UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE … · 2012-03-14 · UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische Analyse Drug Quality and Registration

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep Farmaceutische Analyse

Drug Quality and Registration (DruQuaR) Group

Academiejaar 2010 - 2011

Vergelijking van methoden voor de activiteitsbepaling van

asparaginase

Jochem VANCOILLIE

Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling

Promotor

Prof. Dr. Apr. B. De Spiegeleer

Commissarissen

Prof. Dr. D. Deforce

Prof. Dr. apr. H. Robays

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN

Vakgroep Farmaceutische Analyse

Drug Quality and Registration (DruQuaR) Group

Academiejaar 2010 - 2011

Vergelijking van methoden voor de activiteitsbepaling van

asparaginase

Jochem VANCOILLIE

Eerste Master in de Geneesmiddelenontwikkeling

Promotor

Prof. Dr. Apr. B. De Spiegeleer

Commissarissen

Prof. Dr. D. Deforce

Prof. Dr. apr. H. Robays

AUTEURSRECHT

“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie

beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik

valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de

verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van de resultaten uit deze

masterproef.”

DATUM

Promotor Auteur

Prof. B. De Spiegeleer Jochem Vancoillie

DANKWOORD

Graag had ik een pagina de tijd genomen om een aantal mensen te bedanken zonder wiens hulp deze thesis nooit

tot stand had kunnen komen.

Vooreerst wil ik mijn promotor en tevens persoonlijke begeleider, professor Bart De Spiegeleer, bedanken. Niet

enkel voor de opportuniteit om aan dit onderzoek deel te nemen, maar ook voor de tijd die hij voor mij

vrijmaakte in zijn drukke dagen om mij te begeleiden, mijn kritische geest aan te scherpen en mij talloze nieuwe

inzichten te verschaffen. Het vertrouwen, de zelfstandigheid en de verantwoordelijkheid die mij werden

toevertrouwd, zullen niet enkel waardevol gebleken zijn voor deze thesis, maar ook voor de verdere stappen in

mijn carrière.

Daarnaast wil ik ook het voltallige personeel van DruQuaR bedanken, die altijd klaar stonden om naar mijn

vragen te luisteren, zijnde praktisch of theoretisch, en deze naar het beste van hun vermogen te beantwoorden.

Deze mensen waren echter meer dan een vraagbaken, ze maakten de tijd in het labo aangenaam. De sporadische

babbels waren een aangename afwisseling.

Verder wil ik ook mijn medestudenten en vrienden in de kijker zetten, daar zonder vriendschap en steun van hen

deze afgelopen 4 jaar minder gemakkelijk zouden verlopen zijn. Ook mijn vriendin mag hierin niet ontbreken,

zij heeft namelijk een groot deel van mijn frustraties tijdens deze 12 weken getemperd en altijd het volste

vertrouwen in mij getoond.

Maar mijn grootste dank gaat uit naar mijn ouders die zich gedurende 22 jaar lang reeds belangeloos hebben

ingezet voor mij, zowel gedurende goede als slechte periodes. De kans om deze studies aan te vangen is aan hen

te danken, het latere succes dat ik hopelijk zal genieten zal een resultaat zijn van hun harde werk, hun opvoeding

en steun.

INHOUDSOPGAVE

1. INTRODUCTIE ............................................................................................................. 1

1.1. LEUKEMIE ..................................................................................................................... 1

1.1.1. Algemeen ..................................................................................................... 1

1.1.2. Acute Lymfoblastische Leukemie .................................................................. 1

1.2. ASPARAGINASE ............................................................................................................ 2

1.2.1. Algemeen ..................................................................................................... 2

1.2.2. Karakterisatie ............................................................................................... 4

1.2.2.1. Enzymactiviteit ................................................................................................. 4

1.2.2.2. Structuuranalyse ............................................................................................... 9

1.2.2.3. Zuiverheidsanalyse ......................................................................................... 12

1.2.3. Actief Centrum ........................................................................................... 12

1.2.4. Soorten asparaginase ................................................................................. 16

1.2.5. Stabiliteit ................................................................................................... 16

2. OBJECTIEF ................................................................................................................ 18

3. MATERIAAL EN METHODEN ..................................................................................... 19

3.1. TOESTELLEN EN REAGENTIA ...................................................................................... 19

3.1.1. UV/Vis spectrofotometer ........................................................................... 19

3.1.2. Centrifuge .................................................................................................. 19

3.1.3. Thermomixer ............................................................................................. 19

3.1.4. pH meter .................................................................................................... 19

3.1.5. Waterstation .............................................................................................. 19

3.1.6. Balansen .................................................................................................... 20

3.1.7. Producten .................................................................................................. 20

3.2. METHODEN ................................................................................................................ 21

3.2.1. Nessler ....................................................................................................... 22

3.2.2. Berthelot .................................................................................................... 24

3.2.3. Indooxine ................................................................................................... 25

3.2.4. Glutamaat dehydrogenase ......................................................................... 26

3.2.5. Aspartaat Transaminase ............................................................................. 28

3.2.6. Methodenevaluatie .................................................................................... 30

4. RESULTATEN ............................................................................................................ 31

4.1. NESSLER ..................................................................................................................... 31

4.2. BERTHELOT ................................................................................................................ 32

4.3. INDOOXINE ................................................................................................................ 33

4.4. GLUTAMAAT DEHYDROGENASE ................................................................................ 34

4.5. ASPARTAAT TRANSAMINASE ..................................................................................... 35

4.6. GESIMULEERDE ASPARAGINASE METHODENEVALUATIE ......................................... 36

4.6.1. Situering..................................................................................................... 36

4.6.2. Nessler ....................................................................................................... 37

4.6.3. Berthelot .................................................................................................... 39

4.6.4. Indooxine ................................................................................................... 40

4.6.5. Glutamaat Dehydrogenase ......................................................................... 42

4.6.6. Aspartaat Transaminase ............................................................................. 43

5. DISCUSSIE ................................................................................................................ 45

5.1. STATISTISCH ............................................................................................................... 45

5.2. NIET-STATISTISCH ...................................................................................................... 47

6. ALGEMEEN BESLUIT ................................................................................................. 49

7. LITERATUURLIJST ..................................................................................................... 50

LIJST MET GEBRUIKTE AFKORTINGEN

ADP: Adenosine Difosfaat

Ala: Alanine

ALL: Acute lymfoblastische anemie

ASAT: Aspartaat Transaminase

Asn: Asparagine

ASNASE: Asparaginase

Asp: Asparaginezuur

BSA: Bovine Serum Albumine

CD: Circulair Dichroïsme

DAD: Diode Array Detector

DH: Dehydrogenase

DRS: Diffuse Reflectieve Spectroscopie

DSC: Differential Scanning Calorimetry

EFS: Event-Free Survival

ELISA: Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay

ESI: Electrospray Ionisatie

GDH: L-glutaminezuurdehydrogenase

Glu: Glutaminezuur

Gly: Glycine

HPLC: High Performance Liquid Chromatography

HSD: Honestly Significant Difference

Ig: Immunoglobuline

Ile: Isoleucine

I.m.: intramusculair

IU: International Unit, de hoeveelheid enzym dat de omzetting van 1 µmol substraat tot

product per minuut onder gedefinieerde condities katalyseert

I.v.: intraveneus

KGA: Keto-Glutaarzuur

LoD: Limit of Detection

LoQ: Limit of Quantification

LSD: Least Significant Difference

MG: Moleculair Gewicht.

MS: Massaspectrometrie/Massaspectrometer

NAD: Nicotinamide Adenine Dinucleotide

Ox.: Oxidatie

PPM: Parts Per Million

Ribo: Ribose

RP-HPLC: Reversed-Phase HPLC

RSD: Relatieve Standaard Deviatie

SDS-PAGE: Sodium Dodecylsulfaat Polyacrylamide Gelelectroforese

SEC: Size-Exclusion Chromatografie

SPE: Vaste Fase Extractie

St. Dev.: Standaard Deviatie

Thr: Threonine

UV: Ultraviolet licht

UV-VIS: Ultraviolet en zichtbaar licht

1

1. INTRODUCTIE

1.1. LEUKEMIE

1.1.1. Algemeen

Leukemie is een verzamelterm voor verschillende vormen van bloedkanker, meestal

van de witte bloedcellen of leukocyten. Leukemie wordt gekenmerkt door een ontregelde en

ongecontroleerde groei van verschillende types van witte bloedcellen in het beenmerg.

Vanuit het beenmerg gaan de kankercellen over op het circulerende bloed en zo ook op

andere organen, zoals de lymfeklieren, de milt en de lever. Elk orgaan kan worden

aangetast, inclusief het centraal zenuwstelsel.

(http://www.cancer.org/Cancer/LeukemiainChildren/OverviewGuide/childhood-leukemia-

overview-what-is-childhood-leukemia)

De witte bloedcellen maken deel uit van het immuunsysteem en hebben als functie

vreemde indringers, zoals bacteriën en virussen, te bestrijden. Bij leukemie is de vorming

van deze cellen in het rijpingsproces gestoord. De cellen zijn dus nog niet rijp en bijgevolg

niet in staat hun functie uit te oefenen. Het beenmerg is niet meer in staat voldoende

normaal functionerende bloedcellen te produceren.

Er wordt een onderscheid gemaakt tussen acute leukemie, dat op korte tijd ontstaat

en waarbij de cellen erg onrijp zijn, en chronische leukemie, welke trager verloopt en

waarbij de cellen zich verder in het ontwikkelingsproces bevinden. Verder worden ze nog

onderverdeeld in lymfatische en myeloïde leukemie, afhankelijk van de cellijn waaruit de cel

afkomstig is. (http://www.skion.nl/kbk/leukemieen)

1.1.2. Acute Lymfoblastische Leukemie

Acute lymfoblastische leukemie (ALL) is een vorm van leukemie die gekenmerkt

wordt door een overmaat aan lymfoblasten. Maligne, onrijpe witte bloedcellen worden

continu geproduceerd en vermenigvuldigd in het beenmerg. Het gevolg hiervan is dat de

gezonde cellen verdreven worden uit het weefsel, maar ook dat het overbevolkte beenmerg

lymfoblasten vrij zal stellen in het bloed, met de dood tot gevolg indien onbehandeld.

2

ALL komt het vaakst voor in de kindertijd in de periode van 2 tot 10 jaar. De kans op

genezing bij kinderen is ongeveer 80%, bij volwassenen ligt die kans op zo’n 40%.

Acuut, zoals reeds vermeld, verwijst naar het relatief korte tijdsverloop van de ziekte,

die fataal kan zijn in slechts enkele weken indien men dit onbehandeld laat. Lymfoblastisch

slaat op de cellen die betrokken zijn. Hier zijn het lymfocyten, die echter nog onrijp zijn, ze

bevinden zich nog in de “blast”-staat. (Randolph, 2004)

1.2. ASPARAGINASE

1.2.1. Algemeen

Asparaginasen zijn natuurlijk voorkomende tetramere enzymen die de hydrolyse

katalyseren van het niet-essentiële aminozuur L-asparagine tot L-asparaginezuur en

ammoniak (Figuur 1.1). Dit proces gaat extracellulair door.

Figuur 1.1: Reactiemechanisme van asparaginase gekatalyseerde deaminatie

(Verma et al., 2007)

Asparaginasen kunnen voor verscheidene doeleinden worden aangewend.

Asparaginasen, afkomstig uit bijvoorbeeld erwten (Tuncel et al., 2010), worden industrieel

gebruikt in de voedingsindustrie om de vorming van acrylamide tegen te gaan, een

vermoedelijk carcinogeen. Door het omzetten van asparagine tot asparaginezuur kan de

Maillard-reactie van asparagine tot acrylamide niet meer doorgaan bij de verwerking van

bepaalde types voeding.

3

Asparaginase wordt ook in de medische wereld gebruikt. Deze asparaginasen,

afkomstig van bacteriën zoals Escherichia coli en Erwinia chrysanthemi, zijn een belangrijk

onderdeel in de behandelingstherapie van ALL. Leukemiecellen zijn namelijk beperkt in de

upregulatie van hun asparaginesynthetase en hebben dus nood aan een exogene toevoer

van asparagine. Parenteraal toegediende asparaginase zorgt voor een depletie van

extracellulair asparagine, en in mindere mate van glutamine, waardoor de proteïnesynthese

in de leukemiecel wordt geïnhibeerd. Dit leidt tot selectieve celdood. (Albertsen et al., 2002)

Daar asparaginasepreparaten van bacteriële oorsprong zijn, zijn ze immunogeen en

geven ze tot in 60% van de gevallen aanleiding tot klinische hypersensitiviteit, waarvan de

kans stijgt met het aantal voorafgaande toedieningen. Deze overgevoeligheidsreacties zijn

het gevolg van de productie van anti-asparaginase antilichamen, die van het type IgG zijn.

Enkele symptomen zijn anafylaxis, pijn, oedeem, urticaria en pruritus.

De antilichamen tegen asparaginase leiden niet altijd enkel tot klinische

overgevoeligheid, maar veroorzaken ook een snelle inactivatie van het enzym. Dit wordt

“silent hypersensitivity” ten gevolge van “silent antibodies” genoemd. Dit komt voor bij

ongeveer 30% van de patiënten en kan dus leiden tot resistentie en een gedaalde

therapeutische efficaciteit. (Pieters et al., 2010)

Een onderverdeling in de bacteriële asparaginasen wordt gemaakt in type I en type II

asparaginasen. Type I asparaginasen (Km~ 10-3 M) worden tot expressie gebracht in het

cytoplasma en worden gekarakteriseerd door een enzymatische activiteit voor zowel L-

asparagine als L-glutamine. Type II asparaginasen (Km~ 10-5 M) daarentegen worden onder

anaerobe omstandigheden in de periplasmatische ruimte tot expressie gebracht en hebben

een hoge specifieke activiteit ten opzichte van L-asparagine. Het zijn enkel de type II

asparaginasen die als chemotherapeutica worden gebruikt bij de behandeling van ALL.

4

1.2.2. Karakterisatie

Met karakterisatie van asparaginase bedoelen we de technieken waarmee we de

volledige “identiteit” ervan kunnen blootleggen. We willen te weten komen hoe snel en

efficiënt het enzym werkt en hoe het proteïne is opgebouwd. Onderstaande technieken

helpen ons bij deze karakterisatie.

1.2.2.1. Enzymactiviteit

De enzymactiviteit is de omzetting van substraat (in mol) of de vorming van product

(in mol) per tijdseenheid (seconde) door het enzym onder welbepaalde omstandigheden van

pH, temperatuur en substraatconcentratie. Om de enzymactiviteit van L-asparaginase te

bepalen zijn er verscheidene methoden voor handen. we kunnen deze methoden indelen op

basis van het analyt dat kwantitatief bepaald wordt: de daling van het substraat asparagine

of de stijging van de producten asparaginezuur of ammoniak.

Asparaginezuur

o Een aminozuuranalyse van asparaginezuur (ook toepasbaar op het

substraat asparagine, om depletie te bepalen) kan zelf op verscheidene

manieren gebeuren. De meest gebruikte is een RP-HPLC gekoppeld aan

een detector. De detector kan een fluorescentiemeter na derivatisatie

(met LoQ = 0,1 µM) (Nath et al., 2008), (Boos et al., 1996), UV-detector na

derivatisatie (LoQ = 0,01 µM) (Avramis et al., 2007) of ESI-MS (LoQ = 0,35

µM) (Tuncel et al., 2010) zijn.

o Een andere techniek om asparaginezuur te gaan kwantificeren is een

gekoppelde enzymatische assay. Asparaginezuur, afkomstig van de

gekatalyseerde desaminatie van asparagine, reageert met α-

ketoglutaarzuur in de aanwezigheid van aspartaat aminotransferase,

waardoor oxaloacetylzuur ontstaat dat op zijn beurt gereduceerd β-NAD+

(=β-NADH) oxideert in aanwezigheid van malaat dehydrogenase(Figuur

1.2). De oxidatie van NADH resultereert in een daling van absorbantie bij

5

340 nm, wat eenvoudig gemeten wordt met een UV-spectrofotometer

(LoQ = 4,2 µM). (Vrooman et al., 2010)

Figuur 1.2: Reactiemechanisme bij gekoppelde enzymatische assay

o Een aselectieve methode die voorhanden is, is conductometrie. Dit is een

methode die gebaseerd is op een stijging van de geleidbaarheid, te wijten

aan de productie van ammoniak en asparaginezuur. (Drainas et al., 1985)

(Stecher et al., 1999)

Ammoniak

o Nessler-methode. Deze maakt gebruik van het Nessler reagens, wat een

mengels is van K2HgI4 en een KOH of NaOH oplossing (Demuthkaya et al.,

2006). Het Nessler reagens interageert met ammoniak op volgende

manier (Figuur 1.3): (Leonard, 1963)

Figuur 1.3: Reactiemechanisme Nessler

De extinctie wordt gemeten met een UV-VIS spectrofotometer bij 485

nm. (Moorthy et al., 2010) (Demuthkaya et al., 2006) De Nessler-methode

heeft een werkzaam gebied van 0,5 – 12 µg/ml.

o Berthelot-methode. Het gevormde ammonia reageert met hypochloriet

waardoor chloramine wordt gevormd. Dat chloramine reageert met Na-

6

nitroprusside en fenol tot quinone chloramine, dat verder reageert onder

alkalische condities om uiteindelijk indofenolblauw te produceren (Figuur

1.4).

Figuur 1.4: Mechanisme van de indofenol-blauwvorming

De hoeveelheid indofenol dat geproduceerd wordt is direct proportioneel

met de hoeveelheid ammonia dat vrijgesteld werd uit het substraat. De

kwantificatie van indofenol gebeurd spectrofotometrisch, waarbij de

absorbantie bij 675 nm wordt gemeten. (Moliner-Martinez et al., 2005).

Een stijging in blauwe kleur wordt onderscheiden tussen 0 en 20 µg/ml.

(Lau et al., 2004) De Berthelot-methode kent ook vele variaties, die vooral

een verbeterde serum/plasma-staal behandeling beogen. Een van de

recentere variaties voor plasmabepalingen is het gebruik van een SPE

(vaste-fase extractie), gekoppeld aan een DRS (diffuse reflectieve

spectroscopie). Het detectielimiet bij SPE-DRS is 10 µg/l. (Moliner-

Martinez et al., 2005) Een andere methode is het gebruik van een niet-

reversibele solid-phase sensor (sensorstrips). De reactie bij deze

wegwerpstrips gaat veel sneller door, namelijk in 3 minuten in plaats van

20 minuten. De range bij deze methode is van 0,5 – 10 µg/ml. (Lau et al.,

2004) Nog een andere variant is een micel-gemedieerde extractie.

7

Voordeel bij deze werkwijze is dat ze sneller is. Ook de precisie en

accuraatheid ligt hoger. Detectielimiet hier is 1 ng/ml. (Afkhami et al.,

2008) Berthelot heeft als voordeel over Nessler dat ze minder gevoelig is

aan interferenties.

o Verder bestaan er ook enzymatische ammoniakbepalingen. Kits die

gebruik maken van het enzym GDH (glutamaat dehydrogenase) laten toe

de concentratie van ammoniak te bepalen via een NADPH-afhankelijke

reactie (Figuur 1.5). De omzetting van NADPH naar NADP+ wordt

kwantitatief gemeten door de daling in absorbantie bij 340 nm. Met deze

GDH kits kan men concentraties bepalen in de range van 0,2 – 15 µg/ml.

(http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Bulletin/aa010

0bul.Par.0001.File.tmp/aa0100bul.pdf)

Figuur 1.5: Reactiemechanisme van de Glutamaat Dehydrogenase-kit

o Indooxine-methode. De Indooxine-methode is gebaseerd op de reactie

van hydroxylamine, afkomstig van het gemodificeerd asparagine AHA

(asparaginezuur-β-hydroxamaat), met 8-hydroxyquinoline. (Wehner et al.,

1992) De intens groen gekleurde Indooxine-kleurstof die gevormd wordt

door de reactie (Figuur 1.6) leent zich uitermate tot een spectroscopische

bepaling van de extinctie bij 710 nm. (Lanvers et al., 2002)

8

Figuur 1.6: Reactiemechanisme van de Indooxine-methode

Eiwitbepalingen

o Algemene eiwitbepalingen. Een type proteïne assay dat men reeds

toegepast heeft op asparaginase is het Bradford proteïne assay. De

absorbantie bij deze colorimetrische assay wordt gemeten bij 595 nm. Als

referentie standaard gebruikt men BSA (bovine serum albumine).

(Khushoo et al., 2004) Andere colorimetrische proteïneassays die men nog

niet heeft toegepast op asparaginase, maar wel mogelijk zijn, zijn de

Lowry assay, waarbij met de absorbantie meet bij 750 nm, de modernere

variant van de Lowry assay, namelijk de bicinchoninezuur assay waarbij

we de extinctie meten bij 562 nm (en waarvoor kits bestaan) en de

Biureet test waar we gaan meten bij 540 nm. (Sapan et al., 1999)

o Selectieve asparaginase bepalingen. Electrochemiluminescentie

immunoassay werd reeds toegepast op asparagine synthethase, maar nog

niet op asparaginase. (Lorenzi et al., 2008)

9

o Behalve via deze assays heeft men de concentratie van het enzym ook nog

via UV-spectroscopie bepaald, waarbij men de extinctie bij 280 nm gaat

meten. Ook een differentiële refractometer werd gebruikt om de

concentratie te bepalen, al vereist deze techniek wel een grondige

voorafgaande dialyse. (Cammack et al., 1975)

1.2.2.2. Structuuranalyse

Onder structuuranalyse valt o.a. de primaire, secundaire en tertiaire structuur, maar

ook het moleculair gewicht en fragmentatie vallen hieronder.

Onder primaire structuur verstaan we de opeenvolging van aminozuren. Dit wordt

opgehelderd door middel van diverse technieken. Een klassieke methode is de Edman-

degradatie (Edman et al., 1949), waarbij het N-terminale residu wordt gelabeld en

afgesplitst, zonder dat de rest van de peptidebindingen wordt gebroken. (Maita et al,. 1979)

Een alternatieve, modernere methode is de massaspectrometrie. Eerst wordt via chemische

of enzymatische afbraak het eiwit onder gecontroleerde omstandigheden gehydrolyseerd in

kleinere stukken. Het gevormde mengsel van peptiden wordt doorheen een HPLC gestuurd

om ze te scheiden en detectie gebeurt met MS (voor massabepaling) of MSn (voor

aminozuursequentie van elke fractie).

(https://www.msu.edu/~gallego7/MassSpect/MSandPMM.htm) (Han et al., 2001)

De primaire structuur van enkele asparaginasen zijn reeds volledig opgehelderd (figuur 1.7).

10

Figuur 1.7: Aminozuursequenties van het monomeer van verscheidene asparaginasen.

Getallen bovenaan = sequentie van E. coli asparaginase, onderaan = W. succinogenes

asparaginase. * = residu cruciaal voor de activiteit. Donkerrood = residu voorkomend in

alle enzymen. Licht rood = zeer geconserveerd residu. Paars = vaak voorkomend residu,

behalve in W. succinogenes. Groen = vaak voorkomende residu in elke subfamilie (licht

groen, asparaginasen; donkergroen, glutaminase/asparaginasen). Roze = residu’s zijn zeer

geconserveerd in beide subfamilies. (Lubkowski et al., 1996)

De secundaire structuur, de lokale opvouwing in driedimensionele

structuurelementen, wordt onder andere bepaald met behulp van circulair dichroisme. CD

steunt op het vermogen van de CD-spectrometer om het verschil in absorptie tussen links-

11

en rechts-circulair gepolariseerd licht te meten. Een afwezigheid van een regelmatige

structuur leidt tot een CD-intensiteit van nul. Een geordende structuur, zoals een α-helix of

een β-sheet, daarentegen zal resulteren in een spectrum. CD heeft ook inzicht gegeven over

het ontvouwen van de secundaire structuren van de proteïne. (Benjwal et al., 2006) (Shifrin

et al., 1972) Differential Scanning Calorimetry (DSC) kan worden aangewend om de

thermische stabiliteit te bepalen. Hierbij wordt een staal samen met een referentie

verwarmd en op dezelfde temperatuur gehouden. Het verschil in toegevoegde warmte is

hier dan te wijten aan ontvouwing van de proteïne door breking van de H-bruggen van de α-

helix of β-sheet structuren. (Benjwal et al., 2006) (Bruylants et al., 2005)

De tertiaire structuur van asparaginase (Figuur 1.8) werd bepaald met behulp van X-

straal kristallografie, een techniek die de relatieve positie van atomen binnen een kristal

toont, en NMR (nucleaire magnetische resonantie), een techniek waarmee men de

omgeving van een atoom kan onderzoeken. Elk monomeer is identiek en bestaat uit 2 α/β

domeinen. (Lubkowski et al., 1996) (Wehner et al., 1992)

Figuur 1.8 : Driedimensionale structuur van Erwinia chrysanthemi asparaginase. Een

van de 4 identieke monomeren is aangeduid in felle kleuren. De C-terminale uiteinden zijn

rood gekleurd, de N-terminale uiteinden blauw. Een van de actieve centra wordt

voorgesteld door het grijze gebied. (Lubkowski, 2003)

12

De quaternaire structuur van het enzym werd ook via X-straal kristallografie bepaald.

Zo weten we bijvoorbeeld dat asparaginase voorkomt als een homotetrameer, die te

beschouwen valt als een dimeer van dimeren. (Swain et al., 1993) (Lubkowski et al., 1996)

1.2.2.3. Zuiverheidsanalyse

Zuiverheid van asparaginase werd nagegaan met behulp van gelelektroforese, zowel

SDS-PAGE (natrium dodecylsulfaat polyacrylaminde gelelektroforese) als 2-dimensionale

elektroforese. Dit werd gekoppeld aan een immunoblotting. Dit laat niet enkel toe met een

bepaalde zekerheid te zeggen of het eiwit wel asparaginase is (identificatie), maar ook of er

degradatie-fragmenten, andere contaminant-eiwitten of andere onzuiverheden in het staal

zitten. (Gupta et al., 2009)

1.2.3. Actief Centrum

Asparaginasen zijn enzymen die actief zijn als homotetrameren met een 222

symmetrie (orthorhombische vorm). Elk monomeer bestaat uit ongeveer 330

aminozuurresidues (in geval van Erwinia chysanthemi zijn het er 327) die 14 β-sheets en 8 α-

helixen vormen, gerangschikt in twee te onderscheiden α/β domeinen, namelijk het grotere

N-terminale domein en het kleinere C-terminale domein (zie figuur 1.9). Beide domeinen zijn

verbonden met een linker die bestaat uit een 20-tal residues. Tussen de 4e en de 5e β-sheet

van het N-terminaal domein bevindt er zich een cross-over die linksdraaiend is, wat vrij

zelden voorkomt. Dit is een belangrijke determinant van hun activiteit. (Lubkowski et al.,

2003) (Papageorgiou et al., 2008)

Asparaginase kan beschouwd worden als een dimeer van 2 intieme dimeren en heeft

4 actieve centra. Elk van deze actieve centra bevat voornamelijk aminozuren uit het N-

terminale domein van de ene subunit, maar bevat contacten uit het C-terminaal domein van

de intiem gebonden subunit (Figuur 1.9). De twee actieve centra van elke dimeer liggen

tussen het N-terminale domein van de ene subunit en het C-terminale domein de andere

subunit. (Lubkowski et al., 2003) (Swain et al., 1993)

13

Figuur 1.9: Actief centrum van een monomeer van Erwinia chrysanthemi. Het N-terminale

domein is in het blauw afgebeeld, het C-terminale domein in het rood, de linker-regio in

het grijs. Een fragment van het tweede monomeer dat bijdraagt tot de actieve site is

afgebeeld in het licht rood. (Aghaiypour et al., 2001)

Twee aminozuurresidu’s die belangrijk zijn in het katalytisch proces en zich in het

actieve centrum bevinden zijn Thr-15 (threonine) en Tyr-29 (tyrosine) (Figuur 1.10). Thr-15

(en voor E. coli Thr-12) is geïdentificeerd als het primaire nucleofiel, Tyr-29 houdt de

aanvallende nucleofiel in de meest gunstige positie. (Kravchenko et al., 2008) Het eerste

tetraëdrische acylenzyme-tussenproduct wordt gevormd na een nucleofiele aanval door Thr-

15 op het carbonzuur koolstof van het substraat. Die koolstof ondergaat dan een nucleofiele

aanval door een watermolecule, en het tweede tetraëdrische intermediair wordt omgezet

tot het uiteindelijke product. (Aghaiypour et al., 2001)

14

Figuur 1.10: Close-up van het actief centrum van Erwinia chrysanthemi met aspartaat

(achtergrond) en sulfaat (voorgrond) gebonden. W = watermolecule, getallen zijn de

bindingslengte (in Angström) van de waterstofbrug met tussen haakjes de

standaarddeviatie. Rood= zuurstof. Blauw = stikstof. (Lubkowski et al., 2003)

In de omgeving van het actief centrum vindt men een flexibele lus (Figuur 1.11), van

residu 14 tot 33, dat de bindingsplaats afdicht bij binding van het substraat aan het enzym.

Residu’s Gly-13 (glycine) tot en met Gly-18 vormen de scharnier van de flexibele lus dat zich

systematisch aanpast aan 1 van de 2 conformaties, namelijk open of gesloten. In gesloten

toestand is de zijketen van Thr15 naar het centrum van het actieve centrum. (Lubkowski et

al., 2003)

15

Figuur 1.11 Flexibele lus van Erwinia chryanthemi asparaginase (Lubkowski et al., 2003)

Om te kunnen binden op het actieve centrum moet het substraat voorkomen in de

zwitterionvorm, m.a.w. moet asparagine elektrisch neutraal zijn. Gebonden asparagine gaat

waterstofbindingen vormen met residu’s uit het rigide deel van de pocket en residue’s van

de mobiele lus (Thr-15 en Tyr-29) waardoor er een soort “brug” ontstaat tussen beide delen.

Moleculen groter dan L-glutamine, een natuurlijk substraat, passen niet in het actieve

centrum. (Lubkowski et al., 1996) (Aghaiypour et al., 2001)

Glutamine speelt een belangrijke rol in het stikstoftransport in het bloed en

langdurige depletie van dit aminozuur gedurende de asparaginasetherapie veroorzaakt

ernstige nevenwerkingen. Sommige asparaginasen, zoals E. coli-asparaginase, hebben

glutaminase-activiteit. In deze glutaminase-activiteit zou residu Asn-248 (asparagine) een

grote rol spelen. Dit residu is in Erwinia chrysanthemi, dat geen glutaminase-activiteit

vertoont, vervangen door Ser-248 (serine). Residu 248 neemt deel in waterstofbindingen

met Asp-90 (asparaginezuur) (zowel het Ser-248 als Asn-248 residu) en met Glu-283 (enkel

het Asn-248 residu). De rol van residu Asp-90 is waarschijnlijk de conformaties van de

negatief geladen zijketens die dicht bij elkaar liggen te stabiliseren. (Lubkowski et al., 1996)

(Aghaiypour et al., 2001)

16

1.2.4. Soorten asparaginase

Er zijn heel wat species die asparaginase tot expressie brengen, waardoor deze

enzymen andere eigenschappen (zoals KM (Michaëlis constante), specifieke activiteit,

moleculair gewicht, optimale temperatuur en pH) kunnen bevatten. Voor een meer

gedetailleerde lijst wordt verwezen naar Bijlage 1.

Bacterieel: Dit koninkrijk bevat de meeste asparaginasen. Hierbij zijn het

voornamelijk de proteobacteriën die dit enzym tot expressie brengen, alsook

sommige firmicutes, deinococcus-thermus, ciliophora en actinobacteriën.

Schimmel: De ascomycota en basidiomycota zijn hier de divisies die het enzym tot

expressie brengt.

Plant: Hierbij is het vooral in de angiospermen dat asparaginase wordt

teruggevonden, hoewel er in enkele pinophyta en bryophyta ook asparaginase is

aangetroffen.

1.2.5. Stabiliteit

Asparaginase (van E. coli) heeft een vrij breed pH-activiteitsgebied gaande van pH 4,5

tot pH 11,5; hierbuiten verliest het zijn activiteit. Rond pH 4,5 en pH 11,5 zakt de activiteit

naar ongeveer 50% van de maximale activiteit. Na tijdelijke blootstelling aan deze pH’s, werd

de pH terug naar 8.5 gebracht, waarna het enzym zijn activiteit terugkreeg. Dit wijst erop dat

de conformationele veranderingen bij deze pH’s nog reversibel zijn.

Er werd een kleine stijging in activiteit opgemerkt als de pH stijgt van ongeveer 4,5

naar 10,5 (Figuur 1.9). De reden dat het activiteitsmaximum in de alkalische regio ligt, is

waarschijnlijk een gevolg van het evenwicht tussen asparaginezuur en asparagine.

Asparaginezuur in zuur milieu is geprotoneerd en heeft een grotere affiniteit voor het actief

centrum. Onder die omstandigheden wordt het een competitieve inhibitor. Bij alkalische pH

verschuift de balans richting gedeprotoneerde vorm, namelijk aspartaat. Dit is de vorm met

een lagere affiniteit voor het actief centrum. Hierdoor is de binding van het actief centrum

met asparagine bij iets hogere pH bevoordeeld.

17

Figuur 1.9 Activiteit/stabiliteits-pH relatie van E. coli asparaginase

Asparaginase kan door temperatuursstijging zijn functie volledig verliezen en deze

ook weer partieel terugwinnen, afhankelijk van de condities waarin het enzym zich bevindt.

Na opwarming (65°C, 20 min) bleek er na afkoeling (37°C) geen herstel van activiteit bij pH 5

en pH 11,5. Bij pH 8,6 werd 50% van de oorspronkelijke activiteit waargenomen. Stecher et

al. toonde hiermee aan dat er een irreversibele structurele verandering bij pH 5 en 11,5

plaatsvond, zonder herstel, terwijl er bij pH 8,6 wel partieel herstel optreed. Deze

denaturatie kan een gevolg zijn van de dissociatie van asparaginase subunits. (Stecher et al.,

1999)

18

2. OBJECTIEF

Er is tegenwoordig nog geen consensus over welke toedieningsweg (i.v. of i.m.),

snelheid van toediening en concentratie de meest effectieve en veilige is. Gezien de klinische

vraag naar infuustoediening, die afwijkt van de beperkte en enige erkende toedieningswijze

(i.m. bolus), en het gebrek aan stabiliteitsgegevens, wensen wij in deze initiële

onderzoeksfase de verschillende methoden te vergelijken waarmee we de activiteit van het

enzym als farmaceutisch preparaat kunnen bepalen.

Het hoofdobjectief van deze masterthesis is dus een comparatieve studie maken van

de verschillende methoden om de activiteit van asparaginase als farmaceutisch preparaat

te bepalen. Deelaspecten daartoe zijn:

1. De ontwikkeling van verschillende methoden, aangepast voor het onderzoek

in QC omstandigheden.

2. De evaluatie van de verschillende methoden.

3. Het vergelijken van deze methoden, gebaseerd op statistische en andere

descriptoren.

Aan de hand de aldus bekomen kengetallen, kan een prioriteitslijst van methoden

opgesteld worden.

Deze thesis is een pilootwerk, dat kadert binnen een collaboratief onderzoek om

uiteindelijk de stabiliteit van asparaginase in een farmaceutisch preparaat te kunnen

bepalen. Daarnaast zal men ook andere technieken, zoals MS en CD gebruiken om de

stabiliteit te karakteriseren.

19

3. MATERIAAL EN METHODEN

3.1. TOESTELLEN EN REAGENTIA

3.1.1. UV/Vis spectrofotometer

Het toestel waarop de metingen zijn uitgevoerd is een UV/Vis spectrofotometer

(interne referentie QR-185) “Ultraspec 4000” van Pharmacia Biotech. Deze is uitgerust met

een deuterium lamp van Cathodion. De cuvetten die gebruikt werden zijn quartz-suprasil

cuvetten met een weglengte van 1 cm. Een cuvetcorrectie werd doorgevoerd voor iedere

proefneming.

3.1.2. Centrifuge

De centrifuge is een gekoelde tafelcentrifuge “Eppendorf Centrifuge 5417” (interne

referentie QR-263), afkomstig van Voor’t Labo, Eeklo.

3.1.3. Thermomixer

Het apparaat om de Eppendorfs te verwarmen is een “Eppendorf Thermomixer

Comfort” (interne referentie QR-412). Deze werd aangekocht bij Fisher Scientific, Aalst.

3.1.4. pH meter

De gebruikte pH meter is een “SevenEasy pH Meter S20” (interne referentie QR-333),

aangeschaft bij Mettler Toledo, Schwerzenbach.

3.1.5. Waterstation

Het waterzuiveringsstation dat werd gebruikt om het water te deïoniseren is een

Arium 611VF Water Purification System (interne referentie QR-233), aangekocht bij Sartorius,

Leuven.

20

3.1.6. Balansen

De gebruikte balansen om af te wegen zijn Analytical Balance XS-105 D (interne

referentie QR-277) en Analytical Balance XS-204 (interne referentie QR-196), beide

aankomstig van Mettler Toledo, Zaventem.

3.1.7. Producten

In onderstaande Tabel 3.1 staan alle producten die voor deze masterthesis zijn

gebruikt, inclusief lotnummer en productcode.

Tabel 3.1: Gebruikte producten

Product Leverancier Productcode Lotnummer

Kwik(II)-jodide Merck (Whitehouse Station, USA) 4420 4168046

Kaliumjodide Sigma-Aldrich (St.-Louis, USA) 100934463 BCBB9119

Natriumhydroxide Fluka Analytical (Buchs, Zwitserland)

71694 1421467

DruQuaR water Jochem 14/03/2011 10h21

Ammoniumchloride UCB (Brussel, België) 1141 89079051

Natriumcarbonaat (watervrij)

UCB (Brussel, België) 1720 99D210054

Natriumwaterstofcarbonaat UCB (Brussel, België) 1707 92287083

Natrium nitroprusside Sigma-Aldrich (St.-Louis, USA) 13451 SZBA0970

Thymol Janssen Chimica (Geel, België) 15.033.95 2378912

Ethanol Chem-lab (Zedelgem, België) CL00.0112.2500 18.2400710.2400

Natriumhypochloriet Sigma-Aldrich (St.-Louis, USA) 425044 STBB7477V

Fenol kristallen Conforma S.A. (Destelbergen, België) / 100g 14253

Hydroxylamine hydrochloride

UCB (Brussel, België) 1391 94027196

Zoutzuur Sigma-Aldrich St.-Louis, USA) 30721 91770

8-hydroxyquinoline Aldrich (St.-Louis, USA) 252565-50G BCBD6040V

Absolute ethanol Riedel-de Haën (Seelze, Duitsland)

nbs 7118A

Citroenzuur monohydraat Merck (Whitehouse Station, USA) 244.1000 K16008444

Dinatriumwatterstoffosfaat dihydraat

Merck (Whitehouse Station, USA) 10.6580.1000 K28624480

Trichloorazijnzuur Sigma-Aldrich (St.-Louis, USA) 33731 90340

Ammonia Assay Kit Sigma (St.-Louis, USA) AA0100-1KT 100M6204

Malaat Dehydrogenase Sigma (St.-Louis, USA) 63228-10MG 1441510V

Aspartaat transaminase Sigma (St.-Louis, USA) 62751-1KU 069K7003V

21

β-nicotinamide Adenine Dinucleotide

Sigma (St.-Louis, USA) N4505-100MG 010M5153V

Kaliumwaterstoffosfaat Sigma-Aldrich (St.-Louis, USA) 00662-1K6 063K0147

Asparaginezuur ABC Chemicals (Lancashire, Engeland)

260204 04B23M0126

Dinatrium α-ketoglutaarzuur dihydraat

Aldrich (St.-Louis, USA) 101031942 BCBC9151V

Kaliumwaterstoffosfaat Merck (Whitehouse Station, USA) 1.048.731.000 A0188073101

Albumine Standaard BSA Thermo (Scientific Rockford, USA) 23209 IL116702

PBS-buffer Sigma (St.-Louis, USA) P-3813 060M8222

3.2. METHODEN

In de literatuur worden verscheidene technieken beschreven om de activiteit van

asparaginase te bepalen (zie sectie 1.2.2. Karakterisatie). Hieruit werden 5 methoden

geselecteerd: Nessler, Berthelot, Indooxine, Glutamaat Dehydrogenase en Aspartaat

Transaminase. De keuze werd bepaald door enkele voorafgaande overwegingen:

De substraat/productbepaling dient selectief, maar instrumenteel en

operationeel zo eenvoudig en robuust mogelijk te zijn.

De methode dient kwantificatie toe te laten, waarbij accuraatheid, precisie en

lineariteit belangrijke aspecten zijn.

Algemene kosten, inclusief analysetijd, dienen zo minimaal mogelijk gehouden te

worden.

Gezien deze “gebruikerswensen”, werden methoden gebaseerd op elektrische

geleidbaarheid (selectiviteit?) of HPLC bepalingen (eenvoud? kost?) niet weerhouden.

Methoden die finaal gebruik maken van UV-VIS werden dus verkozen. Hierbij werd steeds

voor elke methode gestart met een literatuurstudie, waarna er één protocol geselecteerd

werd op basis van de gebruiksfrequentie in publicaties en detail van de beschrijvingen (Tabel

3.2).

22

Tabel 3.2: Basisprotocols

Methode Basisprotocols

Nessler EPA method 350.2, 1974

Franklin Township Municipal Sanitary Authority, 2006

Berthelot

Searcy et al., 1964

Afkhami et al., 2008

Moliner-Martinez et al., 2005

Indooxine Frear et al., 1955

Lanvers et al., 2002

Glutamaat Dehydrogenase Sigma Aldrich gebruikersprotocol, 2008

Aspartaat Transaminase Wilkinson et al., 1972

Asselin et al., 1993

In vele gevallen ging het echter om bio-activiteitsbepalingen die asparaginase in

serum/plasma bepalen. Dit protocol werd dan door ons aangepast, waarbij eenvoud en

lineariteit de belangrijkste ontwikkelingscriteria waren.

3.2.1. Nessler

Reagentia

o Nessler reagens: 1,4 g kaliumjodide en 2,2 g kwik(II)-jodide oplossen in

enkele ml water en aanlengen tot 10 ml. 3,2 g natriumhydroxide oplossen

in enkele ml water en aanlengen tot 10 ml. Meng beide oplossingen.

Hierbij kan een kleine hoeveelheid rood-bruine neerslag van kalium

tetraiodomercuraat ontstaan. Bewaard in een donkere fles, uit het directe

zonlicht, blijft dit reagens tot 1 jaar stabiel.

23

Standaardreeks

o Ammonium referentie stockoplossing: 315,0 mg ammoniumchloride

oplossen in water en aanlengen tot 100,0 ml (1000 ppm). Hiervan 10,0 ml

pipetteren in een maatkolf van 100,0 ml en aanlengen tot de ijkstreep

(100 ppm). Van deze stockoplossing werd de standaardreeks bereid (Tabel

3.3).

Tabel 3.3: Standaardreeks Nessler

Concentratie (ppm) Volume stockoplossing (ml) Totaal volume (ml)

blanco 0,0 10,0

0.5 5,0 1000,0

1 5,0 500,0

3 6,0 200,0

5 10,0 200,0

10 5,0 50,0

15 15,0 100,0

20 10,0 50,0

Werkwijze: Van bovenstaande oplossingen werd 10,0 ml gepipetteerd in een

proefbuis en in iedere proefbuis werd 0,2 ml van de heldere fractie van het

Nessler reagens gepipetteerd. De oplossingen werden gemengd en de reactie

ging door gedurende 10 minuten. Hierna werd de absorbantie van de oplossingen

bepaald met behulp van de spectrofotometer bij een golflengte van 425 nm ten

opzichte van een blanco.

Berekeningen: Om via deze methode de concentratie van ammonium in een

onbekend staal te berekenen, stelt men een ijkcurve op van de standaardreeks.

Met de vergelijking van die ijkcurve kan men, met behulp van de absorbantie, de

concentratie bepalen.

24

3.2.2. Berthelot

Reagentia

o Fenol kleurreagens: 5 g fenol en 25 mg natrium-nitroprusside oplossen in

water en aan te lengen tot 100 ml.

o Alkalisch hypochlorietreagens: 2,5 g natriumhydroxide oplossen in water,

3 ml 10-15% natriumhypochloriet toevoegen en aanlengen tot 100 ml.

Standaardreeks


oplossen in water en aanlengen tot 100,0 ml (1000 ppm). Hiervan 10,0 ml

pipetteren in een maatkolf van 100,0 ml en aanlengen tot de ijkstreep

(100 ppm). Hiervan nogmaals 10,0 ml pipetteren in een maatkolf van

100,0 ml en aanlengen tot de ijkstreep (10 ppm). De standaardreeks werd

vanuit deze stockoplossing bereid (Tabel 3.4).

Tabel 3.4: Standaardreeks Berthelot


blanco 0,0 10,0

0,1 1,0 100,0

0,2 2,0 100,0

0,5 5,0 100,0

1 10,0 100,0

3 30,0 100,0

5 50,0 100,0

Werkwijze: 1,0 ml van het fenol kleurreagens werd toegevoegd aan 10,0 ml van

de ammonium standaarden, waarna 30 seconden geschud werd. Vervolgens

werd 1,0 ml van het alkalisch hypochlorietreagens toegevoegd en opnieuw

gedurende 30 seconden geschud. De reactie ging gedurende 15 minuten door bij

37,0°C. Hierna werd de absorbantie van de stalen gemeten bij 633 nm ten

opzichte van een blanco.

25

Berekeningen: Aan de hand van de ijkcurve, die kan worden opgesteld met

behulp van de standaardreeks, kan men de concentratie van ammonium in een

onbekend staal bepalen.

3.2.3. Indooxine

Reagentia

o 8-hydroxyquinoline reagens: 0,2 g 8-hydroxyquinoline oplossen in 10 ml

absolute ethanol (2% (w/v)). 5,3 g natriumcarbonaat oplossen in water en

aanlengen tot 50 ml (1M). Meng 10 ml van de 2% (w/v) 8-

hydroxyquinoline-oplossing met 30 ml van de 1M natriumcarbonaat-

oplossing.

o 0,05 M fosfaatbuffer (pH 6,8): 7,15 g dinatriumwaterstoffosfaat oplossen

in water en aanlengen tot 100 ml. 1,05 g citroenzuur oplossen in water en

aanlengen tot 50 ml. Meng 77,3 ml van de dinatriumwaterstoffosfaat-

oplossing met 22,7 ml van de citroenzuuroplossing.

o Trichloorazijnzuur (12% (w/v)): 1,2 g trichloorazijnzuur oplossen in 10 ml

water.

o 0,01 N HCl oplossing: 100 µl 37 % (m/m) aanlengen tot 100 ml met water.

Standaardreeks

o Hydroxylamine referentie stockoplossing: 84,17 mg

hydroxylamine.hydrochloride oplossen in water en aanlengen tot 1,0 l (40

ppm). Hiervan 25,0 ml pipetteren in een maatkolf van 100 ml, naar pH 3,0

brengen met behulp van een 0,01 N HCl-oplossing en aanlengen tot aan

de ijkstreep (10 ppm). Deze stockoplossing werd gebruikt om de

standaardreeks te bereiden (Tabel 3.5)

26

Tabel 3.5: Standaardreeks Indooxine


blanco 0,0 10,0

1 1,0 10,0

2 2,0 10,0

3 3,0 10,0

4 4,0 10,0

5 5,0 10,0

6 6,0 10,0

7 7,0 10,0

8 8,0 10,0

9 9,0 10,0

10 10,0 10,0

Werkwijze: 1,0 ml van de standaarden werd aangelengd met 0,8 ml water.

Daarna werd 1,0 ml buffer toegevoegd, alsook 2,0 ml trichloorazijnzuur oplossing.

Dit werd gemengd en daarna werd 2,0 ml van het 8-hydroxyquinoline reagens toe

gevoegd. De stop werd onmiddellijk op de proefbuis geplaatst en er werd hevig

geschud. De oplossingen werden gedurende 1 minuut in een warmwaterbad van

95,0°C verwarmd. De oplossingen lieten we nadien gedurende ongeveer 15

minuten afkoelen in een rek tot kamertemperatuur. Hierna werd de absorbantie

bepaald bij 705 nm ten opzichte van een blanco.

Berekeningen: De concentratie van hydroxylamine in een onbekend staal kan

berekend worden door van de standaard reeks een ijkcurve op te stellen. Met de

vergelijking van die ijkcurve kan men de concentratie van het staal berekenen.

3.2.4. Glutamaat dehydrogenase

Reagentia

o “Ammonia Assay” reagens: Reconstitueer één vial door 10,0 ml water in

de vial te pipetteren, meng door inversie. Gesloten blijft de

gereconstitueerde vial stabiel bij 2-8°C gedurende 2 weken.

27

Standaardreeks


oplossen in water en aanlengen tot 500,0 ml (100 ppm). Vanuit deze

stockoplossing werd de standaardreeks bereid, die gelegen is tussen de

aanbevolen range van de “Assay Kit”, zijnde 0,2 – 15 ppm. (Tabel 3.6).

Tabel 3.6: Standaardreeks Glutamaat Dehydrogenase

Werkwijze: In een cuvet werd 1,0 ml van het reagens gepipetteerd, samen met

100 µl van de oplossing met gewenste ammoniak concentratie of water. De

inhoud werd gemengd en geïncubeerd gedurende 5 minuten bij 18-35°C. Water

werd als referentie genomen om de absorbantie bij 340 nm op nul te zetten.

Daarna werden de absorbanties van de verschillende cuvetten bepaald bij 340

nm. Bij elke oplossing voegden we nadien 10,0 µl glutamaat dehydrogenase toe

en lieten opnieuw gedurende 5,0 minuten incuberen bij 18-35°C waarna de

absorbantie opnieuw werd gemeten.

Berekeningen: De concentratie van ammonium in een onbekend staal kan

bepaald worden door middel van een ijkcurve, opgesteld met behulp van de

standaardreeks.

De concentratie kan echter ook berekend worden via Vergelijking 3.1:

Δ A = Ainitieel – AFinaal.

Δ(ΔAStaal) = ΔAstaal - ΔABlanco


blanco 0,0 1,0

0,5 5,0 1000,0

1 5,0 500,0

3 6,0 200,0

5 10,0 200,0

10 5,0 50,0

15 15,0 100,0

20 10,0 50,0

28

# mg NH3/ml oorspronkelijk staal

=

(3.1)

=

=

A = Δ(ΔAstaal)

TV = Totaal Volume van het assay in ml

SV = Staal Volume in ml

MW van ammonia = 17 g/mol

F= Verdunningsfactor van bij staalvoorbereiding

ε = millimolaire extinctiecoëfficiënt voor NADPH bij 340 nm [in mM-1 cm-1 of

equivalent ml/µmol)(1/cm)]

d = weglengte van het licht (cm) = 1 cm

3.2.5. Aspartaat Transaminase

Reagentia

o Fosfaatbuffer (1,0 M en 0,1 M): 13,6 g kaliumdiwaterstoffosfaat en 3,3 g

natriumhydroxide oplossen in water en aanlengen tot 100 ml (1,0 M, pH

7,5). Pipetteer hiervan 25 ml in een maatkolf van 100 ml en leng aan tot

de ijkstreep.

o NADH oplossing: 4 mg β-NADH oplossen in 2 ml 0,1 M fosfaatbuffer. Deze

oplossing is slechts 1 dag stabiel.

o α-ketoglutaarzuur oplossing: 0,73 g α-ketoglutaarzuur oplossen in 35 ml

water en 5 ml buffer. De pH werd gemeten en indien nodig gecorrigeerd

naar 7,5. Deze oplossing is een maand houdbaar bij 4 °C

29

o Aspartaat transaminase oplossing (9-10 U): 30 µl aspartaat transaminase

suspensie (434 U/mg) pipetteren in een maatkolf van 2 ml en aanlengen

tot de ijkstreep met 0,1 M fosfaatbuffer.

o Malaat dehydrogenase oplossing (9-10 U): 1 mg malaat dehydrogenase

(432 U/mg) op lossen in 0,1 M fosfaatbuffer en aanlengen tot 5 ml.

Standaardreeks

o Asparaginezuur referentie stockoplossing: 25,0 mg asparaginezuur op

lossen in 350,0 ml water en 50,0 ml 1,0 M fosfaatbuffer, de pH indien

nodig corrigeren naar 7,5 en aanlengen tot 500,0 ml met water (50 ppm).

Deze stockoplossing werd gebruikt om de standaardreeks te bereiden

(Tabel 3.7).

Tabel 3.7: Standaardreeks Aspartaat Transaminase


blanco 0,0 50

5 5,0 50

10 10,0 50

15 15,0 50

20 10,0 25

25 25,0 50

30 15,0 25

35 35,0 50

40 20,0 25

Werkwijze: 1,3 ml van de 0,1 M fosfaatbuffer, 1,0 ml asparaginezuuroplossing,

0,2 ml NADH, 0,1 ml malaat dehydrogenase en 0,2 ml aspartaat transaminase

werden in een proefbuis gepipetteerd en geïncubeerd gedurende 15 minuten bij

25,0 °C. De reactie werd gestart door 0.2 ml van de α-ketoglutaarzuur oplossing

toe te voegen, waarna voorzichtig werd gemengd. De reactie ging door bij 25,0 °C

gedurende 5,0 minuten. De daling in absorbantie werd na deze 5 minuten

bepaald bij 340 nm.

30

Berekeningen: Aan de hand van een ijkcurve, die kan worden opgesteld met de

standaardreeks, kan men de concentratie van asparaginezuur in een onbekend

staal bepalen.

3.2.6. Methodenevaluatie

De stockoplossingen werden als volgt bereid:

Stockoplossingen Protocol

o Ammonium stockoplossing: 20,0 mg ammoniumchloride in water en

aanlengen tot 100,0 ml (63,7 ppm). Dit 10 en 100 maal verdunnen om

respectievelijk een 6,37 ppm en 0,637 ppm stockoplossing te bekomen.

o Hydroxylamine stockoplossing: 26,0 mg hydroxylamine.hydrochloride in

water en aan lengen tot 200,0 ml. Dit 10 maal verdunnen teneinde een

6,18 PPM stockoplossing te bekomen.

o Asparaginezuur stockoplossing: 20,0 mg asparaginezuur in water en

aanlengen tot 100,0 ml. Deze oplossing 10 maal verdunnen, teneinde een

20 ppm stockoplossing te bekomen.

Stockoplossingen andere stalen

o Ammonium stockoplossing: 200,0 mg ammoniumchloride in PBS en

aanlengen tot 100,0 ml

o Hydroxylamine stockoplossing: 130,0 mg hydroxylamine.hydrochloride in

PBS en aanlengen tot 100,0 ml.

o Asparaginezuur stockoplossing: 250,0 mg asparaginezuur in PBS en

aanlengen tot 50,0 ml.

31

4. RESULTATEN

4.1. NESSLER

In Bijlage 2 vindt men de absorbantiewaarden terug, gemeten bij 425 nm. Figuur 4.1

geeft deze waarden grafisch weer. Op de bekomen waarden werd een lineaire regressie

toegepast: R² was 0,9989, de F-waarde bedroeg 1800,6. De 95% betrouwbaarheids-

intervallen voor het snijpunt en de richtingscoëfficiënt zijn respectievelijk [-0,03764;0,04450]

en [0,1226;0,1503]. De R² en F-waarde vertellen ons dat er een sterk lineair verband is

tussen de concentratie en de absorbantie bij 425 nm. In Bijlage 2 vindt men eveneens de

plot van de gestandaardiseerde residuen, waarop men een parabolische vorm kan

waarnemen. Deze kan indicatief zijn voor een kwadratisch verloop. Dit is echter niet zo daar

de kwadratische coëfficiënt niet significant is. Gezien het betrouwbaarheidsinterval van het

snijpunt de nul bevat, kunnen we er ook vanuit gaan dat deze lineaire curve door de

oorsprong gaat, zodat in de toekomst een 1-puntscalibratie kan volstaan. Ervan uitgaande

dat absorbantiewaarden boven 1 minder gunstig zijn voor kwantitatieve doeleinden, is de

bovengrens van het werkzame gebied met onze Nessler methode dus 7,3 ppm.

Figuur 4.1: ijkcurve Nessler

y = 0,1365x + 0,0034R² = 0,9989

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

1,1

0 1 2 3 4 5 6 7

Ab

sorb

anti

e (

42

5 n

m)

PPM

Nessler: ijkcurve

32

4.2. BERTHELOT

De absorbantiewaarden, gemeten bij 633 nm, vindt men terug in Bijlage 3. Deze

waarden worden grafisch weergegeven in Figuur 4.2. Op de bekomen waarden werd een

lineaire regressie toegepast: R² was op 0,9922, de F-waarde bedroeg 380,8. Het 95%

betrouwbaarheidsinterval voor het snijpunt is [-0,1180;0,05323] en het 95 %

betrouwbaarheidsinterval voor de richtingscoëfficiënt is [0,7892;1,097]. Het

betrouwbaarheidsinterval van het snijpunt bevat de nul, waardoor we kunnen aannemen

dat deze deze ijkcurve ook door de oorsprong gaat, waardoor in de toekomst een 1-

puntscalibratie kan volstaan. Uit de R² en F-waarde kunnen we afleiden dat er tussen de

concentratie en de absorbantie bij 633 nm een sterk lineair verband is, wat bevestigd wordt

door de gestandaardiseerde residuen (Bijlage 3). De helling bij Berthelot is veel groter dan

deze bij Nessler, waaruit we kunnen concluderen dat Berthelot een grotere sensitiviteit

heeft. Absorbantiewaarden boven de 1 zijn, zoals bij 4.1 reeds aangehaald, minder geschikt

voor kwantitatieve doeleinden. Daarom is de bovenlimiet van deze methode 1,1 ppm.

Figuur 4.2: ijkcurve Berthelot

y = 0,943x - 0,0324R² = 0,9922

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

1,1

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Ab

sorb

anti

e (

63

3 n

m)

PPM

Berthelot: ijkcurve

33

4.3. INDOOXINE

Figuur 4.3 geeft de absorbantiewaarden, die we hebben bekomen bij 705 nm,

grafisch weer. Deze waarden, samen met de grafiek van de gestandaardiseerde residuen,

vindt men terug in Bijlage 4. Op deze waarden werd een lineaire regressie toegepast: de

gevonden R² was 0, 9975 terwijl de F-waarde 3153,1 bedroeg. Uit deze gegevens kunnen we

afleiden dat er voor deze methode een sterk lineair verband bestaat tussen de concentratie

en de absorbantie bij 705 nm Voor het snijpunt en de richtingscoëfficiënt waren de 95%

betrouwbaarheidsintervallen respectievelijk [0,005816;0,05192] en [0,08675;0,09416]. Het

interval van het snijpunt bevat de waarde nul niet, waardoor we niet met zekerheid kunnen

zeggen dat een 1-puntscalibratie met deze methode mogelijk is. De sensitiviteit van deze

methode kleiner dan deze van Berthelot en Nessler, daar de richtingscoëfficiënt kleiner is

dan die van de twee voorgaande methoden. De bovenlimiet bij onze Indooxine methode is

10,7 ppm (Absorbantie = 1) .

Figuur 4.3: ijkcurve Indooxine

y = 0,0905x + 0,0289R² = 0,9975

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 2 4 6 8 10 12

Ab

sorb

anti

e (

70

5 n

m)

PPM

Indooxine: ijkcurve

34

4.4. GLUTAMAAT DEHYDROGENASE

Bijlage 5 bevat de absorbantiewaarden van deze methode, gemeten bij 340 nm en

Figuur 4.4 geeft deze waarden grafisch weer. De resultaten van de lineaire regressie, die op

deze waarden werden toegepast, zijn de volgende: R² was 0, 9991 en de F-waarde bedroeg

6377,6. Deze resultaten wijzen op een sterk lineair verband tussen de concentratie en

absorbantie bij 340 nm. In bijlage 5 vindt men ook de grafische weergave van de

gestandaardiseerde residuen terug, die ook een lineair verband bevestigen. Het 95%

betrouwbaarheidsinterval van het snijpunt bedroeg [0,9902;1,0091], het 95%

betrouwbaarheidsinterval de richtingscoëfficiënt bedroeg [-0,03258;-0,03065]. Dit interval

bevat absolute waarden kleiner dan de richtingscoëfficiënten van de voorgaande methoden,

waardoor we kunnen besluiten dat deze methode minder sensitief is. Daar het bij deze

methode om een daling in absorbantie gaat, hebben we vastgelegd dat een daling van meer

dan 0,5 absorbantie-eenheden minder gunstig is voor een kwantitatieve bepaling. De

bovenlimiet van de range is bijgevolg 15,8 ppm voor deze methode.

Figuur 4.4: ijkcurve Glutamaat Dehydrogenase

y = -0,0316x + 0,9996R² = 0,9991

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

0 5 10 15 20 25

Ab

sorb

anti

e (

34

0 n

m)

PPM

Glutamaat Dehydrogenase: ijkcurve

35

4.5. ASPARTAAT TRANSAMINASE

In Bijlage 6 vindt men de absorbantiewaarden, gemeten bij 340 nm, die op Figuur 4.5

grafisch weergegeven worden. Op deze waarden werd een lineaire regressie toegepast: R²

was 0, 9963 en de F-waarde bedroeg 1864,9. Hierdoor kunnen we besluiten dat er een sterk

lineair verband bestaat tussen de concentratie en de absorbantie bij 340 nm, wat bevestigd

wordt door de gestandaardiseerde residuen die terug te vinden zijn in Bijlage 6. De

betrouwbaarheidsintervallen voor het snijpunt en de richtingscoëfficiënt zijn respectievelijk

[0,8854;0,9135] en [-0,01137;-0,01019]. De richtingscoëfficiënt heeft een absolute waarde

kleiner dan de voorgaande methodes, waardoor we kunnen besluiten dat deze methode de

minst sensitieve is. Gezien dalingen van meer dan 0,5 absorbantie-eenheden minder gunstig

zijn voor kwantitatieve doeleinden, werd de bovengrens het werkzaam gebied voor onze

methode bepaald op 46,3 ppm.

Figuur 4.5: ijkcurve Aspartaat Transaminase

y = -0,0108x + 0,8995R² = 0,9963

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Ab

sorb

anti

e (

34

0 n

m)

PPM

Aspartaat Transaminase: ijkcurve

36

4.6. GESIMULEERDE ASPARAGINASE METHODENEVALUATIE

4.6.1. Situering

Om na te gaan of de methoden ook toepasbaar zijn wanneer ze gebruikt worden om

de activiteit van asparaginase te bepalen, werd elke methode onderworpen aan een

gesimuleerde asparaginase-activiteitsbepaling. Er werd in deze fase van methode-

ontwikkeling dus nog niet gewerkt met asparaginase zelf, gezien de hoge kostprijs ervan.

Figuur 4.6: schema asparaginase

Steeds werden 4 verschillende stalen aangemaakt, ieder in drievoud: staal W (water),

staal B (buffer), staal A (acid) en staal BSA. Het staal W volgde de bereiding zoals beschreven

wordt in sectie 3.2.1. en in vorige secties geëvalueerd werden. De stalen B, A en BSA volgden

het schema afgebeeld in Figuur 4.6 en de samenstelling van de stalen vindt men in Tabel 4.1.

Hierdoor kan een eventuele interferentie of interactie opgespoord worden.

Tabel 4.1: Staalsamenstelling

Volume stock (ml) Volume BSA (µl) Volume HCl (µl) Volume PBS (µl) Totaal volume (ml)

Staal W 0 0 0 0 2,21

Staal B 2 0 0 21 2,21

Staal A 2 0 10 11 2,21

Staal BSA 2 11 10 0 2,21

37

Vooraleer het afgenomen supernatans kan worden gebruikt, moet deze verdund

worden in functie van de methode gezien de verschillende werk-concentraties. Tabel 4.2

geeft de verdunningsfactoren en uiteindelijke concentraties weer.

Tabel 4.2: Verdunningsreeks

Protocol Verdunningsfactor Eindconcentratie te meten product (ppm)

Nessler 1/100 6,39

Berthelot 1/1000 0,639

Indooxine 1/100 6,18

Glutamaat Dehydrogenase 1/100 6,39

Aspartaat Transaminase 1/250 19,97

Hieronder vindt men de resultaten van de methodenevaluatie. Ieder staal werd

standaard in twee- of drievoud bereid. Gemiddelden, st. dev. (standaard deviatie) en RSD

(relatieve standaard deviatie) worden gegeven van de verschillende stalen, alsook de

resultaten van de one-way ANOVA en Post-Hoc analyses (Tukey’s HSD (Honestly Significant

Difference), Bonferroni en LSD (Least Significant Difference)).

4.6.2. Nessler

Tabel 4.3 toont de gemeten waarden van de stalen onderworpen aan de Nessler

methode. De RSD’s van deze stalen hebben een waarde die lager is dan 2,5: dit is de door

ons opgelegde grens waaronder we de herhaalbaarheid als aanvaardbaar definiëren.

38

Tabel 4.3: Nessler

Staal Absorbantie425 nm Statistiek

Staal W1 0,877 Gemiddelde: 8,72E-01

Staal W2 0,872 St. Dev.: 5,00E-03

Staal W3 0,867 RSD: 5,73E-01

Staal B1 0,862 Gemiddelde: 8,61E-01

Staal B2 0,862 St. Dev.: 2,31E-03

Staal B3 0,858 RSD: 2,68E-01

Staal A1 0,862 Gemiddelde: 8,54E-01

Staal A2 0,847 St. Dev.: 7,64E-03

Staal A3 0,852 RSD: 8,95E-01

Staal BSA1 0,849 Gemiddelde: 8,58E-01

Staal BSA2 0,866 St. Dev.: 8,54E-03

Staal BSA3 0,859 RSD: 9,96E-01

Figuur 4.7: Plot Nessler

De Levene homogeniteitstest van de variantie leverde een Levene statistiek waarde op van

1,170 met significantie 0,380. Vervolgens gaf een one-way ANOVA analyse ons een F(3,8) =

4,549 met significantie 0,038. Gezien onze F-waarde statistisch significant is, kunnen we

besluiten dat minstens een van de gemiddelden statistisch verschillend is van de andere.

Omwille hiervan werden Post-Hoc testen uitgevoerd en deze wezen uit dat er een significant

39

verschil is tussen de staal W- en staal A-populatie (Tukey HSD, Bonferroni en LSD) en tussen

de staal W- en staal BSA-populatie ( enkel LSD). Er worden 2 homogene subsets gedefinieerd,

namelijk staal W-staal B-staal BSA en staal B-staal A-staal BSA. Figuur 4.7 geeft grafisch de

resultaten weer. De resultaten van de Levene-, ANOVA- en Post Hoc-testen vindt men terug

in Bijlage 7.

4.6.3. Berthelot

In Tabel 4.4 worden de gemeten waarden getoond van de stalen die werden

onderworpen aan de Berthelot methode. Deze stalen hebben RSD’s met een waarde die

lager is dan 2,5, wat een goede herhaalbaarheid aantoont.

Tabel 4.4: Berthelot

Staal Absorbantie633

nm Statistiek


Staal W2 0,608 St. Dev.: 3,51E-03

Staal W3 0,615 RSD: 5,74E-01

Staal B1 0,624 Gemiddelde: 6,25E-01

Staal B2 0,624 St. Dev.: 2,31E-03

Staal B3 0,628 RSD: 3,69E-01

Staal A1 0,632 Gemiddelde: 6,28E-01

Staal A2 0,623 St. Dev.: 4,73E-03

Staal A3 0,630 RSD: 7,52E-01

Staal BSA1 0,625 Gemiddelde: 6,22E-01



40

Figuur 4.8: Plot Berthelot

De Levene statistiek gaf ons een waarde 0,741 met significantie 0,557, wat ons toeliet

om een ANOVA uit te voeren. Deze ANOVA resulteerde in F(3,8) = 12,800 met significantie

0,002. Met andere woorden, de vier stalen komen niet uit eenzelfde populatie. De Post-Hoc

testen toonden aan dat de W-stalen statistisch significant verschillend zijn van de drie

andere stalen, zoals Figuur 4.8 visueel weergeeft. De detailresultaten van de statistische

testen vindt men terug in bijlage 8.

4.6.4. Indooxine

De gemeten waarden van de stalen van de indooxine methode vindt men terug in

Tabel 4.5. De waarden van de RSD’s zijn kleiner dan 2,5. De Levene statistiek had een waarde

0,075 en significantie 0,972, waardoor we een ANOVA konden uitvoeren. Deze one-way

ANOVA gaf een F(3,8) = 36,975 met significantie 4,9 x 10-5. De F waarde was significant,

waardoor we Post-Hoc analysesuitvoerden die aantoonden dat er een statistisch significant

verschil is tussen de populatie van staal W en de andere stalen. De 2 homogene subsets

41

worden grafisch weergegeven in Figuur 4.9. De resultaten van de statistische testen vindt

men terug in bijlage 9.

Tabel 4.5: Indooxine

Staal Aborbantie705 nm Statistiek


Staal W2 0,637 St. Dev.: 1,35E-02

Staal W3 0,652 RSD: 2,08E+00

Staal B1 0,5701 Gemiddelde: 1,12E+00

Staal B2 0,5491 St. Dev.: 2,15E-02

Staal B3 0,5591 RSD: 1,92E+00

Staal A1 0,5781 Gemiddelde: 1,15E+00

Staal A2 0,5641 St. Dev.: 2,36E-02

Staal A3 0,5871 RSD: 2,05E+00

Staal BSA1 0,5881 Gemiddelde: 1,16E+00

Staal BSA2 0,5841 St. Dev.: 1,99E-02

Staal BSA3 0,5691 RSD: 1,71E+00 1 ) Deze waarden zijn gecorrigeerde waarden, de concentratie bedroeg 12.34 ppm tov 6.18 ppm voor de waarden van referentie

Figuur 4.9: Plot Indooxine

42

4.6.5. Glutamaat Dehydrogenase

Tabel 4.6 geeft de gemeten waarden weer van de stalen van de Glutamaat

Dehydrogenase methode.

Tabel 4.6: Glutamaat Dehydrogenase

Staal (PPM) Absorbantieinitieel,340 nm Absorbantieeind, 340 nm ΔA Δ(ΔA) Statistiek

BLANCO 1,033 1,001 0,032

Staal W1 1,018 0,775 0,243 0,211 Gemiddelde: 2,11E-01

Staal W2 1,023 0,781 0,242 0,210 St. Dev.: 7,07E-04

RSD: 3,36E-01

Staal B1 1,029 0,778 0,251 0,219 Gemiddelde: 2,20E-01

Staal B2 1,017 0,765 0,252 0,220 St. Dev.: 7,07E-04

RSD: 3,22E-01

Staal A1 1,027 0,773 0,254 0,222 Gemiddelde: 2,25E-01

Staal A2 1,037 0,777 0,260 0,228 St. Dev.: 4,24E-03

RSD: 1,89E+00

Staal BSA1 1,025 0,774 0,251 0,219 Gemiddelde: 2,22E-01

Staal BSA2 1,024 0,771 0,253 0,221 St. Dev.: 3,61E-03

Staal BSA3 1,026 0,768 0,258 0,226 RSD: 1,62E+00

Figuur 4.10: Plot Glutamaat Dehydrogenase

43

De RSD’s van deze stalen liggen allen onder de grens van 2,5, waardoor de

herhaalbaarheid aanvaardbaar is. De Levene statistiek werd gevonden op 4,246 met

significantie 0,077, waardoor we een ANOVA konden uitvoeren. Deze ANOVA gaf als

resultaat F(3,5) = 8,934 met significantie 0,019 , waaruit we kunnen besluiten dat niet alle

stalen tot dezelfde populatie behoren. De hierop volgende Post-Hoc analyses toonden aan

dat staal W hier een afwijkend gedrag vertoont. Op Figuur 4.10 kunnen deze staalresultaten

visueel worden gezien. De statistische resultaten vindt men terug in bijlage 10.

4.6.6. Aspartaat Transaminase

De gemeten waarden van de Aspartaat Transaminase methode zijn terug te vinden

in Tabel 4.7. De goede herhaalbaarheid van de methode wordt aangetoond door de RSD’s

van de stalen die een waarde hebben die lager ligt dan 2,5.. We voerden een ANOVA uit en

deze resulteerde in F(3,4) = 75,526 met significantie 0,001, waaruit we concludeerden dat

minstens één van de stalen tot een verschillende populatie behoorde. Met behulp van de

daaropvolgende Post-Hoc analyses vonden we de twee variatie-populaties, namelijk staal W

enerzijds en staal B-staal A-staal BSA anderzijds, zoals grafisch weergegeven in Figuur 4.11.

De statistische resultaten vindt men terug in bijlage 11.

Tabel 4.7: Aspartaat Transaminase

Staal Absorbantie340 nm Statistiek

BLANCO 1,004 Gemiddelde: 7,60E-01

Staal W1 0,766 St. Dev.: 8,49E-03

Staal W2 0,754 RSD: 1,12E+00

Gemiddelde: 8,26E-01

Staal B1 0,828 St. Dev.: 3,54E-03

Staal B2 0,823 RSD: 4,28E-01


Staal A1 0,828 St. Dev.: 4,24E-03

Staal A2 0,822 RSD: 5,14E-01




44

Figuur 4.11: Plot Aspartaat Transaminase

45

5. DISCUSSIE

Met behulp van alle gegevens uit de sectie Resultaten, kunnen we nu een statistische

en niet-statistische vergelijking maken van de 5 methoden, om uiteindelijk de beste

methode te selecteren.

5.1. STATISTISCH

Onderstaande tabel geeft de belangrijkste eigenschappen weer van de verschillende

methodes, bekomen met de statistische gegevens uit de sectie Resultaten.

Tabel 5.1: Statistische methodenvergelijking

Nessler Berthelot Indooxine

Glutamaat Dehydrogenase

Aspartaat Transaminase

Bovenlimiet Range (ppm)

7,30 1,10 10,74 15,80 46,33

Herhaalbaarheid (RSD)

5,22E-01 3,11E-01 1,39E-00 1,15E-00 5,73E-01

Lineariteit F 1800,6 380,8 3153,1 6377,6 1864,9

R² 0,9989 0,9922 0,9975 0,9991 0,9963

LoD (ppm) 0,073 0,049 0,15 0,24 1,44

LoQ (ppm) 0,30 0,082 1,24 0,80 4,80

Sensitiviteit 1,37E-01 9,43E-01 9,05E-02 -3,16E-02 -1,08E-02

We definieerden de bovenlimiet van het lineaire gebied (range) als de concentratie

van het analyt (in ppm) die overeenstemt met 1 absorptie-eenheid, daar we er vanuit gaan

dat absorbantiewaarden boven 1 minder geschikt zijn voor robuuste kwantitatieve

doeleinden. Bij Glutamaat Dehydrogenase en Aspartaat Transaminase is de bovengrens

gedefinieerd als de concentratie die een daling van 0,500 absorptie-eenheden veroorzaakt.

De bovengrenzen werden bepaald met behulp van de lineaire vergelijking van de ijkcurve.

De herhaalbaarheid werd bepaald aan de hand van de metingen die men terug vindt

onder 4.6.1. De RSD’s werden berekend met behulp van de gepoolde standaarddeviatie. De

concentraties waarbij dit gebeurde waren 6,37 ppm voor Nessler en Glutamaat

Dehydrogenase, 0,637 ppm voor Berthelot, 6,18 ppm voor Indooxine en 20 ppm voor

46

Aspartaat Transaminase. Deze concentraties liggen ongeveer in het midden van de range. De

herhaalbaarheid krijgt een waarde < 2,5 wanneer geen enkele RSD deze grens overschrijdt.

De lineariteit werd beoordeeld aan de hand van 2 descriptoren, namelijk de F- en de

R²-waarde. Samen geven deze waarden aan of er een sterk lineair verband is tussen de

concentratie en de absorbantie bij een bepaalde golflengte. Een F-waarde groter dan 20 en

een R² groter dan 0,99 zijn de vereisten.

LoD (Detectielimiet) en LoQ (Kwantificatielimiet) werden berekend met behulp van

de gepoolde standaard deviatie sp, berekend aan de hand van de Vergelijking (5.1):

(5.1)

met de waarden die men terug vindt onder 4.6.1.2. resultaten. LoD en LoQ zijn die

concentraties die overeenstemmen met 3 x sp voor LoD en 10 x sp voor LoQ en die berekend

werden met behulp van de lineaire vergelijking van de ijkcurves.

De sensitiviteit wordt weerspiegeld door de richtingscoëfficiënt van de ijkcurve. Hoe

steiler deze curve verloopt, hoe gevoeliger de methode is. De waarden in de tabel zijn de

richtingscoëfficiënten die men terug vindt op de grafieken in 4.1 tot en met 4.5, en die dus

de verandering in absorbantie per ppm analyt weergeven.

Zoals blijkt uit Tabel 5.1 is aan de voorwaarde van lineariteit bij iedere methode

voldaan, gezien de hoge F- en R²-waarden. Geen enkel staal in geen enkel protocol heeft een

RSD die hoger ligt dan 2,5, de arbitraire waarde door ons vastgelegd, waardoor we kunnen

besluiten dat ieder protocol een voldoende herhaalbaarheid vertoont. De belangrijkste

selectiecriteria zijn de LoQ, die bij voorkeur zo laag mogelijk ligt, en de sensitiviteit, die bij

voorkeur zo hoog mogelijk dient te zijn.

De selectiviteit met betrekking tot de asparaginas condities tonen aan dat voor alle

methoden het waterstaal zich anders gedraagt dan de 3 andere stalen. Echter, dit hoeft geen

onoverkomelijk probleem te zijn, gezien de keuze van de referentie standaard. Uit deze

statistische methodenvergelijking blijkt Berthelot de laagste detectielimiet te hebben, met

47

de beste gevoeligheid. Nessler was statistisch de tweede meest geschikte methode, met het

tweede laagste detectielimiet en de tweede beste gevoeligheid. Indooxine eindigt statistisch

op de derde plaats , Glutamaat Dehydrogenase als vierde en Aspartaat Transaminase als

vijfde.

5.2. NIET-STATISTISCH

In de Tabel 5.2 vindt men een niet-statistische beoordeling van de verschillende

methoden terug.

Tabel 5.2: Niet-statistische methodenvergelijking

Nessler Berthelot Indooxine Glutamaat Dehydrogenase Aspartaat Transaminase

Aantal producten1 3 (1) 4 (2) 7 (4) 2 (1) 6 (6)

Tijd 13,5 min 20 min 25,5 min 11 min 30 min

Prijs 0,4064 € 0,9409 € 0,4430 € 1,8831 € 2,3158 €

Moeilijkheidsgraad 1 3 6 3 13

1) De waarde tussen haakjes is het aantal reagentia dat met deze producten wordt bereid.

De parameter “Aantal producten” geeft weer hoeveel verschillende producten er

nodig zijn om de nodige reagentia te bereiden, stockoplossingen en water niet inbegrepen.

De waarde tussen haakjes is het aantal reagentia dat hiermee wordt bereid.

De parameter “Tijd” is de tijd nodig om de proef uit te voeren. Het correct afwegen

of pipetteren van 1 product wordt gerekend op een halve minuut, het bereiden van een

reagens op 1 minuut. Voor verwarmen, afkoelen, schudden, etc. worden de aangegeven of

werkelijke tijden in rekening gebracht.

De parameter “Prijs” weerspiegelt de kost om de proef uit te voeren op 1 staal.

48

De parameter “Moeilijkheidsgraad” Vergelijking 5.2 weergegeven:

(5.2)

#R: het aantal gemaakte reagentia

#pH: het aantal opgegeven pH-verificatie/correcties.

#T: Het aantal stappen die een specifieke temperatuur vereisen

#t: Het aantal stappen met een kritische tijdsduur. Deze worden een gewicht van 2

toegekend.

Nessler blijkt de eenvoudige en goedkoopste methode te zijn met een relatief korte

tijdsduur, waardoor deze aan de hand van de niet-statistische descriptoren als eerste keuze

wordt genomen. Een tweede plaats werd toegekend aan Berthelot, met een lage

moelijkheidsgraad en relatief lage kost. Glutamaat Dehydrogenase, met zijn vergelijkbare

moeilijkheidsgraad ten opzichte van Berthelot maar een kostprijs die tweemaal zo hoog ligt,

is volgens deze niet-statistische methodenvergelijken de derde aangewezen methode.

Indooxine volgt als vierde methode en Aspartaat Transaminase maakt het lijstje af met een

hoge moelijkheidsgraad en kostprijs.

Samenvattend kan men stellen dat Berthelot de eerst aangewezen keuze is, daar de

statistische eigenschappen zwaarder doorwegen dan de niet-statistische, gevolgd door

Nessler. Indooxine krijgt de derde plaats toebedeeld, daar deze statistisch iets beter is dan

Glutamaat Dehydrogenase door de lagere LoD en betere gevoeligheid. De minst aangewezen

keuze van deze methodenvergelijking is de Aspartaat Transaminase methode.

49

6. ALGEMEEN BESLUIT

Voor ieder van de vijf asparaginase activitetisbepalingsmethoden is een protocol

opgesteld en geëvalueerd. In principe zijn alle methoden geschikt om opgenomen te worden

in de verdere onderzoeksfase naar de activiteit en stabiliteit van asparaginase. Verscheidene

statistische en niet-statistische selectiecriteria werden opgesteld en geëvalueerd, teneinde

een finaal protocol te kiezen. Aan de hand van alle beschikbare gegevens, en het

orthogonaliteitsprincipe verwaarlozend, hebben we de keuze laten vallen op zowel Nessler

als Berthelot.

De Berthelot methode vertoont de laagste LoQ en de hoogste sensitiviteit. Dit laat

ons toe minieme wijzigingen in concentratie met hoge nauwkeurigheid te detecteren.

Daardoor is deze methode uiterst geschikt om op te nemen in de latere stabiliteitsstudies,

daar kleine veranderingen in de stabiliteit van het enzym mogelijks kleine verschillen in

enzymactiviteit kunnen teweegbrengen. De lineariteit en herhaalbaarheid voldoen aan onze

vooropgestelde eisen en de niet statistische kenmerken maken van deze methode een snelle,

gemakkelijke en relatief goedkope kwantitatieve test. Deze criteria samen maken van

Berthelot de voor ons meest geschikte methode.

De Nessler methode wordt als tweede methode gekozen gezien deze methode de

tweede laagste LoQ en tweede hoogste sensitiviteit heeft, waardoor we met deze methode

reeds lage concentraties kunnen detecteren, alsook kleine stijgingen in concentratie kunnen

waarnemen. Deze methode heeft een lagere kostprijs, moeilijkheidsgraad en tijdsduur dan

Berthelot. Door deze eigenschappen, samen met het hogere bovenlimiet waardoor

concentraties hoger dan 1,1 ppm kunnen worden bepaald, hebben er toe geleid dat ook

deze methode in de verdere stabiliteitsstudies kan worden opgenomen.

50

7. LITERATUURLIJST

Afkhami, A.; Norooz-Asl, R. (2008). Micelle-Mediated Extraction and Spectrophotometric Determination of Ammonia in Water Samples utilizing Indophenol Dye Formation. Journal of the Brazilian Chemical Society, 19, 1546-1552.

Aghaiypour, K.; Wlodawer, A.; Lubkowski, J. (2001). Do bacterial L-asparaginases utilize a catalytic triad Thr-Tyr-Glu? Biochimica Et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology, 1550, 117-128.

Albertsen, B. K.; Schroder, H.; Jakobsen, P.; Avramis, V. I.; Muller, H. J.; Schmiegelow, K.; Carlsen, N. T. (2002). Antibody formation during intravenous and intramuscular therapy with Erwinia asparaginase. Med Pediatr Oncol, 38, 310-316.

Avramis, V. I.; Martin-Aragon, S.; Avramis, E. V.; Asselin, B. L. (2007). Pharmacoanalytical assays of Erwinia asparaginase (erwinase) and pharmacokinetic results in high-risk acute lymphoblastic leukemia (HR ALL) patients: simulations of erwinase population PK-PD models. Anticancer Res, 27, 2561-2572.

Benjwal, S.; Verma, S.; Rohm, K. H.; Gursky, O. (2006). Monitoring protein aggregation during thermal unfolding in circular dichroism experiments. Protein Sci, 15, 635-639.

Boos, J.; Werber, G.; Ahlke, E.; Schulze-Westhoff, P.; Nowak-Gottl, U.; Wurthwein, G.; Verspohl, E. J.; Ritter, J.; Jurgens, H. (1996). Monitoring of asparaginase activity and asparagine levels in children on different asparaginase preparations. Eur J Cancer, 32A, 1544-1550.

Bruylants, G.; Wouters, J.; Michaux, C. (2005). Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem, 12, 2011-2020.

Cammack, K. A.; Marlborough, D. I.; Miller, D. S. (1972). Physical properties and subunit structure of L-asparaginase isolated from Erwinia carotovora. Biochem J, 126, 361-379.

Demuthkaya, L. N.; Kalinichenko, I. E. (2006). Interaction of aliphatic polyamines with Nessler reagent. Journal of Analytical Chemistry, 61, 1063-1066.

Drainas, D.; Drainas, C. (1985). A conductimetric method for assaying asparaginase activity in Aspergillus nidulans. Eur J Biochem, 151, 591-593.

51

Edman, P. (1949). A method for the determination of amino acid sequence in peptides. Arch Biochem, 22, 475.

EPA Method 350.2. (1974). Nitrogen, ammonia (colorimetric, titrimetric, potentiometric, distillation procedure).

Franklin Township Municipal Sanitary Authority. (2006). Laboratory standard operating procedures.

Frear, D. S.; Burrell, R. C. (1955). Spectrophotometric Method for Determining Hydroxylamine Reductase Activity in Higher Plants. Analytical Chemistry, 27, 1664-1665.

Gupta, M. K.; Subramanian, V.; Yadav, J. S. (2009). Immunoproteomic identification of secretory and subcellular protein antigens and functional evaluation of the secretome fraction of Mycobacterium immunogenum, a newly recognized species of the Mycobacterium chelonae-Mycobacterium abscessus group. J Proteome Res, 8, 2319-2330.

Han, J.; Sheng, L. S.; Yang, Z. Y.; Xiang, B. R.; An, D. K. (2001). [High performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometric characterization of recombinant L-asparaginase II]. Yao Xue Xue Bao, 36, 46-50.

http://www.cancer.org/Cancer/LeukemiainChildren/OverviewGuide/childhood-leukemia-overview-what-is-childhood-leukemia (14/02/2011)

https://www.msu.edu/~gallego7/MassSpect/MSandPMM.htm (23/02/2011)

http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Sigma/Bulletin/aa0100bul.Par.0001.File.tmp/aa0100bul.pdf (28/03/2011)

http://www.skion.nl/kbk/leukemieen (14/02/2011)

Khushoo, A.; Pal, Y.; Singh, B. N.; Mukherjee, K. J. (2004). Extracellular expression and single step purification of recombinant Escherichia coli L-asparaginase II. Protein Expr Purif, 38, 29-36.

Kravchenko, O. V.; Kislitsin, Y. A.; Popov, A. N.; Nikonov, S. V.; Kuranova, I. P. (2008). Three-dimensional structures of L-asparaginase from Erwinia carotovora complexed with aspartate and glutamate. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 64, 248-256.

52

Lanvers, C.; Vieira Pinheiro, J. P.; Hempel, G.; Wuerthwein, G.; Boos, J. (2002). Analytical validation of a microplate reader-based method for the therapeutic drug monitoring of L-asparaginase in human serum. Anal Biochem, 309, 117-126.

Lau, K. T.; Edwards, S.; Diamond, D. (2004). Solid-state ammonia sensor based on Berthelot's reaction. Sensors and Actuators B-Chemical, 98, 12-17.

Leonard (1963). Quantitative Range of Nessler's Reaction with Ammonia. Clinical Chemistry, 9, 417-422.

Lorenzi, P. L.; Llamas, J.; Gunsior, M.; Ozbun, L.; Reinhold, W. C.; Varma, S.; Ji, H.; Kim, H.; Hutchinson, A. A.; Kohn, E. C.; Goldsmith, P. K.; Birrer, M. J.; Weinstein, J. N. (2008). Asparagine synthetase is a predictive biomarker of L-asparaginase activity in ovarian cancer cell lines. Mol Cancer Ther, 7, 3123-3128.

Lubkowski, J.; Dauter, M.; Aghaiypour, K.; Wlodawer, A.; Dauter, Z. (2003). Atomic resolution structure of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 59, 84-92.

Lubkowski, J.; Palm, G. J.; Gilliland, G. L.; Derst, C.; Rohm, K. H.; Wlodawer, A. (1996). Crystal structure and amino acid sequence of Wolinella succinogenes L-asparaginase. Eur J Biochem, 241, 201-207.

Maita, T.; Morokuma, K.; Matsuda, G. (1979). Amino acid sequences of the tryptic peptides from carboxymethylated L-asparaginase from Escherichia coli. Hoppe Seylers Z Physiol Chem, 360, 1483-1495.

Moliner-Martinez, Y.; Herraez-Hernandez, R.; Campins-Falco, P. (2005). Improved detection limit for ammonium/ammonia achieved by Berthelot's reaction by use of solid-phase extraction coupled to diffuse reflectance spectroscopy. Analytica Chimica Acta, 534, 327-334.

Moorthy, V.; Ramalingam, A.; Sumantha, A.; Shankaranaya, R. T. (2010). Production, purification and characterisation of extracellular L-asparaginase from a soil isolate of Bacillus sp. African Journal of Microbiology Research, 4, 1862-1867.

Nath, C. E.; Dallapozza, L.; Eslick, A. E.; Misra, A.; Carr, D.; Earl, J. W. (2009). An isocratic fluorescence HPLC assay for the monitoring of l-asparaginase activity and l-asparagine depletion in children receiving E. colil-asparaginase for the treatment of acute lymphoblastic leukaemia. Biomed Chromatogr, 23, 152-159.

53

Papageorgiou, A. C.; Posypanova, G. A.; Andersson, C. S.; Sokolov, N. N.; Krasotkina, J. (2008). Structural and functional insights into Erwinia carotovora L-asparaginase. FEBS J, 275, 4306-4316.

Pieters, R.; Hunger, S. P.; Boos, J.; Rizzari, C.; Silverman, L.; Baruchel, A.; Goekbuget, N.; Schrappe, M.; Pui, C. H. (2011). L-asparaginase treatment in acute lymphoblastic leukemia: a focus on Erwinia asparaginase. Cancer, 117, 238-249.

Pritsa, A. A.; Kyriakidis, D. A. (2001). L-asparaginase of Thermus thermophilus: purification, properties and identification of essential amino acids for its catalytic activity. Mol Cell Biochem, 216, 93-101.

Randolph, T. R. (2004). Advances in acute lymphoblastic leukemia. Clin Lab Sci, 17, 235-245.

Sapan, C. V.; Lundblad, R. L.; Price, N. C. (1999). Colorimetric protein assay techniques. Biotechnol Appl Biochem, 29 ( Pt 2), 99-108.

Scotti, C.; Sommi, P.; Pasquetto, M. V.; Cappelletti, D.; Stivala, S.; Mignosi, P.; Savio, M.; Chiarelli, L. R.; Valentini, G.; Bolanos-Garcia, V. M.; Merrell, D. S.; Franchini, S.; Verona, M. L.; Bolis, C.; Solcia, E.; Manca, R.; Franciotta, D.; Casasco, A.; Filipazzi, P.; Zardini, E.; Vannini, V. (2010). Cell-cycle inhibition by Helicobacter pylori L-asparaginase. PLoS One, 5, e13892.

Searcy, R. L.; Simms, N. M.; Foreman, J. A.; Bergquist, L. M. (1965). A study of the specificity of the Berthelot colour reaction. Clin Chim Acta, 12, 170-175.

Shifrin, S.; Grochowski, B. J. (1972). L-Asparaginase from escherichia coli B. Succinylation and subunit interactions. J Biol Chem, 247, 1048-1054.

Stecher, A. L.; de Deus, P. M.; Polikarpov, I.; Abrahao-Neto, J. (1999). Stability of L-asparaginase: an enzyme used in leukemia treatment. Pharm Acta Helv, 74, 1-9.

Swain, A. L.; Jaskolski, M.; Housset, D.; Rao, J. K.; Wlodawer, A. (1993). Crystal structure of Escherichia coli L-asparaginase, an enzyme used in cancer therapy. Proc Natl Acad Sci U S A, 90, 1474-1478.

Tuncel, N. B.; Yilmaz, N.; Sener, E. (2010). The effect of pea (Pisum sativum L.)-originated asparaginase on acrylamide formation in certain bread types. International Journal of Food Science and Technology, 45, 2470-2476.

Verma, N.; Kumar, K.; Kaur, G.; Anand, S. (2007). L-asparaginase: a promising chemotherapeutic agent. Crit Rev Biotechnol, 27, 45-62.

54

Vrooman, L. M.; Supko, J. G.; Neuberg, D. S.; Asselin, B. L.; Athale, U. H.; Clavell, L.; Kelly, K. M.; Laverdiere, C.; Michon, B.; Schorin, M.; Cohen, H. J.; Sallan, S. E.; Silverman, L. B. (2010). Erwinia asparaginase after allergy to E. coli asparaginase in children with acute lymphoblastic leukemia. Pediatr Blood Cancer, 54, 199-205.

Wehner, A.; Harms, E.; Jennings, M. P.; Beacham, I. R.; Derst, C.; Bast, P.; Rohm, K. H. (1992). Site-specific mutagenesis of Escherichia coli asparaginase II. None of the three histidine residues is required for catalysis. Eur J Biochem, 208, 475-480.

Wilkinson, J. H.; Baron, D. N.; Moss, D. W.; Walker, P. G. (1972). Standardization of clinical enzyme assays: a reference method for aspartate and alanine transaminases. J Clin Pathol, 25, 940-944.

Wriston, J. C., Jr. (1985). Asparaginase. Methods Enzymol, 113, 608-618.

Yao, M.; Yasutake, Y.; Morita, H.; Tanaka, I. (2005). Structure of the type I L-asparaginase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus horikoshii at 2.16 angstroms resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 61, 294-301.

BIJLAGE 1

Species Δ Type KM Specifieke activiteit Optimale temperatuur

(°C) Optimale pH

Moleculair gewicht Referentie

(mM) (µmol/min/mg) (dalton)

BACTERIE

Proteobacteriën

Enterobacter cloacae Verma et al., 2007

Erwinia aroidae II Lubkowski et al., 1996

Erwinia carotovora II Lubkowski et al., 1996

Erwinia chrisanthemi II Lanvers et al., 2002

Escherichia coli II Lanvers et al., 2002

Helicobacter pylori 0,29 7 140000 Scotti et al., 2010

Photobacterium leiognathi

Verma et al., 2007

Photobacterium phosphoreum

Verma et al., 2007

Proteus Vulgaris 0,026 300 57 7 Wriston et al., 1985

Pseudomonas fluorescens

II Lubkowski et al., 1996

Pseudomonas ovalis II Lubkowski et al., 1996

Pseudomonas Stutzeri II 0,145 132,3 37 9 132000 Lubkowski et al., 1996

Salmonella enterica Verma et al., 2007

Serratia marcenscens 0,1 226 8,5 147000 Verma et al., 2007

Vibrio fisheri Verma et al., 2007

Vibrio harveyi Verma et al., 2007

Vibrio succinogenes Moorthy et al., 2010

Wolinella succinogenes II 0,0478 202 7,3 146000 Lubkowski et al., 1996

Firmicutes

Bacillus mesentericus Verma et al., 2007

Brevibacillus brevis Verma et al., 2007

Staphylococcus sp.-6A 8,6 Verma et al., 2007

Deinococcus-thermus

Thermus aquaticus Verma et al., 2007

Thermus thermophilus 2,8 840 9,2 200000 Pritsa et al., 2001

Ciliophora

Tetrahymena pyriformis

Pritsa et al., 2001

Actinobacteriën

Mycobacterium phlei 0,7 Verma et al., 2007

Nocardia asterodies Verma et al., 2007

Streptomyces karnatakensis Moorthy et al., 2010

Streptomyces longsporusflavus Verma et al., 2007

Streptomyces venezualae Moorthy et al., 2010

SCHIMMEL

Ascomycota

Candida utilis Verma et al., 2007

Aspergillus nidulans Verma et al., 2007

Aspergillus niger Tuncel et al., 2010

Aspergillus oryzae Tuncel et al., 2010

Aspergillus tamari Moorthy et al., 2010

Aspergillus terreus Verma et al., 2007

Saccharomyces cerevisiae I 0,74 6,5

Verma et al., 2007

II 0,35 6,8 Verma et al., 2007

Basidiomycota

Rhodosporidium toruloides Verma et al., 2007

Rhodotorula rubra Verma et al., 2007

PLANT

Angiosperm

Arabidopsis thaliana Verma et al., 2007

Lupinus angustifolius 8,5 150000 Verma et al., 2007

Lupinus angustiplius Verma et al., 2007

Lupinus araboreus 6,6 150000 Verma et al., 2007

Lupinus arborens Verma et al., 2007

Lupinus luteus Verma et al., 2007

Lupinus polyphylus 12,2 1,65 144000 Verma et al., 2007

Phaseolus multiflorus Tuncel et al., 2010

Pisum sativum 3,2 136600 Tuncel et al., 2010

Vicia faba Tuncel et al., 2010

Zea mays Tuncel et al., 2010

Pinophyta

Pinus pinaster Verma et al., 2007

Pinus radiata Verma et al., 2007

Bryophyta

Sphagnum fallax I 7,4 Verma et al., 2007

BIJLAGE 2

Concentratie (ppm) Absorbantievoor cuvetcorrectie Absorbantiena cuvetcorrectie

0,5 0,064 0,063

1 0,144 0,144

3 0,474 0,424

5 0,673 0,679

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

0 1 2 3 4 5 6

Stan

dar

d R

esi

du

als

PPM

Nessler : gestandaardiseerde residuen plot

BIJLAGE 3


0,1 0,055 0,054

0,2 0,169 0,169

0,5 0,526 0,476

0,5 0,396 0,396

1 0,906 0,912

3 2,779 2,78

5 3,709 3,704

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Stan

dar

d R

esi

du

als

PPM

Berthelot: gestandaardiseerde residuen plot

BIJLAGE 4


1 0,093 0,093

2 0,221 0,219

3 0,319 0,316

4 0,452 0,399

5 0,47 0,472

6 0,571 0,571

7 0,675 0,68

8 0,758 0,757

9 0,832 0,832

10 0,927 0,925

-2,5

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

0 2 4 6 8 10 12

Stan

dar

d R

esi

du

als

PPM

Indooxine: gestandaardiseerde residuen plot

BIJLAGE 5

Concentratie (ppm) Ainitieel, voor cuvetcorrectie Ainitieel, na cuvetcorrectie Aeind, voor cuvetcorrectie Aeind, na cuvetcorrectie

0 1,027 1,027 0,991 0,991

0,5 1,029 1,028 0,984 0,983

1 1,029 1,029 0,966 0,966

3 1,085 1,035 0,964 0,914

5 1,028 1,036 0,844 0,850

10 1,026 1,027 0,682 0,683

15 1,028 1,033 0,510 0,515

20 1,027 1,032 0,364 0,372

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

0 5 10 15 20 25

Stan

dar

d R

esi

du

als

PPM

Glutamaat Dehydrogenase: gestandaardiseerde residuen plot

BIJLAGE 6


0 0,915 0,913

5 0,844 0,833

10 0,843 0,788

15 0,726 0,729

20 0,69 0,696

25 0,627 0,631

30 0,615 0,577

35 0,515 0,515

40 0,475 0,473

-2

-1,5

-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Stan

dar

d R

esi

du

als

PPM

Aspartaattransaminase: gestandaardiseerde residuen plot

BIJLAGE 7

BIJLAGE 8

BIJLAGE 9

BIJLAGE 10

BIJLAGE 11

Documents

UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE … · 2012-03-14 · UNIVERSITEIT GENT FACULTEIT FARMACEUTISCHE WETENSCHAPPEN Vakgroep Farmaceutische Analyse Drug Quality and Registration