UNIVERSITE LIBRE DE BRUXELLESFaculté de Médecine

IRIBHM

Activation des cellules rétiniennes lors d’uvéites autoimmunesexpérimentales: Rôle des cytokines pro‐inflammatoires et effet 

du transfert du gène SOCS1

Maya MAKHOUL

En vue de l’obtention du grade légal de Docteur en Sciences Biomédicales et Pharmaceutiques

Promoteur : Pr.  François WillermainCo‐promoteur: Dr. Catherine Bruyns

Année académique 2011‐2012

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ce  travail  a  pu  être  réalisé  grâce  au  soutien  financier  des  Fonds  pour  la formation  à  la  Recherche  dans  l’industrie  et  dans  l’Agriculture  (FRIA)  ainsi qu’aux  fonds  de  la  fondation  David  et  Alice  Van  Buuren  et  aux  fonds  de  la Recherche en Ophtalmologie (FRO).  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Remerciements J’exprime mes  remerciements  les plus  sincères au Professeur François Willermain qui m’a fait  l’honneur de m’accueillir dans son  laboratoire et m’avoir  fait découvrir cette discipline complexe  et  variée  qu’est  l’immunologie  oculaire.  Tes  compétences  alliées  à  tes  grandes qualités  pédagogiques  et  humaines  sont  exemplaires.  Merci  pour  ton  aide,  tes encouragements  et  ta  grande  disponibilité, malgré  les  nombreuses  « casquettes »  que  tu dois porter. 

Je tiens aussi à remercier très chaleureusement  le Dr  Laure Caspers qui m’a accueillie au sein de son équipe. 

J’exprime mes profonds remerciements au Dr Catherine Bruyns pour l’aide précieuse qu’elle a  apporté  à  la  réalisation  de  ce  travail,  pour  ces  conseils  constructifs,  ses  commentaires pertinents  et  pour  son  aide  lors  de  la  correction  de  ce  manuscrit.  Que  les  dieux  de l’orthographe soient toujours avec  François et moi. Merci d’avoir jugé mon travail à de très nombreuses reprises avec honnêteté et sincérité. 

Mes  remerciements vont également à mes collègues  le Dr Lia  Judice, ma grande  sœur de labo,  le Dr Valérie Elmaleh,  le Dr Daphina Draganova,  le Dr Magda Bazewicz,  le Dr Philippe Koch,  qui  par  leurs  encouragements  et  leurs  soutiens  ont  pleinement  contribués  à  la réalisation de ce travail. A vous tous un grand Merci. 

Merci à  Lise, ancienne doctorante au  laboratoire et amie depuis maintenant 5 ans. Merci pour ton amitié et tous les moments partagés au sein ou en dehors du labo. Merci aussi pour tes conseils et ta grande contribution  à la mise en page de ce manuscrit. Le regard attentif et esthétique que tu as toujours su porter à mes présentations n’a pas d’égale. 

Je  remercie  très  particulièrement  Olivier,  Catherine  et  Abdel  pour  leurs  aides  et  leurs grandes disponibilités. 

A mes parents, mes amis Kaouthar, Alain, Anitha et Mohamed, merci de m’avoir entouré de votre affection et de votre soutien tout au long de ces années de thèse. Votre confiance et vos encouragements m’ont été si précieux pendant tout l’accomplissement de ce travail. 

 Si j’en suis là, c’est grâce à vous. 

A ma sœur Dorine, ce  travail  t’est dédié. Me supporter n’est pas  toujours  facile, mais  ton amour,  ta patience,  ta générosité et  ta présence ont été  les  ressorts  indispensables de ce travail. 

Merci d’être toi et merci d’être là. 

                                                                                                                                 

                                                                                                                                  Makhoul Maya 

Liste des abréviations AAV: Adeno‐Associated Virus 

ACAID: Anterior Chamber Associated Immune Deviation 

Ag S: Arrestin 

Ag: Antigen 

AICD: Activation‐ Induced Cell Death 

AIRE: AutoImmune Regulator 

APECED: Autoimmune PolyEndocrinopathy Can‐didiasis Ectodermal Dystrophy 

BCR: B Cell Receptor 

BHR: Barrière Hémato‐Rétinienne 

CCL: Chemokine (C‐C motif) Ligand 

CFA: Complete Freund’s Adjuvant 

CIITA: Class II Transactivator 

CMH: Complexe Majeur d’Histocompatibilité 

CPA : Cell Presenting Antigen 

CsA : Cyclosporine A 

CTL : Lectine du Type C 

CTLA4: Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4 

CXCL: Chemokine (C‐X‐C motif) Ligand 

DAMP: Damage Associated Molecular Pattern 

DC: Dendritic cell 

EAE: Experimental Autoimmune Encephalomyelitis 

EPR: Epithelium Pigmentaire Rétinien 

FADD: Fas Associated Death Domain 

Foxp3: Forkhead box p3 

GAS: Gamma‐Activated Sequence 

G‐CSF: Granulocyte Colony Stimulating Factor 

GITR: Glucocorticoid‐Induced TNFR‐Related pro‐tein 

HLA: Human Leukocyte Antigen 

ICAM1: Intracellular Adhesion Molecule 

IFN: Interferon 

IL: Intreleukin 

IPAF: Ice Protease Activating Factor 

IRAK: IL‐1 Receptor‐Associated Kinase 

IRAK: Interleukin Receptor Associated Kinase 

IRBP: Interphotoreceptor Binding Protein 

IRF: Interferon Regulating Factor 

IκB: Inhibitor of kappa B 

JAK: Janus Kinase 

LFA1: Lymphocyte Function Associated Antigen 

LPS: Lipopolysaccharide 

LT: Lymphocyte 

MAI: Maladie AutoImmune 

MAPK: Mitogen Activated Protein Kinase 

MCP1: Monocyte Chimoattractant Protein 1 

MIP: Macrophage Inflammatory Protein  

MyD88: Myeloid Differentiation primary responses gene (88) 

NAIP: Neuronal Apoptosis Inhibition Protease 

NALP: Nacht‐LRR and Pyrin‐domain‐containing protein 

NF‐κB: Nuclear factor κB 

NK: Natural Killer 

NLR: Nod Like Receptor 

NO: Nitric Oxid 

NOD: Nucleotide Binding Oligomérisation 

NOS2: Nitric Oxide Synthase 2 

PAMP: Pathogen Associated Molecular Pattern 

PBMC: Peripheral Blood Mononuclear Cell 

PD‐1: Programed Death Protein‐1 

PECAM1: Platelet Endothelial Cell Adhesion 1 

PGN: Peptidoglycan 

PI3K: Phosphoinositide 3‐kinase 

PRR: Pattern Recognition Receptor 

PTX: Pertussis Toxin 

RAG: Recombination Activating Gene 

RIP: Receptor Interacting Kinase 

SOCS: Suppressor Of Cytokine Signaling 

STAT: Signal Transducers and Activators of Tran‐scription 

TAK: TGF‐β‐Activated Kinase 

TCR: T Cell Receptor 

TGFβ: Transforming Growth Factor‐β 

TLR: Toll Like Receptor 

TNF(R): Tumor Necrosis Factor (Receptor) 

TRADD: TNF Receptor Death Domain 

TRAF: TNF Receptor Associated Factor 

TRIF: TIR‐domain containing adapter inducing IFNβ 

UAE: Uvéite Autoimmune Expérimentale 

UIE: Uvéite Induite par Endotoxine 

VCAM1: Vascular Adhesion Molecule 

VEGF: Vascular Endothelial Growth Factor 

VIP:  Vasoactive Intestinal Peptide 

VKH: Vogt‐Koyanagi‐Harada 

VLA‐4: Very Late Antigen 4 

ZO‐1: Zonula‐Occludens 1 

α‐MSH: α‐Melanocyte‐Stimulating Hormone 

1

Table des matières TABLE DES MATIÈRES ................................................................................................................... 1

INTRODUCTION ............................................................................................................................ 3

1. Anatomie de l’œil 3

1.1 Anatomie de la rétine ................................................................................................................................. 3

1.2 Les cellules gliales de la rétine .................................................................................................................... 5

1.3 La barrière hémato-rétinienne ................................................................................................................... 5

2. Le système immunitaire 6

2.1 Introduction ............................................................................................................................................... 6

2.2 Immunité innée .......................................................................................................................................... 6

2.2.1 Barrière physico-chimique 6

2.2.2 Les récepteurs de reconnaissance des pathogènes de l’immunité innée 7

2.2.3 L’œil et l’immunité innée 8

2.2.4 Désordre associé à l’immunité innée : maladies auto-inflammatoires 9

2.3 Immunité adaptative .................................................................................................................................. 9

2.3.1 La tolérance centrale 10

2.3.2 Présentation classique d’antigène et activation des lymphocytes T naïfs 11

2.3.3 La tolérance périphérique 12

2.3.4 Régulation de l’immunité adaptative par le système de l’immunité innée 13

2.3.5 Désordre associé à l’immunité adaptative : les maladies auto-immunes 14

3. Le privilège immun oculaire 15

3.1 Introduction ..............................................................................................................................................15

3.2 Mécanismes impliqués dans le privilège immun oculaire ...........................................................................15

3.2.1 L’ignorance immunologique 16

3.2.2 Inhibition par des substances immunosuppressives 16

3.2.3 Déviation immune associée au segment antérieur 16

4. Les uvéites 17

4.1 Classification des uvéites ...........................................................................................................................17

4.2 Epidémiologie des uvéites .........................................................................................................................18

4.3 Les uvéites non-infectieuses ......................................................................................................................18

4.4 Les modèles expérimentaux d’uvéites .......................................................................................................20

4.4.1 Uvéite induite par endotoxine (UIE) 20

2

4.4.2 Uvéite autoimmune expérimentale (UAE) 20

4.4.3 Uvéite induite par transfert adoptif de cellules dendritiques (DC-UAE) 21

4.4.4 Uvéite induite par transfert adoptif de LT 22

4.5 Vision générale de la physiopathologie des uvéites auto-immunes ............................................................22

5. Rôle de l’activation des cellules rétiniennes dans le développement d’uvéite non infectieuse 24

5.1 Introduction ..............................................................................................................................................24

5.2 Effet des cytokines sur les cellules de l’EPR ................................................................................................24

5.2.1 Effets de l’IFNγ 24

5.2.2 Régulateur négatif de la signalisation : SOCS 25

5.2.3 Effets du TNFα et de l’IL-1β sur l’EPR 26

5.2.4 Effet de l’IL-17 et de l’IL-22 27

5.2.5 Effet des cytokines proinflammatoires sur les cellules gliales 29

6. Traitements des uvéites non-infectieuses 30

6.1 Les corticostéroïdes ..................................................................................................................................30

6.2 Les immunosuppresseurs ..........................................................................................................................31

6.2.1 Les antimétabolites 31

6.2.2 Les inhibiteurs des cellules T 31

6.2.3 Les agents alkylants 31

6.2.4 Les agents biologiques 32

6.3 Thérapeutique expérimentale ...................................................................................................................32

6.3.1 Inhibition de l’activation des cellules rétiniennes par transfert de gènes codant pour des cytokines

anti-inflammatoires 32

OBJECTIFS DU TRAVAIL ............................................................................................................... 34

RÉSULTATS ................................................................................................................................. 35

1. Caractérisation de l’expression de VCAM-1 au niveau rétinien lors d’uvéite autoimmune expérimentale 35

2. Le TNFα inhibe l’expression du CMH II induite par l’IFNγ au niveau des cellules de l’épithélium pigmentaire

rétinien 37

3. Etude de la surexpression rétinienne du gène SOCS1 dans un modèle murin d’uvéite autoimmune

expérimentale 39

4. Effet de la surexpression stable du gène SOCS1 dans l’activation in vitro d’épithélium pigmentaire rétinien

par des cytokines pro-inflammatoires 41

DISCUSSION ET PERSPECTIVES .................................................................................................... 51

RÉSUMÉ ..................................................................................................................................... 77

3

Introduction 1. Anatomie de l’œil

L’œil consiste en 3 couches concentriques entourant un milieu transparent. Il y a tout d’abord

une enveloppe fibreuse cornéo-sclérale. La couche intermédiaire, vasculaire, est l’uvée qui est

constituée de l’iris, du corps ciliaire et de la choroïde. L’iris sépare la chambre antérieure du

cristallin. En arrière de l’iris et du cristallin se trouve la chambre postérieure occupée par le vitré.

Enfin, la couche interne, neurale, est celle de la rétine (figure 1)

1.1 Anatomie de la rétine

Fonctionnellement, la rétine a deux grandes composantes : la neuro-rétine formée de plusieurs

assises cellulaires qui tapissent la partie postérieure du globe oculaire et la couche de

l’épithélium pigmentaire qui est la couche la plus externe de la rétine. Nous allons décrire ses

différentes couches d’arrière en avant (figure2).

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR)

L’EPR est une des couches cellulaires les plus importantes du système visuel, notamment vital à

la survie des cellules photoréceptrices (cônes et bâtonnets). Elle participe à la régulation de la

réponse immunitaire locale ainsi qu’au maintien du privilège immun de l’œil. Elle est constituée

d’une couche monocellulaire de cellules hexagonales et doit son nom à l’apparence brunâtre qui

est dû aux mélanosomes. On estime qu’un œil adulte contient de 4 à 6 millions de cellules de

l’EPR. Postérieurement, l’épithélium pigmentaire repose sur la membrane de Bruch puis la

chorio-capillaire qui sert de support vasculaire au tiers externe de la rétine. Latéralement, les

cellules de l’EPR sont reliées entre elles par des zonulae occludentes, et des zonulae adherentes.

Les zonulae occludens constituent des jonctions intercellulaires « serrées » (tight junction)

caractérisées par la fusion des membranes cellulaires de deux cellules adjacentes de l’EPR. Ces

jonctions serrées sont à la base de la barrière hémato-rétinienne externe, puisqu’elles

empêchent le passage passif de molécules, même de petit poids moléculaire de la circulation

choroïdienne vers la rétine neurosensorielle. La surface apicale (antérieure) des cellules de l’EPR

Outer Limiting Membrane 

(OLM)Inner Limiting Membrane 

(ILM)Muller

cells

Bipolar cells

Ganglion cells+ Astrocytes

Photoreceptor cells

RPE cells

Figure 1 : Anatomie de l’œil et de la rétine. 

4

fait face à l’espace sous-rétinien. L’espace sous-rétinien qui est un espace virtuel est limité

antérieurement par la membrane limitante externe, formée par les zonulae adhérents qui

attachent les photorécepteurs entre eux et à une cellule de Müller voisine.

La couche des photorécepteurs

Les cellules photosensibles de la rétine sont les photorécepteurs représentés par les cônes et les

bâtonnets. Il y a approximativement 100 millions de bâtonnets et 5 millions de cônes dans l’œil

humain. Ils sont composés d’un segment externe, d’un segment interne, d'un noyau et d'une

fibre interne. Les segments externes des photorécepteurs contiennent le pigment visuel, la

rhodopsine ; ils baignent dans la matrice interphotorécepteur et sont entourés par les villosités

des cellules de l’EPR. La fonction des photorécepteurs est de convertir l’énergie lumineuse en

influx électrique qui sera propagé par les cellules bipolaires puis par les cellules ganglionnaires,

dont les axones constituent le nerf optique, transmettant l’information jusqu’au cortex visuel.

La membrane limitante externe

Sous la lumière du microscope optique, la membrane limitante externe semble séparer les

articles externes des photorécepteurs de leurs noyaux situés dans la couche nucléaire externe.

On sait grâce à la microscopie électronique que la membrane limitante externe est composée

par les zonulae adhérents qui joignent les cellules de Müller entre elles et avec les

photorécepteurs.

La couche nucléaire externe

Elle contient le soma et le noyau des photorécepteurs.

La couche plexiforme externe

La couche plexiforme externe marque la jonction entre les neurones de premier

(photorécepteurs) et deuxième ordre (cellules bipolaires) de la rétine.

La couche nucléaire externe

Elle est constituée par les noyaux des cellules bipolaires. On y trouve également les noyaux des

cellules horizontales et amacrines qui modulent l'influx visuel venant des photorécepteurs ainsi

que les noyaux des cellules gliales principales de la rétine, les cellules de Müller.

La couche plexiforme interne

Choroid 

Photoreceptors

Outer nuclear layer

Outer plexiform layerInner nuclear layer

Inner  plexiform layer

Ganglion cell layer

Internal limiting membrane

Nerve fiber layer

Figure 2 : Coupe histologique de la rétine.Section  transversale  montrant  les  10  couches  cellulaires  de  la  rétine:  l’EPR,  la  couche  des photorécepteurs, la limitante externe, la couche nucléaire externe, la couche plexiforme externe, la couche nucléaire  interne,  la couche plexiforme  interne,  la couche des cellules ganglionnaires, la couche des fibres nerveuses et la membrane limitante interne. Adapté de R. Caspi et al .,2010

Neural retina

RPE

Choroid vesselSclera

5

La couche plexiforme interne représente les synapses entre les cellules bipolaires et les

neurones de troisième ordre que sont les cellules ganglionnaires. Elle contient également un

abondant réseau vasculaire.

La couche des cellules ganglionnaires

Elle contient principalement les noyaux des cellules ganglionnaires, ainsi que des éléments gliaux

et vasculaires.

La couche des fibres

La couche des fibres est constituée par les axones des cellules ganglionnaires, des cellules gliales

et des gros vaisseaux dérivant de l’artère et de la veine centrale de la rétine.

La membrane limitante interne.

C’est l’élément le plus interne de la rétine : véritable membrane basale sur laquelle repose

l’apposition ininterrompue des pieds des cellules Müller.

1.2 Les cellules gliales de la rétine

Les cellules de Müller, les astrocytes et la microglie constituent le tissu glial rétinien. Les cellules

de Müller sont de grandes cellules qui s’étendent verticalement des photorécepteurs à la

membrane limitante interne. Elles ont une structure complexe avec de nombreuses expansions

cytoplasmiques. Leur noyau se situe dans la couche nucléaire interne. La membrane limitante

externe n’est en fait que la juxtaposition des jonctions intercellulaires étroites et serrées entre

les expansions des cellules de Müller et les segments internes des photorécepteurs. Les cellules

de Müller ne jouent pas seulement un rôle de soutien passif. Elles interviennent dans

l’homéostasie de la matrice extracellulaire et jouent aussi un rôle dans la régulation immunitaire

locale. Il existe 2 autres types de cellules gliales : 1) les astrocytes qui se trouvent dans la couche

des fibres optiques 2) les cellules microgliales (macrophages de la rétine) qui dérivent de

précurseurs hématopoïétiques.

1.3 La barrière hémato-rétinienne

La barrière hémato-rétinienne (BHR) protège anatomiquement la rétine, tissu vulnérable qui n’a

pas la possibilité de se réparer des lésions induites par les cellules inflammatoires infiltrantes1.

Cette BHR est constituée d’une partie interne qui repose sur la présence de jonctions étanches

Choroïd

EPR

Müller cell

Blood vessel

NEURORETINA

EPREPR

Internal BRB

External BRB

Figure 3: La Barrière hémato‐rétinienne  (BHR) en situation physiologique.La BHR est  composée de deux parties. La BHR  interne  repose  sur  la présence de  jonctions serrées entre les cellules endothéliales des vaisseaux rétiniens, renforcées par des extensions des cellules de Müller et des astrocytes. La BHR externe est formée par les jonctions serrées entre les cellules de l’EPR. En situation physiologique, la BHR bloque l’accès des lymphocytes à la neurorétine. 

Th1Th17

6

des cellules endothéliales rétiniennes renforcées par des extensions des cellules de Müller et des

astrocytes2 . La BHR externe est formée par une couche unicellulaire de l’épithélium pigmentaire

rétinien (EPR) maintenue par des jonctions serrées. Ces BHR limitent l’entrée des cellules et des

molécules venant de la circulation sanguine dans le tissu oculaire et permettent de préserver

l’homéostasie immunologique de l’œil (figure 3).

2. Le système immunitaire

2.1 Introduction

Le terme immunité évoque les mécanismes de défense qu’un organisme développe à l’encontre

des microorganismes. Les fonctions du système immunitaire sont 1) de défendre de l’invasion

des microorganismes tout en tolérant les commensaux 2) d’éliminer les constituants altérés de

l’organisme. Afin d’assurer ces fonctions, deux stratégies différentes ont été développées au

cours de l’évolution. Le système immunitaire inné et adaptatif. L’immunité innée assure une

réponse rapide et identique à chaque rencontre avec un agent pathogène tandis que l’immunité

adaptative (ou acquise ou spécifique) possède une «mémoire ». Cette mémoire immunologique

est une caractéristique exclusive du système adaptatif : l’efficacité de la réponse croit à chaque

nouveau contact avec un même antigène. Un seul contact avec un antigène peut donc être

suffisant pour induire une réponse immunitaire persistante et protectrice. Une collaboration

étroite entre les 2 systèmes est indispensable pour assurer la défense de l’organisme contre les

agents infectieux.

2.2 Immunité innée

2.2.1 Barrière physico-chimique

Afin de prévenir l’entrée des pathogènes dans les tissus, l’organisme dispose de multiples

moyens : des barrières physiques, des flux, des agents chimiques, des substances bactéricides,

une flore commensale, etc. La peau qui est constituée d’un épithélium kératinisé à plusieurs

couches est tout d’abord une formidable barrière naturelle lorsqu’elle n’est pas lésée. L’entrée

de la plupart des pathogènes s’effectue au niveau des épithélio qui tapissent les muqueuses

respiratoires, digestives etc. Un rôle mécanique important est joué à ce niveau par le mucus, qui

est un piège très efficace contre les agents pathogènes dont il inhibe l’adhésion, favorisant leur

Pattern Recognition Receptor (PRR)

Family Cellular location

Toll like receptors (TLRs) Plasma membranes and endosomes

C‐type lectins (CTLs) Plasma membrane

CytoplasmicRetinoic acid‐inducible gene (RIG‐1)‐like helicase (RHLs)

NOD‐like receptor (NLRs) Cytoplasmic

Table 1 : Les différents récepteurs PRR  et leurs localisations cellulaires 

7

élimination par les mouvements ciliés ou le péristaltisme intestinal. Certaines cellules de ces

épithélio produisent rapidement des peptides antimicrobiens, les défensines, dont la synthèse

est induite par des cytokines et des agents infectieux. Elles exercent une activité anti-infectieuse

microbicide (dépolarisation et perméabilisation membranaire) mais surtout, elles amplifient la

réponse inflammatoire et stimulent la réponse immunitaire adaptative. De très nombreuses

autres molécules comme les acides gras de la peau, le lysozyme et la phospholipase A2 des

larmes et de la salive, le pH acide de l’estomac, les enzymes digestives et les sels biliaires du

tractus gastro-intestinal s’opposent directement à l’entrée des pathogènes et participent ainsi à

la défense innée en constituant une barrière chimique et enzymatique. Il est également

important de mentionner le rôle protecteur joué par la flore commensale qui dans certains

organes, entre en compétition avec les pathogènes pour les nutriments et pour la fixation à des

récepteurs spécifiques.

2.2.2 Les récepteurs de reconnaissance des pathogènes de l’immunité innée

L’activation de l’immunité innée qui constitue une première ligne de défense contre les

pathogènes est médiée par des récepteurs PRRs (Pattern recognition Receptor) qui

reconnaissent des motifs hautement conservés présents chez de nombreux pathogènes, appelés

PAMP (Pathogen-Associated Molecular pattern) (tableau1). Les PAMPs sont exclusivement

synthétisés par des microbes pathogènes et commensaux, jamais par leur hôte et sont essentiels

à leur survie. Les récepteurs PRRs sont exprimés sur les phagocytes, les cellules dendritiques

(DC) et de nombreux autres types cellulaires tels que les cellules endothéliales et épithéliales.

Différentes familles de PRR ont été décrites. Les TLRs et les lectines du type C (CTL) sont

exprimés sur la membrane plasmique et endosomiale. Les TLRs qui reconnaissent les acides

nucléiques (ADN et ARN) sont exprimés au niveau cytoplasmique. Les NLRs (Nod Like Receptor)

sont eux aussi exprimés en intracellulaire. Un TLR a été décrit pour la première fois chez la

drosophile comme une protéine transmembranaire intervenant lors du développement

embryonnaire3. Chez l’homme, il existe 13 TLRs qui ont des fonctions différentes selon leur

localisation et les ligands qu’ils peuvent reconnaître4, 5. Ils sont soit exprimés sur la membrane

cellulaire, soit dans le cytoplasme par de nombreuses cellules du système immunitaire (cellule

dendritique, macrophage, lymphocyte T et B, et polymorphonucléaire) mais aussi à la surface de

NLRP‐IPAF/NAL

P

TLR

PAMPs

MyD88 TRIF

NO

D1

NO

D2

NF‐κB AP‐1

IRF

Inflammasone

Pro‐caspase caspase1

TLR

MyD88 TRIF

Endosome

Cytokines proinfl.

IFNα, IFNβ

ADN, ARN 

Cleavage

Pro‐IL‐1 IL‐1

Figure 4 : Les  récepteurs PRRs et leurs voies de signalisation.Les récepteurs aux PAMPs  induisent des voies de signalisation différentes après  leur activation par des composantes de la paroi bactérienne mais aussi par des acides nucléiques viraux et bactériens. Ils activent  les  facteurs de  transcription NF‐κB, AP‐1 et  IRF qui  sont  impliqués dans des  cascades proinflammatoires. Les pathogènes  intracellulaires peuvent également être détectés par   d’autres récepteurs, les Nod like receptors (NLRs). Lors de leur activation NOD1 et NOD2 vont s’oligomériser et activer la voie NF‐κB et la voie AP‐1. Ils vont également induire la formation d’un assemblage des récepteurs  IPAF/NALP1 et NALP3 appelé inflammasome qui va activer  la caspase‐1 et  favoriser  la maturation et la sécrétion d’IL‐1.

8

cellules épithéliales6, 7. Ces récepteurs sont activés par des composants de la paroi bactérienne

mais aussi par les acides nucléiques viraux et bactériens. La stimulation des TLRs active la voie du

NF-κB et des MAPK (Mitogen activated protein kinase), induisant la production de molécules

proinflammatoires. La transcription des IRF (Interferon Regulating Factor) est aussi un élément

central lié à l’activation de cette classe de récepteur6, 8, 9 (figure4).

Les récepteurs CTL quant à eux lient le mannose et le glucose et sont principalement exprimés

par les cellules dendritiques et les macrophages. Ils jouent un rôle important dans la dégradation

du microorganisme et la présentation d’antigène en association avec les complexes majeurs

d’histocompatibilité (CMH) qui va activer le système immunitaire adaptatif.

La détection intracellulaire des motifs microbiens n’est pas seulement limitée aux TLRs. Une

autre famille de récepteurs a été identifiée : les NLRs. La famille des NLRs regroupe les sous-

familles des protéines NODs (Nucleotide-binding Oligomerization Domain) des NALPs (NACHT-

LRR and Pyrin-domain-containing proteins) et d’IPAF/NAIP (Ice-Protease Activating

Factor/neuronal apoptosis Inhibitor Protease). Ils sont exprimés par de nombreux types

cellulaires et activent le NF-κB, l’IRF (Interferon Regulatory Factor) et les MAPK (Mitogen

Activated Protein Kinase). L’activation de certains NLRs induit l’assemblage des récepteurs

IPAF/NALP1 et NALP3 au sein de l’inflammasome, qui va activer la caspase1, protéine clé dans

l’activation des cytokines proinflammatoires de la famille de l’IL-110, 11.

2.2.3 L’œil et l’immunité innée

L’œil et ses annexes constituent un petit compartiment de l’organisme, particulièrement exposé

et possédant une multiplicité de moyens de défense. Pour la protection oculaire, les barrières

mécaniques sont assurées d’une part par les cils et le clignement des paupières et d’autre part

par les cellules de l’épithélium cornéen qui sont liées par des jonctions serrées et forment une

couche cellulaire protectrice entre milieux intérieur et extérieur. Le film lacrymal, par ces trois

couches (lipidique, aqueuse, et mucinique) constitue quant à lui une barrière chimique vis-à-vis

des pathogènes12. L’œil bénéficie aussi d’un tissu lymphoïde associé aux muqueuses caractérisé

par la production abondante d’anticorps naturels et d’une flore commensale qui empêche

l’implantation de germes pathogènes. Enfin, l’expression par différentes cellules de l’œil de

9

nombreux TLRs et NLRs et leur implication dans la réponse immunitaire innée participe

activement à la protection oculaire13.

2.2.4 Désordre associé à l’immunité innée : maladies auto-inflammatoires

Le concept de maladie auto-inflammatoire fut proposé en 2000 par Galon et al. pour définir des

pathologies inflammatoires chroniques apparaissant en l’absence d’infection et de mise en

évidence d’auto-Ac ou de lymphocytes T autoréactifs, à la différence des pathologies

autoimmunes. Certaines comme la goutte sont d’origine métabolique, d’autres, comme la

maladie de Crohn, sont multifactorielles. Ces pathologies sont associées à une activation

exacerbée du système immunitaire inné. La goutte par exemple est induite par des dépôts de

cristaux d’acide urique au niveau articulaire, qui va activer l’oligomérisation de l’inflammasome

NALP14. Si la maladie de Crohn a de nombreuses causes, l’existence de polymorphismes de NOD2

semble particulièrement influer sur la susceptibilité à développer cette pathologie15, 16. Les

fièvres périodiques héréditaires sont aussi des maladies auto-inflammatoires. Les mutations qui

en sont responsables sont extrêmement variées, mais conduisent pour la plupart à la sécrétion

non régulée d’IL-1β17.

2.3 Immunité adaptative

La réponse adaptative, seconde ligne de défense est apparue avec les vertébrés à mâchoires il y

a environ 550 millions d’années. Cette transition, brutale, reste encore énigmatique, source de

nombreuses spéculations. L’immunité adaptative repose sur l’expression par les lymphocytes T

et B de récepteurs à l’antigène hautement spécifiques (TCR et BCR). Ces récepteurs sont

composés d’une chaîne α/lourde et d’une chaîne β/légère. Chaque chaîne contient un segment

V (variable) un segment C (constant) et un segment J (Jonction) dont la recombinaison est

assurée par un ensemble d’enzymes portant le nom de recombinase V(D)J composé de protéines

RAG1 et RAG2 (Recombination-Activating gene). Ce processus assez complexe permet de

générer un nombre quasi illimité de TCR/BCR capables de reconnaître un très large répertoire

d’antigènes. Cependant, ce processus aléatoire conduit à l’émergence de clones lymphocytaires

potentiellement autoréactifs (reconnaissant des protéines du soi) et donc dangereux pour

10

l’organisme. Pour pallier à cela, des mécanismes de tolérance centrale sont mis en place afin

d’éliminer ces lymphocytes exprimant des récepteurs autoréactifs.

2.3.1 La tolérance centrale

Les lymphocytes B reconnaissent les antigènes solubles natifs ; les lymphocytes T ne

reconnaissent que des petits peptides qui résultent du processing intracellulaire d’antigènes

natifs qui leur sont présentés en association avec des molécules du complexe majeur

d’histocompatibilité (CMH) à la surface des cellules présentatrices d’antigène (CPA). La structure

reconnue par le TCR dérive donc à la fois de la molécule du CMH et du peptide antigénique :

l’organisme doit sélectionner d’abord les lymphocytes T qui reconnaissent des molécules du

CMH du soi puis exclure ceux qui reconnaissent des auto-antigènes 18. Cette sélection en deux

étapes se fait pendant l’ontogenèse au niveau du thymus. Les cellules T, dont le TCR possède

une affinité modérée pour les molécules du CMH présentes à la surface des cellules épithéliales

du cortex thymiques, sont sélectionnées positivement. Près de 95% des lymphocytes T ne seront

pas sélectionnés à ce stade et mourront par apoptose. Ensuite, les lymphocytes T dont le TCR

reconnaît avec une grande affinité un peptide du soi présenté par des molécules du CMH de

cellules dendritiques et de la médullaire thymique seront sélectionnés négativement. Par

ailleurs, les lymphocytes T qui possèdent une affinité intermédiaire pour les molécules du CMH,

sont susceptibles de se différencier en T régulateurs, sur lesquels nous reviendrons

ultérieurement. De plus, il est important de signaler que les thymocytes en voie de

différenciation ont aussi la possibilité d’effectuer, grâce aux recombinases RAG, une réédition de

leur TCR ayant une forte affinité pour un antigène de soi. A la fin de ce processus, les

lymphocytes T autoréactifs auront donc été éliminés et seuls les lymphocytes dont le TCR

reconnaît un peptide du non soi sur un CMH du soi, seront sélectionnés19. Un dernier

mécanisme de tolérance prenant place dans le thymus est l’anergie lymphocytaire qui sera

davantage détaillée dans la partie consacrée à la tolérance périphérique. Une sélection négative

des lymphocytes B autoréactifs a lieu au niveau de la moelle osseuse.

Cette délétion des lymphocytes T autoréactifs induite dans le thymus constitue donc la tolérance

centrale. Néanmoins, de nombreux auto-antigènes ne sont pas présents dans le thymus ou sont

présents en trop faible quantité pour induire une tolérance. Ces antigènes sont appelés

Figure 5: Présentation d’antigène et polarisation lymphocytaire en différents sous ‐types. Représentation des différentes  lignées  cellulaires  T  auxilliaires  impliquées dans  la physiopathologie de l’UAE. Adapté de O’Shea J.J et al,2010.

IL‐23

11

cryptiques et sont typiquement exprimés dans les organes immuns privilégiés. Dans le cas de

l’œil, il s’agit principalement des protéines impliquées dans la phototransduction et le cycle des

rétinoïdes 20. Malgré la tolérance centrale, il existe donc des lymphocytes T et B qui

reconnaissent des auto-antigènes. Les mécanismes qui inhibent l’activation pathologique de ces

lymphocytes T et B autoréactifs constituent la tolérance périphérique que nous développerons

après avoir introduit la présentation antigénique.

2.3.2 Présentation classique d’antigène et activation des lymphocytes T naïfs

Après leur développement dans le thymus, les lymphocytes T naïfs circulent entre la circulation

sanguine et les organes lymphoïdes secondaires. Ils expriment soit le marqueur CD4

(lymphocytes T helper), soit CD8 (lymphocyte T cytotoxique) selon qu’ils sont prêts à reconnaître

un antigène dérivé d’un pathogène extracellulaire ou intracellulaire18. Les seules CPA capables

d’activer des lymphocytes T naïfs sont les cellules dendritiques ; les macrophages et les

lymphocytes B peuvent également agir comme CPA, mais pas pour induire des réponses

primaires. Il est également bien établi que la présentation d’antigènes aux lymphocytes T

implique deux signaux21. Le premier signal constitue la présentation d’antigène en elle-même et

est délivré par l’engagement du complexe TCR/CD3 à la surface du lymphocyte T avec le peptide

antigénique présenté par les molécules du CMH à la surface de la CPA. Les lymphocytes T CD4

reconnaissent les peptides liés aux CMH de classe II et les lymphocytes CD8 ceux liés aux CMH de

classe I. Un deuxième signal est donné par l’interaction des molécules co-stimulatrices, B7.1

(CD80) et B7.2 (CD86) exprimés sur la CPA et leur ligand CD28 exprimé par la cellule T. De plus,

l’interaction du CD40 avec son ligand le CD40L (CD154) est requise pour une activation complète

des lymphocytes T, puisque l’engagement du CD40 à la surface de la CPA induit une

augmentation de l’expression des molécules co-stimulatrices. Le premier et deuxième signal

sont indispensables et communs à toute présentation classique d’antigène. Par contre, le type

de cytokines sécrétées par la CPA peut varier et est capital pour la différenciation du lymphocyte

activé22. En effet, selon la nature des cytokines présentes lors de cette activation, l’IL-12, l’IL-4,

l’IL-6/TGFβ ou TGFβ, les précurseurs CD4+ se différencient respectivement en cellule Th1, Th2,

Th17 et Treg23(figure5). Le premier critère qui permet de différencier ces sous-classes de LT

helper est le profil cytokinique qu’elles expriment. Les TCD4 Th1 sécrètent de l’IL-2, de l’IFNγ et

12

du TNFα tandis que les TCD4+ Th2 sécrètent plutôt de l’IL-4, 5, 10 et 13 et les Th17 de l’IL-17A-F,

de l’IL-21 et de l’IL- 22 et les T regs du TGFβ et de l’IL-10. D’un point de vue fonctionnel, la

réponse Th1 stimule l’immunité cellulaire et participe à la défense contre les microorganismes

intracellulaires, tandis que la réponse Th2 stimule l’immunité humorale et permet de lutter

contre les infections aux helminthes. Le sous-type Th17 quant à lui semble impliqué dans la lutte

contre les microorganismes extracellulaires par l’induction d’une réponse plutôt granulocytaire.

Le sous-type Th2 est souvent associé aux réponses allergiques, tandis que les cellules Th1 et

Th17 semblent impliquées dans de nombreuses maladies auto-immunes, telles que la sclérose

en plaques, la polyarthrite et aussi les uvéites24-26.

2.3.3 La tolérance périphérique

Comme nous l’avons vu, certains lymphocytes T autoréactifs échappent à la sélection thymique

et sont normalement maintenus quiescents par des mécanismes de tolérance périphérique.

Les 4 mécanismes de tolérance périphérique qui peuvent s’exercer sur les lymphocytes T sont

l’anergie, la délétion clonale par apoptose, l’ignorance immune et l’immunorégulation.

L’anergie est définie comme l’inactivation fonctionnelle des lymphocytes T qui survient lorsque

ces cellules reconnaissent des antigènes en absence de costimulation. Dans ces conditions, les

récepteurs d’antigène des lymphocytes T (TCR) peuvent perdre leurs capacités à transmettre des

signaux activateurs, ou peuvent engager préférentiellement un de leurs récepteurs inhibiteurs

de la famille de CD28, CTLA-4 (Cytotoxic T Lymphocyte Antigen-4) ou PD-1 (Programmed Death

Protein-1).

Un autre mécanisme de tolérance périphérique est la délétion clonale par apoptose. Deux

mécanismes d’apoptose sont impliqués dans la délétion clonale des lymphocytes T : d’une part

l’apoptose passive lorsque les cellules T sont privées de facteurs de croissance (IL-2, IL-4, IL-9, IL-

15, IL-21) permettant l’activation de facteurs anti-apoptotiques, d’autre part l’apoptose active

induite par la fixation de l’IL-2 sur son récepteur (Activeted Induced Cell Death). De plus, la

reconnaissance des autoantigènes peut entraîner la coexpression des récepteurs de mort et de

leurs ligands. Le récepteur de mort le mieux connu est une protéine FAS qui est exprimée sur de

13

nombreux types cellulaires et le ligand de Fas (FasL), qui est exprimée surtout sur les

lymphocytes T activés.

L’ignorance immune qui est liée à la compartimentalisation des cellules immunitaires participe

également à la tolérance périphérique. Un lymphocyte autoréactif naïf ne migre pas vers les

organes périphériques ; il circule uniquement entre le sang, la rate et les ganglions. Ainsi, si

l’autoantigène est présents dans un organe solide et qu’il ne gagne jamais les ganglions, les

lymphocytes autoréactifs ne pourront jamais être activés et ne migreront donc pas dans le tissu

potentiellement cible de la réaction auto-immune.

L’immunorégulation est le dernier mécanisme de tolérance périphérique. Il correspond à la

suppression de la prolifération et de l’activation de clones T autoréactifs par les lymphocytes T

régulateurs (cellules T CD4+CD25high) et par les cellules NK27, 28. Leur mécanisme d’action est

décrit par certains auteurs comme étant dépendant d’un contact cellulaire29, 30 ; pour d’autres, il

dépend d’une sécrétion d’IL-10 ou de TGFβ (Transforming Growth Factor-β), de même que

l’intervention de molécules membranaires notamment celle la molécule CTLA4 et du GITR

(Glucocorticoid-Induced Tumor-necrosis factor like Receptor). Enfin, le développement et la

fonction de ces cellules dépendent d’un facteur de transcription Foxp3 mais aussi de l’IL-2. Des

mutations du gène Foxp3 chez l’homme et la souris causent une maladie auto-immune

systémique qui touche plusieurs organes.

2.3.4 Régulation de l’immunité adaptative par le système de l’immunité

innée

Une avancée importante dans la compréhension du fonctionnement du système immunitaire a

été apportée par Charles Janeway qui a proposé qu’un des aspects du système immunitaire inné

est d’informer le système immunitaire adaptatif sur la nature de l’antigène 31. Il est important de

se rappeler à ce stade qu’un antigène peut dériver d’une protéine du soi, d’une protéine

symbiotique ou d’un agent pathogène. La théorie de Janeway prédit l’existence des PRRs et

postule que leur activation pourrait aider les cellules présentatrices d’antigène à distinguer entre

les antigènes infectieux et les antigènes non infectieux. Cette hypothèse est aujourd’hui

largement acceptée et le rôle des PRRs dans la formation de la réponse immunitaire adaptative

14

est bien démontré32. Dans ce contexte, il a été montré que différents TLRs régulent de façon

différentielle la synthèse des membres de la famille de l’IL-12 (IL-12p70, IL-23 et IL-27) et ainsi

orientent la différenciation de l’immunité adaptative vers un profil Th1, Th2 ou Th1733. Fait

intéressant, l’hypothèse de Janeway a été étendue à un modèle de danger plus généralisé par

Matzinger 34. Dans cette théorie du danger, le signal qui informe la cellule sur la nature de

l’antigène ne passe pas uniquement par les PAMPS, mais est élargi à d’autres molécules

produites lors de lésions tissulaires ou de mort cellulaire. En référence au nom de PAMPs, le

terme DAMPs (Damage-Associated Molecular pattern molecules) a été introduit pour définir

cette nouvelle famille de signaux endogènes qui sont aussi connus sous le nom d’alarmines. En

conséquence, une série de molécules endogènes (cristaux d’urates, des nucléotides etc) ont des

propriétés adjuvants ou proinflammatoires 35. Des données récentes ont mis en évidence que les

cellules non-hématopoétiques jouent également un rôle important dans la détection de signaux

de danger et dans la manière dont ils façonnent la réponse immunitaire adaptative36. Pour

terminer, on peut donc conclure que la manière dont le système immunitaire innée traduit le

contexte de la présentation antigénique module la réponse de l’immunité adaptative.

2.3.5 Désordre associé à l’immunité adaptative : les maladies auto-immunes

Les maladies autoimmunes (MAI) sont des atteintes chroniques qui résultent de la rupture de la

tolérance des LT vis-à-vis des antigènes de soi. Elles touchent environ 5 à 7% de la population

dans les pays occidentaux37; on en connaît plus de 40 et quasiment tous les organes peuvent

être touchés. Ces pathologies peuvent être classées en MAI spécifiques d’organes et MAI

systémiques. Cette classification s’appuie sur des critères cliniques. Les MAI spécifiques d’organe

ont une expression limitée à un organe (sclérose en plaque et certaines uvéites). Les MAI

systémiques, quant à elles affectent plusieurs organes. Les MAI se différencient également en

fonction de l’origine des lésions observées au cours de ces atteintes. Celles-ci sont les

conséquences soit d’une réponse immunitaire humorale où les lésions sont secondaires à la

présence d’autoanticorps pathogènes, soit cellulaire où les LT sont responsables des lésions. Les

MAI sont d’origines multifactorielles impliquant à la fois des facteurs génétiques et des facteurs

environnementaux. Les MAI sont parfois d’origine monogénique comme le syndrome APECED,

lié à une mutation du gène AIRE codant pour un facteur de transcription, qui régule l’expression

15

thymique de certains antigènes. Cependant, la plupart des MAI sont d’origine multigénique. Leur

développement dépend de la présence de plusieurs gènes de susceptibilité et de l’interaction

entre ces gènes qui donnent à un individu une susceptibilité à développer la maladie. Le

développement d’une encéphalomyélite autoimmune par exemple est associé à la présence

d’une dizaine de loci de susceptibilités différentes38. Différents facteurs environnementaux

responsables du développement de MAI ont été impliqués : des agents infectieux, des agents

toxiques, des agents médicamenteux. Ces agents peuvent mimer des antigènes du soi

(mimétisme moléculaire) et modifier la réponse immunitaire.

3. Le privilège immun oculaire

3.1 Introduction

En 1873, Van Dooremal montre que des cellules tumorales humaines prolifèrent dans la

chambre antérieure d’œil de lapins, mais nulle part ailleurs dans le corps. Ces expériences sont

répétées et étendues à d’autres espèces animales par Peter Medawar qui crée le terme de

« privilège immun » pour désigner cette tolérance inattendue de greffons au niveau de certains

organes39. A l’époque, Medawar considérait que le privilège immun était dû à une ignorance

immunologique. Du fait de l’absence de drainage lymphatique de l’œil et de l’existence d’une

BHR, l’hypothèse était que le matériel antigénique était séquestré à l’intérieur de l’œil et qu’en

conséquence le système immunitaire ignorait simplement sa présence. Des travaux plus récents,

réalisés par Streilein ont démontré sans équivoque que la séparation entre le système

immunitaire et l’œil ne représentait qu’une partie du phénomène complexe du privilège

immun40. En effet, il a été bien établi que le privilège immun est aussi le résultat de mécanismes

actifs impliquant d’une part des cellules résidentes de l’œil et d’autre part, l’expression

thymique des antigènes rétiniens et leur contrôle sur le répertoire des cellules T spécifiques

d’antigènes oculaires.

3.2 Mécanismes impliqués dans le privilège immun oculaire

Le modèle actuel du privilège immun oculaire repose sur l’association des trois éléments :

l’ignorance immunologique, la sécrétion des substances immunosuppressives solubles et

membranaires et l’ACAID (Anterior chamber associated immune deviation).

16

3.2.1 L’ignorance immunologique

La chambre postérieure de l’œil est séparée du système immunitaire par une barrière hémato-

rétinienne composée de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et des cellules endothéliales des

vaisseaux rétiniens renforcées par les prolongements de cellules de Müller. En outre, bien que la

surface externe de l’œil et l’espace sous-conjonctival soient drainés par la lymphe jusqu’aux

ganglions régionaux, les autres structures oculaires, notamment les plus internes, ne sont pas

drainées par la lymphe.

3.2.2 Inhibition par des substances immunosuppressives

Bien que la BHR empêche le passage des protéines, elle est moins efficace pour prévenir

l’infiltration des lymphocytes activés41. Cependant, les lymphocytes entrant dans l’œil sont

confrontés à un environnement peu propice à leur activation. Premièrement, l’œil comporte

très peu de cellules exprimant des molécules du CMHII pouvant jouer le rôle de cellules

présentatrices d’antigène. Deuxièmement, les cellules résidentes oculaires(les cellules gliales de

Müller, les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien, les cellules endothéliales de la cornée et

les cellules épithéliales du corps ciliaire et de l’iris) sont capables d’inhiber l’activation

lymphocytaire par des mécanismes impliquant des molécules membranaires42-45.Parmi celles-ci

on note une forme membranaire du TGF-β, le FasL, le CTLA4, la galectine et la

thrombospondine42, 46, 47. Troisièmement, les fluides oculaires sont riches en molécules

immunosuppressives notamment le TGF-β, α-MSH ou le VIP produit par ces cellules oculaires48.

Ces facteurs solubles inhibent non seulement l’activation des lymphocytes mais aussi des

cellules de l’immunité innée comme les cellules NK, les macrophages, les polynucléaires

neutrophiles 49. Enfin, les inhibiteurs de l’activation du complément sont exprimés de façon

constitutive et fonctionnelle dans l’œil50, 51. Leur rôle dans le maintien de l’environnement

immunosuppresseur oculaire est démontré par l’augmentation de l’inflammation en leur

absence52, 53.

3.2.3 Déviation immune associée au segment antérieur

Le dernier mécanisme expliquant le privilège immun oculaire concerne le phénomène connu

sous le terme de « Anterior Chamber-Associated Immune Deviation » (ACAID). Une protéine

17

étrangère injectée dans la chambre antérieure de l’œil n’est pas ignorée par le système

immunitaire, au contraire, elle induit une déviation de la réponse immune caractérisée par une

diminution des réactions d’hypersensibilité retardée, l’induction d’une réponse à anticorps et la

différenciation/activation de cellules T régulatrices. L’induction de l’ACAID nécessite la migration

de CPA de la chambre antérieure de l’œil vers la rate. Au niveau splénique, elles recrutent des

cellules T natural killer par le biais de la production de MIP2 (Macrophage inflammatory protein

2). Les lymphocytes B de la zone marginale sont aussi nécessaires à la mise en place de

mécanismes qui culminent avec la production de cellules TCD4 et TCD8 régulatrices. Les

premières inhibent l’induction de la réponse immunitaire afférente, alors que les secondes

inhibent son expression (réponse immunitaire efférente). Les antigènes placés dans l’espace

sous-rétinien induisent une déviation de la réponse immunitaire similaire à l’ACAID54, 55.

4. Les uvéites

4.1 Classification des uvéites

L’uvéite est une pathologie fréquente caractérisée par l’atteinte inflammatoire de l’uvée ainsi

que, dans certains cas, des structures oculaires adjacentes : le vitré, la rétine ou le nerf optique.

Les uvéites relèvent d’étiologies très diverses et sont souvent de cause indéterminée ou

idiopathique. Dans le cas où une étiologie est retrouvée, 4 catégories d’uvéites peuvent être

distinguées : les uvéites infectieuses (groupe des herpes virus, toxoplasmose, tuberculose,

syphilis, maladie de Lyme, brucellose, bartonellose etc.) les uvéites non infectieuses, secondaires

à une maladie systémique (spondylarthrite ankylosante, rhumatisme psoriasique, uvéite liée à

HLA B27, arthrite juvénile idiopathique de l’enfant, sarcoidose, maladie de Behçet, syndrome de

Vogt-Koyanagi-Harada, sclérose en plaques) à des entités ophtalmologiques supposées non

infectieuses (chorioretinopathie de Birdshot) et à des causes médicamenteuses (rifabutine,

etanercept, sulfamides)56, 57. Lorsqu’aucune cause n’est retrouvée, on parle d’uvéites

idiopathiques et on considère qu’il s’agit d’une atteinte autoimmunitaire limitée à l’œil.

Actuellement, la classification des uvéites la plus utilisée en clinique est anatomique

(http://research.mssm.edu/sun). Elle est basée sur la localisation principale de l’inflammation

intraoculaire. On définit ainsi l’uvéite antérieure qui est associée à une atteinte de l’iris et du

corps ciliaire, l’uvéite intermédiaire qui est caractérisée par des signes inflammatoires au niveau

18

du corps ciliaire, de la pars plana et de l’extrême périphérie rétinienne et l’uvéite postérieure où

les signes inflammatoires sont au niveau de la rétine et de la choroïde. Enfin, le terme panuvéite

implique une atteinte de toutes les parties de l’œil, les structures situées en avant,

intermédiaires et en arrière.

4.2 Epidémiologie des uvéites

Les études portant sur l’épidémiologie de l’uvéite sont rares et souvent biaisées. La prévalence

totale (nombre de patients atteints ou ayant été atteints dans la population) a été estimée à 38

cas pour 100.000 en France dans les années 1980 et varie selon les études et les pays de 68 à

730 pour 100.00058, 59. Quant à l’incidence annuelle (nombre de patients atteints par an dans la

population), elle varie de 11 à 7 pour 100.000 habitants avec un pic entre 20 et 50 ans60, 61. Sur

l’ensemble des uvéites, le sex-ratio est proche de 1 mais il varie en réalité fortement en fonction

de l’âge et des étiologies. Les uvéites sont essentiellement une maladie de l’adulte survenant à

un âge situé entre 20 et 40 ans 62. Quant à la distribution des étiologies elle varie nettement en

fonction des pays et cette variabilité est retrouvée pour presque toutes les formes anatomiques

d’uvéites63. En effet, plusieurs études ont montré que les atteintes antérieures sont les plus

fréquentes dans le monde occidental, alors que les données sont très différentes en Asie ou les

panuvéites sont les plus courantes64. Les raisons de ces différences sont multiples faisant à la fois

intervenir des critères génétiques et environnementaux. A l’heure actuelle, les uvéites non

infectieuses représentent deux tiers des causes d’uvéites chroniques dans les centres de

référence.

4.3 Les uvéites non-infectieuses

Les uvéites non-infectieuses sont une des principales causes de cécité dans les pays

industrialisés. Elles touchent 2 millions d’Américains et à l’origine de 10% d’handicap visuel aux

USA65. Certaines formes comme l’ophtalmie sympathique ou la maladie de Birdshot ne touchent

que l’œil alors que d’autres sont associées à des maladies systémiques comme la maladie de

Behçet, la sarcoïdose ou la maladie de Vogt-Koyanagi Harada. L’ensemble de ces uvéites sont

généralement considérées comme auto-immune. On retrouve effectivement plusieurs

arguments plaidant en faveur de phénomènes auto-immuns chez les patients atteints d’uvéite

19

non infectieuse. Premièrement, ces patients développent fréquemment une réponse

lymphocytaire à l’encontre de différents antigènes rétiniens (AgS, IRBP). Une telle autoréactivité

est également retrouvée chez les sujets sains. Néanmoins, le nombre de lymphocytes

spécifiques des antigènes rétiniens dans le sang des patients semble être supérieur aux sujets

sains66.

Deuxièment, il existe une forte association entre de nombreuses uvéites et certaines molécules

du complexe majeur d’histocompatibilité. Les plus frappantes sont l’association entre

l’ophtalmie sympathique et le VKH (réponse immune contre la mélanine) avec la molécule HLA-

DR4 et la maladie de Birdshot avec la molécule HLA-A29 (réponse immune contre l’arrestine)67,

68.

Troisièmement, de nombreuses données accumulées ces dernières années démontrent

l’implication et la prédominance des lymphocytes effecteurs TCD4+ de sous-type Th1 lors de ces

uvéites69, 70.Si pendant de nombreuses années, le concept physiologique de l’uvéite a été

dominé par le rôle majeur des lymphocytes Th1, des données récentes ont clairement impliqué

le rôle des lymphocytes Th17 chez l’homme dans des uvéites autoimmunes comme la maladie

de Behçet, la maladie de Vogt Koyanagi Harado, et la maladie de Birdshot71-73.

Enfin, l’effet bénéfique des traitements ciblant l’activation des lymphocytes T (Cyclosporine A,

daclizumab) est également un argument en faveur du rôle de l’autoimmunité dans le

développement des uvéites non infectieuses. Néanmoins, il a été récemment démontré que

l’auto-inflammation participait également au développement d’uvéite non infectieuse chez

certains patients. Le meilleur exemple est certainement donné par les patients atteints du

syndrome de Blau, syndrome associé à une mutation de NOD2, dont le tableau caractéristique

comporte une uvéite. La vision actuelle, est que les uvéites non infectieuses représentent un

groupe très hétérogène où certaines formes sont plus médiées par des composantes

d’autoimmunité et d’autres par des composantes d’auto-inflammation. De manière élégante les

différents composants d’autoimmunité et d’auto-inflammation se retrouvent dans les différents

modèles expérimentaux d’uvéites. Nous allons discuter brièvement certains de ces modèles en

se concentrant sur leurs spécificités et leurs limites (figure6).

Autoimmune Auto-inflammatoire

Adoptive transferof EAU

Uveitis duringMS(Multiple sclerosis)

Blau syndrome

Sarcoidosis

SPA (Spondylarthritis)IdiopathicWDS…

Experimentalautoimmuneuveitis (EAU)

Endotoxinexperimental uveitis(EU)

Uvéite non infectieuse :Autoimmune ou autoinflammatoire ?

Figure 6a: Uvéite non infectieuse: autoinflammatoire ou autoimmuneLes uvéites non infectieuses représentent un ensemble de maladies très hétérogène  ou certaines formes sont plus médiées par des composantes d’autoimmunité et d’autres par des composantes d’autoinflammation. Le meilleur exemple est certainement donné par les patients atteints du syndrome de Blau où la seule composante autoinflammatoire est suffisante pour générer une uvéite.

Adoptive transfer

J0 J18

Uveitis

IRBP activated lymphocytes Th1/Th17

Experimental autoimmune uveitis

Pathogen  pattern induced uveitis

PAMPs: LPS

24h 48h

Uveitis

PTXCFAIRBP

C57BL/6

EAU

J0 J21

IRBP stimulated

CPM

unstimulated

LT proliferation

Figure 6: Modèles expérimentauxd’uvéites Une uvéite peut être induite expérimentalement en utilisant des mécanismes auto‐immuns (transfert adoptif de lymphocytes autoréactifs), autoinflammatoires  (PAMPs, LPS) ou les deux composantes (UAE).

20

4.4 Les modèles expérimentaux d’uvéites

4.4.1 Uvéite induite par endotoxine (UIE)

Rosembaum et ses collègues sont les premiers à avoir décrit une uvéite antérieure aiguë chez les

rats à la suite d’injection d’endotoxine dans le coussinet plantaire ( UIE)74. Ce modèle met en jeu

essentiellement les composants du système immunitaire inné et est caractérisé par une rupture

de la barrière hémato-oculaire, l’infiltration intraoculaire de cellules inflammatoires et par la

production de cytokines et chimiokines inflammatoires. Actuellement, beaucoup de données ont

été rapportées sur l’implication du TLR4 ainsi que sur les molécules adaptatrices MyD88 et TRIF

dans le développement de l’UIE 75. Par ailleurs, d’autres TLRs comme les TLR2, TLR4 et TLR9 sont

liés à des pathologies inflammatoires qui sont souvent associées à des uvéites76. Des études

récentes se sont intéressées à l’implication d’autres composants bactériens dans le

développement de l’inflammation intraoculaire. Le PGN (peptidoglycan) motif présent dans

toutes les parois des bactéries intracellulaires Gram+ et Gram- semble bien pouvoir déclencher

de l’inflammation oculaire mais les mécanismes par lesquels il opère ne sont pas entièrement

compris. On sait tout de même que ces PGN se fixent sur un des membres de la famille des

NLRs, NOD277.

4.4.2 Uvéite autoimmune expérimentale (UAE)

Wacker et al ont décrit le premier modèle animal d’UAE en 1965 en immunisant des cochons

d’Inde avec des extraits rétiniens. Cela a conduit à la découverte en 1977 du premier auto-

antigène rétinien, l’arrestine78. En 1986, Igal Gery et ses collaborateurs sont les premiers à avoir

identifié les propriétés fortement uvéitogéniques de l’IRBP chez les rats79. L’IRBP est une

protéine impliquée dans le transport de la vitamine A entre les cellules photoréceptrices et les

cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien. L’IRBP s’est avéré être aussi très pathogénique

dans plusieurs souches de souris couramment disponibles. Néanmoins, comme chez l’homme, la

souris doit avoir un fond génétique permissif pour développer une uvéite. Les haplotypes H2

susceptibles sont H2r, H2k et H2b dans l’ordre de susceptibilité forte à modérée respectivement

chez les souris B10RIII>B10BR>C57BL/6. La susceptibilité des souches est dépendante de gènes

du CMHII. Il est évident que le CMHII n’intervient que de façon partielle dans la prédisposition

21

génétique, l’influence des gènes non-CMH (répertoire T, régulation hormonale et régulation des

cytokines et médiateurs inflammatoires) jouant également un rôle important dans leur

développement.

Pour l’induction de l’UAE, l’IRBP est émulsifié dans l’adjuvant complet de Freund (contenant des

Mycobacterium tuberculosis tuées). Par ailleurs, l’injection péritonéale de toxine de pertussis

est aussi nécessaire dans la plupart des modèles. Il existe différents peptides de l’IRBP qui sont

uvéitogènes. L’IRBP 161-180 est connu pour induire une uvéite sévère chez les souris de souche

B10RIII, impliquant principalement le pôle postérieur avec un détachement rétinien chez la

majorité des souris80. Le peptide 1-20 (et 1-16) cause des uvéites postérieures modérées chez les

souris C57Bl/6. Dans ce modèle, il y a activation de clones de lymphocytes autoréactifs Th1 et

Th17 avec une prédominance du sous-type Th17. Ces lymphocytes vont ensuite migrer au niveau

oculaire, reconnaître leur antigène, activer des cellules résidentes et des macrophages. Le profil

histologique est caractérisé par un infiltrat riche en neutrophile81. Ce modèle est fortement

dépendant de l’effet adjuvant du CFA et du PTX qui donne définitivement une place à l’immunité

innée et à l’auto-inflammation dans le développement de l’UAE.

4.4.3 Uvéite induite par transfert adoptif de cellules dendritiques (DC-UAE)

L’UAE peut être aussi induite non plus par injection directe de l’antigène émulsifié dans du CFA

mais par injection de cellules dendritiques (cellules professionnelles dans la présentation

antigénique) préalablement maturées (anti-CD40 et LPS in vitro) et pulsées avec de l’IRBP 161-

18082. Ce modèle diffère du modèle classique de l’IRBP parce que d’une part il est indépendant

de l’effet adjuvant (CFA/PTX) et d’autre part il est caractérisé par un influx de cellules T qui

produisent de grandes quantités d’IFNγ et très peu d’IL-17. Quand on immunise des souris

déficientes pour le gène de l’IFNγ par des DC pulsées à l’IRBP on protège contre la maladie

malgré une forte production d’IL-1781. Il est dès lors possible que l’utilisation d’adjuvants dans

certains modèles animaux de maladie autoimmune telle que l’EAE ou l’UAE pourrait biaiser

l’importance de l’IL-17 et expliquer les différences entre les modèles.

22

4.4.4 Uvéite induite par transfert adoptif de LT

Il est possible d’induire l’UAE, chez des souris naïves (non immunisés), en transférant les

lymphocytes Th1 ou Th17 provenant de souris immunisées par l’IRBP. En pratique, ces

lymphocytes sont isolés à partir de la rate et des ganglions des souris immunisés puis restimulés

in vitro. Les lymphocytes autoréactifs Th1 et Th17 sont ainsi amplifiés avant d’être transférés

dans une souris naïve. Par ailleurs, durant la période d’amplification, il est possible de les

polariser en un sous-type Th1 ou Th17 et donc de réaliser des transferts adoptifs Th1 ou Th17. La

polarisation vers un modèle Th1 est caractérisée par un infiltrat riche en macrophages et riche

en neutrophiles dans la polarisation Th1781. Les signes cliniques sont plus précoces, car les

lymphocytes transférés sont préalablement activés au sein des souris donneuses et restimulés in

vitro. L’utilisation de cette méthode a permis de déterminer le nombre minimal de lymphocytes

activés nécessaires pour induire l’UAE. De plus, il est possible de moduler, dans une certaine

limite, la sévérité de la maladie en variant le nombre de cellules Th1 ou Th17 injectées41, 83.

4.5 Vision générale de la physiopathologie des uvéites auto-immunes

La propension à développer une uvéite auto-immune est intimement liée aux lymphocytes T

autoréactifs qui reconnaissent les tissus rétiniens comme des tissus étrangers. L’élimination

incomplète des lymphocytes T effecteurs spécifiques d’antigènes rétiniens dans le thymus,

combinée au défaut des mécanismes de tolérance périphérique conduit à la circulation d’un

pool de cellules T non tolérisées. En effet, la séquestration des antigènes rétiniens et leur

séparation du système immunitaire par des barrières rétiniennes empêchent la libre circulation

des cellules entre l’œil et le reste l’organisme. Ainsi, les lymphocytes périphériques circulant

n’ont aucune chance de rencontrer les antigènes rétiniens dans des conditions normales non-

inflammatoires et n’ont donc aucune chance d’être tolérisés par ce biais. L’activation de ces

lymphocytes non tolérisés aura lieu donc en périphérie après exposition à un antigène rétinien

libéré au décours d’un trauma oculaire (ophtalmie sympathique) ou par cross-présentation d’un

antigène de micro-organisme mimant un antigène oculaire. De tels antigènes mimant les

antigènes oculaires ont été décrits84. L’œil semble donc extrêmement dépendant des

mécanismes de tolérance au soi qui ont lieu dans le thymus. La présence d’antigènes rétiniens

23

dans le thymus a été démontrée pour la première fois par l’équipe d’Egwagu85. Ces auteurs ont

montré que le niveau d’expression thymique de l’antigène S et de l’IRBP dans différentes

souches de souris était inversement corrélé à la prédisposition des animaux à l’UAE induite par

un même antigène. Ainsi, les souches résistantes à l’UAE expriment des niveaux plus élevés

d’IRBP dans le thymus que les souches sensibles. Les souris greffées avec un thymus de souris

IRBP-KO développent des UAE très sévères avec des faibles doses d’IRBP. Une situation similaire

est observée chez les souris déficientes en gène AIRE, un facteur de transcription régulant

l’expression des antigènes rétiniens dans le thymus86. Les souris déficientes en AIRE développent

des auto-anticorps anti-rétinien spécifiques d’Ag exprimés au niveau de la couche des

photorécepteurs. En outre, ces souris présentent des infiltrats rétiniens associés à des

altérations des photorécepteurs, histologiquement très proches de ceux observés au cours de

l’UAE classique87. Inversement, des études récentes montrent que l’expression d’un Ag rétinien,

dans un environnement non-privilégié, induit une tolérance immune et protège contre le

développement de l’UAE. Ainsi la tolérance périphérique serait le maillon faible, incapable de

compenser les défauts de la tolérance centrale responsable de l’émigration de cellules T

spécifiques d’antigènes rétinien en périphérie. Ces cellules T non tolérisées pourraient être alors

activées par l’exposition à un antigène rétinien ou à un épitope croisé en présence d’agents

adjuvants provenant d’une infection ou d’une réponse inflammatoire concomittante. Malgré la

présence de T régulateurs naturels, si une quantité suffisante de cellules effectrices sont

activées, elles vont migrer jusqu'à l’œil. Des données de l’équipe de R.Caspi semblent montrer

que les premières cellules T uvéitogènes qui entrent dans l’œil le font de manière aléatoire41.

Dans le modèle du rat, des marquages par un fluorochrome ont montré que les lymphocytes T

activés spécifiques ou non-spécifiques de l’AgS pénètrent dans l’œil avec la même fréquence.

Les cellules non spécifiques disparaissent rapidement et l’œil redevient normal. Par contre les

cellules T spécifiques de l’AgS restent dans les tissus oculaires et plusieurs jours plus tard, l’œil

développe une uvéite destructrice. L’induction de l’UAE implique donc la reconnaissance de l’Ag

in situ. Dans un œil sain le trafic libre de cellules et molécules est rendu difficile par la présence

de la BHR. Comment les premières cellules T spécifiques de l’Ag rétinien traversent-elles les

barrières ? Il est important de garder à l’esprit que les cellules T activées sont collantes,

Central tolerance

Figure 7 : Autoimmunité oculaire. L’élimination  incomplète  des  lymphocytes  T  effecteurs  dans  le  thymus,  combinée  au  défaut  des mécanismes de  tolérance périphérique  conduit à la  circulation d’un pool de  cellules T autoréactive non  tolérisées.  Les    cellules  T  régulatrices  naturelles  (nTreg)  sont  exportées  du  thymus  en  même temps que  les cellules T autoréactives (Th1/Th17) permettant ainsi  le contrôle de ces dernières. Les cellules  T  effectrices  activées migrent  au  niveau  tissulaire  après  avoir  traversée  l’endothélium  des vaisseaux, y compris dans l’oeil. La reconnaissance spécifique de leur antigène dans le tissu est suivie par  la  rupture  de  la  BHR,  l’amplification  du  recrutement  de  lymphocytes  et  du  processus inflammatoire au niveau oculaire aboutisant à l’uvéite clinique. Les antigènes rétiniens libérés à partir des tissus  lésés  induisent au niveau splénique  la génération de Treg qui permettent de retrouver un nouvel état de tolérance.

Innate stimuli: PTX,LPS ..

« Escapes »

Peripheral tolerance

APC Th1Th17

IL‐12, IL‐23, IL‐6, TGFβ

Migration and infiltration 

Chemokines, adhesion molecules

UVEITIS

spleen

nTreg

nTreg inductionIRBP+mTECs

iTreg

24

envahissantes et partagent des propriétés avec les cellules métastasiques tumorales. En effet,

elles produisent de nombreuses molécules d’adhésion et des enzymes dégradant la matrice. Ces

caractéristiques leur permettent d’adhérer aux cellules endothéliales des vaisseaux sanguins et

de s’extravaser au sein de l’œil (figure 7). Nous allons voir dans la section suivante l’importance

de l’activation des cellules de la BHR par les lymphocytes T autoréactifs dans le développement

d’UAE.

5. Rôle de l’activation des cellules rétiniennes dans le développement d’uvéite non infectieuse

5.1 Introduction

De nombreux arguments démontrent que lors d’uvéites expérimentales, les cellules résidentes

de l’œil ne sont pas des victimes innocentes mais participent au contraire activement au

développement de la maladie. En effet, les cellules de la BHR qui normalement empêchent les

cellules inflammatoires de pénétrer dans l’œil vont être activées par les médiateurs libérés par

les lymphocytes T autoréactifs et voir leurs propriétés profondément modifiées. Ainsi, sous

l’influence principale des cytokines sécrétées par les lymphocytes Th1 /Th17, ces cellules vont se

mettre à exprimer des molécules d’adhésion, des molécules du CMH et produire des cytokines

proinflammatoires. La BHR sera ainsi rompue et les lymphocytes T autoréactifs pourront

pénétrer à l’intérieur de l’œil et y déclencher l’inflammation. Les principales cytokines libérées

par les lymphocytes Th1 et Th17 et responsables de l’activation des cellules de la BHR, sont

l’IFNγ, le TNFα, l’IL-1β, l’IL-17 et l’IL-22. Si ces cytokines sont capables d’activer les différents

types cellulaires de la BHR, la majorité des travaux ont été effectués sur l’EPR qui sera donc

traité séparément (figure 8).

5.2 Effet des cytokines sur les cellules de l’EPR

5.2.1 Effets de l’IFNγ

L’IFNγ joue un rôle important dans la physiopathologie des uvéites, puisqu’on a détecté de l’IFNγ

dans les yeux d’UAE et chez les patients atteints d’uvéite88, 89. De plus, C Egwuagu et al ont

démontré que l’expression transgénique intra-oculaire d’IFNγ augmente la sévérité et accélère le

développement d’UAE chez le rat90.

Figure 8: Rupture de la BHR et activation des cellules de l’EPR.Des modèles d’UAE ont démontré qu’une  inflammation oculaire survient  lorsque des  lymphocytes TCD4+ sont activés par des antigènes oculaires en présence de signaux de danger. Ces lymphocytes, de  sous‐types  Th1  et  Th17,  vont  migrer  dans  l’œil  et  sécréter  des  cytokines  pro‐inflammatoires ayant la capacité d’activer les cellules de l’EPR. Sous l’effet de ces cytokines les cellules de l’EPR vont exprimer des molécules d’adhésion et de co‐stimulation et sécréter des cytokines,

EPR

Müller cell

Blood vessel

NEURORETINA

Th1 Th17

Innate stimuli: PTX,LPS ..

25

L’IFNγ est intimement impliqué dans la régulation de l’immunité innée et adaptative. C’est une

cytokine proinflammatoire sécrétée essentiellement par les lymphocytes TCD4 du sous-type Th1,

mais aussi par les lymphocytes TCD8, les cellules NK et par les macrophages activés. L’activation

de son récepteur qui est composé de deux sous-unités distinctes IFNGR1 et IFNGR2 est couplée à

la voie dite de JAK-STAT qui est bien connue et a été caractérisée au niveau des cellules de l’EPR

par l’équipe de C Egwuagu91. Après liaison de l’IFNγ à son récepteur, les protéines JAK1 et JAK2

(Janus Kinase) sont activées, et vont stimuler la phosphorylation de STAT1 (Signal Transducer

and Activator of Transcription). Cette phosphorylation induit la formation d’homodimères de

STAT1 qui vont migrer dans le noyau et promouvoir en se liant au niveau de sites GAS (Gamma

Activated Sequences) l’expression de gènes précoces (early genes) nommés IRF (IFN Regulatory

Factor). Les IRF vont collaborer avec STAT1 pour assurer la transcription des gènes induits par

l’IFNγ. Il s’agit principalement de cytokines, de molécules d’adhésion, de la NO synthase, et des

molécules du CMH de classe I et II. Par ailleurs, les gènes SOCS (Suppressors Of Cytokines

Signalling) sont également transcrits. Ceux-ci codent pour des protéines qui vont inhiber la

phosphorylation de STAT1 et sont donc les éléments d’une boucle de rétro-contrôle négatif de la

stimulation par l’IFNγ (figure 9).

Une des conséquences majeure de l’activation des EPR lors de l’inflammation et l’induction

membranaire de molécules du CMH II qui a été retrouvée à la surface des cellules de l’EPR chez

des patients atteints d’uvéites et dans le modèle d’UAE92-94. Les cellules de l’EPR exprimant du

CMHII lors de l’inflammation pourraient ainsi servir localement de cellules présentatrices

d’antigènes et activer les lymphocytes T autoréactifs95. La stimulation de l’EPR par l’IFNγ a

également d’autres conséquences. On retrouve en particulier une augmentation du CD54 (ICAM-

1), du CD4096, des protéines du complément97, du VEGF98 et une diminution de ZO-199. Les effets

de l’IFNγ sur la production de cytokines sont plus difficiles à analyser car la plupart des études

ont été faites sur l’EPR stimulé par un cocktail de cytokines.

5.2.2 Régulateur négatif de la signalisation : SOCS

Les membres de la famille SOCS sont impliqués dans une boucle de rétrocontrôle négatif de la

signalisation induite par de nombreuses cytokines, hormones, facteurs de croissance dont l’IFNγ,

Figure 9 : Cascade de signalisation intracellulaire de l’IFNγLa liaison de l’IFNγ à son récepteur entraîne une succession de phosphorylations initiées par la famille Janus Kinases  (JAK)  conduisant  à la  dimérisation  du  facteur  de  transcription  STAT‐1  (Signal  Transducer  and Activator  of  Transcription  1)  et  à sa  migration  dans  le  noyau.  Il  s’ensuit  la  transcription  de  différentes cytokines  pro‐inflammatoires  (CMHII,  VCAM1…), mais  également  d’une  protéine  nommée  Suppressor  of cytokines Signaling‐1 (SOCS‐1)  impliquée dans  la régulation négative de  la transduction du signal. En effet, SOCS1 va se lier aux protéines JAK, inhiber leur activités catalytique et ainsi bloquer l’activation par l’IFNγ.

STAT1

CytokinesAdhesion molecules

CMH‐II

JAK

IFNγ

STAT1

GAS

JAKP P

P

P

P

P

P

P

P

P P

P

-STAT1STAT1

STAT1

STAT1SOCS1

P

P

GAS

RPE

26

les ligands des TLRs et plusieurs interleukines qui activent les voies JAK/STAT100. Des membres

de la famille de SOCS peuvent être induits par d’autres stimuli qui n’activent pas JAK/STAT tels le

LPS, l’insuline et l’EGF101. Par contre, à l’état basal, les protéines SOCS ne sont pas ou peu

exprimées dans la cellule. On compte à l’heure actuelle 8 membres dans cette famille : SOCS 1 à

7 et la protéine CIS102. Ils sont caractérisés par une structure commune très conservée avec deux

domaines fonctionnels importants. Le domaine SH2 permet aux protéines SOCS1 de rentrer en

compétition avec STAT pour le site de fixation sur le récepteur et parvient ainsi à inhiber le

signal. Un autre moyen utilisé par SOCS1 est de se lier directement à JAK et ainsi d’inhiber leur

phosphorylation et leur activation subséquente103. Les protéines de la famille SOCS se

caractérisent aussi par la présence d’un motif caractéristique en C-terminal. Ce domaine très

conservé est appelé « SOCS–BOX ». Il a été démontré que ce motif est un adaptateur qui permet

la liaison de SOCS au complexe de l’ubiquitine ligase E3. Ce complexe permet la liaison de

molécules d’ubiquitine aux protéines qui pourront être reconnues par le protéasome et être

dégradés104, 105.

Les protéines SOCS sont donc impliquées dans la boucle de contrôle négative de nombreuses

cytokines. Leur importance à ce niveau est bien illustrée par les souris SOCS1-KO, qui meurent

rapidement des suites d’une infiltration de leurs organes par des cellules inflammatoires105.

5.2.3 Effets du TNFα et de l’IL-1β sur l’EPR

De nombreux travaux attestent de l’importance du TNFα dans le développement des UAE. Tout

d’abord, plusieurs auteurs ont noté l’augmentation de l’expression du TNFα intra-oculaire lors

d’UAE. De plus, l’administration de TNFα recombinant à des animaux atteints d’UAE aggrave

significativement la maladie. Inversement, la maladie peut être supprimée par administration

d'anticorps anti-TNFα106. Le TNFα possède de nombreuses propriétés pro-inflammatoires. Il est

produit principalement par les macrophages, les lymphocytes mais aussi par les cellules

endothéliales et épithéliales. Les réponses biologiques au TNFα sont médiées par deux

récepteurs distincts : le TNFR1 ou p55 et le TNFR2 ou p75. Le TNFR1 contient des domaines de

mort cellulaire sur sa partie intracellulaire107, domaines qui sont absents du TNFR2. Après liaison

au TNFR1, la partie intracellulaire du récepteur se lie au TNF Receptor Death Domain (TRADD)

qui dans le cas du TNFR1 peut activer l’apoptose cellulaire via le Fas Associated Death Domain

TNFα

IκBPr

Figure 10Schéma simplifié de la voie de signalisation du TNFα et de l’IL‐1β. 

La transduction  du signal induit par le TNFα et l’IL‐1β converge vers l’activation d’un facteur de transcription le NF‐Κb. Le NF‐Κb se trouve dans le cytoplasme où il est maintenu par une liaison à l’IκB. Après fixation du TNFα et de l’IL‐1β à leur récepteur, il y a une activation du complexe kinase qui va phosphoryler l’IκB lequel va  se détacher du NF‐Κb, être ubiquitiné puis dégradé dans  le protéasome  tandis que  le NF‐Κb  libéré va pouvoir migrer dans le noyau où il va activer la transcription de gènes pro‐inflammatoires.

CytokinesAdhesion molecules

MHC II

IL-1β

NFκB

NFκBIκB

27

(FADD). Dans le cas du TNFR1 et TNFR2, une voie proinflammatoire est également stimulée via le

TNF Receptor Associated Factor 2 (TRAF2) et le Receptor-Interacting Kinase (RIP)108.

L’IL-1 est principalement produite par les macrophages et possède des propriétés activatrices

sur de nombreux types cellulaires dont les lymphocytes T, les cellules endothéliales et

épithéliales. L’IL-1 existe sous deux formes : l’IL-1α qui est membranaire et l’IL-1β qui est

sécrétée. Elles agissent sur le même récepteur. Après leur liaison au récepteur du type I (IL-1R),

celui-ci interagit avec l’IL-1Racp (IL-1R accessory protein) et après une série de changement

conformationnels, MyD88 est recruté. Il s’ensuivra le recrutement et l’activation de plusieurs

autres protéines (IRAK, TRAF6, TAK1) et finalement l’activation du complexe des IκB kinases109.

La stimulation des récepteurs au TNFα et à l’IL-1β converge vers l’activation du complexe de

l’IκB kinase. Celui-ci, constitué de 3 sous-unités (α, β, γ) va phosphoryler l’IκB. Une fois

phosphorylé, il va se détacher du NF-κB, être ubiquitiné puis dégradé dans le protéasome tandis

que le NF-κB libéré va pouvoir migrer dans le noyau ou il va activer la transcription des gènes

dont les promoteurs possèdent un site κb tels que les gènes de certaines cytokines, de

molécules d’adhésion, et celui de l’IκB110(figure 10).Le TNFα et l’IL-1β sont des médiateurs

fondamentaux de l’activation des cellules de la BHR. Les cellules de l’EPR sont en effet très

sensibles à l’IL-1β et au TNFα auxquels elles répondent par l’induction de molécules d’adhésion

et la sécrétion de cytokines proinflammatoires. En effet, in vitro, lorsqu’ elles sont stimulées par

du TNFα et l’IL-1β, les cellules de l’EPR vont exprimer de l’ICAM-1, de la NO synthase et du ZO-1

et sécréter différentes cytokines telles que l’IL-8, du Rantes et du MCP1111.

5.2.4 Effet de l’IL-17 et de l’IL-22

Depuis la description par Luger.D et al du rôle des lymphocytes Th17 dans les uvéites non-

infectieuses, de nombreux auteurs sont venus confirmer que ce sous-type lymphocytaire était

fortement impliqué dans la maladie112-115.

Les lymphocytes Th17 ont été décrits comme des cellules TCD4+ productrices d’IL-17A et d’IL-

17F mais aussi d’IL-21 et d’IL-22116. L’IL-17A et l’IL-17F appartiennent à une famille de 6 cytokines

(IL-17A à IL-17F), dont les effets se caractérisent par des propriétés proinflammatoires telles que

la sécrétion de facteurs granulopoïétiques, le G-CSF (Granulocyte Colony-Stimulating Factor) l’IL-

28

6 , de MIP et par la sécrétion de chimiokines (CXCL-1,-2, -5,-6, -8, -9 etc) par les cellules cibles117.

Par ailleurs, comme beaucoup d’autres cytokines, l’IL-17 a aussi une activité anti-inflammatoire.

Cette dualité de fonction a été rapportée au cours de l’UAE118. L’IL-17 agit sur les cellules cibles

via deux récepteurs : l’IL-17 RA et l’IL-17 RC. Bien que la cascade de signalisation de l’IL-17 soit

loin d’être complètement élucidée, il a été démontré que la transduction du signal implique la

PI3K/AKT, le NF-κB, et la MAPK 119, 120.

L’IL-22 est une cytokine qui appartient à la famille de l’IL-10. Elle exerce ses fonctions

biologiques par le biais de 2 récepteurs, l’IL-22R1 et l’IL-10R2 qui sont essentiellement situés sur

les cellules résidentes des tissus d’origine épithéliales. Ses propriétés anti et pro-inflammatoires

dépendent du tissu impliqué121-123. IL-22 est produite par les lymphocytes de sous-type Th1,

Th17 et Th22. Une étude par microarray, a montré que les PBMC isolés de patients atteints

d’uvéite, exprimaient fortement le gène de l’IL-22124. Au niveau intracellulaire, il est connu que

l’IL-22 active STAT3 et régule l’expression de molécules proinflammatoires et antimicrobiennes

et est ainsi impliqué dans les défenses de l’hôte, l’inflammation et la réparation tissulaire116, 125.

Les effets de l’IL-17 et de l’IL-22 sur les cellules résidentes de l’œil ne sont pas encore clairs et

font l’objet de nombreuses études. Cependant, il a été démontré in vitro que les EPR humaines

expriment constitutivement de l’IL-17RC et de l’IL-22R mais pas de l’IL-17RA. L’IL-17A et l’IL-17F

stimulent sensiblement la sécrétion de médiateurs inflammatoires tels que le CXCL8, CCL2,

CCL20, MIP-2, G-CSF et l’IL-6 par les EPR. De plus, l’IL-17A et l’IL-17F compromettent

significativement la fonction de la BHR externe (monocouche de l’EPR) en modifiant la

distribution de ZO-1 et des occludines124. Ces données sont à mettre en perspective avec celles

de Ke Y et al qui ont montré sur l’EPR de souris que l’IL-17 induisait une réponse plutôt anti-

inflammatoire sur ce type cellulaire, en comparaison à une réponse fortement inflammatoire

retrouvée sur les astrocytes rétiniens. De manière intéressante ces auteurs liaient cet effet

« anti-inflammatoire » de l’IL-17 à une induction de SOCS1 et SOCS3 dans l’EPR et aussi dans les

astrocytes rétiniens126.

En ce qui concerne les effets de l’IL-22 sur l’EPR, si Liz et al retrouvent un effet sur la résistance

transépitheliale, celui-ci n’est pas retrouvé par Chen Y et al qui, s’ils mettent bien en évidence le

29

récepteur, ne retrouvent aucun effet de cette cytokine ni sur la résistance transepithéliale, ni sur

l’expression de ZO-1, ni sur la production de cytokines124, 127.

5.2.5 Effet des cytokines proinflammatoires sur les cellules gliales

En dehors des effets sur l’EPR, les cytokines proinflammatoires modifient aussi le phénotype

d’autres types cellulaires rétiniens (les cellules de Müller, les astrocytes, et les cellules

microgliales) au cours de l’inflammation.

Les cellules de Müller sont les cellules gliales principales de la rétine et sont des constituants

importants de la BHR interne. Elles jouent un rôle important dans la physiopathologie de

l'inflammation intra-oculaire en exprimant des molécules du CMH de classe II. Elles peuvent

ainsi, soit activer les lymphocytes T en jouant le rôle de cellules présentatrices d’antigènes, soit

inhiber leur prolifération et leur production d’IL-2. Elles produisent de l’IL-1β et du TNFα au

cours de l’inflammation oculaire ou après stimulation par le lipopolysaccharide (LPS)128. De

manière intéressante, il a été bien démontré que le niveau de production de TNFα par les

cellules de Müller est corrélé à la susceptibilité de la souche de laquelle sont issues les cellules

de Müller. Les cellules de Müller et la microglie du rat Lewis, espèce particulièrement sensible à

l’inflammation oculaire, produisent du TNFα et du monoxyde d’azote (NO) lorsqu’elles sont

stimulées in vitro129, 130. In vivo, des études récentes ont montré que l’activation des cellules de

Müller par l’IFNγ altère l’intégrité de la BHR qui est maintenue grâce aux cellules astrocytaires131-

133.

Les rôles exacts des astrocytaires dans l’inflammation intraoculaire n’ont jamais été entièrement

identifiés. Comme pour les cellules de l’EPR et les Müller dans des contextes proinflammatoires,

les astrocytes expriment des molécules du CMHII et des molécules de costimulation et sécrètent

différentes cytokines proinflammatoires (TNFα, IL-6, IL-12 et IL-23). Jiang et al ont démontré in

vitro que ces astrocytes peuvent activer des lymphocytes T autoréactifs134, 135. Le même groupe a

aussi montré que les astrocytes expriment de l’IL-6 du TNFα et du CCL2 en réponse à l’IL-17 et

que l’IFNγ et l’IL-17 ont un effet synergique sur la migration ces cellules in vitro126.

30

Les cellules microgliales de la rétine dérivent de précurseurs hématopoïétiques et se

renouvellent au cours du temps. Chez les souris, leur remplacement total prend 6 mois136, 137.

Elles expriment de nombreux marqueurs inflammatoires comme les molécules du CMH II, du

CD45 et du CD68 et peuvent présenter des antigènes aux lymphocytes138. Elles sont

principalement situées dans la rétine périphérique et autour de la tête du nerf optique mais sont

plus particulièrement trouvées dans la couche des cellules ganglionnaires et photoréceptrices.

Ces cellules produisent du TNFα et du NO et migrent au sein de la rétine lors de l’inflammation.

Cette migration vers le site inflammatoire dépend de l’expression d’un récepteur membranaire

CD200. Il a été démontré que bloquer la cascade de signalisation induite par l’interaction

CD200/CD200R augmenterait la production de NOS2 dans la rétine et la sévérité de la maladie

tandis que l‘utilisation d’anticorps anti-CD200R protègerait de la maladie139.

6. Traitements des uvéites non-infectieuses

Malgré leurs effets secondaires bien connus, les corticostéroïdes demeurent les agents

principalement utilisés dans le traitement des uvéites non-infectieuses du segment

postérieur140.Toutefois, au cours des 30 dernières années, l’utilisation croissante d’agents

immunosuppressif et plus récemment d’agents biologiques s’est accélérée afin d’atteindre deux

principaux objectifs 1) minimiser les effets secondaires dû à l’utilisation à long terme des

stéroïdes 2) introduire une approche thérapeutique plus ciblée.

6.1 Les corticostéroïdes

Les corticostéroïdes sont le traitement de première ligne des uvéites. Leur utilisation est

néanmoins limitée par les effets secondaires inévitables que l’on rencontre après un usage

chronique. Classiquement, le traitement d’attaque consiste en de la methylprednisolone à 1

mg/Kg. Après maximum un mois, les corticostéroïdes sont diminués progressivement puis

stoppés. Si la maladie n’est pas contrôlée de cette manière, on ajoute au traitement un

immunosuppresseur141.

31

6.2 Les immunosuppresseurs

Les immunosuppresseurs forment un groupe de médicaments bien connus et particulièrement

utiles chez les patients corticodépendants. Ils peuvent être classés en antimétabolites, en

inhibiteur des lymphocytes T en agents alkylants et en agents biologiques.

6.2.1 Les antimétabolites

Les antimétabolites agissent en inhibant une enzyme, la dihydrofolate réductase qui freine la

production de la tétrahydrofolate, un métabolite nécessaire à la synthèse des nucléotides. Par

conséquent, les antimétabolites entravent la synthèse de l’ADN et de l’ARN, il en résulte ainsi

une inhibition non sélective de la prolifération des cellules T et B. Ces traitements sont donc des

immunosuppresseurs puissants peu spécifiques et de ce fait associés à des effets secondaires

parfois sévères. Les plus utilisés sont le ledertrexate et l’azathioprine.

6.2.2 Les inhibiteurs des cellules T

L’implication centrale des lymphocytes T dans la physiopathologie des uvéites non infectieuses

en fait une cible thérapeutique naturelle. La cyclosporine (CsA) et le tacrolimus, membres de la

famille des macrolides agissent principalement en bloquant la cascade de signalisation initiée par

l’IL-2 en inhibant la calcineurin. L’équipe de R Nussenblatt est la première à avoir démontré

l’efficacité de la CsA tant dans le modèle animal d’UAE que chez l’homme142. Plus récemment,

des anticorps neutralisant le récepteur à l’IL-2 (daclizumab) ont été mis au point et semblent

montrer une certaine efficacité dans les essais cliniques143, 144. Néanmoins, les mécanismes

d’action de ces traitements restent peu clairs. Ils pourraient aggraver certaines pathologies

autoimmunes à médiation cellulaire, par inhibition des lymphocytes T reg car l’IL-2 est

nécessaire à leur maintien et à leur prolifération145.

6.2.3 Les agents alkylants

Le cyclophosphamide et le chlorambucil sont généralement utilisés en oncologie et dans des cas

sévères de maladies rhumatismales. Leurs effets secondaires sont très nombreux et

potentiellement gravissimes. Ils sont peu utilisés dans la prise en charge des uvéites non

infectieuses146.

32

6.2.4 Les agents biologiques

Bien que les médicaments décrits précédemment exercent une activité immunosuppressive

efficace, ils demeurent associés à des complications systémiques et ne sont pas spécifiques des

uvéites non infectieuses. Les progrès réalisés dans la compréhension des mécanismes

immunitaires impliqués dans la physiopathologie des uvéites ont permis le développement de

nouveaux agents biologiques plus ciblés. Ces agents biologiques sont pour la plupart des

anticorps recombinants ou des antagonistes de cytokines et de récepteurs de surface cellulaire.

Ils peuvent également inclure des cytokines recombinantes comme l’IFNα. Un des premiers

exemples de réussite, est la neutralisation de l’activité du TNFα par une protéine de fusion le

TNFR-IS/IgG147, 148. L’efficacité des anticorps anti-TNF (l’infliximab) chez l’homme n’est plus à

prouver car ils sont utilisés couramment comme traitement thérapeutique dans plusieurs

maladies autoimmunes dont les uvéites149. Les agents biologiques ont d’autres cibles comme les

signaux de costimulation, le CTLA-4 (abatacept), la réponse B par l’intermédiaire des anticorps

anti-CD20 (Rituximab) ou les cytokines proinflammatoires par l’utilisation d’anticorps anti-IL-1

(anakirna) ou anti-Il-6 (tocilizumab)150-152. Enfin, plusieurs agents biologiques ont également

comme cibles des molécules d’adhésions (Natalizumab, ou la prévention de l’efflux des

lymphocytes T des ganglions lymphatiques vers l’organe cible par inhibition du sphingosine-1-

phosphate récepteur (FTY 720)153. Ces deux stratégies ont montré des effets bénéfiques dans les

essais cliniques de la sclérose en plaque et dans le modèle de l’UAE153. L’implication des

macrophages dans la phase effectrice de l’inflammation par leur production d’IL-6, de TNFα et

de NO, en fait une cible thérapeutique intéressante. Copland A et al ont montré qu’une

inhibition du clivage du facteur C5 du complément et la stimulation du récepteur inhibiteur

CD200 réduit la sévérité de la maladie lors de l’UAE154.

6.3 Thérapeutique expérimentale

6.3.1 Inhibition de l’activation des cellules rétiniennes par transfert de gènes

codant pour des cytokines anti-inflammatoires

Parmi les nouvelles approches possibles, la thérapie par transfert de gène occupe une place de

choix. Cette thérapie vise à transférer des gènes directement dans les tissus malades afin de

33

corriger une expression défectueuse ou d’apporter l’expression de nouveaux gènes. Dans le cas

des maladies immunitaires, l’apport d’un gène codant pour une protéine immunosuppressive

permettrait un traitement local de la maladie. Le transfert de gène se fait via des vecteurs viraux,

cellulaires ou chimiques. Le choix de ces vecteurs est une des étapes clefs dans la stratégie de

thérapie génique. Pour le traitement des maladies rétiniennes (dégénératives ou immunitaires),

les vecteurs recombinants basés sur les virus adéno-associés (AVV) semblent des candidats

idéaux155. En effets, les AAVs possèdent une série de propriétés biologiques qui en font un outil

de choix pour infecter un tissu aussi particulier que la rétine : 1) les virus AVVs ne sont pas

pathogènes 2) les vecteurs AVVs sont capables de transduire des cellules post mitotiques,

d’origines diverses et de façon stable156. Ainsi plusieurs travaux ont montré la faisabilité de

l’utilisation clinique de tels vecteurs pour délivrer des gènes thérapeutiques, notamment dans

un type de dégénérescence rétinienne157. Dans le contexte des uvéites non infectieuses, si les

projets n’ont pas encore atteint les essais cliniques, plusieurs groupes ont utilisé ces vecteurs

pour faire produire des molécules immunosuppressives telles que l’IL-10 virale, l’IFNα et l’IL-1RA

par les cellules rétiniennes158-161.

34

Objectifs du travail

Le but de ce travail est dans un premier volet de mieux caractériser l’activation des cellules de la

BHR lors d’uvéite autoimmune.

Pour ce faire, nous avons d’une part analysé l’expression rétinienne de la molécule d’adhésion

VCAM-1, in vivo, dans un modèle d’UAE classique ou par transfert adoptif de lymphocytes

autoréactifs.

Nous avons ensuite étudié in vitro, la régulation de l’expression du CMHII sur les cellules de l’EPR

par l’IFNγ et le TNFα.

Enfin, dans une autre partie du travail, nous avons testé s’il était possible d’inhiber le

développement d’une uvéite autoimmune en bloquant l’activation des cellules de la BHR. Nous

avons ainsi surexprimé le gène SOCS1 au niveau rétinien et étudier l’effet de cette surexpression

in vivo et in vitro sur le développement de la maladie.

35

Résultats 1. Caractérisation de l’expression de VCAM-1 au niveau rétinien lors

d’uvéite autoimmune expérimentale

Characterization of retinal expression of vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) during

experimental autoimmune uveitis

M Makhoul*, R Dewispelaere*, LJ Relvas, V Elmaleh, L Caspers , C Bruyns and F Willermain

Accepté pour publication (Experimental Eye Research)

Contexte

L’activation des cellules rétiniennes de l’œil est un élément clef dans le développement d’UAE.

Une des composantes majeures de cette activation est l’induction de l’expression de molécules

d’adhésion permettant le passage des lymphocytes autoréactifs au travers de la BHR. Ainsi,

l’uprégulation des molécules d’adhésion VCAM-1, ICAM-1 et PECAM1 au niveau de

l’endothélium rétinien a été montré comme un prérequis pour la migration leucocytaire lors

d’UAE. Néanmoins, il n’y a pas dans la littérature de description complète de l’expression de ces

molécules d’adhésion sur les autres types cellulaires de la BHR lors d’UAE. Nous avons donc

entrepris une série de marquages afin de caractériser l’expression de VCAM-1 sur les cellules

rétiniennes dans deux modèles d’uvéites non infectieuses : l’UAE classique et l’UAE induite par

transfert de lymphocytes T autoréactifs.

Résultats et conclusions

Nos résultats montrent que VCAM-1 n’est pas exprimé dans la rétine d’un animal sain mais est

induit dès la deuxième semaine post transfert adoptif. Dans la rétine d’un animal atteint d’uvéite

de faible sévérité, l’expression de VCAM-1 est uniquement induite au niveau de certaines zones

de vasculite et au niveau du corps ciliaire. Dans les yeux plus malades, ces lésions de vasculite

s’étendent et toute la limitante est alors marquée. En parallèle, la limitante externe devient

également faiblement positive comme l’EPR. Dans les uvéites sévères, l’expression de VCAM-1

est nettement plus marquée tant au niveau de la limitante interne que de la limitante externe.

L’EPR et le corps ciliaire demeurent aussi positifs dans ces yeux forts malades. Nous avons

36

ensuite voulu déterminer quel type de cellules rétiniennes exprimait VCAM-1 par des

expériences de triple marquage à l’aide d’anticorps marquant les cellules endothéliales

(endogline), les cellules gliales (GFAP) et VCAM-1. Nos résultats montrent qu’au niveau des

zones de vasculite, l’expression de VCAM-1 colocalise soit avec l’endogline soit avec la GFAP. Au

niveau de la membrane de la limitante interne, l’expression de VCAM-1 colocalise également

avec la GFAP. Le même pattern (EPR, cellules de Müller, astrocytes et cellules endothéliales)

d’expression de VCAM-1 au niveau rétinien a été retrouvé dans le modèle d’UAE classique. En

conclusion, nos résultats mettent en évidence que l’ensemble des cellules de la BHR (EPR,

cellules de Müller, astrocytes et cellules endothéliales) expriment progressivement VCAM-1 lors

d’UAE, et que l’étendue et l’intensité de cette expression est corrélée à la sévérité de la maladie.

 

 

Characterization of retinal expression of vascular cell adhesion molecule 

(VCAM‐1) during experimental autoimmune uveitis 

M  Makhoul  *(1),  R  Dewispelaere*(1,2),  LJ  Relvas  (1,2),  V  Elmaleh  (1,2),  L  Caspers  (2),  C 

Bruyns (1)  and F Willermain (1,2).  

(1) I.R.I.B.H.M  (Institute  of  Interdisciplinary  Research),  Université  Libre  de  Bruxelles  Campus  Erasme, 

Brussels, Belgium. (2) Department of Ophthalmology, CHU St‐Pierre and Brugmann, Brussels, Belgium. 

*MM and RD contributed equally to this work. 

Corresponding author: Makhoul Maya. 

Address: Route de Lennick 808‐ B 1070 Brussels, Belgium 

Tel: 0032/5554104 

FAX: 0032/5554655 

E‐mail address: mmakhoul@ulb.ac.be 

Keywords: Uveitis, Retina, VCAM‐1, BHR, Cytokines 

 

 

ABSTRACT 

Leukocyte adhesion to the blood retinal barrier is a critical step in the pathogenesis of non‐

infectious uveitis and  is mediated  in part through the  induction of adhesion molecules on 

retinal  cells. Here, we have  investigated  the  retinal  expression of Vascular Cell Adhesion 

Molecule  1  (VCAM‐1)  in  mouse  experimental  models  of  non‐infectious  uveitis.  For  each 

eyes,  a  histological  score  was  given,  and  the  expression  of  VCAM‐1  analysed  by 

immunohistology. Co‐labellings  for GFAP,  endoglin,  aquaporin  4  and  recoverin were  also 

performed  in order to determine which cell type expressed VCAM‐1.  In  low grade uveitis, 

obtained  after  adoptive  transfer of  semi‐purified  autoreactive  lymphocytes, VCAM‐1 was 

only punctually expressed in the internal limiting membrane and epithelial cells of the ciliary 

body. Using the same adoptive transfer protocol, we found that, in correlation with disease 

severity, the staining extended to all internal limiting membranes, vasculitis lesions, Müller 

cell extensions, outer  limiting membranes and RPE  cells. VCAM‐1 expression  in  the  inner 

limiting membrane and Müller cell extensions co‐stained with GFAP expression. In vasculitis 

lesions, VCAM‐1 co‐localized with either GFAP and endoglin expression. The labeling in the 

outer  limiting  membrane,  did  not  exactly  co‐stained  with  AQ4  (Müller  cells  marker)  or 

recoverin (photoreceptor marker) and the nature of this expression remained unexplained. 

Finally, VCAM‐1 expression was also analysed in classical experimental autoimmune uveitis 

eyes, and a similar pattern of expression was found. In conclusion VCAM‐1 is expressed on 

all blood retinal barrier cells during experimental non‐infectious uveitis and might thus play 

an important role in inflammatory cell recruitment during disease development. 

 

 

 

 

 

 

 

1. INTRODUCTION 

Uveitis  is an  important cause of human visual disability and blindness, which can have an 

infectious  or  autoimmune  etiology.  Experimental  models  of  uveitis  (EAU)  have  been 

generated  in vivo  in different animal  species, by  immunization with a number of antigens 

including  interphotoreceptor retinoid‐binding protein (IRBP) (Avichezer et al., 2003;Donoso 

et al., 1988). Disease can also be  induced by  the adoptive  transfer of  retinal   autoreactive 

antigen‐specific  lymphocytes (Shao et al., 2006). Clinical and histopathological studies have 

shown high similarities between those models and human non infectious uveitis (Pennesi et 

al., 2003). 

In  EAU,  eye  damage  is  caused  by  infiltrating  lymphocytes,  macrophages  and 

polymorphonuclear  cells,  recruited  from  the  circulation.  The  lymphocytes  that migrate  to 

the eye are  constituted by both  retinal antigen‐specific and nonspecific  cells  (Caspi et al., 

1993;Chan  et  al.,  1990).  Elucidating  the mechanisms  by which  activated  T  cells  cross  the 

blood‐retinal  barrier  (BRR)  and  gain  entry  to  the  retina  is  of  significant  importance  to 

understand and eventually  control  the pathogenesis of EAU. The BRB was  reported  to be 

severely  affected during  EAU  (Xu  et  al.,  2005).  This barrier  is  composed by  an  inner part 

which relies on the tight  junctions of retinal vascular endothelial cells and by extensions of 

Müller cells surrounding retinal blood vessels. The outer BRB relies on the tight junctions of 

retinal pigment epithelial cells (RPE) (Bringmann et al., 2004;Bringmann et al., 2005).   

In general, lymphocyte extravasation is governed by a variety of factors, such as the state of 

cell  activation  and  the  repertoire  of  adhesion  molecules  expressed  by  the  local  vascular 

endothelial  cells  (Martin  et  al.,  2005).  In  this  context,  upregulating  the  expression  of 

endothelial  adhesion  molecules  VCAM‐1,  ICAM‐1,  PECAM1  in  retinal  microvascular 

endothelium appeared to promote  leucocyte migration during EAU (Xu et al., 2003).   Many 

authors have investigated in vitro the migration of ocular antigen‐specific T cells across RPE 

monolayers.  They  observed  that  VCAM‐1  expression  which  was  not  constitutive  on 

untreated RPE was induced by IFNγ stimulation and that the addition of antibodies to either 

VCAM‐1 or VLA‐4 (very  late antigen‐4) the VCAM‐1  ligand, caused a significant reduction  in 

transepithelial  migration  (Devine  et  al.,  1996).  Importantly,  two  groups  have  also 

demonstrated  that  blocking  the  interaction  of  VCAM‐1  and  VLA‐4  significantly  reduced 

 

 

clinical  signs  of  EAU  and  EIU  (endotoxin‐induced  uveitis)  (Martin  et  al.,  2005;  Hafezi‐

Moghadam et al., 2007). Such data strongly suggest that the expression of VCAM‐1 on BRB 

cells  could  be  critical  in  uveitis  development.  Accordingly,  Xu  et  al  have  reported  that 

alongside other  adhesion molecules,  the expression of VCAM‐1  increases progressively  as 

EAU developed  (Xu et al., 2003). However, a detailed  analysis of  the different  retinal  cell 

type expressing VCAM‐1 during EAU has not yet been extensively performed. 

The aim of this study was to  investigate  in vivo, during uveitis, the modification of VCAM‐1 

expression pattern on several types of ocular resident cells. 

2. MATERIAL AND METHODS 

2.1 Reagents and animals 

IRBP peptide 1‐20  (GPTHLFQPSLVLDMAKVLLD),  representing  residues 1‐20 of human  IRBP, 

was  synthesized  by  New  England  Peptide  (Gardner,  MA.USA).  Pertussis  toxin  (PTX)  and 

complete Freund’s adjuvant  (CFA) were purchased  from Sigma‐Aldrich  (Bornem, Belgium). 

Pathogen‐free  female C57BL/6 mice  (6‐to‐8 weeks old), purchased  from  Janvier  (Genest St 

Isle,  France)  were  housed  and  maintained  at  the  animal  facilities  in  accordance  with 

European guidelines. Animal  treatment  conformed  to  the ARVO Statement  for  the Use of 

Animals in Ophthalmic and Vision Research. All T cells were cultured in RPMI 1640 medium 

supplemented with 25 Mm HEPES, 10%  foetal bovine  serum, 1% L‐glutamine, 1%  sodium‐

pyruvate, 100 IU/ml penicillin, and 100g/ml streptomycin and 5.10‐5M β‐mercaptoethanol in 

a 5% CO2 and 95% humidity incubator.  

2.2 EAU induction 

EAU was induced by injecting subcutaneously 100µl of a mixture of 500µg IRBP peptide 1‐20 

emulsified  in CFA and supplemented with 2.5mg/ml killed Mycobacterium Tuberculosis. All 

animals received at the same time an intraperitoneal injection of a single dose of 1.5µg PTX. 

2.3 Adoptive transfer model of experimental autoimmune uveitis 

EAU was induced by adoptive transfer of autoreactive lymphocytes following the protocol of 

Shao  H  et  al.,  2006.  Briefly,  naïve  C57BL/6  mice  were  immunized  as  for  EAU  induction. 

Twelve days  later, mice were  killed  and  their  spleen  and draining  lymph nodes  collected. 

 

 

Splenic T cells were semi‐purified by passage on nylon wool fiber columns, pooled with total 

lymph node cells and cultured with 10 µg/ml  IRBP1‐20  for 2 days before being  injected  i.p 

into naïve C57BL/6 mice (3x10 6 cells/mouse). 

2.4 Histological grading 

For  histological  grading,  eyes  were  collected,  prefixed  for  6  h  at  4°C  in  PFA 

(paraformaldehyde) 4%, sucrose 3% and then put in three successive baths of 5%, 10% and 

20% sucrose in PBS, respectively, for 24h each. Entire eyes were embedded in OCT (Sakura) 

and cut in 10 µm frozen sections using a cryostat (CM3050S Leica). A classical hematoxylin‐

eosin staining was then realized. The severity of EAU was evaluated on six sections, cut at 

different  levels  in  each  eye,  and    scored  on  a  scale  from  0  (no  disease)  to  4  (maximum 

disease) with half points increments, according to lesion type, size, and number by using the 

R. Caspi’s histological grading system  (Caspi et al., 1993).  In brief,  the minimal criterion  to 

score an eye as positive by histopathology was an inflammatory cell infiltration of the ciliary 

body, choroid, or retina (EAU grade 0.5). Progressively higher grades were assigned for the 

presence of discrete  lesions  in  the  tissue,  such  as  vasculitis,  granuloma  formation,  retinal 

folding or detachment, and photoreceptor damage. 

2.5 Immunohistology 

Frozen  sections were  fixed with PAF 4%  for 15 min and blocked  in TBS  (Tris 10 mM, NaCl 

0.9%,  pH  7.6)  supplemented  with  5%  horse  serum  and  Triton  0.3%  for  2  hours.  Then, 

sections were incubated overnight with the following primary antibodies, alone or in mixture 

as indicated in data: anti‐VCAM‐1 (rat 1/200; BD Pharmingen Erembodegen, Belgium), anti‐

GFAP  (mouse 1/500; Millipore Rakestraat, Belgium), anti‐recoverin  (goat 1/500; SantaCruz 

Biotech Heidelberg, Germany) anti‐endoglin (goat 1/500; BD Pharmingen), anti‐aquaporin 4 

(rabbit 1/100; Millipore) diluted in TBS supplemented with 5% horse serum and 0.1%Triton. 

After  three washings  in TBS,  the sections were  incubated  in  the dark  for 1h30 either with 

species  specific  secondary  antibodies  coupled  to  different  fluorochromes,  as  indicated  in 

results or with Hoechst to stain the nuclei (Invitrogen Gent, Belgium). After several washings, 

sections were mounted in Glycergel (Dako) supplemented with 2.5% Dabco (Sigma‐Aldrich). 

Pictures  of  immunostainings  were  acquired  using  an  Axio  Observer  Z1  microscope  (Carl 

 

 

Zeiss,  Inc.). The MOM (mouse‐on‐mouse) Basic Kit (Vector Laboratories, Peterborough, UK) 

was  used  to  prevent  high  background  staining  when  using  mouse‐derived  primary 

monoclonal  antibodies.  Eye  sections  were  in  that  case  incubated  for  1h  with  MOM  IgG 

blocking  reagent, washed,  incubated overnight with  the primary antibody  in MOM diluent 

(600µl  protein concentrate in 7.5 ml PBS) and then for 1h30 with the secondary antibody in 

MOM  diluent.  The  negative  control  sections  were  incubated  with  secondary  antibodies 

alone. 

3. RESULTS 

3.1 VCAM‐1 expression in the retina during non‐infectious uveitis 

To  investigate  the  possible  role  of  VCAM‐1  in  the  development  of  experimental  non‐

infectious  uveitis,  we  first  analyzed  the  ocular  expression  of  VCAM‐1  by 

immunohistochemistry,  3 weeks  after  the  adoptive  transfer  of  semi‐purified  IRBP‐specific 

autoreactive lymphocytes. In the normal retina, VCAM‐1 expression was totally absent (data 

not shown). Figure 1 shows that VCAM‐1 was expressed  in all eyes with uveitis. Moreover, 

the extension and intensity of its expression were correlated with the severity of the disease. 

Indeed,  in  low grade animals, VCAM‐1 expression was restricted to certain  locations of the 

internal  limiting  membrane  (ILM)  and  ciliary  body  (CB)  (Figure  1A  and  1B).  In  severely 

inflamed eyes, the expression of VCAM‐1 extended to all the internal limiting membrane and 

to the outer retinal layers including the outer limiting membrane (OLM) (Figure 1C and 1D). 

To determine the kinetics of appearance of VCAM‐1 expression, we performed an adoptive 

transfer of autoreactive  lymphocytes as previously reported, and analyzed the eyes after 1, 

2, and 3 weeks. VCAM‐1 expression appeared between day 7 and day 14  in  the  ILM,  the 

ciliary body (CB) and retinal vasculitis  lesions (V) as shown  in figure 2B. At day 21, VCAM‐1 

staining was stronger and extended to some area of the external retina (OLM) (Figure 2C). 

3.2 Expression of VCAM‐1 by RPE and epithelial cells of the ciliary body 

After such a global  investigation of VCAM‐1 retinal expression, we  focused more on a cell‐ 

specific  expression.  A  careful  analysis  of  previous  stainings  demonstrated  that  in  the 

adoptive  transfer model of EAU, both epithelial  cells of CB  (ECB) and RPE  cells expressed 

VCAM‐1‐.(Figure 3).  

 

 

3.3 Characterization of VCAM‐1 expression in the internal limiting membrane (ILM) 

Normal mouse retina consists in ten well‐identified histological layers (Figure 4A). As shown 

before, VCAM‐1 is expressed in the ILM during uveitis (Figure 4B). To better analyze the cell‐

type expression of VCAM‐1 in ILM, we have performed co‐staining experiments using GFAP, 

a classical marker of glial cells and Müller cells. In control animals, GFAP was mainly located 

in  the  ganglion  cell  layer  (data  not  shown)  while  in  eyes  developing  intraocular 

inflammation,  GFAP  expression  extended  from  the  ILM  to  the  OLM  (Figure  4C).  These 

patterns of expression correspond   to Müller cells (Motulsky et al., 2010). As shown  in the 

merged  picture  (Figure  4D),  VCAM‐1  co‐stained  with  GFAP  at  the  ILM  and  some  radial 

extension of Müller cells.  

3.4 Characterization of VCAM‐1 expression in vasculitis lesions 

Vasculitis  is an  important feature of non‐infectious uveitis. We found that vasculitis  lesions 

strongly expressed VCAM‐1  (Figure 5A). To better analyze VCAM‐1 expression  in vasculitis 

lesions  co‐immunostainings  were  performed  with  endoglin,  an  highly  specific  marker  of 

endothelial cells  from  the  superfamily of TGF‐beta  (Figure 5B) and  the glial markers GFAP 

(Figure 5D). As shown in figures 5C, 5E and 5F, in vasculitis lesions, VCAM‐1 is expressed by 

both endoglin positive cells and GFAP positive cells. Further confirmation of these data was 

obtained by confocal immunofluorescence microscopy (Figure 6).  

3.5 Characterization of VCAM‐1 expression in the outer limiting membrane (OLM) 

In  order  to  better  analyze  the  expression  of  VCAM‐1  in  the  OLM,  which  is  made  of 

intercellular  links between Müller cells and photoreceptors (Figure 7B and 7F), co‐stainings 

with  aquaporin‐4  antibody  (AQ4)  (Müller  cell  marker)  (Figure  7C)  and  recoverin 

(photoreceptor marker)  (Figure 7G) were performed in dedicated areas of the OLM (Figure 

7A and 7E  respectively). After having  carefully examined  the  co‐stainings VCAM‐1/AQ4 or 

VCAM‐1/recoverin  the nature  of  this  expression  remained  unexplained  (Figure  7D,  Figure 

7H).  

3.6 VCAM‐1 expression in the retina during classical EAU 

In parallel, we have also investigated the VCAM‐1 retinal cell expression within the classical 

model of EAU. EAU was thus induced in C57BL/6 mice by immunization with IRBP peptide 1‐

 

 

20. After 3 weeks, a histological score was given for each eye (n= 16), and the expression of 

VCAM‐1  analysed  by  immunohistology.  Co‐labellings  for  GFAP  and  endoglin,  were  also 

performed. As expected, VCAM‐1 was no found under normal conditions (data not shown), 

but  strongly  induced  in  inflamed  eyes.  The  pattern  of  expression was  similar  as  the  one 

described in the adoptive transfer model, with a pronounced expression in vasculitis lesions 

(on both endoglin and GFAP positive cells)  (figure 8A, 8B and 8C), ciliary body  (figure 8G), 

internal limiting membrane (figure 8H, 8I et 8J), Müller cell extensions (figure 8A, 8D et 8E), 

outer limiting membrane (arrow) and RPE cells (arrow) (figure 8H).  

4. DISCUSSION 

Lymphocyte  recruitment  to  the  eye  is  a  critical  step  in  the  pathogenesis  of  ocular 

inflammation.  This  process  is  governed  by  factors  such  as  the  state  of  activation  of 

inflammatory  cells  and  the  repertoire  of  adhesion  molecules  expressed  locally  by  retinal 

cells.    In  this context,  it has been  suggested  that VCAM‐1 might play an  important  role  in 

inflammatory  cell  recruitment  during  autoimmune  ocular  disease.  Indeed,  Xu  et  al  have 

shown  that  the  expression  of  VCAM‐1  increased  progressively  in  retinal  arteries  and 

arterioles  during  EAU  development  (Xu  et  al.,  2003).  However,  the  precise  cell  retinal 

expression  of  VCAM‐1  in  experimental  models  of  non‐infectious  uveitis  has  never  been 

clearly defined. Our studies bring new data on this particular point. 

We  found that  in uninflamed eyes, VCAM‐1 was not expressed constitutively  in the retina. 

During  EAU,  the  expression  of  VCAM‐1  appeared  between  day  7  and  day  14,  matching 

precisely uveitis development. Interestingly, VCAM‐1 expression correlated with the clinical 

grade of ocular inflammation at day 21. In eyes with minimal signs of inflammation, VCAM‐1 

expression was weak. In contrast, in eyes with severe grades of ocular inflammation, VCAM‐

1  was  strongly  expressed  across  the  BRB.  It  was  most  pronounced  in  the  vascular 

endothelium of blood vessels in the retina and ciliary body but also occurred in the internal 

limiting membrane, Müller cell extensions, outer  limiting membrane and RPE cells  in eyes 

with severe inflammation. 

A  similar  upregulation  of  VCAM‐1  expression  has  been  described  during  experimental 

autoimmune encephalomyelitis (EAE) (Theien et al., 2001). In addition, an increased VCAM‐1 

 

 

expression has also been observed in experimental model of colitis and arthritis (Koch et al., 

1991;Sans et al., 1999).  Importantly, and  in accordance with our data, VCAM‐1 expression 

during those diseases was not restricted to endothelial cells. In EAE, for example, alongside 

its expression on endothelial cells, VCAM‐1 was also expressed on astrocytes and microglia 

(Lee and Benveniste, 1999). Moreover, proinflammatory  conditions  can also drive  in  vitro 

the expression of VCAM‐1 on renal, lung and retinal epithelial cells (Clarke et al., 2007; Ho et 

al., 2008; Platts et al., 1995). Altogether, with our data, this suggests that VCAM‐1 expression 

is  involved  in  inflammatory  cell  recruitment  during  various  inflammatory  diseases.  Those 

experimental findings have led to the development of specific antibodies to alpha 4 integrins 

which  are  currently used  in patients with MS  and  colitis but have not  yet been  tested  in 

uveitis  patients  (Rivier  and  Rine,  1992).  Preliminary  experimental  studies  in mice  suggest 

that  blocking  the  interaction  of  VCAM‐1  and  its  ligand  VLA‐4  protects  from  disease 

development. Hence, blocking experimentations with anti‐VLA‐4 or peptide inhibitor of VLA‐

4 resulted  in a  less severe endotoxin‐induced uveitis (EIU) and EAU, respectively (Martin et 

al., 2006; Hafezi‐ Moghadam et al., 2007). 

In conclusion, we  found  that VCAM‐1  is  induced on all BRB cell  types during experimental 

non‐infectious uveitis. Moreover,  in  the adoptive model,  the  intensity and extension of  its 

expression correlates with the severity of the disease. This suggests that VCAM‐1 might play 

an important role in inflammatory cell recruitment during autoimmune uveitis.   

 

 

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LEGENDS TO FIGURES   

Figure 1: VCAM 1 is expressed in the retina in the adoptive transfer model of EAU

Autoreactive T lymphocytes were adoptively transferred in naïve mice. Three weeks after,

eye cryosections were prepared, hematoxylin-eosin staining was used to grade the disease

severity and immunofluorescent staining to detect VCAM-1 expression (in bright green A, B,

C and D). Cell nuclei were stained with DAPI (blue). ILM indentifies the inner limiting

membrane, OLM the outer limiting membrane and CB the ciliary body. The figures 1A, B, C

and D are a photomontage of 36 pictures of complete section of the retina. H&E sections

representation of histological grades are shown below.

Figure 2: VCAM-1 is progressively induced in the retina in the adoptive transfer model of

EAU

Kinetics of VCAM-1 expression after adoptive transfer of autoreactive lymphocytes. Eyes

were analyzed after 1, 2 and 3 weeks. Tissues were labeled using an anti-VCAM-1 antibody

(in bright green A, B and C). Cell nuclei were stained with DAPI (blue). ILM identifies the

inner limiting membrane, OLM the outer limiting membrane, CB the ciliary body and V the

vasculitis. The figures 2A, B and C are a photomontage of 36 pictures of complete section of

the retina.

Figure 3: VCAM-1 is expressed on RPE and epithelial cells of the ciliary body.

After EAU induction, retina was submitted to immunofluorescent staining for VCAM-1 by

using anti-VCAM-1 antibody. Cell nuclei were stained with DAPI (blue). ECB represents the

epithelial cell of ciliary body and RPE retinal pigment epithelial cell.

Figure 4: Analysis of VCAM-1 expression on the internal limiting membranes in the

adoptive transfer model of EAU

After 21 days post-transfer of autoreactive lymphocyte, the retina was submitted to

hematoxilin and eosin staining (A). After EAU induction, the retina was submitted to

immunofluorescent co-stainings by using anti-VCAM-1 (B) and anti-GFAP (C). D

corresponds to merged image. The following secondary antibodies were used: anti-rat

conjugated to Alexa Fluor 488 (Molecular probes) and Rhodamine Red X (Jackson Immuno

research). ILM identifies the inner limiting membrane, GCL the ganglion cell layer, IPL the

inner plexiform layer, INL the inner nuclear layer, OPL the outer plexiform layer, ONL the

 

 

outer nuclear layer, OLM the outer limiting membrane, IS the inner segments of the

photoreceptors, OS the outer segments of the photoreceptors and RPE the retinal pigmented

epithelium. Pictures were taken at 20X magnification.

Figure 5: VCAM-1 expression on glial and endothelial cells in retinal vasculitis lesions in the

adoptive transfer model of EAU

After 21 days post-transfer of autoreactive lymphocyte, the retina was submitted to

immunofluorescent co-staining by using antibodies anti-VCAM-1 (A), anti-endoglin (B) and

anti-GFAP (D). C, E and F correspond to merged images.  The following secondary

antibodies were used: anti-rat conjugated to Alexa Fluor 488 (Molecular probes), Rhodamine

Red X (Jackson Immuno research) and Cyn5 (Jackson Immuno Research). Cell nuclei were

stained with DAPI (blue). ILM identifies the inner limiting membrane, OLM the outer

limiting membrane, RPE the retinal pigmented epithelium.  Pictures were taken at 20X

magnification.

Figure 6: Confocal analysis of VCAM-1 expression in vasculitis lesions in the adoptive

transfer model of EAU.

After 21 days post-transfer of autoreactive lymphocyte, the retina was submitted to

immunofluorescent co-staining by using antibodies against-VCAM-1, endoglin and Glial

Fibrillary Acidic Protein and the image analyse by confocal microscopy. Grey images

correspond to merged VCAM-1/ endoglin or VCAM-1/GFAP.

Figure 7: Analysis of VCAM-1 expression in the external limiting membrane in the adoptive

transfer model of EAU.

After 21 days post-transfer of autoreactive lymphocyte, the retina was submitted to

immunofluorescent co-staining by using antibodies against-VCAM-1 (B and F), aquaporin 4

(AQ4; C) and recoverin (G) in dedicated areas of the OLM (A and E). D and H correspond

to merged images.  The following secondary antibodies were used: anti-rat conjugated to

Alexa Fluor 488 (Molecular probes) and Rhodamine Red X (Jackson Immuno research). Cell

nuclei were stained with DAPI (blue). ILM represents the inner limiting membrane and OLM

the outer limiting membrane. Pictures were taken at 20X magnification. B, C,D, F, G and H

were magnified using photoshop.

Figure 8: VCAM-1 expression in the retina during classical EAU

 

 

Immunofluorescence staining of cryostat section from mice immunized with retinal extract

(IRBP 1-20) and CFA at 21 days after immunization. Section stained with antibodies against

anti-VCAM-1 (A, H and G), anti-endoglin (B) and anti-GFAP (D and I). C, E, F and J

correspond to merged images. The following secondary antibodies were used: anti-rabbit

conjugated to Alexa Fluor 488 (Molecular probes), rhodamine Red X (Jackson Immuno

research) and Cyn5 (Jackson Immuno research). Dapi nuclear staining is represented in blue.

Pictures were taken at 20X magnification.

Supplementary figures:

Negative control:

After 21 days post-transfer of autoreactive lymphocyte, the retina was submitted to

immunofluorescent co-staining by using only secondary antibodies. Image A correspond to

merged image. B, C and D represent respectively staining with anti-Rat secondary antibody,

coupled to Alexa 488, anti-goat secondary antibody coupled to cyanin 5 and anti-mouse

secondary antibody coupled to Rhodamine Red X. Dapi nuclear staining is represented in

blue.

Optic Nerve

After 21 days post-transfer of autoreactive lymphocyte, the retina sections with the optic

nerve were selected and submitted to immunofluorescent co-staining by using antibodies anti-

VCAM-1 (D), anti-endoglin (B) and anti-GFAP (C). A, E, F and G correspond to merged

images. The following secondary antibodies were used: anti-rat conjugated to Alexa Fluor

488, Rhodamine Red X and Cyn5. Cell nuclei were stained with DAPI (blue).

 

 

A

Figure 1Grade 0.5VCAM1

DAPI

CB

B

Grade 1

ILM

ILM

ECB

A

CB

ILM

OLM

Grade 2

V

CB

ILM

OLM

D

Grade 3

C

ILM

CB

V

V

CB

ILM

DAY 7 DAY 14 DAY 21VCAM1DAPI

OLM

A B C

Figure 2

VCAM1DAPI

ECB

RPE

Figure3.

Figure3.

Merged

CA

GL

IPL

INL

OPL

ISOSRPE

ILM

OLMONL

D

GFAP

B C

VCAM1

Figure 4.

Figure5.

DoubleMerged

Double Merged 

Endoglin GFAP

VCAM1

A

E

B D

C

ILM

OLMRPE

F

TripleMerged

Figure 6.VCAM1 GFAP

VCAM1

Merged

MergedEndoglin

Merged

Figure 7.

AQ 4VCAM1

RecoverinVCAM1

Merged

Merged

OLM

ILM

ILM

OLM

CA DB

GE F

H

OLM

OLM OLM

OLM OLM OLM

OLME F

ILM

OLM

VCAM1

I

VCAM1

TripleMerged 

VILM

A

Merged 

C

Endoglin

BMerged 

E

GFAP

D

F

ILM

OLM

ECB

ECB

OLM

G

OLM

ILM

VCAM1 GFAP

H I J

RPE

C

Figure 8.

Supplementary figure:Negative control

Alexa 488

RRxCya 5

TripleMerged

A B

C D

Supplementary figure:Optic nerve

Endoglin GFAP

VCAM1

A

Triple Merged

EndoglinVCAM1

GFAPVCAM1

B C

D

E F

G

Double Merged Double Merged

Triple Merged

37

2. Le TNFα inhibe l’expression du CMH II induite par l’IFNγ au niveau des cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien

TNFα suppresses IFNγ-induced MHC class II expression on retinal pigmented epithelial cells

cultures

M Makhoul, C Bruyns, P Koch, LJ Relvas, M Bazewicz, L Caspers, F Willermain.

Acta Ophtalmol. 2011 Sep; 90(1):38-42

Contexte

Un autre effet majeur de l’activation des cellules de la BHR lors d’UAE est l’induction des

molécules du CMHII à la surface de l’EPR. En effet, lors de l’inflammation, les cellules de l’EPR

expriment du CMHII et peuvent ainsi servir localement de cellules présentatrices d’antigènes et

activer les lymphocytes T autoréactifs. In vitro, l’IFNγ est la seule cytokine capable d’induire

cette expression. Néanmoins, l’EPR est également sensible à d’autres cytokines, telles que le

TNFα qui stimulent notamment la sécrétion d’autres cytokines (IL-8, IL-6…) et l’expression

d’ICAM-1111. In vivo, il est probable que ces différentes cytokines coagissent sur l’EPR. Nous

avons donc voulu tester l’effet du TNFα sur l’induction de molécules du CMH II par l’IFNγ. L’effet

du TNFα nous intéressait particulièrement puisque plusieurs des traitements par anti-TNFα sont

utilisés chez les patients atteints d’uvéite ou d’autres maladies autoimmunes.

Résultat et conclusions

Pour étudier l’effet du TNFα sur l’induction du CMH de classe II médiée par l’IFNγ, une lignée

humaine de cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien (ARPE-19) a été cultivée in vitro et

stimulée par du TNFα ou de l’IFNγ ou par les deux cytokines simultanément. Nos résultats

montrent que le TNFα inhibe l’induction de l’expression de molécules du CMH II à la surface de

l’EPR obtenue après traitement par l’IFNγ. L’infliximab, un anticorps anti-TNFα utilisé en clinique

humaine, annihile l’effet inhibiteur du TNFα sur l’induction de CMH II. Par contre, le TNFα

augmente l’expression d’ICAM-1 obtenue après stimulation par l’IFNγ. Par ailleurs, le TNFα n’a

pas d’effet sur l’induction d’IRF1 et la phosphorylation de STAT-1 après traitement par l’IFNγ.

Toutes ces données suggèrent que le TNFα n’agit pas en diminuant globalement la voie de

signalisation de l’IFNγ, mais agit spécifiquement sur l’induction du CMH II. L’expression de CMH

38

II est régulée au niveau transcriptionnel et fait notamment intervenir le facteur de transcription

Class II transactivator (CIITA). Nous avons donc mesuré par RT-PCR quantitative et IP

(immunoprécipitation) l’expression du CIITA dans les différentes conditions de stimulation. Nos

résultats montrent que l’IFNγ induit bien la transcription de CIITA et que cette induction est

inhibée par le TNFα.

En conclusion, nous avons établi que le TNFα inhibe l’induction de l’expression de molécules du

CMHII induite par l’IFNγ sur les cellules de l’EPR. Cet effet inhibiteur est annihilé par l’infliximab

et n’est pas dû à une inhibition globale de la voie de l’IFNγ mais à une inhibition spécifique du

CIITA. Nos résultats appuient avec l’importance du rôle du TNFα dans la résolution de

l’inflammation.

Introduction

Retinal pigment epithelial (RPE) cellsare located between the choroid andthe neuroretina and constitute theexternal blood retinal barrier (BRB)(Willermain et al. 2000). One of theirfunctions is to down-regulate inflam-matory reactions in the posterior partof the eye. Accordingly, the immuno-suppressive properties of RPE havebeen extensively described. Manyauthors have reported that RPE cellscan inhibit T-lymphocyte activationand secrete immunosuppressive cyto-kines such as transforming growthfactor beta (TGFb) (Willermain et al.2002; Kaestel et al. 2005; Zamiri et al.2005). On the other hand, in intraocu-lar inflammation, RPE cells are thetarget of a cytokine network in whichIFNc and TNFa play central roles(Holtkamp et al. 2001). Their specificcontribution to RPE cell activation isstill unknown, and it is frequentlybelieved that those cytokines act insynergy. In this setting, Shi et al.(2008) have recently demonstratedthat stimulation of RPE cells with acombination of IFNc, TNFa andinterleukin 1-beta (IL-1b) is far morepotent than with a single mediator inchemokine production. However, theeffects of those cytokines on RPE cellactivation are not always additive,and it has been shown that IFNc

TNFa suppresses IFNc-inducedMHC class II expression onretinal pigmented epithelial cellscultures

Maya Makhoul,1 Catherine Bruyns,1 William’s Elong Edimo,1

Lia Judice Relvas,1,2 Magdalena Bazewicz,1,2 Philippe Koch,1,2

Laure Caspers2 and Francois Willermain1,2

1I.R.I.B.H.M (Institute of Interdisciplinary Research), Universite Libre De

Bruxelles-Campus Erasme, Brussels, Belgium2Department of Ophthalmology, CHU St-Pierre and Brugmann, Brussels, Belgium

ABSTRACT.

Purpose: One major consequence of retinal pigment epithelium (RPE) cell

activation during autoimmune uveitis is the induction of MHC II molecules

expression at their surface. IFNc is regarded as the main cytokine involved in

this induction. As TNFa plays a central role in autoimmune uveitis, we investi-

gated its effects on IFNc-mediated MHC II induction on RPE cells.

Methods: Retinal pigment epithelium cells (ARPE-19) were stimulated with

IFNc, TNFa and the anti-TNFa antibody infliximab. The expression of

MHCII and ICAM-1 was analysed by flow cytometry. The activation and

expression of IRF-1 and STAT-1, two proteins involved in IFNc-signalling

pathway, were analysed by WB. Class II transactivator (CIITA) expression

was monitored by qRT-PCR and immunoprecipitation.

Results: TNFa inhibits IFNc-induced MHC II expression on ARPE cells in a

dose-dependent manner. Infliximab completely reverses the inhibitory effect of

TNFa. We did not observe an inhibitory effect of TNFa on the expression of

ICAM-1 induced by IFNc. Similarly, IFNc-induced STAT1 phosphorylation

and IRF1 expression were not affected by TNFa. On the contrary, we found

that TNFa suppresses IFNc-induced CIITA mRNA accumulation and protein

expression.

Conclusion: TNFa inhibits IFNc-induced MHC II expression in RPE cells.

This inhibitory effect was reversed by infliximab and was not because of a glo-

bal inhibition of IFNc -mediated RPE cell activation but rather to a specific

down-regulation of CIITA expression. Those findings are consistent with the

role of TNFa in the resolution of inflammation and might help to elucidate the

complex development of autoimmune uveitis.

Key words: class II transactivator – cytokines – MHCII – retinal pigment epithelium – uveitis

Acta Ophthalmol. 2012: 90: e38–e42ª 2011 The Authors

Acta Ophthalmologica ª 2011 Acta Ophthalmologica Scandinavica Foundation

doi: 10.1111/j.1755-3768.2011.02241.x

Acta Ophthalmologica 2012

e38

inhibits the TNFa- and IL-1b-inducedincrease in TGFb2 production (Na-gineni et al. 2007).

One of the major consequences ofRPE cell activation during inflamma-tion is the induction of MHC class IImembrane expression. Indeed, inmarked contrast to the normal physi-ological situation, MHC class IIexpression has been reported inhuman patients with various intraocu-lar pathologies, including uveitis. Sim-ilarly, MHC class II expression hasbeen found on RPE cells in the modelof experimental autoimmune uveitisand can be induced in vitro with IFNcstimulation (Chan et al. 1986; Livers-idge et al. 1988). It has been then pos-tulated that RPE cells can act asantigen-presenting cells and stimulateautoreactive lymphocytes during uve-itis. Importantly, Sun et al. (2003)have demonstrated that the level ofexpression was crucial and that RPEcells activate uveitogenic T cells whenthey express a high level of MHCclass II molecules, but inhibit T cellswhen they express a low level. It isthus important to study the effects ofother common cytokines on the IFNc-mediated MHC class II induction onRPE cells.

In this work, we found that TNFadramatically inhibits IFNc-mediatedMHC class II induction. This inhibi-tory effect is reversed by infliximab, afact that is not owing to a global inhi-bition of IFNc-mediated RPE cellactivation but rather to a specificdown-regulation of class II transacti-vator (CIITA) expression. Those find-ings are consistent with the role ofTNFa in the resolution of inflamma-tion and might help elucidate thecomplex development of autoimmuneuveitis.

Materials and Methods

Cell culture and treatment

American retinal pigment epitheliumtype 19 (ARPE-19) is a spontaneouslyarising human RPE cell line obtainedfrom the American Type Culture Col-lection (ATCC, Manassas, VA, USA).These cells were cultured in a 1:1 mix-ture of Dulbecco’s modified Eagle’smedium (DMEM; Invitrogen, Mere-lbeke, Belgium) and Ham’s F12 with2.5 mm l-glutamine (Invitrogen), sup-plemented with 10% fetal bovine

serum (FBS), 100 IU ⁄ml penicillin and100 g ⁄ml streptomycin in a 5% CO2and 95% humidity incubator at 37 �C.Recombinant human IFNc and TNFawere purchased from Invitrogen.

Cell death measurements: propidium

iodide and annexin V staining

Double staining with fluorescein isothi-ocyanate (FITC)-conjugated annexin Vand propidium iodide (PI; Sigma) wasperformed for the quantification ofnecrosis and apoptosis. Cells were har-vested, washed once with ice-cold PBSand resuspended in 100 ll calcium-binding buffer (10 mm HEPES, Ph 7.4,140 mm NaCl, 2.5 mm CaCl2) contain-ing annexin V-FITC (1 lg ⁄ml) (BDBiosciences) and PI (2 lg ⁄ml) solution.After 15-min incubation in the dark atroom temperature, the cells werediluted with 400 ll binding bufferbefore flow cytometric analysis (BDFACScan and Cell Quest software,Erembodegem-Drop, Belgium).

Flow cytometry

Cells were plated into 60-mm dishes at5 · 105 cells ⁄dish in complete mediumand allowed to adhere overnight. Beforestimulation, the culture medium wasreplaced with fresh DMEM ⁄HAM’SF-12 medium supplemented with 10%FBS. Cells were stimulated with IFNc(150 ng ⁄ml = 300 U ⁄ml based on da-tasheet information) or TNFa(30 ng ⁄ml) alone or with both cytokinesfor 48 hr. The cells were then recoveredand washed. Expression of MHCIImolecules and ICAM-1 was quantifiedby flow cytometry using a mouse anti-human specific antibody comparativelyto control isotype (Becton-Dickinson,Erembodegem, Belgium). Labelled cellswere analysed with a FACS Caliburflow cytometer and the Cell Quest Soft-ware (Becton-Dickinson).

Western blot analysis

American retinal pigment epithelium–type cells were cultured and stimulatedwith IFNc, TNFa or both as describedpreviously. STAT1 phosphorylationand IRF1 induction were analysed bythe Western blot, 30 min and 24 hrafter stimulation. Cells were lysed in abuffer containing Tris–HCl 50 mm (pH7.5), 100 mm NaCl, 200 mm NaF, 5 mm

Na4P2O7, 4 mm Na3VO4, 2 mm pefa-

block, 10 lg ⁄ml aprotinine and10 lg ⁄ml leupeptine. Briefly, cells werescrapped off and lysates collected. Pro-tein concentrations were determinedusing the Bradford assay. Equalamounts of proteins (100 lg) were sep-arated by sodium dodecyl sulphate–polyacrylamide gel electrophoresis andtransferred to nitrocellulose mem-branes. Non-specific binding wasblocked by incubation with 5% fat-freemilk powder. Immunodetection wasperformed by incubating the mem-brane with specific primary antibodies:anti-phospho-STAT and total anti-STAT (cell signalling) and anti-IRF1antibody (Santa Cruz) for 2 hrs atroom temperature. Blots were thenwashed and incubated for 1 hr with asecondary horseradish peroxidase–con-jugated antibody before being devel-oped using a chemoluminescentdetection kit (ECL system; PerkinElmer, Imperiastraat Zaventem, Bel-gium). For immunoprecipitation, celllysates were incubated overnight withantibodies to CIITA (Santa Cruz) andsubsequently with protein G-Sepharosefor 2 hr. The beads were washed threetimes in PBS and collected by centrifu-gation. After boiling, samples wereloaded onto 10% gel polyacrylamide,and membranes were probed with ananti-CIITA antibody. Immunodetec-tion was then carried out as describedin the previous section, using chemolu-minescent detection kit.

Real-time PCR

American retinal pigment epithelium–type-19 cells were seeded at5 · 105 cells ⁄well in 6-well plates. Oneday later, IFNc (150 ng ⁄ml), TNFa(30 ng ⁄ml) or both were added to thecultures for 24 hrs. Cells were col-lected for quantitative reverse tran-scription PCR analysis of CIITA geneexpression. b-Actin was used as anonmodulated reference gene. ThemRNA extraction and isolation werecarried out using the automatedMagNA Pure LC Instrument systemand the MagNAPure LC mRNAIsolation Kit II following manufac-turer’s instructions (Roche AppliedScience, Vilvoorde, Belgium). A onestep real-time quantitative RT-PCRtechnique using the RNA MasterHybridization Probes Kit (RocheApplied Science) was used to quantifymRNA expression using specific

Acta Ophthalmologica 2012

e39

primes and fluorescent probes forhuman CIITA and b-actin purchasedfrom Applied Biosystems (Lennik,Belgium). Data are presented as nor-malized expression of CIITA versusb-actin (2)DCIITA ⁄ bactin).

Statistical analysis

Levels of significance for comparisonsbetween samples were determinedusing Student’s test distribution.

Results

TNFa inhibits IFNc-mediated MHC class

II expression on ARPE cells

We first tested the effects of TNFa onthe IFNc-mediated MHC class IIinduction on ARPE cells. Americanretinal pigment epithelium–type cellswere stimulated with IFNc, TNFa ora mixture of both cytokines. Twodays later, MHC class II expressionwas analysed by flow cytometry.Figure 1 shows that the IFNc-medi-ated MHC class II expression wasstrongly decreased by TNFa, in dose-dependent manner (Fig. 2). TNFaalone had no effect (data not shown).In addition, we compared the viabilityof IFNc- and ⁄or TNFa-treated anduntreated ARPE cells by performingAnnexin V-PI flow cytometry staining.We found no significant differences inapoptosis or necrosis between the dif-

ferent culture conditions (2–6% apop-tosis ⁄necrosis) (data not shown).Because the anti-TNFa antibody inf-liximab is commonly employed totreat patients with autoimmune uve-itis, we wanted to study its effect onthe TNFa inhibition of IFNc-medi-ated MHC class II expression. Ameri-can retinal pigment epithelium–typecells were thus incubated with inflix-imab alone, IFNc and infliximab,IFNc and TNFa or IFNc and TNFaand infliximab before MHC class IIexpression analysis. We found thatinfliximab completely reversed theinhibitory effect of TNFa on theIFNc-mediated MHC class II expres-sion (Fig. 3).

The inhibitory effect of TNFa on IFNc-

mediated RPE cell activation is restricted

to MHC II induction

We next wanted to assess whetherTNFa could globally dampen theeffects of IFNc on ARPE cells. Wethus analysed the effects of TNFa onthe regulation of ICAM-1 by IFNc.American retinal pigment epithelium–type cells were stimulated with differ-ent combinations of IFNc and TNFa,and 2 days later, the expression ofICAM-1 was analysed by flow cytom-etry. In accordance with other reports,we found that ICAM-1 is constitu-tively expressed by RPE cells and up-regulated by IFNc or TNFa treatment(Fig. 4). Figure 4 also demonstratesthat TNFa has an additive effect onthe up-regulation of ICAM-1 expres-sion by IFNc. We also found thatTNFa had no effect on the IFNc-mediated induction of indoleamine2,3-dioxygenase (IDO), anotherimportant IFNc target gene (data notshown). Altogether, those data indi-cate that the inhibitory effect ofTNFa on the IFNc-mediated RPE cellactivation is not owing to a globalinhibition of the IFNc pathway.

TNFa specifically inhibits IFNc-mediated

class II transactivator expression in RPE

cells

We also investigated the effect ofTNFa on two key elements of theIFNc signalling cascade: the phos-phorylation of STAT1 and the induc-tion of IRF1. American retinalpigment epithelium–type cells werestimulated with IFNc, TNFa or amixture of both cytokines, and cell

21

Cell

num

ber

3

MHC class II expression

0

100 101 102 103

Fig. 1. TNFa inhibits IFNc-induced MHC

class II membrane expression in American

retinal pigment epithelium–type (ARPE) cells.

American retinal pigment epithelium–type

cells were incubated with IFNc (150 ng ⁄ml)

alone (profile 3) or with IFNc and TNFa(30 ng ⁄ml) (profile 2) for 48 hr. HLA-DR

expression was monitored by flow cytometry.

Profile 1 represents untreated cells. Data are

representative of three independent experi-

ments.

IFNγ 15 7.5 5 TNFα dose

(ng/ml)

MH

CII p

osi

ve c

ells

(%)

***

IFNγ+TNFα

300

10

20

30

40

50

60

70

80

Fig. 2. IFNc-induced MHC class II was strongly decreased by TNFa, in dose-dependent man-

ner. American retinal pigment epithelium–type cells were incubated for 48 hr with IFNc(150 ng ⁄ml) alone or with IFNc and decreasing concentrations of TNFa (30–5 ng ⁄ml). MHCII

expression was monitored by flow cytometry. Data are representative of three independent

experiments. ***p < 0.001 (compared with IFNc treatment).

1

2

2 3 4

11MHC class II expression

Cell

num

ber

100

0

101 102 103

Fig. 3. Infliximab restores IFNc-mediated

MHC II expression on TNFa- treated Ameri-

can retinal pigment epithelium–type (ARPE)

cells. American retinal pigment epithelium–

type cells were incubated with IFNc(150 ng ⁄ml) alone (profile 3) or with IFNcand TNFa (30 ng ⁄ml) (profile 2) or with

IFNc ⁄TNFa ⁄ infliximab (5 lg) (profile 4) for

48 hr. MHC II expression was monitored by

flow cytometry. Profile 1 represents untreated

cells. Data are representative of three inde-

pendent experiments.

Acta Ophthalmologica 2012

e40

lysates were analysed by western blotsusing specific antibodies. Figure 5shows that IFNc stimulation inducedSTAT1 phosphorylation and thatTNFa did not modulate this activa-tion. Similarly, TNFa stimulation didnot change the level of IRF1 induc-tion obtained after 1 day of IFNcstimulation. These data suggest thatthe inhibitory effect of TNFa on theIFNc-mediated MHC class II induc-tion is because of a specific inhibitionof the pathway leading to MHC classII expression. It has been widelydescribed that MHC class II expres-sion is exquisitely controlled at thetranscription level, mainly by the CI-ITA. We thus analysed the effects ofTNFa and IFNc on CIITA expres-sion. American retinal pigment epithe-

lium–type cells were stimulated byIFNc and ⁄or TNFa and quantitativeRT-PCR, using specific primers forCIITA, and b-actin was performed onRNA extracts. We found that unstim-ulated ARPE cells did not express CI-ITA mRNA that was induced afterIFNc stimulation (Fig. 6A). Of note,TNFa co-treatment inhibits the IFNc-mediated mRNA CIITA expression inARPE cells (Fig. 6A). We further con-firmed these data at the protein levelby performing immunoprecipitationassays (Fig. 6B).

Discussion

Cytokine-mediated activation of RPEcells has been proposed to play animportant role in inflammatory cellrecruitment and tissue damage in uve-itis. In this regard, TNFa is generallyconsidered to be a proinflammatorycytokine because of its stimulatoryeffect on the expression of inflamma-tory mediators such as nitrous oxide,adhesion molecules and cytokines byRPE cells. However, TNFa also playsan important role in the resolution ofthe immune response (Holtkamp et al.2001; Dick et al. 2004). Indeed, TNFais capable of significant immuno-modulatory actions. In vivo, TNFaprevents type 1 diabetes in non-obese

diabetic mice and delays the develop-ment of lupus in NZB ⁄NZW F1 mice(Jacob & McDevitt 1988; Grewalet al.1996). In vitro, chronic exposureto TNFa suppresses the responses ofT cells, by attenuating T-cell receptorsignalling (Jacob & McDevitt 1988;Dick et al. 2004).

Herein, we demonstrate that TNFainhibits IFNc-induced MHC class IIexpression in ARPE cells, by down-reg-ulating CIITA. As lymphocyte activa-tion by RPE cells depends on their levelof MHC class II expression, our studysupports the notion that TNFa alsopossesses immunomodulatory proper-ties on those cells (Sun et al. 2003).

The effect of TNFa on MHC classII expression is cell type dependent.Different groups have shown thatTNFa enhances IFNc-mediated MHCclass II expression on astrocytes,whereas mostly no effects were foundin microglial cells (Vidovic et al. 1990;Panek & Benveniste 1995; Luder et al.2003). Importantly, it appears that theadditive effect of TNFa on the IFNc-mediated MHC class II expression onastrocytes is CIITA independent(Dong et al.1999). On the contrary,Mueller et al. have demonstrated thatTNFa inhibits up-regulation of MHCclass II expression on myeloid cells byinhibiting CIITA expression. Interest-ingly, the same group found thatMHC class II expression was signifi-cantly reduced on myeloid cells fromrheumatoid arthritis patients withactive disease, but was increased tonormal levels after anti-TNFa anti-body treatment. Those findings areconsistent with our data and clearlyemphasize the role that TNFa plays inthe resolution phase of inflammation.

In the context of autoimmune uve-itis, the role of TNFa seems to bedependent on the experimental model.Studies in TNFR ⁄p55 ⁄p75) ⁄ ) recep-tor-deficient mice have demonstratedthat TNFa is not essential in endo-toxin-induced uveitis and that defi-cient mice develop the diseasesimilarly to controls (Rosenbaumet al. 1998). On the contrary, fullexpression of experimental autoim-mune uveitis is prevented in singleTNFRp55) ⁄) mice (Calder et al.2005). Consequently, TNFa blockademinimizes experimental autoimmuneuveitis but has no effect on and mayeven exacerbate endotoxin uveitis(Kasner et al. 1993; Rosenbaum &

+

+

–

+

–

–

TNFα

IFNγ

P-STAT

STAT-T

IRF-1

Fig. 5. TNFa does not modulate IFNc-medi-

ated STAT1 activation and IRF1 induction

in American retinal pigment epithelium–type

(ARPE) cells. American retinal pigment epi-

thelium–type cells were incubated with med-

ium alone, with IFNc (150 ng ⁄ml) alone or

with TNFc (30 ng ⁄ml) and IFNc. STAT1

phosphorylation and IRF1 induction were

analysed by western blot 30 min or 24 hr

after stimulation, respectively.

2

3

4

1

2

ICAM1- expression

Cell

num

ber

100 101 102 103 104

Fig. 4. TNFa and IFNc up-regulate ICAM-1

expression on American retinal pigment

epithelium–type (ARPE) cells. American reti-

nal pigment epithelium–type cells were incu-

bated with IFNc (150 ng ⁄ml) alone (profile 3)

or with TNFa (30 ng ⁄ml) alone (profile 2) or

with IFNc ⁄TNFa (profile 4) for 48 hr.

ICAM-1 expression was monitored by flow

cytometry. Profile 1 represents untreated.

Data are representative of three independent

experiments.

***

**

***

IFNγ

IFNγ/

TNFα

TNFα

Unt

reat

ed

– –

+

+ +

+

STAT-T

CIITA

– + – +

0

0.5

1.5

1

2

2.5

3

Nor

mal

ized

CIIT

A m

RNA

expr

essi

on

TNFα

IFNγ

(A)

(B)

Fig. 6. TNFa inhibits IFNc-induced class II

transactivator expression in American retinal

pigment epithelium–type (ARPE) cells. Amer-

ican retinal pigment epithelium–type cells

were incubated with medium alone or with

IFNc (150 ng ⁄ml) or with TNFa (30 ng ⁄ml)

or with both cytokines for 24 hr. Class II

transactivator (CIITA) mRNA expression

was analysed by quantitative RT-PCR com-

paratively to b-actin mRNA expression (A).

CIITA protein expression was analysed after

immunoprecipitation by western blot (B).

**p < 0.01; ***p < 0.001(compared with

IFNc treatment).

Acta Ophthalmologica 2012

e41

Boney 1993; Dick et al. 1996). Thismay partially explain the fact thatwhile TNFa blockade often appearseffective against refractory noninfec-tious uveitis, its efficacy is not univer-sal. For example, complete remissionhas been described in 31–75% ofBehcet patients with uveitis aftercontinuous infliximab infusion(Theodossiadis et al. 2007). Moreover,anti-TNFa treatment efficacy seems towane over time, at least in certain spe-cific uveitis subgroups (Simonini et al.2008). In the light of our data, wespeculate that an interference with theregulation of MHC class II expressionon RPE cells might partially explainthose variations of clinical responseduring infliximab therapy in noninfec-tious uveitic patients.

In conclusion, we found that TNFadramatically inhibited IFNc-mediatedMHC class II induction. This inhibi-tory effect was reversed by infliximaband was not owing to a globalinhibition of IFNc -mediated RPE cellactivation but rather to a specificdown-regulation of CIITA expression.These findings are consistent with therole of TNFa in the resolution ofinflammation and might help usunderstand the complex pathogenesisof autoimmune uveitis.

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Received on October 25th, 2010.

Accepted on June 18th, 2011.

Correspondence:

Makhoul Maya

I.R.I.B.H.M (Institute of Interdisciplinary

Research)

Universite Libre de Bruxelles-Campus

Erasme

Brussels

Belgium

Tel: + 32 555 4104

Fax: + 32 555 4655

Email: mmakhoul@ulb.ac.be

Acta Ophthalmologica 2012

e42

39

3. Etude de la surexpression rétinienne du gène SOCS1 dans un modèle murin d’uvéite autoimmune expérimentale

Retinal AAV2-mediated SOCS1 over-expression in experimental autoimmune uveoretinitis

Koch P*, Makhoul M*, Elmaleh V, Lau-Kilby A, Caspers L, Bruyns C, Tenenbaum L, Willermain F

Données non publiées

Contexte

L’activation des cellules rétiniennes par des cytokines proinflammatoires telles que l’IFNγ est une

étape clé dans le recrutement de lymphocytes T autoréactifs lors du développement d’UAE. En

effet, l’IFNγ est massivement sécrété par les lymphocytes de sous-type Th1 lors de

l’inflammation et modifie profondément la fonction des cellules rétiniennes, en particulier de la

BHR. En accord avec ces données, de l’IFNγ a été détecté dans les yeux d’UEA et chez les

patients atteints d’uvéite88, 89. De plus, C Egwuagu et al ont démontré que l’expression

transgénique intra-oculaire d’IFNγ augmente la sévérité et accélère le développement d’UAE

chez le rat162.

L’IFNγ active la transcription de gènes pro-inflammatoires mais aussi l’induction de gènes tels

que SOCS1 qui sont impliqués dans la régulation négative de cette voie. De plus en plus d’études

montrent qu’en plus de son action sur la voie JAK/STAT, SOCS1 peut inhiber d’autres voies de

signalisation comme la voie du NF-κB163. Dans ce travail, nous avons émis l’hypothèse que le

blocage de l’activation des cellules rétiniennes par l’IFNγ pouvait moduler le développement

d’UAE. Nous avons donc étudié l’effet de la surexpression du gène SOCS1 au niveau rétinien sur

le développement de la maladie.

Résultats et discussion

Les choix du sérotype du virus ainsi que de la voie d’injection utilisée ont été faits pour

transduire un grand nombre de cellules en traumatisant le moins possible la rétine. Dans un

premier temps, en utilisant des AAV2 exprimant la GFP, nous avons pu montrer que la technique

d’injection sous rétinienne était plus traumatique et nous avons donc décidé d’utiliser la voie

intra-vitréenne pour injecter des AVV2 contenant le gène SOCS1, dans l’œil droit des souris

uniquement. Nous avons vérifié par RT-PCR quantitative que le gène SOCS1 était bien exprimé

40

dans l’œil après injection du vecteur AAV2-CAG-SOCS1. Ensuite, nous avons étudié l’effet de la

surexpression de SOCS1 sur le développement d’UAE. L’analyse des grading clinique n’a pas

montré de différence significative entre les yeux injectés par l’AAV2-SOCS1 versus l’AAV2-EGFP

contrôle. Afin de normaliser par rapport à la diversité inter-individuelle de la maladie, nous

avons calculé pour chaque souris un ratio grades cliniques de l’œil injecté sur l’œil non injecté.

L’analyse de la moyenne de ces ratios montre un effet à la limite de la significativité entre le

groupe SOCS1 et le groupe EGFP en terme de grades cliniques. La différence devient par contre

significative lorsque l’analyse de ces ratios est faite sur les grades histologiques. Une analyse

plus détaillée de ces ratios histologiques montre que l’effet est plus marqué dans les zones

infectées par l’AAV2. En conclusion, nos données montrent que suite à l’injection intravitréenne

d’AAV2-CAG-SOCS1, la surexpression de SOCS1 dans l’œil ne protège globalement pas les

animaux du développement d’UAE. Cependant, elle pourrait réduire localement l’inflammation.

Retinal AAV2‐mediated SOCS1 over‐expression in Experimental Autoimmune 

Uveoretinitis 

 

 Koch P*(1, 2), Makhoul M*(1), Elmaleh V(1,2), Lau‐Kilby A (2), Caspers L(2), Bruyns C   (1)  , 

Willermain F(1,2), Tenenbaum L(1). 

*KP and MM contributed equally to this work. 

 

(1) I.R.I.B.H.M  (Institute  of  Interdisciplinary  Research),  Université  Libre  de  Bruxelles‐Campus  Erasme, 

Brussels, Belgium. (2) Department of Ophthalmology, CHU St‐Pierre and Brugmann, Brussels, Belgium. 

 

     Key words: SOCS1, AAV2, EAU, clinical grading, intravitreal injection. 

Abstract 

Introduction: Activation of retinal cells by IFNγ is required for inflammatory cell recruitment 

during  experimental  autoimmune  uveitis  (EAU)  development.  IFNγ  activates  the 

transcription  of  many  pro‐inflammatory  genes  but  also  induces  suppressor  of  cytokine 

signaling (SOCS) proteins, which act as negative regulators of IFNγ signalling.  

Purpose:  To  study  the  effects  of  retinal  SOCS1  overexpression  on  EAU  development. 

Methods:  Adeno‐associated  vectors  AAV2‐  CAG‐GFP  or  AAV2‐CAG‐hSOCS1 were  injected 

intravitreally  in  the  right  eye  solely.  Four weeks  after AAV  injection,  EAU was  induced  in 

C57Bl6 mice by sc  immunization with IRBP peptide 1‐20. Disease severity was measured by 

clinical  and  histological  grading.  GFP  and  MHC  II  expression  were  analyzed  by 

immunofluorescence  and  SOCS1  expression  by  quantitative  RT‐PCR.  Results:  Intravitreal 

injection  of  AAV2‐CAG‐SOCS1  resulted  in  ocular  SOCS1  overexpression.  No  statistical 

difference was observed between EAU grading of eyes  injected with AAV2‐CAG‐hSOCS1 or 

AAV2‐CAG‐GFP  recombinant  viruses.  However,  a  high  inter‐animal  variability  of  disease 

induction was  observed,  possibly masking  the  effect  of  SOCS1.  In  order  to  normalize  for 

disease severity, the means of ratios of the clinical scores of the AAV injected eyes over the 

contralateral non‐injected eyes (I/NI) were calculated and found to be not quite significant 

between SOCS1 and EGFP group.  In contrast, this difference becomes significant when the 

mean of  ratio analysis was performed  in histological grades. Moreover when  the different 

constituents of the histological grading where  independently analysed the protective effect 

was more pronounced in the compartments targeted by the intravitreal AAV injection. 

Conclusion: Following AAV2 intravitreal injection, SOCS1 retinal expression does not globally 

protect  against  EAU  development.  However,  our  data  suggest  that  it  may  reduce 

inflammation locally at the site of infection. 

 

 

 

 

Introduction 

Uveitis  is an  important cause of blindness worldwide and affects predominantly patients  in 

the working age group  (Wakefield and Chang, 2005). The  inflammatory process can affect 

different parts of the eye and is often of autoimmune origin. Autoimmune uveitis can also be 

induced  in  susceptible  animals  by  injections  of  retinal  antigens  or  their  derived  peptides. 

Experimental  autoimmune  uveitis  (EAU)  possesses  many  characteristics  of  human 

autoimmune  posterior  uveitis  with  the  formation  of  vitritis,  retinal  vasculitis  and 

chorioretinitis (de Smet and Chan, 2001). 

Human and experimental data have helped  to characterize some  important aspects of  the 

disease.  Autoimmune  lymphocytes  of  the  Th1  and  Th17  subtypes  have  been  found  both 

during  EAU  and  in  patients  affected  of  autoimmune  uveitis  (Amadi‐Obi  et  al.,  2007; 

Nussenblatt et al., 1980). Those lymphocytes are stimulated in the periphery and at the eye 

level,  activate  the  cells  of  the  blood  retinal  barrier  (BRB),  promoting  thereby  intraocular 

inflammation and uveitis development. Hence, retinal pigment epithelium  (RPE), microglial 

cells, Müller  cells  and  astrocytes  have  been  proposed  to  account  for  the  penetration  of 

inflammatory cells  into the eye  (de Kozak et al., 1994;  Jiang et al., 2008; Willermain et al., 

2000). The role of pro‐inflammatory cytokines such as IFNγ and TNFα in their activation has 

also been widely described (Holtkamp et al., 2001; Xu et al., 2003). 

IFNγ,  a  type  II  family  cytokine,  is massively  secreted  by  Th1  lymphocytes  and  has  been 

detected in the eyes of patients with uveitis (Hooks et al., 1988). IFNγ has pro‐inflammatory 

effects  on  all  retinal  cell  types  involved  in  pathological  inflammatory  cell  recruitment. 

Studies have mostly focused on RPE cells  in which IFNγ  induces MHC class II, ICAM1, CD40, 

and cytokine expression (Liversidge et al., 1988; Milikan et al., 2009; Willermain et al., 2000).  

In vitro, IFNγ also stimulates retinal astrocytes and Müller cells to produce proinflammatory 

cytokines (de Kozak et al., 1994; Ke et al., 2009). Accordingly, intraocular expression of IFNγ 

increases  the severity and accelerates  the onset of EAU  in transgenic rats  (Egwuagu et al., 

1999). 

IFNγ  activates  the  JAK/STAT  signaling  pathways  leading,  through  a  series  of 

phosphorylations, to the activation of the STAT transcription factor which will promote the 

transcription  of  IFNγ‐regulated  genes  (Baker  et  al.,  2009).  Most  of  them  are  pro‐

inflammatory, but IFNγ also induces suppressor of cytokine signaling (SOCS) proteins, which 

act as negative regulators. Interestingly, it has been demonstrated that SOCS1 is induced in 

retina  during  EAU  and  suggested  that  this  gene  could  be  implicated  in  the  negative 

regulation  of  the  disease  (Liu  et  al.,  2008;  Takase  et  al.,  2005).  Moreover,  SOCS1 

overexpression has been demonstrated to block IFNγ activation in vitro and to protect organ 

damage in experimental models of autoimmune diabetes and lung inflammation (Federici et 

al., 2002;  Flodstrom‐Tullberg et al., 2003; Nakashima et al., 2008).  It  is  thus possible  that 

retinal  overexpression  of  SOCS1  could  block  the  activation  of  resident  cells  by  IFNγ  and 

protect eyes from EAU development. 

Different groups have demonstrated that adeno‐associated viruses (AAV) are excellent tools 

for gene transfer  into the retina, without  inflammatory reaction. Different cellular tropisms 

have  been  described,  depending  on  the  serotype  and  route  of  administration  (Ali  et  al., 

1998).  Intravitreal  injection of AAV2 vectors  leads  to  infection of  ciliary body, Müller cells 

and ganglion cells (Dudus et al., 1999; Harvey et al., 2002; Klimczak et al., 2009; Smith et al., 

2005).  In  contrast,  AAV2  subretinal  injection  results  mainly  in  RPE  and  photoreceptor 

infection  (Ali et al., 1998; Ali et al., 1996).  In  the context of EAU,  two groups have shown, 

using  either  the  intravitreal  or  the  subretinal  route,  that AAV2  driven  viral  interleukin‐10 

(vIL‐10) expression protects animals from EAU development (Broderick et al., 2005; Smith et 

al., 2005). Therefore, based on the down‐regulating role of SOCS1  in the  IFNγ cascade and 

the  usefulness  of AAV  vectors  for  retinal  gene  transfer, we  herein  investigated  an AAV2‐

mediated SOCS1 intraretinal overexpression to prevent EAU development. 

Material and Methods 

Animal care 

8 weeks old  female C57BL/6J mice were purchased  from Charles River  (Brussels, Belgium) 

and were bred  in accordance to the ARVO statement  for the use of animals  in ophthalmic 

and vision research. 

Adeno‐associated viruses 

AAV vector plasmids, harbouring ITRs from serotype 2 and the human SOCS1 or eGFP genes 

under  the  control of  the CAG promoter were  constructed  at  the Gene Vector Production 

Network  (GVPN;  Laboratoire  de  Thérapie Génique, Nantes,  France).  Recombinant  viruses 

were  produced  using  a  transencapsidation  production method  (Weber  et  al.,  2003).  The 

injected  titers,  expressed  in  viral  particles  per  ml,  were  of  4.7.1010p/ml  for  AAV2‐CAG‐

hSOCS1 and titer‐matched for AAV2‐CAG‐eGFP. 

Ocular injections 

Animals were anesthetized by a 100µL  intramuscular  injection  in  the  leg of Rompun 0.2% 

and  Ketalar  20mg/mL mixture.  Eyes were  dilated  using  tropicamide  0.5%  (Tropical,  Thea 

Pharma, France) drops and a cover slip was positioned on the cornea using a viscoelastic gel 

(Vidisic®, Tramedico, Belgium). Intravitreal delivery of 3µL of PBS, AAV2‐CAG‐eGFP or AAV2‐

CAG‐hSOCS1  recombinant  viruses  was  performed  in  the  right  eye  only  using  a  33Ga 

Hamilton  needle  (7803‐05,  Hamilton,  Reno,  USA)  under  microscopic  control  (Zeiss, 

Göttingen,  Germany).  Subretinal  injection  of  AAV2‐CAG‐eGFP  was  similarly  done  with  a 

puncture realized from the vitreous cavity through the retina. 

Real time RT‐PCR 

Total RNA was  isolated from normal eyes or eyes  injected with AAV2‐CAG‐hSOCS1 by using 

Trizol  (Invitrogen, Merelbeke, Belgium) combined with a purification step with  the RNeasy 

mini kit (Quiagen, Venlo, Netherlands). SOCS1 mRNA quantification has been performed by 

using  a  one  step  quantitative  RT‐PCR  assay with  the  RNA Master Hybridization  Probe  Kit 

(Roche Applied Science). The primes and  fluorescent probes used to detect human SOCS‐1 

and β‐actin were purchased from Applied Biosystems (Lennik, Belgium).  

EAU induction 

Four weeks after  intraocular vector delivery, EAU was  induced by  injecting subcutaneously 

500µg  of  IRBP  peptide  1‐20  (GPTHLFQPSLVLDMAKVLD,  Sigma Genosys, UK)  v/v  CFA with 

2.5mg/mL Mycobacterium  Tuberculosis  (Sigma,  UK)  and  intraperitoneally  1.5µg  Pertussis 

Toxin (Sigma) per mouse. 

Clinical grading 

Mice  eyes were  examined  every week,  from one day  after  surgery  to  4 weeks  after  EAU 

induction. A  full  clinical grading  system was performed at 28 days post‐immunisation. For 

this purpose, eyes were dilated and examined under the slit‐lamp of a surgical microscope 

(Zeiss, Göttingen, Germany) using a coverslip and viscoelastic material (Vidisic®, Tramedico, 

Belgium). Clinical grade has been optimised by P. Koch, accordingly to a previously described 

system  (Xu  et  al.,  2008).  Briefly,  vitritis  as  well  as  optic  neuropathy  were  examined  as 

separate  scores  and  vasculitis  and  retinitis  were  graded  as  either  active  or  inactive 

inflammation  in  term  of  percentage  of  lesions  and  the most  severe  injury  found  in  the 

fundus. Clinical score was a mean of 10 different grades on a maximum score of 4 (Koch P., 

PhD thesis). 

Histology and immunofluorescence staining 

For  histology  and  immunohistochemistry,  animals  were  sacrificed  at  28  days  post‐

immunisation.  Injected  and  non‐injected  eyes  were  removed,  and  fixed  in  4% 

paraformaldehyde and 3% sucrose at 4°C for 6 hours. Eyes were then put in three successive 

baths of respectively 5, 10 and 20% of sucrose for 24 hours each before being embedded in 

OCT (TissueTek®, Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Nederlands) and stored at ‐80°C. 10 

micron sections were obtained at ‐23°C using a cryostat (Leica CM 3050S), with 5 samples of 

sections  at  each  level  (serial  cuttings)  in  order  to  correlate  histology  and 

immunofluorescence.  A  classical  haematoxylin‐eosin  (H&E)  staining was  then  realized.  In 

order  to  get  comparable  results with  our  clinical  grading  system,  all  sections  of  all  eyes 

(between  12  and  28  sections  per  eye) were  analysed  following  the AD Dick's  histological 

grading system, by two independent observers (Dick et al., 1994).  

For  immunofluorescence,  conventional  techniques were used with  the  following different 

primary and secondary antibodies: anti‐GFP rabbit polyclonal antibody (1:1000, Abcam, UK); 

anti‐MHCII  rat  polyclonal  antibody  (1:100,  BD  Pharmingen,  Belgium);  anti‐GFAP  mouse 

monoclonal  antibody  (1:500,  Sigma‐Aldrich,  Belgium);  anti‐vimentin  rabbit  polyclonal 

antibody  (1:100, Sigma‐Aldrich, Belgium); anti‐chicken FITC‐conjugated secondary antibody 

(1:400,  Jackson  Immunolabs,  USA);  anti‐rat  Cyanine  2  (1:1000,  Invitrogen,  Merelbeke, 

Belgium);  anti‐rabbit  coupled  to Cyanine  5  (1:600  Jackson  Immunolabs, USA)  and  anti‐rat 

coupled  to  Cyanine  3  (1:600,Jackson  Immunolabs,  USA).  Different  anti‐SOCS1  primary 

antibodies (i.e. H‐93, SantaCruz) were tested without strong repetitive evidence of a specific 

labeling.  Nuclei  were  counterstained  with  Dapi.  Slides  were  mounted  with  fluorsave® 

(Darmstad, Germany). 

A  laser  scanning Axiocam MR2  fluorescent microscope  equipped with  the Axiovision  v4.7 

sotware  (Zeiss,  Göttingen,  Germany)  and  a  confocal microscope  (Axiovert100,  Carl  Zeiss, 

Germany) equipped with automated analysing system (Lasersharp version 3,2 biorad) were 

used  to  analyse  the  labelled  slides.  Pictures  have  been  optimised  and  assembled  when 

necessary using Photoshop CS4 software. 

Statistical analysis 

Data are presented as means ± standard error (SD) of mean. Severity of EAU was examined 

by non‐parametric Mann‐Whitney U test using SPSS v12 software. A statistically significant 

difference was obtained with p value equal or less than 0.05. 

 

Results 

1.  Comparative  effects  of  subretinal  or  intravitreal  injections  of  AAV2  vectors  on  retina 

transduction. 

As a prerequisite to the study of SOCS1 retinal overexpression on the EAU development, we 

first  investigated, with a control AAV2 vector expressing the marker gene GFP  (AAV2‐CAG‐

eGFP), the influence of different routes of administration on retina transduction. Subretinal 

injections  of  AAV2‐CAG‐eGFP  vectors were  done  through  the  vitreous  cavity,  following  a 

clinical‐based injection technique, and compared to common intravitreal injections. 

As  illustrated  in  figure  1a,  subretinal  injections  led  to  a  strong  transduction  of  the  outer 

retina, including RPE cells, in the area of the bullous retinal detachment (figure 1b) but also 

of the inner retina (figure 1c). However, by using this technique, a retinal scar was observed 

at  the  injection  site  (figure 1b).  This  remodelling was  frequently  limited but  some  retinal 

changes were always observed by fundus examination and histology. In some selected cases, 

this  scarring process was  important with  folds of  the whole  retina and  the emergence of 

retinal folds, as shown  in figure 1d.  In contrast,  intravitreal vector delivery was an efficient 

technique to widely  infect the  inner retina up to the outer plexiform  layer, without retinal 

destructions (figure 1e). As demonstrated in figure 1f, epithelial cells of the ciliary body were 

also transduced. Thereby, we decided to use classical  intravitreal  injections for  later SOCS1 

gene transfer experiments in EAU. 

Careful analysis of the GFP green staining suggests that intravitreal injections of AAV2‐CAG‐

eGFP permit  the  infection of  retinal ganglion cells and other neurons, as well as epithelial 

cells of  the ciliary body and Müller cells. We  further  realised co‐staining experiments with 

antibodies  against  vimentine  (Cy3,  red,  detection  of Müller  cells)  and  GFAP  (Cy5,  pink, 

detection  of  astrocytes  and  activated  Müller  cells)  to  better  analyse  retinal  glial  cell 

infection. As shown  in figure 2, superior panel, AAV2‐CAG‐eGFP  intravitreal delivery allows 

the  transduction of  retinal  cells  that are vimentine and GFAP negative,  representing most 

probably  retinal  ganglion  cells but not  astrocytes.  In  the  inferior panel,  some Müller  cells 

were infected. By comparing superior and inferior panels (arrowhead), we identified in some 

areas activated Müller cells that were GFAP positive. By using the intravitreal route, we were 

not able to transduce RPE cells. 

2. SOCS1 expression after intravitreal injections of AAV2‐CAG‐hSOCS1 vector   

In  a  second  set  of  experiments,  we  examined  if  the  intravitreal  delivery  of  AAV2‐CAG‐

hSOCS1 vector was effective to obtain a human SOCS1 overexpression in the mouse retina. 

We  have  chosen  to  use  human  SOCS1  because  of  potential  usefulness  in  human  cells; 

moreover,  it  has  been  reported  to  be  functional  in mice  (Cottet  et  al.,  2001),  we  have 

ourselves tested the efficacy of the human SOCS1 on mouse RPE cells (supplementary data 

1).  Adult  C57BL/6J mice were  thus  injected with  AAV2‐CAG‐hSOCS1  recombinant  viruses 

(4.7.1010  particles/mL)  in  the  vitreous  cavity  of  the  right  eye,  the  non‐injected  left  eye 

serving  as  control.  Four  weeks  later,  the  animals  were  killed  and  their  eyes  recovered. 

Unfortunately,  none  of  the  four  different  antibodies  we  have  tested  for  human  SOCS1 

histological  detection  gave  a  suitable  and  reproducible  fluorescent  signal  on  eye 

cryosections. We thus extracted the RNA from the whole eyes and performed real time RT‐

PCR assays  for  the human SOCS1 mRNA expression referred  to  the house keeping gene �‐

actin mRNA expression. As observed in figure 3, we obtained a strong expression of SOCS1 in 

the  injected eyes, as compared  to normal eyes  (p<0.05) or contralateral non‐injected eyes 

(p<0.05). 

3. Effects of SOCS1 retinal overexpression on EAU development 

After  having  demonstrated  that  AAV2‐CAG‐hSOCS1  injections  lead  to  ocular  SOCS1 

expression, we have next evaluated the effects of this expression on EAU development. We 

thus performed  intravitreal  injections  in the right eye of C57BL/6J mice with PBS or AAV2‐

CAG‐hSOCS1 or AAV2‐CAG‐eGFP recombinant viruses. Four weeks later, an EAU was induced 

by  systemic  immunisation with  IRBP  1‐20.  The  animals were  followed weekly  by  fundus 

examination. At day 28, a  final clinical grading was performed  in both eyes  (right  injected 

ones  and  left  non‐injected  ones)  of  all  mice.  Animals  were  then  killed  and  their  eyes 

processed for histology. Two independent experiments were conducted for the SOCS1 (n=9) 

and GFP (n=9) groups. The figures 4a, illustrate the clinical scores of all injected (I) and non‐

injected (NI) eyes  in the PBS, GFP and SOCS1 groups respectively. As a whole, the data did 

not  show any  statistical difference  in  the  clinical grading of EAU between  the AAV2‐CAG‐

hSOCS1 and  the AAV2‐CAG‐eGFP  injected eyes. However, as  illustrated  in  figure 4a,  there 

exists a high individual variability in the severity of the disease from one animal to another. 

We  thereby  decided  to  calculate  for  each mouse  the  ratio  of  the  clinical  scores  of  the 

injected eye on the non‐injected one. The mean of the ratios were 1.14+/‐0.48, 1.26+/‐0.46, 

0.98+/‐0.30 in the PBS, GFP and SOCS group respectively. The difference between eGFP and 

SOCS mean were not quite significant (p=0.078) and non‐significant between PBS and SOCS 

(p=0.172)  (Figure  4b).  In  contrast,  this  difference  becomes  significant when  the mean  of 

ratio analysis was performed in histological grades (Figure 4c). Moreover when the different 

constituents of the histological grading where  independently analysed the protective effect 

was more pronounced  in  the  compartments  targeted by  an  intravitreal AAV  injection. As 

illustrated  in  figure  4d, we  found  the  highest  significant  difference  in  the mean of  ratios 

between  the  GFP  and  SOCS1  groups when  analysing  the  ciliary  body,  the  vasculitis  and 

perivascular cuffing (p=0.008, p=0.009 and p=0.008 respectively). No significant differences 

were observed for vitritis (p=0.366) nor rod outer segment (p=0.534).  

4. MHC class II expression during EAU and after GFP/SOCS1 gene transfer  

MHCII  is  thought  to  play  a major  role  in  the  activation  of  lymphocytes within  the  retina 

during  EAU  (Jiang  et  al.,  2008)  and  is  strongly  up‐regulated  by  IFNγ. We  thus  decided  to 

examine  if  SOCS1 over‐expression  could have  any effect on  retinal MHCII expression. We 

therefore analysed the expression of MHC class II in EAU eyes injected with the AAV2‐CAG‐

eGFP  vectors  and  interestingly,  we  never  observed  GFP  expressing  cells  that  expressed 

MHCII  even when MHC  class  II  expressing  cells were  very  close  to  the GFP  positive  cells 

(figures  5a  and  5b). Moreover,  in  some  areas  with  very  severe  inflammation,  the  GFP‐

expressing  retinal  cells  seemed  to  be  destroyed  by  MHCII  expressing  cells  (figure  5c). 

Unfortunately, we were not able to correlate MHCII and SOCS1 expression, since we could 

not find good quality antibodies for human SOCS1 detection. 

Discussion 

Immunosuppressive gene  transfer  into retinal cells represents a promising strategy  for  the 

management of autoimmune uveitis. Until now,  such approach has been based on  retinal 

cell transduction for secreted immunosuppressive cytokines such as IL‐10, IL‐1 RA and hIFN‐

α  (Broderick  et  al.,  2005;  Smith  et  al.,  2005;  Trittibach  et  al.,  2008;  Lichun  T  et  al  2011). 

However,  targeting  intracellular pathways  implicated  in  retinal  cell activation  seems more 

specific and might be more advantageous (Ke et al., 2009). We have thus tested in this work 

if retinal SOCS1 overexpression could protect from EAU development. 

Actually, AAV2 has emerged as an excellent candidate to infect the retina, depending on the 

route  of  administration,  without  inducing  inflammatory  response  in  healthy  animals 

(Bainbridge et al., 2003). With AAV2‐CAG‐eGFP vectors, we have experienced two routes of 

delivery, the intravitreal one and the subretinal one which was more comparable to human 

surgery. Subretinal  injection  through  the vitreous  cavity allowed us  to  combine  subretinal 

and intravitreal delivery, probably due to an expulsion of viruses from the retinal bubble to 

the vitreous cavity. However,  it  led  to a  traumatic  remodelling of  the  retina,  leading us  to 

choose classical intravitreal injections for later gene transfer experiments in EAU. In line with 

published  reports, we  found  that  intravitreal  injection  of  AAV2‐CAG‐eGFP  leads  to  infect 

Müller  cells  and  epithelial  cells  of  the  ciliary  body,  both  cell  types  being  implicated  in 

inflammatory cell recruitment and EAU development (Harvey et al., 2002; Hauck et al., 2007; 

Smith et al., 2005).  Interestingly,  it has been demonstrated  that, even  if only 15% of  total 

Müller cells were infected after intravitreal AAV2 injection, intravitreal delivery of vectors to 

the  inner retina could be enhanced by digestion of the  inner  limiting membrane or by the 

use  of  an  AAV6  vector  variant  (Dalkara  et  al.,  2009;  Klimczak  et  al.,  2009).  Those  two 

strategies should be investigated in EAU to enhance infection‐related limitations. 

After  having  demonstrated,  by  real  time  PCR,  an  ocular  SOCS1  expression  following 

intravitreal  AAV2‐mediated  gene  transfer,  we  next  investigated  the  effects  of  SOCS1 

overexpression on EAU, by comparing  the effects of  intravitreal  injections of either AAV2‐

CAG‐hSOCS1 or AAV2‐CAG‐eGFP vectors versus PBS, in the right eyes of C57BL/6J mice, four 

weeks before  immunisation with  IRBP 1‐20 retinal antigen. Overall, our data did not show 

any statistical difference in the clinical grading of EAU between the SOCS1, injected eye and 

the contralateral non‐injected control eye. It is common to observe an important variability 

in the severity of EAU between different animals but each frequently develops a comparable 

inflammation  in both eyes. We  therefore decided  to compare  for each animal,  the clinical 

and  histological  scores  of  the  right  injected  on  the  left  uninjected  eyes  and  calculated  a 

mean of those ratios for the SOCS1 and GFP groups to further examine the effect of SOCS1 

overexpression  in EAU. The mean of  the  ratios of  the  clinical  scores was non  significantly 

reduced  in the SOCS1 group as compared to the EGFP group.  In contrast, the difference  in 

mean of ratio of histological score between SOCS1 group and the GFP group was significant. 

Interestingly, when we independently analysed the different constituents of the histological 

grading,  the  decreased  inflammation  was  definitely more  pronounced  within  the  ocular 

compartments targeted by an intravitreal AAV2 infection. 

Concerning the MHCII expression by  the retina, we never detected  in the  inner retina and 

ciliary body GFP expressing cells that were MHCII positive. Unfortunately, since none of the 

different antibodies we have tested for human SOCS1 histological detection gave a suitable 

and  reproducible signal on eye cryosections, we could not  investigate MHCII expression  in 

SOCS1  infected  retinal  cells.  The  global  retinal  expression  of MHCII  did  not  seem  to  be 

significantly  different  between  the  AAV2‐CAG‐hSOCS1  injected  eyes  and  non‐injected 

controls.  

Our results do not allow concluding that SOCS1 expression, mediated by intravitreal injection 

of  AAV2  protects  the  eyes  from  EAU  development.  Those  data  are  in  contrast with  the 

established  role  of  local  tissue  SOCS1  expression  in  the  control  of  inflammation  in  organ 

specific  autoimmune  damage  including  EAU  (ref  SOCS1/EAU)  which  has  been  shown  to 

protect organ from tissue damage (Balabanov R et al., 2009; Yu CR et al 2011). This can be 

explained by several hypotheses. First, intravitreal AAV2 injections lead to a relatively limited 

infection of retinal cells  implicated  in EAU development. Hence, our data are  in agreement 

with  other  studies  demonstrating  that  intravitreal  injection  of  AAV2  mostly  infecting 

ganglion  cells  rather  than BRB  cells. Second,  it  is also possible  that SOCS1 overexpression 

only  affects  retinal  cell  activation  by  IFNγ  but  not  by  other  cytokines  also  playing  an 

important role in EAU development, such as IL‐17 or TNFα. However, the recent description 

by Yu CR et al, that transgenic mice and rats expressing SOCS1 under the control of the opsin 

promoter are protectived from EAU development, suggest that a strong SOCS1 expression in 

none  BRB  cells  is  sufficient  to  block  EAU  development  (Yu  CR  and  al.,  2011).  A  third 

explanation might be that the level of protein expression was too low to obtain a significant 

protective effect. 

In conclusion, immunosuppressive gene transfer is an interesting approach for treatment of 

uveitis. Among all potentialities, blocking  the activation of  retinal  cell by proinflammatory 

cytokines appears as a very elegant way to protect the eye from inflammatory development. 

However,  following AAV2  intravitreal  injection, SOCS1  retinal expression does not globally 

protect  against  EAU  development.  However,  our  data  suggest  that  it  may  reduce 

inflammation locally at the site of infection. 

 

 

 

 

 

 

 

 

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LEGENDS TO FIGURES   

Figure 1: Comparison of intravitreal and subretinal injection routes on GFP expression  

C57BL/6J mice were  injected  in the right eye either subretinally through the vitreous cavity 

or intravitreally with 3µL of AAV2‐CAG‐eGFP at 4.7.1010p/mL. Four weeks later, the animals 

were  killed  and  their  eyes  recovered  and  processed  for  histology.  GFP  expression  was 

investigated by indirect immunofluorescence. The figure 1a is a photomontage of 36 pictures 

of a subretinal injection showing GFP expression in the outer retina, especially in the area of 

the  bullous  retinal  detachment  (figure  1b,  arrowhead, magnification  3x)  and  in  the  inner 

retina  (figure  1c, magnification  3x).  In  figure  1b,  the  asterisk  shows  a  remodelling  of  the 

retina at the puncture site.  In  figure 1d, the asterisk shows a  folding of the retina and the 

arrowhead retinal folds. The figure 1e illustrates the GFP expression in the inner retina and 

the  figure 1f  in epithelial  cells of  the  ciliary body  after  intravitreal delivery of AAV2‐CAG‐

eGFP vectors. 

Figure 2: AAV2 intravitreal injection leads to inner retina transduction 

Another set of slides  from  the GFP expressing eyes  (as shown  in  figure 1) were co‐stained 

with DAPI, with an anti‐vimentine antibody (Cy3, red) for a specific detection of Müller cells 

and with an anti‐GFAP antibody (Cy5, pink) for a detection of astrocytes and activated Müller 

cells  (figure  2,  superior  and  inferior  panels,  left,  merge  pictures).  Superior  panel:  GFP 

expression  by  retinal  cells  that  are  vimentine  (middle)  and  GFAP  (right)  negative, most 

probably retinal ganglion cells, but not astrocytes (asterisk).  Inferior panel: GFP transduced 

Müller cells. The arrowhead in the superior panel shows GFAP positive astrocytes whereas in 

the inferior panel it identifies also activated Müller cells that were GFAP positive.  

Figure 3: Detection of SOCS1 overexpression by real time PCR  

C57BL/6J  mice  were  injected  with  AAV2‐CAG‐hSOCS1  recombinant  viruses  (4.7.1010 

particles/mL)  in  the  vitreous  cavity  of  the  right  eye,  the  non‐injected  left  eye  serving  as 

control. Four weeks  later, the animals were killed and their eyes recovered. Human SOCS1 

expression was tested by quantitative RT‐PCR on whole SOCS1 injected or contralateral non‐

injected eyes comparatively to normal eyes. Mean +/‐ SD. ** p= 0.02 and *** p=0.006. 

Figure 4: Effects of SOCS1 delivery on EAU development 

C57BL/6J mice were injected intravitreally, in the right eye only, with either PBS (n=6), AAV2‐

CAG‐eGFP (n=9) or AAV2‐CAG‐hSOCS1 (n=9) vectors, four weeks prior to immunisation with 

IRBP  1‐20.  28  days  later,  a  full  clinical  grading  of  all  eyes  was  performed,  scoring 

inflammation. Mice were then sacrificed, their eyes processed and analysed for a clinical and 

histological grading. Figures 4a: represent clinical scores of all  injected (I) and non‐injected 

(NI)  eyes  in  the  PBS,  GFP  and  SOCS1  groups  (pooled  data  from  two  independent 

experiments). Figure 4b:    represent  the mean of  the  ratios of  the  injected  (I) versus non‐

injected (NI) eye of each individual mouse in the PBS, GFP and SOCS1 groups, for the clinical 

(PBS/SOCS: p=0.172, GFP/SOCS p=0.078 respectively). Figure 4c:  illustrate the difference  in 

the mean of histological ratios between SOCS group and the EGFP group  (p=0.032). Figure 

4d:  similar  calculations  of  mean  of  ratios  for  different  elements  representative  of  the 

histological  score:  ciliary  body  p=0.008,  vasculitis  p=0.009  and  vascular  cuffing  p=0.008. 

Mean+/‐SD. 

Figure 5: MHCII expression after eGFP or SOCS1 overexpression in EAU 

Intravitreal administration of AAV2‐CAG‐eGFP or ‐SOCS1 vectors was performed in right eyes 

of 8 weeks old C57BL/6J mice,  four weeks prior to their  immunisation. 4 weeks  later, EAU 

animals were killed and eyes were processed  for  immunohistology. Figures 5a, 5b, and 5c 

illustrate  GFP  (Cy2,  green),  MHCII  (Cy3,  red)  and  DAPI  (blue,  for  nucleus)  co‐labelling.. 

Pictures were  taken at x20 magnification. Figure 5a: GFP expression within  the epithelium 

from the ciliary body (arrow). No correlation was found with the red expressing MHCII cells 

(arrowhead). Figure 5b, asterisk: positive MHCII expression in small vasculitis associated with 

a  fine cuffing  leading  to an  invasion of cells  in  the subretinal space  (figure 5b, arrowhead) 

and inflammatory cells within a granuloma (figure 5c, asterisk). None expressed GFP.  

 Supplementary data 1: Effects of human SOCS1  stable overexpression  in RPE mice  cells activation by IFNγ.   We constructed a plasmid containing hSOCS1 gene  (plasmid SOCS1). As control, we used 

the same plasmid without SOCS1 gene (plasmid CTRL). Subsequently, we performed stable 

transfection in RPE mice cells in order to obtain 2 cells lines; clone SOCS1 and clone CTRL. 

The  effect  of  IFNγ  stimulation  on  STAT1  and  P‐STAT1  expression was  then  analysed  by 

western blot. 

Figure 1

Figure 2

Figure 3

Normal eyes Non injected eyes AVV‐SOCS1 injected eyes

*****

Nor

mal

ized

 SO

CS1 

mRN

A e

xpre

ssio

n

PBS n=6 eGFP n=9 SOCS1 n=9Cl

inic

al g

radi

nf (/

4)

Figure 4

NI NINII II

a.M

ean 

of r

atio I/

NI G

radi

ng C

linic NS

NSb.

NS

NS

PBS n=6 eGFP n=9 SOCS1 n=9

eGFP n=6 SOCS1 n=6

Mea

n of r

atio I/

NI 

Gra

ding

 His

tolo

gy

Figure 4

Ciliary body Vasculitis Vasc Cuffing

Mea

n of r

atio I/

NI G

radi

ng H

isto

logy

**

*** ******

c.

d.

Figure 5

RPE   Clone CRTL Clone SOCS1

100kDA P‐STAT1

/‐/ IFNγ

STAT191kDA

Supplementary data 1

41

4. Effet de la surexpression stable du gène SOCS1 dans l’activation in vitro d’épithélium pigmentaire rétinien par des cytokines pro-inflammatoires

Effect of SOCS1 overexpression on RPE cells activated by cytokines

Bazewicz M*, Makhoul M*, Draganova D, Chartro A, Tenebaum L, Elmaleh V, Bruyns C,

Willermain F

Données non publiés

Introduction

Une des hypothèses permettant d’expliquer la relative absence d’effet in vivo de la

surexpression de SOCS1 au niveau rétinien sur le développement de l’UAE est que SOCS1 bloque

principalement la voie de l’IFNγ et n’affecte pas les autres voies d’activation des cellules

rétiniennes impliquées dans le développement d’UAE. Néanmoins, plusieurs travaux réalisés sur

d’autres types cellulaires suggèrent que l’expression de SOCS1 est transitoirement induite par

une grande variété de cytokines inflammatoires et anti-inflammatoires et peut interférer avec

leur activation (1,2). Brand et al ont par exemple démontré que, dans les cellules hépatiques,

l’IL-22 active la voie STAT1 et induit ainsi l’expression de SOCS1 qui bloque la prolifération

hépatique (3). De plus, SOCS1 par sa liaison à la sous-unité p65 de la protéine NF-κB, renforce

son ubiquitylation et sa dégradation et par conséquent régule négativement la signalisation

induite par le NF-κB (4). De même, Ke Y et al ont montré, sur une lignée de cellules d’EPR de

souris, que l’IL-17 induisait l’expression de SOCS1 et que cette expression limitait l’activation de

ces cellules par l’IL-17 (5).

En accord avec ces données, les résultats de Yu CR et al ont démontré qu’une surexpression de

SOCS1 par les photorécepteurs permet de bloquer le développement d’UAE, suggérant que

SOCS1 pourrait bloquer l’activation des cellules rétiniennes par plusieurs cytokines (6). Nous

avons décidé d’investiguer cette hypothèse. Pour ce faire, nous avons surexprimé le gène SOCS1

par transfection stable dans une lignée humaine de cellules ARPE-19. Nous avons ensuite

investigué les effets de cette surexpression sur l’activation des cellules de l’EPR par différentes

cytokines : IFNγ, TNFα et IL-22.

42

Résultats

1. EFFET DE L’IFNγ SUR L’ACTIVATION DES CELLULES DE L’EPR.

1.1 Etude de l’expression stable de SOCS1 par les clones cellulaires et effet de l’IFNγ sur

l’expression de SOCS1 par les ARPE.

Nous avons commencé ce travail en quantifiant par qRT-PCR l’expression de SOCS1 dans les

clones SOCS1 et CTRL et dans les cellules ARPE natives ou stimulées par l’IFNγ. Les données de la

fig.1 montrent que la stimulation des ARPE par l’IFNγ pendant 24h entraine une augmentation

dose-dépendante de l’expression de l’ARNm SOCS1. Cette figure montre également que le clone

SOCS exprime des taux d’ARNm SOCS1 largement supérieurs à ceux exprimés par les cellules

ARPE non-stimulées. Par contre, le clone CTRL présente une expression de SOCS1 identique à

celle des ARPE non stimulées.

1.2. Effet de la surexpression stable de SOCS1 sur la transduction du signal intracellulaire induit

par l’IFNγ.

Une stimulation par l’IFNγ entraine la phosphorylation du facteur de transcription STAT1. Nous

avons donc testé par WB la présence de la forme phosphorylée de STAT1 (P-STAT1) dans les

ARPE et les clones stimulées ou non par de l’IFNγ. La fig.2 montre qu’en absence de stimulation

par l’IFNγ, P-STAT1 n’est détecté ni dans les ARPE, ni dans les clones. Après stimulation par l’IFNγ

pendant 5 ou 30 minutes, P-STAT1 est présent aussi bien dans les ARPE que dans le clone CTRL.

En revanche, dans le clone SOCS1, P-STAT1 n’est que très faiblement détecté. Dès lors, dans ces

conditions expérimentales, seule la surexpression stable de SOCS1 empêche la phosphorylation

de STAT1 en réponse à une stimulation par l’IFNγ.

1.3. Effet de la surexpression stable de SOCS1 sur l’expression membranaire des molécules CD 54

et CMH II induite par l’IFNγ.

Nous avons ensuite étudié par cytométrie de flux l’effet de la surexpression de SOCS1 sur

l’expression membranaire de CD54 et de CMH II (fig.3). Les résultats montrent que les clones

SOCS1 et CTRL expriment constitutivement, et de manière égale, du CD54 pas du CMH II. Une

43

stimulation par IFNγ augmente de l’expression du CD54 et induit celle du CMH II sur le clone

CTRL mais pas sur le clone SOCS1.

1.4. Effet de la surexpression stable de SOCS1 sur la sécrétion d’IL-8 induite par l’IFNγ.

Nous avons quantifié comparativement par ELISA la sécrétion d’IL-8 par les clones SOCS1 et

CTRL. La fig.4 indique que le clone CTRL secrète constitutivement de l’IL-8 et que le clone SOCS1

en secrète quatre fois moins. La stimulation par l’IFNγ inhibe la sécrétion d’IL-8 par le clone CTRL

et cet effet inhibiteur n’est pas retrouvé dans le clone SOCS1.

2. EFFECT DU TNFα SUR L’ACTIVATION DES CELLULES DE L’EPR.

2.1. Effet de la surexpression stable de SOCS1 sur la transduction du signal intracellulaire induit

par le TNFα.

Une stimulation par le TNFα entraine la phosphorylation et la dégradation d’IκB dans le

cytoplasme ce qui permet la libération du facteur de transcription NFκB et sa translocation au

noyau. Les données de WB de la fig.5 montrent la présence d’IκBα dans les ARPE et dans les

clones au repos. Après stimulation par le TNFα, l’IκBα est dégradée dans les ARPE ainsi que dans

les clones CTRL et SOCS1. Ces résultats indiquent que la surexpression de SOCS1 n’a pas d’effet

sur la phosphorylation et la dégradation de l’IκBα.

2.2. Effet de la surexpression stable de SOCS1 sur l’expression membranaire des molécules CD 54

et CMH II induite par le TNFα.

La modulation de l’expression membranaire de CD54 et de CMH II par les clones sous l’effet du

TNFα a été étudiée comparativement par cytométrie de flux. La fig.6 montre que le TNFα

n’induit pas l’expression du CMH II sur les clones SOCS1 et CTRL. En revanche, le TNFα induit

l’expression du CD54 par le clone CTRL. Cette induction est très faiblement inhibée dans le clone

SOCS1.

44

2.3. Effet de la surexpression stable de SOCS1 sur la sécrétion d’IL-8 induite par le TNFα.

Les résultats de la fig.7 indiquent que la stimulation par TNFα augmente très fortement, et de

façon similaire, la sécrétion basale d’IL-8 par les clones SOCS1 et CTRL. La surexpression de

SOCS1 n’empêche donc pas l’induction de la sécrétion d’IL-8 par le TNFα. Néanmoins, lorsque

nous combinons une stimulation par TNFα et IFNγ, nous observons un effet inhibiteur de l’IFNγ

sur l’induction d’IL-8 par le TNFα dans le clone CTRL mais pas dans le clone SOCS1.

3. EFFET DE L’IL-22 SUR L’ACTIVATION DES CELLULES DE L’EPR.

3.1. Mise en évidence du récepteur à l’IL-22.

L’IL-22, une cytokine produite par les lymphocytes Th17, est impliquée dans une série de

maladies inflammatoires. Nous avons décidé d’étudier son rôle dans l’activation de l’EPR. Nous

avons commencé cette étude par la mise en évidence du récepteur IL-22Rα1 dans les ARPE par

WB. Le récepteur à l’IL-22 est un hétérodimère composé de l’IL-10R2, ubiquitaire, et de l’IL-

22Rα1, la présence duquel détermine si une cellule est la cible de l’IL-22. La fig.8 montre que ce

récepteur est exprimé de manière constitutive par les ARPE.

3.2. Transduction du signal intracellulaire induit par l’IL-22.

Des études ont montrés que l’IL-22 entraine la phosphorylation des protéines STAT1, 3 et 5 dans

quelles cellules (fig. 9)(3). Nos résultats de WB n’ont pas démontré de tels effets de l’IL-22 sur les

ARPE (Fig 9).

Discussion et perspectives

L’EPR joue un rôle essentiel dans l’induction et le maintien du privilège immun oculaire.

Paradoxalement, il peut également participer activement à la physiopathologie des uvéites

quand il est exposé à des cytokines pro-inflammatoires. Dans ce travail nous avons étudié in

vitro le rôle de la surexpression stable du gène SOCS1 sur l’activation de l’EPR par des cytokines

pro-inflammatoires IFNγ, TNFα, et IL-22. Notre intérêt pour SOCS1 est motivé par une série de

données : i) l’expression de SOCS1 dans la rétine augmente lors de la phase active d’UAE et

45

diminue pendant sa résolution, suggérant que SOCS1 joue un rôle de modulateur de

l’inflammation au niveau rétinien (7), ii) la surexpression de SOCS1 au niveau local permet de

protéger les organes cibles dans des modèles de diabète auto-immun (8) et d’inflammation

pulmonaire (9) et iii) SOCS1 peut, en plus de réguler négativement la transduction du signal

intracellulaire induit par l’IFNγ, inhiber d’autres voies de signalisation, notamment celle du

NFκB(10).

Nous avons réalisé nos expériences avec une lignée humaine de cellules d’EPR, les ARPE-19, et

deux clones obtenus par transfection stable : un clone SOCS1 et un clone CTRL. Nous avons

confirmé que le clone SOCS1 a une expression de SOCS1 largement supérieure à celle du clone

CTRL et des ARPE non-stimulées et qu’une stimulation des ARPE par l’IFNγ induit l’expression de

SOCS1 de façon dose-dépendante. Ces résultats sont en accord avec une autre étude qui montre

que l’expression de SOCS1 est augmentée dans les cellules humaines d’EPR stimulées par IFNγ

(11).

Nous avons également établi que la surexpression stable de SOCS1 empêche la phosphorylation

de STAT1 sur tyrosine 701 en réponse à une stimulation par l’IFNγ. Ce même effet a été retrouvé

dans des kératinocytes transfectés par le gène SOCS1 (12). En revanche, nous n’avons pas mis en

évidence un effet de la surexpression stable de SOCS1 sur la dégradation de l’IκB, un marqueur

de l’activation de la voie NFκB. A l’inverse, des études ont démontré un effet inhibiteur de SOCS1

sur la voie NFκB dans des hépatocytes murins et des macrophages (4, 13). Un des mécanismes

proposés est l’induction de l’ubiquitination de la sous-unité p65 de l’NFκB par SOCS1 (4). Dès

lors, il est possible que nous n’ayons pas pu mettre en évidence une inhibition de la voie NFκB

car notre cible de détection, l’Iκb, se trouve en amont de l’activité inhibitrice potentielle de

SOCS1. Afin d’avoir plus de certitude quant au rôle de SOCS1 sur la voie NFκB dans l’EPR nous

devrions étudier son effet sur l’ubiquitination de p65.

Notre travail a continué par l’étude de l’effet de la surexpression stable de SOCS1 sur des

marqueurs de l’activation de l’EPR induits par les cytokines pro-inflammatoires IFNγ et TNFα.

L’expression membranaire du CMH II par les cellules de l’EPR est un des marqueurs de son

activation. L’EPR n’exprime pas de CMH II en situation physiologique mais bien lors d’uvéite (14).

46

De plus, il existe une relation entre le taux d’expression de CMH II et le niveau d’activation des

lymphocytes T uvéitogènes (15). Nos résultats confirment que le CMH II n’est pas exprimé sur les

clones SOCS et CTRL au repos. Il est induit sur le clone CTRL suite à une stimulation par l’IFNγ

mais pas par le TNFα. Cette induction n’est pas surprenante car il a été établi que l’IFNγ active

l’expression de CIITA, un co-activateur transcriptionnel du gène du CMH II, via la voie JAK/STAT.

En accord, nous avons démontré une très forte inhibition de l’induction du CMH II par l’IFNγ

dans le clone SOCS1. Un effet identique a été mis en évidence dans des kératinocytes

surexprimant SOCS1 (12).

La molécule d’adhésion CD54 est un autre marqueur de l’activation des cellules de l’EPR. Cette

protéine est impliquée dans l’extravasation des lymphocytes au niveau de l’EPR et leur

infiltration de la neurorétine (16). De plus, l’administration d’anticorps anti-CD54 peut diminuer

la sévérité de l’UAE (17). Nos données montrent que le CD54 est exprimé constitutivement, et

de manière égale par les deux clones et que son expression est augmentée par l’IFNγ et par le

TNFα dans le clone CTRL. Ce même effet sur les cellules de l’EPR a été démontré par une autre

équipe (19). Par contre, la surexpression de SOCS1 inhibe très fortement l’expression du CD54

induite par l’IFNγ et très faiblement celle induite par le TNFα. Comme les deux cytokines

participent à l’activation du promoteur du CD54, via les facteurs de transcription IRE et NF-κB

respectivement (18), la surexpression stable de SOCS1 semble inhiber efficacement l’IRE mais

pas l’NFκB au niveau du promoteur du CD54.

La sécrétion d’IL-8 par les cellules de l’EPR est un autre marqueur de leur activation. L’IL-8 est

chimioattractive pour les neutrophiles et son importance dans les uvéites est illustrée par une

efficacité thérapeutique des anticorps anti-IL-8 dans l’uvéite induite par endotoxine (20). Nous

avons montré que le clone CTRL sécrète l’IL-8 de manière constitutive, ce qui est a déjà été

décrit pour les ARPE (21). En accord avec la littérature, nous avons observé une augmentation

importante des taux d’IL-8 après stimulation par le TNFα, le gène de cette chimiokine étant sous

contrôle de l’NFκB (22). Nos données concernant l’effet inhibiteur de l’IFNγ (seul ou en

combinaison avec le TNFα) sur la sécrétion endogène d’IL-8 s’inscrivent dans notre hypothèse

que cet effet est variable dans différents types cellulaires. En effet, selon le type cellulaire

47

étudié, l’IFNγ peut avoir un effet inhibiteur ou pro-sécrétoire sur l’IL-8 (23, 12). Concernant le

clone SOCS1, la surexpression stable de SOCS1 a un effet sur la sécrétion basale d’IL-8 qui est

moindre. Cependant, lors de la stimulation par TNFα cette sécrétion atteint les mêmes taux que

dans le clone CTRL. L’effet activateur du TNFα de la voie NFκB est donc prédominant sur une

éventuelle inhibition exercée par SOCS1. En opposition avec nos résultats qui indiquent un effet

inhibiteur de l’IFNγ sur la sécrétion d’IL-8, une équipe a montré un effet pro-sécrétoire de SOCS1

sur l’IL-8 dans des kératinocytes, via une activation de la voie Extracellular Signal Regulated

Kinase (ERK) 1/ 2 par SOCS1 (24). Actuellement, nos données ne permettent pas d’expliquer

cette différence. Des investigations complémentaires sur les mécanismes intracellulaires

d’interaction entre SOCS1, ERK, NFκB et la sécrétion d’IL-8 mériteraient d’être réalisées.

La dernière partie de ce travail a consisté en l’étude du rôle de l’IL-22 dans l’activation de l’EPR.

Cette cytokine est sécrétée par les lymphocytes Th 17 (25) et son gène est fortement exprimé

dans les lymphocytes de patients atteints d’uvéite. De plus, l’IL-22 peut interrompre les jonctions

serrées des cellules de l’EPR et induire leur apoptose (26). Nous avons tout d’abord démontré

que l’IL-22Rα1 est exprimé par les ARPE. Des études sur des hépatocytes ont montré que la

transduction du signal intracellulaire de l’IL-22 entraine la phosphorylation des protéines STAT1,

3 et 5 (3). Nos résultats de WB n’ont pas confirmé de tels effets de l’IL-22 sur les ARPE. A notre

connaissance, aucune autre équipe n’a étudié la phosphorylation de STAT après stimulation des

cellules d’EPR par l’IL-22. Dès lors, il est possible que l’IL-22 agisse sur l’EPR via d’autres voies de

signalisation telles que JNK, ERK et p38 (27). Ces voies restent à être explorées dans les ARPE.

Par ailleurs, nous disposons de résultats préliminaires d’ELISA qui indiquent une absence d’effet

de l’IL-22 sur la sécrétion d’IL-8 par les ARPE. Ces résultats sont en accord avec une étude

récente qui a montré que la stimulation des ARPE-19 par de l’IL-22 n’augmente pas leur

sécrétion d’IL-8 (28).

A l’issue de ce travail, nous avons établi que la surexpression stable du gène SOCS1 dans les

cellules d’EPR a un effet inhibiteur sur leur activation par l’IFNγ mais pas par le TNFα.

Afin de conclure à une absence d’effet de SOCS1 sur la voie NFκB empruntée par le TNFα nous

devrions néanmoins effectuer des investigations complémentaires. Nous devrions également

48

compéter notre étude de l’IL-22 en tant qu’activateur potentiel des cellules de l’EPR et explorer

les rôles de l’IL-17, une autre cytokine Th 17 impliquée dans la physiopathologie des uvéites.

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Tableau 1: Tableau récapitulatif des conditions de stimulation pour les différentes expériences de WB

IFNγ/ dose de stimulation (ng/ml)

Figure 1 : Expression de SOCS1 par  les clones cellulaires et effet de  l’IFNγ sur  l’expression de SOCS1 par  les ARPE. Un nombre identique de cellules est cultivé pour chaque condition. Les ARPE sont stimulés pendant 24h par de l’IFNγ à des concentrations croissantes. Les clones ne sont pas stimulés. L’ARNm est extrait par MagNa Pure. La transcription inverse et la PCR sont réalisées en  une  étape  en  utilisant  des  primers  et  sondes  TaqMan  et  l’instrument  LightCycler.    La quantification de SOCS1 est normalisée par la quantité de β actine dont les taux d’expression sont invariants.  Les  résultats  présentés  sont  issues  de  trois  expériences  réalisées  en  triplicat, indépendantes et statistiquement comparées par un test t pour échantillons non‐pairés.

Figure  2  :  Effet  de  la  surexpression  stable  de  SOCS  1  sur  la  transduction  du  signal intracellulaire  induit  par  l’IFNγ. Les  ARPE  et  les  deux  clones  sont  stimulés  par  150ng/mL d’IFNγ pendant 5 ou 30 min. Une quantité identique de protéines pour  chaque  condition est soumise à une  électrophorèse.  Les protéines  sont ensuite  transférées  sur une membrane de nitrocellulose  qui  est  incubée  avec  des  anticorps  spécifiques.  La  lecture  est  réalisée  par l’Odyssey  Infrared  Imaging  System.    Cette  figure  est  représentative  de  deux  expériences indépendantes.

CMH IICD54

Figure 3 : Effet de la surexpression stable de SOCS1 sur l’expression membranaire des molécules CD 54 et CMH II induite par l’IFNγ. Un nombre identique de cellules est cultivépour chaque condition. Les cellules sont stimulées par 150ng/mL d’IFNγ pendant 48h. Elles sont ensuite suspendues dans du PBS‐azide en présence d’anticorps spécifiques conjugués àla  phycoérythine.  L’analyse  est  faite  au  FACSCalibur.  Les  résultats  présentés  sont représentatifs de trois expériences indépendantes et réalisées en duplicat.

Figure  4 : Effet de la surexpression stable de SOCS1 sur la sécrétion d’IL‐8 induite par l’IFNγ.  Un nombre  identique de cellules est cultivé pour chaque condition et stimulé par 150ng/mL d’IFNγpendant  24h.  Le  surnageant  cellulaire  est  analysée  par  une  ELISA  en  sandwich.  Cette  figure  est représentative de trois expériences  indépendantes réalisées en triplicat. Un test t pour échantillons non‐pairés est utilisé pour la comparaison statistique.

Figure  5 :  Effet  de  la  surexpression  stable    de  SOCS1  sur  la  transduction  du  signal intracellulaire  induit par  le TNFα. Les ARPE et  les deux clones sont stimulés par 30ng/mL de TNFα pendant 30 min. Une quantité identique de protéines pour chaque condition est soumise à une  électrophorèse.  Les  protéines  sont  ensuite  transférées  sur  une  membrane  de nitrocellulose  qui  est  incubée  avec  des  anticorps  spécifiques.  La  lecture  est  réalisée  par l’Odyssey Infrared Imaging System.  Cette figure représente une expérience réalisée.

Figure 6 : Effet de  la  surexpression  stable de  SOCS1  sur  l’expression membranaire des molécules CD 54 et CMH  II  induite par  le TNFα. Un nombre  identique de cellules est cultivépour chaque condition. Les cellules sont stimulées par 30ng/mL de TNFα pendant 48h. Elles sont ensuite  suspendues  dans  du  PBS‐azide  en  présence  d’anticorps  spécifiques  conjugués  à la phycoérythine. L’analyse est faite au FACSCalibur. Les résultats présentés sont représentatifs de trois expériences indépendantes et réalisées en duplicat.

Figure  7 : Effet  de  la  surexpression  stable  de  SOCS  1  sur  la  sécrétion  d’IL‐8 induite  par  le  TNFα.  Un  nombre  identique  de  cellules  est  cultivé pour  chaque condition  et  stimulé par  30ng/mL  de  TNFα ou  par  une  combinaison  de  TNFα et  de l’IFNγ, 150ng/mL, pendant 24h. Le surnageant cellulaire est analysée par une ELISA en sandwich. Cette figure est représentative de trois expériences indépendantes réalisées en  triplicat.  Un  test  t  pour  échantillons  non‐pairés  est  utilisé pour  la  comparaison statistique.

Figure  8 : Mise  en  évidence  du  récepteur  à l’Il‐22. Les  ARPE  non‐stimulés  sont utilisées pour cette expérience. Le load control est le Stat1 total. Après incubation avec des anticorps spécifiques, la lecture de la membrane est réalisée par l’Odyssey Infrared Imaging System.  Cette figure représente une expérience réalisée.

Figure 9 : Transduction du signal  intracellulaire  induit par  l’IL‐22. Les ARPE sont stimulés par  100ng/mL  d’IL‐22  avec  ou  sans  ajout  de  150ng/mL  d’IFNγ pendant  5  ou  30  min.  Une quantité identique de protéines pour chaque condition est soumise à une électrophorèse. Les protéines  sont ensuite  transférées  sur une membrane de nitrocellulose qui est  incubée avec des anticorps spécifiques. La lecture est réalisée par  l’Odyssey Infrared Imaging System.   Cette figure est représentative de trois expériences indépendantes.

51

Discussion et perspectives Les uvéites non infectieuses sont considérées actuellement comme une des plus importantes

cause de déficience visuelle dans la population des jeunes adultes. Par ailleurs, jusqu'il y a peu

sa prévalence au sein de la population vieillissante a été grossièrement sous-estimée164. Elles

affectent jusqu'à 115 personnes sur 100 000 dans la population occidentale et un peu moins

d’un quart d’entre elles nécessitent un traitement immunosuppressif systémique65.

Les uvéites non infectieuses sont généralement considérées comme autoimmunes et initiées par

la perte de la tolérance immune aux protéines rétiniennes. Elles sont orchestrées d’une part ,

systémiquement par deux sous populations lymphocytaires dont la signature cytokinique est

l’IFNγ (Th1) et l’IL-17 (Th17) et d’autre part, localement, par l’activation du tissu rétinien.

Néanmoins, la vision systémique actuelle est plus complexe et fait intervenir une activation

pathologique de l’immunité innée, donnant une composante d’auto-inflammation aux uvéites

non infectieuses. En effet, pour générer la maladie, il faut une activation concomitante de

l’immunité innée (auto-inflammation) et la génération d’une réponse lymphocytaire spécifique

dirigée contre des antigènes rétiniens (réponse spécifique à médiation cellulaire). Dans cette

vision plus récente, les uvéites non infectieuses représentent un ensemble hétérogène de

maladies ayant chacune une composante auto-inflammatoire et autoimmune aux proportions

variables. Certaines pathologies font figure d’exception à l’instar du syndrome de Blau où la

seule composante auto-inflammatoire est suffisante pour générer une uvéite clinique165, 166.

Etant donné que l’autoimmunité et l’auto-inflammation empruntent différentes voies

moléculaires, une meilleure compréhension de leurs rôles respectifs dans le développement des

uvéites pourra aider à mieux diagnostiquer les patients et aussi à les traiter plus spécifiquement.

Les syndromes auto-inflammatoires type CAPS (caractérisé par une hypersécrétion de l’IL-1β)

sont à ce titre un bel exemple de traitement spécifique puisque plusieurs cas d’uvéites

s’améliorant spectaculairement suite à un traitement bloquant l’IL-1β ont été décrits17, 167, 168.

En plus de ce volet systémique, de nombreux travaux attestent de l’importance de l’activation

des cellules rétiniennes dans le développement d’uvéites non infectieuses. Loin de jouer un rôle

52

passif durant la maladie, elles vont être stimulées par une série de molécules pro-inflammatoires

et ainsi permettre le recrutement et l’activation de cellules immunocompétentes.

Notre travail de thèse s’inscrit précisément dans ce contexte du rôle de l’activation des cellules

rétiniennes et plus spécifiquement de celles de la barrière hémato-rétinienne dans le

développement d’uvéite non infectieuses. Lors de ce travail, nous avons tout d’abord caractérisé

in vivo, dans deux modèles expérimentaux, l’expression de la molécule d’adhésion VCAM-1 sur

les cellules de la BHR. Nous avons ensuite analysé in vitro, sur les cellules de l’EPR qui forment la

partie externe de la BHR, les effets antagonistes du TNFα sur l’induction des molécules de CMH

de classe II par l’IFNγ. Enfin, nous avons étudié les effets du blocage de l’activation des cellules

rétiniennes par l’IFNγ en surexprimant le gène SOCS1 in vivo et in vitro.

Dans la première partie du travail, nous avons étudié l’expression de VCAM-1 par les cellules de

la BHR lors de l’inflammation intraoculaire. VCAM-1 est une molécule d’adhésion qui facilite

l’extravasation des leucocytes du sang vers les tissus169, 170. Elle a pour ligand une intégrine α4β1

(VLA-4) qui est exprimée sur les leucocytes inflammatoires. L’équipe de John Forrester avait déjà

mis en évidence une induction progressive de VCAM-1, ainsi que d’autres molécules d’adhésion,

lors d’UAE171. Le rôle de VCAM-1 dans la migration intraoculaire de leucocytes avait déjà été

suggéré à l’époque par des études in vitro sur l’EPR172. Néanmoins, jusqu’à présent, on pensait

que VCAM-1 était uniquement exprimé par les cellules endothéliales et l’EPR lors d’UAE. Il

manquait donc une analyse complète de l’expression de cette molécule d’adhésion sur

l’ensemble des types cellulaires de la BHR lors d’UAE, in vivo. Nous avons donc entrepris une

série de marquages afin de caractériser l’expression de VCAM-1 au niveau rétinien dans deux

modèles d’uvéites non infectieuses : UAE classique et par transfert de lymphocytes T

autoréactifs. Nous avons montré que VCAM-1 n’est pas exprimé dans l’œil sain mais est induit

progressivement lors de la maladie et que l’intensité et l’extension de son expression étaient

dépendantes de la sévérité de la maladie. Par ailleurs, nous avons montré que VCAM-1 pouvait

être induit sur l’ensemble des cellules de la BHR.

53

Ces données rejoignent les résultats de plusieurs travaux ayant montré le rôle central de VCAM-

1 dans le développement des pathologies autoimmunes telles que les encéphalites

autoimmunes expérimentales, les colites et les arthrites. Il est important de noter que, en accord

avec nos données, dans l’ensemble de ces modèles, l’expression de VCAM-1 n’est pas limitée

aux cellules endothéliales. Dans l’EAE, par exemple, VCAM-1 est également exprimé par les

astrocytes et les cellules de la microglie173. Par ailleurs, il a aussi été montré que des stimulations

pro-inflammatoires sont capables d’induire l’expression de VCAM-1 à la surface de cellules

rénales, pulmonaires et rétiniennes, in vitro174-176. Ces données expérimentales ont mené au

développement d’anticorps bloquant la liaison de VCAM-1 avec le VLA-4. Un tel anticorps a été

utilisé en clinique dans le traitement de la sclérose en plaque177, 178.

Par contre, il y a curieusement peu de travaux ayant étudié le blocage de l’interaction de VLA-4

avec VCAM-1 lors d’uvéite non infectieuse. Le groupe de Gragoudas a montré, en utilisant un

anticorps monoclonal que ce blocage supprimait le développement d’uvéite induite par injection

d’endotoxine177. Un autre groupe a utilisé un peptide inhibiteur et a ainsi montré une

amélioration significative sur le développement d’UAE dans le modèle B10RIII178. Lors de notre

travail de thèse, nous avons aussi analysé les effets du blocage de cette interaction en utilisant

un anticorps bloquant dans le modèle de transfert adoptif. L’analyse des grades cliniques n’a pas

montré de différence significative entre le groupe traité par l’anticorps bloquant en comparaison

avec celui ayant reçu l’isotype contrôle (annexe 1). Ces résultats suggèrent que d’autres

molécules d’adhésion jouent un rôle important pour le recrutement intraoculaire de cellules

inflammatoires. Cette hypothèse est en accord avec plusieurs travaux qui montrent que le

blocage de l’interaction entre ICAM-1 et LFA-1 diminuait fortement l’incidence et la sévérité

d’UAE179, 180. Ces données suggèrent par ailleurs que l’interaction ICAM-1/LFA-1 joue un rôle

prépondérant par rapport à VCAM-1/VLA-4, ce qui est en partie corroboré par nos analyses de

cytométrie de flux montrant clairement que les cellules inflammatoires expriment bien plus de

LFA-1 que de VLA-4 (annexe 2). Nous n’avons malheureusement pas poussé plus avant cette

analyse de l’expression de molécules d’adhésion sur les cellules inflammatoires et en particulier

sur les lymphocytes T autoréactifs rétine-spécifique. Ce champ d’études est pourtant très

prometteur puisqu’il a été montré récemment, dans un modèle d’EAE, que les lymphocytes

54

autoréactifs Th1 et Th17 utilisent des intégrines différentes pour pénétrer à l’intérieur du

système nerveux181.

Après avoir étudié in vivo l’expression de VCAM-1 par les cellules rétiniennes lors d’UAE nous

nous sommes intéressés à la régulation par le TNFα de l’expression du CMHII induit par l’IFNγ sur

les cellules de l’EPR. L’EPR joue un rôle majeur dans le maintien du statut du privilège immun de

l’œil en formant la barrière hémato-rétinienne externe, et en exprimant des facteurs

immunosuppressifs. Paradoxalement, ces cellules, après stimulation par des cytokines

proinflammatoires, peuvent également activer les lymphocytes autoréactifs et ainsi participer au

développement des uvéites non infectieuses.

Chan CC et son équipe ont les premiers montré l’expression de molécules du CMHII par les

cellules de l’EPR chez les patients atteints d’uvéite93. Par la suite, des travaux in vitro ont

confirmé que l’EPR pouvait exprimer des molécules du CMHII, après stimulation par l’IFNγ94, 182.

Dès lors, d’autres groupes se sont penchés sur la fonctionnalité de cette induction de CMHII par

les cellules de l’EPR. Il est aujourd’hui bien démontré que le niveau d’expression du CMHII sur les

cellules d’EPR par l’IFNγ est dose-dépendante et que lorsque ces cellules expriment un niveau

élevé de molécules du CMHII, elles peuvent servir de cellules présentatrices d’antigène et activer

les lymphocytes T autoréactifs95. A contrario, les cellules qui expriment le CMHII de façon

restreinte transmettent plutôt un signal suppresseur. Le niveau d’expression des molécules du

CMH II pourrait donc jouer un rôle clef dans le développement d’uvéites non infectieuses. Il est

donc important de mieux comprendre les mécanismes qui régulent cette expression. A ce titre,

un élément capital de l’activation des cellules de la BHR lors d’uvéite non infectieuse est le

contexte multi-cytokinique de la stimulation. En effet, durant le processus inflammatoire, l’EPR

va être la cible d’un ensemble de cytokines sécrétées par les cellules inflammatoires. Il serait

donc intéressant d’étudier les effets d’autres cytokines présentes lors de l’inflammation sur

l’induction du CMHII par l’IFNγ au niveau des EPR.

55

Dans ce travail nous avons démontré que le TNFα inhibe l’expression du CMHII induit par l’IFNγ

sur les ARPE par régulation négative du CIITA. Comme l’activation des lymphocytes T par les

cellules de l’EPR dépend de leur niveau d’expression du CMHII, notre étude soutient l’idée que le

TNFα possède des propriétés immunomodulatrices sur l’activation de ces cellules95. L’effet du

TNFα sur l’expression des molécules du CMH II semble tributaire du type cellulaire. En effet,

différents groupes ont montré que le TNFα augmente l’expression du CMHII sur les astrocytes,

alors qu’aucun effet n’a été retrouvé sur les cellules microgliales 183-185. Cet effet additif du TNFα

sur les astrocytes est CIITA indépendant186. Au contraire, Mueller et al ont démontré que le TNFα

inhibe la régulation positive du CMH II sur les cellules myéloïdes par inhibition du CIITA. Le

même groupe a constaté que le CMH II était significativement réduit chez les patients atteints de

polyarthrite rhumatoïde, mais était porté à des niveaux normaux après traitement par de l’anti-

TNFα 187. Ces constatations sont compatibles avec nos données et soulignent clairement le rôle

que joue le TNFα dans la phase de résolution de l’inflammation.

En effet, si en général, le TNFα est considéré comme une cytokine pro-inflammatoire en raison

de son effet stimulateur prononcé sur l’expression d’une variété de molécules pro-

inflammatoires, beaucoup de données ont également montré que le TNFα joue un rôle

important dans la résolution de la réponse immune106, 188. Cette dualité d’effet se retrouve dans

les différents modèles animaux. En effet, si de nombreuses souches de souris surexprimant le

TNFα développent des maladies autoimmunes, un rôle protecteur du TNFα a pu être montré

dans d’autres modèles expérimentaux. Par exemple, d’une part, les souris NOD surexprimant le

TNFα au niveau du pancréas sont protégées du développement du diabète et d’autre part, des

injections répétées de TNFα inhibent le développement du diabète expérimental et de la

néphrite lupique189, 190. De la même manière, les souris TNFα/KO développent une EAE

exacerbée191. Au niveau des uvéites expérimentales, le rôle du TNFα semble aussi dépendre du

modèle. Une étude sur les souris TNFR p55/p75 KO démontre que le TNFα n’est pas essentiel

pour le développement d’UIE192. Par contre, dans le modèle d’UAE, l’expression de la maladie

est incomplète chez les souris TNFR p55 KO193.

56

Ces effets contrastés du TNFα sur le développement de maladies autoimmunes sont reflétés par

certains résultats « paradoxaux » obtenus avec les thérapies anti-TNFα qui améliorent l’état de

la majorité des patients atteints d’arthrite rhumatoïde ou de maladie inflammatoire du tube

digestif. Cependant, certains d’entre eux vont développer un syndrome lupique ou une maladie

neuroinflammatoire194, 195. De la même manière, la maladie des patients atteint de sclérose en

plaque va être exacerbée par les thérapies anti-TNFα196. Les effets immunomodulateurs du

TNFα pourraient aussi en partie expliquer le fait que les thérapies anti-TNF n’améliorent qu’une

partie des patients atteints d’uvéite non infectieuse197, 198 .

Nos deux premiers travaux illustrent l’importance et la complexité de l’activation des cellules

rétiniennes par des cytokines pro-inflammatoires dans le développement d’uvéites. Nous avons

ensuite étudié la possibilité de bloquer le développement de la maladie en inhibant cette

activation par la surexpression d’un gène immunosuppressif SOCS1.

Le transfert de gène immunosuppressif au niveau des cellules rétiniennes représente une

stratégie thérapeutique prometteuse qui permet d’éviter les effets secondaires liés au

traitement immunosuppressif classique. De par sa petite taille, sa structure fermée, sa

transparence et sa facilité d’accès par diverses voies d’injections aux différentes couches

rétiniennes, l’œil semble être un organe unique pour une approche thérapeutique via transfert

de gène. De plus, de nombreuses méthodes d’examen des yeux sont actuellement disponibles

pour surveiller l’efficacité des traitements. Jusqu'à présent, plusieurs groupes ont obtenu des

résultats intéressants en faisant produire (après transfert de gène) par les cellules rétiniennes

des molécules immunosuppressives sécrétées telles que l’IL-10 virale, l’IFNα etc159, 160, 199.

Cependant, cette stratégie n’aide pas à disséquer l’implication spécifique des cellules résidentes

de l’œil dans le développement de l’UAE. En revanche, cibler les voies intracellulaires semble

plus spécifique et pourrait permettre de mieux comprendre les mécanismes de développement

d’UAE.

57

Nous avons donc décidé de surexprimer le gène SOCS1 au niveau rétinien et d’étudier l’effet de

cette surexpression sur le développement de l’UAE. Les choix du virus et du sérotype du virus

ainsi que de la voie d’injection utilisée ont été faits pour transduire un grand nombre de cellules

en traumatisant le moins possible la rétine. Dans un premier temps, en utilisant des AAV2

exprimant l’EGFP, nous avons pu montrer que la technique d’injection sous-rétinienne était plus

traumatique et nous avons donc décidé d’utiliser la voie intra-vitréenne pour injecter des AAV2

contenant le gène SOCS1, dans l’œil droit des souris uniquement. Nous avons vérifié par RT-PCR

quantitative que le gène SOCS1 était bien exprimé dans l’œil après injection du vecteur AAV2-

CAG-SOCS1. Ensuite, nous avons étudié l’effet de la surexpression de SOCS1 sur le

développement d’UAE. L’analyse des grading clinique n’a pas montré de différence significative

entre les yeux injectés par l’AAV2-SOCS1 versus l’AAV2-EGFP contrôle. Afin de normaliser par

rapport à la diversité inter-individuelle de la maladie, nous avons calculé pour chaque souris un

ratio des grades cliniques de l’œil injecté sur l’œil non injecté. L’analyse de la moyenne de ces

ratios montre un effet à la limite de la significativité entre le groupe SOCS1 et le groupe EGFP en

terme de grades cliniques. La différence devient par contre significative lorsque l’analyse de ces

ratios est faite sur les grades histologiques. Une analyse plus détaillée de ces ratios histologiques

montre que l’effet est plus marqué dans les cellules infectées par l’AAV2.

Nos expériences mènent plutôt à la conclusion que l’expression de SOCS1, médié par injection

intravitréenne de l’AAV2 ne protège globalement pas les yeux du développement d’une UAE.

Nos données sont en contradiction avec des travaux montrant un rôle positif de SOCS1 dans le

contrôle de dommages causés aux tissus lors de certaines pathologies autoimmunes. Balabanov

r et al ont ainsi montré que la surexpression locale de SOCS1 protégeait les oligodendrocytes des

effets délétères de l’IFNγ dans un le modèle d’EAE200. De la même manière, il a été démontré,

dans un modèle de fibrose pulmonaire, que la surexpression de SOCS1 obtenue par injection

d’adénovirus, diminuait l’infiltration lymphocytaire, la fibrose et la mortalité201.

L’absence d’effet que nous avons eu dans notre modèle peut avoir plusieurs explications.

Premièrement, l’injection intravitréenne conduit à une infection relativement limitée des

cellules rétiniennes impliquées dans le développement de l’UAE. En effet, nos données sont en

58

accord avec d’autres études qui démontrent que l’injection intravitréenne d’AAV2 cible

principalement les cellules ganglionnaires et moins les cellules qui forment les BHR. Toutefois, la

description récente par Yu R et al, que les souris et rats transgéniques exprimant SOCS1 sous le

contrôle d’un promoteur de l’opsine (spécifique des photorécepteurs) sont protégés du

développement de l’UAE, suggère qu’une absence d’expression par les cellules des BHR, n’est

pas indispensable pour bloquer le développement de l’UAE. Néanmoins, comme souligné plus

haut les cellules exprimant SOCS1 dans le travail de Yu R et al sont les photorécepteurs et non

les cellules ganglionnaires202. Si les deux ne sont pas des cellules de la BHR plusieurs travaux

suggèrent toutefois que les photorécepteurs, en plus de leurs rôles de photoréception et de

transmission du signal pourraient être impliqués directement dans la régulation de

l’inflammation intraoculaire. Cette hypothèse a pour la première fois été avancée par le groupe

de Nussenblatt lorsqu’ils avaient mis en évidence que les photorécepteurs expriment du

GITRL203. Même si nous n’avons pu identifier le type cellulaire impliqué, nos données montrent

également une expression importante de VCAM-1 au niveau de la limitante externe, constituée

en partie des photorécepteurs. L’ensemble de ces données indiquent donc que les

photorécepteurs pourraient être impliqués dans la régulation de la réponse immune

intraoculaire et qu’à ce titre, ils sont peut-être de meilleurs candidats pour une surexpression de

SOCS1. Il a d’ailleurs été montré que la stimulation du récepteur à l’IL-27 à la surface des

photorécepteurs induisait l’expression de SOCS1 et la sécrétion d’IL-10 par ces cellules204.

Cependant, il se pourrait également que le niveau d’expression de la protéine SOCS1 soit trop

faible pour obtenir un effet protecteur ou que la surexpression de SOCS1 affecte uniquement

l’activation des cellules de la rétine par l’IFNγ mais pas par d’autres cytokines telles le TNFα, l’IL-

17, ou l’IL-22 qui jouent aussi un rôle important dans le développement d’UAE. C’est cette

dernière hypothèse que nous avons choisi d’investiguer in vitro dans ce travail de thèse.

Afin d’explorer cette dernière hypothèse, nous avons généré des clones stables d’EPR exprimant

SOCS1 et nous avons étudié l’effet de cette surexpression sur l’activation des cellules par

d’autres cytokines.

59

Dans un premier temps, nous avons validé notre système cellulaire en montrant que l’activation

par l’IFNγ était bien bloquée dans le clone SOCS1 et pas dans le clone contrôle. Cet effet

inhibiteur était attendu et rejoint les données de la littérature en général et du travail séminal

de Federici et al sur des clones de kératinocytes, en particulier205, 206. Nous avons ensuite voulu

explorer les effets de la surexpression de SOCS1 sur l’activation de l’EPR par d’autres cytokines

importantes dans les uvéites non infectieuses. Etant donné son rôle capital à cet égard, nous

avons commencé par étudier le TNFα, et n’avons pas observé d’effet inhibiteur de SOCS1 sur

l’induction d’IL-8 ou de CD54 par cette cytokine. SOCS1 est pourtant induit par le TNFα dans

plusieurs types cellulaires et été démontré comme un régulateur négatif de l’inflammation

induite par le TNFα sur les cellules endothéliales207.

Il a également été démontré que SOCS1 bloque l’activation de la voie JAK-STAT par l’IL-22 dans

les cellules hépatiques208. Comme un rôle potentiel de l’IL-22 dans le développement d’uvéite

non infectieuse a été suggéré, nous avons analysé l’effet de la surexpression de SOCS1 sur

l’activation des cellules de l’EPR par l’IL-22. Comme prérequis, nous avons établi l’expression du

récepteur à l’IL-22 par les cellules de l’EPR, mais nous n’avons pas pu mettre en évidence un

effet de l’IL-22 sur l’EPR. Nos données sont en accord avec celles de Chen Y et al qui ont

également mis le récepteur en évidence, sans toutefois trouver d’effets de la cytokine sur la

production d’autres cytokines ou sur la résistance transépithéliale127. Li Z et al avaient pourtant

montré un effet de l’IL-22 sur la résistance transépithéliale et la mort cellulaire par apoptose124.

Ces différences de résultats entre études pourraient s’expliquer par le fait que dans cette

dernière étude les auteurs ont travaillé sur des cellules d’EPR primaires et que des différences

significatives entre ces dernières et le clone d’ARPE-19 ont été rapportées209.

Récemment, plusieurs travaux sont venus étayer le rôle capital qu’avait l’IL-17 dans le

développement des uvéites non infectieuses. Nous avons donc investigué les effets potentiels de

SOCS1 sur l’activation de l’EPR par l’IL-17. Jusqu'à présent nous avons uniquement pu montrer

que SOCS1 ne bloquait pas l’induction d’IL-8 induite par l’IL-17. Cette absence d’effet peut

s’expliquer dès lors que Chen Y et al ont récemment montré qu’au niveau des ARPE, l’induction

d’IL-8 obtenue après stimulation par l’IL-17 impliquait les voies des MAPK, du NF-κB et d’AKT210.

60

Toutefois Ke et al ont mis en évidence au niveau d’EPR de souris que l’IL-17 induisait l’expression

de SOCS1 qui limitait la production d’IL-6 et augmentait celle de LIF126. Même si nous n’avons

pas retrouvé une induction de SOCS1 par l’IL-17, nous comptons investiguer son effet sur la

production de ces autres cytokines.

Conclusion

L’importance de l’activation des cellules cibles dans le développement des maladies

autoimmunes spécifiques est en train d’émerger. Que ce soit le système nerveux central, le rein

ou l’œil, de nombreux travaux attestent du rôle joué par l’activation des cellules résidentes dans

leur propre destruction. Ce type d’approche s’est pour l’instant surtout limité à une vision

analytique de la physiopathologie et a permis d’améliorer notre compréhension des mécanismes

des maladies autoimmunes tissues spécifiques. En disséquant le rôle de VCAM-1 lors d’uvéite

non infectieuse, ou en analysant la régulation de l’expression des molécules du CMH de classe II

par l’EPR, notre travail de thèse s’inscrit dans cet aspect de l’étude de l’autoimmunité. De plus

en plus de travaux s’appliquent à investiguer cette dimension en bloquant localement l’une ou

l’autre voie d’activation cellulaire. Si cette approche a bien été validée dans des travaux utilisant

des animaux transgéniques, elle reste encore peu développée dans un contexte de transfert de

gène. C’est pourtant de cette manière que pourraient s’ouvrir des perspectives de thérapies

ciblées. Le but de la deuxième partie de notre thèse était très ambitieux puisqu’il visait

précisément à tester la faisabilité du transfert d’un gène codant pour une protéine intracellulaire

bloquant la voie de l’IFNγ. Nous étions donc en marge à la fois des travaux transgéniques (ou

l’expression du transgène est plus facilement contrôlée) et des transferts de gènes codants pour

des protéines immunosuppressives sécrétées qui dominent pour l’instant la littérature. Si, dans

le cadre de notre approche, nous n’avons pas pu démontrer d’effet protecteur global, nous

pensons en avoir compris les raisons et commencer à investiguer les principales pistes. Ainsi

nous espérons surmonter les défis techniques afin de tenter d’atteindre des objectifs plus

thérapeutiques.

Annexe 1: Rôle du VLA-4 dans le recrutement des cellules inflammatoires lors de l’UAE. Des souris C57BL6 ont été immunisés par injection sous-cutanée dans la patte, du peptide immunodominant 1-20 de l’IRBP émulsionné avec du adjuvant complet de Freund et injection intra-péritonéale de PTX. Pour bloquer le VLA-4, les animaux ont reçu 10 mg/kg d’anticorps monoclonal anti-VLA4 par voie intrapéritonéale tous les 2 jours pendant les 21 jours nécessaires au développement de l’inflammation intra-oculaire. Les animaux contrôles ont reçu des quantités égales d’un anticorps IgG1 (clone 15H6). Un fond d’œil est réalisé à j 21 post-injection, sous contrôle microscopique après dilatation des yeux. Un score clinique est attribué à chaque œil selon le système de H Xu et al, 2008. L’expérience à été réalisé deux fois de manière indépendante (8 souris par groupe au total). Chaque point représente le score clinique d’un œil de souris. Il n’ y a pas de différence significative entre les deux groupes.

Supplementary data

Annexe 2: Analyse de l’expression des molécules VLA-4 et LFA-1 par les lymphocytes T autoréactifs impliqués dans le développement de l’UAE. Des souris C57BL6 ont été immunisés par injection sous-cutanée dans la patte, du peptide immunodominant 1-20 de l’IRBP émulsionné avec du adjuvant complet de Freund et injection intra-péritonéale de PTX. Douze jours après l’immunisation, les rates et ganglions de chaque souris sont prélevés et enrichis en LT par passage sur colonne de nylon et enfin restimulé par l’IRBP 48h in vitro. Une analyse par cytométrie de flux à l’aide d’anticorps anti-CD4, anti-VLA4 et anti-LFA1 a été réalisée sur ces cellules.

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RÉSUMÉ Les uvéites non infectieuses sont considérées actuellement comme une des plus importantes cause de déficience visuelle dans la population des jeunes adultes. Les uvéites non infectieuses sont des atteintes inflammatoires de la rétine et de l’uvée et sont généralement considérées comme autoimmunes et initiées par la perte de la tolérance immune aux protéines rétiniennes. Elles sont orchestrées d’une part, systémiquement par deux sous populations lymphocytaires dont la signature cytokinique est l’IFNγ (Th1) et l’IL-17 (Th17) et d’autre part, localement, par l’activation du tissu rétinien. Néanmoins, la vision systémique actuelle est plus complexe et fait intervenir une activation pathologique de l’immunité innée, donnant une composante d’autoinflammation aux uvéites non infectieuses. En plus de ce volet systémique, de nombreux travaux attestent de l’importance de l’activation des cellules rétiniennes dans le développement d’uvéites non infectieuses. Loin de jouer un rôle passif durant la maladie, elles vont être stimulées par une série de molécules pro-inflammatoires et ainsi permettre le recrutement et l’activation de cellules immunocompétentes.

Notre travail de thèse s’inscrit précisément dans ce contexte du rôle de l’activation des cellules rétiniennes et plus spécifiquement de celles de la barrière hémato rétinienne (BHR) dans le développement d’uvéite non infectieuses.

Lors de ce travail, nous avons tout d’abord caractérisé in vivo, dans deux modèles expérimentaux, l’expression de la molécule d’adhésion VCAM-1 (Vascular Adhesion Molecule) sur les cellules de la BHR. VCAM-1 est une molécule d’adhésion qui facilite l’extravasation des leucocytes du sang vers les tissus. Nous avons montré que VCAM-1 n’est pas exprimé dans l’œil sain mais est induit progressivement lors de la maladie et que l’intensité et l’extension de son expression étaient dépendantes de la sévérité de la maladie. Par ailleurs, nous avons montré que VCAM-1 pouvait être induit sur l’ensemble des cellules de la BHR.

Nous avons ensuite analysé in vitro, sur les cellules de l’EPR (Epithélium Pigmentaire Rétinien) qui forment la partie externe de la BHR, les effets antagonistes du TNFα sur l’induction des molécules de CMH de classe II par l’IFNγ. Durant le processus inflammatoire, l’EPR est la cible d’un ensemble de cytokines secrétées par les cellules inflammatoires. Il a été donc intéressant d’étudier les effets d’autres cytokines présentes lors de l’inflammation sur l’induction du CMHII par l’IFNγ au niveau de l’EPR. Nous avons démontré que le TNFα inhibe l’expression du CMH II induit par l’IFNγ sur les ARPE par régulation négative du CIITA (Class II Transactivator). Comme l’activation des lymphocytes T par les cellules de l’EPR dépend de leur niveau d’expression du CMH II, notre étude soutient l’idée que le TNFα possède des propriétés immunomodulatrices sur l’activation de ces cellules, et participe ainsi à la phase de résolution de l’inflammation.

Enfin, nous avons étudié les effets du blocage de l’activation des cellules rétiniennes par l’IFNγ en surexprimant le gène SOCS1 (Suppressor Of Cytokine Signaling) in vivo et in vitro.

Nous avons surexprimé le gène SOCS1 au niveau rétinien et étudier l’effet de cette surexpression sur le développement de l’UAE. L’analyse des grading clinique n’a pas montré de différence

significative entre les yeux injectés par l’AAV2-SOCS1 versus l’AAV2-EGFP contrôle. Afin de normaliser par rapport à la diversité inter-individuelle de la maladie, nous avons calculé pour chaque souris un ratio des grades cliniques de l’œil injecté sur l’œil non-injecté. L’analyse de la moyenne de ces ratios montre un effet à la limite de la significativité entre le groupe SOCS1 et le groupe EGFP en terme de grades cliniques. La différence devient par contre significative lorsque l’analyse de ces ratios est faite sur les grades histologiques. Nos expériences mènent donc plutôt à la conclusion que l’expression de SOCS1, médié par injection intravitréenne de l’AAV2 ne protège globalement pas les yeux du développement d’une UAE.

Cette absence d’effet peut avoir comme explication que l’injection intravitréenne conduit à une infection relativement limitée des cellules rétiniennes impliquées dans le développement de l’UAE. Il se pourrait également que le niveau d’expression de la protéine SOCS1 soit trop faible pour obtenir un effet protecteur ou que la surexpression de SOCS1 affecte uniquement l’activation des cellules de la rétine par l’IFNγ mais pas par d’autres cytokines telles le TNFα, l’IL-17, ou l’IL-22 qui jouent aussi un rôle important dans le développement d’UAE. C’est cette dernière hypothèse que nous avons choisi d’investiguer in vitro. Nos résultats montrent que la surexpression de ce même gène SOCS1 dans les cellules d’EPR a un effet inhibiteur sur leur activation par l’IFNγ mais pas par le TNFα.

Ce travail met tout d’abord en évidence l’importante expression, in vivo, de VCAM1 par les cellules de la BHR lors d’UAE et in vitro les effets antagonistes du TNFα et de l’IFNγ sur la régulation de l’expression de molécules du CMHII à la surface de l’EPR. Nos expériences démontrent que la surexpression du gène SOCS1 après injection intravitréenne du vecteur AAV-CAG-SOCS1 n’a que peu d’effet sur le développement de la maladie. Par ailleurs, la surexpression de ce même gène SOCS1 dans les cellules d’EPR a un effet inhibiteur sur leur activation par l’IFNγ mais pas par le TNFα et l’IL-17.