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genere Bacillus Famiglia: Bacillaceae genere Clostridium UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIA Facoltà di MEDICINA e CHIRURGIA Corso di Laurea in Medicina e Chirurgia AA 2012-2013

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genere BacillusFamiglia: Bacillaceae

genere Clostridium

UNIVERSITA' degli STUDI di PERUGIAFacoltà di MEDICINA e CHIRURGIA

Corso di Laurea in Medicina e ChirurgiaAA 2012-2013

• Gram + (a volte si decolorano e appaiono Gram -)• Sporigeni• Anaerobi stretti• Ubiquitari: presenti in suolo, acqua, tratto GI

dell’uomo e degli animali

CLOSTRIDI

Clostridium tetaniClostridium botulinumClostridium difficileClostridium perfringens

specie di interesse medico

Clostridi: patogenicità

Il potere patogeno dei clostridi è attribuito a:1) capacità di sopravvivere in condizioni ambientali

avverse mediante la FORMAZIONE DI SPORE.2) rapidità di crescita in ambienti ricchi di nutrienti e privi

di ossigeno.3) capacità di produrre numerose TOSSINE (istolitiche,

enterotossine e neurotossine).

Clostridium tetani

• bacillo di piccole dimensioni

• mobile

• sporigeno

• acapsulato

• Gram + (a volte Gram -)

• le spore sono in posizione terminale, rotonde (“a mazza di tamburo”)

TETANOLISINA: emolisina ossigeno-labile analogaalla streptolisina O

TETANOSPASMINA: neurotossina, responsabile delle manifestazioni cliniche del tetano. E’ prodotta dalla cellula durante la fase stazionaria.

Fattori di virulenza

produce 2 tossine:

TETANOSPASMINA• E’ codificata in un plasmide.• E’ prodotta come singola molecola (150 KDa) che viene scissa da proteasiin due subunità peptidiche:subunità leggera (catena A) e subunità pesante(catena B) tenute insieme da un ponte disolfuro.• La catena A, è una zinco-endopeptidasi• La catena B si lega con l’estremità -COOH terminale ad un recettore sulla superficie dei motoneuroni (ganglioside GM2 , residui di acido sialico). • La tossina viene internalizzata in una vescicola endocitica e risale dalle terminazioni periferiche al SNC (soma dei motoneuronidel midollo spinale) tramite trasporto assonale retrogrado. • Dopo acidificazione della vescicola endosomicala catena A viene rilasciata nel citosol

A

B

La tetanospasmina viene rilasciata dai dendriti post-sinaptici, attraversa lo spazio giunzionale della sinapsi, e va a localizzarsi a livello delle vescicole delle terminazioni nervose presinaptiche.La tetanospasmina agisce scindendo le proteine di superficie delle vescicole del neurotrasmettitore (VAMP),impedendone il legame alle proteine del bottone sinaptico(SNAP-25, sintaxina, sinaptobrevina) e quindi bloccando il rilascio dei neurotrasmettitori inibitori GABA (acido gamma-amino-butirrico)e glicina, determinando una PARALISI SPASTICA.

Il legame della tossina è irreversibileper cui la guarigione dipende dal temponecessario alla formazione di nuove terminazioni assoniche.

A. la trasmissione nervosa è regolata dall’equilibrio tra neurotrasmettitori eccitatori ed inibitori.

B. i neurotransmettitori inibitori (GABA, glicina) prevengono la depolarizazione della membrana postsinaptica e la conduzione delsegnale elettrico.

C. la tetanospasmina non interferisce con la produzione delGABA o della glicina, ma con il loro rilascio (attività presinaptica).

D. In assenza di neurotrasmettitori inibitori, l’eccitazione degli assoni non viene contrastata.

EpidemiologiaC. tetani è ubiquitario. Colonizza il tratto gastroenterico di animali erbivori e dell’uomoed è presente soprattutto sul terreno.La forma vegetativa è sensibile alla presenza di ossigeno, la forma sporale può invece sopravvivere a lungo.Attualmente si stima che nel mondo si verificano 1 milione dicasi/anno, con una mortalità compresa fra il 20 e il 50%.

TETANO: tappe patogenetiche

Trauma: ingresso delle spore

Anaerobiosi nella lesione (necrosi): germinazione delle spore

Crescita fino alla fase stazionaria nella stessa sede: produzione della tossina

Migrazione della tossinaper via anterograda: fino alle sinapsi inibitorie

Inibizione rilascio GABA e Glicina: PARALISI SPASTICA

Passaggio a livello pre-sinaptico: inibizione rilascio vescicole pre-sinaptiche

Trauma: danno tissutale

Il periodo di incubazione dalla ferita alla comparsa dei sintomi varia da alcuni giorni a diverse settimane a seconda:• della dose infettante • del sito di infezione (più o meno distale)

Forme di tetano:- generalizato- locale- cefalico- neonatale

Tetano generalizzato (o discendente) tutta la tossina prodotta non può essere assorbita dalle terminazioni nervose locali e quindi passa in circolo ed è assorbita successivamente dai nervi motori. I centri più suscettibili sono a livello di testa e collo ed i primi sintomi sono rappresentati dal TRISMA (contrazione dei muscoli masseteri), con SPASMO MUSCOLARE DISCENDENTE dal collo al tronco ed agli arti. PARALISI RESPIRATORIA per interessamento dei muscoli respiratori.Segni clinici: trisma, risus sardonicus (contrazione dei muscoli facciali), opistotono, sudorazione, irritabilità, aritmia, disidratazione.Stimoli ambientali possono scatenare lo spasmo.

trisma opistotono

risus sardonicus

Forma localizzata (o ascendente) La tossina viaggia lungo la via neuronale (nervi periferici) e le manifestazioni sono limitate alle aree di danno primario.

Il tetano localizzato si manifesta spesso in persone vaccinate in modo inadeguato e, di solito, si risolve spontaneamente.E’caratterizzato da una contrazione dei muscolicircostanti la zona di inoculazione delle spore epuò essere accompagnato da una lieve formadi trisma dovuta alla diffusione della tossina,per via nervosa ascendente, al tratto superioredel midollo spinale.

Altre forme:cefalico : interessa la testa con paralisi

dei nervi cranicineonatale : taglio del cordone ombelicale

con bisturi contaminati

tetano neonatale

Diagnosi

E’ prevalentemente clinica

Esame microscopico: non praticabile sul campione biologico

Coltura in anaerobiosi: a lenta crescita e difficile

PROVA BIOLOGICA: dimostrazione della presenza della tossina nelle feci o nel siero può essere effettuata mediante prova biologica nel topolino (test di neutralizzazione in vivo)

Prevenzione e terapiaTrattamento del tetano manifesto- terapia di supporto- pulizia delle ferite - somministrazione di penicillina, metronidazolo- somministrazione di siero antitetanico

PrevenzioneIn pz non esposti: vaccinazione con vaccino anatossico

(tossoide tetanico: 3 dosi + dose booster ogni 10 anni)In pz esposti (se non immuni): siero antitetanico + vaccino

Vaccino anatossico:• La esotossina trattata con

formalina al 4%O, per 40 giorni a 37°C, perde il potere tossico e mantiene il potere antigenico (anatossina). L’anatossina evoca anticorpi antitossici.

• Occorre eseguire inoculazioni di richiamo dopo 5-10 anni dalla vaccinazione completa.

Vaccinazione antitetanica

Vaccinazione antitetanica

Calendario italiano delle vaccinazioni obbligatorie:

• 3° mese: polio inattivato, difterite tetano, HBV.• 5° mese: polio inattivato, difterite, tetano, HBV.• 11° mese: polio inattivato, difterite, tetano, HBV.• 3° anno: polio inattivato.• 6° anno: difterite, tetano.

Clostridium botulinum

Clostridium botulinum

• E’ suddiviso in 4 gruppi (I - II - III - IV) sulla base del tipo di tossina prodotta e della sua attività proteolitica.

• I ceppi I e II sono repsonsabili della maggior parte della patologia nell’uomo

• Esistono 7 tossine distinte antigenicamente (A, B, C, D, E, F, G)

• I tipi A, B, E, F sono associati alla patologia nell’uomo.

Fattori di virulenza: tossina botulinicaTossina A-B strutturalmente simile alla tossina tetanica.La proteina intera ha un peso molecolare di 150 KDa ed è

formata da 2 o più subunità (A-B)La subunità A è neurotossica (zinco-endopeptidasi)Le parti B -non tossiche- proteggono la neurotossina

dall’inattivazione da parte degli acidi dello stomacoLa tossina blocca la neurotrasmissione a livello delle sinapsi

colinergiche, prevenendo il rilascio del neurotrasmettitore acetilcolina (paralisi flaccida)

- esiste anche una tossina dimerica che altera la permeabilità vascolare.

La neurotossina viene assorbita dalla mucosa dell’intestino tenue, entra nel circolo sanguigno e diffonde fino alle terminazione nervose delle sinapsi neuromuscolari. La subunità B della tossina si lega a acido sialico e glicoproteine sui motoneuroni, la subunità A viene endocitata e inattiva le proteine (SNAP-25, sinaptobrevina) che regolano il rilascio dell’acetilcolina, determinando blocco della contrazione muscolare (paralisi flaccida).

Fibra nervosa

Fibra muscolare

Neurotrasmettitore Acetilcolina

La tossina botulinica provoca paralisi flaccida bloccando il rilascio di acetilcolina

Sina

psi c

olin

ergi

cape

rifer

ica

BOTULISMO INTOSSICAZIONE BOTULINICA

paralisi flaccida acuta, afebbrile,simmetrica, discendente, ad inizio bulbare

TOSSINA BOTULINICA

TOSSINA BOTULINICA

Per via endovenosa o intramuscolare 0.09 - 0.15 µg

Per via inalatoria 0.7 - 0.9 µg

Per via orale 70 µg

Dose letale :

A differenza delle spore, la neurotossina ètermolabile, venendo inattivata da un trattamento a 100 C° per 10 minuti.La bollitura di alimenti contaminati prima del loro consumo, elimina la tossina attiva. Una volta ingerita, la tossina non viene inattivata dal pH acido e dagli enzimi proteolitici dello stomaco

Forme di botulismoBotulismo alimentare (forma classica)

50 casi di botulismo all’anno dovuti a cibi inscatolati in casa (tossine di tipo A e B); consumo di pesce surgelato (tossina d tipo E).

Botulismo infantile associato al consumo di cibo (in particolare miele) contaminato da spore botuliniche100 casi ogni anno

Botulismo da ferite contaminate per presenza di spore nel suolo, acqua, alimenti conservati in casararo

Botulismo alimentare (classico):• Periodo d’incubazione dopo consumo di alimenti: 1-2 giorni• Quadro clinico:

Si ha un primo interessamento dei nervi cranici, seguito da un blocco simmetrico e discendente dei motoneuroni.

vertigini, debolezza, diplopia, midriasi, xerostomia, stipsi (effetti anticolinergici della tossina).dolori addominali apiressiadebolezza dei muscoli periferici (astenia)paralisi flaccida progressivamorte per paralisi respiratoria

• La mortalità si è ridotta dal 70% al 10% mediante l’impiego di cure supportive come nella cura delle complicazioni respiratorie.

Alimenti a rischio

Insaccati

Alimenti in scatola

Conserve fattein casa

Botulismo da ferite:Produzione in vivo della tossina nella feritaPeriodo d’incubazione: 4 giorniSintomi identici al botulismo alimentare

Botulismo infantile:Bambini di 1-6 mesiColonizzazione del tratto gastrointestinale e

produzione di neurotossina.CostipazioneParalisi flaccidaArresto respiratorioMortalità: 1-2 %

Diagnosi di botulismo:

• La diagnosi clinica, confermata dall’isolamento colturale o dalla dimostrazione della presenza di tossina nel cibo.

• Per isolare Clostridium botulinum in campioni contaminati, occorre riscaldare il materiale per 10’ ad 80°C per uccidere i batteri contaminanti non sporigeni.

• La dimostrazione della presenza della tossina nelle feci o nel siero può essere effettuata mediante prova biologica nel topolino (test di neutralizzazione in vivo)

Trattamento • Supporto ventilatorio adeguato • Eliminazione del germe dal tratto GI: lavaggio

gastrico• Terapia con penicillina, metronidazolo• Uso di antisieri trivalenti (A, B, E)

Controllo• Distruzione delle spore nei prodotti alimentari• Distruzione della tossina preformata (80°C x 20’)• Evitare l’alimentazione con miele in bambini di meno

di 1 anno di età.

Tossina botulinica: altri possibili effetti ……….

positivo (?!)Botox etc.

negativo (come possibile arma nel bioterrorismo)

Clostridium difficile

Clostridium difficile

Causa malattie associate alla somministrazione prolungata di antibiotici.

FORME CLINICHE:- colonizzazione asintomatica- diarrea autolimitante- colite pseudomembranosa (formazione di una pseudomembrana, ossia uno strato

aderente di cellule infiammatorie e detriti sulla mucosa danneggiata. Essa rappresenta il quadro clinico più grave e relativamente raro di una patologia causata dall'uso di antibiotici)

Tossine:• Tossina A o Enterotossina:

Chemiotattica per i PMN nell’ileoProvoca rilascio di citochine, ipersecrezione di fluidi e necrosi emorragica

• Tossina B o Citotossina:Provoca depolimerizzazione dell’actina, distruzione del citoscheletro cellulare

Fattori d’adesione: legame alle cellule del colon umano.

Ialuronidasi: ha attività citolitica.

Spora: sopravvivenza per mesi in ambiente ospedaliero.

fattori di virulenza

C. difficile fa parte della popolazione batterica residente intestinale in un piccolo numero di individui (circa i 5%)

La malattia insorge in pazienti trattati con antibiotici per alterazione della normale popolazione commensale e sovracrescita di C. difficile, o per aumentata suscettibilità all’acquisizione esogena di C. difficile.

In tale caso, il microrganismo prolifera nel colon e produce in questa sede le sue tossine.

Patogenesi

1. le tossine A e B determinano la glicosilazione di numerose proteine cellulari che svolgono importanti funzioni regolatoriecellulari (proliferazione, apoptosi) . La loro loro inattivazione determina alterazione di numerosi processi cellulari e morte della cellula.

2. Si ritiene che citochine proinfiammatorie, liberate delle cellule della mucosa intestinale, determinano il richiamo di polimorfonucleati e l’instaurarsi di una risposta infiammatoria acuta, che causa danno alle cellule della mucosa ed al tessuto circostante.

Trasmissione:Le infezioni endogene hanno origine dopo trattamento conantibiotici per alterazione della popolazione microbica gastrointestinale residente con prevalere di C. difficile.Le infezioni esogene si trasmettono da persona a persona soprattutto negli ospedali.Le spore possono rimanere per più settimane o mesi.

Soggetti a rischio:- Pazienti ricoverati che ricevono trattamento antibiotico (beta-lattamici e clindamicina)

-Soggetti non ospedalizzati dopo somministrazione prolungata di antibiotici

ClinicaColite pseudomembranosa:l’accumulo di fibrina, muco e detriti cellulari determina la formazione di uno strato giallastro (la pseudomembrana) che,progressivamente, copre una regione sempre più estesa della mucosa.

La mortalità e di circa il 10%

DiagnosiSi può isolare il clostridio e dimostrare la

presenza delle tossine in campioni di feci.

Per l’isolamento i campioni vengono comunemente seminati su un terreno selettivo contenente

cicloserina, cefoxitina, e fruttosio (CCFA) e incubati in anaerobiosi per 48 ore.

Diagnosi:In campioni di feci viene dimostrata la

presenza di:Enterotossina A con test immunologici (test ELISA con Ab )

Citotossina B su colture cellulari in vitrodelle linea continua McCoy(saggio di citotossicità)

Trattamento Ampicillina, Metronidazolo, Vancomicina(riattivazione del 20-30% dopo terapia

antibiotica)

ControlloControllo della diffusione e trasmissione delle

spore in ambiente ospedaliero