Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI CATANIA
FACOLTA' DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI
CORSO DI LAUREA IN SCIENZE BIOLOGICHE
DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA ANIMALE "M. La Greca"
MARIA RENATA RANIOLO
ALTERAZIONE DEL MUCO CERVICALE IN DONNE INFERTILI
T e s i d i l a u r e a i n B i o l o g i a d e l l o S v i l u p p o
Relatrice:
CHIAR.MA PROF.SSA RENATA VISCUSO
Correlatore:
DOTT. GIOVANNI BRACCHITTA
ANNO ACCADEMICO 2009-10
1
PREMESSA
Fin dall’antichità l’uomo ha abbandonato la vita solitaria e
nomade per riunirsi in tribù, la prole ha rappresentato la
continuità del sangue ed il potere delle braccia per coltivare e
per combattere: avere figli è stata una inevitabile necessità. Il
fatto che tra le tribù primitive non esistessero scapoli si può
ricondurre all’impossibilità di sopravvivere al di fuori di una
rigida divisione dei compiti e di un solido nucleo in grado di
espandersi.
In una civiltà contadina come quella descritta dalla Bibbia che
aveva fatto della fecondità uno dei suoi primi impegni, la sterilità
non poteva che essere vissuta come una punizione.
Di fatto la sterilità si è sempre presentata e continua oggi a
presentarsi come un grave problema, non solo organico ma che
ha risvolti importanti anche sulla psiche degli individui
coinvolti,sulla vita di relazione, sulla vita sessuale, e sul
benessere e la salute della coppia.
Sulla base di ciò è stata maturata l’idea centrale che ha motivato
e sostenuto l’intero progetto di ricerca: sensibilizzare l’interesse
scientifico, aiutare e cercare di capire le coppie che sono costrette
a sopportare la “diversità” e la “mancanza” che le caratterizzano.
2
La sterilità, diffusa a livello globale, è un problema da cui sono
afflitte almeno 150 milioni di coppie al mondo.(1)
In molti paesi, studi scientifici hanno dimostrato che la sterilità
coniugale mostra percentuali stabili od in aumento, attestabili
intorno al 15-20% della popolazione.(2)
Fino a 20-30 anni fa le coppie sterili nei paesi sviluppati erano
una su quattordici(circa il 7%).
Oggi a distanza di poco più di due decenni l’indice di sterilità è
cresciuto paurosamente attestandosi intorno al 20%. Ogni 10
coppie due risultano sterili.
Nel nostro paese 50-60.000 coppie non riescono ad avere figli,
chiedendo un consulto per infertilità.(3)
Da questi dati si evince quanto il problema della sterilità sia
rilevante non solo da un punto di vista sociale(scarsa natalità
significa infatti anche scarso ricambio generazionale
e quindi di idee e cultura) ma anche economico.
La sterilità dunque non è soltanto evidenza patologica, ma una
vera e propria crisi di vita personale e relazionale, che in alcuni
casi conduce a disagi e disturbi profondi ed invalidanti.
Da ulteriori ricerche emerge un’impressionante disinformazione
sulle possibili scelte terapeutiche disponibili per le coppie con
problemi di concepimento:circa la metà di queste coppie(48%)
3
afferma infatti che le opzioni proposte loro dagli operatori
sanitari sono poco chiare o scarsamente allettanti. A dispetto di
questa diffusione negativa, tuttavia, molte delle terapie attuali
sono semplici, non invasive ed estremamente efficaci.(4)
4
INTRODUZIONE
Concetto di infertilità
Si è generalmente portati a distinguere tra il concetto di sterilità
ed il concetto di infertilità: l’infertilità fa riferimento ai problemi
connessi con l’attecchimento o con lo sviluppo dell’embrione,
con conseguente incapacità di portare a termine la gravidanza per
la donna; la sterilità si definisce come condizione di ostacolo per
la fecondazione con conseguente mancanza di capacità
procreativa sia nell’uomo che nella donna.
Secondo l'organizzazione Mondiale della Sanità (O.M.S.) e
l'American Fertility Society (A.F.S.) una coppia è da considerarsi
infertile quando non è in grado di concepire e di avere un
bambino dopo un anno o più di rapporti sessuali; si distingue poi
un’ infertilità secondaria in quelle coppie che non riescono ad
avere un bambino dopo una gravidanza coronata con successo.
Mentre sterile è quella coppia nella quale uno od entrambi i
coniugi sono affetti da una condizione fisica permanente che non
renda possibile avere dei bambini.
Nella donna esistono periodi fisiologici di sterilità identificabili
come il periodo puberale e quello direttamente successivo alla
menopausa.
5
Anche durante il normale ciclo mestruale la donna va in contro a
periodi di sterilità fisiologica se si considera il fatto che la
fecondazione dell’uovo è ottenibile solo tra il 12-20 giorno di
ciclo. Durante il rapporto sessuale infatti, gli spermatozoi
vengono depositati in fondo alla vagina, vicino al collo
dell’utero. Gli spermatozoi passano attraverso il muco cervicale,
entrano nell’utero e risalgono le tube di Falloppio, dove può
avere luogo la fecondazione. Se questa avviene e tutte le
condizioni sono favorevoli, l’ovulo fecondato si impianta in 6ª/7ª
giornata nella mucosa uterina o endometrio, dando così inizio
alla gravidanza. Una disfunzione o un ostacolo in qualsiasi punto
di questo processo possono impedire che avvenga la gravidanza,
portando la coppia ad interrogarsi circa la propria fertilità.
6
Epidemiologia applicata all’infertilità
L’applicazione dell’epidemiologia a questa condizione ha delle
limitazioni che sono legate al fatto che non si tratta di analizzare
le caratteristiche e la diffusione di un agente etiologico ben
preciso; l’infertilità è infatti espressione di agenti etiologici
diversi, talvolta sintomatici ma molto spesso asintomatici da un
punto di vista clinico. Una ridotta o totale incapacità riproduttiva
è, inoltre, espressione dell’interazione di due differenti
condizioni fisiche, quella maschile e quella femminile.
Una stima dell’ infertilità di una popolazione deve quindi
necessariamente utilizzare dei metodi approssimativi di tipo
indiretto o diretto.
Una stima indiretta prende in considerazione il numero
complessivo di coppie in età feconda che non hanno avuto figli;
tale tipo di indagine può avere il rischio di una sovrastima dei
dati, in quanto l’assenza di figli, in una certa percentuale di casi,
è una scelta e non un effetto dell’infertilità. Il rischio di
sovrastima dei dati è reale nei paesi industrializzati dove la scelta
dell’uso di mezzi contraccettivi è più diffusa, viceversa nei paesi
in via di sviluppo questo rischio è irrilevante a causa delle
7
differenti condizioni socio-culturali che non hanno portato ancora
ad una completa separazione della sessualità dalla procreazione.
Le stime dirette dell’infertilità sono certamente più affidabili, in
quanto si basano su indagini demografiche specifiche condotte
sull’intera popolazione o su “gruppi campione”. Queste indagini
permettono di determinare quante coppie al momento
dell’inchiesta sono:
1) volontariamente o involontariamente non procreanti;
2) affette da infertilità primaria;
3) affette da infertilità secondaria;
L'evidenza di un progressivo calo della crescita demografica nei
Paesi occidentali, maggiormente industrializzati, ha fatto sorgere
il dubbio che ciò potesse essere connesso anche ad un incremento
dei casi di infertilità e sterilità.
Purtroppo in Italia abbiamo esclusivamente come parametri di
riferimento solo i dati ISTAT che considerano esclusivamente gli
indici di natalità e di fecondità senza una analisi precisa
dell'incidenza dell'infertilità e della sterilità.
Tale incremento nei paesi occidentali è dovuto a numerosi fattori:
- età media dei coniugi (mediamente più elevata rispetto al
passato);
8
- difficoltà ed esigenze sociali che inducono la coppia a
programmare il concepimento in un’epoca più tardiva;
- incremento delle malattie sessualmente trasmesse;
- stress;
- abitudini voluttuarie (tabagismo, uso di droghe, abuso di alcol ed
altro);
- nuovo ruolo sociale della donna che, essendo sempre di più
allontanata dal nucleo familiare, convive sempre meno con il
proprio coniuge;
- inquinamento;
In base a quanto esposto possiamo dire che è utile un attento
monitoraggio epidemiologico del fenomeno sia in sede locale che
nazionale ed internazionale.
Tale monitoraggio per essere efficace deve essere condotto non
solamente attraverso l’analisi di dati demografici, ma soprattutto
attraverso l'utilizzo di inchieste di tipo diretto mirate ad
individuare il problema riproduttivo nelle sue diverse espressioni.
Solo così sarà possibile riconoscere e studiare più
approfonditamente i fattori di rischio e condurre idonee
campagne informative di prevenzione.
Ad esempio per quanto riguarda l’infertilità maschile in Italia
nonostante negli ultimi anni gli uomini abbiano preso maggior
9
coscienza del loro ruolo primario nelle difficoltà legate al
concepimento, la quasi totalità (90%) non fa prevenzione e non
consulta l’andrologo preventivamente, dato oltremodo allarmante
tenendo conto che la maggior parte dei casi di infertilità maschile
hanno origine da patologie uro-genitali, che in diversi casi si
possono prevenire o curare.(5)
Un secondo dato preoccupante è che ben il 50% degli uomini
italiani non si sottopone a visita andrologica nemmeno a seguito
di una diagnosi di infertilità.(6)
10
Infertilità Femminile
L’infertilità femminile può essere dovuta a diversi fattori:
fattore neuro-endocrino, ovulatorio, tubarico, uterino-
endometriosico, immologico e cervicale.
FATTORE NEUROENDOCRINO
Si calcola che il 40-50% dell’infertilità femminile abbia origine
da disfunzioni endocrine. Qualunque anomalia lungo l’asse
ipotalamo-ipofisi-gonadi può portare o ad una mancanza di
ovulazione o ad un alterato ciclo ovulatorio oppure ad una
secrezione ormonale disregolata.
Perché avvenga l’ovulazione si deve produrre una sorta di
“reazione a cascata” ormonale. Alcuni neuroni dell’ipotalamo
liberano l’ormone chiamato GnRH, questo raggiunge la
ghiandola pituitaria anteriore che, a sua volta, rilascia le
gonadotropine, cioè gli ormoni follicolo-stimolante (FSH) e
luteinizzante (LH). Sono questi ad agire sull’ovaio portando a
maturazione il follicolo e, quindi, alla produzione della cellula
uovo; se infatti il follicolo non viene portato a completa maturità,
sino al rilascio della cellula uovo, non potrà avvenire l’incontro
di quest’ultima con gli spermatozoi ed il conseguente
concepimento.
11
I principali problemi ormonali che causano sterilità sono:
A) “l’ipogonadismo e ipogonadismo ipogonadotropo”:
consiste nello scarso funzionamento delle gonadi e nella ridotta
produzione di gonadotropine. Di norma bassi livelli di GnRH
sono correlati a problemi dell’ipotalamo la cui funzionalità può
essere compromessa da neoplasie o altri tipi di lesioni; mentre
bassi livelli di FSH o LH sono correlati a problemi dell’ipofisi. In
questo caso si parla di ipogonadismo centrale.
In alcuni casi sono il “semplice” risultato di un forte stress
emotivo o fisico; alcune atlete, ad esempio, soffrono di
amenorrea (mancanza di mestruazione per almeno tre mesi
consecutivi) a causa dell’eccesso sforzo profuso nell’attività
sportiva. Questo è un esempio di ipogonadismo primario in cui la
causa è un mal funzionamento delle gonadi.
Anche disagi psichici, quali l’anoressia o la bulimia,
possono determinare sterilità femminile su base ormonale.
B) “FSH o ipogonadismo ipergonadotropo” : consiste in
un mal funzionamento delle gonadi (cioè delle ovaie)
accompagnato ad un aumento delle gonadotropine; le ovaie non
svolgono il loro lavoro e non rispondono agli stimoli del
cervello; e poiché l’ipofisi, per sollecitare le ovaie a lavorare,
12
mette in circolo maggiori quantità di ormone follicolo stimolante
(l’FSH appunto) il risultato è un aumento di questo ormone.
C) “l’iperprolattinemia : è un ormone prodotto dall’ipofisi;
il suo ruolo fisiologico nella donna è quello di preparare durante
la gravidanza, in sinergismo con estrogeni e progesterone, la
ghiandola mammaria alla lattazione e successivamente al parto
quello di mantenere e promuovere la lattazione.
A causa di stress, all’uso di particolari farmaci, o alla
presenza di adenoma ipofisario si può verificare un rilascio
eccessivo di prolattina; elevati livelli di quest’ultima possono
interferire con la produzione di GnRH e con il funzionamento
delle ovaie, causando anovulazione e irregolarità mestruale.
D) “l’ipotiroidismo”: le disfunzioni della tiroide possono
interferire con la fertilità, causando irregolarità mestruali e
disturbi dell’ovulazione.
È soprattutto l’ipotiroidismo ad interferire con la fertilità.
In primo luogo il rallentamento generale del metabolismo che si
ha nell’ipotiroidismo provoca un rallentamento anche del
metabolismo degli ormoni sessuali ed in particolare dell’FSH, la
cui quantità di conseguenza può aumentare. In secondo luogo
quando la tiroide non lavora abbastanza lipotalamo e l’ipofisi
cercano di stimolarla aumentando la quantità di TRH ( ormone di
13
rilascio della tireotropina ) e di TSH ( ormone tireostimolante ), il
quale a sua volta provoca un aumento della prolattina che può
causare iperprolattinemia.
Un lieve aumento della prolattina non dà in genere alcun
sintomo, ma all’aumentare dei valori si hanno in genere disturbi
dell’umore ( ansia, irascibilità ), irregolarità mestruale. La
mancanza delle mestruazioni e la galattorrea ( cioè la fuoriuscita
di latte dai capezzoli ) si hanno solo se la prolattina è molto alta.
FATTORE OVULATORIO
La maturazione periodica ed il rilascio dell’ovocita pronto per
essere fecondato sono una tappa fondamentale del processo
riproduttivo femminile; disfunzioni ovulatorie possono essere
fonte di sterilità femminile.
Esempio sono:
a) “la sindrome dell’ovaio policistico” : è un disturbo
complesso delle ovaie; gli ovociti maturi vengono
periodicamente espulsi dall'ovaio durante il processo di
ovulazione per essere fecondati ad opera degli spermatozoi. In
presenza di questa sindrome le ovaie hanno dimensioni superiori
alla media e presentano al loro interno numerose cisti, piccole
cavità ripiene di liquido; la superficie esterna appare punteggiata
da un numero anomalo di piccoli follicoli.
14
I follicoli ovarici presentano differenti stadi di sviluppo; la loro
maturazione è influenzata da alcuni ormoni prodotti dall'ipofisi,
una ghiandola endocrina situata alla base dell'encefalo. Nella
sindrome dell'ovaio policistico molti follicoli non raggiungono
mai il completo sviluppo, l'ovulazione avviene raramente e le
pazienti presentano una condizione di infertilità. I cicli mestruali
sono irregolari: possono trascorrere anche molte settimane senza
che si presenti una mestruazione. Altri segni della sindrome sono
una condizione di sovrappeso e la presenza di un'eccessiva
quantità di peli superflui.
b)”la sindrome del follicolo luteinizzato”: è una rara
disfunzione ovulatoria, caratterizzata dalla presenza nelle ovaie
di follicoli che si trasformano direttamente in corpo luteo senza
rilasciare l’oocita; di conseguenza i cicli sono anovulatori.
c)Si parla di “insufficienza della fase luteale” quando la fase
luteale del ciclo (durante la quale il corpo luteo rilascia
progesterone per mantenere alto l’endometrio), dura meno di 10-
11 giorni. Così l’endometrio non si sviluppa abbastanza da
consentire il mantenimento dell’impianto dell’embrione.
FATTORE TUBARICO
Il fattore tubarico di infertilità comprende una serie di condizioni
che determinano alterazioni od ostruzioni delle tube di Falloppio
15
che, in genere, si associano a malattia infiammatoria pelvica o a
precedente chirurgia pelvica o tubarica.
Le alterazioni della funzionalità tubarica possono essere causa di
infertilità interferendo con la captazione dell'ovocita e con la sua
migrazione nella tuba, oppure possono determinare una
alterazione quantitativa o qualitativa del fluido tubarico che a sua
volta può interferire con il processo di fecondazione dell'ovocita
da parte dello spermatozoo.
In genere si hanno però delle lesioni ostruttive a carico della
tuba. Tali lesioni possono realizzarsi a vari livelli:
prossimalmente o distalmente rispetto alla cavità uterina. Mentre
le lesioni prossimali possono essere più probabilmente ricondotte
ad un processo flogistico ascendete (cioè che risale dall'utero),
quelle distali vengono più facilmente ricondotte a processi
infiammatori che originano dall'intestino o dagli organi pelvici.
FATTORE ENDOMITRIOSICO
E’ una malattia cronica ginecologica caratterizzata dalla presenza
di endometrio, mucosa che riveste la cavità uterina, in sedi
ectopiche, esterne alla cavità, ove normalmente non dovrebbe
essere rappresentato. Questo tessuto si và a localizzare in organi
quali: ovaio, tube, peritoneo, legamenti utero-sacrali, vagina,
vescica, intestino, e setto retto-vaginale.
16
Le “isole endometriosiche” possono bloccare le tube di
Falloppio o alterare i processi ovulatori.
Inoltre ogni mese, per effetto dell’ attività ormonale ovarica,
il tessuto endometriale impiantato in sede anomala va incontro a
sanguinamento, nello stesso modo in cui si verifica per
l’endometrio in fase di desquamazione mestruale. Tale
sanguinamento comporta un’irritazione dei tessuti circostanti,
che dà luogo all’innesco di processi infiammatori con formazione
di tessuto cicatriziale ed esiti aderenziali.
FATTORE CERVICALE:
Gli spermatozoi per raggiungere e penetrare l'ovocita da
fecondare devono compiere un lungo percorso attraverso il tratto
genitale femminile, e la cervice uterina ha un ruolo importante in
questo processo. Essa, con la sua attività secretiva, svolge le
seguenti funzioni:
1. Protegge lo spermatozoo dall'ambiente vaginale ostile.
2. Fornisce l'energia aggiuntiva necessaria allo spermatozoo.
3. Facilita il passaggio dello sperma dalla vagina all'utero durante il
periodo ovulatorio
4. Preserva gli spermatozoi vitali entro le cripte cervicali e consente
la loro liberazione fino a 3 giorni dall'eiaculazione.
17
Spesso si manifesta come un’incapacità a produrre il normale muco
cervicale nella quantità e caratteristiche idonee. Ciò può essere
causato anche da infezioni che hanno danneggiato le ghiandole che
producono il muco. Altre volte nella cervice si trovano anticorpi
antispermatozoo che sono in grado di immobilizzare gli spermatozoi
stessi, anche in presenza di una quantità e di una consistenza normali
di muco cervicale. Tale condizione viene spesso detta
“incompatibilità di coppia”: si tratta di una forma di infertilità
immunologica molto rara.
In tutti questi casi il collo dell’utero può rappresentare una
barriera davvero impenetrabile.
Oggetto del nostro studio è stata l’alterazione del muco cervicale
nell’interazione con gli spermatozoi.
18
Che cos’è il muco cervicale
E’ proprio ad opera delle ghiandole presenti nel collo o cervice
uterina che viene prodotto il muco cervicale, una secrezione
eterogenea, composta per il 90% da acqua.
Negli esseri umani, la cervice ha una struttura cilindrica di
diversi centimetri di lunghezza, composta principalmente da
tessuto muscolare e fibroso. Indicativamente al centro, la cervice
uterina è perforata da un dotto longitudinale denominato canale
endocervicale. L’estremità prossimale del canale
endocervicale (orifizio cervicale interno) si apre nella cavità
uterina, mentre l’estremità distale (orifizio cervicale esterno) è
situato nella parte superiore della vagina. L’orifizio cervicale
esterno è, usualmente, rivolto verso il fornice vaginale posteriore.
Dopo l’eiaculazione, l’orifizio esterno della cervice rimane
immerso nel liquido seminale deposto nel fornice della vagina
posteriore.
Il canale endocervicale è rivestito da una membrana mucosa che
forma un intricato sistema di pieghe e recessi denominate
cripte cervicali. È lo spazio più interno delle cripte che
immagazzina gli spermatozoi, ed è l’epitelio della mucosa che
19
produce secrezioni vitali per il sostegno ed il trasporto degli
spermatozoi.
Il numero, la dimensione e la localizzazione delle cripte cervicali
variano con l’età e sono influenzati dall’ambiente ormonale
predominante nelle varie fasi del ciclo mestruale. Il canale
cervicale, inoltre, contiene cellule secernenti muco la cui quantità
e composizione dipende dal numero di cripte e dalla
concentrazione degli ormoni sessuali.
La quantità e la qualità del muco cambiano durante il ciclo sotto
l’influsso dei vari ormoni, ed è per questo che ci si può servire
dell’osservazione del muco per monitorare l’ovulazione.
Il muco ha soprattutto una funzione protettiva: è una sorta di
tappo del canale cervicale, che chiude il passaggio tra la vagina e
l’utero impedendo che batteri e altri organismi entrino nella
cavità uterina. Perciò per gran parte del ciclo il muco è
impenetrabile agli spermatozoi, e solo per alcuni giorni, in
prossimità dell’ovulazione, si trasforma in modo da consentire il
passaggio degli spermatozoi verso l’utero.
Al di fuori del muco gli spermatozoi non possono sopravvivere
nell’ambiente acido della vagina, e solo quelli che riescono ad
entrare nel muco riescono a sopravvivere.
20
Dentro il muco fertile, che li protegge e gli fornisce nutrimento,
gli spermatozoi vivono molte ore (fino a 4-5 giorni), durante le
quali escono continuamente per raggiungere l’utero.
Il muco funziona dunque come serbatoio per gli spermatozoi; se
la quantità di muco non è sufficiente, o se le caratteristiche
chimiche lo rendono ostile agli spermatozoi, la fecondazione non
può avvenire anche se i rapporti avvengono nel periodo giusto.
Per cui l’interazione con le secrezioni del tratto riproduttivo
femminile è di importanza per la sopravvivenza e per la capacità
funzionale degli spermatozoi.
La valutazione dell’interazione tra spermatozoi e muco cervicale
è un importante criterio che deve essere incluso in ogni studio
completo di infertilità.
Il reperto di un’alterata interazione tra sperma e muco cervicale
può rappresentare un’indicazione per l’inseminazione o
applicazione di strategie terapeutiche.
21
Caratteristiche chimico fisiche del muco cervicale
Il muco cervicale mostra particolari proprietà fisiche :
CONSISTENZA; SPINNABARKET e FERNING
(cristallizzazione a foglie di felce).
La consistenza è influenzata dalla aggregazione molecolare e
dalla concentrazione di proteine e ioni.
Il muco varia in consistenza durante il ciclo: è assai viscoso nella
fase premestruale (spesso ricco di cellule), mentre ha una
consistenza acquosa a metà del ciclo, subito prima
dell’ovulazione. Appena avvenuta l’ovulazione, la viscosità del
muco comincia nuovamente ad aumentare.
Lo spinnabarket (filanza) descrive le caratteristiche di fibrosità,
filanza ed elasticità del muco cervicale.
Il fernign si riferisce al grado e alle caratteristiche di
cristallizzazione (appunto a foglia di felce) che si osservano
quando il muco si essicca su una superficie di vetro.
Esso è un gel acquoso composto da una matrice proteica e dal
plasma cervicale. Entrambi i componenti sono molto ricchi di
acqua di cui sono composti all’85-95%. Quast’ultima agisce da
22
mezzo idratante per la matrice proteica insolubile ad alta
viscosità e da veicolo per le molecole solubili del plasma
cervicale. I costituenti solubili del plasma cervicale sono
numerosi, Sali inorganici (soprattutto cloruro di sodio, potassio,
rame, zinco, calcio magnesio e così via), composti a basso peso
molecolare come: maltosio, proteine e lipidi. Il compito
principale di questi componenti consiste nel fornire un mezzo
adeguato alla preservazione ed alla migrazione dello sperma.
Nel tessuto cervicale sono presenti anche cellule plasmatiche
produttrici di IgG e IgM.
La parte centrale del muco cervicale, che ne determina l’aspetto a
gel e gran parte delle proprietà fisiche, è costituito da una
macromolecola denominata mucina. La produzione di mucina
è stimolata dagli estrogeni, ma le proprietà finali del muco
dipendono dal rapporto estrogeni/progesterone che, da un lato,
determina la quantità, dall’altro la sua viscosità.
Inoltre acqua, elettroliti, proteine solubili ed altre sostanze
provenienti dai vasi sanguigni determinano la composizione
finale del muco e di conseguenza le sue proprietà necessarie a
svolgere la sua funzione biologica principale e cioè permettere la
penetrazione allo sperma.
23
Controllo ormonale del ciclo mestruale
Il ciclo mestruale è l’insieme dei meccanismi che portano la
donna all’ovulazione cioè alla maturazione della cellula uovo o
ovocita. L’intero ciclo è sotto il controllo dell’ipofisi e
dell’ipotalamo.
Le mestruazioni formano una normale parte di un processo
ciclico naturale che si svolge nelle donne sane tra la pubertà e la
fine della fertilità. L’inizio delle mestruazioni, conosciuto come
“menarca”, avviene attorno ai 12 anni, ma è normale tra gli 8
e i 16. fattori come l’eredità, la dieta e soprattutto la salute
possono accelerare o ritardare il menarca.
L’ultimo periodo, la menopausa, solitamente sopraggiunge tra i
45 e i 55 anni.
La presenza di mestruazioni non prova che l’ovulazione abbia
avuto luogo: le donne che non ovulano possono avere cicli
mestruali; questi sono definiti cicli anovulatori. inoltre,
l’assenza di mestruazioni non prova che la fertilizzazione sia
avvenuta poiché la mancata produzione dell’ormone in donne
non incinte può sopprimere in certe occasioni il flusso mestruale.
Il ciclo di una donna dura in media 28 giorni e può essere diviso
in 3 fasi sulla base degli eventi endocrini:
24
FASE FOLLICOLARE
in questa fase del ciclo ovarico l’ipofisi rilascia una quantità
modesta di FSH (ormone follicolostimolante) e LH (ormone
luteinizzante) in risposta agli stimoli provenienti dall’ipotalamo;
in questa fase le cellule del follicolo immaturo dispongono di
recettori per l’ormone FSH ma non per l’ormone LH. Le
molecole di FSH inducono l’accrescimento da 5 a 7 follicoli
ovarici e le cellule di tale struttura in sviluppo producono
estrogeni. Il follicolo più grande secerne inibina che serve a
fermare i follicoli sopprimendo la produzione di FSH. Questo
follicolo dominante continua a crescere, forma un
rigonfiamento vicino alla superficie dell’ovaia, e diventa presto
competente per l’ovulazione. Una bassa concentrazione di
estrogeni da parte del follicolo mantiene la secrezione di
gonadotropine ipofisarie (FSH, LH) a livelli parimenti modesti
attraverso un meccanismo di feedback negativo.
Questi rapporti ormonali si modificano nella fase ovulatoria
quando il ritmo della secrezione di estrogeni da parte del
follicolo in sviluppo inizia a crescere molto rapidamente; per un
controllo di feedback positivo aumenteranno anche le
gonadotropine (FSH, LH). Ormai la maturazione del follicolo è
arrivata ad un punto tale che questa struttura dispone di recettori
25
per l’ormone LH e può rispondere a questa molecola segnale che
determina nel follicolo stesso la definitiva maturazione;
l’ovulazione si verifica circa 24 h dopo la comparsa del picco di
LH, in seguito all’ovulazione, LH stimola la formazione del
corpo luteo, una particolare struttura cicatriziale che funziona
come ghiandola endocrina.
I follicoli producono estrogeni che iniziano la formazione di un
nuovo strato di endometrio nell’utero, storicamente conosciuto
come “endometrio proliferativo”.
Se fecondato, l’embrione sarà impiantato all’interno di questa
mucosa.
OVULAZIONE
Quando il follicolo è maturato, secerne abbastanza estradiolo da
portare al rilascio dell’ormone luteinizzante ( LH ). In ogni ciclo
medio questo rilascio di LH avviene intorno al 12 giorno e può
durare 48h. Il rilascio di LH fa maturare l’ovulo e indebolisce la
parete del follicolo ovario. Questo processo porta all’ovulazione :
il rilascio dell’ovulo maturo, la cellula più grande del corpo.
L’ovulo, lasciata l’ovaia, inizia il suo percorso attraverso le tube
di Falloppio, verso la cavità uterina.
L’orifizio del canale cervicale è aperto e da esso scende un muco
trasparente e filante. Si pensa che questo speciale tipo di muco
26
cominci ad uscire dall’utero 24-48 h prima dell’ovulazione e che
duri 48 h. si ritiene che i 4 giorni successivi all’inizio della
secrezione di muco filante siano fecondi.
Il muco dell’ovulazione è alcalino, per permettere la
sopravvivenza degli spermatozoi, che nell’acidità vaginale
morirebbero in poche ora, e costituisce materialmente una strada
per entrare nell’utero.
FASE LUTEA (O LUTEINICA)
il corpo luteo è il corpo solido che si forma nelle ovaie dopo che
l’ovulo è stato rilasciato dalle tube di Falloppio, è cresciuto e si è
diviso. Dopo l’ovulazione, il follicolo residuo si trasforma in
corpo luteo con l’aiuto di ormoni secreti dall’ipofisi. Se è
avvenuta la fecondazione questo corpo produce, oltre gli
estrogeni, anche un altro ormone, il progesterone, che prepara la
mucosa dell’utero a ricevere l’uovo fecondato, favorendo
l’immagazzinamento di sostanze nutritive ed un maggiore
afflusso di sangue. Nel caso invece che l’uovo non sia stato
fecondato il corpo luteo degenera e cessa di produrre ormoni; di
conseguenza il livello di progesterone crolla. Parte della mucosa
uterina si stacca e viene espulsa assieme all’ovulo non fecondato,
dando origine ad una perdita di sangue che dura alcuni giorni e
che non è altro che la mestruazione.
27
Alterazione del muco cervicale
Le alterazioni cicliche dei costituenti del muco cervicale umano
possono influenzare la capacità penetrativa degli spermatozoi e la
loro sopravvivenza: la penetrabilità agli spermatozoi inizia
approssimativamente alla nona giornata di un ciclo normale di 28
giorni, ed aumenta gradualmente per raggiungere il massimo in
corrispondenza dell’ovulazione. Successivamente, la
penetrabilità inizia a diminuire, prima ancora che sono evidenti
cambiamenti delle caratteristiche del muco.
La secrezione del muco cervicale non è un fenomeno casuale e
neppure dipendente dall’ovulazione; è invece un fenomeno
indotto dagli ormoni ovarici.
In base agli ormoni coinvolti vengono distinti due tipi principali
di muco:
• tipo E : estrogenodipendente;
• tipo G : progestinodipendente;
entrambi sono sempre presenti in porzioni variabili.
Il tipo E è prodotto in seguito al 17-beta-estradiolo (estrogeno) e
in fase preovulatoria rappresenta il 97% del muco prodotto.
il muco di tipo E ha una struttura di macromolecole filiformi che
si dispongono parallelamente.
28
Può essere ulteriormente diviso in EL in cui la struttura è
organizzata in canali verticali ma molto stretti che permettono a
stento il passaggio degli spermatozoi e in ES in cui i canali sono
più larghi e permettono un facile passaggio degli spermatozoi. Il
muco di tipo G ha una struttura costituita di micelle piccole con
spazi irregolari che non formano canali ordinati bensì una sorta
di rete e impedisce di fatto il passaggio degli spermatozoi.
Il muco man mano che ci si avvicina all’ovulazione diventa
sempre più organizzato in canali facilmente attraversabili dagli
spermatozoi, il muco ovulatorio contiene il 20-25% di ES, il 72
% di EL ed il 3% di G.
Il muco EL ha una funzione di sostegno dei canali che sono
formati prevalentemente da muco di ES, inoltre EL ha anche la
funzione di intrappolare gli spermatozoi anomali in quanto non
hanno quasi mai un andamento rettilineo.
Il fattore cervicale di infertilità è dovuto alla produzione di muco
non idoneo alla penetrazione degli spermatozoi e/o anticorpi da
parte della mucosa endocervicale.
Le cause che stanno alla base del fattore cervicale possono
essere:
ANATOMICHE
- anatomiche sul collo dell’utero;
29
- sinechie cervicali;
FUNZIONALI
- muco cervicale ostile;
- muco cervicale acido;
INFIAMMATORIE
- endocerviciti;
IMMUNOLOGICHE
- produzione di anticorpi antispermatozoi;
30
La consistenza del muco cervicale
E’il più importante dei fattori che influenzano la penetrazione
degli spermatozoi. Durante la fase ovulatoria, a metà del ciclo, la
resistenza alla progressione degli spermatozoi è minima, mentre
un muco viscoso, come quello che si osserva nella fase luteinica,
rappresenta una barriera impenetrabile. Detriti cellulari e
leucociti, nel muco cervicale, possono impedire la migrazione
degli spermatozoi.
Il muco cervicale subisce delle modificazioni nel corso del ciclo
ovulatorio in relazione alle variazioni ormonali. In particolare
l’aspetto, la consistenza e la quantità di questo fluido si
modificano in relazione al cambiamento dei livelli di estrogeni.
Gli estrogeni hanno un andamento del tutto particolare durante
tutto il ciclo mestruale.
Durante la fase follicolare aumentano progressivamente la
vascolarizzazione, la congestione, l’edema e la secrezione
mucosa. L’orifizio uterino esterno si apre di circa 3 mm
momento dell’ovulazione per poi tornare ad 1 mm. L’aumento di
estrogeni causa un aumento della quantità del muco cervicale di
10-30 volte. L’azione degli estrogeni determina la secrezione di
un muco sempre più abbondante, fluido e più filante.
31
L’elasticità del muco (filanza) aumenta, come accade per
l’arborizzazione (arborizzazione a foglie di felce del muco
essiccato su un vetrino ed esaminato al microscopio), che diventa
più evidente subito prima dell’ovulazione.
L’arborizzazione indica l’aumentata concentrazione di NaCl nel
muco cervicale, un effetto degli estrogeni.
Se gli estrogeni sono in scarsa quantità, il muco sarà assente o in
misura ridotta: muco scarso, denso e poco filante.
Durante la fase luteinica, il progesterone determine ispessimento
del muco cervicale che diventa meno fluido e perde la sua
elasticità e la capacità di determinare l’arborizzazione a “foglia di
felce”.
È stato documentato che in realtà solo una minoranza di
spermatozoi eiaculati procede verso il tratto genitale superiore;
molti permangono in vagina e vengono inattivati. A livello del
canale cervicale lo sperma entra in contatto con il muco che, se
da un lato agisce da barriera per gli spermatozoi con anomalie
della motilità e della morfologia, dall’altro con la sua
microarchitettura , sensibile al clima estrogenico, guida gli
spermatozoi verso la cavità uterina. Sotto l’influenza degli
estrogeni la cervice secerne un muco estremamente idratato, in
cui il contenuto di acqua può raggiungere il 96%, essendo la
32
quota di idratazione correlata alla capacità di penetrazione degli
spermatozoi: la valutazione dell’idratazione del muco
cervicale è infatti parametro affidabile per individuare i
giorni fertili del ciclo.
Inoltre le cripte della mucosa cervicale sembrano in grado di
“intrappolare” gli spermatozoi per conservarlo e dargli una via
preferenziale nella risalita verso la cavità uterina.
Il muco rappresenta il FATTORE PRIMARIO DI
FECONDITà, cioè la condizione prima ed indispensabile di
penetranza e di migrazione, nelle vie genitali femminili, degli
spermatozoi.
La fecondità o capacità di penetranza e di migrazione degli
spermatozoi, essendo regolata dall’andamento delle secrezione
mucosa cervicale, varierà con le modificazioni della struttura
chimico-fisica del muco.
Ci sarà così, in base alla quantità e alla qualità del muco
cervicale, più o meno capacità di penetranza spermatica.
L’indice di possibilità di concepimento varierà, di conseguenza,
continuamente entro il periodo di secrezione di muco. Seguendo
le variazioni di questo.
33
Anticorpi anti spermatozooi
Il sistema mucoso rappresenta il sistema immunocompetente più
importante nell’organismo femminile per la produzione degli
anticorpi provenienti dalle plasmacellule. Gli ASAb
appartengono alla classe IgA, mentre quelli circolanti nel sangue
o nella linfa appartengono alla classe IgG e IgM.
Una donna sessualmente attiva viene esposta continuamente a un
gran numero di antigeni spermatici da quando comincia i suoi
rapporti sessuali, che, però, normalmente non attivano il suo
sistema immunocompetente se non in particolari condizioni.
Vi sono molte teorie al riguardo: traumi, periodi mestruali,
lesioni dell’epitelio della cervice e così via.
La presenza di ASAb nel muco cervicale determina
agglutinazinone e immobilizzazione degli spermatozoi, dopo la
deposizione in vagina e la loro successiva penetrazione nel muco.
Ciò impedisce a quegli spermatozoi la risalita nel canale
cervicale dopo la loro deposizione in vagina nel muco cervicale e
quindi il raggiungimento dell’ovulo nelle tube.
Vanifica quindi i rapporti, anche quelli “mirati” nel giorno
ovulatorio, e provoca infertilità di coppia inspiegata, che talora
può diventare anche molto prolungata. Va anche considerato che
gli ASAb del muco cervicale producono alterazioni della
34
membrana degli spermi penetrati che diventano inabili alla
fertilizzazione, sia per alterazioni della membrana della testa, che
per alterazioni del DNA ivi contenuto. L’abitudine di considerare
il test per la ricerca degli anticorpi per ultimo, dopo aver
condotto a termine tutti gli altri o dopo terapie prolungate che
non portano a nessun risultato, produce fino al 5% delle cause
che producono infertilità inspiegata di coppia. Talora esistono
nella storia clinica di queste pazienti diversi Post-Coital-Tests
negativi, con presenza di muco ovulatorio ottimale per
consistenza, filanza e ferning, ma con chiara presenza in esso di
spermatozoi agglutinati e immobilizzati, di partners che
mostrano, peraltro in più esami seminali, concentrazioni
spermatiche per unità di volume, nella norma.
Quando gli ASAb sono riscontrabili nel muco cervicale (IgA)
sono riscontrabili anche nel siero come IgG e IgM per cui le
ricerche devono essere effettuate in entrambi i sistemi.
Le coppie con anticorpi anti-spermi non devono essere
considerate sterili ma poco fertili.
35
Felcizzazione
La cristallizzazione del muco cervicale dipende dalla % di
elettroliti e dalla composizione chimica del secreto cervicale per
effetto della produzione di estrogeni, dai quali dipende pure la
quantità del muco stesso, che nel periodo periovulatorio
raggiunge i 700 mg/24h.
La cristallizzazione è indicativa di una sufficiente produzione di
estrogeni da parte dell’ovaio : si manifesta con la comparsa di
una cristallizzazione a "piccole foglie di felce" già al 5°-6°
giorno del ciclo, con arborizzazioni progressivamente più grandi
fin verso il 12° giorno ed un ulteriore aumento della superficie
delle foglie di felce in fase ovulatoria.
Questa caratteristica insieme alla presenza di un muco chiaro,
limpido, trasparente ma soprattutto poco viscoso e filante
favorisce la progressione degli spermatozoi dalla vagina
all’interno dell’utero.
Infatti il fenomeno della cristallizzazione evidenzia che in esso si
formano canali percorribili dagli spermatozoi al fine di facilitarne
la progressione.
Il muco cervicale è indubbiamente uno dei mezzi migliori per
garantire la motilità degli spermatozoi, infatti, sono stati ritrovati
36
spermatozoi mobili nel canale cervicale fino a 205 h dopo il
coito.
Per cui la cervice uterina e la sua secrezione fungono sia da
serbatoio che da selettore di spermatozoi.
Le condizioni patologiche che compromettono una qualsiasi delle
complicate funzioni della cervice, possono causare un’alterazione
della penetrazione dello sperma e quindi infertilità. Tra tutte le
possibili alterazioni cause d’infertilità il trasporto alterato dello
sperma rappresenta una malattia della cervice uterina. Per una
valutazione del muco esistono diversi test, tra questi il test
postcoitale (PCT) che si basa sulla valutazione del numero di
spermatozoi in movimento qualche ora dopo il coito.
L’approccio generale alla classificazione ed al trattamento
dell’infertilità dovuta ad un’alterazione della funzione cervicale
può essere sintetizzato nei seguenti termini:
• Nei casi di ridotta penetrazione spermatica dovuta a deficienza
estrogenica, la valutazione del fattore cervicale rivela una
risposta normale della mucosa endocervicale alla stimolazione
esogena. Dopo la somministrazione di etinilestradiolo, viene
prodotto un muco abbondante, con qualità fisiche e biologiche
normali. In questi casi, il fattore cervicale è normale, e
37
l’induzione dell’ovulazione con gonadotropine umane
determinerà una corretta stimolazione della cervice, una
produzione di muco adeguato ed una normale penetrazione
spermatica. Test postcoitali persistentemente negativi,
concomitanti con la ridotta penetrazione dello sperma del marito
attraverso il muco della moglie e dell’eventuale donatrice,
indicano un difetto spermatico che può essere più o meno
evidenziato all’esame del liquido seminale.
• Nei casi di test postcoitali anormali che mostrano ripetutamente
un’assenza totale di sperma nel muco cervicale, ma in cui risulti
un buon muco cervicale facilmente penetrabile dallo sperma del
marito in vitro, il problema principale riguarda un’alterazione
della deposizione spermatica. In casi rari e facilmente
diagnosticabili, una deposizione spermatica alterata può essere
imputata a ragioni anatomiche, quali differenti gradi di ipospadia,
malposizione cervicale o prolasso uterino grave. Nella maggior
parte dei casi essa deriva da una funzione sessuale impedita.
Impotenza celata o non comunicata sono le cause principali di
questa alterazione. In tali casi, l’inseminazione artificiale con
sperma del partner rappresenta il trattamento più efficace. Va
ricordato che questa terapia costituisce semplicemente una
38
soluzione medica efficace e non deve essere mai applicata senza
una concomitante terapia psicologica e/o sessuologica.
• La mancanza di una risposta da parte delle cripte endocervicali
alla stimolazione estrogenica (dismucorrea) può costituire la
sequela tardiva di un processo infiammatorio o la conseguenza di
tecniche chirurgiche quali la conizzazione, l’amputazione o
l’elettrocoagulazione della cervice uterina. Una delle tecniche
che trova maggiore risultato è l’inseminazione intrauterina,
utilizzando sia l’eiaculato frazionato che lo sperma “purificato”
del marito.
39
Alterazioni Anatomiche
Altre cause di infertilità femminile possono riguardare anomalie
dell’utero sia della sua parte più estesa in addome, cioè il corpo
uterino, sia di quello che sporge in vagine, il collo o cervice. I
fibromi, ad esempio, sono masse fibrose che frequentemente si
trovano nell’utero ma di rado sono causa di infertilità a meno che
non sporgano in cavità uterina. Il corpo dell’utero può presentare
delle malformazioni come i setti, specie di speroni che sporgono
in cavità uterina e disturbano l’impianto dell’embrione quando
superano certe dimensioni.
Il collo dell’utero, invece, può essere responsabile del fattore
cervicale di infertilità femminile. Questo si può verificare nel
caso dell’aplasia o agenesia : malformazione congenita
caratterizzata da assenza o arresto dello sviluppo di un tessuto o
di un organo durante il processo di differenziamento e sviluppo
embrionale.
Se infatti viene a mancare il collo dell’utero, dove sono presenti
le cellule responsabili della secrezione del muco cervicale, gli
spermatozoi in assenza di muco non possono risalire in cavità
uterina e poi verso le tube.
40
Endocerviciti
Le infiammazioni della mucosa del canale cervicale sono
determinate dall’arrivo di germi che possono raggiungerla sia in
conseguenza di infezioni primitivamente genitali che di infezioni
delle vie urinarie propagatesi dal tratto genitale.
Nelle forme batteriche di infezioni i germi si localizzano e si
moltiplicano all’interno delle ghiandole: la prima conseguenza è
rappresentata da un eccesso delle secrezioni cervicali, che
modificano il pH (da lievemente alcalino a lievemente acido) e
tale variazione implica una modificazione del normale habitat
della flora vaginale.
Causa di infiammazione sono anche la comparsa di aderenze,
chiamate anche adesioni o sinechie, sono formazioni di tessuto
che legano tra loro organi o parti che normalmente sarebbero
staccati.
Un tipo particolare di aderenze sono quelle che si formano dentro
l’utero ( SINECHIE ENDOUTERINE ) o nel collo ( SINECHIE
INRTACERVICALI ), alle quali si dà il nome di Sindrome di
Asherman. Queste aderenze occludono più o meno
completamente il canale cervicale, impedendo la normale
produzione di muco cervicale, e quindi possono causare difficoltà
nel concepimento o aborto; spesso causano irregolarità mestruali
41
( in particolare una diminuzione del flusso ) che possono arrivare
fino all’amenorrea.
Qualunque cosa provochi un trauma o un’infiammazione nella
zone peritoneale può causare la formazione di aderenze.
Le cause più comuni delle aderenze sono infatti:
- INTERVENTI CHIRURGICI sugli organi genitali; ad esempio un
raschiamento dell’utero è la prima causa di adesioni intrauterine;
- INFEZIONI ACUTE o CRONICHE in particolare dovute a malattie
sessualmente trasmesse;
- ENDOMETRIOSI, che creano uno strato di infiammazione perenne e la
formazione di aderenze in tutti gli organi pelvici.
Le aderenze sono a volte totalmente asintomatiche, ma possono
provocare dolore pelvico anche forte, dolori mestruali, crampi e
dolori intestinali.
Le aderenze possono essere rimosse chirurgicamente;
l’intervento dà buoni risultati per le aderenze uterine, mentre le
percentuali di gravidanza sono basse dopo gli interventi alle tube.
L’alternativa è la procreazione assistita.
42
Tecniche di Procreazione Medicalmente Assistita
Si definiscono come tecniche di PMA tutte quelle procedure che,
agendo direttamente sugli spermatozoi ( gamete maschile ), gli
ovociti (gamete femminile) o gli embrioni, consentono di
superare alcuni ostacoli alla fecondazione naturale per un
progetto finalizzato a realizzare una gravidanza.
Le tecniche di PMA sono attualmente rappresentate da una vasta
gamma di opzioni terapeutiche a diverso grado di invasività, sia
tecnica che psicologica sulla coppia. Tali tecniche vengono
classificate in I, II, e III livello sulla base della loro complessità e
del grado di invasività.
La tecnica che viene utilizzata per ovviare il problema del muco
cervicale è l’inseminazione intrauterina: è una procedura di
Procreazione Medicalmente Assistita di I livello basata sulla
deposizione del seme opportunamente preparato direttamente
all’interno della cavità uterina, sincronizzando tale procedura con
l’ovulazione.
A seconda della zona ove viene depositato il seme
l’inseminazione viene definita INTRACERVICALE (nel collo
dell’utero ), INTRAUTERINA ( nella cavità uterina ),
43
INTATUBARICA ( nelle tube ), INTRAPERITONEALE ( nella
cavità addominale, non più in uso ).
Oggigiorno è prassi comune ricorrere all’inseminazione
intrauterina, che è quella di più semplice esecuzione. Si divide in
OMOLOGA ed ETEROLOGA a seconda che si usi il seme del
partner maschile della coppia o si ricorra alla banca del seme
(consentito soltanto in alcuni paesi esteri).
L’inseminazione artificiale omologa viene praticata
principalmente nei casi di ostilità del muco cervicale ed in alcuni
casi di sterilità inspiegata : in periodo periovulatorio il seme del
partner viene deposto direttamente nella cavità uterina, evitando
così il contatto con il muco cervicale.
L’inseminazione artificiale eterologa è stata vietata in Italia a
seguito della legge 40 del 2004 che regolamenta la procreazione
medicalmente assistita.
L’inseminazione intrauterina ( IUI ), è spesso associata a
stimolazione farmacologia per indurre la stimolazione follicolare.
Il razionale di tale tecnica è volta ad aumentare il numero di
spermatozoi che raggiungono le tube superando la barriera
cervicale ed a correggere disfunzioni che possono risultare
misconosciute durante l’iter diagnostico.
44
I presupposti affinché sia possibile ricorrere all’inseminazione
intrauterina sono:
- l’assenza di un fattore maschile di infertilità di grave entità;
- l’assenza di alterazioni a carico delle tube;
Questa tecnica riconosce come principali indicazioni:
- presenza di oligo-spermia moderata;
- endometriosi minima;
- fattore cervicale ( anche di tipo immunologico );
- insufficienza della fase luteale;
- tutte le condizioni di infertilità idiopatica in cui sia stata
esclusa la presenza di alterazioni a carico delle tube o
del tratto genitale inferiore;
Come si procede : generalmente si esegue una stimolazione
ovarica; normalmente in un ciclo spontaneo la donna produce un
solo follicolo dominante; in questa procedura si esegue una
induzione controllata dell’ovulazione ottenendo la produzione di
un numero di follicoli maggiori di uno anche se pur sempre in un
numero limitato; quando la tecnica follicolare appare
soddisfacente, il medico induce l’ovulazione mediante la
somministrazione di un farmaco ( HCG ). Circa 2h prima del
momento scelto per l’inseminazione si richiede all’uomo di
fornire un campione del liquido seminale. Si procede al
45
trattamento del seme in laboratorio per selezionare gli
spermatozoi dotati di una maggiore vitalità e per eliminare germi
e detriti.
Il seme così preparato viene caricato in un tubicino di plastica (
catetere ) ed introdotto in cavità uterina. La paziente dopo circa
30 minuti può tornare a casa.
La tecnica non prevede anestesia né locale né generale, e si può
paragonare come grado di invasività all’esecuzione di un pap-
test.
Può essere fatta su ciclo spontaneo ( senza stimolazione ) o su
ciclo stimolato ( stimolazione ovarica ).
I vantaggi del ciclo spontaneo sono l’assenza, in pratica, di
stimolazione farmacologica per la donna.
Lo svantaggio maggiore dello spontaneo risale nel fatto che un
solo ovocita, nella maggior parte delle ipotesi, viene ovulato e
pertanto le chance di successo sono teoricamente più basse.
L’immissione direttamente dentro la cavità uterina permette di
abbreviare quindi il cammino che dovranno effettuare gli
spermatozoi stessi, evitando di incontrare la cervice uterina,
luogo a volte impenetrabile per la presenza di muco ostile, o di
anticorpi anti-spermatozoo.
46
Il rischio di questa tecnica è gravidanza plurima in caso di
eccessiva o incontrollata stimolazione.
47
SCOPO DEL LAVORO
Lo studio condotto nella presente tesi si basa sull’analisi del
muco cervicale di pazienti arrivati al centro con diagnosi di
infertilità idiopatica (cioè quando il medico non ha potuto
determinare la causa dell’infertilità della coppia), ed in caso di
programmazione di rapporti mirati.
Nell'ambito dello studio dei fattori che possono essere alla base
di condizioni di infertilità femminile i dosaggi ormonali
rivestono un ruolo di fondamentale importanza.
Essi possono essere eseguiti in diversi momenti del ciclo
mestruale. In linea di massima possiamo distinguere esami basali
(eseguiti nelle fasi iniziali del ciclo mestruale) ed esami eseguiti
in seconda fase.
Gli esami basali hanno principalmente lo scopo di valutare la
riserva ovarica e di escludere la presenza di patologie che
possono interferire sulla funzione riproduttiva. Essi vengono in
genere eseguiti il 2° o al massimo il 3° giorno del ciclo e
consistono principalmente nel dosaggio di FSH, LH, Estradiolo,
Progesterone, Prolattina.
Il dosaggio di alcuni ormoni al di fuori della fase basale riveste in
primo luogo un ruolo di rilievo nella diagnostica dell'ovulazione.
48
Al momento dell'ovulazione infatti il follicolo si trasforma
divenendo corpo luteo il quale secerne progesterone. Questo
ormone agisce a livello della mucosa dell'utero (cioè
dell'endometrio) inducendone una trasformazione secretiva che è
fondamentale per accogliere l'embrione. Il dosaggio del
progesterone dopo il 14° giorno del ciclo ha quindi un ruolo
fondamentale ai fini di valutare il realizzarsi del fenomeno
ovulatorio. Ulteriori dosaggi servono inoltre per cercare di capire
se la seconda fase del ciclo è di lunghezza adeguata, esistono
infatti delle condizioni di insufficienza luteinica in cui i livelli di
progesterone si riducono troppo precocemente inducendo un
anticipo delle mestruazioni ed impedendo pertanto un adeguato
impianto dell'embrione.
Avendo eseguito i dosaggi ormonali basali e soprattutto gli
intermedi di ciclo in pazienti stimolati e non, abbiamo osservato
alterazioni del quadro ormonale; sono state associate queste
alterazioni endocrine con la qualità del muco cervicale.
A tal fine abbiamo selezionato 18 pazienti, prelevando il muco
cervicale nel periodo periovulatorio ed eseguendo un PCT (Post
Coital Test).
49
MATERIALI E METODI
POST COITAL TEST
Usato molti anni nella diagnostica di sterilità di coppia il Post
Coital Test (PCT) o test di Sims Hunter anche se non esente da
discussioni e controversie, ancora oggi rimane (secondo molti)
un esame insostituibile e di grande utilità.
Il suo scopo è quello di valutare le caratteristiche del muco
cervicale e la quantità-motilità degli spermatozoi in esso presenti
dopo alcune ore dal rapporto sessuale.
Può essere ritenuto come uno strumento di indagine inserito tra
quelle che sono le indagini di I livello (basilari) nella diagnostica
della coppia sterile; fornisce infatti fondamentali e preziose
informazioni “in vivo” sull’interazione sessuale uomo-donna
senza alcun artificio laboratoristico.
RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEL MUCO CERVICALE
I prelievi non sono dolorosi, non vi è alcun rischio e non è
necessario il ricovero; l’unico discomfort è legato alla necessità
di uno speculum vaginale con la paziente in posizione
ginecologica (tipica posizione assunta in occasione della visita
ostetrico-ginecologica).
L’orifizio esterno deve essere delicatamente pulito con un
tampone di cotone per rimuovere eventuali contaminanti vaginali
50
esterni. Vengono quindi condotti dei prelievi nel fornice vaginale
(fondo alla vagina), sulla superficie del collo uterino (orifizio
uterino esterno) ed al suo interno (canale cervicale).
Il muco viene prelevato aspirando con una siringa da tubercolina
(senza ago), una siringa da muco, una pipetta o un capillare di
polietilene.
Se è possibile la qualità del muco dovrebbe essere valutata
immediatamente dopo il prelievo, in caso contrario dovrà essere
conservato con cura fino al momento dell’osservazione.
Il muco può essere conservato nella stessa siringa per
tubercolina, in capillari di polietilene o in piccole provette, chiuse
con un tappo o con carta paraffinata per evitarne la
disidratazione, e facendo attenzione a ridurre al minimo la
quantità di aria nel contenitore per la conservazione. I campioni
dovranno essere conservati in frigorifero a 4 °C per un periodo
che non superi i 5 giorni. Il muco dovrà essere utilizzato
preferibilmente entro 2 giorni dal prelievo, registrando il tempo
intercorso tra la raccolta e l’utilizzo. Non devono essere effettuati
test di penetrazione spermatozoaria o prove reologiche su
campioni di muco che siano stati congelati e scongelati.
VALUTAZIONE DEL MUCO CERVICALE
51
La valutazione delle proprietà del muco cervicale comprende lo
studio della filanza, della cristallizzazione, della consistenza e del
pH.
Queste caratteristiche del muco cervicale sono quantificate
secondo il sistema definito da Moghissi (1976), basato
sull’originaria proposta di Insler et al. (1972). Il punteggio
massimo è 15, ma un punteggio superiore a 10 è generalmente
indice di una buona qualità di muco, capace cioè di favorire la
penetrazione degli spermatozoi; un punteggio inferiore a 10,
invece, indica un muco di qualità scadente. Il punteggio deriva
dal volume del muco cervicale raccolto e da quattro variabili che
descrivono il suo aspetto e le sue caratteristiche (consistenza,
cristallizzazione, filanza e cellularità). Il pH del muco non
compare nel calcolo del punteggio totale del muco cervicale, ma
dovrebbe essere misurato come un importante fattore
nell’interazione tra spermatozoi e muco cervicale (Eggert-Kruse
et al., 1993).
VOLUME
Il volume viene valutato come segue:
0 = 0 ml 1 = 0,1 ml 2 = 0,2 ml 3 = 0,3 ml o più. CONSISTENZA
52
La consistenza del muco cervicale è il più importante dei fattori
che influenzano la penetrazione degli spermatozoi. Durante la
fase ovulatoria, a metà ciclo, la resistenza alla progressione degli
spermatozoi nel muco è minima, mentre un muco viscoso, come
quello che si osserva nella fase luteinica, rappresenta una barriera
impenetrabile. Detriti cellulari e leucociti, nel muco cervicale,
possono impedire la migrazione degli spermatozoi, ed anche
estese endocerviciti possono essere associate ad una ridotta
fertilità.
Alla consistenza si attribuisce il seguente punteggio:
0 = muco premestruale, compatto, altamente viscoso
1 = muco di viscosità intermedia
2 = muco leggermente viscoso
3 = muco preovulatorio (metà ciclo), minimamente viscoso.
CRISTALLIZZAZIONE
La cristallizzazione viene valutata esaminando il muco
asciugato all’aria sopra un vetrino portaoggetti. Una simile
preparazione può evidenziare diversi pattern di cristallizzazione
che possono avere un aspetto simile ad una felce. In funzione
della composizione del muco, la “foglia di felce” può avere solo
un ramo primario, o il ramo può essere ramificato una, due o tre
volte, per formare, rispettivamente, rami secondari, terziari e
53
quaternari. Devono essere analizzati diversi campi all’interno del
preparato, ed il punteggio indica il più alto grado di
cristallizzazione del campione,secondo le seguenti definizioni:
0 = mancanza di cristallizzazione
1 = cristallizzazione atipica
2 = cristallizzazione con ramificazioni primarie e secondarie
3 = cristallizzazione con ramificazioni terziarie e quaternarie.
FILANZA
Il muco cervicale posto su un vetrino portaoggetti viene toccato
con un coprioggetto o con un secondo vetrino, tenuto
trasversalmente, che viene poi delicatamente sollevato. La
lunghezza del filamento di muco cervicale che si forma tra i due
vetrini viene misurata in centimetri, e classificata come segue:
0 = < 1 cm
1 = da 1 a 4 cm
2 = da 5 a 8 cm
3 = 9 cm o più.
CELLULARITÀ
Il conteggio di tutte le cellule dovrebbe essere espresso in
cellule/mm3 (ml). Una stima del numero dei leucociti e di altre
cellule nel muco cervicale, tradizionalmente, si basa sul numero
contato in campo ad alto numero di ingrandimenti (HPF). Una
54
combinazione di lenti che produce HPF è un oculare ad ampio
campo (diametro di apertura 20 mm) da 10x ed un obiettivo da
40x. Dal momento che l’ampiezza del campo visivo del
microscopio è uguale al diametro dell’apertura dell’oculare
diviso per l’ingrandimento dell’obiettivo, questo sistema di lenti
produce un campo microscopico con un diametro approssimativo
di 500 mm. Lo spessore del preparato, allo stesso modo, può
venire standardizzato appoggiando il coprioggetto sopra del
grasso al silicone contenente sferette di vetro di 100 mm
(Drobnis et al., 1988). Se lo spessore del campo d’osservazione è
di 100 mm, il suo volume dovrebbe essere 0,02 mm3. Di
conseguenza, in queste condizioni, il conteggio di 10 cellule/HPF
corrisponde ad approssimativamente a 500 cellule/mm3.
I valori per la classificazione delle cellule sono:
0 = > 20 cellule/HPF o > 1000 cellule/mm3
1 = 11-20 cellule/HPF o 501-1000 cellule/mm3
2 = 1-10 cellule/HPF 01-500 cellule/mm3
3 = 0 cellule.
PH
Il pH del muco del canale endocervicale dovrebbe essere
misurato con una apposita cartina, range 6,4-8,0, in situ oppure
subito dopo la raccolta. Se il pH viene misurato in situ, bisogna
55
prestare attenzione ad agire correttamente, dal momento che il
pH del muco esocervicale è sempre più basso di quello del muco
del canale endocervicale. E’ necessario inoltre prendere
precauzioni per evitare la contaminazione con le secrezioni
vaginali, che hanno un pH acido.
Gli spermatozoi sono sensibili alle variazioni di pH del muco
cervicale: un muco acido immobilizza gli spermatozoi, mentre un
muco alcalino può esaltarne la motilità. Una eccessiva basicità
del muco cervicale (pH superiore a 8,5) può, tuttavia, avere un
effetto negativo sulla vitalità degli spermatozoi. Il valore ottimale
del pH per la migrazione e la sopravvivenza degli spermatozoi
nel muco cervicale è compreso tra 7,0 e 8,5, il range di pH, cioè,
del muco periovulatorio normale. Un valore di pH compreso tra
6,0 e 7,0, tuttavia, può ancora essere ritenuto compatibile con la
penetrazione degli spermatozoi.
In alcuni casi il muco cervicale può essere sensibilmente più
acido, sia per una alterata secrezione, sia per la presenza di
un’infezione batterica.
56
RISULTATI
Durante il periodo dello svolgimento della presente tesi abbiamo
studiato 18 coppie, i maschi avevano i requisiti di inserimento in
un programma di rapporti mirati, le donne non mostravano
particolari alterazioni ormonali basali. Le donne sono state
sottoposte al prelievo di muco cervicale dopo circa 6-8 ore dal
rapporto, successivamente si è proceduto alla valutazione dei
parametri rilevanti ai fini dell’attribuzione di un punteggio al test,
facendo particolare attenzione alla valutazione della
cristallizzazione:
o 8 donne hanno presentato un muco cervicale con punteggio ≥
di 10 e quindi idoneo alla penetrazione degli spermatozoi. Di
queste donne, in quattro casi la cristallizzazione del muco si
presentava primaria e secondaria mentre negli altri quattro
casi la cristallizzazione si prentava terziaria e quaternaria.
o 8 donne hanno presentato un muco con punteggio < di 10 e >
5 e quindi sfavorevole alla penetrazione degli spermatozoi;
infatti all’esecuzione del PCT si è osservata una bassa
presenza di spermatozoi in 7 casi, rendendo pertanto il test
insufficiente, in 1 solo caso si è osservata buona presenza di
57
spermatozoi con relativo PCT medio. Tutti i casi presentano
una cristallizzazione soltanto primaria o secondaria.
o Due donne hanno presentato un muco con punteggio ≤ di 5 e
quindi ostile alla penetrazione degli spermatozoi; infatti
all’esecuzione del PCT questo è risultato insufficiente in un
caso, in cui la cristallizzazione era assente, e negativo
nell’altro dove la cristallizzazione era atipica.
Punteggio Muco Cervicale
8
8
2
Ideale
Sfavorevole
Ostile
58
N° Giorno Ciclo E2 LH Prog Volume Consistenza Ferning Spinnbarkeit Cellularità Muco PCT
1 14 1221 12,54 5,29 2 2 2 3 3 12 Eccellente
2 11 431 3,84 0,82 3 2 3 1 3 12 Medio
3 13 272 27 3,18 1 3 2 2 3 11 Medio
4 13 885 7,4 6,2 2 1 2 1 2 8 Medio
5 9 315 6,87 1,2 3 3 3 1 3 13 Medio
6 14 82 9,5 3,38 1 2 2 1 1 7 Insufficiente
7 11 2136 1,66 1,07 2 1 0 0 1 4 Insufficiente
8 12 1749 1,77 10,97 3 0 1 1 1 6 Insufficiente
9 10 765 7,3 0,4 3 2 2 1 2 9 Insufficiente
10 16 725 19,5 1,24 3 2 1 1 2 9 Medio
11 12 1578 8,56 2,7 3 1 2 1 2 9 Insufficiente
12 14 683 3,82 0,91 3 2 2 2 2 11 Buono
13 11 1160 4,89 1,66 3 2 3 2 2 12 Buono
14 12 1363 13,7 10,05 1 2 2 1 1 7 Insufficiente
15 12 170 37,4 1,17 1 1 2 2 1 7 insufficiente
16 14 884 16,2 1,3 3 2 3 3 1 12 Buono
17 13 87 45 5,6 1 1 1 1 1 5 Negativo
18 12 1126 63,5 1,62 2 2 2 3 2 11 Medio
59
DISCUSSIONE
Dall’elaborazione dei dati ottenuti nel presente lavoro si evince
che i pazienti con un punteggio di muco ≥ di 10 mostrano
normalità dei singoli parametri indagati e associazione con un
normale assetto ormonale.
Ferning in pz con Muco Ideale
441° e 2°
3° e 4°
N° E2 LH Prog Vol Consistenza Ferning Spinnbarkeit Cellularità Muco
5 315 6,87 1,2 3 3 3 1 3 13
1 1221 12,54 5,29 2 2 2 3 3 12
2 431 3,84 0,82 3 2 3 1 3 12
13 1160 4,89 1,66 3 2 3 2 2 12
16 884 16,2 1,3 3 2 3 3 1 12
3 272 27 3,18 1 3 2 2 3 11
12 683 3,82 0,91 3 2 2 2 2 11
18 1126 63,5 1,62 2 2 2 3 2 11
60
Foto: 1 – muco ideale, cristallizzazione terziaria e quaternaria.
61
Foto: 2 – muco ideale, cristallizzazione terziaria e quaternaria.
62
I pazienti che mostrano un punteggio di muco < di 10 e > di 5
presentano almeno una alterazione in 1 dei 5 parametri presi in
considerazione per la valutazione, inoltre mostrano delle
alterazioni in uno dei tre ormoni indagati per lo studio della
funzione ovulatoria.
Ferning in pz con Muco Sfavorevole
261° e 2°
Atipica
N° E2 LH Prog Vol Consistenza Ferning Spinnbarkeit Cellularità Muco
9 765 7,3 0,4 3 2 2 1 2 9
10 725 19,5 1,24 3 2 1 1 2 9
11 1578 8,56 2,7 3 1 2 1 2 9
4 885 7,4 6,2 2 1 2 1 2 8
6 82 9,5 3,38 1 2 2 1 1 7
14 1363 13,7 10,05 1 2 2 1 1 7
15 170 37,4 1,17 1 1 2 2 1 7
8 1749 1,77 10,97 3 0 1 1 1 6
63
Foto: 3 – muco sfavorevole, cristallizzazione primaria e secondaria
64
Delle due donne che hanno un punteggio di muco cervicale ≤ a 5,
una ha mostrato un quadro ormonale tipico di disendocrinopatia,
l’altra paziente presentava un normale assetto ormonale, ma
verosimilmente il test è stato eseguito in netto anticipo rispetto al
periodo ovulatorio.
Ferning in pz con Muco Ostile
1 1 Assente
Atipico
N° E2 LH Prog Vol Consistenza Ferning Spinnbarkeit Cellularità Muco
17 87 45 5,6 1 1 1 1 1 5
7 2136 1,66 1,07 2 1 0 0 1 4
65
Foto: 4 – muco ostile, cristallizzazione assente o atipica.
66
CONCLUSIONI
Dall’esame dei seguenti dati si evince che pazienti con
un’alterazione di uno dei parametri valutati al fine
dell’attribuzione di uno score al muco cervicale, sono associati
con una alterazione di almeno uno dei parametri ormonali o di un
alterato rapporto tra estradiolo, progesterone ed ormone
luteinizzante, pur rientrando singolarmente nel range di
normalità, ciò si traduce in una scarsa penetrazione degli
spermatozoi lungo il canale cervicale. Quindi in realtà un
apparente caso di sterilità idiopatica può ricondursi ad una
condizione facilmente diagnosticabile con semplici indagini
cliniche, strumentali e di laboratorio, che opportunamente
corretta può riportare la donna ad una fisiologica gravidanza,
evitando inutili ulteriori esami e/o inserimenti in programmi di
fecondazione assistita. Ulteriori dati sono necessari per dare
significatività statistica al presente lavoro.
67
BIBLIOGRAFIA
Ambrosi G. et al., Anatomia dell’uomo, Edi-Ermes, Milano,
2008.
“Barriers to Assisted Conception treatment”- Light speed
research, June 2004.
Becher N., Waldorf KA, Hein M., Uldbjerg N., the cervical
mucus plug: structured review of the literature, Acta Obstet
Gynecol Scand, 2009.
Brunelli R., Papi M., Arcovito G., Bompiani A., Castagnola M.,
Parasassi T., Sampaolese B., Vincenzoni F., De Spirito M.,
Globular structure of human ovulatory cervical mucus, Faseb
journal, 2007.
Cardellini P., Ciani F. et al., Citologia e Istologia, Idelson-
Gnocchi, 2004.
68
Cucchi L., L donna ha più voglia di maternità, Quotidiano il
Giornale, 2009.(3);(4)
De Sutter P., Rational diagnosis and treatment in infertility, Best
Pract. Res. Clin. Obstet Gynaecol, 2006.
Di Prospero F., Epidemiologia dell’infertilità, Modulo
Organizzativo di Endocrinologia Ginecologica Civitanova
Marche, pubblicato nel sito www.salutedonna.it, 2007.
Dossier Medicina News, L’infertiltà è la mancanza di
concepimento dopo 12 mesi di rapporti liberi non protetti,
pubblicato nel sito www.dossiermedicina.it (5);(6).
Flamigni C., La procreazione assistita, Bologna, il Mulino, 2006.
Gilbert S.F., Biologia dello sviluppo, Bologna, 1996.
Hrometz SL, Gates VA, Review of available infertilità
treatments, Drugs today, 2009.
Raso M., trattato di Anatomia Patologica Clinica, Piccin,
Padova, 1986.
69
Reno A., Ricerca Auto-Anticorpi-Antisperma(nel muco e nel
siero della partner), pubblicato nel sito
www.renoannibalo.it/italiano/anticorpi_donna.htlm.
Rhoades R., Pflanzer R., Fisiologia Generale e Umana, Piccin,
Padova, 2004.
Rosati P., Colombo R., La cellula, Edi-Ermes, Milano, 1999.
Scaravelli G., che cos’è l’infertilità, Istituto Superiore di Sanità:
Registro Nazionale Procreazione Medicalmente Assistita.(2)
Scaravelli G., Infertilità maschile e femminile, Istituto Superiore
di Sanità: Registro Nazionale Procreazione Medicalmente
Assistita.(7)
Vaglio N., Ginecologia Clinica, Piccin, Padova, 1983.
W M Saltzman, M L Radomsky, K J Whaley, and R A Cone,
Antibody diffusionin human cervical mucus, Biophysical journal,
1994.
70
Willem Ombelet, Ian Cooke, Silke Dyer, Gamal Serour, and Paul
Devroey, Infertility and the provision of infertility medical
services in developing countries, Hum Reprod Update.
2008.(1)
World Healt Organization, Manuale di laboratorio per l’esame del liquido
seminale umano e dell’interazione tra spermatozoi e muco cervicale, Istituto
Superiore di Sanità, quarta edizione, 2001.
71
I N D I C E
PREMESSA .................................................................................................. 1
INTRODUZIONE......................................................................................... 4
CONCETTO DI INFERTILITÀ ........................................................... 4
EPIDEMIOLOGIA APPLICATA ALL'INFERTILITÀ ...................... 6
INFERTILITÀ FEMMINILE ............................................................. 10
CHE COS'È IL MUCO CERVICALE ................................................ 18
CARATTERISTICHE CHIMICO FISICHE DEL MUCO C............. 21
CONTROLLO ORMONALE DEL CICLO ........................................... 23
ALTERAZIONI DEL MUCO CERVICALE..................................... 27
LA CONSISTENZA DEL MUCO CERVICALE ............................................ 30
ANTICORPI ANTI SPERMATOZOI ........................................................... 33
LA FELCIZZAZIONE .............................................................................. 35
ALTERAZIONI ANATOMICHE ................................................................ 39
ENDOCERVICITI ................................................................................... 40
TECNICHE DI PROCREAZIONE MEDICALMENTE ASSISTITA (PMA) ...... 42
SCOPO DEL LAVORO ............................................................................ 47
MATERIALI E METODI ........................................................................... 49
POST COITAL TEST ............................................................................... 49
72
RISULTATI ................................................................................................ 56
DISCUSSIONE........................................................................................... 59
CONCLUSIONI.......................................................................................... 66
BIBLIOGRAFIA......................................................................................... 67
73
Ringraziamenti
Ringrazio la prof.ssa Renata Viscuso per la cortese disponibilità
e gentilezza.
Ringrazio il Centro Aster di Diagnosi e Cura della Sterilità,
presso la Clinica del Mediterraneo di Ragusa, nelle persone del
Dott. Giovanni Bracchitta, del Dott. Nunzio Minniti e del Dott.
Roberto lo Frano per la disponibilità e professionalità
dimostrata, grazie ai quali non soltanto ho potuto approfondire
lo studio nel settore della fecondazione assistita, ma ho anche
ricevuto dei preziosi insegnamenti sia nell’ambito lavorativo che
di vita.
Ringrazio la mia famiglia per avermi sostenuta in questo
percorso, per aver condiviso con me tutte le piccole vittorie che
hanno portato a questa grande conquista; per la forza che mi
hanno sempre dato.
Ringrazio gli amici di sempre che hanno condiviso con me tanti
momenti fra cui il mio percorso universitario.
Ringrazio gli amici che da un po’ hanno incrociato la mia strada
portando nella mia vita sole, allegria e un bene immenso.
Ringrazio i miei colleghi nei quali ho trovato dei veri amici,
persone uniche e speciali che porto nel cuore sempre nonostante
74
la distanza; per tutti i momenti condivisi, per esserci dati la forza
di andare avanti non solo nello studio ma nelle piccole cose di
ogni giorno; grazie perché per me siete stati una seconda casa.
