UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO – MATEMATIĈKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Marija J. Jovanović

Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima

Micromeria juliana L. (Benth.)

MASTER RAD

Niš, 2014.

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO – MATEMATIĈKI FAKULTET

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima

Micromeria juliana L. (Benth.)

Master rad

Kandidat: Mentor:

Marija J. Jovanović Dr Dragana D. Stojiĉić, vanredni profesor

Br. indeksa: 56

Niš, 2014.

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

Axillary bud induction on nodal explants Micromeria juliana L.

(Benth.)

Master thesis

Candidate: Mentor:

Marija J. Jovanović Dr Dragana D. Stojiĉić, associate professor

No. of index: 56

Niš, 2014.

Zahvaljujem se svojoj mentorki prof. dr Dragani Stojičić na izboru teme,

ukazanoj pomoći, savetima, podršci i strpljenju pri izradi ovog master rada.

Takođe se zahvaljujem i asistentkinji Svetlani Tošić na pruženoj pomoći pri izradi

eksperimentalnog dela ovog rada. Ovaj master rad je rađen u okviru doktorske

disertacije asistenta Svetlane Tošić i sadrži još uvek nepublikovane rezultate.

Najveću zahvalnost dugujem svojoj porodici, Nikoli i svojim prijateljima na

podršci, pomoći, ljubavi i razumevanju.

Hvala Vam što ste uvek uz mene!

SADRŢAJ:

SAŽETAK ………...…………………………………………………………………………….. 1

1. UVOD ………………………………………………………………………………………… 3

1.1. Opšte karakteristike familije Lamiaceae …………….………………………….……… 4

1.1.1. Rod Micromeria …………………………………….…………………………….. 5

1.1.2. Micromeria juliana (L.) Benth. ex Rchb. …….……………………………...……. 6

1.2. Kultura in vitro ……....……………………….………………………….....…………... 8

1.2.1. Mikropropagacija ……………………………………………….…………..….… 10

2. CILJ RADA ……………………………………………………………………………….… 13

3. MATERIJAL I METODE …………………………………….....………………………… 15

3.1. Biljni materijal …….……...…………………………………………………………… 16

3.2. Hranljiva podloga MS …….………………………………………………….……….. 16

3.2.1. Hranljiva podloga za indukciju aksilarnih pupoljaka M. juliana ………….…….. 18

3.3. Metode sterilizacije ………………………….……………………………………...…. 19

3.3.1. Sterilizacija biljnog materijala ………………………………………………….... 20

3.3.2. Sterilizacija hranljivih podloga …………………………………………………... 21

3.3.3. Sterilizacija instrumenata i prostora ……………………………………………... 22

3.4. Merenje sveţe i suve mase biljaka ………………………………………………..….. 22

3.5. Statistiĉka analiza ………………………….……………………………………......… 22

4. REZULTATI …………………………………………………………………………......…. 23

4.1. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. juliana .......................... 24

4.2. Uticaj razliĉitih tretmana na masu biljaka M. juliana .................................................... 34

5. DISKUSIJA ............................................................................................................................. 35

6. ZAKLJUČAK ......................................................................................................................... 38

7. LITERATURA ........................................................................................................................ 40

8. BIOGRAFIJA KANDIDATA ............................................................................................... 44

SKRAĆENICE:

BA – 6 – benzil – aminopurin

IAA – indol – 3 – sirćetna kiselina

1

SAŽETAK

Micromeria juliana L. (Benth.) ex Rchb. je aromatiĉna biljka koja pripada porodici

Lamiaceae. Veoma je efikasna u leĉenju mnogih bolesti i tegoba. U ovom radu su definisani

uslovi pri kojima dolazi do indukcije pupoljaka M. juliana, njihovog izduţivanja, kao i uticaj

razliĉitih tretmana na produkciju biomase. Korišćene su razliĉite kombinacije regulatora rastenja,

citokinina (BA) i auksina (IAA) na MS hranljivoj podlozi. Najveći broj pupoljaka formirao se na

eksplantatima koji su gajeni na podlozi sa 3 µM BA i 0,57 µM IAA. Na istoj podlozi je

zabeleţena i najveća sveţa masa biljaka M. juliana. Najveću duţinu imali su pupoljci na

eksplantatima gajenim na podlozi sa 0,57 µM IAA, dok su najveću suvu masu imali eksplantati

gajeni na podlozi sa 10 µM BA i 0,57 µM IAA.

Ključne reči: Micromeria juliana, aksilarni pupoljci, benzil – aminopurin, indol – sirćetna

kiselina

2

ABSTRAKT

Micromeria juliana L. (Benth.) ex Rchb. is an aromatic plant that belongs to the family

Lamiaceae. It is very effective in treating many diseases and ailments. This work defines the

conditions which cause the induction of buds M. juliana, their elongation, and the influence of

different treatments on biomass production. Different combinations of plant growth regulators,

cytokinins (BA) and auxin (IAA) were used on MS medium. The highest number of buds was

formed on the explants that were cultured on medium with 3 μM BA and 0,57 μM IAA. The

highest fresh weight of plants M. juliana was registered on the same medium. A maximum length

had buds on explants that were grown on medium with 0,57 μM IAA, while the highest dry

weight had explants on medium containing 10 μM BA and 0,57 μM IAA.

Keywords: Micromeria juliana, axillary buds, benzyl - aminopurine, indole - acetic acid

3

1. UVOD

4

1.1. Opšte karakteristike familije Lamiaceae

Familija usnatica (Lamiaceae) obuhvata veoma vaţnu i brojnu grupu biljaka.

Predstavljena je sa 200 rodova i oko 3500 vrsta. Najveće bogatstvo rodova i vrsta je u

Mediteranu, Maloj i centralnoj Aziji. U flori Balkanskog poluostrva familija je predstavljena sa

371 vrstom, od ĉega su 84 vrste Balkanski endemiti. U Srbiji je zastupljena sa 147 vrsta u okviru

30 rodova. Od svih familija, Lamiaceae zauzimaju drugo mesto po broju vrsta u ovom delu

Evrope. Predstavnici familije Lamiaceae su kosmopolitske vrste koje naseljavaju suva i dobro

osunĉana mesta – livade, pašnjake, kamenjare. Poznate su i korovske kao i rudimentarne vrste.

Biljke familije Lamiaceae su jednogodišnje i višegodišnje zeljaste biljke, poluţbunovi ili

ţbunovi, retko drveće. Stablo im je ĉetvorougaonog oblika, listovi su prosti, naspramnog

rasporeda, bez zalistaka. Cvetovi imaju karakteristiĉnu graĊu i zigomorfne su simetrije. Ĉašica se

sastoji od pet sraslih listića, cevasta je, kod nekih predstavnika ĉak dvousnata. Krunica je

sastavljena od pet listića, koji su u donjem delu srasli u cev, dok je gornji deo razdvojen na dva

dela: gornju usnu, koju ĉine dva kruniĉna listića i donju usnu, sastavljenu od tri kruniĉna listića.

Andreceum se sastoji od 4 prašnika, od kojih su dva duţa a dva kraća, dok se kod nekih rodova

nalaze samo dva prašnika (Salvia, Rosmarinus). Tuĉak je izgraĊen od dve karpele. Plodnik je

nadcvetan, dvook, sa po jednim semenim zametkom u svakom okcu. Cvetovi su sakupljeni u

manje cimozne cvasti. Plod je merikarpijum koji se raspada na ĉetiri jednosemena plodića (Tatić

B., Bleĉić V. 2002).

Cvetna formula: K(5) [ C(5) A(4,2) ] G(2)

Lamiaceae imaju karakteristiĉan miris jer sadrţe etarska ulja (aromatiĉni alkoholi, fenoli,

terpeni, ketoni, aldehidi itd.). Etarska ulja su smeštena u ţlezdanim dlakama na površini lista i

drugih organa. Etarska ulja se koriste u medicini, farmaciji, kozmetiĉkoj industriji a neke vrste se

koriste i kao zaĉinske biljke. Najpoznatiji predstavnici familije su: majĉina dušica, nana,

ruzmarin, ţalfija, lavanda, origano, matiĉnjak, mrtva kopriva, bosiljak, rtanjski ĉaj, srdaĉica,

trava iva i mnogi drugi.

5

1.1.1. Rod Micromeria

U starijoj literaturi postojale su brojne nedoumice u pogledu taksonomije i nomenklature

Micromeria vrsta, što potvrĊuje i postojanje velikog broja sinonima za pojedine vrste. Neke su

svrstane u rod Thymus, Satureja, Calamintha, Melissa idr. (Kalogjera i Vladimir, 1992).

Prvi put rod Micromeria opisuje Bentham 1829. godine. Rod sadrţi 130 vrsta koje su

najvećim delom rasprostranjene u mediteranskoj i makaronezijskoj regiji (Morales, 1991). Prema

Brӓuchler et al. (2008), rod Micromeria se prostire od mediteransko – makaronezijske regije, sve

do juţne Afrike, Indije i Kine (Slika 1.). U flori Srbije i Crne Gore rod je predstavljen sa 10 vrsta,

od kojih su 7 endemiĉne (Šilić, 1979).

Slika 1. Rasprostranjenost roda Micromeria u svetu (Brӓuchler, 2008)

6

Boissier (1879) deli rod Micromeria u tri sekcije:

Pseudomelissa (M. thymifolia, M. albanica, M. pulegium, M. dalmatica)

Eumicromeria (M. croatica, M. juliana, M. cristata, M. parviflora)

Cymularia

Nedavne molekularne analize su pokazale da je rod Micromeria polifilan, tako da su

ĉlanovi sekcije Pseudomelisa blisko srodni rodu Clinopodium, pa su vrste iz ove sekcije

prebaĉene u rod Clinopodium, gde i spadaju zbog morfoloških karakteristika (Arabaci et al.,

2010). Micromeria juliana, koja je korišćena u ovom radu pripada sekciji Eumicromeria.

1.1.2. Micromeria juliana (L.) Benth. ex Rchb.

Carstvo: Plantae

Razdeo: Magnoliophyta

Klasa: Magnoliopsida

Red: Lamiales

Familija: Lamiaceae (Labiatae)

Rod: Micromeria

Slika 2: Micromeria juliana (L.) Benth. ex Rchb.

7

Morfologija i biologija: Micromeria juliana (Sinonimi: Clinopodium julianum,

Micromeria minoa, Sabbatia corymbosa, Satureja juliana, Satureja spicata) je višegodišnja

zeljasta biljka (Slika 2). Ima formu listopadnog ţbuna visine 10 – 40 cm, ĉesto manji, dlakavi, sa

mnogo stabljika. Listovi su usko ovalnog oblika, naspramnog rasporeda. Cvetovi su ljubiĉaste

boje udruţeni u cvasti. Koren i izdanci pri dnu su odrvenjeni. Cveta od maja do jula.

Stanište: Ovoj vrsti odgovaraju suva, svetla (pešĉana) zemljišta. Naseljava i kamenjare i

pukotine kreĉnjaĉkih stena mediteranskog i submediteranskog pojasa. Javlja se u rasponu od 0 do

oko 800 (1000) m nadmorske visine. Raste na kiselim, neutralnim i baznim zemljištima. Moţe da

raste na nutritivno siromašnom zemljištu. Ne moţe da raste u senci. Populacije su sa malim

brojem jedinki.

Distribucija: Rasprostranjena je u Hrvatskoj, Hercegovini, Crnoj Gori, Kosmetu,

Makedoniji, jugoistoĉnoj Francuskoj, Portugaliji, Italiji, Albaniji, Grĉkoj, Bugarskoj, Turskoj

(Palić, 2009) kao i u severozapadnoj Africi, u zapadnom delu Male Azije i na Kritu.

Terapeutska upotreba: Micromeria juliana je veoma korisna biljka u leĉenju mnogih

bolesti i tegoba. Nadzemni deo biljke ima diuretiĉka svojstva. Veoma je efikasna u leĉenju

kamena u bubregu i bešici, kao deo biljnih mešavina ili samostalno. Ekstrakt biljke se koristi kod

upale ţeluca, peptiĉkog ulkusa, prehlade i muĉnine prilikom putovanja. TakoĊe pomaţe u varenju

neutrališući gasove, pojaĉava znojenje i dobar je ekspektorans. Koncentrovani ekstrakt biljke se

koristi kao laksativ. Moţe da se koristi i kao zaĉin.

Micromeria juliana spade u ugroţene biljne vrste. Pored ograniĉene distribucije i malog

broja jedinki ugroţavaju je i ispaše i gaţenje ţivotinja pored urbanih mesta, kao i poţari, nastali

prirodnim putem ili antropogeno.

8

1.2. Kultura in vitro

Kultura biljnog tkiva predstavlja dobijanje novih individua u laboratorijskim uslovima in

vitro. Iz vegetativnih delova biljaka uzetih iz spoljašnje sredine, u sterilnim uslovima, na

hranljivim podlogama u laboratoriji, mogu se proizvesti nove jedinke, i one se kasnije mogu

vratiti na prirodna staništa. Deo biljke koji se uvodi u kulturu, bez obzira od kojeg se tkiva

sastoji, naziva se eksplantat. Kultura in vitro je od velikog znaĉaja jer proizvodnjom velikog

broja biljaka i njihovim vraćanjem u prirodna staništa moţe da se spreĉi potpuno išĉezavanje

ugroţenih i retkih biljaka, zaštitom i obnavljanjem njihovog genofonda. TakoĊe, kultura in vitro

daje znatan doprinos farmaciji, šumarstvu i hortikulturi, gde je mnogo manji pritisak na biljke u

prirodi koje se koriste u ovim oblastima.

Dve osobine biljnih ćelija su kljuĉne za in vitro umnoţavanje biljaka:

totipotentnost – sposobnost biljnih ćelija da se in vitro diferenciraju, dele i regenerišu

pojedine organe, pa ĉak i celu biljku i

plastičnost – sposobnost biljke da menja svoj program rastenja, metabolizma i razvića u

zavisnosti od uslova i signala iz spoljašnje sredine.

Postoje razliĉiti pristupi u klasifikaciji tehnika kulture biljaka in vitro (Vinterhalter i

Vinterhalter, 1996, Nešković et al. 2003). One se mogu podeliti prema:

1. tipu eksplantata koji se uvodi u kulturu (ćelije, organa, tkiva)

a) kultura kalusa – agregati ćelija nastali kao posledica neorganizovanog rastenja biljnih

organa ili kultivisanih ćelija

b) kultura ćelija u suspenziji – populacija ćelija i malih ćelijskih agregata u teĉnoj

podlozi

c) kultura pojedinačnih ćelija – postiţe se izolacijom ćelija iz kalusa ili kulture ćelija u

suspenziji, enzimskim ili mehaniĉkim izdvajanjem

9

d) kultura protoplasta – kultura ćelija kojima je enzimskim putem odstranjen ćelijski zid,

a protoplasti su ostali oĉuvani i ţivi

e) kultura semena – iz semena se dobijaju zdravi klijanci; koristi se za povećanje

efikasnosti klijanja kod vrsta koje teško klijaju

f) kultura embriona – zigotskih i somatskih, omogućava prevazilaţenje dormancije i

skraćivanje ciklusa gajenja biljaka

g) kultura meristema – koriste se meristemi sa vrha korena i stabla, pogodna su za

gajenje in vitro jer su bez virusnih infekcija

h) kultura korena

2. prema nameni:

a) mikropropagacija – umnoţavanje izolovanih vrhova apikalnih i aksilarnih pupoljaka,

koji obuhvataju meristeme vrha stabla ili one koji su formirani u pazuhu lisnih

primordija (mikropropagacija u uţem smislu),

b) organogeneza – obrazovanje pupoljaka i korenova de novo

c) kultura haploida – haploidne ćelije muškog (androgeneza) i ţenskog gametofita

(ginogeneza) mogu da se u odreĊenim uslovima razviju u biljni organizam bez

oploĊenja,

d) somatka embriogeneza – tehnika u kojoj embrioni nastaju od somatskih ćelija

e) somaklonalno variranje – nastanak nove nasledne varijabilnosti pod dejstvom faktora

kulture in vitro

f) genetička manipulacija – molekularno – genetiĉki metod kojim se genetiĉki materijal

prenosi iz ćelija ili protoplasta na ćeliju ili protoplast in vitro, bez generativne faze i

polnog ciklusa (somatska hibrdizacija, citoplazmatska hibridizacija, genetiĉka

transformacija).

10

Navedene metode razmnoţavanja se ĉesto mogu kombinovati, što znaĉi da kulture

dobijene jednom metodom mogu kasnije da se gaje primenom neke druge.

1.2.1. Mikropropagacija

Već je pomenuto da neki autori (Vinterhalter i Vinterhalter, 1996, Nešković et al. 2003)

termin mikropropagacija u “uţem smislu” ili samo mikropropagacija koriste za kulturu aksilarnih

i apikalnih pupoljaka, dok pod terminom mikropropagacija u “širem smislu” podrazumevaju bilo

koji postupak metode kulture in vitro koji obezbeĊuje klonsko razmnoţavanje biljaka.

Mikropropagacija je od velike vaţnosti jer se koristi za razmnoţavanje endemiĉnih i

retkih biljaka spreĉavajući da potpuno išĉeznu, zatim za razmnoţavanje ugroţenih i ukrasnih

biljaka, lekovitih biljaka, radi obezbeĊivanja sirovina za industrijsku proizvodnju. Veliki znaĉaj

mikropropagacija ima i u suzbijanju i eliminaciji biljnih virusa meĊu biljkama, koristeći

meristeme kao eksplantate u kojima se ne nalaze virusi. TakoĊe daje rezultate koji su od velikog

znaĉaja za poljoprivredu, hortikulturu i šumarstvo.

Tokom razvoja kulture in vitro postojale su razliĉite podele procesa mikropropagacije.

MeĊutim, podela koja je najprihvatljivija, i koja se danas najviše koristi jeste podela koju su dali

Debergh i Maene (1981). U ovoj podeli mikropropagacija se deli na 4 faze koje su obeleţene

brojevima od 0 do 4.

Faza 0 je dobila naziv “nulta” po tome što u stvari ne predstavlja fazu samog

razmnoţavanja, već se u ovoj fazi vrši izbor majke biljke i njena priprema, odnosno obuhvata sve

postupke pre uvoĊenja biljke u kulturu in vitro.

Faza 1 predstavlja prvu fazu klonskog razmnoţavanja. Obuhvata uspostavljanje aseptiĉne

kulture, što se odnosi na sterilnu izolaciju eksplantata, sterilizaciju prostora, pribora i posuĊa, kao

i pripremanje i sterilizaciju hranljivih podloga.

11

Faza 2 je faza u kojoj se umnoţavaju klonirane biljke, koje bi kada se odvoje od kulture

bile sposobne da nastave svoj rast i daju kompletnu biljku. Uovoj fazi se obavezno koriste biljni

regulatori rastenja (citokinini, auksini, giberelini…).

Faza 3 podrazumeva obavljanje neophodnih koraka za osposobljavanje biljaka za

individualni rast, fotosintezu i preţivljavanje bez dodataka ugljenih hidrata – priprema za rast u

prirodnom okruţenju. To podrazumeva indukciju korenova in vitro pre prebacivanja u zemlju.

Faza 4 predstavlja pripremu i prenos biljaka iz in vitro u uslove spoljašnje sredine (ex

vitro). Ova faza je veoma znaĉajna zato što prenos biljaka u spoljašnju sredinu predstavlja

fiziološki stres, koji neke biljke ne mogu da pravaziĊu, jer su u in vitro uslovima imale sve

potrebne hranljive materije, optimalnu temperaturu, visoku vlaţnost i zaštitu od mikroorganizama

u sterilnim uslovima.

Prednosti vegetativnog razmnoţavanja u uslovima in vitro:

- In vitro razmnoţavanje moţe biti mnogo brţe od in vivo razmnoţavanja;

- Moguće je razmnoţavanje biljaka ĉije umnoţavanje nije moguće u in vivo uslovima;

- Mikroklonirane biljke ĉesto rastu bolje i brţe od biljaka koje rastu u in vivo uslovima jer

su osloboĊene od patogena i infekcija bakterijama i gljivama;

- U kulturi in vitro se razmnoţavaju samo zdrave biljke;

- Vegetativno razmnoţavanje u uslovima in vitro moţe poĉeti sa vrlo malo biljnog

materijala kao poĉetnog eksplantata;

- Zahvaljujući kontrolisanim uslovima moguće je vremenski predvideti proizvodnju

odreĊenih kultura;

- Veliki znaĉaj ovaj vid razmnoţavanja našao je u ex situ zaštiti ugroţenih i retkih biljnih

vrsta.

Nedostaci vegetativnog razmnoţavanja u uslovima in vitro:

- U nekim kulturama koje se razmnoţavaju na ovaj naĉin genetiĉka stabilnost je niska;

12

- Kod drvenastih vrsta teško je indukovati formiranje korenovog sistema in vitro;

- Prenos biljaka iz uslova in vitro u uslove in vivo nekada je jako teţak i mukotrpan posao;

- Regenerativna sposobnost se moţe izgubiti nakon nekoliko subkultura kalusnog tkiva;

- U nekim sluĉajevima sterilizacija eksplantata koji se uvode u kulturu in vitro je izuzetno

teška.

13

2. CILJ RADA

14

Cilj ovog rada:

Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima M. juliana i ispitivanje uticaja

razliĉitih kombinacija regulatora rastenja na rastenje i izduţivanje aksilarnih pupoljaka

Ispitivanje uticaja nutritivnih podloga na produkciju biomase eksplantata M. juliana

Statistiĉka obrada dobijenih rezultata

IzvoĊenje zakljuĉaka i tumaĉenje rezultata u skladu sa postojećim podacima iz literature

15

3. MATERIJAL I METODE

16

3.1. Biljni materijal

Postoje dve vrste biljnog materijala koje mogu da se koriste za in vitro izolaciju: biljke

koje se gaje u kontrolisanim uslovima (u staklari) i biljni materijal sakupljen u prirodi. Ako se

eksplantat izoluje iz biljke koja je rasla u prirodi postoji veća verovatnoća da će doći do infekcije

pa je neophodna ozbiljnija sterilizacija tkiva. Izuzetak ĉine tkiva koja se izoluju iz unutrašnjosti

biljnih organa, kao na primer iz kambijalne zone nekog ţbuna ili drveta, ili iz organa rezervoara

hrane kao što su pupoljci, krtole idr. (Marić, 1995).

Biljke Micromeria juliana iz prirodnog staništa iz kanjona Moraĉe (Crna Gora) donete su

i sa njih su prikupljena semena. Semena su in vitro isklijala, biljke dobijene na ovaj naĉin bile su

upotrebljene za uspostavljanje kulture aksilarnih pupoljaka (nepublikovani materijal, D. Stojiĉić,

S. Tošić). Biljke dobijene na ovaj naĉin su izdeljene na nodalne eksplantate. Vršni pupoljak nije

korišćen kao eksplantat. Nodalni eksplantati su postavljani na hranljivu podlogu MS (Murashige i

Skoog, 1962) sa razliĉitim kombinacijama regulatora rastenja – citokinina (BA) i auksina (IAA).

3.2. Hranljiva podloga MS

Hranljiva podloga (medijum) predstavlja smešu agara, šećera, mineralnih soli, vitamina,

inozitola, aminokiselina, kofaktora i hormona. Priprema se kuvanjem i steriliše autoklaviranjem

pre ili posle razlivanja u posude za kultivaciju in vitro. Hranljive podloge mogu biti teĉne i

ĉvrste. Teĉne sadrţe sve navedene komponente osim agara (Vinterhalter i Vinterhalter, 1996).

Hranljiva podloga koja je korišćena u ovom radu je MS podloga. Doterivanje pH podloge

je uraĊeno sa 1N NaOH, i podešena vrednost treba da iznosi 5,8. Treba imati u vidu da tokom

autoklaviranja pH podloge opadne za oko 0,5 pH jedinica, pa ako se spusti ispod vrednosti 5,0

postoji mogućnost da se podloga nakon autoklaviranja ne stegne. Kasnije, pH podloge menja i

sama biljka koja raste na njoj. pH vrednost podloge se najĉešće proverava indikator papirom

(Merck pH 5,4 – 7,0), mada je pravilnije da se odreĊuje pH – metrom.

17

Sastav MS podloge prikazuje Tabela 1. Sve prikazane teţine koriste se za pripremanje

jednog litra hranljive podloge.

Makro mineralne soli MS (mg/l)

KNO3 1900

NH4NO3 1650

CaCl2 x 2H2O 440

MgSO4 x 7H2O 370

KH2PO4 170

Mikro mineralne soli MS (mg/l)

MnSO4 x 4H2O 22.3

ZnSO4 x 7H2O 8.6

H3BO3 6.2

KJ 0.83

NaMoO4 x 2H2O 0.25

CuSO4 x 5H2O 0.025

CoCl2 x 6H2O 0.025

FeSO4 x 7H2O 27.8

Na2EDTA 37.2

Organski dodaci MS (mg/l)

vitamin B1 0.4

vitamin B6 0.5

nikotinska kiselina 0.5

glicin 2.0

(g/l)

mioinozitol 0.1

saharoza 30.0

agar 7.0

Tabela 1. Sastav MS hranljive podloge

18

3.2.1. Hranljiva podloga za indukciju aksilarnih pupoljaka Micromeria juliana

Za indukciju aksilarnih pupoljaka na eksplantatima M. juliana korišćena je MS podloga sa

razliĉitim kombinacijama regulatora rastenja. MS podloga bez regulatora rastenja je sluţila kao

kontrola. TakoĊe, korišćena je i MS podloga sa indol – sirćetnom kiselinom kao kontrola 2.

Citokinin BA je korišćen u koncentracijama 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 10 i 30 µM, a auksin indol –

sirćetna kiselina u koncentraciji 0.57 µM. Korišćene kombinacije regulatora rastenja prikazane su

u Tabeli 2.

Podloga BA (µM) IAA (µM)

1 0 0

2 0 0.57

3 0.1 0.57

4 0.3 0.57

5 1.0 0.57

6 3.0 0.57

7 10.0 0.57

8 30.0 0.57

Tabela 2. Hranljive podloge za indukciju aksilarnih pupoljaka M. juliana

Nakon pripreme, hranljive podloge su razlivene u staklene teglice, po tri teglice za svaku

kombinaciju biljnih hormona, kao i za kontrole. U svakoj teglici postavljeno je po 10 nodalnih

eksplantata, ukupno 30 za svaku kombinaciju. Eksplantati su bili pribliţno iste veliĉine.

Postavljeni su uspravno, donjim delom uronjeni u podlogu. Eksplantati su gajeni u kulturi 28

dana, na temperaturi od 21 ± 2 °C i fotoperiodu od 16 sati svetlosti i 8 sati mraka. Nakon 28 dana

utvrĊen je broj pupoljaka, njihova duţina, izmerena je sveţa masa biljaka, a nakon sušenja

(nekoliko dana na sobnoj temperaturi) i njihova suva masa. Dobijeni podaci su obraĊeni

statistiĉki.

19

3.3. Metode sterilizacije

Sterilizacija je postupak kojim se kompletno odstranjuju ili uništavaju svi oblici

mikroorganizama. Metode sterilizacije se dele na fiziĉke i hemijske.

Fizičke metode sterilizacije obuhvataju sterilizaciju toplotom, zraĉenjem i mehaniĉku

sterilizaciju (filtriranje). Sterilizacija toplotom moţe biti:

Sterilizacija suvom toplotom:

Opaljivanje na plamenu – koristi se za sterilizaciju metalnog i staklenog pribora. Na ovaj naĉin

sterilišu se pincete, špatule, makaze, otvori epruveta, itd.

Toplim vazduhom – ovaj vid sterilizacije vrši se upotrebom suvog sterilizatora (princip metode

će biti opisan u odeljku 3.3.3. sterilizacija instrumenata).

Sterilizacija vlaţnom toplotom:

Kuvanjem – Ovaj vid sterilizacije danas je u velikoj meri prevaziĊen, ali se moţe upotrebljavati

za sterilizaciju gumenih creva i sliĉnog pribora. Sterilizacija se vrši na 100 °C tokom 15 minuta.

Vodenom parom pod pritiskom – Sterilizacija vlaţnom toplotom pod pritiskom podrazumeva

upotrebu autoklava (detaljnije u odeljku 3.3.2.).

Vodenom parom bez pritiska – Sterilizacija vlaţnom toplotom bez pritiska podrazumeva

upotrebu Kohovog lonca i vodenog kupatila, a sama sterilizacija oznaĉena je kao tindalizacija ili

frakciona sterilizacija.

Radijacija (zraĉenje)

Ultravioletnim (UV) zracima – Ovaj vid sterilizacije podrazumeva upotrebu svetlosti malih

talasnih duţina (250-300 nm), što se ostvaruje upotrebom UV lampi. Na ovaj naĉin sterilišu se

radne površine i vazduh u laboratorijama.

20

Jonizujuće zračenje (X zraci, zraci) – Dejstvom zraĉenja vrši se jonizacija, stvaraju se

peroksidi i na taj naĉin uništavaju mikroorganizmi.

Mehaniĉke metode – filtracija

Metodom filtracije se odstranjuju bakterije iz teĉnosti uz pomoć filtera na kojima se nalaze pore

veliĉine od jednog do nekoliko mikrona. Filtracija se obavlja primenom pozitivnog pritiska iznad

teĉnosti ili negativnog (upotrebom vakuuma). Postoji više vrsta filtera: Seitz-ov filter,

Chamberland-ov filter, Berkefeld-ov filter i membranski filteri.

MeĊu hemijskim sredstavima koja se primenjuju za sterilizaciju treba spomenuti etilen –

oksid, koji se koristi samo u te svrhe, dok se ostala hemijska sredstva primenjuju prvenstveno za

dezinfekciju.

U kulturi in vitro postoje 4 izvora infekcija: biljka, hranljiva podloga (nedovoljno

sterilisana), vazduh i istraţivaĉ (neprecizan rad) (Marić,1995).

3.3.1. Sterilizacija biljnog materijala

Procedura sterilizacije eksplantata, kao prva faza mikropropagacije je veoma vaţna za

uspešnost organogeneze, posebno ako se poĉetni eksplantati uzimaju iz prirode. Biljni materijal

treba da bude dobro sterilisan pre njegove izolacije in vitro, jer je upravo biljni materijal najĉešće

glavni uzrok infekcije u kulturi.

Sterilizacija semena je spoljašnja, zapoĉinje potapanjem semena u 70% alkohol u trajanju

od nekoliko sekundi (96% alkohol je jak i izaziva izuzetno veliku dehidrataciju). Zatim se

semena prenose u 25% - ni rastvor varikine (komercijalni naziv natrijum hipohlorita - NaOCl sa

60 g aktivnog hlora/l) u trajanju od 25 minuta. Nakon toga se semena isperu tri puta sterilnom

destilovanom vodom, i u sterilnim uslovima se prenose na hranljive podloge uz pomoć sterilnih

instrumenata. Iz sterilnih semena razvijaju se sterilne biljke sa kojih se uzimaju nodalni

eksplantati.

21

Ukoliko se i nakon primenjene sterilizacije biljnog materijala, kasnije javi infekcija neki

od uzroka su:

- tzv. unutrašnje infekcije ĉiji su uzroĉnici mikroorganizmi u samoj biljci i ne mogu se

ukloniti spoljašnjom sterilizacijom. Rešenje u ovakvim sluĉajevima je kultura meristema,

jer većina mikroorganizama ne naseljava meristeme, kao i dodavanje antibiotika

hranljivoj podlozi

- neprecizan rad (neoprane ruke, nesterilisana površina stola, nesterilni instrumenti …)

- alkohol u koji se uranjaju instrumenti pred opaljivanje je zagaĊen

- hranljive podloge se ne ĉuvaju u sterilnim uslovima

- nije sterilna prostorija u kojoj je laminarna komora

- suviše ljudi ulazi u inokulacionu prostoriju, i na taj naĉin inficiraju pod i vazduh.

3.3.2. Sterilizacija hranljivih podloga

Sterilizacija hranljivih podloga vrši se vodenom parom pod pritiskom, odnosno u

autoklavu. Za hranljive podloge autoklaviranje poĉinje kada pritisak dostigne vrednost 0,67 bara

(odnosno 0,067 MPa, što priblizno iznosi 0,8 atm) i temperaturu od 114 – 115 °C. Na ovoj

temperaturi hranljive podloge se sterilišu 20 do 25 minuta. Ukoliko se autoklaviraju na

temperaturi od 121°C, vreme sterilizacije se skraćuje i iznosi 15 do 20 minuta (Vinterhalter i

Vinterhalter, 1996).

Podloge za potrebe ovog eksperimenta sterilisane su na temperatri od 120 °C u trajanju od

30 minuta. Po završetku sterilizacije, efikasnost autoklaviranja se proverava specijalnom trakom

osetljivom na temperaturu. Ukoliko posude sa podlogom sadrţe više od 50 ml podloge, vreme

autoklaviranja bi trebalo malo produţiti.

22

3.3.3. Sterilizacija instrumenata i prostora

Instrumenti (pincete, skalpeli...) se sterilišu iskuvavanjem u destilovanoj vodi 30 minuta.

Nakon iskuvavanja prebacuju se u alkohol, a neposredno pre upotrebe se sterilišu i opaljivanjem

na plamenu špiritusne lampe. Instrumenti se mogu sterilisati i u suvom sterilizatoru na

temperaturi od 160 do 180°C, u trajanju od 1 do 2 sata. U suvom sterilizatoru se mogu sterilisati i

predmeti od stakla i porculana. Pre sterilizacije u suvom sterilizatoru objekti moraju biti stavljeni

u metalne kutije ili zavijeni u hartiju, kako nakon sterilizacije ne bi došlo do kontaminacije.

Radna prostorija i površine se sterilišu UV lampama, najmanje dva sata pre poĉetka rada.

Radne površine se takoĊe dezinfikuju alkoholom.

3.4. Merenje sveže i suve mase biljaka

Sveţa masa biljaka merena je odmah nakon utvrĊivanja broja pupoljaka i njihove duţine.

Suva masa je merena nakon nekoliko dana sušenja biljnog materijala. Sva merenja su obavljena

na automatskoj analitiĉkoj vagi, sa preciznošću od 0,1 mg. Dobijeni podaci su nakon toga

statistiĉki obraĊeni.

3.5. Statistička analiza

Obrada podataka je uraĊena statistiĉko – grafiĉkim paketom Statgraphics, procedura

ANOVA i test LCD na nivou znaĉajnosti p<0,05. Statistiĉka analiza je uraĊena za svaki

parametar i u tabelama je predstavljena slovima. Statistiĉki znaĉajne razlike predstavljene su

razliĉitim slovima, ista slova oznaĉavaju da tih razlika nije bilo.

23

4. REZULTATI

24

4.1. Indukcija aksilarnih pupoljaka na nodalnim eksplantatima Micromeria juliana

Nodalni eksplantati Micromeria juliana postavljeni su na MS hranljivu podlogu: a) bez

regulatora rastenja (kontrola), b) sa auksinom IAA (0,57 µM), i c) sa kombinacijom auksina IAA

(0,57 µM) i razliĉitih koncentracija citokinina BA (0, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 i 30 µM ). Na induktivnoj

podlozi eksplantati su gajeni 4 nedelje i za to vreme došlo je do formiranja aksilarnih pupoljaka

na svim eksplantatima bez obzira na kojoj podlozi su gajeni. Na svim eksplantatima došlo je do

promene boje listova koji su bili u dodiru sa hranljivom podlogom. Najviše odstranjenih

eksplantata zbog nekroze bilo je na MS podlozi sa 30 µM BA + 0,57 µM IAA, ukupno 11

eksplantata od 30 postavljenih. Infekcija se javila na podlozi MS 3 µM BA + 0,57 µM IAA,

obuhvatajući samo jedan eksplantat. Na ostalim podlogama nije došlo do znaĉajnih promena u

pogledu nekroze i infekcije.

Posle statistiĉke obrade podataka dobijeni su sledeći rezultati :

Tabela 3. prikazuje proseĉan broj aksilarnih pupoljaka po eksplantatu, kao i njihovu

duţinu u milimetrima

U Tabeli 4. prikazan je uticaj razliĉitih tretmana na masu biljaka Micromeria juliana

Tabela 3. Uticaj regulatora rastenja na indukciju i izduţivanje aksilarnih pupoljaka M. juliana

Tretman Proseĉan broj

pupoljaka po

eksplantatu

Proseĉna duţina

pupoljaka (mm)

1 Bez hormona 5,86 ± 0,40b 3,95 ± 0,31

b

2 0,57 μM IAA 4,68 ± 0,33ab

6,47 ± 0,79c

3 0,1 μM BA + 0,57 μM IAA 5,73 ± 0,42b 4,12 ± 0,37

b

4 0,3 μM BA + 0,57 μM IAA 3,68 ± 0,49a 4,18 ± 0,42

b

5 1 μM BA + 0,57 μM IAA 4,52 ± 0,42ab

3,94 ± 0,36 b

6 3 μM BA + 0,57 μM IAA 9,39 ± 0,65c 3,84 ± 0,20

b

7 10 μM BA + 0,57 μM IAA 4,37 ± 0,38a 2,56 ± 0,18

a

8 30 μM BA + 0,57 μM IAA 4,00 ± 0,49a 1,75 ± 0,10

a

Višestruki test intervala - vrednosti oznaĉene istim slovom u koloni ne pokazuju razliku na nivou znaĉajnosti p0.05

25

Eksplantati su uspešno rasli i razvijali se na MS hranljivoj podlozi bez regulatora rastenja.

MeĊutim, eksplantati su se vidljivo razlikovali u duţini internodija, pojedini eksplantati su imali

izduţene a pojedini eksplantati skraćene internodije (Sl. 3). Na malom broju eksplantata došlo je

do pojave adventivnih korenova (Sl. 4). Proseĉan broj pupoljaka po eksplantatu iznosio je 5,86.

Proseĉna duţina pupoljaka bila je 3,95 mm (Tab. 3).

Slika 3. M. juliana na MS podlozi bez hormona

Slika 4. Eksplantati M. juliana na MS podlozi bez hormona

MS

M. juliana

MS

M. juliana

26

Eksplantati gajeni na podlozi MS sa 0,57 μM IAA (Sl. 5) takoĊe pokazuju razliku u duţini

internodija (Sl. 6). Boja im je nešto svetlija, svetlo zelena do ţuta. Na skoro svim eksplantatima

došlo je do razvića adventivnih korenova (Sl. 6), što potvrĊuje ulogu auksina u razviću

adventivnih korenova. Proseĉan broj pupoljaka po eksplantatu bio je 4,68 što je znaĉajno manja

vrednost u odnosu na kontrolu bez hormona (Tab. 3). Proseĉna duţina pupoljaka bila je 6,47 mm,

i to je znaĉajno više nego na eksplantatima sa bilo koje druge podloge.

Slika 5. M. juliana na podlozi MS + 0,57 μM IAA

Slika 6. Esplantati M. juliana na podlozi MS + 0,57 μM IAA

MS + 0,57 μM IAA

M. juliana

MS + 0,57 μM IAA

M. juliana

27

Na MS podlozi sa 0,1 μM BA i 0,57 μM IAA (Sl. 7) proseĉan broj pupoljaka po

eksplantatu iznosio je 5,73 što je pribliţno kao i na podlozi bez hormona, dok je proseĉna duţina

pupoljaka bila 4,12 mm (Tab. 3). Sa sve većom koliĉinom BA u podlozi dolazi do smanjenja

proseĉne duţine pupoljaka, sa izuzetkom kod koncentracije 0,3 BA, gde je proseĉan broj

pupoljaka neznatno veći. Na svega nekoliko eksplantata su se razvili adventivni korenovi (Sl. 8).

Eksplantati su bili pribliţno iste visine, sa ponekim izuzetkom (Sl. 7).

Slika 7. M. juliana na MS podlozi sa 0,1 μM BA + 0,57 μM IAA

Slika 8. Eksplantat M. juliana na MS podlozi sa 0,1 μM BA + 0,57 μM IAA

MS + 0,1 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

MS + 0,1 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

28

Kod eksplantata gajenih na MS podlozi sa 0,3 μM BA i 0,57 μM IAA (Sl. 9) zabeleţen je

najmanji proseĉan broj aksilarnih pupoljaka po eksplantatu i iznosio je 3,68 (Tab. 3). Proseĉna

duţina pupoljaka bila je 4,18 mm i od ove vrednosti sledi smanjenje proseĉnih duţina pupoljaka

sa povećanjem koncentracije BA u podlozi. Samo na jednom eksplantatu je došlo do razvića

adventivnih korenova (Sl. 10), jer je još uvek koncentracija auksina veća od koncentracije

citokinina.

Slika 9. M. juliana na MS podlozi sa 0,3 μM BA i 0,57 μM IAA

Slika 10. Eksplantati M. juliana na MS podlozi sa 0,3 μM BA i 0,57 μM IAA

MS + 0,3 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

MS + 0,3 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

29

Na podlozi MS sa 1 μM BA i 0,57 μM IAA (Sl. 11) proseĉan broj pupoljaka je iznosio

4,52. Proseĉana duţina pupoljaka po eksplantatu, kao što je već napomenuto, se smanjuje i na

ovoj podlozi je iznosila 3,94 mm (Tab. 3). Na ovoj podlozi primećuje se veći broj tamnijih listova

na gajenim eksplantatima usled njihovog kontakta sa podlogom - polegla forma zbog jaĉeg

razvijanja jedne grane (Sl. 12). Na ovoj i svim sledećim podlogama nije došlo do razvića

adventivnih korenova.

Slika 10. M. juliana na MS podlozi sa 1 μM BA i 0,57 μM IAA

Slika 12. Eksplantati M. juliana na MS podlozi sa 1 μM BA i 0,57 μM IAA

MS + 1 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

MS + 1 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

30

Eksplantati koji su gajeni na podlozi MS sa 3 μM BA i 0,57 μM IAA (Sl. 13), imali su

kraće internodije i skoro ţbunastu formu, ali i veliki broj pupoljaka (Sl. 14). Na ovoj podlozi

zabeleţen je najveći proseĉan broj pupoljaka po eksplantatu koji je iznosio 9,39 (Tab. 3). Ovo je

jedina podloga na kojoj je proseĉan broj pupoljaka veći od vrednosti na kontrolnoj MS podlozi

bez hormona. S obzirom na već pomenutu formu koju imaju, proseĉna duţina pupoljaka je bila

sve manja i iznosila je 3,84 mm.

Slika 13. M. juliana na MS podlozi sa 3 μM BA + 0,57 μM IAA

Slika 14. Eksplantati M. juliana na MS podlozi sa 3 μM BA + 0,57 μM IAA

MS + 3 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

MS + 3 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

31

Na podlozi MS sa 10 μM BA i 0,57 μM IAA (Sl. 15) gajeni eksplantati su bili razliĉitih

morfoloških karakteristika. Neki su imali duţe, neki kraće internodije, a neki toliko kratke da su

bili ţbunaste forme (Sl. 16). Proseĉan broj aksilarnih pupoljaka po eksplantatu na ovoj podlozi

iznosio je 4,37 (Tab. 3). Njihova proseĉna duţina bila je 2,56 mm.

Slika 15. M. juliana na MS podlozi sa 10 μM BA + 0,57 μM IAA

Slika 16. Eksplantati M. juliana na MS podlozi sa 10 μM BA + 0,57 μM IAA

MS + 10 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

MS + 10 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

32

Na MS podlozi sa 30 μM BA i 0,57 μM IAA svi eksplantati su bili ţbunaste forme, sa

izuzetno kratkim internodijama (Sl. 17, 18). Od ukupno 30 postavljenih eksplantata, 19 se

uspešno razvilo. Na ovoj podlozi je zabeleţena najmanja proseĉna duţina pupoljaka koja je

iznosila 1,75 mm (Tab. 3). Proseĉan broj pupoljaka po eksplantatu iznosio je 4,00 što je druga po

redu najmanja zabeleţena vrednost u ovom radu.

Slika 17. M. juliana na MS podlozi sa 30 μM BA + 0,57 μM IAA

Slika 18. Eksplantati M. juliana na MS podlozi sa 30 μM BA + 0,57 μM IAA

MS + 30 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

MS + 30 μM BA + 0,57 μM IAA

M. juliana

33

Dobijeni rezultati se mogu prikazati i grafiĉki, histogramom. Na histogramu 1. uoĉava se

da je samo kombinacija hormona 3 µM BA + 0,57 µM IAA na MS podlozi dovela do povećanja

proseĉnog broja pupoljaka po eksplantatu u odnosu na kontrolu bez hormona, što ujedno

predstavlja i najveću vrednost. Svi ostali tretmani hormonima ne dovode do povećanja broja

pupoljaka. Najmanja vrednost proseĉnog broja pupoljaka je zabeleţena na podlozi MS sa 0,3 µM

BA + 0,57 µM IAA. Najveća proseĉna duţina pupoljaka je postignuta na podlozi MS sa 0,57 µM

IAA, dok su najmanju proseĉnu duţinu imali pupoljci na eksplantatima gajenim na MS podlozi

sa 30 µM BA + 0,57 µM IAA.

Histogram 1. Uticaj regulatora rastenja na broj i duţinu aksilarnih pupoljaka M. juliana

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Bez hormona 0,57 μM IAA 0,1 μM BA + 0,57 μM IAA

0,3 μM BA + 0,57 μM IAA

1,0 μM BA + 0,57 μM IAA

3,0 μM BA + 0,57 μM IAA

10 μM BA + 0,57 μM IAA

30 μM BA + 0,57 μM IAA

Prosečan broj pupoljaka po eksplantatu

Prosečna duzina pupoljaka

34

4.2. Uticaj različitih tretmana na masu biljaka Micromeria juliana

Sveţa masa biljaka merena je odmah nakon evidentiranja broja pupoljaka i njihove

duţine, i to za svaki eksplantat posebno. Nakon nekoliko dana, kada se materijal dobro osuši,

merena je suva masa eksplantata. Dobijeni podaci su obraĊeni statistiĉki. U Tabeli 4. prikazan je

uticaj razliĉitih tretmana na masu biljaka Micromeria juliana.

Iz dobijenih rezultata vidi se da je najveća proseĉna sveţa masa zabeleţena kod

eksplantata koji su rasli na podlozi MS sa 3 μM BA i 0,57 μM IAA, i iznosila je 0,061 mg. Na

istoj podlozi razvio se i najveći broj pupoljaka. Najmanja proseĉna sveţa masa zabeleţena je kod

eksplantata na podlozi MS sa 30 μM BA i 0,57 μM IAA i iznosila je 0, 012 mg. Eksplantati koji

su rasli na ovoj podlozi su bili veoma mali, ţbunaste forme, pa su dobijeni rezultati oĉekivani. Na

istoj podlozi je zabeleţena i najmanja proseĉna vrednost suve mase, koja je iznosila 0,0020 mg.

Najveću proseĉnu vrednost suve mase imali su eksplantati koji su rasli na MS podlozi sa 10 μM

BA i 0,57 μM IAA, i ta vrednost je iznosila 0,0085 mg.

Tabela 4. Uticaj razliĉitih tretmana na masu biljaka Micromeria juliana

Tretman Proseĉna sveţa masa

(mg)

Proseĉna suva masa

(mg)

1 Bez hormona 0,017 ± 0,0019a 0,0028 ± 0,00030

a

2 0,57 μM IAA 0,046 ± 0,0079bcd

0,0056 ± 0,00066abc

3 0,1 μM BA + 0,57 μM IAA 0,027 ± 0,0019ab

0,0043 ± 0,00027ab

4 0,3 μM BA + 0,57 μM IAA 0,044 ± 0,0053bcd

0,0057 ± 0,00066bc

5 1 μM BA + 0,57 μM IAA 0,051 ± 0,0013cd

0,0060 ± 0,00057bc

6 3 μM BA + 0,57 μM IAA 0,061 ± 0,0042d 0,0070 ± 0,00041

bc

7 10 μM BA + 0,57 μM IAA 0,038 ± 0,0034bc

0,0085 ± 0,00074c

8 30 μM BA + 0,57 μM IAA 0,012 ± 0,0010a 0,0020 ± 0,00022

a

Višestruki test intervala - vrednosti oznaĉene istim slovom u koloni ne pokazuju razliku na nivou znaĉajnosti p0.05

35

5. DISKUSIJA

36

Micromeria juliana je uspešno gajena u kulturi. M. juliana je uvedena u kulturu in vitro

od strane D. Stojiĉić i S. Tošić i njihovi neobjavljeni rezultati bili su nam dostupni na uvid. U

toku je publikacija indukcije aksilarnih pupoljaka i analiza etarskih ulja ove vrste. Najveći broj

radova u kojima je korišćena vrsta M. juliana odnosili su se na ispitivanje sastava esencijalnih

ulja. Slavkovska et al. (2005) nalaze da u sastavu esencijalnih ulja preovlaĊuju terpenske

komponente. Kasnije, Kostadinova et al. (2007) govore da su to seskviterpeni. Hemijski sastav

esencijalnih ulja iz listova ĉine ugljovodonici (7%) i jedinjenja kiseonika (57%), gde je glavni

sastojak karvakrol (Phokas et al. 1980), dok Kremer et al. (2014) govore da je glavna

komponenta esencijalnog ulja kariofilin – oksid. Prema Stojanović et al. (2005) glavni sastojci

esencijalnog ulja su verbenol, timol, kariofilin – oksid, borneol i mirtenol. Što se tiĉe broja

hromozoma, Martin et al. (2011) potvrĊuju ranija istraţivanja da broj hromozoma kod M. juliana

iznosi 30 (2n).

U ovom radu su definisani uslovi u kojima dolazi do indukcije pupoljaka M. juliana,

zatim njihovog izduţivanja, kao i uticaj razliĉitih tretmana na produkciju biomase. Pupoljci su se

razvijali na svim eksplantatima bez obzira na kojoj su podlozi gajeni. Najveći proseĉan broj

pupoljaka je indukovan na eksplantatima koji su gajeni na MS podlozi sa 3 µM BA i 0,57 µM

IAA i iznosio je 9,39. Njihova proseĉna duţina iznosila je 3,84 mm. Ovu kombinaciju hormona

koristili su mnogi autori, takoĊe u cilju indukcije pupoljaka. Tako je, kod biljke Agastache

rugosa najveći broj i najbolji kvalitet pupoljaka postignut na MS podlozi sa upravo ovom

kombinacijom hormona (Zielinska et al. 2011). BA i IAA su pozitivno delovali i na indukciju

pupoljaka kod vrste Ocimum killimandscharicum L. (Sharma et al. 2013), Ocimum citriodorum

Vis. (Janarthanam i Sumathi, 2012), kao i kod vrste Mentha viridis L. (Rahman et al. 2013), dok

se kod vrste Ocimum basilicum L. najveći broj pupoljaka razvio na podlozi MS sa 11 µM BA bez

auksina (Asghari et al. 2012). Kod vrste Mentha piperita L. u indukciji pupoljaka najbolje se

pokazala kombinacija citokinina (BA) i kinetina (Sunandakumari et al. 2004) kao i kombinacija

auksina (NAA) i kinetina (Venkatramalingam and Ebbie, 2011).

Proseĉna duţina pupoljaka bila je najveća na eksplantatima koji su gajeni na MS podlozi

samo sa auksinom IAA (0,57µM), i iznosila je 6,47 mm. Drugaĉiji rezultati dobijeni su kod vrste

Mentha piperita L. gde je najveća duţina pupoljaka postignuta na MS podlozi samo sa

citokininom (BA) (Ghanti et al. 2004). Sa povećanjem koncentracije BA u podlozi, smanjivala se

37

proseĉna duţina pupoljaka na eksplantatima M. juliana. Iako citokinini pospešuju proliferaciju

aksilarnih izdanaka, njihova inhibitorna uloga u elongaciji izdanka je takoĊe dobro poznata

(Zuzarte et al. 2010).

U ovom radu najpovoljniji uticaj na produkciju sveţe mase eksplantata M. juliana imala

je podloga na kojoj se razvio i najveći broj pupoljaka na eksplantatima (MS podloga sa 3 μM BA

i 0,57 μM IAA). Na toj podlozi proseĉna sveţa masa biljaka je bila najveća i iznosila je 0,061mg.

Najveću proseĉnu suvu masu imali su eksplantati gajeni na MS podlozi sa 10 μM BA i 0,57 μM

IAA, i ta vrednost je iznosila 0,0085 mg.

38

6. ZAKLJUČAK

39

Micromeria juliana (L.) Benth. ex Rchb. je uspešno gajena u kulturi in vitro. Najveći broj

aksilarnih pupoljaka indukovan je na eksplantatima koji su gajeni na MS podlozi sa 3 µM

citokinina BA i 0,57 µM auksina IAA. Ovo je jedina podloga gde je zabeleţen veći broj

pupoljaka u odnosu na kontrolnu MS podlogu bez hormona. Najveća proseĉna duţina pupoljaka

je izmerena na eksplantatima koji su gajeni na podlozi MS samo sa auksinom IAA u

koncentraciji 0,57 µM. Adventivni korenovi su se razvili samo na podlogama u kojima je

koncentracija IAA bila veća od koncentracije BA. Sa povećanjem koncentracije BA smanjivao se

broj eksplantata na kojima su se razvili adventivni korenovi.

Najveću proseĉnu sveţu masu imali su eksplantati gajeni na MS podlozi sa 3 µM BA i

0,57 µM IAA, dok je najveća vrednost proseĉne suve mase zabeleţena na eksplantatima na MS

podlozi sa 10 μM BA i 0,57 μM IAA.

Dobijeni rezultati su pokazali da se Micromeria juliana moţe uspešno gajiti i

razmnoţavati u in vitro uslovima, i da se od veoma malo poĉetnog materijala moţe dobiti veliki

broj biljaka koje se mogu reintrodukovati na svoja prirodna staništa. Na taj naĉin spreĉava se

potpuno išĉezavanje ove biljke, i postiţe se znaĉajan napredak u farmaceutskoj, kozmetiĉkoj i

prehrambenoj industriji gde je ova biljka našla svoju primenu.

40

7. LITERATURA

41

1. Arabaci, T., Dimenci, T., Celep, F., 2010: Morphological character analysis in Turkish

Micromeria Benth. (Lamiaceae) species with a numerical taxonomic study. Turkish Journal

of Botany, 34: 379 – 389.

2. Asghari, F., Hossieni, B., Hassani, A., Shirzad, H., 2012: Effect of explants source and

different hormonal combinations on direct regeneration of basil plants (Ocimum basilicum

L.). AJAE, 3: 12 – 17.

3. Brӓuchler, C., Ryding, O., Heubl, G., 2008: The genus Micromeria (Lamiaceae), a

synoptical update. Willdenowia, 38: 363 – 410.

4. Boissier, E., 1879: Flora orientalis. Basel & Geneve, 4: 568 – 575.

5. Debergh, P., Maene, L., 1981: A scheme for commercial propagation of ornamental plants

by tissue culture, Sci. Hort., 14: 335–345.

6. Ghanti, K., Kaviraj, C. P., Venugopal, R. B., Jabeen, F. T. Z., Rao, S., 2004: Rapid

regeneration of Mentha piperita L. from shoot tip and nodal explants. Indian Journal of

Biotechnology, 3: 594 – 598.

7. Janarthanam, B., Sumathi, E., 2012: Plantlet regeneration from nodal explants of Ocimum

citriodorum Vis. Bangladesh J. Sci. Ind. Res., 47: 433 – 436.

8. Kalogjera, Z., Vladimir, S., 1992: Micromeria vrste u flori Hrvatske. Farmaceutski glasnik,

48: 203 – 214.

9. Kostadinova, E., Alipieva, K., Stefova, M., Stafilov, T., Antonova, D., et al. 2007: Chemical

composition of the essential oils of three Micromeria species growing in Macedonia and

Bulgaria. Macedonian Journal of Chemistry and Chemical Engineering, 26: 3 – 7.

10. Kremer, D., Dunkić, V., Rušĉić, M., Matevski, V., Ballian, D., Bogunić, F., Eleftheriadou,

E., Stešević, D., Kosalec, I., Bezić, N., Stabentheiner, E., 2014: Micromorphological traits

and essential oil contents of Micromeria kerneri Murb. and M. juliana (L.) Benth.

Phytochemistry, 98. 128 – 136.

11. Marić, M., 1995: Kultura biljnih tkiva. Draganić, Beograd.

12. Martin, E., Cetin, O., Dırmenci, T., Ay, H., 2011: Karyological studies of Clinopodium L.

(Sect. Pseudomelissa) and Micromeria Benth. s. str. (Lamiaceae) from Turkey. Caryologia,

64: 398 – 404.

13. Morales, V., 1991: El genero Micromeria Bentham (Labiateae) en la Peninsula Iberica e

Islas Baleares. Anales Jard. Bot. Madrid, 48: 131 – 156.

42

14. Murashige, T., Skoog, F., 1962: A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with

Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum, 15: 473 – 497.

15. Nešković, M., Konjević, R., Ćulafić, Lj., 2003: Fiziologija biljaka. Biološki fakultet,

Beograd.

16. Palić, I., 2009: Hemijska analiza i mikrobiološka aktivnost ekstrakata odabranih vrsta roda

Micromeria Bentham, PhD Dissertation, Prirodno – matematiĉki fakultet, Univerzitet u

Nišu.

17. Phokas, G., Patouha – Volioti, G., Katsiotis, S., 1980: Studies on the essential oils from

Micromeria juliana leaves. Plantes Medicinales et Phytotherapie, 14: 159 – 163.

18. Rahman, M. M., Ankhi, U. R., Biswas, A., 2013: Micropropagation of Mentha viridis L.: An

aromatic medicinal plant. International Journal of Pharmacy & Life Sciences, 4: 2926 –

2930.

19. Sharma, N. K., Vandana, T., Kumar, M., Kumar, H., 2013: In vitro regeneration of Ocimum

killimandscharicum L.: A camphor yielding medicinal plant. Journal of Cell and Tissue

Research, 13: 3937 – 3942.

20. Slavkovska, V., Couladis, M., Bojović, S., Tzakou, O., Pavlović, M., Lakušić, B., Jancic, R.,

2005: Essential oil and its systematic significance in species of Micromeria Bentham from

Serbia and Montenegro. Plant Systematics and Evolition, 255: 1 – 15.

21. Stojanović, G., Palić, I., Ursić – Janković, J., 2005: Composition and antimicrobial activity

of the essential oil of Micromeria cristata and Micromeria juliana. Flavour and Fragrance

Journal, 21: 77 – 79.

22. Sunandakumari, C., Martin, K. P., Chithra, M., Sini, S., Madhusoodanan, P. V., 2004: Rapid

axillary bud proliferation and ex vitro rooting of herbal spice, Mentha piperita L. Indian

Journal of Biotehnology, 3: 108 – 112.

23. Šilić, Ĉ., 1979: Monografija radova Satureja L., Calamintha Miller, Micromeria Bentham,

Acinos Miller i Clinopodium L. u flori Jugoslavije. Zemaljski muzej Bosne i Hercegovine,

Sarajevo.

24. Tatić, B., Bleĉić, V., 2002: Sistematika i filogenija viših biljaka. Zavod za udţbenike i

nastavna sredstva, Beograd.

43

25. Venkatramalingam, K., Ebbie, M.G., 2011: An Efficient in vitro Culture Method of Shoot

Regeneration for a Medicinaly Important Plant Mentha Piperita. Journal of Plant Sciences,

6: 108-112.

26. Vinterhalter, D., Vinterhalter, B., 1996: Kultura in vitro i mikropropagacija biljaka. Axial,

Beograd.

27. Zielinska, S., Piatczak, E., Kalemba, D., Matkowski, A., 2011: Influence of plant growth

regulators on volatiles produced by in vitro grown shoots of Agastache rugosa (Fischer &

C.A.Meyer) O. Kuntze. Plant Cell Tiss Organ Cult, 107: 161 – 167.

28. Zuzarte, M., Dinis, A., Cavaleiro, C., Salgueiro, L., Canhoto, M., 2010: Trichomes, essential

oils and in vitro propagation of Lavandula pedunculata (Lamiaceae). Industrial Crops and

Products, 32: 580 – 587.

44

8. BIOGRAFIJA KANDIDATA

Marija J. Jovanović roĊena je 23. jula 1989. godine u Nišu. Završila je osnovnu školu

„Bogdan Blagojević“ u Medoševcu, a nakon toga 2004. godine upisuje srednju medicinsku školu

„Dr Milenko Hadţić“ u Nišu, smer pedijatrijska – sestra tehniĉar.

Nakon završene srednje škole, školske 2008/2009. godine, zapoĉinje osnovne akademske

studije, na Prirodno – matematiĉkom fakultetu, Univerziteta u Nišu, na Departmanu za biologiju i

ekologiju, koje završava 2011. godine sa zvanjem „biolog“. Iste godine upisuje master

akademske studije, na Departmanu za biologiju i ekologiju, smer Biologija, na istom fakultetu,

koje završava 2014. godine.