UNIVERZA V LJUBLJANIpefprints.pef.uni-lj.si/674/1/Izolacija_kvasovk... · II Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. Dipl. delo

UNIVERZA V LJUBLJANI

PEDAGOŠKA FAKULTETA

BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

DIPLOMSKO DELO

BERNARDA FINŽGAR

UNIVERZA V LJUBLJANI

PEDAGOŠKA FAKULTETA

BIOTEHNIŠKA FAKULTETA

Študijski program: Biologija in gospodinjstvo

Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih

habitatov

DIPLOMSKO DELO

Mentorica: prof. dr. Nina Gunde-Cimerman Kandidatka: Bernarda Finžgar

Somentorica: doc. dr. Polona Zalar

Ljubljana, marec 2012

II Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov.

Dipl. delo. Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biotehniška fakulteta, Biologija-gospodinjstvo, 2012

Diplomsko delo je zaključek univerzitetnega študijskega programa Biologija in

gospodinjstvo. Opravljeno je bilo v laboratorijih Katedre za molekularno genetiko in

biologijo mikroorganizmov na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete Univerze v

Ljubljani.

Študijska komisija na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete je za mentorico

diplomskega dela imenovala prof. dr. Nino Gunde-Cimerman, za somentorico doc. dr.

Polono Zalar in za recenzentko prof. dr. Ines Mandić-Mulec.

Mentorica: prof. dr. Nina Gunde-Cimerman

Somentorica: doc. dr. Polona Zalar

Recenzentka: prof. dr. Ines Mandić-Mulec.

Komisija za oceno in zagovor:

Predsednica: doc. dr. Barbara Vilhar

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za biologijo

Članica: prof. dr. Nina GUNDE-CIMERMAN


Članica: doc. dr. Polona ZALAR


Članica: prof. dr. Ines MANDIĆ-MULEC.

Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo

Podpisana se strinjam z objavo svoje diplomske naloge v polnem tekstu na spletni strani

Digitalne knjižnice Biotehniške fakultete. Izjavljam, da je naloga, ki sem jo oddala v

elektronski obliki, identična tiskani verziji.

Datum zagovora:

Naloga je rezultat lastnega raziskovalnega dela.

Bernarda Finžgar

III Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov.


KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA

ŠD Dn

DK 577.2:582.282.23(043.2)=163.6

KG glive/kvasovke/Saccharomyces cerevisiae/morfologija/naravni habitati/ITS

rDNA/industrijska okolja/življenjski krog

AV FINŽGAR, Bernarda

SA GUNDE-CIMERMAN, Nina (mentorica)/ZALAR, Polona (somentorica)/MANDIĆ-

MULEC, Ines (recenzentka)

KZ SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16

SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

ZA Univerza v Ljubljani, Pedagoška fakulteta, Biologija in gospodinjstvo


LI 2012

IN Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov

TD diplomsko delo (univerzitetni študij)

OP XII, 79 str., 23 pregl., 16 sl., 7 pril., 85 vir.

IJ sl

JI sl/en

AI Pivska kvasovka Saccharomyces cerevisiae je že od 60. let 20 stoletja evkariontski eksperimentalni

organizem, ki je postal leta 1996 z določitvijo celotnega nukleotidnega zaporedja genoma še pomembnejši. Čeprav

njena biokemijska vloga v fermentacijskem procesu dolgo časa ni bila pojasnjena, smo njen metabolizem in

produkte uporabljali že tisočletja (npr. kruh, pivo, vino). Kvasovka S. cerevisiae je pomembno orodje za

pridobivanje rekombinantnih proteinov (genska manipulacija). Predstavlja pa tudi velik potencial na področju

biogoriv, proizvodnje bioetanola iz odpadnih materialov, kot je lignoceluloza. Kvasovka sicer pogosto naseljuje

antropogena okolja, manj pa je znanega o njeni ekologiji. Namen diplomskega dela je bila selektivna izolacija vrste

S. cerevisiae iz antropogenih in manj običajnih naravnih okolij. Cilj naloge je bila pridobitev sevov s potencialno

neobičajnimi metaboličnimi lastnostmi za to vrsto, ki bi bile uporabne pri sintezi bioetanola. V sklopu diplomske

naloge smo nabrali 273 različnih vzorcev, ki smo jih razdelili v 27 različnih skupin. Z uporabo selektivnega gojišča

z dodatkom 10 % etanola smo izolirali 122 kvasnih kultur, ki smo jih sprva proučevali na ravni morfologije (barva,

oblika) in mikromorfologije kolonij (velikost in oblika celic). Preverjali smo, ali so sevi homo- ali heterotalični ter

v ta namen proučevali prisotnost spolnih struktur (aski, askospore) na acetatnem agarju. Dokončna identifikacija je

potekala na molekularno-genetskem nivoju s primerjavo nukleotidnih zaporedij regij notranjih distančnikov 1 in 2,

vključno s 5,8S rDNA zaporedjem (ITS rDNA). Iz 122 vzorcev smo izolirali 44 sevov kvasovke vrste S.

cerevisiae. Vrsto S. cerevisiae smo najpogosteje izolirali iz vinogradniških vzorcev ter vod industrijskih okolij,

posamezne seve pa smo izolirali tudi iz mlečnih izdelkov, sveže stisnjenih nepasteriziranih sadnih sokov, tal pod

sadnim drevjem, sadjem in zelenjavo, iz žuželk, domačega kisa, razgrajenega lesa, svežega in gnilega sadja in

zelenjave ter iz silaže. Sevom S. cerevisiae smo določili asimilacijski, fermentacijski in temperaturni profil ter

opazovali odstopanja med posameznimi sevi.

IV Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov.


KEY WORDS DOCUMENTATION

ND Dn

DC 577.2:582.282.23(043.2)=163.6

CX fungi/ yeast/Saccharomyces cerevisiae/morphology/natural habitat/ITS rDNA/

industrial environment/life cycle

AU FINŽGAR, Bernarda

AA GUNDE-CIMERMAN, Nina (supervisor)/ZALAR, Polona (co-advisor)/MANDIĆ-

MULEC, Ines (reviewer)

PP SI-1000 Ljubljana, Kardeljeva ploščad 16

SI-1000 Ljubljana, Jamnikarjeva 101

PB University of Ljubljana, Faculty of education, Biology – home ecomomics

University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department of Biology

PY 2012

TI Isolation of yeast Saccharomyces cerevisiae from unusual natural habitats

DT Graduation Thesis (University studies)

NO XII, 79 p., 23 tab., 16 fig., 7 ann., 85 ref.

LA sl

AL sl/en

AB Baker yeast Saccharomyces cerevisiae has been an eukarontic experimental organism since 1960s,

becoming even more significant with the determination of its complete nucleotide genome sequence in 1996. Even

though its biochemical function in the fermentation process had long remained unclear, its metabolism and

products (eg. bread, beer, wine) have been used for millennia. S. cerevisiae yeast represents an important organism

for production of recombinant proteins (gene manipulation). Moreover, it exhibits great potential for biofuels and

the process of bioethanol production from waste materials such as lignocellulose. The yeast is generally found in

anthropogenic environments, yet little is known about its ecology. The purpose of this given thesis was to perform

a selective isolation of the S. cerevisiae species from both anthropogenic and less common natural habitats. The

aim was to aquire strains with metabolic properties that would be potentially uncommon for the species, yet

effective in bioethanol synthesis. In the scope of the research, 273 collected samples were divided into 27 different

groups. Through the use of a selective growth medium with the addition of 10 % ethanol, 122 yeast cultures were

isolated and initially defined according to their morphology (colour, shape) and micromorphology (cell size and

shape). In order to identify the strains according to their homothallic or heterothallic properties, the presence of

sexual structures (asci, ascospores) was examined on acetate agar. The concluding identification took place at the

molecular genetic level through the comparison of nucleotide sequencing of the regions of internal transcribed

spacers 1 and 2, including the 5.8S rDNA sequence (ITS rDNA). From the 122 samples, 44 strains of the S.

cerevisiae yeast were isolated. The S. cerevisiae species was typically isolated from vinicultural samples and

industrial environment waters, whereas individual strains were isolated also from dairy products, freshly squeezed

non-pasteurized juices, the ground beneath fruit trees, fresh or rotten fruits and vegetables, insects, vinegar,

decomposed wood, and from silage. The S. cerevisiae strains were determined according to their assimilation,

fermentation and temperature profiles, and the differences among individual strains were examined.

V Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov.


KAZALO VSEBINE

KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA ....................................................... III

KEY WORDS DOCUMENTATION ................................................................................. IV

KAZALO PREGLEDNIC ................................................................................................ VIII

KAZALO SLIK ................................................................................................................... IX

KAZALO PRILOG .............................................................................................................. X

OKRAJŠAVE IN SIMBOLI ............................................................................................... XI

1 UVOD ............................................................................................................................... 1

1.1 NAMEN DELA IN DELOVNE HIPOTEZE .............................................................. 2

2 PREGLED OBJAV ......................................................................................................... 3

2.1 KVASOVKA SACCHAROMYCES CEREVISIAE ...................................................... 3

2.1.1 Osnovna opredelitev kvasovke Saccharomyces cerevisiae..................................... 3

2.1.2 Taksonomija kvasovke Saccharomyces cerevisiae ................................................. 3

2.1.3 Uporaba kvasovke Saccharomyces cerevisiae skozi zgodovino do danes.............. 4

2.1.4 Fenotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae ...................................... 5

2.1.4.1 Oblika in velikost celic in kolonij kvasovke Saccharomyces cerevisiae ....... 5

2.1.5 Genotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae ..................................... 5

2.1.5.1 Genom kvasovke Saccharomyces cerevisiae................................................. 5

2.1.5.1.1 Ribosomska DNA kvasovk ....................................................................... 6

2.1.5.2 Hibridi rodu Saccharomyces .......................................................................... 6

2.1.6 Življenjski krog kvasovke Saccharomyces cerevisiae ............................................ 7

2.1.6.1 Razmnoževanje kvasovke Saccharomyces cerevisiae ................................... 7

2.1.7 Fermentacijski sistemi in produkti kvasovke Saccharomyces cerevisiae ............... 8

2.1.7.1 Potrebna temperatura in pH za rast kvasovk.................................................. 8

2.1.7.2 Kisik kot vir energije ..................................................................................... 8

2.1.7.3 Prehrana in presnova pri kvasovkah .............................................................. 9

2.1.7.3.1 Presnova ogljika pri kvasovkah ................................................................ 9

2.1.7.3.2 Presnova sladkorjev do etanola ............................................................ 9

2.1.7.3.3 Ostali produkti presnove sladkorjev ................................................... 10

2.1.7.3.4 Presnova dušika pri kvasovkah ............................................................... 10

2.1.7.4 Tehnološko industrijska uporabnost produktov kvasovk ............................ 10

2.1.7.4.1 Izrabljanje produktov kvasovke S. cerevisiae v prehrambeni industriji . 10

2.1.7.4.2 Uporaba kvasovke S. cerevisiae v pivovarstvu .................................. 11

2.1.7.4.3 Proizvodnja bioetanola z razgradnjo lignoceluloze ................................ 11

2.1.7.4.4 Uporabnost kvasovke S. cerevisiae pri rekombinantnih tehnikah .......... 12

2.1.8 Ekologija kvasovke S. cerevisiae in njeni habitati ................................................ 13

2.1.8.1 Poznana nahajališča kvasovke S. cerevisiae iz industrijskih procesov ........ 13

2.1.8.2 Nahajališča kvasovke S. cerevisiae v naravi ................................................ 14

2.2 METODIKA PROUČEVANJA KVASOVK ............................................................ 14

VI Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov.


2.2.1 Metodika izolacije kvasovk ................................................................................... 14

2.2.1.1 Vzorčenje, izolacija in gojenje kvasovk na gojiščih .................................... 14

2.2.2 Metode identifikacije kvasovk .............................................................................. 15

2.2.2.1 Klasične metode identifikacije kvasovk ...................................................... 15

2.2.2.1.1 Morfološke metode ................................................................................. 15

2.2.2.1.2 Fiziološke značilnosti .............................................................................. 16

2.2.2.2 Molekularne metode identifikacije .............................................................. 16

3 MATERIAL IN METODE .......................................................................................... 17

3.1 MATERIAL ............................................................................................................... 17

3.1.1 Mikrobiološka gojišča za gojenje kvasovk ........................................................... 17

3.1.2 Mikrobiološka gojišča za sporulacijo S. cerevisiae............................................... 18

3.1.3 Raztopine, pufri in zmesi....................................................................................... 21

3.1.4 Reagenti ................................................................................................................. 23

3.1.5 Kemikalije ............................................................................................................. 23

3.1.6 Laboratorijska oprema ........................................................................................... 25

3.2 METODE ................................................................................................................... 25

3.2.1 Vzorčenje............................................................................................................... 25

3.2.2 Izolacija kvasovk iz nabranih vzorcev .................................................................. 27

3.2.2.1 Priprava vzorcev in anaerobno gojenje v tekočem gojišču .......................... 27

3.2.2.2 Aerobno gojenje na trdem gojišču ............................................................... 27

3.2.2.3 Izbira in redčenje kulture do posameznih kolonij ........................................ 27

3.2.2.4 Shranjevanje ................................................................................................. 27

3.2.3 Določevanje fenotipskih lastnosti ......................................................................... 28

3.2.3.1 Morfologija kolonij ...................................................................................... 28

3.2.3.2 Morfologija kvasnih celic ............................................................................ 28

3.2.3.3 Morfologija askospor ................................................................................... 28

3.2.4 Določevanje genotipskih lastnosti ......................................................................... 28

3.2.4.1 Izolacija genomske DNA ............................................................................. 28

3.2.4.1.1 Izolacija genomske DNA z izolacijskim kitom Prepman Ultra® ........... 28

3.2.4.1.2 Ekstrakcija DNA z mehansko lizo .......................................................... 28

3.2.4.2 Verižna reakcija s polimerazo (PCR) .......................................................... 29

3.2.4.3 Gelska elektroforeza .................................................................................... 30

3.2.4.4 Določanje in obdelava nukleotidnega zaporedja ......................................... 30

3.2.4.5 Shranjevanje izoliranih kvasovk .................................................................. 30

3.2.5 Asimilacijske, fermentacijske in encimske lastnosti ............................................. 30

3.2.5.1 Asimilacijske lastnosti ................................................................................. 30

3.2.5.2 Fermentacijske lastnosti ............................................................................... 31

3.2.5.3 Encimske lastnosti ....................................................................................... 31

3.2.5.4 Temperaturni testi ........................................................................................ 31

3.2.6 Parjenje haploidnih sevov Saccharomyces cerevisiae .......................................... 31

VII Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov.


4 REZULTATI ................................................................................................................. 32

4.1 OPIS VZORCEV ....................................................................................................... 32

4.1.1 Izolacija kvasovk glede na skupine vzorcev ......................................................... 36

4.1.1.1 Brezalkoholne gazirane pijače ..................................................................... 39

4.1.1.2 Citrusi ........................................................................................................... 39

4.1.1.3 Domači kis ................................................................................................... 40

4.1.1.4 Gnilo sadje in zelenjava ............................................................................... 40

4.1.1.5 Gobe, lišaji ................................................................................................... 40

4.1.1.6 Gozdna stelja (listni drobir) ......................................................................... 40

4.1.1.7 Jagodičevje ................................................................................................... 40

4.1.1.8 Mlečni izdelki .............................................................................................. 41

4.1.1.9 Razgrajen les ................................................................................................ 42

4.1.1.10 Silaža ............................................................................................................ 42

4.1.1.11 Sladki sadeži ................................................................................................ 42

4.1.1.12 Sveže stisnjeni sadni sokovi pred pasterizacijo ........................................... 43

4.1.1.13 Vinogradniški vzorci .................................................................................... 43

4.1.1.14 Voda iz industrijskih okolij .......................................................................... 44

4.1.1.15 Tla pod sadnimi drevesi, sadjem, zelenjavo ................................................ 46

4.1.1.16 Žuželke (vinske mušice) .............................................................................. 46

4.2 IZOLACIJA IN IDENTIFIKACIJA KVASOVKE S. CEREVISIAE ........................ 47

4.2.1 Vzorci, iz katerih smo izolirali kvasovko Saccharomyces cerevisiae................... 47

4.2.2 Fenotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae .................................... 49

4.2.3 Genotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae ................................... 54

4.2.4 Fiziološki testi sevov kvasovke Saccharomyces cerevisiae .................................. 56

4.2.5 Parjenje haploidnih sevov na acetatnem agarju .................................................... 60

5 RAZPRAVA IN SKLEPI ............................................................................................. 62

5.1 RAZPRAVA .............................................................................................................. 62

5.1.1 Rod Saccharomyces .............................................................................................. 65

5.1.2 Druge kvasovke ..................................................................................................... 66

5.2 SKLEPI ...................................................................................................................... 67

5.3 ANALIZA UČNIH NAČRTOV ZA OSNOVNO ŠOLO .......................................... 68

5.3.1 Obravnavanje mikroorganizmov v izobraževalnem procesu ................................ 68

6 POVZETEK .................................................................................................................. 71

7 VIRI ................................................................................................................................ 73

PRILOGE ........................................................................................................................... 80

VIII Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov.


KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica 1: Taksonomska opredelitev kvasovke S. cerevisiae. .................................................................... 3 Preglednica 2: Seznam reagentov s proizvajalci. ............................................................................................ 23 Preglednica 3: Seznam kemikalij s proizvajalci. ............................................................................................. 23 Preglednica 4: Seznam laboratorijske opreme. ................................................................................................ 25 Preglednica 5: Seznam možnih nahajališč oz. vzorčenih substratov za uspevanje kvasovke S. cerevisiae. .... 26 Preglednica 6: PCR-mešanica za en vzorec. .................................................................................................... 29 Preglednica 7: PCR-program. .......................................................................................................................... 30 Preglednica 8: Pregled skupin vzorcev glede na izvor in število vzorcev, število vseh kvasnih izolatov in

izolatov kvasovke S. cerevisiae kot delež med vsemi kvasnimi izolati. .......................................................... 32 Preglednica 9: Opis vzorcev po skupinah glede na kraj, število vseh odvzetih vzorcev in število pozitivnih

izolatov na kvasovke. ...................................................................................................................................... 36 Preglednica 10: Spisek kvasnih izolatov iz površin gob in lišajev. ................................................................. 40 Preglednica 11: Spisek kvasnih izolatov iz mlečnih izdelkov. ........................................................................ 41 Preglednica 12: Spisek kvasnih izolatov iz razgrajenega lesa. ........................................................................ 42 Preglednica 13: Spisek kvasnih izolatov iz silaže. .......................................................................................... 42 Preglednica 14: Spisek kvasnih izolatov iz sveže stisnjenih nepasteriziranih sadnih sokov. .......................... 43 Preglednica 15: Spisek kvasih izolatov iz vinogradniških vzorcev. ................................................................ 44 Preglednica 16: Spisek kvasih izolatov iz vod v industrijskih okoljih. ........................................................... 45 Preglednica 17: Spisek kvasih izolatov iz tal pod sadnimi drevesi, sadjem in zelenjavo. ............................... 46 Preglednica 18: Izolati vseh sevov S. cerevisiae z opisom vzorca za izolacijo ............................................... 47 Preglednica 19: Morfološke lastnosti izoliranih sevov S. cerevisiae. .............................................................. 51 Preglednica 20: Primerjava ITS zaporedij sevov S. cerevisiae s tipskim sevom: primerjava dolžine pomnožka

in zaporedja, odstotka podobnosti po BLAST algoritmu in odstotka ujemanja (sorodnosti). ......................... 55 Preglednica 21: Asimilacijski profili sevov S. cerevisiae po 21 dneh inkubacije. .......................................... 57 Preglednica 22: Rezultati fermentacijskih testov glukoze, saharoze, maltoze in ksiloze pri izbranih sevih S.

cerevisiae po 28 dneh inkubacije..................................................................................................................... 60 Preglednica 23: Kombinacije parjenja sevov S. cerevisiae, ki tvorijo askospore. ........................................... 61

IX Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov.


KAZALO SLIK

Slika 1: Kolonije in oblika celic S. cerevisiae. .................................................................................................. 5 Slika 2: Shematski prikaz enot rDNA. .............................................................................................................. 6 Slika 3: Življenjski krog kvasovke (menjava haploidne in diploidne generacije). ............................................ 7 Slika 4: Zastopanost posamezne skupine vzorcev glede na število vseh vzorcev. .......................................... 34 Slika 5: Osnovne izolacijske plošče gojišča MEA s kloramfenikolom. .......................................................... 35 Slika 6: Število vseh kvasnih izolatov razporejeno na izolate sevov vrste S. cerevisiae in na izolate drugih

kvasovk po skupinah vzorcev. ......................................................................................................................... 38 Slika 7: Zastopanost posameznih vrst kvasovk med izolati............................................................................. 39 Slika 8: Prikaz vrstne raznolikost kvasovk iz mlečnih izdelkov. ..................................................................... 41 Slika 9: Prikaz vrstne raznolikost kvasovk iz vinogradniških vzorcev . .......................................................... 43 Slika 10: Prikaz vrstne raznolikost kvasovk iz voda industrijskih okolij. ....................................................... 45 Slika 11: Primerjava števila nabranih vzorcev s številom vseh izolatov kvasovk in številom izoliranih sevov

S. cerevisiae po skupinah vzorcev. .................................................................................................................. 48 Slika 12: Deleži izoliranih sevov S. cerevisiae po skupinah vzorcev. ............................................................. 49 Slika 13: Osnovna izolacijska gojišča MEA + Ch in YM s kolonijami S. cerevisiae. .................................... 50 Slika 14: Posamezne kvasne celice različnih sevov S. cerevisiae ................................................................... 53 Slika 15: Mikrografije mikroskopskih preparatov po acidorezistentnem barvanju sevov S. cerevisiae pod

različnimi povečavami..................................................................................................................................... 54 Slika 16: Parjenje sevov S. cerevisiae pri 400× in 1000× povečavi. ............................................................... 61

X Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov.


KAZALO PRILOG

Priloga A: Opis vzorcev s krajem vzorčenja po skupinah vzorcev za vse seve kvasovk. Priloga B: Opis vzorcev, iz katerih nismo izolirali kvasovk, s krajem vzorčenja po skupinah vzorcev.

XI Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov.


OKRAJŠAVE IN SIMBOLI

ATP energetsko bogata molekula adenozin 5-trifosfat

ATPaza adenozintrifosfataza, encim, ki katalizira hidrolizo APT-ja v ADP in fosfat

BLAST osnovno iskalno orodje lokalne poravnave (Basic Local Alignment Search Tool)

bp bazni par

CBS mikrobiološka zbirka gliv Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht

Ch kloramfenikol

CTAB cetil trimetil amonijev bromid

DNA deoksiribonukleinska kislina

dNTP deoksinukleotid trifosfat

EDTA etidiaminotetrocetna kislina

EtOH etanol

EXF Mikrobiološka zbirka gliv na Katedri za molekularno genetiko in biologijo

mikroorganizmov, Oddelek za biologijo, Biotehniška fakulteta, Univerza v

Ljubljani

FADH2 koencim, prenašalec elektronov (»Flavin Adenine Dinucleotide«)

GTP energetsko bogata molekula gvanozin 5-trifosfat

ITS notranji distančniki, ki ločujejo rDNA posameznih ribosomskih podenot

(»Internal Transcribed Spacer«)

MEA agar s sladnim ekstraktom (»Malt Extract Agar«)

mRNA obveščevalna (»Messenger«) RNA, ki prenaša genetično sporočilo iz jedra do

ribosomov v citoplatmi

mtDNA mitohondrijsko zaporedje DNA

NAD koencim, prenašalec elektronov (»Nicotinamide Adenine Dinucleotide«)

NADH na NAD vezan vodikov elektron

NCBI internetna baza podatkov »National Center for Biotechnology Information«

PCR polimerazna verižna reakcija (»Polymerase Chain Reaction«)

PDA krompirjev agar z glukozo (»Potato Dextrose Agar«)

rDNA zaporedje DNA, ki kodira ribosomsko RNA

XII Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov.


RNAza encim, ki cepi molekule RNA

RNA ribonukleinska kislina

sp. vrsta (»species«)

TBE Tris-boratni elektroforezni pufer

TE Tris-EDTA

Tris 2-amino-2-hidroksimetil-1,3-propandiol

tRNA prenašalna (»Transfer«) RNA, ki prenaša potrebne aminokisline za sintezo

beljakovin do mRNA na ribosomih

UREA sečnina oz. organska spojina (NH2)2CO za presnovo dušikovih spojin

YCB definirano gojišče z univerzalnim virom ogljika, brez vira dušika (»Yeast

Carbon Base«)

YE kvasni ekstrakt (»Yeast extract«)

YM agar s sladno-kvasnim ekstraktom (»Yeast-Malt extract«)

YNB definirano gojišče z univerzalnim virom dušika, brez vira ogljika (»Yeast

Nitrogen Base«)

http://en.wikipedia.org/wiki/Organic_compound

http://en.wikipedia.org/wiki/Nitrogen

http://en.wikipedia.org/wiki/Nitrogen

http://en.wikipedia.org/wiki/Carbon

http://en.wikipedia.org/wiki/Carbon

1 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov.


1 UVOD

Eden glavnih problemov današnje družbe je zadovoljitev energetskih potreb in zamenjava

surovin fosilnih materialov z obnovljivimi viri. S tem bi zmanjšali onesnaževanje s

toplogrednimi plini. Bioetanol predstavlja primeren in vzdržen obnovljiv alternativni vir

energije, primeren je tudi kot transportno gorivo, predvsem pa bi veliko doprinesel k

zmanjševanju emisij toplogrednih plinov v primerjavi z naftnim bencinom.

Dandanes je vsa proizvodnja bioetanola usmerjena v tehnologijo prve generacije, pri

katerih uporabljajo surovine, kot so trsni sladkor ali žitni škrob, vendar je produkcija

nezadovoljiva glede na potrebe. Velik potencial za proizvodnjo etanola kot goriva

predstavljajo lignocelulozni materiali kot druga generacija biogoriv. Glavni obetajoči viri

so različni odpadni produkti lignoceluloze v kmetijstvu (koruzna stebla, pšenična in

ječmenova slama, vlakna sladkornega trsa), odpadni produkti iz gozdov, papirne industrije

in komunalnih vod. Procesi uporabe lignoceluloznih zalog za produkcijo bioetanola so še

vedno v razvojni fazi in potrebujejo tehnološki preboj, da bodo postopki postali

ekonomično izvedljivi. Procese sestavljajo štiri glavne tehnološke operacije: predhodna

obdelava surovin materialov, hidroliza ogljikovih polimerov v sladkorje, fermentacija

sladkorjev z mikroorganizmi do etanola in destilacija oz. separacija do čistega etanola.

Med mikroorganizmi je predvsem kvasovka vrste Saccharomyces cerevisiae prednostni

organizem, ki je sposoben produkcije etanola. Zaradi tega se mednarodni evropski 7.

okvirni projekt NEMO (Novel high performance enzymes and micro-organisms for

conversion of lignocellulosic biomass to bioethanol) v okviru enega od glavnih ciljev

osredotoča na izboljšavo lastnosti kvasovk, predvsem vrste S. cerevisiae. Namen je vzgojiti

bolj učinkovit mikroorganizem, primeren za razgradnjo heksoznih in pentoznih sladkorjev,

v kombinaciji z visoko toleranco na povišan etanol, temperaturo in biomasne inhibitorje.

Projekt temelji na raziskovanju in razvijanju novih tehnologij z uporabo nenavadno

visokozmogljivih encimov in najbolj tolerantnih mikroorganizmov. Etanolni doprinos

fermentacije ksiloze in arabinoze (pentoze) je dokaj nizek v primerjavi s heksoznimi

sladkorji, zato poleg večjega doprinosa etanola poskušajo zmanjšati ostale produkte (npr.

ksilitol in glicerol).

Vrsta Saccharomyces cerevisiae je poznana že iz zgodovine s tradicionalnih področij

pridelave kruha, vina, piva in mošta. Zasledili so jo v vinogradih, grozdju in drugem sadju,

na insektih, hrastovem in drugem lubju in v tleh pod drevesi (Diezmann in Dietrich, 2009;

Erlend s sod., 2006), kot kvarljivca hrane in pri ostalih fermentacijskih procesih (Pitt in

Hocking, 1999). Na splošno lahko izpostavimo, da se kvasovka nahaja v zelo raznolikih

habitatih v naravi, saj za svojo rast potrebuje zadostno količino ogljikovih virov (npr.

glukozo, fruktozo, manozo, galaktozo, saharozo in maltozo ob prisotnosti kisika) (Boulton

in Quain, 2001).

V diplomskem delu smo želeli dobiti vpogled v naravne habitate kvasovke Saccharomyces

cerevisiae. Na podlagi že opisanih nahajališč v literaturi in možnih nahajališč smo nabirali

različne vzorce ter iz njih z uporabo selektivne metode izolacije osamili kvasovke.

Osredotočili smo se na kvasovke, ki so bile morfološko podobne vrsti Saccharomyces

cerevisiae. Izolate smo najprej morfološko okarakterizirali in jih nato identificirali na



osnovi molekularnogenetskih značilnosti. Preverjali smo tudi njihove metabolične

sposobnosti asimilacije različnih virov ogljika in dušika ter fermentacijo.

1.1 NAMEN DELA IN DELOVNE HIPOTEZE

V diplomskem delu smo imeli namen izolirati čim večje število sevov kvasovk

Saccharomyces cerevisiae iz naravnih, raznolikih nahajališč, poznanih že iz literature, in iz

različnih potencialnih nahajališč.

Cilj diplomske naloge je bil, da seve kvasovke S. cerevisiae morfološko opredelimo na

podlagi fenotipskih lastnosti (morfologija kolonij, mikroskopska morfologija celic,

acidorezistentno barvanje askospor, UREA testi) in izolate molekularno identificiramo s

pomočjo genotipskih lastnosti kvasovke do vrste z nukleotidnim zaporedjem ITS rDNA z

uporabo metode PCR.

Predvidevali smo, da se pojavljajo določene razlike med sevi kvasovk glede zmožnosti

asimilacije različnih virov ogljika, dušika in zmožnosti rasti pri različnih temperaturah.

Glede teh lastnosti smo pričakovali možne razlike med sevi v sklopu znotrajvrstne

variabilnosti.



2 PREGLED OBJAV

2.1 KVASOVKA SACCHAROMYCES CEREVISIAE

2.1.1 Osnovna opredelitev kvasovke Saccharomyces cerevisiae

Kvasovka vrste Saccharomyces cerevisiae je enocelični mikroorganizem iz kraljestva gliv,

ki se razmnožuje z brstenjem, zatorej ne tvori spor v/na plodiščih (Walker, 2009). Je

najbolj natančno proučen evkariontski organizem na celičnem, molekulskem in genetskem

nivoju, zato služi kot model ekoloških in evolucijsko-genetskih študij (Landry s sod.,

2006).

2.1.2 Taksonomija kvasovke Saccharomyces cerevisiae

Kvasovko S. cerevisiae taksonomsko uvrščamo med askomicetne glive kvasovke (Walker,

2009). Taksonomska opredelitev kvasovke S. cerevisiae je prikazana v preglednici 1.

Preglednica 1: Taksonomska opredelitev kvasovke S. cerevisiae (NCBI).

Taksonomska kategorija Opredelitev S. cerevisiae

Domena Eukarya (evkariont)

/ Opisthokonta

Kraljestvo Fungi (glive)

Podkraljestvo Dikarya

Deblo Ascomycota

/ Saccharomyceta

Poddeblo Saccharomycotina

Razred Saccharomycetes (kvasovke)

Red Saccharomycetales

Družina Saccharomycetaceae

Rod Saccharomyces

Vrsta Saccharomyces cerevisiae

Glive (lat. Fungi) so evkariontski organizmi, ki jih uvrščamo v posebno kraljestvo.

Predstavljajo obsežno in raznoliko skupino organizmov, ki jih medsebojno povezuje

morfologija, način prehranjevanja in ekologija. So heterotrofni organizmi, saj je njihova

rast odvisna od organsko vezanega ogljika. Kot saprofiti pridobijo za svoj obstoj potrebna

hranila iz odmrlih delov organizmov s pomočjo razgradnje na račun zelo raznolikih

hidrolitičnih encimov. Manjše organske molekule pa nato absorbirajo v celice preko

celične stene in membrane (Solomon s sod., 2005).

Kraljestvo gliv delimo na štiri debla glede na tvorbo spolnih spor: Chytridiomycota,

Zygomycota, Ascomycota in Basidiomycota. Včasih so askomicetne glive razporejali glede

na ureditev askov, danes pa askomicetne glive razvrščamo na podlagi razvoja askov in

plodišč, po načinu in odprtju askov ter sproščanju askospor.

Posebnost debla Ascomycota so glive, ki jih uvrščamo v red Saccharomycetales, saj tvorijo

posamezne celice, ki jih imenujemo kvasovke. Kvasovke so kljub podobni rasti in

ekološkim podobnostim heterogena skupina. Najdemo jih tako med zigomicetnimi,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Undef&id=716545&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock



bazidiomicetnimi (npr. Cryptococcus spp. in Rhodotorula spp.) in askomicetnimi glivami

(npr. Saccharomyces spp.) (Walker, 2009).

2.1.3 Uporaba kvasovke Saccharomyces cerevisiae skozi zgodovino do danes

Vrsta Saccharomyces cerevisiae je sinonim za kvasovke, katere predstavnike imenujemo

po vrsti kvasovke v pivskem sladu, opazovani leta 1837. Ta vrsta je po vsej verjetnosti

najstarejši gojeni mikroorganizem. Zapisi pričajo o uporabi kvasovke pri varjenju piva v

Sumeriji in Babilonu že 6000 let pr. n. št. V tistem času je bila S. cerevisiae uporabljena

tudi v Gruziji pri obdelavi grozdja in v Egiptu kot krušni kvas (Feldman, 2005). Na njeno

uporabo kaže tudi najdba kvasovke v keramičnem posodi za vino v grobnici enega od

prvih kraljev Egipta, Scorpiona I, ki je vladal 3150 let pr. n. št. (Landry s sod., 2006).

Kvasovka S. cerevisiae lahko fermentira sladkor (Feldman, 2005). Biokemijska vloga

kvasovke v fermentacijskem procesu dolgo časa ni bila pojasnjena, kljub temu da so

produkt procesa uporabljali že tisočletja. To specifično lastnost so uporabljali pri

proizvodnji alkoholnih pijač (npr. vino, pivo), prehrani (npr. kruh, kefir) in medicinski

uporabi (npr. antibiotiki in encimi). Van Leeuwenhoek je leta 1680 prvi opazoval kvasne

celice pod mikroskopom (Kavanagh, 2005). Zaradi edinstvenih lastnosti je postala

raziskovalni organizem. Prve študije o kvasovki je zapisal Louis Pasteur (Études sur la

bière) leta 1857 (Feldman, 2005), šele leta 1863 pa je dokončno pojasnil toliko let

nepoznano biokemijsko vlogo Saccharomyces cerevisiae v fermentacijskem procesu

(Feldman, 2005; Kavanagh, 2005).

Kvasovka S. cerevisiae je postala modelni eksperimentalni organizem okoli leta 1960, ko

so jo začeli uporabljati kot eksperimentalni sistem v molekularni biologiji. Kasneje, leta

1980, je bila uporabljena kot gostiteljski organizem pri proizvodnji zdravila za hepatitis B

(Feldman, 2005). Leta 1996 pa je postala prvi evkariontski organizem, pri katerem so

določili celotno nukleotidno zaporedje genoma (Feldman, 2005; Kavanagh, 2005). Po

sekveniranju genoma so znanstveniki določili funkcijo 6000 genov (Solomon s sod., 2005).

V naslednjih letih je kvasovka postala uporabna referenca za določitev homologije sekvenc

pri človeških, živalskih ali rastlinskih genih in pri primerjalnih študijah mnogih enoceličnih

organizmov (Feldman, 2005). Kvasovka je imela pomembno vlogo pri razvoju različnih

tehnologij in je utrla pot biološkim raziskavam z uporabo tehnike rekombinantnih DNA

(Kavanagh, 2005).

Ugotovljeno je, da je kvasovka idealni sistem za uspešno proučevanje celične zgradbe in

osnovnih celičnih mehanizmov. V primerjavi z ostalimi evkariontskimi modelnimi

organizmi ima Saccharomyces cerevisiae naslednje prednosti:

- Je enocelični organizem, ki ga v nasprotju z bolj kompleksnimi evkarionti, lahko

gojimo na različnih gojiščih, kar zagotavlja popoln nadzor nad okoljskimi parametri.

- Je uporaben mikroorganizem za različne klasične in genetske tehnike.

- Je primer, s katerim so dokazali, da so se bistvene celične funkcije ohranile vse od

kvasovk do sesalcev.

- Generacijski čas kvasovke je približno 80 min, saj je masovna produkcija celic zato

hitra.

- Enostavni postopki izolacije visoke molekulske mase DNA za rDNA, mRNA in tRNA

(Feldman, 2005; Walker, 2009).



Čeprav je kvasovka vrste Saccharomyces cerevisiae dobro proučena kot modelni

eksperimentalni organizem s poznanim nukleotidnim zaporedjem celotnega genoma, pa

kljub temu zelo malo vemo o njenih naravnih habitatih in populacijski genetiki (Sampaio

in Gonçalve, 2008).

2.1.4 Fenotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae

2.1.4.1 Oblika in velikost celic in kolonij kvasovke Saccharomyces cerevisiae

Vrsta S. cerevisiae tvori na trdih gojiščih okrogle do eliptične kolonije z gladkim robom.

Profil kolonije je gladek, lahko pa je kolonija tudi popkasto oblikovana (umbilicirana

kolonija). Kolonije so rahlo pigmentirane – kremne barve (Barnett s sod., 2000; Walker,

2009) in mazave. V tekočem gojišču lahko opazimo sedimentacijo in flotacijo celične

mase. Sedimentacija je granulirana (Pitt in Hocking, 1999).

Velikost kvasnih celic je lahko zelo različna glede na razvojno stopnjo, vrste in pogoje za

rast. Celice vrste Saccharomyces cerevisiae (glej sliko 1) so eliptične do jajčaste oblike,

dolge od 5 do 10 µm in široke od 1 do 7 µm. Povprečni celični volumen kvasovke je 29

µm3

za haploidno in 55 µm3 za diploidno celico (Feldman, 2005). Askospore so kroglaste

oblike in gladke. Aski so lahko kroglasti ali elipsoidni (Pitt in Hocking, 1999).

Slika 1: Kolonije in oblika celic S. cerevisiae (Pitt in Hocking, 1999; CBS baza podatkov).

A: kolonija na MEA, B, C: celice kolonije različne povečave, D: aski in askospore

2.1.5 Genotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae

2.1.5.1 Genom kvasovke Saccharomyces cerevisiae

Genom kvasovke S. cerevisiae je znan že več kot deset let. Kvasni genom vsebuje okoli

6000 genov, ki so locirani na 16 kromosomih (Landry s sod., 2006). Vsebuje relativno

majhen, zelo racionalno izkoriščen genom z 12,5 Mb neponavljajočih zaporedij DNA.

(Kavanagh, 2005; Feldman, 2005). Na začetku zaporedja je 1200 genov ribosomskih

ponovitev (rDNA), ki kodirajo RNA in beljakovine. Ta regija se pogosto uporablja pri

filogenetskih študijah (Feldman, 2005). Poleg jedrnega genoma, ki v haploidnem

laboratorijskem sevu predstavlja 70 do 80 % skupne dednine, vsebujejo kvasovke še

mitohondrijsko DNA (Kavanagh, 2005).

http://sl.wikipedia.org/w/index.php?title=Askospora&action=edit&redlink=1



2.1.5.1.1 Ribosomska DNA kvasovk

Glavni razlog za pogosto uporabo ribosomske DNA v molekularno-genetski identifikaciji

je prisotnost gena v številnih kopijah. Poleg tega so ribosomi prisotni pri vseh kvasnih

celicah in so evolucijsko zelo ohranjeni (van de Peer s sod., 1997).

Vsaka enota rDNA je sestavljena iz nukleotidnega zaporedja za ribosomsko RNA, ki

kodira malo podenoto – 18S rDNA (SSU) in veliko podenoto – 28S rDNA (LSU), ter 5.8S

rDNA. Te funkcionalne regije so ločene med seboj z vmesniki. SSU (»small subunit«)

rDNA in LSU (»large subunit«) rDNA sta ločeni z zunanjima prepisnima vmesnikoma

(ETS) in neprepisnima vmesnikoma (NTS). Oba vmesnika imenujemo medgenska

vmesnika (IGS). 5.8S rDNA je vrinjena med dva notranja prepisna vmesnika (ITS1, ITS2).

Regija ITS se nahaja znotraj zapisa za 18S in 28S. Geni, ki kodirajo posamezno enoto

rDNA (18S, 5.8S in 28S) se navadno nahajajo v tandemu, te pa se lahko ponavljajo od sto

do tisočkrat v genomu in predstavljajo približno 10 % celotnega genoma (Hwang in Kim,

1999).

Slika 2: Shematski prikaz enot rDNA (Hwang in Kim, 1999: 216).

ETS – zunanja prepisna vmesnika, NTS – zunanji neprepisni vmesnik, IGS – medgenski vmesnik (ETS,

NTS), ITS1 in ITS2 – notranja prepisna vmesnika

Za kvasovko S. cerevisiae je značilno, da ima regijo rDNA bogato z adeninom in timinom

(A + T). Avtonomna ponavljajoča sekvenca (Autonomously replicating sequence ARS) je

pri kvasovki S. cerevisiae: (A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T) (Palzkil s sod., 1986).

2.1.5.2 Hibridi rodu Saccharomyces

Evoluciji hibridov vrst Saccharomyces lahko sledimo preko zapisa DNA. Zelo sorodne

vrste imajo te zapise zelo identične in jih uvrščamo v skupino Saccharomyces sensu

stricto; druge, manj kompatibilne oz. manj podobne seve pa v skupino Saccharomyces

sensu lato (Sampaio in Gonçalve, 2008).

Sodobnejše filogenetske študije v rodu Saccharomyces priznavajo osem vrst: S. bayanus,

S. cerevisiae, S. paradoxus, S. pastorianus, S. uvarum, S. cariocanus, S. kudriavzevii in S.

mikatae. Večina teh vrst se je razvijala ločeno. Vrsti S. pastorianus in S. bayanus pa naj bi

bili hibrida, saj je v njunih genomih zaslediti nukleotidna zaporedja tako S. cerevisiae kot

S. uvarum (Sampaio in Gonçalve, 2008). Kvasovke rodu Saccharomyces sensu stricto

predstavljajo šest vrst in en naravni hibrid (Liti s sod., 2006).

V skupino Saccharomyces sensu stricto, poleg S. cerevisiae, spadajo še najbližji sorodniki

S. bayanus, S. pastorianus in S. paradoxus (Boulton in Quain, 2001). Najbližji sorodnik S.

cerevisiae po sekvenci je S. paradoxus (Liti s sod., 2006). Najbolj sorodne znotraj skupine

delimo lahko v dve skupini, in sicer S. bayanus in S. pastorianus ter S. cerevisiae in S.



paradoxus glede na temperaturno odzivnost (Boulton in Quain, 2001). Nekateri dokazi

jasno kažejo, da različne temperature rasti posameznih vrst igrajo pomembno vlogo pri

križanju različnih vrst Saccharomyces in nastajanju novih hibridov (Sampaio in Gonçalve,

2008). Skupini cerevisiae in bayanus sta zmožni rasti pri nižji maksimalni in optimalni

temperaturi in imata značilen transport fruktoze preko aktivnega protonskega transporta.

Križanci med skupinama cerevisiae in bayanus so stabilni genetski hibridi. Jedro in

mitohondrijska DNA sta podedovana od enega organizma s fragmenti DNA obeh

organizmov (Boulton in Quain, 2001). Edino vrst S. kudriavzevii in S. uvarum sta zmožni

rasti pri še nižji temperaturi kot S. cerevisiae in S. paradoxus iz skupine Saccharomyces

sensu stricto (Liti s sod., 2006).

Odkriti so bili tudi hibridi med vrstama Saccharomyces cerevisiae in Saccharomyces

kudriavzevii, hibridi med S. cerevisiae in S. bayanus in trojni hibrid S. bayanus × S.

cerevisiae × S. kudriavzevii (Gonzalez s sod., 2006).

2.1.6 Življenjski krog kvasovke Saccharomyces cerevisiae

2.1.6.1 Razmnoževanje kvasovke Saccharomyces cerevisiae

Kvasovka Saccharomyces cerevisiae je zelo dobro proučen organizem z zelo jasno

določenim, kompleksnim življenjskim krogom (Landry s sod., 2006; Kavanagh, 2005).

Življenjski krog kvasovke lahko delimo na dve stopnji: (1) nespolno razmnoževanje poteka

v obliki brstenja ter (2) spolno razmnoževanje kot parjenje in sporulacija (nastanek

askospor). Bistvo življenjskega kroga kvasovke je, da celice izmenjujejo spolno in

nespolno fazo (glej sliko 3) (Landry s sod., 2006).

Slika 3: Življenjski krog kvasovke (menjava haploidne in diploidne generacije).

Kvasovko S. cerevisiae po navadi v naravi najdemo kot enocelični diploidni (2n)

organizem (Landry s sod., 2006; Hartwell, 1974). Razmnoževanje in rast celic S.

cerevisiae so v splošnem vezani na brstenje. To je nespolno razmnoževanje (mitoza), ki

poteka na specifični lokaciji na površini materinske celice. Brstenje zagotavlja, da

hčerinska celica dobi celotno kopijo genetskega materiala materinske celice (Kavanagh,

2005). Po prepisu genetskega materiala na obe nastajajoči celici se del celične stene



podaljša in zraste v hčerinsko celico. Novonastali brst lahko odpade, ko je še zelo majhen,

ali pa zraste na materinski celici skoraj do končne velikosti. Včasih nekaj brstov ostane

med seboj povezanih (Zalar in Gunde-Cimerman, 2002). Brazgotine brsta (t. i. porodne

brazgotine) so specifične in se kažejo kot izbokline na celični površini. Ostanejo na obeh

celicah po delitvi in nastanku nove hčerinske celice (Feldman, 2005). Po poteku mitoze

nastaneta torej dve genetsko enaki diploidni celici.

Proces nespolnega razmnoževanja lahko omejujejo določeni okoljski parametri.

Pomanjkanje hranil (npr. dušika) ali prisotnost nefermentabilnih virov ogljika lahko izzove

pri kvasovkah spolno razmnoževanje (mejozo). Diploidne celice z mejozo tvorijo tetrado

štirih haploidnih askospor (štiri genetsko različne celice) v aska, katerega steno predstavlja

stena prej diploidne celice (Landry s sod., 2006). Proces običajno poteka aerobno (Calum

in Grei, 2008). Z razpadom aska se sprostijo štiri haploidne askospore (Feldman, 2005).

Nastale haploidne askospore po mejozi se lahko ob prisotnosti potrebnih hranil naprej

nespolno razmnožujejo z mitozo, kar imenujemo kaljenje (Herskowitz, 1988).

Kvasovka ostane v haploidni fazi do srečanja celice nasprotnega paritvenega tipa – poteče

parjenje (Raspor, 1996). Pri kvasovkah S. cerevisiae sta poznana dva paritvena tipa: a in

(dve različni haploidni askospori). Paritveni tip a in α sta dve celici, ki se med sabo 100 %

privlačita zaradi delovanja feromonov. Pri parjenju a in α celic dobimo a/α diploidne celice

(Landry s sod., 2006). Posebnost kvasovke vrste S. cerevisiae je, da haploidne celice lahko

spremenijo paritveni tip s pomočjo DNA-preureditve (Herskowitz, 1988). Novo nastali

enocelični diploidni (2n) organizmi tako sklenejo življenjski krog kvasovke.

Do zaustavitve kaljenja lahko pride tudi takrat, ko so v bližini prisotne celice drugih

kvasovk, s katerimi lahko poteka paritev (Herskowitz, 1988). Tako lahko nastanejo hibridi

s sorodnimi vrstami kvasovk Saccharomyces sensu stricto. Diploidni hibridi nastanejo z

združitvijo celic dveh različnih vrst. Ti hibridi se razmnožujejo nespolno z mitozo. Pri njih

produkcija spor z mejozo ni mogoča zaradi razlike v genetskem materialu, ki ga v nov

organizem doprinese vsaka vrsta (Calum J. M., Greig, 2008).

2.1.7 Fermentacijski sistemi in produkti kvasovke Saccharomyces cerevisiae

2.1.7.1 Potrebna temperatura in pH za rast kvasovk

Večina laboratorijskih in industrijskih kvasovk najbolje uspeva v temperaturnem območju

med 20 in 30 °C. Optimalna rast za kvasovko S. cerevisiae je območje med 25 do 35 °C

(Pitt in Hocking, 1999), torej je kvasovka termotolerantna (Rupnik s sod., 2005). Nekateri

sevi kvasovke so sposobne rasti tudi v območju od 10 °C do 39 °C (Pitt in Hocking, 1999).

Večina kvasovk raste najbolje na gojiščih med pH 4,5 in 6,5. Znotrajcelični pH kvasovk je

reguliran v sorazmerno ozkem območju, predvsem preko delovanja ATP-azne protonske

membranske črpalke. Pri kvasovki S. cerevisiae je pH okoli 5 (Walker, 2009).

2.1.7.2 Kisik kot vir energije

Kot vsi organizmi tudi kvasovke potrebujejo vir energije za preživetje. Energijo

pridobivajo s celičnim dihanjem, pri katerem se s pomočjo kisika oksidirajo organske

molekule. Energija se shranjuje v kemijskih vezeh ATP-ja. Poznamo dve vrsti celičnega



dihanja – anaerobno in aerobno. Če kvasovka lahko raste tako ob prisotnosti, kot tudi v

odsotnosti kisika, jo imenujemo fakultativni aerob ali pa fakultativni anaerob, odvisno od

prednostnega načina rasti npr. fakultativni anaerob preferenčno raste aerobno (Petro,

2010).

Kvasovke vrste S. cerevisiae so fakultativno anaerobni organizmi in so na splošno

nezmožni rasti pod striktno anaerobnimi pogoji. Kisik je potreben kot dejavnik rasti, poleg

tega pa ga potrebujejo za zagotavljanja terminalnih elektronskih akceptorjev pri celičnem

dihanju, pri biosintezi membranskih maščobnih kislin in sterolov. S. cerevisiae je

auksotrofična. To je lastnost organizma, nezmožnega sintetizirati esencialne organske

spojine, potrebne za rast. Če so prisotni steroli in določene nenasičene maščobne kisline, je

kvasovka S. cerevisiae sposobna rasti tudi v anaerobnih pogojih (Verduyn s sod., 1990).

2.1.7.3 Prehrana in presnova pri kvasovkah

Kvasne celice za rast potrebujejo makrohranila (vir ogljika, dušika, kisika, žvepla, fosforja,

kalija in magnezija), elemente v sledovih (npr. Ca, Cu, Fe, Mn in Zn) in rastne faktorje

(organske komponente, ki jih ne uporabljajo kot vir energije) (Walker, 2009).

2.1.7.3.1 Presnova ogljika pri kvasovkah

V prisotnosti kisika praktično vse vrste kvasovk lahko oksidirajo sladkorje z dihanjem v

mitohondrijih. Prav tako so sposobne pretvoriti sladkor v etanol in CO2 (Raspor, 1996).

Kvasovka S. cerevisiae dobro raste na heksozah (glukozi, fruktozi, manosi in galaktozi) in

preprostih oligosaharidih (maltozi, saharozi in rafinozi) (Sampaio in Gonçalve, 2008;

Boulton in Quain, 2001). Za te vrste sladkorjev je značilno, da jih S. cerevisiae lahko

fermentira v alkohol in ogljikov dioksid. Ostale ogljikove substrate, kot so etanol, glicerol

in acetati, pa kvasovka lahko uporabi le ob zadostnem viru kisika (Walker, 2009).

2.1.7.3.2 Presnova sladkorjev do etanola

Različne vrste kvasovk so sposobne asimilirati in fermentirati različne vrste sladkorjev.

Njihov potencial je povezan s transportnimi sistemi v celični membrani in razpoložljivimi

hidrolitičnimi encimi, ki jih izločajo v okolje (Raspor, 1996).

Osnovna presnova sladkorjev pri kvasovkah temelji na fermentaciji in respiraciji. Sladkor

(glukozo) preko glikolize pretvori v piruvat. Če je prisoten kisik, nato poteče respiracija, če

kisika ni, pa fermentacija. Pri alkoholni fermentaciji sladkorjev S. cerevisiae oksidira

koencim NADH v NAD, ki je potreben za nastanek piruvata. Pri tem sodeluje encim

piruvat dekarboksilaza, ki dekarboksilira piruvat v acetaldehid, ki ga nato reducira

alkoholna dehidrogenaza do alkohola. Regeneracija NAD je potrebna za ohranjanje redoks

ravnotežja, da ne pride do zaustavitve glikolize (Walker, 2009; Kavanagh, 2005). Aerobna

respiracija glukoze je pri kvasovkah energetsko učinkovita presnova, ki zajema glikolizo in

ciklus citronske kisline (Krebsov cikel), elektronsko transportno verigo in oksidativno

fosforilacijo (Walker, 2009).

Kvasovke vrste S. cerevisiae imajo tako imenovan »Crabtree efekt«. Sposobne so

fermentirati visoke koncentracije sladkorjev, če je prisoten kisik (respirofermentator)

(Walker, 2009). Crabtree efekt je alkoholna fermentacija ob prisotnosti kisika, ko glukoza



preseže določeno mejno koncentracijo. Ob prisotnosti presežka sladkorja poteče aerobna

fermentacija glukoze v etanol, ta pa zagotavlja velik del energije, ki je potrebna za tvorbo

biomase (Verduyn s sod., 1990). Kvasovke delimo na Crabtree pozitivne in negativne.

Kvasovke, kot je Saccharomyces cerevisiae, ki kopičijo etanol tudi v prisotnosti kisika,

imenujemo Crabtree pozitivne kvasovke, ostale, ki razgradijo sladkor do CO2, pa Crabtree

negativne kvasovke (Piškur s sod., 2006; Wardrop s sod., 2004).

2.1.7.3.3 Ostali produkti presnove sladkorjev

Pri fermentaciji alkoholnih pijač (npr. pri pivu, vinu, destiliranih žganih pijačah,

jabolčniku) lahko poleg etanola in ogljikovega dioksida opazimo tudi druge produkte

presnove. Ti metaboliti so razni derivati alkoholov (npr. izoamil alkohol, butanol), polioli

(npr. glicerol), estri (npr. etil acetat), organske kisline (npr. sukcinat) in aldehidi (npr.

acetaldehid) (Walker, 2009; Kavanagh, 2005).

2.1.7.3.4 Presnova dušika pri kvasovkah

Kvasovke potrebujejo za rast dušik. Amonijev sulfat je pogosto uporabljeno hranilo v

gojiščih za rast kvasovk, ker na ta način lahko zagotovimo tako asimilacijo dušika kot

žvepla. Nekatere kvasovke lahko kot vir dušika uporabljajo tudi nitrat in nitrit. Tudi veliko

organskih dušikovih virov, kot so npr. aminokisline, peptidi, purini, pirimidini in amini,

lahko zagotovi potrebe kvasne celice po dušiku (Walker, 2009).

2.1.7.4 Tehnološko industrijska uporabnost produktov kvasovk

Kvasovke so pomembne pri tradicionalni biotehnologiji kot tudi pri moderni

biotehnologiji. Kvasovke rodu Saccharomyces predstavljajo konkurenco ostalim

kvasovkam z edinstveno kombinacijo lastnosti, kot so hitra rast, tudi ob visoki

koncentraciji sladkorjev, dobra sposobnost za proizvodnjo in porabo etanola in toleranca

na več okoljskih stresorjev, kot so visoka koncentracija etanola in nizka koncentracija

kisika (Piškur s sod., 2006).

Poleg tega, da kvasovko S. cerevisiae uporabljamo pri različnih tehnologijah proizvodnje

hrane, je pomembna tudi pri tehnologijah za raziskavo dednine, uporabljamo pa jo tudi kot

gostiteljski organizem pri tehnologijah za heterologne proteine. Je nepogrešljiva pri

proizvodnji protiteles, hormonov, encimov, npr. amilaz, proteaz, barvil in arom (Walker,

2009). Kvasovka S. cerevisiae je organizem, pri katerem so izolirali encima alkohol

dehidrogenazo in invertazo (Novak-Štagoj in Podobnik, 2006). Še posebej je zanimiva

zaradi svoje tradicionalne prisotnosti v človeških okoljih in je splošno priznana kot varen

organizem, zato jo uporabljamo pri eksperimentalnem delu (Raspor, 1996). Poleg vseh

naštetih komercialnih sektorjev (živila, kemikalije, industrijski encimi, farmacija) pa je

pomembna tudi z vidika kmetijstva in okolja (Walker, 2009).

2.1.7.4.1 Izrabljanje produktov kvasovke S. cerevisiae v prehrambeni industriji

Kvasovka S. cerevisiae je nenadomestljiva v tehnologiji proizvodnje piva, vina, sakeja,

pekovskega kvasa in kruha, sira, kisa, alkoholnih destilatov, energije, krmnega kvasa,

uporabnih kemikalij in aditivov. Njihovi proizvodi so skoraj nepogrešljivi (Piškur s sod.,

2006).

http://www.mendeley.com/profiles/forbes-wardrop/



Vrsta S. cerevisiae med kvasovkami zasluži posebno mesto, saj je njena uporaba v

prehrambene namene skoraj tako stara kot naša civilizacija (Novak-Štagoj in Podobnik,

2006). Produkcija etanola in proizvodnja CO2 je za človeka najvažnejša tehnološka lastnost

kvasovke, ki jo izkoriščajo za vzhajanje pekovskih izdelkov. Specifični produkti kvasovk

dajejo živilom svojevrstne organoleptične lastnosti (Raspor, 1996; Kavanagh, 2005).

2.1.7.4.2 Uporaba kvasovke S. cerevisiae v pivovarstvu

V pivovarstvu poteka proizvodnja piva kot semi-aerobni proces, ki ga lahko reguliramo s

temperaturo in mešanjem. V primeru pivovarskih produktov je glavni vir ogljika ječmen.

Večina kvasovk ne fermentira škroba, zato amilaza in glukoamilaza ječmen pretvorita v

slad. Na ta način škrob hidrolizira do sladkorjev, ki jih kvasovke lahko fermentirajo do

etanola (Kavanagh, 2005). V tem postopku poteča kvasna flokulacija (kosmičenje), kar je

nespolno in reverzibilno združenje celic. Celice se držijo druga druge in tvorijo kosmiče. V

pivovarski industriji uporabljajo predvsem kvasovko S. cerevisiae, da lahko njene celice

preprosto in stroškovno učinkovito ločijo od fermentacijskega produkta (Zhao in Bai,

2009; Kavanagh, 2005).

2.1.7.4.3 Proizvodnja bioetanola z razgradnjo lignoceluloze

Dandanes je bioetanol zelo pomemben v industriji goriva. Tudi plastiko, kot je na primer

polietilen, lahko proizvedejo iz etanola. Bioetanol so uporabljali že med 2. svetovno vojno,

vendar je bila proizvodnja tedaj ekonomsko nekonkurenčna. V zadnjih treh desetletjih pa

se temu zopet posveča ogromno raziskav (Taherzadeh in Karimi, 2007).

Produkcija etanola kot goriva temelji na surovinah z visoko vsebnostjo saharoze (trsni

sladkor), na škrobne surovine in na lignocelulozno biomaso (Sánchez in Cardona, 2008).

Manj kot 4 % etanola proizvedejo iz olj, ostali etanol pa proizvajajo preko fermentacije

bioloških virov. Trenutno ga največ proizvajajo iz sladkorjev in škrobnih materialov,

vendar ima največji potencial v prihodnosti lignoceluloza. Lignocelulozni material je

obnovljiv, velikokrat neuporabljen in zelo dostopen vir surovin. Glavni viri lignoceluloze

so predvsem ostanki lesne industrije, komunalni odpadki, odpadne vode in rastlinski

odpadni produkti. Ti materiali vsebujejo polimerizirane sladkorje v obliki celuloze in

hemiceluloze, ki jih lahko razgradimo s hidrolizo in kasneje fermentiramo v etanol s

pomočjo mikroorganizmov (Taherzadeh in Karimi, 2007).

Lignocelulozni material vsebuje predvsem zmes ogljikovih polimerov (celulozo in

hemicelulozo – holoceluloza), lignina in rudnin (Taherzadeh in Karimi, 2007). Ogljikove

hidrate v lignoceluloznem materialu je potrebno spremeniti s hidrolizo (kemična in

encimska) v enostavne sladkorje še pred fermentacijo. Celulozo in hemicelulozo lahko

fermentiramo v etanol, lignin pa ostane stranski produkt. Po hidrolizi nastanejo poleg

heksoz tudi pentoze, predvsem ksiloza je glavni sladkor po hidrolizi hemiceluloze. Med

fermentacijo morajo biti mikroorganizmi sposobni učinkovite razgradnje in velikega

izkoristka, morajo biti odporni na proteinske inhibitorje in fermentirati etanol iz pentoz

(Taherzadeh in Karimi, 2007).

Kvasovka S. cerevisiae ima najbolj obetavne lastnosti, ki jo uvrščajo med prednostne

mikroorganizme za pridelavo bioetanola druge generacije. Glavna pomanjkljivost je, da

kvasovka ne fermentira ksiloze (Taherzadeh in Karimi, 2007; Semenčenko s sod., 2011).



Lastnosti kvasovke, da fermentira pentoze je možno spremeniti tudi z genetskim

inženirstvom oziroma s tehnologijo rekombinantne DNA. Pri tem ostaja organizem

toleranten na etanol in pridobi sposobnost, da presnavlja dodaten substrat. Drugi pristop k

rešitvi tega problema pa je uporaba drugih mikroorganizmov (kvasovk in bakterij), ki so

sposobni fermentirati tudi pentozo (V. Semenčenko s sod., 2011).

Glavni problem pri proizvodnji bioetanola je fermentacija zmesi heksoz in pentoz ob

prisotnosti inhibitorjev. V ta namen želijo razviti mikroorganizem, ki bi bil sposoben

razgradnje obeh vrst sladkorjev. Naslednji problem je okoljevarstveni, saj bi morali biti trdi

ostanki proizvodnje etanola in odpadna voda, ki nastanejo v etanolnem obratu, spremenjeni

v druge produkte ali razgradljivi (Taherzadeh in Karimi, 2007).

2.1.7.4.4 Uporabnost kvasovke S. cerevisiae pri rekombinantnih tehnikah

Poleg produkcije etanola je druga pomembna metabolična aktivnost tudi sinteza homo- in

heterolognih proteinov (Raspor, 1996). Kvasovke kot gostiteljski sistem so primerni za

intracelularno in ekstracelularno izražanje genov različnega izvora (humanega, živalskega,

rastlinskega ali virusnega). Izražanje tujih genov vključuje več korakov. Začne se z

vključitvijo tuje kodirajoče sekvence DNA (cDNA) v primerno ekspresijsko kaseto

(vektor), ki vsebuje kvasni promotor in terminator. Nadaljnji postopek poteka z

vključitvijo oz. vnosom vektorja v ustrezen gostiteljski sev ter stabilno vzdrževanje le-tega

v celicah. Sledi sinteza heterolognega proteina pri specifičnih, točno določenih pogojih

gojenja in kot končna faza izolacija in čiščenje tarčnega proteina (Novak-Štagoj in

Podobnik, 2006).

Kvasovka S. cerevisiae je zaradi svojih lastnosti pomembno orodje za pridobivanje

rekombinantnih proteinov. Je primeren gostiteljski organizem za uspešno produkcijo

številnih proteinov: protiteles, hormonov, rastnih dejavnikov ter drugih farmacevtsko

pomembnih makromolekul. Dobro poznavanje njene genetike in fiziologije omogoča

uspešno načrtovanje vektorjev, posttranslacijskih modifikacij, visokoprodukcijskih

gostiteljskih sevov in enostavno gensko manipulacijo. Dobro poznavanje njenih

molekularnih in biokemijskih lastnosti omogoča razvoj specifičnih, tako klasičnih kot

rekombinantnih genskih tehnik (Novak-Štagoj in Podobnik., 2006).

Poleg številnih prednosti pa ima uporaba S. cerevisiae tudi nekaj pomanjkljivosti, kot so:

nezmožnost rasti do visokih gostot, neučinkovito izločanje proteinov v gojišče,

prekomerna in nepravilna glikozilacija (Novak-Štagoj in Podobnik, 2006). Čeprav

obstajajo številne omejitve pri uporabi te kvasovke kot gostitelja heterolognih proteinov,

pa prednosti uporabo odtehtajo. Prednost kvasovk v primerjavi s kompleksnejšimi

gostitelji, kot so sesalske celice, je v tem, da so preprostejše, enostavnejše, njihovo gojenje

je cenejše in poznavanje boljše (Novak-Štagoj in Podobnik, 2006).

Prednost S. cerevisiae je še v tem, da ima status GRAS (Generally Regarded As Safe) in za

večino genskih manipulacij ni etično sporna. Prvi ekspresijski vektorji so bili razviti prav

za S. cerevisiae (Raspor, 1996). Na njihovi osnovi se je že v zgodnjih 80 letih prejšnjega

stoletja razvila proizvodnja številnih, zlasti farmacevtsko zanimivih rekombinantnih

proteinov v industrijskem merilu (kot so npr.: inzulin, hepatitis B antigen, uratna oksidaza,

glukagon, stimulator rasti granulocit-makrofaga, trombocitni rastni dejavnik,

hirudin/desirudin, hirudin/lepirudin) (Novak-Štagoj in Podobnik, 2006).



2.1.8 Ekologija kvasovke S. cerevisiae in njeni habitati

Kvasovko Saccharomyces cerevisiae štejemo med udomačene enocelične organizme, ki so

jih v preteklosti izolirali iz njenega naravnega habitata za potrebe človeku pomembnih

fermentacij in industrij (Landry s sod., 2006; Sampaio in Gonçalve, 2008). V naravnem

ekosistemu jo običajno težje zasledimo, nekaj raziskav pa kaže, da naj bi S. cerevisiae v

naravnem okolju obstajala mnogo pred človeško uporabo za fermentacijo (Sampaio in

Gonçalve, 2008).

Danes S. cerevisiae najdemo v okoljih, ki jih dobro poznamo zaradi industrijskih procesov,

kot so pridelava kruha, vina, jabolčnika in piva. V industriji s hrano je ena glavnih krivcev

za kvar hrane (Pitt in Hocking, 1999; Carter s sod., 2009). Vendar pa kvasovko S.

cerevisiae najdemo tudi v naravi (Pitt in Hocking, 1999; Carter s sod., 2009). Naravni

habitati S. cerevisiae so še vedno dokaj neraziskani (Sampaio in Gonçalve, 2008). V

literaturi je navedeno, da S. cerevisiae lahko osamimo iz vinogradov, grozdja in drugega

sadja, pri fermentacijskih procesih, iz insektov, hrastovega lubja ali tal poleg hrasta in

drugih listnatih dreves (Erlend s sod., 2006).

Kvasovko S. cerevisiae v naravi običajno najdemo v diploidni fazi (Kavanagh, 2005). To

so industrijski udomačeni sevi, ki smo jih iz človeškega fermentacijskega okolja prenesli v

naravo. Naravni divji sevi so haploidni in so manj odporni kot industrijski sevi, ki pri

izolatih običajno prevladujejo. Prisotnost obeh, udomačenih in divjih sevov, so zasledili v

naravi na izolatih iz sadja, v produktih iz grozdja, izcedkih dreves in v sadnih sokovih.

Našli pa so jih tudi na insektih, ki jih sladki rastlinski sokovi in smole različnih dreves

privlačijo (Fay in Benavides, 2005; Kavanagh, 2005).

2.1.8.1 Poznana nahajališča kvasovke S. cerevisiae iz industrijskih procesov

Kvasovke poseljujejo habitate, ki vsebujejo bogat vir ogljika. Najbolj so proučene

predvsem kvasovke S. cerevisiae v habitatih, ki so tehnološko pomembni za človeka, kot

so fermentacija vina, pridelava grozdja v vinogradih in vse stopnje fermentacije do

končnih produktov. Prisotnost kvasovk je povezana z vsebnostjo sladkorja. Ko vsebnost

sladkorja pada, narašča pri fermentaciji količina etanola. Kvasovke, ki niso tolerantne na

etanol, odmrejo, prevladajo pa kvasovke S. cerevisiae, ki so tolerantne na etanol (Boundy-

Mills, 2006). Glavni tehnološko-okoljevarstveni pomen kvasovke S. cerevisiae je tudi ta,

da pretvorijo saharide in tako zaščitijo določena hranila pred razpadom. Njihovi

metabolični proizvodi, npr. alkohol pri S. cerevisiae, omogoča konverzijo živila v novo

obliko ob sočasnem konzerviranju (Raspor, 1996).

Kvasovke vrste S. cerevisiae so torej našli v smolah različnih dreves, pri fermentaciji vina,

viskija in kakava (Pitt in Hocking, 1999), na razpadlem lesu, različnem sadju (Boundy-

Mills, 2006) in palminem vinu (Ibekwe s sod., 2006). Izolirali so jo tudi iz različnih sokov

in ekstraktov, pokvarjenih naravnih sokov, raznih osvežilnih pijač, ki so bile izpostavljene

staranju (npr. mineralna voda, pomarančni sok z mehurčki, izotonični napitki), in sokov

pred pasterizacijo. Prav tako je znano, da so kvasovko S. cerevisiae izolirali iz mlečnih

produktov, kot je sir, jogurt in skuta. Poleg tega so jih našli tudi v fermentiranih mlečnih

izdelkih in kefirju (Pitt in Hocking, 1999).



Na splošno bioetanol proizvajajo s fermentacijo sladkorjev in škrobnih materialov. V

prihodnosti pričakujejo, da bo lignoceluloza glavni vir za produkcijo etanola poleg ostalih

omenjenih. Zato lahko pričakujemo, da bi lahko našli kvasovko S. cerevisiae tudi med

gozdnimi ostanki (les, lubje, smola, trhlovine), komunalnimi odpadki, odpadnimi vodami

in raznimi rastlinskimi odpadnimi produkti (tudi listna stelja, humus, listni drobir) (Pitt in

Hocking, 1999; Taherzadeh in Karimi, 2007).

2.1.8.2 Nahajališča kvasovke S. cerevisiae v naravi

Vedno več raziskav kaže, da S. cerevisiae zaseda in poseljuje večje število habitatov, ki

niso povezani s človeško aktivnostjo (Landry s sod., 2006). Večina kvasovk se nahaja v

tleh ali na razpadajočih organskih odpadkih v okolju ter sodelujejo pri procesu kroženja

organskih in anorganskih snovi. Njihov cikel je v nekaterih primerih, npr. pri fermentaciji

mošta v vino, proučevan, vendar še vedno niso pojasnjeni vsi odnosi v kroženju in

razširjanju teh mikroorganizmov (Raspor, 1996).

Prednostni habitati kvasovk so sicer rastlinska tkiva (listi, cvetovi in plodovi), nekatere

vrste pa lahko najdemo tudi v parazitskem razmerju z živalmi. Nekaj vrst kvasovk je

možno izolirati iz specifičnih ali ekstremnih okoljih, kot so nahajališča z zelo nizko vodno

aktivnostjo (okolja z visoko vsebnostjo sladkorja ali soli), nizko temperaturo (npr. polarna

območja) ali kjer je zelo majhna prisotnost kisika (npr. prebavni trakt živali). Kvasovko S.

cerevisiae so zasledili v vodi, na rastlinah, živalih in insektih (Walker, 2009).

Nove vrste so odkrili pri raziskavah habitatov, kot so listje, čebele, hrošči, druge žuželke in

drugi nevretenčarji, kumare in druga zelenjava, brezalkoholne gazirane pijače, mlečni

izdelki, čiste vode in morska okolja (Boundy-Mills, 2006). Veliko izolatov vrste

Saccharomyces cerevisiae so izolirali iz vinogradov, in sicer v povezavi z grozdjem

(grozdne jagode, ki so jih ptiči ali insekti poškodovali), iz poškodovanega sadja, iz tal pod

drevesi (predvsem drevesne vrste Quercus), iz izcedkov sadnih dreves in smol (Sampaio in

Gonçalve, 2008; Landry s sod., 2006), ter iz riževega vina in drugih vrst vin (Sujayas sod.,

2003). Kvasovko so našli tudi v rastlinskih tekočinah različnih drevesnih vrst (npr. smole

in drugi izločki dreves), v tleh pod drevesi in na površini gob (Sampaio in Gonçalve,

2008).

Kvasovka S. cerevisiae poseljuje mnogo habitatov. Z raziskavami v zadnjih letih so

ugotovili, da vsaka populacija določenega habitata skriva pomembne genetske variacije

(Landry s sod., 2006). Glavni dejavniki so predvsem klima, geografska lokacija,

temperatura, padavine, habitat, vsebnost makro- in mikrohranil, kisik, vlaga, pH, prisotnost

metabolitov in toksinov (Boundy-Mills, 2006).

2.2 METODIKA PROUČEVANJA KVASOVK

2.2.1 Metodika izolacije kvasovk

2.2.1.1 Vzorčenje, izolacija in gojenje kvasovk na gojiščih

Kvasovke lahko osamimo iz vzorcev z uporabo bodisi selektivnih (nizek pH gojišča,

visoko koncentracijo etanola ali sladkorja) ali bogatitvenih metod (gojišča z dodatkom



specifičnih virov ogljika, npr. etanola, rafinoze). V obeh primerih gojiščem dodajamo

antibiotike, ki zavrejo rast drugih mikroorganizmov (Sampaio in Gonçalve, 2008).

Osnovna sestava gojišča za rast in vzdrževanje kvasovk vsebuje sladni ali kvasni ekstrakt s

peptonom in glukozo (Walker, 2009). Za rast potrebujejo vir ogljika (npr. glukoza,

fruktoza, saharoza) in dušika (npr. pepton, tripton), določene vitamine, minerale in rastne

faktorje, ki so za vsako vrsto specifični. Pogosto gojiščem dodajamo tudi dodatke (npr.

kvasni ekstrakt, sladni ekstrakt). YM (»Yeast-Malt extract«) in MEA (»Malt extract agar«)

gojišči sta zelo pogosti za izolacijo, uporabljajo pa jih tudi za vzdrževanje in shranjevanje

kvasnih kultur v tekoči ali trdni obliki. Gojiščem lahko dodamo različne dodatke, kot npr.

sol (10 % NaCl), kloramfenikol (Ch) in etanol (10 % EtOH). Takšna gojišča pogosto

uporabljamo za izolacijo kultur, medtem ko za rast specifične vrste ali skupine kvasovk

uporabljamo selektivne ali diferencialne medije (Boundy-Mills, 2006).

Nekatere fizikalno-kemijske dejavnike zagotovimo s sestavo gojišč (pH), druge pa z

zunanjim okoljem (temperatura, kisik). Gojimo jih pod pogoji, ki so za mikroorganizme

najbolj optimalni (Rupnik s sod., 2005).

2.2.2 Metode identifikacije kvasovk

Določevanje kvasovk temelji večinoma na morfoloških znakih – fenotipske lastnosti. Za

določitev je potrebna gojitev na gojišču. Pomembne so značilnosti kulture, kot so barva,

oblika in struktura kolonij (Guarro s sod., 1999; Tarr, 2004). Prepoznava vrst kvasovk s

pomočjo morfoloških znakov je pogosto močno omejena. Vse lastnosti, kot so rast, celična

morfologija, rezultati fermentacijskih in asimilacijskih testov, lahko zelo varirajo med sevi

znotraj vrste (Kurtzman, 2006). Zato se vzporedno z morfološkimi znaki za prepoznavo oz.

identifikacijo uporabljajo fiziološke in biokemijske tehnike. Za razliko od teh so

molekularne tehnike splošno uporabnejše, saj so genotipski znaki prisotni povsod in so

neodvisni od ekspresije (Guarro s sod., 1999). Uporabljamo primerjave nukleotidnih

zaporedij DNA, saj tako lahko natančno identificiramo vrsto (Kurtzman, 2006).

2.2.2.1 Klasične metode identifikacije kvasovk

2.2.2.1.1 Morfološke metode

Vrste kvasovk lahko identificiramo in karakteriziramo na podlagi več različnih kriterijev,

kot so celična morfologija (npr. način celične delitve in oblika spor), fiziologija (npr. testi

fermentacije sladkorjev) in imonulogija (npr. imunoflurescenca) (Walker, 2009).

Morfološke lastnosti vegetativnih in spolnih struktur kvasovk so pomembne pri

prepoznavanju rodov kvasovk, poleg tega pa upoštevamo tudi izgled kolonij. K slednjemu

prištevamo barvo kolonij, površino, profil ter rob kolonij. Kvasovka S. cerevisiae se

razmnožuje tudi spolno, kar opazimo kot menjavo generacij s tvorbo značilnih celic

(askospor). Tvorbo askospor lahko pri nekaterih rodovih kvasovk izzovemo s specifičnimi

gojišči (acetatni agar za rod Saccharomyces, redčen V8 agar za rod Metschnikowia, malt

agar za rod Pichia). Za razvoj askospor je pomembna tudi temperatura, saj večina rodov

sporulira pri temperaturi od 20 do 25 ºC. Izgled askospor je prav tako pomemben

taksonomski znak (Zalar, 2011). Askospore lahko opazujemo z različnimi barvanji, npr. pri

rodu Saccharomyces z acidorezistentnim barvanjem – askospore so acidorezistentne in se



ne razbarvajo s kislim alkoholom. Acidorezistentno barvanje je diferencialno barvanje, pri

katerem preparat obarvamo z barvilom karbolfuksin, ter razbarvamo s kislim alkoholom.

Zaradi značilne sestave celične stene ostanejo obarvane le acidorezistentne askospore.

Sledi barvanje s kontrastnim barvilom metilenskim modrilom. Pri kvasovki S. cerevisiae se

askospore obarvajo rdeče, aski in vegetativne celice pa modro (Barnett s sod., 2000).

2.2.2.1.2 Fiziološke značilnosti

Asimilacijske in fermentacijske lastnosti kvasovk so še vedno tiste ključne lastnosti, na

podlagi katerih kvasovke opisujemo in identificiramo do nivoja vrst. Prav tako je

pomemben temperaturni razpon rasti, rast ob prisotnosti oz. odsotnosti določenih

vitaminov, cikloheksimida ter toleranca visokih koncentracij glukoze in NaCl. Kot dodatne

lastnosti se uporabljajo zmožnost sinteze škroba, ocetne kisline, hidroliza sečnine in

diazonium modro B-reakcija.

Za kvasovko Saccharomyces cerevisiae je značilno, da asimilira D-glukozo, naslednje vire

ogljika pa sevi lahko asimilirajo ali ne: D-galaktozo, saharozo, maltozo, trehalozo,

rafinozo, malezitozo, melebiozo, škrob, glicerol, D-manitol, etanol, nekateri sevi

asimilirajo tudi D-glukozid in laktat (Boulton in Quain, 2001; Barnett s sod., 2000).

Kvasovka lahko tolerira 10 % NaCl oz. 50 % glukoze v gojišču. Raste pri optimalni

temperaturi 25 °C, maksimalna temperatura rasti pa je 30 °C do 35 °C, včasih tudi od 37

oz. do 42 °C. Škroba ne sintetizira, niti ne ocetne kisline, prav tako pa ne hidrolizira

sečnine, reakcija diazonium modro pa je negativna (Barnett s sod., 2000).

2.2.2.2 Molekularne metode identifikacije

Prepoznava vrst kvasovk s pomočjo zgoraj opisanih morfoloških in fizioloških znakov je

pogosto močno omejena. Zato se vzporedno s fenotipskimi znaki za prepoznavanje vrst oz.

identifikacijo uporabljajo zanesljivejše metode na ravni genotipa (Guarro s sod., 1999;

Kurtzman, 2006). V taksonomiji kvasovk je najbolj pogosto uporabljeno zaporedje 26 S

rDNA oz. D1/D2 domena zaporedja LSU (Kurtzman s sod., 2011). Vrste in seve lažje

ločimo na podlagi variabilnejših zaporedij, kot je ITS rDNA. Pri tem je poleg samega

zaporedja pomembna tudi dolžina pomnožene DNA, saj je le-ta različna pri različnih

vrstah kvasovk (van der Vossen s sod., 2003; Sujaya s sod., 2003).

Glavni razlogi za uporabo regije ITS, ki kodirajo ribosomsko RNA, je pojavljanje v več

kopijah v tandemskem zaporedju, poleg tega pa so ribosomi prisotni v vseh organizmih in

imajo skupni evolucijski izvor (Guarro s sod., 1999; Kurtzman, 2006). Metoda verižne

reakcije s polimerazo (»Polymerase Chain Reaction« – PCR) z izbranim parom

oligonukleotidnih začetnikov ob določenih pogojih pomnoži del jedrne DNA. Nukleotidna

zaporedja pomnožkov uporabljamo za identifikacijo in jih primerjamo z nukleotidnimi

zaporedji v javno dostopnih bazah (Kurtzman, 2006; Zalar, 2011).



3 MATERIAL IN METODE

3.1 MATERIAL

3.1.1 Mikrobiološka gojišča za gojenje kvasovk

TEKOČA GOJIŠČA YM Z 10 % ETANOLOM IN KLORAMFENIKOLOM

sladni ekstrakt 3 g pH 4–5

kvasni ekstrakt 3 g

pepton 5g

glukoza 10 g

kloramfenikol 0,10 g

destilirana voda do 1000 ml

Ustrezne količine sestavin raztopimo v destilirani vodi in steriliziramo v avtoklavu

(121 °C, 1,2 atm, 15 min). Po avtoklaviranju, ko se gojišče že ohladi, aseptično dodamo

100 ml 96 % etanolom (EtOH). V sterilne epruvete aseptično odpipetiramo 10 ml gojišča

in jih zapremo z zamaškom.

GOJIŠČE MEA PO BLAKESLEE-JU (»MALT EXTRACT AGAR«) (Samson in sod.,

2004)

sladni ekstrakt 20 g pH 5,0–5,5

pepton 1,0 g

glukoza 20 g

agar 20 g


Ustrezno količino sestavin raztopimo v destilirani vodi, po potrebi segrevamo. Uravnamo

vrednost pH gojišča med 5,0 in 5,5. Steriliziramo v avtoklavu (121 °C, 1,2 atm, 15 min) in

vroče gojišče razlijemo v sterilne petrijevke oz. epruvete.

GOJIŠČE MEA S KLORAMFENIKOLOM (Andrews in Pitt, 1987)

Postopek priprave gojišča je enak kot pri gojišču MEA, s tem, da dodamo 0,05 g

kloramfenikola v 1 l gojišča, in sicer pred avtoklaviranjem.

GOJIŠČE PDA (»POTATO DEXTROSE AGAR«)

predpripravljeno gojišče - krompirjev agar (proizvajalec Biolife, Italija) 42 g




Ustrezno količino sestavin raztopimo v destilirani vodi v mikrovalovni pečici. Gojišče

steriliziramo v avtoklavu (121 °C, 1,2 atm, 15 min) in vroče razlijemo v sterilne petrijevke

oz. epruvete.

3.1.2 Mikrobiološka gojišča za sporulacijo S. cerevisiae

ACETATNI AGAR (Scott, 1979)

natrijev acetat 9,8 g pH 7

glukoza 10 g

NaCl 12 g

MgSO4×7H2O 7 g

YE (Yeast Extract) 2,5 g

agar 20 g


Ustrezno količino sestavin raztopimo s pomočjo mikrovalovne pečice v destilirani vodi.

Steriliziramo z avtoklavom (121 °C, 1,2 atm, 15 min) in aseptično odpipetiramo po 2 ml v

epruvete oz. prelijemo ustrezno količino na sterilne petrijevke.

UREAZNI AGAR

pepton 1 g pH 6,8–7

NaCl 5 g

KH2PO4 2g

glukoza 1 g

fenol rdeče 1,8 g

agar 20 g


Ustrezno količino sestavin raztopimo z mikrovalovno pečico v destilirani vodi.

Steriliziramo v avtoklavu (121 °C, 1,2 atm, 15 min).

sečnina 20 g sečnine/100 ml destilirane vode

Pripravimo raztopino 20 % sečnine in jo steriliziramo preko membranskega filtra s

premerom por 0,22 μm. Raztopino aseptično dodamo na 55 °C ohlajeno gojišče,

premešamo z magnetnim mešalom in aseptično odpipetiramo po 2 ml v male epruvete.



GOJIŠČA ZA FERMENTACIJSKE TESTE

Osnovno gojišče:

kvasni ekstrakt 4,5 g pH 7

pepton 7,5 g


raztopina bromtimol modro 40 ml (50 mg raztopimo v 75 ml destilirane vode)

Osnovno gojišče z ustreznimi količinami raztopimo v destilirani vodi. V velike epruvete z

durhamovimi cevkami odpipetiramo po 9 ml osnovnega gojišča in avtoklaviramo (121 °C,

1,2 atm, 15 min).

Sladkorji: D-glukoza, maltoza, saharoza, d-ksiloza

Po 20 g sladkorja raztopimo v 100 ml destilirane vode in steriliziramo s filtracijo preko

0,22 µm membranskih filtrov Millipore.

Po avtoklaviranju osnovnega gojišča v epruvete z durhamovimi cevkami aseptično dodamo

1 ml koncentrirane raztopine sladkorja.

GOJIŠČA ZA TEMPERATURNE TESTE

YNB (»Yeast Nitrogen Base«)

YNB (Difco) 1,7 g

glukoza 20 g

(NH4)2SO4 5 g

agar 22 g


Ustrezno količino sestavin raztopimo v destilirani vodi. Steriliziramo z avtoklavom

(121 °C, 1,2 atm, 15 min) in aseptično prelijemo v sterilne petrijevke.

TRDA GOJIŠČA ZA TESTE ASIMILACIJE OGLJIKOVIH SPOJIN

YNB (»Yeast Nitrogen Base«) z dodanim virom ogljika

Osnovno gojišče:

YNB 1,7 g

(NH4)2SO4 5 g

agar 20 g




Iz ustrezne količine sestavin raztopimo v destilirani vodi z mikrovalovno pečico osnovno

gojišče. Steriliziramo osnovno gojišče v avtoklavu (121 °C, 1,2 atm, 15 min). Ohladimo na

55 °C in dodamo raztopino s posameznim virom ogljika. Premešamo z magnetnim

mešalom in prelijemo na sterilne petrijevke.

Raztopina posameznega dodanega vira ogljika:

dodani vira ogljika 5 g


Viri ogljika: D-glukoza, D-galaktoza, L-sorboza, D-glukozamin, D-riboza, D-ksiloza, L-

arabinoza, L-ramnoza, maltoza, a,a trehaloza, celobioza, melibioza, rafinoza, melezitoza,

škrob, glicerol, ribitol, D-manitol, mio-inozitol, D-glukuronat, sukcinat, citrat, fruktoza,

sorbitol.

V stekleni čaši pripravimo 5 % raztopino posameznega vira ogljika, ki jo filtrsko

steriliziramo preko membranskih filtrov s premerom por 0,22 μm ter dodamo osnovnemu

gojišču po avtoklaviranju.

TRDA GOJIŠČA ZA TESTE ASIMILACIJE DUŠIKOVIH SPOJIN

YCB (»Yeast Carbon Base«) z dodanim virom dušika

Osnovno gojišče:

YCB 17 g

agar 20 g


Ustrezno količino sestavin osnovnega gojišča raztopimo z mikrovalovno pečico v

destilirani vodi. Steriliziramo v avtoklavu (121 °C, 1,2 atm, 15 min). Osnovno gojišče

ohladimo na 55 °C, mu aseptično dodamo ustrezno raztopino in pred prelivanjem na

petrijevke premešamo z magnetnim mešalom.

Raztopina posameznega dodanega viri dušika/100 ml destilirane vode:

nitrat (KNO3) 0,78 g

nitrit (NaNO2) 0,26 g

L-lizin 0,56 g

Iz ustreznih sestavin pripravimo raztopine in jih filtrsko steriliziramo preko membranskih

filtrov s porami premera 0,22 μm. Aseptično dodamo raztopino osnovnemu gojišču po

avtoklaviranju.



TRDA GOJIŠČA ZA UGOTAVLJANJE ENCIMSKIH AKTIVNOSTI

Osnovno gojišče za pektinazno aktivnost (hidroliza pektina) pri pH 5 (pektinaza) in pH 7

(pektinliaza):

pektin citrusov 10 g

YNB 6,7 g

agar 20 g


Ustrezne količine sestavin raztopimo z magnetnim mešalom v destilirani vodi. Posebej

moramo biti pozorni, da se pektin pred sterilizacijo popolnoma raztopi. Steriliziramo pri

110 °C 10 min in aseptično prelijemo na sterilne petrijevke.

Reagent: CTAB 10 g/100 ml

Gojišče po inkubaciji prelijemo z reagentom CTAB in tako opazimo rezultat encimske

aktivnosti.

Osnovno gojišče za celulolitična aktivnost (hidroliza karboksimetil celuloze):

karboksimetil celuloza 10 g

celobioza 5 g

YNB 6,7 g

agar 20 g


Ustrezno količino sestavin raztopimo v destilirani vodi. Pred sterilizacijo dobro raztopimo

vse sestavine s segrevanjem na mešalniku, še preden dodamo agar. Steriliziramo v

avtoklavu (121 °C, 1,2 atm, 15 min) in aseptično prelijemo na sterilne petrijevke.

Reagent: kongo rdeče 3 g/100 ml

Gojišče po inkubaciji prelijemo z reagentom kongo rdeče in tako opazimo rezultat

encimske aktivnosti.

3.1.3 Raztopine, pufri in zmesi

RAZTOPINA RNA-ZE

pankreatična RNAza 10 mg

natrijev acetat (0,01 M) 1 ml

pH 7,4 (uravnavamo z dodatkom 1M Tris Cl)



CTAB PUFER

Tris 24,2 g pH 7,5 (uravnamo z 1M HCl)

NaCl 82 g

Na-EDTA 7,4 g

CTAB 20 g

ultra čista voda do 1000 ml

TE PUFER

Tris 1,2 g pH 8 (uravnamo z 1M HCl)

Na-EDTA 0,4 g

ultra čista voda do 1000 ml

MEŠANICA SILIKAGELA IN CELITA

silikagel 30 g

celit 15 g

PUFER 1×TAE

Tris baza 242,0 g

ocetna kislina 57,1 ml

0,5 M EDTA (pH 8) 100 ml


50×TBE pufer smo 50-krat redčili z destilirano vodo in dobili 1×TAE pufer, ki smo ga

uporabili.

5×NANAŠALNI PUFER

bromtimol modro 2,5 g

ksilen cianol 2,5 g

glicerol 300 ml


ELEKTROFOREZNI GEL

agaroza 0,3 g



1×TAE pufer 30 ml

3.1.4 Reagenti

Preglednica 2: Seznam reagentov s proizvajalci.

Reagent Proizvajalec

PrepMan® Ultra

Applied Biosystems,

California, ZDA

ITS4: mesto vezave na 3' koncu 28S rDNA: nukleotidno zaporedje (5' proti 3'):

TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC Jena Bioscience

GmbH, Jena, Nemčija ITS5: mesto vezave: na 5' koncu 18S rDNA: nukleotidno zaporedje (5' proti 3'):

GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G

Microbank (sistem za shranjevanje kvasovk) Pro-Lab Diagnostics,

Kanada

3.1.5 Kemikalije

Preglednica 3: Seznam kemikalij s proizvajalci.

Kemikalija Proizvajalec

10×PCR pufer brez MgCl2

Fermentas,. Life Sciences, Litva Lestvica: "100bp DNA Ladder Plus"

RNA-ze

Taq polimeraza (5U/μl)

Agar agar

Merck, Darmastadt, Nemčija

Celit

Citrat

D-ksiloza

Etanol 70 %

MgSO4 × 7 H2O

Nitrit (NaNO2)

Pepton

Silikagel

Sečnina (Urea)

a,a trehaloza

Sigma Chemical C., St. Luis, Mo., ZDA

Bromtimol modro

Celobioza

CTAB

D-glukozamin

D-riboza

Fenol rdeče

Fruktoza

Karboksimetil celuloza

se nadaljuje



nadaljevanje

Kemikalija Proizvajalec

Karbol fuksin

Sigma Chemical C., St. Luis, Mo., ZDA

Kloramfenikol

Kongo rdeče

L-arabinoza

L-lizin

L-sorboza

Melibioza

Mio-inozitol

Na acetat

NaCl

Rafinoza

Ribitol

Sorbitol

Sukcinat

D-galaktoza

Kemika, Zagreb, Hrvaška

D-manitol

Glukoza

KH2PO4

L-ramnoza

Metilensko barvilo

Na-EDTA

Saharoza

Tris baza

HCl

Kloroform

Etanol 96 % (EtOH) Chemo d. d., Ljubljana, Slovenija

Glicerol

Sladni ekstrakt Applied Biosystems, California, ZDA

dNTP Carl Roth Gmbh+Co

Potato dextrose agar

Agaroza Difco laboratories, Detroit, Michigan, ZDA

Maltoza Beton, Dickinson and Company, Sparks, MD

Škrob

Nitrat (KNO3)

Zorka Šabac YCB

YNB

YE (kvasni ekstrakt) Biolife Italiana S.r.l.

Pektinski citrat /

Kisli alkohol (HCl + EtOH) /



3.1.6 Laboratorijska oprema

Preglednica 4: Seznam laboratorijske opreme.

Naziv Oznaka modela Proizvajalec

Aparatura za PCR Eppendorf, Nemčija

Avtoklav A-63C Kambič, Slovenija

Avtomatske pipete Eppendorf, Nemčija

Digestorij Variolab Molibien W90 Waldner, Nemčija

Digitalna kamera DP12 Olympus, Japonska

Električni transformator za elektroforezo Consort E143 Sigma-Aldrich, ZDA

Elektroforezna banjica E33 Hoefer, ZDA

Filtri s premerom por 0,22 μm Millex Millipore Corporate Headquarters,

ZDA

Hladilnik 4 °C Elektronik Gorenje, Slovenija

Homogenizator Retsch, Nemčija

Inkubator 30 °C Sutjeska, Jugoslavija

Laminarij IBK 1V2 Iskra, Slovenija

Ledomat Elektra-Bema, Slovenija

Magnetno mešalo Rotamix 550MMH Tehtnica, Slovenija

Mikroskop Olympus BX51 Olympus, Japonska

Mikrovalovna pečica Gorenje, Slovenija

pH meter Metrom 713 Železniki, Slovenija

Plinski gorilnik (Bunsenov) TLOS, Hrvaška

Stereomikroskop Steri SV11 z virom

svetlobe KL1500 LCD Zeiss, Nemčija

Tehtnice ET-1111 Tehtnica, Slovenija

Transluminator Syngene, Velika Britanija

Vodna kopel Pharmacia Biotech, Švedska

Vrtinčasto mešalo (vortex) Železniki, Slovenija

Zamrzovalnik (-20 °C) Lieberr, Nemčija

Zamrzovalnik (-80 °C) Semilab, Nemčija

3.2 METODE

3.2.1 Vzorčenje

Pred vzorčenjem smo določili seznam možnih nahajališč kvasovke S. cerevisiae, iz

katerega smo izhajali pri zbiranju vzorcev in kasnejšemu grupiranju vzorcev. Upoštevali

smo nahajališča, iz katerih je bila kvasovka Saccharomyces cerevisiae že izolirana, in

druga možna nahajališča. Seznam je predstavljen v preglednici 5.

Kraj in čas vzorčenja je bil poljuben in vnaprej nedoločen. Vzorčenje se je začelo v

začetku oktobra 2008 in je trajalo do konca februarja 2010 v posameznih večjih sklopih,

glede na sezonsko možnost nabiranja vzorcev. Kraji vzorčenja so bili različni. Večino

vzorcev smo nabrali v Sloveniji, nekaj vzorcev je bilo tudi iz ZDA (3 vzorci tal iz

vulkanskih predelov; Salt Lake), 10 vzorcev tal iz Nemčije (Mönchengladbach), vzorec



olivnega olja iz Dugega otoka in vzorec rdeče murve iz Pule. Vzorci so bili večinoma iz

Jesenic in okolice, Bistrice ob Sotli, Brega pri Žirovnici, Apač, Mrzlega vrha nad Idrijo,

Ljubljane, Mozirja, Portoroža, Sečovelj, Blejskega Vintgarja, doline Triglavske Bistrice,

Visoč, Tržiča, Pirana in Vojskega pri Idriji. Podrobnejši opisi nahajališč vzorcev so opisani

v prilogi (priloga A in B).

Preglednica 5: Seznam možnih nahajališč oz. vzorčenih substratov za uspevanje kvasovke S. cerevisiae.

brezalkoholne gazirane pijače morska voda (pristaniška, umazana)

buče za kuhanje (razpoke, semena, stiskalnica za olje) odpadna voda ribje pridelovalne industrije

citrusi olivno olje

cvetovi z veliko nektarja onesnažena tla

čebelji panji razgrajen les

deževniki silaža

domači kis sladka voda

domači siri in mlečni izdelki sladki plodovi, smolni vršički, smola

gnilo sadje in zelenjava sladkorni trs

gobe, lišaji slana voda iz solin nižje slanosti

gozdna stelja (listni drobir) slive

hrošči, ki vrtajo v les (črevo) sveže stisnjeni sadni sokovi pred pasterizacijo

hrošči, ličinke šampanjec

industrijska okolja – voda tla (zemlja) pod sadnimi drevesi, kjer leži sadje

iztrebki plazilcev tla (zemlja) pod zelenjavo

jabolčna čežana vabe DG18 v ribogojnici in soline

jagodičevje vinogradi (tla, zamaški, sodi, stiskalnice, mošt)

kaktusi voda iz ribogojnic

kislo zelje vzorci rib

kompost z nafto/asfaltom kontaminirana tla

lubje zemlja, kjer raste sladkorna pesa

med žuželke (vinske mušice)

Tekoče vzorce smo odvzeli v sterilne posodice (npr. vzorec sirotke, mošta, sveže

stisnjenega soka pred pasterizacijo, vodne usedline, slivove brozge, kisa …). Večje

količine tekočin smo shranjevali v 1,5-litrske PVC-plastenke (npr. odpadne vode za

filtracijo). Trdne vzorce, kot so zemlja, gnilobe, sir, vinske mušice, silaža, jabolka iz kisa,

itd., smo shranili v PVC-vrečke za shranjevanje živil. Brise gob, lista limone in površine

kože brancina smo vzorčili s sterilnimi vatenkami, ki smo jih po odvzemu brisov shranili v

plastičnih epruvetah. Vzorce smo nanesli v selekcijska gojišča takoj, oz. po največ 14

dneh. V slednjem primeru smo vzorce shranili na 4 °C. Vsakemu vzorcu smo dodali

oznako B in zaporedno številko (npr. B45). Če smo iz enega vzorca odvzeli več izolatov

smo to označili z hierarhijo zaporednih črk tik za številko (npr. B45A).



3.2.2 Izolacija kvasovk iz nabranih vzorcev

3.2.2.1 Priprava vzorcev in anaerobno gojenje v tekočem gojišču

Vzorce smo namestili v tekoča gojišča z 10 % etanola kot selekcijskim faktorjem (YM +

10% EtOH s kloramfenikolom). V primeru tekočih vzorcev smo dodali po 1000 µl vzorca

v 10 ml gojišča, v primeru trdnih vzorcev pa cca. 1 žličko vzorca. Če smo vzorčili brise,

smo inkubirali v gojišču odrezan konec vatenke, če pa smo vzorce koncentrirali s filtracijo,

pa smo v tekoče gojišče dali kar filter papir z oborino, ki se je na njem ulovila. Vse

epruvete smo označili z dodeljenimi oznakami in jih inkubirali v anaerobnih loncih, v

katerih smo vzpostavili naslednjo atmosfero: N2 – 80 %, CO2 – 10 % in H2 – 10 %. V

lonec smo dodali paladijev katalizator ter lonec inkubirali pri 30 °C teden dni.

3.2.2.2 Aerobno gojenje na trdem gojišču

Po tednu dni inkubacije smo aseptično iz vsake epruvete odvzeli po 100 µl gojišča z

usedlino. V tekočem gojišču je bila rast kvasovk opazna kot motnost. Odvzeti vzorec smo

nacepili na petrijevke z osnovnim gojiščem MEA z antibiotikom kloramfenikolom.

Petrijevke smo inkubirali aerobno en teden pri 30 °C.

3.2.2.3 Izbira in redčenje kulture do posameznih kolonij

Po inkubaciji smo pregledali rast mešanih kultur na osnovnih gojiščih. Na njem so se

razrasle različne kolonije, včasih je bilo gojišče popolnoma preraslo, na nekaterih gojiščih

pa kvasovke niso rasle. Slednja gojišča smo inkubirali dodatnih sedem dni na 30 °C, po

tem času pa smo jih zavrgli. Glede na morfologijo kolonij smo določili, katere kolonije

bomo izolirali. Izbrali smo tiste kolonije, ki so bile bele do krem barve, po obliki okrogle,

robovi kolonij pa so bili gladki. Površina kolonije naj bi bila gladka, profil kolonije

nekoliko izbokel in njen ustroj mazave. Ustrezne kolonije smo izolirali z nanosom do

posameznih kolonij na gojišče MEA s kloramfenikolom. Kjer je bilo gojišče popolnoma

preraščeno, smo vzorec cepili do posameznih kolonij in iz njih izolirali čiste kulture.

Izolate smo ustrezno označili tako, da smo za oznako vzorca dodali podčrtaj in veliko

tiskano črko (npr. B45_A). Če je bilo na gojišču prisotnih več kolonij, smo jim določili

določeno hierarhijo oznak (npr. B45_A, B45_B, itd.). Zopet smo petrijevke zalepili s

parafilmom, jih narobe obrnili in inkubirali en teden pri 30 °C. Postopek cepljenja do

posameznih kolonij smo ponavljali toliko časa, dokler nismo dobili povsem čiste kulture.

3.2.2.4 Shranjevanje

Posamezno čisto kolonijo smo sterilno prenesli iz osnovnega gojišča na poševnike z

osnovnim gojiščem MEA, ki smo jih zaprli z vatenim zamaškom in jih zaščitili s

cigaretnimi papirčki. Poševnike z rastočimi kulturami smo shranjevali v hladilniku pri

4 °C.



3.2.3 Določevanje fenotipskih lastnosti

3.2.3.1 Morfologija kolonij

S pomočjo stereomikroskopa in s prostim očesom smo opazovali barvo in obliko kolonij,

rob, površino in profil kolonij (glej poglavje 3.2.2.3 Izbira in redčenje kulture do

posameznih kolonij).

3.2.3.2 Morfologija kvasnih celic

Za opazovanje morfologije celic smo pripravili mikroskopske preparate, ki smo jih

pripravili v 60 % mlečni kislini. Pokrili smo jih s krovnim steklom in opazovali obliko

celic s svetlobnim mikroskopom Olympus BX-51 in jih fotografirali z digitalno kamero

Olympus DP-12.

3.2.3.3 Morfologija askospor

Acidorezistentno barvanje (barvanje po Zehl-Neelsenu) je diferencialno barvanje za

ugotavljanje prisotnosti askospor. Acetatna gojišča smo pripravili v malih epruvetah z

zamaškom (glej poglavje 3.1.2 Mikrobiološka gojišča za sporulacijo S. cerevisiae). Na

gojišče smo sterilno nacepili s cepilno zanko čisto kulturo. Inkubirali smo na 30 °C en

teden. Po inkubaciji smo barvali askospore po postopku acidorezistentnega barvanja.

Kvasovke smo razmazali po površini objektnega stekla, na katero smo prej kapnili

fiziološko raztopino. Objektno steklo smo trikrat potegnili čez plamen, da smo celice

fiksirali. Na objektnik smo kapnili karbol fuksin in ga pustili delovati 5 minut. Barvilo smo

nato odlili in ga nato sprali s 70 % etanolom. Razbarvali smo s kislim alkoholom in sprali z

destilirano vodo. Nato smo na objektnik kapnili metilensko barvilo in ga pustili delovati 3

minute. Preparat smo sprali z vodo in ga pustili, da se posuši. Te preparate smo pogledali s

svetlobnim mikroskopom Olympus BX-51 in jih fotografirali z digitalno kamero Olympus

DP-12. Askospore se pri tem obarvajo rdeče-roza, stene askov in vegetativne celice pa

modro.

3.2.4 Določevanje genotipskih lastnosti

3.2.4.1 Izolacija genomske DNA

3.2.4.1.1 Izolacija genomske DNA z izolacijskim kitom Prepman Ultra®

V sterilne mikrocentrifugirke (2 ml) smo sterilno odpipetirali 100 µl reagentnega kita za

izolacijo DNA Prepman Ultra®. Sveže kolonije smo zajeli s cepilno zanko in jih dodali kitu

za izolacijo. Nato smo tretirali vzorce v mikrocentrifugirkah v vroči kopeli (100 °C) 10

minut. Vzorce smo po 10 minutah pobrali iz kopeli in jih ohlajali 2 minuti. Nato smo jih

centrifugirali pri 14 000 rpm (obratih na minuto) oz. 16 873 g 2 minuti. Supernatant z

DNA smo odpipetirali v sveže mikrocentrifugirke, ki smo jih shranili v zamrzovalnik pri -

20 °C.

3.2.4.1.2 Ekstrakcija DNA z mehansko lizo

Ekstrakcija DNA z mehansko lizo se uporablja za izolacijo DNA-gliv, predvsem tistih s

tršo celično steno. Ta postopek smo uporabili samo enkrat, in sicer za vzorce, pri katerih ni

bilo mogoče izolirati DNA z izolacijskim kitom Prepman Ultra®.



V mikrocentrifugirko (2 ml) z oglatim dnom s silikagelno mešanico in kovinsko kroglico

odpipetiramo 300 µl CTAB pufra. S sterilno spatulo smo prenesli v CTAB pufer 1 večjo

cepilno zanko čiste kulture kvasovk iz shranjenih poševnikov (glej poglavje 3.2.2.4

Shranjevanje). Material smo strli s homogenizatorjem do homogenata 1 minuto. Nato smo

odpipetirali dodatnih 200 µl CTAB pufra in premešali na mešalu. Inkubirali smo 30 minut

v vodni kopeli pri 65 °C. Nato smo mikrocentrifugirki dodali v digesoriju 500 µl

kloroforma in premešali na mešalu za 1–2 sekundi. Mešanico v mikrocentrifugirki smo

centrifugirali še 5 minut pri 14.000 rpm (16.873 g). Zgornjo vodno fazo smo odpipetirali v

novo sterilno mikrocentrifugirko, preostanek pa zavrgli v odlagalnik. Odpipetiranemu delu

smo dodali 800 µl 96 % etanola predhodno ohlajenega na -20 °C. Nato smo previdno

ročno premešali raztopino in jo inkubirali v mikrocentrifugirkah pri temperaturi -20 °C

preko noči. Naslednji dan smo mikrocentrifugirke centrifugirali 5 minut pri 14.000 rpm

(16.873 g). Previdno smo odpipetirali supernatant in sprali preostali pelet s 500 µl 70 %

etanola, ohlajenim na -20 °C. Sledilo je centrifugiranje 5 minut pri 14.000 rpm (16.873 g)

in pazljivo odpipetiranje etanola, ne da bi se dotaknili peleta. Pelet smo nato osušili na

zraku do suhega in ga resuspendirali v 49 µl TE pufru in dodali 1 µl RNAze.

Mikrocentrifugirko smo inkubirali 5–30 minut v topli sobi pri 37 °C. Postopek priprave

vseh reagentov je opisan v poglavju 3.1.3 Raztopine, pufri in zmesi.

3.2.4.2 Verižna reakcija s polimerazo (PCR)

Polimerazna verižna reakcija (PCR) temelji na pomnoževanju določenih delov rDNA s

pomočjo specifičnih začetnih oligonukleotidov. Za pomnoževanje ITS rDNA regije smo

uporabili oligonukleotidna začetnika ITS4 in ITS5. Pomnožek pa vključuje 5,8S rDNA in

dva vmesna distančnika ITS1 in ITS2 – skupno ITS rDNA (McCullough, 1998).

PCR-mešanico smo pripravljali v mikrocentrifugirki (1,5 ml) v določenih količinskih

razmerjih, opisanih v preglednici 6. Mešanico smo pripravljali na ledu in jo aseptično

odpipetirali v mikrocentrifugirka za PCR. PCR-vzorec za negativno kontrolo je

predstavljala mešanica brez DNA.

Preglednica 6: PCR-mešanica za en vzorec.

Reagent Koncentracija Količina (µl)

Bidestilirana H2O 26,32

MgCl2 25 mM 0,5

10×pufer Dream Taq brez MgCl2 3,5

dNTP (AB) nukleotidi 10 mM 0,7

Oligonukleotidni začetek 1 (ITS4) 10 pmol/μl 1,4

Oligonukleotidni začetek 2 (ITS5) 10 pmol/μl 1,4

Dream Taq polimeraza 5 U/μl 0,18

Izolirana DNA 1

Program za pomnožitev ITS rDNA regije z verižno reakcijo s polimerazo je opisan v

preglednici 7. Po končani reakciji smo prisotnost pomnožkov preverili z gelsko

elektroforezo.



Preglednica 7: PCR-program.

Proces Temperatura Interval Št. ciklov

začetna denaturacija 94 °C 1 minuta 1

denaturacija 94 °C 35 sekund

30 vezava začetnih oligonukleotidov 55°C 53 sekund

podaljševanje verige DNA 72 °C 30 sekund

končno podaljševanje verige DNA 72 °C 10 minut 1

zaključek 4 °C ∞ 1

3.2.4.3 Gelska elektroforeza

Za preizkus uspešnosti pomnožitve smo uporabili 1 % agarozni gel z 1×TAE pufrom. V

gel smo dodali barvilo, ki obarva DNA produkte »syber green« ter gel nalili v nosilec za

strjevanje gela. Gel smo vstavili v elektroforetsko banjico v 1×TAE pufer. V prvo

vdolbinico na gelu smo odpipetirali 2 µl DNA-lestvico (Gene ruler 100 bp DNA), v

naslednje vdolbinice pa po 5µl vzorcev (1,5 µl nanašalnega pufra in 4 µl PCR produkta).

Elektroforeza je potekala pri 100 V. Po končani elektroforezi smo gel pogledali v

transiluminatorju G-box, ga fotografirali in obdelali z računalniškim programom Gene

snap.

3.2.4.4 Določanje in obdelava nukleotidnega zaporedja

Nukleotidna zaporedja (sekvence) so določili v podjetju Macrogen (Seul, Koreja).

Pridobljena nukleotidna zaporedja smo poiskali in pregledali z najbolj sorodnimi in jih na

ta način določili preko zaporedij v bazi podatkov NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) v

bazi GeneBank na spletu s funkcijo BLAST.

3.2.4.5 Shranjevanje izoliranih kvasovk

Izolirane in identificirane kvasovke smo shranili v zbirki ekstremofilnih mikroorganizmov

EX na Oddelku za biologijo Biotehniške fakultete. Sveže kulture smo shranili v

zamrzovalniku na -80 °C s sistemom MicroBank. Večjo količino čiste kolonije kvasovk

smo s cepilno zanko prenesli na kroglice mikrocentrifugirke MicroBank, pretresli,

odpipetirali tekočino in shranili na ustrezno mesto v zamrzovalnik.

3.2.5 Asimilacijske, fermentacijske in encimske lastnosti

Pri kvasovkah identificiranih kot Saccharomyces cerevisiae smo preverjali določena

odstopanja znotraj različnih sevov na podlagi asimilacijskih, fermentacijskih in encimskih

lastnosti.

3.2.5.1 Asimilacijske lastnosti

Za preverjanje asimilacijskih lastnosti smo pripravili ustrezna gojišča (glej poglavje 3.1.2

Mikrobiološka gojišča za sporulacijo S. cerevisiae) za preverjanje asimilacije na dušik in

ogljik. Iz posameznega seva kvasovke Saccharomyces cerevisiae smo pripravili suspenzijo

celic v destilirani vodi v mikrocentrifugirkah (1,5 ml). V obliki kapljic smo jih nanesli na

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/



različna ustrezna gojišča. Ta gojišča smo zalepili s parafilmom in jih inkubirali 21 dni pri

30 °C. Po 7., 14. in 21. dnevu smo pregledovali rast na ploščah v primerjavi z negativno

kontrolo osnovnega gojišča YCB oz. YNB za asimilacijo dušika oz. ogljika. Končne

rezultate smo podali po 21 dneh inkubacije.

3.2.5.2 Fermentacijske lastnosti

Pri kvasovkah identificiranih kot Saccharomyces cerevisiae smo preverjali fermentacijske

sposobnosti (poglavje 3.1.2 Mikrobiološka gojišča za sporulacijo S. cerevisiae). Pripravili

smo suspenzijo celic 20 sevov Saccharomyces cerevisiae v destilirani vodi (cca. polovica

cepilne zanke v 0,5 ml). Osnovnemu gojišču smo dodali sterilno s pipeto 50 µl suspenzije

in inkubirali na 30 °C 2–3 tedne. Posamezne vmesne rezultate smo si večkrat zapisovali.

Pozitivna reakcija je bila, če se je gojišče zakisalo (obarvalo rumeno) in se je sproščal CO2

(nastanek mehurčka v durhamovi cevki).

3.2.5.3 Encimske lastnosti

Preverjali smo pektinsko in celulolitično aktivnost sevov Saccharomyces cerevisiae.

Pripravili smo ustrezna gojišča po postopku opisanem v poglavju 3.1.2 Mikrobiološka

gojišča za sporulacijo S. cerevisiae. Iz posameznih sevov S. cerevisiae smo pripravili

suspenzijo v mikrocentrifugirkah (1,5 ml) in suspenzije po kapljicah nanašali na ustrezna

gojišča. Plošče z gojišči smo inkubirali teden dni na 30 °C. Pozitivna reakcija pri

pektinazni aktivnosti je bila opazna po dodatku 1 % CTAB, in sicer kot cona zbistritve

okoli kolonij. Pri celulolitični aktivnosti smo seve cepili na enak način kot pri pektinazni

aktivnosti, gojišča pa smo prelili z 0,03 % kongo rdečim in inkubirali 15 minut. Reagent

smo nato odlili in sprali z 1 M NaCl. V tem primeru je bila pozitivna reakcija vidna kot

intenzivno svetlo rumen obroč okoli kolonij.

3.2.5.4 Temperaturni testi

Za različne seve kvasovke Saccharomyces cerevisiae smo preverjali rast pri različnih

temperaturah. Iz posameznih sevov kvasovke smo pripravili suspenzijo z destilirano vodo

v mikrocentrifugirkah (1,5 ml) in jo nanesli na osnovno YNB gojišče z glukozo. Plošče

smo zlepili s parafilmom in jih inkubirali pri 10 °C, 20 °C, 25 °C, 30 °C in 37 °C.

Rezultate smo preverjali vsak teden, tri tedne zaporedoma.

3.2.6 Parjenje haploidnih sevov Saccharomyces cerevisiae

Izbrali smo seve S. cerevisiae, ki po rasti na acetatnem agarju niso tvorili askospor. S

kombinacijami teh različnih sevov S. cerevisiae smo želeli ugotoviti, če so kompatibilni

paritveni tipi oz. ali tvorijo askospore. Pripravili smo gojišče, opisano v poglavju 3.1.2 in

nanesli določene kombinacije sevov na gojišča. Petrijevke smo zalepili s parafilmom in jih

inkubirali samo 7 dni pri 30 °C. Po tednu dni smo celice barvali po postopku

acidorezistentnega barvanja (glej poglavje 3.2.3.3 Morfologija askospor) in jih pregledali s

svetlobnim mikroskopom Olympus BX-51 ter jih fotografirali z digitalno kamero Olympus

DP-12.

32 Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih okolij.


4 REZULTATI

4.1 OPIS VZORCEV

Vseh 273 vzorcev smo združili v 27 skupin (glej Preglednico 8). Iz 273 vzorcev smo

osamili 122 kvasnih kultur (izolatov). Način selektivne izolacije, ki smo ga uporabili (10 %

EtOH in anaerobna inkubacija) je selekcioniral kvasovke. Filamementozne glive smo

zasledili samo pri 6 % izolatov. Največ vzorcev smo zajeli iz naslednjih skupin: gobe in

lišaji (14 %), vinogradniški vzorci (10 %), vzorci rib (10 %) in vode industrijskih okolij (8

%) (glej sliko 4). Vsaka skupina vzorcev, iz katere smo izolirali vsaj en sev kvasovk, bo

predstavljena po poglavjih v nadaljevanju. Vsi vzorci z vsemi kvasnimi izolati in

nahajališči vzorcev so opisani v prilogi (priloga A).

Preglednica 8: Pregled skupin vzorcev glede na izvor in število vzorcev, število vseh kvasnih izolatov in

izolatov kvasovke S. cerevisiae kot delež med vsemi kvasnimi izolati.

Skupina vzorcev Izvor vzorca Št.

vzorcev

Št. kvasnih

izolatov

Št. izolatov S.

cerevisiae (%)

brezalkoholne gazirane pijače Mrzli vrh nad Idrijo,

Ljubljana (SI) 2 1

buče za kuhanje (razpoke, semena,

stiskalnica za olje) Apače (SI) 1 0

citrusi Jesenice (SI) 6 1

domači kis Breg pri Žirovnici,

Mozirje, Jesenice (SI) 9 5 1 (20 %)

gnilo sadje in zelenjava Breg pri Žirovnici (SI) 15 3 1 (33 %)

gobe, lišaji

Blejski Vintgar, dolina

Triglavske Bistrice,

Vojsko pri Idriji (SI)

38 3

gozdna stelja (listni drobir) Jesenice, dolina

Triglavske Bistrice (SI) 5 2

jagodičevje Breg pri Žirovnici,

Jesenice (SI) 8 4

kislo zelje Breg pri Žirovnici (SI) 5 0

med Breg pri Žirovnici (SI) 1 0

mlečni izdelki Breg pri Žirovnici,

Visoče, Jesenice (SI) 14 15 4 (27 %)

morska voda v pristanišču Portorož (SI) 1 0

olivno olje Dugi otok (HR) 1 0

onesnažena tla Jesenice (SI) 5 0

razgrajen les

Jesenice, dolina

Triglavske Bistrice, Breg

pri Žirovnici (SI)

17 12 1 (8 %)

sladki plodovi (npr. slive) Breg pri Žirovnici (SI),

Pula (HR) 2 1 1 (100 %)

silaža Breg pri Žirovnici (SI) 11 7 1 (14 %)

slana voda iz solin nižje slanosti Sečovlje (SI) 10 0

se nadaljuje



nadaljevanje

Skupina vzorcev Izvor vzorca Št.

vzorcev

Št. kvasnih

izolatov

Št. izolatov S.

cerevisiae (%)

smolni vršički, smola, lubje Breg pri Žirovnici,

Jesenice (SI) 8 0

sveže stisnjeni sadni sokovi pred

pasterizacijo Breg pri Žirovnici (SI) 7 6 3 (50 %)

tla pod sadnimi drevesi, kjer leži sadje Breg pri Žirovnici,

Bistrica ob Sotli (SI) 11 7 2 (29 %)

tla, kjer raste sladkorna pesa Mönchengladbach (D) 10 0

vinogradniški vzorci (tla, zamaški, sodi,

stiskalnice za grozdje, mošt)

Bistrica ob Sotli, Breg pri

Žirovnici, Jesenice (SI) 28 27 15 (56 %)

voda iz industrijskih okolij Jesenice, Tržič (SI) 23 26 13 (50 %)

vzorci rib Piran (SI) 26 0

z nafto/asfaltom kontaminirana tla Jesenice (SI), Salt Lake

(ZDA) 4 0

žuželke (vinske mušice) Jesenice, Breg pri

Žirovnici (SI) 5 2 2 (100 %)

SKUPAJ 273 122 44 (36 %)

Vse odvzete vzorce smo inkubirali v tekočem selekcijskem gojišču v anaerobni atmosferi

(glej poglavje 3.2.2 Izolacija kvasovk iz nabranih vzorcev), jih nanesli na gojišče

MEA+Ch in kvasovke izolirali do čistih kultur. Kvasovke smo z uporabo selektivne

izolacijske tehnike izolirali iz 45 % vzorcev. Primeri nekaterih osnovnih izolacijskih gojišč

so prikazani na sliki 5. Kolonije, ki so bile morfološko podobne kvasovki S. cerevisiae

(barva, oblika kolonije), smo nacepili do čistih kultur in izolate molekularno identificirali

na podlagi ITS zaporedja. Največ (tretjina) sevov je po identifikaciji pripadalo iskani

kvasovki S. cerevisiae (36 %) (glej Preglednico 8). Identifikacija izolatov je opisana v

naslednjem poglavju.



Slika 4: Zastopanost posamezne skupine vzorcev glede na število vseh vzorcev (N = 273).

gobe, lišaji (13,9%)

vinogradniški vzorci

(10,3%)

vzorci rib (9,5%)

voda iz industrijskih

okolij (8,4%)

razgrajen les (6,2%) gnilo sadje in

zelenjava (5,5%)

mlečni izdelki (5,1%)

silaža (4,0%)

tla pod sadnimi

drevesi, kjer leži sadje

(4,0%)

slana voda iz solin

nižje slanosti (3,7%)

tla, kjer raste

sladkorna pesa (3,7%)

domači kis (3,3%)

jagodičevje (2,9%)

smolni vršički, smola,

lubje (2,9%)

sveže stisnjeni sadni

sokovi pred

pasterizacijo (2,6%)

citrusi (2,2%)

gobe, lišaji (13,9%) vinogradniški vzorci (10,3%)

vzorci rib (9,5%) voda iz industrijskih okolij (8,4%)

razgrajen les (6,2%) gnilo sadje in zelenjava (5,5%)

mlečni izdelki (5,1%) silaža (4,0%)

tla pod sadnimi drevesi, kjer leži sadje (4,0%) slana voda iz solin nižje slanosti (3,7%)

tla, kjer raste sladkorna pesa (3,7%) domači kis (3,3%)

jagodičevje (2,9%) smolni vršički, smola, lubje (2,9%)

sveže stisnjeni sadni sokovi pred pasterizacijo (2,6%) citrusi (2,2%)

gozdna stelja (1,8%) kisanje zelja (1,8%)

onesnažena tla (1,8%) žuželke (vinske mušice) (1,8%)

z nafto/asfaltom kontaminirana tla (1,5%) brezalkoholne gazirane pijače (1 %)

sladki plodovi (npr. slive) (0,7%) buče za kuhanje (0,4%)

med (0,4%) morska voda v pristanišču (0,4%)

olivno olje (0,4%)



Slika 5: Osnovne izolacijske plošče gojišča MEA s kloramfenikolom.

A, B, C: vinogradniški vzorci (tla, zamaški, sodi, stiskalnice, mošt), D, F: vzorci sveže stisnjenih

nepasteriziranih sadnih sokov, E: vzorci domačih sirov in mlečnih izdelkov



4.1.1 Izolacija kvasovk glede na skupine vzorcev

Izolati vseh kvasovk so predstavljeni v preglednici 9 po skupinah vzorcev. Izolacije, pri

katerih smo izolirali kvasovke, so po skupinah prikazane na sliki 6 skupaj s številom sevov

kvasovke S. cerevisiae.

Preglednica 9: Opis vzorcev po skupinah glede na kraj, število vseh odvzetih vzorcev in število pozitivnih

izolatov na kvasovke.

Skupina vzorcev Opis vzorcev (kvasni izolati v oklepaju) Kraj odvzema

vzorca

Št.

vzorcev

Št. kvasnih

izolatov

brezalkoholne

gazirane pijače - kombuča (EXF-4926) Ljubljana 2 1

citrusi - sok limone (EXF-6210) Jesenice 6 1

domači kis

- goba za kisanje jabolčnega kisa (EXF-4923),

- jabolčni kis (EXF-5296),

- jabolčni mošt (EXF-4927),

- jabolka iz jabolčnega kisa (EXF-6305),

- usedlina jabolčnega kisa (EXF-6307)

Breg pri

Žirovnici 9 5

gnilo sadje in

zelenjava

- gnile rumene kolerabe (EXF-5733),

- gnila breskev (EXF-6215),

- gnil stročji fižol (EXF-6216)

Breg pri

Žirovnici 15 3

gobe, lišaji

- neidentificirane drevesne gobe (EXF-6222),

- bris površine gobe Pseudohydnum gelatinosum

(EXF-6262, EXF-6263)

Blejski

Vintgar,

Vojsko

38 3

gozdna stelja

(listni drobir) - mešani listni drobir (EXF-6212, EXF-6303)

Jesenice,

dolina

Triglavske

Bistrice

5 2

jagodičevje - maline (EXF-6208, EXF-6209, EXF-5732, EXF-

6211) Jesenice 8 4

mlečni izdelki

- kefir (EXF-5288, EXF-5289, EXF-5295, EXF-6230,

EXF-6233),

- voda kislega mleka (EXF-4924),

- sirotka (EXF-6231),

- ovčji sir (EXF-6232),

- kajmak (EXF-6237, EXF-6238, EXF-6239),

- kravji sir z orehi (EXF-6240),

- kravji sir (EXF-5871, EXF-6241, EXF-5872),

Breg pri

Žirovnici,

Visoče,

Jesenice

14 15

razgrajen les

- trhel les (EXF-6300, EXF-6301, EXF-6302, EXF-

5868, EXF-5869, EXF-6220, EXF-6264, EXF-6221,

EXF-6242),

- staro žaganje (EXF-6304, EXF-6223, EXF-6224)

Jesenice,

dolina

Triglavske

Bistrice

17 12

silaža

- koruzna silaža (EXF-5284, EXF-6225, EXF-6226,

EXF-6227, EXF-6228),

- del koruznega storža (EXF-6229, EXF-6306)

Breg pri

Žirovnici 11 7

sladki plodovi

(npr. slive) - slive (EXF-5287)

Breg pri

Žirovnici 2 1

sveže stisnjeni

sadni sokovi pred

pasterizacijo

- jagodni sok (EXF-5290, EXF-5291, EXF-5292),

- hruškov sok (EXF-5297, EXF-4925),

- jabolčni sok (EXF-5293)

Breg pri

Žirovnici 7 6

se nadaljuje



nadaljevanje

Skupina vzorcev Opis vzorcev (kvasni izolati v oklepaju)

Kraj

odvzema

vzorca

Št.

vzorcev

Št. kvasih

izolatov

vinogradniški

vzorci (tla,

zamaški, sodi,

stiskalnice, mošt)

- mošt (EXF-5272, EXF-4909, EXF-4911),

- vinski kamen (EXF-5273, EXF-4913, EXF-4915),

- tla, kamor se steka vino (EXF-4912, EXF-5274),

- grozdni peclji (EXF-5275, EXF-5277 , EXF-4917,

EXF-5278, EXF-4919, EXF-4922)

- tropine (EXF-4914, EXF-5276, EXF-5280, EXF-6235,

EXF-6236),

- koruzni liček kot čep na sodu (EXF-4916, EXF-4918,

EXF-5279, EXF-5282, EXF-4921),

- grozdje (EXF-4920),

- mlado vino (EXF-5294),

- leseni sod za vino (EXF-6217)

Bistrica

ob Sotli 28 27

voda industrijskih

okolij

- usedline odpadne vode iz skal (EXF-6218, EXF-6219,

EXF-5870),

- odplake iz avtopralnice (EXF-6243, EXF-6252, EXF-

6253, EXF-6254, EXF-6255),

- onesnažena voda potokov (EXF-6244, EXF-6245,

EXF-6308, EXF-6309, EXF-6246, EXF-6247, EXF-

6248, EXF-6249, EXF-6250, EXF-6251, EXF-5874,

EXF-6261, EXF-5875),

- odpadne vode pred vstopom v čistilno napravo pri

proizvodnji lepenke (EXF-5873, EXF-6256, EXF-6257,

EXF-6258, EXF-6259)

Jesenice,

Tržič 23 26

tla pod sadnimi

drevesi, sadjem

zelenjavo

- tla pod jabolkom (EXF-5283, EXF-6214),

- tla pod grozdjem (EXF-5285, EXF-5286),

- tla pod paradižnikom (EXF-6213),

- tla pod breskvijo (EXF-5735)

- tla, kjer je ležalo grozdje (EXF-5281)

Breg pri

Žirovnici,

Bistrica

ob Sotli

11 7

žuželke (vinske

mušice) - vinske mušice z ličinkami (EXF-5734, EXF-6234) Jesenice 5 2

SKUPAJ 201 122



Slika 6: Število vseh kvasnih izolatov (N = 122) razporejeno na izolate sevov vrste S. cerevisiae (N = 44) in

na izolate drugih kvasovk (N = 78) po skupinah vzorcev.

Zastopanost posameznih vrst kvasovk, ki so se pojavljale med izolati, je prikazana na sliki

7. Prevladuje iskana kvasovka S. cerevisiae, ostale vrste pa so zastopane v manjšini. Ostale

izolate smo identificirali kot vrste Candida albicans, C. ethanolica, C. glabrata, C.

paludigena, C. tropicalis, C. zemplinina, C. zeylanoides, Clavispora lusitaniae, Dekkera

bruxellensis, Hanseniaspora uvarum, Issatchenkia orientalis, Kazachstania unispora,

Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Metschnikowia aff. fructicola,

Metschnikowia pulcherrima, Pichia guilliermondii, Pichia membranifaciens, Pichia

sporocuriosa, Rhodotorula mucilaginosa, Saccharomyces paradoxus, Saccharomycodes

ludwigii, Torulaspora delbrueckii, Wickerhamomyces anomalus, Yarrowia lipolytica,

Zygosaccharomyces bailii in nekaj izolatov kot rod Candida ter razred Saccharomycetes.

1

1

1

1

1

2

2

3

4

13

15

1

1

3

2

4

4

2

11

6

5

3

11

13

12

0 5 10 15 20 25 30

brezalkoholne gazirane pijače

citrusi

gobe, lišaji

gozdna stelja (listni drobir)

jagodičevje

domači kis

gnilo sadje in zelenjava

razgrajen les

silaža

sladki plodovi (npr. slive)

tla (zemlja) pod sadnimi drevesi, sadjem in zelenjavo

žuželke (vinske mušice)

sveže stisnjeni sadni sokovi pred pasterilizacijo

mlečni izdelki

voda industrijskih okolij


št. izolatov kvasovk

izolati sevov vrste S. cerevisiae izolati drugih vrst kvasovk



Slika 7: Zastopanost posameznih vrst kvasovk med izolati (N = 122).

Z rdečo barvo je označen stolpec zastopanosti izolatov kvasovke S. cerevisiae.

4.1.1.1 Brezalkoholne gazirane pijače

To skupino predstavljata vzorca gaziranih pijač Cocta in kombuča. Iz slednje smo izolirali

in identificirali kvasovko Candida ethanolica (EXF-4926).

4.1.1.2 Citrusi

Vzorce iz te skupine so predstavljale neškropljene rastline, in sicer: listi limone, sladki

izločki lista limone, sok limone, olupki limone, sredica limone. Od vseh vzorcev smo

kvasovke izolirali iz soka iztisnjene limone ter izolat identificirali kot Issatchenkia

orientalis (EXF-6210).

4,1%

0,8%

0,8%

1,6%

0,8%

3,3%

2,5%

36,1%

4,1%

1,6%

0,8%

0,8%

7,4%

0,8%

0,8%

3,3%

3,3%

0,8%

5,7%

3,3%

4,9%

0,8%

1,6%

1,6%

1,6%

0,8%

3,3%

0,8%

0,8%

0,8%

0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40%

Zygosaccharomyces bailii

Yarrowia lipolytica

Wickerhamomyces anomalus

Torulaspora delbrueckii

Saccharomycodes ludwigii

Saccharomycetes

Saccharomyces paradoxus

Saccharomyces cerevisiae

Rhodotorula mucilaginosa

Pichia sporocuriosa

Pichia membranifaciens

Pichia guilliermondii

neidentificirano

Metschnikowia pulcherrima

Metschnikowia aff. fructicola

Kluyveromyces marxianus

Kluyveromyces lactis

Kazachstania unispora

Issatchenkia orientalis

Hanseniaspora uvarum

Dekkera bruxellensis

Clavispora lusitaniae

Candida zeylanoides

Candida zemplinina

Candida tropicalis

Candida sp.

Candida paludigena

Candida glabrata

Candida ethanolica

Candida albicans

Odstotek zastopanosti kvasnih izolatov



4.1.1.3 Domači kis

Nabrali smo skupno 9 vzorcev jabolčnega in vinskega kisa ter še druge vzorce, ki so bili

povezani s pripravo kisa: »gobe« za kisanje, jabolka oz. grozdje pri kisanju, usedline in

mošt. Iz vseh vzorcev smo pridobili 5 izolatov, ki smo jih uvrstili v vrste: Saccharomyces

cerevisiae (EXF-5296 vzorec iz jabolčnega kisa), Saccharomycodes ludwigii (EXF-4927

vzorec iz jabolčnega mošta) in Zygosaccharomyces bailii (EXF-4923 vzorec iz »gobe« za

pripravo jabolčnega kisa stare 2 leti). Dva izolata sta ostala neidentificirana: EXF-6305

(vzorec jabolka iz jabolčnega kisa) in EXF-6307 (vzorec iz usedlin jabolčnega kisa).

4.1.1.4 Gnilo sadje in zelenjava

Iz petnajstih vzorcev smo izolirali samo tri izolate kvasovk, ki smo jih uvrstili v dve

različni vrsti: Issatchenkia orientalis (EXF-6215: iz gnile breskvine koščice; EXF-6216: iz

gnilega stročjega fižola) in Saccharomyces cerevisiae (EXF-5733: iz gnile kolerabe).

Ostali vzorci brez izolatov so bili nabrani iz breskev, brokolija, solate, jabolka, fižola,

kumar in buč.

4.1.1.5 Gobe, lišaji

V to skupino smo uvrstili vzorce brisov površine gob, ki so bili večinoma nabrani v

pragozdu Vojsko pri Idriji. Seznam gob je opisan v prilogi B. Poleg teh smo v skupino

uvrstili tudi neidentificirane lišaje in ostale gobe. Skupno število nabranih vzorcev je bilo

38, od teh smo identificirali tri izolate z dvema različnima vrstama: Saccharomyces

paradoxus in Zygosaccharomyces bailii. Opis substratov z identifikacijami in oznakami

sevov je prikazan v preglednici 10.

Preglednica 10: Spisek kvasnih izolatov iz površin gob in lišajev.

Identificirana vrsta EXF številka seva Opis vzorca za izolacijo Lokacija

Saccharomyces paradoxus EXF-6222 nedoločene drevesne gobe Blejski

Vintgar

Zygosaccharomyces bailii

EXF-6262 navadna ledenka Pseudohydnum gelatinosum Vojsko

pri Idriji

EXF-6263 navadna ledenka Pseudohydnum gelatinosum Vojsko

pri Idriji

4.1.1.6 Gozdna stelja (listni drobir)

Kvasovke smo poskušali izolirati iz 5 različnih vzorcev različne stopnje razgradnje

gozdnega materiala (listje, veje, iglice, humus). Iz vzorca mešanega listnega drobirja smo

izolirali in identificirali kvasovko Issatchenkia orientalis (EXF-6212), en izolat (EXF-

6303) pa je ostal neidentificiran.

4.1.1.7 Jagodičevje

To skupino predstavlja 8 vzorcev različnih vrst jagodičevja (maline, robide, jagode, ribez,

kosmulje) in izdelkov iz jagodičevja. Izolirali in identificirali smo le 4 izolate: Issatchenkia

orientalis (EXF-6209), Pichia sporocuriosa (EXF-6208 in EXF-6211), Saccharomyces

paradoxus (EXF-5732).



4.1.1.8 Mlečni izdelki

Vzorčili smo 14 različnih mlečnih izdelkov: domači kefir, kefirjeve gobice, kislo mleko,

sirotko, različne vrste sirov (kozji, ovčji, kravji, z dodatki npr. orehi in sir v slanici),

kajmak, feta sir. Iz teh vzorcev smo izolirali in identificirali 15 sevov, ki smo jih uvrstili v

6 različnih vrst in en rod. Zastopanost posamezne vrste kvasovk je prikazana na sliki 8.

Izolirali smo naslednje vrste: Candida zeylanoides, Dekkera bruxellensis, Kluyveromyces

lactis, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica in rod

Candida. Izolati, identifikacije in natančen opis substratov so prikazni v preglednici 11.

Slika 8: Prikaz vrstne raznolikost kvasovk iz mlečnih izdelkov (N =15).

Preglednica 11: Spisek kvasnih izolatov iz mlečnih izdelkov.

Identificirana vrsta EXF številka seva Opis vzorca za izolacijo Lokacija

Candida sp. EXF-6241 kravji sir Visoče

Candida zeylanoides EXF-6237 kajmak Jesenice

EXF-6238 kajmak Jesenice

Dekkera bruxellensis EXF-4924 voda kislega mleka Breg pri Žirovnici

Kluyveromyces lactis EXF-6230 kefir Visoče

EXF-6240 kravji sir z orehi Visoče

Kluyveromyces marxianus

EXF-6231 sirotka Visoče

EXF-6232 ovčji sir v slanici Visoče

EXF-6233 kefir Visoče

EXF-5288 kefir Breg pri Žirovnici


EXF-5289 kefir Breg pri Žirovnici

EXF-5295 kefirjeva gobica Breg pri Žirovnici

EXF-5871 kravji sir Visoče

EXF-5872 kravji sir Visoče

Yarrowia lipolytica EXF-6239 kajmak Jesenice

Saccharomyces

cerevisiae

4 sevi

27%

27% 13%

13%

6%

7% 7%

Saccharomyces cerevisiae Kluyveromyces marxianus Candida zeylanoides

Kluyveromyces lactis Candida sp. Dekkera bruxellensis

Yarrowia lipolytica



4.1.1.9 Razgrajen les

Ta skupina zajema 17 vzorcev razkrojenega lesa, npr. staro žaganje, trhel les. Šest kvasnih

izolatov smo uvrstili v naslednje vrste: Candida paludigena, Kluyveromyces lactis,

Saccharomyces cerevisiae in dva izolata v razred Saccharomycetes. Štirje izolati (EXF-

6300, EXF-6301, EXF-6302, EXF-6304) so ostali neidentificirani (preglednica 12).

Preglednica 12: Spisek kvasnih izolatov iz razgrajenega lesa.

Identificirana vrsta EXF števila

seva Opis vzorca za izolacijo Lokacija

Candida paludigena

EXF-5868 trhel les dolina Triglavske Bistrice




Kluyveromyces lactis EXF-6242 trhel les blizu onesnaženega potoka Jesenice

neidentificirano

EXF-6301 trhel les blizu onesnaženega potoka Jesenice


EXF-6304 žaganje dolina Triglavske Bistrice


Saccharomyces cerevisiae EXF-5869 trhel les dolina Triglavske Bistrice

Saccharomycetes (razred) EXF-6223 žaganje dolina Triglavske Bistrice

EXF-6224 žaganje dolina Triglavske Bistrice

4.1.1.10 Silaža

Nabrali smo 11 vzorcev silaže, ki so jih predstavljali različni deli koruze po različnih

postopkih obdelave le-te do nastanka silaže. Izolirali smo 7 izolatov kvasovk, ki smo jih

uvrstili v 6 različnih vrst kvasovk: Candida tropicalis (EXF-6225, EXF-6228),

Kazachstania unispora (EXF-6227), Metschnikowia aff. fructicola (EXF-6229),

Saccharomyces cerevisiae (EXF-5284) in Wickerhamomyces anomalus (EXF-6226). Izolat

EXF-6306 je ostal neidentificiran (glej Preglednico 13).

Preglednica 13: Spisek kvasnih izolatov iz silaže.

Identificirana vrsta EXF število


Saccharomyces cerevisiae EXF-5284 koruzna silaža Breg pri Žirovnici

Candida tropicalis EXF-6225 koruzna silaža Breg pri Žirovnici

EXF-6228 koruzna silaža Breg pri Žirovnici

Kazachstania unispora EXF-6227 koruzna silaža Breg pri Žirovnici

Metschnikowia aff. fructicola EXF-6229 svež storž koruze spodnji del Breg pri Žirovnici

neidentificirano EXF-6306 svež storž koruze spodnji del Breg pri Žirovnici

Wickerhamomyces anomalus EXF-6226 koruzna silaža Breg pri Žirovnici

4.1.1.11 Sladki sadeži

To skupino predstavljata samo vzorca sadežev rdeče murve in sliv. Iz slednje smo izolirali

in identificirali en sev kvasovke S. cerevisiae (EXF-5287).



4.1.1.12 Sveže stisnjeni sadni sokovi pred pasterizacijo

Vzorčili smo sedem vzorcev nepasteriziranih sadnih sokov: jabolčni, hruškov, jagodni,

bezgov in breskov. Izolate smo uvrstili v dve različne vrste: Saccharomyces cerevisiae

(EXF-5297, EXF-4925, EXF-5293), Torulaspora delbrueckii (EXF-5291, EXF-5292) in

en izolat v razred Saccharomycetes (EXF-5290) (preglednica 14).

Preglednica 14: Spisek kvasnih izolatov iz sveže stisnjenih nepasteriziranih sadnih sokov.

Identificirane vrste EXF številka



EXF-5297 hruške sok (tepke, moštarce) Breg pri Žirovnici

EXF-4925 hruške sok (tepke, moštarce) Breg pri Žirovnici

EXF-5293 jabolčni sok Breg pri Žirovnici

Saccharomycetes (razred) EXF-5290 jagodni sok z dodatkom

sladkorja Breg pri Žirovnici

Torulaspora delbrueckii EXF-5291

jagodni sok z dodatkom

sladkorja Breg pri Žirovnici

EXF-5292 jagodni sok Breg pri Žirovnici

4.1.1.13 Vinogradniški vzorci

V to skupino smo uvrstili 28 vzorcev. Ta skupina vzorcev je zelo raznolika in predstavlja

vzorce, ki so bili nabrani v vinogradu: deli grozdja (grozdne jagode, peclji) in tropine.

Večina vzorcev je bila nabrana v zidanicah oz. v prostoru, kjer se stiska grozdje:

stiskalnica za grozdje, tla, kamor se je scejalo vino ob stiskanju, čepi sodov, vinski kamen

v sodih, različno star mošt in vino. Identificirali smo 7 različnih vrst: Clavispora

lusitaniae, Dekkera bruxellensis, Hanseniaspora uvarum, Kluyveromyces lactis, Pichia

membranifaciens, Saccharomyces cerevisiae, Zygosaccharomyces bailii in en izolat

razreda Saccharomycetes. Opisi vzorcev po posameznih vrstah za vsak sev so predstavljeni

v preglednici 15, deleži vseh vrst pa so prikazani na sliki 9.

Slika 9: Prikaz vrstne raznolikost kvasovk iz vinogradniških vzorcev (N = 27).

Saccharomyces

cerevisiae

15 sevov

55%

18%

7%

4%

4%

4%

4% 4%

Saccharomyces cerevisiae Dekkera bruxellensis Zygosaccharomyces bailii

Clavispora lusitaniae Kluyveromyces lactis Pichia membranifaciens

Saccharomycetes Hanseniaspora uvarum



Preglednica 15: Spisek kvasih izolatov iz vinogradniških vzorcev.

Identificirane vrste

EXF

številka

seva

Opis vzorca za izolacijo Lokacija

Clavispora lusitaniae EXF-6217 leseni tramovi, podpora za sode Bistrica ob Sotli

Dekkera bruxellensis

EXF-4913 vinski kamen Bistrica ob Sotli

EXF-4918 ličkanje, zgornji čep na sodu (vino) Bistrica ob Sotli

EXF-4921 ličkanje, spodnji čep (vino) Bistrica ob Sotli

EXF-5274 tla, na katera se je scejalo vino Bistrica ob Sotli

EXF-4915 vinski kamen Bistrica ob Sotli

Hanseniaspora uvarum EXF-4922 peclji, belo grozdje Breg pri Žirovnici

Kluyveromyces lactis EXF-5279 ličkanje, zgornji čep na sodu (vino) Bistrica ob Sotli

Pichia membranifaciens EXF-5278 peclji, rdeče grozdje Bistrica ob Sotli


EXF-4909 mošt izpod stiskalnice Bistrica ob Sotli

EXF-4914 tropine, rdeče grozdje, stare 10 dni Bistrica ob Sotli

EXF-4920 enkrat stisnjen grozd Bistrica ob Sotli

EXF-5273 vinski kamen, rdeče vino Bistrica ob Sotli

EXF-4911 čist rdeč mošt Bistrica ob Sotli

EXF-4912 prostor, kjer se vino steka na beton Bistrica ob Sotli

EXF-4916 ličkanje, spodnji čep na sodu, mošt, 1. dan Bistrica ob Sotli

EXF-4919 peclji, belo grozdje Bistrica ob Sotli

EXF-5280 tropine po drugem stiskanju, belo grozdje Bistrica ob Sotli

EXF-5282 ličkanje, spodnji čep (vino) Breg pri Žirovnici

EXF-5294 rdeče domače vino, staro 7 dni Breg pri Žirovnici

EXF-5276 tropine rdeče grozdje, staro 10 dni Bistrica ob Sotli

EXF-5272 rdeč mošt s tropinami Bistrica ob Sotli

EXF-4917 peclji, rdeče grozdje Bistrica ob Sotli

EXF-4909 mošt izpod stiskalnice Bistrica ob Sotli

EXF-5277 peclji, rdeče grozdje Bistrica ob Sotli

Saccharomycetes (razred) EXF-5275 peclji, rdeče grozdje, staro 10 dni Bistrica ob Sotli

Zygosaccharomyces bailii EXF-6235 tropine Jesenice

EXF-6236 tropine Jesenice

4.1.1.14 Voda iz industrijskih okolij

Nabrali smo 23 različnih vzorcev, ki smo jih odvzeli iz odpadnih vod različnih

industrijskih proizvodenj, npr. pri proizvodnji lepenke, voda iz čistilnih naprav,

avtopralnic, ali drugače onesnažena voda (reke, potoki, izviri, meteorne vode). Vzorce so

predstavljali bodisi vzorci vode, usedline ali manjši kosi odpadnega materiala iz vode. Iz

teh vzorcev smo izolirali in identificirali 26 izolatov, ki smo jih uvrstili v osem različnih

vrst. Največji delež izolatov predstavlja vrsta Saccharomyces cerevisiae (13 izolatov),

Rhodotorula mucilaginosa (5 izolatov) ter Candida zemplinina (2 izolata). Preostale

posamične izolate pa smo uvrstili v naslednje vrste: Candida albicans, Candida glabrata,

Hanseniaspora uvarum, Pichia guilliermondii in Saccharomyces paradoxus. En izolat

(EXF-6308) je ostal neidentificiran. Deleži vseh vrst so prikazani na sliki 10. Izolati,

identifikacije in natančen opis substratov so prikazni v preglednici 16.



Slika 10: Prikaz vrstne raznolikost kvasovk iz voda industrijskih okolij (N = 26).

Preglednica 16: Spisek kvasih izolatov iz vod v industrijskih okoljih.

Identificirana vrsta

EXF

številka

seva


Candida albicans EXF-6259 vzorec pred vstopom v čistilno napravo pri

proizvodnji lepenke Tržič

Candida glabrata EXF-6251 onesnažena voda potoka Ukova Jesenice

Candida zemplinina EXF-6244 onesnažena voda potoka Blejščica Tržič

EXF-6309 onesnažena voda Jesenice

Hanseniaspora uvarum EXF-6245 onesnažena voda potoka Ukova Jesenice

neidentificirano EXF-6308 onesnažena voda potoka na Tomšičevi cesti Jesenice

Pichia guilliermondii EXF-6253 odplake iz avtopralnice Jesenice

Rhodotorula mucilaginosa

EXF-6243 odplake iz avtopralnice Jesenice




EXF-6261 onesnažena voda potoka Blejščica Tržič


EXF-6218 usedline skal v odpadni vodi Jesenice

EXF-6219 usedline skal v odpadni vodi Jesenice

EXF-5873 vzorec pred vstopom v čistilno napravo pri


EXF-6246 onesnažena voda potoka na Tomšičevi cesti Jesenice



se nadaljuje

Saccharomyces

cerevisiae

13 sevov

50%

19%

7%

4%

4%

4%

4% 4% 4%

Saccharomyces cerevisiae Rhodotorula mucilaginosa Candida zemplinina

Candida albicans Candida glabrata Hanseniaspora uvarum

Pichia guilliermondii ni bilo identificirano Saccharomyces paradoxus



nadaljevanje

Identificirana vrsta

EXF

številka

seva




EXF-6250 onesnažena voda potoka Ukova Jesenice

EXF-5874 onesnažena voda potoka Ukova Jesenice







EXF-5875 onesnažena voda reke Mošenik Tržič

Saccharomyces paradoxus EXF-5870 usedline skal v odpadni vodi Jesenice

4.1.1.15 Tla pod sadnimi drevesi, sadjem, zelenjavo

Zadnja skupina so vzorci tal (zemlja) pod različnimi sadnimi drevesi, pod sadeži (npr.

jabolko, grozdje, breskev) in pod zelenjavo (npr. paradižnik, kumara, brokoli). Nekateri

sadeži in zelenjava so bili tudi že nagniti. Nabrali smo 11 vzorcev in iz njih pridobili 7

izolatov, ki pripadajo štirim različnim vrstam: Hanseniaspora uvarum, Issatchenkia

orientalis, Metschnikowia pulcherrima in Saccharomyces cerevisiae. Natančnejši podatki o

izolatih in izvoru so podani v preglednici 17.

Preglednica 17: Spisek kvasih izolatov iz tal pod sadnimi drevesi, sadjem in zelenjavo.

Identificirane vrste EXF številka


Hanseniaspora uvarum

EXF-5285 tla, kjer je ležal rdeč grozd in razpadlo listje trte Breg pri

Žirovnici

EXF-5286 tla, kjer je ležal rdeč grozd in razpadlo listje trte Breg pri

Žirovnici

Issatchenkia orientalis

EXF-6213 tla pod gnilim paradižnikom Bistrica ob

Sotli

EXF-6214 tla pod gnilim jabolkom Bistrica ob

Sotli

Metschnikowia pulcherrima EXF-5283 tla pod gnilim jabolkom Breg pri

Žirovnici


EXF-5735 tla pod gnilo breskvijo Bistrica ob

Sotli

EXF-5281 tla, kjer so bile tropine grozdja Bistrica ob

Sotli

4.1.1.16 Žuželke (vinske mušice)

Pet vzorcev so predstavljale vinske mušice, ki smo jih nabrali s sadja, sladkorja, kisa in

grozdja. Kot vrsto Saccharomyces cerevisiae smo identificirali dva izolata: sev EXF-6734

je bil izoliran iz vinskih mušic na soku kosmulja-marabela in sev EXF-6234 izoliran iz

vinskih mušic na grozdju.



4.2 IZOLACIJA IN IDENTIFIKACIJA KVASOVKE S. CEREVISIAE

4.2.1 Vzorci, iz katerih smo izolirali kvasovko Saccharomyces cerevisiae

Med vsemi vzorci, iz katerih smo izolirali kvasovke na MEA + Ch ploščah, smo iskali

kolonije s fenotipskimi lastnostmi kvasovke Saccharomyces cerevisiae in izolirali 122

sevov. Od 27 skupin vzorcev smo kvasovko S. cerevisiae identificirali iz 11 skupin

vzorcev. Izolirali smo 44 različnih sevov kvasovke S. cerevisiae (glej Preglednico 18).

V kar nekaj primerih je bilo število vzorcev veliko, izolatov pa malo ali jih sploh ni bilo.

Pri izoliranih sevih kvasovke S. cerevisiae sta takšna primera v skupini vzorcev: gobe in

lišaji, razgrajen les. Ostala odstopanja so prikazana na sliki 11.

Deleži vseh 44 sevov po skupinah vzorcev so predstavljeni na sliki 12. Največji delež

izoliranih Saccharomyces cerevisiae je bil v skupinah: vinogradniški vzorci (34 %), vode

industrijskih okolij (30 %) in mlečni izdelki (9 %).

Preglednica 18: Izolati vseh sevov S. cerevisiae z opisom vzorca za izolacijo

EXF številka

izolata Opis vzorca za izolacijo Kraj odvzema vzorca

EXF-4909 svež mošt iz stiskalnice Bistrica ob Sotli

EXF-4911 mošt iz rdečega grozdja Bistrica ob Sotli

EXF-4912 tla, kjer se vino steka na beton Bistrica ob Sotli

EXF-4914 tropine rdečega grozdja (stare 10 dni) Bistrica ob Sotli

EXF-4916 koruzno ličkanje na spodnjem čepu sodu (mošt star 24 h) Bistrica ob Sotli

EXF-4917 peclji rdečega grozdja Bistrica ob Sotli

EXF-4919 peclji belega grozdja Bistrica ob Sotli

EXF-4920 grozdje (enkrat stisnjeno) Bistrica ob Sotli

EXF-4925 sok zmletih hrušk Breg pri Žirovnici

EXF-5272 mošt iz rdečega grozdja s tropinami Bistrica ob Sotli

EXF-5273 vinski kamen rdečega vina Bistrica ob Sotli

EXF-5276 tropine rdečega grozdje (stare 10 dni) Bistrica ob Sotli

EXF-5277 peclji rdečega grozdja Bistrica ob Sotli

EXF-5280 tropine po drugem stiskanju belega grozdja Bistrica ob Sotli

EXF-5281 tla, kjer so bile tropine grozdja (staro 10 dni) Bistrica ob Sotli

EXF-5282 koruzno ličkanje na spodnjem čepu soda (vino) Bistrica ob Sotli

EXF-5284 koruzna silaža Breg pri Žirovnici

EXF-5287 slive (zmlete) Breg pri Žirovnici

EXF-5289 kefir (iz kefirjeve kulture) Breg pri Žirovnici

EXF-5293 jabolčni sok Breg pri Žirovnici

EXF-5294 rdeče domače vino (staro 7 dni) Breg pri Žirovnici

EXF-5295 kefir (iz kefirjeve kulture) Breg pri Žirovnici

EXF-5296 jabolčni kis Breg pri Žirovnici

EXF-5297 sok zmletih hrušk Breg pri Žirovnici

EXF-5733 gnile rumene kolerabe Breg pri Žirovnici

EXF-5734 vinske mušice z ličinkami v soku marabele in kosmulje Jesenice

EXF-5735 zemlja pod gnilo breskvijo Bistrica ob Sotli

EXF-5869 trhel les dolina Triglavske Bistrice se nadaljuje



nadaljevanje

EXF številka

izolata Opis vzorca za izolacijo Kraj odvzema vzorca

EXF-5871 domač kravji sir Visoče

EXF-5872 domač kravji sir Visoče

EXF-5873

odpadna voda pred vstopom v čistilno napravo pri


EXF-5874 odpadna voda pri potoku Ukova Jesenice

EXF-5875 odpadne vode pri potoku Mošenik Tržič

EXF-6218 usedlina odpadne vode, ki se zliva v potok Tomšičeva Jesenice

EXF-6219 usedline pri izviru potoka Tomšičeva Jesenice

EXF-6234 ličinke vinskih mušic z vinskim kisom Jesenice

EXF-6246 odpadna voda potoka Tomšičeva Jesenice

EXF-6247 odpadna voda, ki teče v potok Tomšičeva Jesenice



EXF-6250 odpadna voda pri potoku Ukova Jesenice

EXF-6256

odpadne vode pred vstopom v čistilno napravo pri


EXF-6257



EXF-6258



Slika 11: Primerjava števila nabranih vzorcev (N = 142) s številom vseh izolatov kvasovk (N = 110) in

številom izoliranih sevov S. cerevisiae (N = 44) po skupinah vzorcev.

9

14

23

5

17

15

11

2

7

28

11

5

15

26

2

12

3

7

1

6

27

7

1

4

13

1 1 1

3

15

2

0

5

10

15

20

25

30

Šte

vil

o v

zorc

ev /

izo

lato

v

število nabranih vzorcev število vseh izolatov kvasovk število izoliranih sevov S. cerevisiae



Slika 12: Deleži izoliranih sevov S. cerevisiae po skupinah vzorcev (N = 44).

4.2.2 Fenotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae

Kvasovko S. cerevisiae smo lahko v prvi fazi identificirali na podlagi morfoloških

lastnosti, kot so oblika in barve kolonij na izolacijski plošči MEA s kloramfenikolom.

Opazovali smo morfologijo kolonij z naslednjimi lastnostmi, ki so značilne za vrsto S.

cerevisiae: krem-bež barva, gladki robovi, tip profila kolonije je gladek, lahko tudi z

izboklino na sredini, velikost kolonije pa je zelo različna (slika 13).

Kolonije domnevne vrste smo pregledali s svetlobnim mikroskopom pri 100×, 400× in

1000× povečavi. Celice S. cerevisiae so splošno eliptične do jajčaste oblike (glej sliko 14).

V preglednici 19 so prikazane morfološke lastnosti posameznih izoliranih sevov

Saccharomyces cerevisiae glede na obliko celic, barvo in obliko celic pri

acidorezistentnem barvanju in na gojišču s sečnino. Kvasovka S. cerevisiae ne hidrolizira

sečnine, kar je razvidno tudi iz lastnosti tipskega seva CBS-1171. Hidroliza sečnine ni bila

opazna pri nobenem sevu, razen izjeme seva EXF-5869, ki se je obarval roza. Izbrani

primeri mikroskopskih posnetkov acidorezistentnega barvanja sevov Saccharomyces

cerevisiae so prikazani na sliki 15. Barva celic po acitorezistentem barvanju je različna

glede na vsebnost askov, vegetativnih celic (modro) in askospor (roza).


15 sevov

34%

voda iz industrijskih

okolij

13 sevov

30%

mlečni izdelki

4 sevi

9%

sveže stiskani sadni

sokovi pred

pasterizacijo

3 sevi

7%

žuželke (vinske

mušice)

2 seva

5%

tla pod sadnimi

drevesi, sadjem in

zelenjavo

2 seva

5%

domači kis

1 sev

2%

razgrajen les

1 sev

2%

gnilo sadje in

zelenjava

1 sev

2%

silaža

1 sev

2%

sladki plodovi

1 sev

2%

vinogradniški vzorci voda iz industrijskih okolij

mlečni izdelki sveže stiskani sadni sokovi pred pasterizacijo

žuželke (vinske mušice) tla pod sadnimi drevesi, sadjem in zelenjavo

domači kis razgrajen les

gnilo sadje in zelenjava silaža

sladki plodovi



Slika 13: Osnovna izolacijska gojišča MEA + Ch in YM s kolonijami S. cerevisiae.

A: EXF-5284, B: EXF-5280, C: EXF-5295, D: EXF-5296, E: EXF-5297, EXF-4925, F: EXF-4914



Preglednica 19: Morfološke lastnosti izoliranih sevov S. cerevisiae.

EXF izolat Mikroskopiranje

izolatov

Prisotnost

askospor/vegetativnih

celic

EXF-4909 OG A, KV

EXF-4911 OG A, KV

EXF-4912 OG A, KV

EXF-4914 OK A, KV

EXF-4916 OK A, KV

EXF-4917 OG A

EXF-4919 OG A, KV

EXF-4920 OG A

EXF-4925 OG KV

EXF-5272 OG A, KV

EXF-5273 OG A, KV

EXF-5276 OG A, KV

EXF-5277 OG KV

EXF-5280 OG KV

EXF-5281 OG A, KV

EXF-5282 OG A, KV

EXF-5284 OK A, KV

EXF-5287 OG A, KV

EXF-5289 OG KV

EXF-5293 OG A, KV

EXF-5294 OG A, KV

EXF-5295 OG A, KV

EXF-5296 OG A, KV

EXF-5297 OK A, KV

EXF-5733 OK A, KV

EXF-5734 OK, P A, KV

EXF-5735 OK A, KV

EXF-5869 OK KV

EXF-5871 OK, P KV

EXF-5872 OK, P KV


EXF-5874 OK, P KV


EXF-6218 O KV

EXF-6219 OK KV


EXF-6246 OK A, KV

EXF-6247 OK A, KV

EXF-6248 OK A, KV se nadaljuje



nadaljevanje

EXF izolat Mikroskopiranje

izolatov

Prisotnost

askospor/vegetativnih

celic

EXF-6249 OK KV

EXF-6250 OK, P KV

EXF-6256 OK A, KV



Mikroskopiranje izolatov (oblike celic): OK – okrogle, P – podolgovate, OG – oglate.

Prisotnost askospor/vegetativnih celic po acidorezistentnem barvanju: KV – vegetativne kvasne celice, A –

askospore.



Slika 14: Posamezne kvasne celice različnih sevov S. cerevisiae (1000× povečava, merilca so na posameznih

slikah)

A: EXF-4919, B: EXF-5734, C: EXF-6219, D: EXF-5733, E: EXF-5873, F: EXF-6218, G: EXF-4925, H:

EXF-6249



Slika 15: Mikrografije mikroskopskih preparatov po acidorezistentnem barvanju sevov S. cerevisiae pod

različnimi povečavami (400×, 1000×; merilca so na posameznih slikah).

A: EXF-6234, B: EXF-5735, C: EXF-6249, D: EXF-5875, E: EXF-5874, F: EXF-6246, G: EXF: 6257, H:

EXF-5733, I: EXF-6256

4.2.3 Genotipske lastnosti kvasovke Saccharomyces cerevisiae

Seve S. cerevisiae smo identificirali do nivoja rodu in vrste na molekularni genetski ravni,

in sicer na podlagi nukleotidnih zaporedij ITS rDNA. Preglednica 20 prikazuje vse seve S.

cerevisiae v primerjavi z ITS zaporedjem tipskega seva CBS1171. Izolirane seve smo

primerjali glede na podobnost / razlike v zaporedju. Podatke smo primerjali po podobnosti

izračunane po BLAST algoritmu (NCBI) in ujemanju s tipskim sevov po dolžini ITS

zaporedja in bazah v njem. Kljub slabi kvaliteti nukleotidnega zaporedja smo v preglednici

podali tudi te. Slabo kvaliteto zaporedji pripisujemo pojavljanju zaporednih istih

nukleotidov, kar povzroči napake v sekveniranju (prekrivanje nukleotidnega zaporedja).

Zaradi tega je samo del nukleotidnega zaporedja jasen, kar smo videli na kromatogramu

(izpis sekvence določenega dela gena).



Preglednica 20: Primerjava ITS zaporedij sevov S. cerevisiae s tipskim sevom: primerjava dolžine pomnožka

in zaporedja, odstotka podobnosti po BLAST algoritmu in odstotka ujemanja (sorodnosti).

Izolacijska številka

izolata

Dolžina ITS

pomnožka

Število vseh baz v

ITS zaporedju

% podobnosti po

BLAST algoritmu

Ujemanje (sorodnost)

s tipskim sevom (%)

CBS1171 T neznano 777 100 % 100 %

EXF-4911 900 777 100 % 99 %

EXF-4912 900 777 100 % 99 %

EXF-4916 900 777 100 % 99 %

EXF-4917 800 647 100 % 100 %

EXF-4919 900 777 99 % 99 %

EXF-4925 900 339 99 % 87 %*

EXF-5272 900 354 99 % 76 %*

EXF-5273 900 735 80 % 99 %

EXF-5276 900 701 87 % 99 %

EXF-5277 900 647 83 % 100 %

EXF-5280 900 365 100 % 85 %*

EXF-5281 900 636 100 % 100 %

EXF-5282 900 593 99 % 99 %

EXF-5284 900 652 100 % 99 %

EXF-5287 900 532 99 % 82 %*

EXF-5289 900 738 99 % 99 %

EXF-5293 900 511 99 % 99 %

EXF-5294 900 458 100 % 98 %

EXF-5295 900 325 99 % 99 %

EXF-5296 900 777 100 % 99 %

EXF-5297 900 339 99 % 90 %

EXF-5733 900 470 100 % 99 %

EXF-5734 900 592 99 % 95 %

EXF-5735 900 777 100 % 99 %

EXF-5869 800 552 99 % 94 %

EXF-5871 900 730 95 % 98 %

EXF-5872 900 742 99 % 99 %

EXF-5873 900 475 95 % 96 %

EXF-5874 900 524 99 % 96 %

EXF-5875 1000 530 83 % 97 %

EXF-6218 1000 574 96 % 96 %

EXF-6219 1000 554 93 % 98 %

EXF-6234 900 760 98 % 99 %

EXF-6246 1000 731 96 % 99 %

EXF-6247 1000 508 99 % 98 %

EXF-6248 900 667 99 % 99 %

EXF-6249 1000 743 100 % 99 %

EXF-6250 900 453 99 % *

EXF-6256 900 464 98 % 90 % *

se nadaljuje



nadaljevanje

Izolacijska številka

izolata

Dolžina ITS

pomnožka

Število vseh baz v

ITS zaporedju

% podobnosti po

BLAST algoritmu

Ujemanje (sorodnost)

s tipskim sevom (%)

EXF-6258 900 221 99 % 86 %*

EXF-6257 1000 122 89 % 98 % *

EXF-4920 1000 590 92 % 72 %*

EXF-4914 900 777 100 % 98 %

EXF-4909 1000 777 96 % 98 %

* slaba kvaliteta nukleotidnega zaporedja

4.2.4 Fiziološki testi sevov kvasovke Saccharomyces cerevisiae

Asimilacijski profili in rezultati temperaturnih testov sevov izolatov S. cerevisiae so podani

v preglednici 21. Vse seve smo primerjali s podatki, veljavnimi za vrsto (CBS baza

podatkov). Izstopajo sevi EXF-6256, EXF-6257, EXF-6258 v asimilaciji ksiloze, laktoze

in ribitola. Sev EXF-5869 asimilira ksilozo. Sevi EXF-5289, EXF-5295, EXF-5871 in

EXF-5872 asimilirajo laktozo. L-arabinozo asimilirajo sevi EXF-6257, EXF-6256, EXF-

6249, trehalozo asimilirajo sevi EXF-6250, EXF-6219, EXF-6218, EXF-5869, EXF-5734,

EXF-5733, sukcinat asimilirajo sevi EXF-5875 in EXF-5284 ter L-arabinozo asimilirajo

sevi EXF-6250, EXF-6248, EXF-6247, EXF-5733 in EXF-4925. V preglednici 22 so

podani rezultati naključno izbranih dvajsetih sevov iz vsake skupine vzorcev S. cerevisiae

za fermentacijske teste glukoze, saharoze, maltoze in ksiloze. Preverjali smo tudi encimsko

aktivnost za pektinsko in celulolitično aktivnost sevov vseh izolatov S. cerevisiae, vendar

rasti na teh gojiščih pri nobenem sevu ni bilo.



Preglednica 21: Asimilacijski profili sevov S. cerevisiae po 21 dneh inkubacije.

D-g

luko

za

D-g

alak

toza

L-s

ahar

oza

D-g

luko

zam

in

D-r

iboza

D-k

silo

za

L-a

rabin

oza

L-r

amno

za

mal

toza

treh

alo

za

celo

bio

za

mel

ibio

za

lak

toza

rafi

no

za

mel

ezit

oza

škro

b

gli

cero

l

rib

ito

l

D-m

anit

ol

mio

-ino

zito

l

fru

kto

za

sorb

ito

l

sahar

oza

D-g

luku

ron

at

sukci

nat

citr

at

met

ano

l

etan

ol

nit

rat

nit

rit

L-l

izin

10

- %

NaC

l

10 °

C

20 °

C

25 °

C

30 °

C

37 °

C

EXF-4909 + w - - - - - - w w - - - w - - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + +

EXF-4911 + w - - - - - - w w - - - w - - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + +

EXF-4912 + w - - - - - - w w - - - w - - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + +

EXF-4914 + w - - - - - - w w - - - w - - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + +

EXF-4916 + w - - - - - - w w - - - w - - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + +

EXF-4917 + w - - - - - - w w - - - w - - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + +

EXF-4919 + w - - - - - - w w - - - w - - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + +

EXF-4920 + w - - - - - - w w - - - w - - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + +

EXF-4925 + w - - - - w - w w - - - w - - - - - - - + / - - - - / - - - w w w + + +

EXF-5272 + w - - - - - - w w - - - w - - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + +

EXF-5273 + w - - - - - - w w - - - w - - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + +

EXF-5276 + w - - - - - - w w - - - w - - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + +

EXF-5277 + w - - - - - - w w - - - w - - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + +

EXF-5280 + w - - - - - - w w - - - w - - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + +

EXF-5281 + w - - - - - - w w - - - w - - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + +

EXF-5282 + w - - - - - - w w - - - w - - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + +

EXF-5284 + w - - - - - - w w - - - w w - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + +

EXF-5287 + w - - - - - - w w - - - w w - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + +

EXF-5289 + w w - - - - - + w - - + + + - w - - - w + / - + - - / - - - w + w + + +

EXF-5293 + w - - - - - - w w - - - w - - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + +

se nadaljuje



nadaljevanje

D-g

luko

za

D-g

alak

toza

L-s

ahar

oza

D-g

luko

zam

in

D-r

iboza

D-k

silo

za

L-a

rabin

oza

L-r

amno

za

mal

toza

treh

alo

za

celo

bio

za

mel

ibio

za

lak

toza

rafi

no

za

mel

ezit

oza

škro

b

gli

cero

l

rib

ito

l

D-m

anit

ol

mio

-ino

zito

l

fru

kto

za

sorb

ito

l

sahar

oza

D-g

luku

ron

at

sukci

nat

citr

at

met

ano

l

etan

ol

nit

rat

nit

rit

L-l

izin

10

- %

NaC

l

10 °

C

20 °

C

25 °

C

30 °

C

37 °

C

EXF-5294 + w - - - - - - w w - - - w - - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + w

EXF-5295 + w - - - - - - + w - - + w - - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + +

EXF-5296 + w - - - - - - + w - - - w - - w - - - w w / - - - - / - - - w + w + + +

EXF-5297 + w - - - - - - w w - - - w w - - - - - - + / - - - - / - - - w w w + + +

EXF-5733 + w - - - - w - w - - - - w w - - - - - - + / - - - - / - - - w w w + + +

EXF-5734 + w - - - - - - w - - - - w w - - - - - - w / - - - - / - - - w w w + + +

EXF-5735 + w - - - - - - w w - - - w w - - - - - - + / - - - - / - - - w w w + + +

EXF-5869 + w - - - + - - w - - - - w w - - - - - - w / - - - - / - - - w w w + + +

EXF-5871 + w - - - - - - w w - - + w - - - - - - - + / - - - - / - - - w w w + + +

EXF-5872 + w - - - - - - w w - - + w - - - - - - - w / - - - - / - - - w w w + + +

EXF-5873 + w - - - - - - w w - - - w + - - - - - - + / - - - - / - - - w w w + + +

EXF-5874 + w - - - - - - w w - - - w + w - - - - - + / - - - - / - - - w w w + + +

EXF-5875 + w - - - - - - w w - - - w w - - - - - - w / - + - - / - - - w w w + + +

EXF-6218 + w - - - - - - + - - - - w w - - - - - - w / - - - - / - - - w w w + + +

EXF-6219 + w - - - - - - + - - - - w w - - - - - - w / - - - - / - - - w w w + + +

EXF-6234 + w - - - - - - w w - - - w - - - - - - - + / - - - - / - - - w w w + + +

EXF-6246 + w - - - - - - w w - - - w - - - - - - - + / - - - - / - - - w w w + + +

EXF-6247 + w - - - - w - w w - - - w - - - - - - - + / - - - - / - - - w w w + + +

EXF-6248 + w - - - - w - w w - - - w - - - - - - - + / - - - - / - - - w w w + + +

EXF-6249 + w w - - - - w w / / w w w / - w w - - + w + / - - / + - - - / + + + + +

EXF-6250 + w - - - - w - w - - - / w - - - - - - - + / - - - - / - - - w w w + + +

se nadaljuje



nadaljevanje

D-g

luko

za

D-g

alak

toza

L-s

ahar

oza

D-g

luko

zam

in

D-r

iboza

D-k

silo

za

L-a

rabin

oza

L-r

amno

za

mal

toza

treh

alo

za

celo

bio

za

mel

ibio

za

lak

toza

rafi

no

za

mel

ezit

oza

škro

b

gli

cero

l

rib

ito

l

D-m

anit

ol

mio

-ino

zito

l

fru

kto

za

sorb

ito

l

sahar

oza

D-g

luku

ron

at

sukci

nat

citr

at

met

ano

l

etan

ol

nit

rat

nit

rit

L-l

izin

10

- %

NaC

l

10 °

C

20 °

C

25 °

C

30 °

C

37 °

C

EXF-6256 + w w - - w - w w / / w w w / w w w - - + w + / - - / + - - - / + + + + +

EXF-6257 + w w - - w - w w / / w w w / w w w - - + w + / - - / + - - - / + + + + +

EXF-6258 + w w - - w - - + / / w w w / - - w - - + w + / - - / + - - - / + + + + +

S.

cerevisiae (lastnosti

vrste)*

+ +- +- - - - - - + + - +- - + w +- +- - - - + / + - - - - +- - - - +- / / + + +-

+ rast, - ni rasti, w šibka rast, / - ni definirano; 1. vrstica: viri C, viri N, drugi viri in temperatura rasti, *(Barnett, 2000).



Preglednica 22: Rezultati fermentacijskih testov glukoze, saharoze, maltoze in ksiloze pri izbranih sevih S.

cerevisiae po 28 dneh inkubacije.

Glukoza Saharoza Maltoza Ksiloza

EXF-4909 + + + -

EXF-5281 + + + -

EXF-5284 + + + -

EXF-5287 + + + -

EXF-5293 + + + -

EXF-5294 + + + -

EXF-5295 + + + -

EXF-5296 + + + -

EXF-5297 + + + -

EXF-5733 + + + -

EXF-5734 + + + -

EXF-5735 + + + -

EXF-5869 + + + -

EXF-5871 + - + -

EXF-5873 + + + -

EXF-5875 + + + -

EXF-6234 + + + -

EXF-6248 + + + -

EXF-6249 + + + -

EXF-6257 + - - -

S. cerevisiae

(lastnosti vrste)* + + + -

Rumena barva tekočega gojišča in mehurček s CO2 predstavlja pozitiven rezultat (+), v nasprotnem primeru

je rezultat negativen (-) zelena obarvanost gojišča in brez mehurčka; *(Barnett, 2000).

4.2.5 Parjenje haploidnih sevov na acetatnem agarju

Izbrali smo seve S. cerevisiae, ki so se po acidorezistentnem barvanju obarvali modro

(prisotne le vegetativne kvasne celice). Z uporabo gojišča acetatnega agarja lahko

izzovemo spolno razmnoževanje oz. mejozo vegetativnih kvasnih celic, če sta si seva

kompatibilna (paritveni tip a in α). Končni produkt mejoze so haploidne askospore. S

parjenjem različnih haploidnih sevov S. cerevisiae smo želeli ugotoviti kompatibilnost

različnih paritvenih tipov, ki jo opazimo, kot tvorbo askospor (roza obarvane strukture).

Kombinacije sevov in rezultati paritve so podani v preglednici 23. Po parjenju so dvojice

sevov EXF-5871 in EXF-4925 ter EXF-5872 in EXF-5871 poleg vegetativnih sevov

tvorile tudi askospore (glej sliko 16). Ugotovili smo, da so ti sevi heterotalični, kar je

značilno za naravne izolate.



Preglednica 23: Kombinacije parjenja sevov S. cerevisiae, ki tvorijo askospore.

× EXF-5289 EXF-4925 EXF-5871 EXF-5872 EXF-6250 EXF-5874

EXF-5280 KV KV KV KV KV KV

EXF-5289 KV KV KV KV KV

EXF-4925 A, KV KV KV KV

EXF-5871 A, KV KV KV

EXF-5872 KV KV

EXF-6250 KV

KV – kvasne vegetativne celice (modro obarvane na mikroskopskem preparatu), A – askospore (roza

obarvane na mikroskopskem preparatu); kombinacije sevov so v tabeli označene z vijolično barvo.

Slika 16: Parjenje sevov S. cerevisiae pri 400× in 1000× povečavi (merilca so na posameznih slikah).

A: EXF-5871 in EXF-4925, B: EXF-5872 in EXF-5871. Vegetativne celice so obarvane modro, askospore pa

rdeče.



5 RAZPRAVA IN SKLEPI

5.1 RAZPRAVA

V današnji družbi vedno več govorimo o rešitvah primanjkovanja fosilnih goriv in

onesnaževanja okolja s fosilnimi viri energije. Spremembe podnebja, onesnaževanje zraka

in vpliv tople grede so vsakodnevne tematike, ki zadevajo vsakega izmed nas. Problem

prestavljajo predvsem ogljikov monoksid, ogljikov dioksid, žveplov dioksid, ... Da bi se

izognili onesnaževanju zraka z omenjenimi emisijami, posegamo po čistejših gorivih, ki jih

imenujemo biogoriva. Vendar pa je uporaba biogoriv vprašljiva z vidika vpliva na okolje

in posledic prekomernega poseganja v biotsko raznovrstnost. Kljub temu je bioetanol

obnovljiv vir energije, ki bi lahko nadomestil omejene vire fosilnih goriv, predvsem kot

alternativa bencinskemu gorivu. Največ raziskav posvečajo proizvodnji bioetanola iz

lignoceluloznega odpadnega materiala kot tehnologiji druge generacije (Nikolić s sod.,

2009).

Pri proizvodnji bioetanola pri fermentaciji hidrolizata biomase do bioetanola sodelujejo

mikroorganizmi, med katerimi so najpomembnejše kvasovke. Njihova naloga je, da

pretvorijo glukozo do alkohola in ogljikovega dioksida. Lignocelulozni hidrolizat poleg

glukoze vsebuje tudi razne monosaharide (ksiloza, manoza, galaktoza in arabinoza) in

oligosaharide (Semenčenko s sod., 2011).

Raziskave mikroorganizmov, ki lahko proizvajajo etanol, so usmerjene predvsem v

kvasovko Saccharomyces cerevisiae kot fermentatorja heksoze. Eden od osnovnih

problemov pri proizvodnji bioetanola iz lignocelulozne biomase je, da kvasovka S.

cerevisiae lahko fermentira le določene mono- in disaharide. S. cerevisiae ne more

asimilirati celuloze in hemiceluloze direktno, niti pentoze (predvsem ksiloze), ki nastaja pri

hidrolizi celuloze (Semenčenko s sod., 2011).

Na splošno je kvasovka S. cerevisiae omenjena v literaturi pri proizvodnji vina, piva in

kruha. S človeško aktivnostjo je bila prinesena iz svojega naravnega habitata. V naši

civilizaciji se pojavlja že nekaj tisočletij, brez da bi natančneje poznali njeno naravno

življenjsko okolje. Sevi naravnih habitatov so heterotalični (haploidne vegetativne celice).

S spoznavanjem naravnih habitatov, ki jih kvasovka poseljuje, pa lahko dobimo nove seve

z novimi lastnostmi. (Legras s sod., 2007; Fay in Benavides, 2005). Raznolikost genotipov

se kaže predvsem v rezistenci na specifične nutriente in prilagoditvah na okolje. Na ta

način lahko pridobimo organizme, ki bi lahko bili bolj uspešni tudi pri proizvodnji

bioetanola (Semenčenko s sod., 2011).

Večina raziskav ekologije vrste Saccharomyces cerevisiae temelji na okoljih, ki so

povezana z aktivnostjo človeka ali so bile v naravo iz tega okolja prinesene. Na podlagi

habitatov omenjenih v literaturi smo predvideli seznam 27 različnih okolij, iz katerih smo

izhajali pri nabiranju vzorcev. Iz 273 raznolikih vzorcev smo pridobili 122 kvasnih kultur

(izolatov). Med njimi je bilo 44 sevov vrste S. cerevisiae. Seve S. cerevisiae smo izolirali

iz različnih vinogradniških vzorcev (15 sevov), vzorcev vodnih industrijskih okolij (13

sevov), mlečnih izdelkov (4 seve), sveže stisnjenih sokov pred pasterizacijo (3 seve),

žuželk in tal pod sadnimi drevesi, sadjem in zelenjavo (iz vsake skupine po 2 seva) in po

en sev iz domačega kisa, razgrajenega lesa, gnilih sadežev in zelenjave, silaže in sladkih

plodov.



Omembo kvasovke S. cerevisiae iz vinogradniških vzorcev (vino, kis, mošt) lahko zelo

pogosto zasledimo v literaturi. Poleg prevladujoče kvasovke iz rodu Saccharomyces lahko

zasledimo tudi druge rodove: Bulleromyces, Candida, Issatchenkia, Kluyveromyces,

Pichia, in Zygosaccharomyces. Ti rodovi so najbolj običajni predvsem na površini grozdja,

pecljih, vinu, soku grozdja in moštu (Bisson in Josep, 2009; Rodicio in Heinisch, 2009).

Identificirali smo vrste Kluyveromyces lactis, Pichia membranifaciens,

Zygosaccharomyces bailii in Saccharomyces cerevisiae ter sev, ki smo ga uvrstili v razred

Saccharomycetes. Predvsem rod Saccharomyces s predstavniki S. bayanus, S. cerevisiae,

S. pastorianus in hibridom S. bayanus × S. cerevisiae so najpogosteje omenjene kvasovke

v povezavi s predelavo grozdja v vino (Spencer in Spencer, 1997). Pri fermentaciji mošta v

vino sta omenjeni še vrsti Zygosaccharomyces bailii in Clavispora lusitaniae (Nisiotou s

sod., 2007), ki smo jih izolirali tudi v naši raziskavi. Dekkera bruxellensis pa je opisana kot

kvasovka, ki kvari vino (Renouf in Lonvaud-Funel, 2007).

Kis nastane iz vina, lahko pa ga izdelajo tudi neposredno iz tekočin, ki vsebujejo sladkor,

na primer iz mošta, jabolčnika ali sladu. Pri kisanju sodelujejo različni mikroorganizmi,

predvsem kvasovke in acetobakterije, ki proizvajajo ocetno kislino, ki daje kisu značilne

organoleptične lastnosti. Iz domačih kisov smo izolirali vrste Zygosaccharomyces bailii,

Saccharomyces cerevisiae in Saccharomycodes ludwigii. Vse te vrste sevov EXF-5296,

EXF-4927 in EXF-4923 smo izolirali iz jabolčnega kisa. S. cerevisiae je zelo pogosta

kvasovka pri fermentaciji jabolčnega soka v kis (Qin s sod, 1995).

Vinske mušice so organizmi, ki jih privablja vonj tekočin, v katerih poteka fermentacija.

Ličinke se prehranjujejo s tekočinami in glivami v zelo zrelem ali gnijočem sadju. Pri

poteku fermentacije je znano, da sodelujejo kvasovke vrste S. cerevisiae (Louise in van

Opzeeland, 1984). Kvasovko S. cerevisiae smo izolirali v dveh primerih iz mušic, ki so

bile nabrane iz takšnih vzorcev. V literaturi je omenjeno, da so S. cerevisiae našli na

insektih vrste Mesophylax adopersus in rodu Drosophila (Sampaio in Gonçalve, 2008).

Večina kvasovk se nahaja v zemlji ali na razpadajočih organskih odpadkih v okolju ter

sodelujejo v procesu kroženja organskih in anorganskih snovi (Raspor, 1996).

Fermentacija, razgradnja in gnitje so splošni procesi, pri katerih sodeluje lahko tudi

kvasovka S. cerevisiae in tako z razgradnjo ogljikovih virov (predvsem sladkorjev v

glukoze, fruktoze, maltoze, saharoza itd.) do ogljikovega dioksida in alkohola sproži kvar

živila (Boulton in Quain, 2001). Kvasovko S. cerevisiae so tako že izolirali iz sadja in

zelenjave ter nagnitih delov le-teh (Pitt in Hocking, 1999). V literaturi zasledimo, da so

našli S. cerevisiae tudi v drevesnih tekočinah (npr. smole) in v zemlji pod drevesom.

Omenjeni so rodovi dreves Ulmus (bresti), Carpinus (gabri) in Nothofagus (bukovke)

(Sampaio in Gonçalve, 2008). Kvasovko so izolirali tudi iz raznih sokov in ekstraktov,

pokvarjenih naravnih sokov in osvežilnih pijač (npr. mineralna voda, pomarančni sok z

mehurčki, izotonični napitki). V naši raziskavi smo izolirali kvasovko S. cerevisiae iz tal,

kjer je ležala gnila breskev, iz gnile rumene kolerabe, jabolčnega in hruškovega soka in iz

sliv, kar potrjuje zgoraj omenjene podatke iz literature. S. cerevisiae smo izolirali iz

vzorcev, kot so tla pod sadnimi drevesi, sadjem in zelenjavo, gnilobe sadja in zelenjave ter

sladkih plodov. Našli smo tudi seve vrst Hanseniaspora uvarum in Issatchenkia orientalis.

ki so jih že izolirali iz sadja in zelenjave, predvsem grozdja, jabolk in paradižnika (Wilson

s sod., 1991). Naši sevi so bili izolirani iz tal, kjer so ležale gnile breskve, jabolka, grozdje

in paradižnik. Vrsta Metschnikowia pulcherrima je kvasovka, ki jo najdemo na cvetovih z

http://sl.wikipedia.org/wiki/Vino

http://sl.wikipedia.org/wiki/Gnitje

http://sl.wikipedia.org/wiki/Sadje



veliko nektarja in drugih sladkih površinah (Spencer in Spencer, 1997), v našem primeru

pa smo sev izolirali iz tal pod gnilim jabolkom. Pichia sporocuriosa je v literaturi prvič

omenjena kot izolat iz tropskega sadja rambutan (Tornai-Lehoczki s sod., 2000). Seve te

vrste smo pridobili iz dveh vzorcev gnilih malin in zavretega kompota z malinami in

rabarbare. Iz skupine jagodičevja smo izolirali še kvasovko S. paradoxus.

V raziskavah je omenjeno, da so kvasovko S. cerevisiae našli tudi v sokovih pred

pasterizacijo (Pitt in Hocking, 1999). Poleg rodu Saccharomyces smo izolirali tudi sev

vrste Torulaspora delbrueckii, ki so jo na Japonskem uporabljali kot vzhajalno sredstvo pri

peki kruha in slaščic (Spencer in Spencer, 1997). Izolat te vrste smo izolirali iz

nepasteriziranega soka jagod. V literaturi je omenjeno, da so kvasovko S. cerevisiae in

Torulaspora delbrueckii izolirali iz homogeniziranega soka jagod (Maimer in Busse,

1992). Pri proučevanju fermentacije soka hrušk kot aromatične komponente so omenjene

kvasovke vrste S. cerevisiae (García-Llobodanin s sod., 2007), katerih seve smo izolirali

tudi v naši raziskavi.

Kvasovka S. cerevisiae je dokaj pogost organizem, ki ga najdemo v jabolčnem,

grenivkinem, limoninim, paradižnikovem soku in v ostalih sokovih višje koncentracije

glukoze in fruktoze (Shearer s sod., 2002). Predvidevanje, da se kvasovka S. cerevisiae

nahaja v vzorcih citrusov (npr. olupki citrusov, listi itd.), izhaja iz raziskav, omenjenih v

literaturi. Znano je, da kvasovko uporabljajo za fermentacijo etanola iz odpadnih

produktov limonine lupine (Wilkins s sod. 2007) in da so jo zasledili tudi v pomarančnem

soku (Zook s sod., 1999). Iz limoninega soka smo izolirali le vrsto Issatchenkia orientalis

(sinonim Pichia kudriavzevii), ki tudi spada v družino Saccharomycetaceae.

Prav tako je znano, da so kvasovko S. cerevisiae izolirali tudi iz mlečnih produktov, kot so

sir, jogurtova skuta in jogurt. Poleg tega so jih izolirali tudi iz fermentiranih mlečnih

izdelkov, kefirja in skute (Pitt in Hocking, 1999). Tudi mi smo izolirali seve iz vzorca

kefirja, kot omenja literatura, saj je S. cerevisiae eden glavnih mikroorganizmov, ki

sodeluje pri procesu fermentacije mlečnih produktov do kefirja in tvorbe ogljikovega

dioksida in alkohola (Koutinasa sod., 2007). Iz izolatov različnih vrst sira so omenjene

populacije kvasovk vrst Dekkera bruxellensis in Kluyveromyces lactis (Fadda s sod.,

2001), ki smo jih izolirali tudi v našem primeru. Kluyveromyces marxianus smo izolirali iz

sirotke, kefirja, in sira v slanici, ker sodeluje pri alkoholni fermentaciji mleka (Grba s sod.,

2002). Kot habitati za seve vrste Candida zeylanoides in Yarrowia lipolytica se v literaturi

pojavljajo slanica in slani siri (Seiler in Busse, 1990). V našem primeru smo te seve

izolirali iz kajmaka in nekaterih drugih vrst sirov.

Velik potencial za proizvodnjo etanola kot goriva predstavljajo lignocelulozni materiali.

Glavni obetajoči viri so različni kmetijski odpadni produkti lignoceluloze (koruzna stebla,

pšenična in ječmenova slama, vlakna sladkorni trsa), gozdni odpadni produkti, odpadki

papirne industrije in komunalne vode (Lichtenthaler, 2008). Pri preverjanju nahajališč S.

cerevisiae v skupini vzorcev silaže smo izolirali en sam sev te vrste, poleg pa še ostale

seve vrst Candida tropicalis, Wickerhamomyces anomalus, Kazachstania unispora,

Metschnikowia aff. fructicola. Več predstavnikov rodu Saccharomyces pa smo izolirali iz

skupine vzorcev razgrajenega lesa in odpadnih industrijskih vod.

V prihodnosti pričakujejo, da bo lignoceluloza glavni vir za produkcijo etanola poleg

škrobnih in sladkornih virov ogljika. Zato smo pričakovali, da bi kvasovko S. cerevisiae

http://www.mycobank.org/MycoTaxo.aspx?Link=T&Rec=337013

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141022907001755#aff1



lahko izolirali tudi iz ostankov dreves (les, lubje, smola, trhlovine) (Taherzadeh in Karimi,

2007). Izolirali smo en sev iz trhlega lesa in dva seva razreda Saccharomycetes iz starega

žaganja, kjer so bile kvasovke izpostavljene ksilozi. Znano je, da S. cerevisiae ne more

fermentirati ksiloze (Taherzadeh in Karimi, 2007), zato smo jo zasledili samo v enem

vzorcu. Ostali sevi pa so pripadali vrstama Candida paludigena in Kluyveromyces lactis.

Komunalni odpadki, odpadne vode in razni rastlinski odpadni produkti (listna stelja,

humus) so opisani kot nahajališča izolatov kvasovke S. cerevisiae (Taherzadeh in Karimi,

2007). Iz vzorcev gozdne stelje jih nismo izolirali. Iz odpadnih vod industrijskih okolij

smo izolirali 13 sevov kvasovke S. cerevisiae, predvsem iz usedlin, onesnaženih potokov

in odpadnih vod industrijskih okolij pri proizvodnji lepenke. Ostale vrste sevov, ki smo jih

izolirali, so Candida albicans, Candida glabrata, Candida zemplinina, Hanseniaspora

uvarum, Pichia guilliermondii in rdeče kvasovke Rhodotorula mucilaginosa. Vse

omenjene vrste so značilne za onesnažene vode, predvsem iz rodu Candida, Rhodotorula

in Hanseniaspora (Hagler in Mendonqa-Hagler, 1981).

V literaturi (Sampaio in Gonçalve, 2008) smo zasledili, da so našli vrsto S. cerevisiae tudi

na površini gob. Iz skupine gob in lišajev smo vzorčili 40 vzorcev, od tega 31 brisov

površine gob. Našli nismo nobene kvasovke S. cerevisiae, izolirali pa smo zelo sorodno

vrsto S. paradoxus s površine neidentificirane glive.

5.1.1 Rod Saccharomyces

Tradicionalno določevanje kvasovk večinoma temelji na morfologiji in asimilacijskih

profilih ogljika in dušika. Kvasovke smo od drugih organizmov ločili z dodanim 10 %

etanolom v gojišče. Podoben postopek selekcije je opisan tudi pri izolaciji kvasovk

Saccharomyces iz hrastovega lubja, kjer so za selekcijo uporabljali 1 % rafinoze in 8 %

etanola (Sampaio in Gonçalve, 2008). Za določitev je potrebna gojitev na različnih

gojiščih. Pomembne značilnosti kulture so barva, oblika in struktura kolonij (Guarro s sod.,

1999; Tarr, 2004).

Hidroliza sečnine je fiziološka lastnost kvasovk, ki jo lahko preverimo kot pomoč pri

identifikaciji (Roberts s sod., 1978). Tipski sev CBS 1171 kvasovke S. cerevisiae, izoliran

leta 1883, ne hidrolizira sečnine. Naši izolirani sevi ravno tako niso hidrolizirali sečnine.

Izjema je sev EXF-5869, pri katerem se je gojišče obarvalo roza, kar je pomenilo, da je

potekla reakcija. V literaturi je navedeno, da kvasovka S. cerevisiae sečnine ne hidrolizira

(Roberts s sod., 1978), zato je v našem primeru najverjetneje prišlo do napake ali

kontaminacije.

Po postopku acidorezistentnega barvanja se askospore kvasovke S. cerevisiae obarvajo

rdeče, aski (stena) in vegetativne celice pa modro (Barnett s sod., 2000). Homotalija je

kopulacija celic istega individuuma iz istega talusa. Pri heterotaliji pa gre za kopulacijo

celic različnih individuumov (Kavanagh, 2005). Obarvanost kvasnih celic je bila od seva

do seva različna. Homotalični sevi so bili tisti, ki so imeli poleg vegetativnih celic tudi

aske ali samo askospore z aski. Preverjali smo kompatibilnost parjenja med sevi, ki so

imeli samo haploidne vegetativne celice (modro obarvane celice). Torej so si sevi, ki so po

paritvi tvorili askospore z aski (modro in roza obarvane celice), med sabo kompatibilni. Ti

sevi so heterotalični. Kompatibilnost parjenja smo zasledili med parom sevov EXF-5871 in



EXF-4925 ter EXF-5872 in EXF-5871. Iz tega lahko sklepamo, da gre za naravne izolate.

Vzorci so bili izolirani iz kravjega sira in hruškovega soka. Ostali sevi si med seboj niso

bili kompatibilni.

V primerjavi z znanimi podatki za vrsto S. cerevisiae so se sevi EXF-6256, EXF-6257,

EXF-6258 razlikovali v asimilaciji ksiloze, laktoze in ribitola. Ti sevi so izolirani iz

odpadnih vod pri proizvodnji lepenke. Rast teh sevov na gojiščih obogatenih s ksilozo in

ribitolom je bila šibka. Sev EXF-5869 asimilira ksilozo, izoliran je bil iz trhlega lesa. Sevi

EXF-5289, EXF-5295, EXF-5871 in EXF-5872 asimilirajo laktozo, sevi so izolati mlečnih

produktov. Različno asimilacijo sevov od lastnosti za vrsto smo ugotovili tudi na gojiščih z

L-arabinozo pri sevih izoliranih iz vodnih industrijskih okolij EXF-6257, EXF-6256, EXF-

6249, na gojiščih z trehalozo pri sevih EXF-6250, EXF-6219, EXF-6218, EXF-5869, EXF-

5734, EXF-5733, na gojiščih z sukcinatom pri sevih EXF-5875 in EXF-5284 ter na

gojiščih z L-arabinozo pri sevih EXF-6250, EXF-6248, EXF-6247, EXF-5733 in EXF-

4925. Vsi sevi rastejo pri temperaturi od 10 °C do 37 °C. Predvsem opazimo odstopanja pri

sevih, ki so bili izolirani iz skupine vzorcev vodna industrijska okolja.

Prepoznava vrst gliv s pomočjo morfoloških znakov je pogosto močno omejena. Za razliko

od teh so molekularne tehnike uporabnejše, saj so genotipski znaki enotni in neodvisni od

ekspresije (Guarro s sod., 1999). Z uporabo teh metod smo identificirali 44 sevov vrste S.

cerevisiae.

Zelo sorodne vrste združujemo v skupino Saccharomyces sensu stricto. Najbolj sorodne

seve lahko znotraj delimo v dve skupini, in sicer S. bayanus in S. pastorianus ter S.

cerevisiae in S. paradoxus. Po križanju seva med skupinama S. cerevisiae in S. bayanus

nastanejo stabilni genetski hibridi (Boulton in Quain, 2001). Seve hibrida S. bayanus × S.

cerevisiae smo izolirali iz vzorcev vinogradniških vzorcev: EXF-4909, EXF-4917 in EXF-

4920. Vendar pa samo po identifikaciji z zaporedjem ITS ne moremo trditi, da gre za

hibrid, saj bi za takšno trditev potrebovali podatke s »finger print« tehniko. Zato smo te tri

seve opredelili kot vrsto S. cerevisiae.

Poleg S. cerevisiae smo iz rodu Saccharomyces izolirali še 3 seva S. paradoxus in 1 sev S.

ludwigii. Vrsto S. paradoxus je prvič omenil Antonie van Leeuwenhoek leta 1995. Drugo

sorodno vrsto S. ludwigii, ki jo pogosto najdemo pri pridelavi soka v kis pa so prvič

omenili že leta 1888. Štiri seve smo identificirali samo do razreda in jih uvrstili v razred

Saccharomycetes.

5.1.2 Druge kvasovke

Na osnovi ITS rDNA nukleotidnega zaporedja smo identificirali tudi nekatere druge vrste

kvasovk, predvsem iz rodu Candida. Večina vrst tega rodu je bila morfološko podobna

naši iskani kvasovki S. cerevisiae. Po študijah sorodnih vrst reda Saccharomycetales

(Diezmann s sod., 2004) smo našli veliko podobnosti z vrstami rodu Candida (npr.

Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis itd.), Issatchenkia orientalis,

Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Pichia guilliermondii, Pichia

membranifaciens, Pichia sporocuriosa in Yarrowia lipolytica, ki smo jih identificirali tudi

tekom naše raziskave. Predvsem je v študijah navedena fenotipska podobnost kolonij

(Goldstein in McCusker, 2001) rodu Candida. Pri našem delu smo identificirali 14 sevov



te vrste. V veliko primerih (Stiles Battey s sod., 2002) pri raznih industrijskih pijačah, npr.

pri vinu, jabolčniku, kisu, pogosto zasledimo sopojav vrst Saccharomyces cerevisiae in

Zygosaccharomyces bailii. Slednjo smo izolirali predvsem iz vinogradniških vzorcev in

jabolčnega kisa. Izolirali smo jih tudi iz gob in lišajev, česar v literaturi nismo zasledili.

Pojavljanje vrste Rhodotorula mucilaginosa (5 izolatov) iz odpadnih vod je dokaj tipično

(Rogers in Wilson, 1966). Pomembno pa je poudariti, da so vse te vrste tolerirale etanol v

gojišču, ki smo ga uporabili za selekcijo kvasovk.

Za bolj ciljano izolacijo vrste S. cerevisiae bi lahko na osnovi pridobljenih rezultatov

izkoristili podatke o fermentaciji različnih sladkorjev: rafinozo, maltozo, melecitozo,

glukonat. Teoretično bi na ta način lahko znižali prisotnost ostalih vrst kvasovk, tolerantnih

na etanol, vsaj za polovico.

5.2 SKLEPI

V okviru diplomskega dela smo iz 273 različnih ekoloških vzorcev osamili 122 sevov

kvasovk.

Zaradi uporabe selektivne metode izolacije s tekočim gojiščem z dodatkom 10 % EtOH in

anaerobno inkubacijo so večino izolatov (94 %) predstavljali želeni mikroorganizmi –

kvasovke.

Izolirane kvasovke smo uvrstili v naslednje rodove: Candida, Clavispora, Dekkera,

Hanseniaspora, Issatchenkia, Kazachstania, Kluyveromyces, Metschnikowia, Pichia,

Rhodotorula, Saccharomyces, Torulaspora, Wickerhamomyces, Yarrowia in

Zygosaccharomyces.

Štiriinštirideset izolatov (36 % vseh) smo na osnovi ITS zaporedja in morfologije

identificirali kot vrsto Saccharomyces cerevisiae.

Najpogosteje smo seve vrste Saccharomyces cerevisiae izolirali iz vinogradniških vzorcev

in vode v industrijskih okoljih, domačega kisa in mlečnih izdelkov.

Posamezne seve vrste Saccharomyces cerevisiae smo izolirali iz svežega in gnilega sadja,

zelenjave in iz žuželk, ki so prisotne v procesih razpadanja rastlinskega materiala.

Iz trhlega lesa smo izolirali en sam izolat vrste S. cerevisiae.

Sevi S. cerevisiae, ki razgrajujejo ksilozo, so bili izolirani iz trhlega lesa (1) in iz odpadnih

vod pri proizvodnji lepenke (3).

Izolati rodu Saccharomyces so imeli daljše ITS zaporedje (dolžina 900 nukleotidov) v

primerjavi s kvasovkami drugih rodov (različne dolžine od 500 do 800 nukleotidov), kar bi

lahko uporabili pri selekcijskem predizboru te vrste.

Pri določenih izolatih vrste S. cerevisiae smo opazili odstopanja od za to vrsto značilnih

asimilacijskih lastnosti. Razlike so bile pri asimilaciji naslednjih virov ogljika: D-ksiloza (9

%), L-arabinoza (11 %), L-ramnoza (7 %), trehaloza (15 %), laktoza (19 %), ribitol (9 %)

in sukcinat (5 %). Ta odstopanja verjetno predstavljajo znotrajvrstno variabilnost.



Gojišča, s katerimi bi lahko bolj selektivno izolirali kvasovke vrste S. cerevisiae, bi poleg

10 % EtOH in anaerobne inkubacije lahko vsebovalo naslednje vire ogljika: rafinozo,

maltozo, melecitozo, glukonat. Verjetno bi na ta način vsaj za polovico lahko znižali

prisotnost ostalih neželenih vrst kvasovk, ki tudi tolerirajo etanol.

5.3 ANALIZA UČNIH NAČRTOV ZA OSNOVNO ŠOLO

5.3.1 Obravnavanje mikroorganizmov v izobraževalnem procesu

Učenci devetletne osnovne šole se z naravoslovnimi tematikami srečujejo že v prvem

triletju v okviru predmeta spoznavanje okolja. Nadgradnji tega predmeta sledi predmet

naravoslovje in tehnika v 4. in 5. razredu. Predmet se nadaljuje v predmetih naravoslovje v

6. in 7. razredu, tehnika in tehnologija v 6., 7. in 8. razredu, gospodinjstvo v 5. in 6.

razredu, ter biologija, kemija in fizika v 8. in 9. razredu. Skozi učni sistem devetletnega

osnovnošolskega programa se učenci pogosto, vendar zelo splošno srečujejo s pojmom

mikroorganizem, redkeje pa se omenjajo glive kvasovke. V učnem načrtu za osnovno šolo

se med mikroorganizmi največ pozornosti posveča bakterijam.

V šestem razredu devetletne osnovne šole se učenci po učnem načrtu pri učni temi živa in

neživa narava seznanijo z vlogo mikroorganizmov v naravi. Zavedajo se medsebojne

povezanosti žive in nežive narave in pri tem spoznajo pomemben člen razkrojevalcev

mikroorganizme. Pri učni temi vrt se seznanijo s pojmom gnitja pri kompostiranju.

Spoznajo, da so rastlinski in živalski ostanki hrana za druge živali. S tem omenijo nekatere

talne živali (npr. deževnike, mokrice, železne kačice, itd.) in živa bitja, ki jih s prostim

očesom ne vidimo (t. i. mikroorganizme). Naučijo se, da prekopavamo kompostni vrt

zaradi pomanjkanja kisika, saj pomanjkanje kisika povzroči proces gnitja. Pri tem so

dejavni tudi mikroorganizmi (plesni in gnilobne bakterije).

Pri učni temi njiva in polje spoznajo lastnosti kolobarjenja. Omenimo, da imajo metuljnice

na koreninah drobne gomolje z mikroorganizmi, ki sprejemajo dušik iz zraka. Naučijo se,

da naravna gnojila tako učinkujejo s pomočjo organizmov v tleh in dovajajo rastlinam

snovi, ki jih te potrebujejo za rast.

Učenci se pri učni temi travnik seznanijo s kisanjem mleka, ki nastane zaradi naselitve

mikroorganizmov (bakterije, glive oz plesni). Spoznajo vpliv mlečnokislinskih bakterij in

znajo utemeljiti proces mlečnokislinskega vrenja, kjer bakterije pretvorijo sladkor iz mleka

v mlečno kislino. Beljakovine zaradi delovanja kisline spremenijo strukturo in postanejo

netopne, čvrste in se izločijo iz mleka. Spoznajo pojem fermentirani mlečni izdelki in

vedo, da različne vrste mleka in vrste mlečnokislinskih bakterij določajo svojstveno

organoleptično lastnost izdelkom kot so kefir, jogurt, kislo mleko. Učenci znajo

pridobljeno znanje povezati tudi s procesom kisanja zelja, repe in silaže. Takšen proces

zavira rast gnilobnih bakterij in je zato izdelek trajnejši. Gre za način shranjevanja, ki

ohrani skoraj vse hranilne snovi. Pri tej tematiki je očitna medpredmetna povezava s

predmetom gospodinjstvo v 6. razredu, kjer učenci spoznajo živila z več beljakovinami in

načine za shranjevanje oz. podaljševanje časa uporabe živil.

Izbirna učna tema sadovnjak omenja mikroorganizme kot bolezni sadnega drevja (npr.

hruščev ožig), ki so nezaželene, vendar s tem procesom sodelujejo v naravnem kroženju



snovi (npr. bakterije sadne gnilobe). Pri tem lahko učencem omenimo, da so

mikroorganizmi v sadovnjaku tudi koristni, saj poskrbijo za razpad semenskih ovojnic, ki

omogoča kalitev semena. Sam učni načrt te koristnosti ne izpostavi. Učenci pa se seznanijo

s glivo kvasovko, kot povzročiteljico spremembe sadnega soka. Jabolka lahko predelamo v

jabolčni sok, mošt in kis. Učenci se naučijo, da so za to spremembo odgovorne glive

kvasovke, ki sladkorje v soku spremenijo v alkohol in ogljikov dioksid. Ta proces

imenujemo alkoholno vrenje (oz. alkoholna fermentacija). V tej učni temi so prvič

omenjene glive kvasovke, kot živa bitja, ki povzročijo alkoholno vrenje. Učenci spoznajo

shranjevanje s pasterizacijo (segrevanje okoli 75°C). Tudi tukaj je medpredmetna

povezava s predmetom gospodinjstvo v 6. razredu, ko se učenci seznanijo s shranjevanjem

živil.

Tudi v izbirni učni temi vinograd, so pod poglavjem živa bitja v vinogradu omenjani

mikroorganizmi. Učenci vedo, da se gliva peronospora (Plasmopara viticola) razmnožuje s

trosi in se tako prenese na druge trste v vinogradu. Učenci spoznajo postopke vinarstva in s

tem alkoholno vrenje, ki ga povzročajo glive kvasovke s procesom pretvorbe grozdnega

sladkorja v alkohol in ogljikov dioksid, s sproščanjem toplote.

V učnem načrtu za 7. razred devetletne osnovne šole se učenci srečajo z glivami v učni

temi gozd. Spoznajo kot zanimivost, da so tudi plesni vrste gliv. Bolj podrobno se učenci

srečajo z glivami v 8. razredu pri učni temi evolucija in sistematika (kraljestvo gliv).

Učenci v učni temi gozd opredelijo sestav listnega odpada. Spoznajo, da so razkrojevalci

(bakterije in glive) najštevilčnejša živa bitja v listnem odpadu. Naučijo se, da razkrojevalci

pretvarjajo organske snovi (ostanke rastlin, živali in iztrebkov) v neorganske snovi in, da

so le ti končni člen pri nastanku humusa. Povezanost živih bitij v gozdu znajo utemeljiti s

tvorbo prehranjevalnih verig in jih povezati v prehranjevalne splete.

V 8. razredu se tematike iz naravoslovja nadaljujejo pri predmetu biologija. V učni temi

biologija kot veda o življenju spoznajo pomembne znanstvenike. Mikroorganizmi so

predstavljeni z biologom L. Pasteur, ki je ovrgel teorijo o spontanem nastanku življenja. Z

eksperimentom steklenih bučk z zavitimi vratovi je dokazal, da se neživa snov okuži z

mikroorganizmi iz zraka. Učenci tukaj ponovijo pojma pasterizacija in sterilizacija, ki so

jih spoznali v 6. razredu pri predmetih naravoslovje in gospodinjstvo. Spoznajo odkritje

penicilina, ki ga je po naključju odkril A. Fleming, ko je le ta zaviral rast bakterijam.

Učenci spoznajo antibiotične lastnosti glive penicilina. Bolj podrobneje se učenci seznanijo

s tehnikami mikroskopiranja, zato lahko bolj podrobneje opazujejo mikroorganizme pod

svetlobnim mikroskopom ali stereolupo (npr. krušna plesen, kvasovke, itd.).

Tudi v osmem razredu so omenjeni mikroorganizmi kot razkrojevalci v učni temi

življenjska pestrost (lastnosti živih bitij). Bolj podrobneje učenci spoznajo kraljestvo gliv v

učni temi sistematika z evolucijo. Seznanijo se podrobneje s štirimi kraljestvi (cepljivke,

glive, rastline, živali). Že v predhodnih razredih so se učenci poučili o pomembni vlogi

gliv v naravi pri razgradnji organskih snovi. Učenci znajo razložiti naslednje pojme:

sluzavke, prave glive, plesnivke, zaprtotrosnice, odprtotrosnice in spoznajo osnovne

lastnosti gliv (načini prehranjevanja: saprofiti ali gniloživke, paraziti ali zajedalci, mikoriza

ali simbioza z rastlinami, so heterotrofi in se razmnožujejo s trosi). Kot prave glive in

plesnivke omenijo glavičasto krušno plesen. Med zaprtotrosnice štejemo najpomembnejše

glive kvasovke, ki spreminjajo sladkor v alkohol (alkoholna fermentacija). Primer



delovanja organizmov lahko obrazložimo z vzhajanjem kruha, ki so ga učenci spoznali v 6.

razredu pri gospodinjstvu pri peki kruha. V okviru te tematike se seznanijo tudi z zdravilno

čopičasto plesnijo, ki izloča snov, ki zavira rast bakterij.

Učna tema prebavila pri obravnavanju človeka v 9. razredu devetletne osnovne šole pri

tematiki mehanska in biokemijska prebava ne omenja prisotnost mikroorganizmov v

črevesju (črevesne bakterije). Omenjene so prebavne žleze z encimi, v učnem načrtu pa ni

poudarka na črevesnih bakterijah, ki prispevajo svoj delež k boljši odpornosti našega

imunskega sistema in boljši prebavi. Pri vsaki učni temi učenci obravnavajo bolezni.

Mikroorganizmi so v tej tematiki predvsem omenjeni kot virusi in bakterije, ki povzročajo

bolezenske znake (npr. salmonela, tetanus, sifilis, glivice, norice, ošpice, AIDS, itd.).

Najpogostejše glivične okužbe s kvasovkami povzroča rod Candida, ki povzroča soor ali

kandidozo. Tudi kvasovke vrste Malassezia furfur povzročajo kožno bolezen pityriasis

versicolor (tinea versicolor). Mikroorganizmov je približno desetkrat več kot celic v našem

telesu. Na tem mestu se zdi pomembno omeniti tudi simbiotsko povezanost človeka in

mikroorganizmov, kar pa učni načrt za 9. razred ne predvideva.

Osnovnošolski predmet gospodinjstvo pokriva več disciplin družboslovnega in

naravoslovnega področja. S tem predmetom se učenci srečajo v 5. in 6. razredu. Pri

modulu ekonomika gospodinjstva govorijo o nesrečah, ki se lahko zgodijo, med njimi tudi

zastrupitve. Poudarja se osebna higiena, kot preprečitev okužbe in širjenja nalezljivih

bolezni. V 6. razredu se to nadaljuje pri modulu hrana in prehrana s higieno prehrane in

čistočo pri pripravi hrane. Učenci spoznajo, kako hrana lahko škoduje. Srečajo se s

pojmom varna hrana, kar pomeni, da ta hrana ne vsebuje škodljivih mikroorganizmov.

Naučijo se kaj mikroorganizmi potrebujejo za rast in razmnoževanje, kjer opredelijo vpliv

temperature, hrane, vlage in časa. Učenci poznajo načine preprečevanja kvarjenja živil in

podaljšanja časa uporabe s postopki konzerviranja (dodajanje sladkorja, soli, kisa) in

pravilnim shranjevanjem (hlajenje, zmrzovanje, sušenje). Opredelijo kako vplivata

postopka pasterizacija in sterilizacija na mikroorganizme. Mikroorganizmi pa se pri tem

predmetu omenjajo tudi pri živilih, ki vsebujejo več ogljikovih hidratov (peka kruha) in

živila z več beljakovin (fermentacijski izdelki – priprava jogurta).



6 POVZETEK

Eden glavnih problemov današnje družbe je zadovoljitev energetskih potreb in zamenjava

surovih fosilnih materialov z obnovljivimi surovinami. Bioetanol predstavlja primeren

obnovljiv alternativni vir energije tudi kot transportno gorivo, predvsem pa je pomemben

kot velik doprinos k zmanjševanju emisij toplogrednih plinov.

Raziskave za proizvodnjo bioetanola so usmerjene na mikroorganizme, ki lahko

proizvajajo etanol, predvsem na kvasovko Saccharomyces cerevisiae kot fermentatorja

heksoze. Eden od osnovnih problemov pri produkciji bioetanola iz lignocelulozne biomase

je, da kvasovka S. cerevisiae lahko fermentira samo določene mono- in disaharide, kot so

glukoza, fruktoza, maltoza in saharoza. Ta vrsta ne more direktno asimilirati celuloze in

hemiceluloze, prav tako pa ne more asimilirati pentoz, predvsem ksiloze, ki nastaja pri

hidrolizi celuloze. Kljub temu ima kvasovka velik potencial na področju proizvodnje

bioetanola z izkoristkom lignoceluloznih odpadnih materialov in rekombinantnih tehnik.

Na splošno je kvasovka Saccharomyces cerevisiae omenjena v literaturi v povezavi s

proizvodnjo vina, piva in kruha. S človeško aktivnostjo je bila prinesena iz njenega

naravnega habitata v človeško okolje. S spoznavanjem naravnih habitatov, ki jih kvasovka

poseljuje, lahko pridobimo nove seve, ki imajo specifične lastnosti, zlasti večjo toleranco

na različne stresne pogoje.

Gensko raznolikost kvasovk iz različnih naravnih okolij smo v diplomskem delu zajeli z

273 različnimi vzorci, ki smo jih razdelili v 27 različnih skupin. Kvasovke iz vzorcev smo

specifično namnožili v YE tekočem gojišču z dodanim 10 % etanola pod anaerobnimi

pogoji. Pridobljene kulture smo nacepili na MEA gojišča z dodanim kloramfenikolom.

Glede na morfologijo kultur smo določili zanimive izolate, ki smo jih nanesli na sveže

gojišče in kasneje shranili na MEA poševnike za nadaljnjo obdelavo. Izolirali smo 122

kvasnih kultur, ki smo jih določili najprej po fenotipskih lastnostih in jih kasneje

molekularno identificirali do vrste.

Preverjali smo fenotipske lastnosti, kot so barva in oblika kolonij, velikost in oblika celic,

obarvanost askov, askospor in vegetativnih celic po acidorezistentnem barvanju in barve

gojišča po hidrolizi sečnine. S parjenjem različnih haploidnih sevov S. cerevisiae smo

želeli ugotoviti kompatibilnost različnih paritvenih tipov t.i. heterotaličnost sevov.

Pri sevih vrste Saccharomyces cerevisiae smo preverili asimilacijske lastnosti izolatov

(asimilacije različnih virov ogljika in dušika) ter jih primerjali s podatki za vrsto S.

cerevisiae. Opravili smo tudi temperaturne teste. Seve smo gojili na MEA in PDA gojiščih

pri temperaturah med 5 °C in 37 °C ter jih makromorfološko opisali.

Seve smo identificirali na osnovi genotipskih lastnosti. Za to smo uporabili zaporedje ITS

rDNA, ki je sicer uveljavljeno kot najpomembnejše zaporedje pri identifikaciji gliv (DNA

črtna koda). Izolirani genomski DNA smo pomnožili odseke ITS regije z

oligonukleotidnima začetkoma 1 in 2. S primerjavo ITS rDNA nukleotidnega zaporedja,

pridobljenega s tehniko PCR, smo identificirali 122 izolatov. Med 122 izolati smo določili

44 sevov kot kvasovko Saccharomyces cerevisiae.



V okviru diplomskega dela smo določili, da S. cerevisiae poleg bolj poznanih, industrijsko

pomembnih habitatov, povezanih s človeško aktivnostjo, poseljuje tudi raznolike naravne

habitate. Iz različnih vinogradniških vzorcev smo izolirali 15 sevov, 13 sevov iz

industrijskih okolij, 4 seve iz mlečnih izdelkov, 3 seve iz sveže stisnjenih sokov pred

pasterizacijo in po 2 seva iz vinskih mušic in tal pod sadnimi drevesi, sadjem in zelenjavo.

Po en sev smo izolirali iz vzorcev domačega kisa, razgrajenega lesa, gnilih sadežev in

zelenjave, silaže in sladkih plodov.



7 VIRI

Andrews S., Pitt, J. I. 1987. Further studies on the water relations of xerophilic fungi,

including some halophiles. Journal of general microbiology, 133, 2, 233–238.

Barnett J.A., Payne R. W., Yarrow D. 2000. In Yeasts: characteristics and identification, 3.

izdaja, Cambridge, United Kingdom, Cambridge University Press: 1152.

Biocemical and enzymatic reactions. Urea test. 2010.

http://bioweb.wku.edu/courses/biol208/lab_manual/208-4%20week%204.pdf (10.

5. 2011)

Biogoriva: koristna ali škodljiva za okolje?. 2008. Okolje, Evropski parlament.

http://www.europarl.europa.eu/sides/getDoc.do?pubRef=-//EP//NONSGML+IM-

PRESS+20080229STO22603+0+DOC+PDF+V0//SL&language=SL (20. 1. 2012)

Bisson L. F., Josep C. M. L. 2009. Yeast. V: Biology of microorganisms on grapes, in

must and in wine. König H., Unden G., Fröhlich J. (ur.). Berlin Heidelberg,

Springer: 47–60.

Blondin, B., Dequin, S., Querol, A., Legras, J.L. 2009. Genome of Saccharomyces

cerevisiae and related yeast. V: Biology of microorganisms on grapes, in must and

in wine. H. König, G.Unden, J. Fröhlich (ur.). Berlin Heidelberg, Springer: 361–

378.

Boulton C., Quain D. 2001. Brewing yeast and fermentation. London, Blackwell Science:

656 str.

Boundy-Mills, K. 2006. Methods for investigating yeast biodiversity V: Biodiversity and

ecophysiology of yeasts. Rosa, C., Peter G.(eds.). Berlin Heidelberg, Springer: 67–

95.

Calum J. M., Greig D. 2008. Prezygotic reproductive isolation between Saccharomyces

cerevisiae and Saccharomyces paradoxus, BMC Evolutionary Biology, 8: 1.

Carter M. D., Liti Gianni, Moses Alan M., Parts Leopold, James Stephen A., Davey Robert

P., Roberts Ian N., Blomberg Anders, Warringer Jonas, Burt Austin, Koufopanou

Vassiliki, Tsai Isheng J., Bergman Casey M., Bensasson Douda, O’Kelly Michael

J. T., Oudenaarden Alexander van, Barton David B. H., Bailes Elizabeth, Jones

Matthew, Quail Michael A., Goodhead Ian, Sims Sarah, Smith Frances, Durbin

Richard & Louis Edward. 2009. Population genomics of domestic and wild yeasts,

Nature, 458, 7236: 337–341.

CBS KNAW baza podatkov – Fungal biodersity centre. 2011.

http://www.cbs.knaw.nl/collections/BioloMICS.aspx?Table=CBS%20strain%20dat

abase&Name=CBS%201171&Fields=All&ExactMatch=T (1. 7. 2011)

Diezmann S., Cox C. J., Schönian G., Vilgalys R. J., Mitchell T. G. 2004. Phylogeny and

evolution of medical species of Candida and related taxa. A multigenic analysis

journal of clinical microbiology, 42, 12: 5624–5635.

http://bioweb.wku.edu/courses/biol208/lab_manual/208-4%20week%204.pdf

http://www.europarl.europa.eu/sides/getDoc.do?pubRef=-//EP//NONSGML+IM-PRESS+20080229STO22603+0+DOC+PDF+V0//SL&language=SL

http://www.europarl.europa.eu/sides/getDoc.do?pubRef=-//EP//NONSGML+IM-PRESS+20080229STO22603+0+DOC+PDF+V0//SL&language=SL

http://precedings.nature.com/users/701fdb1e750f840e84294a31b6b231d1

http://precedings.nature.com/users/f6287eb212739d8cdd3e77b2445ab83a

http://precedings.nature.com/users/6cda979b3e4c6e66ec0190a5ff5fed66

http://precedings.nature.com/users/d9082b133ea0f10a2d1e50d2736fe2a7

http://www.cbs.knaw.nl/collections/BioloMICS.aspx?Table=CBS%20strain%20database&Name=CBS%201171&Fields=All&ExactMatch=T

http://www.cbs.knaw.nl/collections/BioloMICS.aspx?Table=CBS%20strain%20database&Name=CBS%201171&Fields=All&ExactMatch=T



Diezmann S., Dietrich F. S. 2009. Saccharomyces cerevisiae: Population divergence and

resistance to oxidative stress in clinical, domesticated and wild isolates. PLoS

ONE, 4(4): e5317.

Erlend A., Townsend J., Adams I. R., Nielsen M. K., Taylor W. J. 2006. Population

structure and gene evolution in Saccharomyces cerevisiae. Federation of European

Microbiological Societies FEMS Yeast Published by Blackwell Publishing, FEMS

Yeast Research, 6, 5: 702–715.

Fadda M. E., Cosentino S., Deplano M., Palmas F. 2001. Yeast populations in Sardinian

feta cheese, International Journal of Food Microbiology, 69, 1–2: 153–156.

Fay J. C., Benavides J. A. 2005. Evidence for domesticated and wild populations of

Saccharomyces cerevisiae. PLoS genetics. 1, 1: 66–71.

Feldman H. 2005. Yeast molecular biology. A short compendium on basic features and

novel aspects. Adolf-Butenandt-Institute. University of Munich,

http://biochemie.web.med.uni-muenchen.de/Yeast_Biol/ (8. 3. 2011)

García-Llobodanin L., Achaerandio I., Ferrando M., Güell C., López F. 2007. Pear

distillates from pear juice concentrate: Effect of lees in the aromatic composition.

Journal of agricultural and food chemistry, 55, 9: 3462–3468.

Goldstein A. L., McCusker J. H. 2001. Development of Saccharomyces cerevisiae as a

model pathogen. A system for the genetic identification of gene products required

for survival in the mammalian host environment. Genetics, 159, 2: 499–513.

Gonzalez S. S., Barrio E., Gafner J., Querol A. 2006. Natural hybrids fromSaccharomyces

cerevisiae, Saccharomyces bayanus and Saccharomyces kudriavzevii in wine

fermentations, FEMS (Federation of European Microbiological Societies

Published) Yeast, 6, 8: 1221–1234.

Grba S., Stehlik-Tomas V, Stanzer D, Vahčić N., Škrlin A. 2002. Selection of Yeast Strain

Kluyveromyces marxianus for alcohol and biomass production on whey. Chemical

and Biochemical Engineering Quarterly, 16, 1: 13–16.

Guarro J., Gene J., Stchigel A.M. 1999. Developments in fungal taxonomy. Clinical

Microbiology Reviews, 12(3): 454–500.

Hagler A. N., Mendonqa-Hagler M. C. 1981. Yeasts from marine and estuarine waters

with different levels of pollution in the state of Rio de Janeiro, Brazil. Appued and

environmental microbiology, 41, 1: 173–178.

Hartwell L. H. 1974. Saccharomyces cerevisiae cell cycle. Bacteriological reviews, 38, 2:

164–198.

Herskowitz I. 1988. Life cycle of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae,

Bacteriological reviews, 52, 4: 536–553.

http://biochemie.web.med.uni-muenchen.de/Yeast_Biol/



Hwang U.-W., Kim W. 1999. General properties and phylogenetic utilities of nuclear

ribosomal DNA and mitochondrial DNA commonly used in molecular systematics.

The Korean Journal of Parasitology, 37(4): 215–228.

Ibekwe I.N., Nwabueze R. N., Anyanwu B. N. 2006. Characterisation of palm wine yeast

isolates for industrial utilisation. African jurnal of Biotechnology, 5, 19: 1725–

1728.

Kavanagh K. 2005. Fungi: Biology and applications. Wiley, Chichester: 256 str.

Koutinasa A. A., Athanasiadisb I., Bekatoroua A., Psarianosa C., Kanellakia M., s

Agouridisa N., Blekasb G. 2007. Kefir-yeast technology: Industrial scale-up of

alcoholic fermentation of whey, promoted by raisin extracts, using kefir-yeast

granular biomass. Enzyme and microbial technology, 41, 5: 576–582.

Kurtizman C.P., Robnett C. J. 2003. Phylogenetic relationships among yeasts of the

Saccharomyces complex determined from multigene sequence analyses. FEMS

Yeast research, 3, 4: 417–432.

Kurtzman C. P. 2006. Yeast species recognition from gene sequence analyses and other

molecular methodes. Mycoscience, 47, 2: 65–71.

Kurtzman C. P., Fell J. W., Boekhout T., Robert V. 2011. Methodsfor isolation, phenotypic

characterization and maintenance of yeasts. V: Kurtzman C. P., Fell J. W.,

Boekhout T. (ur.) The yeasts, a taxonomic study, 5th edn. Amsterdam, Elsevier

Science: 87–110.

Kurtzman C. P., Fell J. W., Robert V., Boekhout T. 2003. Methods to identify yeast. V:

Yeasts in food. Boekhout T., Robert V. (ur.). Cambridge, Woodhead Publishing:

69–121.

Landry C. R., Townsend J. P., Hartl D. L., Cavalieri D. 2006. Ecological and evolutionary

genomics of Saccharomyces cerevisiae. Molecular Ecology, 15, 3: 575–591.

Legras J. L., Merdinoglu D., Cornuet J. M., Karst F. 2007. Bread, beer and wine:

Saccharomyces cerevisiae diversity reflects human history, 16, 10: 2091–2102.

Lichtenthaler, F. W. 2008. Carbohydrate-based product lines: The key sugars of biomass:

Availability, present non-food uses and potential future development lines, in

biorefineries-industrial processes and products: Status Quo and future directions.

Kamm B., Gruber P. R., Kamm M. (ur.), Weinheim, Wiley-VCH Verlag GmbH:

949 str.

Liti G., Barton D. B. H., Louis E. J. 2006. Sequence diversity, reproductive isolation and

species concepts in Saccharomyces, Genetics, 174, 2: 839–850.

Louise E.M., Van Opzeeland K. 1984. Olfactory microhabitat selection in Leptopilina

heterotoma (Thomson) (Hym.: Eucoilidae), a parasitoid of Drosophilidae.

Netherlands journal of zoology, 35, 3: 497–504.










Maimer E., Busse M. 1992. Growth properties and gas formation by yeasts isolated from

processed fruits in media with various brix values and sorbic acid contents. Journal

of food protection, 55, 3: 192–197.

NCBI 2010a. Basic local alignment searchtool (BLAST). Bethesda, NCBI – National

Center for Biotechnology Information. http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (20.

7. 2010) 1 str.

NCBI 2010b. GenBank baza podatkov. Bethesda, NCBI – National Center for

Biotechnology Information. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez (20. 7. 2010):

1 str.

Nisiotou A. A., Spiropoulos A. E., Nychas G. E. 2007. Yeast community structures and

dynamics in healthy and botrytis-affected grape must fermentations, Applied and

Environmental Microbiology, 73, 21: 6705–6713.

Novak-Štagoj M., Podobnik M. 2006. Kvasovke – tovarne rekombinantnih proteinov.

Formacevtski vestnik, 57, 4: 235-240.

http://www.sfd.si/modules/catalog/products/prodfile/fv4_2006.pdf (25. 4. 2011)

Oda Y., Yabuki M., Tonomura K., Fukunaga M. 1998. A phylogenetic analysis of

Saccharomyces species by the sequence of 18S–28S rRNA spacer regions. Yeast,

13, 13: 1243–1250.

Palzkill T. G., Oliver S. G., Newlon C. S. 1986. DNA sequence analysis of ARS elements

from chromosome III of Saccharomyces cerevisiae: identification of a new

conserved sequence.Nucleic Acids Res, 14, 15:6247–6264.

Petro S. 2010. Fermentation in the yeast Saccharomyces cerevisiae.

https://docs.google.com/viewer?url=http%3A%2F%2Fphobos.ramapo.edu%2F~spe

tro%2Flab_pdf%2FFermlab.pdf (20. 4. 2011)

Piškur J., Rozpe E., Polakova S., Merico A., Compagno C. 2006. How did Saccharomyces

evolve to becomea good brewer?. Trends in Genetics, 22, 4: 183–186.

Pitt J. I., Hocking A. D. 1999. Fungi and food spoilage. 2nd ed. London, Blackie Academic

& Professional: 593 str.

Qin B., Chang F. J., Barbosa-Cánovas G. V., Swanson B. G. 1995. Nonthermal

inactivation of Saccharomyces cerevisiae in apple juice using pulsed electric fields.

Lebensmittel-Wissenschaft und-Technologie, 26, 6: 564–568.

Raspor P. 1996. Biotehnologija. Osnovna znanja. Ljubljana, Bia: 815 str.

Raspor P., Smole – Možina S., Čadež N. 2000. Identification of yeasts from grape / muste /

wine system. V: Food microbiology protocols. Spencer J. F. T., Rafout de Spencer

A. L. (eds.). Totowa, New Jersey, Humana Press Inc.: 1–14 (Methods in

biotehnology; 14).

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/(SICI)1097-0061(199710)13:13%3C%3E1.0.CO;2-T/issuetoc

https://docs.google.com/viewer?url=http%3A%2F%2Fphobos.ramapo.edu%2F~spetro%2Flab_pdf%2FFermlab.pdf

https://docs.google.com/viewer?url=http%3A%2F%2Fphobos.ramapo.edu%2F~spetro%2Flab_pdf%2FFermlab.pdf



Renouf V., Lonvaud-Funel A. 2007. Development of an enrichment medium to detect

Dekkera/Brettanomyces bruxellensis, a spoilage wine yeast, on the surface of grape

berries. Microbiological Research, 162, 2: 154–167.

Roberts G. D., Horstmeier C. D., Land G. A., Foxworth J.H. 1978. Rapid urea broth test

for yeasts. Journal of Clinical Microbiology, 7, 6: 584–588.

Rodicio R., Heinisch J. J. 2009. Sugar metabolism by Saccharomyces and non-

Saccharomyces yeasts. V: Biology of microorganisms on grapes, in must and in

wine. König H., Unden G., Fröhlich J. (ur.). Berlin Heidelberg, Springer: 113–134.

Rodrigues F., Ludovico P., Leao C. 2006. Sugar metabolism in yeasts : an overview of

aerobic and anaerobic glucose catabolism - Chapter. 6. V: Biodiversity and

ecophysiology of yeasts. Rosa C., Peter G. (eds.). Berlin Heidelberg, Springer:

101–121.

Rogers T. O., Wilson H. A. 1966. pH as a selecting mechanism of the microbial flora in

wastewater-polluted acid mine drainage. Journal of Water Pollution Control

Federation, 38, 6: 990–995.

Rupnik M., Zalar P., Turk M., Janc M. 2005. Splošna mikrobiologija. Ljubljana,

Študentska založba: 77 str.

S. Nikolić, L. Mojović, M. Rakin, D. Pejin. 2009. Bioethanol production from corn meal

by simultaneous enzymatic saccharification and fermentation with immobilized

cells of Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus, Fuel, 88, 9: 1602–1607.

Sampaio J. P., Gonçalves P. 2008. Natural populations of Saccharomyces kudriavzevii in

Portugal are associated with oak bark and are sympatric with S. cerevisiae and S.

paradoxus, Applied and enviromental micorbiology, 74, 7: 2144–2152.

Samson R. A., Hoekstra E. S., Frisvad J. C., Filtenborg O. 2004. Introduction to food - and

airborn fungi. 7th ed. Utrecht, Centraalbureau voor Schimmelcultures: 389 str.

Sánchez O. J., Cardona C. A. 2008. Trends in biotechnological production of fuel ethanol

from different feedstocks. Bioresource Technology, 99, 13: 5270–5295.

Scott W. A. 1979. Cognitive structure: theory and measurement of individual differences.

Washington, V. H. Winston: 252 str.

Seiler H., Busse M. 1990. The yeasts of cheese brines. International Journal of Food

Microbiology, 11, 3–4: 289–303.

Semenčenko V. V., Mojović L. V., Petrović S. D., Ocić O. J. 2011. Novi trendovi u

proizvodnji bioetanola, Hem. ind., 65, 2: 103–114.

Shearer A. E., Mazzotta A. S., Chuyate R., Gombas D. E. 2002. Heat resistance of juice

spoilage microorganisms. J Food Prot, 65, 8: 1271–1275.

Solomon E. P., Berg L. R., Martin D. W. 2005. Biology 7th ed. Belmont (CA): Thomson,

Brooks/Cole: 1234 str.

http://www.jstor.org/stable/25035574

http://www.jstor.org/stable/25035574

http://www.sciencedirect.com/science/journal/09608524

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_tockey=%23TOC%235692%232008%23999009986%23688992%23FLA%23&_cdi=5692&_pubType=J&view=c&_auth=y&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=88c5d0d0035a500dba7437c6ce673221





Spencer J.F.T., Spencer D.M. 1997. Ecology: where yeast live. V: Spencer, J.F.T., Spencer

D.M (ur.). Yeasts in natural and artificial habitats. Berlin, Springer-Verlag Berlin:

33–58.

Stiles Battey A., Duffy S., Schaffner D. W. 2002. Modeling yeast spoilage in cold-filled

ready-to-drink beverages with Saccharomyces cerevisiae, Zygosaccharomyces

bailii, and Candida lipolytica. Applied and Environmental Microbiology, 68, 4:

1901–1906.

Sujaya I.N., Antara N.S., Sone T., Tamura Y., Aryanta W. R., Yokota A., Asano K.,

Tomita F. 2003. Identification and characterization of yeasts in brem, a traditional

Balinese rice wine. World Journal of Microbiology & Biotechnology, 20, 2: 143–

150.

Taherzadeh M. J. Karimi K. 2007. Acid-based hydrolysis processes for ethanil from

lignocellulosic materials. A review bioRes, 2, 3: 472–499.

Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics

Analysis (MEGA) Sofrware version 4.0. Molecular Biology and Evolution, 24, 8:

1596–1599.

Tarr S. 2004. Yeasts from Lesotho – Their classification and possible applications. Faculty

of Natural and Agricultural Sciences, http://etd.uovs.ac.za/ETD-

db/theses/available/etd-09292005-160929/unrestricted/TARRS.pdf (20. 3. 2011)

The life cycle of yeast. 2011. Department of Biology, Davidson College.

http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/2001/oldham/1YFYORF.htm (26.

7. 2011)

Tornai-Lehoczki P. G., Dlauchy J. D., Vitanyi G. 2000. Pichia sporocuriosa sp. nov., a

new yeast isolated from rambutan. Antonie van Leeuwenhoek, 77, 1: 37–42.

Van de Peer Y., Jansen J., De Rijk J., De Wachter R.. 1997. Database on the structure of

small ribosomal subunit RNA. Nucleic Acids Research, 25, 1: 111–116.

Van der Vossen J. M. B. M., Rahaoi H., De Nijsi M., Hartog J. B. 2003. PCR methods for

tracing and detection od yeasts in food chain. V: Yeasts in food: Beneficial and

detrimental aspects. Boekhout T., Robert V. (eds.). Cambridge, Woodhead

Publishing, Boca Raton, CRC Press: 123–138.

Verduyn C., Postma E., Scheffers W.A., Van Dijken J. 1990. Physiology of

Saccharomyces cerevisiae in anaerobic glucose-limited chemostat cultures. Journal

of General Microbiology, 136, 3: 395–403.

Walker G. M. 2009. Yeasts. V: The desk encyclopedia of microbiology. 2nd ed. M.

Schaechter (ed.). London Elsevier/Academic Press: 1174–1187.

Wardrop F. R., Liti G., Cardinali G., Walker G. M. 2004. Physiological responses of

Crabtree positive and Crabtree negative yeasts to glucose upshifts in a chemostat.

http://etd.uovs.ac.za/ETD-db/theses/available/etd-09292005-160929/unrestricted/TARRS.pdf

http://etd.uovs.ac.za/ETD-db/theses/available/etd-09292005-160929/unrestricted/TARRS.pdf

http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/2001/oldham/1YFYORF.htm%20(26

http://www.mendeley.com/profiles/forbes-wardrop/



University. of Milan Department of Food Science and Microbiology, 54, 1: 103–

114.

Wilkins M. R., Widmer W. W., Grohmann K. 2007. Simultaneous saccharification and

fermentation of citrus peel waste by Saccharomyces cerevisiae to produce ethanol.

Process Biochemistry, 42, 12: 1614–1619.

Wilson C. L., Wisniewski M. E., Biles C. L., McLaughlin R., Chalutz E., Droby S. 1991.

Biological control of post-harvest diseases of fruits and vegetables: alternatives to

synthetic fungicides. Crop Protection, 10, 3:172–177.

Zalar P. 2011. Mikrobna raznolikost in identifikacija: Glive. Ljubljana, Oddelek za

biologijo, Biotehniška fakulteta, Univerza v Ljubljani: 123 str.

Zalar P., Gunde-Cimerman N. 2002. Taksonomija in identifikacija gliv. Ljubljana,

Študentska založba: 92 str.

Zhao X. Q., Bai F.W. 2009. Yeast flocculation: new story in fuel ethanol production.

Biotechnology Advances, 27: 849–856.

Zook C. D., Parish M. E., Braddock R. J., Balaban M. O. 1999. High pressure inactivation

kinetics of Saccharomyces cerevisiae ascospores in orange and apple juices, 64, 3:

533–535.


http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_tockey=%23TOC%235278%232007%23999579987%23674282%23FLA%23&_cdi=5278&_pubType=J&view=c&_auth=y&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_userid=10&md5=ad6b9207bc2a78fe2d0c45362d314b06

Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih okolij.


PRILOGE

Priloga A: Opis vzorcev s krajem vzorčenja po skupinah vzorcev za vse seve kvasovk.

Skupina vzorcev Opis vzorcev EXF št. seva Identifikacija seva Izvor vzorca (kraj)

brezalkoholne gazirane pijače kombuča EXF-4926 Candida ethanolica Ljubljana

citrusi sok limone EXF-6210 Issatchenkia orientalis Jesenice

domači kis

goba za kisanje jabolčnega kisa EXF-4923 Zygosaccharomyces bailii Breg pri Žirovnici

jabolčni kis EXF-5296 Saccharomyces cerevisiae Breg pri Žirovnici

jabolčni mošt EXF-4927 Saccharomycodes ludwigii Mozirje

jabolka iz jabolčnega kisa EXF-6305 neidentificirano Breg pri Žirovnici

usedlina jabolčnega kisa EXF-6307 neidentificirano Breg pri Žirovnici


gnile rumene kolerabe EXF-5733 Saccharomyces cerevisiae Breg pri Žirovnici

gnila breskev EXF-6215 Issatchenkia orientalis Breg pri Žirovnici

gnil stročji fižol EXF-6216 Issatchenkia orientalis Breg pri Žirovnici

gobe, lišaji neidentificirane drevesne gobe

EXF-6222 Saccharomyces paradoxus Blejski Vintgar

EXF-6263 Zygosaccharomyces bailii bukov pragozd Vojsko

bris površine gobe Pseudohydnum gelatinosum EXF-6262 Zygosaccharomyces bailii bukov pragozd Vojsko

gozdna stelja (listni drobir) mešani listni drobir EXF-6212 Issatchenkia orientalis Jesenice

EXF-6303 neidentificirano dolina Triglavske Bistrice

jagodičevje maline

EXF-6208 Pichia sporocuriosa Jesenice

EXF-6209 Issatchenkia orientalis Jesenice

EXF-5732 Saccharomyces paradoxus Jesenice

EXF-6211 Pichia sporocuriosa Jesenice

mlečni izdelki

kefir

EXF-5288 Kluyveromyces marxianus Breg pri Žirovnici

EXF-6230 Kluyveromyces lactis Visoče

EXF-6233 Kluyveromyces marxianus Visoče

EXF-5289 Saccharomyces cerevisiae Breg pri Žirovnici


voda kislega mleka EXF-4924 Dekkera bruxellensis Breg pri Žirovnici

ovčji sir EXF-6232 Kluyveromyces marxianus Visoče

kajmak

EXF-6237 Candida zeylanoides Jesenice

EXF-6238 Candida zeylanoides Jesenice

EXF-6239 Yarowia lipolitica Jesenice se nadaljuje



nadaljevanje


mlečni izdelki

kravji sir z orehi EXF-6240 Kluyveromyces lactis Visoče

sirotka EXF-6231 Kluyveromyces marxianus Visoče

kravji sir

EXF-5871 Saccharomyces cerevisiae Visoče

EXF-6241 Candida sp. Visoče

EXF-5872 Saccharomyces cerevisiae Visoče

razgrajen les

trhel les

EXF-6300 neidentificirano Jesenice

EXF-5868 Candida paludigena dolina Triglavske Bistrice

EXF-5869 Saccharomyces cerevisiae dolina Triglavske Bistrice




EXF-6242 Kluyveromyces lactis Jesenice



staro žaganje

EXF-6304 neidentificirano dolina Triglavske Bistrice

EXF-6223 Saccharomycetes (razred) dolina Triglavske Bistrice

EXF-6224 Saccharomycetes (razred) dolina Triglavske Bistrice

silaža

koruzna silaža


EXF-6225 Candida tropicalis Breg pri Žirovnici

EXF-6226 Wickerhamomyces anomalus Breg pri Žirovnici

EXF-6227 Kazachstania unispora Breg pri Žirovnici

EXF-6228 Candida tropicalis Breg pri Žirovnici

del koruznega storža EXF-6229 Metschnikowia aff. fructicola Breg pri Žirovnici

EXF-6306 neidentificirano Breg pri Žirovnici

sladki plodovi (npr. slive) slive EXF-5287 Saccharomyces cerevisiae Breg pri Žirovnici

sveže stisnjeni sadni sokovi

pred pasterizacijo

jagodni sok

EXF-5290 Saccharomycetes (razred) Breg pri Žirovnici

EXF-5291 Torulaspora delbrueckii Breg pri Žirovnici

EXF-5292 Torulaspora delbrueckii Breg pri Žirovnici

hruškov sok EXF-5297 Saccharomyces cerevisiae Breg pri Žirovnici


jabolčni sok EXF-5293 Saccharomyces cerevisiae Breg pri Žirovnici se nadaljuje



nadaljevanje


vinogradniški vzorci (tla,

zamaški, sodi, stiskalnice,

mošt)

mošt

EXF-5272 Saccharomyces cerevisiae Bistrica ob Sotli



vinski kamen


EXF-4915 Dekkera bruxellensis Bistrica ob Sotli


tla, kamor se steka vino EXF-4912 Saccharomyces cerevisiae Bistrica ob Sotli


vinogradniški vzorci (tla,

zamaški, sodi, stiskalnice,

mošt)

grozdni peclji

EXF-5275 Saccharomycetes (razred) Bistrica ob Sotli



EXF-5278 Pichia membranifaciens Bistrica ob Sotli


EXF-4922 Hanseniaspora uvarum Breg pri Žirovnici

tropine




EXF-6235 Zygosaccharomyces bailii Jesenice

EXF-6236 Zygosaccharomyces bailii Jesenice

koruzni liček kot čep na sodu



EXF-5279 Kluyveromyces lactis Bistrica ob Sotli



grozdje EXF-4920 Saccharomyces cerevisiae Bistrica ob Sotli

mlado vino EXF-5294 Saccharomyces cerevisiae Breg pri Žirovnici

leseni sod za vino EXF-6217 Clavispora lusitaniae Bistrica ob Sotli

voda industrijskih okolij usedline odpadne vode iz skal

EXF-6218 Saccharomyces cerevisiae Jesenice

EXF-6252 Rhodotorula mucilaginosa Jesenice

EXF-6253 Pichia guilliermondii Jesenice


EXF-5870 Saccharomyces paradoxus Jesenice se nadaljuje



nadaljevanje


odplake iz avtopralnice




onesnažena voda potokov

EXF-6244 Candida zemplinina Tržič

EXF-6309 Candida zemplinina Jesenice







voda industrijskih okolij

onesnažena voda potokov

EXF-6245 Hanseniaspora uvarum Jesenice

EXF-6251 Candida glabrata Jesenice


EXF-6261 Rhodotorula mucilaginosa Tržič

EXF-5875 Saccharomyces cerevisiae Tržič


proizvodnji lepenke





EXF-6259 Candida albicans Tržič

tla pod sadnimi drevesi, sadjem

zelenjavo

tla pod jabolkom EXF-5283 Metschnikowia pulcherrima Breg pri Žirovnici

EXF-6214 Issatchenkia orientalis Bistrica ob Sotli

tla pod grozdjem EXF-5285 Hanseniaspora uvarum Breg pri Žirovnici

EXF-5286 Hanseniaspora uvarum Breg pri Žirovnici

tla pod paradižnikom EXF-6213 Issatchenkia orientalis Bistrica ob Sotli

tla pod breskvijo EXF-5735 Saccharomyces cerevisiae Bistrica ob Sotli

tla, kjer je ležalo grozdje EXF-5281 Saccharomyces cerevisiae Bistrica ob Sotli

žuželke (vinske mušice) vinske mušice z ličinkami EXF-5734 Saccharomyces cerevisiae Jesenice




Priloga B: Opis vzorcev, iz katerih nismo izolirali kvasovk, s krajem vzorčenja po skupinah vzorcev.

Skupina vzorcev Opis vzorcev Izvor vzorca (kraj)

brezalkoholne gazirane pijače pijača Cocta Mrzli vrh nad Idrijo

buče za kuhanje (razpoke, semena, stiskalnica za bučno olje) domače bučno olje Apače

buča (semena, razpoke, cvet buče, stebla, skorja buče) Breg pri Žirovnici

citrusi limonin (sok, olupek, sredica, list) Breg pri Žirovnici

domači kis

jabolka namočena v jabolčnem kisu Breg pri Žirovnici

domači vinski kis Jesenice

sluz na jabolčnem kisu Breg pri Žirovnici


gnila breskev Breg pri Žirovnici

gnilo steblo brokolija Breg pri Žirovnici

gnilo jabolko Jesenice

gnila kumara Breg pri Žirovnici

gobe, lišaji

neidentificirane drevesne gobe Blejski Vintgar

različni lišaji (skorjasti, listasti, grmičasti) Blejski Vintgar

brisi površine gob: hojeva polževka - Hygrophorus

pudorinus, smrekova kresilača - Fomitopsis pinicola,

cinobrasti drobnolukničar - Pycnoporus cinnabarinus,

bukova polževka - Hygrophorus fagi, žolti luskinar -

Pholiota aurivella, navadna ledenka - Pseudohydnum

gelatinosum, skorjasta zamazanka - Exidia sp., bela

polževka - Hygróphorus ebúrneus, rdečelistka -

Entoloma sp., skorjevka - Corticiaceae, bukova

kresilka - Fomes fomentarius, Maskulina aylinium,

Trichordopsis odorata, bradavec, sluzasta širokolistka,

štorovka - Armillaria sp., luskinar, čedna bolgarka,

vitka lesenjača - Xylaria polymorpha, tintnica -

Coprinus sp., pegasta čeladica - Mycena maculata,

redpičasta čeladarica, meglenka - Clitocybe sp.,

kučmica - Galerina sp., bukova mlečnica - Lactarius

blennius, lososova sirovka - Lactarius salmonicolor,

skledica - Peziza sp., luskinarji - Pholiota sp.

bukov pragostVojsko pri

Idriji

gozdna stelja (listni drobir) humus Jesenice

listni drobir (različne stopnje razkroja) dolina Triglavske Bistrice se nadaljuje



nadaljevanje


jagodičevje

robide Breg pri Žirovnici

marabela Jesenice

kosmulje Jesenice

kislo zelje kislo zelje Breg pri Žirovnici

voda pri kisanju kislega zelja (različno staranje) Breg pri Žirovnici

mlečni izdelki

slana voda feta sira Jesenice

domača skuta Visoče

sirotka Jesenice

med lipov med Breg pri Žirovnici

morska voda v pristanišču slana pristaniška voda Portorož

olivno olje domače olivno olje Dugi otok (HR)

onesnažena tla

onesnažena zemlja tovarna Acroni Jesenice

onesnažena zemlja blizu tovarne (odlagališče smeti) Jesenice

skladiščenje odpadnega železa Jesenice

razgrajen les

trhel les Jesenice

staro žaganje dolina Triglavske Bistrice

ostanki delno pogoretega žaganje Breg pri Žirovnici

slana voda iz solin nižje slanosti solinska voda iz različnih solinskih kanalov Sečovlje

usedlina tal pri 4. bazenu soline Sečovlje

smolni vršički, smola, lubje

smolni vršički (bor, smreka) Breg pri Žirovnici

smola (smreka) Breg pri Žirovnici

lubje s smolo (bor, smreka) Breg pri Žirovnici

sladki plodovi (npr. slive) plod rdeče murve Pula (HR)

silaža koruza (steblo, listi, koruzni laski, poškodovana zrna) Breg pri Žirovnici

silaža (različna starost) Breg pri Žirovnici

sveže stisnjeni sadni sokovi pred pasterizacijo hruškov sok Breg pri Žirovnici

bezgov sok Breg pri Žirovnici

tla, kjer raste sladkorna pesa zemlja, kjer je rasla sladkorna pesa Mönchengladbach (D)

tla pod sadnimi drevesi, kjer leži sadje

zemlja, kjer je ležal rdeč grozd Breg pri Žirovnici

zemlja pod krmno peso Bistrica ob Sotli

zemlja pod rdečo peso Bistrica ob Sotli

zemlja pod kumarami Bistrica ob Sotli

zemlja pod paradižnikom Bistrica ob Sotli

zemlja pod jabolkom Bistrica ob Sotli se nadaljuje



nadaljevanje


vinogradniški vzorci (tla, zamaški, sodi, stiskalnice za grozdje, mošt) mošt Bistrica ob Sotli

voda iz industrijskih okolij

odpadna voda potok Tomšičeva Jesenice

odpadne vode reka Mušenik Tržič

meteorne vode Jesenice

pritok Dolžanke v Tržiško Bistrico Tržič

potok Blejščica Tržič

vzorci rib brisi površine kože piranskega brancina Piran

deli prebavil piranskega brancina Piran

z nafto/asfaltom kontaminirana tla zemlja z asfaltom Jesenice

žuželke (vinske mušice) vinske mušice (družina Drosophilidae) Jesenice

listne uši (naddružina Aphidoidea) na fižolu Breg pri Žirovnici

Documents

UNIVERZA V LJUBLJANIpefprints.pef.uni-lj.si/674/1/Izolacija_kvasovk... · II Finžgar B. Izolacija kvasovk Saccharomyces cerevisiae iz neobičajnih naravnih habitatov. Dipl. delo