de balayage sont indiquées dans la partie gauche de la figure.
88
Commentaires: Cette dépendance de la température de transition (Tm) envers la
vitesse de balayage (v) est caractéristique des phénomènes sous contrôle cinétique.
Il semble qu'avec les deux méthodes (soit avec un seul tracé calorimétrique, soit à l'aide de plusieurs tracés calorimétriques), les paramètres cinétiques sont du même
ordre de grandeur contrairement au cas de l'actine F sans phalloïdine où la
différence entre les deux méthodes d'évaluation était plus importante (tableau 8). La
comparaison entre les paramètres cinétiques évalués par les deux méthodes est
présentée au tableau 10.
-15 co urbe no vitesse de
ba layage
CD 9 .5 °C/h
CD @ 18.6 °C/h
-16 ® Cl) 27.9 °C/h -(\lE 0 37.2 °C/h a-.;;; 0) - Ea/R
;::- Cl) ® 46.5 °C/ h - CD 55.9 °C/h C
-17
-18~------------~--------------~------------~
2.79 2.80 2.81 2.82
(1fT m) • 1000 IK-1
Figure 35: Relation entre la température de transition (Tm) de l'actine F en présence de phalloïdine à des rapports molaires phalloïdine:actine proches de l'unité, et la vitesse de balayage (II) . La détermination des paramètres cinétiques (Ea et In(A)) a été effectuée à partir d'une régression linéaire de In(IIfT m2
) versus 1 fT m selon l'équation [16]. Les données de base proviennent des thermogrammes de la figure 34.
89
Tableau 10
Paramètres cinétiques de la dénaturation thermique de l'actine F en présence de phalloïdine évalués à l'aide de différentes méthodes.
Technique Ea In(ç/s·1) ou In[A· s· (mg/ml)(n.1)] kJ/mole
Thermogramme simple (D.S.C.) In(ç) 1
n = 1.071 ± 0.002 491 ± 30 160.1 ± 0.1
Thermogrammes multiples (D.S.C.) In(A) n non évalué 545 ± 100 178.5 ± 0.1
Étant donné que l'ordre n de la dénaturation est proche de l'unité, la valeur de In(~) est voisine de In(A).
5.33 Modèle proposé de l'effet thermostabilisant de la phalloïdine sur l'actine
L'utilisation de la phalloïdine pour l'étude de la dénaturation thermique de
l'actine s'est avérée un outil fort utile pour cerner certains aspects de la dénaturation
thermique de l'actine. Cette étude a également permis de mieux comprendre
l'interaction entre l'actine et la phalloïdine.
La polymérisation de l'actine monomérique induite par les sels (2 mM MgCI2 + 100 mM KCI) produit la forme filamenteuse de l'actine. L'actine F montre une
thermostabilité plus élevée que la forme monomérique. Ceci peut s'expliquer par le
fait que les interactions entre les monomères augmenteraient la thermostabilité du
filament. Ces résultats sont confirmés par les études de A. Bertazzon et al (1990).
En présence de fortes concentrations de phalloïdine, le filament est beaucoup
plus thermostable, et contrairement à l'actine F seule, le filament saturé en
phalloïdine se dénature selon une cinétique d'ordre 1 (les ordres fractionnaires
peuvent être un indice d'une fragmentation lors de la dénaturation). Ce dernier point
confirmerait, dans une certaine mesure, que la dépolymérisation ou la fragmentation
de l'actine F en présence de phalloïdine est très réduite (Coluccio, L.M. et Tilney,
L.G., 1984).
90
L'étude de la dénaturation thermique de l'actine F à des rapports molaires
phalloïdine:actine inférieurs à l'unité montrent que, non seulement le monomère
d'actine directement lié à la molécule de phalloïdine est thermostabilisé, mais que les
monomères voisins et non directement liés sont aussi protégés. La figure 29
confirme, dans une certaine mesure, cette observation par l'étalement de la transition
vers les températures élevées pour des rapports molaires phalloïdine:actine de 0.02
à 0.37. La figure 36 schématise l'effet thermostabilisant de la phalloïdine sur le
filament d'actine. Sachant que la structure filamenteuse thermostabilise le monomère
d'actine, on peut suggérer que, si certains monomères qui composent le filament
sont plus thermostabilisés que les autres à cause de la phalloïdine, le reste du
filament en sera affecté.
o monomère non lié à la phalloïdine
monomère non lié © sfobilisé par la phalloïdi ne
• monomère lié à la phallo idi ne
Ra pport Rapport Rapport
Ph : aeline = 0 Ph : aell ne > 1 Ph : aellne < 1
Figure 36: Schéma illustrant l'effet thermostabilisant de la phallo"loine sur le filament d'actine.
Concernant l'actine G, l'interprétation est nettement plus complexe. Nos
résultats montrent que l'actine G est protégée contre la dénaturation thermique par
l'ajout de phallo"idine ce qui laisse penser à une interaction possible entre la
phalloïdine et l'actine G. Cette interprétation serait toutefois en désacord avec des
études antérieures qui ont montré que la phalloïdine n'interagit qu'avec la forme F
de l'actine (De Vries, 1. et al, 1976). Une explication plausible serait que
l'augmentation progressive de la température en calorimétrie différentielle à balayage
91
induit la polymérisation de l'actine qui est alors capable de se lier à la phalloïdine.
L'épaulement à 67°C sur la figure 30 est possiblement associé à la présence
d'actine F. Cet épaulement à 67°C associé à la présence d'actine F prend de
l'importance avec l'augmentation de la concentration de phalloïdine. La hausse lente
de température, pouvant induire une polymérisation de l'actine serait la cause
principale de l'interaction entre l'actine G et la phalloïdine.
5.4 Synthèse des observations
L'ensemble des résultats et observations obtenus sur les différents types
d'actine, à l'aide de plusieurs techniques, permet certaines réflexions générales
concernant la dénaturation thermique de l'actine.
5.41 Actine G
La dénaturation thermique de l'actine G semble obéir à des lois cinétiques
simples. L'actine G se dénature de façon irréversible sous contrôle cinétique.
Les résultats obtenus à l'aide d'une méthode isothermale (variation d'intensité
de fluorescence intrinsèque), montrent plusieurs caractéristiques des phénomènes
cinétiques. La figure 15 a montré que l'ordre de dénaturation est voisin de l'unité car
la cinétique de dénaturation est indépendante de la concentration (équation [54]).
La dépendance de la constante de vitesse (kapp) envers la température peut être
décrite par une loi d'Arrhénius comme illustré à la figure 16. L'énergie d'activation
ainsi obtenue est d'environ 230 kJ/mole.
Les courbes obtenues par calorimétrie différentielle à balayage, montrent aussi
que la dénaturation thermique de l'actine G est sous dépendance cinétique. La
courbe en continu de la figure 17 est associée à une transition binaire irréversible
(équation [30]). Cette solution numérique est plus satisfaisante que celle de
Bertazzon, A. et al (1990) illustrée à la figure 7 et basée sur une approche purement
thermodynamique (équation [9]).
Une autre caractéristique des phénomènes sous dépendance cinétique est la
92
relation entre la température de transition (f m) et la vitesse de balayage (v) illustrée
à la figure 19. Cette dépendance de la température de transition de l'actine G envers
la vitesse de balayage est observée sur les données provenant d'autres auteurs
mais n'a pas fait l'objet d'une étude publiée. La figure 6 montre bien cette relation
dans un espace d'Arrhénius.
De plus, les paramètres cinétiques Ea et ln (A) obtenus par calorimétrie
différentielle à balayage (soit la variation de la capacité calorifique versus la
température) sont du même ordre de grandeur que les paramètres cinétiques
obtenus par fluorescence. Cette similitude des paramètres cinétiques semble
confirmer que la dénaturation de l'actine G est bien décrite par chacune des
techniques.
Des trois types d'actine (actine G, actine F et actine F en présence de fortes
concentrations de phalloïdine) pour une vitesse de balayage donnée, la température
de transition (f m) de l'actine G est la plus faible.
5.42 Actine F
La dénaturation thermique de l'actine F semble aussi obéir à des lois cinétiques
mais celles-ci sont plus complexes. Tout comme l'actine G, l'actine F se dénature
de façon irréversible sous contrôle cinétique.
La complexité du phénomène de la dénaturation thermique de l'actine F est en
majorité causée par un ordre n de dénaturation probablement inférieur à l'unité.
Cette observation est confirmée par une méthode isothermale et par calorimétrie
différentielle à balayage. Les résultats obtenus par fluorescence montrent qu'il y a
un effet de la concentration d'actine F sur sa dénaturation thermique, effet qui est
montré à la figure 21. A l'aide de la relation entre le temps de demi-vie et la
concentration initiale d'actine ( In(t1/ 2) vs In[N]o} illustré à la figure 22, la valeur de
l'ordre n est évaluée à 0.61. L'effet de la température sur la vitesse de dénaturation
de l'actine F est similaire à celui de l'actine G. A l'aide d'un graphique d'Arrhénius
illustré à la figure 24, la valeur d'énergie d'activation oscille entre 245 et 260 kJ/mole.
93
La régression effectuée sur le tracé calorimétrique de la figure 25 fournit une
valeur d'ordre n se situant à 0.68, valeur qui est comparable à celle obtenue avec
la méthode isothermale. Toutefois, l'énergie d'activation évaluée à partir d'un seul
tracé calorimétrique est de 390 kJ/mole, valeur supérieure à celle obtenue
précédemment par la méthode isothermale. Toujours par calorimétrie différentielle
à balayage, l'énergie d'activation évaluée, à partir de plusieurs thermogrammes, est
de 255 kJ/mole, une valeur qui est du même ordre de grandeur que celle obtenue
par la méthode isothermale.
La signification d'un ordre de dénaturation inférieur à l'unité n'est pas évidente
à concevoir. Une valeur fractionnaire de l'ordre indique probablement que le filament
d'actine se fragmente ou dépolymérise lors de sa dénaturation thermique. Il est donc
possible, comme dans le cas de la flagelline, que le taux de dépolymérisation
augmente à température élevée (Oosawa, F. et Asakura, S., 1975) ce qui serait une
des causes d'un ordre de dénaturation inférieur à l'unité. Toutefois, en faisant
abstraction de la signification physique d'un ordre (n) inférieur à l'unité celui-ci peut
être interprété comme n'étant qu'un facteur de forme.
Les valeurs des paramètres cinétiques évaluées à l'aide d'un seul
thermogramme sont plus élevées par rapport aux autres techniques. L'énergie
d'activation évaluée par cette méthode est de 390 kJ/mole. Mis à part cette dernière
valeur de l'énergie d'activation, on remarque que dans le cas de l'actine G et F, on
a une valeur d'énergie d'activation du même ordre de grandeur, voisin de 250
kJ/mole. Pour une même vitesse de balayage, l'actine F va se dénaturer à plus
haute température que l'actine G. La forme filamenteuse confère donc à l'actine une
thermostabilité plus élevée, comparée à l'actine G.
5.43 Actine en présence de phalloïdine
Le choix de la phalloïdine comme outil d'étude de la dénaturation thermique de
l'actine a permis de cerner certains aspects de la dénaturation thermique.
La modification des thermogrammes d'actine G en présence de phalloïdine a
été surprenante car aucune étude antérieure n'a mis en évidence une interaction
94
entre la phallo"idine et l'actine G. Cette modification peut être interprétée par une
double influence de la phalloïdine. Premièrement, la présence de phalloïdine va
diminuer la concentration critique de l'actine, et deuxièmement, l'augmentation lente
de la température va induire une polymérisation partielle de l'actine, d'où interaction
possible entre l'actine F ainsi formée et la phalloïdine. Avec cette hypothèse, les
résultats obtenus en calorimétrie différentielle à balayage sont biaisés, car la hausse
lente de la température modifie l'état de la protéine avant sa dénaturation thermique,
la phalloïdine favoriserait dans ce cas la forme filamenteuse au détriment de la forme
globulaire qui peut alors interagir avec la phalloïdine.
Contrairement à Miyamoto, Y. et al (1986), la calorimétrie différentielle à
balayage montre que la thermostabilité optimale est obtenue à un rapport molaire
phalloïdine:actine proche de l'unité et non pas de 0.5. L'effet thermostabilisant est
évident, à une vitesse de balayage donnée, le filament d'actine saturé en phalloïdine
a une température de transition supérieure d'environ 10 à 15°C à la température
de transition de l'actine F sans phalloïdine. Par contre, à faible rapport molaire
phalloïdine:actine, on peut admettre qu'il y a trois types d'actine; des monomères
d'actine F directement liés à la phalloïdine, des monomères non liés à la phalloïdine
mais qui subissent indirectement l'effet thermostabilisant de la phalloïdine et
finalement des monomères d'actine simplement thermostabilisés par la forme
filamenteuse seule. La figure de principe 36 illustre cet effet.
Des tracés calorimétriques de la figure 29 et ceux des figures 32 et 34, on peut
faire une observation intéressante; l'actine filamenteuse saturée en phalloïdine est
associée à une transition simple (c'est-à-dire qui ne comporte pas de transition
secondaire ou étalement de pic) contrairement à l'actine F non saturée en
phalloïdine (figure 29). Une analyse quantitative des tracés calorimétriques de l'actine
F saturée en phalloïdine montre que la transition est d'ordre 1. Des paramètres
cinétiques du même ordre de grandeur sont obtenus, que ce soit à l'aide d'un seul
thermogramme (Ea = 491 kJjmole), ou à l'aide de la relation entre la température
de transition et la vitesse de balayage (Ea = 545 kJjmole). Cette valeur de l'énergie
d'activation est le double de celle obtenue avec l'actine F et l'actine G sans
phalloïdine.
95
Alors que l'ordre de la dénaturation thermique de l'actine filamenteuse sans
phalloïdine est inférieur à l'unité, un ordre de dénaturation voisin de l'unité est
observé pour I.'actine saturée en phalloïdine. Il est possible que le filament d'actine
saturé en phalloïdine ne dépolymérisera ou fragmentera moins avant sa dénaturation
thermique. Une des propriétés de la phalloïdine est justement de réduire le taux de
dépolymérisation de l'actine.
Étant donné que la phalloïdine se lie entre les deux sous-unités de l'actine
(Hegyi, G. et al, 1986) et qu'il en résulte une augmentation considérable de la
thermostabilité de l'actine, on peut en déduire que cette région, entre les deux sous
unités, est critique dans la dénaturation thermique de cette protéine. Dans le même
ordre d'idée, la présence d'un ion divalent entre les deux sous-unités de l'actine est
quasi-essentiel à la structure compacte de l'actine (Bertazzon, A. et al, 1990).
5.5 Signification des paramètres cinétiques
On peut s'interroger, entre autre, sur la signification réelle, moléculaire, des
paramètres cinétiques tels l'énergie d'activation (Ea), le paramètre de collision
(In (A» , l'ordre (n) de dénaturation, dans le cas de la transition irréversible d'une
protéine. La plupart des études axées sur la signification de ces paramètres ont
souvent été effectuées avec des modèles beaucoup plus simples que des protéines
en solution, et il peut être hasardeux de prétendre qu'un parallèle direct soit possible
entre ces modèles simples et les protéines.
Il ne semble pas qu'il y ait de lien clairement établi entre les paramètres
cinétiques évalués et les paramètres thermodynamiques régissant la première étape
de la dénaturation (schématisé par l'équation [10]). Une relation entre la quantité de
chaleur associée à la transition thermique (AHcal par exemple) et les paramètres
cinétiques précédemment mentionnés est sûrement possible, mais pas clairement
établie.
La quantification, ou l'évaluation des paramètres qui déterminent la transition
irréversible de protéines est assez récente et ne remonte qu'en 1988 (Sanchez-Ruiz,
J.M. et al, 1988), si on exclut le travail préliminaire effectué par R. Lumry et Eyring,
96
H., (1954). Il en résulte que peu d'auteurs ont tenté d'expliquer la signification de ces
paramètres cinétiques. De façon très succinte et à l'aide de simulation de l'équation
[30], on peut commenter qualitativement l'effet des paramètres cinétiques sur la
forme de la transition et leur signification plausible:
1- Plus l'énergie d'activation Ea est élevée, plus la réaction va s'effectuer à haute température, c'est ce qui est simulé à la figure 37. L'énergie
d'activation dans ce cas peut être associée à une barrière énergétique que
doit surmonter l'état natif pour atteindre l'état dénaturé. Le peuplement des
niveaux énergétiques supérieurs peut se faire en augmentant simplement la
température du milieu.
Cl) ::J CT -... 0 a; 0
-Cl) -0 tU C. tU 0 Cl) '0 c: 0 -tU ... tU >
30
In(Als- 1) • 105
40 50 60 70
Température,T (OC)
Ea kJ/mole
CD 290 (3) 300
o 310
80
Figure 37: Figure de principe illustrant l'effet de la variation de l'énergie d'activation sur une simulation de thermogramme tout en conservant les autres paramètres constants. Simulation effectuée avec l'équation [30] pour un p = 0.011 Kjs.
2- Plus le facteur de collision A est élevé, pour une même valeur d'énergie
d'activation, plus la température de transition est basse, c'est ce qui est
97
simulé à la figure 38. La signification de ce facteur dans le cas de la
dénaturation irréversible des protéines est moins claire que pour l'énergie
d'activation. Certains auteurs préfèrent exprimer autrement ce facteur. Par
exemple, Sanchez-Ruiz, J.M., (1992) utilise à la place de ce facteur un terme
dépendant d'une température caractéristique (T'" associé à une valeur de
kapp égal à l'unité). Selon la théorie cinétique des gaz, un facteur de collision
élevé peut signifier que l'état final est moins ordonné que l'état initial ou que
l'orientation des réactifs entre eux est peu important (Latham, J.L. et
Burgess, A.E., 1977).
Cl> Ea • 300 kJ/mole ;j
0- In(A/sol) -~ CD 100 0
as CD 102 0 CI) 105
-Cl> -0 as Co as 0
Cl> ""C C 0 -as ~
as >
30 40 50 60 70 80
Température,T (OC)
Figure 38: Figure de principe illustrant l'effet de la variation du facteur de collision sur une simulation de thermogramme tout en conservant les autres paramètres constants. Simulation effectuée avec l'équation [30J pour un JI = 0.011 Kjs.
3- L'ordre de dénaturation joue principalement sur la symétrie de la transition.
Plus la valeur de l'ordre (n) est inférieure à l'unité, plus la transition sera
asymétrique avec une pente plus abrupte après la température de transition
Tm' Cette évolution de la forme de la transition a été simulée à la figure 13.
98
Pour des valeurs de n supérieur à 1, l'asymétrie sera prononcée mais
inversée et continue par rapport au cas précédent avec une pente plus
abrupte avant la température de transition, Tm' Pour des ordres n supérieurs
ou égal à l'unité, il n'y a pas de discontinuité dans la relation âCp vs T. Des
transitions symétriques semblent être possibles pour des ordres d'environ
1.4 à 1.6.
La signification des paramètres cinétiques évalués à partir de transitions
thermiques de protéines reste peu précise compte tenu de la complexité des
phénomènes mis en jeu. Toutefois, de façon globale, ces paramètres nous
permettent de prédire, dans des conditions bien spécifiques, certains
comportements jusqu'alors imprévisibles de quelques protéines.
99
CONCLUSIONS
La dénaturation thermique de l'actine a fait l'objet d'un intérêt croissant au cours
des dernières années. Le déploiement de cette protéine sous l'effet de la chaleur a
été observé à l'aide de plusieurs techniques dont: la fluorescence (Lehrer, S. et
Kerwar, G., 1972; Ikeuchi, Y. et al 1990), la viscosimétrie (Ikeuchi, Y. et al, 1990), la
mesure de l'activité ATPasique (Ikeuchi, Y. et al, 1990) et le D.S.C. (Bertazzon, A.
et al, 1990; Tatunashvili, L.V. et Privalov, P.L., 1984; Fausnaugh, J.L. et al, 1984; Le
Bihan, T. et Gicquaud, C., 1991). Parmi ces techniques, le D.S.C. offre un grand
avantage car il permet la mesure directe de paramètres thermodynamiques
impliqués au cours de la transition ainsi que la mise en évidence de domaines
coopératifs dans la protéine.
Comme mentionné auparavant, le bilan des travaux antérieurs sur l'actine révèle
d'importantes différences sur les paramètres mesurés ainsi que sur les mécanismes
de dénaturation proposés par différents auteurs (Bertazzon, A. et al, 1990;
Tatunashvili, L.V. et Privalov, P.L., 1984; Contaxis, C.C. et al, 1977). La différence la
plus importante est la température de transition de l'actine G qui varie de 45°C à 80°C selon les auteurs (Ikeuchi, Y. et al, 1990; Bertazzon, A. et al, 1990; Le Bihan,
T. et Gicquaud, C., 1991; Tatunashvili, L.V. et Privalov, P.L., 1984; Fausnaugh, J.L.
et al, 1984).
Or, ces différents auteurs interprètent leurs résultats à l'aide de modèles
d'équilibre thermodynamique. Cette approche avait été antérieurement utilisée avec
succès pour l'étude de protéines particulières dont la dénaturation thermique obéit
à des phénomènes d'équilibre thermodynamique (Privalov, P.L., 1979). Cependant,
la dénaturation thermique de nombreuses protéines et de l'actine en particulier, est
un phénomène irréversible et l'application des lois qui régissent les systèmes
réversibles ne nous parait pas toujours appropriée, même si cette approche est
considérée comme applicable par certains auteurs (Hu, C. Q. et Sturtevant, J., 1987;
Manly, S.P. et al, 1985). Quelques études ont toutefois montré qu'il était possible de
caractériser, à l'aide d'une approche thermodynamique, la dénaturation irréversible
de certaines protéines, lorsque la température de transition n'est pas affectée par
la vitesse de balayage (Lohner, K. et Esser, A.F., 1991).
100
Une meilleure caractérisation des phénomènes thermiques impliqués lors de la
dénaturation thermique de l'actine nécessite donc une approche nouvelle. Dans
cette optique, la présente étude est axée sur l'utilisation de l'approche cinétique pour
tenter de mieux préciser le comportement thermique de différentes formes de
l'actine.
La dénaturation thermique de l'actine G est un phénomène cinétique qui peut
être décrit par des lois cinétiques simples tel, un ordre de dénaturation égal à l'unité
et que la constante de vitesse kapp varie en fonction de la température selon une loi
d'Arrhénius. Nous avons mesuré des paramètres cinétiques qui étaient du même
ordre de grandeur et ce, à l'aide de deux techniques complètement différentes soit:
par calorimétrie ainsi que par fluorescence.
Concernant l'actine F, l'interprétation des résultats est plus complexe et
certaines divergences quant à la valeur de paramètres ont été observées surtout au
niveau de la valeur de l'énergie d'activation Ea et du facteur de collision pondéré
In(ç). La complexité de l'interprétation des résultats provient d'un ordre de
dénaturation fractionnaire dont une des conséquences évidentes est la relation entre
la concentration initiale d'actine F et son temps de demi-vie. Cette relation entre le
temps de demi-vie et la concentration (qui découle d'un ordre de dénaturation
fractionnaire) est associée à un phénomène de fragmentation.
En présence de phalloïdine, cette fragmentation est réduite et est reflétée par
des ordres de dénaturation proches de l'unité. L'interaction entre la forme globulaire
de l'actine et la phalloïdine serait due en grande partie à une baisse de la
concentration critique de l'actine associée à la fois à l'augmentation de température
et à la présence de la phalloïdine elle même.
Il est également possible d'expliquer certaines lacunes expérimentales de
plusieurs auteurs ayant étudié la dénaturation de l'actine par une interprétation
cinétique. Les différentes températures de transition de l'actine G peuvent être
expliquées par l'influence de la vitesse de balayage qui est différente d'un auteur à un autre. La forme asymétrique des transitions associées à la dénaturation
thermique de l'actine G et F de Bertazzon, A. et al (1990) obtenue par D.S.C. peut
101
être aussi mieux expliquée à l'aide d'une approche cinétique.
De plus, l'irréversibilité de la dénaturation thermique n'est pas contraignante
dans une approche cinétique et de ce fait, la caractérisation de la transition
thermique de l'actine G et F à l'aide d'une approche d'équilibre thermodynamique
n'est pas justifiée.
En bref, l'analyse de nos résultats obtenus par fluorescence et par D.S.C. nous
a montré que la dénaturation thermique de l'actine correspond davantage à une
transition irréversible sous contrôle cinétique qu'à un processus obéissant à un
modèle d'équilibre thermodynamique. Cette conclusion peut être sûrement élargie
à d'autres protéines dont la caractérisation de la dénaturation thermique est ambiguë
et suscite un besoin d'outils mathématiques pour traiter ce type de transition.
La maîtrise de l'application de l'approche cinétique et thermodynamique
combinées permet, entre autre, la caractérisation d'une plus grande gamme de
transitions thermiques ainsi qu'une réflexion plus réaliste de l'acquisition
d'informations pertinentes découlant de ces transitions.
102
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A1
Annexe A Relation entre la température de transition et la vitesse de balayage pour des
ordres de dénaturation différents de l'unité.
La relation entre la température de transition, Tm' et la vitesse de balayage, v,
a été démontrée par Sanchez-Ruiz, J.M. et al, (1988) pour un ordre de dénaturation
égal à l'unité. Toutefois, il n'a pas été clairement établi, dans le passé, que cette
relation était semblable pour des ordres n différents de l'unité. Nous présentons en
premier lieu, le cas classique soit lorsque l'ordre n est égal à l'unité et par la suite
le deuxième cas (ordre n différent de l'unité). Il sera alors plus simple de faire
certains parallèles entre les deux cas.
ordre 1: Par définition, la température de transition Tm' est la température à laquelle
la variation de la capacité calorifique est maximale d'où d(4Cp)jdT = 0 et par
analogie d(dajdT)jdT = 0 selon la relation [6]. Une transition thermique simple
d'ordre 1 peut être facilement ramenée à la relation [24] (voir section 4.12 Méthodes
de régression):
- = - exp - . (1 - a) da A (-Eal dT v RT
[A1]
d'a = ~[Aexp( -Eal · (1 - a)] = 0 [A2] dT2 dT v RT
d'a = A exp[ -Ea] Ea . (1 -a) _ exp[ -Ea] da = 0 [A3] dT2 v RTm RT2 RTm dT
m
A2
En remplaçant la valeur de da/dT de [A3] par celle provenant de [A1], on obtient:
exp[ -Ea] Ea . (1 - a) - exp[ -Ea] A exp[ -Ea]. (1 - a) = 0 [A4] RTm RT2 RTm v RTm m
L'élimination des termes communs de l'équation [A4] fournit:
Ea A [-Ea] -- - -exp -- = 0 RT2 v RTm m
[A5]
[A6]
On peut linéariser la dépendance entre la température de transition et la vitesse de
balayage comme l'a effectué Sanchez-Ruiz, J.M. et al, (1988) .
La pente du graphique In(v /T m 2) vs 1 /T m est une valeur constante:
In[~] = In(AR) _ Ea_1 T2 Ea R Tm
m
d,n[i] d[ T~]
= -Ea R
[A7]
[A8]
[A9]
A3
Donc, pour un ordre n égal à l'unité, la pente de la relation In(v /T m 2) VS 1/T m est
constante et vaut -Ea/A.
ordre n: Le développement est similaire au cas précédent. L'équation de départ est
l'équation [40] dont l'équation [24] est un cas particulier:
da = lexp( -Ea]. (1 -a)n dT v RT
[A10]
-=--exp- ·(1-a) =0 dIa d [ç ( -Ea) n] dT2 dT v RT
[A11]
l exp[ -Ea] Ea . (1 -a)n - exp[ -Ea]n (1 _ a)(n-1) da = 0 v RTm RT2 RTm dT
m
[A12]
En remplaçant la valeur de da/dT de [A12] par celle provenant de [A10] on obtient:
exp[ -Ea] Ea . (1 - a)n - exp[ - Ea]n (1 _a)(n-1) l exp[ -Ea] (1 - a)n = 0 [A13] RTm RT2 RTm v RTm m
L'élimination des termes communs de l'équation [A13] fournit:
[A14]
La valeur de a à Tm peut se définir comme am
Si am est constant donc indépendant de Tm et de v alors:
dln(~) =
d( T~l Ea R
Ea 1
A4
[A15]
[A16]
[A17]
[A18]
Si am dépend de la vitesse de balayage (v) ou de la température de transition (Tm),
alors:
dln(~)
d( T~l Ea R
[A19]
Si il existe une relation entre am et la température de transition, Tm' alors la pente de
A5
la relation In(v /T m 2) VS 1 /T m n'est pas constante et vaut:
(n-1) dln(1-am)T~ Ea dTm R
[A20]
Une analyse numérique des transitions montre que pour une plage réaliste de
coefficients donnés soit environ: Ea ~ 250 kJ/mole, In(~) ~ 80 et n ~ 0.6, la valeur
de am est indépendante de la température de transition pour des vitesses de
balayage se situant entre 10 et 80 oC/ho Il semble à priori envisageable que am soit
indépendant pour une plage de coefficients beaucoup plus larges.
De plus, pour la plage de paramètres considérés, am demeure assez voisin de
0.5 et il est donc évident que le terme (n-1)ln(1-am) de l'équation [A16] qui est de
l'ordre de 0.3 est négligeable vis-à-vis du terme In(~Rn/Ea) qui a une valeur se
situant entre 70 et 80.
Annexe B Données brutes
titre: effet de la température sur la dénaturation de l'&ctine G
comment. données brute. de la figure 15
fichier :
date:
A :
B :
k :
lANN!:XOl
10-12 aout 1991
1ère série
70.777
24 . 6
0.0300
tempér . :
cono. :
échelle
2ème série 3ème série
72.53 69.6
25.589 29.6
0.0637 0.0088
Y:
DO tempe tempér. : 55 . 5 C tempér. : 58 . 5 C tempér . : 51.5 C
min I320 I320 n I320 I320 n I320 I320
expér. théor. expér. théor . expér . théor .
46 315
\hAHt Ir.> .... > ............ > ...• >. 48 455
n
variable
0.05 mg/ml
*64
4ème série
69 . 88
27.42
0 . 0145
tempér.: 54.5 C
I320 I320
expér. théor.
81
titr. : .ff.t d. la concentration .ur la dénaturation d. l'actin. C
eo_ent. donné •• brut •• d. la fiqur. 16
fichi.rl 1ANHEX02 t_pér. :
clat.: 31 juillet 1991
'eh.ll. Y:
1.r •• éri •• ln2a 2 ..... ri •• ln2b 3 ••• uri •• ln 2c
A , 1. 4665 0 . 9358 0.4822
B , 0.5115 0 . 3584 0.2
k 0.0200 0 . 0182 0.0241
t_p. coneent .: 0 . 0652 .q/.l eoncent .: 0 . 0417 .q/.1 concent . : 0.0209 .q/ .l
.in 1320 Inor. Fi Fi I320 Inora Fi F % I320 Inor-. Fi
expér. expér. expér . théor. expér . expér . expér . théor . expér . expér . expér .
· ûd~( <Ü 12 59 . 5 1. 8594 0 . 16 0 . 19 18 . 5 1.23 0.81 0 . 80 80.5 0 . 63 0 . 13
ü 'iifl '.: 30 56 . 2 1 . 1563 0 . 56 0 . 55 12 . 3 1.13 0 . 54 0 . 58 74.5 0 . 58 0 . 50
60 51. 6 1.6125 0 . 28 0 . 30 66.4 1. 04 0 . 28 0.34 61 . 5 0 . 53 0.23
~':5'~ii( 120 48 . 3 1. 5094 0.08 0 . 09 64 . 6 1. 01 0 . 21 0 . 11 65.8 0.51 0.16
10 155 41 . 8 1 . 4938 0 . 05 0.05 60 . 3 0 . 94 0 . 02 0 . 06 62.8 0.49 0 . 04
)~i\~~,:r~ 12 225 41.2 1. 415 0.02 0 . 01 60 . 6 0.95 0.03 0 . 02 62.8 0 . 49 0 . 04
14 300 46.2 1 . 4438 -0 . 04 0 . 00 51.3 iliiL -0.11 0 . 00 60 . 8 ... 04
HW ( ~~~ ... I ,(.~~ir @~Ué )
éeh.ll. en ordonné. ; .ch 32 64 128
e oncentr d. dénat .; cd 0 . 0652 0 . 0411 0 . 0209
eoneentr. d. a •• ur. (1 ); C. 0 . 065 2 0 . 0411 0 . 0209
La fonction •• t .valu .. par nf i t
,. , eorr •• pond au pourcentaq. d. la prot.in. native Fi - ( 1320(exper. ) - A) 1 B
I320 nor-.. - (I320(exper).* Cd)/(C. * .ch)
(1) : ••• ur •• ffectu. en diluant 100 X (0 . lal / lO.1)
55.5·C
variable
variable
4 •••• 'ri •• ln3
14.61
30 . 981
0.0191
eoneent. : 3 . 26 .q/.l
F % I320 Inor-. F %
théor. expér. expér . expér .
0 . 15 63 . 5 99 . 2 0 . 79
0.49 59 . 4 92 . 8 0 . 59
0.24 53.5 83.6 0.29
0.06 51.9 81.1 0.21
0 . 02 49 . 3 11 . 0 0 . 08
0 . 00 48.9 16 . 4 0 . 06
0 . 00.11. 41 . 9 14 . 8 0 . 01
(1#( · @·~t
64
3 . 2600
0 . 0326
5 •••• éri •• ln4
39 . 619
14 . 14
0 . 0190
eoneent.: 1 . 63 .q/.l
Fi I320 Inor. Fi
théor. expér. expér . expér.
0.80 64.0 50 . 0 0.13
0 . 56 61.0 41 . 1 0.56
0 . 32 56 . 5 44.1 0.32
0.10 54.6 42 . 1 0 . 21
O. 05~ 52 . 5 41. 0 0.09
0.01 51.2 40 . 0 0.02
0 . 00 50 . 2 39 . 2 -0 . 03
I·H·M ~é;: IM~M
128
1.6300
0 . 0163
Fi
th_or .
0 . 80
0.51
0 . 32
0 . 10
0 . 05
0 . 01
0.00
bŒ/E
llJ N
83
fichier: 1ANNEX03 tempér variable
date: 23 juillet 91 conc. : 0.0439 mg/ml
*64
A 69.81 71.87
B 29 . 34 29.44
k 0.048 0.05
fichier:
date:
A
1ANNEX04
25 juillet 1991
tempér. :
conc. :
37.48
16.14
variable
0.0468 mg/ml
Y: *32
39.18
12.4
84
titre: effet de la température sur la dénaturation de l'actine G
comment. donnée. brute. néce.eaire pour la figure 17
fichier: lANNI!:X05
date: 21-22 Aout 1991
lire série 2ime série
A : 57.586 57.342
B : 9.1667 19 . 757
k : 0.008 0 . 0037
no temps tempér. : 53.5 C tempér . : 47.5 C
min I320 I320 Ft I320 I320 F' expér . thé or . expér. théor .
tempér. :
conc. :
échelle Y:
3ime série
58.235
11. 4 04
0.0339
tempér .: 57 C
I320 I320
expér. théor.
67.5
F'
0.79
variable
0.045 mg/ml
*64
4ème série
57.93
18.899
0 . 0267
tempér.: 55 C
I320 I320
expér. théor.
85
j~;PW~è (H~i
I UE lv.UMU· ?<Ù~ ~ . ~~d l}} O;, ~;#;;8;' •• ~· )··<·U·<···}·<····· .. } .. !} HU lu· .• v· ••. U} II U} I}UUV il·.·.·····.U} Hlluu u····· II ········.·.·. ····}· .. uul V uu }I 66.5 66.6 0.72
61.3 61.3 ... :.:.:.:.:.:.:.:.:.:.:.,
'.' .. 60.5 60 . 9 ., ..... ,., ...........
59.8 60 . 3
, ............ ..: ..•.•..... ,
50 560 0.05
titre: Princi paux paramètres mesurés par variation d ' intensit' de fluorescence
commentaire donn'es brutes des études de la variation d'intensité de fluorescence de l ' actine G
fichier: 1ANNI!:X06 synthèse des fichiers 1annex01-1annexOS
effet nom conc tempér A DA B DB k Ok chi cal R sqr coef of
mesuré des fiahie Mg/ml C min-1 min-1
J~# )p:~~~gr .... A~9~~KJ~}( <W;@MMW;W)i§f~A~:;;M /~~~~SM :Oitdif ti9QM I } tempéra 2 - 25juil 0.0468 49.5 37 . 48 2 . 90 16.14 2 . 80 6.01!:-03 1.61!:-03 0.1203 1.0000
M\iiM#,M~~~Mgi i!W~b)$;f,#;l(O ;h#;4D A;ù(~#tW~)~~!:;oto;~W .· MMM,k:>:::::::::::::::::'::·' tempéra 1-23juil 0 . 0468 58 . 5 69.81 0 . 85 29.34 0.97 4.81!:-02 4.51!:- 03 1.4927 0.9998 0.9875
#,~k~#W~Wh > W~#f > !i" ~ &Eg ~ gMW#fWW~@WN#Wè~AW m9#~iWbiiièH tempéra 1-1012aout 0.0500 55 . 5 70.78 0 . 57 24 . 60 0.96 3.01!:-02 2.91!:- 03 0.8936 0 . 9999 0 . 9856
èii@~,#i~~~~W-~m5!i @~Mi;~~;W##;W~A@WW~~~{ o},ii":s tempéra 3-1012aout 0.0500 51.5 69.60 0.60 29 . 60 0.65 8.81!:-03 8.51!:-04 0.6121 0 . 9999 0 . 9946
AA~bMW#~ii@M;MMlV~ rna~hW . ù ; ü1dii Ji$iW{ iMM@f ~kmg @iMM AiMM tempéra 1-2122aout 0.0450 53.5 57 . 59 0.63 9.17 0.55 8.01!:-03 1.21!:-03 0.1212 1.0000 0.9853
~~*~MgmW~MM# H·1: ; ~ • ):1~)(ù#Hôi t i~~~~J#~M. V#f:~J §;~~1MhMU~;~Ht tempéra 3-2122aout 0.0450 56.9 58.23 0 . 27 11.40 0 . 31 3 . 41!:-02 2.61!:-03 0.1571 1.0000 0.9906
#~H~dm~AA~#.MMK ( HW$1Wf O;OUàii A;~lF#Mfl;#hf~;~~àWHMMM~f cODcent 1-31juil
titre : Rel d' Arrhen obtenues à partir de mesures de fluorescence
commentaire donnée. brute. de la figure 16
nom
des f i c
3-25jui
1-23jui
1-2122a
k
min- 1
lIt
k-1
0 . 006 0.00310
0 . 048 0.00302
0 . 034 0.00303
In(k) Regression Output:
s80- 1
-9 . 21 std Err of y Est
-7.14 No. of Observations
1 7
- 7.48 In(A) 76 . 8 Dln(A) 0 . 28
76 . 8217
0.28008
0 . 94368
13
11
86
87
TABLEAU RECAPITULATIF
titre: dénaturation thermique de l'actine G version du log 4
des donn nom du fichier: a:\scnr12a.o3c fact
rti+ modèle considéré dénat. therm. irré rtf-
conc(mg/ml) 3.43 Tm(C): 60.50 ligne de droite sigmoide unite vol(ml) 0.5 Ti(C): 48.19 P.M. 42500 Tf(C): 69.03 Qt 27587.17 26712.3 uJ
683.647 661.968 "J/mole 417.5126 426.043 "J/mole
S.R. (C/sec) 0.0104 OH I---'-'-'-'--'-'---...;..:...;....;.;...-'--....L..--- ----; DH(vh)
temperature critique pour l'obtention d'une si r coop. 0.610714 0.6436 (vh/cal Ea 0.000 284.523 "J/mole
Ti1 42.5558 temper init de regress pour ln(A) 0.00 96.4667 Tf1 48.1929 temper final de regress pour n 1.0008 Ti2 69.0314 temper init de regress pour Tf2 80.0182 t r final de regress ur ordre 1 ordre n
O.--.--.--.--.---~.-~--.-~-.
-500 ·······+········[········-]--·······f····· ···t······!·········!·········t···· .. · ~ 1 1 î i i 1 i
g -1000 ·········j·········-[--······-j-········t·· ····t····· -t-...... -t-........ j ......... j ......... . l :::: : ::: : ~ -1500 ·········t··················"!""······· ............... t·······l······T·······_·········
i -2000 .. ..... . .. ... : ··r······"[""······ ·······l·······r······r·······
1 -2500 ········T·······"1""·······(······l ········"[""····· ·· : ·······r······· j·········(·······
~ -3000 ·········]"·········[·········!·········l·········i ......... ]" ·· ···l········"!"·······l········ ~ -3500 ......... j ......... y ...... -l-........ y ...... y .... -j... .+ ....... -I--....... j ......... .
: : : : : :: -4000 ......... _ ............................. _ ................... _................ :
-4500+--r--r--r~--~-+--+--r--r-~
35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 température (C)
\
B8
titre: Relation d 'Arrhenius obtenue. l partir des données de la figure 18
commentaire donnée. illustrée. à la figure 19
fichier : 1ANNEX07
lIT In(k) lIT In(k) lIT In(k)
1t" (-1) 8ec ' (-1) 1t" ( - 1) 8ec ' (-1) 1t'(-1) oec ' (-1)
Regression:
3 . 0731E-03 -8.701 3.033 2E- 03 -7.340 2.9944E-03 -5.975 0 96.4638
3 . 0721E-03 -8.764 3.0323E-03 -7.296 2.9935E-03 - 5 . 945 DO 0 . 447
3 . 0711E-03 -8.783 3.0313E-03 -7.238 2.9925E-03 - 5.926 P - 34224
3.0701E-03 -8.705 3. 0304E-03 -7.201 2 . 9916E-03 -5.890 DP 148 . 2
3.0691E-03 - 8 . 669 3.0294E-03 - 7 . 145 2.9907E- 03 -5.858 chi 2 0.00299
3 . 0682E-03 -8.619 3.0284E-03 -7 . 137 2.9898E-03 - 5 . 818 r 2 0 . 9999
3.0672E-03 -8 . 583 3.02751!:-03 -7 . 116 2.9888E-03 - 5.779 ceff . det 0 . 9978
3.0662E-03 -8 . 489 3.0265E-03 -7 . 081 2.9879E- 03 - 5.756
3.0652E-03 -8.421 3.0256E- 03 - 7.044 2.9870E-03 - 5.721
3.0U2E-03 -8 . 400 3.0246E- 03 -7.023 2 . 9860E-03 - 5 . 673
3.0633E-03 -8.365 3.0237E-03 -6.978 2.9851E-03 - 5 . 661 Ea 284.536 1.23213
3.0623E-03 -8 . 399 3.0227E- 03 - 6.931 2.9842E- 03 -5.644 In( 96.4638 0.447
3 . 0613E-03 -8.417 3 . 0218E-03 -6.906 2.983lE-03 - 5.612
3.0603E-03 -8 . 363 3.0208E- 03 -6.861 2 . 9823E-03 - 5.597
3.0594E-03 -8 . 343 3.0199E- 03 - 6.819 2 . 9814 E- 03 - 5.559
3 . 0584E-03 -8 . 261 3 . 0189E-03 -6.791 2.9805E- 03 -5.534
3.0574E-03 -8 . 269 3 . 0180E-03 - 6 . 747 2 . 9795E-03 -5.513
3 . 0564E-03 - 8 . 184 3.0170E-03 - 6.746 2 . 9786 E- 03 -5 . 478
3.0555E-03 -8 . 167 3 . 0161E-03 -6.717 2.9777E-03 -5.441
3.0545E- 03 -8.101 3 . 0151E-03 -6.699 2.9768E-03 - 5.414
3.0535E-03 -8 . 072 3 . 0142E-03 - 6 . 670 2.9759E-03 -5.376
3.0525E-03 - 7 . 993 3 . 0132E-03 - 6.637 2 . 9749E-03 -5.359
3.0516E-03 -7 . 927 3.0123E-03 - 6.594 2 . 9740E-03 -5 . 349
3 . 0506E-03 -7 . 906 3 . 0113E- 03 - 6.554 2.9731E-03 -5 . 328
3 . 0496E-03 -7 . 915 3 . 0104E-03 - 6.519 2.9722E- 03 -5.305
3 . 0487E-03 -7 . 873 3.0094E- 03 - 6.478 2.9712E-03 -5.276
3.0477E-03 -7.832 3 . 0085E-03 - 6 . 439 2.9703E- 03 -5.243
3 . 0467E-03 -7 . 805 3.0075E- 03 - 6 . 403 2.9694E- 03 - 5 . 205
3 . 0458E-03 -7.760 3.0066E- 03 -6.375 2.9685E- 03 -5 . 185
3.0U8E-03 -7.731 3.0057E-03 - 6 . 370 2.9676E-03 -5.141
3.0438E-03 -7.705 3. 0047E- 03 -6.330 2.9667E- 03 - 5 . 118
3 . 0429E-03 - 7 . 653 3.0038E- 03 -6.29 3 2.9657E- 03 - 5 . 082
3.0419E- 03 -7.608 3 . 0028E-03 - 6 . 259 2.9648E- 03 -5.063
3 . 0409E-03 -7.570 3.0019E- 03 - 6.231 2.9639E- 03 - 5 . 070
3.0400E-03 -7.521 3.0010E- 03 -6 . 197 2.9630E-03 -5 . 040
3.0390E-03 -7.517 3.0000E- 03 -6.161 2 . 9621E-03 -5 . 030
3.0380E-03 - 7.513 2 . 9991E-03 -6.121 2.9612E-03 -5 . 005
3 . 0371E-03 - 7.483 2.9982E- 03 -6.086 2 . 9603E-03 -4 . 960
3.0361E-03 -7.445 2 . 9972E-03 - 6.050 2 . 9594E-03 -4 . 947
3.0351E-03 -7 . 398 2.9963E-03 -6.017 2 . 9584E-03 -4 . 916
3 . 0342E-03 - 7 . 374 2 . 9953E-03 - 6 . 000
89
titre: Relation Tm versus S.R.; actine G
commentaire données illustrées à la figure 21
fichier: 1ANNEX08
no S.R. Tm 1/Tm In(v/Tm In(sr/T Regression y=o+p*X
1 9.0 56.714 0.00303 -17.589 -17.341 0 71.4833
2 27.8 58.714 0.00301 -16.473 -16.806 DO 17.55
3 37.5 60.857 0.00299 -16.187 -16.239 P -29300
4 67.3 63.714 0.00297 -15.619 -15.495 DP 6596
chi 2 0.00015
r A 2 1.0000
coeff. dét. 0.9998
Ea 243.6 +1- 54.8391
In(A) 81. 7686 +1- 0.09797
Dln(A) DAIA
titre: effet de la concentration sur la dénaturation de l' actine ,.
comment. données brute. de la figure 22
fichier: lANIIEX09 tempér . :
date : 29 avril 1992 conc. :
échelle Y: *128
no tempe concentration : 3 mg/ml concentration: 1 mg/ml concentration : 0.3 mg/ml
min série série 2 série 3 moyenne séri e 1 série 2 série ~ JftOYenne série 1 .érie 2 série 3 moyenne
paramètre.
f
n
k
A
B
concentration
ordre n ordre 1
20 . 608
0 . 7937
0.0098 0 . 0073
-6 . 413
68 . 493
mg/ml concentration
59 . 0 58 . 3
ordre n ordre 1
61.158
0.7647
0 . 0116 0 . 0116
-4.608
66 . 214
55.8 56.7
2.4
mg/ml concentration
56.1 56 . 2
3.9 3 . 0
ordre n ordre 1
211. 71
0.8288
0 . 0148 0.0206
0.3108
62 . 694
no temps
min
moy err ordre n o rdre moy err ordre n ordre moy err ordre n ordre
2 6 59.4 59 . 1 58 . 3 0.90 59.0 0.58 57.0 57.2 56.2 0.42 56.9 55.7
!yA; I U·é.~i;fF .?~f:i~ l.f.·. ~~é'~~llu· :~~·~··@·· ~i ··l· ·······" •. ~~'~;···x·· · l uAfJ." II U~é~j I U ~~A# ~ 8~@~~~F·. l u §A\~il u §ù~ I U}i~ ! ~: 1 4 18 54.5 1.19 53.6 53.6 50 . 4 0 . 98 49 . 4 49 . 1 46.5 1.63 45.3 43.6
41
80
ordre n -
ordre 1 -
45 . 1
32.4
f*(c " (l-n) - (l-n)*k*t )" (l/(l-n ) )
A + B*exp(-kt)
loi
35.0
'"
relation entre le tempe de demi-vie et la concentration
0 . 47 36.9
1. 73 10 . 9
0.44 2.1
•••••••• ;:.:.0'.;: •• : •••.••••• ' ....... . 36.5 Il 28 . 9 1.05 28 . 6 27.3
,,,,,l' ,~ l / iil.5 . 21.6 10.4 1.63 11.9 12 . 4
11.5 4 . 5 0 . 95 3 . 9 5 . 4 ••••••.••••••.•.•. 1 •.•.•••• • •• "' ••
.........
3.0 0.78 0.2 1.3
c : concentration
n : ordre
k : constante de vitesse
t : temps
donnée. brutes de la figure 23
tl/2 c In(tl/2 ln(c) Regression output :
min . mg/ml
82.4 3.0 4 . 412 1.099
0.000 53.9
33.4
1.0
0 . 3
3.987
3.509 - 1.204
Conatant
std Err of y Eat
R Squared
No . of Observations
Degrees of Freedom
3 . 9829 X Coefficient (a #Ô,~r 0.0052 std Err of Coef 0.0032
0 . 9999
pente - 1-n; ordre-
810
titre: effet de la température sur la dénaturation de l'actin. ,.
commentaire donné.s brute. d. 1. figure 24
fichier : lANNEX10 paramètres ordre n ordre n fi ordre 1
date : 25 mars 1992 f 202.496 195.0607
série 1 n 1.0435 fixe temper. : 62 C k 0.0597 0.0278 0 . 0589
cono . : 0 . 29 mg/ml A 1.6384
éebelle Y : 128 B 57.2672
no tempe IIvaleurs expérimentales valeurs théoriques
min Il série 1 série 2 série 3 moyenne err ordre n ordre n fi ordre 1
2 2.0 Il 53.8 53.6 53.8 53.7 0 . 12 52.5 51.8 52.5 l,,,,,,,.
4 6.0
6 15.0
8 25.0
10 40 . 0
HU > ~Qùi 12 60.0
ordre n fixe -ordre n -ordre 1 -
titre:
commentaire
fichier:
date :
série
temper. :
cone . :
éebelle Y:
i,;;;: 42.5 42.3 44.2 43.0 1.04 41.9 43.1 41.9
~ ~, :""''>'"''
22.8 23 . 8 23 . 6 23 . 4 0.53 25 . 5 27.0 25 . 3
.".,.,., .. ,.,., 13.3 15.0 18.4 15.6 2.60 14.9 14.4 14.8
""""""',',',:ci"'",:,, }}}.,.' :;:" ;;;:': l"'", Lia .,','",',',',','"""",'" ":,,, 4 . 6 6 . 3 7 . 5 6 . 1 1.46 6.8 3.8 7.1
...... , ,. ~ .>">"".""". ~.<'(' I·.,,'::'. ~ ·:" ~·;; " . ,.,., .. " ,.,.,.,.,., ,,::,,:"'::iQ:;,, '
~ """'>"" ' .. '.':,è': ', ,,';l;;' 4.6 5.2 3.6 4.5 0.81 2.5 0 . 0 3.3
0 . 61
e: concentration
f*(e A(l-n) - (l-n)*k*t) A(l/(l-n) ) n: ordre
A + B*exp(-kt) k: CODatante d. viteBse
t: temps
effet de la température sur la dénaturation de l' actine .,.
donné •• brut •• de 1. fiqure 24
lANNEX10
27 mara 1992
58 C
0.29 mg/ml
128
paramètre. ordre n
200 . 3584
n 0.8428
k 0 . 0138
A
B
ordre n fi ordre 1
198.7719
fixe
0.00945 0 . 0172
-2.1888
60.7104
no tempe valeurs expérimentales valeurs théoriques
min série 1 série 2 série moyenne err ordre n ordre n fi ordre 1
1········,···· 2 0 . 65 52.5
1·.·.·.· .. ·
l'·'·'·'·'·'·'·'·'·'·'· 4 18.0 42 . 2 43.5 3.10 42.7
l,',',''''''''''''''' ""; '","',,"," 6 35.0 29 . 8 31.5 31.0 30.8 31.4 32.6 31.1 1..>,,,,,,,,,.,,,,,>
1::::"',,,·,2:2 20.3 0 . 89 19.4 20 . 0
~~;~ 1 . . ihi. 1 ;L,; 6.2 5.2 0 . 95 8.3 7 . 2 8 . 7
f<$. I / Ù( 1 ••••. Q;;}> I H> ~}f l ) i,f l .) g~ 4 . 0 4.7 3.9 0 . 91 2.4 0 . 8 2 . 4
ordre n fixe -0.61
e: concentration
ordre n - f*(e A(l-n) - (l- n)*k*t) A(l/(l-n) ) n: ordre
ordre 1 - A + B*exp(-kt) k: constante de vitesse
t: tempe
811
titre: effet de la température sur la dénaturation de l' aotine F
commentaire
fichier:
date :
série
temper. :
cone . :
échelle Y:
données brutes de la figure 24
lANNEX11
29 marli 1992
56 C
0.29 mg/ml
128
paramètre.
no temps Ilvaieurs expérimentales
min série 1 série 2 série moyenne
7.0 54.9 54.5 53.5 54.3
21.0 48.8 49.8 47.3 48.6
45 . 0 36.5 39 . 8 32 . 0 36.1
ordre n fixe • 0 . 61
ordre n •
ordre 1 •
f*(c A(l-n) - (l-n)*k*t) A(l/(l-n))
A + B*exp(-kt)
f
n
k
A
B
err
0 . 72
1.26
3.92
ordre n ordre n fi ordre 1
202.1248 200.4202
0.8776
0.009208
fixe
0.005959
valeurs théoriques
0.0112
-0 . 88192
59.8912
ordre n ordre n fi ordre
46.7 47 . 5 46 . 5
35.7 37 . 0 35 . 3
c: concentration
n : ordre
Je:: constante de vitesse
t: temps
titre: effet de la température sur la dénaturation de l' actine .,.
commentaire
fichier:
date :
série
temper. :
cono . :
échelle Y:
donné •• brut •• de la figure 24
lANNEXll
31 mara 1992
54 C
0 . 29 mg/ml
128
paramètres
no tempe valeurs expérimental ••
min série 1 série 2 série moyenne
11. 0 55.6 54.0 54.6 54 . 7
n
k
A
B
err
0.81
ordre n ordre n fi ordre 1
204.1856
0 . 9109
0 . 004689
200 . 4998
fixe
0 . 002889
valeurs théorique.
0.005649
0 . 84288
58.7776
ordre n ordre n fi ordre 1
55.9 55 .3 56.1
:< : 33.011 53.9 55 . 0 49.8 52.9 2 . 74 49.8 49.9
:' '4:~;',;;;i;;; ;;;;;;;;;;;;;;;'l:;;~r' :::;;;';';';';';';';44",
47.5 38.5 37.0 41 . 0
12 353 . 0 14.0 12.0 12 . 0 12.7
ordre n fixe - 0 . 61
ordre n -
ordre l -
f*(c A(l_n ) - (l-n)*k*t) " (l/(l- n))
A + B*exp(-kt)
5 . 68 38.0 39.0
1.15 7 . 9 5 . 6
e : concentration
n: ordre
k: constante de vitesse
t: temps
37.6
18 . 6
& ;,
8 . 8
812
813
TABLEAU RECAPITULATIF
titre: denaturation thermique actine F
c des donn nom du fichier: a:\scnr34a.t2c fact
rti+ modele considere denaturation thermiq irreversible fractionnair rtf-
conc(mg/ml) 3. 55 Tm(C) : 70.35 ligne de Base droit sigmoide vol (ml) 0.5 Ti(C): 57.88 param err P.M. 42500 Tf(C): 76.77 Qt 38957 37008 S.R. (C/sec) 0.010417 OH 932.77 886.11
OH(vh) 782.7 790.14 temperature critique pour l'obtention d'une sig r coop. 0.8391 0.8917
Ea 52.68 0.000 389.9448 Ti 1 52.2556 temper init de regress pour Cpn ln(A) 0.157 0.00 131.0817 Tf1 57.4641 temper f inal de regress pour C n 0.004 0.676822 ri2 77.18 temper init de regress pour Cpd Tf2 82.1343 t r final de regress ur C ordre ordre n
5000
4000
Q' 3000 -"3 2000 -(1) :J cr 1000 ~ 0 0 CU 0 (1)
-1000 ~ 0
................ ; ................ ; ................ ; ........... ... ~ ........... + ............... l .............. .
................................. [ ................ ! .............. ~ .......... ) .............. .1 .............. .
1 ••••••• ••••••• 1 1 111 •• ••• ••••••• j l l j l l
···············r ··············r············ ····r······ ·····r· ·······l·············l·············· ················t················t················t··· ·········r····· ······t ···············t···············
CU Q- -2000 0 (1) -3000 "U
~ -4000 > 11 ; 1 ) : ; i i i i
-5000 ·····r ·········· ···r·············r ·············r ············l·············l ·············· -6000+----r--~----T----r--~----T---~
50 55 60 65 70 75 80 85 temperature (C)
814
unite
uJ kJ/mole kJ/mole (vh/cal kJ/mole
815
titre: Relation Tm versus S.R.; actine F
commentaire données illustrées à la figure 36
fichier: IANNEX13
no S.R. Tm l/Tm ln(v/Tm ln( sr/T Regression y=O+P*X
1 18.33 67.50 0.00294 -16.942 -16.907 0 72.9798
2 27.80 68.60 0.00293 -16.532 -16.618 00 8.2
3 37.47 70.30 0 . 00291 -16.243 -16.174 P -30620
4 57.20 71.10 0.00290 -15.825 -15.967 DP 2811
5 46.48 71.36 0.00290 -16.034 -15.900 chi 2 0.00637
r A 2 1.0000
coeff. dét. 0.9753
Ea 254.575 +/- 23.3707
In(A) 83.3092 +/- 0.06478
816
TABLEAU RECAPITULATIF
tit re: denaturation thermique act F + Ph
COODr,ess des donn nom du fichier: E:\data\actph\scnr34a.t3c fact
rti+ modele considere denaturation thermiq irreversible fractionnai rtf -
conc(mg/ml) 3.55 Tm(C) : 84.40 ligne de Base droit sigmoide vol (ml) 0.5 Ti(C): 70.14 P.M. 42500 Tf(C): 90.16 Qt 46106 42084 S.R. (C/sec) 0.01033 OH 1103.9 1007.6
OH(vh) 708.78 743.96 temperature cr itique pour l'obtention d'une sig r coop. 0.642 0.7383
Ti1 58.0886 Tf1 70.1415 Ti2 90.1589 Tf2 94.0538
-Cf)
"0 fij Cf)
::J 0
~ '-"
Ea 0.000 temper init de regress pour Cpn ln(A) 0.00 temper final de regress pour C n temper init de regress pour Cpd t
-34
-35
-36
-37
-38
-39
-40
-41
-42
-43
-44
r final de regress pour C ordre
• 11r1:: ) · . . . . · . . . . · . . . . · . . . ,
j········jll........( ••••••••••••••
1····11·············[·1
···············jf···!········ r ·~··················· ........... ....... ""!................... . ... "1" .................. "[ ................... ]"" ....... .. ........ .
503.79 164 . 464 1.34346
ordre n
40 50 60 70 80 90 100
unite
uJ kJ/mole kJ/mole (vh/cal kJ/mole
817
titre: Relation Tm versus S.R.; actine F + Ph
cOJllJllentaire données illustrées à la figure 36
fichier: 1ANNEX14
no S.R. Tm l/Tm ln(v/Tm ln(Sr/T Regression y=o+p*X
1 9.47 81.96 0.00282 -17.685 -17.501 0 167.428
2 18.65 83.25 0.00281 -17.015 -16.831 DO 41.69
3 27.90 83.03 0.00281 -16.611 -16.945 P -65670
4 37.19 84.50 0.00280 -16.332 -16.187 DP 14880
5 46.48 85.01 0.00279 -16.112 -15.926 chi 2 0.0902
6 55.91 84.35 0.00280 -15.923 -16.264 r A 2 0.9980
coeff. dét. 0.8297
Ea 545.98 +/- 123.712
ln(A) 178.52 +/- 0.10325
