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Aus der Klinik für kleine Haustiere
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Untersuchung von Endostatin freisetzenden Stammzellimplantaten
zur Behandlung des Glioblastoms im Rattenmodell
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)
durch die
Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Kerstin Kleinschmidt
aus Paderborn
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. vet. med. Ingo Nolte
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. vet. med. Ingo Nolte
2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. phil. nat. Stephan Steinlechner
Tag der mündlichen Prüfung: 23. November 2006
Fördernde Institutionen: International Neuroscience Institute
Hannover (INI) GmbH
Internationale Stiftung Neurobionik Hannover
Bundesministerium für Bildung und
Forschung (BMBF)
Meiner großartigen Familie
gewidmet
Abkürzungsverzeichnis
AGM-1470 Fumagillinanalogon CSF Zerebrospinalflüssigkeit
Ak Antikörper DMEM Dulbecco´s Modified Eagle
AP anterior-posterior Medium
zu Bregma DMSO Dimethylsulfoxid
Aqua dest. destilliertes Wasser DNA Desoxyribonucleinacid
Ba Barium DV dorso-ventral zu Bregma
bFGF basic Fibroblast EBNA Human Fetal Kidney Cells
Growth Factor ECB Endostatin CellBeads®
BHS Blut-Hirn-Schranke EGFR Epidermal Growth Factor
BHSC Baby Hamster Receptor
Kidney Cells EIA enzymatischer
Bm Bregma -1 mm mitte/ Immunoassay
Implantationskoordinate EMSC Endostatin sezernierende
mitte mesenchymale
Bo Bregma -1 oben/ Stammzellen
Implantationskoordinate EN Endostatin und
oben Tiernummer
BSA Bovines Serum Albumin eNOS endotheliale
BT4Ca Gliomzelllinie aus BDIX- Stickstoffoxidsynthasen
Ratten ES Embryonale Stammzellen
Bu Bregma -1 mm unten/ EtOH Ethanol
Implantationskoordinate FDA Federal Drug
unten Administration
Ca Kalzium Fm größte Fläche mitte
CB CellBead® Fo größte Fläche oben
CBs CellBeads Fu größte Fläche unten
CO2 Kohlenstoffdioxid G Guluronsäure
ga gauge KDR/Flk-1 Kinase Insert Domaine
GBM Glioblastoma multiforme Receptor/Fetal Liver
GCB Goldpartikel enthaltende Kinase CellBeads® kg Kilogramm
GFAP Glial Fibrillary Acidic KGW Körpergewicht Protein KH2PO4 Kaliumdihydrogen-
GLP Good Laboratory Practise phosphat
GLUTs Glutaminasen LCB leere CellBeads®
GZ Gliomzellen LM latero-medial zu Bregma
HCl Salzsäure M Mannuronsäure
H.E. Hämatoxylin-Eosin- µ Mikro
Färbung m molar
HIF-1 hypoxia-inducable-factor-1 MCP-1 Monocyte Chemoattractant
hMSC humane mesenchymale Protein-1
Stammzellen MEZ Mitteleuropäische Zeit
H2O2 Wasserstoffperoxid Mg Magnesium
hTERT humane Telomerase MHC Major Histocompatibility
Reverse Transkriptase Complex
i.c.v. intrazerebroventrikulär MHH Medizinische Hochschule
i.c. intrakraniell Hannover
IgE Immunglobulin E Min. Minute
IHC Immunhistochemie MRI Magnet Resonance
IL Interleukin Imaging
i. p. intraperitoneal MSC Mesenchymale
JPEG Joint Photographic Expert Stammzellen
Group MtOH Methanol
kD Kilo Dalton
Na2HPO4 Dinatriumhydrogen- TRS Target Retrieval Solution
phosphat U/Min. Umdrehungen pro Minute
NaCl Kochsalz VEGF Vascular Endothelial
O2 Sauerstoff Growth Factor
OT Objektträger Vol Volumen
p Piko vWF von-Willebrand-Faktor
PBS Phosphate Buffered Saline Ztm zentrales Tierlaboratorium
PDGF Platelet-Derived Growth der MHH
Factor ZZ Zellzahl
PFA Paraformaldehyd
PKB Proteinkinase B
PP Polypropylen
r² Pearssonscher
Korrelationskoeffizient
ROI Region of Interest
RT Raumtemperatur
s.c. subkutan
SCB Stammzell CellBeads®
SD Standardabweichung
Sek. Sekunde
SEM Standardfehler
SPIO superparamagnetische
Eisenoxide
SYBR Cyaninfluoreszenzfarbstoff
SZ Stammzellen
TIFF Target Image File Format
TIMP-1 Matrixmetalloproteinase-1
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung.............................................................................................1
2 Literaturübersicht................................................................................3
2.1 Glioblastoma multiforme................................................................................ 3
2.1.1 Einführung .................................................................................................. 3 2.1.2 Histologie.................................................................................................... 5 2.1.3 Pathophysiologische Grundlagen............................................................... 6 2.1.4 Einteilung der Gliome und Diagnostik......................................................... 7 2.1.5 Klinisch-therapeutische Konsequenzen...................................................... 8 2.1.6 Neue Behandlungsansätze ...................................................................... 10 2.1.7 Glioblastome bei Hund und Katze ............................................................ 11
2.2 Experimentelles Glioblastom-Modell .......................................................... 14
2.3 Angiogenese ................................................................................................. 16
2.3.1 Einführung ................................................................................................ 16 2.3.2 Angiogenese im Glioblastoma multiforme ................................................ 17 2.3.3 Therapieansätze zur Hemmung der Angiogenese ................................... 19
2.4 Endostatin ..................................................................................................... 21
2.4.1 Einführung ................................................................................................ 21 2.4.2 Wirkungen ................................................................................................ 23 2.4.3 Therapeutischer Einsatz........................................................................... 27
2.5 Mikrokapseln zur intrazerebralen Gliomtherapie ....................................... 29
2.5.1 Einführung ................................................................................................ 29 2.5.2 Verkapselungsmaterial: Alginat ................................................................ 33 2.5.3 Biokompatibilität ....................................................................................... 35 2.5.4 Therapeutischer Einsatz........................................................................... 37
2.6 Ziel der vorliegenden Arbeit......................................................................... 39
3 Untersuchungsgut und Methoden...................................................41
3.1 Tiere ............................................................................................................... 41
3.1.1 Herkunft.................................................................................................... 41 3.1.2 Haltung und Fütterung.............................................................................. 41 3.1.3 Narkose und Analgesie ............................................................................ 42
3.2 Implantate: CellBeads®................................................................................. 43
3.2.1 Herkunft.................................................................................................... 43 3.2.2 Verkapselungstechnologie ....................................................................... 45
3.3 Gliomzelllinie BT4Ca..................................................................................... 46
3.3.1 Herkunft.................................................................................................... 46 3.3.2 Syngenität ................................................................................................ 46
3.4 Versuchsplanung: Experimentelle Gruppen .............................................. 47
3.4.1 Etablierung des Models ............................................................................ 47 3.4.1.1 Tumorzellinokulation .......................................................................... 47 3.4.1.2 CellBead® Implantationen .................................................................. 48 3.4.1.3 Zweizeitige Operation ........................................................................ 49
3.4.2 Untersuchung der Wirksamkeit des Endostatins ...................................... 50 3.4.2.1 Gruppe I: Kontrollgruppe Gliom (BT4Ca)........................................... 50 3.4.2.2 Gruppe II: Gliom (BT4Ca) und leere CellBeads® (LCB)..................... 51 3.4.2.3 Gruppe III: Gliom (BT4Ca) und Endostatin CellBeads® (ECB)........... 51 3.4.2.4 Gruppe IV: Gliom (BT4Ca) und Stammzell CellBeads® (SCB) .......... 51
3.5 Versuchsdurchführung ................................................................................ 53
3.5.1 Zellkultur................................................................................................... 53 3.5.1.1 Kultivierung der Gliomzellen .............................................................. 54 3.5.1.2 Kryokonservierung der Gliomzellen ................................................... 55 3.5.1.3 Auftauen der Gliomzellen................................................................... 56 3.5.1.4 Vitalzellzählung .................................................................................. 56
3.5.2 Behandlung der Gliomzellen vor der Implantation.................................... 57 3.5.3 Behandlung der CellBeads® vor der Implantation .................................... 59 3.5.4 Stereotaktische Implantationstechnik ....................................................... 60
3.5.4.1 Stereotaktische Implantation der Gliomzellen .................................... 62 3.5.4.2 Stereotaktische Implantation der CellBeads®..................................... 63
3.6 Neuropathologische Untersuchungen ........................................................ 65
3.6.1 Transkardiale Perfusionsfixierung ............................................................ 66 3.6.2 Nachfixierung ........................................................................................... 67 3.6.3 Kryobehandlung ....................................................................................... 67 3.6.4 Gefrierschnitte .......................................................................................... 68 3.6.5 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.)........................................................... 70 3.6.6 Immunhistochemische Färbungen (IHC) .................................................. 71
3.6.6.1 Von-Willebrand-Faktor (vWF) ............................................................ 73 3.6.6.2 Endostatin .......................................................................................... 73
3.6.7 Mikroskopische Auswertung..................................................................... 74 3.6.7.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.) zur Etablierung des Modells ....... 75 3.6.7.2 Immunhistologischer Nachweis des Endostatins ............................... 75 3.6.7.3 Immunhistologie zur Untersuchung der Tumorvaskularisierung ........ 76 3.6.7.4 H.E.-Färbung zur Untersuchung der Tumorgrößen ........................... 77
3.7 Statistische Auswertung .............................................................................. 79
4 Ergebnisse .........................................................................................81
4.1 Entwicklung des Versuchsmodells ............................................................. 81
4.1.1 Zellkultur................................................................................................... 81 4.1.1.1 Kultivierung ........................................................................................ 81 4.1.1.2 Vitalzellzahl ........................................................................................ 81
4.1.2 Experimentelles Glioblastom .................................................................... 82 4.1.2.1 Bildtafel 1 ........................................................................................... 85
4.1.3 Koordinaten zur intrazerebroventrikulären Implantation der CellBeads® .. 86 4.1.4 Koordinaten für die BT4Ca-Inokulation und zweizeitige Operation .......... 88
4.1.4.1 Bildtafel 2 ........................................................................................... 90
4.2 Untersuchung der Wirksamkeit ................................................................... 91
4.2.1 Histologischer Nachweis der Implantate................................................... 91 4.2.2 Nachweis der Endostatinfreisetzung aus den CellBeads®........................ 91
4.2.2.1 Bildtafel 3 ........................................................................................... 93 4.2.3 Untersuchung der Tumorvaskularisierung................................................ 94
4.2.3.1 Bildtafel 4 ........................................................................................... 99 4.2.4 Untersuchung der Tumorvolumina ......................................................... 104
4.2.4.1 Bildtafel 5 ......................................................................................... 105 4.2.5 Korrelation zwischen Tumorvolumen und Blutgefäßdichte..................... 107
5 Diskussion .......................................................................................109
5.1 Diskussion der Methodik............................................................................ 109
5.1.1 Tierexperimentelles Modell..................................................................... 109 5.1.1.1 Gliomzelllinie BT4Ca........................................................................ 109 5.1.1.2 Histologie des Tumors ..................................................................... 110 5.1.1.3 Intrazerebroventrikuläre Implantation der CellBeads® ..................... 111 5.1.1.4 Biokompatibilität der implantierten CellBeads® ................................ 112
5.1.2 Untersuchungsmethoden ....................................................................... 113 5.1.2.1 Immunhistologische Untersuchung der Endostatinfreisetzung ........ 113 5.1.2.2 Wirksamkeitsuntersuchung der Endostatin CellBeads®................... 114
5.2 Diskussion der Ergebnisse der Wirksamkeitsuntersuchung.................. 118
5.2.1 Endostatinfreisetzung aus den CellBeads® ............................................ 118 5.2.2 Wirksamkeit der Endostatin sezernierenden CellBeads® ....................... 119
5.2.2.1 Immunhistologisch dargestellte Blutgefäßdichte .............................. 120 5.2.2.2 Tumorvolumina und Korrelation mit der Blutgefäßdichte ................. 123
5.3 Aussicht und Schlussbetrachtung ............................................................ 127
6 Zusammenfassung..........................................................................130
7 Summary ..........................................................................................132
8 Literaturverzeichnis ........................................................................134
9 Anhang.............................................................................................164
9.1 Bezugsquellen............................................................................................. 164
9.1.1 Versuchstiere ......................................................................................... 164 9.1.2 Allgemeiner Bedarf und OP-Bedarf ........................................................ 164 9.1.3 Verbrauchsmaterialien Zellkultur ............................................................ 166 9.1.4 Verbrauchsmaterialien Histologie und Immunhistologie ......................... 167 9.1.5 Geräte und Software .............................................................................. 169
9.2 Reagenzien .................................................................................................. 172
9.2.1 Färbungen .............................................................................................. 172 9.2.2 Perfusionsfixierung................................................................................. 172 9.2.3 Zellkultur................................................................................................. 173
9.3 Färbeprotokolle ........................................................................................... 174
9.3.1 Färbeprotokoll Hämatoxylin-Eosin-Färbung ........................................... 174 9.3.2 Färbeprotokoll Immunhistologie ............................................................. 175
9.4 Protokolle der Versuchsdurchführung ..................................................... 176
9.5 Statistik ........................................................................................................ 180
9.5.1 Vaskularisierungsdichte.......................................................................... 180 9.5.2 Tumorgrößen.......................................................................................... 191 9.5.3 Korrelationen zwischen Vaskularisierung und Tumorvolumina .............. 193
9.6 Danksagung ................................................................................................ 195
1 Einleitung 1
1 Einleitung
Tumorerkrankungen stellen nach den Herz-Kreislauferkrankungen die zweithäufigste
Todesursache dar. Etwa 27% der Bevölkerung sterben infolge neoplastischer
Entartungen. 1-2% der beim Menschen auftretenden Tumoren sind Neoplasien des
Zentralnervensystems und zirka 15 bis 30% davon sind Glioblastome. Das
Glioblastoma multiforme ist ein auf die proliferative Entartung von Gliazellen
zurückzuführender Gehirntumor. Es nimmt innerhalb weniger Wochen enorme
Ausmaße an und führt über die mit seinem das gesunde Gehirngewebe
verdrängenden Wachstum einhergehenden neurologischen Symptome zum Tod.
Nach Diagnosestellung liegt die mittlere Überlebenszeit bei 12 bis 15 Monaten. Da
das Glioblastom infiltrierend wächst, ist eine chirurgische Resektion des kompletten
Tumorgewebes in der Regel nicht möglich und es kommt fast immer zur Ausbildung
eines Rezidivs. Sowohl Zytostatikagaben und Immuntherapien als auch
strahlentherapeutische Interventionen führen bestenfalls zu einer Verlangsamung
des Glioblastomwachstums, so dass die Prognose trotz der Anwendung aller klinisch
genutzten kurativen Behandlungsoptionen als infaust zu beurteilen ist.
Die Proliferation der Gliomzellen geht mit einer tumorinduzierten kapillaren
Blutgefäßneubildung einher. Das Größenwachstum des Glioblastoma multiforme ist
dabei auf Grund des gesteigerten Sauerstoff- und Nährstoffumsatzes von der
Neoangiogenese abhängig (FOLKMAN 1990). Endostatin ist ein 22kD großes
endogenes Protein, das über noch nicht restlos geklärte Mechanismen selektiv
gegen die neovaskuläre Endothelzellproliferation wirkt (OU-YANG et al. 2006). Seine
antiangiogene Potenz und sein selektiver und somit im Vergleich zu anderen
Tumortherapien nahezu nebenwirkungsfreier Effekt machen Endostatin zu einem
geeigneten Glioblastomtherapeutikum. Da Endostatin eine kurze Halbwertszeit von
unter 12 Stunden hat und zudem die Blut-Hirn-Schranke den Zielort gegen das
Kreislaufsystem abschirmt, ist eine systemische Applikation des Wirkstoffs nicht
geeignet, um ausreichend hohe Dosen innerhalb des Gehirns zu erzielen
(BJERKVIG et al. 2003).
2 1 Einleitung
Humane mesenchymale Stammzellen sind mittels eines einfachen Eingriffs aus dem
Knochenmark zu gewinnen und lassen sich gentechnisch so modifizieren, dass sie
dauerhaft Endostatin sezernieren. Die Verkapselung solcher Wirkstoff
produzierender Zellen mit einer für Nährstoffe, Sauerstoff und Endostatin
durchlässigen, aber gegen die Bestandteile des Empfängerimmunsystems
abschirmenden Alginatmatrix ermöglicht die intrazerebrale Applikation (MARKUSEN
et al. 2006). Diese „Bioreaktoren“ ermöglichen die anhaltende Produktion von
Endostatin direkt am Zielort. Die verkapselten Stammzellen weisen dabei trotz
erhaltener Vitalität und Sekretionsleistung eine stark eingeschränkte
Proliferationsrate mit 1 bis 2 Zellteilungen nach der Verkapselung auf. Von READ et
al. (2001) und in einer vorausgegangenen Dissertationsarbeit (BARTSCH 2005)
konnte gezeigt werden, dass die zirka 600 µm großen Mikrokapseln nach
tierexperimenteller intrazerebraler Implantation von xenogenen Zellen gut
biokompatibel waren und keine Abstoßungsreaktionen der Empfängertiere
aufwiesen. In dieser Arbeit sollte die Endostatinfreisetzung nach
intrazerebroventrikulärer Implantation solcher vitale, sekretionsaktive Stammzellen
enthaltender Alginatkapseln im Rattenmodell gezeigt werden. Zudem sollte die
Wirksamkeit der als CellBeads® bezeichneten, von der Firma CellMed AG (Alzenau,
Deutschland) hergestellten Mikrokapseln auf ein experimentelles Glioblastom
untersucht werden. Dabei sollten als Voraussetzung für die klinische Anwendung
unter den Bedingungen der Good Laboratory Practice (GLP) die Auswirkungen auf
die intratumorale Vaskularisierungsdichte und das Tumorwachstum quantifiziert
werden.
2 Literaturübersicht 3
2 Literaturübersicht
2.1 Glioblastoma multiforme
2.1.1 Einführung
Das Glioblastoma multiforme (GBM) ist einer der am häufigsten vorkommenden und
gleichzeitig am aggressivsten wachsenden Tumoren des Gehirns. Es nimmt seinen
Ursprung in den Gliazellen. Die derzeitige Klassifizierung durch die World Health
Organisation (WHO) führt das GBM als ein Grad IV Gliom auf (KLEIHUES et al.
2002). Nach der WHO-Klassifikation werden die Hirntumoren unterteilt nach ihren
jeweiligen Ursprungszellen und die Gliome somit in Astrozytome, Oligodendrogliome
und Mischtumoren eingeteilt. Darüber hinaus wird der histologische Malignitätsgrad
zur Klassifizierung herangezogen, wobei „low-grade“- (Malignitätsgrad I und II) von
„high-grade“-Tumoren (Malignitätsgrad III und IV) unterschieden werden (WIESTLER
u. SCHMIDT 1998).
Tabelle 1 Einteilung der high-grade Tumoren nach WHO
Malignitätsgrad Gliatumoren WHO-Klassifikation
III IV
Anaplastisches Astrozytom + Astrozytäre
Tumoren Glioblastoma multiforme +
Oligodendrogliome Anaplastisches Oligodendrogliom +
Mischgliome Anaplastisches Oligoastrozytom + Nach der Einteilung der Tumorarten von KERNOHAN u. SAYRE (1952) werden
Astrozytome, Ependymome und Oligodendrogliome in einer 4-Punkte-Skala
entsprechend ihrer Malignität klassifiziert (NATAF et al. 2005).
4 2 Literaturübersicht Dabei stellen Astrozytome vom Grad 3 und 4, auch als Glioblastoma multiforme
bezeichnet, etwa 50% aller Gliome dar. Etwa 1-2% aller beim Menschen
vorkommenden Neoplasien sind Tumoren des Zentralnervensystems (ZNS).
Die neuroektodermalen Tumoren, insbesondere die Glioblastome, bilden hierbei
noch vor den Angiomen und den Meningiomen die größte Gruppe mit einem Anteil
von 15-30% aller Tumoren im Gehirn.
Glioblastome zeichnen sich durch ihr schnelles Wachstum aus. Sie infiltrieren diffus
in benachbarte Strukturen, so dass eine komplette chirurgische Resektion in der
Regel nicht gelingen kann, sondern Resttumorgewebe im Gehirn verbleibt (DHAYAT
u. GUGGEMOS 1999/2000). Häufig nehmen sie enorme Ausmaße an, bevor
Symptome auftreten. Zu den ersten klinischen Symptomen gehören starke, meist
nicht medikamentös zu beeinflussende Kopfschmerzen, Sehstörungen, epileptische
Anfälle, Lähmungserscheinungen, Sprachstörungen, Bewusstseinseintrübung,
Beeinträchtigungen des Erinnerungsvermögens und der Sensorik sowie
Persönlichkeitsveränderungen (BRUCE et al. 2005).
Hochmaligne Gliome und diffus intrinsische Ponsgliome haben eine infauste
Prognose (JOHANNESEN et al. 2002). Die mittlere Überlebenszeit nach der
Diagnosestellung beträgt trotz intensiver chirurgischer, radio- und
chemotherapeutischer Interventionen derzeit selten mehr als 12 bis 15 Monate und
nur 8-12% der Betroffenen überleben bis zu zwei Jahren oder länger (KIOI et al.
2006).
Die Inzidenz der Glioblastome liegt bei etwa 1 bis 3 Krankheitsfällen pro 100.000
Einwohner, dies entspricht etwa 4000 bis 5000 Neuerkrankungen pro Jahr in
Deutschland. 60% der primären Glioblastome treten bei Erwachsenen älter als 50
Jahre auf (BRUCE et al. 2005). In einer klinischen Studie von 1976 lag der Anteil der
betroffenen Kinder bei 8,8% (DOHRMANN et al.1976).
2 Literaturübersicht 5
2.1.2 Histologie
Die Histogenese der Glioblastome nimmt ihren Ursprung in den Gliazellen. Die
Gesamtheit der Gliazelle mit ihren das Stützgewebe bildenden Ausläufern wird als
Glion bezeichnet. Zu den Gliazellen zählen verschiedene Zelltypen mit
verschiedenen physiologischen Aufgaben im Zentralnervensystem. Astrozyten
übernehmen Stütz- und Versorgungsfunktionen, die Mikroglia ist Bestandteil des
Abwehrsystems, Zellen der Oligodendroglia bilden die Markscheiden im zentralen
Nervensystem und Schwannsche Zellen umscheiden die peripheren Nervenfasern.
Astrozyten sind neben den Endothelzellen die Zellen des Zentralnervensystems, die
unter physiologischen Umständen zur Proliferation befähigt sind. Der Zellumsatz liegt
dann bei weniger als 1%. Neuere Arbeiten weisen daraufhin, dass auch andere nicht
neoplastisch entartete Zelltypen des ZNS, insbesondere Neurone zur Neogenese in
der Lage sind (YAMASHITA et al. 2006, WRIGHT et al. 2006). Kommt es zu einer
Störung der regulären Proliferations- und Apoptosemechanismen, kann es zur
tumorösen Entartung von Astrozyten oder Zellen der Oligodendroglia kommen, die
dann Grundlage für ein Astrozytom, Oligodendrogliom oder einen Mischtumor als
Endstadium dieser Veränderung darstellen. Der Anteil der proliferierenden und damit
die Wachstumsrate des Tumors bestimmenden Gliomzellen beträgt etwa 15 bis 30%.
Trotz einer hohen Zellverlustrate von 10 bis 80% verdoppelt sich das Tumorvolumen
alle 40 bis 50 Tage (HOSHINO 1984). Das Glioblastoma multiforme stellt sich
makroskopisch vielfältig mit Nekrosebezirken, stark vaskularisierten Bereichen und
mit teilweise großen durch Einblutungen hervorgerufenen Kavernen dar. Typisch ist
die glasige, weiche, teilweise zerfließende Textur. Am häufigsten zeigen sich
zerebello-medullär gelegene Gliome im frontotemporalen Bereich, die sich bei
Diagnosestellung oft schon über den die Gehirnhälften verbindenden Balken hinaus
bis in die andere Hemisphäre ausgedehnt haben (Schmetterlingsgliom).Histologisch
stellt sich das Glioblastom im entdifferenzierten Zustand mit einem weitgehend
pleomorphen Zellbild dar, welches durch zahlreiche Mitosen, aber auch funktionale
Zellen gekennzeichnet ist.
6 2 Literaturübersicht Zudem zeigen sich perifokal ödematisierte Strukturen und nekrotische Bereiche
werden von solchen mit deutlich erhöhter Zelldichte - so genannten Pseudopalisaden
- umgeben.
Dazu kommen Gefäßneubildungen, die durch ihre vermehrte Anzahl, abnorme
Größe und auftretende glomeruläre Strukturen gekennzeichnet sind (WAGGENER et
al. 1976). Die Blutgefäße innerhalb eines Glioblastoms weisen eine endotheliale
Hyperplasie von bis zu zehn Endothelzellen in einem Gefäßquerschnitt auf, sind
gewunden und zum Teil fenestriert (BREM et al. 1972).
2.1.3 Pathophysiologische Grundlagen
Wie GREENE u. HARVEY 1964 bereits zeigten, kommt es in der Regel nicht zur
Entstehung tumorferner Metastasen, da abgeschwemmte Gliomzellen nicht an den
Gefäßendothelien haften, in andere Gewebe einwandern und auch nicht
proliferationsfähig anwachsen können.
Die Vaskularisierungsdichte und Morphologie der Tumorblutgefäße sind
Malignitätskriterien zur Abgrenzung zwischen Gliomen der Grade III und IV nach
WHO und stellen außerdem ein entscheidendes prognostisches Kriterium dar (LEON
et al. 1996). So dient die Blut-Hirn-Schranke (BHS), die sich aus Kapillarendothel,
Basalmembran und Oberflächenmembranen der Astrozytenausläufer
zusammensetzt, in physiologischer Weise als Stoffwechselbarriere, die passiv nur
von niedermolekularen lipophilen Substanzen passiert werden kann. Bei
pathologischen Veränderungen wie Fieber, durch Bakterientoxine, aber auch durch
den Einfluss von Neoplasien kann es zu einer erhöhten Permeabilität und in Folge
dessen zur Ödembildung kommen. Die korrelierend mit dem Glioblastoma multiforme
neugebildeten Blutgefäße weisen Strukturveränderungen auf, die mit einer Störung
der BHS einhergehen.
2 Literaturübersicht 7 Sie weisen eine geringere Dichte ihres Zellverbandes mit aufgelockerten Tight
Junctions und einer veränderten Transporterproteinexpression auf, die wiederum auf
die Wirkung des vermehrt freigesetzten "Vascular Endothelial Growth Factor" (VEGF)
zurückgeführt wird (ESSER et al. 1998). Aus der vermehrten Durchlässigkeit der
Gefäße, der damit einhergehenden Ödematisierung und dem gleichzeitig innerhalb
des knöchernen Schädels zunehmenden Tumorvolumen resultiert eine Steigerung
des Gehirndrucks. Die damit einhergehende Kopfschmerzsymptomatik wird vom
Patienten meist zuerst wahrgenommenen.
2.1.4 Einteilung der Gliome und Diagnostik
Die Definition hochgradiger Gliome basiert auf histologischen Kriterien. Klinisch
erfolgt diese Klassifizierung anhand von Probebiopsien oder reseziertem
Tumorgewebe. Neben der astrozytären oder oligodendrogliären Differenzierung der
Tumorzellen werden vor allem die Merkmale der Malignität beurteilt: zelluläre
Anaplasie, mitotische und apoptotische Figuren, hohe Zelldichte,
Blutgefäßneubildung und -struktur sowie Anzahl und Ausdehnung von intratumoralen
Nekrosen (KLEIHUES u. SOBIN 2000). Die Zellen des Glioblastoma multiforme
stellen sich als anaplastische, wenig differenzierte, runde oder pleomorphe Zellen mit
teilweise mehreren meist atypischen Zellkernen dar (REARDON u. WEN 2006).
Klinisch werden Gliome in erster Linie radiomorphologisch mittels
Computertomographie (CT) und Magnetresonaztomographie (MRT) klassifiziert, da
gerade bei Hirnstammgliomen die Morbidität in Folge von Resektionen hoch und
außerdem die prognostische Relevanz der Histomorphologie gering ist. Hierbei
werden typische diffuse intrinsische Ponsgliome, typische Mittelhirngliome, dorsal
exophytische zerebello-medulläre Gliome und untypische Hirnstammgliome
unterschieden.
8 2 Literaturübersicht Zur Planung des therapeutischen Vorgehens und der Beurteilung der prognostischen
Aussichten nach einer operativen Tumorentfernung oder -reduktion werden vor allem
die Ausdehnung und Lokalisation der Neoplasien in CT und MRT dargestellt und
bewertet.
Neue molekularbiologische und immunhistologische Möglichkeiten der Diagnostik
erlauben die Darstellung von durch die Tumorzellen exprimierten Proteinen, die nicht
nur als Proliferations-, sondern auch als Identifikationsmerkmale nutzbar sind
(FACOETTI et al. 2006).
2.1.5 Klinisch-therapeutische Konsequenzen
Derzeit beschränkt sich die Therapie auf ein massives palliatives Vorgehen mit einer
chirurgischen Tumorresektion, der eine Strahlen- und/ oder Chemotherapie folgen.
Die komplette Resektion des Tumors ist auf Grund seines diffus-infiltrativen
Wachstums in der Regel ausgeschlossen, so dass der Operationserfolg auf die
Tumorreduktion beschränkt bleibt (BELLO et al. 2002). KIRSCH et al. (2000a)
beschrieben, dass das Glioblastom Metastasen hemmende Proteine sezerniert und
es durch die operative Reduktion des Primärtumors auf Grund des Wegfalls dieser
Proliferation hemmenden Wirkung zu einer Erhöhung der Rezidivrate kommen kann.
MAUFFREY (2006) zeigte aber, dass die radikale Operation direkt im Anschluss an
die Diagnosestellung die einzig wirksame Therapie ist. Sie führt eindeutig zu einer
Lebenszeitverlängerung bei im Gegensatz zur systemischen Chemo-
therapeutikagabe weitgehend erhaltener Lebensqualität. Dennoch birgt der Eingriff
Risiken wie körperliche und geistige Einbußen mit einer bei der Resektion von
Stammhirngliomen hohen Mortalität und auf Grund der sehr hohen Rezidivrate einer
mittleren Überlebenszeit von nur 12 bis 15 Monaten (BARKER et al. 1998, RAINOV
et al. 2006)
2 Literaturübersicht 9 STEWART ermittelte 2002 im Rahmen eines Reviews über die generelle
systemische Verabreichung von Chemotherapeutika bei Glioblastoma multiforme
Patienten eine Verlängerung der mittleren Überlebenszeit von 2 Monaten. BOIARDI
et al. (1999) stellten anhand einer klinischen Studie fest, dass die Überlebenszeit bei
lokal behandelten Glioblastompatienten mit 21 Monaten im Vergleich zu 15 Monaten
bei ausschließlich systemisch mittels Chemotherapeutika (Cisplatinum) behandelten
Patienten verlängert war. ANDERSEN et al. (2006) beschrieben zudem, dass auch
eine radiotherapeutische Behandlung lediglich mit einer Verlangsamung des
Krankheitsprozesses verbunden war, das Tumorvolumen aber stetig weiter zunahm.
Trotz zahlreicher Therapieansätze hat es nach DEORAH et al. (2006) seit den
achtziger Jahren durch die Anwendung der bis heute klinisch eingesetzten
Behandlungsmethoden keine signifikante Steigerung in den Überlebensraten bei
Glioblastompatienten gegeben.
Auf Grund dessen befassen sich aktuelle Untersuchungen mit dem Einsatz neuer
Therapien wie zum Beispiel der Immuntherapie, Radioimmuntherapie oder der
Beeinflussung der Neovaskularisierung (Antiangiogenese), insbesondere unter dem
Gesichtspunkt der Entwicklung lokaler Applikationsmöglichkeiten.
10 2 Literaturübersicht
2.1.6 Neue Behandlungsansätze
Einen neuen therapeutischen Ansatz zeigen Methoden aus dem Bereich der
Nanotechnologie und der Mikroverkapselung auf. Hier sind viele verschiedene
Möglichkeiten der Bekämpfung von Gehirntumoren in der Entwicklung, zu denen
sowohl lokale Immuno- und Radiotherapie, der Einsatz von Neuronen generierenden
Zellen als auch der von „Medikamentenpumpen“ gehört. Vorteil all dieser
Behandlungsansätze ist, dass sie direkt am Zielort in hohen Dosen wirken (DUNN u.
BLACK 2003). Dabei kommen minimal invasiv implantierbare Mikrokapseln und so
genannte „Bioreaktoren“ zum Einsatz. Diese enthalten verkapselte Wirkstoffe oder
Wirkstoff sezernierende Zellen und lassen so eine genaue und sichere Applikation
von therapeutischen Substanzen selbst an schwer zugänglichen Orten wie dem
operativ kaum erreichbaren Hirnstammgliom zu. BRANNON-PEPPAS u.
BLANCHETTE (2004) beschrieben mehrere Studien aus den vergangenen fünf
Jahren, die aufzeigten, dass diese als Medikamententransporter genutzten
Implantate die Applikation eines breiten Wirkstoffspektrums ermöglichten, das von
Chemotherapeutika über Angiogenesehemmer bis hin zu Radio- und
Immuntherapeutika reichte.
Die hohe Vaskularisierungsdichte des Tumors ist ein therapeutisch genutzter
Angriffspunkt. Ziel ist, die Versorgung des Tumors mit Nährstoffen und Sauerstoff zu
unterbinden, indem man antiangiogenetisch auf ihn einwirkt.
Die Folgen sind sowohl eine Tumorreduktion als auch eine langfristige
Wachstumshemmung (SON et al. 2006). Gerade im letzten Jahrzehnt wurden viele
antiangiogenetisch wirkende Proteine und ihre Wirkung auf das Wachstum von
Neoplasien untersucht. Im experimentellen Einsatz und teilweise auch bereits in der
klinischen Erprobungsphase sind Endothelzellen supprimierende Proteine wie zum
Beispiel Angiostatin, Endostatin, Avicine, Interleukin-12, Flavopiridol und Interferon
alpha. Ziel ist die minimal invasive Applikation direkt in den Tumor, um sowohl die
Blut-Hirn-Schranke zu umgehen als auch den Verlust durch Metabolisierung zu
minimieren (BRANNON-PEPPAS u. BLANCHETTE 2004).
2 Literaturübersicht 11 Bei der Anwendung des Gamma-Knifes, das auch als „Strahlenskalpell“ bezeichnet
wird und im Jahre 1968 von LEKSEL erstmalig eingesetzt wurde, werden mittels γ-
Strahlung sowohl die Tumorzellen selbst als auch die Endothelzellen der sie
versorgenden Gefäße dauerhaft geschädigt. Die Nebenwirkungen sind auf Grund der
bei einer Abweichung von nur 0,3 mm sehr hohen Präzision, mit der man auf die
neoplastischen Gewebe einwirken kann, gering. HSIEH et al. (2005) zeigten in einer
Retrospektivstudie über 5 Jahre eine allgemeine verlängerte mittlere Überlebenszeit
von 16,7 Monaten bei mittels Gamma-Knife strahlentherapierten Patienten, die
neben der direkten Tumorzellschädigung ebenfalls auf die Zerstörung
proliferierender Blutgefäße und die Unterversorgung der Gliomzellen zurückgeführt
wird.
2.1.7 Glioblastome bei Hund und Katze
Tumoren des zentralen Nervensystems sind beim Hund nicht so selten, wie lange
Zeit angenommen, bei der Katze treten sie häufig auf. Wie beim Menschen sind die
Folgen für das betroffene Tier unabhängig vom Malignitätsgrad der Neoplasie auf
Grund der Verdrängung funktionellen Gehirngewebes drastisch (NOLTE u. NOLTE
2001). Nach HEIDNER et al. (1991) liegen die mittleren Überlebenszeiten nach der
Diagnosestellung ohne Behandlung oder nur mit symptomatischer Therapie bei einer
Woche, nach der Tumorresektion bei 3 Wochen. Intrakranielle Neoplasien treten
beim Hund häufiger auf als beim Menschen (LIPSITZ et al. 2003). So sind es beim
Hund im Jahr 14,5 Fälle pro 100.000 im Vergleich zu 4-5 Fällen beim Menschen
(STOICA et al. 2004). Das GBM ist weltweit bei Hunden sehr selten und tritt bei
Katzen etwas häufiger auf. Besonders häufig sind brachycephale Rassen betroffen
mit einer Rassedisposition für Boston Terrier, Englische Bulldoggen und
insbesondere Boxer. Die Inzidenz ist bei über 6 Jahre alten Hunden erhöht. Einen
geschlechtsspezifischen Einfluss gibt es nicht (OBERMAIER et al. 1995, STOICA et
al. 2004).
12 2 Literaturübersicht Die caninen glialen Tumoren sind den humanen sowohl morphologisch als auch
immunhistologisch sehr ähnlich und ebenfalls hauptsächlich in den
Gehirnhemispheren, dem Thalamus, dem Hypothalamus und dem Stammhirn
lokalisiert (STOICA et al. 2004). Sie zeigen ebenfalls eine erhöhte Zelldichte und
Vaskularisierung, Pleomorphismus, Zellkernpolygonie, mitotische Aktivität und die
Bildung von Nekrosen umgebenden Pseudopalisaden (LIPSITZ et al. 2003). Die
Vergleichbarkeit von Gliomen im Hund und im Menschen macht die klinischen
Erfahrungen und Retrospektiverkenntnisse aus der Veterinärmedizin zum einen
wichtig für die Humanmedizin, zum anderen ermöglicht diese die Anwendung von für
den Menschen entwickelten Medikamenten auch beim Hund (SNYDER et al. 2006).
Auch die mit schnell wachsenden Gehirntumoren einhergehenden Symptome bei
Hund und Katze ähneln denen des Menschen. So beschrieben LIPSITZ et al. (2003)
bei fünf Hunden mit GBM Ataxien bis hin zur Tetraparese, Kopfschiefhaltung,
Nystagmus und Benommenheit. Vier der fünf Tiere zeigten zudem einen Drang nach
rechts, der sich in im Kreisgehen und einer Kopf-rechts-Haltung äußerte. Ähnliche
Symptome beschrieben STOICA et al. 2004 und HIGGINS et al. 2001 für
Astrozytome und granuläre ZNS Tumoren bei Hunden. DICKINSON et al. (2000)
erhoben diese neurologischen Befunde ergänzt durch eine reduzierte optische
Antwort auf eine Drohreaktion bei zwei Katzen mit Oligodendrogliomen.
Grundsätzlich sind die therapeutischen Probleme bei der Behandlung glialer
Tumoren der Haustiere die gleichen wie in der Humanmedizin. Auch in der
Veterinärmedizin gibt es Ansätze zur chemotherapeutischen Behandlung von
Gliomen, wobei die meisten Berichte über Lomustin vorliegen. Die Resultate waren
jedoch nicht zufrieden stellend und es waren keine Verlängerungen der
Überlebenszeiten zu ermitteln (DOBSEN et al. 2003).
Die Diagnosestellung erfolgt beim Kleintier wie beim Menschen anhand der
Darstellung mittels Computertomographie (CT) oder Magnetic Resonance Imaging
(MRI). Eine Differenzierung der verschiedenen Gehirntumoren ist aber so aufgrund
der allegorischen Ähnlichkeit vieler Gehirntumoren in der Regel nicht möglich
(KRAFT et al. 1997, FUCHS et al. 2003).
2 Literaturübersicht 13 Die prognostische und damit therapieentscheidende Bedeutung des
Malignitätsgrades ist aber gerade bei intrakraniellen Neoplasien wie dem GBM aus
klinischer Sicht immens. Eine diagnostische Option stellt die Färbung und
lichtmikroskopische Darstellung von Zellausstrichen nach stereotaktisch platzierter
Nadelbiopsie dar (FERNANDEZ et al. 1997). So stellten VERNAU et al. (2001) dar,
dass sich das canine Glioblastom anhand seiner glomerulären Blutgefäßformation
sowie anhand einer vermehrten Karyomegalie gut von den besser differenzierten
Astrozytomen unterscheiden lässt. STOICA et al. (2004) entwickelten zudem
immunhistochemische Untersuchungsmethoden zur Spezifizierung von
Tumorbiopsien. So konnten sie in 84% der untersuchten Tiere positive
Immunreaktionen des sauren Gliafaserproteins (GFAP, Glial fibrillary acidic protein)
nachweisen. Außerdem konnten sie zeigen, dass sowohl das Tumorsupressorgen
p53 als auch der Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) reduziert waren.
NOLTE et al. konnten 2005 eine verbesserte MRI Darstellung intrakranieller
Tumoren und ihrer Demarkation durch die Anwendung von superparamagnetischen
Eisenoxiden (SPIO) als Kontrastmedien belegen.
Die singuläre Strahlentherapie von Gliomen bei Haustieren führt zu vergleichbaren
Erfolgen wie die Tumorresektion. BREARLY et al. fanden 1999 in einer Studie
mittlere Überlebenszeiten von 40 Wochen nach alleiniger Strahlentherapie und von
44 Wochen nach einer Kombination von Tumorresektion und Bestrahlung heraus.
Eine andere Studie (HEIDNER et al. 1991) ergab nur mittlere Überlebenszeiten von
20 Wochen nach strahlentherapeutischer Intervention. Im Vergleich zu den
Therapieerfolgen beim Menschen sind die Verlängerungen der Überlebenszeit nach
Behandlung beim Hund von einer auf bis zu 44 Wochen gravierend. Da aber in die
zum Hund vorliegenden Retrospektivstudien nicht nur das Glioblastoma multiforme,
sondern auch andere gliale Tumoren eingegangen sind, sind diese Daten nur
bedingt vergleichbar.
14 2 Literaturübersicht
2.2 Experimentelles Glioblastom-Modell
Für ein geeignetes Tiermodell zur Induktion eines reproduzierbaren Tumors gibt es
diverse Ansätze. Dabei wurden Gliomzellen, die zuvor in vitro kultiviert worden
waren, als Zellsuspensionen oder auch zusammenhängende in vivo oder in vitro
gezüchtete Tumorgewebe transplantiert. Besonderes Augenmerk liegt auf den
Variablen wie der verwendeten Tierart, der Tumorzelllinie, der Menge der
implantierten Gliomzellen, der Inokulationslokalisation sowie dem
Behandlungsbeginn und der Applikationsmethodik der angewendeten Therapeutika.
IWADATE et al. (2005) injizierten Ratten 105 Gliomzellen der Zelllinie 9L 4 mm
posterior und 3 mm lateral zur Kreuzungsstelle der Sutura interfrontalis und der
Sutura sagittalis (Bregma) nach Bohrlochtrepanation mittels einer Mikroliterspritze mit
einer 25-gauge Nadel direkt in das Parenchym der rechten Hemisphäre und starteten
die folgende Behandlung per Injektion an denselben Koordinaten, nachdem der
Tumor drei Tage gewachsen war.
In einem anderen Modell wurden Mäusen 5 x 104 U87 Gliomzellen nach
Schädeltrepanation intraparenchymal injiziert und acht Tage nach der
Tumorinokulation mit einer intraperitonealen Endostatininjektion begonnen
(SCHMIDT et al. 2004).
Für eine MRI (magnetic resonance imaging) Studie wurden Ratten C6-Gliomzellen
intrakraniell implantiert (BEAUCHESNE et al. 2003). BEUTLER et al. (1999)
verwendeten ebenfalls C6-Gliomzellen, implantierten diese aber subkutan in den
Nacken von Ratten sowie auch von Mäusen, um ein Glioblastommodell zu
entwickeln.
TSENG et al. (2004) implantierten Fischer-Ratten 105 RT-2-Tumorzellen, in 10 µl
Phosphatpuffer (PBS) suspendiert, subkutan in die rechte Flanke und starteten die
Behandlung direkt im Anschluss beziehungsweise nach fünf Tagen, um ein Modell
mit variablen Tumorgrößen zu entwerfen.
2 Literaturübersicht 15
YANG et al. (2005) entwickelten ein reproduzierbares Tumormodell, indem sie die
Zelllinie F98 aus CD-Fischerratten gewannen, nachdem sie diese mit N-ethyl-N-
Nitroseharnstoff behandelt hatten, um die Entartung der Zellen auszulösen. Nach der
in vitro Kultivierung der gewonnenen Zellen wurden jeweils 103, 104 und 105 dieser
zu CD-Fischer-Ratten syngenen Zellen stereotaktisch in den rechten Nucleus
caudatus implantiert. DRUCKREY u. LANDSCHUTZ (1971) generierten auf dieselbe
Weise zu BDIX-Ratten syngene BT4C-Gliomzellen. Die Syngenität dieser Zelllinie
zu BDIX-Ratten wurde durch die Typisierung der MHC-Komplexe überprüft
(BEUTLER et al. 1999).
Die Glioblastomzelllinie BT4C wurde häufig verwendet, um ein reproduzierbares
Glioblastom in Ratten hervorzurufen. Sie wurden zur Entwicklung eines
Gehirntumormodells erfolgreich per Injektionem nach Schädeltrepanation
intraparenchymal beziehungsweise in das Corpus Callosum von weiblichen BDIX-
Ratten implantiert (LEHTIMÄKI et al. 2003, GRIFFIN et al. 2003).
READ et al. (2001a) injizierten mittels einer Mikroliterspritze 8 x 103 BT4C
Gliomzellen intraparenchymal in die rechte Gehirnhemisphäre. Gleichzeitig
implantierten sie an derselben Stelle Endostatin produzierende „Bioreaktoren“, um
deren Wirksamkeit zu untersuchen. In einer anderen Arbeit wurden C6-Gliomzellen
verwendet, die als zusammenhängende Zellsphäroide auf Alginat nach der
Gehirnpräparation direkt auf den Gehirnhemisphären platziert wurden (READ et al.
2001b).
16 2 Literaturübersicht 2.3 Angiogenese
2.3.1 Einführung
Unter Angiogenese wird die von bereits bestehenden Gefäßen ausgehende kapillare
Einsprossung in das umgebende Gewebe als Folge der Proliferation, Differenzierung
und Migration von Endothelzellen verstanden. Diese Vorgänge sind im Körper streng
reguliert und bewegen sich in einer feinen Balance (PEROULIS et al. 2002).
Im gesunden adulten Organismus überwiegen die die Gefäßbildung hemmenden
Botenstoffe gegenüber der Konzentration der Aktivatoren. Bei einem proliferierenden
Glioblastom ist dieses Gleichgewicht zu Gunsten der Angiogeneseförderer
verschoben (O`REILLY et al. 1997). So synthetisieren Glioblastomzellen fünfzigmal
mehr Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) als Zellen eines geringergradigen
Astrozytoms (PLATE et al. 1993). Hinzu kommt, dass der Rezeptor für VEGF,
KDR/Flk-1, der von Endothelzellen in gesundem Gehirngewebe regulär nicht
exprimiert wird, von Tumorzellen in hohem Maße synthetisiert wird (PLATE et al.
1992). Ohne einen auslösenden Reiz haben Endothelzellen eine Teilungsrate von
nur 0,01%, was bedeutet, dass sich eine Endothelzelle bei Durchlaufen eines
normalen Zellzyklus nur ca. alle drei Jahre teilt. Erhöhte Teilungsraten findet man
beispielsweise während der Reproduktionszyklen, der Schwangerschaft, bei
Wundheilungsprozessen, im Zusammenhang mit der Retinopathia diabetica und
beim Wachstum von Tumoren (ENGERMANN et al. 1967; HOBSON u. DENEKAMP
1984).
2 Literaturübersicht 17 2.3.2 Angiogenese im Glioblastoma multiforme
Bis zu einer Größe von 2 mm³ werden die sich teilenden Gliomzellen durch Diffusion
aus der Umgebung und den Liquorfluß ausreichend versorgt. Proliferieren sie
darüber hinaus, ist das Wachstum von da an angiogeneseabhängig. Sobald die
morphologische Tumorbildung einmal begonnen hat, ist jede Zunahme der
Zellpopulation auf die Zubildung von Blutgefäßen angewiesen (FOLKMAN 1990),
wobei dann jede weitere Endothelzelle nach DHANABAI et al. (1999) rechnerisch
das Wachstum von 50 bis 100 Gliomzellen ermöglicht. Diese Abhängigkeit des
Tumorwachstums von der Entstehung neuer Blutgefäße wird auch durch die Abläufe
bei der Bildung von Tumormetastasen verdeutlicht. Häufig können Fernmetastasen
erst Monate oder Jahre nach der Operation des Primärtumors auftreten („tumor
dormancy“). Vermutlich hängt dies damit zusammen, dass zwischen der Entstehung
einer Mikrometastase und der Ausbildung von Kapillaren, die Voraussetzung für
einen klinisch relevanten Tumorprogress ist, eine längere zeitliche Verzögerung liegt
(„angiogenic switch“) (HOSSFELD et al. 2001).
Das Ausmaß der Blutgefäßneubildungen und das Auftreten hypoxischer Bereiche
sind direkt mit der Malignität und vor allem der schlechteren Prognose eines Tumors
assoziiert. Die Untersuchung der Tumorvaskularisation ist eine Möglichkeit zur
Abschätzung des Dysplasiegrades von Tumoren.
Werden Tumorzellen hypoxischem Stress ausgesetzt, so wird Hypoxia-Inducable-
Factor-1 (HIF-1) aktiviert, der die Transkription verschiedener Gene promotet. Es
werden Proteine sezerniert, die sich fördernd auf die Neovaskularisierung auswirken,
darunter Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Glutaminasen (GLUTs) und
glykolytische Enzyme (PLATE et al. 1992). Unter normalen Sauerstoffbedingungen
und in gesundem Gewebe wird HIF-1 durch einen Proteasekomplex unterdrückt und
es finden keine angiogenetischen Prozesse statt (LUO et al. 2006).
18 2 Literaturübersicht
WESSELING et al. (1997) zeigten auf, dass in Glioblastomen ein Circulus vituosus
entsteht. Die Versorgung mit Blutgefäßen ist nicht nur Bedingung für die
Tumorproliferation. Eine erhöhte Vaskularisierungsdichte und die damit
einhergehende Interaktion zwischen Gliomzellen und Endothelzellen sowie die
erhöhte Nährstoffversorgung treiben die Gliomzellproliferation zudem voran. Diese
Gliomzellen wiederum rekrutieren durch die HIF-1 Ausschüttung neue Blutgefäße.
LUSE zeigte bereits 1960 mittels Elektronenmikroskopie, dass sich auch der
endotheliale Aufbau der Gefäßstrukturen im gesunden Gehirngewebe von denen
diverser Gehirntumoren deutlich unterschied. So war sowohl die allgemeine
Gefäßform anders strukturiert, wobei die Astrozytenendfüße durch Gliomzellen
ersetzt waren, als auch eine vermehrte Extrazellularmatrix mit doppelter
Basalmembran zu finden. Nachfolgende Studien zeigten ein verdünntes Endothel
sowie vermehrte Vesikel und Fenestrierungen (HIRANO u. MATSUI 1975). Der
kapillare Aufbau in einem Glioblastom ist in Abbildung 1 schematisch dargestellt.
2 Literaturübersicht 19
E
P
GZ
EZMEZM
AE
BMBA
L L
fE
P
Abbildung 1 Physiologische Struktur von Kapillaren (A) und Kapillaren im Glioblastom (B) modifiziert nach FISCHMANN (2004) Die Astrozytenendfüße (AE) sind im Tumor durch Gliomzellen (GZ) ersetzt. Die
Extrazellulärmatrix (EZM) ist vermehrt und weist eine Trennung der
Basalmembranen (BM) auf. Das Endothel (E) der Tumorgefäße ist schmal und
fenestriert (fE). (L)= Lumen, (P)= Perizyt
2.3.3 Therapieansätze zur Hemmung der Angiogenese
Die Inhibition der Angiogenese bietet einen Ansatz zur Behandlung von Tumoren,
Diabetes bedingter Nephropathie, Arthritis und Psoriasis, wohingegen die Stimulation
der Angiogenese beispielsweise zur Therapie von Erkrankungen der
Herzkranzgefäße, Herzversagen und bei Gewebeverletzungen eingesetzt wird
(PANDYA et al. 2006).
Aus der direkten Beziehung zwischen Prognose des GBM und seiner
Vaskularisierung ergibt sich die Hemmung der Blutgefäßneubildung als
therapeutischer Ansatz zu seiner Behandlung.
20 2 Literaturübersicht Alle Angiogenesehemmer wirken, anders als beispielsweise Chemotherapeutika,
fokussiert auf ihr Ziel, so dass sie aktiv gegen den Tumor, aber nicht toxisch
gegenüber Zellen des gesunden Gewebes sind (FOLKMAN 2006).
Die bislang am besten untersuchten endogenen Angiogenesefaktoren sind
endotheliale Wachstumsfaktoren wie VEGF, "Fibroblast Growth Factor" (FGF),
"Platelet-Derived Growth Factor" (PDGF), Angiogenin, Interleukin-8 (IL-8) und
Proteine aus der Familie der Matrixmetalloproteinasen. Es werden ständig weitere an
der Angiogenese beteiligte Faktoren und ihre Rezeptoren untersucht und damit
einhergehend auch immer mehr antiangiogenetisch wirksame Moleküle. Dazu
gehören vor allem die endogenen Faktoren Angiostatin, Endostatin,
Thrombospondin-1 und -2, und chemische Verbindungen wie das
Fumagillinanalogon AGM-1470 oder Inhibitoren der Matrixmetalloproteinasen wie
TIMP-1 (KUNZ u. HARTMANN 2002).
In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Medikamenten entwickelt, die spezifisch
bestimmte Schritte der Neoangiogenese blockieren sollten. Die
Angiogeneseinhibitoren, die zurzeit klinisch getestet werden, lassen sich in vier
Klassen mit unterschiedlichen Wirkungsmechanismen aufteilen (HOSSFELD et al.
2001):
1) Matrixmetalloprotease-Inhibitoren
2) Inhibitoren für Endothelzellen
3) Inhibitoren der pro-angiogenetischen Faktoren
4) Integrinantagonisten
Derzeit sind 28 endogene Angiogeneseinhibitoren bekannt, wobei Endostatin der
erste ist, der als Fragment der Extrazellulärmatrix identifiziert wurde. Die ersten
Angiogeneseinhibitoren sind von der Food and Drug Administration (FDA) in den
USA und 28 Nationen für die Tumortherapie zugelassen worden (FOLKMAN 2006).
Für Endostatin gibt es noch keine Zulassung in den USA und in Europa. Einen
Überblick gibt die Tabelle 2.
2 Literaturübersicht 21
Tabelle 2 Von der FDA zugelassene Angiogeneseinhibitoren
Angiogenesis inhibitors approved by the FDA in the U.S. and in 28 other countries including endostatin (China) and Macugen (U.S. and Brazil) Date approved Drug Place Disease December 2003 Thalidomide Australia Multiple myeloma February 2004 Avastin U.S. (FDA) Colorectal cancer November 2004 Tarceva U.S. (FDA) Lung cancer December 2004 Avastin Switzerland Colorectal cancer December 2004 Macugen U.S. (FDA) Macular degeneration January 2005 Avastin European Union (25 countries) Colorectal cancer September 2005 Endostatin (Endostar) China (SFDA) Lung cancer aus: FOLKMAN (2006)
2.4 Endostatin
2.4.1 Einführung
Die Struktur des antiangiogenen Peptids Endostatin entsteht als Spaltprodukt der C-
terminalen, als „Non-Collagenous“ bezeichneten Domäne des Kollagen XVIII.
Ähnlich wie für Kollagen XVIII selbst (REHN et al. 1996) sind für Endostatin
verschiedene Varianten mit unterschiedlichen N-Termini und Längen beschrieben
worden (SASAKI et al. 1998). Zudem bestehen Unterschiede zwischen humanem
Endostatin und dem anderer Spezies. Die humanen Endostatinformen sind zum
Beispiel 12 Aminosäuren kürzer beziehungsweise 4, 9 und 14 Aminosäuren länger
als die murinen Endostatine (STÄNDKER et al. 1997, FELBOR et al. 2000). Aus
dieser Beobachtung lässt sich schließen, dass an unterschiedlichen
Produktionsorten und in verschiedenen Geweben wahrscheinlich unterschiedliche
Endostatinformen hergestellt werden, die eventuell differierende antiangiogenetische
Potenz haben. Die Genkarten für humanes Endostatin (COL18A1) als Spaltprodukt
von Kollagen, Typ XVIII, alpha 1, die Ratte (Rattus norvegicus, Col18a1; collagen,
type XVIII, alpha 1), Mausendostatin (Mus musculus, Col18a1; procollagen, type
XVIII, alpha 1), Hühnerendostatin (Gallus gallus, COL18A1; collagen, type XVIII,
alpha 1), den Zebrafisch (Danio rerio, AJ494837), die Fruchtfliege (Drosophila
melanogaster, CG331711; CG33171-PE, isoform E) und den Hund (Canis lupus f.
familiaris, LOC4747781, similar to Collagen alpha 1(XV) chain precursor) liegen vor.
22 2 Literaturübersicht
Für die Katze wurden das entsprechende Gen und Protein noch nicht beschrieben.
Die Sequenzhomologie zwischen humanem und caninem Endostatin beträgt 83.76%
auf Nukleinsäureebene beziehungsweise 82.27% auf Aminosäureebene
(WEIZMANN 2006). KAMSTOCK et al. (2006) infundierten Hunden mit
Weichteilsarkomen canine Endostatin DNA, um seine Tumor supprimierende
Wirkung zu untersuchen. Es wird vor allem in lymphoidem, konnektivem und
epithelialem Gewebe, der Nebenniere, dem Pankreas und der Niere sezerniert.
(MARNEROS, A. G. u. B. R. OLSEN 2005). Die strukturellen Unterschiede
ermöglichen eine Antikörper vermittelte Differenzierung und damit den
immunhistologischen Nachweis speziesverschiedener Endostatine (LI, et al. 2005).
So verwendeten ROSSMEISL et al. (2002) einen polyklonalen Kaninchen Antikörper
gegen rekombinantes canines Endostatin in einem enzymatischen Immunoassay
(EIA) zur Detektion der Endostatinkonzentration im Serum von an malignen
Neoplasien erkrankten Hunden.
Endostatin entsteht, indem es durch Pankreas-Elastase und Cathepsin L
proteolytisch aus der Non-Collagenous 1-Domäne des Kollagen XVIII, welches als
Gerüsteiweiß hauptsächlich in perivaskulären Membranen zu finden ist, abgespaltet
wird (WEN et al. 1999, FELBOR et al. 2000). Das entstehende Peptid ist 22 kD
schwer. In Abbildung 2 ist Kollagen mit seiner Endostatinendung schematisch
dargestellt.
Über die Halbwertszeit von Endostatin sind in der Literatur unterschiedliche Angaben
zu finden. So findet sich bei JOKI et al. (2000) die Angabe, nach 7 Stunden sei die
Hälfte des Proteins abgebaut. BJERKVIG et al. (2003) sprechen von 10,7 Stunden.
2 Literaturübersicht 23
Abbildung 2 Schematische Darstellung der Endostatinsynthese aus Kollagen XVIII
Cathepsin L und Pankreas-Elastase spalten Endostatin aus der Non-
Collagenous Domäne-1 des Kollagen XVIII proteolytisch ab.
2.4.2 Wirkungen
Nach wie vor ist der antiangiogene Wirkungsmechanismus des Endostatins nicht
vollständig geklärt. Es wirkt sich auf ein sehr breites Spektrum an Angriffspunkten im
Zusammenhang mit der Proliferation, Differenzierung, Migration und Apoptose von
neovaskulären Endothelzellen aus. Außerdem beeinflusst es sowohl die Verbindung
zwischen den Endothelzellen und der umgebenden Matrix als auch den
zytoskelettären Aufbau der Zellen selbst (DIXELIUS et al. 2002; KEEZER et al.
2003). KIM et al. zeigten 2002 auf, dass Endostatin an KDR/Flk-1, den Rezeptor des
VEGFs, bindet. Durch diese Bindung interagiert es mit der Signaltransduktion des
VEGF, indem es die VEGF induzierte Phosphorylierung der Kinase (Erk1/2) reduziert
und somit die nachfolgenden Angiogenese induzierenden intrazellulären Schritte
blockiert (PETERSEN et al. 2005, GETMANOVA et al. 2006).
Zusätzlich interagiert es mit den a5- und aV-Integrinen und die daraus folgende
Angiogenese hemmende Wirkung besteht eventuell in einem sich negativ auf die
Endothelzellproliferation auswirkenden antiadhäsiven Mechanismus (REHN et al.
2001, SUDHAKAR et al. 2003).
Non- Collagenous Domäne-1
Endostatin
--Elastase
Pankreas
Proteolyse
Cathepsin LCathepsin L
Proteolyse Kollagen XVIII
Non-Collagenous-Domäne-1
Pankreas Elastase
24 2 Literaturübersicht
Nach DHANABEI et al. (1999) hat Endostatin zudem eine damit einhergehende
Endothelzell-Apoptose fördernde Wirkung, für die die verminderte Expression der
antiapoptotischen Proteine Bcl-2 und Bcl-XI verantwortlich gemacht wird.
Außerdem bindet Endostatin an Heparin und auch an Heparansulfate. Für den
endothelzellaktivierenden Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) dienen
Heparansulfate als Korezeptoren. Daraus folgernd wurde eine kompetitive Hemmung
der Wachstumsfaktor-Korezeptoren durch Endostatin diskutiert (SASAKI et al. 1999).
Weiterhin ist Glypikan, ein Proteoglycan der Zellmembranen und
Migrationsvermittler, als Heparinase sensibler Rezeptor für Endostatin beschrieben
worden. Durch die Bindung von Endostatin vermittelt er eine antiapoptotische
Signalkaskade (HAGIHARA et al. 2001, KARUMANCHI et al. 2001).
Endostatin moduliert zudem sowohl die Expression als auch die Präsentation von
Plasminogen-Aktivatoren und auch deren Inhibitoren auf der Oberfläche von
Endothelzellen (WICKSTRÖM et al. 2001).
Da Endostatin die katalytische Aktivität der Matrixmetalloproteinasen 1 und 2
reguliert, könnte es auch über die veränderte proteolytische Potenz der
Endothelzellen selber antiangiogene Wirkung haben (KIM et al. 2000). Hinzu kommt,
dass Endostatin sowie auch Angiostatin den intrazellulären Kalziumgehalt der
Endothelzellen erhöhen und auf diese Weise die Signalkaskaden angiogener
Faktoren beeinträchtigen können (JIANG et al. 2001).
Caspase-8 ist ein zentrales Apoptose auslösendes Protein. Die Proteinkinase-B
(PKB) wirkt regulierend auf diesen Apoptosemechanismus. Endostatin wiederum
blockiert die PKB und hebt somit die zellschützende Wirkung auf (SKURK et al.,
2004, KANG et al. 2006).
VEGF wirkt auf endotheliale Stickstoffoxidsynthasen (eNOS), die wiederum eine
Zellmigration induzieren, indem es Serotonin 1177 phosphoryliert. Endostatin führt zu
einer Dephosphorylierung an Serotonin 1177 und wirkt so der VEGF vermittelten
Endothelzellaktivierung entgegen (URBICH et al. 2002).
2 Literaturübersicht 25
Morphologisch zeigt sich die Wirkung von Endostatin auf die Struktur von
Tumorblutgefäßen, wobei sowohl die Gefäßdichte als auch der Durchmesser der
einzelnen Gefäße verringert wird, was dann zu einer Beeinträchtigung der
funktionellen Gefäßversorgung führt (BJERKVIG et al. 2003).
Vorteil der antiproliferativen Wirkung des Endostatins ist, dass es ausschließlich auf
neovaskuläre Endothelzellen abzielt (OU-YANG et al. 2006) und so eine weitgehend
nebenwirkungsfreie Therapie möglich macht, da bereits ausgereifte Gefäße nicht
beeinträchtigt werden. Einen Überblick verschafft Abbildung 3 auf Seite 26.
26 2 Literaturübersicht
Erk 1/2
Abbildung 3 Schematisierte Darstellung der Wirkungsweise von Endostatin Endostatin antagonisiert die Neoangiogenese in Tumoren (A) Es blockiert die
Bindung von VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) an seinen Rezeptor
KDR/Flk-1 (B), wirkt Apoptose fördernd in dem es den PKB (Proteinkinase B) (E) und
den Bcl-2 und Bcl-XI (C) vermittelten Zellschutz aufhebt. Durch Blockade des
Korezeptors Heparansulfat (D) verhindert es die Endothelzellaktivierung durch bFGF
(basic Fibroblast Growth Factor). Es verhindert die Phosphorylierung an
Serotonin1177 und so die eNOS (endotheliale Stickstoffoxidsynthase vermittelte
Zellmigration (F). Bild A aus: http://www.cancerchoices.com/7facts-angiogenesis.htm (08/2006)
2 Literaturübersicht 27 2.4.3 Therapeutischer Einsatz
ABDOLLAHI et al. (2003) zeigten den antiproliferativen Effekt von Endostatin auf
humane Endothelzellen in vitro. Endostatin wirkte sich vermindernd auf die
Überlebensrate des Endothelzellklons (clonogenic survival) aus, steigerte die
Apoptoserate, reduzierte die Migrations- und Invasionsrate sowie die Bildung von
strukturierten Blutgefäßen. Weiterhin wurde im Tierversuch gezeigt, dass das
Tumorwachstum nach täglicher subkutaner (s.c.) Endostatingabe verzögert war.
Versuche in Mäusen mit humanen Glioblastomimplantaten, denen sowohl Gene für
einen VEGF-Rezeptor als auch ein Angiostatin-Endostatin-Fusionsgen transferiert
wurden, zeigten sowohl eine deutliche Tumorreduktion als auch eine Abnahme in der
Vaskularisierungsdichte und verlängerte Überlebenszeiten (OHLFEST et al. 2005).
Zur Gentransfektion wurde ein so genanntes „sleeping-beauty“-Transposon
verwendet, welches während der G1-Phase des Zellzyklus mitsamt der zu
transferierenden Sequenzen selbständig in die DNA eindringt.
Die starke Vaskularisierung von Tumoren geht mit einer Suppression der
endothelialen Adhäsionsmoleküle einher, aus der eine reduzierte Interaktion
zwischen Leukozyten und Blutgefäßwänden folgt. Die daraus folgende Anergie der
Endothelzellen gegenüber vielen Immunotherapien und Anti-Tumor-Vakzinationen
wurde durch die gleichzeitige Gabe von Endostatin umgangen und es wurden
vermehrte Leukozyteninteraktionen als Reaktion auf die primären Therapeutika
gezeigt (DIRKX et al. 2006).
Synthetisch hergestellte Endostatinfragmente wurden in einem Endometriose-
Mausmodell untersucht und es zeigte sich eine deutliche Abnahme der
endometrialen Läsionen ohne eine Unterdrückung des normalen Zyklus und ohne
einhergehende toxische Wirkungen (BECKER et al. 2006a).
28 2 Literaturübersicht
Anhand eines Mausmodells untersuchten SUZAKI et al. (2005) den therapeutischen
Einsatz von Endostatin zur Behandlung von Asthma. Die Behandlung mit Endostatin
verminderte die durch Ovalbumin erhöhte Ansprechbarkeit der Atemwege, die
pulmonale allergische Inflammation und die Produktion spezifischer IgE-Antikörper
sowie Entzündungsmediatoren.
Ein Kolontumormodell in der Ratte zeigte hingegen zwar verlängerte
Überlebenszeiten der oral mit Endostatin behandelten Tiere, aber keine signifikante
Tumorreduktion oder Verringerung der Metastasierungsrate der Primärtumoren (LI u.
LI 2005).
LI et al. (2006) untersuchten die Tumor supprimierende Wirkung von Endostatin auf
das nasopharyngeale Karzinom, indem sie ein Adenovirus als Träger des
Endostatingens verwendeten. Sie konnten sowohl in der Zellkultur als auch in vivo
einen Tumorzellrückgang aufzeigen.
Zur Therapie renaler Strukturveränderungen, die mit dem Diabetes mellitus Typ 1
einhergehen, wurde Endostatin an einem murinen Nephropathiemodell untersucht.
Es zeigten sich deutlich geringere Hyperplasien der glomerulären Strukturen und
eine generelle Verringerung der Läsionen der Nieren im Vergleich zur Kontrollgruppe
(ICHINOSE et al. 2005).
In einem Glioblastommodell konnte gezeigt werden, dass die intratumorale Infusion
von Endostatin wesentlich effektiver war als eine systemische (intraperitoneale)
Applikation. Während die systemische Therapie mit Endostatin kaum einen Effekt
hatte, konnte bei lokaler Infusion von 10-fach niedrigeren Mengen an Endostatin eine
Hemmung des Tumorwachstums von ca. 75% erreicht werden (SCHMIDT et al.
2004). FOLKMAN (2006) sprach von der Ebnung des Weges für die
Angiogenesehemmer in die klinische Anwendung nach drei Jahrzehnten
Forschungsarbeit durch die Entwicklung lokaler Applikationsmethoden.
2 Literaturübersicht 29 2.5 Mikrokapseln zur intrazerebralen Gliomtherapie
2.5.1 Einführung
Die systemische Behandlung von Neoplasien im Gehirn mittels antitumoröser
Wirkstoffe wie Chemotherapeutika oder antiangiogener Proteine wird auf Grund der
Abschirmung des Gehirns durch die Blut-Hirn-Schranke (BHS) erschwert. Ihre
geringe passive Permeabilität und das hoch selektive Transportsystem wirkten beim
Einsatz therapeutischer Moleküle zur Behandlung zerebraler Erkrankungen stark
limitierend (BOBO et al. 1994, EMERICH u. SALZBERG 2001). Hinzu kommt, dass
Wirkstoffe nach systemischer Applikation und Überwinden der BHS einen großen
interstitiellen, parenchymalen Druck überwinden müssen, um die Tumorzellen zu
erreichen (KIRSCH et al. 2000b). In Konzentrationen, die bei systemischer
Behandlung verabreicht werden müssten, um eine ausreichend hohe Dosis am
Zielort zu erreichen, wäre mit erheblichen Nebenwirkungen zu rechnen (JAIN 1991,
MEYERS et al. 1992).
Um eine auf antiangiogenen Mechanismen beruhende Gliom supprimierende
Wirkung zu erzielen, bedarf es hoher Konzentrationen eines potenten
Angiogeneseinhibitors über einen langen Zeitraum am Zielort (FOLKMAN 1995).
Bedingt durch die nur kurze biologische Halbwertszeit von Endostatin, die
Barrierefunktion der BHS sowie durch den verminderten Blutfluss innerhalb der
zentralen Tumorregionen ist die Applikationsform von wesentlicher Bedeutung. Eine
systemische Glioblastombehandlung ist dem zu Folge nur sehr begrenzt möglich und
es wird vermehrt nach Optionen für die lokale Wirkstoffverabreichung gesucht.
SIPOS u. BREM (2000) beschrieben das GBM für die Anwendung direkt lokaler
Therapien als sehr gut geeignet, da die Metastasierungsrate gering ist und die
Tumoren an nur einer Lokalisationsstelle verbleiben.
30 2 Literaturübersicht Um die BHS wirkungsvoll zu umgehen, war ein Lösungsansatz die direkte zerebrale
Injektion von Wirkstoffen in den Tumor, das umgebende Gewebe oder in das
Liquorsystem mittels Medikamentenpumpen. Hierbei zeigten sich aber sowohl die
Dosierung als auch die Stabilität der Proteine problematisch.
Hinzu kamen entzündliche Gewebsreaktionen sowie Infektionen des Gehirns als
Reaktion auf die sich dauerhaft im Gewebe befindenden Anteile der Apparaturen
(TSENG u. AEBISCHER 2000).
Um diese Probleme zu überwinden, haben verschiedene auf lokalen
Applikationsmethoden basierende Ansätze experimentelle Anwendung gefunden,
dabei kamen gentherapeutische Vektoren (GRISCELLI et al. 1998, MA et al. 2002),
aber auch auf Zellen basierende Transplantate (JOKI et al. 2001, READ et al. 2001)
zum Einsatz. Verschiedene Projekte zur lokalen Tumorbehandlung unter Anwendung
von Angiostatin oder Endostatin haben eine signifikante Inhibition des
Tumorwachstums aufgezeigt (TANAKA et al. 1998, DE BOUARD et al. 2002). Es
wurde mit zwei verschiedenen Implantatmodellen gearbeitet, zum einen mit
Makrokapseln wie zum Beispiel Hohlfaserkapseln und Diffusionskammern und zum
anderen mit Mikrokapseln. Die Implantation von Makrokapseln führte zu sowohl
chirurgischen Problemen auf Grund ihrer Größe als auch zu starken
Abwehrreaktionen bei den Empfängern. Hinzu kamen durch lange Diffusionsstrecken
bedingte Nekrotisierungen des implantierten Gewebes und das Versagen der
Implantate (KUHTREIBER et al. 1999). Unter Mikrokapseln versteht man die
Einbettung von Zellen in eine auf Hydrogelen, zum Beispiel Alginat, basierende
Matrix.
Mikrokapseln haben ein sehr viel vorteilhafteres Oberflächen-Volumen-Verhältnis,
erlauben eine definierte Bestimmung ihrer Permeabilität und garantieren so eine
ausreichende Versorgung der von ihnen beinhalteten Zellen mit Nährstoffen und
Sauerstoff. Ebenso können von den implantierten Zellen sezernierte Proteine durch
die Alginathülle dauerhaft und definiert in das umliegende Gewebe diffundieren.
2 Literaturübersicht 31 Die für die Bestandteile des Immunsystems nicht durchdringbare Hülle schützt
zudem die Implantate vor der Immunabwehr des Wirtes, so dass auch xenogene
Transplantationen ohne Wirtsabstoßung möglich sind. Die geringe Größe der
Mikrokapseln, die unter 1000 µm Durchmesser liegt, ermöglicht außerdem die
minimalinvasive Implantation gleich mehrerer Kapseln selbst in kleinste Räume wie
zum Beispiel die Muskulatur oder das Gehirnparenchym.
Auf Grund ihres Aufbaus aus lebenden, dauerhaft Wirkstoff sezernierenden Zellen in
einer umgebenden permeablen Matrix werden diese Kapseln auch als „Bioreaktoren“
bezeichnet.
Neben verkapselten Gewebeanteilen wie pankreatischen Inselzellen, die zur
Behandlung von Diabetes mellitus Typ 1 transplantiert wurden, kamen bisher 3
Kategorien von Zellen zum Einsatz (EMERICH u. SALZBERG 2001):
Postmitotische Zellen wie adrenerge chromaffine Zellen wurden zur chronischen
Schmerzbehandlung eingesetzt (BUCHSER et al. 1997). Außerdem wurden
immortalisierte Zellen, zum Beispiel Dopamin sezernierende PC12-Zellen, zur
Therapie der Parkinsonerkrankung verwendet (AEBISCHER et al. 1991).
Einen neuen Ansatz stellt die Verwendung gentechnisch so modifizierter Zellen dar,
dass sie ein bestimmtes Protein gezielt sezernieren („cell engineering“). Hier spricht
man auch von somatischer ex vivo Gentherapie, die im Unterschied zur in vivo
Gentherapie, bei der genetisches Material direkt in das Patientengewebe
transplantiert wird, eine genetische Insertion der Zellen in vitro und eine
nachfolgende Verkapselung vor der Implantation in den Patienten beinhaltet.
Hierfür werden in der Regel modifizierte humane mesenchymale Stammzellen
(hMSC) verwendet. Stammzellen sind am Anfang der Entwicklung stehende, nicht
ausdifferenzierte und noch zur Autoreproduktion befähigte Zellgruppen, die je nach
Gewebezugehörigkeit unterschieden werden in embryonale (ES), germinale,
hämatopoetische, somatische, epitheliale und mesenchymale Stammzellen (MSC).
Nach ihren Eigenschaften werden sie in pluripotente Zellen, zu denen die ES
gehören, multipotente Zellen wie die MSC und in unipotente Zellen, zu denen auch
die hämatopoetischen Stammzellen gehören, eingeteilt.
32 2 Literaturübersicht Humane mesenchymale Stammzellen sind undifferenzierte Vorläuferzellen, die zur
Rekonstruktion von Geweben mesenchymalen Ursprungs eingesetzt werden können
und die das Muttergewebe von Binde- und Stützgewebe, glatter Muskulatur sowie
von Skelett- und Herzmuskel darstellen. Sie sind durch ihre fibroblastenartige
Morphologie, adhärentes Wachstum und ihr Potenzial, in Adipozyten, Osteoblasten,
Myozyten und Chondrozyten zu differenzieren, gekennzeichnet.
MSC können durch einen einfachen chirurgischen Eingriff gewonnen werden. Hierbei
wird der Beckenkamm des Spenders punktiert und Knochenmark entnommen. Nach
einem von FRIDENSHTEIN (1982) etablierten Verfahren können hMSC aus
Knochenmarkaspiraten isoliert und expandiert werden. Dazu werden die
mononukleären Zellen mittels Dichtegradientenzentrifugation gereinigt und die
mesenchymalen Stammzellen über Plastikadhärenz selektioniert, indem die mobilen
hämatopoetischen Stammzellen durch mehrmaliges Entfernen des Kulturmediums
herunter gewaschen werden. (AURICH et al. 2006).
Durch Genmodifizierung verändert lassen sich hMSC zur Behandlung von
Gehirngewebsschädigungen wie zum Beispiel bei Hirninfarkten oder Schädel-Hirn-
Traumata und auch zur Bekämpfung hirneigener Neoplasien einsetzen. So zeigten
sie eine deutliche inhibitorische Wirkung auf die Proliferation von Gliomzellen, die
durch die Genmodifikation bedingte Sekretion therapeutischer Zytokine noch
gesteigert wurde (HAMADA et al. 2005).
Werden hMSC durch die humane Telomerase reverse Transkriptase (hTERT),
welche der bestimmende Faktor der enzymatischen Aktivität der humanen
Telomerasen ist, modifiziert, so erreicht man eine „sanfte“ Immortalisierung der
Zellen. Es entsteht eine permanente Zelllinie, ohne dass diese eine onkologische
und damit unkontrollierbare Proliferationsaktivität entwickeln. Auf diese Weise wurde
eine Zelllinie mit weitgehend normalen Zellverhältnissen geschaffen, deren
Proliferation nach der Verkapselung mit Alginat nach ein bis zwei Zellteilungen zum
Erliegen kommt. Diese hTERT-MSC sind unendlich klonierbar und überlebensfähig
ohne in einer Alginatmatrix durch anhaltende Proliferation die Integrität der Kapsel zu
zerstören. (HORIKAWA u. BARRETT 2003).
2 Literaturübersicht 33 Die in dieser Arbeit verwendeten, mit der hTERT versehenen hMSC waren
morphologisch identisch mit den primären hMSC und exprimierten
Oberflächenantigene, einschließlich CD105, CD 73 und CD166. Die hTERT-MSC
zeigten in vitro eine ähnliche Teilungsrate wie unveränderte mesenchymale
Stammzellen und teilten sich bis zu einer Proliferationsdichte von über 80
Verdoppelungen der Population (KOBUNE et al. 2003).
2.5.2 Verkapselungsmaterial: Alginat
Ein ideales Glioblastomtherapeutikum muss prädiktiv im Hinblick auf das
Tumoransprechen und gleichzeitig nicht toxisch für das gesunde Gehirngewebe sein
(HOFER et al. 2002). Dementsprechend musste ein Implantat entwickelt werden,
welches eine kontinuierliche, lokale, hoch konzentrierte Wirkstofffreisetzung
garantierte, ohne zu Abstoßungsreaktionen oder Entzündungen zu führen. Um die
Ausgangsbasis für eine solche Applikationsform zu schaffen, sind in den letzten
Jahren eine große Anzahl von Mikrokapseln aus den verschiedensten Materialien
(Alginat, Agar, Agarose und synthetischen Polymeren) entwickelt und getestet
worden (DULIEU et al. 1999).
Alginat ist ein wasserlösliches Salz der Alginsäure, welches als natürliches
Polysaccharid aus marinen Braunalgen, wie Laminaria, Ecklonia, Macrocystis,
Lessonia, Ascophylum und Durvillea extrahiert wird. Es besteht aus zwei
Uronsäuren, β-D-Mannuronsäure (M) und α-L-Guluronsäure (G), die über 1,4
Bindungen verknüpft sind. Der strukturelle Polymeraufbau wird durch drei
Sequenzblöcke bestimmt, die entweder homopolymer als M-M- oder G-G-Blöcke
oder heteropolymer als M-G-Blöcke vorliegen. Werden dem Alginat mono- oder
divalente Kationen zugesetzt, so kommt es zu Quervernetzungen der Polymere. Bei
der Verwendung divalenter Kationen außer Magnesium (Mg2+) bildet sich ein
dreidimensionales Netzwerk (GIUNCHEDI et al. 2000). Eine Darstellung des
strukturellen Aufbaus ist in der Abbildung 4 einzusehen.
34 2 Literaturübersicht
aus: SMITH (2005)
Abbildung 4 Struktureller Aufbau von Alginat Die Guluronsäuren und Mannuronsäuren sind als MM- und GG- Blöcke über α (1→4)
und β (1→4) Bindungen verknüpft.
Die entstehenden wässrigen Gele können zur Herstellung Poren enthaltender
semipermeabler Mikrokapseln als Einbettung für Wirkstoffe, Zellen oder Gewebe
vertropft werden (PANDEY et al. 2005). Die Verkapselung mit Alginat schirmt die
implantierten Gewebeverbände oder Zellen gegen das Immunsystem des Patienten
ab (LÖHR et al. 2001), so dass auch eine Xenotransplantation möglich ist, und führt
darüber hinaus zu einer Immobilisierung der eingebetteten Zellen.
Die Affinität von Alginat zu den verschiedenen verwendeten divalenten Kationen und
damit die Stabilität seiner Quervernetzung und der entstehenden Gele nimmt in der
Reihenfolge Cd>Ba>Sr>Ca>Ni>Cu>Mn ab (VISTED et al. 2001). Die
morphologische Beständigkeit und die Widerstandsfähigkeit nehmen für Alginatgele
deutlich zu, wenn das in der Vergangenheit üblicherweise eingebundene Kalzium
(Ca)2+-Ion durch Barium (Ba2+) ersetzt wird. Zudem lässt die Verwendung von
Bariumionen eine Verkleinerung der Mikrokapseln zu und verringert die Permeabilität
für Immunglobulin G des Implantatempfängers (MORCH et al. 2006). Ein weiterer
Nachteil von Kalziumionen als Gelbildner ergab sich aus seiner
Chelatbildungsfähigkeit mit anderen körpereigenen Molekülen wie zum Beispiel
Zitraten. So fanden DUVIVIER-KALI et al. (2001) heraus, dass sich bei
Alginatkapseln mit hohem Mannuronsäureanteil, die mit einer
Bariumchloridvernetzung hergestellt wurden, eine geringere fibrotische Reaktion
auftrat als bei Kalziumchlorid vernetzten Kapseln.
2 Literaturübersicht 35 ROKSTAD et al. (2003) zeigten, dass bei der Verwendung von Poly-L-Lysin
Alginaten die Zellen nicht ausreichend gehemmt waren und es durch eine
fortschreitende Proliferation der Zellen zu einer Zerstörung der Kapseln kam.
Durch die Vertropfung der wässrigen, kationenvernetzten Gele lassen sich mit Hilfe
spezieller Beadgeneratoren Alginatperlen beziehungsweise Alginatbeads formen.
Diese Mikrokapseln bestehen aus einer inneren Alginathülle, in der die Zellen als
Zellcore in einer Alginatmatrix eingebettet vorliegen, und aus einer äußeren
Alginathülle, die das Beadinnere durch ihre immunisolierenden Eigenschaften vor
den Immunabwehrsystemen des Empfängers schützt. Einen Überblick über die
Diffusionseigenschaften verschafft Abbildung 6. Diese Art der Doppelverkapselung
gibt den Implantaten trotz erhaltener Flexibilität zudem die nötige Stabilität.
2.5.3 Biokompatibilität
MARKUSEN et al. (2006) belegten, dass Alginat sich sehr gut als
Verkapselungsmaterial für Stammzellen eignet. Es wurde gezeigt, dass hMSC nach
der Verkapselung mit Alginat eine Vitalität von über 80% behielten, ohne jedoch
weiter zu proliferieren und zu einer Desintegration der Mikrokapseln zu führen.
Die Biokompatibilität der Alginatkapseln hängt von der Reinheit der Implantate, ihrer
Stabilität, der Verarbeitung, den verwendeten divalenten Kationen und vor allem der
die Permeabilität bestimmenden Struktur der Alginatmatrix ab. Mögliche
Komplikationen äußern sich in einem fibrotischen Überwachsen der Kapseln,
welches durch Sauerstoff- und Nährstoffentzug zum Tod der eingekapselten Zellen
führt. DE VOS et al. (1999) zeigten diesbezüglich, dass es auch ohne fibrotische
Überwachsungen zum Tod von etwa 10% der von ihnen implantierten verkapselten
ß-Pankreaszellen kam, und nahmen auch hier eine Nährstoffunterversorgung
bedingt durch zu lange Diffusionswege als Ursache an. Sie zeigten aber auch, dass
alle Implantate, die die ersten offensichtlich kritischen 4 Wochen überlebten, auch
nach 8 Wochen noch vital waren.
36 2 Literaturübersicht
Alginatkapseln mit einem hohen Mannuronsäureanteil führten zu einer verstärkten
Immunreaktion des Empfängers mit einer vermehrten Bildung proinflammatorischer
Zytokine, wohingegen guluronsäurereichere (high-G Alginate) intraperitoneal
(KULSENG et al. 1999) und auch im Gehirn von Ratten (READ et al. 2001) gut
toleriert wurden.
OMER et al. (2003) verwendeten ein Alginat mit einem Mannuronsäureanteil von
61% (high-M Alginate), um xenogene Pankreaszellen in Mäuse zu transplantieren,
und wiesen auch hier eine Überlebenszeit der verkapselten Zellen von 20 Wochen
nach. Alginate mit einem hohen Guluronsäureanteil weisen zudem die größte
Porenbildung auf und ermöglichen so eine bessere Versorgung der verkapselten
Zellen und eine erhöhte Wirkstofffreisetzung (READ et al. 1999).
2 Literaturübersicht 37 2.5.4 Therapeutischer Einsatz
Die Verwendung von Zellen enthaltenden Mikrokapseln ist innerhalb eines sehr
weiten therapeutischen Spektrums möglich. Die besonderen Vorteile dieser sehr
kleinen, hocheffizienten und gut biokompatiblen Wirkstofflieferanten ermöglichen
insbesondere die Anwendung in schwer zugänglichen und kleinen Zielbereichen wie
der Muskulatur und dem Gehirn.
Einen Überblick über erfolgreich erprobte Anwendungsgebiete von sezernierende
Zellen enthaltenden Alginatbeads gibt die Tabelle 3.
Tabelle 3 Übersicht über die experimentelle Anwendung von Alginatbeads Author Disease Encapsulation Cell line Protein Outcome
Read et al., 2001
Gliomas in rat Microencapsulation 293 Endostatin Prolonged survival
Emerich et al., 1997
Huntington´s disease
Microencapsulation BHK CNTF Reduced neuronal loss
Mitsumoto et al, 1994
Amyotrophic lateral sclerosis
Microencapsulation BHK CNTF Prolonged survival
Winn et al., 1989
Parkinson´s disease Microencapsulation and Macroencapsulation
PC 12 Dopamine Reduced rotation behaviour
Abbreviation: BHK, baby hamster kidney, 293, EBNA human fetal kidney
aus: VISTED et al. (2001)
Es wurde in mehreren Studien gezeigt, dass Alginatkapseln eine für die Diffusion von
Endostatin gut geeignete Permeabilität aufwiesen und eine ausreichend hohe
Freisetzung des Proteins ermöglichten. JOKI et al. (2001) verwendeten hierzu
Endostatin sezernierende BHK 12-Zellen (baby hamster kidney cells) und READ et
al. (2001) verkapselten EBNA 293-Zellen (human fetal kidney cells).
Zur Entwicklung therapeutischer Ansätze zur Behandlung des Glioblastoms wurden
alginatverkapselte xenogene Zellen bereits erfolgreich in immunkompetenten Ratten
(READ et al. 2001a) als Heterotransplantate in einem Mausmodell (JOKI et al. 2001)
und sowohl subkutan als auch intrakraniell bei Tumoren in Mäusen (READ et al.
2001b) angewendet.
38 2 Literaturübersicht
Grundsätzlich gibt es verschiedene Optionen zur intrazerebralen Behandlung mit
alginatverkapselten Zellen. Eine Möglichkeit ist die Applikation in das Liquor führende
System: den Subarachnoidalraum oder die Gehirnventrikel. Von dieser
Implantationslokalisation ausgehend ist die Verteilung therapeutischer Substanzen
durch die Fließrichtung der Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) gesteuert. Dieser Fluss ist
von der Produktionsstelle, dem Plexus Choroideus in den Ventrikeln, zu den
Arachnoidalvilli gerichtet, von wo aus der Liquor gefiltert und dem abführenden
venösen System zugeführt wird. Optional können Alginatbeads direkt in das
Parenchym implantiert werden, wo die Implantate fest im Gewebe liegen und
sezernierte Proteine in die direkte Umgebung abgeben. Bei der Implantation in
Liquor führende Räume kommt es zu einer weiter reichenden Verteilung der
Substanzen, aber auch zu einer größeren Verdünnung. Zur Behandlung des
Glioblastoms ist die Applikation in eine Tumorresektionshöhle oder direkt in das
Tumorgewebe hinein möglich. So werden möglichst hohe Konzentrationen
antitumoröser Wirkstoffe direkt am beziehungsweise im Tumor selbst erreicht
(VISTED et al. 2001).
Eine Glioblastomtherapie mittels mikroverkapselter Zellen ist nicht dazu geeignet alle
Tumorzellen zu vernichten und den Patienten zu heilen, sondern sie soll ein lokale
Tumorkontrolle erreichen und so aus einer definitiv tödlich verlaufenden Krankheit
ein chronisches, handhabbares Leiden machen (VISTED u. LUND-JOHANSEN
2003).
2 Literaturübersicht 39
2.6 Ziel der vorliegenden Arbeit
Das Ziel der vorliegenden Arbeit waren die Entwicklung eines reproduzierbaren
Glioblastommodells in der Ratte und die Untersuchung einer ex vivo Gentherapie zur
Behandlung eines induzierten Glioblastoma multiforme (GBM) mit
alginatverkapselten humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC), die so
gentechnisch modifiziert wurden, dass sie das antiangiogene Protein Endostatin
freisetzten. Zunächst sollte die Kultivierung der verwendeten Gliomzelllinie etabliert
und die zur Implantation geeignete Zellzahl zum Erhalt eines experimentellen GBM,
das qualitative Gruppenvergleiche zulässt, gefunden werden. Außerdem musste eine
stereotaktische Implantationstechnik zur Inokulation der Gliomzellen und zur
Implantation der zu untersuchenden Mikrokapseln entworfen werden. Dabei mussten
geeignete Koordinaten zur Gliomzellinokulation und zur Implantation der
Alginatbeads gefunden werden. Diese sollten einerseits eine Applikation der
Implantate intraparenchymal mit Kontakt zum Ventrikelsystem
(intrazerebroventrikulär) und andererseits eine intraparenchymale Implantation des
Tumors erlauben. Dabei sollten Mikrokapseln und Tumor zudem möglichst nah
beieinander lokalisiert sein, ohne dass aber die rein mechanische Einwirkung der
Implantation der Alginatbeads Auswirkungen auf das Tumorwachstum hatte. Im
Anschluss an die Etablierung des Modells war mittels immunhistologischer
Markierung der Nachweis der Endostatinfreisetzung und damit die Funktionalität der
verwendeten, von der Firma CellMed AG (Alzenau, Deutschland) hergestellten
Alginat-Mikrokapseln (CellBeads®) nach intrazerebraler Implantation aufzuzeigen.
Außerdem sollte die Wirksamkeit sowohl Endostatin sezernierende MSC
enthaltender CellBeads® (Endostatinbeads, ECB) als auch nicht genetisch
modifizierte hTERT-MSC enthaltender CellBeads® (Stammzellbeads, SCB) auf das
Glioblastom im Vergleich zu leeren Alginatkapseln (Leerbeads, LCB)
beziehungsweise unbehandelten Tumoren untersucht werden.
Untersuchungsparameter waren hierbei die Blutgefäßdichte und –morphologie sowie
das Tumorvolumen, die sowohl histologisch als auch immunhistologisch zu prüfen
waren.
40 2 Literaturübersicht
Aufbauend auf den Ergebnissen einer vorausgegangenen Dissertationsarbeit
(BARTSCH 2005) sollte die Wirksamkeit der verwendeten CellBeads® unter GLP-
Bedingungen (Good Laboratory Practice) als Voraussetzung für die Beantragung der
klinischen Anwendung getestet werden. Dazu war das tierexperimentelle
Glioblastommodell zu standardisieren und die Untersuchungsergebnisse unter den
Vorgaben der GLP zu quantifizieren.
Die Etablierung des Glioblastommodells in der BDIX-Ratte wurde nach folgenden
Gesichtspunkten durchgeführt:
1. Entwicklung einer standardisierten Kultivierung der verwendeten syngenen
Gliomzelllinie BT4Ca.
2. Überprüfung der geeigneten zu implantierenden BT4Ca-Zellzahl um einen
reproduzierbaren Tumor nach einer definierten Überlebenszeit zu erhalten.
3. Ermittlung der geeigneten Koordinaten und Applikationsmethodik für die
Implantation sowohl der Gliomzelllinie BT4Ca als auch der zu
untersuchenden CellBeads®.
Die Untersuchung der Wirksamkeit der Endostatin sezernierende humane mesenchymale Stammzellen enthaltenden CellBeads® auf das Glioblastom
erfolgte unter Berücksichtigung folgender Fragestellungen:
1. Kommt es nach einer Implantation Endostatin sezernierende hTERT-MSC
enthaltender Mikrokapseln (ECB) über einen Zeitraum von 12 Tagen zu
einer Wirkstofffreisetzung von Endostatin und wo ist das Protein
intrazerebral zu finden?
2. Besteht nach der Implantation Endostatin sezernierende hTERT-MSC
enthaltender Mikrokapseln (ECB) eine Wirksamkeit auf die Blutgefäßdichte
innerhalb des Glioblastoms?
3. Besteht nach der Implantation Endostatin sezernierende hTERT-MSC
enthaltender Mikrokapseln (ECB) eine Wirksamkeit auf das
Glioblastomwachstum?
3 Untersuchungsgut und Methoden 41
3 Untersuchungsgut und Methoden
3.1 Tiere
3.1.1 Herkunft
Die Versuchstiere wurden im SPF-Bereich des Institutes für Versuchstierkunde und
dem Zentralen Tierlaboratorium der Medizinischen Hochschule Hannover gezüchtet
und wurden zur Versuchsdurchführung in die Tierhaltung des S1-Bereiches des
International Neuroscience Institute Hannover (INI GmbH) überführt.
Zur Durchführung der Versuche zur Etablierung der Methodik wurden 31 weibliche
BDIX/Ztm-Ratten eingestellt. Diese waren zwischen 8 und 12 Wochen alt und wogen
zwischen 200 und 350 Gramm.
Für die Überprüfung der Wirksamkeit von Endostatin freisetzenden CellBeads® wurden 40 weibliche BDIX/Ztm-Ratten eingestellt. Die Tiere waren zum Zeitpunkt der
Versuchsdurchführung 10 bis 14 Wochen alt und wogen zwischen 250 und 350
Gramm.
3.1.2 Haltung und Fütterung
Die Tiere wurden in Gruppengrößen bis zu drei Tieren in Makrolon®- Käfigen Typ IV
unter kontrollierten, standardisierten Umweltbedingungen gehalten. Gefüttert wurde
ad libitum ein pelletiertes Haltungsfutter (Altromin® Alleinfuttermittel 1324, Altromin
GmbH, Lage). Die Tiere hatten stets freien Zugang zu Trinkwasser über Makrolon®-
Flaschen. Es wurde Standardweichholzgranulat für Labortiere (Altromin) als
Käfigeinstreu verwendet. Die Raumtemperatur betrug während der gesamten
Haltungsdauer 23°C ± 2°C bei einer Luftfeuchtigkeit von 55% ± 5%. Die Beleuchtung
erfolgte ausschließlich durch Kunstlicht bei <250 Lux im Raum und <60 Lux im
Käfigbereich in einem kontinuierlichen Tag-Nachtzyklus mit einer Dunkelphase von
12 Stunden und einer entsprechenden Hellphase von 6:00 bis 18:00 Uhr MEZ.
42 3 Untersuchungsgut und Methoden
Die Versuchstiere wurden wöchentlich in saubere Käfige mit frischer Einstreu
umgesetzt und erhielten zweimal wöchentlich frische Futterpellets und frisches
Trinkwasser.
Alle Tiere wurden frühestens nach einer Eingewöhnungszeit von einer Woche an die
herrschenden Umgebungsbedingungen operiert. Im Anschluss an die Operationen
wurden die Tiere für eine Dauer von mindestens 5 Tagen einzeln in Makrolon®-
Käfigen Typ III gehalten.
Die Haltung und Versuchsabläufe wurden in einem Versuchstierbuch dokumentiert.
Darin wurden Tierstamm, Geschlecht, Geburtsdatum, Einstellungsdatum, Herkunft,
Projektzugehörigkeit, Aktenzeichen des genehmigten Tierversuchsvorhabens,
Narkoseart, Art des Eingriffs, Datum des Eingriffs, Euthanasiemethode und -datum
festgehalten und diese Daten sowohl vom Experimentator als auch vom
Versuchsleiter durch Unterschrift bestätigt.
Alle Untersuchungen wurden durch die verantwortliche Regierungsbehörde
Hannover unter den Aktenzeichen 509.6-42502-04/758 und 33.42502-05/1022
genehmigt und fanden ausschließlich im S1- Bereich des International Neuroscience
Institute Hannover (INI GmbH) statt.
3.1.3 Narkose und Analgesie
Zur Durchführung der Experimente wurden die Tiere mittels intraperitonealer
Injektionsnarkose bestehend aus Ketanest® (Wirkstoff: Ketamin, 75 mg/kg KGW,
Pfizer, Karlsruhe, Deutschland) und Domitor® (Wirkstoff: Medetomidin, 0,2 mg/kg
KGW, Pfizer) für eine Dauer von durchschnittlich 45 Minuten narkotisiert.
Die Narkosetiefe wurde während des gesamten Eingriffs durch Überprüfung der
Reflexe anhand des Zwischenzehenreflexes und des Lidreflexes überwacht.
Bei Wiedereinsetzen eines Tiefenschmerzreflexes erfolgte eine Narkose-
verlängerung durch intraperitoneale Verabreichung von Ketanest® (20 mg/kg KGW).
3 Untersuchungsgut und Methoden 43
Bis zum Aufwachen standen die Tiere unter Beobachtung und wurden zur
Vermeidung einer Hypothermie warm gehalten. Zur postoperativen Analgesie wurde
den Tieren Novaminsulfon ratiopharm® (Wirkstoff: Metamizol-Natrium, 110 mg/kg
KGW, Ratiopharm, Ulm, Deutschland) oral nach Einsetzen des Schluckreflexes und
weiterhin über das Trinkwasser während des gesamten Untersuchungszeitraumes
verabreicht.
Die Tiere wurden während der gesamten postoperativen Phase zweimal täglich auf
ihr Allgemeinbefinden hin untersucht und die Befunde dokumentiert. War das
Allgemeinbefinden eines Tieres, insbesondere seine Futteraufnahme, gestört, so
wurde dieses euthanasiert.
3.2 Implantate: CellBeads®
3.2.1 Herkunft
Die alginatverkapselten Implantate (CellBeads®) wurden durch die Firma CellMed AG
(Alzenau, Deutschland) hergestellt und der INI GmbH zur Verfügung gestellt.
Zum Einsatz kamen leere CellBeads® (Leerbeads, LCB), die nur aus der Alginathülle
und Goldpartikeln zur besseren Sichtbarmachung bestanden. Außerdem wurden
CellBeads® verwendet, die vitale mesenchymale Stammzellen humanen Ursprungs
ohne gentechnische Modifikation enthielten (Stammzellbeads, SCB) und solche
CellBeads®, die humane mesenchymale Stammzellen enthielten, welche so
genetisch modifiziert wurden, dass sie humanes Endostatin sezernierten
(Endostatinbeads, ECB). In Abbildung 5 sind die verwendeten CellBeads®
dargestellt. Die verwendeten Zellklone wurden in der gentechnischen S1-Anlage der
Firma CellMed AG generiert und verkapselt.
Durch den Hersteller wurde die Vitalität der verwendeten Chargen in vitro mit Hilfe
eines Alamar Blue Monitoring über 60 Tage kontrolliert.
44 3 Untersuchungsgut und Methoden
Alamar Blue ist eine Substanz, die in ihrer oxidierten Form als blauer und in ihrer
reduzierten Form als roter Farbstoff vorliegt, der dann fluorimetrisch nachgewiesen
werden kann. Vitale Zellen sorgen durch ihre metabolische Aktivität für ein den
Farbstoff in seine detektierbare reduzierte Form überführendes Milieu.
Die Biokompatibilität der in dieser Arbeit verwendeten Stammzellkapseln wurde in
einer vorausgegangenen Dissertationsarbeit am International Neuroscience Institute
überprüft. Dazu wurden die Mikrokapseln sowohl BDIX/Ztm-Ratten als auch
immundefizienten Ztm:RNU-Ratten intraparenchymal implantiert und nach einem
Untersuchungszeitraum von 8 Wochen sowohl histomorphologisch als auch nach
Explantation der Implantate mittels SYBR Green Vitalitätsfärbung durch den
Hersteller überprüft. Dabei dringt ein fluoreszenzmikroskopisch grün darstellbarer
Farbstoff (SYBR) in die lebenden Zellen ein und die abgestorbenen Zellen stellen
sich durch Propidiumjodid angefärbt rot dar (BARTSCH, 2005).
Endostatinsekretion
Nährstoff diffusion
Sauerstoff diffusion
Abschirmung gegen das Immunsystem
CellBeads® mit Zellcore im Inneren und umgebender Alginatkapsel, die für die
Bestandteile der Empfängerabwehr nicht durchdringbar ist, aber die Ernährung und
Sauerstoffversorgung der Stammzellen mittels Diffusion erlaubt.
Abbildung 5
Nativaufnahme der
verwendeten CellBeads®
Abbildung 6
Schematische Darstellung der Diffusionsverhältnisse in Alginatbeads
587 µm
398 µm
3 Untersuchungsgut und Methoden 45
3.2.2 Verkapselungstechnologie
Die verwendete humane mesenchymale Stammzelllinie wurde durch einen
Gentransfer bei der Firma CellMed AG gentechnisch modifiziert. Um die
Synthetisierung von Endostatin durch die hMSC zu erreichen, wurde die
entsprechende Stammzelllinie mittels Transfektion verändert, indem ein
Plasmidvektor in ihren Zellkern eingeschleust wurde, in den zuvor die entsprechende
Endostatin cDNA kloniert worden war. Diese Einschleusung erfolgte durch eine
modifizierte Elektroporationsmethode, bei der ein elektrisches Feld angelegt wurde,
welches das Plasmid wiederum direkt in den Zellkern einschleuste. Das Verfahren
führte zudem zu einer „sanften“ Immortalisierung der Zellen, die mit einer stark
limitierten Zellteilung verbunden war. Nach Abschluss der Behandlung waren die
verwendeten Zelllinien maximal zu ein bis zwei Zellteilungen fähig. Die Biosicherheit
und Virusfreiheit wurden vom Hersteller getestet.
Die so veränderten Stammzellen und auch die nicht modifizierten hMSC wurden mit
einer Alginatlösung in einem 20 mM BaCl2-Fällbad vertropft. Die Zellzahl betrug
konstant 40 Millionen Zellen pro ml im Core, wobei der Durchmesser des Cores von
409 bis 457 µm und der Gesamtdurchmesser der CellBeads® von 541 bis 612 µm
variierte. Den Leerbeads wurde zur sowohl makroskopisch als auch mikroskopisch
besseren Wiederauffindbarkeit ein Goldanteil von 10% zugegeben. Im Anschluss an
die Verkapselung wurden die fertig gestellten CellBeads® für einen Tag bei +37°C
und 5% CO2 in Kultur genommen und anschließend kryokonserviert. Zur
Versuchsdurchführung wurden die Implantate auf Trockeneis verschickt und im
International Neuroscience Institute aufgetaut.
46 3 Untersuchungsgut und Methoden
3.3 Gliomzelllinie BT4Ca
3.3.1 Herkunft
Die Gliomzelllinie BT4Ca wurde von dem Institut für Zellbiologie (Tumorforschung)
des Universitätsklinikums Essen, Hufelandstraße 55, 45122 Essen generiert
(DEISSLER et al. 1996) und kryokonserviert. Bei dieser Zelllinie handelt es sich um
Glioblastomzellen, die durch die Applikation von Ethylnitroseharnstoff in BDIX/Ztm-
Ratten induziert worden sind. Auf diese Weise wurde eine zum Rattenstamm
syngene Zelllinie erzeugt (DRUCKREY u. LANDSCHUTZ 1971). Die Zellen wurden
bei ca. -70°C auf Trockeneis im Kryoröhrchen versandt und bei Ankunft im
International Neuroscience Institute sofort aufgetaut und kultiviert. Sie wuchsen
überwiegend homogen und hatten eine Generationszeit von durchschnittlich 10
Stunden. Nach ihrer Ankunft im International Neuroscience Institute wurde die
BT4Ca Zelllinie über 3 Passagen von je 5 Tagen kultiviert und vermehrt, um eine
Akklimatisierung an die veränderten Kulturbedingungen zu ermöglichen. Um eine
Zellbank anzulegen, aus der für jeden Versuch immer gleich behandelte
Zellportionen entnommen werden konnten, wurden die Zellen portioniert und in
flüssigem Stickstoff bei ca. -196°C kryokonserviert.
3.3.2 Syngenität
Vom Institut für Versuchstierkunde und dem Zentralen Tierlabor der Medizinischen
Hochschule Hannover wurde die Syngenität der verwendeten Gliomzelllinie zu dem
dort gezüchteten BDIX/Ztm-Rattenstamm anhand eines komplementabhängigen
Zytotoxizitätstestes zusätzlich überprüft. Dabei wurde eine antikörpervermittelte
Zelllyse dann ausgelöst, wenn oligospezifische Antikörper, welche spezifisch auf die
bei der Ratte bekannten MHC-Klasse I und II Komplexe reagieren, banden. Die
Zellmembran wurde dann durch eine komplementabhängige Reaktion zerstört und
zugegebenes Trypanblau, ein Indikatorfarbstoff für abgestorbene Zellen, färbte die
lysierten Zellen an.
3 Untersuchungsgut und Methoden 47
3.4 Versuchsplanung: Experimentelle Gruppen
3.4.1 Etablierung des Models
3.4.1.1 Tumorzellinokulation
Ziel der Versuche war es, die ideale BT4Ca-Zellzahl zur Implantation zu finden, um
ein Tumormodell zu entwickeln, mit dem man einen möglichst immer gleich großen
Tumor nach einer bestimmten Zeit reproduzieren kann. Bei der Verwendung der
BT4Ca Gliomzelllinie, der implantierten Zellzahl, den Implantationskoordinaten und
der Auswahl des Rattenstamms wurde sich an der bestehenden Literatur (READ et
al. 2001, LEHTIMÄKI et al. 2003, GRIFFIN et al. 2003) orientiert (Siehe Kapitel 2.3
Experimentelles Glioblastom-Modell).
Zur Bestimmung der optimalen Tumorzellzahl wurden insgesamt 14 BDIX/Ztm-
Ratten operiert, wobei jeweils 2 Tieren 2 x 103, 4 x 103, 6 x 103 und 8 x 103 BT4Ca-
Zellen injiziert wurden. Nach einem Versuchszeitraum von 12 Tagen wurden die
gewachsenen Tumoren mittels Hämatoxylin-Eosin (H.E.) gefärbter Gefrierschnitte
beurteilt.
Dabei wurde besonderes Augenmerk auf die Tumorausdehnung, deren anatomisch-
topographische Lage und die Vergleichbarkeit der jeweils mit derselben Zellzahl
inokulierten Tumoren gelegt. Zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit der Methodik
wurden anschließend weitere 6 BDIX/Ztm-Ratten, von denen jeweils 3 Tiere 6 x 103
und 3 Tiere 8 x 103 Tumorzellen inokuliert bekamen, histologisch untersucht und
insbesondere die Größe und Ausdehnung mit den vorausgegangenen auf die
Reproduzierbarkeit der Methodik hin verglichen.
48 3 Untersuchungsgut und Methoden
3.4.1.2 CellBead® Implantationen
Ziel war es, reproduzierbare Koordinaten zur intrazerebroventrikulären (i.c.v.)
Applikation der CellBeads® zu ermitteln, die eine intraparenchymale Implantation mit
Kontaktaufnahme zum Ventrikelsystem ermöglichten. Zur Ermittlung der
Implantationskoordinaten und der Implantationstechnik wurden insgesamt 13
BDIX/Ztm-Ratten operiert.
Anhand der bestehenden Literatur wurde in der anterior-posterior (AP) Ausdehnung
von der Kreuzungsstelle der Suturae interfrontalis und sagittalis (Bregma) ausgehend
-1 mm gewählt (READ et al. 2001). Untersucht wurden verschiedene Koordinaten in
der latero-medialen (LM) und in der dorso-ventralen (DV) Ausdehnung jeweils
bezogen auf Bregma. Dabei wurde zum einen unter dem Gesichtspunkt ermittelt,
genau die LM-Koordinate zu finden, bei der der rechte Seitenventrikel gerade
eröffnet wird, die CellBeads® aber noch im zerebralen Parenchym platziert werden
(intrazerebroventrikulär). Zum anderen musste eine Tiefe in der DV-Ausdehnung
gefunden werden, bei der die bis zu 612 µm großen Implantate sicher und
reproduzierbar appliziert waren, ohne wieder aus dem Stichkanal herauszuquellen.
Dazu wurde ein Vorbohren auf eine tiefer liegende Koordinate (einen Millimeter tiefer
als die Applikationskoordinate) erprobt, um Raum für das zu injizierende Volumen zu
schaffen.
3 Untersuchungsgut und Methoden 49
3.4.1.3 Zweizeitige Operation
Es musste eine Methode entwickelt werden, die sowohl die Tumorzellinokulation als
auch die CellBead® Implantation erlaubte, ohne dass es zu einer gegenseitigen
mechanischen Beeinträchtigung durch die Einwirkungen während der Injektionen
kam. Um ein Anwachsen der BT4Ca-Gliomzellen zu ermöglichen und eine nicht
kalkulierbare Verdrängung der Zellsuspension durch die mechanische Einwirkung
der CellBead®-Implantation zu verhindern, wurden die Mikrokapseln einen Tag nach
den Tumorzellen und außerdem weiter medioventral appliziert.
Zur Entwicklung der Methodik wurden 4 BDIX/Ztm-Ratten operiert und die
histologischen Befunde nach einem Versuchszeitraum von 12 Tagen mittels der
Beurteilung Hämatoxylin-Eosin (H.E.) gefärbter Gefrierschnitte mit den Ergebnissen
aus den Untersuchungen zur alleinigen Implantation von CellBeads®
beziehungsweise BT4Ca-Zellen verglichen. Wichtig war hierbei neben der
unveränderten Tumorausdehnung und der korrekten Lage der Implantate in
Kommunikation mit dem rechten Seitenventrikel, die Lage der CellBeads® und des
Glioms zueinander. Dabei sollte ein möglichst geringer Abstand zwischen Tumor und
Mikrokapseln bestehen, um die Wirkstoffapplikation direkt am Zielort zu
gewährleisten.
50 3 Untersuchungsgut und Methoden
3.4.2 Untersuchung der Wirksamkeit des Endostatins
Die Untersuchung der Wirksamkeit von Endostatin sezernierenden,
alginatverkapselten humanen mesenchymalen Stammzellen (EMSC) wurde an 40
BDIX/Ztm-Ratten durchgeführt. Hierzu wurden 4 Versuchsgruppen mit jeweils 10
Tieren unterschieden. Einen Überblick über die Versuchsgruppen verschafft Tabelle
4 auf Seite 52.
Da 1 Tier unter der Operation verstarb, 3 Tiere vor Ablauf des Versuchszeitraumes
aus Tierschutzgründen euthanasiert werden mussten, bei 2 Tieren die CellBead®
Implantation misslang und bei einem weiteren Tier kein Tumor wuchs, wurden die
Daten von insgesamt 33 Tieren ausgewertet.
Die Durchführung und Auswertung der Versuche erfolgte verblindet. Die nach
Abschluss der Studie bekannt gegebene Kodierung der CellBead® Chargen erfolgte
durch die Firma CellMed AG nach folgendem Schlüssel:
leere CellBeads® = Charge CB039
Endostatin sezernierende MSC CellBeads® = Charge CB038
nicht genmodifizierte MSC CellBeads® = Charge CB037
3.4.2.1 Gruppe I: Kontrollgruppe Gliom (BT4Ca)
In der Kontrollgruppe wurden 10 BDIX/Ztm-Ratten die Glioblastomzellen in einer
einmaligen Injektion an Tag 0 implantiert. Aufgrund des Verlustes von 3 Tieren
wurden die Daten von 7 Tieren ausgewertet. Nach einer Versuchsdauer von 12
Tagen wurden die Tumoren histomorphologisch auf ihre Größe, ihre Lage und
Ausdehnung, ihren strukturellen Aufbau, die Morphologie und Dichte ihrer Blutgefäße
und insbesondere die Parallelen zur Pathologie des humanen Glioblastoms hin
untersucht. Die Versuchsergebnisse dieser Tiere dienten außerdem als
Vergleichswerte zu den anderen 3 Versuchsgruppen im Bezug auf die
Tumorvolumina, die Vaskularisierungsdichte und als negativer Vergleich zur
immunhistologischen Darstellung humanen Endostatins bei der behandelten Gruppe.
3 Untersuchungsgut und Methoden 51
3.4.2.2 Gruppe II: Gliom (BT4Ca) und leere CellBeads® (LCB)
Bei den 10 Tieren der Gruppe II wurden neben den Glioblastomzellen leere, nur
Goldpartikel enthaltende CellBeads® (LCB, CB039) intrazerebroventrikulär (i.c.v.)
implantiert. Da bei 1 Ratte die Implantation misslang und 1 Tier vor Abschluss der
Studie euthanasiert wurde, wurden nur 8 Tiere untersucht. Die histologischen und
immunhistologischen Ergebnisse zeigten den Einfluss, den eine Implantation der
Mikrokapseln, das dadurch gesetzte Trauma und die damit einhergehende
Astrozytose auf den im Rattengehirn wachsenden Tumor und seine Angiogenese
hat.
3.4.2.3 Gruppe III: Gliom (BT4Ca) und Endostatin CellBeads® (ECB)
Die Endostatin-Gruppe setzte sich aus 10 Tieren zusammen, denen neben dem
Tumor CellBeads® verabreicht wurden, die Endostatin sezernierende Stammzellen
enthielten (ECB, CB038). Dabei erfolgte die Auswertung im Bezug auf die
Freisetzung von Endostatin in das sie umgebende Gewebe und den Liquor über das
Ventrikelsystem und dessen Wirksamkeit auf die Vaskularisierung und das
Tumorwachstum mittels histologischer und immunhistologischer Untersuchungen.
3.4.2.4 Gruppe IV: Gliom (BT4Ca) und Stammzell CellBeads® (SCB)
Durch die Versuchsergebnisse der Gruppe IV, in der den 10 Versuchstieren
zusätzlich zum Glioblastom CellBeads® mit hMSC verabreicht wurden, die kein
Endostatin-Plasmid enthielten (SCB), sollte die Beeinflussung des Tumors durch die
Anwesenheit von vitalen Stammzellen und ihren Endostatin unabhängigen
Sekretionsproduktion anhand der histologischen und immunhistologischen
Untersuchungen dargestellt werden. 1 Tier verstarb unter der Operation und 1
weiteres wurde auf Grund seines hochgradig gestörten Allgemeinbefindens vor
Ablauf des Untersuchungszeitraumes euthanasiert, so dass auch in dieser Gruppe
nur 8 Ratten zur Untersuchung herangezogen werden konnten.
52 3 Untersuchungsgut und Methoden
Tabelle 4 Übersicht der experimentellen Versuchsgruppen zur
Untersuchung der Wirksamkeit Endostatin sezernierender Stammzellen enthaltender CellBeads®
Operationsverfahren, Stamm und Anzahl der Tiere, verwendete Mikroimplantate,
Untersuchungsparameter nach der Injektion von 8 x 10³ BT4Ca Zellen und 12 Tagen
Versuchsdauer
Operation und
Ratten- stamm Tieranzahl
Implantierte CellBeads®
Untersuchungs- Parameter
Gruppe I Kontrolltiere
Glioblastom
(BT4Ca)
10 (7)
BDIX/Ztm-
Ratten
keine
Tumorvolumen
Tumorvaskularisierung
Endostatinfreisetzung (IHC,
Negativkontrolle)
Histomorphologie des Tumors
Gruppe II Glioblastom
(BT4Ca)
und LCB
10 (8)
BDIX/Ztm-
Ratten
Leerbeads
Tumorvolumen
Tumorvaskularisierung
Endostatinfreisetzung (IHC)
Histologie der
Gewebereaktionen
Gruppe III Glioblastom
(BT4Ca)
und ECB
10
BDIX/Ztm-
Ratten
Endostatin
sezernierende
CellBeads®
Tumorvolumen
Tumorvaskularisierung
Endostatinfreisetzung (IHC)
Histologie der
Gewebereaktionen
Gruppe IV Glioblastom
(BT4Ca)
und SCB
10 (8)
BDIX/Ztm-
Ratten
nicht
sezernierende
Stammzellbeads
Tumorvolumen
Tumorvaskularisierung
Endostatinfreisetzung (IHC)
Histologie der
Gewebereaktionen
3 Untersuchungsgut und Methoden 53
3.5 Versuchsdurchführung
3.5.1 Zellkultur
Alle Arbeiten mit der verwendeten BT4Ca-Gliomzelllinie wurden in einer Sterilbank
(Heraeus Hera Safe, Kendro Laboratory Products GmbH, Hanau, Deutschland)
durchgeführt. Für die durchzuführenden Pipettierschritte wurden eine elektrische
Pipettierhilfe (Pipetus®-Akku, Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt,
Deutschland) und steril verpackte serologische Pipetten (Sarstedt, Nümbrecht,
Deutschland) verwendet. Alle für die Zellkultur verwendeten Materialien und
Substanzen wurden steril verpackt gekauft oder wie zum Beispiel der Phosphatpuffer
vor der Verwendung bei 3 bar und 121 +/-1°C für 20 Minuten autoklaviert (CertoClav,
Sterilizer GmbH, Traun, Österreich). Mit Gliomzellen verunreinigter Abfall und
Verbrauchsmaterialien wurden ebenfalls vor der Entsorgung oder
Wiederverwendung autoklaviert. Zu entsorgende Flüssigkeiten wurden mit einer aus
Pasteurpipette, Schlauch und Pumpe bestehenden Absaugvorrichtung in eine
Autoklavierflasche abgesaugt und vor der Entsorgung autoklaviert. Vor Arbeitsbeginn
wurden alle benötigten Gerätschaften sowie das Innere der Zellkulturbank mit einem
Schnelldesinfektionsspray (Deso Med Rapid AF, Desomed AG, Freiburg) behandelt.
Für die BT4Ca-Zellen benötigte Flüssigkeiten wie zum Beispiel das Kulturmedium,
Phosphatpuffer oder Trypsin wurden vor der Verwendung im Wasserbad
(Wasserbad GFL 1008, GFL, Burgwedel, Deutschland) auf 37°C erwärmt.
54 3 Untersuchungsgut und Methoden
3.5.1.1 Kultivierung der Gliomzellen
Das für die Kultivierung der BT4Ca-Zellen verwendete Kulturmedium wurde aus der
einen pH-Indikator enthaltenden Mediumgrundlage Dulbecco's Modified Eagle
Medium (DMEM high Glucose, PAA Laboratories GmbH, Cölbe, Deutschland),
welcher Penicillin- Streptomycin (PAA Laboratories), Natriumpyruvat (PAA
Laboratories), Fetales Kälberserum (PAA Laboratories) und L-Glutamin (PAA
Laboratories) zugesetzt wurden, hergestellt. Die Rezeptur ist im Anhang einzusehen.
Die Kultivierung erfolgte im Brutschrank (NAPCO Series 5400 Co2-Incubator,
Labotect GmbH, Göttingen, Deutschland) bei 37°C und 5% CO2- Begasung. Um die
idealen Einsaatdichten zu ermitteln, wurden zunächst verschiedene Zellzahlen in
jeweils 15 ml Medium in 75 cm2- Gewebekulturflaschen (Greiner BIO-ONE,
Frickenhausen, Deutschland) eingesät und bei einer Bewuchsdichte zwischen 70
und 90% subkultiviert. Um die Zellen zu subkultivieren, wurde zunächst das in der
Flasche befindliche Kulturmedium mittels Absaugvorrichtung abgesaugt und der
Zellrasen mit ca. 6 ml sterilem PBS (Phosphate Buffered Saline, Code No.S302430,
DakoCytomation GmbH, Hamburg, Deutschland) gespült. Im Anschluss wurden 3 ml
Trypsin (PAA Laboratories) hinzugegeben, um die adhärent auf dem Flaschenboden
wachsenden Zellen abzulösen. Nach 2 Minuten wurde die Trypsinreaktion durch
Zugabe von 7 ml Kulturmedium abgestoppt und die Zellsuspension aus der
Gewebekulturflasche in ein 15 ml Polypropylen (PP) -Röhrchen (Greiner-BioOne)
überführt. Die Zellsuspension wurde anschließend bei 133 G zentrifugiert (Megafuge
1.OR, Kendro Labaratory Products GmbH, Hanau, Deutschland) und nach dem
Absaugen des Überstandes das Gliomzellpellet in 4 ml Kulturmedium resuspendiert.
Anschließend wurde die Lebendzellzahl mittels Vitalzählung (siehe Kapitel 3.5.1.4)
bestimmt. Das Suspensionsvolumen, das rechnerisch 6 x 105 Zellen enthielt wurde
mit 15 ml Medium in eine sterile Gewebekulturflasche pipettiert und in den
Brutschrank verbracht. Am Tag nach der Einsaat und weiter an jedem zweiten Tag
wurde das alte Kulturmedium abgesaugt, der Zellrasen mit etwa 5 ml sterilem PBS
gespült und frisches Kulturmedium aufpipettiert.
3 Untersuchungsgut und Methoden 55
Der Grad der Konfluenz, die Zellmorphologie und -homogenität, die Gleichmäßigkeit
des Bewuchses und Farbe sowie Trübung des Mediums wurden täglich mittels
Inversmikroskop (Inversmikroskop Leica DM IRB, Leica, Bensheim, Deutschland)
beurteilt und protokolliert.
3.5.1.2 Kryokonservierung der Gliomzellen
Die BT4Ca-Zellen wurden nach ihrer Ankunft im International Neuroscience Institute
(INI GmbH, Hannover) zunächst vermehrt und an die Kulturbedingungen adaptiert.
Dann wurde eine Zellbank angelegt und kryokonserviert, um immer gleiches
Ausgangsmaterial verwenden zu können. Dazu wurden die Zellen aus einer 75 cm2
Gewebekulturflasche mittels Trypsin herausgelöst, gezählt und abzentrifugiert, in
Einfriermedium resuspendiert und in 2 ml Kryoröhrchen mit Außengewinde
(Nalgene®Kryoröhrchen, Nalge) portioniert. Das verwendete Einfriermedium bestand
aus 10% DMSO (Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) und 90%
fetalem Kälberserum (PAA Laboratories). Ab dem Moment, in dem die Zellen in
Einfriermedium suspendiert waren, wurde zügig gearbeitet, da das DMSO bei
Raumtemperatur die Zellmembranen schädigt. Die Aufnahme des zuvor
ausgezählten Zellpellets in Einfriermedium erfolgte so, dass rechnerisch eine
Suspension mit einer Dichte von 106 BT4Ca-Zellen in 1,8 ml entstand. Anschließend
wurden jeweils 1,8 ml der Suspension in ein Kryoröhrchen pipettiert und dieses
verschlossen. Jeweils 18 gefüllte Kryoröhrchen wurden in einem Einfriergerät
(Behälter Qualifreeze PC Mr. Frosty, Omnilab, Bremen, Deutschland), in dem die
Röhrchen reguliert durch eine Isolierung mit 100%igem Isopropanol um genau -1°C/
Minute abgekühlt wurden, in eine -80°C Gefriertruhe (National Lab GmbH, Mölln,
Deutschland) gebracht. Die Zellen verblieben über Nacht bei -80°C und wurden am
nächsten Tag in einen Stickstofftank (Air Liquide Deutschland GmbH, Bremen,
Deutschland) überführt. Hier lagerten sie in der gasförmigen Phase über dem
flüssigen Stickstoff (Air Liquide) bei ca. -196°C bis zur weiteren Verwendung.
56 3 Untersuchungsgut und Methoden
3.5.1.3 Auftauen der Gliomzellen
Die kryokonservierten Zellportionen wurden zur weiteren Verwendung aus dem
Stickstofftank entnommen und im Wasserbad (Wasserbad GFL 1008, GFL) bei 37°C
aufgetaut. Anschließend wurden sie zügig in ein 15 ml PP-Röhrchen, mit 10 ml
Kulturmedium überführt, um das bei Raumtemperatur die Zellmembranen
schädigende Einfriermedium zu verdünnen. Während des Auftauvorgangs wurden
die Kryoröhrchen mehrfach vorsichtig kurz aufgedreht, um bei dem extremen
Temperaturwechsel einen Druckausgleich zu gewährleisten und ein Explodieren des
Röhrchens zu verhindern. Anschließend wurde die mit Kulturmedium verdünnte
Suspension sofort bei 133 G für 5 Minuten zentrifugiert und der Überstand
abgesaugt. Das im PP-Röhrchen verbliebene Zellpellet wurde anschließend in 4 ml
Kulturmedium resuspendiert und die Lebendzellzahl mittels Trypanblaufärbung
lichtmikroskopisch bestimmt (siehe Kapitel 3.5.1.4). Die Einsaat erfolgte
entsprechend der ermittelten optimalen Einsaatdichten in 75 cm2
Gewebekulturflaschen mit 15 ml Kulturmedium.
3.5.1.4 Vitalzellzählung
Die Zählung der BT4Ca-Gliomzellen erfolgte als Lebendzellzahlbestimmung mittels
Trypanblau (Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Deutschland). Das Zellpellet wurde nach
dem Zentrifugieren (133 G, 5 Min.) und dem Absaugen des Überstandes in einer
definierten Menge PBS oder Kulturmedium resuspendiert. Anschließend wurden
10 µl Zellsuspension in ein Eppendorfgefäß (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland)
überführt und mit 10 µl Trypanblau resuspendiert. Trypanblau dringt durch die
lysierten Zellmembranen abgestorbener Zellen ein und färbt diese blau an. 10 µl
dieser Mischung wiederum wurden unter das Deckgläschen einer Neubauer-
Zählkammer (Omnilab-Laborzentrum, Bremen, Deutschland) pipettiert. Unter dem
Inversmikroskop (Leica DM IRB) wurden anschließend die vitalen nicht blau
angefärbten Zellen in allen vier großen Feldern der Zählkammer ausgezählt.
3 Untersuchungsgut und Methoden 57
Die Berechnung der Zellzahlen pro Kulturflasche und des Volumens an Suspension,
dass die gewünschte Zellzahl enthält, erfolgte nach folgenden Formeln:
Zellzahl (ZZ)= ( ) [ ]2
lVdcba µ×+++ Vol. [ ]lµ = [ ]ZZ
lVz µ×
ZZ = Zellzahl insgesamt pro Flasche
V[µl] = Volumen, in dem das Zellpellet resuspendiert wurde, in µl
Vol. [µl] = gesuchtes Volumen, das z enthält, in µl
z = gewünschte Zellzahl
a, b, c, d = Zählergebnisse der 4 ausgezählten Quadrate
Alle Zellzählungen und Berechnungen wurden protokolliert. Das verwendete
Protokoll ist im Anhang einzusehen.
3.5.2 Behandlung der Gliomzellen vor der Implantation
Für die Tumorzellimplantationen wurden jeweils zwei Zellportionen aus der
angelegten Zellbank entnommen, aufgetaut und jeweils über den gleichen Zeitraum
mit der gleichen Einsaatdichte und unter den gleichen Bedingungen kultiviert. Den
Untersuchungen zu den optimalen Einsaatdichten folgend wurden 6 x 105 BT4Ca-
Zellen in eine 75 cm2 Gewebekulturflasche eingesät (Tag 0). An Tag 3 nach der
Einsaat wurden die Zellen subkultiviert und erneut 6 x 105 Zellen in jeweils 6
Gewebekulturflaschen eingesät. Jeweils an Tag 1 nach der Einsaat wurde ein
Mediumwechsel durchgeführt und an Tag 3 nach dem Subkultivieren wurden die
Zellen bei einer Konfluenz von mindestens 70% zur Operation verwendet.
Nach dem Herauslösen aus den Zellkulturflaschen mittels Trypsin und dem
Abzentrifugieren wurden die Zellen in 4 ml sterilem PBS (DakoCytomation)
resuspendiert. Anschließend wurde mittels Trypanblaufärbung die Vitalzellzahl
bestimmt und protokolliert.
58 3 Untersuchungsgut und Methoden
Rechnerisch wurde die Menge PBS ermittelt, in der die Gesamtzellzahl
aufgenommen werden musste, um eine Zelldichte von 8 x 103 Zellen in 3 µl PBS zu
erhalten. Im Anschluss wurden die Zellen erneut abzentrifugiert und in der
errechneten Menge sterilem PBS resuspendiert. Durch das zweimalige
Abzentrifugieren und die Wiederaufnahme in sterilem PBS wurden immunogene
Mediumreste, entfernt. Die so für die Operation vorbereitete Zellsuspension wurde im
verschlossenen PP-Röhrchen in der Sterilbank stehend gelagert.
3.5.2.1 Untersuchung der Zellvitalität bei Lagerung in PBS
Während der Operationsdurchführung waren die Tumorzellen in sterilem PBS
suspendiert und standen bei Raumtemperatur in einem verschlossenen 15 ml PP-
Röhrchen in der Sterilbank. Da hierbei von verschlechterten Bedingungen gegenüber
der Lagerung in Zellkulturmedium bei Brutschrankbedingungen (37°C, 5% CO2)
ausgegangen werden musste, wurde eine Vitalzellzahlbestimmung über einen
Zeitraum von insgesamt 9 Stunden durchgeführt.
Die in einer definierten Dichte von 8 x 10³ Zellen pro 3µl PBS vorliegende
Zellsuspension wurde nach jeweils einer halben Stunde erneut resuspendiert, 10 ml
entnommen und mittels Trypanblaufärbung eine Vitalzellzahlbestimmung
durchgeführt (siehe Kapitel 3.5.1.4). Auf diese Weise wurde der Zeitraum ermittelt,
nach dem die Lebendzellzahl in der PBS Suspension bei Raumtemperatur um mehr
als 10% abgenommen hatte.
Bei der CellMed AG (Alzenau; Deutschland) wurde des Weiteren eine
Vitalzellzahlbestimmung mittels Cell-Counter (CASY®, cell counter and analysis
system, Schärfe System GmbH, Reutlingen, Deutschland) durchgeführt. Das
Verfahren ermöglicht eine Unterscheidung der vitalen, intakten Zellpopulation (8-25
µm) und einer membrangeschädigten, sterbenden Zellpopulation (2-8 µm).
3 Untersuchungsgut und Methoden 59
Dazu wurden die BT4Ca-Zellen nach Kultivierung über 2 mal 48 Stunden in sterilen
Phosphatpuffer aufgenommen und nach zweimaligem Abzentrifugieren jeweils 10 ml
PBS-Zellsuspension in zwei 15 ml PP-Röhrchen (Greiner BIO-One) überführt.
Zum Zeitpunkt 0h, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 7.5h, 9h wurde mittels CASY® Messung die
Zellfraktion der intakten, vitalen Zellen (8-30 µm) bestimmt.
Die Ergebnisse wurden auch hier durch eine Vitalitätsfärbung und Lebendzellzählung
verifiziert. Da die Vitalität von Zellen in PBS durch ein Absenken des
Zellstoffwechsels begünstigt werden kann, wurden die Lagerung und
Vitalitätsuntersuchung nicht nur bei Raumtemperatur, sondern auch bei 4°C im
Kühlschrank durchgeführt.
3.5.3 Behandlung der CellBeads® vor der Implantation
Die CellBeads® wurden von der Firma CellMed AG jeweils am Tag der Operationen
oder einen Tag vorher als Kryokonservate auf Trockeneis bei ca. -70°C verschickt
und kurz vor der OP im International Neuroscience Institute aufgetaut.
Eine Stunde vor Beginn der Arbeiten wurde die Sterilbank (Telstar AH-100, Labotect,
Göttingen, Deutschland) in Betrieb genommen und für die Implantationen vorbereitet.
Nach der Reinigung und Desinfektion (Deso Med Rapid AF, Desomed AG, Freiburg,
Deutschland) der Werkbank wurden die CellBeads® aus dem Kulturmedium in ein
engmaschiges Nylon-Siebchen (100 µm Maschenweite, BD Falcon, Bioscience,
USA) überführt und mehrfach mit ca. 30 ml sterilisiertem Phosphatpuffer (PBS, 0,1
M, pH 7,4) gespült, um mögliche Fremdkörperreaktionen durch Bestandteile des
Kulturmediums wie zum Beispiel hoch immunogenes fetales Kälberserum zu
vermeiden. Dann wurde das Siebchen mit den Implantaten in die Vertiefung einer
Zellkulturplatte (6er well-plate, Greiner BIO-ONE) gehängt, welches so hoch mit
sterilem PBS befüllt war, dass die CellBeads® gerade mit Flüssigkeit bedeckt waren.
60 3 Untersuchungsgut und Methoden
Anschließend wurden ca. 20 Mikrokapseln unter Sichtkontrolle (Mikroskop Zeiss NC
32, Carl Zeiss, Jena, Deutschland) mit einer 1 ml Insulinspritze (Dispomed Witt oHG,
Geinhausen, Deutschland), auf die eine stumpfe Hamiltonkanüle (ga 18, Länge 51
mm, pst: AS, tap-, Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz, Schweiz) aufgesetzt war, aus
dem Sieb entnommen und in eine sterile Petrischale (Greiner BIO-ONE) gegeben.
Mit der Insulinspritze wurden überflüssige Beads und Flüssigkeit unter
mikroskopischer Sichtkontrolle wieder entfernt. 12 CellBeads® wurden anschließend
mit einer 10 Mikroliterspritze (Hamilton) und einer scharfen, schräg angeschliffenen
Kanüle (ga 19, Länge 15 mm, pst:4, tap:Y, Hamilton) aufgenommen und zur
Implantation bereitgehalten.
Das Siebchen mit den übrigen Implantaten wurde anschließend in eine Vertiefung
der Zellkulturplatte überführt, die mit Kulturmedium befüllt war, um ein Aufquellen der
Implantate in PBS zu vermeiden.
3.5.4 Stereotaktische Implantationstechnik
Die Operationen erfolgten mittels eines stereotaktischen, mikrochirurgischen
Verfahrens unter lichtmikroskopischer Sichtkontrolle (Mikroskop NC Varioskop, Carl
Zeiss) an zwei aufeinander folgenden Tagen.
Die Gliomzelllinie wurde am ersten Tag (Tag 0) inokuliert und die Implantation der
CellBeads® erfolgte am Tag darauf (Tag 1).
Die Tiere wurden vor den Operationen gewogen und gekennzeichnet und alle Daten
einschließlich der Narkose, der Operationsdauer, den Koordinaten und den erfolgten
Implantationen wurden protokolliert. Das Operationsprotokoll ist im Anhang
aufgeführt. Das Operationsfeld auf der Schädeloberseite wurde auf einer Fläche von
etwa 2 x 2 cm rasiert, gereinigt, entfettet und desinfiziert (Cutasept®, BODE Chemie
GmbH & Co., Hamburg, Deutschland).
3 Untersuchungsgut und Methoden 61
Auf die Bulbi occuli wurde zum Schutz vor Austrocknung während der Dauer der
Narkose eine Augensalbe (Vidisic, Augengel, Bausch & Lomb GmbH, Berlin,
Deutschland) aufgebracht.
Vor der Fixierung der Tiere in dem Stereotakten (SAS 4120, ASI Instruments,
Warren, USA) wurde Interaural 0 (IA0) bestimmt, um anhand anatomischer
Richttoleranzwerte die Orientierung an Bregma als Überprüfungspunkt möglich zu
machen. Dazu wurde die am beweglichen Seitenarm des Stereotakten angebrachte
Operationsnadel genau zwischen die beiden mittig eingestellten Ohrbalken gebracht
und die Koordinaten abgelesen. Anschließend wurde die Ratte im Stereotakten
fixiert. Anhand der Millimeterskalen wurden die Ohrbalken dabei so eingestellt, dass
das Tier genau in der Mitte fixiert war. Mit der Schnauzenklemme (incisor bar) wurde
die Schädeldecke so horizontal ausgerichtet, dass Lamda und Bregma nach
stereotaktischer Koordinatenermittlung auf derselben Höhe lagen. Vor Beginn des
Eingriffs erfolgte eine erneute Desinfektion des Operationsfeldes (Cutasept®). Die
benötigten, zuvor mit 70%igem Ethanol gereinigten Instrumente wurden für 20
Sekunden in ein Schnellsterilisiergerät (FST Fine Science Tools, Heidelberg,
Deutschland) gebracht. Mit einem Einmalskalpell (Carl Roth GmbH + Co. KG,
Karlsruhe, Deutschland) wurde eine sagittale Hautinzision auf einer Länge von etwa
einem Zentimeter zur Präparation des Operationsgebietes vorgenommen. Das
Periost wurde daraufhin mehrmals geschlitzt und mit einem Rasparatorium
(Dewimed Medizintechnik, Tuttlingen, Deutschland) zur Seite geschoben. Mit einem
Wattestäbchen wurde 3%ige Wasserstoffperoxidlösung aufgebracht, um die
Knochennähte, insbesondere die Suturae interfrontalis und sagittalis, zu bleichen
und besser sichtbar zu machen. Im Anschluss daran wurden die Koordinaten von
Bregma mit der am Seitenarm befestigten Operationsnadel angefahren, abgelesen
und mittels Differenzbestimmung zu IA0 kontrolliert und protokolliert. Von Bregma
aus 1 mm nach posterior und 2,8 mm sowie 3,4 mm nach rechts lateral wurden die
beiden Lokalisationen für die Bohrlochtrepanationen angesteuert und mit einem
dünnen Filzstift markiert. Einen schematischen Überblick über die
Implantationskoordinaten gibt die Abbildung 8 auf Seite 65.
62 3 Untersuchungsgut und Methoden
Die Trepanationen erfolgten mittels eines 2,1 mm Bohrkopfes (FST Fine Science
Tools) und eines Handbohrers (Proxxon Minimot 40/E, Proxxon GmbH, Niersbach,
Deutschland) unter Schonung der Dura Mater. Der Bohrkopf wurde jeweils direkt auf
den Markierungen angesetzt, so dass zwei ineinander übergehende Bohrlöcher
entstanden, deren Zentren jeweils der Koordinate für die Implantation der
Gliomzellen (LM -2,8mm) und für die der CellBeads® (LM –3,4mm) entsprachen.
Anschließend wurde die Dura Mater mit einer scharfen Kanüle geschlitzt und Reste
und Knochenkanten mit einer feinen Pinzette (Dewimed Medizintechnik) entfernt, um
ein Verlegen der Implantationskanüle zu vermeiden. Direkt im Anschluss wurden die
Tumorzellen implantiert und am darauf folgenden Tag die CellBeads®.
3.5.4.1 Stereotaktische Implantation der Gliomzellen
Die in einem 15 ml PP-Röhrchen mit einer Zelldichte von 8 x 103 Zellen in 3µl zuvor
unter der Sterilbank (Heraeus Hera Safe, Kendro Laboratory Products GmbH,
Hanau, Deutschland) bereitgestellte BT4Ca Zellsuspension wurde zunächst mittels
einer serologischen 2 ml Pipette (Sarstedt) gründlich resuspendiert. Vor der
Verwendung wurde eine 10 Mikroliterspritze (Hamilton) mit einer scharf
angeschliffenen Implantationskanüle (ga 19, Länge 15 mm, pst: 4, tap: Y, Hamilton)
mehrfach mit 70%igem Ethanol gespült und, nachdem diese getrocknet waren,
mehrfach mit sterilem Phosphatpuffer (PBS, 0,1 M, pH 7,4) nachgespült. Dabei
wurde darauf geachtet, dass der Totraum in der so vorbereiteten Spritze mit einer
Luftblasen freien Flüssigkeitssäule gefüllt war. Anschließend wurden mit der
Mikroliterspritze 3 µl (= 8 x 103 Zellen) Suspension aufgezogen und diese an dem
beweglichen Arm des Stereotakten so fixiert, dass die Schräge des
Kanülenanschliffs zum Operateur zeigte. Die Kanüle wurde in das Bohrloch gefahren
und von der Schädeloberfläche ausgehend 5 mm abgesenkt. Nach einer
Verweildauer von ca. 10 Sekunden wurde die Kanüle wieder um einen Millimeter auf
DV -4 mm angehoben und die Zellsuspension zügig abgesetzt.
3 Untersuchungsgut und Methoden 63
Nach weiteren 20 Sekunden wurde die Kanüle aus dem Bohrloch gezogen und die
Spritze mehrfach mit sterilem PBS gespült.
Anschließend wurde die Hautwunde mit etwa 4 Einzelheften mit nicht resorbierbarem
Nahtmaterial (Ethilon 4/0, Tierärztebedarf J. Lehnecke GmbH, Schortens,
Deutschland) über den nicht separat verschlossenen Trepanationsstellen vernäht.
Die restliche Zellsuspension wurde vor jeder weiteren Entnahme gründlich
resuspendiert.
Aufgrund der Ergebnisse aus der Vitalzellzahlbestimmung bei Lagerung in PBS
(siehe Kapitel 3.5.2.1 Bestimmung der Vitalzellzahl in Phosphatpuffer zur Operation)
wurde die Zellsuspension während der Dauer der Operationen alle drei Stunden
durch Zellen aus einer neuen Zellkulturflasche aus dem Brutschrank ersetzt.
3.5.4.2 Stereotaktische Implantation der CellBeads®
Am Tag nach der Injektion der BT4Ca-Gliomzellen wurde die Ratte zur Implantation
der CellBeads® erneut mit Ketamin (Ketanest®, Pfizer) und Medetomidin (Domitor®,
Pfizer) narkotisiert und im Stereotakten fixiert. Die Wunde und ihre Umgebung
wurden erneut gereinigt und desinfiziert (Cutasept®), auf die Augen wurde wieder
Salbe (Vidisic) als Tränenersatz aufgebracht. Im Anschluss wurden ein oder zwei der
die Hautwunde verschließenden Einzelhefte wieder geöffnet, so dass ein Zugang zur
medial gelegenen Bohrlochtrepanation möglich war, die Fäden entfernt und die
Wundflächen mit einer feinen Schere (Dewimed Medizintechnik) aufgefrischt. Die
mediale Trepanation verschließende Fibrosierungen wurden mit einer feinen Pinzette
vorsichtig entfernt und die Gehirnoberfläche an der für die Mikrokapseln
vorgesehenen Implantationskoordinate erneut freigelegt. Dabei wurde darauf
geachtet, Gewebszubildungen, die das für die Gliomzellinokulation verwendete
laterale Bohrloch verschlossen, zu schonen.
64 3 Untersuchungsgut und Methoden
Die wie in Kapitel 3.5.3 beschrieben vorbereitete Mikroliterspritze mit den 12
CellBeads® wurde in den steuerbaren Arm des Stereotakten eingespannt und in das
mediale Bohrloch an der Koordinate AP -1 mm, LM -2,8 mm zu Bregma gefahren.
Anschließend wurde die Kanülenspitze von der Schädeldecke ausgehend um 6 mm
abgesenkt, etwa 10 Sekunden gewartet und dann auf DV -5mm wieder
hochgefahren. Die CellBeads® wurden dann im Schuss abgesetzt und die
Mikroliterspritze nach einer Verweildauer von etwa 20 Sekunden wieder entfernt.
Dabei wurden eventuell aus dem Stichkanal wieder hervorquellende CellBeads®
registriert, gezählt und protokolliert.
Im Anschluss an die Implantationen wurde der Stempel aus der verwendeten
Mikroliterspritze herausgezogen und diese mittels einer aufgesetzten Insulinspritze
mit sterilem PBS gespült. Die Spülflüssigkeit wurde in einer sauberen Petrischale
aufgefangen, um eventuell in der Spritze oder der Kanüle verbliebenen Restinhalt
mikroskopisch zu begutachten und zu protokollieren. Somit war eine kontrollierte
Aussage über die tatsächlich implantierte Anzahl CellBeads® möglich und mit der
später histologisch aufgefundenen Anzahl vergleichbar. Nach Abschluss des
Eingriffs wurde die aufgefrischte Hautwunde erneut durch Einzelhefte mit nicht
resorbierbarem Nahtmaterial (Ethilon 4/0) verschlossen.
3 Untersuchungsgut und Methoden 65
Bregma
DV – 4 mm
DV – 5 mm
LM –3,4 mm
LM – 2,8 mm
AP – 1 mm
Gliom
CB
modifiziert nach PAXINOS (1998)
Abbildung 7 Operationsfeld mit Abbildung 8 Schematische Implantationskanüle Darstellung der
Implantationskoordinaten
Suturae interfrontalis und sagittalis, Grün: Tumorbereich, und BT4Ca
die sich in Bregma kreuzen, Bohrloch Inokulation
und abgesenkte Implantationskanüle Rosa: Bereich in dem die CB
aufzufinden sind und CB Implantation
3.6 Neuropathologische Untersuchungen
Die histopathologischen Untersuchungen der Gehirne fanden bei den Tieren, die zur
Ermittlung der idealen Implantationskoordinaten untersucht wurden, nach einem
Versuchszeitraum von 2 Tagen, bei allen anderen Tieren nach Tag 12 statt. Hierzu
wurden die Gehirne fixiert, entnommen, geschnitten, gefärbt und histologisch
untersucht.
66 3 Untersuchungsgut und Methoden
3.6.1 Transkardiale Perfusionsfixierung
Nach Ablauf der Versuchszeiträume wurden die Rattengehirne mittels transkardialer
Paraformalin-Perfusion fixiert. Hierzu wurden die Tiere erneut mittels
intraperitonealer Ketanest® (Ketamin, Pfizer) und Domitor® (Medetomidin, Pfizer)
Injektion tief narkotisiert und anschließend in Rückenlage auf einer Korkunterlage
fixiert. Dabei wurde auf eine stabile Kreislaufsituation geachtet. Mit einer Schere
wurde zunächst eine Laparotomie und im Anschluss die Eröffnung des Thorax
durchgeführt, wobei rechts und links die Rippen durchtrennt wurden. Das Sternum
mit den Rippen wurde nach kranial vorverlagert und fixiert. Danach erfolgte eine
vorsichtige Präparation und Entfernung des Herzbeutels. Eine Knopfkanüle (1,6 ml,
GE Medical Systems, Garbsen, Deutschland) wurde nach Perforation des linken
Ventrikels in der Herzspitze vorgeschoben, bis sie an der Herzbasis gerade in der
Aorta sichtbar wurde, und mit einer Arterienklemme in ihrer Lage fixiert. Mit einem
Scherenschlag wurde das rechte Herzohr eröffnet, um so das Abfließen des Blutes
und der nachströmenden Flüssigkeiten zu ermöglichen. Der Perfusionsdruck lag
etwas über der Höhe des Blutdruckes der Ratte und wurde an den angeschlossenen
Infusionsflaschen reguliert.
An ein durch einen Wechselschalter verbundenes Infusionsbesteck waren eine
Infusionsflasche mit 0,9%iger Kochsalzlösung und eine mit durch Phosphatpuffer
(0,01 M, pH 7,4) frisch depolymerisiertem 4%igem Paraformaldehyd (PFA, Sigma-
Aldrich Chemie GmbH, München, Deutschland) angeschlossen. Alle Lösungen
wurden bei Raumtemperatur verwendet. Zunächst wurden die Schläuche geöffnet
bis keine Luftblasen mehr im System waren.
Dann wurde zunächst Kochsalzlösung durch die Knopfkanüle in die Ratte infundiert,
bis die abfließende Flüssigkeit klar und die Leber deutlich entblutet war (ca. 150 ml),
um eine Koagulation des Blutes im Gehirn und störende Effekte durch Erythrozyten
bei nachfolgenden Färbungen zu verhindern. Durch Umlegen des Wechselschalters
wurde dann auf die Perfusion mit Paraformaldehyd umgeschaltet.
3 Untersuchungsgut und Methoden 67
Die fixierende Infusion der 4%igen Paraformaldehydlösung (PFA) erfolgte in einer
Menge von etwas mehr als 1 ml Lösung pro Gramm Körpergewicht (durchschnittlich
300 ml). Nach abgeschlossener Perfusionsfixierung wurde der Kopf abgesetzt und
der Schädel frei präpariert. Mit einer Hohlmeißelzange (Dewimed Medizintechnik)
wurde die Schädeldecke von Kaudal her abgetragen bis das gesamte Gehirn frei lag.
Mit einer feinen Schere wurden die Gehirnhäute und die Kopfnerven durchtrennt, das
Gehirn in toto entnommen und in ein mit 4%iger PFA-Lösung befülltes
Schraubgläschen überführt.
3.6.2 Nachfixierung
Die entnommenen Gehirne wurden zwei Tage lang in 4%igem PFA im Kühlschrank
bei 4°C nachfixiert. Anschließend wurden die Gehirne zweimal mit Phosphatpuffer
(0,1 M, pH 7,4) gewaschen und zur Kryoprotektion in ein Schraubgläschen mit
30%iger Sucroselösung (30 g Sucrose, Sigma-Aldrich und 70 g PBS 0,01 M, pH 7,4)
überführt. Hier verblieben die Gehirne bis zu ihrem Absinken, um die Bildung von
Eiskristallen bei der folgenden Schockgefrierung zu vermeiden.
3.6.3 Kryobehandlung
Die nach der transkardialen Perfusionsfixierung entnommenen nachfixierten und mit
Sucroselösung vorbehandelten Gehirne wurden in einer Aluminiumform
schockgefroren. Ein Gefäß mit 2-Methylbutan (Carl Roth) als Intermedium wurde
hierzu in flüssigen Stickstoff gehängt und die durch die Aluminiumform geschützten
Gehirne für maximal 5 Minuten darin schockgefroren. Anschließend wurden die
Gehirne bei -20°C (Economic no Frost, Robert Bosch GmbH, Stuttgart, Deutschland)
aufbewahrt.
68 3 Untersuchungsgut und Methoden
3.6.4 Gefrierschnitte
Die Gefrierserienschnitte wurden mit einem Kryostaten (Gefriermikrotom, Microm HM
560 Cryo-Star, MICROM International GmbH, Walldorf, Deutschland) angefertigt und
auf beschichtete Objektträger (SuperFrost®Plus, Menzel, Braunschweig,
Deutschland) aufgezogen. Zunächst wurden die eingefrorenen Gehirne mit Hilfe
eines Einbettungsmediums für Gefrierschnitte (Tissue-Tek®, Sakura Fine Tek Europe
B.V., Zoeterwoude, Niederlande) auf dem Objekttisch aufgefroren und eingebettet.
Besonderes Augenmerk wurde hierbei auf die sichere Fixierung der Tumoren gelegt.
Im Anschluss wurden bei einer Objekttemperatur von -21°C Gefrierschnitte mit einer
Dicke von 10 µm angefertigt, diese mit einem feinen Pinsel ausgerichtet und auf die
Objektträger gebracht. Die Gefrierschnitte trockneten anschließend 24 Stunden bei
Raumtemperatur und wurden dann bei -20°C (Economic no Frost, Bosch) gelagert.
Im Rahmen der Etablierung des Versuchsmodells wurde jeweils jeder dritte
Gewebeschnitt alternierend auf einen Objektträger aufgezogen. Auf jeden
Objektträger kamen 6 Schnitte, so dass jeder der insgesamt 20 Objektträger pro Tier
einen Überblick über das ganze Gehirn darstellte. Es wurde der Bereich 0,5 mm bis
3 mm posterior zu Bregma untersucht. Die Orientierung erfolgte hierbei anhand des
anatomischen Atlanten von PAXINOS, G. u. C. WATSON (1998) über die
Neuroanatomie des Rattengehirns.
Um mit den histologischen Befunden für die Wirksamkeitsstudie im Hinblick auf
Tumorvolumen und –vaskularisierung reproduzierbare morphometrische
Berechnungen durchführen zu können, war es erforderlich, regelmäßige und
repräsentative Schnitte durch die Tumoren zu erhalten. Daher wurde folgendes
System für die Aufnahme der Gewebeschnitte entwickelt:
Immer 12 Schnitte à 10 µm machten einen Takt aus (120 µm). Immer zwei
aufeinander folgende Schnitte wurden zusammen aufgenommen, um einen
Referenzschnitt zu haben. So ergaben sich 6 Proben in einem Takt. Jeweils zwei
dieser Proben waren für eine Färbung geplant, um zur Kontrolle eine B-Probe zur
Verfügung zu haben.
3 Untersuchungsgut und Methoden 69
Daraus folgten jeweils 3 A- und B- Proben für die drei geplanten Färbungen je Takt.
Die zur selben Färbung und A- oder B-Probe gehörenden Gewebeschnitte zweier
Takte wurden auf einem Objektträger aufgenommen, so dass auf jedem Objektträger
4 Schnitte waren und für 2 aufgenommene Takte à 24 Gewebeschnitte 6
Objektträger benötigt wurden. Einen Überblick über die Systematik gibt die
schematische Darstellung in Abbildung 9. Mit der Aufnahme der Schnitte wurde bei
lichtmikroskopisch (Olympus BX51 Hellfeldmikroskop, Olympus, Hamburg,
Deutschland) kontrolliertem Tumoranfang begonnen und bis zum Tumorende
fortgefahren. Konnten auf Grund der Größe eines Tumors nicht alle Schnitte
aufgenommen werden, so wurde immer ein ganzer oder mehrere ganze Takte
verworfen, um die Systematik einzuhalten und für die Auswertung repräsentative
Querschnitte durch die Gehirne beziehungsweise die Tumoren zu garantieren. Vor
Beginn des Schneidens wurde die makroskopisch erkennbare rostrokaudale
Tumorausdehnung mit einer Schieblehre bestimmt und danach entschieden, der
wievielte Takt jeweils aufgenommen beziehungsweise wie viele zwischen den
aufgenommenen Schnitten verworfen wurden. Das Protokoll der
Gefrierschneidetechnik ist im Anhang aufgeführt.
1 13
2 14
3 15
4 16
5 17
6 18
7 19
8 20
9 21
10 22
11 23
12 24
25 37
26 38
27 39
28 40
29 41
30 42
31 43
32 44
33 45
34 46
35 47
36 48HE A HE B vWF A vWF B En A En B HE A HE B vWF A vWF B En A En B
Objektträger
1
Objektträger
2
Objektträger
3
Objektträger
4
Objektträger
5
Objektträger
6
Objektträger
7
Objektträger
8
Objektträger
9
Objektträger
10
Objektträger
11
Objektträger
12
Takt 1 + Takt2 Takt 3 + Takt4
Die Zahlen 1 bis 48 kennzeichnen die aufgenommenen Gewebeschnitte
HE A = A-Probe für H.E.-Färbung HE B = B-Probe für H.E.-Färbung
vWF A = A-Probe für vWF-Färbung vWF B = B-Probe für vWF-Färbung
En A = A-Probe für Endostatin-Färbung EN B = B-Probe für Endostatin-Färbung
Abbildung 9 Schematische Darstellung der Schneidesystematik für die ersten 4 Takte Bis zum Tumorende wurde entsprechend weiter verfahren.
70 3 Untersuchungsgut und Methoden
3.6.5 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.)
Die Gewebeschnitte zur Etablierung des Modells sowie die Schnitte auf einem
Objektträger je Takt zur Untersuchung der Wirksamkeit der CellBeads® wurden
mittels Hämatoxylin (Harris Hämatoxylin, Thermo Electron Corporation GmbH,
Dreieich, Deutschland) und Eosin (Shandon Instant Eosin Aqueous, Thermo Electron
Corporation) gefärbt. Bei der H.E.-Färbung stellt sich der Zellkern durch Bindung des
Hämatoxylins an das basophile Chromatin dunkelblau dar. Die zytoplasmatischen
Proteine werden durch Salzbildung der Eosinanionen mit den positiven
Proteingruppen rot angefärbt.
Die aus der -20°C Kühlung entnommenen Objektträger mit den zu untersuchenden
Proben wurden zunächst mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur
aufgetaut, um Kristallbildungen zu vermeiden. Anschließend wurden je 10
Objektträger in einer Glasküvette zum Quellen für 10 Minuten in einen mit
Leitungswasser gefüllten Färbetrog gestellt. Im Anschluss erfolgte die Inkubation in
zuvor gefiltertem Hämatoxylin für 3 Minuten und danach eine Wässerung für 5
Minuten in fließendem Leitungswasser. Zur Differenzierung wurden die Schnitte
anschließend für 1 Sekunde in 50%igem Ethanol dem 0,15% HCl zugesetzt wurde,
getaucht, erneut 5 Minuten gewässert und anschließend 2 Minuten in Eosin inkubiert.
Nach zweimaliger Spülung in Aqua dest. für jeweils 1 Minute wurden die
Gewebeschnitte in einer aufsteigenden Alkoholreihe (2 x 70%, 2 x 96%, 2 x 99% für
je 1 Minute) entwässert. Abschließend erfolgte eine dreimalige Behandlung mit Xylol
(Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland) und das Eindecken der
Objektträger mit Entellan (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) und Deckgläschen
(Menzel GmbH + CoKG, Braunschweig, Deutschland). Das Färbeprotokoll ist dem
Anhang beigefügt.
3 Untersuchungsgut und Methoden 71
3.6.6 Immunhistochemische Färbungen (IHC)
Für die immunhistologischen Färbungen (IHC) wurden die Objektträger eine Stunde
vor Arbeitsbeginn bei Raumtemperatur aufgetaut und getrocknet. Anschließend
wurden die Schnitte 3 mal 5 Minuten in Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4) gewaschen,
um grobe Verunreinigungen zu entfernen. Dann wurde ein Peroxidase Block
durchgeführt, um unspezifische Hintergrundfärbungen durch Reaktionen mit der
endogenen Peroxidase zu vermeiden. Dies geschah mittels einer Präinkubation für
15 Minuten in einer Lösung aus 5333 µl Wasserstoffperoxid und 400 ml PBS unter
Lichtausschluss. Für alle IHC Schritte wurden Färbetröge und Objektträgergestelle
aus lichtundurchlässigem, hitzebeständigem Polyoxymethylen verwendet (Carl Roth
GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Deutschland). Im Anschluss wurden die Peroxidreste
durch zweimaliges Spülen für je 5 Minuten in sauberem PBS entfernt und die
Schnitte dann für 5 Minuten in TRS-Puffer (Target Retrieval Solution, Code No
S169984, DakoCytomation GmbH, Hamburg, Deutschland) gestellt. Bei TRS handelt
es sich um einen gebrauchsfertigen Puffer mit einem idealen pH-Wert von 6,1 zur
Antigendemaskierung. In einem Dampfgarer (Multi Gourmet FS 20, Braun AG,
Kornberg, Deutschland) wurde ein Färbetrog mit frischem TRS erhitzt. Bei Erreichen
von mindestens 92°C wurden die Objektträger in das heiße TRS überführt und bei
Erreichen von 94°C die Zeitmessung für 30 Minuten gestartet. Nach dieser
Hitzedemaskierung der zu detektierenden Antigene wurden die Objektträger samt
Färbetrog mit dem heißen TRS in ein Eiswasserbad verbracht und dort weitere 20
Minuten belassen, bevor das Gestell mit den Objektträgern aus dem Färbetrog
entnommen wurde. Bei zu frühem Herausnehmen bestand die Gefahr, dass die
Schnitte aufgrund ihrer hohen Temperatur trockneten. Die abgekühlten Objektträger
wurden anschließend feucht in Coverplates (Shandon Clips, Thermo Electron GmbH,
Dreieich, Deutschland) eingespannt. Dabei entstand zwischen dem Coverplate und
der Oberfläche des Objektträgers ein Kapillarspalt, in dem sich eine
Flüssigkeitssäule aufbaute.
72 3 Untersuchungsgut und Methoden
Auf die nach oben gerichtete Öffnung dieses Spaltes wurden die weiteren
Reagenzien aufpipettiert, so dass sie sich den Kapillarkräften folgend gleichmäßig
über die Oberfläche des Objektträgers und somit über die Gewebeschnitte verteilten.
Im nächsten Schritt erfolgte die Blockung unspezifischer Antigenbindungen und die
Absättigung endogener Proteine um unerwünschte Hintergrundfärbungen zu
minimieren. Hierzu wurden 200 µl Antibody Diluent (Code No S080983,
DakoCytomation) aufpipettiert und 30 Minuten inkubiert. Der jeweils verwendete
Primärantikörper (siehe Kapitel 3.6.6.1 und 3.6.6.2) wurde den Verdünnungsreihen
entsprechend in Antibody Diluent verdünnt und anschließend für 30 Minuten in den
Coverplates inkubiert. Nach der Primärantikörperinkubation folgten 2 Spülschritte
über 5 Minuten mit je 500 µl TRS-Puffer und anschließend die Inkubation mit dem
statt eines Sekundärantikörpers zur Bindung an den Primärantikörper verwendeten
Polymer (EnVision + System/ HRP, Rabbit (AEC+), Code No K400811,
DakoCytomation) für weitere 30 Minuten. Nach einer Wiederholung des
Spülvorgangs wurde das Chromogen (Code No K 346911, DakoCytomation),
welches eine Bindung mit dem Polymer einging und so zu der antikörperspezifischen
Rotfärbung führte, auf die Objektträger pipettiert. Nach 26 minütiger Inkubation
wurde aus einer Spritzflasche zügig destilliertes Wasser über die Coverplates
gegeben um den Farbstoff wieder abzuspülen. Nach der Entnahme der Objektträger
aus den Coverplates folgte eine Hintergrund-Gegenfärbung mittels Hämatoxylin-
Inkubation (Thermo Shandon) für 1 Minute. Anschließend wurde durch zweimaliges
Tauchen in Ammoniaklösung (0,0037 M, Carl Roth) für jeweils 5 Minuten gebläut.
Nach zweimaligem Spülen für je 5 Minuten mit Aqua dest. wurden die Objektträger
mit einem Eindeckmedium auf Wasserbasis (Faramount Aqueous Mounting Medium,
DakoCytomation) und Deckgläschen (Menzel) eingedeckt. Bei allen durchgeführten
immunhistologischen Färbungen wurde ein Objektträger statt mit Primärantikörper
mit einer Negativkontrolle (Negative Control Rabbit Immunoglobulin Fraction, Code
No X093602, DakoCytomation) inkubiert, um das Färbeergebnis kontrollieren zu
können. Alle Färbungen wurden auf die gleiche Weise durchgeführt und dem im
Anhang einzusehenden Färbeprotokoll entsprechend protokolliert.
3 Untersuchungsgut und Methoden 73
3.6.6.1 Von-Willebrand-Faktor (vWF)
Der von Willebrand-Faktor ist ein Protein, das von den Endothelzellen der
Blutgefäßwände exprimiert wird. Er spielt eine Hauptrolle bei der Hämostase. Kommt
es zum Riss in einer Gefäßwand, liegen Kollagene frei. Der vWF bindet an dieses
und an Glykoprotein I/IX auf den Thrombozyten und vermittelt somit die
Plättchenaggregation. Eine immunhistochemische Färbung des vWF ist somit dazu
geeignet die Blutgefäßwände auch kleinster Kapillaren darzustellen.
Es wurde aus jedem aufgenommenen Takt ein Objektträger gefärbt.
Verwendet wurde ein polyklonaler Primärantikörper gegen humanen von-Willebrand-
Faktor, der mit Ratten-vWF kreuzreagiert (Polyclonal anti human vWF, Code No
A008202, DakoCytomation). Vor der eigentlichen Versuchsdurchführung wurden
Verdünnungsreihen des Primärantikörpers getestet, um die ideale
Antikörperverdünnung von 1:400 zu ermitteln.
Der verwendete Antikörper (Ak) stammt aus dem Kaninchen, so dass ein Polymer
(EnVision + System/ HRP, Rabbit (AEC+), Code No K400811, DakoCytomation)
verwendet wurde, welches spezifisch an Kaninchen-Ak bindet.
3.6.6.2 Endostatin
Bei Endostatin handelt sich um ein Protein, das auch endogen sezerniert wird. Um
spezifisch das aus den implantierten Mikrokapseln freigewordene humane
Endostatin nachzuweisen, wurde ein polyklonaler Antikörper gegen humanes
Endostatin verwendet, der nicht mit dem der Ratte kreuzreagiert (Polyclonal Antibody
to Human Endostatin, Cat No DP3053, Acris Antibodies GmbH, Hiddenhausen,
Deutschland). Um eine Verwechselung mit dem endogenen Endostatin der Ratte
zusätzlich auszuschließen, wurden auch die Gewebeschnitte der nicht mit humanem
Endostatin behandelten Tiere gefärbt und verglichen. Auch der verwendete
Endostatin-Primärantikörper entstammte dem Kaninchen, so dass dasselbe Polymer
wie bei der von-Willebrand-Faktor-IHC verwendet werden konnte.
74 3 Untersuchungsgut und Methoden
Eine zuvor getestete Verdünnungsreihe ergab eine ideale Antikörperverdünnung von
1:75 für den Endostatin-Ak. Um den qualitativen Nachweis des humanen Endostatins
zu führen und die Proteinverteilung innerhalb des Gewebeanschnitts zu beurteilen,
wurden jeweils 2 Objektträger mit Gewebeschnitten aus den Bregma -1 mm am
nächsten liegenden Takten gefärbt. So wurden insgesamt 4 Lokalisationen aus dem
Bereich der Implantationskoordinate auf die Anwesenheit humanen Endostatins
untersucht. Es wurden alle 10 Tiere der mit Endostatinbeads behandelten Gruppe
und jeweils 3 Tiere aus den anderen 3 Gruppen untersucht.
3.6.7 Mikroskopische Auswertung
Die histologische Beurteilung der gefärbten Gewebeschnitte erfolgte
lichtmikroskopisch mit dem Olympus System-Mikroskop BX51 Hellfeld (Olympus,
Hamburg, Deutschland) und die fotografische Dokumentation mittels einer digitalen
Kamera (Color View Soft Imaging System, Olympus). Die Bilddokumente wurden zur
Archivierung im TIFF-Format und in dieser Arbeit als JPEG-Formate verwendet. Die
Bildbearbeitung und Auswertungen wurden mit der Software cell*f (Imaging Software
for Life Sciences Microscopy, Olympus) durchgeführt. Die Bilddateien der gefärbten
Schnitte sind nach folgendem Schema benannt worden: Tiernummer/ Gruppe
(CellBead®-Charge kodiert)/ Färbung/ Schnittnummer (Beispiel: EN79/CB039/HE/4).
Bei den zur Bestimmung der Vaskularisierungsdichte herangezogenen Bildern wurde
zusätzlich die ausgewertete Lokalisation vermerkt (Bu/Bo/Bm, Fo/Fu/Fm).
3 Untersuchungsgut und Methoden 75
3.6.7.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.) zur Etablierung des Modells
Bei der histologischen Auswertung der H.E. gefärbten Schnitte zur
Versuchsetablierung wurde die Implantationstechnik zur intrazerebroventrikulären
Applikation der CellBeads® daran beurteilt, wie viele Mikrokapseln im Gewebe zu
finden waren, wo diese lagen und ob sie im Kontakt zum rechten Seitenventrikel
standen. Außerdem wurden die Gewebsreaktionen auf die CellBeads®
beziehungsweise auf den Stichkanal beurteilt.
Zur Etablierung des Glioblastommodells lag das Hauptaugenmerk auf der
histomorphologischen und strukturellen Beurteilung des Tumors, dabei wurden
besonders die Größe und Ausdehnung der experimentellen Gliome verglichen. Bei
den zur Entwicklung der zweizeitigen Applikation von Gliomzellen und Mikrokapseln
operierten Tieren wurden die Lage und die Tiefe der jeweiligen Stichkanäle und die
Lage und Entfernung des Tumors und der CellBeads® zueinander bewertet.
3.6.7.2 Immunhistologischer Nachweis des Endostatins
Mit Hilfe der immunhistochemischen Markierung humanen Endostatins erfolgte der
Nachweis der Proteinfreisetzung durch die Implantate und damit der
Funktionsfähigkeit der CellBeads®. Gleichzeitig wurde untersucht, wo der Wirkstoff
sich anreicherte. Die Auswertung erfolgte anhand einer Klassifikation in eine positive
oder negative Immunreaktion.
Dazu wurden die Gewebeschnitte lichtmikroskopisch mit dem BX51 Hellfeld
Mikroskop untersucht und in verschiedenen Vergrößerungen mit der SoftImage-
Kamera fotografiert. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf die CellBeads®, das
sie direkt umgebende Gewebe, die Ventrikelwände, den Plexus Choroideus und den
Virchow Robin Raum als erwartete Gebiete der Endostatinanreicherung gelegt.
76 3 Untersuchungsgut und Methoden
3.6.7.3 Immunhistologie zur Untersuchung der Tumorvaskularisierung
Die lichtmikroskopische Auswertung der immunhistochemischen Anfärbung des von-
Willebrand-Faktor erfolgte nach dem Abfotografieren der Gewebeschnitte mit dem
BX51 Hellfeld Mikroskop und der SoftImage-Kamera mit dem 10-er Objektiv. Um
mehrere repräsentative Lokalisationen der Tumorvaskularisierung beurteilen zu
können, wurden 2 Gewebeschnitte pro Tier und 3 Regionen pro Gewebeschnitt
ausgewertet. Es wurden die Gewebeschnitte des in der Volumenauswertung
bestimmten größten Tumoranschnitts (größte Fläche) und der
Implantationslokalisation (Bregma -1 mm) in der rostrokaudalen Ausdehnung des
Tumors untersucht. An diesen beiden Lokalisationen wurde dann jeweils 1
Ausschnitt an der maximal dorsal liegenden, der am weitesten ventral liegenden
Tumorausdehnung und an einer immer auf dieselbe Weise angefahrenen und so
randomisierten Position zwischen den ersten beiden beurteilt.
Die 6 aufgenommenen Regionen (ROI, Region of Interest) wurden getrennt
ausgewertet und ihre Bezeichnung erfolgte als:
ROI- Fu (größte Fläche unten) ROI- Bu (Bregma -1 mm unten)
ROI- Fo (größte Fläche oben) ROI- Bo (Bregma -1 mm oben)
ROI- Fm (größte Fläche Mitte) ROI- Bm (Bregma -1 mm Mitte)
Die Auswertung erfolgte mittels mit der Software cell*f (Olympus) durchgeführter
Partikeldetektion. Dabei war ein fotografiertes Sichtfeld gleich der detektierten
Fläche (ROI). Durch die Verwendung des immer gleichen Objektivs wurde
sichergestellt, dass eine jedes Mal gleich große Fläche von 575321,78 µm2
untersucht wurde. Zunächst wurde eine Farbwertüberarbeitung durchgeführt, um die
positiv rot gefärbten Blutgefäßwände für die digitale Detektion deutlich von der
blauen Hämatoxylin-Gegenfärbung abzusetzen. Für alle Bilder wurden dieselben
einmal definierten Farb-, Gamma- und Sättigungswerte verwendet.
3 Untersuchungsgut und Methoden 77
Im Anschluss wurde ein Farbschwellwert bestimmt, bei dem Partikel eines
bestimmten Farbwertes als positiv detektiert wurden. Auch dieser einmal definierte
Wert wurde für alle Auswertungen gleichermaßen angewendet. Die Partikel, deren
Farbe diesen Schwellwert überschritten, wurden im Anschluss detektiert.
Blutgefäßanschnitte, deren nicht rot angefärbte Hohlraumvolumina von der Software
nicht detektiert wurden, wurden mittels Handwerkzeug hinzugefügt. Durch die
Software ermittelt beziehungsweise berechnet wurden die Anzahl der detektierten
Partikel, die Dichte der Partikel, die Gesamtfläche aller detektierten Partikel im ROI
und deren prozentualer Flächenanteil an der Fläche des ROI. Diese Daten wurden in
einer Datenbank archiviert und zur weiteren Berechnung in Excel übertragen.
Ermittelt wurden die Mittelwerte und Standardabweichungen der einzelnen Gruppen
für alle gemessenen Parameter.
3.6.7.4 H.E.-Färbung zur Untersuchung der Tumorgrößen
Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (H.E.) der Gewebeschnitte aus der
Wirksamkeitsuntersuchung dienten der histomorphologischen Beurteilung, dem
Nachweis der Implantate, und zur Ermittlung der Tumorvolumina. Histologisch stellte
sich der Bereich des Glioblastoms dunkellila und der des gesunden
Gehirnparenchyms rot dar. Der zur Aufnahme der Gefrierschnitte auf Objektträger
entwickelten Systematik (Vergleich Kapitel 3.6.4) folgend wurde aus jedem
aufgenommenen Takt ein Gewebeschnitt ausgewertet. Das Tumorvolumen wurde
mit folgendem histomorphologischen Verfahren näherungsweise bestimmt: Gemäß
der entwickelten Systematik (Vergleich Kapitel 3.6.4) wurden in regelmäßigen
Abständen durch die gesamte Länge der rostrokaudalen Tumorausdehnung die
Gewebeschnitte mit dem 1,25-fach vergrößernden Objektiv in mehreren
Einzelaufnahmen abfotografiert und mittels rechnerischen Ränderabgleichs durch die
verwendete Software, der Bildmontagefunktion (Multiple Image Alignment), zu einem
Gesamtbild des Gewebeanschnitts zusammengefügt.
78 3 Untersuchungsgut und Methoden
Anschließend wurden die Flächen des histologisch darstellbaren, soliden
Tumorgewebes bei 50-facher Zoomfunktion mit der Messfunktion ausgemessen.
Die Berechnung des Teilvolumens zwischen zwei Gewebeschnitten erfolgte nach der
Formel für den Kegelstumpf:
Kegelstumpfvolumen = ( ) ( ) ( )
3²221²1 hrrrr ××+×+ π
Dabei entsprach der Takt als Abstand zwischen 2 Schnitten der Höhe h. Die Radien
r2 und r2 wurden als Äquivalentradien aus den gemessenen Flächen der
Tumoranschnitte jeweils vor und nach dem Takt mit folgender Formel ermittelt:
Äquivalentradius = π
lächegemesseneF
Das Gesamtvolumen eines Tumors ergab sich aus der Addition aller berechneten
Kegelstümpfe.
3 Untersuchungsgut und Methoden 79
3.7 Statistische Auswertung
Die Daten aus den Volumenberechnungen zum Vergleich der Tumorgrößen wurden
als arithmetische Mittelwerte statistisch ausgewertet. Dazu wurden die
arithmetischen Mittelwerte über alle durch die Addition der aus den gemessenen
Flächen berechneten Kegelstümpfe ermittelten Tumorgesamtvolumina einer
Versuchsgruppe miteinander verglichen.
Die anhand der Partikeldetektion ermittelten Daten zur Blutgefäßdichte wurden als
arithmetische Mittelwerte über alle 4 Gruppen ausgewertet.
Es wurden die arithmetischen Mittelwerte der detektierten Partikelflächen als
prozentualer Anteil der von den Gefäßen eingenommenen Fläche an 6
untersuchten ROI (Region of Interest) getrennt berechnet und miteinander
verglichen. Weiterhin wurden die arithmetischen Mittelwerte der Summen der von
den Gefäßen eingenommenen Flächen von den 3 jeweils in einem Tumoranschnitt
ausgewerteten ROI als Gefäßfläche Summe an beiden untersuchten
Gewebeanschnitten (Implantationslokalisation und größte Fläche) getrennt ermittelt.
Als Gefäßanzahl Summe wurde die Summe der mittels Partikeldetektion gezählten
Partikel über 3 ROI an jeweils der Implantationslokalisation und an dem
Tumoranschnitt mit der größten Tumorfläche berechnet.
Die statistische Auswertung erfolgte mittels der Berechnung des arithmetischen
Mittelwertes und der Standardabweichung (SD). Zunächst wurde eine mehrfaktorielle
Varianzanalyse ANOVA (one way analysis of variance) durchgeführt, um zu
ermitteln, ob mehrere unabhängige Variablen (oder Faktoren) einzeln oder in
beliebiger Kombination einen statistisch gesicherten Einfluss auf ein Merkmal
(abhängige Variable) haben. Mit der Varianz wurde die mittlere quadratische
Abweichung der Daten vom Mittelwert beschrieben. Um einen gesicherten, nicht
zufälligen Unterschied zwischen den einzelnen Versuchsgruppen zu belegen, wurde
dabei mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von kleiner 5% (P value < 0,05) gerechnet.
80 3 Untersuchungsgut und Methoden
Als Post Test zur Untersuchung der tatsächlichen Unterschiede zwischen den
Mittelwerten der Versuchsgruppen wurde der Tukey-Kramer multiple comparison
Test durchgeführt, bei dem alle Gruppen gegeneinander verglichen werden. Auch
hier wurde mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von kleiner 5% (P value <0,05)
gerechnet, welche aussagt, dass die errechneten Signifikanzen mit einer
Wahrscheinlichkeit von größer 95% „wahr“ sind.
Zur Bestimmung der Korrelation zwischen Blutgefäßdichte und Tumorvolumina
wurde die Summe der 3 pro Gewebeschnitt ermittelten Gefäßflächen den
Tumorvolumina für jede Versuchsgruppe getrennt gegenübergestellt.
Zur Ermittlung der Korrelationen von Tumorvolumen und Vaskularisierungsdichte
wurde die Funktion f(x) = a x X + Y zugrunde gelegt, wobei a die Steigung (slope) ist,
und X die Verschiebung auf der X-Achse (X-Intercept) und Y die Verschiebung auf
der Y-Achse (Y-Intercept) definiert. Liegt ein funktionaler Zusammenhang zwischen
X und Y vor, so lässt sich ein Stichprobenkorrelationskoeffizient r angeben, der
quadriert zu r² den Pearssonschen Korrelationskoeffizienten darstellt. Dieser
Koeffizient beschreibt die Güte des funktionalen Zusammenhangs zwischen zwei
Datenmengen (Goodness of Fit) und es wird von einer bestehenden Korrelation
gesprochen, wenn r² > 0,8 ist.
Alle statistischen Berechnungen und die graphische Darstellung wurden mit dem
Programm Prism® Version 4.03 (GraphPad Software Inc., San Diego, USA)
durchgeführt.
4 Ergebnisse 81
4 Ergebnisse
4.1 Entwicklung des Versuchsmodells
4.1.1 Zellkultur
4.1.1.1 Kultivierung
Die Untersuchungen zur Ermittlung der idealen Einsaatdichte und Passagedauer
zeigten, dass bei einer Einsaatdichte von 6 x 105 Zellen in eine 75 cm2 Flasche an
Tag 0 und einer Passagedauer von 2 Passagen mit einer Subkultivierung an Tag 3
nach der Einsaat und einem Mediumwechsel jeweils an Tag 1 nach der Einsaat die
Zellen eine weitgehende Homogenität und eine Bewuchsdichte von 80% +/- 10%
aufwiesen. Das auf den Zellen stehende Medium war jeweils an Tag 1 und 3 klar und
wies nur einen sehr geringen Anteil gelöster, abgestorbener Zellen auf. Es war
hellrötlich gefärbt und somit noch im für die Zellen optimalen pH- Bereich 7 bis 7,5.
4.1.1.2 Vitalzellzahl
Die Messung der Zellvitalität von BT4Ca-Zellen im Lagerungsversuch in sterilem
Phosphatpuffer (PBS) bei Raumtemperatur mittels Trypanblaufärbung und Zählung
in der Neubauer-Kammer zeigte einen zunehmenden Lebendzellverlust nach 4
Stunden. Dabei konnte ein logarithmischer Verlauf bei der Abnahme der vitalen
Zellen beobachtet werden.
Die Untersuchung mittels Cell-Counter (CASY®, cell counter and analysis system,
Schärfe) ergab, dass die Zellen in PBS bei Raumtemperatur bis zu 4 Stunden und
bei 4°C bis zu 5 Stunden problemlos gelagert werden konnten. In diesem Zeitrahmen
lag die Vitalität der Zellen über 90%. Alle Tiere, die in diesem Zeitrahmen mit ein und
derselben Zellsuspension operiert wurden, erhielten somit die gleiche Anzahl vitaler
BT4Ca-Zellen. Der Verlauf des Vitalzellzahlrückgangs wird in der Abbildung 10
dargestellt.
82 4 Ergebnisse
Aufgrund der ermittelten Ergebnisse wurde unter Einbeziehung von einer Stunde
Sicherheitsspanne eine maximale Verwendungszeit für die zur Operation
angesetzten Zellsuspensionen von 3 Stunden festgelegt, um eine gleich bleibende
implantierte Tumorzellzahl sicherzustellen.
Vitale BT4Ca Zellen bei Lagerung in PBS
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 10 Stunden
Lagerung bei RT Lagerung bei 4°C
Vitale Zellen [%]
Abbildung 10 Ergebnisse der Vitalzellzählung von BT4Ca-Zellen bei
Lagerung in PBS Deutliche Reduktion der vitalen Zellen nach 4 Stunden bei Lagerung bei
Raumtemperatur und nach 5 Stunden bei Lagerung im Kühlschrank
4.1.2 Experimentelles Glioblastom
Die Untersuchungen zur Etablierung eines reproduzierbaren Tumormodells ergaben
eine optimale zu implantierende Gliomzellzahl von 8 x 103 BT4Ca-Zellen von der
Schädeloberfläche ausgehend, nach Absenken der Kanülenspitze auf DV -5 mm, 4
mm tief im Gewebe injiziert. Histologisch zeigten sich nekrotisierte Bereiche, die von
solchen mit einer erhöhten Zelldichte eingegrenzt waren.
4 Ergebnisse 83
Die perifokalen Tumorbereiche wiesen ödematisierte Strukturen mit aufgelockerten
Zellverbänden auf. Vor allem in den zentralen Tumorbereichen war eine starke
Vaskularisierung mit einer großen Anzahl glomerulär gewundener Blutgefäße zu
sehen. Makroskopisch stellten sich die Tumoren vielfältig mit blasigen, zum Teil
blutig infiltrierten, kavernösen Strukturen und zerfließender Textur dar.
Makroskopische Abbildungen des Tumors sind in Abbildung 11 und 12 und
histologische Gewebeschnitte in Bildtafel 1 auf Seite 85 einzusehen.
Auch die Implantation von 6 x 103 BT4Ca-Zellen führte zur Ausbildung eines zur
Auswertung ausreichend voluminösen Tumors, allerdings waren hier die
Variabilitäten innerhalb der Tumorgrößen bei den untersuchten Tieren sehr groß, so
dass keine Reproduzierbarkeit gewährleistet war. Implantierte Zellzahlen von
weniger als 6 x 103 Zellen führten zu sehr unregelmäßigem Tumorwachstum und
schon bei Reduktion der inokulierten Zellzahl auf 4 x 103 BT4Ca-Zellen wuchs bei 1
von 2 Tier gar kein Tumor mehr an. Die beurteilten Gewebeschnitte sind beispielhaft
in Bildtafel 1 auf Seite 85 dargestellt und eine Übersicht über die erhobenen Befunde
ist Tabelle 5 auf Seite 84 zu entnehmen.
Tumor
Tumor
Abbildung 11 Experimentelles Gliom Abbildung 12 Experimentelles Gliom fixiert und kryokonserviert paraformaldehydfixiert verdrängendes Wachstum, Ventrikel blasige, gallertige, teilweise blutig
komprimiert infiltrierte Textur
84 4 Ergebnisse
Tabelle 5 Ermittlung der geeigneten Gliomzellzahl zur Etablierung eines reproduzierbaren Tumormodells
Injizierte Zellzahl, Stamm und Anzahl der Tiere, erhobene Befunde nach 12 Tagen
Versuchsdauer
Rattenstamm BDIX/Ztm Tierzahl n =
implantierte Tumorzellzahl
histologische Befunde
2 Tiere 2 x 103
BT4Ca-Zellen
beide Tiere:
kein morphologisches Tumorwachstum;
vereinzelte Gliomzellen im Stichkanal
2 Tiere 4 x 103
BT4Ca-Zellen
1 Tier: Tumor < 1 mm
1 Tier: Gliomzellen im Stichkanal, kein
morphologisches Tumorwachstum
2 Tiere 6 x 103
BT4Ca-Zellen
1 Tier: ca. 5 mm Tumordurchmesser
1 Tier: ca. 3 mm Tumordurchmesser
Tumoren oberflächlich auf Hirnrinde
2 Tiere 8 x 103
BT4Ca-Zellen
1 Tier: ca. 7,5 mm Tumordurchmesser
1 Tier: ca. 9 mm Tumordurchmesser
Wachstum in der Tiefe, bis an den Seitenventrikel
Wiederholung zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit
3 Tiere 6 x 103
BT4Ca-Zellen
1 Tier: kein morphologisches Tumorwachstum
1 Tier: ca. 1 mm Tumordurchmesser
1 Tier: ca. 2,5 mm Tumordurchmesser
3 Tiere 8 x 103 BT4Ca-Zellen
alle Tumoren zwischen 7,5 und 10 mm
Durchmesser
Wachstum in der Tiefe, bis an den Seitenventrikel
4 Ergebnisse 85
4.1.2.1 Bildtafel 1
Bildtafel 1 H.E. Färbung zur Untersuchung der idealen Zellzahl zur Implantation und Darstellung der Tumorhistomorphologie
Tumoren (a) 12 Tage nach der Implantation von 2000 (A), 4000 (B), 6000 (C) und 8000 BT4Ca Gliomzellen (D/E/F/G/H/I); Gewundene, teils glomeruläre Blutgefäße (b) und Pseudopalisaden (c) (E/F); Übergang (d) von Pseudopalisaden (c) zu nekrotisierendem, aufgelockertem Gliomzellverband (e); Endothelzellproliferation (f), Migration (g) und Differenzierung (h) mit eingewanderten Erythrozyten (i)
B
E D
C A
G F
a a a
c b a
H I
d e
c
b c
f
h
g i
a
86 4 Ergebnisse
4.1.3 Koordinaten zur intrazerebroventrikulären Implantation der CellBeads®
Zur Implantation der CellBeads® intraparenchymal mit Kontakt zum liquorführenden
Ventrikelsystem wurde an den Koordinaten -1 mm AP (anterior-posterior), -2,8 mm
LM (latero-medial) und -5 mm DV (dorso-ventral) nach Vorbohren auf -6 mm DV zu
Bregma eine sichere Applikation der Implantate unter Eröffnung des rechten
Seitenventrikels ermöglicht. Dabei konnten mehrfach reproduziert zwischen 8 und 12
CellBeads® mit Kontakt zum rechten Seitenventrikel intraparenchymal in der rechten
Großhirnhemisphäre platziert werden. Einen Überblick gibt Tabelle 6 und die
mikroskopisch erhobenen Befunde sind beispielhaft in Bildtafel 2 auf Seite 90
einzusehen.
4 Ergebnisse 87
Tabelle 6 Ermittlung der zur Implantation der CellBeads® geeigneten stereotaktischen Koordinaten
Stamm und Anzahl der Tiere, Implantationskoordinaten, Befunde nach der
Implantation von 12 CB und nach 2 Tagen Versuchsdauer
Rattenstamm BDIX/Ztm Tierzahl n =
latero-mediale Koordinate (LM)
dorso-ventrale Koordinate (DV)
histologische Befunde
2 Tiere LM
-3,2 mm
DV -2,8 mm 2 CB nachweisbar
kein Kontakt zum Ventrikel
zu weit dorsal
2 Tiere LM
-3,2 mm
DV -3,5 mm 6 CB nachweisbar
kein Kontakt zum Ventrikel
zu weit lateral
2 Tiere LM
-3 mm
Vorbohren auf DV
-7 mm, Absetzen
bei DV -6 mm
kein CB nachweisbar
Stichkanal nicht im Ventrikel
zu tief, zu weit lateral
2 Tiere LM
-3 mm
Vorbohren auf DV
-6 mm, Absetzen
bei DV -5 mm
10 CB nachweisbar
kein Kontakt zum Ventrikel
2 Tiere LM
-2,8 mm
Vorbohren auf DV -6 mm, Absetzen
bei DV -5 mm
12 CB nachweisbar
CB stehen in Kommunikation
zum rechten Seitenventrikel
Wiederholung zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit
3 Tiere LM
-2,8 mm
Vorbohren auf DV -6 mm, Absetzen
bei DV -5 mm
zwischen 8 und 12 CB
reproduzierbar mit Kontakt
zum Ventrikel nachgewiesen
88 4 Ergebnisse
4.1.4 Koordinaten für die BT4Ca-Inokulation und zweizeitige Operation
Zur Inokulation des Tumors einen Tag vor der Implantation der Mikrokapseln
erwiesen sich die Koordinaten -1 mm AP (anterior-posterior), -3,4 mm LM (latero-
medial) und -4 mm DV (dorso-ventral), nach Vorbohren auf -5 mm DV, als geeignet.
So waren die Tumoren auch nach der CellBead®-Implantation in ihrer Größe und
Ausdehnung nach 12 Tagen mit denen der Tiere, die nur Gliomzellen implantiert
bekamen, vergleichbar. Die implantierten CellBeads® waren trotz des stark
verdrängenden Wachstums des experimentellen Glioms auch nach 12 Tagen an der
geplanten Lokalisation zuverlässig nachzuweisen und intakt. In der Bildtafel 2 auf
Seite 90 ist die Kombination der beiden OPs anhand von Gewebeschnitten
dokumentiert und Tabelle 7 verschafft einen Überblick über die durchgeführte
Untersuchung.
4 Ergebnisse 89
Tabelle 7 Entwicklung der Methodik zur zweizeitigen Implantation von Tumorzellen und CellBeads®
Stamm und Anzahl der Tiere, implantierte Tumorzellzahl, implantierte Mikrokapseln,
Implantationskoordinaten, erhobene Befunde nach 12 Tagen Versuchsdauer
Ratten-stamm BDIX/Ztm Tierzahl n =
Tumor-inokulation rechte Hemisphäre Tag 0
CellBead® Implantation rechte Hemisphäre Tag 1
histologische Befunde
4 Tiere 8 x 10³ BT4Ca-
Zellen
AP -1 mm
LM -3,4 mm
DV -5/ -4 mm
12 leere
CellBeads®
AP -1 mm
LM -2,8 mm
DV -6/ -5 mm
zwischen 8 und 12 intakte CB mit
Kontakt zum rechten Seitenventrikel
nachgewiesen
alle Tumordurchmesser zwischen 8,5
und 10 mm
Tumorausdehnung bis an Ventrikel
reichend
Lage von CellBeads® und Tumor
zueinander so, dass sie in direkter
Kommunikation zueinander stehen
gegebene Reproduzierbarkeit
90 4 Ergebnisse
4.1.4.1 Bildtafel 2
Bildtafel 2 H.E. Färbung zur Ermittlung der idealen Implantationskoordinaten und zur Untersuchung der zweizeitigen OP
Nach Implantation von 12 CellBeads® (CB) an AP -1 mm: 2 Tage post OP: an LM -3,2 DV -2,8 mm (A) nur 2 CB nachweisbar; an LM -3,2 mm DV -3,5 mm (B) 6 CB nachweisbar aber kein Kontakt zum Ventrikel (V); an LM – 3 mm DV – 7/-6 mm (C) kein CB; an LM -3 mm DV -6/-5 mm (D) waren insgesamt 10 CB nachweisbar (nur 7 im Schnitt erkennbar) und LM -2,8 mm DV -6/-5 mm (E) 12 CB mit Kontakt zum Ventrikelsystem 12 Tage post OP: wobei an Tag 0 8 x 10³ BT4Ca an LM -3,4 DV -5/-4 mm und an Tag 1 12 CB an LM -2,8 mm DV -6/-5 mm implantiert wurden (F/G); CB mit Kontakt zum Ventrikelsystem und gleichzeitig tumornah lokalisiert, Tumor (a) im Wachstum unbeeinflusst
A
F
E D
C B
G
a
a
V V
CB CB
CB CB
CB CB
4 Ergebnisse 91
4.2 Untersuchung der Wirksamkeit
4.2.1 Histologischer Nachweis der Implantate
Bei allen 26 Tieren der 3 Versuchsgruppen, denen CellBeads® implantiert worden
waren, konnten die implantierten Mikrokapseln histologisch nachgewiesen werden.
Zur Auswertung der Ergebnisse aus den Untersuchungen zur Wirksamkeit des
Endostatins sollten nur Daten von Versuchstieren herangezogen werden, bei denen
mindestens 5 intakte Implantate nachgewiesen werden konnten. Dieses Kriterium
erfüllten alle operierten Tiere. Dabei wurde besonderes Augenmerk auf die
strukturelle Darstellung der äußeren Alginathülle und die Unversehrtheit des inneren
Zellcores gelegt. Beispielhaft sind die implantierten CellBeads® in den Abbildungen
der Bildtafel 5 auf Seite 105 einzusehen.
4.2.2 Nachweis der Endostatinfreisetzung aus den CellBeads®
Ziel war es zum einen das freigesetzte humane Endostatin und damit die
Funktionalität der Implantate nachzuweisen. Zum anderen sollte gezeigt werden, wo
im Gehirnschnitt das Endostatin nach intrazerebroventrikulärer Applikation der
sezernierende Zellen enthaltenden Implantate aufzufinden war, um Hinweise auf die
Verteilung zu erhalten.
In den Gewebeschnitten der Tiere aus der mit Endostatinbeads (ECB) behandelten
Gruppe III konnte eine deutlich positive Immunreaktion gezeigt werden, anhand derer
die Freisetzung des humanen Endostatins belegt werden konnte. Dazu wurden
jeweils 2 Gewebeschnitte pro Tier auf das Vorhandensein von Endostatin-Antikörper-
Präzipitaten hin untersucht. Es konnte bei 9 von 10 Tieren der mit Endostatinbeads
behandelten Gruppe III Endostatin nachgewiesen werden.
92 4 Ergebnisse
Zum Vergleich wurden stichprobenweise jeweils 3 Tiere aus allen 3 übrigen Gruppen
untersucht. In den Gewebeschnitten aus diesen Gruppen war keine positive
Immunreaktion nachweisbar.
Im Rahmen der Auswertung konnte eine deutlich positive Färbung der im Zellcore
der angeschnittenen CellBeads® liegenden Stammzellen gezeigt werden. Zudem war
die Alginathülle der Mikrokapseln an vielen Stellen ebenfalls positiv rot angefärbt.
Weiterhin war eine immunhistologisch positiv zu bewertende Anfärbung des die
CellBeads® direkt umgebenden Gewebes erkennbar. Im Bereich des experimentellen
Glioblastoms sowie des umgebenden Parenchyms konnten zudem multipel verteilte
immunpositive Aggregate dargestellt werden. Diese wurden in einer Entfernung von
bis zu 4 mm entfernt von den CellBeads® angereichert im Gewebe gezeigt. Eine
immunpositive Aktivierung konnte weiterhin in den Bereichen der Ventrikelwände und
des Virchow Robin Raumes ausgemacht werden. Die aufgefundenen
Endostatinpräzipitate sind beispielhaft in der Bildtafel 3 auf Seite 93 dargestellt.
4 Ergebnisse 93
4.2.2.1 Bildtafel 3
Bildtafel 3 Immunhistologische Färbung des humanen Endostatins nach der Implantation von Endostatin sezernierenden humanen mesenchymalen Stammzellen (EMSC) für 12 Tage
Das von den genmodifizierten Stammzellen sezernierte Protein konnte in den Stammzellen (A), im Alginat (al) (A/B), im direkt die CellBeads® umgebenden Parenchym (B/C), im Parenchym in einer Distanz von bis zu 4 mm zu den CellBeads® (D/H), im Tumorgewebe (G/H/J), im Virchow Robin Raum (E/F) und als Anlagerungen an den Gefäßen (I) nachgewiesen werden. Die Pfeile weisen auf die positiven Immunreaktionen hin.
D E F G
H I
A C B
J
EMSC
al CB
CB CB
94 4 Ergebnisse
4.2.3 Untersuchung der Tumorvaskularisierung
Zunächst wurden die Histomorphologie und Struktur der Blutgefäße beurteilt. Dabei
zeigten sich vor allem in den zentralen und ventralen Tumorregionen der
unbehandelten Tiere stark vaskularisierte Bereiche mit bis zu 500 Gefäßanschnitten
pro Quadratzentimeter, die einen Durchmesser von bis zu 600 µm erreichten. In den
subarachnoidal gelegenen Randbereichen der Tumoren waren deutlich weniger und
feinere Kapillaren zu erkennen. Ein großer Anteil der Gefäße wies eine endotheliale
Hyperplasie sowie eine Vielzahl mitotischer Figuren auf und war zum Teil stark
gewunden mit kavernösen Ausbuchtungen. Die histomorphologische Untersuchung
der mit Endostatin CellBeads® behandelten Tumoren zeigte deutlich kleinere
Blutgefäße, deren Endothelien strukturierter und unauffälliger waren. Zudem wiesen
die Tumoren der behandelten Tiere, anders als die der Kontrolltiere avaskuläre
Bereiche ohne Gefäßanschnitte auf. Die histomorphologischen Befunde des Tumors
und seiner Blutgefäße sind in Bildtafel 1 auf Seite 85 dargestellt.
Die Untersuchung der Blutgefäßdichten erfolgte nach zwei verschiedenen
Auswertungsparametern, die über die Partikeldetektion der immunhistologisch rot
angefärbten Endothelien erhoben wurden.
Einmal wurde die Gesamtfläche der detektierten Endothelien einschließlich der
Gefäßlumina als prozentualer Anteil an der detektierten Fläche des ROI (Region of
Interest) gemessen und die arithmetischen Mittelwerte der Gruppen gegeneinander
statistisch ausgewertet. Dabei wurden die 6 pro Tier detektierten ROI getrennt
ausgewertet. Zusätzlich wurde die Summe der Gefäßflächen über die 3 jeweils in
einem der beiden ausgewerteten Gewebeschnitte (größte Fläche und
Implantationslokalisation) aufgenommenen ROI gebildet. Die Daten wurden ebenfalls
statistisch über alle Gruppen ausgewertet.
4 Ergebnisse 95
Der andere Auswerteparameter war die Anzahl der Blutgefäße an denselben
Lokalisationen. Diese Gefäßanzahl wurde als Summe der detektierten
Gefäßanschnitte über die aufgenommenen 3 ROI für die beiden Gewebeschnitte
getrennt bestimmt und verglichen.
An der Implantationslokalisation war die Vaskularisierungsdichte bei den mit
Endostatinbeads (ECB) behandelten Tieren nach allen Auswerteparametern und in
allen 3 ROI signifikant kleiner als bei den Kontrollgruppen. Die Fläche der Gefäße in
allen 3 ROI, die Summe der Flächen über alle 3 ROI und die Summe der
Gefäßanzahl über alle 3 ROI war bei den mit ECB behandelten Tieren der Gruppe I
signifikant kleiner als bei den Gruppen I, II und IV.
Signifikanzen der mit ECB behandelten Tiere an der Implantationslokalisation:
ECB vs BT4Ca P < 0,05
ECB vs LCB P < 0,01
ROI-Bo
ECB vs SCB P < 0,01
ECB vs BT4Ca P < 0,05 ROI-Bm
ECB vs LCB P < 0,001
ROI-Bu ECB vs LCB P < 0,001
ECB vs BT4Ca P < 0,001
ECB vs LCB P < 0,001
Summe Flächen Bo/Bu/Bm
ECB vs SCB P < 0,01
Summe Anzahl Bo/Bu/Bm ECB vs BT4Ca P < 0,01
96 4 Ergebnisse
Bei der nach ROI getrennten Auswertung der Gefäßflächen zeigte sich im ROI-Bm
(Bregma –1 mm Mitte) eine signifikante Reduktion bei der mit Stammzellbeads (SCB)
behandelten Gruppe IV gegenüber der mit Leerbeads (LCB) behandelten Gruppe II.
Diese Signifikanz fand sich auch in der Summe der Gefäßflächen über alle 3 ROI (an
Bregma -1 mm) wieder.
Signifikanzen der SCB Gruppe an der Implantationslokalisation:
ROI-Bm SCB vs LCB P < 0,05
Summe Flächen Bo/Bm/Bu SCB vs LCB P < 0,01
Des Weiteren zeigte sich in der Auswertung der Summen der Gefäßflächen, dass die
Gefäßanschnittsflächen der Kontrollgruppe I (nur BT4Ca) signifikant kleiner war als
die der mit leeren Beads behandelten Gruppe II (LCB).
Signifikanz bei der Kontrollgruppe gegenüber Gruppe II an der Implantations-
Lokalisation:
Summe Flächen Bo/Bm/Bu BT4Ca vs LCB P < 0,01
Bei der statistischen Auswertung der Blutgefäßdichten an der Lokalisation der
größten Tumoranschnittsfläche zeigte sich die mit ECB behandelte Gruppe III bei
der Beurteilung der Gefäßflächen an allen 3 getrennt berechneten ROI, der Summe
der Gefäßflächen über 3 ROI und bei der Auswertung der Gefäßanzahl signifikant
kleiner als alle anderen Gruppen.
Die Auswertung der Gefäßanzahl als Summe über 3 ROI an der größten
Tumorfläche war bei der Endostatinbead-Gruppe III (ECB) signifikant kleiner als bei
allen anderen.
4 Ergebnisse 97
Dabei bestanden keine Unterschiede der Gruppen I, II und IV zueinander.
Signifikanzen der mit Endostatin behandelten Gruppe I an der größten
Tumoranschnittfläche:
ECB vs BT4Ca P < 0,01
ECB vs LCB P < 0,001
ROI-Fo
ECB vs SCB P < 0,001
ECB vs BT4Ca P < 0,01
ECB vs LCB P < 0,001
ROI-Fm
ECB vs SCB P < 0,05
ECB vs BT4Ca P < 0,05
ECB vs LCB P < 0,001
ROI-Fu
ECB vs SCB P < 0,05
ECB vs BT4Ca P < 0,001
ECB vs LCB P < 0,001
Summe Flächen Fo/Fu/Fm
ECB vs SCB P < 0,001
ECB vs BT4Ca P < 0,01
ECB vs LCB P < 0,05
Summe Anzahl Fo/Fu/Fm
ECB vs SCB P < 0,01
Bei allen zur Gefäßfläche erhobenen Daten (in den 3 getrennt gemessenen ROI und
in der Summe über alle drei ROI) war zudem die Gefäßfläche der Kontrollgruppe I
(nur BT4Ca) signifikant kleiner als die der mit Leerbeads behandelten Gruppe II
(LCB). Signifikanzen der Kontrollgruppe gegenüber LCB:
ROI-Fo BT4Ca vs LCB P < 0,05
ROI-Fm BT4Ca vs LCB P < 0,001
ROI-Fu BT4Ca vs LCB P < 0,05
Summe Flächen Fo/Fu/Fm BT4Ca vs LCB P < 0,001
98 4 Ergebnisse
Die Gruppe IV (Stammzellbeads, SCB) zeigte bei der statistischen Auswertung der
Daten aus ROI-Fm (größte Fläche Mitte), ROI-Fu (größte Fläche unten) und bei
denen aus der Summe der Flächen über alle 3 ROI einen signifikanten Unterschied
zur Gruppe II (Leerbeads, LCB). Signifikanzen SCB gegenüber Leerbeads:
ROI-Fm SCB vs LCB P < 0,05
ROI-Fu SCB vs LCB P < 0,01
Summe Flächen Fo/Fu/Fm SCB vs LCB P < 0,001
Einen Überblick verschaffen die Graphen 1 bis 10 und die Abbildungen der Bildtafel
4 auf Seite 99. Die ausführlichen statistischen Daten sind dem Anhang beigefügt.
4 Ergebnisse 99
4.2.3.1 Bildtafel 4
Bildtafel 4 Immunhistologische Färbung des von-Willebrand-Faktors zur Beurteilung der Blutgefäßdichten nach 12 Tagen Übersichtsaufnahme mit dem 1,25er Objektiv (AI/AII/AIII/AIV) und beispielhafte Darstellung der mit dem 10er Objektiv zur Partikeldetektion aufgenommenen ventralen ROI (BI/BII/BIII/BIV); Endothelien (e) der intratumoralen Blutgefäße (b) rot angefärbt; Gliomzellen und Parenchym blau; Für Glioblastome typische, glomeruläre Struktur der Blutgefäße erkennbar (c).
Gruppe I (AI/BI) nur BT4Ca-Zellen
Gruppe II (AII/BII) BT4Ca-Zellen und
Implantation
leerer CellBeads®
Gruppe III (AIII/BIII) BT4Ca-Zellen und
Implantation
Endostatin sezernierender
hMSC CellBeads®
Gruppe IV(AIV/BIV) BT4Ca-Zellen und
Implantation
nicht genmodifizierter
hMSC CellBeads®
A I
A IV
A III
A II
B I
B II
B III
B IV
e
e
e
b
c
b
b
e
b
100 4 Ergebnisse
Prozentualer Anteil der von den Gefäßeneingenommenen Fläche
an der Fläche des ROI-Fo(größte Anschnittsfläche-oben)
Kontrolle LCB ECB SCB0
102030405060708090
* ** *
Graph 1
[% R
OI]
Prozentualer Anteil der von den Gefäßeneingenommenen Fläche
an der Fläche des ROI-Fm(größte Anschnittsfläche-mitte)
Kontrolle LCB ECB SCB0
102030405060708090
**
*
**
Graph 2
[% R
OI]
Prozentualer Anteil der von den Gefäßeneingenommenen Fläche
an der Fläche des ROI-Fu(größte Anschnittsfläche-unten)
Kontrolle LCB ECB SCB0
102030405060708090 **
*
**
Graph 3
[% R
OI]
Vaskularisierung an der größten Anschnittsfläche 1
Endostatinbeads (ECB) und Stammzellbeads (SCB)gegenüber Leerbeads (LCB) und der Kontrollgruppe
ROI= Region of Interest= 575321,78 µm²,Fläche über dieausgewertet wurde
= kennzeichnet statistischsignifikante Unterschiedezwischen den Gruppen
*
4 Ergebnisse 101
Prozentualer Anteil der von den Gefäßeneingenommenen Fläche
über alle drei ROI an der größten Anschnittsfläche
Kontrolle LCB ECB SCB0
2.5×105
5.0×105
7.5×105
1.0×106 ***
*
*
Graph 4
[µm
²]
Anzahl der Gefäßanschnitte überalle drei ROI an der größten Anschnittsfläche
Kontrolle LCB ECB SCB0
250050007500
100001250015000175002000022500 * *
*
Graph 5
Vaskularisierung an der größten Anschnittsfläche 2Endostatinbeads (ECB) und Stammzellbeads (SCB)gegenüber Leerbeads (LCB) und der Kontrollgruppe
ROI= Region of Interest= 575321,78 µm²,Fläche über dieausgewertet wurde
* = kennzeichnet statistischsignifikante Unterschiedezwischen den Gruppen
102 4 Ergebnisse
Prozentualer Anteil der von den Gefäßeneingenommenen Fläche
an der Fläche des ROI-Bo(Bregma -1 mm-oben)
Kontrolle LCB ECB SCB0
102030405060708090
***
Graph 6
[% R
OI]
Prozentualer Anteil der von den Gefäßeneingenommenen Fläche
an der Fläche des ROI-Bm(Bregma -1 mm-mitte)
Kontrolle LCB ECB SCB0
102030405060708090
***
Graph 7
[% R
OI]
Prozentualer Anteil der von den Gefäßeneingenommenen Fläche
an der Fläche des ROI-Bu(Bregma -1 mm-unten)
Kontrolle LCB ECB SCB0
102030405060708090 *
*
Graph 8
[% R
OI]
Vaskularisierung an der Implantationslokalisation 1
Endostatinbeads (ECB) und Stammzellbeads (SCB)gegenüber Leerbeads (LCB) und der Kontrollgruppe
ROI= Region of Interest= 575321,78 µm²,Fläche über dieausgewertet wurde
= kennzeichnet statistischsignifikante Unterschiedezwischen den Gruppen
*
4 Ergebnisse 103
Prozentualer Anteil der von den Gefäßeneingenommenen Fläche
über alle drei ROI an Bregma -1 mm
Kontrolle LCB ECB SCB0
2.5×105
5.0×105
7.5×105
1.0×106
*
*** *
Graph 9
[µm
2 ]
Anzahl der Gefäßanschnitte überalle drei ROI an Bregma -1 mm
Kontrolle LCB ECB SCB0
5000
10000
15000 *
Graph 10
Vaskularisierung an der Implantationslokalisation 1Endostatinbeads (ECB) und Stammzellbeads (SCB)gegenüber Leerbeads (LCB) und der Kontrollgruppe
ROI= Region of Interest= 575321,78 µm²,Fläche über dieausgewertet wurde
= kennzeichnet statistischsignifikante Unterschiedezwischen den Gruppen
*
Vaskularisierung an der Implantationslokalisation 2
104 4 Ergebnisse
4.2.4 Untersuchung der Tumorvolumina
Der Vergleich der Tumorvolumina erfolgte nach rechnerischer Auswertung der über
die ganze Länge des Tumors gemessenen Anschnittflächen als arithmetische
Mittelwerte aller Gruppen gegeneinander. Dazu wurden die Gewebeschnitte mittels
Hämatoxylin-Eosin (H.E.) gefärbt und die Flächen mit einer speziellen Software
(cell*f, Olympus) bei 1,25-facher Objektivvergrößerung gemessen. Da ein Tier aus
der Kontrollgruppe I (nur BT4Ca) am Tag 9 post operationem verstarb und bei 2
witeren Tieren die Implantation der Gliomzellen misslang, konnten in dieser Gruppe
nur 7 Tiere ausgewertet werden
Nach der statistischen Auswertung waren die Tumorvolumina der mit Endostatin
sezernierenden Stammzellen behandelten Tiere (Gruppe III, ECB) nicht signifikant
kleiner als die Tumoren bei den Tieren aus den anderen drei Gruppen. Es konnte
lediglich eine tendenzielle Verkleinerung gegenüber der mit Leerbeads (Gruppe II,
LCB) behandelten Gruppe gezeigt werden.
Einen signifikanten Unterschied gab es lediglich zwischen den Tumorvolumina der
Tiere aus der mit LCB behandelten Gruppe gegenüber der mit Stammzellbeads
(SCB) behandelten Gruppe. Dabei waren die Tumoren der mit SCB kleiner als die
Tumoren der mit LCB behandelten Tiere.
Es bestand kein signifikanter Unterschied der Tumorvolumina zwischen den Tieren
der Gruppe I (nur BT4Ca), der Gruppe II (Leerbeads, LCB) und den Tieren der
Gruppe III (Endostatinbeads, ECB). Signifikanzen der Tumorgrößenunterschiede
innerhalb der Gruppen I bis IV, einzige Signifikanz an SCB vs LCB:
BT4Ca vs ECB P > 0,05 SCB vs ECB P > 0,05
BT4Ca vs LCB P > 0,05 SCB vs LCB P < 0,05
BT4Ca vs SCB P > 0,05 ECB vs LCB P > 0,05
Die detaillierten Ergebnisse der statistischen Untersuchung sind im Anhang
aufgeführt. Zur graphischen Darstellung siehe Graph 11 und einen Überblick über die
Tumoren verschaffen die Abbildungen der Bildtafel 5 auf Seite 105.
4 Ergebnisse 105
4.2.4.1 Bildtafel 5
Bildtafel 5 H.E. Färbung zum Nachweis der Implantate und zur Auswertung der Tumorgrößen nach 12 Tagen
Tumoren (a) bei den Gruppen I bis IV (AI/AII/AIII/AIV) mit in Kommunikation zum Ventrikel (V) implantierten Leerbeads (LCB), Endostatin CellBeads® (ECB), nicht sezernierenden Stammzellbeads (SCB); Darstellung der implantierten CellBeads® und ihres Kontaktes zum Ventrikel (B/C); CellBeads® mit Alginatkapsel (al) und nicht sezernierenden Stammzellen (hMSC) (D), Endostatin sezernierende Stammzellen (EMSC) im CellBead® (E) und Goldpartikel (gp) im Leerbead (LCB) (F)
AI
AIV AIII
AII
a
aa
a
SCBECB
LCB
B
FE D
CECB
ECBSCB
LCB
LCB
VV
al EMSC al gphMSC
106 4 Ergebnisse
Kontrolle SCB ECB LCB0.0
2.5×10 10
5.0×10 10
7.5×10 10
1.0×10 11
1.2×10 11
1.5×10 11
1.7×10 11 *
Arithmetische Mittelwerte über die Tumorvolumina, gemessen als Flächen in µm² in definierten Abständen durch die Länge des Tumors und berechnet als Summe von Kegelstümpfen in µm³
[µm³]
Tumorvolumina
Endostatinbeads (ECB) und Stammzellbeads (SCB)gegenüber Leerbeads (LCB) und der Kontrollgruppenach 12 Tagen
Graph 11
*
= statistisch signifikanter Unterschied zwischen zwei Gruppen
4 Ergebnisse 107
4.2.5 Korrelation zwischen Tumorvolumen und Blutgefäßdichte
Um zu ermitteln, ob ein direkter Zusammenhang zwischen der Vaskularisierung des
Tumors und seinem Volumen bestand, wurden für jede Versuchsgruppe getrennt die
Korrelation zwischen den Gefäßflächen und dem Tumorvolumen bestimmt. Dazu
wurde die Summe der Gefäßflächen über die 3 an einer Lokalisation ausgewerteten
ROI (Region of Interest) gebildet. So entstand eine Gefäßflächensumme pro
Lokalisation (Bregma –1 mm oder größte Fläche) und pro Tier, deren Korrelation zu
den entsprechenden Tumorvolumina ermittelt wurde. Bei 7 Tieren in Gruppe I (nur
BT4Ca) macht das 14 Paare (Graph 12), für Gruppe II (LCB) 16 Paare (Graph 13),
für Gruppe III (ECB) 20 Paare (Graph 14) und für Gruppe IV (SCB) noch mal 16
Paare (Graph 15), deren Korrelation getrennt voneinander berechnet wurde.
Es zeigte sich, dass bei diesem Versuchsmodell das Tumorvolumen und die
Blutgefäßdichte nicht korrelierten (r² < 0,8). Die graphische Darstellung ist in Graph
12-15 einzusehen und die genauen statistischen Daten sind im Anhang aufgeführt.
108 4 Ergebnisse
Korrelation Kontrollgruppenur BT4Ca
0
2.5×1
010
5.0×101
0
7.5×10
10
1.0×1
011
1.2×101
1
1.5×10
11
1.7×10
11
2.0×10
112.5×1053.0×1053.5×1054.0×1054.5×1055.0×1055.5×1056.0×1056.5×1057.0×1057.5×105
Goodness of Fitr² 0,4276Sy.x 108400
Graph 12
Tumorvolumen
Gefä
ßflä
che
ROI [
µ²]
Korrelation Leerbeads (LCB)
0
2.5×10
10
5.0×1
010
7.5×1
010
1.0×10
11
1.2×1
011
1.5×1
011
1.7×10
11
2.0×1
011
01.0×1052.0×1053.0×1054.0×1055.0×1056.0×1057.0×1058.0×1059.0×1051.0×1061.1×106
Goodness of Fitr² 0,2485Sy.x 169400
Graph 13
Tumorvolumen
Gef
äßflä
che
RO
I [µ²
]
Korrelation Stammzellbeads (SCB)
7.5×1
010
1.0×1
011
1.2×1
011
1.5×1
011
1.7×1
011
2.0×1
011
2.5×1053.0×1053.5×1054.0×1054.5×1055.0×1055.5×1056.0×1056.5×1057.0×1057.5×105
Goodness of Fitr² 0,003635Sy.x 131900
Graph 15
Tumorvolumen
Gef
äßfl
äche
RO
I [µ²
]
Korrelation Endostatinbeads (ECB)
0
2.5×1
010
5.0×1
010
7.5×1
010
1.0×1
011
1.2×1
011
1.5×1
011
1.7×1
011
2.0×1
011
0
5.0×104
1.0×105
1.5×105
2.0×105
2.5×105
Goodness of Fi tr² 0,1285Sy.x 45300
Graph 14
Tumorvolumen
Gef
äßflä
che
ROI [
µ²]
Korrelation zwischen Tumorvoluminaund Vaskularisierung
über beide LokalisationenDie Summe der Gefäßflächen aller sechs ausgemessenen ROIgegenüber dem jeweiligen Tumorvolumen für alle vier Gruppengetrennt
Korrelation zwischen Tumorvolumina
und Vaskularisierung
über beide Lokalisationen Die Summe der Gefäßflächen aller sechs ausgemessenen ROI
gegenüber dem jeweiligen Tumorvolumen für alle vier Gruppen getrennt
5 Diskussion 109
5 Diskussion
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte ein reproduzierbares Glioblastommodell in
der Ratte entwickelt werden, bei dem ein vergleichbarer experimenteller Gehirntumor
in der rechten Großhirnhemisphäre erzeugt wurde. Daran sollte die Wirksamkeit
Endostatin freisetzender CellBeads® auf die Blutgefäßdichte und das Tumorvolumen
untersucht werden. Die Freisetzung des von den Implantaten sezernierten Wirkstoffs
sollte immunhistologisch bewiesen und damit die Funktionalität der Implantate belegt
werden. Dazu mussten die Verfahren der Zellkultur und die Inokulation der Zellen
etabliert werden. Weiterhin sollte eine Methodik zur sicheren Applikation der
mikroverkapselten Stammzellen in einer festen intraparenchymalen Lage mit
Kontaktaufnahme zum Ventrikelsystem entwickelt werden.
5.1 Diskussion der Methodik
5.1.1 Tierexperimentelles Modell
5.1.1.1 Gliomzelllinie BT4Ca
Die Gliomzelllinie BT4C wurde 1971 von DRUCKREY et al. durch die Verabreichung
von N-ethyl-N-Nitroseharnstoff in BDIX-Ratten generiert. Auf diese Weise konnte
eine zu diesem Rattenstamm syngene Gliomzelllinie mit einem identischen MHC-
Haplotypen entwickelt werden, die zur Inokulation eines experimentellen
Gehirntumors geeignet war. DEISSLER et al. generierten 1996 an der Universität
Essen in BDIX/Ztm-Ratten mittels derselben Methodik eine Gliomzelllinie und
nannten diese BT4Ca. Diese Zellen wurden für die vorliegende Arbeit von dem
Institut für Zellbiologie (Tumorforschung) des Universitätsklinikums Essen bezogen
und im International Neuroscience Institute (Hannover) kultiviert. Die Syngenität mit
den BDIX/Ztm-Ratten wurde am Zentralen Tierlabor der Medizinischen Hochschule
(Hannover) mittels Zytotoxizitätstest bestätigt.
110 5 Diskussion
BEUTLER et al. (1999) führten zum Beweis der Syngenität mit BDIX-Ratten eine
MHC-Typisierung der verwendeten Gliomzellen durch. Die Kultivierung erfolgte
anhand der vorliegenden Literatur (READ et al. 2001, BEREZIN et al. 1997), wobei
sowohl überprüft wurde, welche die idealen Einsaatdichten und die beste
Passagedauer für die hier verwendeten Zellen waren und ob die Gliomzellen durch
die Kryokonservierung Vitalitätsverluste zeigten. Diese Prüfung erfolgte anhand der
Austestung verschiedener an der Literatur orientierter Ausgangswerte und wurde so
lange wiederholt, bis zufrieden stellende und reproduzierbare Ergebnisse im Hinblick
auf Zellmorphologie, Dichte des Zellrasens und Vitalität der Zellen erzielt wurden.
5.1.1.2 Histologie des Tumors
Die Gewebeschnitte zur histologischen Auswertung wurden orientiert an der
bestehenden Literatur als Kryostatenserienschnitte mit einer Schnittdicke von 10 µm
angefertigt, mittels Hämatoxylin Eosin (H.E.) gefärbt und beurteilt (LANGEN et al.
1998, ABOUNADER et al. 1995). Dabei wurden die Zellkerne angefärbt und der
strukturelle Aufbau des Tumors dargestellt (siehe Bildtafel 1 auf Seite 85) Die
Tumoren stellten sich typisch mit einer erhöhten Zelldichte, mitotischen Figuren,
großen glialen Tumorzellen mit großem Kern-Plasma-Verhältnis, der Bildung von
Pseudopalisaden und Nekrosen sowie einer erhöhten Vaskularisierungsdichte und
endothelialer Hyperplasie dar (TANAKA et al. 2006). Makroskopisch zeigten die
Tumoren die für Glioblastome typische gallertige bis zerfließende, blasige, teilweise
blutig infiltrierte Struktur (siehe Abbildung 8 auf Seite 65). Die histologischen Befunde
waren weitgehend mit den bei humanen Glioblastomen erhobenen vergleichbar
(WAGGENER et al. 1976). Eine veränderte Blutgefäßmorphologie einhergehend mit
der Ausbildung kavernöser und gewundener Gefäßstrukturen war ebenfalls zu
erkennen (LEON et al. 1996). Allerdings stellten sich das Tumorwachstum und seine
Ausdehnung im Vergleich zu den pathologischen Befunden beim Menschen weniger
infiltrativ als vielmehr verdrängend dar (DHAYAT u. GUGGEMOS 1999/2000).
5 Diskussion 111
So konnten nur vereinzelt von Gliomzellen flankierte Blutgefäße ausgemacht werden,
die infiltrierend in das umgebende Parenchym einwuchsen.
Die ermittelte Zellzahl von 8 x 103 Zellen suspendiert in 3 µl zur Inokulation des
Tumormodells findet sich in der Literatur bei READ et al. (2001a). Es wurde versucht
durch die Applikation von weniger Tumorzellen einen kleineren Tumor entstehen zu
lassen und dadurch eine Verlängerung des Untersuchungszeitraumes zu
ermöglichen. Aufgrund der logarithmischen Proliferation der Zellen und der
Notwendigkeit einer Mindestzellzahl (BEREZIN et al. 1997) zur Entwicklung eines
gleichmäßigen Tumors wurden aber bei der Applikation von weniger Zellen keine
zufrieden stellenden Ergebnisse erzielt. Bereits die Reduktion der implantierten
Zellzahl auf 6 x 10³ führte zu einer großen Variabilität innerhalb der Tumorgrößen
(Kapitel 4.1.2 Bildtafel 1, Seite 85). Diese Ergebnisse deckten sich mit den Befunden
aus der in vitro Untersuchung der Zellen zur Ermittlung der geeigneten
Einsaatdichten. Dabei zeigte sich ebenfalls eine starke Erhöhung der Heterogenität,
einhergehend mit dem Absterben von bis zu 50% der Zellen innerhalb der ersten 3
Tage nach der Subkultivierung, wenn diese zu gering konzentriert (< 3 x 104 pro ml)
in die Zellkulturflaschen eingesät worden waren.
5.1.1.3 Intrazerebroventrikuläre Implantation der CellBeads®
Die intraparenchymale räumlich nahe zum Tumor gelegene Applikation der
CellBeads® mit Kontakt zum Ventrikelsystem sollte eine Diffusion des Proteins
Endostatin in den Tumorbereich gewährleisten. Es gelang bis zu 12 CellBeads®
direkt am rechten Seitenventrikel, fest im Parenchym verankert und durch Eröffnung
des Ventrikels während der Implantation, in Kommunikation zu ihm zu platzieren. Die
histologischen Befunde zeigten, dass der Stichkanal nach 12 Tagen weitgehend
verschwunden war, so dass auch teilweise von einem astrozytären Wiederverschluss
der Ventrikeleröffnung ausgegangen werden muss (siehe Bildtafel 2 auf Seite 90).
112 5 Diskussion
Die direkte transparenchymale Diffusion, wurde von READ et al. (2000) über eine
Strecke von 1,7 mm beschrieben. Durch den Kontakt zum rechten Seitenventrikel
wurde außerdem eine Verteilung des Endostatins über den Liquor erreicht. Die
Implantate wurden in dieser Arbeit nicht direkt im Tumor platziert sondern
intraparenchymal ventral des Glioms. Trotzdem konnten immunhistologisch positive
Endostatinaggregate auch in einer Entfernung von bis zu 4 mm von den CellBeads®
sowohl intraparenchymal als auch im Tumorgewebe nachgewiesen werden. Die
Untersuchung der Diffusion über eine längere Distanz ist besonders von klinischer
Relevanz, da nach der chirurgischen Tumorresektion im Tumorbett verbliebene,
Rezidive auslösende Tumorzellen so über Diffusion nach einer Applikation der
CellBeads® in der Resektionshöhle erreicht würden.
Vorteile der Verabreichung eines therapeutischen Wirkstoffs mit Hilfe
alginatverkapselter Stammzellen sind die Möglichkeit der minimal invasiven, direkten
Verabreichung unter Umgehung der Blut-Hirn-Schranke. So werden hohe
Wirkstoffkonzentrationen am Zielort bei minimaler systemischer Belastung erzielt und
zudem die Möglichkeit einer somatischen ex vivo Gentherapie ohne Eingriff in das
Patientengenom geschaffen.
5.1.1.4 Biokompatibilität der implantierten CellBeads®
In diversen Veröffentlichungen wurde Alginat eine gute Biokompatibilität und
Immunisolierung sowohl nach intraperitonealer (KULSENG et al. 1999) als auch
nach intrazerebraler Injektion (READ et al. 1999, VISTED u. LUND-JOHANSEN
2003) zugeschrieben. Anhand klinischer Versuche wurden die Stabilität und
Verträglichkeit bewiesen (LAHAM et al. 1999, SOON-SHIONG et al. 1994). Neuere
Publikationen belegten zudem den erfolgreichen Einsatz alginatverkapselter Gewebe
oder Stoffe zur neuroprotektiven Therapie bei Morbus Huntington (BORLONGAN et
al. 2004a), der Parkinsonerkrankung (YASUHARA et a. 2005) und beim Schlaganfall
(BORLONGAN et al. 2004b).
5 Diskussion 113
Weiterhin wurde in einer vorausgegangenen Dissertationsarbeit am International
Neuroscience Institute (BARTSCH 2005) eine gute Biokompatibilität, einhergehend
mit erhaltener Vitalität der implantierten Stammzellen nach 8 Wochen bei den in
dieser Arbeit verwendeten CellBeads® gezeigt. So wurde histologisch eine
unveränderte Neuronenstruktur mit geringgradiger Astrozytose und ohne
Fibrosierungen gezeigt.
Nach Explantation der CellBeads®, konnte bei 98% der Implantate mittels SYBR
vermittelter Markierung eine erhaltene Vitalität nachgewiesen werden. Die in dieser
Arbeit erhobenen histologischen Befunde zeigten keine Hinweise auf eine
Entzündungsreaktion oder Aktivierung immunologischer Prozesse sowie intakte und,
aus der positiven immunhistologischen Reaktion des Endostatins folgernd,
sezernierende vitale Implantate. Dies belegt die gute Verträglichkeit und
Anwendbarkeit der verwendeten xenogenen alginatverkapselten Implantate.
5.1.2 Untersuchungsmethoden
Die angewendeten Untersuchungsmethoden ließen die Vergleichbarkeit der
erhobenen Daten mit publizierten Methoden und Ergebnissen zu, hielten der
Überprüfung auf Reproduzierbarkeit stand und erlaubten die Beurteilung der
Wirksamkeit des durch die implantierten Mikrokapseln sezernierten Endostatins.
Die verwendeten CellBead® Chargen waren dabei bis zum Abschluss der
Auswertungen kodiert, so dass durch die verblindete Durchführung eine
unvoreingenommene Datenerhebung garantiert war.
5.1.2.1 Immunhistologische Untersuchung der Endostatinfreisetzung
READ et al. (2001) zeigten die Endostatinverteilung nach der Implantation
sezernierender Mikrokapseln mittels immunhistologischer Anfärbung des Proteins.
Um den Nachweis des sezernierten Proteins Endostatin und damit der Funktionalität
der Gefäße immunhistologisch zu führen, wurde ein Antikörper ausgewählt, der
spezifisch an humanes Endostatin bindet.
114 5 Diskussion
Da das Endostatin als frei diffundierendes Protein erwartungsgemäß zumindest in
weiter von seinem Ausgangspunkt, den CellBeads® entfernten Bereichen, stark
verdünnt vorlag, wurde eine sehr sensible Antikörperverdünnung gewählt. Dennoch
waren störende Hintergrundfärbungen durchweg gering und die immunhistologisch
positiv rot gefärbten Proteinaggregate nach Gegenfärbung mit Hämatoxylin sehr gut
zu erkennen (siehe Bildtafel 3 auf Seite 93).
Die Endostatinfreisetzung wurde als positive oder negative Immunreaktion
ausgewertet, wobei das Auffinden des humanen Endostatins außerhalb der
CellBeads® den Schluss auf die stattgefundene Sekretion erlaubte. Weiter wurde
beurteilt, wo im Gewebeanschnitt Endostatin zu finden war, um so Hinweise auf
seine Verteilung zu bekommen.
5.1.2.2 Wirksamkeitsuntersuchung der Endostatin CellBeads®
Die antiangiogene Wirksamkeit von Endostatin wurde trotz der bisher nicht genau
geklärten Wirkmechanismen in verschiedenen Arbeiten untersucht. Die meisten der
aktuellen Veröffentlichungen befassen sich dabei mit den tumorsuppressiven Folgen
einer Angiogenesehemmung durch Endostatin. So untersuchten SU et al. (2006) die
Auswirkungen einer Endostatinbehandlung auf das Prostatakarzinom, LI et al. (2006)
auf ein nasopharyngeales Karzinom, ALBA et al. (2006) untersuchten die
Auswirkungen unterschiedlicher Serumendostatinkonzentrationen auf das Wachstum
von Mammakarzinomen und SUBRAMANIAN et al. (2006) zeigten
Tumorsuppression und verlängerte Überlebenszeiten bei ovariellen Tumoren. Aber
auch im Zusammenhang mit anderen mit einer erhöhten Vaskularisierung
einhergehenden Erkrankungen wurde die Wirksamkeit von Endostatin getestet.
BECKER et al. (2006b) zeigten die antiangiogene Wirkung des Endostatins
einhergehend mit einer Besserung der histomorphologischen Befunde bei der
Endometriose und ICHINOSE et al. (2005) zeigten eine Verbesserung der
Nierenbefunde bei Diabetes Mellitus Typ 1 unter Endostatinbehandlung.
5 Diskussion 115
READ et al. (2001) untersuchten die Wirkung von Endostatin auf das Glioblastom
anhand der Implantation alginatverkapselter Endostatin sezernierender Stammzellen.
Sie zeigten verlängerte Überlebenszeiten von 84% gegenüber den Kontrolltieren,
quantifizierten die Tumorvolumina jedoch nicht. Zudem färbten sie die intratumoralen
Blutgefäße immunhistologisch an und zeigten bei 77% der behandelten Tiere nicht
vaskularisierte Bereiche werteten aber auch hier nur qualitativ aus. Die in dieser
Arbeit durchgeführte Detektion der angefärbten Endothelien ermöglicht auch den
quantitativen Vergleich der Vaskularisierungsdichten. JOKI et al. (2001) untersuchten
die Auswirkungen Endostatin freisetzender Mikrokapseln auf Gliomzellen in einem
Mausmodell und verglichen das Gewicht der entnommenen Tumoren. Sie konnten
eine Tumorreduktion nachweisen, inokulierten aber die Tumoren nicht intrazerebral,
sondern subkutan und erhoben keine Daten über die Neovaskularisierung. Eine
komplette Entnahme der Tumoren war bei dem in dieser Arbeit angewendeten
intrazerebralen Modell nicht praktikabel. Das induzierte Gliom wäre durch seine
gallertig weiche Textur nicht in toto zu entnehmen gewesen und so der entstehende
Fehler nicht kalkulierbar. Zudem ermöglichten die histologische und
immunhistologische Untersuchung nach Kryofixation und Anfertigung von
Serienschnitten auch die Beurteilung von Histomorphologie, Nachweis der CB,
Endostatinsekretion und Gewebsreaktionen des Empfängertieres.
5.1.2.2.1 Histologische Untersuchung der Tumorvolumina
Die Hämatoxylin Eosin (H.E.) Färbung ermöglichte eine deutliche Abgrenzung des
Tumorgewebes vom umgebenden Parenchym, so dass eine Ausmessung der
Anschnittflächen gut realisierbar war. Das verwendete Mikroskop BX51 Hellfeld
(Olympus) in Kombination mit der eingesetzten Software cell*f (Software for Life
Imaging, Olympus) ermöglichten durch eine Bildmontagefunktion (Multiple Imaging
Alignment, MIA) die Aufnahme auch sehr großer Tumoranschnitte bei immer
derselben Vergrößerung (1,25er Objektiv) in einem Bild (siehe Bildtafel 5 auf Seite
105).
116 5 Diskussion
Dabei wurden mehrere Aufnahmen von den verschiedenen Bereichen des Tumors
angefertigt und mittels rechnerischen Ränderabgleichs, der MIA Funktion, zu einem
Bild zusammengesetzt. Um ein möglichst genaues Arbeiten zu ermöglichen, wurden
die Tumoren im Anschluss mittels Handwerkzeug Funktion bei 50-fachem Zoom
umfahren und die entstehenden Flächen durch das Programm berechnet und
dokumentiert.
Waren in einem Gewebeanschnitt mehrere nicht miteinander verbundene
Tumoranschnittflächen zu erkennen beziehungsweise kam es durch
Schneideartefakte zur Überlappung einzelner Tumorbereiche, so wurden diese
Flächen zusätzlich umfahren und die Werte addiert. Die Berechnung erfolgte
standardisiert über alle Tumoren mit Excel (Microsoft) auf einem Personal Computer
und wurde mit einem CASIO CFX-9850GB PLUS-WE (Casio Computer Co., LTD.,
Tokyo, Japan) kontrolliert.
5.1.2.2.2 Immunhistologische Untersuchung der Vaskularisierung
In Ahnlehnung an verschiedene Publikationen, die sich mit der immunhistologischen
Darstellung von Blutgefäßen in einem Tumor oder anderen stark vaskularisierten
Gebieten auseinander gesetzt haben, wurde der von-Willebrand-Faktor als Ziel der
antikörperbindungsabhängigen Färbung gewählt (READ et al. 2001, YOSHIMURA et
al. 1998). Dabei bindet der Antikörper an die Endothelien der Blutgefäße und lässt
sich über eine Sekundärantikörper vermittelte Farbstoffbindung sichtbar machen. Der
von-Willebrand-Faktor wird nur von den Endothelzellen exprimiert, so dass der
Nachweis hochspezifisch ist. Aufgrund der konstant hohen Synthese des von-
Willebrand-Faktors und der hohen Sensitivität des Antikörpers ist die Untersuchung
zudem ausreichend sensibel (SELBY et al. 1997). Die immunhistologisch positiven
deutlich rot gefärbten Endothelien hoben sich von dem mittels Hämatoxylin-
Gegenfärbung blau gefärbten Hintergrund deutlich ab und waren sehr gut digital zu
detektieren (siehe Bildtafel 4 auf Seite 99).
5 Diskussion 117
Die Auswertung erfolgte mittels automatisierter und dadurch standardisierter
Partikeldetektion. Dazu wurde anhand von mehreren Beispielen, die manuell im
Schnitt markiert wurden, zunächst ein Farbschwellwert bestimmt, der die
Detektionsgrenze definierte. Dieser einmal festgelegte Wert wurde dann für alle
folgenden Detektionen übernommen. Die Datenerhebung erfolgte einmal als Summe
der Gefäßflächen pro detektierter Fläche (ROI, Region of Interest) und zudem als
Gesamtanzahl der detektierten Blutgefäßanschnitte. So wurde die
Vaskularisierungsdichte in zwei verschiedenen Parametern ausgedrückt. Es wurden
pro Tier insgesamt 6 ROI ausgewertet, davon jeweils 3 an 2 verschiedenen
Lokalisationen. Da die Blutgefäße in einem Glioblastom dem Tumor folgend
dreidimensional auswachsen und dabei eine Baumkronen ähnliche Struktur
annehmen, wurden die Lokalisationen so gewählt, dass bei allen Tieren eine
ähnliche Blutgefäßstruktur zu erwarten war.
Dazu wurden die Implantationslokalisation (Bregma –1 mm) als Ausgangspunkt des
Tumorwachstums und der Anschnitt mit der größten gemessenen Fläche als
morphologisches Zentrum des Tumorwachstums ausgewählt. Dieser breite
Auswerterahmen wurde gewählt, um zufällige Blutgefäßansammlungen,
beziehungsweise zufällig nicht stark durchblutete Bereiche, ausgleichen zu können.
118 5 Diskussion
5.2 Diskussion der Ergebnisse der Wirksamkeitsuntersuchung
5.2.1 Endostatinfreisetzung aus den CellBeads®
Anhand der durchgeführten immunhistologischen Untersuchungen konnte Endostatin
sowohl in den implantierten Mikrokapseln als auch außerhalb der Implantate gezeigt
werden (siehe Bildtafel 3 auf Seite 93). Damit gelten die Freisetzung des Proteins
und die Funktionalität der Implantate als erwiesen. Die positive Anfärbung von
Endostatin der in den angeschnittenen CellBeads® liegenden Stammzellen belegte
ihre Sekretionsaktivität und somit ihre Vitalität während des
Untersuchungszeitraumes. Positive Immunreaktionen zeigten sich besonders im
Bereich der Alginatkapsel, in der das Endostatin in besonders hoher Konzentration
vorlag. Dies beweist die Diffusion des Endostatins durch die Implantatkapsel. Eine
positive Endostatinmarkierung zeigte sich auch im die CellBeads® direkt
umgebenden Parenchym. Weitere Endostatinanreicherungen waren im Bereich des
rechten Seitenventrikels und im die Gehirngefäße begleitenden Virchow Robin Raum
zu beobachten. Diese Beobachtungen waren im Hinblick auf den physiologischen
intrazerebralen Drainageweg und Proteintransport, vom Plexus Choroideus
ausgehend transparenchymal über die Arachnoidalvilli zu den abführenden
Blutgefäßen, zu erwarten. Sowohl diese Beobachtungen, als auch in einer
Entfernung von bis zu 4 mm von den CellBeads® aufgefundene immunpositive
Präzipitate weisen, anders als von READ et al. (2001) beschrieben, auf eine
transparenchymale Endostatindiffusion über 1,7 mm hinaus, hin. Da die
Mikrokapseln mit Kontakt zum liquorführenden Ventrikelsystem implantiert wurden,
muss auch von einem Endostatintransport über den Liquor ausgegangen werden. So
ist es möglich, dass die fern von den Mikrokapseln gefundenen Präzipitate auch auf
extraparenchymal transportiertes Endostatin zurückzuführen sind.
5 Diskussion 119
Eine genaue Ermittlung der Endostatinverteilung und Beurteilung des intrazerebralen
Endostatinweges waren mit diesem Verfahren nicht möglich. Es muss davon
ausgegangen werden, dass das sezernierte Protein an vielen Stellen so stark
verdünnt im Parenchym vorlag, dass es mittels Immunhistologie nicht angefärbt
beziehungsweise durch die Gegenfärbung überfärbt wurde. Deshalb konnten nur
Anreicherungen des Proteins lokalisiert werden und daraus Schlussfolgerungen auf
seine Verteilung gezogen werden.
5.2.2 Wirksamkeit der Endostatin sezernierenden CellBeads®
Die Untersuchung der Wirksamkeit des von den Implantaten freigesetzten
Endostatins erfolgte anhand von zwei Parametern. Zum einen war dies die
Untersuchung der antiangiogenen Wirkung. Dazu wurde die Vaskularisierungsdichte
in den untersuchten Tumoren als anteilige Gefäßfläche und als Blutgefäßanzahl pro
untersuchter Region ermittelt. Der andere untersuchte Parameter war die Reduktion
des Tumorvolumens, die als Folge der Unterversorgung mit Nährstoffen und
Sauerstoff durch die Hemmung der Neovaskularisierung erwartet wurde (FOLKMAN
et al. 1990).
Dabei wurde das experimentelle Glioblastom ohne nachfolgende Implantation und
nach Implantation von CellBeads® mit Endostatinsekretion, leeren CellBeads® und
CellBeads® mit Stammzellen, deren Sekretionsprofil nicht genetisch modifiziert
worden war, miteinander verglichen. Dies erlaubte zunächst eine Aussage darüber,
ob die alleinige Implantation von Mikrokapseln mit oder ohne Inhalt das
Tumorwachstum und die Einsprossung von Blutgefäßen beeinflusst. Weiterhin
konnte geklärt werden, wie sich die Anwesenheit von humanen, nicht
genmodifizierten, hTERT Stammzellen und ihren Sekretionsproduktion auf das
Wachstum und die Vaskularisierung des Glioblastoms auswirkte.
120 5 Diskussion
Zudem erlaubte dies die Beurteilung der antiangiogenen und tumorsuppressiven
Wirkung von Endostatin bei immunhistologisch belegter Endostatinfreisetzung durch
die Implantate. Im Hinblick auf den gewählten Untersuchungszeitraum muss
berücksichtigt werden, dass lediglich festgestellt werden konnte, welchen Einfluss die
jeweiligen Parameter auf ein schnell wachsendes Glioblastom innerhalb von 12
Tagen hatten.
5.2.2.1 Immunhistologisch dargestellte Blutgefäßdichte
Die immunhistologisch positiv rot gefärbten Endothelien der intratumoralen
Blutgefäße wiesen die auch für das humane Glioblastoma multiforme typischen
Strukturen wie Hyperplasie, Fenestrierung und mitotische Figuren auf. Sie stellten
sich bei den drei nicht mit Endostatin behandelten Gruppen besonders in den
ventralen und mittleren Tumorbereichen mit teilweise enormen Ausmaßen dar. Dabei
waren sie häufig gewunden und weiteten sich zu kavernösen Strukturen mit einem
Durchmesser von bis zu 600 µm aus. Bereits histomorphologisch konnten so
zwischen der behandelten und den unbehandelten Gruppen deutliche Unterschiede
ausgemacht werden, die in Bildtafel 4 auf Seite 99 dargestellt sind. Bei den mit
Endostatin behandelten Tieren waren die Blutgefäßanschnitte mit durchschnittlich ca.
30 µm Durchmesser durchweg kleiner, die Endothelien zeigten sich in der Regel
organisierter und es konnten seltener mitotische Figuren aufgefunden werden.
Bei der Auswertung der Vaskularisierungsdichten innerhalb der Tumoranschnitte der
verschiedenen Untersuchungsgruppen zeigte sich eine durch alle Parameter und
Lokalisationen gleichermaßen signifikante Reduktion der Blutgefäße bei den mit
Endostatin behandelten Tieren. Dabei waren sowohl die absolute Anzahl der
Gefäße, vor allem aber auch die relativen Flächenverhältnisse von Blutgefäßen zu
Tumorgewebe, die auch die Verringerung der Gefäßdurchmesser berücksichtigen,
reduziert. Daraus folgt, dass die antiangiogene Wirksamkeit der Endostatin
freisetzenden CellBeads® als erwiesen angesehen werden kann.
5 Diskussion 121
Die eindeutigen Unterschiede nach einem Untersuchungszeitraum von 12 Tagen
verdeutlichen zudem, wie schnell die Neovaskularisierung eines so schnell
wachsenden Tumors wie des Glioblastoma multiforme voran schreitet und welche
hochpotenten, die Endothelzellproliferation fördernden Mechanismen, dem Tumor
zur Verfügung stehen. Dazu schrieb FOLKMAN 1971, dass durch Tumoren
induzierte Kapillareinsprossungen mit einer Geschwindigkeit von 1 mm pro Tag
wachsen können. Des Weiteren zeigen die Ergebnisse die hohe Potenz von
Endostatin, diesen proliferationsfördernden Mechanismen entgegenzuwirken. Die
Vorteile der direkten lokalen Applikation des Wirkstoffs als Sekretionsprodukt von
alginatverkapselten als Bioreaktoren fungierenden Implantaten werden anhand der
vorliegenden Ergebnisse belegt. SCHMIDT et al. (2004) zeigten sowohl eine
Reduktion der Blutgefäßdichte um 33,5% als auch eine Tumorreduktion von 74%
nach lokaler Endostatinbehandlung eines experimentellen Glioblastoms in der Maus.
Sie applizierten den Wirkstoff aber mittels Mikroinfusion über 4 Wochen durch fest
implantierte Minipumpen, die, in der Flanke subkutan implantiert, die Infusionslösung
über einen Schlauch in das Gehirn leiteten. Diese Applikationsmethode ermöglicht
zwar sehr hohe Wirkstoffkonzentrationen am Zielort, ist aber klinisch so nicht
anwendbar. Sie birgt im Vergleich zu der hier angewendeten Methode hohe
Komplikationsrisiken, wie Abstoßungsreaktionen und Infektionen des Gehirns durch
die intrazerebralen Anteile der Apparaturen. READ et al. (2001) wendeten Endostatin
freisetzende Alginatkapseln intrazerebral zur Therapie experimenteller Glioblastome
an und konnten sowohl Rückgänge in der Vaskularisierung als auch eine signifikante
Tumorreduktion zeigen, beschrieben die Vaskularisierung aber nur qualitativ als
Anteil der Tiere, bei denen nicht vaskularisierte Bereiche zu finden waren. JOKI et al.
(2001) untersuchten ebenfalls Endostatin freisetzende Alginatkapseln und werteten
die Blutgefäßdichte nach immunhistologischer Färbung des von-Willebrand-Faktors
als Gefäßanzahl aus.
122 5 Diskussion
Sie konnten eine signifikante Reduktion nach Endostatinbehandlung zeigen,
wendeten aber ein Mausmodell an, bei dem sie Tumorzellen subkutan in der Flanke
inokuliert hatten, und erlaubten so nur bedingt Rückschlüsse auf intrazerebrale
Vorgänge zur Behandlung eines Glioblastoma multiforme. Sowohl BJERKVIG et al.
(2001) als auch HUSZTHY et al. (2006) zeigten reduzierte intratumorale
Neovaskularisierung nach Endostatinbehandlung, werteten jedoch nur die absolute
Gefäßanzahl aus, die nicht die teilweise enormen Unterschiede in den
Gefäßdurchmessern beziehungsweise -volumina berücksichtigt.
Anhand der an der Lokalisation des größten Tumoranschnitts erhobenen Daten
wurde eine signifikant höhere Vaskularisierungsdichte der Tumoren nach der
Implantation leerer CellBeads® gezeigt als bei den Tieren der Kontrollgruppe, denen
nur die Gliomzellen ohne weiteren operativen Eingriff am darauf folgenden Tag
inokuliert wurden. Dieses Ergebnis lässt die Vermutung zu, dass die reine
Implantation, das damit einhergehende Trauma und die dadurch ausgelöste
Astrozytose eine Steigerung der Neovaskularisierung zur Folge hatte.
Die traumabedingte Endothelzellproliferation wird von Astrozyten über VEGF und
Angiopoetin-2 vermittelt (NAG et al. 2005, SALHIA et al. 2000). An der
Implantationslokalisation konnte diese Signifikanz jedoch nicht bestätigt werden.
Außerdem hätte dann auch die Vaskularisierungsdichte bei der mit SCB behandelten
Gruppe folgerichtig größer sein müssen als bei der Kontrollgruppe, da ja auch hier
eine CellBead®-Implantation ohne Endostatineinfluss vorlag. Die mit Endostatin
behandelte Gruppe zeigte zudem an allen Lokalisationen eine signifikant kleinere
Blutgefäßdichte als die Kontrollgruppe ohne CellBead®-Implantation.
5 Diskussion 123
5.2.2.2 Tumorvolumina und Korrelation mit der Blutgefäßdichte
Die Erhebung der Tumorgrößen erfolgte anhand der rechnerisch als Summe von
Kegelstümpfen aus den gemessenen Anschnittflächen ermittelten und demzufolge
idealisierten Tumorvolumina (siehe Bildtafel 5 auf Seite 105). Die statistische
Auswertung ergab dabei keinen signifikanten Unterschied in den Tumorgrößen
zwischen der mit Endostatin freisetzenden CellBeads® behandelten Gruppe und den
drei anderen Gruppen. Sowohl die Freisetzung und intratumorale Verteilung sowie
auch die antiangiogene Wirksamkeit des von den ECB sezernierten Endostatins
konnten nachgewiesen werden. Da aber die Tumorgrößen unverändert blieben,
stellte sich die Frage nach der Korrelation zwischen der Reduktion der Blutgefäße
und dem Wachstum der Tumoren. Eine Gegenüberstellung der entsprechenden
Datenpaare belegte, dass kein statistischer Zusammenhang (r²< 0,8) zwischen
beiden Parametern bestand und die Hemmung der Neovaskularisierung in diesem
Modell keinen Einfluss auf das Glioblastomwachstum hatte. Das zeigt auf, dass die
signifikante Reduktion der Tumorvaskularisierung durch die Behandlung mit
Endostatin sezernierende Stammzellen enthaltenden CellBeads® ohne
einhergehende Verkleinerung des Tumorvolumens im Vergleich zu den
Kontrollgruppen nicht im Widerspruch zueinander stehen. Verschiedene
Veröffentlichungen beschreiben einen nachhaltigen Effekt der Antiangiogenese auf
die Proliferation von Gliomzellen und damit die Größenzunahme von Glioblastomen
(ZHANG et al. 2000, SCHMIDT et al. 2004, OHLFEST et al. 2005). Andere Studien
zeigten ebenfalls eine antiangiogene Wirkung des humanen Endostatins mit
signifikanter Reduktion der Vaskularisierungsdichte in einem Tumormodell in der
Ratte, ohne eine Tumorreduktion beziehungsweise Antiangiogenese bedingte
Auswirkungen auf die Tumorzellproliferation oder verlängerte Überlebenszeiten
nachweisen zu können (HUSZTHY et al. 2006, PRADILLA et al. 2005). HUSZTHY et
al. (2006) schlussfolgerten auf eine speziesspezifische Wirkung des Endostatins, da
sie mit murinem Endostatin und demselben Versuchsaufbau eine deutliche
Tumorreduktion und auch Verlängerung der Überlebenszeiten erzielten.
124 5 Diskussion
Da aber in dieser Arbeit deutliche Auswirkungen auf die Vaskularisierung durch
speziesfremdes humanes Endostatin gezeigt werden konnten, ist nicht die Wirkung
des speziesfremden Proteins fraglich, sondern der Zusammenhang dieser Wirkung
mit der Tumorreduktion. So bietet die Theorie der speziesabhängigen Wirkung keine
biologische Erklärung für die unveränderten Tumorgrößen trotz erwiesener
Blutgefäßreduktion in dieser Arbeit.
Da aber die Tumoren in dem hier entwickelten Modell bereits nach 12 Tagen
Volumina von durchschnittlich 95,82 mm³ einnahmen und zu einer das
Allgemeinbefinden der Versuchstiere beeinträchtigenden Gewebsverdrängung
führten, wurden die Befunde aus Tierschutzgründen bereits vor dem Auftreten einer
Symptomatik nach einem im Gegensatz zu anderen Arbeiten relativ kurzen
Untersuchungszeitraum erhoben. Zu diesem Zeitpunkt ist davon auszugehen dass
zumindest über Distanzen von einigen Millimetern (FOLKMAN 1990), die Versorgung
des Tumors über den Liquor noch ausreicht um seine Nekrotisierung und daraus
folgende Volumenreduktion zu verhindern. So konnten auch die Effekte der
Endostatinwirkung vor allem im Parenchym nahen Tumorbereich gezeigt werden, da
der dorsale, dem Liquor führenden Subarachnoidalraum angeschlossene
Tumorbereich in allen Gruppen geringer vaskularisiert war. READ et al. (2001)
führten zur Überprüfung der tumorsuppressiven Wirkung einen Vergleich der
Überlebenszeiten (Kaplan-Meyer) durch und konnten zeigen, dass erst nach einem
Versuchszeitraum von ca. 21 Tagen Unterschiede zwischen den Gruppen ersichtlich
wurden. Auch SCHMIDT et al. (2004), die das Endostatin mittels Mikropumpen in das
Gehirn applizierten, verglichen die Tumorgrößen erst nach 21 Tagen. Das führt zu
der Vermutung, dass der Untersuchungszeitraum im Bezug auf die korrelative
Auswirkung der Unterversorgung des Glioblastoms durch die Reduktion der
Blutgefäße auf den Tumor in dieser Studie zu kurz war. Die Proliferation der
Gliomzellen könnte zunächst enorm schnell voranschreiten, ohne dabei in
ausreichendem Maß auf die Endothelproliferation angewiesen zu sein.
5 Diskussion 125
Vermutlich ist nach 12 Tagen bei antiangiogenetisch behandelten Tieren so zwar die
Neovaskularisierung deutlich minimiert, das Tumorwachstum oder seine
Nekrotisierungsrate aber noch unbeeinflusst. Ein ähnliches Bild zeigen auch Befunde
von mittels Gamma-Knife strahlentherapierten Glioblastompatienten auf (SZEIFERT
et al. 2002). Auch hier zeichnen sich bereits wenige Tage nach der Behandlung
deutliche Rückgänge in der Blutgefäßversorgung beziehungsweise die Verödung
und der Verlust der Funktionalität der Endothelien ab. Mit einer daraus folgenden
Nekrotisierung und Reduktion des Tumorvolumens ist aber erst 4 bis 8 Wochen nach
der Behandlung zu rechnen.
Die mit nicht Endostatin sezernierenden Stammzellbeads (SCB) behandelten Tiere
zeigten signifikant kleinere Tumoren im Vergleich zur mit leeren CellBeads® (LCB)
behandelten Gruppe. Ein möglicher Erklärungsansatz hierfür ist, dass die
verwendeten nicht Endostatin sezernierenden humanen mesenchymalen
Stammzellen (SCB) eine ganze Reihe Zytokine wie Interferon Gamma, IL-12, IL-3,
IL-7 sowie hohe Konzentration an IL-6, IL-8 und MCP-1 sezernieren. Diese könnten
einerseits einen negativen Einfluss auf das Wachstum der Gliomzellen, aber
andererseits eventuell auch positive Auswirkungen auf die Abwehrlage des
Versuchstiers gegenüber dem Tumor haben. Prinzipiell sezernieren aber sowohl die
nicht zur Endostatinsekretion modifizierten als auch die Endostatin produzierenden
Stammzellen dieses Zytokinprofil. Trotzdem könnte es sein, dass die Endostatin
sezernierenden Stammzellen aufgrund der polarisierten Sekretionsleistung
grundsätzlich weniger andere Proteine freisetzen. Nachgewiesen ist von der Firma
CellMed AG eine vermehrte Sekretion von IL-12 bei den nicht genmodifizierten
hMSC gegenüber den Endostatin sezernierenden Stammzellen. Von einem
möglichen antitumorigenen Effekt des IL-12 sprechen YANG et al. bereits 2004. KIM
et al. zeigten 2006 an einem intrakraniellen Mausmodell eine vermehrte Aktivierung
tumorspezifischer zytotoxischer T-Zellen durch die Behandlung mit IL-12
sezernierenden Dendritischen Zellen. So bietet die vermehrte IL-12 Sekretion der
SCB einen möglichen Erklärungsansatz für die signifikante Tumorreduktion nach
ihrer Implantation im Vergleich zu den mit LCB behandelten Tieren.
126 5 Diskussion
Ein zufallsbedingter Unterschied der Tumorvolumina zwischen der mit leeren Beads
und der mit Stammzellbeads behandelten Gruppe kann aber ebenfalls nicht
ausgeschlossen werden, insbesondere da bei keiner der beiden mit Stammzellen
enthaltenden CellBeads® behandelten Gruppen eine signifikante Tumorreduktion
gegenüber der Kontrollgruppe, die nur die Gliomzellen inokuliert bekam, aufgezeigt
werden konnte.
5 Diskussion 127
5.3 Aussicht und Schlussbetrachtung
Die durchgeführten Untersuchungen zeigten eine signifikante antiangiogene
Wirksamkeit des von alginatverkapselten Stammzellen freigesetzten Endostatins
nach intrazerebraler CellBead®-Implantation. Um die Tumorreduktion als Folge der
Gliomzellunterversorgung durch Unterdrückung der Neoangiogenese zu belegen,
müssten weitere Studien folgen, die ein experimentelles Glioblastommodell zugrunde
legen, welches einen verlängerten Untersuchungszeitraum ermöglicht. Dazu könnte
versucht werden kleinere Tumoren zu entwickeln, beziehungsweise eine
Gliomzelllinie zu verwenden, die langsamer proliferiert. Eine andere Möglichkeit stellt
die Verwendung eines anderen Tiermodells mit einem größeren Versuchstier dar.
Dabei könnte außerdem berücksichtigt werden, dass zur klinischen Anwendung beim
Glioblastoma multiforme im Menschen eine Applikation von weit mehr CellBeads® in
eine große Tumorresektionshöhle zur Hemmung eines Rezidivs möglich wäre.
Genmodifizierte Stammzellen, denen die Wirkstoffproduktion als Motor für einen als
Medikament einsetzbaren Bioreaktor eingearbeitet wurde, bieten bereits ein breites
Spektrum an therapeutischen Möglichkeiten. Die Verwendung von
immunisolierenden Matrizes wie Alginat oder poly-L-Lysinen zur Entwicklung lokal
anwendbarer Therapeutika erweitern den Bereich der möglichen Indikationen und
erlauben auch die Applikation stammzellunabhängiger Stoffe. So wird ebenfalls eine
lokale Verabreichung von Chemotherapeutika wie beispielsweise Doxorubicin in
diffusionsdurchlässigen Kapseln direkt in das Glioblastom denkbar. Auch eine
Kombination aus Stammzellkapseln und Wirkstoff enthaltenden Implantaten als
Zusammenstellung antitumorigener Stoffe wäre möglich und besser kontrollierbar
anzuwenden als nach systemischer Verabreichung. Um genaue Aussagen darüber
treffen zu können, wie viel Wirkstoff durch eine bestimmte Anzahl implantierter
CellBeads® freigesetzt wird und wohin dieses gelangt, sollten Langzeitstudien
angeschlossen werden, die eine Untersuchung der intrazerebralen Endostatinkinetik
erlauben.
128 5 Diskussion
Im Rahmen von Langzeitstudien müsste zudem die maximale Überlebensdauer der
Stammzellen und auch der Haltbarkeit der Alginatkapsel im intrazerebralen Milieu
untersucht werden.
Die Vergleichbarkeit der humanen glialen Tumoren mit denen bei Hund und Katze
(STOICA et al. 2004) sowie die große Ähnlichkeit des humanen Endostatins mit dem
des Hundes machen die Anwendung der verwendeten Implantate in der
Veterinärmedizin denkbar. Die Ähnlichkeit der Gene zwischen Mensch und Hund
beträgt im Unterschied zu nur 67,2 (n) zwischen Ratte und Mensch 83,7 (n)
(WEIZMANN 2006). Trotzdem konnte eine eindeutige Wirkung des humanen
Endostatins in der Ratte gezeigt werden. Dies lässt die Schlussfolgerung zu, dass
humanes Endostatin auch die Vaskularisierung und damit die Gliomversorgung im
Hund antagonisiert. Des Weiteren ist eine Entwicklung therapeutische Proteine
sezernierender caniner mesenchymaler Stammzellen und deren Verkapselung mit
Alginat zur Behandlung verschiedener Erkrankungen denkbar. Endostatin
sezernierende CBs könnten wie beim Menschen in Tumorresektionshöhlen
eingebracht werden oder stereotaktisch nach Schädeldeckentrepanation minimal
invasiv in ein diagnostiziertes nicht reseziertes Glioblastom injiziert werden, um eine
Lebensverlängerung zu erreichen. Dabei muss berücksichtigt werden, dass es sich
bei den bisher entwickelten Stammzellpräparaten um Xenoimplantate handelt und
die Zerstörung der Beads zur sicheren Abstoßung führen würde. Außerdem ist das
derzeitige Mittel der Wahl zur Lebensverlängerung bei an Gliomen erkrankten
Hunden und Katzen die Strahlentherapie (BREARLY et al. 1999). Eine Bestrahlung
würde aber die implantierten Stammzellen schädigen, so dass eine Kombination
dieser beiden Therapien von vornherein auszuschließen ist.
Die vorgelegte Arbeit führte zur Etablierung eines reproduzierbaren intrazerebralen
Glioblastommodells in der Ratte und der erfolgreichen Implantation von Alginat
verkapselten Stammzellen in das Gehirnparenchym mit Kontakt zum Liquor
führenden Ventrikelsystem. Es konnten die intrazerebrale Endostatinfreisetzung und
damit die Funktionalität der verwendeten CellBeads® belegt werden.
5 Diskussion 129
Zudem konnte eine Reduktion der Vaskularisierungsdichte des experimentellen
Glioblastoms von über 80% durch die intrazerebroventrikuläre Verabreichung
Endostatin sezernierender CellBeads® nachgewiesen werden. Die Implantation der
CellBeads® unter, statt wie bei READ et al. (2001) und BARTSCH (2005) in den
Tumor hat klinisch eine hohe Relevanz, da sie eine Endostatinwirkung über eine
Diffusionsdistanz belegt. Damit wird eine postoperative Anwendung in einer
Tumorresektionshöhle zur Bekämpfung infiltrierter im Tumorbett verbleibender
Mikrotumoren vorstellbar.
Alle Arbeiten wurden unter GLP-Bedingungen durchgeführt und entsprechend
dokumentiert, so dass die Voraussetzungen für eine spätere klinische Anwendung
gegeben sind. Im Unterschied zu der vorausgegangenen Dissertation von BARTSCH
(2005) und den Arbeiten von READ et al. (2001) und HUSZTHY et al. (2006) wurde
erstmalig unter GLP-Bedingungen die Freisetzung und antiproliferative Wirkung von
Endostatin nach der Implantation alginatverkapselter genmodifizierter
mesenchymaler Stammzellen qualitativ untersucht und bestätigt.
130 6 Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
Kerstin Kleinschmidt
Untersuchung von Endostatin freisetzenden Stammzellimplantaten zur Behandlung des Glioblastoms im Rattenmodell
Das Glioblastoma multiforme (GBM) hat eine Inzidenz von 4000 bis 5000
Neuerkrankungen pro Jahr. Trotz der Anwendung aller bekannten Therapien geht die
Diagnose GBM mit einer infausten Prognose einher. Die mittlere Überlebenszeit liegt
bei 12 bis 15 Monaten nach Diagnosestellung. Ein neuer Therapieansatz zur
Bekämpfung des schnell wachsenden Tumors basiert auf antiangiogenen
Mechanismen. Ziel ist es, das GBM durch die Unterdrückung der Neo-
vaskularisierung einer Unterversorgung auszusetzen, um eine Wachstumshemmung
und Nekrotisierung des Tumorgewebes zu erreichen. Endostatin, ein endogenes 22
kD großes Protein, ist ein gut verträglicher Angiogenesehemmer. Problematisch ist
aber seine Verabreichung. Da das Protein eine sehr kurze Halbwertszeit hat und die
Blut-Hirn-Schranke überwinden muss, sind durch systemische Gaben keine
ausreichend hohen Konzentrationen des Proteins im Tumorgebiet erzielbar. Die
Verwendung ex-vivo genmodifizierter Endostatin sezernierender humaner
mesenchymaler Stammzellen (EMSC) ermöglicht eine dauerhafte Produktion des
Proteins. Durch die Verkapselung solcher EMSC mit einer für Nährstoffe und
Sauerstoff diffusionsdurchlässigen, aber gegen die Bestandteile der Empfänger-
abwehr abschirmenden Alginatmatrix, wird die intrazerebrale Implantation direkt am
Zielort möglich. Alginat ist ein Alginsäure-Polymer aus marinen Braunalgen, das eine
gute Biokompatibilität aufweist. Zur Herstellung der in dieser Arbeit implantierten
CellBeads® (CBs) wurde ein Alginat mit einem hohen Guluronsäureanteil (High-G
Alginate), das mit Bariumionen vernetzt war, verwendet.
6 Zusammenfassung 131
Ziel dieser Arbeit war es, ein GBM Modell zu standardisieren und daran die
antiangiogene und tumorreduzierende Wirkung von mit Alginat zu CBs vertropften
EMSC zu untersuchen. Am Tag nach der Gliominokulation wurden den Tieren an
zuvor entwickelten Koordinaten CBs intrazerebroventrikulär und gleichzeitig nahe
dem GBM implantiert. Untersucht wurden eine Kontrollgruppe (nur BT4Ca), eine
Gruppe mit leeren CBs (LCB), eine Gruppe mit Stammzellen ohne
Endostatinsekretion (SCB) und eine Gruppe mit Endostatinbeads (ECB) jeweils nach
12 Tagen Versuchszeitraum. Die Implantate konnten histologisch intakt
nachgewiesen werden und es zeigten sich keine immunologischen Reaktionen der
Empfängertiere. Erstmalig konnte immunhistologisch die Endostatinfreisetzung und
damit die Funktionalität der CBs sowie die intrazerebrale Diffusion des Proteins über
eine Distanz von bis zu 4 mm in das Tumorgewebe gezeigt werden. Anhand einer
immunhistologischen Färbung des von-Willebrand-Faktors (vWF) und
anschließender Partikeldetektion wurde die Vaskularisierungsdichte innerhalb des
experimentellen GBM untersucht. In einem intracraniellen GBM Modell konnte
erstmalig eine signifikante Verringerung der Vaskularisierungsdichte (P<0,05) nach
Implantation Endostatin sezernierender Stammzellen nachgewiesen und unter den
Bedingungen der Good Laboratory Practice (GLP) quantifiziert werden. Es konnte
keine signifikante Tumorreduktion gezeigt werden. Eine Verlängerung des
Untersuchungszeitraumes erscheint sinnvoll, um eine tumorsupprimierende Wirkung
als Folge der Blutgefäßreduktion zu zeigen. Das Fehlen der Korrelation zwischen
Vaskularisierungsdichte und Tumorgröße wurde für diesen Versuch statistisch belegt
(r²< 0,8). Die gute Biokompatibilität und Funktionalität der CBs zeigt, dass die
Verkapselung von Wirkstoff sezernierenden Stammzellen mit Alginat ein breites
Spektrum von denkbaren Anwendungsbereichen bietet. Endostatin diffundierte aus
den CBs transparenchymal bis weit in den Tumorbereich hinein, wies eine große
antiangiogene Potenz auf und war in der Lage, die Neoangiogenese im schnell
wachsenden experimentellen Glioblastom um bis zu 80% zu reduzieren. Diese
Ergebnisse machen eine postoperative Applikation in die Resektionshöhle bei GBM
Patienten im Sinne einer Rezidivprävention denkbar.
132 7 Summary
7 Summary
Kerstin Kleinschmidt
Examination of Endostatin releasing stem cell implants as glioblastoma therapeutics in a rat model
Glioblastoma multiforme (GBM) has an incidence of 4000-5000 cases every year.
Despite the use of all known treatments, GBM still has a poor prognosis. Having
contracted GBM, the medium term life expectancy is 12 to 15 months after diagnosis.
A new treatment opportunity in the abatement against this rapidly growing tumour is
based on antiangiogenic mechanisms. The aim, by suppressing the
neovascularization and thus starving the GBM, is to achieve growth inhibition and
necrotization of the tumour-tissue. Endostatin, an endogenous 22 kD protein, is an
auspicious angiogenesis inhibitor. But due to its short half-time and the barrier
function of the blood-brain-barrier problems arise with its administration. Thus,
effective protein concentrations are not achievable with systematic application. The
use of genetically engineered mesenchymal stem cells expressing endostatin
(EMSCs) allows a constant protein production. By encapsulating these EMSCs with a
nutrient and oxygen permeable alginate matrix the intracerebral implantation at the
target site is possible. This alginate capsule insulates the EMSCs from the
components of the recipient’s immune response. Alginate is an algine-acid polymer
from marine brown-alga with a good biocompatibility. To generate the CellBeads®
(CBs) used in this study, an alginate with high guluronic acid concentration (high G-
alginate) linked with Barium ions was applied. The task of this dissertation was to
standardise a GBM model and to examine the antiangiogenic and the tumour
reducing effects of alginate-CBs containing EMSCs. In order to have a reproducible
experimental GBM, BT4Ca-Glioma cells were injected into the right hemisphere of
BDIX/Ztm-rats. The day after glioma inoculation, CBs were stereotactically implanted
near the GBM approaching the ventricle.
7 Summary 133
A control group (BT4Ca only), a group with empty CBs (LCB), a group with stem cells
without endostatin secretion (SCB) and a group with endostatin beads (ECB) were
examined after 12 days. The implants could be histologically proven to be intact and
no immunological reactions of the host animals were witnessed. The endostatin
release and therefore the functionality of the CBs was immunohistologically shown.
The protein diffusion was proven at a distance of up to 4 mm into the tumour-tissue.
By means of the immunohistological staining of the von-Willebrand-Factor (vWF) and
subsequent histomorphological detection the vascularization density within the GBM
was examined. In this study for the first time significant (P<0,05) reductions of blood
vessel density could be quantificated under conditions of Good-Laboratory-Practise
(GLP) after implantation of Endostatin releasing stem cells. No significant reduction
of tumour size could be shown. A prolongation of the examination period seems
sensible to show the tumour suppressing effects following angiogenesis rejection.
The absence of a correlation between vascularization density and tumour size was
statistically marked down for this experiment (r² <0,8). The good biocompatibility and
functionality of the CBs shows that the encapsulation of the active substance
expressing stem cells with alginate leaves us with a wide spectrum for possible
applications. Transparenchymal Endostatin diffusion far into the tumour-site, its high
antiangiogenic potency and the reduction of neoangiogenesis in a rapidly growing
experimental glioblastoma up to 80% was prevented. Hence a postoperative
application within the resection cavity of GBM patients in order to prevent
recrudescence considers possible.
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164 9 Anhang 9 Anhang
9.1 Bezugsquellen
9.1.1 Versuchstiere
Rattenstamm Anzahl Tiere Bezugsquelle
BDIX/Ztm 65 Zentrales Tierlaboratorium
der Medizinischen
Hochschule Hannover
9.1.2 Allgemeiner Bedarf und OP-Bedarf
Material Bezugsquelle
Mini-Bulldog-Klemmen 35 mm Aesculap AG und Co. KG, Tuttlingen
Flüssigstickstoff Air Liquide Deutschland GmbH, Bremen,
Deutschland
Altromin® Alleinfuttermittel 1324 Altromin GmbH, Lage, Deutschland
Augensalbe, Vidisic Augengel Bausch & Lomb GmbH, Berlin,
Deutschland
Kanülen, 100 Sterican Gr. 17, 0,5 x 25
mm
Braun Omnifix-F Einmalspritzen 1 ml
B. Braun, Melsungen, Deutschland
Nylon-Siebchen (100 µm Maschenweite) BD Falcon, Bioscience, USA
Hautdesinfektionsspray (Cutasept®) Bode Chemie, Hamburg, Deutschland
CellBeads® CellMed AG, Alzenau, Deutschland
Desinfektionsspray (Desomed® Rapid
AF),
Händewaschgel (Desowasch®),
Händedesinfektionsmittel (Aseptoman®)
Desomed AG, Freiburg, D
Pinzetten
Scheren
Dewimed Medizintechnik, Tuttlingen,
Deutschland
9 Anhang 165
Rasparatorium
Arterienklemmen
Hohlmeißelzange
Dewimed Medizintechnik, Tuttlingen,
Deutschland
Insulinspritzen Dispomed Witt oHG, Geinhausen,
Deutschland
Mikroliterspritzen 10 µl, Typ 1710
Hamiltonkanüle (ga 19, Länge 15 mm,
pst:4, tap:Y)
Hamiltonkanüle (ga 18, Länge 51 mm,
pst: AS, tap-)
Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz,
Schweiz
Einmalhandschuhe: Kimberly Clark
Powder Free Latex Exam Gloves
Kimberly Clark, Zavantem, Belgien
OT SuperFrost®Plus
Deckgläser 24 x 60 mm # 1
Menzel, Braunschweig, Deutschland
Kohlenstoffdioxid (CO2) Messer, Krefeld, Deutschland
Perfusionsbesteck Omnilab, Bremen, Deutschland
Ketanest®, Ch. B.: 40923A
Domitor®, Ch. B. : 1026548
Pfizer GmbH, Karlsruhe, Deutschland
Einmalrasierer Monomed P.J. Dahlhausen, Köln, Deutschland
Einbettungsmedium (Tissue-Tek®
O.C.T.TM) für Kryoeinbettung
Sakura Fine Tek Europe B.V.,
Zoeterwoude, Niederlande
Pipettenspitzen 10 µl, 100 µl, 200 µl,
1000µl
Eppendorfgefäße 1,5 ml und 2 ml
Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
Makrolon®-Käfige Typ IV
Makrolon®-Trinkflaschen
TECNIPLAST GmbH, Hohenpeißenberg,
Deutschland
Tierwaage Tefal, Offenbach am Main, Deutschland
Coverplates, Coverplate-Kassetten für
IHC
Thermo Electron GmbH, Dreieich,
Deutschland
Nahtmaterial (4/0 Ethilon, monofil,
(Polyamid 6)
Tierärztebedarf J. Lehnecke GmbH,
Schortens, Deutschland
166 9 Anhang
9.1.3 Verbrauchsmaterialien Zellkultur
Material Verwendung Bezugsquelle
DMSO Einfriermedium Carl Roth GmbH + Co.
KG, Karlsruhe,
Deutschland
PBS (Phosphate Buffered Saline,
Code No.S302430)
OP/Spülen DakoCytomation GmbH,
Hamburg, Deutschland
Gewebekulturflaschen 75 cm² und
25 cm²
Zellkulturplatten, 6er well, 12er
well, 24er well, 48er well und 96er
well
PP-Röhrchen 15 ml und 25 ml
Kultivierung
Kultivierung/Vorberei
tung der Implantate
Suspendieren/
Abzentrifugieren
Greiner BIO-ONE,
Frickenhausen,
Deutschland
elektrische Pipettierhilfe
(Pipetus®-Akku)
Pasteurpipetten
Pipettierschritte/
Resuspendieren
Pipettierschritte/
Resuspendieren
Hirschmann Laborgeräte
GmbH & Co.KG,
Eberstadt, D
Gliomzellen (BT4Ca) experimentelles
Glioblastom
Institut für Zellbiologie
(Tumorforschung) des
Universitätsklinikums
Essen, Essen,
Deutschland
Kryoröhrchen mit Außengewinde,
2 ml
Kryokonservierung Nalgene®Kryoröhrchen,
Nalge Europe Ltd.,
Neerijse, Belgium
Einfrierbox (Behälter Qualifreeze
PC Mr. Frosty)
Neubauer-Zählkammer (Tiefe 0,1
mm, 1/400 u. 1/25 qm²)
Kryokonservierung
Zellzählung
Omnilab Laborzentrum,
Bremen, Deutschland
9 Anhang 167
DMEM high Glucose (4°C)
Penicillin-Streptomycin (-20°C)
Na-Pyruvat (4°C)
Trypsin (-20°C)
L-Glutamin(-20°C)
Fetales Kälberserum (Charge Nr.:
A64905-0311/R1952, -20°C)
Mediumgrundlage
Kulturmediumzusatz
Kulturmediumzusatz
Kulturmediumzusatz
Kulturmediumzusatz
Kulturmediumzusatz
PAA Laboratories GmbH,
Cölbe, Deutschland
Serologische Pipetten (einzeln
steril verpackt) 1 ml, 5 ml, 10 ml
und 25 ml
Pipettierschritte/
Resuspendieren
Sarstedt, Nümbrecht,
Deutschland
Trypanblau Vitalzellzählung Sigma-Aldrich,
Deisenhofen,
Deutschland
9.1.4 Verbrauchsmaterialien Histologie und Immunhistologie
Material Verwendung Bezugsquelle
Polyclonal Antibody to Human
Endostatin, Cat No DP3053
Immunhistologie Acris Antibodies GmbH,
Hiddenhausen,
Deutschland
2-Methylbutan (3927.1)
Xylol (8118)
Färbetröge und OT Gestelle aus
Polyoxymethylen
Kryoeinbettung
H.E. Färbung
Immunhistologie
Carl Roth GmbH + Co.
KG, Karlsruhe,
Deutschland
Target Retrieval Solution (Code
No S169984)
Antibody Diluent (Code No
S080983
Immunhistologie
Immunhistologie
DakoCytomation GmbH,
Hamburg, Deutschland
168 9 Anhang
Polymer (EnVision + System/
HRP, Rabbit (AEC+), Code No
K400811)
Chromogen (Code No K 346911)
Faramount Aqueous Mounting
Medium
Negative Control Rabbit
Immunoglobulin Fraction (Code
No X093602)
Polyclonal anti human vWF, Code
No A008202
Immunhistologie
Immunhistologie
Immunhistologie
Immunhistologie
Immunhistologie
DakoCytomation GmbH,
Hamburg, Deutschland
Aqua dest. Histologie/
Immunhistologie
INI GmbH Grundfos,
Hannover, Deutschland
NaCl (0278)
Ethanol Absolut (8006)
Salz für PBS
H.E. Färbung
J.T.Baker, Deventer,
Niederlande
Paraformaldehyd (1.04005.1000)
Wasserstoffperoxid (30%)
Entellan (1.07961.0500)
Salzsäure (1.09057.1000)
Perfusionsfixierung
OP/Immunhistologie
Eindeckmedium
H.E. Färbung
Merck, Darmstadt,
Deutschland
NA2HPO4 (S-0876)
KH2PO4 (P-5379)
Sucrose (S-8501)
Perfusionsfixierung
Salz für PBS
Kryoprotektion
Sigma-Aldrich Chemie
GmbH, München,
Deutschland
Hämatoxylin (Harris Hämatoxylin
6765003)
Eosin (Shandon Instant Eosin
Aqueous 6765540)
Coverplates (Shandon Clips)
Coverplate-Kassetten
H.E. Färbung
H.E. Färbung
Immunhistologie
Immunhistologie
Thermo Electron
Corporation GmbH,
Dreieich, Deutschland
9 Anhang 169
9.1.5 Geräte und Software
Material Verwendung Bezugsquelle
Stereotakt (SAS 4120) Stereotaktische
Implantationen
ASI Instruments, Warren,
USA
Photoshop
Version 6.0
Bildbearbeitung Adobe, San Jose, USA
Dampfgarer (Multi Gourmet FS
20)
Immunhistologie Braun AG, Kornberg,
Deutschland
Mikroskop Carl Zeiss NC 32
Varioskop
Mikroskop NC Varioskop
Superlux 301
Vorbereitung der
Implantate
OP-Mikroskop
Lichtquelle
Carl Zeiss, Jena,
Deutschland
CASIO CFX-9850GB PLUS-WE Statistik Casio Computer Co.,
LTD., Tokyo, Japan
Tischautoklav, CertoClav Sterilisierung,
Zellkultur
CertoClav Sterilizer
GmbH, Traun, Österreich
Sterilizer Schnell-
sterilisierung
FST Fine Science Tools,
Heidelberg, Deutschland
Wasserbad (Wasserbad GFL
1008)
Zellkultur GFL, Burgwedel,
Deutschland
Kern 440-33 Chemikalienwaage Gottl. Kern, Albstadt,
Deutschland
Prism® Version 4.03 Statistik GraphPad Software Inc.,
San Diego, USA
Sterilbank (Heraeus Hera Safe)
Zentrifuge (Megafuge 1 OR)
Zellkultur
Zellkultur
Kendro Laboratory
Products GmbH, Hanau,
Deutschland
Abzug Histologie/
Immunhistologie
Köttermann, Uetze-
Hennigsen, Deutschland
170 9 Anhang
Brutschrank (NAPCO Series 5400
Co2-Incubator)
Sterilbank Telstar AH-100
Kultivierung der
Gliomzellen
Vorbereitung der
Implantate
Labotect GmbH,
Göttingen, Deutschland
Inversmikroskop Leica DM IRB Beurteilung der
Gliomzellen
Leica, Bensheim,
Deutschland
Kühlschrank 4°C Zellkulturreagenzien Liebherr, Biberach an der
Riss, Deutschland
Kryostat Gefriermikrotom (Microm
HM 560 Cryo-Star)
Gefrierschnitte MICROM International
GmbH, Walldorf,
Deutschland
Gefriertruhe -80°C Einfrieren der
Gliomzellen
National Lab GmbH,
Mölln, Deutschland
Mikroskop Olympus BX51 Hellfeld
Digitalkamera (Color View Soft
Imaging System)
cell*f Imaging Software for Life
Sciences Microscopy
Auswertung
Bildaufnahme
Bildbearbeitung/
Messungen/
Partikeldetektion
Olympus, Hamburg,
Deutschland
Omnilab MR 3001 K Magnetrührer Omnilab, Bremen,
Deutschland
Kühlschrank 4 °C Chemikalien Robert Bosch GmbH,
Stuttgart, Deutschland
Messer Sec 35, Low Profile
Blades
Gefrierschnitte Richard-Allan Scientific,
Kalamazoo, USA
9 Anhang 171
Cell-Counter (CASY®, cell counter
and analysis system
Vitalzellzählung Schärfe System GmbH,
Reutlingen, Deutschland
Bohr- und Fräsgerät Minimot 40/E Kraniotomie Proxxon, Niersbach,
Deutschland
Gefrierschrank –20°C (Economic
no Frost)
Lagerung der
Gehirne/
Zellkulturalliquots
Robert Bosch GmbH,
Stuttgart, Deutschland
172 9 Anhang
9.2 Reagenzien
9.2.1 Färbungen
Alkoholreihe und Xylol
2 x 1 Min. 70% Ethanol
2 x 1 Min. 96% Ethanol
2 x 1 Min. 100% Ethanol
3 x 1 Min. 100% Xylol
HCl-EtOH für H.E. Färbung
100 ml Aqua dest.
100 ml Ethanol absol.
0,5 ml Salzsäure (30%ig)
Peroxidase Block für Immunhistologie
5333 µl Wasserstoffperoxid
400 ml PBS (0,1 M, DakoCytomation)
9.2.2 Perfusionsfixierung
PBS (Phosphatpuffer)
nach DAKO Handbuch, 0,1 M auf 1 Liter Aqua dest. (pH 7,2)
1,48 g NA2HPO4
0,43 g KH2PO4
7,20 g NaCl
9 Anhang 173
PFA (Paraformaldehydlösung)
1 L PBS (0,1 M)
40 g PFA
unter Rühren auf 60°C unter Abzug erhitzen, Klären mit NaOH, filtrieren, Lagerung
bei 4°C, Verwendung bis nächsten Tag
Sucroselösung
70 g PBS (0,1 M)
30 g Sucrose
9.2.3 Zellkultur
Kulturmedium
174 ml DMEM High Glucose
20 ml fetales Kälberserum
2 ml Natriumpyruvat
2 ml Penicillin Streptomycin
2 ml L-Glutamat
nach dem Auftauen im Wasserbad steril unter der Werkbank in autoklavierte
Glasflasche pipettieren, Lagerung bei 4°C, Verwendbar 1 Woche
Einfriermedium
180 ml DMEM High Glucose
20 ml fetales Kälberserum
nach dem Auftauen im Wasserbad steril unter der Werkbank in autoklavierte
Glasflasche pipettieren, sofort verwenden
174 9 Anhang
9.3 Färbeprotokolle
9.3.1 Färbeprotokoll Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Zeit Färbeschritt 30 Min. OT bei Raumtemperatur auftauen lassen
10 Min. Spülen in Leitungswasser
3 Min. Inkubation in Hämatoxylin
5 Min. Wässern in fließendem Leitungswasser zum Bläuen
1 Sek. Differenzieren in 0,15%HCl-EtOH
5 Min. Wässern in fließendem Leitungswasser zum Spülen
3 Min. Spülen in Aqua dest.
2 Min. Inkubation in Eosin
2 x 1 Min. Spülen in Aqua dest.
Alkoholreihe zum Entwässern
Xylol
Eindecken mit Entellan
9 Anhang 175
9.3.2 Färbeprotokoll Immunhistologie
Immunhistologie Endostatin/ vWF Host: Rabbit Dako K400811 PBS (Phosphate Buffered Saline) TRS (Target Retrieval Solution) 1L (900ml Aqua dest.+ 100ml TRS) PrimärAk Verdünnung in Antibody Diluent (anti human endostatin, bzw. anti-vWF)
SC (Shandon Clips) Zeit Vorgang
60 Min bei RT auftauen in schwarzen Schiffchen 3x5 Min Phosphatpuffer waschen (0,1 mol/L) 2x15 Min Peroxidase Block [5333,33µl H2O2 auf 400ml
Phosphatpuffer (0,1 mol/L)]
2x5 Min PBS Dako waschen 1x5 Min waschen TRS (Target Retrieval Solution) 30 Min Kochen mit TRS erhitzen auf >92°C, OT rein,
Zeit erst messen, wenn >94°C erreicht
20 Min In Puffer stehend abkühlen lassen, dann in kalten Puffer überführen
SC In Shandon Clips einklemmen mit TRS SC 30 Min Blocking Antibody Diluent SC 30 Min Primär AK verdünnt in Antibody Diluent,
bzw. negative Kontrolle 1:400
SC 2x5 Min waschen TRS 500µl SC 30 Min Polymer SC 2x5 Min waschen TRS 500µl SC 26 Min Chromogen
mit Aqua dest. Waschen (schnell Spritzflasche) 1 Min Hämatoxylin 2x in 5 Ammoniak (0,037 mol/L), tauchen 2x5 Min Aqua Dest. waschen Eindecken mit Faramount
OT Bemerkungen OT Bemerkungen OT Bemerkungen 1 14 27 2 15 28 3 16 29 4 17 30 5 18 31 6 19 32 7 20 33 8 21 34 9 22 35 10 23 36 11 24 37 12 25 38 13 26 39 40 Negativ Kontrolle
176 9 Anhang 9.4 Protokolle der Versuchsdurchführung
OP-Protokoll BT4Ca Inokulation und CB Implantation
Projekt Tier Tag der Einstellung
KGW (g)
m / w OP-DatumTag 0
OP-Beginn OP-Dauer
Endostatin EN g w Min
Injektionen Uhrzeit
Vol./Med. ml Ket. ml Dom.
Nadel Nadel IA0 AP Bregma AP
LM LM DV DV
Bohrlochkoordinaten AP-1; LM-2,8 bis AP-1; LM3,4
Bregma Koordinaten Ergebnis
AP -1 LM –3,4
DV BT4Ca-Impl. -5/-4 Anzahl BT4Ca Flasche Inj. Volumen
verwendete Hamiltonkanüle: ga 19, spitz
OP-Datum Tag 1
OP-Beginn OP-Dauer
Min
Injektionen Uhrzeit
Vol./Med. ml Ket. ml Dom.
Bregma Koordinaten Ergebnis
AP -1 LM -2,8
DV CB-Impl. -6/-5 aufgezogen Restinhalt Implantiert 1.Impl. 2.Impl.
verwendete Hamiltonkanüle: ga 19, spitz Perfusionsdatum:__________________________
9 Anhang 177 Schneideprotokoll für 6000-10000 µm langen Tumor Datum:_________ Seite 1 Taktlänge 360µm Takt µm S OT Bez. Bemerkng
Takt µm S
OT Bez. Bemerkng
1 0-120 1 1 HE A 1+2 7 2880-3000 289 13 HE A 7+8 0-120 2 2880-3000 290 0-120 3 2 HE B 1+2 2880-3000 291 14 HE B 7+8 0-120 4 2880-3000 292 0-120 5 3 vWF A 1+2 2880-3000 293 15 vWF A 7+8 0-120 6 2880-3000 294 0-120 7 4 vWF B 1+2 2880-3000 295 16 vWF B 7+8 0-120 8 2880-3000 296 2 480-600 49 1 HE A 1+2 8 3360-3480 337 13 HE A 7+8 480-600 50 3360-3480 338 480-600 51 2 HE B 1+2 3360-3480 339 14 HE B 7+8 480-600 52 3360-3480 340 480-600 53 3 vWF A 1+2 3360-3480 341 15 vWF A 7+8 480-600 54 3360-3480 342 480-600 55 4 vWF B 1+2 3360-3480 343 16 vWF B 7+8 480-600 56 3360-3480 344 3 960-1080 97 5 HE A 3+4 9 3840-3960 385 17 HE A 9+10 960-1080 98 3840-3960 386 960-1080 99 6 HE B 3+4 3840-3960 387 18 HE B 9+10 960-1080 100 3840-3960 388 960-1080 101 7 vWF A 3+4 3840-3960 389 19 vWF A 9+10 960-1080 102 3840-3960 390 960-1080 103 8 vWF B 3+4 3840-3960 391 20 vWF B 9+10 960-1080 104 3840-3960 392 4 1440-1560 145 5 HE A 3+4 10 4320-4440 433 17 HE A 9+10 1440-1560 146 4320-4440 434 1440-1560 147 6 HE B 3+4 4320-4440 435 18 HE B 9+10 1440-1560 148 4320-4440 436 1440-1560 149 7 vWF A 3+4 4320-4440 437 19 vWF A 9+10 1440-1560 150 4320-4440 438 1440-1560 151 8 vWF B 3+4 4320-4440 439 20 vWF B 9+10 1440-1560 152 4320-4440 440 5 1920-2040 193 9 HE A 5+6 11 4800-4920 481 21 HE A 11+12 1920-2040 194 4800-4920 482 1920-2040 195 10 HE B 5+6 4800-4920 483 22 HE B 11+12 1920-2040 196 4800-4920 484 1920-2040 197 11 vWF A 5+6 4800-4920 485 23 vWF A 11+12 1920-2040 198 4800-4920 486 1920-2040 199 12 vWF B 5+6 4800-4920 487 24 vWF B 11+12 1920-2040 200 4800-4920 488 6 2400-2520 241 9 HE A 5+6 12 5280-5400 529 21 HE A 11+12 2400-2520 242 5280-5400 530 2400-2520 243 10 HE B 5+6 5280-5400 531 22 HE B 11+12 2400-2520 244 5280-5400 532 2400-2520 245 11 vWF A 5+6 5280-5400 533 23 vWF A 11+12 2400-2520 246 5280-5400 534 2400-2520 247 12 vWF B 5+6 5280-5400 535 24 vWF B 11+12 2400-2520 248 5280-5400 536
Endostatin: OT: Endo 2,2 + 1,6 bis Endo - 2,56 + - 3,14; jeweils 4 Schnitte/OT; 2 Lokalisationen/ OT, alles in doppelter
Ausführung
178 9 Anhang Seite 2 Ta kt µm S OT Bez. Bemerkng
Takt µm S OT Bez. Bemerkng
13 5760-5880 577 25 HE A 13+14 19 8640-8760 865 37 HE A 19+20 5760-5880 578 8640-8760 866 5760-5880 579 26 HE B 13+14 8640-8760 867 38 HE B 19+20 5760-5880 580 8640-8760 868 5760-5880 581 27 vWF A 13+14 8640-8760 869 39 vWF A 19+20 5760-5880 582 8640-8760 870 5760-5880 583 28 vWF B 13+14 8640-8760 871 40 vWF B 19+20 5760-5880 584 8640-8760 872
14 6240-6360 625 25 HE A 13+14 20 9120-9240 913 37 HE A 19+20 6240-6360 626 9120-9240 914 6240-6360 627 26 HE B 13+14 9120-9240 915 38 HE B 19+20 6240-6360 628 9120-9240 916 6240-6360 629 27 vWF A 13+14 9120-9240 917 39 vWF A 19+20 6240-6360 630 9120-9240 918 6240-6360 631 28 vWF B 13+14 9120-9240 919 40 vWF B 19+20 6240-6360 632 9120-9240 920
15 6720-6840 673 29 HE A 15+16 21 9600-9720 961 41 HE A 21+22 6720-6840 674 9600-9720 962 6720-6840 675 30 HE B 15+16 9600-9720 963 42 HE B 21+22 6720-6840 676 9600-9720 964 6720-6840 677 31 vWF A 15+16 9600-9720 965 43 vWF A 21+22 6720-6840 678 9600-9720 966 6720-6840 679 32 vWF B 15+16 9600-9720 967 44 vWF B 21+22 6720-6840 680 9600-9720 968
16 7200-7320 721 29 HE A 15+16 22 10080-10200 1009 41 HE A 21+22 7200-7320 722 10080-10200 1010 7200-7320 723 30 HE B 15+16 10080-10200 1011 42 HE B 21+22 7200-7320 724 10080-10200 1012 7200-7320 725 31 vWF A 15+16 10080-10200 1013 43 vWF A 21+22 7200-7320 726 10080-10200 1014 7200-7320 727 32 vWF B 15+16 10080-10200 1015 44 vWF B 21+22 7200-7320 728 10080-10200 1016
17 7680-7800 769 33 HE A 17+18 23 10560-10680 1057 45 HE A 23+24 7680-7800 770 10560-10680 1058 7680-7800 771 34 HE B 17+18 10560-10680 1059 46 HE B 23+24 7680-7800 772 10560-10680 1060 7680-7800 773 35 vWF A 17+18 10560-10680 1061 47 vWF A 23+24 7680-7800 774 10560-10680 1062 7680-7800 775 36 vWF B 17+18 10560-10680 1063 48 vWF B 23+24 7680-7800 776 10560-10680 1064
18 8160-8280 817 33 HE A 17+18 24 11040-11160 1105 45 HE A 23+24 8160-8280 818 11040-11160 1106 8160-8280 819 34 HE B 17+18 11040-11160 1107 46 HE B 23+24 8160-8280 820 11040-11160 1108 8160-8280 821 35 vWF A 17+18 11040-11160 1109 47 vWF A 23+24 8160-8280 822 11040-11160 1110 8160-8280 823 36 vWF B 17+18 11040-11160 1111 48 vWF B 23+24 8160-8280 824 11040-11160 1112
Zusätzliche OT:
Nr. Bez. was Nr. Bez. Was Nr. Bez. wasNr. Bez. was
9 Anhang 179
Zellzahlbestimmung
• Neubauerzählkammer und Deckglas mit 70%igem EtOH reinigen • Zellen je nach Pellet Größe mit bis zu 8ml Medium resuspendieren • 10µl Zellsuspension mit 10µl Trypanblau mischen: 10µl in Kammer geben • 4 Quadrate auszählen • Zellen auf dem linken und oberen Rand nicht mitzählen • Berechnung der Zellzahl
o Summe der Quadrate :2 (wenn mit Trypanblau) o Summe der Quadrate :4 (wenn ohne Trypanblau) o x 104 = Zellzahl pro ml o x Anzahl der ml in denen Zellen gelöst sind = Zellzahl gesamt
Datum: Flasche Trypan-
blau A B C D :2 (m.Tr.)
:4 (o.Tr.) = Zellzahl Kammer[x104]
x ml
Zellzahl/Flasche
pro 75cm2 Flaschen 6x105 Zellen einsetzen Volumen berechnen nach Formel: X ml= 5
5
10106×××
zyml
X= in Zellkulturflasche einzusetzen Y = Menge Medium, in dem das Pellet aufgenommen wurde Z = Anzahl der Zellen pro Flasche Flasche Menge in ml, die 6x105 Zellen
enthalten
180 9 Anhang 9.5 Statistik
9.5.1 Vaskularisierungsdichte
Statistik Vaskularisierung an der größten Tumoranschnittsfläche Parameter Value Fläche Gefäße Fo Table Analyzed Fläche Gefäße oben (gr. Anschnittsfläche Tumor) One-way analysis of variance P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 19,29 R squared 0,6662 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 39,07 P value P<0.0001 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 4065 3 1355 Residual (within columns) 2037 29 70,23 Total 6102 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB -12,28 4,003 P < 0.05 -24.10 to -0.4558 Kontrolle vs ECB 17,07 5,846 P < 0.01 5.815 to 28.33 Kontrolle vs SCB -2,166 0,7064 P > 0.05 -13.99 to 9.654 LCB vs ECB 29,35 10,44 P < 0.001 18.51 to 40.18 LCB vs SCB 10,11 3,412 P > 0.05 -1.310 to 21.53 ECB vs SCB -19,24 6,844 P < 0.001 -30.07 to -8.403 Fläche Gefäße Fm Table Analyzed Fläche Gefäße mitte (gr. Anschnittsfläche Tumor) One-way analysis of variance P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 31,12 R squared 0,763 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 27,13 P value P<0.0001 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 9726 3 3242 Residual (within columns) 3021 29 104,2 Total 12750 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB -26,6 7,123 P < 0.001 -41.00 to -12.21 Kontrolle vs ECB 18,97 5,334 P < 0.01 5.263 to 32.68 Kontrolle vs SCB -9,882 2,646 P > 0.05 -24.28 to 4.515 LCB vs ECB 45,58 13,31 P < 0.001 32.38 to 58.77 LCB vs SCB 16,72 4,634 P < 0.05 2.814 to 30.63 ECB vs SCB -28,85 8,428 P < 0.001 -42.05 to -15.66
9 Anhang 181
Statistik Vaskularisierung an der größten Tumoranschnittsfläche Fläche Gefäße Fu Table Analyzed Fläche Gefäße unten (gr. Anschnittsfläche Tumor) One-way analysis of variance P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 14,8 R squared 0,6049 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 6,815 P value 0,078 P value summary ns Do the variances differ signif. (P < 0.05) No ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 8441 3 2814 Residual (within columns) 5514 29 190,1 Total 13950 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB -23,16 4,589 P < 0.05 -42.61 to -3.706 Kontrolle vs ECB 20,4 4,245 P < 0.05 1.878 to 38.92 Kontrolle vs SCB 1,603 0,3176 P > 0.05 -17.85 to 21.05 LCB vs ECB 43,55 9,417 P < 0.001 25.73 to 61.38 LCB vs SCB 24,76 5,079 P < 0.01 5.968 to 43.55 ECB vs SCB -18,8 4,064 P < 0.05 -36.62 to -0.9686 Summe Fläche Gefäße Fu/Fo/Fm Table Analyzed Summe Fläche Gefäße (größte Anschnittsfläche Tumor) One-way analysis of variance P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 54,46 R squared 0,8493 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 9,144 P value 0,0274 P value summary * Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 2,102E+12 3 7,007E+11 Residual (within columns) 3,731E+11 29 12870000000 Total 2,475E+12 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB -356900 8,598 P < 0.001 -516900 to -196900 Kontrolle vs ECB 324700 8,215 P < 0.001 172400 to 477100 Kontrolle vs SCB -60130 1,448 P > 0.05 -220100 to 99870 LCB vs ECB 681600 17,92 P < 0.001 535000 to 828300 LCB vs SCB 296800 7,401 P < 0.001 142200 to 451400 ECB vs SCB -384800 10,11 P < 0.001 -531500 to -238200
182 9 Anhang
Statistik Vaskularisierung an der Implantationslokalisation Parameter Value Fläche Gefäße Bo Table Analyzed Fläche Gefäße oben (Bregma -1 mm) One-way analysis of variance P value 0,0004 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 8,169 R squared 0,458 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 27,82 P value P<0.0001 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 3147 3 1049 Residual (within columns) 3724 29 128,4 Total 6871 32
Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff
Kontrolle vs LCB -5,549 1,338 P > 0.05 -21.53 to 10.43 Kontrolle vs ECB 16,48 4,174 P < 0.05 1.261 to 31.70 Kontrolle vs SCB -6,416 1,547 P > 0.05 -22.40 to 9.568 LCB vs ECB 22,03 5,796 P < 0.01 7.380 to 36.68 LCB vs SCB -0,8663 0,2162 P > 0.05 -16.31 to 14.58 ECB vs SCB -22,9 6,024 P < 0.01 -37.55 to -8.247 Fläche Gefäße Bm Table Analyzed Fläche Gefäße mitte (Bregma -1 mm) One-way analysis of variance P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 10,23 R squared 0,5143 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 27,48 P value P<0.0001 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 8279 3 2760 Residual (within columns) 7820 29 269,7 Total 16100 32
Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff
Kontrolle vs LCB -19,65 3,27 P > 0.05 -42.81 to 3.512 Kontrolle vs ECB 23,07 4,032 P < 0.05 1.016 to 45.13 Kontrolle vs SCB 6,639 1,105 P > 0.05 -16.52 to 29.80 LCB vs ECB 42,72 7,757 P < 0.001 21.49 to 63.95 LCB vs SCB 26,29 4,528 P < 0.05 3.913 to 48.67 ECB vs SCB -16,43 2,983 P > 0.05 -37.66 to 4.796
9 Anhang 183
Statistik Vaskularisierung an der Implantationslokalisation Fläche Gefäße Bu Table Analyzed Fläche Gefäße unten (Bregma -1 mm) One-way analysis of variance P value 0,0002 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 8,964 R squared 0,4811 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 20,55 P value 0,0001 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 8093 3 2698 Residual (within columns) 8728 29 301 Total 16820 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB -24,14 3,803 P > 0.05 -48.61 to 0.3268 Kontrolle vs ECB 18,06 2,987 P > 0.05 -5.244 to 41.36 Kontrolle vs SCB 4,885 0,7694 P > 0.05 -19.59 to 29.36 LCB vs ECB 42,2 7,252 P < 0.001 19.77 to 64.63 LCB vs SCB 29,03 4,733 P < 0.05 5.388 to 52.67 ECB vs SCB -13,17 2,264 P > 0.05 -35.60 to 9.256 Summe Fläche Gefäße Bu/Bo/Bm Table Analyzed Summe Fläche Gefäße (Bregma -1 mm) One-way analysis of variance P value P<0.0001 P value summary *** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 24,55 R squared 0,7175 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 18,07 P value 0,0004 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 1,701E+12 3 5,669E+11 Residual (within columns) 6,697E+11 29 23090000000 Total 2,37E+12 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB -283900 5,105 P < 0.01 -498200 to -69540 Kontrolle vs ECB 331400 6,259 P < 0.001 127300 to 535500 Kontrolle vs SCB 29390 0,5284 P > 0.05 -185000 to 243700 LCB vs ECB 615300 12,07 P < 0.001 418900 to 811800 LCB vs SCB 313300 5,831 P < 0.01 106200 to 520400 ECB vs SCB -302000 5,926 P < 0.01 -498500 to -105600
184 9 Anhang
Statistik Gefäßanzahl an der größten Tumoranschnittsfläche und an der Implantationslokalisation Summe Anzahl Gefäße Fu/Fo/Fm Table Analyzed Summe Anzahl Gefäße (größte Anschnittsfläche Tumor) One-way analysis of variance P value 0,0059 P value summary ** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 5,089 R squared 0,3449 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 18,42 P value 0,0004 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 445000000 3 148300000 Residual (within columns) 845300000 29 29150000 Total 1290000000 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB 663,6 0,3359 P > 0.05 -6952 to 8279 Kontrolle vs ECB 7705 4,096 P < 0.05 454.0 to 14960 Kontrolle vs SCB -1139 0,5764 P > 0.05 -8754 to 6477 LCB vs ECB 7042 3,889 P < 0.05 62.11 to 14020 LCB vs SCB -1803 0,9443 P > 0.05 -9160 to 5555 ECB vs SCB -8844 4,884 P < 0.01 -15820 to -1865 Summe Anzahl Gefäße Bu/Bo/Bm Table Analyzed Summe Anzahl Gefäße (Bregma -1 mm) One-way analysis of variance P value 0,0043 P value summary ** Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 5,442 R squared 0,3602 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 20,2 P value 0,0002 P value summary *** Do the variances differ signif. (P < 0.05) Yes ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 317800000 3 105900000 Residual (within columns) 564500000 29 19460000 Total 882200000 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value 95% CI of diff Kontrolle vs LCB 2583 1,6 P > 0.05 -3640 to 8806 Kontrolle vs ECB 8214 5,343 P < 0.01 2288 to 14140 Kontrolle vs SCB 2677 1,658 P > 0.05 -3546 to 8900 LCB vs ECB 5631 3,805 P > 0.05 -72.83 to 11330 LCB vs SCB 94,25 0,0604 P > 0.05 -5918 to 6106 ECB vs SCB -5536 3,741 P > 0.05 -11240 to 167.1
9 Anhang 185 Erhobene Daten zu Blutgefäßflächen an der größten Tumoranschnittsfläche größte Anschnittsfläche Flächen
Fläche ROI µm²: 575321,78 Fläche ROIx3 1725965,338 BT4Ca Gesamtsumme Flächen ROIs [µm²] 12081757,4 oben mitte unten Tier Fläche Klasse Fläche Klasse Fläche Klasse Summe Flächen/Tier Flächenanteil/Tier Flächenanteil/Gruppe µm² µm² µm² µm² % %
102 77421,48 114298,69 112625,27 304345,44 17,63334587 106 147848,82 148065,10 196922,87 492836,79 28,55426906 122 77121,38 123141,51 107271,48 307534,38 17,81810865 123 108146,11 73448,77 135063,92 316658,80 18,3467649 80 168818,31 120441,67 124782,34 414042,32 23,9890289 83 131843,07 228027,13 340204,21 700074,41 40,56132496 93 97784,54 117856,17 159911,68 375552,38 21,75897572
7 808983,71 925279,05 1176781,76 2911044,52 168,66 24,09 MW 115569,10 132182,72 168111,68 415863,50 24,09454544 STBW 35230,57302 47666,83218 81917,6638 142794,7709 8,273327844 CB039 Gesamtsumme Flächen ROIs [µm²] 13807722,7 oben mitte unten Tier Fläche Klasse Fläche Klasse Fläche Klasse Summe Flächen/Tier Flächenanteil/Tier µm² µm² µm² µm² %
100 265204,55 313339,35 205388,02 783931,92 45,41991103 101 175531,32 321763,01 425314,13 922608,46 53,45463406 111 233132,14 293922,94 390344,44 917399,52 53,15283565 115 144554,22 244348,11 288222,36 677124,69 39,23165042 116 127161,27 456872,59 238819,20 822853,05 47,67494665 79 82683,36 271633,18 465337,86 819654,40 47,48962124 88 115513,07 232235,31 202124,64 549873,02 31,85886793 94 345838,90 147870,43 195186,90 688896,24 39,91367736
8 1489618,83 2281984,92 2410737,54 6182341,29 358,20 44,77 MW 186202,35 285248,12 301342,19 772792,66 44,77451804 STBW 88620,39698 88796,57925 109926,305 127652,5436 7,396008528 CB038 Gesamtsumme Flächen ROIs [µm²] 17259653,4 oben mitte unten Tier Fläche Klasse Fläche Klasse Fläche Klasse Summe Flächen/Tier Flächenanteil/Tier µm² µm² µm² µm² %
108 15722,18 12716,69 28826,48 57265,35 3,3178737 112 14262,61 26107,45 32203,50 72573,56 4,204810075 118 22104,34 20879,33 37654,04 80637,70 4,672035008 119 23928,16 14540,86 66021,82 104490,84 6,054052056 121 13089,39 30169,87 45144,00 88403,25 5,12195978 124 8854,50 19776,73 42888,87 71520,10 4,143773924 82 12022,17 38354,58 156865,85 207242,59 12,0073439 85 25862,49 32283,84 31837,05 89983,39 5,213510656 98 13635,14 10328,05 6046,00 30009,18 1,738689726
103 24133,93 25146,47 60208,18 109488,57 6,343613769 10 173614,90 230303,87 507695,78 911614,55 52,82 5,28
MW 17361,49 23030,39 50769,58 91161,45 5,281766259 STBW 6046,605816 9069,990392 40863,927 46818,7644 2,712613247 CB037 Gesamtsumme Flächen ROIs [µm²] 13807722,7 oben mitte unten Tier Fläche Klasse Fläche Klasse Fläche Klasse Summe Flächen/Tier Flächenanteil/Tier µm² µm² µm² µm² %
110 96244,75 167045,81 187617,18 450907,74 26,12495928 114 147800,50 160226,46 78950,87 386977,82 22,42094971 117 164554,75 116413,71 83672,20 364640,66 21,12676629 120 124284,33 235451,54 119804,83 479540,70 27,78391261 84 113954,55 307269,77 223039,33 644263,65 37,32772843 96 96326,59 162186,57 156269,35 414782,51 24,03191428 97 154673,38 240481,87 307640,62 702795,86 40,71900224
105 126521,08 123183,48 114323,20 364027,75 21,09125511
8 1024359,92 1512259,20 1271317,59 3807936,71 220,63 27,58 MW 128044,99 189032,40 158914,70 475992,09 27,57831099 STBW 25814,25807 65927,78131 78043,7864 129285,0641 7,490594465
186 9 Anhang Erhobene Daten zu Gefäßflächen an der Implantationslokalisation Bregma -1 Flächen
Fläche ROI µm²: 575321,78 Fläche ROIx3 1725965,34 BT4Ca Gesamtsumme Flächen ROIs [µm²] 12081757,37 oben mitte unten Tier Fläche Klasse Fläche Klasse Fläche Klasse Summe Flächen/Tier Flächenanteil/Tier Flächenanteil/Gruppe µm² µm² µm² µm² % %
102 166031,54 91979,91 232107,81 490119,26 28,3968195 106 213995,14 226572,99 227852,92 668421,05 38,72737383 93 144984,71 140568,44 106444,36 391997,52 22,71178399
122 64811,37 136361,99 78827,99 280001,35 16,22288369 123 76984,28 96654,43 188939,30 362578,01 21,00725924 80 88064,77 57424,18 246192,40 391681,35 22,69346578 83 87710,11 433754,32 89955,99 611420,42 35,42483786
7 842581,93 1183316,28 1170320,76 3196218,97 185,18 26,45 MW 120368,85 169045,18 167188,68 456602,71 26,4549177 STBW 55581,6277 128386,2765 73111,4351 140461,258 8,138127375 CB039 Gesamtsumme Flächen ROIs [µm²] 13807722,71 oben mitte unten Tier Fläche Klasse Fläche Klasse Fläche Klasse Summe Flächen/Tier Flächenanteil/Tier µm² µm² µm² µm² %
100 177767,484 248111,12 216757,51 642636,12 37,23343128 101 67508,32 477084,78 436567,45 981160,55 56,84705987 111 97762,92 406723,80 479952,94 984439,66 57,03704686 115 103025,61 211225,59 327890,27 642141,47 37,20477203 116 89907,44 404866,00 549667,02 1044440,45 60,51340826 79 187568,86 80430,32 59807,74 327806,92 18,99267111 88 90838,83 295894,73 240018,20 626751,76 36,31311378 94 404077,37 132458,99 138003,63 674539,99 39,08189654
8 1218456,83 2256795,332 2448664,75 5923916,91 343,22 42,90 MW 152307,10 282099,42 306083,09 740489,61 42,90292497 STBW 110548,325 140434,7643 172507,3312 243973,23 14,13546521 CB038 Gesamtsumme Flächen ROIs [µm²] 17259653,38 oben mitte unten Tier Fläche Klasse Fläche Klasse Fläche Klasse Summe Flächen/Tier Flächenanteil/Tier µm² µm² µm² µm² %
108 27219,75 27746,43 33793,69 88759,88 5,142622188 112 22345,36 51811,46 58234,89 132391,71 7,670589108 118 18583,62 51733,77 65070,08 135387,48 7,844160033 119 28497,02 20417,27 88419,43 137333,72 7,95692253 121 55331,82 57414,94 64586,30 177333,06 10,27442759 124 14439,60 10599,71 49048,73 74088,04 4,292556657 82 25757,99 47590,44 33542,03 106890,46 6,193082936 85 16968,58 16007,83 44911,18 77887,58 4,512696698 98 23795,45 25929,89 62032,23 111757,57 6,475076247
103 22726,04 53801,40 133310,27 209837,70 12,15770059 10 255665,24 363053,13 632948,84 1251667,21 72,52 7,25
MW 25566,52 36305,31 63294,88 125166,72 7,251983457 STBW 11379,3467 17837,72813 29555,74684 43306,1908 2,509099684 CB037 Gesamtsumme Flächen ROIs [µm²] 13807722,71 oben mitte unten Tier Fläche Klasse Fläche Klasse Fläche Klasse Summe Flächen/Tier Flächenanteil/Tier µm² µm² µm² µm² %
110 131982,25 219295,17 220478,56 571755,98 33,12673604 114 230503,63 100279,53 81732,90 412516,06 23,90059915 117 145620,16 146249,37 85762,25 377631,79 21,87945397 120 130616,32 69844,94 126370,57 326831,83 18,936176 84 136184,78 70547,79 73423,80 280156,37 16,2318653 96 124165,73 116297,30 164310,03 404773,05 23,45198043 97 245226,56 146249,03 278877,49 670353,07 38,83931251
105 114112,92 177981,81 81618,11 373712,84 21,65239521
8 1258412,35 1046744,94 1112573,70 3417730,99 198,02 24,75 MW 157301,54 130843,12 139071,71 427216,37 24,75231483 STBW 50692,5353 52129,6914 76261,97684 129698,504 7,514548609
9 Anhang 187
Erhobene Daten zur Partikelanzahl an Bregma -1 mm, Seite 1
Dichte Bregma -1 Fläche ROI µm²: 575321,78 Fläche ROIx3 1725965BT4Ca Summe Flächen ROIs [µm²] 12081757,37 oben mitte unten oben mitte unten
Tier
Dichte Partikel alle Klassen
Dichte Partikel alle Klassen
Dichte Partikel alle Klassen
Anzahl Partikel Gesamt
Anzahl Partikel Gesamt
Anzahl Partikel Gesamt
Summe Partikel Dichte/Tier
Dichte/ Gruppe
1/µm² 1/µm² 1/µm² # # # 1/µm² 1/µm² 102 0,00983276 0,00229089 0,00094382 5657 1318 543 7518 0,00435582 106 0,01506461 0,01271289 0,01000000 8667 7314 5754 21735 0,01259295
93 0,00678055 0,00271674 0,00189807 3901 1563 1092 6556 0,00379845 122 0,00391259 0,00143919 0,00127407 2251 828 733 3812 0,00220862 123 0,01765447 0,00124974 0,01907280 10157 719 10973 21849 0,012659
80 0,00333900 0,01186640 0,00725159 1921 6827 4172 12920 0,00748567 83 0,00169992 0,00735415 0,00346241 978 4231 1992 7201 0,00417216
7 0,00832627 0,00566143 0,00627182 33532 22800 25259 81591 0,00675324 MW MW MW Summe Summe Summe Summe STBW 0,006128366 0,004973464 0,006571556 MW 11656 0,00675324 STBW 7434 0,00430718 CB039 Summe Flächen ROIs [µm²] 13807722,71 oben mitte unten oben mitte unten
Tier
Dichte Partikel alle Klassen
Dichte Partikel alle Klassen
Dichte Partikel alle Klassen
Anzahl Partikel Gesamt
Anzahl Partikel Gesamt
Anzahl Partikel Gesamt
Summe Partikel Dichte/Tier
Dichte/ Gruppe
1/µm² 1/µm² 1/µm² # # # 1/µm² 1/µm² 100 0,00328686 0,00453485 0,00498330 1891 2609 2867 7367 0,00426834 101 0,00405686 0,00753144 0,00879508 2334 4333 5060 11727 0,00679446 111 0,00313737 0,00708821 0,00549084 1805 4078 3159 9042 0,00523881 115 0,00731243 0,00617741 0,00639294 4207 3554 3678 11439 0,0066276 116 0,00931131 0,00694220 0,00562120 5357 3994 3234 12585 0,00729157
79 0,00605574 0,00155913 0,00173121 3484 897 996 5377 0,00311536 88 0,00285927 0,00514147 0,00394214 1645 2958 2268 6871 0,00398096 94 0,00839530 0,00369011 0,00212229 4830 2123 1221 8174 0,0047359
8 0,00555189 0,00533310 0,00488488 25553 24546 22483 72582 0,00525662 MW MW MW Summe Summe Summe Summe STBW 0,002563959 0,002029475 0,002297492 MW 9072,8 0,00525662 STBW 2596,8 0,00150457
188 9 Anhang
Erhobene Daten zur Partikelanzahl an Bregma -1 mm, Seite 2
CB038 Summe Flächen ROIs [µm²] 17259653,38 oben mitte unten oben mitte unten
Tier
Dichte Partikel alle Klassen
Dichte Partikel alle Klassen
Dichte Partikel alle Klassen
Anzahl Partikel Gesamt
Anzahl Partikel Gesamt
Anzahl Partikel Gesamt
Summe Partikel Dichte/Tier
Dichte/
Gruppe 1/µm² 1/µm² 1/µm² # # # 1/µm² 1/µm²
108 0,00187026 0,00174685 0,00180942 1076 1005 1041 3122 0,00180884 112 0,00209274 0,00299658 0,00282277 1204 1724 1624 4552 0,00263736 118 0,00059966 0,00134533 0,00173990 345 774 1001 2120 0,0012283 119 0,00118716 0,00111416 0,00159563 683 641 918 2242 0,00129898 121 0,00002002 0,00025391 0,00205624 72 913 1183 2168 0,00125611 124 0,00091775 0,00204234 0,00231175 528 1175 1330 3033 0,00175728
82 0,00175380 0,00247340 0,00153827 1009 1423 885 3317 0,00192182 85 0,00111764 0,00197629 0,00206841 643 1137 1190 2970 0,00172078 98 0,00147396 0,00165125 0,00755403 848 950 4346 6144 0,00355975
103 0,00207710 0,00180421 0,00438016 1195 1038 2520 4753 0,00275382 10 0,00131101 0,00174043 0,00278766 7603 10780 16038 34421 0,0019943
MW MW MW Summe Summe Summe Summe STBW 0,000676052 0,000747742 0,001872938 MW 3442,1 0,0019943 STBW 1315,3 0,00076207 CB037
Summe Flächen ROIs [µm²] 13807722,71 oben mitte unten oben mitte unten
Tier
Dichte Partikel alle Klassen
Dichte Partikel alle Klassen
Dichte Partikel alle Klassen
Anzahl Partikel Gesamt
Anzahl Partikel Gesamt
Anzahl Partikel Gesamt
Summe Partikel Dichte/Tier
Dichte/
Gruppe 1/µm² 1/µm² 1/µm² # # # 1/µm² 1/µm²
110 0,00421677 0,00513452 0,00779042 2426 2954 4482 9862 0,0057139 114 0,00577416 0,00293922 0,00333726 3322 1691 1920 6933 0,00401688 117 0,00302787 0,00210839 0,00155391 1742 1213 894 3849 0,00223006 120 0,00573592 0,00160258 0,00229263 3300 922 1319 5541 0,00321038
84 0,00471736 0,00320864 0,00648333 2714 1846 3730 8290 0,00480311 96 0,00370401 0,00342591 0,00590452 2131 1971 3397 7499 0,00434481 97 0,00597752 0,00316866 0,00780433 3439 1823 4490 9752 0,00565017
105 0,01217579 0,01290234 0,00986231 7005 7423 5674 20102 0,01164682
8 0,00566618 0,00431128 0,00562859 26079 19843 25906 71828 0,00520202 MW MW MW Summe Summe Summe Summe STBW 0,002836002 0,003622582 0,002954905 MW 8978,5 0,00520202 STBW 4929,3 0,00285597
9 Anhang 189
Erhobene Daten zur Partikelanzahl an der größten Tumoranschnittsfläche, Seite 1
Dichte größte Fläche Fläche ROI µm²: 575321,78 Fläche ROIx3 1725965BT4Ca Summe Flächen ROIs [µm²] 12081757,37 oben mitte unten oben mitte unten
Tier
Dichte Partikel alle Klassen
Dichte Partikel alle Klassen
Dichte Partikel alle Klassen
Anzahl Partikel Gesamt
Anzahl Partikel Gesamt
Anzahl Partikel Gesamt
Summe Partikel Dichte/Tier
Dichte/
Gruppe 1/µm² 1/µm² 1/µm² # # # 1/µm² 1/µm²
102 0,00358582 0,00565597 0,00242125 2063 3254 1393 6710 0,00388768 106 0,00782345 0,00916009 0,01349506 4501 5270 7764 17535 0,01015953
93 0,00254466 0,00196759 0,00189285 1464 1132 1089 3685 0,00213504 122 0,00120454 0,00088820 0,00219529 693 511 1263 2467 0,00142935 123 0,01169259 0,00934781 0,00194500 6727 5378 1119 13224 0,0076618
80 0,01873213 0,00623999 0,02344601 10777 3590 13489 27856 0,01613937 83 0,00166863 0,00139748 0,00717512 960 804 4128 5892 0,00341374
7 0,00675026 0,00495102 0,00751008 27185 19939 30245 77369 0,00640379 MW MW MW Summe Summe Summe Summe STBW 0,006499001 0,003587976 0,00823157 MW 11053 0,00640379 STBW 9152,2 0,00530265 CB039 Summe Flächen ROIs [µm²] 13807722,71
oben mitte unten oben mitte unten
Tier
Dichte Partikel alle Klassen
Dichte Partikel alle Klassen
Dichte Partikel alle Klassen
Anzahl Partikel Gesamt
Anzahl Partikel Gesamt
Anzahl Partikel Gesamt
Summe Partikel Dichte/Tier
Dichte/
Gruppe 1/µm² 1/µm² 1/µm² # # # 1/µm² 1/µm²
100 0,00710733 0,00595840 0,00671277 4089 3428 3862 11379 0,00659283 101 0,00668669 0,00994748 0,01266074 3847 5723 7284 16854 0,00976497 111 0,00568204 0,00400124 0,00618784 3269 2302 3560 9131 0,00529037 115 0,00376137 0,00820584 0,00922093 2164 4721 5305 12190 0,00706271 116 0,00390912 0,00776957 0,00694568 2249 4470 3996 10715 0,00620812
79 0,00446880 0,00832925 0,00061531 2571 4792 354 7717 0,00447112 88 0,00033957 0,00568899 0,00045915 1221 3273 1651 6145 0,00356033 94 0,00647290 0,00170339 0,00743584 3724 980 4278 8982 0,00520404
8 0,00480348 0,00645052 0,00627978 23134 29689 30290 83113 0,00601931 MW MW MW Summe Summe Summe Summe STBW 0,002214802 0,002670892 0,004093702 MW 10389 0,00601931 STBW 3269,8 0,00189446
190 9 Anhang
Erhobene Daten zur Partikelanzahl an der größten Tumoranschnittsfläche, Seite 2
CB038 Summe Flächen ROIs [µm²] 17259653,38 oben mitte unten oben mitte unten
Tier
Dichte Partikel alle Klassen
Dichte Partikel alle Klassen
Dichte Partikel alle Klassen
Anzahl Partikel Gesamt
Anzahl Partikel Gesamt
Anzahl Partikel Gesamt
Summe Partikel Dichte/Tier
Dichte/ Gruppe
1/µm² 1/µm² 1/µm² # # # 1/µm² 1/µm² 108 0,00146874 0,00077000 0,00139574 845 443 803 2091 0,0012115 112 0,00164604 0,00265591 0,00359277 947 1528 2067 4542 0,00263157 118 0,00161301 0,00074046 0,00191197 928 426 1100 2454 0,00142181 119 0,00192762 0,00121671 0,00179726 1109 700 1034 2843 0,00164719 121 0,00071960 0,00123409 0,00184592 414 710 1062 2186 0,00126654 124 0,00084474 0,00089341 0,00329033 486 514 1893 2893 0,00167616
82 0,00096120 0,00267502 0,00584195 553 1539 3361 5453 0,00315939 85 0,00464088 0,00496939 0,00274455 2670 2859 1579 7108 0,00411828 98 0,00087429 0,00127233 0,00031461 503 732 181 1416 0,00082041
103 0,00146005 0,00144093 0,00142181 840 829 818 2487 0,00144093 10 0,00161562 0,00178683 0,00241569 9295 10280 13898 33473 0,00193938
MW MW MW Summe Summe Summe Summe STBW 0,001138771 0,001317187 0,001542054 MW 3347,3 0,00193938 STBW 1784,5 0,00103391 CB037 Summe Flächen ROIs [µm²] 13807722,71
oben mitte unten oben mitte unten
Tier
Dichte Partikel alle Klassen
Dichte Partikel alle Klassen
Dichte Partikel alle Klassen
Anzahl Partikel Gesamt
Anzahl Partikel Gesamt
Anzahl Partikel Gesamt
Summe Partikel Dichte/Tier
Dichte/ Gruppe
1/µm² 1/µm² 1/µm² # # # 1/µm² 1/µm² 110 0,00575852 0,00764268 0,00650940 3313 4397 3745 11455 0,00663687 114 0,00658240 0,00175373 0,00520404 3787 6306 2994 13087 0,00758242 117 0,00310261 0,00138010 0,00177292 1785 794 1020 3599 0,00208521 120 0,00265417 0,00058486 0,00284536 1527 2103 1637 5267 0,00305163
84 0,00682401 0,00983450 0,00977192 3926 5658 5622 15206 0,00881014 96 0,00714904 0,00785647 0,00841268 4113 4520 4840 13473 0,00780607 97 0,00755056 0,00620696 0,00887677 4344 3571 5107 13022 0,00754476
105 0,00685008 0,01235830 0,01976807 3941 7110 11373 22424 0,01299215
8 0,00580892 0,00595220 0,00789515 26736 34459 36338 97533 0,00706366 MW MW MW Summe Summe Summe Summe STBW 0,001883046 0,00430944 0,005578841 MW 12192 0,00706366 STBW 5846,2 0,00338721
9 Anhang 191
9.5.2 Tumorgrößen
Statistik der Tumorvolumina Parameter Value Table Analyzed Data 1 One-way analysis of variance P value 0,0209 P value summary * Are means signif. different? (P < 0.05) Yes Number of groups 4 F 3,784 R squared 0,2813 Bartlett's test for equal variances Bartlett's statistic (corrected) 0,2622 P value 0,967 P value summary ns Do the variances differ signif. (P < 0.05) No ANOVA Table SS df MS Treatment (between columns) 2,029E+22 3 6,762E+21 Residual (within columns) 5,183E+22 29 1,787E+21 Total 7,211E+22 32 Tukey's Multiple Comparison Test Mean Diff. q P value Kontrolle vs SCB 22490000000 1,454 P > 0.05 Kontrolle vs ECB -10960000000 0,7439 P > 0.05 Kontrolle vs LCB -47320000000 3,059 P > 0.05 SCB vs ECB -33450000000 2,359 P > 0.05 SCB vs LCB -69820000000 4,671 P < 0.05 ECB vs LCB -36360000000 2,565 P > 0.05 95% CI of diff Kontrolle vs SCB -37140000000 to 82120000000 Kontrolle vs ECB -67740000000 to 45820000000 Kontrolle vs LCB -107000000000 to 12310000000 SCB vs ECB -88100000000 to 21200000000 SCB vs LCB -127400000000 to -12210000000 ECB vs LCB -91020000000 to 18290000000
192 9 Anhang Summen der gemessene Anschnittsflächen
Tumorflächen Endostatinbeads und Stammzellbeads gegenüber Leerbeads und Kontrolle Kontrollgruppe CB037/ SCB Tier Vol Takt Tier Vol Takt EN80 8,1335E+10 480 EN84 2,2939E+10 360 EN83 1,6803E+11 600 EN96 5,4875E+10 480 EN93 6,4975E+10 480 EN97 1,0536E+11 480 EN102 3,0934E+10 480 EN105 5,4586E+10 360 EN106 4,7249E+10 480 EN110 1,3476E+11 600 EN122 9,407E+10 480 EN114 3442419538 120 EN123 1,206E+11 480 EN117 8,8809E+10 480 EN120 4,9209E+10 480 Mittelwert µm³ 8,6742E+10 6,4249E+10 Mittelwert mm³ 86,742235 64,2485135 STBW µm³ 4,6521E+10 4,3223E+10 STBW mm³ 46,5213758 43,2227401 CB038/ ECB CB039/ LCB Tier Vol Takt Tier Vol Takt EN82 1,0143E+11 720 EN79 9,762E+10 540 EN85 1,2343E+11 600 EN88 9,669E+10 600 EN98 1,2912E+11 600 EN94 1,471E+11 480 EN103 9,884E+10 480 EN100 8,0734E+10 480 EN108 5,0943E+10 480 EN101 1,5007E+11 600 EN112 1,0706E+10 360 EN111 1,7994E+11 600 EN118 1,4567E+11 600 EN115 1,4243E+11 600 EN119 1,0633E+11 480 EN116 1,7793E+11 600 EN121 7,5597E+10 480 EN124 1,3495E+11 600 Mittelwert µm³ 9,7702E+10 1,3406E+11 Mittelwert mm³ 97,7015568 134,064787 STBW µm³ 4,1727E+10 3,7974E+10 STBW mm³ 41,7269779 37,9737898 Verwendete Formeln Äquivalentradius r = √ A⁄π Kegelstumpf V = 1⁄3* (r1² + r1*r2 + r2²) Kegel 1⁄3* G* h r1= Radius 1= Radius der ersten Fläche r2= Radius 2= Radius der zweiten Fläche G= Grundfläche bei nur einer Fläche h= Höhe= Takt zwischen den Schnitten Tumorvolumina wurden berechnet als Summe der Kegelstümpfe zwischen zwei ausgemessenen Tumorflächen addiert mit als Kegel berechneten Ausgleichswerten bei Tumorüberständen vor oder nach dem letzten auswertbaren Schnitt.
9 Anhang 193
9.5.3 Korrelationen zwischen Vaskularisierung und Tumorvolumina
Statistik zur Bestimmung der Korrelationen Seite 1 Gefäßfläche Y Intercept Gruppe I BT4Ca Tumorvol. vs. Summe Gefäßflächen aus 6 ROI Best-fit values Slope 0.000002015 ± 0.0000006729 Y-intercept when X=0.0 261500 ± 65170 X-intercept when Y=0.0 -1,298E+11 1/slope 49640095% Confidence Intervals Slope 0.0000005484 to 0.000003481 Y-intercept when X=0.0 119500 to 403500 X-intercept when Y=0.0 -711800000000 to -35480000000 Goodness of Fit r² 0,4276 Sy.x 108400Is slope significantly non-zero? F 8,964 DFn, DFd 1.000, 12.00 P value 0,0112 Deviation from zero? Significant Data Number of X values 14 Maximum number of Y replicates 1 Total number of values 14 Number of missing values 0Gruppe II LCB Tumorvol. vs. Summe Gefäßflächen aus 6 ROI Best-fit values Slope 0.000002254 ± 0.000001048 Y-intercept when X=0.0 611800 ± 79540 X-intercept when Y=0.0 -2,714E+11 1/slope 44360095% Confidence Intervals Slope 0.000000007024 to 0.000004502 Y-intercept when X=0.0 441200 to 782400
X-intercept when Y=0.0 -107700000000000 to -101400000000
Goodness of Fit r² 0,2485 Sy.x 169400Is slope significantly non-zero? F 4,63 DFn, DFd 1.000, 14.00 P value 0,0494 Deviation from zero? Significant Data Number of X values 16 Maximum number of Y replicates 1 Total number of values 16 Number of missing values 0
194 9 Anhang
Statistik zur Bestimmung der Korrelationen Seite 2 Gefäßfläche Y Intercept Gruppe III ECB Tumorvol. vs. Summe Gefäßflächen aus 6 ROI Best-fit values Slope 0.0000004169 ± 0.0000002559 Y-intercept when X=0.0 67430 ± 26980 X-intercept when Y=0.0 -1,618E+11 1/slope 239900095% Confidence Intervals Slope -0.0000001208 to 0.0000009545 Y-intercept when X=0.0 10760 to 124100 X-intercept when Y=0.0 Goodness of Fit r² 0,1285 Sy.x 45300Is slope significantly non-zero? F 2,654 DFn, DFd 1.000, 18.00 P value 0,1207 Deviation from zero? Not Significant Data Number of X values 20 Maximum number of Y replicates 1 Total number of values 20 Number of missing values 0Gruppe IV SCB Tumorvol. vs. Summe Gefäßflächen aus 6 ROI Best-fit values Slope -0.0000002097 ± 0.0000009280 Y-intercept when X=0.0 479700 ± 128700 X-intercept when Y=0.0 2,287E+12 1/slope -476800095% Confidence Intervals Slope -0.000002200 to 0.000001781 Y-intercept when X=0.0 203700 to 755800 X-intercept when Y=0.0 Goodness of Fit r² 0,003635 Sy.x 131900Is slope significantly non-zero? F 0,05108 DFn, DFd 1.000, 14.00 P value 0,8245 Deviation from zero? Not Significant Data Number of X values 16 Maximum number of Y replicates 1 Total number of values 16 Number of missing values 0
9 Anhang 195
9.6 Danksagung
Herrn Prof. Dr. med. T. Brinker herzlichen Dank für die wissenschaftliche Betreuung,
vielmehr aber noch für das immer wieder Mutmachen und für viele gute Tipps. Herrn
Univ. Prof. Dr. vet. med. I. Nolte danke ich für die Übernahme der Betreuung und für
die Gelegenheit anderthalb Jahre lang in der Onkologiesprechstunde lernen zu
dürfen. Herrn Prof. Dr. med. Dr. hc mult Dr. M. Samii danke ich für die Bereitstellung
der Forschungseinrichtungen des INI Hannover und für tolle Feste. Frau PD Dr. med.
P. Klinge vielen Dank für die nette und hilfreiche Beratung in immunhistologischen
Dingen. Der Internationalen Stiftung Neurobionik Hannover und dem
Bundesministerium für Bildung und Forschung danke ich für die finanzielle
Projektunterstützung. Bei der Firma CellMed AG bedanke ich mich für die
Bereitstellung der Implantate und vor allem bei Frau Dr. Christine Wallrapp für die
geduldige und immer freundliche Unterstützung und Hilfe.
Ganz herzlichen Dank an all die, die diese Arbeit möglich gemacht haben und
geholfen haben, wo sie konnten. Allen voran das ganze Laborteam: Steffen Baltes
für Rat und Tat; Christiane Bartling und Jana Unger für viele bunte Schnitte und noch
vieles mehr; Ina Freund, Caro Mallig, Pia Rittmann und allen anderen für eine
wirklich gute Zeit, für Trost, für Kaffee, fürs Zuhören und für Hilfe überall.
Vielen Dank auch an all meine fleißigen Korrekturleser und Übersetzungshelfer.
Ein besonderer Dank geht an meine ganze WG, die mir ohne ein Wort darüber zu
verlieren immer wieder wochenlang den Rücken frei gehalten und ein schönes
Zuhause gegeben hat. Ihr seid die Größten.
Den Engeln und Allen die dazu gehören, danke ich dafür, dass sie mir die Familie
sind, die sie sind und für ihr Verständnis.
Ich danke meinen Freunden, denn ganz sicher ist: Ohne Eure Unterstützung wäre
ich da so nicht durchmarschiert: Nicole Hartmann, Juliane Körte, Enrico Schulz, Anna
Heile, Doro Kollmann, Peter Krause, Mario Kollmann und allen anderen. Es ist
schön, sich auf Menschen verlassen zu können.
Liebe Mama, lieber Papa, liebe Vera, liebe Oma: Euch Danke für einfach alles. ILE.
Christian, ich danke dir von ganzem Herzen.