Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, 2016/17Program: Laboratorijska biomedicina

Predmet:

MOLEKULARNA ENCIMOLOGIJA

Jure Stojan in Marko GoličnikMedicinska fakulteta

Prof. dr. Matjaž Zorko – do generacije 2013/14

Struktura predmeta:

predavanja vaje seminarji

UrnikProgramVajeSeminarjiKolokvijiIzpit

http://ibk.mf.uni-lj.si/teaching/lab_medicina

FFA: LABORATORIJSKA MEDICINA, 2. stMOLEKULARNA ENCIMOLOGIJA

PROGRAM PREDAVANJ 2016/17

VAJE

VAJE

S

IZPIT

K

K

DATUM OBLIKA POUKA (P = predavanje, V = vaje) PROSTOR

6. 10. / 15.00četrtek

P1 (MG): proteinska narava encimov, struktura, stabilnost in fleksibilnost, konformacijske spremembe, koncept aktivnega mesta, klasifikacija

MF:LP

13. 10. / 15.00četrtek

P2 (JS): encimska kataliza (kovalentna, acido-bazna, s približanjem in orientiranjem), termodinamične osnove encimske katalize, časovni potek encimske reakcije, začetna hitrost

MF:LP

18. 10. / 08.00torek

V1 (JS+MG): specifična aktivnost alkalne fosfatazerazdelitev seminarjev

MF:IBK vajalnica

20. 10. / 15.00četrtek

P3 (MG): vplivi na hitrost encimske reakcije, vpliv substrata na hitrost encimske reakcije (Michaelisova kinetika), ravnotežno in stacionarno stanje

MF:LP

25. 10. / 8.00torek

V2 (JS+MG): začetna hitrost, Km, Vmax, kkat MF:IBK vajalnica

27. 10. / 15.00četrtek

P4 (JS): hitra kinetika in nastajanje ravnotežnih in stacionanih stanj, vrste inhibicije (reverzibilna, ireverzibilna), matematično modeliranje encimskih reakcij (holinesteraza in tubokurarin oz. eserin)

MF:LP

10. 11. / 15.00četrtek

Integracija 1 + kolokvij 1 (MG) MF:LP

15. 11. / 8.00torek

V3 (JS+MG): hitra kinetika in modeliranje - demonstracija MF:IBK vajalnica

17. 11. / 15.00četrtek

P5 (JS): molekulski mehanizem encimske reakcije (kimotripsin, acetilholinesteraza), alosterični pojavi, alosterija, kooperativnost, kinetika, matematične osnove, molekulski modeli, pseudokooperativnost

MF:IBK vajalnica

24. 11. / 15.00četrtek

P6 (JS): primeri alosteričnih encimov (PFK, CAT, ATC) MF:LP

1. 12. / 15.00četrtek

P7 (MG): klasifikacija encimov in primeri delovanja značilnih predstavnikov posameznih encimskih razredov

MF:LP

8. 12. / 15.00četrtek

P8 (MG): uporaba encimologije v kliniki (diagnostika, terapija, encimi kot tarče zdravil) in biotehnologiji (mikroorganizmi, imobilizirani encimi, kat. protitelesa)

MF:LP

15. 12. / 15.00četrtek

Integracija 2 + kolokvij 2 (JS) MF:LP

20. 12 / 15.00 torek

S1 (JS+MG) MF:LP

22. 12. / 15.00 četrtek

S2 (JS+MG) MF:LP

januar 2015 izpit (1. rok) po razporedu MF:IBKfebruar 2015 izpit (2. rok) po razporedu MF:IBKjunij 2015 izpit (3. rok) po razporedu MF:IBKseptember 2015 izpit (4. rok) po razporedu MF:IBK

VAJE

VAJE PREDAVANJA, SEMINARJIKJE JE KAJ:

VAJE

Predavanje 1:STRUKTURA PROTEINOV IN NJEN POMEN ZA

DELOVANJE ENCIMOV

Marko GoličnikMedicinska fakulteta

GLEJ: http://ibk.mf.uni-lj.si/teaching/lab_medicina/default.html

marko.golicnik@mf.uni-lj.si

MOLEKULARNA ENCIMOLOGIJA Encimi so biološki katalizatorji:• Skrbijo za dovolj veliko hitrost kemičnih reakcij.

• Pomembno sodelujejo pri regulaciji bioloških procesov.

MOLEKULARNA ENCIMOLOGIJA Encimi so biološki katalizatorji:• Omogočajo črpanje energije in njeno porabo v organizmih.

• V klinični biokemiji so pomembni markerji in reagenti.

MOLEKULARNA ENCIMOLOGIJA Encimi so biološki katalizatorji:Po kemijski strukturi: PROTEINI in RNA (klasični encimi in ribocimi).Ribocimi so izredno pomembni pri zorenju mRNA in pri sintezi proteinov Vse druge procese (reakcije) katalizirajo klasični encimi – več 10.000 različnih PROTEINOV (~75.000 v človeku).

ZATO MORAMO POZNATI STRUKTURO PROTEINOV!

PAZI: več 100 nestandardnih AK (post-transl. modif. & D-AK)!

C-atom

PROTEINE SESTAVLJAJO L-AMINOKISLINE (AK)

Glavne lastnosti (20 standardnih) aminokislin

- klasifikacija AK

- velikost

- naboj

- polarnost

- hidrofobnost

- aromatske AK

- 3D-konfiguracija AK in optična aktivnost

Le po R se razlikujejo!

Klasifikacija proteinogenih aminokislin

Kislinsko-bazne lastnosti aminokislin

N CR3

R1-COOH + H2N-R2 ↔ R1-CONH-R2 + H2O

AMINOKISLINA (AK)

R = AK radikal (stranska veriga)

AK ostanek (residue) = AK – H2O

PROSTA AMINOKISLINA

AMINOKISLINA V PROTEINU

R

NABOJ:Odvisen od pKa vrednosti (25°C) in pH

Aminokislina -COOH -NH3+ R

Alanin 2.3 9.9Glicin 2.4 9.8Fenilalanin 1.8 9.1Serin 2.1 9.2Valin 2.3 9.6Asparaginska k. 2.0 10.0 3.9Glutaminska k. 2.2 9.7 4.3Histidin 1.8 9.2 6.0 !Cistein 1.8 10.8 8.3Tirosin 2.2 9.1 10.9 !Lizin 2.2 9.2 10.8Arginin 1.8 9.0 12.5

Samo R, N- and C- konci so pomembni pri proteinih

N CR3

Aromatske AK (Phe, Tyr, Trp)• velike

• resonanca: -OH v Tyr bolj ‘kisla’

• polarnost: posebne interakcije (kation – )

• absorbirajo UV svetlobo

D,L-sistem

3D STRUKTURA AK DOLOČA 3D STRUKTURO PROTEINOV

POMEMBNO ZA PREPOZNAVANJE: E-S, E-I, R-H, Ag-Ab

rotacija linearno polarizirane svetlobe

( = [].l.c)

STANDARD!Posebne funkcije!

STANDARD!

Shema sinteze proteinov

Transkripcija(prepis DNAmRNA)nukleotidi v nukleotide

Translacija (prevod mRNAprotein)Nukleotidi v aminokisline

Zorenje mRNAPostranslacijske modifikacije AK (samo evkarionti)

R1-COOH + H2N-R2 ↔ R1-CONH-R2 + H2O

Nastanek peptidne vezi:

pre-mRNA

mRNA

Primarna struktura = sekvenca aminokislin

1 2 3 4 5

Sekvenco lahko določimo neposredno iz proteina ali posredno iz mRNA ali DNA.

PO43-

peptidne vezi

Oštevilčenje od N-konca do C-konca!

Ser Gly Tyr Ala LeuS G Y A L

Post-translacijske modifikacije spremenijo sekvenco, ali odstranijo ‘nezaželene dele proteina, vpeljejo nove

funkcionalne skupine in imajo tudi regulatorno vlogo.

Pomembne modifikacije:

• proteolitično procesiranje = izrezovanje delov proteinske verige

• spremembe N- in C-koncev

• glikozilacija (pripenjanje sladkorjev)

• pripenjanje lipidov

• sulfatiranje

• -karboksi-glutaminska kislina

• hidroksilacija

• fosforilacija

• ADP-ribozilacija

• disulfidni mostički

pripenjanje funkcionalnih skupin

Proteolitično procesiranje: ‘aktivacija’ encimov

Namen: encim postane aktiven tam kjer deluje in ne na mestu sinteze! Značilno predvsem za prebavne encime.

Pripenjanje lipidov: interakcija z membrano, 3D struktura

Pripenjanje malih funkcionalnih skupin vodi v spremembo 3D strukture in aktivnosti

• fosforilacija

• -karboksi-glutamat

• metilacija

• sulfatiranje

• hidroksilacija

Nastanek disulfidne vezi: stabilizacija 3D-strukture

Samosestavljanje polipeptidne verige: od primarne do terciarne (kvartarnarne) strukture

ŠIBKE INTERAKCIJE

• odboj pri dotiku

• van der Waalsove interakcije

• elektrostatske interakcije

• vodikova vez

• hidrofobne interakcije

• ion - interakcije (aromatske AK)

| | | | |

R1-COO- H3N+-R2

CH3-CH2-CH3

CH3-CH2-CH3

Vse te šibke interakcije so med AK radikali, H-vezi pa tudi med –CO in HN- v peptidni vezi.

Peptidna vezR1-COOH + H2N-R2 ↔ R1-CONH-R2 + H2O

Velika večina peptidnih vezi je v trans konfiguraciji.

IZJEMA: v zavojih ob Pro je približno 6% peptidnih vezi cis

Delna dvojna vez, zato 6 atomov v isti ravnini!

Dihedralna kota Φ (fi) in Ψ (psi)

Začetni položaj:

Φ = Ψ = 0 stopinjTa položaj je le teoretičen in v resnici ni mogoč!

desnosučna -vijačnica

C

H

N

O

vodikova vez med AKi in AKi+4

RADIKALI (niso prikazani) MOLIJO VEN!

C=O in N-H, ki sta povezana z vodikovo vezjo, sta udeležena v dveh različnih

peptidnih vezeh 5 AK narazen.

struktura (antiparalelna)

struktura (paralelna)

N-t.

N-t.C-t.

C-t.

Delež sekundarnih struktur je lahko različen / Nagubani list je pogosto zvit in

podprt z vijačnicami.

Povezave verig v nagubanem listu

ANTIPARALELNA PARALELNA

zavoj

β-zavoji

RAZLIKA!

Zanke: Ω zanka je navadno iz 40 do 54 AK (citokrom c)

Ω

Ni nujno, da so vsi deli proteina v eni od teh II. struktur NEUREJENA II. STRUKTURA

TERCIARNA STRUKTURA GLOBULARNIH PROTEINOV

Vsi encimi so globularni proteini.

Pet različnih prikazov terciarne strukture mioglobina.

Fotografija lis na filmu po uklonu rentgenskih žarkov skozi kristal Mb.

Protein moramo najprej očistiti, nato kristalizirati in skozi kristal spustiti rentgenske žarke, ki se na atomih zaradi elektronov uklonijo. Analiza uklonskih slik nam da elektronsko gostoto na določeni globini kristala. Iz tega določijo položaj vsakega atoma v proteinu.

‘Zemljevid’ elektronske gostote proteina z AK ostanki.

Ena podenota encima gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze iz Bacillusa stearothermophilusa.

POZOR: Kombinacija različnih II. struktur. Jasno se vidita dve domeni (ena rdeče in druga zelene barve), ki ju lahko ločimo s prekinitvijo ene vezi v verigi, ki povezuje domeni (glej puščico).

Kvartarna struktura hemoglobina.

ZAKAJ KVARTARNA STRUKTURA?

- VARNOST (Hb: 2+2, 2 različna gena)

- ALOSTERIČNI EFEKTI (regulacija – Hb, alosterični encimi)

- POVEČANA & LOKALIZIRANA KONCENTRACIJA AKTIVNIH MEST (AChE)

- MULTIFUNKCIONALNI PROTEINI:

maščobnokislinska sintetaza: 7 aktivnih mest z različnimi funkcijami:

bakterija

gliva

človek

Voda je integralni del proteinske strukture in pomembno prispeva k njeni stabilnosti.

Zvijanje proteinov preučujemo tako, da jih razvijemo (denaturiramo), nato pa opazujemo ponovno zvijanje.

Denaturanti, pH, T in visok P porušijo strukturo. Proces je lahko reverzibilen.

Zakaj denaturacija:

• toplota (visoka temperatura): neposreden vnos energije

• ekstremni pH: ionizacija le v razvitem stanju (premik ravnotežja); elektrostatski odboji na površini proteina; porušenje ionskih interakcij.

• denaturanti (urea, gvanidinijev klorid): preferenčna vezava – deli proteina se raje vežejo z denaturantom kot med seboj (vpliv na H-vezi in hidrofobne interakcije!)

Prerez skozi 3D energijski profil zvijanja proteina. Nativna struktura ima najmanjšo energijo (prosto entalpijo G), povsem razvit protein pa ima največjo energijo (G) in tudi največjo entropijo (S), ker je ta struktura najbolj neurejena.A POZOR, TOPILO!!!

G=H-TS Gminimalna , Sminimalna

prispevek vezi Prispevek (ne)urejenosti

G

Gmaksimalna , Smaksimalna

Šaperoni pomagajo proteinom pri zvijanju in skušajo ponovno zviti razvite proteine.

Premikanje domen v plašču šaperona pomaga pri zvijanju proteinske verige, ki je v notranjosti.

Konformacijske spremembe omogoča hidroliza ATP.

Nekateri proteini so ‘namerno’ nestabilni (vsaj lokalno); to omogoča:

• konformacijske spremembe

• prilagoditve pri vezavi na druge molekule (interakcije protein - protein in protein -nukleinska kislina)

transkripcijski faktor (P. Wright, Scripps)

Metabolično ‘obračanje’ proteinov:

Proteini ‘živijo’ v celici različno dolgo.

Npr.: razpolovni čas encimov v jetrih je od 0.2 do 150 ur.

Pravilo N-konca: Razpolovni čas proteinov je povezan s strukturo N-terminalne AK:

Za proteine z N-terminalnimi Met, Ser, Ala, Thr, Val ali Gly je razpolovni čas večji od 20 ur.

Za proteine z N-terminalnimi Phe, Leu, Asp, Lys ali Arg je razpolovni čas 3 min ali manj.

Pravilo PEST: proteini, ki imajo veliko Pro (P), Glu (E), Ser (S) ali Thr (T) se hitreje razgradijo kot drugi proteini.

Selektivno razgradnjo proteinov uravnavajo znotrajcelični in zunajcelični signali.

Eden od njih je vezava ubikvitina (majhen protein) na za razgranjo namenjen (predvsem delno razvit) protein. Razgradnja ubikvitiniranih proteinov poteka v proteasomih.

ubikvitin PDB 1TBE

H2N COO

signalna sekvenca

veriga ubikvitinov

Primarna struktura za razgradnjo namenjenega proteina

Veriga 4 ali več ubikvitinov usmeriprotein v razgradnjo.

Proteasom je velik kompleks. Jedro ima 4 obroče (2 α in 2 β), vsak je iz 7 proteinov, znotraj pa je votlina kjer se razgrajujejo ubikvitirani proteini. Po 3 podenote v β obročih so proteolitični encimi.

20 S Proteasom (kvasovka) v zaprtem stanju

dva pogleda PDB 1JD2

• Proteasomi prepoznajo in razgrajujejo poli-ubikvitinirane proteine, ki so celici lastni.

• Nekateri celici lastni proteini se le mono-ubikvitinirajo; ti verjetno doživijo razgradnjo v lizosomih.

• Lizosomi so organeli, ki vsebujejo proteolitične encime (katepsine); namenjeni so razgradnji predvsem izvenceličnih proteinov (v celico pridejo z endocitozo).

• Oba sistema sta potrebna za odstranjevanje ‘izrabljenih’ in napačno zvitih ali razvitih proteinov.

• Okrog 50 % vseh sintetiziranih proteinov se takoj razgradi!

Kontrola kvalitete proteinske sinteze

VSE KAR SMO POVEDALI O ZGRADBI, ZVIJANJU IN RAZGRADNJI PROTEINOV VELJA SEVEDA TUDI ZA ENCIME IN JIM OMOGOČA NJIHOVO DELOVANJE!

encimsko katalizirana reakcija

E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P

nekatalizirana reakcija

S ↔ P substrat produkt

Kako encimi delujejo?

E – encimS – substrat, P – produkt ES – kompleks encim-substratEP – kompleks encim-produkt

POZOR, nista aktivirana kompleksa!

Med katalizo encim E specifično veže substrat S, ga pomaga spremeniti v produkt P, encim pa se nespremenjen odcepi. Tako se lahko ponovno in večkrat uporabi. Med tem procesom se tvori kratko živeči kompleks ES (in drugi kompleksi, npr. EP).

Encimi so bio-katalizatorji, ki zmanjšajo aktivacijsko energijo reakcije

S ↔ P E + S ↔ ES ↔ EP ↔ E + P

ΔGo = ΔGo = - RT ln K

ΔG# < ΔG# v > v

ENCIMI

Encimi so visokospecializirani proteini z veliko katalitično močjo (učinkovitostjo – do 1020) in veliko substratno specifičnostjo.

katalitično mesto je čimbolj komplementarno PS

katalitično mesto lahko loči med funkcionalnimi skupinami

(pro)kiralnih molekul

Za razlikovanje enantiomerov mora imeti encim vsaj tri

specifična mesta za vezavo substrata.

Fischerjev koncept: encim popolnoma (ključ-ključavnica) ustreza substratu, a ... ???

KATALITIČNA MOČ ENCIMOVAktivno mesto encimov predstavlja le majhen predel proteinske strukture. Encimi so veliki, da lahko vzdržujejo primerno konformacijo na katero se lahko z dovolj veliko vezavno energijo veže substrat v prehodnem stanju (PS). Substrat/encim se z vezavo inducirano prilagodita drug drugemu (induced fit).

Znižanje aktivacijske proste entalpije za 5,7 kJ/mol zadošča za 10x povečanje hitrosti.

Šibke interakcije: vodikove, elektrostatske, hidrofobne, van der Waalsove interakcije.

*

* - substrat v PS

*

Peptidaza veže substrat (dipeptid) s tremi šibkimi vezmi, vsili substratu novo konformacijo, kar destabilizira peptidno vez

(prehodno stanje!)ENCIM

SUBSTRAT (S1)

VODA (S2)

S1 + S2 P1 + P2

Koshlandov koncept: encim le delno ustreza substratu, a se oba prilagodita – pri tem encim vsili substratu konformacijo prehodnega stanja v kateri se ta najbolje veže na encim in se zaradi tega laže (in tudi hitreje) pretvori v produkt!

Struktura tripsina

Ser 1952451 7

His 57 Asp 102

Katalitična triada

Namen: ‘aktivacija’ Ser (OH)

V aktivnem mestu pridejo zaradi III. strukture skupaj AK, ki so navadno v I.strukturi med seboj precej oddaljene.

N C

KATALITIČNA MOČ ENCIMOVRazlične oblike katalize potekajo s funkcionalnimi skupinami aminokislinskih radikalov, pri tem pa lahko sodelujejo tudi različni kofaktorji (kovinski ioni, koencimi ali prostetične skupine). Aktivni encim s kofaktorjem imenujemo holoencim, sam neaktiven proteinski del pa apoencim (ali apoprotein).

HOLOENCIM = APOENCIM + KOFAKTOR ALI KOENCIM aktiven encim proteinski del neproteinski del molekule

KOENCIMI PROSTETIČNE SKUPINE

• Se sprehajajo med encimi in nanje niso trajno vezani

• Na enem E sprejmejo neko skupino ali molekulo, na drugem jo oddajo

• Tako povezujejo različne encime v kompleksne večstopenjske procese in prenašajo skupine ali molekule med različnimi substrati

• So trajno vezani na določen encim, ki ga nikoli ne zapustijo

• Na istem E sprejmejo neko skupino ali molekulo od enega S in jo oddajo drugemu S

• Tudi povezujejo večstopenjske procese, a običajno sodelujejo z omejenim številom substratov

A-x

A CoE-x

CoE

B

B-x

E1E2

A-x

A

PSk

B

B-xE

PSk-xE

Kofaktorji so lahko tudi le ustrezni kovinski ioni (cink, magnezij, baker itd)

KOFAKTORJI

x = skupina, ki se prenaša

KOENCIMI IN PROSTETIČNE SKUPINE (nastanejo iz vitaminov), ZAGOTOVIJO DODATNE FUNKCIONALNE SKUPINE

PREKURZOR (VITAMIN) SKUPINA PRENOSA KOENCIM/PROST. SK.

tiamin (vitamin B1) aldehidna skupina tiamin pirofosfat

riboflavin (vitamin B2) elektroni in protoni flavin mononukleotid FMN, FAD

nikotinska kislina (niacin)

hidridni ion (H-) nikotinamid adenin dinukleotid NAD

pantotenska kislina in druge molekule

acilne skupine koencim A

piridoksin (vitamin B6) amino skupine piridoksal fosfat

vitamin B12 H-atomi in alkilne skupine (ciano)kobalamin

biotin CO2 (-COOH) biocitin

folna kislina skupine z enim C-atomom tetrahidrofolna kislina

lipojska kislina elektroni in acilne skupine lipojska kislina

6. Tetrahydro folate

2. predavanje

termodinamske in kinetične osnove katalizeencimska katalizačasovni potek encimske reakcijezačetna hitrost