Embed Size (px)
Citation preview
Université de Sherbrooke
Caractérisation des régions régulatrices du promoteur du gène CYPIIB2 de
hamster
Natha lie Coulombe
Département de Biochimie
Memoire présenté a la Faculté de Médecine
en vue de l'obtention du grade de
Maître ès Science (M. Sc.)
Août 1997
O Nathalie Coulombe, 1997
National Library Bibliathéque nationale du Canada
Acquisitions and Acquisitions et Bibiiographic Services services bibliographiques
395 Wellington Street 395. me Wellingtoti OtiawaON K 1 A W OtiawaON K 1 A W Canada Canada
The author has granted a non- exc1usive licence allowing the National Library of Canada to reproduce, loan, distribute or sell copies of this thesis in microform, paper or electronic formats.
The author retains ownership of the copyright in this thesis. Neither the thesis nor substantial extracts fiom it may be printed or otheMrise reproduced without the author's permission.
L'auteur a accordé une licence non exclusive permettant a la Bibliothèque nationale du Canada de reproduire, prêter, distn'buer ou vendre des copies de cette thèse sous la forme de microfiche/nlm, de reproduction sur papier ou sur format électronique.
L'auteur conserve la propriété du droit d'auteur qui protège cette thèse. Ni la thèse ni des extraits substantiels de celle-ci ne doivent être imprimés ou autrement reproduits sans son autorisation.
À mes parents, il qui je dois tout
TABLE DES MATIÈREs
1- La glande ~ ~ r ~ é n a l ~ ~ - - ~ , . , , ~ . . ~ ~ ~ - ~ ~ ~ - ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ . ~ ~ ~ . ~ - ~ - ~ ~ ~ ~ - 9
1.1 - Morphologie et histologie de la glande surrénale.. ....................................................... ..9
................................................................ 1 -2- Types cellulaires du cortex et de la medulu.. 1 O
2- Stérotdogénèse de la glande sorrénal~~,,,, .mamH-~~OmW0.~..~OHe"HHHmu--~-13
. . ........................................................................................................................ 2.1- fistonque. 13
........................................................... 2.2- Le cholestérol, précurseur de la stéroidogénèse. 1 4
...................................................................... 2.3- Glucocortiw~des et minéraiocorticoides. 1 4
3- Biosynthése de I ' a l d o s t é r o n ~ . , . , , ~ . ~ ~ ~ ~ ~ . ~ ~ ~ ~ ~ ~ . ~ . ~ ~ ~ ~ ~ , ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ l 6
.................................................................................................. 3.1 - Cytochrome P45Oscc.. 1 9
........................................................................... 3 -2- 3 P-Hydroxystéro~de dés hydrogénase.. 1 9
.................................................................................................... 3.3- Cytochrorne P450c2 1. -20
...................................................................................................... 3.4- Cytochrome P450c 11 2 1
.................................................................................................... 3.5- Cytochrome P450c 18. -22
4- Régulation de l'expression du cytochrome P450clSa*,--..,m-w"-m.-uw-o..u..23
............................................................ 4.1- Régulation tramcriptionnelle du gène CYPI IB2 26 ,. * . 5. Résultats prelimmaires ~ ~ o ~ ~ w ~ ~ m ~ e ~ . o o ~ o o w ~ ~ o o H ~ ~ e ~ m ~ w ~ ~ m ~ ~ ~ ~ w o w ~ ~ o e ~ o - a ~ o . H ~ ~ ~ ~ ~ H 1 a w . . w W ~ w ~ ~ O
5.1 - Isolation et séquençage du gène CYPI IB2 de hamster ............... .. ........................... 30
5.2 Footprint ........................................................................................................................... 32
4- Effet de dinerents réguiateurs sur Ikxpression de 19actRrité traaseriptionnelle du
promoteur du g h e CWIIBZ de hamster dans les cellules Y-1-2
4. I- Effet de la forskoiin sur l'expression de I'activitti ~ ~ p t i o m e l l e du promoteur du
gène C P I IB2 de hamster dans les cellules Y-1 ........................ .. ........................ ..S4 Y
4.2- Effet du TPA et de la staurosporine sur l'expression de l'activité tnmcriptiomelle du
................................. promoteur du gène CPZ IB2 de hamster ciam les cellules Y- 1 3 4
DISCUSSION-,m.--------..----,pU----I----------------I---Id-------I----------_$7
LISTE DES ILLUSTRATIONS
FIGURE 1 Localisation de la glande surrénale et zunation du cortex sudnalien ................ 12
FIGURE 2 Voies métaboliques de la steroidogénèse sdnalieme chez l'humain .............. 17
FIGURE 3 Systéme de transport des électrons dans les systèmes de P450 mitochondrial ..................................................................................................... et microsornique 18
FXGURE 4 Le système rénine-angiotensine II et l'homéostasie du sodium ( ~ a 3 .................. 25
.................... FIGURE 5 Carte de restriction du gène C P I I B2 de hamster. .............. ...... 3 1
FIGURE 6 Comparaison de la région promotrice du gène CYPI IB2 de hamster avec celles de souris, rat et humain.. ............................................................................. -43
FIGURE 7 Comparaison de la séquence - 1431- 16 1 pb du gène C W I 1 B2 de hamster et celle de souris, rat et humain .................................................................................. 44
FIGURE 8 Comparaison de l'activité CAT de base entre le vecteur p ~ ~ ~ R - b a s i c et le ................................................................................... vecteur KAT-PolyA-AAP 1 47
. . ................................................................................................... FIGURE 9 Deiétion par PCR 48
FIGURE 10 Constructions plasrnidiques contenant différentes dklétions du promoteur du gène CYPI IB2 de hamster ............................................................................... 49
FIGURE 11 Activité transcriptiomelle b d e obtenue avec les differentes consüuctions ..................................................... du promoteur du gène CYPI I B2 de hamster.. -5 1
FIGURE 12 Effet de différents régulateurs sur l'expression de l'activité transcriptionnelle du promoteur du gène CYPIIB2 de hamster dans les cellules Y4 .................... 53
FIGURE 13 Stimulation par la forskolin de l'activité transcriptiomelle obtenue avec les différentes constructions du promoteur du gène CYP I I B2 de hamster.. ........ .55
FIGURE 14 Effet du TPA et de la staurosponne sur l'activité tmwriptiomelle obtenue avec les différentes wnstructiom du promoteur du gène CWl lB2 de
.......................................................................................... ................... hamster.. .. -56
LISTE DES ABRÉVIATIONS
aa DOC IWH-DOC ACTH ADNc Aldo M c ATP B CYPl lA1 CYP11B1 CYP1 IB2 CYPl7 CYP21A CYP2 1 B dATP DHEA D m 0 E. Coli EDTA FBS K+ LB min ~ a " NADP+ NADPH P4SOl7a P4SOc 1 1 P4SOcl8 P450c2 1 P450scc Sds Tris X-Ga1
acide aminé 1 1 désoxywrtiwstérone I &hydr0xy-ll4ésoxywrtiwst6rone Adr6nocorticotropine Acide désoxyninucl6ique complémentaire Aldostérone Adénosine 3' J7-monophosphate cyclique Adénosine triphosphate Corti CO stérone Gène codant pour le cytochrorne P450scc Gène codant pour le cytochrome P4SOcl1 Gène codant pour le cytochrome P450c 18 Gène codant pour le cyîochrome P450c17 Pseudoghe codant pour le cytochrorne P450c2 1 Gène codant pour le cytochrome P450c21 Acide déoxyadénosine triphosphate Déshydropépiandrostérone Dirnethyle sulfoxide Escherichia coli Ethylenediamine tétraacétate de sodium Sérum de veau foetal Potassium Milieu de Luria-Bertani Minutes Sodium Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate Niwtinamide adénine dinucléotide phosphate, forme réduite Cytochrome P450 17a-hydroxylase Cytochrome P4SO 1 1 p-hydroxylase Cytochrome P450 aldostérone synthase Cytochrome P450 2 1-hydroxylase Cytochrome P450 scission de la chahe latérale du cholestérol Sodium dodécyl sulfate Tris hydroxymethyl aminomethane 5-bromo4chloro-3-indoyw d-galactosidas
SOMMAIRE
Précédemment isolé d'une bibliothèque d'ADN génomique de hamster' le gène codant pour le cytochrome P4SOcl8 ou aldostérone synthase est contenu dans une région de 9045pb' incluant une région S 7 n o n ~ t e (ou promoteur) de 3722pb. Plusieurs éléments ont été identifiés dans le promoteur dont la boîte TATA et les séquences-cis putatives Ad1 ii Ad6 Un nouveau élément-cis putatif a été identifié, par footprint, entre -143pb et -161pb. Des expériences de retardation sur gel ont démontrés que cette séquence est liée spécifiquement par des facteurs venant d'un extrait nucléaire de la zone glomérulée de la surrénale de hamster.
L'activité ûmscriptionnelIe du promoteur du gène CYPIIB2 a été étudiée en ufilisant le gene reporteur chloramphénicol acétylbran~férase (CAT). Dix plasmides contenant différentes déletions du promoteur ont été consmiits avec un vecteur pCAT modifié. Des transfections transitoires de ces constructions dans les celllules Y-1 montrent que l'activité de base la plus élevée du promoteur est obtenue avec la construction contenant jusqu'a -134pb. L'augmentation de la longueur du promoteur à -167pb a diminué l'activité traascriphomelle de 35%' indiquant la présence possible d'un élément-cis inhibiteur dans cette région du gène.
L'expression du gène reporteur de toutes les constructions, sauf celle contenant seulement la bolte TATA, a été stimulée par la forskolin, l'activité la plus élevée a été obtenue avec la construction contenant -134pb. Aucune des constructions n'a &té t é u k par le TPA, mais plutôt légèrement i n h i par celui-ci. Et contrairement au TPA la staurosporine, un inhiiiteu. de la voie du PKC, a stimulé l'expression du gène reporteur.
Dans l'ensemble, les résultats démontrent que la région promotrice du gène CYP11B2 de hamster, transfectée dans les cellules Y-1, est sensible a la fonkolin, indiquant que ce gène est contrôlé par la voie de transduction du PKA Et de façon paradoxaley la staurosporine, mais pas le TPA, stimule l'activité du promoteur du gène CWIIB2, indiquant que la PKC peut, du moins dans les cellules Y-1, agir comme un régulateur négatif sur le promoteur de l'aldostérone synthase. De plus, il a été démontré qu'un nouveau élément&, situé entre - 143pb et -16 1, a un effet négatif sur l'activité de base, de même que sur celle stimulk, du promoteur du gene CYPI IB2.
INTRODUCTION
1- LA GLANDE S-NU
De toute les glandes endocrines, les glandes sUTTénales sont a bien des 6gards les plus
intéressantes. Elles produisent une variété remarquable d'hormones, dont certaines ayant des
structures très complexes, différant sedement par des caractéristiques stéréochuniques
"mineures", mais qui varient diin effet sur la pression sanguine au contrôle du métabolisme
intermédiiaire. La glande surrénale doit produire la quantité appropriée d'hormones, de façon
précise et rapide, ceci étant sous un processus de contrôle qui implique des mécanismes
locaux, centraux et périphériques. Des a b e d o n s relativement mineures produisent des
désordres physiques majeurs (discuté plus loin). En général, la fonction des glandes
surrénales est de protéger l'organisme contre les agressions (stress) aigu& et chroniques, ce
concept a étd popularisé par Water Canon en 1929 comme la réponse "fight-or-flight" de la
medulla et par Hans Selye en 1936 comme la "réaction d'alarme" du c o r n
1.1- MorphoIopie et histologie de la glande surrénale
L'organisme possède deux glandes surrénales, chacune étant en contact étroit avec le
pôle supérieur des reins. Ces glandes endocrines sont parmi les organes les plus richement
vascularisés de l'organisme et sécrètent directement les hormones dans le sang La fome des
glandes droite et gauche differe légèrement dûe à leurs relations avec les structures
anatomiques avoisinantes. Une épaisse couche interne de tissu conjonctif adipeux et une
mince capsule externe de tissu fibreux recowrent la glande.
Chacune des glandes surrédes est divisée en deux parties bien distinctes. La
corticosurrénale (ou cortex) , extérieure, qui constitue la plus grande partie de la piande, et de
la rnédullosuirénale (ou medulia), la portion interne de la glande. La zone externe de la
corticosurdnde est enveloppée d'une capsuie de tissu conjonctif
1.2- Tvpes cellulaires du cortex et de la nzaidla
Le cortex srnénalien est divisé en trois zones biochllniquement et
morphologiquement distinctes, quoique plutôt mal défiaies, chacune étant dotée dim
agencement cellulaire différent et sécrétant des groupes différents d'hormones stéroiidiemes
(figure 1) (White PC. et al. 1987). La zone glomédée, la plus externe et la plus étroite
(environ 15% du volume cortical), est siîuée immédiatement sous la capsuie de tissu
conjonctif Elle est composée de cellules disposées en amas ovoïdes. Cette zone est
responsable de la synthèse et de la sécrétion des minéralocorticoïdes, dont le principal est
l'aldostérone. La zone fasciculée, la plus large, où les cellules sont disposées en de longs
cordons étroits, synthétise les glucocortiwïdes, le p ~ c i p a l étant le cortisol chez l'homme et
à un moindre degré, des androgènes- La zone réticuiée, au contact de la rnedulla, contient des
cordons de cellules qui se ramifient Librement et sécrète seulement les androgènes. La
biosynthèse de ces hormones stéroïdiennes passe par une série d'intermédiaires, dont le
précurseur est le cholestérol (discuté plus loin).
La m&la comprend les cellules c h r o m e s , qui entoutent des sinus contenant du
sang Les deux principales hormones synthétisées par la medulu sont l'adrémhe et la
noradrénaine, elles sont sympathomimétiques (produisent des effets qui imitent ceux du
système sympatique). Dans une large mesure, elles sont à l'origine de la réaction d'alarme, et
tout comme les @u~ocorticoides du cortex. ces homme aident i'organisme à combattre le
stress. Toutefois, contrairement aux hormones du cortex, elles ne sont pas essentielles au
maintien de ta vie.
Right S
Right R
tnferior
Cor tex
Cor ter
Medullc
Left
Abdomina
C ~ n « i t v e rissrrt capsule
Zono glomcrukro
Zono f osciculcita
,
Kidney
I A o r t a
Zono ' ret~culcirw
FIGURE 1: a) Localisation de la glande surrénale b) Zonation du cortex surrcinaliçn. (Hadey Mac E. ( 1988) . Endocrinology. 2"d edition. Prentice-Hall)
t STÉROIWCENÈSE DE LA GLANDE SURRÉNALE
2.1 -Historiaue
Le terme stéroïde a été proposé en 1936 par Callow et Young pour toutes les
substances comportant la structure caractéristique ~yclopentenophénanthrène~ et son origine
provient du terne "choleste~e" (pour solide de la bile). En fait, le premier st6rofde
découvert fut Ie cholestérol en 2763, dans des calculs biliaires. Par la suite, la stnicture de
l'oestrone a été élucidée en 1932, suivie de d e de la progestérone en 1934, de la
testostérone en 1935 et de l'aldostérone en 1953. A ce jour, plus d'une trentaine de stéroïdes
ont été identifiés dans plusieurs tissus stéroïdogéniques, ce qui a été d'une grande Unportauce
pour le développement de l'endocrinologie.
La majorité des hormones stéroidiennes sont synthétisées par les glandes surrénales.
Les symptômes cliniques associés à une réduction de sécrétion de ces hormones sont WMUS
depuis très longtemps, en fait bien avant que le concept des homones soit développé. En
1855, Addison décrivit l'insuffisance surrénalienne chronique, puis en 1856 Brown-Séquard
montra la conséquence fataie de la suffénalectornie. Aujourd'hui il est bien connu que les
hormones stéroidiennes jouent un rôle de premier plan dans plusieurs mécanismes
physiologiques tels que le développement lors de I'embryogénèse, la croissance de
l'organisme, la giuconéogénèse, lliornéostasie de la balance sodique-potassique, la régulation
de la pression artérielle, la résistance au stress, etc ...
Ainsi, il est assez évident que les conséquences sont dévastatrices sur i'organisme
pour plusieurs maladies d'origine héréditaire associées a des dérèglements hormonaux de la
surrénale, comme les syndrômes d'Addison et de Corn ou encore les hyperplasies
cong6nitales. Cest pourquoi l'étude des f'acteurs modulant le contrôle de la formation des
hormones surrénaiiennes s'avère de première importance.
2.2- Le cholestérol, précurseur de la stéro'idoeénèse
Comme dit précédemment, les suéroïdes du cortex d n a l i e n originent tous d'un
précurseur commun, le cholestérol (Cm 1. 1961, Shelton JK et ai. 1970). Celui-ci est basé
sur un noyau cyclopentènophé~liinthrène, et ainsi consiste en un noyau de trois cycles a six
carbones (A, B, C) et diin cycle à cinq carbones @) fusionds dans une configuration tram
pour donner une structure presque plane et une chaîne latérale hydrophobe.
Il y a trois sources majeures de cholestérol pour la glande surrénale. 11 peut être
synthétisé de novo à partir de l'acétyl CoA (Balasubfamaniarn S. et al. 1977), il peut
également provenir des lipoprotéines plasmatiques (LDL ch= I'humain) qui interagissent
avec des récepteurs spécifiques à la surface des cellules sum5naiiennes pour provoquer
l'entrée massive de cholestérol, ceci &nt en fkit la source la plus importante pour la surrénale
(Brown MS. et a[. 1979). La troisième source est dérivée du cholestérol estérifié emmagasiné
dans les vésicules lipidiques intracellulaires, il y a hydrolyse des esters par le cholestérol ester
hydrolase pour donner du cholestérol libre CBalasubratnaniam S. et al. 1977).
Les rôles biologiques des g l u ~ ~ ~ ~ r t i w ï d e s et des mùléraIocorticoides ditfrent
considérablement, de même que leur contrôle de synthèse et de sécrétion. La synthèse et la
sécretion des giucocortico~de~ sont contrôlées par une hormone d'origine hypophysaire,
l'adrénocortïcotropine (ACTH), *uidis que le système rénine-angiotensine contrôle la
sécrétion des minéralocorticoïdes.
Les glu~ocorticoides sont liés au métabolisme normal et & la résistance au stress. Au
point de vue biologique, le cortisol est le plus actif chez Ilium- la corticusthne chez le
rat.
Les rôles biologiques des mineralocorticotdes, dont la désoxycorticostén,ne @OC),
la lû-hydroxy4ésoxycorticost~rone (IWH-DûC), et surtout l'aidostérone sont les plus
actifs, sont au niveau de i'équilibre homéostatique des électrolytes, notamment en ce qui
concerne les concentrations en sodium et en potassium. L'aldostérone, qui possède 95% de
Itactivité rninéralocorticoide, agit sur les cellules des tubules réna- augmente leur
réabsorption en sodium et diminue celle en potassium. Ainsi les minéralocortiwïdes sont
directement impliqués dans la régulation du volume sanguin et de la pression artenelle. Par
conséquent, les cas pathologiques associés à une surproduction d'aldostérone sont
caractérisks par des problèmes d'oedème et d'hypertension grave. A l'opposé, les cas de
déficiences en aldostérone mènent à une perte en sodium et à une rétention en potassium de
l'organisme.
3- Biosynthèse de I'aldOSférone
La majorité des enzymes impliqués dans la stérofdogenèse font partie de la grande
famille des cytochromes P450 (figure 2) (Nebert DW. et G o d e s FJ. 1987). Cette nimille
désigne une catégorie d'hydroxylases ayant un hème comme groupe prosthétique et dont le
maximum Babsorbance passe de 420nm à 450nm lorsque la protéine est réduite et
complexée avec le monoxyde de carbone.
Lm cytochromes P450s catalysent une monooxygénation à une position spécifique
sur le stéroïde où plusieurs monooxygénations résuitent en un bris d'un lien CC, ou en une
aromatisation du stéroïde. La réaction implique une réduction de l'oxygène (O2) par une paire
d'électrons provenant du NADPH et un m f e r t d'un atome d'oxygène au substrat
(Hanukogiu L 1992), soit
R-H + Ot + NADPH + E-l? 9 R-OH + HzO + NADP
Des protéines porteuses spécifiques sont impliquées dans le transport des électrons du
NADPH au cytochrorne P450. Au niveau de la mitochondrie le transport d'électrons se fiit
par deux protéines, I'adrénodoxine réductase qui est une flavoprotéine et I'adrénodoxine une
protéine fer-souk (figure 3). Par contre dans le réticulum endoplasmique, le transport
d'électrons se fait par une seule protéine, le cytochrorne P450 réductase qui est une
flavoprotéine possédant le FMN comme cohcteur, lequel joue un rôle similaire à
l'adrénodoxine dans la mitochondrie (figure 3) (Hanukoglu L 1992).
Adr- reductase Adre nodoxin P450
membrane mitochondriale interne
membrane du réticulum endoplasmique
FIGURE 3: Système de transport des électrons dans les systèmes de P450 rnitochondriai et microsornique. Les enzymes du système mitochondnal font face à la matrice. L a enzymes du système microsoma1 font face au cy?osol. Les dew systèmes sont ancrés a la membrane par le domaine N-terminal hydrophobique. ( Hanukoglu 1. 1992)
Le cytochrome P450scc est présent dans les trois zones du cortex d n a l i e n et il est
situé dans la membrane interne de la mitochondrie. Cet enzyme catalyse l'étape limitante de
la biosynthèse des homones stéroïdiennes (Stone D. et al. 1955), soit la conversion du
cholestérol en prégnénolone. Ceci implique trois réactions successives la 2ûa-hydroxyiation,
la 22-hydroxylation et la scission de la chaîne latérale du cholestérol entre les atomes de
carbone 20 et 22.
Les déficiences génétiques reliées au P45Oscc sont rares, mais résultent en une
absence complète d'hormones stéroidiennes menant directement à une mofl prématurée
(néonataie) (HaufFa BP et al. 1985). Queiques cas ont été rapportés dans la littérature, et il
semble qu'une thérapie, débutée très tôt, aux giucocorticoïdes et aux minéralocorticuides,
peut mener a une physiologie relativement normale chez ces individus (Hauffa BP et al.
is8S).
3.2- 3bhvdroxvstéroîde déshydr0~1,énase
Dans la voie de biosynthèse de l'aldostérone, la prégnholone formée par le P450scc
est par la suite convertie en progestérone par le 3~hydroxystéroïde déshydrogdnase (3B-
HSD), au niveau du reticulum endoplasmique. Cet enzyme possède deux activités
catalytiques majeures, soit une déshydrogénation en position 38 et une isomérisation en
position 4 et 5 (Hanukogiu 1. 1992). Il utilise le NADH comme accepteur d'électrons. Le 3P
HSD est situé à ua carrefour dans la stéroïdogénèse puisqu'il pemet différentes voies de
synthèse des déroides (figure 2).
C'est pourquoi une déficience du 3p31SD, qui affecte la synthèse des
glucocorticoides, des minéralocorticoïdes et des homones semelles, est fatale pour les
nouveaux-nk L'anomalie génétique responsable de la déficience en 3f3-HSD est la 2&
hyperplasie congénitale surrénalieme en importance chez les nouveau-nés (Heinch VE. et
al. 1993).
Le cytochrome P450c21 est exprimé dans tes trois zones du cortex sirnénalien et
catalyse une étape essentielle dans la synthèse des glucocorticoides et des
minéralocortiwides (figure 2) (Sasano H et al. 1988). Il est situé dans le réticulum
endoplasmique et possède une activité 2Lhydroxylase nécessaire pour la conversion de la
progestérone en désoxycortiffistérone (DE). En plus du cortex sunénalien, des
cytochromes P450 ayant une activité 2 1-hydroxylase ont été retrouvés dans le foie (Tuckey
RH et al. 1985).
Une déficience de P450c21 conduit la biosynthèse des stéroïdes dans la voie de
production des androgènes. Ceci résulte en une déficience en glucocortiwïdes et en
minéralocortico~des et en une virilisation (White PC. et New MI. 1992). Plus de 90% des cas
d'hyperplasies congénitales surréaaliennes sont dues à une déficience de l'activité du
P450c21 affligeant ewiron un nouveau-nt5 sur 5000 (White K. et New MI. 1992).
Le cytochmme P45Ocll est situé au niveau de la mitochondrie et est exprimé
uniquement dans la zone fasciculée-réticulée du cortex suminalien (Okarnoto M. et Nonaka
Y. 1992), région spécialisée dans la production des glucocorticoides. il possède 3 activités
catalytiques soit la 1 1 p-hydro~lase, la 1 û-hydroxylase et la 19-hydroxyiase (Shinita Y. et ai.
1992). Le P450cll est donc responsable de la conversion de la désoxycorticosterone en
corticostérone ou I &OH-DOC ou 19-OH-M3C et du désorcycortisol en cortisoI.
Quelques particularitb se présentent chez le boeuf où le P450c11 possède également
l'activité de 18-oxydation permettant la formation de l'aldostérone à partu de la 1WH-
cortïcostérone. Ce P450c11 est exprimé dans les trois zones du cortex, mais l'aldostérone est
formée seulement dans la zone gloméntlée (White PC. et al. 1994).
Les symptômes associés à une déficience en 1 1 P-hydroxylase incluent l'hypertension
et une virilisation. L'hypertension, le seul symptôme clinique distinguant entre une déficience
en 1 1 p-hydroxylase ou en 2 1-hydroxylase est causée par des aiveaux élevés de MX (R&sler
A. 1992).
Les cellules de la zone glomédée sont les seules de l'organisme à exprimer le
P450c18 ou aldostérone synthase (Mitani F. et al. 1995). En plus de posséder les mêmes
activités catalytiques que le P450cl1, l'aldostérone synthase, situé au niveau de la
mitochondrie, convertit la Iû-ûH-wrticostérone en aldostérone grâce à son activité 1%
oxydase.
Le P450c 18 est considéré comme I'isoenzyme du P450c 1 1 car ils ont une homologie
très élevée au niveau de la séquence d'acides nucléiques et au niveau de la séquence en
acides aminés (95% et 90% respectivement chez l'humain). Le P450c18 a été le dernier P450
stéroidogénique à être caractérisé, il a été pininé seulement en 1989 ct le gène a été
caractérisé quelques années plus tard (Ogishima T. et al. 1989).
4- Rhlation de I'ex~ression du cytochmme P45ûc18
La régulation de la sécrétion d'aidostérone est un processus complexe, il semble qu'if,
y ait plusieurs mécanismes en jeu L'adrénocorticotropine ou ACîH est un peptide
hypophysaire dérive du précurseur POMC (prmpiomelan0cortin)- L ' A m ne joue qu'un
rôle mineur dans la sécrétion de l'aldostérone, comparativement a son action majeure sur la
production des glucocorticofdes dans la zone fâscicdée-réticulée. L'ACTH agit via le
récepteur ACTH situé dans la membrane des cellules du cortex surrénalien qui, couplé à
I'adénylate cyclase, provoque la formation de IYAMPcC Il semble égaiement que I'ACTH suit
responsable de la régulation à long terne de la stéroidogénèse ( h s JL. et al. 1973,
Brownie AC. et al. 1973).
Le système rénine-angiotensine est un des facteurs majeurs qui contrôle le volume
sanguin et la pression artérielle en maintenant I'homéustasie des ions ~ a + et K+ dans la
circulation Une réduction du volume sanguin causée par une déshydratation, une cafence en
sodium ou une hémorragie, entraîne me chute de la pression artérielle. Lliypoteasion stimule
certaines cellules rénales, les cellules jwaaglomédaires, qui stimulent dans le sang la rénine
qui transforme I'angiotensinogène, une protéine plasmatique produite par le foie, en
angiotensine i, qui est ensuite convertie en angiotensine II par I'enqme de conversion de
l'angiotensine 1. L'angiotensine II stimule la zone gIornéruIée qui produit une plus grande
quantité d'aldostérone (figure 4) (Aguilera G. et Catt KJ 1978, Tarjan E. et al. 1980).
L'aldostérone entraine une augmentation de la réabsorption du sodium et de l'eau, qui résulte
en une augmentation du volume liquide extracellulaire, et rarnène la pression artérielle a la
normale. Comme l'angiotensine II est un vasoconsbicteur puissant, ce processus hvorise
également l'élévation de la pression artérielle. Aussi le système rénine-angiotensine peut lui-
même être modifié par plusieurs t'acteurs incluant le potassium, le sydme nerveux
adrénergique, etc..
Le maintien d'un taux redit en sodium dans la diète stimule la production
d'aldostérone par l'augmentation préférentielle des activités enzymatiques du P450scc et du
P45011f3 (Aguilera G. et Catt KI. 1983, Muller J. et d 1989). La diminution en sodium
stimule la séaétion de rénine et la formation d'AD dans le plasnia De plus, cette réponse à la
restriction en ~ a + est caractérisée par une augmentation du nombre de récepteurs
d'angiotensine II de la surrénale @ouglas J. et Caît Ki. 1976, Aguilera et al. 1978). Cette
augmentation est spécifique aux cellules gloménilées comparativement aux cellules
fwiculées-réticulées qui possèdent trés peu de récepteur d'angiotemsine II, ce qui delimite
I'action de I'angiotensine [I exclusivement aux celldes produisant l'aldostérone (Douglas J.
et al. 1978). Malgr6 que l'angiotensine II stimule rapidement la sécrétion d'aldostérone par la
zone glomérulée du cortex de la sudnale, une stimulation prolongée à I'angiotensine II (ou à
des agonistes de la voie de transduction du PKC) réprime la steroidog&nèse (Enyedi P. et al.
1985, Cozza EN. et Vila M X . 1990).
Parmi les facteurs qui inhibent la sécrétion de l'aldostérone il y a la dopamine, la
somatosîatine, et I'ANF (aîrial natriuretic fiictor). L'ANF est un puissant diurétique qui peut,
entre autre, abaisser la tension artérielle.
/ Da'1]\ [~o+l ]
Aldosterone 1 / Blood Blood
Aldosterone 1
/ pressure 1 pressure t
Zona X 1 zona
glomeruiosa 1 glomerulosa 1
\ JG1 J G t Angiotensin I Angiotensin 1 \ Renin 1 Renin 1
F1GCR.E 4: Le système rénine-angiotensine II et l'homéostasie du sodium ( ~ a ' ) . Les flèches indiquent une augmentation (T) ou une diminution (&) au niveau du facteur indiqué. (Hadley Mac E. (1988) . Endocrinology. tRl edition. Prentice-Hall)
Plusieurs évidences suggérent que 1'AMPc est Le médiateur principal dans l'induction
hormonale des enzymes stérofdogéniques dans les cellules de la slirréoale (Omura T. et
Morohashi K 1995). Ainsi de nombreuses analyses des promoteurs des @es P450
stéroldogéniques ont été e f f i i é e s au cours des deraières années afin d'élucider les
mécanismes d'expression tissu-spécinque de ces gènes et de ceux régulés par I'AMPc.
Un élément répondant à I'AMPc a été identifié dans la région promoirice de chaque
gène P450 (Wateftnan MR et al. 1992). Divers éléments& putatio; ont également été
démontrés comme étant impliqués dans l'expression tissu-spécifique des gènes P450
stéroidogéniques et plusieurs kcteurs de transcnption ont été identifiés. Ii y a six élémentocis
putatifs très conservés dans les g&nes CYPllBI et ClTlIl32 panni les espèces, soit Adl,
Ad.2, Ad3, Ad4, Ad5 et Ad6. L'élément Ad1 (TGACGTGA) un élément s'apparentant au
CRE (TGACGTCA), contribue non seulement a la régulation de l'expression des ghes par
1'AMPc mais aussi à l'expression basale de ces gènes (Morohashi K et Omura T. 1990).
Malgré que la présence d'Ad2 semble nécessaire pour la transcription in vitm du gène
CYPIlB bovin, la fonction de cet élément in vivo et les facteurs s'y liant ne sont pas
clairement déterminés. Il a été montré par contre que les éléments Adl et Ad2 sont
nécessaires pour la transcription in vitro du gène CYPIIB de bovin en présence d'extrait
nucléaire de cortex surninalien (Morohashi K et Omura T. 1990). Des expériences de
retardation sur gel ont montré que 3 facteurs du cortex surrénalien de bovin se lient à la
région contenant Ad1 et Ad2 du gène W I I B de bovin, deux fàcteurs semblent se lier à
Ad2 et un à Ad1 (Morohashi K et ûmura T. 1990).
La présence des éléments Ad3 et A& est requise pour une induction complète par
I'AMPc de l'activité transcnptiomelle du gène CYPI IB de bovin (Morobashi K et Ornura T.
1990,Waterman MR et al. 1992, Takayama K et al. 1994). Il a également été démontré chez
le bovin que les éléments Ad1 et Ad2 sont nécessaires pour que les éléments Ad3 et Ad4
expriment leur fonction (HaShimoto T. et al. 1992). Les éléments Ad5 et Ad6 ne sont pas très
caractérisés. Cependant, il semble qu'ils ne contri'buent pas à l'induction par I'AMPc
(Morohashi K. et Omura T. 1990).
La régulation tmnscriptioanelle est d'abord effituée par des facteurs agissant en
%ans" (i-e. facteurs de transcription), qui interagissent avec des élémentscis situés
généralement en 5' des gènes. Certains fàcteurs CREBs (CAMP Responsive Elernent Binding
protein) se lient à i'élément Adl. Toutefois l'élément palindromique CRI3 exprime une plus
grande activité transcriptionnelle que Adl, in vitro et in vivo (Hashimoto T. et al. 1992). Le
facteur CREB a été le premier d'un groupe de facteurs de transcription ou la liaison au site
palindromique CRE a été démontde (Hoeffer et oL, 1988, Gonzalez et al. 1989). On se réfere
souvent a ce groupe comme étant la faaiille de b e u r de transcription CREB, lequel inclut
CREB, CRE-BPI, CRE-BP2, et plusieurs protéines ATF (Habener JF 1990). Les protéines
CREB/ATF partagent un motif de structure commun, qui consiste en un domaine riche en
leucine (leucine zipper), leur permettant de s'associer en h è r e . Il y a une région basique
adjacente à ce domaine riche m leucine, ces deux régions jouent un rôle dars la liaison à
l'ADN @warrlo VJ et al. 1990, Hai T et al. 1989, Yun Y et ai* 1990).
11 semble que la moitié du site CRE, TGACG ou CGTCA, est la séquence minimum
requise pour l'activation de la transcription him moto T et al. 1992, Ym Y et ai. 1990).
Aussi les membres de la famille CREB fonnent des homodimères et des hktérodimères grâce
aux interactions impliquant le domaine riche en leucine (Hai T et al. 1989, Yun Y et al. 1990,
Kara CJ et 1990). Ce domaine est aussi présent chez d'autres facteurs de ûanscription,
dont les membres du groupe AP-1 (Jun et Fos) (Sassone-Corsi et aL 1988, Landschulz WH
et al. 1988, Koinandes T et aL 1988), et daas certains cas, des membres du groupe J d o s
forment des hétérodimères avec le groupe CREB/ATF (Kara CI et uL 1990, Iw&v LB et
al. 1990, Benbrook DM et al. 1990). Des variations dans la séquence du site CRE ne
semblent pas affecter la liaison de toutes les protéines CREB/ATF de fàçon équivalente (Kani
CJ et 01. 1990, Ivashkiv LB et 01. 19901, suggérant que les variations de la séquence CRE
peuvent jouer un rôle au niveau de la spécificité de certains membres de ce groupe.
Égalemen& les CREBs ne sont pas tous ubiquitaires (Kara CJ et al. 1990), et ainsi
l'expression tissu-spécifique de ces protéines peut déterminer la régulation de certains gènes.
Parmi les facteurs de franmïption proposés, Ad4BP (Ad4 Binding Rotein) semble
être d'une importance particulière, non seulement pour I'expression des enzymes
stéroldogéniques, mais a w i pour le développement et la différentiation des tissus
stéroïdogéniques (Wateman MR. et al. 1992). En effet, au corn d'expériences de retardation
sur gel, Ad4BP a été détecté seulement dans les extraits nucléaires provenant de tissus
stémïdoginiques ('orohashi K. a al. 1992). Également 1'ARNm de Ad4BP a été dktecté
dans tous les tissus stéroidogéniques, par RT-PCR (Honda S. et al. 1993). L'expression de
I'ARNm de Ad4BP a également été détectée dans le cerveau (Honda S. et al. 1993), ce qui
supporte 170bServafion de l'expression du gène CYPI l A ck rat dans le cemeau, malgré que le
type cellulaire du cemeau exprimant Ad4BP reste a clanner . La présence de site de liaison
de Ad4BP dans la région promotrice de tous Ies P450 stéroidogéuiques (CPIIA. CWIIBI.
CIiPIIB2, CP2I. C P I 7 et CP19) a été conhnée en utilisant Ad4BP purifié du cortex
surrénalien de bovin @forohashi K et ol. 1992, iaia et d. 1992). L'analyse de la séquence de
l'ADNc de Ad4BP de bovin a montré que cette protéine possède un domaine "zinc finger"
(Honda S. et al. 1993) lequel est une stnichae commune aux membres de la super-famille des
récepteun stéroidiens et thyroïdiens (Honda S. et al. 1993, Evans RM 1988). Des
comparaisons structurales de Ad4BP avec d'autres protéines possédant un domaine "zinc
fingef' ont démontré une grande homologie avec le fàcteur FE-F1 de la drosophile, lequel
contrôle le gènefurhi tmaz au cours du début de l'embryogénèse (Lavorgna G. et al. 1991)
et avec le facteur homologue chez l'humain, ELP (Tsukiyama T. et al. 1992).
5. Résultats préiiminaires
5.1 IsoIation et séauencage du &ne CYPI I S L de hamster
Le gène CYPIIB2 & hamster a été obtenu par Andrée Lefebvre avant que je débute
ce projet de recherche. En utilisant le cDNA du P450c18 comme sonde pour cribler une
bibliothèque d'ADN génoaiique de hamster, 23 clones incomplets du côté 3' ont été obtenus,
lesquels avaient la même mrte de restriction Le &té 3' du gène CPIIB2 de hamster a été
obtenu par Steeve Véronneau avec une approche par P a en utilisant une amorce située du
côté 3' du cDNA du P45Oc 18.
Le &ne CYPIIB2 de hamster obtenu et séquencé est contenu dans une région de
9045pb, incluant 9 exons, 8 inirons et une région 5' noncodante de 3722pb. La figure 5
montre une représentation schématique de la carte de restriction du gène CYPIIB2 de
hamster.
5.2 FootDrint
Une étude de liaison de trans-activatetu d'extmit nucléaire de la m e gloméruiée de
La surrénale de hamster, sur la région promoîrice du gène CYPIIB2, a été effectuée par
An& Lefebvre. Des séquences protégées de la digestion a la DNase 1 ont été observées
dans les régions de la boîte TATA, Adl, Adî, Ad3, Ad4, Ad5 et Ad6. Une protection a
égaiement été obseïvée pour fa région entre -143pb et -16 1pb. Cette région est aussi protégée
par un extrait nucléaire de la zone giomérulée de surrénales de bovin. La spécificité des
facteurs liant la région -143/-161pb a été démontrée en incubant un excès d'oligonucléotide
double brin correspondant à la séquence -143/-161pb de celie d'Adl, lors de l'analyse de
fwtprint- Seulement l'oligonucléotide -143/-161pb a h i r é la protection à la DNase L
MATÉRIELS ET MÉTHODES
1. Préparation des plasmides
1.1 Maxi préparation par lyse alcaiïne
L'ADN utilisé pour faire les différentes constructions plasmidiques et pour le
séquençage a été préparé selon le protocole décrit dans Maniatis, T. et al en 1989 p.1,38 A
1,39. L'ADN obtenu est par la suite purifié par une précipitation au polyéthylène glycoI selon
le protocole également décrit dans Maniatis, T. et al en 1989 p. 1-40 et 1,41.
1.2 Maxi préparation par Qiaeen-ti~ 500
L'ADN utilisé pour les transfecfior~~ de cellules Y-1 a été préparé selon le protocole
de Qiagen , pour les Qiagen-tips 500, qui permet d'obtenir de l'ADN dont la forme
majoritaire est supercoi1 et très pur.
1.3 Minipré~aration par lyse alcaline
L'ADN est extrait de 1,Sml de culture bactérienne dans du LB agit6 a 37'C pendant
16 heures. 11 est préparé selon une modification du protocole décrit dans Maniatis, T. et al en
1989 p. 125-128. La culture bactérienne est centrifugée L minute à 14000 rpm à 4°C. Le
culot est resuspendu dans 100~1 de solution I contenant 5ûm.M de glucose, 25mM de Tris-Cl
pH 8.0 et lOmM d7EDTA, et incubé 5 minutes à la température de la pièce. Par la suite 200~1
de la solution II, contenant 0.2N de NaOH, 1% de SDS, sont ajoutés et mélangés par
inversion du tube. Après une incubation de 5 minutes à la température de la pièce, 150~1 de
la solution IiI, contenant 3M d'acétate de potassium pH5.5, sont ajoutés et mélangés par
inversion du tube. Suite à une incubation de 5 minutes sur la glace, le mélange est centrifugé
5 minutes à 14000 rpn à 4T. Un volume de phénol-chloroforme-alcool isoarnyl (2524:L)
est mélange au sunageant puis centrifugé 5 minutes a 14000 rpm à 4°C. Par la suite , un
volume de chlorofomealcool isoamyl (24:l) est mklangé au stmmgmt et centdi@ 5
minutes a 14000 rpm à 4T. L'ADN est précipité en ajoutant 2.5 volumes d'éthanol 100% au
surnageant, suivi d'une centnfugation de 15 minutes à 14000 rpm à 4°C. Le culot obtenu est
rincé avec de l'éthanol 75% puis séché dans un appareil Speeà Vac (Savant). Le culot est
ensuite resuspendu daas 50pl de lOmM TrisKC1 pH 8.0 , ImM EDTA et 20p@ Rnase A
z e n t s d'ADN sur gel d'aearose
Une fois les fhgments d'ADN séparés sur gel d'agarose dans le tampon TBE MX, la
bande désirée est purifiée par DEAEcellulose NA45 (Schleider et Schuell, Lachine, Qc). La
membrane est découpée et lavée 5 minutes dans une solution 10 mM EDTA pH 7.6, puis 10
minutes dans une solution 0.5M NaOH, et ensuite rincée plusieurs fois à l'eau stérile. La
membrane traitée est insérée près de la bande voulue, dans le gel d'agarose. L'ADN se lie a
la membrane dunint l'électrophorése.
3.SBauençaee de I'ADN double brin
La technique utilisant les didéoxynucléotides est une adaptation de celle décrite par
Sanger et collaborateurs (1977). Les déazadidéoxynucléotides sont utilisés lors de
compressions de bandes afin de les éliminer. (#CAT. 27- 1 686-0 1, Pharmacia)
4odifications des vecteurs at-basic et DSV-Gai
Un vecteur pCAT@-basic (Promega, Madison, WI, USA) modifié a été utilisé comme
gène reporteur pour étudier les éléments régulateurs du promoteur du gène CYPlIB2 de
hamster. La séquence "API like" (4321 à 4327 pb) a été enlevée par digestion avec les
enzymes de restrictions NdeI et EcdIû9 I .
Une approche par PCR a été utlis& pour enlever la séquence AP1 wnse11sus (3396 à
3402 pb). Pour ce faire 4 oligonuciéotides h n t utilisés, soit
a 5%GCCCCCGTTTTCACœ3' , b Y-TTACTAAACACAGCAAAAAACITAWAATT-3' ,
c 5 ' - A A T G C T A G m G C T G T G T ï T A G T b - 3 t , d S-GGAGGTGTGGGAGGT-3'.
Egalement 2 séquences signal de polyadénylation de SV40 (ie fragment VspI- BamIII) ont
été ajoutées au site Hindm du vecteur.
Le vecteur contenant le gène reporteur P-gaiactosidase, utilisé pour normaliser les
transfdons, a été construit avec le vecteur pCAT@control (Prumega) dont les sites APl ont
été enlevés. Le gène CAT, du vecteur pCATGkontrôle, a été remplacé par celui de la &
galactosidase obtenu par la digestion Bamlta- StuI du vecteur pSV-P-galactosidase
(Prome@)*
S. Constructions dasrnidhues
Les wnstnxctions plasmidiques contenant les délétions du promoteury du &ne
CYPllB2 de hamster, entre -486pb et 63pb, ont été faites par PCR en utilisant une amorce + 1
antisens commune, soit: 5r-?TGGCïGCAGCCCTCCCTACTCTGTCG-3~7 contenant le site
de restriction Pst[ (souligné). Les autres amorces utilisées, contenant les sites Sphl ou Hindm
(souligné) , sont les suivantes: S-CATGCATGCAACAGTCAGTACACAGG-3' (construction
CATGCATGCCCCCAGCTATGA'IT-3' (consbnic tion - 134pb) s 5'-
CCCAAGCTTGGAGCTGGTAAGAC?T-3' (construction -267 Pb) %
SCCCAAGCTTCTCTTCAAAAGATGAAGG-3' (construction -328 pb) ; 5'-
CATGCATGCAGAAACCAAGGTmCTA-3' (construstion -350 pb) ; 5'-
CATGCATGCAGCTITCCTCCTIT?TTT-3' (construction 486 pb)
L'amplification par PCR se fait en présence de 30 pmoles d'amorce, 4 ng de matrice
(promoteur cloné dans pBluescnpt), 250 pM de chacun des dNT?s, 2.5 unités de Taq DNA
polymérase ( Pharmacia), 1X tampon OPA, dans un volume de 100 pl. Le cycle thermique
est de 1 min à 94OC (dénaturation), 1 min a la température d'hybridation spécifique à chaque
paire d'amorce, 1 min a 72OC @olyrnénsaîion), ceci répété de 30 a 35 fois, puis suivi d'une
extension de 5 min à 72OC. Les fhgments produits par PCR sont digérés avec les enzymes de
restrictions appropriées, purifiés, puis liés dans le vecteur modifié pCAT-basic. La séquence
de produits de PCR est vérifiée par s&penpge.
La construction contenant le firagment -2458 pb du promoteur a été tàite en insérant le
fragment SpWSmaI du promoteur dans la coostniction de -350 pb. Ce- construction (-2458
pb) a ensuite été utilisée pour faire celle de -3722 pb en iasérant le Sagrnent S a c m du
promoteur dans le site ham de la cufl~truction -2458 pb.
5.1 Sous-cionape des fragments de ammoteur
5.1 1 Ligation des fragments de oromoteur
Les fragments de promoteur produits par PCR ou par digestion enzymafique sont
purifiés sur gel d'agarose. Ces hgments purifiés sont par la suite Liés dans le vecteur pCAT-
basic modifié @CAT-A AP1-polyA). La ligation est effect~lée dans un tampon Li- 1X
(Gibco, BRL), avec 30 ng de vecteur digéré de Fapon appropriée, 8 unités & T4 DNA Li-
et du fiagrnent de promoteur dans un ratio moléculaire 5:l ( h r t : vecteur) dans un volume
total de 10p1. La réaction de I6hrs se Eiit à la tempénuure de la pièce.
5.12 Transformation
Le quart du milieu de ligation est incubé en présence de 1OOpl de bactéries
compétentes E. coli HB 10 1, pendant 20 min sur glace. Ensuite un choc themique de 45 sec.
à 42OC est f& suivi d'une incubation sur glace de 2 min Pour permettre l'expression du
gène de résistance a l'ampiciline, une incubation de 40 à 60 min, à 37OC, sous agitation est
effechiée suite à l'ajout de 900pl d'un milieu SOC ( G i i . BRL) aux bactéries transformées.
De 200pl a 5 5 0 ~ 1 de ce milieu de culture sont par la suite étalés nir des pétris LB contenant
IOOpg/rnl d'arnpiciline, puis ceux-ci sont incubés à 37OC pendant 16 hrs.
6. Transfection transitoire des cellules Y-l
6.1 Culture des cellules Y4
Les cellules Y-1 sont cultivées dans un milieu Ham's F-IO (Sigma, Co., St-louis, MO,
USA) supplémenté dc 2.5% de sérurn de veau foetal, 15% de sérum de cheval, 200U/ml de
pénicilluie G et 270 @ni de streptomycin sulfate. Les cultures cellulaires sont incubées à
37OC, sous une atmosphère de 5% CO2 et de 95% O*. Le milieu de culture est changé a tout
les 3 ou 4 jours. Lorsque les cellules sont a confluence (80-90%), le milieu est enlevé et Is
ceildes sont rincées avec 4ml de 0.1% trypsin-û.02% EDTA dans du PBS et incubées durant
2-3 minutes a la température de la pi&. Les cellules sont resuspendues daas 1 O d de milieu
complet Les nouvelles boites de culture sont ensemencées avec 1 ml de cellules
resuspendues, dans 15 ml de milieu complet Les cellules atteignent la wduence apréS 10 B
12 jours d'incubation.
6.2 Transfection au calcium phos~hate
Les transfections se font sur des plaques de 6 puits (Falcon) ou 5x10~ cellules par
puits sont ensemencées 24hrs avant la transfection Quatre heures avant la transfection, le
milieu est changé avec du MEM Les cellules sont par la suite transfkctées avec les
collstructions plasmidiques en utilisant la technique de précipitation au calcium phosphate
développée par Graham et Van der Eb . 3Spg d'uw construction plasmidique du promoteur
et 1.7pg du vecteur P-galactosidase sont mélangés à 175~1 d'une solution 250mM CaClz
dans un tube de polypropyl&ne 12x75mm (Falcon 2058). En vortexant doucement, le
mélange ADN-CaCIz est ajouté, une goutte à la fois, à 175pl d'une solution 2X HBS (Hepes-
buffered saline) contenant 5OmM Hepes-NaOH pH7.1, 2 5 W NaCl et 1SmM
Na2HP04.NaE&P04 (pH7.0) dans un hibe de polypropylène 12x75mm Le précipité DNA-
Capo4 est formé lors d'une incubation de 15 minutes a la température de la pièce. Le
précipité est ensuite vortexé, puis ajouté goum à goutte aux cellules (325flpuit). Suite a une
incubation de l8hrs à 37OC en présence du précipité, le milieu est changé par 2 ml de MEM
contenant différents régulateurs et réincubé pour 48hn à 37°C.
Les cellules sont rincées une fois avec I d de PBS IY puis resuspendues dans 50pi
de 0 . 2 5 ' Tris-HCI pH8.0. L'extraction cellulaire est faite par wngélation~ngélation
(glace carbonique, 5 min, 37OC, 5 min). Les débris ceUulaires sont éliminés suite a une
centrifûgation de Smin Le surnageant est comme a -20°C jusqu'aux dosages de l'activité P
ffdiactosidase et CAT.
6.4 Dosage de l'activité Bealactosidase
Un volume de 1 Op1 d'extrait cellulaire est incubé 45 min a 37OC7 avec 3p1 de l OOX
Mg (0.1M MgCl*, 4.5M PMercaptoéthanol), 5 0 ~ 1 de solution ONPG 4mgfml et 237pl de
tampon 0.1M de phosphate de sodium. La réaction est arrêtée en ajoutant 500pl de solution
1M Na2C03. L'absorbante est lue au spectrophotométre à 42011x11 contre un blanc ne
contenant pas d'extrait cellulaire. Chaque échantillon est dosé en duplicata.
6.5 Dosage de l'activité CAT
Le dosage de l'activité chioramphénicol acétyl transférase (CAT) est effectué selon la
technique décrite par Gorman et al. en 1982. Les échantillons sont d'abord incubés 10 min a
65°C pour inactiver les acétylases endogènes. Un volume d'extrait cellulaire correspondant a
une absorbance de 1.7 à 4 2 0 ~ 1 pour l'activité J3-galactosidase est utilisé pour la réacton.
L'extrait cellulaire est incubé avec 4pl de '4~-chl~ramPhéni~l (Amersham), 70p1 de Tris-
HCI 0.25M pH8.0, 20pi d'acétyl CoA 4mM (Phamiacia) dans un volume total de 1 5 0 ~ 4
pendant 3hrs à 37OC. Les différentes formes de chloramphénicol acétylées sont e>maites avec
500~1 d'éthyl acétate. Le solvant est 6vapor6, puis les échantillons sont resuspendus dans un
volume de 20pl d'éthyl a&te et déposés sur une plaque de chromatographie de silice. La
migration se f i t dans une chambre saturée d'un mélange chlorofomie/methanol (955
respectivement). Les produits fornés sont quantifiés en utilisant le PhosphorIrnager SF2
(Molecular Dynamics). Les résultats sont calculés selon le % de chloramphénicol acétylé.
Toutes les expériences sont fites en duplicata
RÉSULTATS
1. Régions conservées du promoteur du gène CYPIIB2 entre espèces
Une comparaison de la &@on promotrice du gène CWIIB2 de hamster avec celles
des gènes de souris, rat et humain est montde a la figure 6. Comme les gènes des 3 autres
espèces, le gène de hamster possède une séquence de la boîte TATA entre -41 et -35pb en
amont du site d'initiation de la transcription Aucune séquence de boîte CAAT n'est présente
dans le gène de hamster. D'autres éléments-cis putatifi de régulation préseats dans le
promoteur du gène C W l lB2 de différentes espèces, soit Adl, Ad2, Ad3,Ad4, Ad5 et Ad6
ont été identifiés chez le hamster. Egalement il y a une séquence paiindromique ( 5'-
l T T l T I T A C T a a a g f c A G T ~ - 3 ' ) située entre -398pb et -367pb dans le
promoteur du gène CYPI IB2 de hamster. Aucune séquence semblable n'a kte identifiée chez
les autres espèces.
Une comparaison entre la séquence - 143/-16 1 pb de hamster et celle de souris et de rat
montre qu'il y a 15 nucléotides conservés, et il y en a 9 lorsque la séquence humaine est
incluse, ceci indiquant un rôle de régulation potentielle de cet élément sur le &ne C W I IB2
(figure 7)
FIGURE 6 : Comparaison de la r5gion promotrice du gène <').'PI IB2 de hamster avec celles de souris. rat et humain. Les nucléotides conservés entre les espèces sont rouges. Également les sept déments& consensus sont indiqués.
FIGURE 7 : Comparaison de la séquence -1431-161pb du gène ~ 7 P I I B 2 de hamster et de celles de souris, rat et humain.
2. MM~cation du vecteur ~ ~ P b a s i c
Afin d'étudier les éléments de régulation du gène CYPIlB2 de hamster, la région
promotrice a été analysée en utilisant le gène CAT comme gène reporteur. Les premiers
essais de transfectiotl dam les cellules Y-1 avec le vecteur pCAT-basic non-modifié montrent
une importante activité CAT en absence de promoteur (figure 8). La forskolin augmente cette
activité.
Le vecteur commercial pCAT-basic contient un élémentsis API consensus et LIU
élément AP 1 Me, lesqzle1s pourraient interférer daas les analyses. L'élément AP 1 like situé à
la position 4321pb du vecteur a été enlevé par digestion avec des e~lzymes de restrictions.
Aucun eazyme de restriction ne powant être utilisé pour l'élément API consensus, une
approche de mutagénèse par PCR a été utilisée (figure 9). Cette technique pennet de faire
une délétion de plusieurs nucléotides dans une séquence en utilisant 4 oligonucléotides. Les
oligonucléotides b et c sont construits de f q n à ce que leur côté 3' hybride à la séquence
d'un côté de la délétion, et que leur wté 5' soit complémentaire de l'autre côté de la délétion
Les hgments AB et CD produits par PCR en utilisant ces oligonucléotides sont
complémentaires au point de délétion, permettant l'amplincation du fragment entier. Lorsque
modifié le fiagrnent est inséré dans le plasmide pour remplacer le fragment contenant
l'élément AP 1 consensus.
Également 2 séquences du signal de polyadényhtion se SV40 ont été ajout& en
amont du site de clonage multiple du vecteur en utilisant des enzymes de restrictions. Le
vecteur pCAT-basic modifie a ét6 mmmé KAT-PolyA-AAP 1.
Lorsque transfècté daos les cellules Y-1, le vecteur pCAT-PolyA-AAR a une activité
CAT de base considérablement inférieure à celle obtenue avec le vecteur pC~T%asic. De
plus, avec le vecteur modifié, il n'y a aucune différence au niveau de l'activité CAT, entre le
contrôle et les cellules traitées B la forskolin ou au TPA (figure 8). Ainsi le vecteur modifid
pCAT-PolyA-AAP1 a été utilid pour étudier les régions régulairices du promoteur du gène
CYPIIB2 de hamster. Pour se fiiire, dix d61étions du promoteur ont été construites (figure
1 O).
FIGURE 8: Comparaison de l'activité CAT de base entre le vecteur p ~ ~ ~ R - b a s i c et le vecteur &AT-PolyA-UP 1. Comparativement à l'activité obtenue avec le vecteur p ~ ~ ~ R - b a s i c , l'activité basale du vecteur modifié est très basse, et n'est pas stimulée par la foakolin. Les résultats montrés sont représentatifs de trois expériences faites en duplicata.
Produit de délétion
FIGURE 9: DéICtion par PCR. La séquence a ètre enlevée est indiquée en rouge. Les lignes continues et pointillées représentent la séquence matrice de chaque coté du point de délétion. Du côté 3' des amorces b et c s'hybrident à la matrice sur un coté de la déletion et le coté 5' est complémentaire à la séquence de la matrice de l'autre coté de la délétion. Ainsi les produits de PCR AB et CD générés se chevauchent au point de délétion.
-.---'Zr Poly A
FIGURE 10: Constructions plasmidiques contenant différentes délétions du promoteur du gène CYPllLlZ de hamster. Le vecteur modifié pCAT-polyA-bApl a été utilisé pour construire les différentes délétions du promoteur. La longueur de chaque construction est indiquée à la droite.
3. Emression de I'activïtd transcri~tionneiie de base du Dromoteur du gène C P I I B 2
dans les cellules Y-1
Dix conStNctions plasmidiques contenant différentes délétions du promoteur ont été
faites pour identifier les élémentsis de réguiation dans la région promotrice du gène
CYPZIB2 de hamster (figure 10). L'activité CAT atteint son maximum lorsqu'exprimé par la
construction de -134pb (figure 1 1). Une diminution de la longueur de la région promotrice au
delà, en enlevant les éléments-cis putatifs Ad5, Ad2 et Adl, résulte en une diminution de
l'activité CAT, indiquant la présence d'éléments-cis stimulateurs dans ces régions du
promoteur. Egdement, une augmentation de la longueur du promoteur de -134pb à - l67pb a
résulté en une diminution de 35% de l'activité CAT, indiquant la présence d'élkments-cis
inhiiiteurs dans ceüe région. Une a m diminution de lyactivité CAT est observée avec la
construction contenant I'élément-cis putatif Ad3, indiquant probablement la présence d'un
élémentsis inhibiteur dans cette région Aucun changement remarquable dans l'activité CAT
n'a été observé avec les constructions -350pb (contenant Ad4), -486pb' -2458pb et -3722pb.
Longueur de promoteur (pb)
FIGURE 1 1: Activité transcriptionnelle basale obtenue avec les differentes constructions du promoteur du gène < 'Y''! iB2 de hamster. Les cellules Y- l ont été transfectées avec les différentes constructions et incubées 48hrs. L'efficacité de la transfection est standardisée par l'activité P-galactosidase obtenue. Les résultats montrés sont représen tati fs de trois expériences faites en dupIicatu.
4. Effet de dW6rents régulateurs sur Ifemression de l'activité traascri~tionnek du
promoteur du &ne CWIIBZ de hamster dans les cetlules Y4
La cons-twtion contenant 3- du promoteur a été transfectée dans les cellules Y-
1 afin d'étudier L'effet & divers faceurs de régulation sur l'activité tmscriptionnelle du
promoteur. Cette région de 3722pb a montré une activité promotrice. L'addition de
dSTcAMP ou de forskolin, lequel stimule la production de CAMP endogène, a augmenté
l'activité CAT de façon importante (figure 12). Par contm, l'angiotensine II et le TPA,
lesquels stimulent la voie de transduction par le PKC, n'ont eu aucun effet stimulateur sur
l'activité CAT. Le TPA semble même avoir un léger effet inhiiiteur. De plus, la
staur~sporine~ un inhibiteur de la voie de transduction par la PKC, a stimulé l'activité CAT.
FIGURE 12:. Effet de différents régulateurs sur I'expression de ['activité trmscriptionnelle du promoteur du gène ( 7 ' P I IR2 de hamster dans les cellules Y-1. Activité CAT relative obtenue avec la constmction contenant -3727pb du promoteur du gène ( ' I T i 1/32 de hamster. Les cellules Y- l ont Sté transfectées avec Ies différentes constnictions et incubées 48hrs seules ou avec: dBT CAMP I mM; Forskol in 25uM: TPA 1 6nM: Angiotensin II 1 OnM; staurosporine 100nM. L'efficacité de la transfection est standardisée par 1 'activité P-galactosidase obtenue. Les résultats montrés sont représentatifs de trois expériences faites en dupiicutu.
4.1 Effet de la forskolin sur l'exvression de l'activité transcriptionnelte du ~mmoteat du
gène CYPIIBZ de hamster dans les cellules Y4
L'expression de l'activité CAT de toutes les constructions plasmidiques' à
I'exception de celie contenant seulement la boîte TATA et du vecteur KAT-polyAdAP1
seul, a &é stimulée en présence de forskolin (figure 13). L'activité maximale est obtenue avec
la constNction de -134pb (43% acétylation). Tout comme pour l'activité CAT de base, une
diminution de la longueur de la région promotrice audela de -134pb' pour exclure les
éléments& putatifs Ad5, Ad2 et Adl, a résulté en une diminution importante de l'activité
CAT. De plus, l'augmentation de la longueur du promoteur de -134pb à -167pb a réduit
l'activité CAT à 24%. Une diminution à 20% de l'activité CAT est observée avec la
construction contenant Ad3. Ii y a une petite augmentation de l'activité CAT en présence de
la région contenant Ad4 Aucun changement significatif de l'activité CAT n'est observé avec
les constructions -486pb' -2458pb et -3722pb. Ces résultats semblent confirmer la pïésence
d'éléments inhibiteurs dans la région -134/-167pb et daus la région contenant Ad3.
4.2 Effet du TPA et de la s taurospo~e sur l'expression de l'activité transcriptionnelle
du promoteur du &ne CIiPIIl32 de hamster dans les celiuies Y-1
La présence de TPA n'a pas stimulé l'activité CAT d'aucune construction, mais a
même cependant diminué Iégèrement l'activité CAT (figure 14). Par contre, la staurosporine
a stimulé l'expression de l'activité CAT de toutes les constructions a l'exception de la
construction Adl, de celle contenant seulement la boîte TATA et du vecteur pCAT-plyA-
W 1 seul (figure 14).
FIGIiRE 13: Stimulation par la forskolin de l'activité transcriptiomelle obtenue avec les différentes constnictions du promoteur du gène ('YP1l612 de hamster. Les cellules Y- i ont été transfectées avec les différentes constructions et incubées 48hrs seules ou en présence de 25pM de forskolin. L'efficacité de la transfection est standardisée par l'activité P-galactosidase obtenue. Les résultats montrés sont représentatifs de trois expériences faites en clz~pIicu~a.
FIGURE 14: EFet du TPA et de la staurosporine sur l'activité tranxriptiomelle obtenue avec les différentes constructions du promoteur du gène CYPI IR2 de hamster. Les ce1 lules Y- 1 ont été transfectées avec les différentes constructions et incubées
48hrs seules ou en présence de 16nM TPA ou lOOnM staurosporine. L'efficacité de la transfection est standardisée par l'activité P-gaiactosidase obtenue. Les résultats montrés sont représentatifs de trois expériences faites en Juplicutu
DISCUSSION
La séquence du gene CYPIIB2 de hamster, obtenue pnkéâemment dans le
laboratoire par Andrée Lefebvre, montre que ce gène contient 9 exons, 8 introns et au moins
3722pb de promoteur. L'alignement de la région promotrice du gène CWZIB2 de hamster
avec celles de rat, souris et humain montre que le géne de hamster possède plusieurs régions
régulatrices consewées: la boîte TATA (gataa) et Ad1 (tgacgtgat) un élément apparenté à la
séquence consensus CRE (tgacgtca) (CAMP responsive element) (Morohashi et Omura,
1990), sont identiques chez les quatre espèces. La séquence Ad2, ca@ugx(alc)acgt
(Morohashi et Omura, 199û), conservée parmi les gWes C P 1 IB de bovin, souris et humain,
a une substitution d'un nucléotide chez le hamster devenant ccaggaamgc. La séquence
consewée Ad3 -ccatccfutctt (Honda et al. 1990) differe chez le hamster par
une substitution du 6- nucléotide, a pour g Ad4, aussi nommé facteur stéroïdogénique-1
(SF-1) (Lala et al., 1992), lequel est p b t dans tous les gènes stéroïdogéniques étudiés
jusqu'l maintenant, est identique dans le gène C Y P I Il32 de rat, souris et hamster (ccaaggtc).
Par contre, chez l'humain les deux derniers nucléotides sont inversés. La séquence Ad5
identifiée dans le gene C P I IB de bovin (ccaPuccxgaccxxx(@t)cxc) won& et al., 1990) a 3
nucléotides substitués dans le gène de hamster, devenant ccagctatgattagaggcct Un autre
élément de régulation, présent dans les gènes de la M e CWIIB, nommé Ad6 est
partiellement conservée dans le gene C F 1 1B2 de hamster. L'élément Ad6 bovin comprend
2 1 nucléotides dont 10 sont conservés chez le hamster et 1 1 sont conservés dans cette région
entre le rat, la souris, l'humain et Ie hamster.
Des analyses de fmtprint effkctu&s par Andrée Lefebvre, en utilisant des extraits
nucléaires de la zone gloméruiée, démontrait des régions consexvées correspondanr aux
éléments mentiornés précédemment, soit la boîte TATq Adl, Ad2, Ad3, Ad4, Ad5 et Ad6.
De plus, une nouvelle séquence protégée a été trouvée entre -143 et -16 1pb. Égaiement, la
présence de facteurs liant ce kgment -143/-161 a été confirmée par des analyses de
retardation sur gel.
L'activité régulatrice du promoteur du gène CYPIIB2 de hamster a été étudiée en
utilisant un système de gène reporteur, soit le chloramphénicol acétyl transférase (CAT)
(Coulombe N. et al. 1996). Les cellules Y-1, provenant d'une tumeur de surrénale de souris,
ont été choisies pour les ~ f d o n s car il a été démontré que le gène CWI IB2 est exprimé
dans ces cellules @omalik et ai., 1991). En faiS non seulement 17ARNm du P45Oaldo est
présent, mais son niveau est augmenté par l'addition d'ACTH dans le milieu de culture des
cellules @orna& et al., 1991). De plus, les cellules Y-1 ont été utilisées avec succès pour
l'analyse des régions réguiatrices du gènc CYPIIB2 de souris @omalik et aL, 1991) et la
liaison des facteurs de transcription entre espèces au promoteur a déjà ée démontrée (Lala et
ai., 1992).
Loque les cellules Y-1 furent ûansfectées par le vecteur p C ~ ~ ~ - b a s i c sans
promoteur, une activité CAT a été détectée. De plus, cette activitk était stimulée par
l'addition de fonkolui ou de TPA. En enlevant les éléments Apl et Apl-Like du vecteur
(Kushner et al., 1994) et en ajoutant deux séquences signal de polyadénylation en amont du
site de clonage multiple, l'activité CAT a été niminuée de fàçon considérabte et, & plus*
toute stimulation par la forskolin et TPA a été éliminde. Ainsi le vecteur p~~T%Osic
modifié, pCAT-polyA-hAP1, a eté utilisé pour faire les différentes constnictio11~ du
promoteur.
La transfmtion des 3722pb du promoteur du gène CYPIIB2 de hamster dans les
celiulesY-1 a montré que ce gène a une activité promotrice dans ces cellules Lorsque
différents firagments de délétion du promoteur ont été testés, l'activité basale la plus élevée a
été obtenue avec la construction -134pb' laquelle contient Adl, un élément de réponse au
CAMP' et aussi Ad2 et Ad5. En augmentant la longueur du promoteur pour inclure la w o n
-143/-16 1, l'activité du promoteur est diminuée indiquant la présence d'un élément régulateur
négatif La présence d'Ad3 (-328pb) a résulté en une plus grande diminution de l'activité du
promoteur. Cependant, l'activitk CAT a l-ment augmenté avec la construction -350pb'
contenant Ad4, mais son activité était seulement à 53% de celle de la constniction -134pb.
L'augmentation de la région promotrice jusqu'à -3722pb n'a pas montré de changement
remarquable dans l'activité du promoteur. La séquence palindromique contenue dans la
région -398/-367 ne semble pas jouer aucun rôle dans la régulation de l'activité promotrice.
Ces résultats indiquent que les premiers 134pb de la région promobice possèdent la plus
grande activité de base et que des éléments inh'biteurs putatifs sont présents dans la région
entre -134pb et l'élément Ad4 (-350pb). Cependant, cette situation differe de celle observée
pour le gène CYPIIB bovin où l'activité basale la plus élevée 2 été obtenue avec la région
promotrice contenant l'élément Ad4 mon& et al., 1990). Une séquence inhibitrice putative a
été démontrée entre les éléments Ad4 et Ad5 du gène CYPIIB2 de souris (Bogerd et al.,
1990). Cette séquence chez la souris correspond a une séquence située en amont de la région
- 1341-16 1 de hamster mais la chevauche sur 5 nucléotides. La présence de possibles éléments
négatifs entre 425pb et -1500pb a été notée dans le promoteur du gène CYPIIB2 de souris
(Holland et al., 1995).
L'addition de forskolin a stimuié l'expression du géne reporteur de toutes les
constructions a l'exception de celles contenant seulement la boîte TATA et celle de Adl. La
forskolin et I'AMPc ont stimulé également l'activité CAT de la construction -3722pb.
indiquant que la voie de transduction impliquant la protéine kinase A (PKA), pourrait être
l'un des contrôles d'expression du gène CYPIIB2. Comme pour l'activité de base, la
construction -134pb contenant Adl, Ad2 et A&, a donné la plus grande activité CAT en
présence de forskolin L'augmentation de la longueur de la région promotrice pour inclure la
séquence -143/-16 1 a résulté en une diminution de l'activité CAT. Aussi la présence d'Ad3 a
causé une diminution de l'activité CAT, confirmant ainsi la présence d'éléments inhibiteurs
putatifs dans cette région du gène. L'activité CAT obtenue avec la construction contenant
Ad4, après stimulation par la fonkolin, fut légèrement plus élevée que celle obtenue avec la
construction Ad3, mais était seulement de 4 1% de la construction de - l34pb. Chez la souris il
a été démontré que l'élément Ad4 est important dans l'expression constitutive mais n'est pas
requis pour l'activité dépendant du PKA (Bogerd et uf, 1990). Ceci contraste avec le rôle
joué par Ad4 chez le bovin où il a été identifié comme un élément nécessaire pour une
réponse complète a 17AMPc, démontrant que l'expression de I'aldostérone synthase et de la
1 1 fbhydroxylase sont réguiés dinéremment comme mentionné précédemment ( Tremblay et
LeHom 1989, Tremblay et LeHom, 1993, LeHoux et al., 1992).
Afin d'évaluer la participaiion de la protéine kinase C (PKC) dans l'expression du
g h e CYPIIB2 de hamster, l'effet de l'angiotensin II (Moiloy CI et al. 1993, Mazmxhi G. et
d 1997, TPA et la stainosporine a été étudie en utilisant les constructions -3722pb et -
350pb. L'angiotensine II n'a eu aucun e E i le TPA un léger effet inhiibiteur et la
staurosporine a stimuié l'activité du promoteur. Le TPA, un activatern connu de la PKC
(Culty et al, 1984), a été testé sur toutes les cunstn~ctions. En effet, le TPA n'a stimulé
l'activité d'aucune construction et a même légèrement diminué l'activité CAT, confirmant
ainsi I'observaiion précédente. De plus, la staurosporine7 un inhibiteur de la voie de
transduction du PKC (Gross et al., 1990), a stimulé l'activité CAT de toutes les wnsbuctioils
au même niveau et selon le même patron que la forskolui. Ces résultats indiquent que la PKC
pouffait être un régulateur négatif du gène C P l lB2, du moins dans les cellules Y-1. II a été
démontré que le traitement des cellules Y-1 avec des inhr'biteurs de PKC, soit la staurosporine
et la calphostin C, augmente I'activité du promoteur du gène CWIIA, tramfecté de f a ç a
transitoire, et aussi la sécrétion de sttkoides (Reyland, 1993). a également été démontré
qu'un traitement avec la staurosporine augmente l'expression des ARNm de 2 autres
enzymes stéroïdogeniques soit le P450 llp-hydroxylase et le 3p-hydroxystéroïde
déshydrogénase, indiquant que la PKC agit comme un régulateur négatif de ces gènes.
En conclusion, l'activité transcriptiomelle de la région promotrice du gène CYPIIBt
de hamster transfectée dans les cellules Y-1, est stimulée par la forskolin et par l'AMPc,
indiquant que ce gène est contrôlé par la voie de transduction du PKA. Par contre, le TPA
inhibe légèrement ['activité nanscriptiomeile du promoteur du gène CYP11B2 de hamster
tandis que la staucosporine la stimule, indiquant que la voie de transduction par la PKC
pourrait agir comme régulateur négatif, du moins dans les cellules Y-1. Également, l'effet
négatif d'un nouvel élément& dans le promoteur du gène CilPIIB2 de hamster a W
démontré sur l'activité basale ainsi que sur l'activité stimulée par la forskolin et la
s taurosporine.
REMERCIEMENTS
Je voudrais remercier en premier lieu le Dr. JeanGuy LeHoux de m'avoir accepté
dans son laboratoire, cela m'a permis de développer des aptitudes et une curiosité scientifique
qui me sont essentieiles dans ce domaine.
J'aimerais égaiement remercier Andrée Lefebvre et Lyne Ducharme pour leur soutien
autant au niveau profdomel qu'amical sans oublier qu'elles m'ont aidé a me défendre des
"machinations" des gars du laboratoire. Également je ne peux oublier de remercier Jean,
Mano, Alain et Steven, pour m'avoir soutenue et encouragée tout au long de la rédaction, et
pour tout le divertissement qu'ils ont su créer dans le laboratoire, malgré que j'en étais très
souvent la victime.
Finalement j'aUnerais remercier le Dr. Gilles Dupuis qui m'a permis d'utiliser sa
hotte pour la culture de cellules et pour les nombreux petits conseils et anecdotes
scientifiques.
Aguilera G Catt KJ ( 1983). Regulation of aldosterone secretion during altered sodium intake. J. Ster. Biochem. 19525-530.
Aguilera G Hauger EU. Catt KJ. (1978). Control of aldosterone secretion during sodium restriction: adrenal receptor regdafion and increase adrenal sensitivity to angiotensin II. Proc. Nad Acad Sci 75:975-979.
Aguilera G. Catt KI. (1978). Regulation of aldosterone secretion by the renin angiotensin system during sodium restriction in nits. Proc. NafL Acad Scx. 75: 4057-406 1.
Balasubramaniarn S. Goldstein .K. Faust JR. Brunschede Y. Brown MS. (1977). Lipoprotein-mediated regulation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase activity and cholesteryl ester metabolism in the adrenal gland of the rat J. Biol. Chem 252: ! 77 1 - 1779.
Benbrooks DM, Jones NC ( 1990). Heterodimer formation between CREB and Jun proteins. Oncogene 5: 295-302.
Bogerd, AM, Franklin, A., Rice, D.A., Schimrner B.P. Parker, KL. (1990). Identification and characterization of two upstfeam elements that regulate adrenocortical expression of steroid 1 1 p-hydroxylase. Mol. Edo. 4:845-850.
Brown MS. Kovanen PT. Goldstein JL. ( 1979). Receptor-mediated uptake of lipoprotein- cholesterol and its utilization for steroid synthesis in the adrenal cortex. Rec. Prog. H o m . Res. 3 5 2 1 5-257.
Brownie AC. Alfano I. Jefcoate CR (1973). Effect of ACTH on adrenal mitochondrial cytochrome P450 in the rat. A. N. Y. Acad Sei. 212: 344-360.
Carr 1. ( 196 1). The ultrastructure of the human adrenal cortex before and after stimulation with ACTH. J. Path. Bact. 81: 10 1 - 106.
Coulombe N. Lefebvre A. LeHoux JG (1996). Characterizarion of the hamster CYPI 1B2 gene regulatory regions. Endo. Res. 22(4):653-6 1.
Cozza EN. Vila MDC. Acevedo-Ducan M. Farese RV. Gomez-Sanchez CE.(1990). Treatment of primary cultures of calf adrenal glornemlosa cells with adrenocorticotropin (ACTH) and phorbol esters: a comparative study of the effects on aldosterone production and ACTH signaling system. Endo. f26:2 169-2 176.
65 Cuity, M., Vilpin, L, Charnbaz, E.U, (1984). Steroidogenic properties of phorbol esters
and cas+ iomphores in bovine adrenocortical ceil suspension Biochem Btophy. R a
Domalik, L. J., Chaplin D.D., Kirman, US., Wu, RC., Liu, W., Howard, T.A, Seldin, MF., Parker, KL. (1 99 1 ). Different isoenzymes of mouse 1 1 p-hydroxylase produce mineralocorticoids and glucocorticoids. Mol. Endo* 5: 1853- 1 86 1.
Douglas J. Aguilera G. Kondo T. Caît KJ. (1978). Angiotensin II receptors and aldosterone production in the rat glomeruiosa cells. Endo. 102: 685696.
Douglas J. Catt KJ (1976). Regdation of angiotensin II receptor in the rat adrend cortex by dietary electrolyte. J. Clin Imest. 58: 834.843.
Dwarki VJ, Montminy M, Verrna IM (1990). Both the basic region and the Ieucine zipper domain of the cyclic AMP responsive element binding protein are essential for transcriptional activation. EM30 J. 9: 225-232.
Enyedi P. Szaba B. Spat A.(1985). Reduced responsiveness of glomerulosa cells after prolonged stimulation with angiotensin II. Am J. P hysiol. E209-26.
Evans RM. ( 1 988). The steroid and thyroid hormone receptor superfamily. Science 240:889-895.
Ganzalez GA, Yamamoto KK, Fisher WH, Kan D, Menzel P. Biggs W, Vale WW, Montminy MR (1989). A cluster of phosphorylation sites on the cyclic AMP- regulated nuclear factor CREB predicted by its sequence. Nature 337: 749-752.
Goman CM, Moffat LI?, Howard BH (1982). Recombinant genomes which express chlorarnphenicol acetyt transferase in m8111111alian cells. Md. Cell. Bol. 2: l044-105 1
Gross, J.L., Herblin, W.F., Do, U.H, Pounds, J.S., Buenaga, L.J., Stephans, L.E. (1 990). Characterization of specific [%'jdimethylstatxosporine binding to proteh kinase C. Biochem PhannacoI. 40: 343-350.
Habener JF (1990). Cyclic AMP response element binding proteins: a cornucopia of transcription factors. Mol. Edo. 4: 108% 1094.
Hadley, ME. ( 1 988). Endocrinology, 2nd edition, Prentice -Hall.
Hai T, Liu F, Coukos WJ, Green MR (1 989). Transcription factors ATF cDNA clones: an extensive family of leucine zipper proteins able to selectivity form DNA-binding heterodimers. Gen. Dev. 3: 2083-2090.
HanukogIuJ., ( 1992). Steroidogenic Enzymes: Structure, fuiction, and role in regulation of steroid hormone biosynthesis. J. Steroid Bzochem Malec. Bol. 43,779-804.
Hashimoto T. Morohashi K. Takayarna K Honda S. Wada T. Handa H Omura T (1992).Cooperative transcription activation between Adl, a CRE-like element, and other elements in the CYPl 1B gene prornoterJ Bioch 112(5):573-5.
Hauffa BP. Miller WL. Grumbach MM. Conte FA. Kaplan SL. (1985). Congenital adrenal hyperplasia due to deficient cholesterol sidechain clivage activity in a patient treated for 1 8 years. C h Endo. 23:48 1 493.
Heinrich V.E., Bettendorf, M et Vaecsei, P. (1993). Male pseudohemphroditism caused by non sait-losing congenital adrenal hyperplasia due to 3-beta-hydroxy steroid dehydrogenase (3-beta-HSD) deficiency. J. Steroid Biochem Mol. Btol. 45,83-85.
Hoeffer JP, Meyer TE, Yun Y, Jarneson JL, Habener IF (1988). Cyclic AMP-responsive DNA-binding protein: structure based on a cloned placental cDNA. Science 242: 12169-12174.
Holland, O.B., Carr, B., Brasier, A-R ( 1995). Aldosterone synthase gene regulaîion by angiotensin Endom. Res. 2 1 : 455462.
Honda S. Morohashi K. Nomura M. Takeya H. Kitajima M. Omura T. (1993). Ad4BP regulating steroidogenic P-450 gene is a member of steroid hormone receptor superfàrnily. J. Biol. Chem. 268(10): 7494-7502.
H o n h S.L, Morohashi, KI., Omura, T. (1990). Novel CAMP regulatory elements in the promoter region of bovine P450(11 P) gene. J. Biochen 108: 1042-1049.
Ivashkiv LB, Liou HC, Kara CJ, Larnph WW, Verma IM, Glimsher LH (1990). rnXBP/CRE-BP2 and c Jun form a complex which bonds to the cyclic AMP, but not to the 12-O-tetradecanoylphorbol- 1 Sacetate, response element. Mol. Cell. Biol. 10: 1609-1621.
Kara CJ, Liou H-C, Ivashkiv LB, Glimcher LH (1990). A cDNA for a human CAMP response element-binding protein which is distinct fiom CREB and expressed preferentially in brain. Mol. Ce!. Biol. 10: 1347-1357.
Kouzarides T, Ziff E (1988). The role of the leucine zipper in the Jm-Fos interaction. Nature 336: 646-65 1.
Kushner, P.J., Baxter, J.D., Duncan, KG., Lopeq G-N., Schaufele, F., Uht, RM, Webb, P., West, B.L. (1994). Eukariotic regulatory elements lurking plasrnid DNA: the activator protein-l site in pUC. Mol. Edo. 8: 405407.
Lala, D.S., Rice, DA., Parker, K.L. (1992). Steroidogenic factor i, a key regulator of steroidogenic enzyme expression, is the mouse homolog of&hi tarasan-factor 1. Mol. Edo. 6: 1249-1258.
Landschulz WH, Johnson PF, McKnight SL, (1988). The leucine ripper. a hypotheticd structure common to a new class of DNA binding proteins. Science 240: 1759- 1764.
Lauber, M. Muller, J., (1989). Purification and characterkatim of two distinct forms of rat adrenai cytochrome P450 1 1 P: Functional and stnictural aspects. Arch Biochem B ioph~~ 274, 10% i 19.
Lavorgna G. Ueda H. Clos J. Wu C. (199 1). FTZ-FI a steroid hormone receptor-like protein implicated in the activation of fushi tareu. Science 252: 848-85 1.
LeHou JG. Mason JI. Ducharme L. (1992). In vivo effects of adrenocorticotropin on hamster adrenal steroidogenic enzymes. Endo. 13 1 : 1 874- 1 882.
Maniatis T., Fritsch, E. F., Sarnbroolg J. (1989). Molecular cloning a laboxatory manual. zd edition, Cold Spring Harbor Laboratory.
Mazzocchi G. Malendowick LK. Gottardo G. RebufEat P. Nussdorfer GG. ( 1997). Angiotensin- Ii stimulates DNA synthesis in rat adrenal glomedosa ceils: receptor subtypes involved and possible signal transduction mechanism. Endocr. Ra. 23(3): 1 9 1 -203
Mitani, F., Ogishirna, T., Miyarnoto, K Ishimura, Y. (1995). Locaiization of P450 aldo and P4SO 1 1 p in normal and regenerating rat adrend cortex Endocr. Res. 21 (1 -2),413-423.
Molloy CJ. Taylor DS. Weber H. (1993). Angiotensin II stimulation of rapid protein tyrosine phosphorylation and protein b a s e activation in rat aortic smooth muscle cells. J. Biol. Chem 268(10): 7338-7345
Morohashi K. Honda S. Inornata Y. Handa H. Omura T (1992). A c o m o n trans-acting factor, Ad4-binding protein, to the promoters of steroidogenic P-450s. J. Biot. Chem 267(25): 179 13-9
Morohashi K. Zanger UM. Hon& S. Ham M. Wateman MR. Omura T (1 993). Activation of CYP 1 1 A and CYP 1 1 B gene promoters by the steroidogenic cell-specific transcription factor Ad4BP. Mol. Endo. 7(9): 1 196-1204.
Morohashi, KL, Omura, T. (1990). Tissue-specifk transcription of P-450 (1 1 P) gene in vitro. J. Biochem 108: 1 050- 1056.
Muller J. Meuli C. Schmit C. Lauber M. (1989). Adaptation of aldosterone biosynthesis to sodium and potassium intake in the rat. J. Ster. Bzochem 34: 27 1 -277.
Nebert DW. Gonzales FJ.( 1987). P4SOgenes: structure, evolution and regulation. Ann. Rev. Biochem, 56: 945-993.
Ogishima T. Mitani F. Ishimuni Y. (1 989). Isolation of aldosterone synthase cytochrome P450 fiom zona giomenilosa rnitochondria of rat adrenal cortex. J. Bioi. C h 264: 10935-10938.
Okamoto, M. et Nonaka, Y. (1992). Motecuiar biology of rat steroid 1 1 &hydroxylase Ip450(11 P)] and aldosterone synthase p450 (1 1 B, ALDO)]. J. Stemid Biochem Mdec. BioL 41,3-8.
Omura T. Morohashi K ( 1995). Gene regdation of steroidogenesis. J. Ster-Bzoch. Mol. Biol. Ss(l-6): 19-25.
P w i s .JL. Canick JA. Mason JI. Estabrook RW. McCarthy fi. (1973). Lifetime of adrenal cytochrome P450 as influenced by ACTH. A. N. Y. Acad Sci. 212: 3 19-342.
Reyland ME. ( 1993). Protein kinase C is a tonic negative regulator of steroidogenesis and steroid hydroxylase gene expression in Y-1 adrenal cells and fiinctions independently of protein kinase A. Moi. Endo. 7: 102 1-1030.
RBsler A. (1992). Steroid 17-beta-hydroxysteroid dehydrogenase deficiency in man: An inherited form of male pseudohermaphroditism. Ster. Biochem Mol. Biol. 43~989- 1002.
Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P.N.A.S. 74(12): 5463-5467.
Sasano, H., White, P.C., New, MI. Sasano, N. (1 988). Immunochemistry of cytochrome P450 2 1-hydroxylase: Microscopic examination of the enzyme in the bovine adrenal cortex and kiciney . Endocrlnoiogy 122,29 1-295.
Sassone-Corsi P, Ransone U, Lamph WW, Vema IM (1988). Direct interaction between Fos and Jun nuctear oncoproteins: role of the leucine zipper domain Nature 336: 692-698.
Shelton JH. Jones AL. ( 1970). The fine structure of the mouse adrenal cortex and the ultrastructure changes in the zona glomedosa with low and high sodium diet AML Rec. 170: 147- 1 82.
Shizuta, Y., Kawamoto, T., Mitschi, Y., Toda, K., Miyahara, K, Ichikawa, Y., h u m , H. Ulick, S. (1992). Molecular genetic studies on the biosynthesis of aldosterone in humans. J , Sferozd Biochem. Moiec. B i d 43,98 1-987.
Stone D. Hechter 0. ( 1955). Studies on ACTH action on pemised bovine adrenals: Aspects of progesterone as an intermediary in corticosteroidogenesis. Arch Biochem Biophp 54: 121-128.
69 Takayama K Morohashi K Honda S. Ham N. Omura T. (1994). Contribution of Ad4BP
a steroidogenic cell-specific transcription factor to regulation of the human CYP 1 1A and bovine CYP 1 1B genes through their distal promoters. J. Bzochem 116: l93-2O3,
Tarjan E. Spat A Balla T. Szekely A. (1980). Role of the renin angiotensin system in the adaptation of aldosterone biosynthesis to sodium restriction in the rat. Acta Endo. 94: 381-388.
Tremblay A. LeHou JG ( 1993). Tfaflscriptional activation of adrenocortical steroidogenic genes by high potassium or low sodium intake. FEBS Let. 3 l7(3):2 1 1 -5.
Tremblay A. LeHoux JG. (1989). Effects of low sodium and high potassium intakes on rat steroid metabolinng enzyrnes. 71' Annuol Meeting of the Endocrine Society. June 21-24 Seattle, WA. Abstract # 1459.
Tsukiyama T. Ueda K Hirose S. Niwa 0. (1992). Embryonai long terminal repeat-binding protein is a murine homolog of FTZ-FI, a member of the steroid receptor superfamily . Mol. Celf. Biol. 1 2: 1 286- 1 29 1.
Tuckey, RH, Okino, S., Bamesy K, Griffin., KJ. Johnson, E.F. (1985). Multiple gene-like sequences related to the rabbit-hepatic progesterone 2 1-hydroxylase cytochrome P450. J. BioL Chem 260,13347-13354,
Waterman MR. Kagawa N. Zanger UM. Momoi K Lund J. Simpson ER ( 1992). Comparaison of CAMP-responsive DNA sequences and their binding proteins associated with expression of the bovine CYP17 and CYPl LA and human CYP2 1 b genes. J. Ster. Biochem. Mol. Biol. 43: 93 1-935.
White, P.C., Cumow, KM. Pascoe, L. (1994). Disorder of steroid 1 1 P-hydroxylase isozymes. Endocr. Rev. 15(4), 42 1-436.
White, P.C., New, M L (1992). Genetic basis of Endocrine disease 2: congenital adred hyperplasia due tu 2 1 -hydroxylase deficiency. J. CZix Endov. Metab. 74,G 1 1 .
Yun Y, Dumoulin M, Habener JF (1990). IjEiÀ-binding and dimerization domains of adenosine-3',5'-cyclic monophosphate-respoosive protein CREB reside in the carboxyl-terminal66 amino acids. Mol. Endo. 4: 93 1-939.
APPENDICES
Communication
Coulombe N. Lefebvre A LeHoux J.G. ( 1996). Characterizaiion of the hamster CYPI IB2 gene
regdatory regions. sevenh conference on the AdrenaI Cortex, Scodand (Ecosse) June
27-30,1996.
Publications
Coulombe N. Lefebvre A LeHoux JG ( 19%). Characterization of the hamster CYP 1 1 B2 gene regdatory regions. Endo. Res. 22(4):653-6 1.
Coulombe N. Lefebvre A. LeHoux JG ( 1997). Characterization of the Hamster CYPI IB2 gene encodiug adrenal cytochrome P450 aldosterone synthase. DNA Cell. Biol. 16(8): 993-1002.
IMAGE WALUATION TEST TARGET (QA-3)
APPLIED 1 IMAGE. lnc 1653 East Main Street - -. , Rochesîer. NY 14609 USA -- -- - - Phone: 7161482-0300 -- -- - - Fax: 71 6/280-5989
O 19% Applied Image. Inc.. Ali R$hts R e m m d
