Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii - IChF PANichf.edu.pl/DW_01_Olga_Krysiak.pdfUniwersytet Warszawski Wydział Biologii Olga Anna Krysiak Nr albumu: 305967 Analiza struktury

Uniwersytet Warszawski

Wydział Biologii

Olga Anna Krysiak

Nr albumu: 305967

Analiza struktury i funkcji plazmidu pOK1

wyizolowanego egzogennie z bakterii występujących w

osadzie czynnym oczyszczalni ścieków „Czajka”

Structure and functions of plasmid pOK1 obtained by

exogenous isolation from bacteria of activated sludge

treatment plant „Czajka”

Praca licencjacka na kierunku Biotechnologia

w ramach Międzywydziałowych Indywidualnych Studiów

Matematyczno - Przyrodniczych

w zakresie Mikrobiologii

Praca wykonana pod kierunkiem

prof. dr hab. Dariusza Bartosika

w Zakładzie Genetyki Bakterii

Instytutu Mikrobiologii

Wydziału Biologii

Uniwersytetu Warszawskiego

Warszawa, wrzesień 2013

2

Oświadczenie kierującego pracą

Oświadczam, że niniejsza praca została przygotowana pod moim kierunkiem i stwierdzam, że

spełnia ona warunki do przedstawienia jej w postępowaniu o nadanie tytułu zawodowego.

Data Podpis kierującego pracą

Oświadczenie autora pracy

Świadom odpowiedzialności prawnej oświadczam, że niniejsza praca dyplomowa została

napisana przez mnie samodzielnie i nie zawiera treści uzyskanych w sposób niezgodny z

obowiązującymi przepisami.

Oświadczam również, że przedstawiona praca nie była wcześniej przedmiotem procedur

związanych z uzyskaniem tytułu zawodowego w wyższej uczelni.

Oświadczam ponadto, że niniejsza wersja pracy jest identyczna z załączoną wersją

elektroniczną.

Data Podpis autora pracy

3

Streszczenie

W niniejszej pracy zaprezentowano wyniki kompleksowej analizy bioinformatycznej

sekwencji nukleotydowej plazmidu pOK1 (41 277 pz), wyizolowanego metodą egzogenną z

bakterii osadu czynnego oczyszczalni ścieków „Czajka” w Warszawie. W plazmidzie pOK1

wyodrębniono potencjalne moduły genetyczne: (i) systemy replikacyjne (REP), (ii) systemy

odpowiedzialne za stabilne utrzymywanie plazmidu w komórce - system partycyjny (PAR) i

addykcyjny (TA), (iii) potencjalny system mobilizacji do transferu koniugacyjnego (MOB),

(iv) sekwencje insercyjne (IS) zintegrowane z genomem plazmidu oraz (v) determinanty

oporności. Przeprowadzono również analizę funkcjonalną zidentyfikowanych systemów REP

i MOB.

Słowa kluczowe

plazmid, analizy bioinformatyczne sekwencji nukleotydowej, antybiotykooporność,

horyzontalny transfer genów

Dziedzina pracy (kody wg programu Sokrates-Erasmus)

13.4 – Biotechnologia

4

Serdecznie dziękuję

Prof. dr hab. Dariuszowi Bartosikowi

za pomoc w powstawianiu tej pracy, wsparcie merytoryczne i cenne wskazówki

mgr. Marcinowi Adamczukowi

za cenne wskazówki podczas tworzenia pracy

Wszystkim Pracownikom, Koleżankom i Kolegom z Zakładu Genetyki

Bakterii

za stworzenie miłej atmosfery

5

Spis treści

Wykaz skrótów stosowanych w pracy .................................................................................... 7

Wstęp ......................................................................................................................................... 9

1. Geny oporności w środowisku ........................................................................................... 9

2. Rola oczyszczalni ścieków w generowaniu nowych oporności i ich transferze .............. 11

3. Izolacja i identyfikacja plazmidu pOK1 ........................................................................... 13

Cel pracy ................................................................................................................................. 15

Materiały ................................................................................................................................. 16

1. Szczepy i plazmidy bakteryjne ......................................................................................... 16

2. Podłoża ............................................................................................................................. 17

3. Roztwory i bufory ............................................................................................................ 18

3.1. Roztwory do izolacji DNA metodą lizy alkalicznej: ................................................ 18

3.2. Bufory i roztwory stosowane do elektroforezy DNA: .............................................. 18

3.3. Roztwory do transformacji bakterii metodą rubidowo-wapniową: ........................... 18

3.4. pozostałe bufory i roztwory:...................................................................................... 18

4. Enzymy, zestawy odczynników, wzorzec wielkości........................................................ 18

5. Odczynniki i ich pochodzenie .......................................................................................... 19

Metody (opisane według skryptu ZGB) ............................................................................... 19

1. Analiza in silico sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych ................................... 19

2. Warunki hodowli .............................................................................................................. 21

3. Izolacja, obróbka i elektroforeza DNA ............................................................................ 21

3.1. Izolacja plazmidowego DNA w małej skali .............................................................. 21

3.2. Izolacja i wizualizacja plazmidowego DNA poprzez ekstrakcję mieszanina

fenol:chloroform ............................................................................................................... 22

3.3. Elektroforeza drobnocząsteczkowego DNA w żelu agarozowym ............................ 22

3.4. Enzymatyczna obróbka DNA .................................................................................... 22

4. Wprowadzanie DNA do komórek bakteryjnych .............................................................. 22

4.1. Transformacja komórek E. coli ................................................................................. 22

4.2. Koniugacja trójrodzicielska ....................................................................................... 23

Wyniki i Dyskusja .................................................................................................................. 24

1. Odczytanie kompletnej sekwencji nukleotydowej plazmidu pOK1 ................................ 24

2. Analiza sekwencji nukleotydowej plazmidu pOK1 ......................................................... 24

2.1. Analiza systemów replikacyjnych ............................................................................. 32

6

2.1.1. System REP1 ...................................................................................................... 32

2.1.2. System REP2 ...................................................................................................... 35

2.1.3. System REP3 ...................................................................................................... 40

2.2. Systemy odpowiedzialne za stabilne utrzymywanie plazmidu w komórce .............. 42

2.2.1. System partycyjny .............................................................................................. 43

2.2.2. Systemy toksyna-antytoksyna ............................................................................ 47

2.2.3 System restrykcji-modyfikacji ............................................................................ 51

2.3. Analiza potencjalnego systemu mobilizacji do transferu koniugacyjnego ............... 59

2.4. Inne elementy genetyczne zintegrowane z genomem plazmidu ............................... 60

2.4.1. Elementy transpozycyjne ................................................................................... 60

2.4.2. Integron .............................................................................................................. 64

2.5. Determinanty oporności ............................................................................................ 69

2.5.1. Fosfotransferaza streptomycyny ........................................................................ 69

2.5.2. Syntaza dihydroptrynianowa .............................................................................. 71

2.5.3. Białka warunkujące odporność na tetracyklinę .................................................. 71

2.5.4. Reduktaza dihydrofolianowa, acetylotransferaza aminoglikozydowa, β-

laktamaza, białko warunkujące oporność na czwartorzędowe związki amonowe ....... 73

2.6. Dodatkowy ładunek genetyczny plazmidu pOK1 ..................................................... 75

2.6.1. Transferaza adenozynofosforanu SoFic ............................................................. 75

2.6.2. Białko z rodziny SNF ......................................................................................... 76

2.6.3. Inwertaza DNA .................................................................................................. 76

2.6.4. Resolwaza ........................................................................................................... 77

2.6.5. Hipotetyczne białka o nieznanej funkcji ............................................................ 78

3. Analiza funkcjonalna wybranych modułów genetycznych plazmidu pOK1 ................... 79

3.1. Moduł replikacyjny. .................................................................................................. 79

3.1.1. Analiza funkcjonalna systemów replikacyjnych. ............................................... 79

3.1.2. Określenie zakresu gospodarzy systemów replikacyjnych pOK1. .................... 81

3.2. Badanie mobilizacji plazmidu pOK1 do transferu koniugacyjnego. ........................ 83

Wnioski .................................................................................................................................... 84

Bibliografia ............................................................................................................................. 85

7

Wykaz skrótów stosowanych w pracy

1. Skróty nazw nukleotydów:

A – adenina

C – cytozyna

G – guanina

T – tymina

N – dowolny nukleotyd

ATP – adenozynotrifosforan

cAMP – cykliczny adenozynomonofosforan

NADP – fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego

2. Skróty nazw aminokwasów:

A – alanina N – asparagina

C – cysteina P – prolina

D – kwas asparaginowy Q - glutamina

E – kwas glutaminowy R – arginina

F – fenyloalanina S - seryna

G – glicyna T - treonina

H – histydyna V - walina

I – izoleucyna W - tryptofan

K – lizyna Y - tyrozyna

L – leucyna X – dowolny aminokwas

M – metionina

3. Pozostałe skróty:

aa – aminokwas(y) (ang. amino acid(s))

CoA – koenzym A (ang. coenzyme A)

DNA – kwas deoksyrybonukleinowy (ang. deoxyribonucleic acid)

HGT – horyzontalny transfer genów (ang. horizontal gene transfer)

HTH – motyw helisa – skręt – helisa (ang. helix – turn – helix)

IGS – region międzygenowy (ang. intergenic sequence)

IR – odwrócone powtórzenia sekwencji nukleotydowej (ang. inverted repeat)

8

IT – iteron

MGE – ruchome elementy genetyczne (ang. mobile genetic element)

NCBI – National Center for Biotechnology Information

nt – nukleotyd(y) (ang. nucleotide(s))

ORF – otwarta ramka odczytu (ang. open reading frame)

oriV – origin replikacji wegetatywnej

P – promotor

Pd – palindrom

pz – pary zasad

rbs – miejsce wiązania rybosomy (ang. ribosome binding site)

REP – moduł replikacyjny

R-M – system restrykcji – modyfikacji (ang. restriction - modification)

RNA – kwas rybonukleinowy (ang. rybonucleic acid)

TA – system toksyna – antytoksyna

TE – elementy transpozycyjnye (ang. transposable elements)

ZGB – Zakład Genetyki Bakterii

9

Wstęp

1. Geny oporności w środowisku

Nasilające się w ostatnich latach zjawisko antybiotykooporności bakterii jest niepokojącym

problemem. Niestety nie jesteśmy w stanie skutecznie przeciwdziałać powstawaniu coraz

większej liczby szczepów opornych. Dostępne dane wskazują, że w ponad 600 genomach

bakterii opornych na antybiotyki występuje ponad 1300 genów oporności (Liu i Pop, 2009),

które mogą być przenoszone miedzy bakteriami w wyniku horyzontalnego transferu genów

(HGT, ang. horizontal gene transfer).

Niekontrolowane stosowanie antybiotyków powoduje selekcję opornych szczepów

bakterii, które zaczynają dominować w różnych populacjach. Izolowane są często szczepy

wielooporne, wykazujące oporność na kilka różnych antybiotyków/chemioterapeutyków, np.

szczepy gronkowca złocistego, Staphylococcus aureus, niewrażliwe na metycylinę i

wykazujące mniejszą wrażliwość na antybiotyki glikopeptydowe oraz wankomycynę

(MRSA) (Witte, 1999).

Oporność jest często wynikiem zmniejszenia stopnia akumulacji szkodliwej substancji

we wnętrzu komórki, co jest spowodowane obecnością pomp błonowych, zwykle

charakteryzujących się szerokim spektrum substratowym (Poole, 2002). Oporność krzyżową,

wynikającą z obecności takich pomp, wykazują między innymi szczepy Pseudomonas

stutzeri, Pseudomonas areuginosa oraz mutanty mar Escherichia coli (Muñoz Bellido i wsp.,

2002). Należy zaznaczyć, że sprawcami groźnych infekcji stają się ostatnio nie tylko bakterie

uznawane od dawna za patogenne, lecz również szczepy oportunistyczne, do których zalicza

się m.in. bakterie z rodzajów Klebsiella, Serratia, Proteus i Pseudomonas (Vetter i Haver,

2002).

Często postrzegamy oporność w sposób uproszczony, tj. przyjmujemy, że szczep

bakterii jest oporny lub wrażliwy. Problematyczne jest jednak określenie progu

pozwalającego na zdefiniowanie rzeczywistej oporności. Często wzrost bakterii w obecności

niewielkiej ilości antybiotyku jest bagatelizowany, choć wiadomo, że poszczególne

mechanizmy mogą warunkować oporność na różnym poziomie. Nawet taka "szczątkowa"

oporność może pełnić ważną rolę w selekcji opornych szczepów w środowisku naturalnym.

Najpowszechniejszą odpowiedzią komórki na antybiotyk jest zahamowanie wzrostu,

czyli bakteriostaza. W leczeniu infekcji, efekt bakteriostatyczny jest często efektywny,

10

ponieważ patogeny są zabijane i usuwane z organizmu przez układ odpornościowy

gospodarza. Odmienną sytuację obserwujemy w środowisku, gdzie przenoszenie genów

oporności oraz rozprzestrzenianie się opornych szczepów jest stymulowane długotrwałą

obecnością antybiotyku w subterapeutycznym stężeniu (Kümmerer, 2004). Za główną

przyczynę wzrostu oporności uważa się nadmierne i nieuzasadnione stosowanie antybiotyków

(Séveno i wsp., 2002). Związki te są wykorzystywane nie tylko w celach leczniczych (w

medycynie i weterynarii), lecz również stosowane są jako substancje przyspieszające wzrost

zwierząt hodowlanych, a także jako związki antybakteryjne przy produkcji środków

czyszczących i dezynfekujących. Niektóre z antybiotyków stosowanych w medycynie, np.

amoksycylina i erytromycyna, są również stosowane jako promotory wzrostu zwierząt

(Sarmah i wsp., 2006). Związki te nie są całkowicie metabolizowane i trafiają do środowiska,

co stwarza warunki presji selekcyjnej (Al-ahmad i wsp., 1999).

Sugeruje się, że rozprzestrzenianiu szczepów opornych sprzyja także stosowanie

szczepionek i biocydów. Na przykład, skorelowano zastosowania szczepionki przeciwko

Streptococcus pneumoniae ze wzrostem liczby infekcji spowodowanych przez oporne

szczepy S. aureus, jednak podstawy tego zjawiska nie zostały szczegółowo zbadane (A report

from the American Society of Microbiology, 2009).

Zakłada się również, że biocydy, dodawane w stężeniach subletalnych do stosowanych

powszechnie środków czystości, prowadzą do selekcji wielu szczepów opornych. Podobną

rolę przypisuje się niektórym związkom chemicznym, m.in. związkom rtęci i srebra

(obecnym np. w wypełnieniach stomatologicznych), chininie, lekom przeciwwirusowym oraz

niektórym mikroelementom (np. cynk, arsen i miedź).

Pomimo wielu dowodów potwierdzających rolę presji antropogenicznej w

generowaniu fenotypów opornościowych, badania z ostatnich lat wskazują, że oporność nie

jest zjawiskiem nowym, istniała bowiem na długo przed odkryciem antybiotyków. Analizy

metagenomiczne starożytnego DNA, pochodzącego z osadów wiecznej zmarzliny

datowanych na 30 000 lat, pozwoliły na identyfikację genów oporności na β-laktamy,

tetracyklinę oraz antybiotyki glikopeptydowe. Stwierdzono ponadto, że kompletny wariant

genu vanA, warunkującego oporność na wankomycynę, jest podobny do współczesnego, co

dodatkowo potwierdza, że używanie antybiotyków jedynie zwiększa presję selekcyjną

szczepów opornych, lecz nie było czynnikiem indukującym powstania oporności (D’costa i

wsp., 2011).

Środowisko naturalne jest ogromnym rezerwuarem genów oporności, których źródłem

może być większość bakterii. Geny tego typu często pochodzą ze szczepów produkujących

11

antybiotyki, gdzie chronią komórki gospodarza przed szkodliwym działaniem wytwarzanych

przez nie związków. Oporność często związana jest z obecnością wspomnianych wcześniej

pomp usuwających niepożądane substancje z komórki. Pompy tego typu kodowane są nie

tylko przez szczepy produkujące antybiotyki. Prawdopodobnie pełnią one również ważne

funkcje m.in. w usuwaniu metabolitów pośrednich, wirulencji, czy sygnalizacji

międzykomórkowej (Piddock, 2006).

Geny oporności mogą też wywodzić się od genów zaangażowanych w metabolizm

bakterii. Na przykład enzym β-laktamaza, warunkujący oporność na antybiotyki -

laktamowe, należy do grupy białek wiążących penicylinę, z których wiele pełni ważne

funkcje w metabolizmie mureiny.

Głównym zjawiskiem umożliwiającym nabywanie przez bakterie oporności jest

horyzontalny transfer genów, warunkujący przenoszenie informacji genetycznej między

komórkami bakterii. Transfer ten w obecności antybiotyków może być zintensyfikowany, np.

w wyniku indukcji ekspresji genów systemów koniugacyjnych niektórych typów ruchomych

elementów genetycznych. W wyniku HGT do bakterii mogą być wprowadzone duże

segmenty DNA, niosące niekiedy kilka genów opornościowych, co skutkuje powstaniem

szczepów wieloopornych. Geny oporności są znajdowane zarówno w plazmidach jak i

chromosomach. Duża ich liczba występuje w obrębie integronów, które stanowią naturalne

systemy umożliwiające konwersję „wyciszonych” kaset genowych do funkcjonalnych genów.

Nabycie fenotypu oporności w wyniku HGT stanowi istotną korzyść w naturalnej konkurencji

między mikroorganizmami i niewątpliwie prowadzi do wzrostu liczebności populacji

opornych szczepów bakterii patogennych.

2. Rola oczyszczalni ścieków w generowaniu nowych oporności

i ich transferze

Głównym celem oczyszczalni ścieków jest usuwanie z nich toksycznych substancji

organicznych i nieorganicznych, zmniejszenie w nich stężenia organicznego węgla, azotu i

fosforu oraz eliminacja różnego typu organizmów patogennych. W tym celu wykorzystywane

są procesy fizyczne (np. filtracja), chemiczne (np. dezynfekcja), jak i procesy przeprowadzane

przez niektóre mikroorganizmy.

Osady czynne i biofilmy znajdowane w oczyszczalniach są bogate w substancje

odżywcze, co stwarza idealne środowisko bytowania dla bakterii (Dionisio i wsp., 2002;

Sorensen i wsp,. 2005). Dzięki temu różnorodność występujących tam mikroorganizmów jest

12

bardzo duża. Analizy metagenomowego DNA wyizolowanego z prób pochodzących z

oczyszczalni ścieków (amplifikacja PCR oraz sekwencjonowanie genów 16S rRNA)

pozwoliły zidentyfikować przedstawicieli ponad dwadziestu gromad bakterii. Najliczniejsze

grupy stanowiły: Proteobacteria, Chloroflexi, Firmicutes, Spirochaetes i Bacteroides

(Wagner i Loy, 2002), a więc zarówno bakterie gramdodatnie jak i gramujemne, w tym ważne

pod względem klinicznym patogeny oportunistyczne. Tak duże nagromadzenie bakterii

stwarza doskonałe warunki stymulujące zdarzenia HGT, które zwykle prowadzą do naturalnej

amplifikacji genów oporności i rozpowszechnienia fenotypów opornościowych. Tym

bardziej, że w izolatach pochodzących z oczyszczalni ścieków identyfikowane są szczepy

oporne na wszystkie ważne, z klinicznego punktu widzenia, klasy antybiotyków, takie jak:

makrolidy, tetracykliny, cefalosporyny, fluorochinolony, aminoglikozydy i β-laktamy

(Bennett, 2008; Martinem, 2009; Szczepanowski i wsp., 2009).

Powszechnie wiadomo, że głównymi sprawcami HGT są ruchome elementy

genetyczne (MGE, mobile genetic elements). Rezerwuar MGE identyfikowanych w

bakteriach z oczyszczalni ścieków jest bogaty i bardzo różnorodny. Wykryto np. liczne

elementy transpozycyjne (transpozony i sekwencje insercyjne), elementy koniugacyjne i

integrujące z DNA oraz integrony (Bennett, 2008; Slater i wsp. 2008). Elementy te

znajdowane są (w różnych kombinacjach) w genomach licznych plazmidów koniugacyjnych,

co stymuluje ich transfer do innych gospodarzy.

Elementy transpozycyjne kodują transpozazę, enzym katalizujący proces transpozycji.

Są one bardzo zróżnicowane pod względem struktury genetycznej. Jedną z najliczniejszych

grup transpozonów stanowi rodzina Tn21. Transpozony z tej grupy często występują w

obrębie integronów, które uważane są za jeden z głównych czynników determinujących

wielooporność u bakterii. Badania sugerują, że plazmidy nabywają mobilne elementy w

wyniku różnorodnych procesów rekombinacyjnych.

Liczne plazmidy opornościowe wyizolowane z izolatów z oczyszczalni ścieków niosą

integrony klasy pierwszej, często sprzężone z transpozonem z rodziny Tn402 (Schluter i wsp.,

2007). Integrony te mogą zawierać do sześciu różnych determinant opornościowych, w tym

warunkujących oporność na czwartorzędowe związki amoniowe. W genomach plazmidów

spotyka się również geny oporności na inne związki toksyczne, np. jony metali ciężkich i

ksenobiotyki, co wskazuje na ich wzmożoną presję selekcyjną w środowisku oczyszczalni.

Oczyszczalnie to zatem miejsce ważne z punktu widzenia ewolucji plazmidów, bowiem w

środowisku tym dochodzi do częstego transferu tych replikonów oraz nabywania przez nie

nowych modułów genetycznych.

13

Prowadzone dotąd badania potwierdzają, że bakterie niosące plazmidy opornościowe

nie są eliminowane w trakcie procesu oczyszczania ścieków. W bakteriach tych dominują

plazmidy o szerokim spektrum gospodarzy. Przeprowadzona identyfikacja i analiza genomów

140 plazmidów niosących geny oporności na antybiotyki o znaczeniu klinicznym, ilustruje

mozaikową strukturę tych replikonów (Szczepanowski i wsp., 2009). Niektóre z tych

plazmidów były izolowane z końcowego wycieku z oczyszczalni, wprowadzanego

bezpośrednio do środowiska. Najliczniejszą grupą stanowią plazmidy należące do grupy

niezgodności IncP-1. Pokrewne plazmidy izolowane są również ze środowisk naturalnych

(Bahl i wsp., 2009). Plazmidy z grupy IncP-1 nie tylko mogą się replikować w szerokim

spektrum gospodarzy, lecz mogą też mobilizować do transferu koniugacyjnego inne

plazmidy. Transfer ten może zachodzić również do bakterii gramdodatnich (Mazodier i wsp.,

1989), cyjanobakterii (Kreps i wsp., 1990) oraz do drożdży (Heinemann i Sprague, 1989).

Odcieki z oczyszczalni są zwykle uwalniane do rzek, dzięki czemu przedostają się do

innych zbiorników wodnych, takich jak jeziora czy wody przybrzeżne (Zang i wsp., 2009).

Ponadto, osady czynne wykorzystywane są w rolnictwie do nawożenia pól (Chee-Sanford i

wsp., 2009), co dodatkowo przyczynia się do wzrostu liczby szczepów opornych w

środowisku.

Rozpowszechnienie plazmidów opornościowych wśród mikroorganizmów

środowiskowych zależy głównie od możliwości stabilnego utrzymywania tych replikonów w

komórkach gospodarzy. Jak wspomniano, plazmidy często warunkują liczne, różnorodne

cechy fenotypowe. Dzięki temu plazmidy niosące geny oporności na antybiotyki mogą być

przenoszone i stabilnie dziedziczone nawet w środowiskach nie poddawanych działaniu presji

selekcyjnej antybiotyku (Sorensen i wsp., 2005; Allen i wsp., 2010). Szczególnie

niebezpieczne, z punktu widzenia człowieka, jest przekazywanie tych plazmidów bakteriom

patogennym, co utrudnia bądź uniemożliwia ich skuteczną eliminację (D’costa i wsp,. 2006).

3. Izolacja i identyfikacja plazmidu pOK1

W Zakładzie Genetyki Bakterii (ZGB) Wydziału Biologii UW prowadzone są badania mające

na celu identyfikację ruchomych elementów genetycznych niosących determinanty oporności

na antybiotyki. Jednym z analizowanych środowisk jest oczyszczalnia ścieków Czajka w

Warszawie. Z mieszaniny bakterii występujących w osadzie czynnym tej oczyszczalni

wyizolowano, metodą egzogenną, plazmid pOK1, o szacowanej wielkości ok. 40 kpz.

Egzogenna izolacja plazmidów polega na wyodrębnieniu replikonu poprzez transformację

14

metagenomowego DNA do zdefiniowanego biorcy (w tym przypadku E. coli TG1) z

zastosowaniem odpowiedniej selekcji. Plazmid zdefiniowano pierwotnie jako replikon

warunkujący oporność na kanamycynę. Odczytano kompletną sekwencję nukleotydową

pOK1. W niniejszej pracy przeprowadzono analizę bioinformatyczną uzyskanej sekwencji

oraz analizę funkcjonalną jego wybranych modułów genetycznych.

15

Cel pracy

Celem niniejszej pracy było przeprowadzenie kompleksowej analizy bioinformatycznej

sekwencji nukleotydowej plazmidu pOK1, wyizolowanego egzogennie z bakterii

występujących w osadzie czynnym oczyszczalni ścieków Czajka w Warszawie oraz

przeprowadzenie analiz funkcjonalnych wybranych modułów genetycznych tego replikonu.

16

Materiały

1. Szczepy i plazmidy bakteryjne

Szczepy i plazmidy bakteryjne, które wykorzystano i skonstruowano w tej pracy

przedstawiono w tabelach 1 i 2.

Tab. 1. Szczepy bakteryjne wykorzystywane w pracy.

Nazwa Charakterystyka Pochodzenie

E. coli TG1 F’;(traD36 proAB+ lacI

q

lacZΔM15) supE44 hsdΔ5 Δ(lac-

proAB.); szczep wykorzystywany

do transformacji

Gibson, 1984

E. coli DH5α F-; Φ80D lacZΔM15 (lacZYA-

orgF)U169 deoR recA1 endA1

hsdR17 phoA supE44 λ- thi1

gyrA96 relA1

Sambrook i Russell,

2001

Szczepy wykorzystywane w badaniu zakresu gospodarza wektorów wahadłowych niosących

systemy replikacyjne plazmidu pOK1:

Paracoccus aminovorans

JCM7685R

Rifr; pochodna dzikiego szczepu

JCM7685R

ZGB

Agrobacterium tumefaciens

LBA 288R


LBA 288R

ZGB

Alcaligenes sp. LM16R Rifr; pochodna dzikiego szczepu

LM16R

ZGB

Stenotrophomonas sp.

LM24R


LM24R

ZGB

Pseudomonas sp. LM12R Rifr; pochodna dzikiego szczepu

LM12R

ZGB

Vogesella sp. 93R Rifr; pochodna dzikiego szczepu

93R

ZGB

Klebsiella pneumoniae Rifr; pochodna dzikiego szczepu ZGB

Yersinia enterocoltica

Ye0:9R


Ye0:9R

ZGB

Aeromonas sp. 82R Rifr; pochodna dzikiego szczepu

82R

ZGB

17

Tab. 2. Plazmidy bakteryjne wykorzystane w pracy.

Nazwa Charakterystyka Pochodzenie

pOK1 naturalny plazmid wyizolowany z

osadu czynnego oczyszczalni

ścieków

ZGB

pRK2013 Kmr; 4,8 kpz; oriColE1; Tra

+

(system transferu RK2); plazmid

pomocniczy w koniugacji

trójrodzicielskiej

Ditta i wsp., 1980

pABW1 Kmr; 4,5 kpz ori pMB1; Mob

+;

oriT RK2; lacZα; MCS

Bartosik i wsp., 1997

pOK1a Kmr; 13891 kpz; pochodna

plazmidu pABW1 zawierająca,

wklonowany w miejsce SacI,

EcoRI fragment restrykcyjny

SacI, EcoRI plazmidu pOK1 (9,4

kpz; pozycja 24234-33666

sekwencji pOK1), zawierający m.

in. system replikacyjny REP2

pOK1

ta praca

pOK1b Kmr; 18274 kpz; pochodna

plazmidu pABW1 zawierająca,

wklonowany w miejsce SacI,

KpnI, fragment restrykcyjny SacI,

KpnI plazmidu pOK1 (13,8 kpz;

pozycja 6320-33782 sekwencji

pOK1), zawierający m. in.

systemy replikacyjne REP1 i

REP3 pOK1

ta praca

2. Podłoża

W pracy stosowano podłoże LB (Luria-Bertani): trypton – 10g/l, ekstrakt drożdżowy – 5 g/l,

NaCl – 5 g/l; pH 7,0 (Sambrook i Russel, 2001).

Podłoże stałe (LA) otrzymywano poprzez zestalenie podłoża płynnego agarem – 15g/l.

W zależności od potrzeb eksperymentu podłoża uzupełniano:

- mieszaniną X – gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozyd) i IPTG (izopropylo

β-D-1-thiogalaktopiranozyd)

- roztworami antybiotyków w stężeniach dobranych eksperymentalnie, w zależności od

doświadczenia:

- kanamycyna – 50, 100, 300, 400, 500, 1000 μg/ml;

18

- trimetoprim – 50, 100 μg/ml;

- tetracyklina – 10, 20 μg/ml;

- streptomycyna – 50 μg/ml;

- ryfampicyna – 50 μg/ml.

3. Roztwory i bufory

3.1. Roztwory do izolacji DNA metodą lizy alkalicznej:

- roztwór I: 50 mM glukoza, 25 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA; pH 8,0;

- roztwór II: 0,2 M NaOh, 1% SDS;

- roztwór III: 3 M octan potasu, 5 M kwas octowy; pH 4,8.

3.2. Bufory i roztwory stosowane do elektroforezy DNA:

- bufor TAE: 40 mM Tris base, 20 mM kwas octowy, 1mM EDTA;

- bufor obciążający: 0,25% błękit bromofenolowy, 30% glicerol;

- żel agarozowy: 0,8% agaroza w buforze TAE.

3.3. Roztwory do transformacji bakterii metodą rubidowo-wapniową:

- roztwór I: 10 mM MOPS, 10 mM RbCl2; pH 7,0;

-roztwór II: 100 mM MOPS, 50 mM CaCl2, 10 mM RbCl2; pH 6,5.

3.4. pozostałe bufory i roztwory:

- bufor TE: 10 mM Tris-HCl, 1mM EDTA; pH 8,0;

- mieszanina stosowana do odbiałczania preparatów DNA: fenol nasycony 1 M Tris-HCl (pH

8,0) : chloroform – 1:1 (v/v);

- roztwór fizjologiczny (RF): 0,85% NaCl.

4. Enzymy, zestawy odczynników, wzorzec wielkości

- enzymy restrykcyjne, ligaza DNA faga T4 – Fermentas, RNaza – Roche, do obróbki

enzymatycznej używano buforów dostarczonych przez producentów;

- zestawy odczynników: „Plazmid Miniprep Plus”, „DNA Clean Up” – A&A Biotechnology;

19

- wzorzec wielkości liniowych fragmentów DNA: a KB Plus DNA Lauder (wielkości

fragmentów: 12,0; 11,0; 10,0; 9,0; 8,0; 7,0; 6,0; 5,0; 4,0; 3,0; 2,0; 1,65; 1,0; 0,85; 0,65; 0,5;

0,4; 0,3; 0,2; 0,1 kpz) – Invitrogen.

5. Odczynniki i ich pochodzenie

- BIO 101: tetracyklina;

- BIOCORP: LB;

- MERC: agar-agar;

- POCh: aceton, błękit bromofenolowy, chloroform, kwas octowy, metanol, glicerol;

- PRONA: agaroza;

- SIGMA: 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozyd (X – gal), bromek etydyny,

chlorek rubidu, chlorek sodu, chlorek wapnia, dimetylosulfotlenek (DMSO), N,N-

dimetyloformamid (DMF), dodecylosiarczan sodowy (SDS), fenol, glukoza, izopropylo β-D-

1-thiogalaktopiranozyd (IPTG), kanamycyna, kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy

(MOPS), kwas solny, octan potasu, octan sodu, ryfampicyna, streptomycyna, trimetoprim,

Tris Base, uwodniony wersenian dwusodowy (EDTA), wodorotlenek sodowy.

Metody (opisane według skryptu ZGB)

1. Analiza in silico sekwencji nukleotydowych i aminokwasowych

W tabeli 3 przedstawiono narzędzia wykorzystywane do przeprowadzenia analiz

bioinformatycznych.

Tab. 3. Narzędzia bioinformatyczne.

Narzędzie Zastosowanie Dostęp

Artemis adnotacja sekwencji, wyróżnienie ORF,

wyznaczanie zawartości par G+C w sekwencji

nukleotydowej, translacja in silico,

przewidywanie wielkości i masy

cząsteczkowej białek

http://www.sanger.ac.uk/res

ources/software/artemis/

Clone Manager

versja 8

adnotacja sekwencji, wyróżnienie ORF,

identyfikacja miejsc rozpoznawanych przez

enzymy restrykcyjne, identyfikacja

sekwencji powtórzonych i palindromowych,

wizualizacja map genetycznych plazmidów,

planowanie klonowania in silico

Scientific & Educational

Software

20


Programy

BLAST

porównywanie sekwencji nukleotydowych i

aminokwasowych z sekwencjami

zdeponowanymi w bazach danych

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov

BPROM identyfikacja potencjalnych sekwencji

promotorowych

http://linux1.softberry.com/b

erry.phtml?topic=bprom&g

roup=programs&subgroup

=gfindb

ORF Finder wyróżnienie ORF http://www.ncbi.nlm.nih.gov

/projects/gorf/

GYM 2.0

Helix–Turn–

Helix Motif

Prediction

identyfikacja potencjalnych motywów helisa

– skręt – helisa w sekwencjach

aminokwasowych

http://users.cis.fiu.edu/~giri/

bioinf/GYM2/welcome.html

http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-

bin/npsa_automat.pl?page=

/NPSA/npsa_hth.html

ISfinder identyfikacja sekwencji podobnych do

sekwencji elementów transpozycyjnych

https://www-is.biotoul.fr//

T-Coffee przyrównanie sekwencji nukleotydowych i

aminokwasowych

http://www.ebi.ac.uk/Tools/

msa/tcoffee/

Motif Scan

Pfam

NCBI

Conserved

Domain Serach

InterProScan

identyfikacja konserwowanych domen i

motywów w sekwencjach białek

http://myhits.isb-sib.ch/cgi-

bin/motif_scan

http://pfam.sanger.ac.uk/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov

/Structure/cdd/wrpsb.cgi

http://www.ebi.ac.uk/Tools/

pfa/iprscan/

BoxShade wizualizacja przyrównań sekwencji

nukleotydowych i aminokwasowych

http://www.ch.embnet.org/s

oftware/BOX_form.html

NCBI dostęp do baz danych GenBank, InterPro,

PubMed i in.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov

/

Predict Protein

YASPIN

przewidywanie struktury drugorzędowej

białek

https://www.predictprotein.

org/

http://www.ibi.vu.nl/progra

ms/yaspinwww/

Reverse

Complement

konwersja sekwencji nukleotydowych na

sekwencje odwrócone i/lub komplementarne

http://www.bioinformatics.o

rg/sms/rev_comp.htm

21


REBASE źródło danych dotyczących systemów

restrykcji - modyfikacji

http://rebase.neb.com/rebase

/rebase.html

2. Warunki hodowli

Szczepy bakteryjne namnażano w podłożu LB z wytrząsaniem przez noc lub do osiągnięcia

fazy wzrostu wykładniczego w łaźni powietrznej w temperaturze 37oC (Escherichia coli) lub

30oC (pozostałe szczepy). Na podłożu stałym (LA) prowadzono inkubację w identycznych

warunkach temperatury przez 24 godziny lub dłużej w zależności od potrzeb eksperymentu.

3. Izolacja, obróbka i elektroforeza DNA

3.1. Izolacja plazmidowego DNA w małej skali

Plazmidowy DNA izolowano według zmodyfikowanej metody Birnboima i Doly’ego (1979).

1,5 ml nocnej hodowli bakteryjnej wirowano przez czas 3 min w temperaturze pokojowej w

mikrowirówce MPW52 (12 000 rpm). Otrzymany osad zawieszano w 100 μl schłodzonego

roztworu I. Po 5-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej dodawano 200 μl roztworu

II, delikatnie mieszano i inkubowano w lodzie przez 5 min. Następnie dodawano 150 μl

schłodzonego roztworu III i ponownie inkubowano w lodzie przez 5 min. Po inkubacji

dodawano 30 μl mieszaniny fenol:chloroform. Po dokładnym wymieszaniu lizat wirowano 10

min w mikrowirówce (12 000 rpm), a do zebranego supernatantu dodawano 1 ml 96%

alkoholu etylowego. DNA wytracano przez 20 min w temperaturze -20 o

C. Następnie próbki

wirowano przez 10 min (12 000 rpm) w temperaturze 4oC, a otrzymany osad przemywano

70% etanolem, suszono i zawieszano w 20-40 μl buforu TE.

Do izolacji paliamidowego DNA z komórek E. coli i szczepów środowiskowych

wykorzystywano także zestaw „Plasmid Miniprep Plus” firmy A&A Biotechnology, zgodnie

z instrukcją załączoną przez producenta.

22

3.2. Izolacja i wizualizacja plazmidowego DNA poprzez ekstrakcję

mieszanina fenol:chloroform

Materiał poprany bezpośrednio z szalki zawieszano w 100 μl wody dejonizowanej, po czym

dodawano równą objętość mieszaniny fenol:chloroform. Następnie intensywnie mieszano

przy użyciu mikrowytrząsarki i wirowano 10 min (12 000 rpm) w temperaturze pokojowej. 15

μl fazy wodnej mieszano z buforem obciążającym i nanoszono na żel agarozowy.

3.3. Elektroforeza drobnocząsteczkowego DNA w żelu agarozowym

Elektroforezę DNA prowadzono w żelu agarozowym o stężeniu 0,8% w buforze TAE przy

gradiencie napięć 3-5 V/cm, przez 1-1,5 godz. w temp. pokojowej. Po rozdziale

elektroforetycznym żele umieszczano w wodnym roztworze bromku etydyny o końcowym

stężeniu 0,5 μg/ml (10 min), a następnie płukano w wodzie destylowanej (10 min). Wyniki

rozdziału analizowano w systemie ImageQuant 300, firmy GE Healthcare.

3.4. Enzymatyczna obróbka DNA

Trawienie enzymami restrykcyjnymi prowadzono w warunkach zalecanych przez producenta,

od 10 min do 1 godz., używając 2 jednostek enzymu na około 1 μg DNA. Jednoczesne

trawienie dwoma enzymami prowadzono, jeśli było to możliwe, w buforze, w którym oba

enzymy wykazywały nie mniej niż 50% aktywności w stosunku do warunków optymalnych.

Ligację fragmentów DNA otrzymanych w wyniku wcześniejszego trawienia

enzymami restrykcyjnymi z wektorami do klonowania prowadzono przez 12 godz. w temp.

16oC. Używano 1-2 jednostki ligazy w mieszaninie reakcyjnej o końcowej objętości 20 μl,

przy nadmiarze wstawki.

DNA po obróbce enzymatycznej oczyszczano za pomocą zestawu „DNA Clean Up”

firmy A&A Biotechnology, stosując zalecenia producenta.

4. Wprowadzanie DNA do komórek bakteryjnych

4.1. Transformacja komórek E. coli

Komórki E. coli transformowano z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody rubidowo –

wapniowej Kushnera (1978). Nocną hodowlę E. coli szczepiono w stosunku 1:50 do nowej

23

porcji pożywki i hodowano z intensywnym wytrząsaniem do uzyskania OD600 0,4-0,5.

Hodowlę, w porcjach po 1,5 ml, schładzano przez 5 min w lodzie i wirowano przez 3 min w 4

oC (6 000 rpm). Osad zawieszano w 1 ml roztworu I do transformacji, inkubowano w lodzie

przez okres 10 min i ponownie wirowano jw. Po usunięciu supernatantu osad zawieszano w

200 μl roztworu II. Zawiesinę inkubowano 15 min w lodzie, po czym dodawano plazmidowy

DNA i nadal inkubowano w takich samych warunkach. Po 10 min komórki poddawano

szokowi cieplnemu w 43 o

C przez 50s, a następnie dodawano 1 ml LB o temperaturze

pokojowej. Przed wysiewem na odpowiednie podłoża selekcyjne bakterie inkubowano przez

1 godz. w temp. 37 oC.

4.2. Koniugacja trójrodzicielska

W celu wprowadzenia odpowiednich plazmidów wykorzystano metodę koniugacji

trójrodzicielskiej. Nocne hodowle szczepu dawcy (szczep E. coli TG1, zawierający

odpowiedni plazmid), szczepu biorcy (badane szczepy Rifr) oraz szczepu pomocniczego (E.

coli DH5α z plazmidem pRK2013 – Kmr, Tra

+), wirowano w celu usunięcia presji

antybiotykowej, a następnie otrzymany osad zawieszano w świeżej porcji podłoża.

Przygotowane hodowle dawcy, biorcy i szczepu pomocniczego mieszano w stosunku 1:2:1.

Po 24 godzinnej inkubacji w 30 oC wyrosła murawę bakteryjną zmywano z powierzchni

szalki 2 ml LB, a odpowiednie rozcieńczenia wysiewano na podłoże selekcyjne LA

uzupełnione ryfampicyną oraz innym antybiotykiem/antybiotykami w odpowiednim stężeniu

dobranym eksperymentalnie w zależności od szczepu.

24

Wyniki i Dyskusja

1. Odczytanie kompletnej sekwencji nukleotydowej plazmidu

pOK1

Wyizolowany DNA plazmidu pOK1 został poddany sekwencjonowaniu. Wykorzystano

technikę pirosekwencjonowania, która oparta jest na wykrywaniu pirofosforanu, uwalnianego

podczas syntezy DNA. Ponieważ w wyniku sekwencjonowania uzyskano kilka kontigów

sekwencji, konieczne było ich złożenie i ustalenie kompletnej mapy fizycznej replikonu. Ten

etap badań został przeprowadzony przez Marcina Adamczuka - doktoranta Zakładu Genetyki

Bakterii.

2. Analiza sekwencji nukleotydowej plazmidu pOK1

Odczytano kompletną sekwencję nukleotydową plazmidu pOK1, o wielkości 41 277 pz.

Procentowa zawartość par G+C sekwencji wynosi 38,74%. Analizę bioinformatyczną

sekwencji rozpoczęto od wyznaczenia otwartych ramek odczytu (ORF, ang. open reading

frame), kodujących potencjalne produkty białkowe. W tym celu wykorzystano programy

Artemis i ORF Finder oraz wyniki analiz porównawczych, uzyskanych przy użyciu pakietu

BLAST (NCBI). Wyróżniano ORF kodujące produkty białkowe o długości większej niż 50

aminokwasów (aa) lub mniejszej, w przypadku, gdy kodowane przez nie białka wykazywały

istotne podobieństwo do sekwencji zdeponowanych w bazach danych.

W rezultacie zidentyfikowano 49 ORF (Fig. 1), które zostały oznaczone, odpowiednio,

jako orf01, orf02 itd., do orf49. Ich potencjalne produkty białkowe oznaczono jako Orf01,

Orf02 itd. Jako pierwszy nukleotyd sekwencji została wybrana adenina występująca 539

nukleotydów powyżej kodonu START orf01.

25

Fig. 1. Organizacja genetyczna plazmidu pOK1 (41 277 pz). W górnym panelu przedstawiono profil zawartości par G+C (Artemis, okno 120 nt). Barwnymi ramkami

wyróżniono podstawowe moduły genetyczne: na zielono moduły odpowiedzialne za replikację plazmidu, na

pomarańczowo – systemy odpowiedzialne za stabilne utrzymywanie plazmidu w komórce (PAR – systemy

partycyjne, RM – restrykcji-modyfikacji oraz TA – toksyna-antytoksyna), na niebiesko – sekwencje insercyjne

(IS) zintegrowane z genomem plazmidu, na fioletowo – determinanty oporności (orf26 - prawdopodobnie

warunkuje oporność na streptomycynę, orf27 – na sulfonamidy, orf39 – na trimetoprim, orf40 – na

aminoglikozydy, orf41 – na β-laktamy, orf42 – na czwartorzędowe związki amoniowe, orf44-45 – na

tetracyklinę). Ramką zaznaczono integron. W dolnym panelu zaznaczono za pomocą strzałek zasięg i orientację transkrypcyjną wyznaczonych ORF.

Podstawowe informacje o wyznaczonych otwartych ramkach odczytu, tj. lokalizację,

orientacje transkrypcyjną, wielkość potencjalnych produktów białkowych oraz ich

prawdopodobna funkcję wraz z informacjami o ich najbliższych homologach zamieszczono w

tabeli 4. Wyznaczone sekwencje kodujące stanowią 75,82% genomu plazmidu.

Dzięki przeprowadzonym analizom porównawczym zidentyfikowanych ORF możliwe

było wyróżnienie w obrębie sekwencji plazmidu pOK1 kilku potencjalnych modułów

genetycznych. Są to: (i) systemy replikacyjne (REP), (ii-iii) moduły odpowiedzialne za

stabilne utrzymywanie plazmidu w komórce - system partycyjny (PAR) i addykcyjny (TA),

(iv) potencjalny system mobilizacji do transferu koniugacyjnego (MOB), (v) sekwencje

insercyjne (IS) zintegrowane z genomem plazmidu oraz (vi) determinanty oporności.

Ważną informacją jest fakt, że 21 z potencjalnych produktów białkowych kodowanych

w sekwencji pOK1 wykazuje znaczny poziom (niekiedy 100%) identyczności z sekwencjami

białek kodowanych w genomie Wohlfahrtiimonas chitiniclastica SH04 (Tabela 4). Pięć z nich

26

zostało opisanych jako potencjalne białka o nieznanej funkcji, nie wykazujące podobieństwa

do innych białek zdeponowanych w bazach danych. Pozostałe to, między innymi: (i) białko

inicjujące replikację (orf46), (ii) systemy toksyna-antytoksyna (orf14-15, orf20, orf23, orf47-

48) oraz (iii) transpozazy orf19, orf22, orf43, orf49). Należy pokreślić, że niektóre geny są

powielone w genomie pOK1, np. geny systemu TA ( orf20-orf 23 i orf47-orf48) oraz gen

transpozazy (orf49 i orf43).

27

Tabela 4. Otwarte ramki odczytu zidentyfikowane w plazmidzie pOK1.

ORF

Region

kodujący (pz)*

Orientacja

Wielkość

białka

(aa)†

Prawdopodobna funkcja‡

Największe podobieństwo (program BLASTP)

Procent

identyczności

(aminkwasy§)

Organizm Numer w GenBank

01 540-1121 → 193 hipotetyczne białko o

nieznanej funkcji 100 (193/193

Wohlfahrtiimonas chitiniclastica

SH04 ZP_21241700.1

02 2528-3705 → 392 białko replikacyjne

55 (134/242) Acinetobacter lwoffii SH145 ZP_06071093.1

03 4075-5154 → 358

transferaza

adenozynomonofosforanu

SoFic

96 (344/358) Wohlfahrtiimonas chitiniclastica

SH04 ZP_21240492.1

04 5192-8035 → 945 białko z rodziny SNF2 74 (706/949) Acinetobacter baumannii WC-136 ZP_18914166.1

05 8087-11176 → 1029 metylotransferaza DNA

58 (617/1071) Acinetobacter sp. HA ZP_10187147.1

06 11182-13665 → 827

potencjalny enzym

restrykcyjny, N- końcowa

część

53 (427/802) Escherichia coli DEC1C EHU17630.1

07 13572-14639 → 355

potencjalny enzym

restrykcyjny, C- końcowa

część

44 (153/348) Escherichia coli DEC2A ZP_13569221.1


nieznanej funkcji 99 (88/89) Wohlfahrtiimonas chitiniclastica

SH04 ZP_21241728.1


nieznanej funkcji 99 (169/171)


SH04 ZP_21241729.1

10 15952-16554 → 200 inwertaza DNA 99 (199/200) Wohlfahrtiimonas chitiniclastica

SH04 ZP_21241730.1

11 16643-17278 → 184 inhibitor inicjacji

sporulacji Soj, częściowy 99 (183/184)


SH04 ZP_21241731.1

28

ORF

Region

kodujący (pz)*

Orientacja

Wielkość

białka

(aa)†



Procent

identyczności

(aminkwasy§)


12 17319-

17531 → 70

białko partycyjne ParB

53 (33/62)

Xanthomonas arboricola pv. pruni str.

CFBP 5530 YP_004888082.1

13 17748-18047 ← 99 hipotetyczne białko o



SH04 ZP_21241755.1

14 18129-18392 ← 87 toksyna YoeB 100 (87/87) Wohlfahrtiimonas chitiniclastica

SH04 ZP_21241756.1

15 18385-18642 ← 85 antytoksyna YefM 100 (85/85) Wohlfahrtiimonas chitiniclastica

SH04 ZP_21241757.1

16 18847-18990 → 43 inhibitor inicjacji

sporulacji Sjo, częściowy 100 (43/43)


SH04 ZP_21241758.1

17 19046-19165 → 38 transpozaza,

podjednostka A 68 (26/38) Vibrio cholerae HC-56A1 ZP_18079930.1

18 19152-19514 → 120 transpozaza,

podjednostka B 68 (79/116) Vibrio cholerae TM 11079-80 ZP_04410225.1

19 19460-19723 ← 85 transpozaza dla sekwencji

inercyjnej IS431mec 81 (69/85)


SH04 ZP_21241703.1

20 19901-20107 → 67 potencjalna antytoksyna

systemu TA 91 (61/67)


SH04 ZP_21241685.1

21 20108-20440 → 110 transpozaza z rodziny

IS3/IS911 77 (65/87) Glaciecola sp. 4H-3-7+YE-5 YP_004436720.1

22 20461-21264 → 267 element insercyjny IS407 55 (139/254) Wohlfahrtiimonas chitiniclastica

SH04 ZP_21241722.1

23 21329-21589 → 87 potencjalna toksyna

systemu TA 93 (80/86)


SH04 ZP_21241684.1




SH04 ZP_21241735.1

29

ORF

Region

kodujący (pz)*

Orientacja

Wielkość

białka

(aa)†



Procent

identyczności

(aminkwasy§)


25 22746-23111 → 121

hipotetyczne białko

zaangażowane w

mobilizację bakterii,

endonukleaza VirD1

95 (115/121)


SH04

ZP_21241734.1

26 23403-24251 ← 282 fosfotransferaza A

streptomycyny 99 (281/282) Haemophilus parasuis ADP21235.1

27 24193-25044 ← 283 syntaza

dihydropterynianowa 100 (283/283) Actinobacillus pleuropneumoniae YP_245431.1

28 25053-25277 ← 74

hipotetyczne białko o

nieznanej funkcji,

częściowe

97 (72/74) Salmonella enterica subsp. enterica

serovar Typhimurium str. SL1344 YP_006203625.1


nieznanej funkcji 96 (51/53) Escherichia coli 3431 ZP_11485833.1

30 25910-26854 ← 314

potencjalne białko

inicjujące replikację,

RepC

99 (313/314) Actinobacillus pleuropneumoniae NP_955652.1


nieznanej funkcji 96 (99/103) Aeromonas bestiarum ABR10074.1

32 27562-28956 ← 464 białko replikacyjne RepA 90 (431/480) Aeromonas bestiarium YP_001220601

33 29132-29455 ← 107 białko partycyjne ParC

57 (61/107) Nitrosomonas eutropha C91 YP_743797.1

34 29773-30402 ← 209 białko partycyjne Par

99 (208/209) Aeromonas bestiarum YP_001220602.1

35 30498-31097 ← 199 resolwaza

100 (199/199) Aeromonas bestiarum YP_001220603.1

30

ORF

Region

kodujący (pz)*

Orientacja

Wielkość

białka

(aa)†



Procent

identyczności

(aminkwasy§)


36 31287-31490 ← 67

konserwowane

hipotetyczne białko o

nieznanej funkcji

88 (59/67) Aeromonas bestiarum ABR10075.1

37 31445-31699 ← 84 modulator transpozonu

Tn21 98 (79/81)

Salmonella enterica subsp. enterica

serovar Typhimurium str. T000240

YP_005250487.1

38 31668-32681 ← 337 integraza 100 (337/337)

Salmonella enterica subsp. enterica

serovar Typhi str. CT18

NP_569372.1

39 32838-33311 → 157

reduktaza

dihydrofolianowa

99 (155/157) Escherichia coli NP_065309.1

40 33287-33865 → 192 acetylotransferaza

aminoglikozydowa 98 (181/185) Escherichia coli NP_957555.1

41 33951-34826 → 291 β-laktamaza 99 (290/291) Escherichia coli YP_003108196.1

42 35038-35211 → 57

białko warunkujące

odporność na

czwartorzędowe związki

amonowe i bromek

etydyny

98 (53/54) Pseudomonas aeruginosa AEN25620.1

43 35264-35950 → 178 transpozaza sekwencji

insercyjnej IS431mec 96 (170/178)


SH04 ZP_21241703.1

44 36109-36732 ← 207

represor TetR, białko

regulujące ekspresję

genów oporności na

tertacyklinę

100 (207/207) Actinobacillus pleuropneumoniae YP_001569045.1

31

ORF

Region

kodujący (pz)*

Orientacja

Wielkość

białka

(aa)†



Procent

identyczności

(aminkwasy§)


45 36824-38026 → 400

białko klasy H

warunkujące oporność na

tetracyklinę

100(400/400) Actinobacillus pleuropneumoniae

izolat 12494 plazmid p12494 YP_001966263.1

46 38450-39505 ← 350 potencjalne białko

inicjujące replikację 99 (347/350)


SH04 ZP_21241699.1

47 39871-40092 → 73 potencjalna antytoksyna 89 (65/73) Wohlfahrtiimonas chitiniclastica

SH04 ZP_21241685.1

48 40093-40353 → 86 potencjalna toksyna 93 (80/86) Wohlfahrtiimonas chitiniclastica

SH04 ZP_21241684.1

49 35264-35950 → 178 transpozaza sekwencji

insercyjnej IS431mec 96 (170/178)


SH04 ZP_21241703.1

* - pozycja pierwszego nukleotydu kodonu inicjacyjnego do kodonu stop w sekwencji † - aa, aminokwasy ‡ - potencjalna funkcja wyznaczona na podstawie porównania domen białkowych § - liczba identycznych aminokwasów w odniesieniu do liczby porównywanych; wg programu BLAST

Systemy replikacyjne

Moduł odpowiedzialny za stabilne utrzymywanie plazmidu w komórce

Determinanty oporności

Inne ruchome elementy genetyczne zintegrowane z genomem plazmidu

32

2.1. Analiza systemów replikacyjnych

W sekwencji plazmidu pOK1 wyróżniono trzy potencjalne systemy replikacyjne (REP). W skład

plazmidowych systemów replikacyjnych wchodzi zazwyczaj gen rep kodujący białko

replikacyjne (jeden z systemów pOK1 koduje dwa białka) oraz przyległy do tego genu region

DNA zawierający origin replikacji, tj. miejsce, w którym dochodzi do zapoczątkowania nowej

rundy replikacyjnej. W kolejnych podrozdziałach scharakteryzowano zidentyfikowane systemy.

2.1.1. System REP1

Otwarta ramka odczytu orf02 (Fig. 1) koduje potencjalne białko replikacyjne (Rep1) systemu

REP1. Białko to wykazuje podobieństwo sekwencji aminokwasowej (55%-57%) do białek

inicjujących replikację, kodowanych w genomach (i) Acinetobacter lwoffii SH145 (GenBank:

EEY88345.1), z Acinetobacter baumannii Naval-8219377 (GenBank: EKP54646.1) oraz (iii)

Acinetobacter johnsonii SH046 (GenBank: EEY94595.1) (sekwencje genomów tych szczepów

uzyskano w wyniku sekwencjonowania metodą Shotgun, zatem nie można określić czy geny rep

występują w obrębie plazmidów czy chromosomów). Białko Rep1 wykazuje także podobieństwo

(na poziomie 45-58%) do plazmidowych inicjatorów replikacji pochodzących ze szczepów

Acinetobacter spp. (GenBank: ADM89093.1 i ADM89094.1) (Bertini i wsp., 2010). Na Fig. 2.

przedstawiono porównanie sekwencji aminokwasowych Rep1 z sekwencjami najbardziej

podobnych białek.

Homologi białka Rep1 są definiowane jako RepB – białka inicjujące replikację,

wykazujące aktywność topoizomerazy I. Białka o takiej aktywności są najczęściej kodowane w

plazmidach replikujących się według mechanizmu toczącego się koła (RC, ang. rolling-circle

replication) (Diaz-Orejas i wsp. 1998).

Rep1_pOK1 1 VDNTPCTVVKDNVLINASYNLNLVEQRLILLAIVRSRETGKGITANDYLE 50

RepB 1 ---MRDLVVKDNALINASYNLDLVEQRLILLAIVEARESGKGINANNPLE 47

SH046 1 ---MRDLVVKDNALINASYNLDLVEQRLILLAIVEARGSGRGINANDPLE 47

SH145 1 ---MRDLVVKDNALINASYNLDLVEQRLILLAIVEARESGKGINANNPLE 47

Rep1_pOK1 51 IHASDYSDNFKTDRSSTYKSLRDNSKQLFKREFSFI----RGN-ETILSRWVSTIKYCDE 105

RepB 48 VHAEGYINQFGVHRNTAYQALKDACNDLFARQFSYQKINERGNIENYRSRWVSEIGYVDN 108

SH046 48 VHAESYVNQFNVARQTAYQALKDACKDLFARQFSYQEVNKRGNIENVLSRWVSEIRYIDD 108

SH145 48 VHAESYINQFNVARQTAYQALKDASKDLFARQFSYQEMNKRGNIENVLSRWVSEIRYVDA 108

Rep1_pOK1 106 TATVSLIFSPEVIVFISELEKHFTSYNLQSISGLTSSYAVRLYEIMSCWKYVQKTPIFGI 168

RepB 109 EAVVKLIFAPAIVPLITRLEEHFTKYELQQVSNLSSAYAVRLYELLIAWRSTGSTPIIEV 168

33

SH046 109 EATVKLIFAPAIVPLITRLEEQFTKYELQQISDLSSAYAVRLYELLIAWRSTGQTPVIEL 168

SH145 109 EATVKLIFAPAIVPLITKLEEQFTKYELQQVSNLSSAYAVRLYELLIAWRSTGQTPVIEI 168

Rep1_pOK1 169 EDFRQRLGVATHEYPRMSNFKTRVLDIAIKQVNTFTNLTVKCEQHKAGRNIIGFSFLISE 228

RepB 169 SDFRQRIGVLDTEYKRMERFKTSVLELAIKQINEHTDITVKYEQHKRGRSISGFSFTFKQ 228

SH046 169 AEFRQKIGVLDDEYTRMGNFKDRVLNLAIAQVNEHTDINVKCEQHKKGRNISGFSFTFKQ 228

SH145 169 EEFRKKIGVLDDEYTRMGNFKDRVLHLAMAQVNEFTDITVKYEQHKKGRSIYGFSFSFKQ 228

Rep1_pOK1 229 KKV-------ERDLNTIDCIDEKPN-EKYITEDEFIALGSDGSDAYEIAIKAFNQGFKIP 281

RepB 229 KKKDNPP--IERDPNTLDLFTKMTDAQRHLFANKLSELP--------------------- 265

SH046 229 KKVIT-----SKSSTSLELFSKMTDAQRHLFANKLSELP--------------------- 262

SH145 229 KKNVNKPNLEARDQNTLDIFTKLTDAQRHLFANKLSELP--------------------- 267

Rep1_pOK1 282 RNLQIKYGIEGDKFLKAKKSASQKAINTDKNKTTSDKATFIL-NDKTIGYLKKTITDSIN 341

RepB 265 ---------EMGRYSQGTESYPQFAIRIAEMLQDPDRIKELYPYLKKVGYMPSNKKDT-- 314

SH046 262 ---------DMNKYSQGTESYTQFAVRIAEMLQDKERFEELLPYLRKAGFN--------- 304

SH145 267 ---------EMSKYSQGTESYPQFAVRIAEMLLDAEKFKELYPYLVKVGFQ--------- 309

Rep1_pOK1 342 KNKHLTNEVKQSFIIVEINEVYDAITTKQNIVDVDNKSVSEMNFKTKMYEAFNIQK 398

RepB 315 -----------------------------------------------------VNG 317

SH046 304 ------------------------------------------------------TK 305

SH145 310 ------------------------------------------------------TK 311

Fig. 2. Porównanie sekwencji aminokwasowych Rep1 pOK1 i białek pokrewnych.

Sekwencje porównywane z Rep1 (Rep1_pOK1) pochodzą kolejno z Acinetobacter baumannii Naval-8219377

(GenBank: EKP54646.1) (RepB), Acinetobacter johnsonii SH046 (GenBank: EEY94595.1) (SH046) oraz

Acinetobacter lwoffii SH145 (GenBank: EEY88345.1) (SH145). Na niebiesko zaznaczono aminokwasy identyczne

we wszystkich sekwencjach, na szaro – identyczne w trzech z nich. Za pomocą kolorowych ramek zaznaczono

przewidywaną strukturę drugorzędowa białka Rep1. Obramowaniami otoczono domeny typu winged-helix.

Jak widać na Fig. 2, wyróżniona orf2 koduje 398 aa białko. Długość sekwencji białek

najbliżej spokrewnionych jest mniejsza i zawiera się w przedziale 248-318 aa. Region sekwencji

konserwowanej w tych białkach nie obejmuje zatem C-końcowej części Rep1. Przeprowadzono

również analizę konserwowanych domen białkowych (program InterProScan), dzięki czemu

zakwalifikowano białko Rep1 do rodziny Rep_3, grupującej plazmidowe białka inicjujące

replikację (Pfam: PF01051). Charakterystyczna dla tej rodziny domena zlokalizowana jest

między 7 a 222 aminokwasem Rep1. Ta sama domena znajduje się również w podobnej

lokalizacji w najbliższych homologach białka Rep1 (Fig. 2).

Wykorzystując programy: PredictProtein, YASPIN i MotifScan nie znaleziono innych

konserwowanych motywów w sekwencji Rep1. Nie wyróżniono także potencjalnych motywów

helisa-skręt-helisa (HTH, ang. helix-turn-helix) (programy: GYM 2.0 i Helix-Turn-Helix Motif

Prediction). Za pomocą programu InterProScan wyznaczono natomiast lokalizację potencjalnych

domen typu wingled-helix-turn-helix (Fig. 2). Domena ta jest odpowiedzialna za oddziaływanie z

DNA, co wpływa na regulację procesu replikacji (Giraldo i wsp., 2004). Brak motywu HTH jest

34

charakterystyczny dla białek replikacyjnych plazmidów replikujących się według mechanizmu

toczącego się koła. Zazwyczaj w tych białkach identyfikowany jest potencjalny motyw zamka

leucynowego (nieobecny jednak w sekwencji Rep1 pOK1) (Diaz-Orejas i wsp., 1998).

Region leżący powyżej orf02 uznano jako potencjalne miejsce startu replikacji plazmidu

(oriV). Wyróżniono tam region sekwencji bogaty w pary G+C (GCR; pozycja ok. 450-500 bp,

średnia zawartość par G+G - 30,9%.) oflankowany przez regiony bogate w pary A+T (ATR1 i

ATR2) (Fig. 3). Regiony ATR1 i ATR2 obejmują, odpowiednio, pozycje ok. 160-200 pz i 300-

400 pz, o zawartości par G+C 23,8% oraz 23,6%. Na Fig. 3. przedstawiono organizację regionu

oriV plazmidu pOK1. W regionie ATR2 występuje 5 prostych, bezpośrednio po sobie 22-

nukleotydowych sekwencji powtórzonych (IT1-IT5). Trzy z nich są identyczne, w czwartej

występuje punktowa zmiana, natomiast w piątej identycznych jest tylko 5 pierwszych

nukleotydów. Prawdopodobnie te sekwencje repetytywne pełnią rolę iteronów, rozpoznawanych

specyficznie przez białko Rep1. Sekwencja dwudziestu nukleotydów wchodzących w skład

ostatniego iteronu ma strukturę palindromu (Pd). Powyżej iteronów obecna jest także inna

sekwencja palindromowa o długości 10 nukleotydów. Należy zauważyć, że w sekwencji

iteronów pojawia się 9-nukleotydowa sekwencja 5’-TTATACCAC-3’ wykazująca podobieństwo

do sekwencji konsensusowej rozpoznawanej przez białko komórkowe DnaA (tzw. DnaA-box)

5’-(T/C)(T/C)(A/T/C)T(A/C)C(A/G)(A/C/T)(A/C)-3’ (Schaefer i Messer, 1991).

W regionie ATR2 wyróżniono również potencjalną sekwencję promotorową genu rep1

[5’-ATGATA(N10)TTTATT-3’], wykazującą pewne podobieństwo do konsensusu sekwencji

promotorów E. coli, rozpoznawanych przez polimerazę RNA związana z podjednostką σ70

: 5’-

TTGACA(N15-19)TATAAT-3’ (Harley i Reynolds, 1987). Poniżej sekwencji paromotorowej

znajduje się potencjalne miejsce przyłączania rybosomu (rbs): 5’-AGGA-3’ (Fig. 3).

35

Fig. 3. Organizacja genetyczna potencjalnego oriV plazmidu pOK1. Przedstawiono wykres zawartości par G+C w obszarze modułu (Artemis, okno 120 nt), zaznaczono położenie

regionów bogatych w pary G+C (GCR) i A+T (ATR1, ATR2) względem genu rep1. W sekwencji wyróżniono

iterony (IT), sekwencje palindromu (Pd), sekwencje -10 i -35 oraz miejsce rbs. Gwiazdką zaznaczono brak

nukleotydu w iteronie IT4 (konserwowanego w IT1-IT3). Zieloną strzałką zaznaczono początek genu rep1.

2.1.2. System REP2

W skład systemu REP2 wchodzą dwie ORF (orf30 i orf32) kodujące potencjalne białka

replikacyjne. Pomiędzy nimi znajduje się orf31, kodujący hipotetyczne białko o nieznanej

funkcji.

Białko Orf30 wykazuje największe podobieństwo sekwencji aa do białka RepC plazmidu

pMS260 Actinobacillus pleuropneumoniae (GenBank: NP_955652.1). Identyczność obu

sekwencji wynosi 99%. Badacze opisali to białko jako potencjalnie inicjujące replikację. Co

ciekawe, regiony międzygenowe (IGS, ang. intergenic sequence), położone powyżej genów

porównywanych białek pOK1 i pMS260 (GenBank: AB109805.1), wykazują 96% identyczność

na poziomie sekwencji nukleotydowej. Zgodnie z adnotacją sekwencji zdeponowanej przez

badaczy, powyżej wspomnianego IGS zlokalizowany jest gen kodujący syntazę

dihydropterynianową typu II. W przypadku pOK1, homologiczne białko (100% identyczność

sekwencji aa) kodowane jest przez orf27(sulII), jednak w IGS pomiędzy orf27 a orf30(repC)

36

znajdują się dodatkowo dwie ORF (nieobecne w pMS20), kodujące hipotetyczne białka o

nieznanej funkcji (orf28, orf29) (Fig. 1 i Tabela 4; Fig. 4).

Region międzygenowy poprzedzający orf30 wykazuje 99% identyczność sekwencji

nukleotydowej z IGS plazmidu pMS260. Poniżej odpowiednika orf30, w plazmidzie pMS260

zlokalizowany jest gen repA, który nie jest obecny w pOK1. W tej pozycji pOK1 zlokalizowana

jest ORF kodująca hipotetyczne białko o nieznanej funkcji (orf31).

Fig. 4. Schemat organizacji genetycznej regionu pOK1 flankującego orf30.

Kolorowymi ramkami oznaczono ORF: niebieskie – kodujące hipotetyczne białka o nieznanej funkcji

niewyróżnione w sekwencji plazmidu pMS260, fioletowe – pochodzące z plazmidu pMS260 Actinobacillus

pleuropneumoniae (GenBank: NP_955652.1), żółte – wyróżnione w plazmidzie pOK1.

Inne białka pokrewne Orf30 pochodzą z plazmidów różnych przedstawicieli

Gammaproteobacteria: Pasteurella multocida (GenBank: 91% identyczności sekwencji aa,

YP_232871.1), Enterobacter cloacae (91%, GenBank: YP_002563153.1), E. coli (88%,

GenBank: YP_002527536.1) i Salmonella enterica (88%, GenBank: YP_006957938.1). Na Fig.

5 przedstawiono porównanie sekwencji aminokwasowych Orf30 i jego najbliższych homologów.

Analiza konserwowanych domen białkowych pozwoliła zakwalifikować Orf30 do

rodziny białek replikacyjnych RepC (Pfam: PF06504). Charakterystyczna dla niej domena

zlokalizowana jest między 35 a 313 aminokwasem Orf30. Ta sama domena znajduje się również

w podobnej lokalizacji w najbliższych homologach opisywanego białka (Fig. 5).

37

pOK1 1 MGHRSKTAGSGGTMAGCSSPPCWRSSARARGCAVVKPKNKHSLSHVRHDPAHCLAPGLFR 60

pleuropneumoniae 1 MGHRSKTAGSGGTMAGCSSPPCWRSSARARGCAVVKPKNKHSLSHVRHDPAHCLAPGLFR 60

cloacae 1 MGHRSKTAGSGGTMAGCSSPLCWSASARARGWPVAKPK--HDLSHARHDPAHCLAPGLFR 58

multocida 1 MGRRSKTAGSGGMTAGCSNPPCWKSSAKARGCAVVKPKNKYSLSHVRHDPAHCLAPGLFR 60

pOK1 61 ALKRGERKRSKLDVTYDYGDGKRIEFKGPEPLGADDLRILQGLVAMAGPNGLVLGPEPKT 120

pleuropneumoniae 61 ALKRGERKRSKLDVTYDYGDGKRIEFKGPEPLGADDLRILQGLVAMAGPNGLVLGPEPKT 120

cloacae 59 ALKRGERKRSKLDVTYDYGDGKRIEFSGPEPLGADDLRILQGLVAMAGPSGLVLGPEPKT 118

multocida 61 ALKRGERKRSKLDVTYDYGDGKRIEFKGPEPLGADDLRILQGLVAMAGPNGLVLSPEPKT 120

pOK1 121 PGGQQLRLFLEPKWEAVTADAMVVKGSYRALAREVGYADIEDS--RPIRECIERLWTVSI 178

pleuropneumoniae 121 PGGQQLRLFLEPKWEAVTADAMVVKGSYRALAREVGYADIEDS--RPIRECIERLWTVSI 178

cloacae 119 PGGQQLRLFLEPKWEAVETDAMVVKGSYRALAREVGYADIEDS--RPIRECIERLWKVSI 176

multocida 121 EGGQQLRLFLESKWEAVTADAMVVKGSYRALAREIGYAEDGGSQFKAIRECIERLWTVSI 180

pOK1 179 IAQNGRKRQGFRLLAEYASDEADGHLYVALNPLIAQAVMGGGLHVRISMDEVRALDSEAA 238

pleuropneumoniae 179 IAQNGRKRQGFRLLAEYASDEADGHLYVALNPLIAQAVMGGGQHVRISMDEVRALDSEAA 238

cloacae 177 IAQHGRKRQGFRLLSEYASDDAEGRLYVALNPLIAQAVMGGGQHVRISMDEVRALDSETA 236

multocida 181 IAQNGRKRQGFRLLAEYASDEAGGRLYVALNPLIAQAVMGGGQHVRISMDEVRALDSEAA 240

pOK1 239 RLLHQRLCGWIDPGKTGKASIDTLCSYVWPSEASSSAMRKRRQRVREALPELEALGWSVV 298

pleuropneumoniae 239 RLLHQRLCGWIDPGKTGKASIDTLCSYVWPSEASSSAMRKRRQRVREALPELEALGWSVV 298

cloacae 237 RLLHQRLCGWIDPGKTGKASIDTLCSYVWPSEAVGSAMRMRRKRVREALPELEALGWSVV 296

multocida 241 RLLHQRLCGWIDPGKTGKAAIDTLCGYVWPSEASGSTMRKRRQRVREALPELVALGWTVT 300

pOK1 299 EYAAGKYDITRPKAAG 314

pleuropneumoniae 299 EYAAGKYDITRPKAAG 314

cloacae 297 EYAAGKYDIARPKAVG 312

multocida 301 EFAAGKYDITRPKAAG 316

Fig. 5. Porównanie sekwencji aminokwasowych Orf30 i białek pokrewnych.

Sekwencje porównywane z sekwencją Orf30 (pOK1) pochodzą kolejno z Actinobacillus pleuropneumoniae

(GenBank: NP_955652.1) (pleuropneumoniae), Enterobacter cloacae (GenBank: YP_002563153.1) (cloacae)

oraz Pasteurella multocida (GenBank: YP_232871.1) (multocida). Na niebiesko zaznaczono aminokwasy

identyczne we wszystkich sekwencjach, na szaro – identyczne w trzech z nich. Kolorowymi ramkami zaznaczono

przewidywaną strukturę drugorzędowa białka Orf30. Obramowaniem zaznaczono zakres domeny RepC.

Kolejne białko kodowane w obrębie systemu REP2 to Orf32. Wykazuje ono

największe podobieństwo sekwencji aa (90%) do białka replikacyjnego (RepA) pochodzącego z

plazmidu pAb5S9 Aeromonas bestiarum (GenBank: YP_001220601.1). Analiza porównawcza

wykazała, że w strukturze plazmidu pOK1 znajduje się znacznych rozmiarów segment DNA

wykazujący duże podobieństwo (na poziomie sekwencji nukleotydowych) do plazmidu pAb5S9

(GenBank; EF495198.1). Fragment ten obejmuje, oprócz orf32, także orf31 (wraz z

38

poprzedzającym ją regionem międzygenowym) oraz orf34, orf35, orf36(orf) (Fig. 6).

Podobieństwo sekwencji nukleotydowych jest duże i dla poszczególnych ORF wynosi,

odpowiednio: 98%, 100%, 96%, 98%, 99%, a na poziomie sekwencji aa kodowanych białek,

odpowiednio, 96%, 90%, 99%, 100% i 88% identyczności.

orf31 koduje hipotetyczne białko o nieznanej funkcji, orf32 – białko replikacyjne,

orf34 – białko partycyjne ParA, orf35 – resolwazę, zaś orf36 – konserwowane hipotetyczne

białko. Warto zauważyć, że orf33 nie wykazuje podobieństwa sekwencji do sekwencji plazmidu

pAb5S9 (Fig. 6). orf33 koduje potencjalne białko partycyjne ParC, konserwowane w

Plazmidzie2 Nitrosomonas eutropha C91 (GenBank: YP_743797.1) (patrz rozdział 2.2.1.

System partycyjny).

Fig. 6. Schemat ilustrujący elementy wspólne plazmidów pOK1 i pAb5S9.

Kolorowymi ramkami oznaczono otwarte ramki odczytu: pomarańczowe – pochodzące z Plazmidu2 Nitrosomonas

eutropha C91 (GenBank: YP_743797.1), zielone – pochodzące z plazmidu pAb5S9 Aeromonas bestiarium

(GenBank: YP_001220601.1), żółte – wyróżnione w plazmidzie pOK1.

Białka homologiczne Orf32 kodowane są także w plazmidach różnych przedstawicieli

Proteobacteria: (i) z klasy Betaproteobacteria – Bordetella bronchiseptica (78%, GenBank:

CAI47016.1), Achromobacter arsenitoxydans (72%, GenBank: WP_008166574.1),

Gammaproteobacteria – Pseudomonas areuginosa (74%, GenBank: YP_001427363.1),

Xanthomonas arboricola (72%, GenBank: YP_004888062.1) oraz (ii) z klasy

Alphaproteobacteria – Azospirillum lipoferum 4B (34%, GenBank: YP_005039538.1),

Nitrobacter hamburgensis X14 (30%, GenBank: YP_575500.1). Homologiczne białka

kodowane są także w Firmicutes – Ammonifex degensii KC4 (37%, GenBank: YP_003240092.1)

oraz Geobacillus sp. WCH70 (31%, GenBank: YP_002951365.1). Badacze opisują białka te

jako niezbędne do replikacji lub inicjacji replikacji.

39

pOK1 1 MAAVEQLSLFDRAEEARAYHDPARAGFFSILVDVNGDKRQSSHRLIEMPTVLELIDKSRD 60

aeruginosa 1 MAGQAQLALFEPADEAGTYHDTARTGFFSLLVAVGKDKRQDSYRLTDMPTILGMVDQTRD 60

bestiarum 1 MAAVEQLSLFDRAEEARAYHDPARAGFFSILVDVNGDKRQSSHRLIEMPTVLELIDKSRD 60

bronchiseptica 1 MAAVAQLSLFDRAEEARAYHDPGRSGFFSILVDVHGDKRQSSHRLVEMPTVLELIDKTRD 60

pOK1 61 TWLTQAEFIRPNRRVVNLARLGLLFADLDTYRTPWAKGRTPEQLAASVLYHCAQEGIPTP 120

aeruginosa 61 TWLTQAEFMRPNRRVVNLARVGLLFADLDTYRQPWATGRTPEQLAATVLYHCAQEGIPTP 120

bestiarum 61 TWLTQAEFIRPNRRVVNLARLGLLFADLDTYRTPWAKGRTPEQLAASVLYHCAQEGIPTP 120

bronchiseptica 61 TWLTQAEFIRPNRRVVNLARIGLMFADLDTYRQPWATGRTPEQLAASVLYHCAQEGIPTP 120

pOK1 121 SMLIFSGRGIQAKWLLDGTIPRQALPRWNACQKYLIDRLRPVGADVAAKDASRVLRLVET 180

aeruginosa 121 SLLVYSGRGIQAKWLLDGTLPRQALPRWNACQRYLVDRLAGLGADPQAKDASRVLRLVST 180

bestiarum 121 SMLIFSGRGIQAKWLLDGTIPRQALPRWNACQKYLIDRLRPVGADVAAKDASRVLRLVET 180

bronchiseptica 121 SLLIFSGRGIQAKWLLDRPVPRQALPRWNACQKYLIDRLMAIGADVAAKDASRVLRLVDT 180

pOK1 181 VNSKSGEICRVVHVENGPDGQPVRYSFEYLAEMLLPVARWTIEQQRQERAERR-QLKLLS 239

aeruginosa 181 VNTKSGDVCRVVHVEHGQDGQPVRYGFEYLAEMLLPVARWDIEQQRRDRAERR-QLKLLP 239

bestiarum 181 VNSKSGEICRVVHVENGPDGQPVRYSFEYLAEMLLPVARWTIEQQRQERAERR-QLKLLS 239

bronchiseptica 181 VNTKSGEICRVVHVETGADGQPVRYGFEYLAEMLLPVARWEIEQQREARAERRQQLKLLP 240

pOK1 240 GAKTDNLRGFSGRQLAWHRLEDLRKLATLRGGVSEGERMQHLFWRLNFLLLSGATHSSQM 299

aeruginosa 240 GGKADNLRGFSGRQLAWDRLEDLRKLGELRGGVREGERMQHLFWRLNFLLLSGATHSGQM 299

bestiarum 240 GAKTDNLRGFSGRQLAWHRLEDLRKLATLRGGVSEGERMQHLFWRLNFLLLSGATHSSQM 299

bronchiseptica 241 GTKTDNLRGFSGRQLAWHRLEDLRKLATLRGGVQEGERMQHLFWRLNFLLLSGATHSGQM 300

pOK1 300 YYEAKALAGELAPPTWAYRDKELMTLYSKAKAYEKGEKISFAGREFAPLYTPKNDTLINL 359

aeruginosa 300 YHEAAALAGELDP-AWSYRSKELMTLYAKAKAYEAGEKVTLGGREFAPLYTPKNDTLISL 358

bestiarum 300 YYEAKALAGELAP-TWAYRDKELMTLYSKAKAYEKGEKISFAGREFAPLYTPKNDTLINL 358

bronchiseptica 301 YHEAKALARELAP-DWQQNSKELMTLYSKAKAYEAGEKITFGGKEYAPLYTPRNDTLINL 359

pOK1 360 FQITDDEQRELKTIISKGMAAERHKDREAD-RRRAAGAVDR---ETYLEAAKTKQAQAQE 415

aeruginosa 359 FQITDDEQRKLRTLISSDMAKERDRERHTA-RRRAAGAVDR---ETYLDAAEAKRAQAQA 414

bestiarum 359 FQITDDEQAQLRTIISKGMAKGRDRARKEA-ARRAAGAVDR---ETYLEAANAKQAQAQA 414

bronchiseptica 360 FQITDQEQCELRTIISRDMAAERRRSATESATRPVGGPLVRWIGKTYLEAANTKQAQAQA 419

pOK1 416 LREQGMTQKQIAEKMGVGLRSVKRYLAEG-------------------AKSVRITNGEA- 455

aeruginosa 415 LKAEGLSVRAIAQRMGISKSLAAMYAKEAAEC----------------PKSVRITADQAM 458

bestiarum 415 LRAQGLSIRAIAQQMGVSVGSVSGYLKAAPGVQSPSVLQA---DLAGCSKSVRITNGEA- 470

bronchiseptica 420 LREQGLSVRAIAAQMGVSVGSVSGYLKAGASVQSGSPITGAVMEKSGVQSPSPITNGEA- 478

pOK1 456 -----------------------HARAVGPA-F 464

aeruginosa 459 PVASIAGSDEGGREGVQSPSVLLMAEPTGRGAV 491

bestiarum 471 -----------------------HARPVGPAFE 480

bronchiseptica 479 -----------------------YARPVGPAFE 488

Fig. 7. Porównanie sekwencji aminokwasowych Orf32 i białek pokrewnych. Sekwencje porównywane z sekwencją Orf32 (pOK1) pochodzą kolejno z Pseudomonas areuginosa (GenBank:

YP_001427363.1) (aeruginosa), Aeromonas bestiarum (GenBank: YP_001220601.1) (bestiarum) oraz Bordetella

bronchiseptica (GenBank: CAI47016.1) (bronchiseptica). Na niebiesko zaznaczono aminokwasy identyczne we

wszystkich sekwencjach, na szaro – identyczne w trzech z nich. Za pomocą kolorowych ramek zaznaczono

przewidywaną strukturę drugorzędowa białka Orf32. Czerwoną czcionką zaznaczono aminokwasy tworzące motyw

helisa – skręt – helisa. Obramowaniem zaznaczono fragment domeny należącej do rodziny DeoR.

40

Poszukiwanie konserwowanych domem białkowych w sekwencji Orf32 wykazało

obecność motywu HTH, odpowiedzialnego za oddziaływanie białka z DNA (HTH Motif

Prediction, Pfam). Wykorzystując program Conserved Domain Search (NCBI) wyróżniono

domenę charakterystyczna dla regulatorów transkrypcji z rodziny DeoR (COG2390). Obie

sekwencje znajdują się w N-końcowej części białka. W białkach homologicznych Orf32 również

występuje sekwencja tworząca potencjalny motyw HTH (Fig. 7).

Założono, że białka Orf30 i Orf31 stanowią jeden system replikacyjny. Byłby to system

podobny do systemów obecnych w plazmidach replikujących się według mechanizmu

odsuwanej nici (ang. strand displacement). W układach tego typu występują trzy kodowane

plazmidowo białka: RepA, RepB i RepC, wykazujące aktywność, odpowiednio, 5’→3’ helikazy,

prymazy i inicjatora (Sakai i Komano, 1996). W pobliżu genów tych białek powinno znajdować

się miejsce startu replikacji oriV, którego w genomie pOK1 nie udało się jednak zidentyfikować

metodami bioinformatycznymi.

2.1.3. System REP3

Białko Orf46 systemu REP3 wykazuje największe podobieństwo sekwencji aa (99%) do: (i)

potencjalnego białka inicjującego replikację Wohlfahrtiimonas chitiniclastica SH04 (GenBank:

ELV07223.1), (ii) do białka replikacyjnego Comensalibacter intestini A911, wyizolowanego z

jelita muszki owocowej (GenBank: AGFR01000020.1) (63% identyczności) oraz (iii)

Acidithiobacillus thiooxidans ATCC 19377 (GenBank: AFOH01000158.1) (54 %

identyczności). Na Fig. 8 przedstawiono porównanie sekwencji aminokwasowych Rep3 z

sekwencjami wymienionych białek. Pokrewne białka (55-49% identyczności) kodowane są także

w przedstawicielach Alphaproteobacteria (Rhodospirillum rubrum F11, GenBank:

AEO46828.1), Betaproteobacteria (Polaromonas naphthalenivorans CJ2, GenBank:

ABM40236.1) i Gammaproteobacteria (Arsenophonus nasoniae, GenBank: CBA72217.1).

Badania przeprowadzone przy użyciu programu InterProScan pozwoliły na

zakwalifikowanie białka Rep3 do rodziny bakteryjnych białek inicjacji replikacji RepA (Pfam:

PF10134). Członkowie tej rodziny to białka zdolne do wiązania jednoniciowego DNA,

zaangażowane w procesy replikacji, rekombinacji i naprawy DNA.

41

Rep3 1 LDMASMEFPLFALKAGDKKIREYCQGDFRIEIVPSVKYGRATIHDKDIWIYCISKLMQAL 60

A911 1 DDIASMEHPLFALKTGDNRVRRYEHNNFSIVIAPNPEYGMATIHDKDIWIYCISKLMQAI 60

ATCC_19377 1 DDTASMEHPLFALRAGDKRVRAYKRGNYKVEIQPGP-YGCATIHDKDVWIYCISQLMEAV 59

SH04 1 LDMASMEFPLFALKAGDKKIREYCQGDFRIEIVPSVKYGRATIHDKDIWIYCISKLMQAL 60

Rep3 61 RDG-EEINRTVHFTIYDYLKITNRHICGATYERTKDSLDRLSGTRVTTNIETDKIKEARG 119

A911 61 YEE-KEISRTVHFTIYDYLITTNRGVDGRYYEKAKNALDRLRSTNITTNIETAKTREARG 119

ATCC_19377 60 NRGRDDISRTVRFVAYDFLVTTNRPVAGVGYDRMADALRRLSGTRIETNIETDGKRERAG 119

SH04 61 RDG-EEINRTVHFTIYDYLKITNRHICGATYERTKDSLDRLSGTRVTTNIETDKIKEARG 119

Rep3 120 FGLIDAWRIVEE-KDGRMIRVSVTLPEWLYRSIASKSVLTINPDYFRLRKPLDRRIYELA 178

A911 120 FGLIDAWRVVEE-KDGRMVRVSVTLPDWLYRSVTSNQVLTISPDYFRLRKPLDRRIYELA 178

ATCC_19377 120 FGLIDAWKVVERGRDNRMTAVEVTLPDWLFRSVKARHVLTLDRDYFRLRKPLDRRIYEIA 179

SH04 120 FGLIDAWRIVEE-KDGRMIRVSVTLPEWLYRSIASKSVLTINPDYFRLRKPLDRRIYELA 178

Rep3 179 RKHCGNNQSWKFNLSTLHQRSGSTASMKEFRKAIKSLAESNQLPDYCVEFDGKKNQVTFV 238

A911 179 RKHCGSQKEWKIRLELLLKKTGSSENLREFRRSIKSLVATNELPDYNVFYNLESDLVNFT 238

ATCC_19377 180 RKHCGIQPRWRATTATLHEKSGSSATLREFRRLIKGLSDSNELPGYQVVFDHDADVVTFY 239

SH04 179 RKHCGNNQSWKFNLSTLHQRSGSTASMKEFRKAIKSLAESNQLPDYCVEFDGKKNQVTFV 238

Rep3 239 KRVCLKDLTEEIKVEAKESKPKRKRITEYEAGQLARPGEEWPDLLKRIGSEYHVIFDQNS 298

A911 239 QKYKL------------------------------------------------------- 243

ATCC_19377 240 PKNGRAGSMAQIRDLLKKPAQTKKKIT--------------------------------- 266

SH04 239 KRVCLKDLTEEIKVEAKEHRPKRKRITEYEAGQLARPGEEWPDLLKRIGSEYHVIFDQNL 298

Rep3 299 ERQ

A911 244 --V

ATCC_19377 267 KQA

SH04 299 -ER

Fig. 8. Porównanie sekwencji aminokwasowych Rep3 pOK1 i białek pokrewnych. Sekwencje porównywane z Rep3 (Rep3) pochodzą kolejno z Comensalibacter intestini A911 (GenBank:

AGFR01000020.1) (A911), Acidithiobacillus thiooxidans ATCC 19377 (GenBank: AFOH01000158.1)

(ATCC_19377) oraz Wohlfahrtiimonas chitiniclastica SH04 (GenBank: ELV07223.1). Na niebiesko zaznaczono

aminokwasy identyczne we wszystkich sekwencjach, na szaro – identyczne w trzech z nich.

W regionie międzygenowym zlokalizowanym powyżej rep3 znajduje się prawdopodobne

miejsce oriV, w którym wyróżniono region bogaty w pary G+C (GCR; 140-180 bp, zawartość

par G+C - 37,2%) oraz poprzedzający go region bogaty w pary A+T (ATR; ok. 150-160 bp,

G+C - 26,2%). Na Fig. 9. przedstawiono organizację omawianego regionu. W regionie GCR

występują 4 proste, bezpośrednio następujące po sobie 23-nukleotydowe powtórzenia sekwencji,

(IT1-IT4) - potencjalne iterony. Trzy z nich są identyczne (IT1-IT3), natomiast czwarte jest

mniej konserwowane (pierwszy nukleotyd IT4 jest jednocześnie ostatnim IT3). W regionie GCR

wyróżniono ponadto sekwencje potencjalnego promotora genu rep3 5’-

TTGACA(N15)AATAGC-3’ oraz miejsce wiązania rybosomu 5’-AGGA-3’.W regionie ATR

wyróżniono natomiast 12-nukleotydowy palindrom oraz potencjalne miejsce wiązania białka

DnaA o sekwencji 5’-TAATACACA-3’ (Fig. 9).

42

Fig. 9. Organizacja genetyczna oriV REP3 plazmidu pOK1.

W górnym panelu przedstawiono profil zawartości par G+C w sekwencji modułu (Artemis, okno 120 nt),

zaznaczono położenie regionów bogatych w pary G+C (GCR) i A+T (ATR) względem genu rep3. Barwa paska

poniżej sekwencji nukleotydowej obrazuje średnią zawartość par G+C (duża zawartość – bordowa). W sekwencji

wyróżniono iterony (IT), sekwencje palindromu (Pd), sekwencje -10 i -35 oraz miejsce rbs. Gwiazdką zaznaczono

zmiany nukleotydowe w ostatnim iteronie. Zaznaczono prawdopodobne miejsce wiązania białka DnaA. Zieloną

strzałką zaznaczono początek genu rep3.

2.2. Systemy odpowiedzialne za stabilne utrzymywanie plazmidu w komórce

Podczas podziału komórek bakterii, obecne w nich plazmidy ulegają segregacji do komórek

potomnych. Plazmidy małe (do kilku tysięcy par zasad) są trwale dziedziczone dzięki

występowaniu w komórce w dużej liczbie kopii. W tym przypadku plazmidy segregowane są w

sposób losowy, bowiem prawdopodobieństwo, że dany plazmid nie znajdzie się w komórce

potomnej jest bardzo małe. Jeśli w komórce, która ulega podziałowi występuje n cząsteczek

plazmidowych to prawdopodobieństwo, że żadna z kopii plazmidu nie trafi do komórki

potomnej wynosi (0,5)n. Podczas każdego podziału powstają dwie komórki potomne, zatem

prawdopodobieństwo, że którakolwiek z nich nie będzie zawierać plazmidu wynosi: P = 2(0,5)n

= 2(1-n)

(Nordström i Austin 1989).

W naturze, plazmidy występujące w niskiej liczbie kopii są również trwale utrzymywane

w populacjach bakterii, niezależnie od obecności presji selekcyjnej. Dzieje się tak dzięki

istnieniu specyficznych mechanizmów skutecznie przeciwdziałających utracie plazmidu podczas

43

podziału. Wyróżniono trzy grupy tego typu systemów. Do pierwszej należą systemy miejscowo-

specyficznej rekombinacji (MRS), które działają przed podziałem komórki (Fig. 10A). Dzięki

nim formy oligomeryczne plazmidów (powstałe m.in. w skutek rekombinacji pomiędzy

cząsteczkami plazmidów) są rozdzielane do samodzielnych monomerów. Z kolei wzrost liczby

monomerów w komórce optymalizuje ich losową segregację do komórek potomnych. Drugą

grupę stanowią systemy aktywnego rozdziału plazmidów (partycji; PAR) do komórek

potomnych (Fig. 10B). Działają one w trakcie podziału komórki. Trzecia grupa to systemy

addykcyjne (TA), których działanie polega na "uzależnieniu" komórek gospodarza od

występującego w nich plazmidu (Fig. 10C). Powodują one eliminację komórek

bezplazmidowych, ich działanie jest zatem widoczne na poziomie populacji. Systemy należące

do drugiej i trzeciej grupy zapewniają dziedziczenie lepsze niż losowe.

Fig. 10. Mechanizmy stabilnego dziedziczenia plazmidów.

(A) Miejscowo-specyficzna rekombinacja; ciemne kółka na plazmidach oznaczają miejsca res; litera x pomiędzy

plazmidami lub wewnątrz dimeru plazmidowego oznacza zachodzenie rekombinacji. (B) Partycja; jasne prostokąty

oznaczają tzw. miejsca centromerowe. (C) Mechanizm addykcyjny czyli posegregacyjna eliminacja komórek

bezplazmidowych; kontury narysowane przerywaną linią oznaczają śmierć komórki na skutek utraty plazmidu

(Zielenkiewicz i Cegłowski, 2002).

W przypadku plazmidów występujących w 1-2 kopiach w przeliczeniu na chromosom

gospodarza, występują często wszystkie trzy opisane wyżej rodzaje mechanizmów

stabilizujących. W kolejnych podrozdziałach przedstawiono opis systemów tego typu

zidentyfikowanych w genomie plazmidu pOK1.

2.2.1. System partycyjny

Systemy aktywnego rozdziału (PAR), nazywane partycyjnymi, to typowe komponenty

plazmidów niskokopiowych. Warunkują one początkowo odpowiednie umiejscowienie

cząsteczek plazmidów w komórce . Do prawidłowego przebiegu tego procesu niezbędna jest

obecność dwóch białek partycyjnych oraz sekwencji centromeropodobnej, specyficznej dla

44

danego systemu PAR. Homologi plazmidowych białek partycyjnych kodowane są również w

chromosomach bakterii, i prawdopodobnie uczestniczą w ich rozdziale. Mechanizm aktywnej

partycji jest zatem bardzo pierwotny, z ewolucyjnego punktu widzenia (Gerdes i wsp., 2000).

Niektóre z systemów PAR funkcjonują w różnych gospodarzach, niekiedy nawet po

przeniesieniu z bakterii gramujemnych do gramdodatnich (Yamaichi i Niki, 2000).

W sekwencji plazmidu pOK1 wyróżniono 5 ORF (orf11, orf12, orf16, orf33 oraz orf34;

Fig. 1) wykazujących podobieństwo sekwencji do ORF białek partycyjnych. Należy podkreślić,

że orf16 jest niekompletna i koduje jedynie 43 aminokwasy identyczne z N-końcową częścią

orf11. Brak pozostałej części sekwencji orf16 może wynikać z wbudowania się w obrębie tej

ramki sekwencji insercyjnej, zawierającej orf17 i orf18 (Fig. 1). Sekwencja aminokwasowa

Orf11 wykazuje na 99% podobieństwo z sekwencją ORF Wohlfahrtiimonas chitiniclastica

SH04, opisanej jako inhibitor inicjacji sporulacji Soj. Na podstawie analiz porównawczych in

silico sekwencji Orf11, białko to można zaliczyć do rodziny CbiA – białek typu

CopQ/CopB/MinD/ParA wiążących się z DNA (Pfam: PF01656). Inne białka pokrewne Orf11

(podobieństwo 70-78%) zostały opisane jako białka partycyjne ParA plazmidów i pochodziły z

różnych gatunków bakterii. W N-końcowej części tych białek zidentyfikowano zmieniony

motyw Walkera A: 5’ – KGG(S/A)GKT – 3’, tworzący tzw. pętlę P, odpowiadającą za wiązanie

ATP (Lutkenhaus i Sundaramoorthy, 2003) oraz aminokwasy zaangażowane w wiązanie jonów

magnezu (NCBI Conserved Domain Search) (Fig. 11).

Potencjalne białko Orf12 wykazuje identyczność sekwencji na poziomie 47-53% do

białek partycyjnych ParB. We wszystkich tych białkach obecna jest charakterystyczna domena

typu ParG (Pfam: PF09274). Podobnej domeny nie udało się zidentyfikować w sekwencji

wyróżnionej w plazmidzie pOK1. W tej domenie występuje motyw wstęga-helisa-helisa

warunkujący wiązanie się z DNA (Golovanov i wsp., 2003). Motyw ten jest obecny w sekwencji

Orf12 (analiza przy użyciu programu InterProScan), co może wskazywać na funkcjonalność tego

białka.

Na podstawie przedstawionych wyżej wyników analiz porównawczych wydaje się, że

produkty orf11 i orf12 kodują, odpowiednio, potencjalne białka typu ParA i ParB. Analiza

sekwencji aminokwasowych tych białek pozwala określić je jako składniki systemu

partycyjnego typu Ib (Ebersbach i Gerdes, 2005). Wskazuje na to: (i) typowa wielkość białek

(192-308 aa dla ParA, 46-131 aa dla ParB), (ii) obecność zmienionego motywu Walkera w N-

końcowej części białka ParA oraz brak motywu HTH, (iii) słabe konserwowanie sekwencji

aminokwasowej białka ParB. orf11 i orf12 znajdują się w tej samej orientacji transkrypcyjnej,

odległość między nimi wynosi 61 pz. Możliwe jest, że tworzą one operon, co jest cechą

45

charakterystyczną systemów PAR. W systemach partycyjnych typu Ib sekwencja

centromeropodobna (parS), rozpoznawana przez białko ParB, znajduje się zazwyczaj powyżej

operonu. Składa się ona z kolejno ułożonych prostych powtórzeń sekwencji (Ebersbach i Gerdes,

2005). W sekwencji plazmidu pOK1 nie zidentyfikowano sekwencji o takiej strukturze -

zarówno poniżej, jak i powyżej genów operonu.

pOK1 1 MKVISVLNQKGGSGKTTIATHLARCIHNAGSSVLLVDSDPQGSARDWSAVNEENPITVIG 60

SH04 1 MKVISVLNQKGGSGKTTIATHLARCIHNAGSSILLVDSDPQGSARDWSAVNEENPITVIG 60

axonopodis 1 MKVIAVLNQKGGSGKTTIATHLARALQLAGADVLLVDSDPQGSARDWAAVREDQPLTVVG 60

oboediens 1 MKVIAVLNQKGGSGKTTIATHLARALQIGGADVLLVDSDPQGSARDWAAVREEQPVTVVG 60

pOK1 61 IDRPTIDRDLKAISNKDFIVIDGAPQTADLAISAIKASDFILIPVQPSPYDIWATSDLVD 120

SH04 61 IDRPTIDRDLKAISNKDFIVIDGAPQTADLAISAIKASDFILIPVQPSPYDIWATSDLVD 120

axonopodis 61 IDRPTIDRDVKAIGRRDFVVIDGAPQAADLAVSAIKAADFVLIPVQPSPYDIWATADLVE 120

oboediens 61 IDRPTIERDLKNIARKDFVVIDGAPQAADLAVSAIKASDFVLIPVQPSPYDIWATSDLVD 120

pOK1 121 LVKQRIEMTDGKLKVAFVVSRAITGTKIGHEIHEALEGYELPILTTRITQRISYPSSAAL 180

SH04 121 LVKQRIEMTDGKLKVAFVVSRAITGTKIGHEIHEALEGYELPILTTRITQRISYPSSAAL 180

axonopodis 121 LVKQRIEVTDGRLQAAFVVSRAIKGTRIGGEVAEALAGYELPILESRITQRVSYPGTAAA 180

oboediens 121 LVKQRIEVTDGKLQAAFVVSRAIKGTRIGAEITEALKGYGLPILESRITQRVSYPGTAAG 180

pOK1 181 GKTVFDIEPKGEASKEILNLYNEIMDEYLSK 211

SH04 181 GKT---------------------------V 184

axonopodis 181 GTTVLESEPEGDAAREVQALAAEIKSKL--I 209

oboediens 181 GSTVMDVEPGSDASKEILSLSNEIKRKL--I 209

Fig. 11. Porównanie sekwencji aminokwasowych Orf11 i białek pokrewnych.

Sekwencje porównywane z sekwencją wyróżnioną w plazmidzie pOK1 pochodzą kolejno z Wohlfahrtiimonas

chitiniclastica SH04 (GenBank: WP_008316972.1) (SH04), Xanthomonas axonopodis (GenBank:

WP_017154884.1) (axonopodis) oraz Gluconacetobacter oboediens (GenBank: WP_010516180.1) (obodiens). Na

niebiesko zaznaczono aminokwasy identyczne we wszystkich sekwencjach, na szaro – identyczne w trzech z nich.

Kolorowymi ramkami zaznaczono przewidywaną strukturę drugorzędowa opisywanego białka. Obramowaniem

zaznaczono aminokwasy tworzące zmieniony motyw Walkera. Żółta czcionką zaznaczono aminokwasy

zaangażowane w wiązanie jonów magnezu.

Potencjalny produkt białkowy orf33 również wykazuje podobieństwo sekwencji aa do

białek partycyjnych. Najbliższym homologiem (podobieństwo sekwencji 57%) jest białko

pochodzące z Nitrosomonas eutropha C91, opisane jako białko partycyjne C (GenBank:

YP_743797.1), o długości identycznej z Orf33. Zarówno w sekwencji Orf33, jak i jego

homologów, nie wyróżniono żadnych konserwowanych domen białkowych ani motywów

sekwencji (analiza porównawcza programami: Pfam, NCBI Conserved Domain Search,

InterProScan). Kolejna ORF (orf34) koduje potencjalne białko, wykazujące podobieństwo

sekwencji (99%) do białka ParA plazmidu pAb5S9 Aeromonas bestiarum (GenBank:

46

YP_001220602.1). Inne pokrewne białka również zostały opisane jako białka o aktywności

ATPaz, zaangażowane w partycje plazmidów lub chromosomów.

W sekwencji Orf34 oraz w sekwencjach pokrewnych białek możliwe jest wyróżnienie

zmienionego motywu Walkera oraz miejsc odpowiedzialnych za wiązanie jonów magnezu (tak

jak w przypadku orf11). Również w tym przypadku analiza porównawcza pozwoliła zaliczyć

Orf34 do rodziny CbiA – białek typu CopQ/CopB/MinD/ParA wiążących się z DNA (Pfam:

PF01656) (Fig. 12).

pOK1 1 MIIGVLNQKGGVGKTTLSVNIAAALAHSGARVLLIDADPQGSSLDWSAAREGDPIFSVVG 60

bestiarum 1 MIIGVLNQKGGVGKTTLSVNIAAALAHSGARVLLIDADPQGSSLDWSAAREGDPIFSVVG 60

savastanoi 1 MIIGVLNQKGGVGKTTLSVNIAAALAQGGARVLLIDADPQGSSLDWSAAREGEPLFSVVG 60

variicoloris 1 MIVGLLNQKGGVGKTTLSVNLAASLARTGARVLLIDADPQGSALDWAAAREGEPLFSVVG 60

pOK1 61 LPRASVHKEIGQVGQGYDHIIIDGPPRVTDLARSAIMASDLVLIPVQPSPYDVWAADEVV 120

bestiarum 61 LPRASVHKEIGQVGQGYDHIIIDGPPRVTDLARSAIMASDLVLIPVQPSPYDVWAADEVV 120

savastanoi 61 LPRPSIHKEISQVGKGYDHIIIDGPPRVTDLARSAIMASDVVLIPVQPSPYDIWAADEVV 120

variicoloris 61 LPRPTVHKEIGQIGHGYDHIIIDGPPRVTDLARSAIMAADVVLIPVQPSPYDIWAADEVV 120

pOK1 121 KLIQEATVYKENLKSAFVVNRKIANTAIGRDVGEALAAYEMPILTSTVTQRVIYAEAAAQ 180

bestiarum 121 KLIQEATVYKENLKSAFVVNRKIANTAIGRDVGEALAAYEMPILTSTVTQRVIYAEAAAQ 180

savastanoi 121 KLVQEATVYKEKLKYAFVVNRKIANTAIGRDVGDALAAYPVPVLSSTITQRVIYAEAAAQ 180

variicoloris 121 KLIEEARVYKENLKSAFVVNRKIANTAIGRDVGEALAAYPVPALVASITQRVVFAEAAAQ 180

pOK1 181 GKAVFEIDTVGPAAAEIAALVAEILEFAK 209

bestiarum 181 GKAVFEIDTAGPAAAEIAALVAEILEFAK 209

savastanoi 181 GKAIFEIAAEGPATAEIQTLVAELLEFGK 209

variicoloris 181 GRAVHEIDGQGPAAAEIEAMRAELMEFAR 209

Fig. 12. Porównanie sekwencji aminokwasowych Orf34 białek pokrewnych.

Sekwencje porównywane z sekwencją wyróżnioną w plazmidzie pOK1 pochodzą kolejno z Aeromonas bestiarum

(GenBank: YP_001220602.1) (bestiarum), Pseudomonas savastanoi (GenBank: WP_004661920.1) (savastanoi)

oraz Singularimonas variicoloris (GenBank: WP_020651362.1) (variicoloris). Na niebiesko zaznaczono

aminokwasy identyczne we wszystkich sekwencjach, na szaro – identyczne w trzech z nich. Kolorowymi ramkami

zaznaczono przewidywaną strukturę drugorzędowa Orf34. Obramowaniem zaznaczono aminokwasy tworzące

zmieniony motyw Walkera. Żółta czcionką zaznaczono aminokwasy zaangażowane w wiązanie jonów magnezu.

Analiza porównawcza wskazuje, że produkt białkowy Orf34 to składnik systemu

partycyjnego Ib, o czym świadczą: typowa wielkość białka (209aa), obecność zmienionego

motywu Walkera w części N-końcowej oraz brak motywu HTH. Ponieważ w sekwencji pOK1

nie wyróżniono w pobliżu orf34 potencjalnego genu kodującego białko ParB możliwe jest, że

jest to system defektywny. Jest mało prawdopodobne, aby opisywana wcześniej orf33 mogła

kodować białko typu ParB. Oba potencjalne geny znajdują się w znacznej odległości od siebie –

47

315 pz. Zarówno powyżej, jak i poniżej opisywanych ORF, nie zidentyfikowano potencjalnej

sekwencji centromeropodobnej.

2.2.2. Systemy toksyna-antytoksyna

Komórki pozbawione plazmidów pojawiają się w populacji z niską częstością, co jest, między

innymi, wynikiem działania systemów toksyna-antytoksyna (TA), warunkujących

posegregacyjną eliminację komórek bezplazmidowych.

Podstawą funkcjonowania systemów TA jest kodowanie dwóch czynników - jednego

wywołującego efekt toksyczny (toksyna), oraz drugiego - nietrwałej antytoksyny (odtrutki),

przeciwdziałającej działaniu toksyny. Stężenie antytoksyny w komórce jest zazwyczaj większe

niż toksyny. Toksyną zawsze jest białko, a antytoksyną może być białko lub antysensowny

RNA. W komórce plazmidowej zachodzi ciągła synteza antytoksyny, która tworzy stabilny

kompleks z toksyną, co zapobiega ekspresji efektu toksycznego. Z chwilą utraty plazmidu, ilość

antytoksyny szybko ulega zmniejszeniu (degradacja przez proteazy komórkowe Lon lub Clp), co

powoduje uwolnienie toksyny z kompleksu lub rozpoczęcie jej syntezy. Komórka

bezplazmidowa jest eliminowana, a w populacji pozostają jedynie komórki posiadające plazmid.

Zazwyczaj białko antytoksyny zawiera dwie domeny: (i) odpowiedzialną za wiązanie DNA oraz

(ii) za interakcje z toksyną (Brown i wsp., 2009).

Systemy TA występują także powszechnie, często w wielu kopiach, w chromosomach

bakteryjnych (Gerdes, 2000). Wykazano zaangażowanie tych systemów w odpowiedzi ścisłej na

warunki stresowe. Funkcją chromosomowych systemów TA jest dostosowanie poziomu syntezy

makromolekuł (białek, DNA) do ilości dostępnych składników odżywczych. Ich aktywacja, w

zależności od rodzaju systemu, może obniżyć poziom replikacji lub translacji, co prowadzi do

zmniejszenia tempa metabolizmu (Gerdes i wsp., 2005). Wykazano, że chromosomowe

homologi genów systemów TA, po przeniesieniu do plazmidów zwiększają ich stabilność

(Aizenman i wsp., 1996).

W sekwencji plazmidu pOK1 wyróżniono trzy systemy TA. Wszystkie wykazują

największą identyczność sekwencji aa, na poziomie 95-100%, z systemami zidentyfikowanymi

w genomie szczepu Wohlfahrtiimonas chitiniclastica SH04. Dwa systemy są identyczne.

Wszystkie zidentyfikowane loci to dwugenowe układy, w których gen antytoksyny poprzedza

gen toksyny. Na Fig. 13 przedstawiono schemat organizacji omawianych systemów TA.

48

Fig

Fig. 13. Schemat organizacji genetycznej systemów TA wyróżnionych w genomie plazmidu pOK1.

Kolorowymi strzałkami zaznaczono ORF systemów TA (ant – gen antytoksyny, tox – gen toksyny) oraz sekwencji

inercyjnych (IS), wbudowanych w jeden z układów. Kolorową czcionką zaznaczono potencjalne sekwencje

promotorów.

Analizowane systemy wykazują wyraźne podobieństwo do systemów, w których

zarówno toksyna jak i antytoksyna są białkami. Systemy te należą zatem do II typu systemów

TA (Yamaguchi i Inouye, 2009). Kompleks toksyny i antytoksyny lub sama antytoksyna działa

jako represor transkrypcji operonu TA, poprzez wiązanie się do palindromowej sekwencji

znajdującej się w regionie promotorowym operonu. Wiązanie to jest możliwe dzięki domenie

obecnej w antytoksynie, o strukturze wstążki-helisy-helisy lub HTH (Brown i wsp., 2009). W

większości przypadków gen antytoksyny poprzedza gen toksyny. Przewidywane białkowe

produkty orf14 i orf15 pOK1 (Pfam: PF02604, PF06769) wykazują 100% podobieństwo

sekwencji do białek toksyny YoeB i antytoksyny YefM (system yoeB-yefM) (Zhang i Inouye,

2009). Antytoksyna YefM jest wysoce niestabilna, co wynika z jej degradacji przez proteazę Lon

oraz ATP-zależne proteazy serynowe. Wykazano, że białko to w czystej formie istnieje w

postaci zdenaturowanej, bez struktury drugorzędowej. Gdy YefM podlega ekspresji wraz z

toksyną YoeB, dimer YefM tworzy stabilny kompleks z cząsteczką YoeB (Cherny i Gazit,

2004). YoeB łączy się z podjednostką 50S rybosomu, specyficznie blokując tworzenie

49

kompleksu inicjatorowego. Oczyszczona toksyna YoeB wykazuje aktywność endorybonukleazy

(Zhang i Inouye, 2009). Na Fig. 14 i Fig. 15 przedstawiono porównanie sekwencji

aminokwasowych omawianych białek z ich najbliższymi homologami.

ant\SH04 1 MHVFTYTDARNNLKSVLDKVVDDADVAFITRKEGGHAVVMGQDHYNSLMETLYLLSSPNN 60

ANC 1 MHVFTYTDARNNLKSVLDKVIDDADVAFITRKEGGHAVVMGQDHYDSLMETLYLLSSPNN 60

CIP 1 MHVFTYTDARNNLKSVLDKVIDDVDVAFITRKEGGHAVVMGQDHYDSLMETLYLLSSPNN 60

Naval-82 1 MHVFTYTDARNNLKSVLDKVIDDADVAFITRKEGGHAVVMGQDHYDSLMETLYLLSSPNN 60

ant\SH04 61 TNRLNESIAQLRSGQVTIRELIED--E 85

ANC 61 TTRLNESIAQLRAGKTKQRELIIDDES 87

CIP 61 ASRLNESIAQLRAGKTKHRELIEDDES 87

Naval-82 61 TTRLNESIAQLRAGKTKQRELIKDDES 87

Fig. 14. Porównanie sekwencji aminokwasowych białka antytoksyny Orf15 i białek pokrewnych.

Sekwencje porównywane z sekwencją antytoksyny (identyczna z sekwencją pochodzącą z Wohlfahrtiimonas

chitiniclastica SH04) (ant\SH04) pochodzą kolejno z Acinetobacter indicus 4215 (GenBank: EPF73072.1) (ANC),

Acinetobacter sp. CIP 70.18 (GenBank: WP_000557944.1) (CIP) oraz Acinetobacter baumannii (GenBank:

WP_000557943.1) (Naval-82). Na niebiesko zaznaczono aminokwasy identyczne we wszystkich sekwencjach, na

szaro – identyczne w trzech z nich. Za pomocą kolorowych ramek zaznaczono przewidywaną strukturę

drugorzędowa opisywanego białka antytoksyny (YefM).

tox\SH04 1 --MNSRNIEWTSNSWDEYIYWQTQDKKILKRINSLIKECQRTPFEGTGKPEPLKANLSGF 58

AYE 1 MRMTNRNVEWTDNAWDEYIYWQTQDKKILKRINTLIKECQRTPFEGTGKPEPLKANLSGF 60

CIP 1 --MTSRNVEWTENAWDEYIYWQTQDKKILKRINTLIRECQRTPFEGTGKPEPLKANLSGF 58

baumannii 1 --MTSRNVEWTENAWDEYIYWQTQDKKILKRINTLIRECQRTPFEGTGKPEPLKANLSGF 58

tox\SH04 59 WSRRIDEKHRLVYEVTDEKISIVQCRFHY 87

AYE 61 WSRRIDEKHRLVYEVTDERISIIQCRFHY 89

CIP 59 WSRRIDEKHRLVYEVTDERISIVQCRFHY 87

baumannii 59 WSRRIDEKHRLVYEVTDERISIIQCRFHY 87

Fig. 15. Porównanie sekwencji aminokwasowych białka toksyny Orf14 i białek pokrewnych.

Sekwencje porównywane z sekwencją toksyny (identyczna z sekwencją pochodzącą z Wohlfahrtiimonas

chitiniclastica SH04) (tox\SH04) pochodzą kolejno z Acinetobacter baumannii AYE (GenBank: YP_001708683.1)

(AYE), Acinetobacter junii CIP 107470 (GenBank: ENV52222.1) (CIP) oraz Acinetobacter baumannii (GenBank:

WP_000203952.1) (baumanii). Na niebiesko zaznaczono aminokwasy identyczne we wszystkich sekwencjach, na

szaro – identyczne w trzech z nich. Za pomocą kolorowych ramek zaznaczono przewidywaną strukturę

drugorzędowa opisywanego białka toksyny (YoeB).

W systemie orf14-orf15 pOK1 gen antytoksyny (o długości 258 pz) nakłada się (8

nukleotydów) na gen toksyny (264 pz). Przed operonem zidentyfikowano potencjalny promotor

(Fig. 13), nie występuje tam jednak sekwencja palindromowa, konserwowana w innych

systemach TA, (warunkująca oddziaływania z represorem).

Kolejny system TA pOK1 tworzą orf20 i orf23. Ich produkty białkowe wykazują

największe podobieństwo do hipotetycznych białek kodowanych w genomie Wohlfahrtiimonas

chitiniclastica. Pokrewne białka (50-70% identyczności sekwencji) to antytoksyny i toksyny z

50

rodziny RelB-RelE. Na Fig. 16 i Fig. 17 przedstawiono porównanie omawianych sekwencji z

białkami im pokrewnymi.

W genomie pOK1 gen antytoksyny i toksyny zostały rozdzielone w wyniki transpozycji

dwóch sekwencji insercyjnych, co spowodowało rozerwanie ciągłości genu antytoksyny

(przewidywane skrócenie białka z 73 do 68 aminokwasów). Prawdopodobnie system ten nie jest

funkcjonalny. Identyczny moduł TA występuje również w innej lokalizacji pOK1 (orf47 i orf48)

(Fig. 1 i Fig. 13), nie jest on jednak zinaktywowany przez IS.

ant 1 MSIISIRLNDYEANLFKEYAAFHGESLSSLFKASLLEKMEDELDLKLLEEAIIYNEKHPE 60

9401234 1 MT-ISVRLSERDAKLFKTYADINGISMSELIRSSVLERIEDEYDIKIYEEAMKEYLSDPE 59

SH04 1 MSIVSIRLNDHEANLFKEYAEFHGASLSSLFKASLLEKMEDELDIKLLEEAIIYNKKHPE 60

ureolytica 1 MSIISVRLNATEERLFTEYAEFHGKSLSTLLKESLAEKMEEELDAKLLVEAKEYNKKNPE 60

ant 61 TYTHDEVKKALGL 74

9401234 60 TYSMDEVEKELGL 73

SH04 61 TYTHDEVRKVLGL 74

ureolytica 61 TYTHQQVKEKLGL 74

Fig. 16. Porównanie sekwencji aminokwasowych białka antytoksyny Orf20 i białek pokrewnych.

Sekwencje porównywane z sekwencją antytoksyny pOK1 (ant) pochodzą kolejno z Clostridiales bacterium

9401234 (GenBank: WP_019214504.1) (9401234), Wohlfahrtiimonas chitiniclastica SH04 (GenBank:

ELV07245.1) (SH04) oraz Oligella ureolitica (GenBank: WP_018574598.1) (ureolitica). Na niebiesko zaznaczono

aminokwasy identyczne we wszystkich sekwencjach, na szaro – identyczne w trzech z nich. Kolorowymi ramkami

zaznaczono przewidywaną strukturę drugorzędowa opisywanego białka antytoksyny.

tox 1 M-YQVIYTAKAVKSLKKIDKTQAKLILSWIEKNLIGCSDPRIKGKEIKGDL-ADWRYRVG 58 MJ3 1 MSYQVVYTKKAIKSLKKVDKAQQRLIIAWIEKHLINAKDPRALGKALKEDLKAYWRYRVG 60

SH04 1 M-YQVIYTAKALKSLKKIDKTQAHLILNWIEKNLIGCSDPRIKGKEIKGNL-ADWRYRVG 58

ureolytica 1 M-FQVIYTAKALKSLSKLDKTQARLIVAWIEKNLVNSSNPRFTGKNIKGDL-ADWRYRVG 58

tox 59 DYRLLCNILDEEIIIEVINVGHRKDIYK 86

MJ3 61 DYRILADINDNEIKIIVFNIGHRKDIYE 88

SH04 59 DYRLLCNISDEEITIEVINVGHRKDIYK 86

ureolytica 59 NYRILCHIIDQTITIEVVNIGHRKDIYK 86

Fig. 17. Porównanie sekwencji aminokwasowych białka toksyny Orf23 i białek pokrewnych.

Sekwencje porównywane z sekwencją toksyny pOK1 (tox) pochodzą kolejno z Salimicrobium sp. MJ3 (GenBank:

WP_008587660.1) (MJ3), Wohlfahrtiimonas chitiniclastica SH04 (GenBank: ELV07244.1) (SH04) oraz Oligella

ureolitica (GenBank: WP_018574597.1) (ureolytica). Na niebiesko zaznaczono aminokwasy identyczne we

wszystkich sekwencjach, na szaro – identyczne w trzech z nich. Kolorowymi ramkami zaznaczono przewidywaną

strukturę drugorzędowa opisywanego białka toksyny.

System relBE jest jednym z najlepiej poznanych systemów TA. Toksyna (RelE)

oddziałuje z miejscem A rybosomu, powodując przecięcie mRNA pomiędzy drugim a trzecim

nukleotydem kodonu stop, co prowadzi do zahamowania translacji (Pedersen i wsp., 2003).

Wykazano, że RelE przecina mRNA na początku regionu kodującego (pierwsze sto kodonów)

51

(Hurley i wsp,. 2011). Sama toksyna RelE nie ma aktywności endorybonukleolitycznej, uważa

się jednak że jest czynnikiem oddziałującym z rybosomem, stymulującym jego endogenną

aktywność rybonukleolityczną (Pedersen i wsp., 2003). Białka RelE i RelB tworzą

tetrameryczny kompleks, w którym cząsteczka RelB okala cząsteczkę RelE. W pełni

funkcjonalne homologi systemu relBE są znajdowane w szczepach bakteryjnych oraz u

archeonów, zarówno w chromosomach, jak i w plazmidach.

W sekwencji antytoksyny pOK1 nie znaleziono żadnej konserwowanej domeny. W

sekwencji toksyny znajduje się domena charakterystyczna dla białek systemów stabilizujących

plazmid (Pfam: PF05016). Do tej rodziny należą białka systemów parDE oraz relBE.

2.2.3 System restrykcji-modyfikacji

Systemy restrykcji modyfikacji (R-M) występują powszechnie u Procaryota. Geny tych

systemów identyfikuje się zarówno w chromosomach, jak i w plazmidach. Systemy R-M

składają się zazwyczaj jedynie z genów kodujących dwa enzymy: (i) endonukleazę (REaza),

rozpoznającą specyficzną sekwencję w DNA oraz (ii) metylotranferazę (MTaza), która poprzez

metylację tej sekwencji, zabezpiecza ją przed przecięciem przez endonukleazę. Uważa się, że

obecność tego typu systemu zabezpiecza komórkę przed inwazją obcego DNA. Udowodniono,

że obecność genów systemów R-M (np. EcoRI lub PaeR7) w plazmidzie zwiększa jego

stabilność segregacyjną (Naito i wsp., 1995). Systemy te, podobnie jak systemy TA, funkcjonują

na zasadzie posegregacyjnego zabijania komórek bezplazmidowych. W tym wypadku obydwa

enzymy - endonukleaza (odpowiednik toksyny) i metylotransferaza (odpowiednik antytoksyny)

są stabilnymi białkami. Efekt toksyczny objawiający się w komórkach bezplazmidowych

(pozbawionych systemu R-M) polega, w tym przypadku, na stopniowym rozcieńczaniu białek

endonukleaz i metylotransferazy w kolejnych podziałach komórkowych. W rezultacie nie

wszystkie sekwencje genomu są metylowane, a wówczas nawet śladowa aktywność

endonukleazy wystarcza do przecięcia sekwencji i rozerwania ciągłości genomu. W sekwencji

plazmidu pOK1 wyróżniono dwie ORF systemu R-M: (i) orf05 – kodująca MTazę i orf07 -

kodująca REazę. Obie ORF ułożone są w tej samej orientacji transkrypcyjnej (Fig. 1).

ORF kodująca potencjalną metylotransferazę wykazuje największą identyczność

sekwencji aa (58%) do metylotransferazy N-4/N-6 pochodzącej z Acinetobacter sp. HA

(GenBank: WP_008305575.1), opisanej jako adenino-zależna metylotransferaza Mod. Inne

białka homologiczne Orf5 pOK1 pochodzą z różnych szczepów Acinetobacter spp., a także z

innych bakterii reprezentujących różne klasy taksonomiczne. Białka te opisywane są jako

52

metylotransferazy systemów restrykcyjnych typu III. Na Fig. 18 przedstawiono porównanie

sekwencji aminokwasowych omawianego białka oraz białek pokrewnych.

pOK1 1 MSIQFLALVAKLKEIFQINRPDLDFGVYRILNARSKEIEEFLNQRLKKKVEISLQESAQS 60 HA 1 MSTQFSALVSKLKEIFQINRPDLDFGVYRILNSRSDEIAEFLDKRLKTKVEQYLGEAKSS 60

MTCC 1 MSTQFSALVSKLKEIFQINRPDLDFGVYRILNARSTEIAEFLDKRLKTKVEQYLGEAKSS 60

aquimarina 1 MS-KYNELVKKLKEIFQIDKPELDFGIYRILNAKADEINNYLENTLKKKISDALASAGNA 59

pOK1 61 LDQNALKDLEDELRDEYGKRAFDEFGELVDTEALNSRVGKKYLALKNSGANQYADESQVY 120

HA 61 LDENAIKELEAELKAEFGKRAFNEQGELIDAEAIESALGQKYIALTQADAHEMTDQSQVY 120

MTCC 61 LDENVLKELEAELKAEFGKRAFNEQGELIDQEAIESALGQKYIALTQADAHEMTDQSQVY 120

aquimarina 60 NKEELERQLAEAIKNAEGA-GFNPD----DSPKVKDLRAQ--ITASSQGANE--HENAVF 110

pOK1 121 NHLLTFFSRYYDEGDFISQRRYKGDTYAIPYSGEEVMLHWANKDQYYTKSGEMFSNYRFK 180

HA 121 SHLLTFFSRYYDEGDFISQRRYKGDTYAIPYSGEEVMLHWANKDQYYTKSGEMFSNYRFK 180

MTCC 121 SHLLTFFSRYYDDGDFISQRRYKGDTYAIPYSGEEVMLHWANKDQYYTKSGEMFSNYRFK 180

aquimarina 111 THLLTFFSRYYDSGDFVSKRRYKGDTYAIPYAGEEVMLHWANKDQYYIKSGENFSNYSFK 170

pOK1 181 LANGKSVLFKLLSADTARENRKDNDKNRCFNLVTEVRTIVKYDEDGEEYEEVIQPFEI-- 238

HA 181 LNDERSVLFRLVSADTARENRKDNDKDRRFIIVTEPKTFTRIDEDGEEFEETIVPFSI-- 238

MTCC 181 LNDERSVLFRLVSADTARENRKDNDKDRRFIIVTEPKTFTRIDEDGEEFEETIVPFSI-- 238

aquimarina 171 LDDGRKVTFKLLAADTAKDNRKDNDADRRFVLV-EQHTRIKYDDEGLDYEDEVLPIVVDS 229

pOK1 239 --IDNELVCLFEYVSFPTTTKQSALNTKALDFIVGSNLISTEWKDELLTLAPTEKDNKRT 296

HA 239 --QNNELTILFEYATLPKGSKQETLNIESYNKIVSAKVLTTDWLNDLAQPAPTEKEPKRT 296

MTCC 239 --QNNELTILFEYATLPKGSKQETLNIESYNKIVSAEVLTTDWLNDLAQPAPTEKEPKRT 296

aquimarina 230 SGEQDELVIQFEYKVVKKGTKQEALVSQALDAILSNSNIQSDWV-DVTKREPTEKNPNRT 288

pOK1 297 ELQKHLDIYTQKNTADYFIHKDLGKFLRHELDFYIKNEVMHLDNVISSDDFTQIERQLTI 356

HA 297 VLQKHLSTYTQKNTADYFIHKDLGKFLRHELDFYIKNEVMHLDDVVSTDQFIQIERQLSI 356

MTCC 297 VLHKHLSTYTQKNTADYFIHKDLGKFLRHELDFYIKNEVMHLDDVVSTDQFIQIERQLSI 356

aquimarina 289 LLEKHLTTYTQRNTADYFIHKDLGGFLSNELDFYIKNEVMNLDNVQNAEVFSDIEKQLRM 348

pOK1 357 IKCLRQVGLEIIDFLASLEDFQKKLWLKKKFVVSSHYCITLDRIDENFYPAIVANDKQWN 416

HA 357 IKCLRQIGLEIISFLASLEDFQKKLWLKKKFVVSAEYCITLDRVDESLYAEIAENTAQWQ 416

MTCC 357 IKCLRQIGLEIISFLASLEDFQKKLWLKKKFVVSAEYCITLDRVDDSLYAEIAENTSQWQ 416

aquimarina 349 IQCLRSISKDIVSFLAQLENFQKKLWEKIKFSWGVNYYISLCKIDTLTLSQLDISEQQIQ 408

pOK1 417 EWESLGFKEKTPNWQTLEYLQAHPYMMVNTALFDLLFKSKLLNSIEDIDEQTNGLIIHSD 476

HA 417 QWEDLGFKGTDAGWGTADYLKQHQALMVDTSLFSLEFKVELLKRIDDLDAQTDGLIIHSD 476

MTCC 417 QWEDLGFKGTDAGWGTIDYLKQHQALMVDTSLFSIEFKARLLKTIDDLDAQTDGLIIHSD 476

aquimarina 409 EWKFLYDLDLESQISITSLADAFPNLMLNTEFMSIESRLKVLSVIEGLDDQLTGTVINSD 468

53

pOK1 477 NFQAISLLENKYKNNIDTVYIDPPYNAKTSEILYKNTFKHASWLSFMDSRLEKTLPLLAK 536

HA 477 NFQALNLIKDKYDSNIQSIYIDPPYNTNASEIIYKNGFKHSSWLSLLDSRFDLTKKLMNK 536

MTCC 477 NFQALRLIEKKYNNTVQSIYIDPPYNTSASEILYKNSFKHSSWATLIENRIEESTSLLKK 536

aquimarina 469 NFQGLQFLKSRYNDKIDCIYIDPPYNATSSEILYKNNFKHSAWLSFIESRLIVAKKLMHP 528

pOK1 537 RSAMCIAIDENEQEYLGMLLGNAYPQYRKHCVALV-HNKKGIQG-KDFSYCHEYAYFLLS 594

HA 537 DSLICVTIDDVEKDKLKMLMDYSFGYENSMGTIVIRNNPSGRSTTKGVSIAHEYGLLYSK 598

MTCC 537 QGLLCVTIDDLELYNLKMILDQQFGAENFLANVLIRNNPSGRSTLKGFSVNHEYGLFYSK 598

aquimarina 529 EATIIIAIDENEQERLGLLIDNLFPNHDKFCISII-HNPAGVQG-INFSSSHEYAYFVFP 586

pOK1 595 EDHMG-----------SNDYILPE--KDWEWSNLRKWGSESTRDTAANCFYPIFIK-D-D 639

HA 597 SE-SAVVGRLPRNEKQDSRYKEVDEVGKFEWVNFRKHGGM--KSDAPSMYYPIFIS-G-D 651

MTCC 597 GELENGVGRLPHDEAQRSRYSLKDNKGFFEWENLRRNGPDSRKEDRPKQYYPIKYNKVEK 656

aquimarina 587 KG-GNYIGQTEREEPL--------------ISNFRDWGGTSARKLAKTCFYPIKVK-D-N 629

pOK1 640 RIIGFGDVCPNDFHPES-NNIE-CGDGS-IAVYPIDQSGIERKWRYERGTVEGILSLLRV 696

HA 652 TL-RIPDMEFNEISKEWLL-KEEPRGNE-VVIYPIDEHGLDRRWKWGIDRFKNELKNCKV 708

MTCC 657 SI-ALLPMEWDERKKTWSHSINSINENE-IILWPHHPKGELKVWRYSKEHIENEPERFQV 714

aquimarina 630 KIVGFGDVCDEDFHPIS-SN---VQDGEITLVYPIDSKGVERKWVFSKSTAERDSDQLFV 685

pOK1 697 NRSK-NELQIQKAKND----LKFKTIWDKNTYIAGDYGTRIVTDIGINTGNNLFPKSIYT 751

HA 709 SNDKSGKKAVYIKARMNEEGVLPMTWWDQKEYSATAYGTNLLKTFFKSLDSFSYPKALNA 768

MTCC 715 IEKD-GLFEVYRKKYINSEGILPRTWWEKPGYSARDNGTRALIEFFGQVAQFDFPKAKDA 773

aquimarina 686 VEDK-GEISIKRKKTT----RSHRTVWDSKKYYANIYGSKVITSMFGE-QPFSFPKSIHT 739

pOK1 752 VKDSIYAISQ---MNDTVLDYFGGSGTTAHATIELNREDNGNRKYILVEQGEYFDTVIKP 808

HA 769 VKDMLKVLSNK-NSNDIVLDYFGGSGTTAHATIALNREDHGNRKYILVEQGEYFDTVIKP 827

MTCC 774 VKDCFKVLK-L-NSKDIALDYFGGSGTSAHAVIDLNREDKGTRKYILMEQGEYFNTVLKP 831

aquimarina 740 VEDCLKALSRFRKKNGIVMDFFAGSGTTGHAAINLNRQDGGTRKFILVEQGDYCKKVTIP 799

pOK1 809 RIQKVVYSKDWKDGKPINTDTGISHCLKVMKLESYEDTLNNLELKRSGDQERLFNGLKD- 867

HA 828 RIQKVIYSADWKEGKPTNPESGISHCLKVVKLESYEDTLNNLELVRKGTQQTLLAEQQTS 887

MTCC 832 RIQKVVYSADWKGGKPTNPESGISHCLKVVKLESYEDTLNNLELVRKGAQQTLLAEQQTS 891

aquimarina 800 RVLKAMYSSRWKSGSPELNDS-ISGIVKVLSIESYEDSLNNLELRKSQATGDLFDSMPE- 857

pOK1 868 ------KQKDDYLMHYMLNIESKGSLLSINDFRKPFDYQMNITTDSAGAYEKQKVDLVET 921

HA 888 AKPEDQNAYSDYLMHYMLELESKDSLLNVKDFLKPFSYQMNITTDSAGAFERKNIDLVET 947

MTCC 892 TKPEDQNAYSDYLMHYMLELESKDSLLNVKDFLKPFSYQMNITTDSAGAFERKNIDLVET 951

aquimarina 858 ------QAKSDYLLNYMLETESKGSLLSTDDFKKPFDYKMKIAVDSAGAFEERNIDLVET 911

pOK1 922 FNYLIGLEVQYIDSQLERGYIQVTGKLRNGDKATILWRDCEKIGYEELTELLDKKLKISA 981 HA 948 FNYLIGMNVQEVDYQLDKGYAQITGKLRTGEYTTVLWRDCEKIGYAELDQLLS-KLKINP 1006

MTCC 952 FNYLIGMNVREADYQLDKGYVQITGQLRTGEYTTVLWRDCDKIGYAELDQLLA-KLKINP 1010

aquimarina 912 FNYLVGLHVNTVESNIERGYVRVEGNLPSGEKALILWRDCEKIGYDDFTKFAN-RFDLFA 970

54

pOK1 982 SDSEYDVIYINGDHTINNRLITDGEQGGKNLKIRSVEQEFLTRMFE---GE 1029 HA 1007 NDGEYQLIYINGDHNVASKYTTKEGE-EKQLKVRSIEQTFLKNMFE----E 1052

MTCC 1011 NDGEYQLIYINGDHNVASKYTTKEGE-EKQLKVRSIEQTFLKNMFE----E 1056

aquimarina 971 KEKTFDVIYVNGDHNLPTAFTSDEGEVTRTLKLRQIEPEFLELMFAPDELA 1021

Fig. 18. Porównanie sekwencji aminokwasowych metylotransferazy Orf5 pOK1 i białek pokrewnych. Sekwencje porównywane z metylotransferazą pOK1 (pOK1) pochodzą kolejno z Acinetobacter sp. HA (GenBank:

WP_008305575.1) (HA), Acinetobacter junii (GenBank: EPR86960.1) (MTCC) oraz Kangiella aquaimarina

(GenBank: WP_018624524.1) (aimarina). Na niebiesko zaznaczono aminokwasy identyczne we wszystkich

sekwencjach, na szaro – identyczne w trzech z nich. Obramowaniem zaznaczono domenę charakterystyczną dla

adenino – specyficznych metylotransferaz DNA Mod. Rzymskimi cyframi zaznaczono sekwencje motywów

charakterystycznych dla metylotransferaz. Żółta czcionka oznacza silnie konserwowane w motywie aminokwasy.

Kolorowymi ramkami zaznaczono przewidywaną strukturę drugorzędowa zidentyfikowanej metylotransferazy.

Sekwencje rozpoznawane przez metylotransferazy typu III są asymetryczne.

Podjednostka układu odpowiadająca z specyficzność – metylotransferaza „Mod” – jest stale

aktywna, natomiast podjednostka odpowiedzialna za aktywność endonukleolityczną „Res” jest

aktywna tylko w kompleksie z Mod, aktywność restrykcyjna jest stymulowana przez S-

adenozylometioninę (AdoMet).

Wykorzystując program Conserved Domains Search zlokalizowano w Orf5 pOK1

domenę charakterystyczną dla adenino-specyficznych metylotransferaz DNA Mod (COG2189).

W jej obrębie wyróżniono dwa fragmenty domeny charakterystycznej dla rodziny N-4/N-6

metylotransferaz (Pfam: PF01555). Jest to rodzina, do której należą metylotransferazy DNA N-4

cytozyno-specyficzne oraz N-6 adenino-specyficzne.

Metylotransferazy N-6 adenino-specyficzna to enzymy, które przenoszą grupę metylową

na grupę aminową w pozycji C-6 adeniny w nici DNA. Są to enzymy znajdowane w trzech

istniejących typach bakteryjnych systemów R-M (w typie III metylotransferaza jest produktem

genu mod). Enzymy te zawierają w N-końcowej części konserwowany motyw Asp/Asn-Pro-Pro-

Tyr/Phe, który może brać udział w wiązaniu substratu lub determinować aktywność katalityczną

(Timinskas i wsp., 1995). AdoMet-zależne metylotransferazy mają konserwowaną domenę

katalityczną, o czym świadczy obecność we wszystkich grupach charakterystycznych motywów

(Malone i wsp., 1995). Motywy te zostały również zidentyfikowane w opisywanej sekwencji

pochodzącej z plazmidu pOK1 (Fig. 18). Funkcja poszczególnych motywów nie została

sprecyzowana, wiadomo jednak, że motywy I, III i X odpowiadają za wiązanie AdoMet, a

motywy IV, VI i VIII są zaangażowane w aktywność katalityczną, dzięki tworzeniu aktywnej

struktury z motywami V i VII (Schluckebier i wsp., 1995).

Otwarte ramki odczytu oznaczone jako orf06 i orf07 kodują potencjalną endonukleazę

restrykcyjną (odpowiednio jego N- i C- końcową część). Wyróżnione ORF nachodzą na siebie

(ponad 90 pz), zaś w obszarze wspólnym prawdopodobnie dochodzi do programowanej zmiany

55

ramki odczytu, co mogłoby prowadzić do powstania białka fuzyjnego. Alternatywnie gen ten

został zmutowany poprzez wprowadzenie mutacji, która zmieniła jego ramkę odczytu.

Potencjalne białko Orf6 wykazuje podobieństwo sekwencji (na poziomie 53-70%) do

endonukleaz restrykcyjnych typu III, pochodzących z różnych szczepów. Orf06 wykazuje

podobieństwo sekwencji do endonukleazy restrykcyjnej E. coli DEC1C (GenBank:

EHU17630.1). Enzym E. coli ma długości 991aa, a podobieństwo Orf6 obejmuje aminokwasy

od 1 do 787. Z kolei Orf07 wykazuje podobieństwo do tego samego białka E. coli - od 785

aminokwasu do końca polipeptydu. Na Fig. 19 i Fig. 20 przedstawiono porównanie sekwencji aa

wyróżnionych składowych systemu R-M pOK1 oraz białek pokrewnych.

pOK1 1 MAKKPIA----KKSKAVKVSFHNQLILTKWLWSHLNPSMLEKMRDQLDKPDYEGIETTGD 56

DEC1C 1 MAKKPTTGKAVKKETNSKLSFHKQLVLNRFMFHFFKDGTLQGLKNRLGEDRFEGIHED-- 58

HA 1 MAKAPKA----K-TKAVKVNFHEQLILNKWLWSKFNPNRLEGMKQQLDHPQFEGIEHEGD 55

baumannii 1 MAKAPKA----K-TKALKVNFHEQLILNKWLWSKFNPNRLEGMKQQLDHQQFEGIEHEGD 55

pOK1 57 NIGQTKFFTVLTSSLFNKHLIDSDTLRRYDLNIAQYWQQITEQRNEKEGHILNLKYFQYL 116

DEC1C 59 --GQSLFFHELSNYLFEVDLIDLDELRRYDLNIVQHWQQITEHRNRKEDTVLNMKYFQYL 116

HA 56 NTGQTKFFSVISNTLFNKQVIDIDVLRRYDLNIVKHWQKITEKRNEIEGHVLNLKYFQYL 115

baumannii 56 NAGQTKFFSVISNTLFNKQVVDIDVLRRYDLNIVKHWQKITEKRNEIEGHVLNLKYFQYL 115

pOK1 117 SLLFTEIYLDHYFNRQSEMIDALDIEIDKYNESQ----K-ELDTFQSYIAEDLNKVSFWN 171

DEC1C 117 SLLFTEIYLDWYFNRKQQLLDGLNNELAAYNAENDKTAKDRANQFKSYVLDDLNKLAYWN 176

HA 116 SLLFTELYLDQYFNHQADMLNELNVELEQYNDDQ----KIDADQFQQYLPEDLNKIGYWN 171

baumannii 116 SLLFTELYLDQYFHHQADMLNELNVELEQYNDDQ----KIDADQFQQYLPEDLNKIGYWN 171

pOK1 172 ATGSGKTLLMHVNILQYLHYFHQKYGVDKNPDQIILLTPNEGLSHQHFHDFELSGI-SAT 230

DEC1C 177 ATGSGKTLLLHVNILQYLHYFQNGN-SHHYPDKIILLTPDERLSKQHLDELENSGFTQYQ 235

HA 172 ATGSGKTLLMHVNILQYLDYFQHQNGDSTYPDQIILLTPNEGLSEQHLQELTDSGF-QAT 230

baumannii 172 ATGSGKTLLMHVNILQYLDYFQHQNGDSTYPDQIILLTPNEGLSEQHLQELTDSGF-QAT 230

pOK1 231 IFDKNRSRDSLLKDEIQIIDINKLSDRDGDKTVATSSLEGQNLVLIDEGHRGTS-SAGIW 289

DEC1C 236 LFDKSKS--APFKGTIEVIDINKLDDKMGDKTVAVEAFEGNNLVLIDEGHKGTGSAAGAW 293

HA 231 LFDKQKSRNSLYRDEIQIIDMNKLSDTDGDKTVATMSLEGKNLVLIDEGHRGTSSTAGAW 290

baumannii 231 LFDKQKSRNSLYRDEIQIIDMNKLSDTDGDKTVATMSLEGRNLVLIDEGHRGTSSSAGAW 290

pOK1 290 MERRDILTRNGFSFEYSATFGQAVNKASNVHKSYEDAKKAKSKMLYNTTALKNLTEEQVS 349

DEC1C 294 MRRRDKLTRDGFAFEYSATFGQAVAGGNNVEAVETEIQKKKAKLLFETTALGKLSEEELA 353

HA 291 MERRDILTKDGFSFEYSATFGQAVSKADNVYKRFEDAKKQKAKMLYG-VAINKLTEEQKK 349

baumannii 291 MERRDILTKDGFSFEYSATFGQAVSKADNVYKRFEDAKKQKAKMLYG-MAINKLTEEQKK 349

pOK1 350 AIQLDDLEKLKCRREALREAYAKNILFDYSYKYFYQDGYGKEVNILNMKEY--SEEQDRD 407

DEC1C 354 QIALTSEEQRDARIQATREVYGKSILFDYSYKFFYEDGYGKESLILNLNPQDDKKDERRY 413

HA 350 NIQLDDLEQQKYRREALREVYAKSILFDYSYKYFYADGYGKEVNILNMKEY--HEDDERN 407

56

baumannii 350 NIQLDELEQQKYRREALREVYAKSILFDYSYKYFYADGYGKEVNILNMKEY--HEDDERN 407

pOK1 408 LYLTACLLAFYQQQYLFKKNEERLVQFNIENPLWVFVGNKVNDDDSDILTIIQFLSRFLD 467

DEC1C 414 EYFTACLLSFYQQQYLFNKNKEKLNEFNIEKPLWVFVGNSVSGEDSDIHAVLRFLAWFLN 473

HA 408 LYLTACLLSFYQQQYLFKKNQVKLAKFNIEKPLWVFVGNKVNDDDSDILAIVKFLADFLD 467

baumannii 408 LYLTACLLSFYQQQYLFKKNQAKLAKFNIEKPLWVFVGNKVNDDDSDILAIVKFLADFLD 467

pOK1 468 PQYKAQNIEWLQDLVTNKSRLVDNSGVNIFTNRFAALHGQVASKLYEDILLRFFNAS-TN 526

DEC1C 474 HETQAK--AWINDLIKNKARILDTKERNIFENRFTALMNA-PEDIYADILSRLFNTTHSG 530

HA 468 ASRKSKVISWLHDLITNTSRLVDPKGNNIFANRFAPLYGQNATELYQDILKSFFNAT-TN 526

baumannii 468 ASRKSKVISWLHDLITNTSRLVDPKGNNIFANRFAPLHGQNATDLYQDILKSFFNAT-TN 526

pOK1 527 QRLNVVRVAANTGELKLQVGENNPFALINVGDEAGLYKLCETLSLDNYFDVRNDDFSPSL 586

DEC1C 531 QRLRVLNLIGSKGELALQVGEAEPFGLINIGDAPSLYKMCEEDTT---FDYQRDDFAKSL 587

HA 527 QRLNVVRITANKGELRLQVGENTPFAVINVGDEKGLYDNCENSSQTHYINARTDDFAESL 586

baumannii 527 QRLNVVRITANKGELRLQVGENTPFAVINVGDEKGLYDNCDESSKTHYLNARTDDFAESL 586

pOK1 587 FGTLNNKDCSINLLIGSKKFTEGWSSWRVSTMGLLNMGTGEGSQIIQLFGRGVRLKGEDF 646

DEC1C 588 FHTLNDKDSRLHILIGSRKFTEGWSSWRVSTMGLLNMGRGEGSQIIQLFGRGVRLKGRNY 647

HA 587 FPTLNNDDSETHLLIGSRKFTEGWSSWRVSTMGLLNMGSGEGAQIIQLFGRGVRLKGENF 646

baumannii 587 FPTLNNDDSETHLLIGSRKFTEGWSSWRVSTMGLLNMGSGEGAQIIQLFGRGVRLKGENF 646

pOK1 647 SLKRT-PREIYTQANYKDLYLDFLQTLNIFGLKANYMEAFREYLNDEGIVLNQDLVTLDF 705

DEC1C 648 SLKRSTPGE-----RPKGLHLEKLETLNVFGVRADYMATFKQYLEDEGITPSDEILELNF 702

HA 647 SLKRT-PREIYSKAEYKGLHLDLMQTINIFGLRADYMEKFRDYLNDEGIILNQDLVTLDF 705

baumannii 647 SLKRT-PREIYSKAEFKGLHLDLMQTINIFGLRADYMEKFRDYLNDEGIILNQDLVTLDF 705

pOK1 706 KTNTIKPSTKLKTLVLKDGYKDNQANGFKAKIKPWVFTQVLDLDWLRQSENSANLEKKIK 765

DEC1C 703 ETRPNMPATRLKTLKLKDGYKDNQRLGFKRVYFPELYE------------VPADFQGKIK 750

HA 706 PTNKIQ-APRLKTLTLKDGYKDNQANGFKAQLKLSMFK------------IPKQYEGKIK 752

baumannii 706 PTNKIQ-APRLKTLTLKDGYKDNQANGFKAQLKLSMFK------------IPKQYEGKIK 752

pOK1 766 KPFVVLDLYPRLQSFHTDRSKEIIE-QDKRQNNIISQDLMCFLI---------------- 808

DEC1C 751 QPHIKLDLYPKLESIDTSRKGENTP-VNVRNEAKLDYKIISAFDFDRLYLAIQNYKLQRG 809

HA 753 KPFVVLDLYPRLQAFHTDKSKRQMDVKDKRQEHEISPKIMCMFDFDEIYLQLQQYKFQRG 812

baumannii 753 KPFVVLDLYPRLQAFHTDKSKRQTDVKDKRQEHEISPKIMCMFDFDEIYLQLQQYKFQRG 812

pOK1 809 ------------------------------------------------------------ 809

DEC1C 810 WSNLRVDKQRLIDFCTGKTKIG-NSWYTLLIPASELEIKQYADIAKQEDIMLRLLTDYTD 868

HA 813 YSNLQLNVDDLQEFCLRNIKSSTEDWYKLLVDGSELS-NDVGGIKKQQAILTELLQSYMD 871

baumannii 813 YSNLQLNVDDLQEFCFRDIKSSTEDWYKLLVDSSELT-NDVSGIKKQQAILTELLQSYMD 871

pOK1 809 ------------------------------------------------------------ 809

DEC1C 869 RFYNTLKNAYEGQFYEVTQVKEDDPGM----IKMYHFEIEET--DDGLAYASRLEQLQQL 922

HA 872 KFYHAIKNAYEGQFYEVTEFSLDDKDLPVQICEQYTLTAKDGQNNEAQEVFDRLETLKDL 931

baumannii 872 KFYHAIKNAYEGQFYEVTEFSLDDKDLPVQICEQYTLTAKDGQNNEAQEVFDRLETLKDL 931

pOK1 809 ------------------------------------------------------------ 809

DEC1C 923 VIDGEIGKAKSWSASGM-VAITFDKHLYYPLLSIEKNANIPLKMRPAAL-----GASSEI 976

HA 932 VAKGDVEKLAPWKEDGSFRAITFDRHLFYPLLD-KKDESLPFTWSPMLFDYTSHTQSSEV 990

baumannii 932 VAKGDVEKLAPWKEDGSFRAITFDRHLFYPLLD-KKDESLPFTWSPMLFDYTSHTQSSEV 990

pOK1 809 ------------------------------------------------------------ 809

DEC1C 977 TFVHDLQSFVDST----------------------------------------------- 990

57

HA 991 KFVLDLQSYINTPAADDLLKDYELYLLRNADNKYRGLGFALAGNFYPDFLLWLVNKQTGQ 1050

baumannii 991 KFVLDLQSYINTPDADALLKGYELYLLRNADNKYRGLGFALAGNFYPDFLLWLVNKQTGQ 1050

pOK1 809 ----------------------------------------LMQFIWSCCST--------- 819

DEC1C 990 ------------------------------------------------------------ 990

HA 1051 QYLTLVDPKGIRNMNHDDAKIELYKEIKNIEAKLEHPDLILSSFILSITPMKDILNNSLS 1110

baumannii 1051 QYLTLVDPKGIRNMNHDDAKIELYKEIKNIEAKLEHPDLILSSFILSITPMKDILNNSLS 1110

pOK1 820 ----------------------RHREVIAI 827

DEC1C 990 ----------------------------KG 991

HA 1111 EEEFAEKNVLFMVGNGTAYLGKMLEKILQL 1140

baumannii 1111 EEEFAEKNVLFMVGNGTAYLEKMLEKILQP 1140

Fig. 19. Porównanie sekwencji aminokwasowych endonukleazy Orf06 i białek pokrewnych.

Sekwencje porównywane z potencjalną endonukleazą pOK1 (pOK1) pochodzą kolejno z E. coli DEC1C (GenBank:

EHU17630.1) (DEC1C), Acinetobacter sp. HA (GenBank: WP_008305576.1) (HA) oraz Acinetobacter baumannii

(GenBank: WP_002116724.1) (baumanii). Na niebiesko zaznaczono aminokwasy identyczne we wszystkich

sekwencjach, na szaro – identyczne w trzech z nich. Obramowaniem zaznaczono aminokwasy tworzące domenę

charakterystyczną dla podjednostki res enzymów restrykcyjnych typu III. Czerwoną czcionką zaznaczono

aminokwasy zaangażowane w wiązanie ATP, żółtą – wiążące jony wapnia.

pOK1 1 Y----------------------------------------------------------- 1

DEC2A 1 ------------------------------------------------------------ 1

HA 1 MAKAPKAKTKAVKVNFHEQLILNKWLWSKFNPNRLEGMKQQLDHPQFEGIEHEGDNTGQT 60

baumannii 1 MAKAPKAKTKALKVNFHEQLILNKWLWSKFNPNRLEGMKQQLDHQQFEGIEHEGDNAGQT 60

pOK1 2 ------------------------------------------------------------ 2

DEC2A 1 ------------------------------------------------------------ 1

HA 61 KFFSVISNTLFNKQVIDIDVLRRYDLNIVKHWQKITEKRNEIEGHVLNLKYFQYLSLLFT 120

baumannii 61 KFFSVISNTLFNKQVVDIDVLRRYDLNIVKHWQKITEKRNEIEGHVLNLKYFQYLSLLFT 120

pOK1 2 ------------------------------------------------------------ 2

DEC2A 1 ------------------------------------------------------------ 1

HA 121 ELYLDQYFNHQADMLNELNVELEQYNDDQKIDADQFQQYLPEDLNKIGYWNATGSGKTLL 180

baumannii 121 ELYLDQYFHHQADMLNELNVELEQYNDDQKIDADQFQQYLPEDLNKIGYWNATGSGKTLL 180

pOK1 2 ------------------------------------------------------------ 2

DEC2A 1 ------------------------------------------------------------ 1

HA 181 MHVNILQYLDYFQHQNGDSTYPDQIILLTPNEGLSEQHLQELTDSGFQATLFDKQKSRNS 240

baumannii 181 MHVNILQYLDYFQHQNGDSTYPDQIILLTPNEGLSEQHLQELTDSGFQATLFDKQKSRNS 240

pOK1 2 ------------------------------------------------------------ 2

DEC2A 1 ------------------------------------------------------------ 1

HA 241 LYRDEIQIIDMNKLSDTDGDKTVATMSLEGKNLVLIDEGHRGTSSTAGAWMERRDILTKD 300

baumannii 241 LYRDEIQIIDMNKLSDTDGDKTVATMSLEGRNLVLIDEGHRGTSSSAGAWMERRDILTKD 300

pOK1 2 ------------------------------------------------------------ 2

DEC2A 1 ------------------------------------------------------------ 1

HA 301 GFSFEYSATFGQAVSKADNVYKRFEDAKKQKAKMLYGVAINKLTEEQKKNIQLDDLEQQK 360

baumannii 301 GFSFEYSATFGQAVSKADNVYKRFEDAKKQKAKMLYGMAINKLTEEQKKNIQLDELEQQK 360

pOK1 2 ------------------------------------------------------------ 2

DEC2A 1 ------------------------------------------------------------ 1

HA 361 YRREALREVYAKSILFDYSYKYFYADGYGKEVNILNMKEYHEDDERNLYLTACLLSFYQQ 420

baumannii 361 YRREALREVYAKSILFDYSYKYFYADGYGKEVNILNMKEYHEDDERNLYLTACLLSFYQQ 420

pOK1 2 ---------------------------------------NF------------------- 3

58

DEC2A 1 --------------------------------------MRFLAWFLNHETQAK--AWIND 20

HA 421 QYLFKKNQVKLAKFNIEKPLWVFVGNKVNDDDSDILAIVKFLADFLDASRKSKVISWLHD 420

baumannii 421 QYLFKKNQAKLAKFNIEKPLWVFVGNKVNDDDSDILAIVKFLADFLDASRKSKVISWLHD 420

pOK1 4 ------------------------------------------------------------ 4

DEC2A 21 LIKNKARILDTKERNIFENRFTALMNA-PEDIYADILSRLFNTTHSGQRLRVLNLIGSKG 79

HA 481 LITNTSRLVDPKGNNIFANRFAPLYGQNATELYQDILKSFFNAT-TNQRLNVVRITANKG 539

baumannii 481 LITNTSRLVDPKGNNIFANRFAPLHGQNATDLYQDILKSFFNAT-TNQRLNVVRITANKG 539

pOK1 4 -------------------------------------S---------------------- 4

DEC2A 80 ELALQVGEAEPFGLINIGDAPSLYKMCEEDTTFDY---QRDDFAKSLFHTLNDKDSRLHI 136

HA 540 ELRLQVGENTPFAVINVGDEKGLYDNCENSSQTHYINARTDDFAESLFPTLNNDDSETHL 599

baumannii 540 ELRLQVGENTPFAVINVGDEKGLYDNCDESSKTHYLNARTDDFAESLFPTLNNDDSETHL 599

pOK1 5 ------------------------------------------------------------ 5

DEC2A 137 LIGSRKFTEGWSSWRVSTMGLLNMGRGEGSQIIQLFGRGVRLKGRNYSLKRSTPGE---- 192

HA 600 LIGSRKFTEGWSSWRVSTMGLLNMGSGEGAQIIQLFGRGVRLKGENFSLKRT-PREIYSK 658

baumannii 600 LIGSRKFTEGWSSWRVSTMGLLNMGSGEGAQIIQLFGRGVRLKGENFSLKRT-PREIYSK 658

pOK1 5 ------------------------------------------------------------ 5

DEC2A 193 –RPKGLHLEKLETLNVFGVRADYMATFKQYLEDEGITPSDEILELNFETRPNMPATRLKT 251

HA 659 AEYKGLHLDLMQTINIFGLRADYMEKFRDYLNDEGIILNQDLVTLDFPTN-KIQAPRLKT 717

baumannii 659 AEFKGLHLDLMQTINIFGLRADYMEKFRDYLNDEGIILNQDLVTLDFPTN-KIQAPRLKT 717

pOK1 5 ------------------------------------------------------------ 5

DEC2A 252 LKLKDGYKDNQRLGFKRVYFPELYEVPADFQGKIKQPHIKLDLYPKLESIDTSRKGENTP 311

HA 718 LTLKDGYKDNQANGFKAQLKLSMFKIPKQYEGKIKKPFVVLDLYPRLQAFHTDKSKRQMD 777

baumannii 718 LTLKDGYKDNQANGFKAQLKLSMFKIPKQYEGKIKKPFVVLDLYPRLQAFHTDKSKRQTD 777

pOK1 5 ------------RFDVFFDFDAIYLELLQYKAQRGYSNLKITQDNIVDFCCNK---DPND 49

DEC2A 312 V-NVRNEAKLDYKIISAFDFDRLYLAIQNYKLQRGWSNLRVDKQRLIDFCTGKTK-IGNS 369

HA 778 VKDKRQEHEISPKIMCMFDFDEIYLQLQQYKFQRGYSNLQLNVDDLQEFCLRNIKSSTED 837

baumannii 778 VKDKRQEHEISPKIMCMFDFDEIYLQLQQYKFQRGYSNLQLNVDDLQEFCFRDIKSSTED 837

pOK1 50 WYKLLIDRSELM-NTVAGIIKQQWILIELLKAYMDKIYSTFKNAYEGQYYTVQEFDLANS 108

DEC2A 370 WYTLLIPASELEIKQYADIAKQEDIMLRLLTDYTDRFYNTLKNAYEGQFYEVTQVKEDDP 429

HA 838 WYKLLVDGSELS-NDVGGIKKQQAILTELLQSYMDKFYHAIKNAYEGQFYEVTEFSLDDK 896

baumannii 838 WYKLLVDSSELT-NDVSGIKKQQAILTELLQSYMDKFYHAIKNAYEGQFYEVTEFSLDDK 896

pOK1 109 MLDDLPIDICQQYTLTAKEDQNSEASDYFERIKNLQALVENGTVDELAPWQQDGSFRAIT 168

DEC2A 430 ---G----MIKMYHFEIEETD--DGLAYASRLEQLQQLVIDGEIGKAKSWSASGM-VAIT 479

HA 897 ---DLPVQICEQYTLTAKDGQNNEAQEVFDRLETLKDLVAKGDVEKLAPWKEDGSFRAIT 953

baumannii 897 ---DLPVQICEQYTLTAKDGQNNEAQEVFDRLETLKDLVAKGDVEKLAPWKEDGSFRAIT 953

pOK1 169 FDRHLYYPLFD-KTDDNLPFTWSPALFDYSKNGQSSEVQFVTDLQEYVNSDIGKEILDGY 227

DEC2A 480 FDKHLYYPLLSIEKNANIPLKMRPAAL-----GASSEITFVHDLQSFVDSTKGQKIIGDK 534

HA 954 FDRHLFYPLLD-KKDESLPFTWSPMLFDYTSHTQSSEVKFVLDLQSYINTPAADDLLKDY 1012

baumannii 954 FDRHLFYPLLD-KKDESLPFTWSPMLFDYTSHTQSSEVKFVLDLQSYINTPDADALLKGY 1012

pOK1 228 QLYLFRNPDNKYRGLGFALAGNFYPDFLMWLVHKESGKQFLTLVDPKGIRNMDSDDAKIE 287

DEC2A 535 SLYLLRNADSKNRGLGFATAGNFYPDFLLWLVDDKSGKQWLSLIDPKGIRNLNLDDPKFG 594

HA 1013 ELYLLRNADNKYRGLGFALAGNFYPDFLLWLVNKQTGQQYLTLVDPKGIRNMNHDDAKIE 1072

baumannii 1013 ELYLLRNADNKYRGLGFALAGNFYPDFLLWLVNKQTGQQYLTLVDPKGIRNMNHDDAKIE 1072

pOK1 288 FYKEIKIIESDIADEKLILNSFILSITSIQDLINCKLTEKEFVDKNVLFMNKGKAYYLGQ 347

DEC2A 595 LYKEIKNLEHKLSDDNLSLSAFIVSETCYVDLVNVPDSKENLEARNVLFIEDTGPLYLEK 654

HA 1073 LYKEIKNIEAKLEHPDLILSSFILSITPMKDILNNSLSEEEFAEKNVLFMVGNGTAYLGK 1132

baumannii 1073 LYKEIKNIEAKLEHPDLILSSFILSITPMKDILNNSLSEEEFAEKNVLFMVGNGTAYLEK 1132

59

pOK1 348 MFQRILFA 355

DEC2A 655 LFSKMVSE 662

HA 1133 MLEKILQL 1140

baumannii 1133 MLEKILQP 1140

Fig. 20. Porównanie sekwencji aminokwasowychj endonukleazy Orf07 i białek pokrewnych. Sekwencje porównywane z potencjalną endonukleazą Orf7 (pOK1) pochodzą kolejno z E. coli DEC2A (GenBank:

EHU33772.1) (DEC2A), Acinetobacter sp. HA (GenBank: WP_008305576.1) (HA) oraz Acinetobacter baumannii

(GenBank: WP_002116724.1) (baumanii). Na niebiesko zaznaczono aminokwasy identyczne we wszystkich

sekwencjach, na szaro – identyczne w trzech z nich.

Dzięki aplikacji Conserved Domain Search i analizie w bazie Pfam w sekwencji Orf06

zlokalizowano domenę charakterystyczną dla podjednostki Res endonukleaz restrykcyjnych typu

III (rodzina resIII, Pfam: PF04851). Baza CDD opisuje tę domenę jako typową dla rodziny

helikaz DEAD (cd00046). Do tej rodziny należą różnego typu białka zaangażowane w ATP-

zależne rozwijanie DNA lub RNA. Domena ta zawiera region odpowiedzialny za wiązanie ATP

(zaznaczony na Fig. 19). Zlokalizowano również region białka prawdopodobnie zaangażowany

w wiązanie jonów wapnia. W sekwencji Orf07 możliwe było wyróżnienie jedynie domeny o

nieznanej funkcji (Pfam: PF14302).

2.3. Analiza potencjalnego systemu mobilizacji do transferu koniugacyjnego

Potencjalny produkt białkowy kodowany przez orf25 prawdopodobnie jest zaangażowany w

mobilizację plazmidu do transferu koniugacyjnego (MOB). Białko to wykazuje największe

podobieństwo sekwencji (95% identyczności) do hipotetycznego białka Wohlfahrtiimonas

chitiniclastica SH04, opisanego przez deponujących sekwencję jako endonukleaza VirD1.

Pokrewne białka (36-47% identyczności) również zostały opisane w bazach danych jako

składniki relaksosomu. Na Fig. 21 przedstawiono porównanie sekwencji aminokwasowych

Orf25 i białek mu pokrewnych.

Poszukiwanie konserwowanych domen wykazało obecność domeny charakterystycznej

dla endonukleazy VirD1 (CDD: cl17530) lub bakteryjnych białek mobilizujących (MobC)

(Pfam: PF05713). Domeny tego typu są zaangażowane w mobilizację plazmidu do transferu

koniugacyjnego. Białko to prawdopodobnie bierze udział w nacięciu DNA w miejscu oriT.

Apisiridej i wsp. (1997) wykazali, że białka pokrewne MobC zawierają motyw sekwencji

L/FxxxG/SxNxNQxAxxxN (znak x oznacza brak konserwowanego aminokwasu w danym

miejscu). Motyw ten jest również obecny w wyróżnionej w sekwencji plazmidu pOK1

(zaznaczony na Fig. 21).

60

pOK1 1 LKK-QNRSIQVGIRFTEEEFAPYKSAAEKLGLSNAELLRAVLLNNFDPKIHDKKTRKDIK 59

ATCC 1 MTK-ENRSIPVSFRLTEREFAPYKLIMDEANISRTEFFRAIFLSKQY--TFTKNQKNEVG 57

Java 1 MRDSKGKSRVITLRLKEDEYARFEQILCDTGISKSDFFRLLILGKFDPNKHNKIAQNNHR 60

SH04 1 MKK-QNRSIQVGIRFTEEEFAPYKYAAEKLGLSNAELLRTVLLNNFNPKIHDRKTRKDIE 59

pOK1 60 KLLFYFNKASNNINQLAKVINTQAKTSNIDTKKLIQFYSKLNRIYDSFENGIEHAKKSSD 119

ATCC 58 KILFAFNKTSNNINQIAKRLNTDNKKGIISQRSYNLAINELISIQSQLQRLIE------- 110

Java 61 KLLFYFNKASNNINQIAKRLNQDHRNGIVSETTYKRILNVLVNVRDTFSNGVD------- 113

SH04 60 KLLFYFNKASNNINQLAKVINTQAKTSNIDTKKLIQFYSKLNRIYDSFENGIEHAKKSSD 119

pOK1 120 PR

ATCC 111 KC

Java 114 KC

SH04 120 PR

Fig. 21. Porównanie sekwencji aminokwasowych Orf25 pOK1 i białek pokrewnych.

Sekwencje porównywane z sekwencją Orf25 (pOK1) pochodzą kolejno z Vibrio ichthyoenteri ATCC 700023

(GenBank: EGU31302.1) (ATCC), Yersinia pestis Java 9 (GenBank: YP_004221720.1) (Java) oraz

Wohlfahrtiimonas chitiniclastica SH04 (GenBank: ELV07177.1) (SH04). Na niebiesko zaznaczono aminokwasy

identyczne we wszystkich sekwencjach, na szaro – identyczne w trzech z nich. Kolorowymi ramkami zaznaczono

przewidywaną strukturę drugorzędowa zidentyfikowanego białka. Obramowaniem zaznaczono konserwowany

motyw charakterystyczny dla białek MobC. Żółta czcionką zaznaczono konserwowane aminokwasy.

2.4. Inne elementy genetyczne zintegrowane z genomem plazmidu

W analizowanej sekwencji wyróżniono kilka ruchomych elementów genetycznych

zintegrowanych z genomem pOK1. Są to elementy transpozycyjne (orf17-orf18, orf19, orf21,

orf22, orf43, orf49) oraz kasety genowe integronu (orf39-orf41). W kolejnych podrozdziałach

zamieszczono szczegółowy opis tych struktur.

2.4.1. Elementy transpozycyjne

Elementy transpozycyjne (TE, ang. transposable elements) stanowią najliczniejszą grupę

ruchomych elementów genetycznych. Są one zdolne do przemieszczania się z jednego miejsca

genomu w inne (w obrębie jednego lub między różnymi replikonami) w wyniku transpozycji,

czyli rekombinacji nieuprawnionej. Jest to proces katalizowany przez transpozazy (Tnpazy),

enzymy kodowane w obrębie TE. Ze względu na stopień złożoności struktury genetycznej,

wśród TE wyróżniamy: sekwencje inercyjne (IS, ang. insertion sequence) oraz transpozony (Tn).

IS są najprostszymi TE, kodują bowiem jedynie informację genetyczną niezbędną do własnej

transpozycji. Na ich końcach występują identyczne lub prawie identyczne odwrócone

powtórzenia sekwencji (IR, ang. inverted repeats). Transpozony są to elementu większe, które

mogą również zawierać geny determinujące fenotyp gospodarza. Wśród transpozonów

61

wyróżniamy transpozony złożone, posiadające na obu końcach IS, oraz transpozony niezłożone,

nie zawierające terminalnie ułożonych IS.

Otwarte ramki odczytu orf17 i orf18 pOK1 kodują potencjalne białka wykazujące

podobieństwo sekwencyjni (68%) do transpozazy Vibrio cholerae TM 11079-80, odpowiednio

do podjednostki A i B (GenBank: EEO05192.1, EEO07032.1). Obydwa białka pOK1 są krótsze

niż te opisane w bazie danych. Sekwencje obu podjednostek wykazują podobieństwo do innych

transpozaz występujących w bakteriach z rodzaju Vibrio, kodowanych przez elementy z rodziny

IS3. Obie ORF pOK1 zachodzą na siebie o 15pz, co może sugerować generowanie fuzyjnej

Tnpzazy w wyniku programowanej zmiany ramki odczytu.

Poszukiwanie konserwowanych domen białkowych w sekwencjach obu podjednostek

(Pfam, Conserved Domains Serach) pozwoliło na zidentyfikowanie charakterystycznej domeny

transpozaz. Podjednostka A zawiera domenę typową dla nadrodziny HTH_Tnp_1 (Pfam:

PF01527), odpowiadającą za aktywność transpozazy i wiązanie z DNA. Pokrewne białka są

kodowane przez wiele elementów insercyjnych oraz transpozaz, w tym przez IS grupy IS3 z

rodziny IS3. Domena ta składa się z motywu HTH (na N-końcu) oraz zamka leucynowego. W

obrębie podjednostki B znajduje się domena należąca do rodziny Rve (Pfam: PF00665). Jest to

domena odpowiadająca za katalityczne właściwości integrazy. Pośredniczy ona w integracji

DNA w miejscu docelowym. Analizy przeprowadzone w bazie danych ISfinder pozwoliły

zaklasyfikować opisywaną IS do rodziny IS3.

Analiza porównawcza wykazała, że Orf19 wykazuje najwyższe podobieństwo sekwencji

(81% identyczność) z Tnpazą IS431mec, pochodzącą z Wohlfahrtiimonas chitiniclastica SH04

(GenBank: WP_008316919.1). Sekwencja Orf19 jest krótsza od tej zdeponowanej w bazie o 93

aminokwasy. Może być to wynikiem wbudowania się w jej obrębie sekwencji insercyjnej,

zawierającej orf17 i orf18 (Fig. 1). W sekwencji Orf19 zidentyfikowano domenę, typową dla

transpozaz (COG3316).

Do Tnpazy IS431mec najwyższe podobieństwo wykazują również orf43 i orf49 pOK1

(identyczność sekwencji aa - 96%). Poszukiwanie konserwowanych domen (Conserved Domains

Serach) pozwoliło wyróżnić w sekwencji obu ORF domenę transpozaz i inaktywowanych

pochodnych (COG3316) oraz domenę Rve (opisaną wcześniej). Analiza porównawcza

wykazała, ze opisywany element wykazuje największe podobieństwo do sekwencji insercyjnych

należących do rodziny IS6.

W sekwencji pOK1 wyróżniono jeszcze jedną IS wykazującą podobieństwo do sekwencji

pochodzącej z Wohlfahrtiimonas chitiniclastica SH04 (GenBank: ZP_21241722.1). Element ten

koduje transpozazę Orf22, wykazująca 55% identyczność sekwencji aa z Tnpazą IS407.

62

Transpozaza ta zawiera domenę Rve oraz domenę HTH_21 (Pfam: PF13276), odpowiadającą za

oddziaływanie z DNA. W wyniku analiz porównawczych przeprowadzonych w bazie ISfinder,

element niosący orf22 zakwalifikowano do grupy IS407 rodziny IS3.

Kolejny TE pOK1 zawiera orf21. Białko Orf21 wykazuje 70% podobieństwo sekwencji

aa do transpozazy z grupy IS407 rodziny IS3, pochodzącej z Vibrio cholerae RC385 (GenBank:

WP_001884878.1). W wyróżnionej sekwencji obecna jest domena należąca do nadrodziny

HTH_Tnp_1 (Pfam: PF01527).

Ponieważ elementy wyróżnione w sekwencji plazmidu pOK1 zostały zaklasyfikowane do

rodzin IS3 i IS6, w tabeli 5 przedstawiono podstawowe informacje charakteryzujące te rodziny.

Tabela 5. Podstawowe informacje o rodzinach IS3 i IS6 (ISfinder).

rodzina podgrupa typowa

wielkość (pz)

generowane

DR końce IR

liczba

ORF

motyw

katalityczny

IS3

IS150 1200-1600 3-4 TG

obecne 2 motyw DDE

IS407 1100-1400 4 TG

IS51 1000-1400 3-4 TG

IS3 1150-1750 3-4 TGa/g

IS2 1300-1400 5 TG

IS6 - 700-900 8 GG obecne 1 motyw DDE

DR, ang. direct repeats, proste powtórzenia sekwencji generowane w miejscu wbudowania elementu. IR, ang.

inverted repeats, odwrócone powtórzone sekwencje obecne na końcach elementu. Kolumna „końce” określa

nukleotydy konserwowane na końcu sekwencji. Duże litery oznaczają silnie konserwowane nukleotydy. Małe litery

oddzielone ukośnikiem oznaczają możliwe zasady (ISfinder).

W sekwencjach po obu stronach orf43 i orf49 zidentyfikowano jednakowe, 21-

nukleotydowe odwrócone powtórzenia. Taka sama sekwencja została znaleziona również

poniżej orf19. W tym przypadku brakuje drugiej sekwencji IR, podobnie i jak części genu

transpozazy. Sekwencje te zostały prawdopodobnie zinaktywowane przez wbudowanie się

elementu insercyjnego niosącego orf17-orf18. Obecność dwóch identycznych sekwencji

insercyjnych (zaznaczonych na Fig. 22) stwarza możliwość przenoszenia zawartego między nimi

fragmentu DNA, w postaci transpozonu złożonego. Możliwe jest również, że z pewną częstością

może dochodzić do delecji fragmentu DNA pomiędzy tymi dwoma sekwencjami, w wyniku

rekombinacji homologicznej.

IS należące do rodziny IS6 zazwyczaj generują w miejscu integracji 8 – nukleotydowe

DR, które w genomie pOK1 nie występują. Nie można jednak wykluczyć, że elementy pOK1,

podobnie jak ISS1W z Lactococcus lactis (Haandrikman, 1990), nie generują DR.

63

Fig. 22. Schemat organizacji potencjalnego nieautonomicznego transpozonu złożonego pOK1. Na schemacie kolorowymi strzałkami zaznaczono ORF znajdujące się w obrębie potencjalnego transpozonu (IS –

sekwencja inercyjna, tetR – koduje białko regulujące ekspresję genów oporności na tetracyklinę, tetH –nadająca

komórce oporność na tetracyklinę, rep – kodująca gen białka inicjującego replikację, TA – system TA).

Powiększono regiony, w których znajdują się odwrócone powtórzenia, oznaczone IRR i IRL (powtórzenie prawe i

lewe).

Na uwagę zasługuje fakt, że powtórzenie IRL sekwencji insercyjnej niosącej orf43,

znajduje się w obszarze defektywnej ORF warunkującej oporność na czwartorzędowe związki

amoniowe i bromek etydyny. W przypadku pozostałych sekwencji insercyjnych nie udało się

wyznaczyć sekwencji IR ani sekwencji DR. Zarówno dla transpozaz sekwencji insercyjnych z

rodzin z IS3, jak i IS6, w części aktywnej enzymu znajduje się motyw DDE. Jest to tak zwana

katalityczna triada utworzona z trzech kwaśnych aminokwasów: dwóch asparaginianów i

glutaminianu. Ich obecność warunkuje aktywność enzymatyczną transpozaz (Nesmelova i

Hackett, 2010). Na Fig. 23 przedstawiono porównanie sekwencji konsensusowych motywów

DDE z sekwencjami niektórych opisywanych transpozaz pOK1.

Motywy DDE transpozaz kodowanych przez pOK1 są zbliżone do sekwencji

konsensusowych. Warto zauważyć, że w przypadku wyróżnionych motywów skróceniu uległy

sekwencje oddzielające aminokwasy tworzące katalityczną triadę. Różnice są szczególnie

widoczne dla sekwencji oddzielających drugi asparaginian od glutaminianu (Fig. 23).

Dla pozostałych potencjalnych transpozaz (Orf17-Orf18, Orf19, Orf21) nie udało się

zidentyfikować motywów DDE. W przypadku Orf19 jest to wynikiem braku dużej części genu

transpozazy. Z podobną sytuacją mamy do czynienia w przypadku transpozazy Orf21.

Transpozazy te, choć prawdopodobnie defektywne, zawierają domeny odpowiedzialne za

oddziaływanie z DNA. Brak motywu DDE powoduje, że transpozazy te są niezdolne do

transpozycji. W przypadku transpozazy Orf17-Orf18, w sekwencji podjednostki B można

wyróżnić jedynie fragment konserwowanej sekwencji motywu DDE, ale zlokalizowanie całego

motywu nie jest możliwe.

64

Fig. 23. Porównanie sekwencji konsensusowych motywów DDE sekwencji insercyjnych należących do rodzin

IS3 i IS6 z motywami DDE wyróżnionymi w sekwencjach insercyjnych wyróżnionych w plazmidzie pOK1. Aminokwasy tworzące część konserwowanego motywu są przedstawione za pomocą dużych, pogrubionych liter.

Wielkie litery oznaczają aminokwasy zachowane w rodzinie IS, a małe wskazują, że dany aminokwas jest

dominujący. Liczby w nawiasach wskazują na liczbę aminokwasów znajdujących się pomiędzy konserwowanymi

rejonami.

2.4.2. Integron

Otwarte ramki odczytu orf38-orf42 stanowią elementy integronu opornościowego (Fig. 24).

Integrony to elementy genetyczne zdolne do włączania kaset genowych w wyniku rekombinacji

specyficznej wobec miejsca (ang. site specific recombination) (Wolinowska i wsp., 2002).

Mobilne integrony zawierają kilka (do 9) kaset genowych, które warunkują oporność na wiele

antybiotyków (Partridge i wsp., 2009). Istnieją też integrony zerowe, nie zawierające żadnej

kasety. Włączanie kaset umożliwia integraza (Int), enzym kodowany w obrębie integronu. Na

podstawie podobieństw sekwencji aminokwasowych integraz wyróżniono 5 grup tych

elementów genetycznych. Białko Orf38 wykazuje największe podobieństwo sekwencji aa do

integraz integronów klasy I (sekwencje te są niemal identyczne).

Integrony klasy I charakteryzują się konserwowanym 5’końcem, kodującym integrazę,

oraz 3’końcem zawierającym ORF kodujące: syntazę dihydropterynianową, defektywne białko

warunkujące oporność na czwartorzędowe związki amoniowe (składnik środków

dezynfekujących i antyseptycznych) i bromek etydyny (gen qacΔE) (w genie tym obecna jest

niewielka delecja, która powoduje, że kodowane białko nadaje komórce nieznaczną oporność,

mimo że posiada własny promotor; Wolinowska i współaut. 2002) (Fig. 24). Przypuszcza się, że

geny te pierwotnie stanowiły części kaset włączonych w strukturę integronu, które utraciły

zdolność do mobilizacji poprzez utratę miejsca rekombinacji (Brown i wsp., 1996).

65

W przypadku integronu pOK1, na końcu 3’ występuje jedynie defektywny gen qacΔE.

Podobne struktury były już opisywane wcześniej (Brown i wsp., 1996). Region 3’ nie jest

niezbędny do funkcjonowania integronu. Poznano integrony klasy I pozbawione części lub

całego tego regionu (Brown i wsp., 1996). orf26, poprzedzająca integron (Fig. 24), koduje

syntazę dihydropterynianową. Gen ten nadaje komórce oporność na sulfonamidy poprzez

syntezę enzymu mogącego zastąpić enzym, będący celem tej klasy leków. Otwarte ramki

odczytu położone poniżej genu int kodują białka warunkujące odporność na: sulfonamidy

(orf39), aminoglikozydy (orf40) i β-laktamy (orf41).

Integrony zawierają zwykle dwa promotory - jeden odpowiedzialny za ekspresję genu

integrazy - Pint, oraz promotor odpowiedzialny za transkrypcję włączanych kaset genowych – Pc

(Fig. 24). Za sprawą integrazy dochodzi rekombinacji pomiędzy miejscem integracji – attI

integronu i obszarem 59-be (ang. 59-base element) znajdującym się w kasecie genowej. Kaseta

genowa w integronach klasy I jest specyficznie włączana między G i TT siedmionukleotydowej

sekwencji, znajdującej się w tzw. miejscu prostym, do którego wiąże się integraza. Powyżej

miejsca prostego znajdują się jeszcze dwa miejsca wiązania integrazy, które działają jako

„wzmacniacze”. Sekwencje wiązania Int to krótkie nieidentyczne sekwencje powtórzone (Gravel

i wsp., 1998). Na Fig. 24 zaznaczono sekwencje miejsca attI oraz inne sekwencje mogące

odgrywać rolę w wiązaniu integrazy.

Sekwencja miejsca attI zmienia się po włączeniu do integronu kasety. 6 ostatnich zasad

pochodzi z kasety. Pomiędzy dwoma włączonymi kasetami powstaje sekwencja oznaczana jako

attC (zaznaczona na rysunku), będąca hybrydą elementów 59-be tych kaset. Kaseta może być

wycięta z dowolnego miejsca w szyku integronu poprzez rekombinacje pomiędzy miejscami

attC kontrolowanym przez integrazę. Powstająca przejściowa forma kolista może być później

włączona przez ten sam enzym w miejsce attI, co umożliwia ekspresję tej kasety z promotora

znajdującego się w obszarze genu integrazy.

Kasety genowe zazwyczaj kodują jedną otwartą ramkę odczytu, ale znane są również

takie, w których można wyróżnić dwie otwarte ramki odczytu. W takich przypadkach jedna z

nich może warunkować oporności na antybiotyk, a druga często koduje białko o nieznanej

funkcji (Wolinowska i wsp., 2002). Prawdopodobnie podobną sytuację obserwujemy w

opisywanym w tej pracy integronie. Wydaje się, że gen kodujący reduktazę dihydrofolianową

oraz gen kodujący acetylotransferazę aminoglikozydową są częścią jednej kasety, bowiem nie

można pomiędzy nimi wyznaczyć miejsca attC. Nie występuje też między nimi region

międzygenowy.

66

Fig. 24. Organizacja genetyczna integronu pOK1.

Na schemacie kolorowymi strzałkami zaznaczono ORF znajdujące się w integronie (intI1 – koduje integrazę, dhfr,

AAC (6’)-Ib, bla, qacΔE – kodują, odpowiednio, reduktazę dihydrofolianową, acetylotransferazę

aminoglikozydową, β-laktamazę oraz białko warunkujące oporność na czwartorzędowe związki amoniowe i bromek

etydyny. Powiększono region międzygenowy, w którym znajduje się miejsce attI oraz regiony, w których znajdują

się miejsca attC. Strzałkami zaznaczono zaproponowane sekwencje powtórzone oraz ich odwrócenia rozpoznawane

przez integrazę. Pionową strzałką zaznaczono miejsce włączania kasety. Pogrubioną czcionką oznaczono promotory

Pc, Pint oraz PqacΔE. Zaznaczono również miejsce oddziaływania z represorem transkrypcji podczas indukcji

odpowiedzi SOS.

Wykazano wcześniej (Guerin i wsp., 2009), że odpowiedź SOS kontroluje ekspresję

integrazy superintegronu V. cholerae oraz integronów klasy I poprzez wiązanie białka

represorowego LexA do miejsca docelowego znajdującego się w obszarze promotora genu

integrazy (MAZEL i wsp., 2011). Na Fig. 24 zaznaczono potencjalne miejsce oddziaływania z

represorem transkrypcji. W celu wyznaczenia tego miejsca wykorzystano sekwencje

konsensusowe ustalone przez Mazela i współpracowników (Mazel i wsp., 2011) (Fig. 25).

67

Fig. 25. Reprezentatywne przykłady miejsc wiązania białka LexA zidentyfikowane powyżej różnych genów

integrazy mobilnych integronów z zaznaczeniem klasy integrazy (1-5). Zaprezentowane sekwencje pochodzą z: E.

coli pSa (GenBank: AAA92752), Providencia stuartii ABR23a (GenBank: ABG21674), Serratia marcescens

AK9373 (GenBank: BAA08929) oraz Vibrio salmonicida VS224 pRVS1 (GenBank: CAC35342).

Na prawym panelu zaprezentowano logo (Crooks i wsp., 2004) profilu użytego do szukania miejsca wiązania

represora LexA w β/γ – Proteobacteria.

Regulon SOS jest globalną siecią regulacyjną, zaangażowaną głównie w naprawę

uszkodzeń DNA, która jest kontrolowana przez białko represorowe LexA (Walker, 1984). Do

represji genów regulonu dochodzi w wyniku wiązaniu białka LexA do specyficznych sekwencji

obecnych w ich regionach promotorowych. U większości β i γ – Proteobacteria miejsce to

stanowi 16-nukleotydowa, sekwencja o strukturze paindromu (CTGTatatatatACAG) (Walker,

1984). Odpowiedź SOS jest indukowana obecnością jednoniciowego DNA, który wiąże się

niespecyficznie do białka rekombinacyjnego RecA, umożliwiając katalityczna inaktywację

białka LexA (Littre, 1991), a tym samym indukcję odpowiedzi SOS. Wykazano, że ekspresja

ponad 40 genów u E. coli jest regulowanych przez represor LexA. Są to geny zaangażowane w

stabilizację widełek replikacyjnych, naprawę DNA oraz podział komórki (Fernandez de

Henestrosa, 2000). Wykazano również, że niektóre powszechnie stosowane antybiotyki i związki

antybakteryjne, takie jak: fluorochinolony, trimetoprim i β-laktamy, mogą wywoływać

odpowiedź SOS, a więc mogą również indukować ekspresję genu integrazy. Presja antybiotyku

może zatem przyczyniać się do rozpowszechniania genów oporności poprzez stymulowanie

wycinania i wbudowywania kaset opornościowych w integronach.

Potencjalny produkt białkowy orf37 pOK1 wykazuje podobieństwo sekwencji

aminokwasowej (98%) do TnpM - modulatora transpozonu Tn21. W genomie pOK1 nie

występują jednak inne geny pochodzące z Tn21.

Wiele transpozonów niosących determinanty oporności należy do podgrupy Tn21 z

rodziny Tn3 (Grinsted i wsp., 1990). Transpozony te spotyka się często w dużych plazmidach

koniugacyjnych o szerokim zakresie gospodarzy. Tn21 niesie geny zaangażowane w proces

transpozycji oraz operon warunkujący oporność na jony rtęci (mer). Tn21 wykorzystuje

mechanizm transpozycji replikacyjnej i ulega insercji w dość przypadkowe miejsca genomu

(Liebert i wsp., 1999). Transpozon ten opisano po raz pierwszy jako składnik plazmidu NR1

68

(R100), wyizolowanego z szczepu Shigella flexneri (Nakaya i wsp., 1960). Liebert i

współpracownicy przedstawili organizację genetyczną elementu Tn21 (Liebert i wsp., 1999),

którą przedstawiono na Fig. 26.

Fig. 26. Schemat organizacji genetycznej Tn21 (wg Liebert i wsp., 1999; zmodyfikowano).

Region transpozycyjny składa się z genów transpozazy (tnpA), resolwazy (tnpR), potencjalnego regulatora

transpozycji (tnpM) oraz miejsca res. Kaseta aadA1 koduje transferazę aminoglikozydów oraz zawiera miejsce 59-

be. Strzałki oznaczają kierunek transkrypcji. Moduł tni odpowiada za transpozycję integronu, w Tn21 uległ

częściowej delecji. Operon mer składa się z genów regulatorowych merD i merR oraz genów struktury merT, merP,

merC i merA. Zaznaczono również dwie otwarte ramki odczytu o nieznanej funkcji ufr1 (merE) i urf2. urf2M jest

hipotetyczną ramką odczytu, która mogła istnieć przed wbudowaniem integronu. Pionowe ramki oznaczają

odwrócone (IR) powtórzenia transpozonu oraz sekwencji inercyjnych.

TE z rodziny Tn3 są zazwyczaj otoczone odwróconymi powtórzonymi sekwencjami (IR)

o długości 38 pz (Sherratt, 1989). Transpozycja transpozonu Tn21 generuje 5 pz duplikacje

miejsca docelowego, w obrębie bogatej w pary AT sekwencji docelowej (Plasterk, 1995). W

sekwencji plazmidu pOK1 wyróżniono 22-nukleotydowe odwrócone powtórzenia flankujące

duży fragment DNA, zawierający gen tnpM oraz integron. Sekwencje te są podobne do

odwróconych powtórzeń elementu inercyjnego należącego do rodziny IS6 (powtórzenia

wyróżnione w sekwencji plazmidu pOK1 są jednak dłuższe). Wbudowanie elementu z tej

rodziny zazwyczaj powoduje stworzenie 8-nukleotydowych prostych powtórzeń. Na Fig. 27

przedstawiono organizację genetyczną fragmentu pOK1 zawierającego wspomniane IR.

69

Fig. 27. Organizacja genetyczna potencjalnego transpozonu plazmidu pOK1.

Pionowymi kreskami zaznaczono odwrócone powtórzenia (IRL i IRR, ang. inverted repeats). Powiększono regiony

międzygenowe zawierające powtórzenia, które zaznaczono na pomarańczowo. W górnym panelu przedstawiono

profil zawartości par G+C (Artemis, okno 120 nt).

Jak widać na schemacie, obszar oflankowany sekwencjami IR charakteryzuje się wyższą

zawartością par GC niż pozostała część plazmidu, co sugeruje nabycie tego elementu DNA

drogą HGT. Ponieważ w opisywanym fragmencie nie wyróżniono genów odpowiedzialnych za

transpozycję, można przypuszczać, że ten potencjalny element może być mobilizowany in trans,

w obecności kompatybilnej transpozazy, kodowanej przez autonomiczne TE.

2.5. Determinanty oporności

W genomie plazmidu pOK1 wyróżniono 8 potencjalnych determinantów oporności na różne

antybiotyki lub środki dezynfekujące. Cztery z nich znajdują się w obrębie integronu. W

kolejnych podrozdziałach przedstawiono ich charakterystykę.

2.5.1. Fosfotransferaza streptomycyny

Otwarta ramka odczytu oznaczona jako orf26 koduje potencjalne białko wykazujące 98-100%

identyczność sekwencji aa z fosfotransferazą streptomycyny A, pochodzącą z różnych

przedstawicieli Gammaproteobacteria. Analiza porównawcza, przeprowadzona za pomocą

programu BLAST, wykazała, że gen fosfatazy streptomycyny A (strA) jest często usytuowany w

różnych plazmidach, w pobliżu genu strB. W sekwencji plazmidu pOK1 wyróżniono jedynie gen

70

strA. Fosfotransferaza streptomycyny A nadaje komórce oporność na streptomycynę.

Streptomycyna jest pierwszym odkrytym antybiotykiem z grupy aminoglikozydów. Antybiotyki

aminoglikozydowe działają bakteriobójczo przede wszystkim na bakterie gramujemne.

Aminoglikozydy łączą się z rybosomami, co prowadzi do zaburzenia translacji. Innym lub

dodatkowym efektem działania jest zmiana integracji błony komórkowej komórki bakteryjnej

(Vakulenko i Mobashery, 2003).

Poznano kilka mechanizmów oporności na leki tej grupy: (i) pompy aktywnie usuwające

antybiotyk (Moore i wsp., 1999), (ii) zmniejszona przepuszczalność (Hancock, 1981), (iii)

modyfikacja rybosomów (Poehlsgaard i Doughtwaite, 2005) oraz (iv) inaktywacja antybiotyku

poprzez jego modyfikację (Shaw i wsp., 1993). Mechanizm oporności uzyskany dzięki nabyciu

przez komórkę genu strA polega na modyfikacji antybiotyku. Kodowana fosfotransferaza

przeprowadza reakcję fosforylacji streptomycyny zachodzącej przy węglu 3’, w wyniku czego

powstaje fosforan streptomycyny nie wykazujący działania antybakteryjnego. Wiele plazmidów

z grupy IncP-1 wyizolowanych z oczyszczalni ścieków posiada gen oporności na streptomycynę

(Schluter, 2007).

Poszukiwanie konserwowanych domen białkowych pozwoliło zakwalifikować Orf26 do

podrodziny 3’-fosfotransferaz aminoglikozydów-APH (kod cdd: cd05120). Członkowie tej

rodziny katalizują przeniesienie grupy γ-fosforanowej z ATP na antybiotyk glikozydowy, przede

wszystkim na: kanamycynę, streptomycynę, neomycynę oraz genamycynę. Gen APH

znajdowany jest w obrębie transpozonów i plazmidów. Uważa się że pierwotnie stanowił on

mechanizm obronny dla szczepów produkujących antybiotyk. Domena charakterystyczna dla

rodziny strA znajduje się między 22 a 280 aminokwasem. W sekwencji opisywanej

fosfotransferazy wyróżniono również miejsca aktywne oraz miejsca wiązania ATP i antybiotyku

(Fig. 28).

1 KKPQEFVIRKLKEPPLNRTNIFFGESHSDWLPVRGGESGDFVFRRGDGHAFAKIAPASRRGELAG 65

66 ERDRLIWLKGRGVACPEVINWQEEQEGACLVITAIPGVPAADLSGADLLKAWPSMGQQLGAVHSL130

131 SVDQCPFERRLSRMFGRAVDVVSRNAVNPDFLPDEDKSTPQLDLLARVERELPVRLDQERTDMVV 195

196 CHGDPCMPNFMVDPKTLQCTGLIDLGRLGTADRYADLALMIANAEENWAAPDEAERAFAVLFNVL 260

261 GIEAPDRERLAFYLRLDPLTWG 282

Fig. 28. Sekwencja aminokwasowa fosfotransferazy streptomycyny kodowanej w obrębie pOK1 .

Obramowaniem zaznaczono konserwowaną domenę charakterystyczną dla 3’fosfataz aminoglikozydów. Kolorem

żółtym oznaczono miejsca aktywne. Kolorowymi literami aminokwasy zaangażowane w wiązanie ATP – niebieskie

oraz wiązanie antybiotyku – czerwone.

71

2.5.2. Syntaza dihydroptrynianowa

Potencjalny produkt białkowy orf27 pOK1 wykazuje podobieństwo sekwencji aa (99-100%) do

syntaz dihydropterynianowych pochodzących z różnych szczepów bakterii. Geny

odpowiedzialne za powstawanie tego enzymu zlokalizowane są w plazmidach, najczęściej w

plazmidach niosących liczne determinanty oporności.

Syntaza dihydropterynianowa nadaje komórce oporność na sulfonamidy. Antybiotyki tej

grupy działają bakteriostatycznie poprzez zaburzenie syntezy kwasu foliowego. Sulfonamid

zastępuje kwas p-aminobenzoesowy i uniemożliwia syntezę kwasu foliowego, co prowadzi do

zahamowania syntezy nukleotydów i uniemożliwia namnażanie się bakterii.

Plazmidowe geny nadające komórce oporność na sulfonamidy to: sul1, sul2 oraz sul3 (Swedberg

i Sköld, 1983; Perreten i Berlin, 2003). Mechanizm oporności związany z obecnością genu sul2,

który zidentyfikowano w pOK1, polega na wytwarzaniu enzymu – syntazy

dihydropterynianowej, katalizującej reakcję kondensacji kwasu p-aminobenzoesowego w

biosyntezie kwasu foliowego (kod cdd: cd00739). Dodatkowa ilość enzymu umożliwia

biosyntezę kwasu foliowego w obecności sulfonamidu.

2.5.3. Białka warunkujące odporność na tetracyklinę

Otwarte ramki orf44 i orf45 zostały zdefiniowane, odpowiednio, jako geny tetR i tetH.

Sekwencje aminokwasowe kodowanych przez nie białek wykazują podobieństwo (100%) do

białek pochodzących z różnych przedstawicieli Gammaprotobacteria, które warunkują oporność

na tetracyklinę. Analiza porównawcza, przeprowadzona ze pomocą programu BLAST,

wykazała, że geny te są często zlokalizowane, z zachowaniem syntenii, w obrębie plazmidów i

transpozonów (Kehrenberg i wsp., 1998).

Tetracyklina i większość jej pochodnych wykazuje działanie antybakteryjne poprzez

zahamowanie wzrostu bakterii. Po wniknięciu do komórki, oddziałuje z rybosomami, co

prowadzi do zablokowania syntezy białek (uniemożliwiają wiązanie się z aminoacylo-tRNA). Są

to antybiotyki dość uniwersalne, dlatego też działają na wiele bakterii - zarówno gramujemnych,

jak i gramdodatnich (Roberts, 2005). Możliwy jest również inny mechanizm, bowiem niektóre

pochodne tetracykliny wiążą się z rybosomem słabo lub wcale, natomiast oddziałują z błoną

komórkową (Rasmussen i wsp., 1991).

Zidentyfikowano różne mechanizmy oporności na antybiotyki tej grupy: (i) pompy

aktywnie usuwające tetracykliny, (ii) wytwarzanie białek chroniących rybosom, czy (iii)

enzymatyczna inaktywacja (van Hoek i wsp., 2011). Poznano dotąd ponad 40 różnych

determinantów oporności. Geny kodujące pompy i białka chroniące rybosom są identyfikowane

72

u gramdodatnich i gramujemnych bakterii, zarówno tlenowych jak i beztlenowych, natomiast

enzymatyczna inaktywacja antybiotyku została opisana tylko dla bakterii gramujemnych. Gen

tetR koduje represor transkrypcji. Białka z tej rodziny regulatorów są zaangażowane w kontrolę

transkrypcji genów kodujących pompy aktywnie usuwające antybiotyki, szlaków biosyntezy

antybiotyków, odpowiedzi na stres osmotyczny i substancje toksyczne, kontrolę szlaków

katabolicznych oraz procesów różnicowania i patogenności (Ramos i wsp., 2005). Białka TetR

mogą działać na dwa sposoby: mogą się wiązać bezpośrednio do operatora np. TetR wiąże się z

genem tetA i hamuje jego transkrypcję przy braku tetracykliny, alternatywnie mogą być

zaangażowane w regulacyjną kaskadę, w której białko TetR może być modulowane przez inny

regulator, lub TetR może wywoływać odpowiedź komórkową.

Analiza w bazie Pfam pozwoliły wyróżnić w sekwencji TetR pOK1 charakterystyczne

domeny - N-końcową (PF00440) i C-końcową (PF02909). Domena N-końcowa warunkuje

wiązanie DNA poprzez motyw HTH. Liczne regulatory transkrypcji charakteryzują się

podobnymi domenami. Na podstawie podobieństwa sekwencji, produkt genu tetR jest zaliczany

do podrodziny białek grupujących represory kontrolujące poziom wrażliwości na hydrofobowe

antybiotyki i detergenty. Domena C-końcowa odpowiada za wiązanie się z genem tetA (nie

wyróżniony w sekwencji plazmidu pOK1) i hamuje jego ekspresję pod nieobecność tetracykliny

(Fig. 29).

1 MAKLDKEQVIDNALILLNEVGIEGLTTRKLAQKIGVEQPTLYWHVKNKRALLDALAETIL 60

61 QKHHHHVLPLPNETWQDFLRNNAKSFRQALLMYRDGGKIHAGTRPSESQFETSEQQLQFL 120

121 CDAGFSLSQAVYALSSIAHFTLGSVLETQEHQESQKEREKVETDTVAYPPLLTQAVAIMD 180

181 SDNGDAAFLFVLDVMISGLETVLKSAK 207

Fig. 29. Sekwencja aminokwasowa białka TetR kodowanego w obrębie pOK1.

Obramowaniem zaznaczono konserwowane domeny na niebiesko N-końcową, na żółto C-końcową. Czerwoną

czcionka zaznaczono motyw HTH.

Produkt genu tetH to pompa usuwająca antybiotyk klasy H. Dzięki analizom w bazach

Pfam i Conserved Domain Database w sekwencji Orf45 zidentyfikowano domenę typową dla

rodziny białek MFS (ang. major facilitator superfamily; PF07690), nazywanej również rodziną

uniporter-symporter-antyporter. Białka tej rodziny ułatwiają transport różnych substratów

(jonów, leków, neurotransmitierów, nukleozydów, aminokwasów i peptydów) z cytoplazmy do

błony wewnętrznej:. Białka zaliczane do tej grupy maja zazwyczaj długość od 400 do 600

73

aminokwasów i zawierają 12 helis transbłonowych. W sekwencji Orf45, długości 400 aa,

wyróżniono aż 11 helis transbłonowych (program TMHMM Server v. 2.0) (Fig. 30).

1 MNKSIIIILLITVLDAIGIGLIMPVLPTLLNEFVSENSLATHYGVLLALYATMQVIFAPI 60

61 LGRLSDKYGRKPILLFSLLGAALDYLLMAFSTTLWMLYIGRIIAGITGATGAVCASAMSD 120

121 VTPAKNRTRYFGFLGGAFGVGLIIGPMLGGLLGDISAHMPFIFAAISHSILLILSLLFFR 180

181 ETQKREALVANRTPENQTASNTVTVFFKKSLYFWLATYFIIQLIGQIPATIWVLFTQYRF 240

241 DWNTTSIGMSLAVLGVLHIFFQAIVAGKLAQKWGEKTTIMISMSIDMMGCLLLAWIGHVW 300

301 VILPALICLAAGGMGQPALQGYLSKSVDDNAQGKLQGTLVSLTNITGIIGPLLFAFIYSY 360

361 SVAYWDGLLWLMGAILYAMLLITAYFHQRKTTPKAVISTP 400

Fig. 30. Sekwencja aminokwasowa białka TetH kodowanego w obrębie pOK1.

Obramowaniem zaznaczono konserwowaną domenę. Czerwoną czcionka zaznaczono aminokwasy potencjalnie

tworzące pory. Zielonym tłem zaznaczono aminokwasy prawdopodobnie tworzące helisy transbłonowe.

2.5.4. Reduktaza dihydrofolianowa, acetylotransferaza aminoglikozydowa, β-laktamaza,

białko warunkujące oporność na czwartorzędowe związki amoniowe

Otwarte ramki odczytu orf39-orf42 warunkują oporność na różne antybiotyki i substancje

toksyczne. Geny te znajdują się w obrębie potencjalnego integronu (patrz podrozdział: 2.4.2.

Integron).

Analiza porównawcza wykonana za pomocą programu BLAST wykazała podobieństwo

sekwencji aa Orf39, na poziomie 99–100%, do reduktaz dihydrofolianowych typu I,

spotykanych u różnych przedstawicieli Gammaproteobacteria. Enzym ten nadaje komórce

oporność na trimetoprim.

Trimetoprim jest syntetycznym chemioterapeutykiem, którego działanie polega na

hamowaniu aktywności reduktazy dihydrofolianowej, w wyniku zablokowania jej miejsca

aktywnego. Enzym ten jest częścią szlaku biosyntezy kwasu foliowego (katalizuje zależną od

NADP redukcję kwasu foliowego), a jego zablokowanie powoduje zatrzymanie syntezy

nukleotydów. Mechanizm oporności jest związany z obecnością genu kodującego reduktazę

dihydrofolianową, która jest niewrażliwa na antybiotyk i przejmuje funkcje reduktazy

kodowanej chromosomowo (wrażliwej na trimetoprim) (Fleming i wsp., 1972).

Poszukiwanie konserwowanych domen białkowych umożliwiło wyróżnienie w sekwencji

opisywanego enzymu domeny charakterystycznej dla reduktazy dihydrofolianowej oraz

potencjalnych miejsc wiązania kwasu foliowego i NADP (Fig. 31).

74

1 VKLSLMVAISKNGVIGNGPDIPWSAKGEQLLFKAITYNQWLLVGRKTFESMGALPNRKYA 60

61 VVTRSSFTSDNENVLIFPSIKDALTNLKKITDHVIVSGGGEIYKSLIDQADTLHISTIDI 120

121 EPEGDVYFPEIPSNFRPVFTQDFASNINYSYQIWQKG 157

Fig. 31. Sekwencja aminokwasowa reduktazy dihydrofolianowej kodowanej w obrębie pOK1.

Obramowaniem zaznaczono konserwowaną domenę. Czerwoną czcionka zaznaczono aminokwasy potencjalnie

wiążące kwas foliowy. Zieloną zaznaczono aminokwasy wiążące NADP.

Analiza porównawcza wykazała, że Orf40 pOK1 wykazuje największe podobieństwo do

6’-N-acetylotransferaz aminoglikozydowych typu Ib (98% identyczności sekwencji

aminokwasowych). Enzym ten warunkuje oporność na antybiotyki aminoglikozydowe, uzyskaną

dzięki modyfikacji antybiotyku. Białka te są również opisywane jako 6’-N-acetylotransferaza

acetylująca fluorochinolony, co może sugerować, że enzym ten nadaje komórce oporność na

antybiotyki tej grupy.

Stosując program Conserved Domain Search stwierdzono, że w sekwencji enzymu

występują domeny charakterystyczne dla acetylotransferaz, tj. domena typowa dla nadrodziny

AlcB oraz domena typowa dla nadrodziny N-acetylotransferaz (Fig. 32). Domena AlcB

odpowiada za katalizowanie reakcji N-acylowania grup hydroksyloaminowych w N-

hydroksybutano - 1, 4 diaminie z sukcynylo-CoA i aktywowanie tioestrowej pochodnej kwasu

bursztynowego (produktu pośredniego cyklu Krebsa).

1 LPNLAKGLTSGSNDSVTLRLMTEHDLAMLYEWLNRSHIVEWWGGEEARPTLADVQEQYLP 60

61 SVLAQESVTPYIAMLNGEPIGYAQSYVALGSGDGRWEEETDPGVRGIDQLLANASQLGKG 120

121 LGTKLVRALVELLFNDPEVTKIQTDPSPSNLRAIRCYEKAGFERQGTVTTPYGPAVYMVQ 180

181 TRQAFERTRSDA 192

Fig. 32. Sekwencja aminokwasowa acetylotransferazy aminoglikozydowej kodowanej w obrębie pOK1.

Obramowaniem zaznaczono konserwowane domeny na różowo domenę AlcB, na niebiesko – domenę

charakterystyczną dla acetylotransferaz GNAT.

Otwarta ramka odczytu orf41 została zidentyfikowana jako gen kodujący β-laktamazę

klasy D - enzym nadający komórce oporność na antybiotyki β-laktamowe. Działanie

antybiotyków tej grupy polega na zahamowaniu syntezy ściany komórkowej poprzez wiązanie

do tzw. białek wiążących penicylinę (ang. penicillin binding proteins, PBPs.) i oddziaływanie z

peptydoglikanami obecnymi w ścianie, co skutkuje jej osłabieniem prowadzi do śmierci

komórki.

75

Najważniejszym i najbardziej powszechnym mechanizmem oporności polega na

hydrolizie w cząsteczce antybiotyku wiązania β-laktamowego, niezbędnego do jego działania.

Biorąc pod uwagę funkcjonalność i charakterystykę molekularną β – laktamaz, wyróżniono kilka

klas tych enzymów. Oprócz wytwarzania enzymu możliwy jest inny mechanizm oporności,

polegający na modyfikacji białek wiążących penicylinę. Wówczas, ich wiązanie z antybiotykiem

staje się niemożliwe i ściana komórkowa nie ulega zniszczeniu (Bradford, 2001).

W sekwencji Orf41 zidentyfikowano sekwencję charakterystyczną dla transpeptydaz

(Pfam: PF00905), do których należą białka wiążące penicylinę. Transpeptydazy to enzymy

uczestniczące w budowie ściany komórkowej, odpowiadają za tworzenie mostków łączących

podjednostki peptydoglikanu.

Z kolei Orf42 kodowane w obrębie pOK1 wykazuje znaczące podobieństwo do genu

oznaczanego jako qacΔE1. Jest to defektywny gen nadający komórce częściową oporność na

czwartorzędowe związki amoniowe i bromek etydyny, który jest charakterystyczny dla

konserwowanej części 3’ integronów klasy I. Czwartorzędowe związki amoniowe to

amfoteryczne surfaktanty, często używane jako środki antyseptyczne i dezynfekcyjne. Ich

stosowane przyczynia się do selekcji fenotypów wieloopornych, determinowanych przez

integrony (Gaze i wsp., 2005).

Oporność na te związki wynika głownie z obecności genu qac kodującego białka

tworzące pompę usuwającą szkodliwe związki z komórki. W sekwencji Orf42 występuje

domena typowa dla nadrodziny białek oporności wielolekowej (Pfam: PF00893). Liczne białka z

tej rodziny zaangażowane są w proces usuwania z komórki toksycznych związków, któremu

towarzyszy napływ do komórki protonów.

2.6. Dodatkowy ładunek genetyczny plazmidu pOK1

Moduły genetyczne wyróżnione w sekwencji pOK1, które opisano w poprzednich rozdziałach,

zajmują większą część genomu plazmidu. W niniejszym rozdziale przedstawiono analizę 13

ORF leżących poza ww. modułami. Dziewięć z nich koduje hipotetyczne białka o nieznanej

funkcji, a blisko połowa wykazuje podobieństwo sekwencji do białek kodowanych w genomie

Wohlfahrtiimonas chitiniclastica SH04.

2.6.1. Transferaza adenozynofosforanu SoFic

Otwarta ramka odczytu orf03 koduje potencjalne białko wykazujące największe podobieństwo

sekwencji aa (96%) do transferazy adenozynofosforanu Wohlfahrtiimonas chitiniclastica SH04

(GenBank: WP_008315219.1). Białka pokrewne (podobieństwo sekwencji rzędu 66-67%)

76

zostały przypisane w bazach danych do rodziny Fic/DOC (PF02661). Rodzina ta składa się z

białek zaangażowanych w filamentację indukowaną przez cAMP (Fic) oraz eliminację komórek

pozbawionych profaga P1 (Doc). Białka Fic są zaangażowane w podział komórki i mogą

odgrywać rolę w syntezie kwasu p-aminobenzoesowego oraz kwasu foliowego. Są to enzymy

zmieniające inne białka poprzez dołączenie grupy adenozyno monofosforanu. Większość

członków tej rodziny zawiera konserwowany motyw HPFXXGNG. Motyw ten został również

znaleziony w sekwencji Orf03, w obrębie domeny charakterystycznej dla białek z rodziny

Fic/DOC (Fig. 33). W opisywanej sekwencji znajduję się również domena charakterystyczna dla

N-końcowej części białek z tej samej rodziny (Fic_N, PF:13784).

Fig. 33. Struktura domenowa białka Orf03 plazmidu pOK1.

Zaznaczono zasięg konserwowanej domeny Fic\DOC oraz sekwencję charakterystycznego dla niej motywu.

2.6.2. Białko z rodziny SNF

Białko pokrewne Orf04 (61-74% identyczności sekwencji aminokwasowej) mają aktywność

helikaz (GenBank: WP_002116862.1, WP_007933579.1). W sekwencji Orf04 wyróżniono

domenę charakterystyczna dla białek zaangażowanych w ATP-zależne rozwijanie RNA lub

DNA (DEXDc, Cdd: cd00046) oraz domenę często spotykaną w helikazach (HELICc, Cdd:

cd00079) (Fig. 34).

Fig. 34. Struktura domenowa białka Orf04 plazmidu pOK1.

Zaznaczono zasięg konserwowanych domen oraz miejsca wiązania ATP, nukleotydów oraz potencjalne miejsce

wiązania jonów magnezu.

2.6.3. Inwertaza DNA

Potencjalny produkt białkowy orf10 wykazuje 99% identyczność sekwencji aminokwasowej z

białkiem Wohlfahrtiimonas chitiniclastica SH04, opisanym jako inwertaza DNA (GenBank:

77

ELV07188.1). Należy podkreślić, że kolejne najbardziej podobne białko (90% identyczności)

również pochodzi z Wohlfahrtiimonas chitiniclastica SH04 i zostało opisane przez deponujących

jako inwertaza DNA lambdoidalnego profaga e14 (GenBank: ELV07232.1). Inne pokrewne

białka są definiowane jako inwertazy DNA lub resolwazy.

Za pomocą programu Conserved Domain Search (NCBI) zidentyfikowano w sekwencji

Orf10 domenę katalityczną charakterystyczną dla rekombinaz serynowych (SR_ResInv, Cdd:

cd03768), do których należą resolwazy, inwertazy, integrazy oraz transpozazy (Fig. 35).

Fig. 35. Struktura molekularna białka Orf10 plazmidu pOK1.

Zaznaczono zasięg konserwowanych domen oraz aminokwasy zaangażowane w aktywność białka.

2.6.4. Resolwaza

Sekwencja aminokwasowa Orf35 wykazuje 100% identyczność z sekwencją resolwazy

kodowanej w plazmidzie pAb5S9 Aeromonas bestiarium (GenBank: YP_001220603.1). orf35

jest zlokalizowana w obszarze pOK1 wykazującym duże podobieństwo do sekwencji plazmidu

pAb5S9 (patrz rozdział: Systemy replikacyjne) (nie stwierdzono, aby we wspomnianym

plazmidzie ww. ORF znajdowała się w obrębie transpozonu). Inne białka pokrewne Orf35

(identyczność sekwencji aminokwasowej 82-88%) są określane jako potencjalne resolwazy, i

występują u różnych przedstawicieli Gammaproteobacteria (GenBank: WP_017154886.1,

AAP22618.1, WP_002804317.1). W przypadku Pseudomonas areuginosa sekwencja pokrewna

orf35 (GenBank: AAP22618.1) znajduje się w obrębie wyspy genomowej (Klockgether i wsp.,

2004). Należy zauważyć, że sekwencje aa wszystkie białek pokrewnych Orf35 są o około 90 aa

dłuższe. Wyjątek stanowi sekwencja pochodząca z plazmidu pAb5S9 o takiej samej długości.

Na Fig. 36 przedstawiono schematycznie strukturę molekularną Orf35. W sekwencji

wyróżniono domenę katalityczna charakterystyczną dla rekombinaz serynowych (SR_ResInv,

Cdd: cd03768), do których należą resolwazy, inwertazy, integrazy oraz transpozazy, a także

domenę HTH , charakterystyczną dla białek Hin i im pokrewnych (HTH_Hin, Cdd: cd00569). W

rekombinazie Hin wyróżnia się domenę wiążącą DNA (HTH_Hin) oraz domenę katalitycznej.

Rozdział kointegratu przez resolwazę transposonów z rodziny Tn3 wymaga utworzenia

78

synaptosomu z trzech dimerów resolwazy związanych z dwoma miejscami res. W sekwencji

opisywanej potencjalnej resolwazy znalezione zostały aminokwasy prawdopodobnie biorące

udział w tworzeniu synaptosomu.

Fig. 36. Struktura molekularna białka Orf35 plazmidu pOK1.

Zaznaczono zasięg konserwowanych domen oraz aminokwasy zaangażowane w aktywność białka.

2.6.5. Hipotetyczne białka o nieznanej funkcji

Dziewięć ORF plazmidu pOK1 koduje hipotetyczne białka o nieznanej funkcji. Jedna z nich,

orf01, koduje białko konserwowane w genomie Wohlfahrtiimonas chitiniclastica SH04

(GenBank: ELV07224.1). W sekwencji tej nie stwierdzono występowania konserwowanych

domen i motywów.

Również białko Orf13 oraz Orf24 kodują białka konserwowane w W. chitiniclastica

SH04 - GenBank, odpowiednio: ELV07179.1 (76% identyczności sekwencji aa) oraz

ELV07178.1 (96% identyczności).

Pozostałe białka pOK1 wykazujące duże podobieństwo z białkami ww. bakterii to: Orf08

(GenBank: ELV07186.1) i Orf09 (GenBank: ELV07187.1) - w obu przypadkach 99%

identyczności sekwencji. Para orf08-orf09 konserwowana jest również w genomie Legionella

shakespearei (odpowiednio, 62% podobieństwa, GenBank: WP_018576134.1 i 56% i

WP_018576135.1).

Poszukiwanie konserwowanych domen białkowych ujawniło w sekwencji Orf08

obecność domeny charakterystycznej dla konserwowanych białek o nieznanej funkcji DUF1778

(Pfam: 08681). Domena ta obejmuje prawie całą długość wyróżnionej sekwencji. W sekwencji

Orf09 wyróżniono natomiast domenę występującą u acetylotransferaz z rodziny GNAT (Pfam:

PF13508).

Otwarta ramka odczytu orf28 koduje białko wykazujące 97% identyczność sekwencji aa

z hipotetycznym białkiem Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. SL1344

(GenBank: YP_006203625.1). Zdeponowana w bazie danych sekwencja polipeptydu o długości

74 aa (równa długości Orf28) została opisana jako białko niekompletne. Pokrewne białka o

79

wysokiej identyczności sekwencji (96-98%) są długości 60aa (Photobacterium damselae subsp.

Piscicida, GenBank: YP_908617.1, Acinetobacter nosocomialis, GenBank: WP_001985034.1).

Wyjątek stanowi hipotetyczne białko z E. coli (GenBank: WP_001513485.1) - o długości 102

aa.

Kolejnym hipotetycznym białkiem jest Orf29. Pokrewne białko (96% identyczności

sekwencji), o długości Orf29, kodowane jest w genomie E. coli (GenBank: WP_001340320.1).

Należy zwrócić uwagę na wysokie podobieństwo (97%) sekwencji Orf29 z sekwencjami białek

opisanych jako białka replikacyjne RepC z różnych plazmidów przedstawicieli

Gammaproteobacteria (S. enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. T000240,

GenBank: YP_005250562.1 i E. coli, GenBank: WP_000240537.1).

Orf31 i Orf36 kodują hipotetyczne białka wykazujące największe podobieństwo

sekwencji do białek kodowanych w plazmidzie pAb5S9 Aeromonas bestiarium (GenBank,

odpowiednio: ABR10074.1 - 96 % identyczność sekwencji aa, i NP_899667.1 - 88 %

identyczność sekwencji). Stanowią one część większego segmentu plazmidu pOK1,

konserwowanego w plazmidzie pAb5S9. Tuż powyżej orf36 znajduje się gen modulatora

transpozonu Tn21 (otwarte ramki odczytu Orf36 i TnpM nachodzą na siebie na obszarze

kodującym 14 aminokwasów), co sugeruje, iż orf39 nie jest kompletna, i zapewne jej ciągłość

została przerwana w wyniku zamierzchłych zdarzeń transpozycyjnych.

3. Analiza funkcjonalna wybranych modułów genetycznych

plazmidu pOK1

W wyniku przedstawionej w tej pracy analizy bioinformatycznej sekwencji genomu plazmidu

pOK1 wyróżniono różne moduły genetyczne. W niniejszym rozdziale przedstawiono wyniki

analiz funkcjonalnych wybranych modułów.

3.1. Moduł replikacyjny.

W genomie pOK1 wyróżniono trzy potencjalne systemy replikacyjne (oznaczone jako REP1,

REP2 i REP3) (Fig. 1).

3.1.1. Analiza funkcjonalna systemów replikacyjnych.

W pierwszym etapie analizy sprawdzono, który z obecnych systemów REP jest funkcjonalny w

E. coli TG1. W tym celu przygotowano konstrukty obejmujące fragmenty plazmidu pOK1,

zawierające, odpowiednio, REP1, REP2, REP3 oraz REP1+REP3. W każdym przypadku

80

plazmid pOK1 poddano trawieniu odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Następnie uzyskane

fragmenty poddano ligacji (cyrkularyzacja fragmentów).

Fig. 37. Schematy fragmentów restrykcyjnych wykorzystywanych do sprawdzenia funkcjonalności systemów

replikacyjnych.

Za pomocą strzałek zaznaczono zasięg i orientację transkrypcyjną potencjalnych ORF. Kolorami wyróżniono

podstawowe moduły genetyczne: na zielono moduły odpowiedzialne za replikację plazmidu, na pomarańczowo –

systemy odpowiedzialne za stabilne utrzymywanie plazmidu w komórce (systemy partycyjne, restrykcji-

modyfikacji oraz toksyna-antytoksyna), na niebiesko – ruchome elementy genetyczne zintegrowane z genomem

plazmidu, na fioletowo – determinanty oporności. Zaznaczono systemy replikacyjne REP1, REP2 i REP3 oraz

fenotypy opornościowe: Tcr – oporność na tetracyklinę, Ap

r – oporność na antybiotyki β-laktamowe, Am

r –

opornośc na aminoglikozydy, Trr – oporność na trimetoprim, Su

r – oporność na sulfonamidy, Sm

r – oporność na

streptomycynę.

81

Mieszaninę ligacyjną wprowadzano metodą transformacji do komórek E. coli TG1, które

wysiewano na odpowiednie podłoża selekcyjne: (i) REP1 – LB ze streptomycyną (15 μg/ml), (ii)

REP2 – LB z kanamycyną (50 μg/ml) oraz LB z trimetoprimem (50 μg/ml), (iii) REP3 – LB z

tetracykliną (20 μg/ml), (iv) REP1+REP3 – LB z tetracykliną 20 μg/ml. Z otrzymanych

transformantów izolowano plazmidowy DNA metodą lizy alkalicznej, a następnie poddawano go

analizie restrykcyjnej i elektroforetycznej. Otrzymane wyniki pozwoliły stwierdzić, że w

komórkach E. coli replikacja zachodzi jedynie z wykorzystaniem systemu REP2 (autoligacja po

trawieniu HindIII).

3.1.2. Określenie zakresu gospodarzy systemów replikacyjnych pOK1

Ponieważ stwierdzono, że w komórkach E. coli TG1 replikacja zachodzi jedynie z

wykorzystaniem REP2, podjęto badania mające na celu poszukiwanie potencjalnych gospodarzy,

w których funkcjonalne są systemy REP1 i REP3.

Podjęto zatem próbę ustalenia zakresu gospodarzy poszczególnych systemów

replikacyjnych. W tym celu sklonowano fragmenty sekwencji plazmidu pOK1 w wektorze

pABW1, otrzymując wektory wahadłowe pOK1a i pOK1b (Fig. 38). Klonowane fragmenty

pOK1 zawierały REP1 bądź REP1+REP3.

Preparat plazmidu pOK1 trawiono enzymami EcoRI i SacI lub SacI i KpnI, a następnie

ligowano z kompatybilnymi końcami liniowej formy wektora pABW1. Następnie mieszaniny

ligacyjne wprowadzano do komórek E. coli TG1 metodą transformacji. Z wyselekcjonowanej

puli transformantów izolowano plazmidowy DNA, który poddawano analizie restrykcyjnej.

Otrzymane transformaty niosące plazmidy wahadłowe, wykorzystano jako dawców w koniugacji

trójrodzicielskiej. Plazmidy wprowadzano do szczepów opornych na ryfampicynę: Paracoccus

aminovorans JCM 7685R, Agrobacterium tumefaciens LBA 288R (oba należące do

Alphaproteobacteria), Alcaligenes sp. LM16R (Betaproteobacteria), Stenotrophomonas sp.

LM24R, Pseudomonas sp. LM12R (oba należące do Gammaproteobacteria), Vogesella sp. 93R

(Betaproteobacteria), Klebsiella pneumoniae, Yersinia enterocoltica Ye0:9R, Aeromonas sp.

82R (trzy należące do Gammaproteobacteria). Jako szczep pomocniczy w koniugacji

wykorzystano szczep E. coli DH5α plazmidem pRK2013. Plazmidy otrzymanych

transkoniugantów analizowano elektroforetycznie.

82

Fig. 38. Organizacja genetyczna wektora pABW1 (a) oraz fragmentów pOK1 zawierajacych systemy REP2

(b), oraz REP1 i REP3 (c).

W pABW1 zaznaczono system replikacyjny (ori ColE1), moduł mobilizacyjny (mob), gen lacZ, gen oporności na

kanamycynę (Km) oraz MCS (ang. multi-cloning site), w obrębie którego znajdują się miejsca cięcia enzymami

EcoRI i SacI, KpnI i SacI. Pod spodem podano nazwy skonstruowanych plazmidów wahadłowych zawierających

sklonowane fragmenty pOK1.

Autonomiczne formy plazmidu stwierdzono jedynie w przypadku plazmidu

zawierającego system REP2. Nie znaleziono gospodarza, w którym replikacji ulegałby konstrukt

niosący potencjalne systemy replikacyjne REP1 i REP3. Wykazano, że plazmid pOK1a ulega

replikacji w szczepach: Paracoccus aminovorans JCM7685R, Agrobacterium tumefaciens LBA

288R, Pseudomonas sp. LM12R, Aeromonas sp. 82R oraz Vogesella sp. 93R. W szczepach

Alcaligenes sp. LM16R i Stenotrophomonas sp. LM24R nie stwierdzono autonomicznej formy

plazmidu. Koniugacja z wykorzystaniem jako biorca szczepu Yersinia enterocoltica Ye0:9R dała

wynik niepowtarzalny. W przypadku koniugacji ze szczepem Klebsiella pneumoniae

prawdopodobnie replikacji ulega system z pABW1.

Podsumowując, otrzymane wyniki system replikacyjny REP2 jest funkcjonalny w

przedstawicielach Alpha-, Beta- i Gammaproteobacteria, co świadczy o jego szerokim zakresie

gospodarzy, natomiast systemy REP1 i REP3 nie są prawdopodobnie funkcjonalne, co wymaga

jeszcze dodatkowej weryfikacji.

83

3.2. Badanie mobilizacji plazmidu pOK1 do transferu koniugacyjnego

W sekwencji opisywanego plazmidu wyróżniono część potencjalnego systemu mobilizacji do

transferu koniugacyjnego (MOB). Analiza funkcjonalna objęła również sprawdzenie tego

modułu. W tym celu wykonano koniugację wykorzystując system transferu pRK2013 (RK2). W

przeprowadzonych testach plazmid pOK1 był niezdolny do transferu koniugacyjnego.

84

Wnioski

Plazmid pOK1 jest ciekawym przykładem replikonu o mozaikowej strukturze. W jego genomie

można wyodrębnić segmenty DNA wykazujące wysokie podobieństwo (na poziomie sekwencji

nukleotydowej) do plazmidów pMS260 z Actinobacillus pleuropneumoniae oraz pAb5S9

Aeromonas bestiarium. Na uwagę zasługuje również fakt, że duża część otwartych ramek

odczytu wyróżnionych w sekwencji pOK1 wykazuje największe podobieństwo do potencjalnych

białek Wohlfahrtiimonas chitiniclastica (w Zakładzie Genetyki Bakterii Uniwersytetu

Warszawskiego wykazano, że bakteria ta zawiera plazmid). Struktura pOK1 została zatem

ukształtowana w głównej mierze w wyniku zdarzeń rekombinacyjnych, do których dochodziło

między trzema ww. plazmidami lub ich pochodnymi. Dzięki zaobserwowanym podobieństwom

możliwe jest zaproponowanie potencjalnych, pierwotnych gospodarzy tego plazmidu, których

nie znamy, bowiem plazmid ten wyizolowano metodą egzogenną.

Występowanie kilku systemów replikacyjnych w genomie pOK1 nie jest zjawiskiem

unikatowym. Przykładem jest kryptyczny plazmid F, który zawiera w swojej strukturze trzy

systemy replikacyjne, z których jeden został zinaktywowany w wyniku transpozycji Tn1000.

Genom plazmidu pOK1 ilustruje jednak inne ważne zjawisko, a mianowicie akumulację w

replikonach złożonych determinantów oporności, które, dzięki szerokiemu zakresowi

gospodarzy jednego z systemów replikacyjnych, mogą być dalej przekazywane w

horyzontalnym transferze genów.

85

Bibliografia

AIZENMAN E, ENGELBERG – KUKLA H, GLASER E, 1996. An Escherichia coli chromosomal “addiction

module” regulated by guanosine 3’,5’ – bispyrophosphate: a model for programmed bacterial cell death. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 93, 6059-6063.

American Academy of Microbiology, 2009. Antibiotic resistance: an ecological perspective on an old problem.

AL-AHMAD A, DASCHNER FD, KÜMMERER K, 1999. Biodegradability of cefotiam, ciprofloxacin,

meropenem, penicillin G, and sulfamethoxazole and inhibition of waste water bacteria. Arch. Environ. Con. Tox.

37, 158- 63.

ALLEN HK, DONATO J, WANG HH, CLOUD-HANSEN KA, DAVIES J, HANDELSMAN J, 2010. Call of the

wild: antibiotic resistance genes in natural environments. Nat. Rev. Microbiol. 8, 251-259

ALONSO A., SANCHEZ P., MARTINEZ J. L., 2001. Environ. Microbiol. 3, 1.

APISIRIDEJ S, LEELAPORN A, SCARAMUZZI C D, SKURRAY R A, FIRTH N, 1997. Molecular analysis of a

mobilizable theta-mode trimethoprim resistance plasmid from coagulase-negative Staphylococci. Plasmid 38, 13-24.

BAHL MI, BURMOLLE M, MEISNER A, HANSEN LH, SORENSEN SJ, 2009. All IncP-1 plasmid subgroups,

including the novel epsilon subgroup, are prevalent in the influent of a Danish wastewater treatment plant. Plasmid

62, 134-139.

BARTOSIK D, WŁODARCZYK M, THOMAS CM, 1997. complete nucleotide sequence of the replicator region

of Paracoccus (Thiobacillus) versutus pTAV1 plasmid and its correlation to several plasmids of Agrobacterium and

Rhizobium species. Plasmid 38, 53-59.

BERTINI A, POIREL L, MUGNIER PD, VILLA L, NORDMANN P, CARATOLLI A, 2010. Characterization and

PCR-based replicon typing of resistance plasmids in Acinetobacter baumannii. Antimicrob. Agents Chemother. 54,

4168-4177.

BENNETT PM., 2008. Plasmid encoded antibiotic resistance: acquisition and transfer of antibiotic resistance

genes in bacteria. Brit. J. pharmacol. 153, 347-357.

BIRNBOIM HC, DOLY J, 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombination plasmid DNA.

Nucleic Acids Res. 7, 1513-1519.

BRADFORD PA, 2001. Extended spectrum β-lactamase in the 21st century: characterization, epidemiology, and

detection of this important resistance threat. Clin. Microbiol. Rev. 14, 933-951

BROWN HJ, STIKES HW, HALL RM, 1996. The integrons In0, In2 and In5 are defective transposon derivatives.

J. Bacteriol. 178, 4429-4437.

CHEE_SANFORD JC, MACKIE RI, KOIKE S, KRAPAC IG, LIN YF, YANNARELL AC, MAXWELL S,

AMINOV RI, 2009. Fate and transport of antibiotic residues and antibiotic resistance genes following land

application of manure waste. J. Environ. Q. 38, 1086-1108.

CROOKS GE, HON G, CHANDONIA JM, BRENNER SE, 2004. WebLogo: a sequence logo generator. Genome

Res. 14, 1188-1190.

D' COSTA VM, McGRANN KM, HUGHES DW, WRIGHT GD, 2006. Sampling the antibiotic resistome. Science

311, 374-377.

DIAZ-OREJAS R, DEL SOLAR G, GIRALDO R, RUIZ-ECHEVARRIA M J, ESPINOSA M, 1998. Replication

and control of circular bacterial plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 62, 434-464.

DIONISIO F, MATIC I, RADMAN M, RODRIGUES OR, TADDEI F, 2002. Plasmids spread very fast in

heterogeneous bacterial communities. Genetics 162, 1525-1532.

86

DITTA G, STANFIELD S, CORBIN D, HELINSKI DR, 1980. Broad host range DNA cloning system for gram-

negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 7347-7351.

EBERSBACH G, GERDES K, 2005. Plasmid segregation mechanisms. Annu. Rev. Genet. 39, 453-479.

FERNANDEZ DE HENESTROSA AR, OGI T, AOYAGI S, CHAFIN D, HAYES JJ, OHMORI H, WOODGATE

R, 2000. Identification of additional genes belonging to the LexA regulon in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 35,

1560-1572.

FLEMING MP, DATTA N, GRÜNEBERG RN, 1972. Trimethoprim resistance determined by R factors. Br. Med.

J. 1, 726-728.

GANDARA A. MOTA LC, FLORES C, PEREZ HR, GREEN CF, GIBBS SG, 2006. Isolation of Staphyloccocus

aureus and antibiotic-resistant Staphylococcus aureus from residential indoor bioaerosols. Environ. Health

Perspect. 114, 1859-1864.

GAZE WH, ABDOUSLAM N, HAWKEY PM, WELLINGTON EM, 2005. Incidence of class 1 integrons in

quaternary ammonium compound-polluted environment. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 1802-1807.

GERDES K, 2000. Toxin-antitoxin modules may regulate synthesis of macromolecules during nutritional stress. J.

Bacteriol. 182, 561-572.

GERDES K, CHRISTENSEN S. K., LOBNER-OLESEN A, 2005. Prokaryotic toxin–antitoxin stress response loci.

Nat. Rev. Microbiol. 3, 371-382.

GERDES K, MOLLER-JENSEN J, BUGGE JENSEN R, 2000. Plasmid and chromosome partitioning: surprises

from phylogeny. Mol. Microbiol. 37, 455-466.

GIBSON TJ, 1984. Studies on the Epstein-Barr virus genome. Praca doktorska. Cambridge University, Anglia.

GIRALDO R, FERNANDES-TRESGUERRES ME. 2004. Twenty years of the pPS10 replicon: insights on the

molecular mechanism for the activation of DNA replication in iteron-containing bacterial plasmids. Plasmid 52, 69-

83.

GOLOVANOV AP, BARILLA D, GOLOVANOVAM, HAYES F, LIAN LY, 2003. ParG, a protein required for

active partition of bacterial plasmids, has a dimeric ribbon-helix-helix structure. Mol. Microbiol. 50, 1141-53.

GOULD IM, 1999. A review of the role of antibiotic policies in the control of antibiotic resistance. J. Antimicrob.

Chemother. 43, 459-465.

GRAVEL A, FOURNIER B, ROY PH, 1998. DNA complexes obtained with the integronintegrase IntI1 at the attI1

site. Nucleic Acids Research, 26, 4347-4355.

GRINSTED J, DE LA CRUZ F, SCHMITT R, 1990. The Tn21 subgrup of bacterial transposable elements. Plasmid

24, 163-189.

GUERIN E, CAMBRAY G, SANCHEZ-ALBEROLA N, CAMOPOY S, ERILL I, DA RE S, GONZALES-ZORN

B, BARBE J, PLOY M-C, MAZEL D, 2009. The SOS Response Controls Integron Recombination. Science 324-

1034.

HARLEY CB, REYNOLDS RP, 1987. Analysis of E. coli promoter sequences. Nucleic Acids Res. 15, 2343-2361.

HANCOCK REW, 1981. Aminoglycoside uptake and mode of action with special reference to streptomycin and

gentamicin. J. Antimicrob. Chemother. 8, 249-276.

HEINEMANN JA, SPRAGUE GF Jr, 1989. Bacterial conjugative plasmids mobilize DNA transfer between

bacteria and yeast. Nature 340, 205-209.

HERMANSON M, JONES GW, KJELLEBERG S, 1987. Frequency of antibiotic and heavy metal resistance,

pigmentation, and plasmids in bacteria of the marine air-water interface. Apll. Environ. Microbiol. 53, 2338-2342.

87

KEHRENBERG C, WERCKENTHIN C, SCHWARTZ S, 1998. Tn5706, a transposon-like element from

Pasteurella multocida mediating tetracycline resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 2116-2118.

KLOCKGETHER J, REVA O, LARBIG K, TÜMMLER B, 2004. Sequence analysis of the mobile genome island

pKLC102 of Pseudomonas aeruginosa. C. J. Bacteriol. 186, 518-534.

KREPS S, FERINO F, MOSARIN C, GERITS J, MERGEAY M, THURIAUX P, 1990. Conjugative transfer and

autonomous replication of a promiscuous IncQ plasmid in the cyanobacterium Synechocystis Pcc-6803. Mol. Gen.

Genet. 221, 129-133.

KUSHNER SR, 1978. An improved method for transformation of E. coli with ColE1 derived plasmids, str. 17-23.

W: Boyer, HB, Nicosia S (red.), Genetic engineering. Elsevier/North Holland, Amsterdam, Holandia.

KÜMMERER K., 2004. Resistance in the environment. J. Antimicrob. Chemother. 54, 311-320.

LIEBERT CA, HALL RM, SUMMERS AO, 1999. Transposon Tn21 Flagship of the Floating Genome. Microbiol.

Mol. Biol. Rev. 63, 507-522.

LITTLE JW, 1991. Mechanism of specific LexA cleavage: autodigestion and the role of RecA coprotease.

Biochimie 73, 411-421.

LIU B, POP M., 2009. ARDB – Antibiotic Resistance Genes Database. Nucleic Acids Res. 37, 443-447.

LUTKENHAUS J, SUNDARAMOORTHY M, 2003. MinD and role of the deviant Walker A motif, dimerization

and membrane binding in oscillation. Mol. Microbiol. 48, 295-303.

MARTINEZ JL 2009. Environmental pollution by antibiotics and by antibiotic resistance determinants. Environ.

Pollut. 157, 2893-2902.

MALONE T, BLUMENTHAL RM, CHENG X, 1995. Structure-guided analysis reveals nine sequence motifs

conserved among DNA amino-methyltransferases, and suggests a catalytic mechanism for these enzymes. J. Mol.

Biol. 253, 618-632.

MAZEL D, 2006. Integrons: agents of bacterial evolution. Nat. Rev. Microbiol. 4, 608-620.

MAZEL D, ERILL I, CAMBRAY G, SANCHEZ-ALBEROLA N, CAMPOY S, GUERIN E, DA RE S,

GONZALES-ZORN B, PLOY M, BARBE J, 2011. Prevalence of SOS-mediated control of integron integrase

expression as an adaptive trait of chromosomal and mobile integrons. Mobile DNA 2, 6-10.

MAZODIER P, PETTER R, THOMPSON C, 1989. Intergeneric conjugation between Escherichia

coli and Streptomyces species. J. Bacteriol. 171, 3583-3585.

MOORE RA, DESHAZER D, RECKSEIDLER S, WEISSMANN A, WOODS DE, 1999. Efflux-mediated

aminoglycoside and macrolide resistance in Burkholderia pseusomallei. Antimicrob. Agents Chemother. 43, 465-

470.

MUÑOZ BELLIDO JL, YAGÜEGUIRAO G, GUITÉRREZ ZUFIAURRE N, MANZANARES AA, 2002. Efflux-

mediated antibiotic resistance in Gram-positive bacteria. Rev. Med. Microbiol. 13, 1-13.

NAITO T, KUSANO K, KOBAYASHI I, 1995. Selfish behavior of restriction-modification systems. Science 267,

897-899.

NAKAYA R, NAKAMURA A, MURATA Y, 1960. Resistance transfer agents in Shigella. Biochem. Biophys. Res.

Commun. 3, 654-659.

88

NESMELOVA IV, HACKETT PB, 2010. DDE Transposases: structural similarity and diversity. Adv. Drug. Deliv.

Rev. 62, 1187-1195.

NORDSTRÖM K, AUSTIN SJ, 1989. Mechanisms that contribute to the stable segregation of plasmids. Annu.

Rev. Genet. 23, 37-69.

PARTRIDGE SR, TSAFNAT G, COIERA E, IREDELL JR, 2009. Gene cassettes and cassette arrays in mobile

resistance integrons. FEMS Microbiol. Rev. 33, 757-784.

PERRETEN V, BOERLIN P, 2003. A new sulfonamide resistance gene (sul3) in Escherichia coli is widespread in

the pig population of Switzerland. Anitimicrob. Agents Chemother. 47, 1169-1172.

PIDDOCK LJ, 2006. Multidrug-resistance efflux pumps not just for resistance. Nat. Rev. Microbiol. 4, 629-636.

PLASTERK RH, 1995. Mechanisms of DNA transposition. In: Sherratt D J, editor. Mobile genetic elements. New

York, N.Y: Oxford University Press, 18–32.

POEHLSGAARD J, DOUGHTWAITE S, 2005. The bacterial ribosome as a target for antibiotics. Nat. Rev.

Microbiol. 3, 870-881.

POOLE K., 2002. Mechanisms of bacterial biocide and antibiotic resistance. J. Applied Microbiol. 92, 55S-64S.

ROBERTS MC, 2005. Update of acquired tetracycline resistance genes. FEMS Microbiol. Lett. 245, 195-203.

RAMOS JL, MARTINEZ-BUENO M, MOLINA-HENARES AJ, TERAN W, WATANABE K, ZHANG X,

GALLEGOS MT, BRENNAN R, TOBES R, 2005. The TetR family of transcriptional repressors. Microbiol. Mol.

Biol. Rev. 69, 326-56.

RASMUSSEN B, NOLLER HF, DAUBRESSE G, OLIVA B, MISULOVIN Z, ROTHSTEIN DM, ELLESTARD

GA, GLUZMAN Y, TALLY FP, CHOPRA I, 1991. Molecular basic of tetracycline action: identification of

analogs whose primary targets is not the bacterial ribosome. Antimicrob. Agents Chemother. 35, 2306-2311.

ROSAS I, SALINAS E, MARTÍNEZ L, CALVA E, CRAVIOTO A, ESLAVA C, AMÁBILE-CUEVAS CF, 2006.

Urban dust fecal pollution in Mexico City: antibiotic resistance and virulence factors of Escherichia coli. Int. J.

Hyg. Environ. Health 209, 461-470.

SAKAIH, KOMANO T, 1996. DNA replication of the IncQ broad-host-range plasmids in gram-negative bacteria.

Biosci. Biotechnol. Biochem. 60, 377-382.

SAMBROOK J, RUSSELL DW, 2001. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory

Press, New York.

SARMAH AK., MEYER MT, BOXALL AB, 2006. A global perspective on the use, sales, exposure pathways,

occurrence, fate and effects of veterinary antibiotics (VAs) in the environment. Chemosphere 65, 725-759.

SCHAEFER Ch, MESSER W, 1991. DnaA protein/DNA interaction. Modulation of the recognition sequence. Mol.

Gen. Genet. 226, 34-40.

SCHLUCKEBIER G, O’GARA M, SAENGER W, CHENG X, 1995. Universal catalytic domain structure of

AdoMet-dependent methyltransferases. J. Mol. Biol. 247, 16-20.

SCHLUTER A, SZCZEPANOWSKI R, PUHLER A, TOP EM, 2007. Genomics of IncP-1 antibiotic resistance

plasmids isolated from wastewater treatment plants provides evidence for a widely accessible drug resistance gene

pool. FEMS Microbiol. Rev. 31, 449-477.

SÉVENO NA, KALLIFADAS D, SMALLA K, VAN ELSAS JD, COLLARD JM, KARAGOUNI AD,

WELLINGTON EMH, 2002. Occurence and reservoirs of antibiotic resistance genes in the environment. Rev.

Med. Microbiol. 13, 15-27.

89

SHAW KJ, RATHER PN, HARE RS, MILLER GH, 1993. Molecular genetics of aminoglycoside resistance genes

and familiar relationships of the aminoglycoside-modifying enzymes. Microbiol. Rev. 57, 138-163.

SHERRATT D, 1989. Tn3 and other related transposable elements: Site-specific recombination and transposition.

In: Berg D E, Howe M M, editors. Mobile DNA. American Society for Microbiology, 163-184.

SLATER FR, BAILEY MJ, TETT AJ, TURNER SL, 2008. Progress towards understanding the fate of plasmids in

bacterial communities. Fems Microbiol. Ecol. 66, 3-13.

SORENSEN SJ, BAILEY M, HANSEN LH, KROER N, WUERTZ S, 2005. Studying plasmid horizontal transfer

in situ: A critical review. Nat. Rev. Microbiol. 3, 700-710.

SZCZEPANOWSKI R, LINKE B, KRAHN I, GARTEMANN KH, GUTZKOV T, EICHLER W, PUHLER A,

SCHLUTER A, 2009. Detection of 140 clinically relevant antibiotic-resistance genes in the plasmid metagenome of

wastewater treatment plant bacteria showing reduced susceptibility to selected antibiotics. Microbiology-Sgm, 155,

2306-2319.

SWEDBERG G, SKÖLD O, 1983. Plazmid-borne sulfonamide resistance determinants studiem by restriction

enzyme analysis. J. Bacteriol. 153, 1228-1237.

VAKULENKO SB, MOBASHERY S, 2003. Versality of aminoglycosides and prospects for their future. Clin.

Microbiol. Rev. 16, 430-450.

VAN HOEK AH, MEVIUS D, GUERRA B, MULLANY P, ROBERTS AP, AARTS HJ, 2011. Acquired antibiotic

resistance genes: an overview. Front. Microbiol. 2, 203.

VETTER N, HAVER E, 2002. Hospital-acquired pneumoniae: a complex killer. Clin. Microbiol. Infect. 8 (Suppl.

1), 38.

WALKER GC, 1984. Mutagenesis and inducible responses to deoxyribonucleic acid damage in Escherichia coli.

Microbiol. Rev. 48, 60-93.

WGNER M, LOY A, 2002. Bacterial community composition and function In sewage treatment systems. Cur. Opin.

Biotechnol. 13, 218-227.

WITTE W, 1999. Antibiotic resistance in Gram-positive bacteria: epidemiological aspects. J. Antimicrob.

Chemother. 44, 1-9.

WOLINOWSKA R, MASNY A, PŁUCIENNICZAK A, 2002. Integrony. Kosmos. 51, 353-364.

YAMAICHI Y, NIKI H, 2000. Active segregation by the bacillus subtilis partitioning system in Escherichia coli.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 14656-14661.

ZHANG XX, ZHANG T, FANG H, 2009. Antibiotic resistance genes in water environment. Appl. Microbiol.

Biotechnol. 82, 397-414.

ZIELENKIEWICZ U, CEGŁOWSKI P, 2002. Mechanizmy stabilnego dziedziczenia plazmidów. Kosmos. Problemy

Nauk Biologicznych 51, 297-304.

Documents

Uniwersytet Warszawski Wydział Biologii - IChF PANichf.edu.pl/DW_01_Olga_Krysiak.pdfUniwersytet Warszawski Wydział Biologii Olga Anna Krysiak Nr albumu: 305967 Analiza struktury