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Aus der Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Kopf- und Halschirurgie am St. Elisabeth Hospital Bochum Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Direktor: Professor Dr. med. H. Hildmann Untersuchungen zum osteoklastären Knochenabbau im Cholesteatom Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Jörg Ebmeyer aus Tübingen 2002

Untersuchungen zum osteoklastären Knochenabbau im … · Inhaltsverzeichnis Seite Abkürzungsverzeichnis 1. Einleitung 1 1.1 Historischer Überblick und Definition 1 1.2 Pathogenese

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Aus der Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Kopf- und

Halschirurgie am St. Elisabeth Hospital Bochum

Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum

Direktor: Professor Dr. med. H. Hildmann

Untersuchungen zum osteoklastären Knochenabbau im Cholesteatom

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin

einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von Jörg Ebmeyer aus Tübingen

2002

Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: PD Dr. med. H. Sudhoff Koreferent: Tag der mündlichen Prüfung: 22. Oktober 2002

Meinem Vater in Dankbarkeit gewidmet

Inhaltsverzeichnis Seite

Abkürzungsverzeichnis

1. Einleitung 1

1.1 Historischer Überblick und Definition 1

1.2 Pathogenese des Cholesteatoms 3

1.2.1 Einteilung der Cholesteatome 3

1.2.1.1 Klassische Einteilung 3

1.2.1.2 Neuere Klassifikation 5

1.3 Klinisches Erscheinungsbild des Cholesteatoms 5

1.4 Typische Komplikationen des Cholesteatoms 6

1.5 Therapiemöglichkeiten des Cholesteatoms 7

1.6 Knochenabbau durch das Cholesteatom 7

1.7 Biologie des Osteoklasten 8

1.7.1 Funktion von Osteoblasten und Osteoklasten 8

1.7.2 Morphologische Grundlagen 8

1.8 Fragestellung und Zielsetzung 10

2. Material und Methoden 12

2.1 Ossikel 12

2.1.1 Präparate 12

2.1.2 Untersuchung der Präparate 12

2.2 Lichtmikroskopie 13

2.2.1 Färbung 13

2.2.1.1 Zellkulturen 13

2.2.1.2 Schädelknochenbiopsien 13

2.2.2 Mikroskop/Dokumentation 13

2.2.2.1 Dokumentation der Zellkulturen 13

2.3 Elektronenmikroskopie 14

2.3.1 Vorbereitung der Präparate 14

2.3.2 Critical Point Trocknung 14

2.3.2.1 Prinzip 14

2.3.2.2 Critical Point Trocknung der Präparate 14

2.3.3 “Sputtern” der Präparate 15

2.3.3.1 Prinzip 15

2.3.3.2 Sputtervorgang 15

2.4 Zellkulturen 16

2.4.1 Gewinnung der Zellen 16

2.4.2 Kultivierung der Zellen 16

2.4.3 Studien mit Zoledronat und Calzitonin in vitro 17

2.4.3.1 Zoledronat 17

2.4.3.2 Calzitonin 17

2.4.3.3 Auswertung der Zellkulturen 17

2.4.4 Dentin-Chips 18

2.5 Tierexperimente 18

2.5.1 Keratinimplantate 18

2.5.2 Zoledronat in vivo 20

2.5.3 Auswertung der Schädelknochenpräparate 20

2.6 Statistiken 21

3. Ergebnisse 22

3.1 Ossikel 22

3.1.1 Kontrollen 22

3.1.2 Knöchelchen aus Cholesteatom-erkrankten Ohren 22

3.1.3 Morphologie des Knochenabbaus 25

3.2 Zellkulturen 30

3.2.1 Wirkung von Zoledronat in vitro 30

3.2.1.1 TRAP-Färbung 30

3.2.1.2 TUNEL-Färbung 32

3.2.2 Wirkung von Calzitonin in vitro 33

3.2.2.1 Zellkulturen 33

3.2.2.2 Dentinscheibchen 34

3.3 Morphologie der Resorptionslakunen 37

3.4 Tierexperimente 41

3.4.1 Keratinpartikel-induzierte Osteolyse in vivo 41

3.4.2 Statistische Auswertung der Schädelpräparate 42

4. Diskussion 44

4.1 Morphologie der Ossikel im Cholesteatom 44

4.1.1 Oberflächliche Resorption 44

4.1.2 Perivaskuläre Knochenresorption 45

4.2 Vergleich der Knochenresorption in vivo und in vitro 45

4.3 Inhibition der Knochenresorption in vitro 46

4.3.1 Zoledronat in vitro 46

4.3.2 Calzitonin in vitro 47

4.4 Inhibition der Knochenresorption in vivo 48

4.4.1 Zoledronat in vivo 48

4.5 Vergleich der Wirkung von Zoledronat + Calzitonin 49

4.6 Klinische Relevanz 50

5. Zusammenfassung 51

6. Literaturverzeichnis 53

7. Danksagungen 60

8. Lebenslauf 61

Abkürzungsverzeichnis α-MEM minimal essential medium

CTR Calzitoninrezeptor

EDTA Ethylen-Diamino-Tetraessigsäure

hCT Humanes Calzitonin

M-CSF macrophage colony stimulating factor

Oc Osteoklast

ODF Osteoklasten-Differenzierungsfaktor (=OPGL=RANKL)

OPGL Osteoprotegerin-Ligand (=ODF=RANKL)

PBS Phosphate-buffered Saline

RANKL receptor-activated NFκB ligand (OPGL=ODF)

REM Raster-Elektronenmikroskopie

SEM Scanning Elektron Microscopy

TNF-α Tumornekrosefaktor α

TNF-β Tumornekrosefaktor β

TRAP tartrate resistent acid phosphatase

TUNEL TdT-mediated UTP nick end labelling

Einleitung 1

1. Einleitung

1.1 Historischer Rückblick und Definition

Das Cholesteatom ist ein häufig zu beobachtendes Krankheitsbild

des Mittelohres, das zu Schwerhörigkeit, einem Verlust des Gleich-

gewichtsorgans, einer Schädigung des Gesichtsnerven, aber auch

zu lebensbedrohlichen endokraniellen und septischen Komplikatio-

nen führen kann.

Du Verney war wahrscheinlich der erste, der eine Cholesteatom-

ähnliche Masse beschrieb. Er bezeichnete das Krankheitsbild 1683

als „Steatom“. Die Bezeichnung „Chole-steat-om“, also „Cholesterin-

Fett-Tumor“, prägte der deutsche Physiologe Johannes Müller 1838

aufgrund von histologischen Beobachtungen. Er beschrieb seinerzeit

„einen geschichteten perlförmigen Tumor aus Fett“.

Cruveilhier sprach 1829 wegen des makroskopisch perlförmigen

Erscheinungsbildes des Cholesteatoms eher deskriptiv von einer

„tumeur perlée“, einer „Perlgeschwulst“ des Felsenbeines. Dieser

Begriff wurde von Rudolf Virchow 1855 aufgegriffen. Bis in die

heutige Zeit hat sich allerdings aus unerfindlichen Gründen der

formal falsche und irreführende Begriff Cholesteatom gehalten.

Es handelt sich beim Cholesteatom um einen benignen Tumor der

Mittelohrräume, der aus zwiebelschalenartig angeordneten verhor-

nenden Plattenepithelzellen besteht. Das Cholesteatom wächst lang-

sam und lokal destruierend, wobei die Destruktion durch einen

Abbau des umliegenden Knochens bedingt ist. Das Cholesteatom

wächst weder aktiv infiltrierend wie ein maligner Tumor, noch setzt

es Metastasen.

Das Cholesteatom kann definiert werden als „chronische osteokla-

stische Knochenzerstörung als Folge von ortsfremdem, verhornen-

dem Plattenepithel in den normalerweise nur mit Schleimhaut ausge-

kleideten Mittelohrräumen mit bedrohlichen Komplikationsmöglichkei-

ten“ (Zenner 1997) (Abbildung 1).

Einleitung 2

Abbildung 1: Rasterelektronenmikroskopisches Bild eines Chole-steatoms. Die einzelnen rosettenartig angeordneten Keratinschup-pen (abgeschilferte Epithelzellen) sind deutlich zu erkennen. A: Übersicht: Hammerkopf mit anhängenden Anteilen eines Cholesteatoms, 60x B: Stärkere Vergrößerung der Keratinschuppen, 120x

B

A

Die fast immer bestehende bakterielle Superinfektion (insbesondere

mit Problemkeimen wie Pseudomonas, Proteus etc.) führt zu einer

eitrigen Entzündung. Man spricht daher auch von einer chronischen

Knocheneiterung.

Einleitung 3

1.2 Pathogenese des Cholesteatoms

Zur Pathogenese des Cholesteatoms existieren verschiedene Theo-

rien (Sudhoff et al. 1999). Generell kann unterschieden werden zwi-

schen kongenitalen (angeborenen) und erworbenen Cholesteatomen

(siehe 1.2.1).

Ein Cholesteatom entsteht in aller Regel dann, wenn Plattenepithel-

zellen in das Cavum tympani (sog. „Paukenhöhle“, Mittelohr) gelan-

gen.

Im Normalfall ist die Paukenhöhle von einem einschichtigen platten

bis kubischen Epithel ausgekleidet. Gelangt verhornendes Platten-

epithel in den Mittelohrraum (sei es aus dem äußeren Gehörgang,

durch Metaplasie oder durch Versprengung embryonaler Mesen-

chymreste), so beginnt dieses aus noch ungeklärten Gründen

unkontrolliert zu wachsen. Die so entstandene „Perle“ aus zwiebel-

schalenartig angeordneten verhornenden Plattenepithelzellen wächst

weiter und bildet die Cholesteatommatrix. Diese wird von der Chole-

steatomperimatrix unterschieden, die durch das subepitheliale Binde-

gewebe gebildet wird.

Im Bereich der Perimatrix kommt es zu einer chronisch inflammatori-

schen Reaktion. Im Rahmen dieser Entzündung kann es zum osteo-

klastären Abbau insbesondere der Gehörknöchelchen, aber auch der

angrenzenden Felsenbeinstrukturen kommen.

1.2.1 Einteilung der Cholesteatome

1.2.1.1 Klassische Einteilung

Aufgrund ihrer grundsätzlich unterschiedlichen Pathogenese unter-

scheidet man zwei verschiedene Gruppen von Cholesteatomen:

(1) Kongenitale (angeborene) Cholesteatome

(2) Erworbene Cholesteatome

Einleitung 4

Zu (1):

Kongenitale Cholesteatome sind definiert als Cholesteatome hinter

einem intakten Trommelfell ohne zurückliegende Infektionen oder

ohrchirurgische Eingriffe (Derlacki et al. 1965). Zur Entstehung kon-

genitaler Cholesteatome bestehen verschiedenste Theorien (Sudhoff

et al. 1999). Das Trommelfell bleibt intakt, es handelt sich um okkulte

Cholesteatome. Das ektopische Plattenepithel verhält sich meist

längere Zeit stumm, kann aber zu denselben zum Teil lebensbedroh-

lichen Komplikationen führen wie das erworbene Cholesteatom.

Diese Hypothese wurde erstmals von Habermann 1888 aufgestellt.

Zu (2):

Die erworbenen oder sekundären Cholesteatome treten weitaus

häufiger auf. Zu ihrer Pathogenese existieren ebenfalls verschiedene

Theorien, die teilweise sehr kontrovers diskutiert werden. Die vier

bedeutendsten Theorien sollen hier kurz dargestellt werden:

1. Aufgrund von Tubenventilationsstörungen bilden sich Retrak-

tionstaschen oder Invaginationen des Trommelfells, in denen sich

Keratinozyten von der Außenfläche des Trommelfells ansammeln

und so ein Cholesteatom bilden können (Wittmaack 1933). Am häu-

figsten betroffen ist die Pars flaccida, da sie der Teil des Trommel-

fells ist, der am wenigsten unter Spannung steht und somit die

größte Compliance aufweist.

2. Plattenepithel des äußeren Gehörgangs wächst durch eine Trom-

melfellperforation in die Pauke vor (Habermann 1888, Bezold 1890).

Die Trommelfellperforation kann dabei entweder entzündlich durch

eine chronische Otitis media oder traumatisch entstehen. Trauma-

tisch kann ein Cholesteatom auch durch Verschleppung von Platten-

epithel z.B. infolge von Schädelfrakturen entstehen.

3. Durch den Reiz einer chronischen Entzündung kommt es zu einer

Metaplasie von Zellen der Mittelohrschleimhaut zu Plattenepithelzel-

len (von Tröltsch 1864, Wendt 1873, Sadé 1971); diese Theorie ist

heute sehr umstritten.

Einleitung 5

4. Sporadisches papilläres Tiefenwachstum von Plattenepithelzellen

von der Außenseite des Trommelfells durch die Basalmembran führt

zur Bildung von kleinen „Keratinozytenzysten“, die sich zu einem

Cholesteatom ausdehnen können (Lange 1925, Ruedi 1978).

In den meisten Fällen wird sicherlich eine Kombination dieser

Theorien die Pathogenese des Cholesteatoms am besten erklären.

1.2.1.2 Neuere Klassifikation

Tos nahm 1993 eine neuere Klassifikation des Cholesteatoms vor,

wobei er sich mehr nach der Lokalisation des Prozesses richtete. Er

unterschied:

1. Attic-Cholesteatom

2. Sinus-Cholesteatom

3. Tensa-Cholesteatom

Das Attic-Cholesteatom wurde definiert als eine unübersichtliche

Retraktion der Pars flaccida (=Schrapnell-Membran), die sich in Attic

oder Aditus und evtl. auch in Antrum, Mastoid oder Mittelohrraum

ausdehnt.

Das Sinus-Cholesteatom bezeichnet eine posterior-superior gelege-

ne Retraktion oder Perforation der Pars tensa, die sich in den Sinus

tympanicus, die posterioren Anteile des Tympanons oder noch weiter

ausdehnt.

Unter dem Tensa-Cholesteatom versteht man eine Retraktion oder

Adhäsion der gesamten Pars tensa, die tympanale Öffnung der Eu-

stachischen Röhre mitbetreffend. Das Tensa-Cholesteatom kann

auch noch weiter in den Attic-Raum vordringen.

1.3 Klinisches Erscheinungsbild des Cholesteatoms

Primäre Cholesteatome können klinisch lange Zeit unauffällig bleiben

und sich erst durch auftretende Komplikationen bemerkbar machen.

Einleitung 6

Klassischerweise tritt ein Cholesteatom jedoch durch zunehmende

Schalleitungsschwerhörigkeit in Verbindung mit schleimig-eitriger,

fötider Otorrhoe in Erscheinung.

Oft berichten Patienten auch über ein periaurikuläres Druckgefühl.

Auch über Tinnitus und Halbseitenkopfschmerz wird gelegentlich

geklagt. Zusätzliches Auftreten eines oder mehrerer Symptome wie

Schwindel, Erbrechen, Ertaubung, Fazialisparese, Fieber, Schüttel-

frost oder Benommenheit muß als Alarmsignal für eine akute

Komplikation gewertet werden.

Ohrmikroskopisch können Cholesteatome sehr unterschiedlich in

Erscheinung treten: Die Bandbreite reicht von einer weißlichen

„Perle“, die durch das intakte Trommelfell hindurchschimmert im

Falle eines primären Cholesteatoms über unübersichtliche Retrak-

tionstaschen bis hin zu schuppig belegten randständigen Trommel-

fellperforationen. Sekundäre Cholesteatome gehen fast immer mit

einer schmierig-eitrigen, fötiden Otorrhoe einher.

1.4 Typische Komplikationen des Cholesteatoms

Die Komplikationsmöglichkeiten des Cholesteatoms sind sehr

schwerwiegend und kommen durch seine Tendenz zustande, den

umliegenden Knochen zu arrodieren bzw. zu resorbieren. Ein

weiterer wichtiger Faktor ist die stets vorhandene bakterielle

Superinfektion, häufig durch Problemkeime. Das Cholesteatom kann

durch Destruktion der Gehörknöchelchenkette zu einer Schallei-

tungsschwerhörigkeit führen, durch Fistelbildung zu einer Schädi-

gung des Innenohres, durch Zerstörung des knöchernen Fazialis-

kanals zu einer Fazialisparese, bei Einbruch in das Labyrinth zu

einer Labyrinthitis bzw. ausgeprägter Schwindelsymptomatik oder zu

einem Verlust des Hörvermögens. Weiterhin kann es durch eine

Arrosion des Sinus sigmoideus zu einer Sinusthrombose und

Thrombophlebitis führen. Ein Durchbrechen in die mittlere bzw.

hintere Schädelgrube kann zu einer Meningitis, Enzephalitis, Hirn-

Einleitung 7

und Kleinhirnabszessen führen. Durch ein Einschleppen von Keimen

in die Blutbahn kann es zu einer Sepsis kommen.

Solche bedrohlichen Komplikationen des Cholesteatoms entstehen

zwar meist erst nach längerem Krankheitsverlauf. Sie lassen sich

jedoch nur durch ein rasches und entschlossenes therapeutisches

Vorgehen verhindern.

1.5 Therapiemöglichkeiten des Cholesteatoms

Eine medikamentöse Therapie des Cholesteatoms ist derzeit nicht

möglich. Aufgrund der drohenden schweren Komplikationen ist eine

operative Sanierung absolut indiziert. Hierbei ist besondere Sorgfalt

auf die vollständige Entfernung des Cholesteatomsackes und des

entzündeten Knochens aus Mittelohr und Mastoid zu verwenden.

Gelingt dies nicht, ist mit hoher Wahrscheinlichkeit ein Rezidiv zu

erwarten.

In vielen Fällen ist eine Wiederherstellung bzw. zumindest eine

Verbesserung des Hörvermögens durch eine Tympanoplastik mög-

lich, wenn die Innenohrfunktion noch nicht nachhaltig beeinträchtigt

ist.

1.6 Knochenabbau durch das Cholesteatom

Zur genauen Pathophysiologie des Knochenabbaus durch das

Cholesteatom existieren verschiedene Theorien. Ging man früher

noch von einer Drucknekrose bzw. Atrophie des Knochens aus

(Erdheim 1905, Grünwald 1910, Rüedi 1957, Tumarkin 1958), misst

man heute der begleitenden Entzündungsreaktion die größte Bedeu-

tung zu. Ein Zusammenspiel verschiedenster Zytokine ist an dieser

Reaktion beteiligt (Amling et al. 1996, Ahn et al. 1990, Bujía et al.

1996, Chung et al. 1998, siehe auch 1.7.2). Den wichtigsten patho-

physiologischen Faktor stellt die entzündungsbedingte Chemotaxis

Einleitung 8

und Aktivierung von Osteoklasten dar, die den Abbau des

umliegenden Knochens bewirken und somit die bereits erwähnten

Komplikationen verursachen können (Chole 1984 + 1988).

1.7 Biologie des Osteoklasten

1.7.1 Funktion von Osteoblasten und Osteoklasten

Die Entwicklung des Skelettsystems, die Reparatur von Knochenbrü-

chen und die Umstrukturierung der Knochensubstanz im Sinne einer

biomechanischen Anpassung an veränderte Beanspruchungen

(„Remodeling“) sind essentielle Ansprüche, die der Knochen neben

seinen mechanischen Stütz- und Haltefunktionen erfüllen muß. Hinzu

kommt eine weitere sehr wichtige Aufgabe des Skelettsystems: Es

dient dem Körper als gigantischer Kalzium- und Phosphatspeicher.

Um all diese Aufgaben zu erfüllen, ist ein ständiger Umbau der

Knochen notwendig. Von außen kaum sichtbar finden stetige An-

und Abbauvorgänge statt. Die Zellen, die diese spezifischen

Aufgaben leisten, sind Osteoblasten und Osteoklasten. Während die

Osteoblasten für den Aufbau von Knochensubstanz und den Einbau

von Kalzium und Phosphat zuständig sind, ist die Aufgabe der

Osteoklasten der Abbau von Knochensubstanz. Sie setzen dabei

nicht nur Kalzium und Phosphat aus dem Knochen frei (Deminerali-

sation des Knochens), sondern sind auch in der Lage, die Knochen-

grundsubstanz, die vornehmlich aus Kollagen Typ I besteht, abzu-

bauen.

Eine Störung der Funktion von Osteoblasten und / oder Osteoklasten

bedingt entweder eine übermäßige Knochendichte (Osteopetrose,

Osteosklerose) oder einen Verlust von Knochenmasse (Osteopenie,

Osteoporose).

1.7.2 Morphologische Grundlagen

Osteoklasten sind terminal differenzierte, hochspezialisierte, amöbo-

id bewegliche vielkernige Riesenzellen und haben eine Größe von

Einleitung 9

10-100 µm. Typischerweise liegen sie in Einbuchtungen, den soge-

nannten Howship’schen Lakunen, die durch ihre knochenresorbie-

rende Tätigkeit entstanden sind. Sie besitzen ein stark basophiles

granuliertes Zytoplasma mit unterschiedlich großen Vakuolen. Die

bis zu 30 (oder sogar mehr) Zellkerne zeigen ein inhomogenes

Muster unterschiedlicher Größe, Form und Basophilie. Am apikalen

(dem Knochen zugewandten) Pol der Zelle ist die Plasmamembran

stark gefaltet und bildet einen Bürstensaum („ruffeled border“),

umrandet von einer dem Knochen sehr eng anliegenden Zone

(„sealing zone“). Hierbei handelt es sich um den resorbierenden Teil

der Zelle. Abgedichtet von der sealing zone dient der Bürstensaum

der Sekretion von knochenabbauenden Enzymen, Protonen, Prote-

inen etc., sowie der Resorption abgebauter Knochenbestandteile.

Die Zelle bildet so ein von der Umgebung abgeschlossenes

Resorptionskompartiment, in dem ein extrem saures Milieu herrscht

(Abbildung 2).

Abbildung 2: Schematische Darstellung eines Osteoklasten in einer Resorptionslakune („Howshipsche Lakune“).

Sealing Zone

Resorption

Sekretion

Knochen

Resorptionskompartiment

Ruffeled border

Nuklei

Sealing Zone

Osteoklasten entstehen durch die asynchrone Fusion von mononu-

kleären Vorläuferzellen aus dem Knochenmark (Nijweide 1986). Ihre

Differenzierung erfolgt aus der Monozyten-Makrophagen Linie

Einleitung 10

(Chambers 1985, 1988, 2000, Prallet 1992, Amling et al. 1996).

Insgesamt ist nur etwa 1% der Knochenoberfläche mit Osteoklasten

bedeckt, es handelt sich also um eine verhältnismäßig kleine Zellpo-

pulation. Die Reifung der Osteoklasten umfasst vier Stadien:

Proliferation, Differenzierung, Fusion und Aktivierung. Im Prolifera-

tionsstadium sind die Zellen monozytisch, teilen sich aktiv und

exprimieren keine Tartratresistente Saure Phosphatase (TRAP). In

der Differenzierungsphase hören die Zellen auf, sich zu teilen und

werden TRAP-positiv. Die Zellen wachsen und fusionieren in der

Fusionsphase zu mehrkernigen Riesenzellen. In der folgenden

Aktivierungsphase bildet sich die „Ruffeled Border“ und die Zellen

beginnen mit der Knochenresorption. Es ist bekannt, daß viele

Zytokine wie zum Beispiel Makrophagen-Koloniestimulierender

Faktor (M-CSF), Interleukin-1, Interleukin-6, Tumornekrosefaktor-α

(TNF-α), Transformierender Wachstumsfaktor-β (TGF-β), Osteokla-

sten-Differenzierungsfaktor (ODF, RANKL, OPGL), Prostaglandine

und Leukotriene die osteoklastäre Knochenresorption steigern

(Amling et al. 1996, Ahn et al. 1990, Bujía et al. 1996, Chung et al.

1998).

Biochemisch kennzeichnend für Osteoklasten ist die Expression von

Calzitoninrezeptoren (CTR), des Vitronektinrezeptors (ανβ3), einer

Protonenpumpe (H+ ATPase), sowie die Bildung von Carboanhydra-

se II und tartratresistenter saurer Phosphatase (TRAP) (Prallet et al.

1992).

1.8 Fragestellung und Zielsetzung

In der vorliegenden Arbeit soll der Knochenabbau im Cholesteatom

rasterelektronenmikroskopisch dargestellt werden. Hierzu sollen im

Rahmen cholesteatomsanierender ohrchirurgischer Eingriffe entnom-

mene Gehörknöchelchen untersucht und die Morphologie des Kno-

chenabbaus dargestellt werden.

Einleitung 11

Wie bereits in der Literatur nachzulesen (z.B. Chole et al. 1984,

Richardson et al. 1993), wird der Knochenabbau im Cholesteatom

mit großer Wahrscheinlichkeit durch die Aktivierung knochenabbau-

ender Zellen (Osteoklasten) bewirkt. Es soll in der vorliegenden

Arbeit nach morphologischen Anhaltspunkten für die Ursache des

cholesteatombedingten Knochenabbaus gesucht werden.

Zur Therapie des Cholesteatoms stehen bisher nur chirurgische

Maßnahmen zur Verfügung. Diese sind oft sehr aufwendig und mit

hohen Komplikations- und Rezidivraten behaftet. In der vorliegenden

Arbeit sollen daher Möglichkeiten zur medikamentösen Hemmung

des Knochenabbaus im Cholesteatom untersucht werden.

Der Einfluss und die Wirkungsweise der Substanzen Calzitonin und

Zoledronat auf Osteoklasten in vitro sollen untersucht und verglichen

werden.

Das Polypeptidormon Calzitonin dient dem Körper zur Modulation

des Kalziumhaushalts. Es bewirkt eine Hemmung der Kalziumfreiset-

zung aus dem Knochen. Dabei wirkt es über den Calzitoninrezeptor

direkt hemmend auf Osteoklasten.

Zoledronat ist ein Bisphosphonat der dritten Generation. Ältere

Bisphosphonate werden bereits zur Therapie der Osteoporose und

anderer mit Knochenabbau einhergehender Erkrankungen einge-

setzt. Ihre Wirkungsweise ist nicht vollständig geklärt. Sie scheinen

ebenfalls eine Hemmung der Osteoklastentätigkeit zu bewirken.

Durch die Untersuchung der Wirkungsweise der erwähnten Pharma-

ka sollen mögliche zusätzliche Therapieoptionen für Cholesteatome

aufgezeigt werden, die das chirurgische Vorgehen erleichtern und

die Komplikations- und Rezidivrate verringern könnten.

Material und Methoden 12

2. Material und Methoden

2.1 Ossikel

2.1.1 Präparate

Zur morphologischen Darstellung des Knochenabbaus im Chole-

steatom wurden 46 Gehörknöchelchen untersucht. 40 dieser Ossikel

stammten von 32 an Cholesteatomen erkrankten Patienten, die in

der Zeit von 1997-1999 an der HNO-Klinik der Universität Bochum

am Mittelohr operiert wurden. Das Alter der Patienten lag zwischen 6

und 86 Jahren, durchschnittlich bei 39,5 Jahren, die Geschlechtsver-

teilung ergab ein Verhältnis M:W von ca. 1:1.

Zum Vergleich wurden 6 Gehörknöchelchen aus Felsenbeinen nicht

am Ohr erkrankter Leichen untersucht. Hierbei handelte es sich um

jeweils 3 Hammer und 3 Ambosse. Bei den Gehörknöchelchen der

an Cholesteatomen erkrankten Patienten handelte es sich um 17

Hammer/Hammerköpfe und 23 Ambosse. Die Präparate wurden

direkt nach der Entnahme in Formalin oder Glutaraldehyd fixiert. Ein

Teil der Gehörknöchelchen wurde daraufhin zur Ablösung von

Weichteilstrukturen und Schleimhaut zunächst für 24 Stunden in

Natrium-Hypochlorid eingelegt (Wong et al. 1991). Danach erfolgte

die Aufbereitung für die rasterelektronenmikroskopische Untersu-

chung wie unter Punkt 2.4 beschrieben.

2.1.2 Untersuchung der Präparate

Sämtliche Präparate wurden rasterelektronenmikroskopisch bei

ansteigenden Vergrößerungen untersucht, wobei besonderer Wert

auf die Morphologie des Knochenabbaus gelegt wurde. Sämtliche

Auffälligkeiten und Befunde wurden fotografisch dokumentiert

(„Agfachrome RSX 200“ Diafilme) und archiviert.

Material und Methoden 13

2.2 Lichtmikroskopie

2.2.1 Färbung

2.2.1.1 Zellkulturen

Für die lichtmikroskopischen Untersuchungen an den Zellkulturen

wurden TRAP-Färbungen angefertigt. TRAP (Tartrate Resistent Acid

Phosphatase, Tartratresistente saure Phosphatase) ist ein Enzym,

das von ausgereiften Osteoklasten gebildet wird. In der TRAP-

Färbung stellt es sich braun dar und erlaubt so die Identifikation von

Osteoklasten. Es wurde das „Leucocyte Acid Phosphatase Kit“ von

Sigma Diagnostics, St. Louis, USA verwendet.

Zur Darstellung apoptotischer Zellen diente die TUNEL-Färbung

(TdT-mediated UTP nick end labelling, In Situ Cell Death Detection

Kit, Boehringer, Mannheim), in der sich apoptotische Zellen dunkel

anfärben.

2.2.1.2 Schädelknochenbiopsien

Die Schädelknochenbiopsien wurden nach der Fixierung zunächst in

0.35 mol/l Na-EDTA (pH 7.4) für mehrere Tage demineralisiert, dann

in aufsteigenden Acetonlösungen dehydriert und in EPON-Araldite

eingebettet. Drei 2µm Schnitte wurden mindestens 100µm voneinan-

der entfernt von jedem Präparat mit Hilfe eines Reichert Ultramicro-

toms angefertigt. Die Präparate wurden mit Toluidinblau gefärbt und

histologisch ausgewertet, wobei die Osteoklasten gezählt wurden.

2.2.2 Mikroskop/Dokumentation

2.2.2.1 Dokumentation der Zellkulturen

Die Untersuchung der Zellkulturpräparate erfolgte mit unserem

Zellkulturmikroskop (Olympus IMT 2). Von jedem Präparat wurden

bei identischer Vergrößerung, Blende und Belichtung fünf Bilder von

unterschiedlichen, zufällig ausgewählten Regionen der Kulturplatte

digital aufgenommen (Digitalkamera Olympus DP 50). Die digitale

Auswertung erfolgte mit Hilfe des Bildanalysesystems Zeiss Kontron

KS 300 wie unter Punkt 2.4.3.3 beschrieben.

Material und Methoden 14

2.3 Elektronenmikroskopie

2.3.1 Vorbereitung der Präparate

Nach der Entnahme wurden die Präparate direkt für mindestens 24

Stunden in Formalin oder Glutaraldehyd fixiert.

2.3.2 Critical Point Trocknung

2.3.2.1 Prinzip

Das Prinzip der Critical Point Trocknung besteht darin, daß sämt-

liches Wasser in einem Präparat durch eine Ersatzflüssigkeit ersetzt

wird. Diese wird daraufhin langsam in einen gasförmigen Zustand

gebracht und so dem Präparat auf schonende Weise wieder

entzogen.

Hierfür eignet sich insbesondere Kohlendioxid (CO2), da es sich

unterhalb von 31°C durch Druckerhöhung zu einer Flüssigkeit

verdichten läßt, die durch eine geringe Erhöhung der Temperatur

wieder zum Verdampfen gebracht werden kann.

2.3.2.2 Critical Point Trocknung der Präparate

Die Präparate wurden zunächst für 10 Minuten in 0,1 molarer PBS-

Lösung gewaschen und dann in einer aufsteigenden Alkoholreihe

dehydriert: Jeweils fünfminütiges Schwenken in Ethanolkonzentratio-

nen von 30%, 50%, 75%, 96% und 2mal hintereinander 100%.

Sodann wurden die Präparate in unserem „Balzers Union Critical

Point Dryer“ (Balzers Union Limited, Accessories for Electron

Microscopy) getrocknet: Die dehydrierten Präparate wurden in die

auf ca. 10 °C vorgekühlte Probenkammer gegeben. Diese wurde

unter hohem Druck mit flüssigem Kohlendioxid gefüllt. Nach

sorgfältigem Durchmischen mit einem Magnetrührer wurde das

Gemisch langsam auf 42°C erhitzt. Dadurch verdampfte das CO2

und konnte langsam abgelassen werden. Den Präparaten wurde so

sämtliche Flüssigkeit entzogen.

Material und Methoden 15

Die getrockneten Präparate wurden auf Probentellerchen geklebt

und zur Bedampfung mit Gold in unseren „Cressington 108auto

Sputter Coater“ gegeben.

2.3.3 „Sputtern“ der Präparate

2.3.3.1 Prinzip

Für die Elektronenmikroskopie müssen die Präparate mit einer

leitfähigen Oberfläche versehen werden. Hierfür werden die Proben

üblicherweise durch einen Induktionsstrom, der Moleküle aus einem

„Target“ herauslöst, mit Gold bedampft. Dieses Verfahren erlaubt es,

eine sehr dünne leitfähige Schicht auf das Gewebe zu bringen, ohne

wichtige Strukturen zu zerstören oder zu verdecken.

2.3.3.2 Sputtervorgang

Es wurde unser Bedampfungsgerät „Cressington 108auto Sputter

Coater“ verwendet. Die Präparate wurden in die Probenkammer des

Gerätes gegeben. Dann wurde zunächst ein Vakuum erzeugt und die

Kammer mit Argon, dem „Prozeßgas“, geflutet, so daß eine Argon-

Atmosphäre mit einem Druck von ca. 0.1 mbar entstand.

Durch einen Sputterstrom von 30 mA wurden aus dem Target (einem

massiven Gold-Block) Moleküle herausgelöst und auf die Oberfläche

des Präparates übertragen. Auf diese Weise bildete sich eine feine,

leitfähige Gold-Schicht auf dem Präparat.

Die so aufbereiteten Präparate wurden mit unserem Raster-Elektro-

nenmikroskop (Stereoscan 250, Cambridge Instruments) untersucht.

Material und Methoden 16

2.4 Zellkulturen

2.4.1 Gewinnung der Zellen

Zur Züchtung von Osteoklasten in vitro wurden Knochenmarkszellen

aus Tibia und Femur von 3-6 Wochen alten männlichen Mäusen

gewonnen.

Die Tiere wurden hierzu zunächst mit Ether betäubt und durch zer-

vikale Dislokation getötet. Daraufhin wurden Tibia und Femur her-

auspräpariert und in einer sterilen Schale auf Eis gesammelt. Für

jeden Versuchsansatz wurden die Knochen von drei Mäusen ver-

wendet.

Die Knochenmarkszellen wurden gewonnen, indem die Röhren-

knochen mit Hilfe einer Spritze mit α-MEM (minimal essential me-

dium) gespült wurden. Die zum Teil verklumpten Knochenmarks-

zellen wurden durch einen Cell Strainer gefiltert und vorsichtig über

Ficoll Hypaque Trennlösung pipettiert. Daraufhin wurden die Zellen

bei 1500 U/min für 15 min zentrifugiert. Aufgrund ihrer unterschied-

lichen Dichte sammelten sich Zellen unterschiedlichen Typs an

verschiedenen Stellen im Reagenzglas und so konnte die Mono-

zyten/Makrophagen-Fraktion selektiv pipettiert werden.

2.4.2 Kultivierung der Zellen

Die so gewonnenen Monozyten und Makrophagen wurden in 24-Well

Zellkulturplatten in α-MEM mit Zusatz von 10% fetalem Kälberserum

(FCS) und Antibiotika bei 37°C in einer Atmosphäre von 95% Luft

und 5% CO2 kultiviert.

Zur Stimulation der Osteoklastogenese wurde den Kulturen 30ng/ml

M-CSF (Macrophage Colony stimulating Factor) und 50ng/ml OPGL

(Osteoprotegerin-Ligand / Osteoklasten-Differenzierungsfaktor) zu-

gegeben. Medium und sämtliche Faktoren wurden jeden zweiten Tag

gewechselt.

Material und Methoden 17

2.4.3 Studien mit Zoledronat und Calzitonin in vitro

Um die Wirkung von Zoledronat bzw. Calzitonin in vitro zu untersu-

chen, wurden diese Substanzen den Zellkulturen in unterschiedlicher

Konzentration jeweils mit dem Mediumwechsel zugegeben.

2.4.3.1 Zoledronat

Zoledronat wurde den Zellkulturen jeden zweiten Tag in Konzentra-

tionen von 10-6 – 10-9 mol/l zugegeben. Zusätzliche Kontrollkulturen

wurden unter Zusatz von EDTA (Äthylendiamintetraessigsäure)

inkubiert, um eine Auswirkung des Calzium-komplexierenden

Effektes von Bisphosphonaten auszuschließen. Die Kulturen wurden

für 10 Tage inkubiert. Dann wurden die Zellen fixiert und TRAP-

Färbungen (siehe 2.2.1.1) durchgeführt. Danach erfolgte die

mikroskopische Auswertung.

2.4.3.2 Calzitonin

Calzitonin wurde den Zellkulturen jeden zweiten Tag in Konzentratio-

nen von 10-6 – 10-10 mol/l zugegeben. Die Kulturen wurden ebenfalls

für 10 Tage inkubiert, dann fixiert und TRAP-Färbungen durchgeführt

(siehe 2.2.1.1). Danach erfolgte die mikroskopische Auswertung.

2.4.3.3 Auswertung der Zellkulturen

Zur Auswertung der Zellkulturen wurden mit Hilfe einer digitalen

Kamera (Olympus DP 50) von jedem Präparat bei identischer

Vergrößerung, Blende und Belichtung fünf Fotos von unterschiedli-

chen, zufällig ausgewählten Regionen der Kulturplatte aufgenom-

men.

Unter Zuhilfenahme des digitalen Bildanalysesystems Zeiss Kontron

KS 300 wurde der prozentuale Anteil der von Osteoklasten be-

deckten Fläche an der Gesamtfläche des Bildausschnittes berech-

net. Die so gewonnenen Zahlen wurden für jedes Präparat gemittelt,

so daß Durchschnittswerte angegeben werden konnten.

Material und Methoden 18

2.4.4 Dentin-Chips

Als Substrat für die Knochenresorption dienten 400µm dicke Dentin-

Chips, die mit Hilfe eines Sägemikrotoms (Leica 1600) aus Walfisch-

zähnen geschnitten wurden. Sie wurden jeweils der Hälfte der

Kulturplatten-Öffnungen zugegeben. Auf den Dentin-Chips fand in

vitro osteoklastäre Knochenresorption statt. Die Auswertung erfolgte

elektronenmikroskopisch. Zunächst wurden die Chips nach Beendi-

gung der Kulturzeit im Ultraschallbad gereinigt und von sämtlichen

Zellen befreit. Daraufhin wurden sie für die Raster-Elektronenmikro-

skopie aufbereitet (siehe 2.3).

Zur Auswertung wurden unter identischen Vergrößerungs- und Be-

lichtungsverhältnissen fünf Bilder von unterschiedlichen Regionen

jedes Präparates digitalisiert. Mit Hilfe unserer Bildanalysesoftware

Zeiss Kontron KS 300 wurde der prozentuale Anteil der Resorptions-

lakunen an der Gesamtfläche der Dentinscheibchen berechnet.

2.5 Tierexperimente

Die tierexperimentellen in-vivo-Studien wurden im Labor von Prof.

Dr. R. Chole, St. Louis, USA, durchgeführt. Bei den Versuchstieren

handelte es sich um drei bis sechs Wochen alte männliche Mäuse

(C57/BL6). Die Versuchsprotokolle wurden vom „Institutional Animal

Care and Use Committee“ (IACUC) der Washington University in St.

Louis genehmigt und die Versuche erfolgten unter Berücksichtigung

der „PHS Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals“,

des „NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals“ und des

„Animal Welfare Act (7 U.S.C. et seq.)“.

2.5.1 Keratinimplantate

Zur Stimulation eines osteoklastären Knochenabbaus wurde ein von

Chole et al. (2001) entwickeltes Modell zur Induktion von

osteoklastärem Knochenabbau benutzt: Den Versuchstieren wurden

Material und Methoden 19

sterilisierte Keratinpartikel subperiostal auf die Schädelkalotte

implantiert.

Zur Implantation erhielten die Mäuse eine Ether-Narkose. Die Haut

über der Kalotte wurde rasiert, desinfiziert und auf einer Länge von

etwa 1,5 cm inzidiert. Der Schädelknochen wurde freipräpariert und

das Periost stumpf nach lateral verschoben. Auf beiden Seiten der

sagittalen Schädelnaht wurden ca. 10-12 mg Keratinpartikel aufge-

bracht, die Haut readaptiert und mit Wundklemmen verschlossen.

Die Tiere vertrugen die Operation gut, es gab keine Mortalität und

keine sichtbare Morbidität.

Nach Beendigung des Experimentes wurden die Tiere in Ethernarko-

se getötet, die Schädelkalotte entfernt und mit einer 5 mm Haut-

Biopsiestanze beiderseits der Sagittalnaht eine Probe entnommen,

wobei die unmittelbar an die Sagittalnaht angrenzende Region

vermieden wurde (Abbildung 3). Die so gewonnenen Präparate

wurden halbiert und in 4% Formaldehyd und 0.05% Glutaraldehyd in

0.1 mol/l Phosphatpuffer (pH 7.4) bei Zimmertemperatur fixiert.

Abbildung 3: Schematische Darstellung der Präparation der Mäu-seschädel. (Mit freundlicher Genehmigung von Prof. Chole, St. Louis)

Material und Methoden 20

2.5.2 Zoledronat in vivo

Zur Untersuchung der Wirkung von Zoledronat in vivo wurden die

Versuchstiere in sechs Gruppen zu je fünf Tieren aufgeteilt. Gruppe

I: Kontrolle 1 (nicht operierte Tiere), Gruppe II: Kontrolle 2 (Operation

ohne Keratinimplantation, keine Injektionen: „SHAM Operation“),

Gruppe III: Kontrolle 3 (Keratinimplantation, tägliche intraperitoneale

Injektionen von Ca++/Mg++-freiem PBS), Gruppe IV-VI: Studiengrup-

pen (tägliche intraperitoneale Injektionen von 1, 3, bzw. 10µg Zole-

dronat pro kg Körpergewicht). Alle Tiere wurden vier Tage vor und

fünf Tage nach der Operation behandelt.

2.5.3 Auswertung der Schädelknochenpräparate

Die Auswertung der Schädelknochenpräparate erfolgte nachdem die

Objektträger mit den Schnitten mit neutralen Codes versehen worden

waren, so dass der Untersucher nicht wusste, um welches Präparat

es sich handelte.

Osteoklasten wurden in den Präparaten identifiziert und auf der

gesamten Länge jedes 5 mm langen Schädelknochen-Präparates

gezählt. Dem Knochen anliegende Zellen konnten anhand folgender

Kriterien eindeutig als Osteoklasten identifiziert werden:

1. mehrkernige (≥ 2 Zellkerne) Zellen

2. deutliche „ruffeled border“

3. granuliertes Zytoplasma

4. im Bereich des Kontaktes mit Knochen zumindest teilweise

aufgelöste Lamina limitans

Um als Osteoklast gezählt zu werden, musste eine Zelle mindestens

drei der vier oben genannten Kriterien erfüllen (Abbildung 19, S. 41). Die statistische Auswertung (Berechnung der Anzahl Osteoklasten

pro Millimeter Knochen) wurde mit Hilfe der Statistiksoftware von

SPSS Science Inc. durchgeführt.

Material und Methoden 21

2.6 Statistiken

Die Datenanalyse erfolgte mit Hilfe der Datenanalysesoftware SPSS

9.0 von SPSS Science Inc. Alle Ergebnisse wurden als Mittelwerte

mit ihrer Standardabweichung und dem Standardfehler berechnet.

Zur Varianzanalyse wurde eine einfaktorielle ANOVA Prozedur

verwendet. Die Berechnung der Signifikanz erfolgte mit Hilfe der

Scheffé-Prozedur, α war 0,05 in allen Analysen.

Ergebnisse 22

3. Ergebnisse

3.1 Ossikel 3.1.1 Kontrollen

Die zur Kontrolle untersuchten gesunden Gehörknöchelchen zeigten

sich in der Raster-Elektronenmikroskopie unverletzt, mit einer allseits

glatten Oberfläche und größtenteils intakter, jedoch teils atrophischer

Schleimhaut (Abbildung 4 A). Die Schleimhautatrophie ist sicherlich

auf die Tatsache zurückzuführen, dass die Kontroll-Präparate aus

Leichen-Felsenbeinen stammten. Nach Entfernung der Weichteile

durch 24stündiges Einlegen in 0,1 molare Natriumhypochlorid-

Lösung zeigte sich eine glatte faserige Lammellenknochenstruktur,

die nur gelegentlich durch Havers’sche Kanäle unterbrochen war

(Abbildung 4 B).

3.1.2 Knöchelchen aus Cholesteatom-erkrankten Ohren

An sämtlichen der untersuchten Gehörknöchelchen von Patienten

mit Cholesteatomen fanden sich deutliche Spuren des Knochenab-

baus (Abbildung 5). Die Schleimhaut war größtenteils intakt, stellenweise im Bereich der

Resorptionslakunen jedoch angedaut. Hier fanden sich gelegentlich

auch große, in den Resorptionslakunen gelegene Zellen, vermutlich

Osteoklasten (Abbildung 8). Auf einigen Gehörknöchelchen ließ sich die noch anhängende

Cholesteatommatrix darstellen. Deutlich zu erkennen war die schup-

pige Struktur des Cholesteatoms, hervorgerufen durch abschilfernde

Plattenepithelzellen (Abbildung 1). Im Randbereich des Cholesteat-

oms ließen sich deutlich die verschiedenen Stadien des Knochenab-

baus darstellen (siehe 3.1.3 „Morphologie des Knochenabbaus“,

Abbildung 6 + 7). Nach Entfernung der Weichteile konnte die Auswirkung des Chole-

steatoms auf die Knochenstruktur dargestellt werden.

Ergebnisse 23

Abbildung 4: Rasterelektronenmikroskopisches Bild eines nicht erkrankten Amboss aus einem Leichen-Felsenbein. A: Unbehandelt. Schleimhautüberzug glatt und intakt, leicht atroph. B: Gleicher Amboss nach Entfernung der Weichteile mit Hypo-chlorid: Glatte Knochenstruktur, einzelne Havers’sche Kanäle (Pfeile) Vergrößerung jeweils 15x

B

A

Ergebnisse 24

Abbildung 5: Übersuchtsaufnahmen von arrodierten Incudes. Die Schleimhaut wurde mit Hypochlorid entfernt. In beiden Fällen ist der lange Fortsatz komplett aufgebraucht. Man erkennt deutlich die Spuren der Resorption: Der Knochen ist von Resorptionslaku-nen bedeckt (Pfeilspitze) und die Havers’schen Kanäle sind erwei-tert (Pfeil): Das Knöchelchen erscheint „ausgehöhlt“. Vergrößerung jeweils 15x

Ergebnisse 25

3.1.3 Morphologie des Knochenabbaus

Der Knochenabbau trat im Wesentlichen in vier verschiedenen

Formen in Erscheinung:

(1) Auflösung der regulären Kollagenstruktur

(2) Bildung von Resorptionslakunen

(3) Verschmelzung / Verklumpung von Kollagenfasern

(4) Erweiterung der Haversschen Kanäle

Zu (1):

Die Auflösung der regulären Kollagenstruktur kann als Vorstufe der

Bildung von Resorptionslakunen gesehen werden. Zwei Stadien

ließen sich nebeneinander beobachten, bevor es zur Ausbildung von

Resorptionslakunen kam: Zunächst ließen sich bei insgesamt noch

intakter Faserknochenstruktur einzelne „angedaute“ Kollagenfasern

darstellen, die aus der regulären Oberflächenstruktur des Knochens

ausgelöst erschienen (Abbildung 7). Im zweiten Stadium war die reguläre Oberfläche aufgelöst, der Fa-

serknochen erschien aufgeraut (Abbildung 7).

Zu (2):

Die Ausbildung von Resorptionslakunen erfolgt über die oben be-

schriebenen Schritte. Resorptionslakunen stellten sich als rundliche,

grüppchenweise angeordnete, im Durchmesser 10-40 µm große,

konfluierende Kerben im Knochen dar (Abbildung 7-9). In seltenen

Fällen ließen sich große Zellen in den Resorptionslakunen darstellen,

bei denen es sich um Osteoklasten handeln dürfte (Abbildung 8). Bei stärkerer Vergrößerung zeigten sich am Boden der Resorptions-

lakunen einzelne arrodierte Kollagenfasern (Abbildung 9).

Zu (3):

Die Verschmelzung von Kollagenfasern war vor allem im direkten

Randbereich des Cholesteatoms zu beobachten und führte zu einer

blumenkohlartigen Verklumpung der Faserknochenoberfläche (Ab-

Ergebnisse 26

bildung 6). Die einzelnen Kollagenfasern waren hier nicht mehr

abgrenzbar.

Zu (4):

Ein weiteres sehr bedeutsames Erscheinungsbild des Knochenab-

baus im Cholesteatom ist die an sämtlichen untersuchten Gehörknö-

chelchen zu beobachtende deutliche Erweiterung der Haversschen

Kanäle (Abbildung 5). Die Gehörknöchelchen erschienen wie aus-

gehöhlt.

Ergebnisse 27

Abbildung 6: Cholesteatommartix (Pfeile), darunter arrodierter Knochen. Die arrodierten Knochenfasern sind verplumpt und die Knochen-oberfläche erscheint blumenkohlartig verschmolzen (insbesondere in Abbildung A zu erkennen). Vergrößerung: A: 770x, B: 210x

A

B

Ergebnisse 28

Abbildung 7: Cholesteatombedingter Knochenabbau, Auflösung der regulären Kollagenstruktur, drei verschiedene Stadien:

● Faserknochen, freiliegend, einzelne Kollagenfasern „angedaut“

▲ regelrechte Faserknochenstruktur aufgehoben, Knochen wirkt „aufgeraut“

■ Resorptionslakunen Gehörknöchelchen mit Hypochlorid behandelt. A: Übersichtsbild, Vergrößerung 450x B: Ausschnitt aus A, Vergrößerung 1000x

A

B ■▲

Ergebnisse 29

Abbildung 8: Resorptionslakunen ohne Entfernung der Weich-teile: Bei den zu erkennenden Zellen (Pfeile) handelt es sich ver-mutlich um Osteoklasten. Vergrößerung 1300x

Abbildung 9: Resorptionslakunen („Howship’sche Lakunen“) nach Entfernung der Weichteile mit Hypochlorid. Am Boden der Resorptionslakunen erkennt man angedaute Kollagenfasern. Vergrößerung 1800x

Ergebnisse 30

3.2 Zellkulturen

In sämtlichen Knochenmarks-Zellkulturen bildeten sich unter Zusatz

von M-CSF und OPGL am dritten bis vierten Tag in vitro mehrkernige

Riesenzellen mit granuliertem Zytoplasma. Sie erreichten eine Größe

von bis zu 500 µm und färbten sich in der TRAP-Färbung kräftig

rötlich-braun an (Abbildung 10).

Abbildunmarkszelle von „Riese

Zusammen

Dentinsche

verursachte

sich hierbe

handelt.

3.2.1 Wirku

3.2.1.1 TRA

In den mit

liche dosis

Größe der O

g 10: Osteoklastenkultur: Stimulierung von Knochen-n der Maus mit OPGL und M-CSF führte zur Bildungnosteoklasten“

genommen mit den Ergebnissen der Auswertung der

ibchen, auf denen sich deutlich der durch diese Zellen

Knochenabbau darstellen ließ, postulieren wir, dass es

i um Osteoklasten bzw. sog. „osteoclast-like cells“

ng von Zoledronat in vitro

P-Färbung

Zoledronat behandelten Zellkulturen ließ sich eine deut-

abhängige Reduktion sowohl der Anzahl als auch der

steoklasten beobachten (Abbildung 11).

Ergebnisse 31

Abbildung 11: Osteoklastenkulturen nach Zugabe von Zoledronat in unterschiedlichen Konzentrationen: A: Kontrolle; B: EDTA-Kontrolle; C: Zoledronat 10-6 mol/l; D: Zoledronat 10-7 mol/l; E: Zoledronat 10-8 mol/l; F: Zoledronat 10-9 mol/l Vergrößerung jeweils 100x

In den Kontrollen und EDTA-Kontrollen waren nach sechs Tagen in

vitro durchschnittlich 36% bzw. 34% der Oberfläche der Kulturplatten

durch Osteoklasten bedeckt. Zoledronat in einer Konzentration von

10-6 mol/l bewirkte eine fast komplette Suppression der Osteoklasto-

genese (1% ± 0,89% der Kulturplattenoberfläche durch Osteoklasten

bedeckt; n = 6; p < 0,001). 10-7 mol/l Zoledronat reduzierten die

Ergebnisse 32

durch Osteoklasten bedeckte Oberfläche der Kulturplatten signifikant

auf durchschnittlich 5% (± 2,28%; n = 6; p < 0,001). 10-8 mol/l

Zoledronat führten zu einer nicht signifikanten Senkung der durch

Osteoklasten bedeckten Fläche auf 20% (± 10,3%; n = 6; p = 0,06).

10-9 mol/l Zoledronat hatten keine Auswirkung auf die

Osteoklastenbildung (Tabelle 1). Die Standardabweichung vom Mit-

telwert für alle Gruppen war 16,17%, der Standardfehler des Mittel-

wertes 2,50%.

Tabelle 1: Grafische Darstellung der Wirkung von Zoledronat auf Osteokla-sten in vitro: Die Balken zeigen den prozentualen Anteil der Kultur-plattenoberfläche, der durch Osteoklasten bedeckt war. Die Fehlerbalken zeigen das 95% Konfidenzintervall der Mittelwerte. n=6 für jede Gruppe. Standardfehler des Mittelwertes = 2,50%.

3.2.1.2 TUNEL-Färbung

Für die TUNEL-Färbung wurden zwei getrennte Versuchsansätze

durchgeführt: Im ersten Ansatz wurden die mit OPGL und M-CSF

stimulierten Knochenmarks-Zellkulturen vom ersten Tag in vitro an

hochdosiert (10-6 mol/l) mit Zoledronat behandelt. Im zweiten Ansatz

wurde Zoledronat erst ab dem fünften Tag in vitro zugegeben,

nachdem sich schon Osteoklasten gebildet hatten.

Ergebnisse 33

Es fanden sich TUNEL-positive Zellen in sämtlichen mit Zoledronat

behandelten Versuchsansätzen, sowohl in reifen Osteoklasten als

auch in Osteoklasten-Vorläuferzellen. (Abbildung 12). Daneben

fanden sich andere, vitale Knochenmarkszellen. In den Kontroll-

Kulturen zeigten sich keine oder nur vereinzelt TUNEL-positive

Zellen.

Abbildung 12: TUNEL-positive Zellen A: Osteoklasten-Vorläuferzellen B: reife Osteoklasten Vergrößerung jeweils 100X

3.2.2 Wirkung von Calzitonin in vitro

3.2.2.1 Zellkulturen

Die Osteoklastogenese wurde durch Zusatz von Calzitonin nicht

beeinflusst: Der durch Osteoklasten bedeckte Anteil der Kulturplat-

tenoberfläche änderte sich durch Zugabe von Calzitonin nicht

(Abbildung 13). Zwischen den Osteoklasten in den Kontrollen und den mit Calzitonin

behandelten Zellkulturen ließen sich weder licht- noch rasterelektro-

nenmikroskopisch morphologische Unterschiede feststellen (Abbil-dung 13 + 14).

Ergebnisse 34

Abbildung 13: Calzitonin hat keine Wirkung auf die Osteoklasto-genese und auf die Osteoklastenmorphologie. A Kontrolle; B Calzitonin 10-6 mol/l; C Calzitonin 10-7 mol/l; D Calzitonin 10-8 mol/l; E Calzitonin 10-9 mol/l; F Calzitonin 10-10 mol/l Vergrößerung jeweils 100x

FE

DC

BA

3.2.2.2 Dentinscheibchen

Auf den Dentinscheibchen ließen sich um die Osteoklasten aus den

Kontrollgruppen herum rasterelektronenmikroskopisch deutlich sicht-

bare Resorptionslakunen darstellen (siehe auch Abbildung 17, S. 39). Diese waren in den Calzitonin-behandelten Kulturen nicht bzw.

nur gering ausgeprägt nachweisbar (Abbildung 14).

Ergebnisse 35

Abbildung 14: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Osteoklasten auf Dentinscheiben (aus Zellkulturen). A: Resorbierender Osteoklast aus einer Kontrollkultur B: Nicht resorbierender Osteoklast aus einer mit 10-6 mol/l Calzitonin behandelten Kultur Vergrößerung jeweils 500x

B

A

Die weitere rasterelektronenmikroskopische Auswertung der Dentin-

Scheibchen ergab nach Ablösen der Zellen im Ultraschallbad eine

deutliche dosisabhängige Abnahme der Anzahl und Größe der Re-

sorptionslakunen in den Calzitonin behandelten Osteoklastenkulturen

(Abbildung 15).

Ergebnisse 36

Abbildung 15: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Resorptionslakunen auf Dentinscheiben nach Entfernung der Zel-len im Ultraschallbad. Die Kulturen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von Calzitonin behandelt. A: Kontrolle; B: 10-10 mol/l Calzitonin; C: 10-9 mol/l Calzitonin; D: 10-8 mol/l Calzitonin; E: 10-7 mol/l Calzitonin; F: 10-6 mol/l Calzitonin Vergrößerung: Jeweils 100x

B

C D

E F

A

In den Kontrollen betrug der Anteil der Resorptionslakunen an der

Gesamtoberfläche der Dentinscheibchen nach 10 Tagen in vitro

durchschnittlich 36% (± 2,25%; n=6). Durch Behandlung mit Calzito-

nin der Konzentration 10-6 mol/l wurde der Anteil der Resorptionsla-

Ergebnisse 37

kunen statistisch signifikant gesenkt auf 1% (± 1,60%; n = 6; p <

0,001). 10-7 mol/l Calzitonin verringerten den Anteil der Resorptions-

lakunen an der Dentinscheibenoberfläche ebenfalls signifikant auf

4% (± 2,04%; n = 6; p < 0,001), 10-8 mol/l Calzitonin senkten den

Anteil der Resorptionslakunen ebenfalls signifikant auf 13% (±

3,67%; n = 6; p < 0,001) und 10-9 mol/l auf 27% (± 1,86%; n = 6; p <

0,001). In den mit 10-10 mol/l Calzitonin behandelten Osteoklastenkul-

turen ließ sich kein signifikanter Rückgang der Resorptionslakunen

feststellen: Die Resorptionslakunen nahmen hier 35% (± 2,50%; n =

6; p = 1) der Dentinoberfläche ein (Tabelle 2).

3 N

s

o

Tabelle 2: Prozentualer Anteil der Oberfläche der Dentinscheiben, der durch Resorptionslakunen bedeckt war. Ordinate: Prozentualer Anteil der Oberfläche der Dentinscheiben Abszisse: Konzentration von zugegebenem Calzitonin Fehlerbalken zeigen das 95% Konfidenzintervall der Mittelwerte. n=6 für jede Gruppe. Standardfehler des Mittelwertes = 1,39%.

.3 Morphologie der Resorptionslakunen

ach Entfernung der Zellen zeigten sich die Resorptionslakunen in

ämtlichen Kontrollen, wie auch in den niedrig dosiert mit Zoledronat

der Calzitonin behandelten Kulturen morphologisch einheitlich. Es

Ergebnisse 38

handelte sich um grüppchenweise dicht nebeneinander angeordnete

rundliche Kerben mit einem Durchmesser von 10-40 µm (Abbildung 16).

Abbildung 16: Resorptionslakunen auf Dentinscheibchen nach Entfernung der Zellen. Entstanden in Osteoklastenkultur. Vergrößerung: 100x, Inlay: 500x

Auf den mitsamt Zellen untersuchten Dentinscheibchen fanden sich

immer ein oder mehrere große Osteoklasten (bzw. osteoclast-like

cells) in den Resorptionslakunen (Abbildung 17).

Ergebnisse 39

Abbildung 17: Resorbierende Osteoklasten auf Dentinscheiben. Die Präparate stammen aus Osteoklastenkulturen. Vergrößerung: A, B: 650x; C: 750x; D: 300x

DC

BA

Die Resorptionszonen erschienen nie in die Tiefe ausgebreitet. Auch

in den Positivkontrollen zeigten sich die Resorptionslakunen flächig

verteilt.

Morphologisch wiesen die in der Osteoklastenkultur entstandenen

Resorptionslakunen eine große Ähnlichkeit zu den Resorptionslaku-

nen auf, die bereits auf den im Rahmen der Cholesteatomchirurgie

entnommenen menschlichen Gehörknöchelchen beschrieben wur-

den. Die in vivo entstandenen Resorptionslakunen erschienen jedoch

weniger oberflächlich ausgebreitet (Abbildung 18).

Ergebnisse 40

A

Abbildung 18: Resorptionslakunen. A: In vivo: Auf einem chirurgisch entfernten Gehörknöchelchen eines an einem Cholesteatom erkrankten Patienten: Die Resorp-tionslakunen erscheinen tiefer. Daneben zeigen sich zum Teil angedaute Kollagenfasern (rechts im Bild). B: In vitro: Auf einem Dentinscheibchen aus einer Osteoklasten-kultur: Die Resorptionslakunen erscheinen oberflächlicher. Vergrößerung jeweils 500x

B

Ergebnisse 41

3.4 Tierexperimente

3.4.1 Keratinpartikel-induzierte Osteolyse in vivo

Anhand unserer o. g. Kriterien (siehe 2.5.3) konnten Osteoklasten in

den Präparaten aus den Schädelkalotten der Versuchstiere eindeutig

identifiziert werden (Abbildung 19).

Abbildung 19: Resorbierender Osteoklast im Markraum eines Mäuse-Kalvariums (Pfeil). Deutlich zu erkennen die „ruffeled bor-der“, das granuläre Zytoplasma und der Verlust der Lamina limi-tans des Knochens. Auf dem vorliegenden Anschnitt zwei Zellker-ne, einer mit deutlichen Nukleoli, der zweite links davon schwer zu erkennen. Perivaskulärer Knochenabbau ebenfalls deutlich zu erkennen (Pfeilspitzen). Toluidinblau-Färbung. Vergrößerung 800x

Die Mehrzahl der Osteoklasten fand sich im Randbereich der Mark-

räume bzw. perivaskulär. Hier zeigten sich auch die deutlichsten

Spuren des Knochenabbaus. Auf der dorsalen Oberfläche der Kalva-

rien, wo direkter Kontakt zu den Keratinpartikeln bestand, zeigten

sich nur selten Osteoklasten (Abbildung 20). Die Behandlung der keratinimplantierten Mäuse mit intraperitonealen

Injektionen von Zoledronat über 7 Tage führte zu einem deutlich do-

sisabhängigen Rückgang der Osteoklastogenese und des Knochen-

abbaus (Abbildung 20).

Ergebnisse 42

Abbildung 20: Wirkung von Zoledronat in vivo (Ausschnitte aus Kalvarien-Biopsien, Toluidinblau-Färbung) A: Kontrolle (Maus nach Keratinimplantation 7 Tage mit PBS-In-jektionen behandelt): Deutlich sichtbare Osteoklasten (Pfeile) und durch sie verursachter Knochenabbau (Pfeilspitzen); B: Maus 7 Tage mit 1 µg Zoledronat pro kg Körpergewicht behandelt: Osteo-klasten (Pfeile) und Knochenabbau (Pfeilspitzen) deutlich zu er-kennen; C: 3 µg/kg: Keine Osteoklasten, kein Abbau; D: 10 µg/kg: Ebenfalls keine Osteoklasten und keine Abbauspuren. Vergrößerung jeweils 100x, Inlay 800x

3.4.2 Statistische Auswertung der Schädelpräparate

Berechnet wurde die Anzahl Osteoklasten pro Millimeter Schädel-

knochen (siehe 2.5.3).

In den Versuchsgruppen 1 (nicht-operierte Kontrollen) und 2 (Opera-

tion ohne Keratinimplantation, keine Injektionen: „SHAM-Kontrolle“)

fanden sich durchschnittlich 0,8 (± 0,47; n=9) bzw. 1,0 (± 0,68; n=9)

Osteoklasten pro Millimeter Schädelknochen.

Durch die subperiostale Implantation von Keratinpartikeln kam es in

den PBS-behandelten Kontrollen zu einer signifikanten Zunahme der

Anzahl Osteoklasten pro Millimeter Schädelknochen auf durch-

schnittlich 4,8 (± 0,9; n = 9; p < 0,001).

Ergebnisse 43

Die Auswertung der Calvarien der mit Zoledronat behandelten Ver-

suchstiere ergab eine deutliche dosisabhängige Reduktion der An-

zahl Osteoklasten pro Millimeter Schädelknochen: Zoledronat in

einer Konzentration von 1 µg/kg Körpergewicht bewirkte einen

Rückgang der Osteoklasten von 4,8/mm auf durchschnittlich 2,1/mm

(± 1,22; n = 9; p < 0,001), 3 µg/kg Zoledronat reduzierten die Osteo-

klastenzahl auf 0,5/mm (± 0,3; n = 9; p< 0,001) und 10 µg/kg führten

zu einer vollständigen Unterdrückung der Osteoklastogenese (n = 9;

p < 0,001) (Tabelle 3).

Tabelle 3: Anzahl der Osteoklasten pro mm Schädelknochen Säule 1: Kontrolle (Nicht operierte Tiere); Säule 2: SHAM Kontrol-le (Operation ohne Keratinimplantation); Säule 3: PBS Kontrolle (Keratinimplantation, tgl. Injektionen von PBS); Säule 4-6: Stu-diengruppen (Keratinimplantation, tgl. Injektionen von 1-10 µg Zo-ledronat pro kg Körpergewicht). n=9 für alle Gruppen. Fehlerbal-ken zeigen das 95% Konfidenzintervall der Mittelwerte. Standard-fehler des Mittelwertes = 0,337.

Ost

eokl

aste

n pr

o m

m K

noch

en

Der Grad der entzündlichen Reaktion im umliegenden Bindegewebe

wurde durch die Gabe von Zoledronat im Vergleich zu PBS-behan-

delten Kontrollen nicht beeinflusst.

Diskussion 44

4. Diskussion

4.1 Morphologie der Ossikel im Cholesteatom

Das Cholesteatom bewirkt einen Abbau von Knochen. Dieser kann

auf intraoperativ gewonnenen Gehörknöchelchen sehr deutlich dar-

gestellt werden. Solche Ossikel zeigen sowohl äußerlich als auch

innerlich Spuren des Knochenabbaus: Es finden sich Resorptionsla-

kunen verschiedener Ausprägung auf ihrer Oberfläche bis hin zum

vollständigen Abbau ganzer Teile des Gehörknöchelchens, in den

meisten Fällen des langen Ambossfortsatzes. Außerdem kommt es

im Cholesteatom zu einer Erweiterung der Haversschen Kanäle und

somit zu einer „Aushöhlung“ der Gehörknöchelchen. Diese Beobach-

tung deutet darauf hin, dass der Knochenabbau nicht nur in direkter

Nachbarschaft des Cholesteatoms an der Knochenoberfläche statt-

findet, sondern auch perivaskulär in den Markräumen der befallenen

Ossikel.

4.1.1 Oberflächliche Resorption

Die Resorption an der Knochenoberfläche läuft in zwei verschiede-

nen Stadien ab: Bevor es zur Ausbildung von Resorptionslakunen

kommt, findet eine oberflächliche Andauung der Kollagenfasern des

Knochens statt. Hierbei wird die reguläre Kollagenstruktur aufgelöst,

jedoch noch nicht resorbiert. Dies ist Anzeichen dafür, dass zunächst

die anorganische (mineralische) Knochenstruktur abgebaut wird.

Schließlich kommt es zur Resorption der organischen Knochensub-

stanz (Kollagen) und somit Bildung von Resorptionslakunen, an

deren Boden man noch angedaute Kollagenfasern erkennen kann.

Diese Beobachtungen stimmen mit den Ergebnissen von Uno et al.

(1995), sowie Wong et al. (1991) überein.

Weiterhin könnte auch die mit der Knochenresorption konkurrierende

Knochenneubildung eine Rolle bei der Entstehung der Morphologie

des Knochenabbaus spielen. So stellen Wong et al. (1991) die These

Diskussion 45

auf, dass es erst dann zur Ausbildung von Resorptionslakunen

kommt, wenn der Knochenabbau die konkurrierende Knochenneubil-

dung verdrängt.

4.1.2 Perivaskuläre Knochenresorption

Die Beobachtung des „perivaskulären Knochenabbaus“ von den

Markräumen her konnte sowohl an operativ entfernten Ossikeln als

auch im Tierexperiment gemacht werden. In unserem Maus-Modell

zum osteoklastären Knochenabbau in vivo zeigten sich die deutlich-

sten Spuren des Knochenabbaus und auch die meisten Osteoklasten

in den Markräumen der Kalvarien der Versuchstiere bzw. perivasku-

lär. Auf der dorsalen Fläche des Knochens, im direkten Kontakt zu

den implantierten Keratinpartikeln, fanden sich deutlich weniger

Osteoklasten und deutlich geringere Spuren des Knochenabbaus.

Diese Beobachtung unterstützt die These, dass der Knochenabbau

im Cholesteatom durch aus dem Blut stammende Zellen und Entzün-

dungsmediatoren bewirkt wird (Schilling et al. 1992, Ahn et al. 1990,

Cheshire et al. 1991, Sadé et al 1981) und spricht gegen die Theorie

einer Druckatrophie des Knochens (Erdheim 1905, Grünwald 1910,

Rüedi 1957, Tumarkin 1958). Die durch Grippaudo (1958), Pollock

(1959) und von Schulthess (1961) beobachtete chronische Osteo-

myelitis von Gehörknöchelchen im Cholesteatom passt ebenfalls zu

diesen Beobachtungen.

4.2 Vergleich der Knochenresorption in vivo und in vitro

Der Vergleich der Morphologie des Knochenabbaus im Cholesteat-

om und in der Osteoklasten-Zellkultur unterstützt ebenfalls die These

eines osteoklastären Knochenabbaus, da die Morphologie der in vivo

und in vitro entstandnen Resorptionslakunen nahezu identisch ist.

Auf der Oberfläche von im Cholesteatom arrodierten Ossikeln finden

sich regelmäßig Resorptionslakunen. Diese sind rund, grüppchen-

weise angeordnet und haben einen Durchmesser von 10-40 µm. Die

Diskussion 46

in der Osteoklastenkultur entstandenen Resorptionslakunen haben

eine fast identische Morphologie. Einziges Unterscheidungsmerkmal

ist, dass die in der Zellkultur entstandenen Resorptionslakunen

oberflächlicher erscheinen. Für diesen Unterschied bestehen mehre-

re Erklärungsmöglichkeiten. Zum einen haben wir in den Zellkulturen

ein anderes Substrat für die Knochenresorption verwendet. Hier wäre

es denkbar, dass das Wal-Dentin andere Resorptionseigenschaften

besitzt als Knochen. Zum anderen wäre es möglich, dass sich die

amöboide Beweglichkeit der Osteoklasten in der Zellkultur stärker

auswirkt, da natürliche Barrieren wie z.B. Schleimhaut hier fehlen.

4.3 Inhibition der Knochenresorption in vitro

Neuere Untersuchungen (Lacey et al. 1998, Yasuda et al. 1998)

haben gezeigt, daß Knochenumbau und Knochenresorption durch

ein Zusammenspiel zwischen dem Rezeptor-Aktivator von NF-κB

(=RANK) und seinem Ligand RANKL (auch OPGL, TRANCE oder

ODF) kontrolliert werden. Der OPGL-Rezeptor (RANK) wurde auf

dendritischen Zellen, Chondrozyten, Osteoklasten-Vorläuferzellen

und reifen Osteoklasten identifiziert (Suda et al. 1999).

Durch Stimulation mit OPGL und M-CSF (Macrophage Colony

Stimulating Factor) konnten aus Knochenmarks-Zellkulturen Osteo-

klastenkulturen etabliert werden. Beide Faktoren sind wirksame

Stimulatoren der Osteoklastogenese und Osteoklastendifferenzie-

rung. Sie führen zuverlässig zur Bildung von resorbierenden Osteo-

klasten aus Knochenmarks-Vorläuferzellen.

4.3.1 Zoledronat in vitro

Zoledronat ist ein Bisphosphonat der dritten Generation und nach-

gewiesenermaßen deutlich stärker wirksam als ältere Bisphospho-

nate (Cheer et al. 2001).

In den Zellkultur-Experimenten konnte gezeigt werden, dass Zoledro-

nat in vitro in Konzentrationen zwischen 10-9 und 10-6 mol/l eine

Diskussion 47

dosisabhängige Inhibition der Osteoklastogenese und der osteokla-

stären Knochenresorption verursacht. Weiterhin war zu beobachten,

dass in den mit Zoledronat behandelten Zellkulturen viele TUNEL-

positive Zellen nachzuweisen waren. Diese traten sowohl in Zellkul-

turen auf, in denen die Osteoklasten-Vorläuferzellen vor der Behand-

lung mit Zoledronat ausgereift waren, als auch in Kulturen, denen

Zoledronat gleich zu Beginn zugegeben wurde. Hier kam es gar nicht

zur Ausbildung reifer Osteoklasten, die Osteoklasten-Vorläuferzellen

zeigten sich TUNEL-positiv.

Diese Beobachtungen deuten darauf hin, daß die inhibierende

Wirkung von Zoledronat auf die Knochenresorption durch eine

Induktion von Apoptose in Osteoklasten und ihren Vorläuferzellen

zurückzuführen sein könnte. Ähnliche Beobachtungen machten auch

Jagdev et al. (2001) und Fromigue et al. (2000) an Brustkrebs-Zellen.

Untersuchungen von Coxon et al. (2000) zum molekularen Me-

chanismus der Wirkung von Bisphosphonaten deuten darauf hin,

dass diese Eigenschaft auf eine Hemmung der Protein-Geranylgera-

nylation zurückzuführen sein könnte.

Ergebnisse von Reinholz et al. (2000) zeigen, dass der inhibitorische

Effekt von Bisphosphonaten auf die Knochenresorption teilweise

auch auf eine Aktivierung von Osteoblasten zurückzuführen ist.

4.3.2 Calzitonin in vitro

In unseren Untersuchungen konnten wir nachweisen, dass humanes

Calzitonin in vitro in Konzentrationen von 10-10 bis 10-6 mol/l

dosisabhängig die OPGL / M-CSF-induzierte osteoklastäre Knochen-

resorption inhibiert. Diese Ergebnisse passen zu den Beobachtungen

von Galvin et al (1998). Auswirkungen auf die Osteoklastogenese

oder Osteoklastenmorphologie konnten in vitro weder licht- noch

raster-elektronenmikroskopisch nachgewiesen werden. Die Wirkung

von Calzitonin scheint am ehesten durch eine direkte Hemmung der

Resorptionstätigkeit der Osteoklasten über den Calzitonin-Rezeptor

bedingt zu sein (Galvin et al. 1998). Eine bereits praktizierte

Anwendung von Calzitonin besteht in der Therapie der Osteoporose.

Diskussion 48

Es existieren daher bereits ausführliche Daten zur systemischen

Anwendung dieses Polypeptidhormons (Weber et al. 1999). Unsere

Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine lokale oder auch systemi-

sche Behandlung mit Calzitonin durchaus einen Stellenwert in der

adjuvanten Therapie des Cholesteatoms zusätzlich zur Chirurgie

haben könnte.

Weiterführende Studien sollten die bereits beschriebene Abnahme

der Wirkung bei langfristiger Calzitonin-Behandlung durch Abnahme

der Rezeptor-Dichte auf den Zielzellen (Samura et al. 2000, Galvin et

al. 1998) untersuchen. Außerdem sollte die Wirkung von Calzitonin

auf den cholesteatombedingten Knochenabbau in vivo weiter unter-

sucht werden. Hier sollte auch die Möglichkeit einer Lokaltherapie mit

Calzitonin in Betracht gezogen werden.

4.4 Inhibition der Knochenresorption in vivo

4.4.1 Zoledronat in vivo

Zur Untersuchung der Wirkung von Zoledronat in vivo zogen wir ein

kürzlich von Chole et al. (2001) beschriebenes Tiermodell zum Kno-

chenumbau im Cholesteatom heran: Sterilisierte Keratinpartikel

wurden subperiostal auf die Oberfläche des Os parietale von Mäusen

implantiert, was zu einer lokalen osteoklastären Knochenresorption

führte.

Dieses Modell konzentriert sich auf die osteoklastäre Knochenre-

sorption und bietet die Möglichkeit, die Funktion von Osteoklasten

und Möglichkeiten ihrer Inhibition in vivo zu untersuchen. Ein Chole-

steatom im eigentlichen Sinne wird nicht erzeugt. Die implantierten

Keratinpartikel sollen jedoch ein Cholesteatom simulieren. Sicherlich

spielt bei der in diesem Modell auftretenden Knochenresorption die

Entzündungsreaktion auf die implantierten Fremdkörper eine ent-

scheidende Rolle.

Der Nachteil eines Maus-Modells liegt also darin, dass die Maus

nicht spontan oder induziert „echte“ Cholesteatome entwickelt. Der

Diskussion 49

entscheidende Vorteil eines Maus-Modells liegt jedoch darin, dass

viele der Gene und Genprodukte, die entzündliche Prozesse steuern

in der Maus sehr gut identifiziert und charakterisiert sind. Außerdem

existieren Knockout-Mäuse oder transgene Mäuse für viele dieser

Gene, so dass gute Ansätze für weiterführende Studien gegeben

sind.

Es wurden bereits diverse Tiermodelle zur Untersuchung des Chole-

steatoms, seiner Entwicklung und Pathophysiologie entwickelt. Die

einzigen Säuger außer dem Menschen, von denen man weiß, daß

sie spontan Cholesteatome entwickeln, sind die mongolische Renn-

maus (Meriones unguiculatus) (Chole et al. 1981) und die Sandrenn-

maus (Psammomys obesus) (Feinmesser et al. 1988). Beide Modelle

bieten große Ähnlichkeiten zur Cholesteatomentstehung beim Men-

schen, haben aber den Nachteil, dass nur sehr wenig genetische

Informationen über die verwendeten Spezies zur Verfügung stehen.

4.5 Vergleich der Wirkungen von Zoledronat und Calzitonin

Die Wirkung dieser beiden unterschiedlichen Substanzen ist ähnlich;

beide reduzieren die osteoklastäre Knochenresorption signifikant.

Die Mechanismen, die dieser Wirkung zugrunde liegen, sind jedoch

sehr unterschiedlich. Zoledronat bewirkt durch eine Induktion von

Apoptose eine Hemmung der Osteoklastogenese, Calzitonin bewirkt

über den Calzitonin-Rezeptor eine Hemmung der Osteoklastenfunk-

tion. Die Wirkung von Calzitonin lässt aufgrund der vorbeschriebenen

Abnahme der Rezeptordichte bei längerer Behandlungsdauer nach

(Samura et al. 2000). Zur Langzeitbehandlung mit Zoledronat liegen

noch keine verwertbaren Ergebnisse vor, aufgrund des Wirkmecha-

nismus wäre ein ähnliches Phänomen jedoch unwahrscheinlich. Eine

systemische Anwendung von Zoledronat erscheint allerdings nicht

unproblematisch, da es wahrscheinlich nachhaltige Auswirkungen

auf den gesamten Knochenstoffwechsel und andere unerwünschte

Wirkungen hätte (Cheer et al. 2001).

Diskussion 50

Aufgrund der unterschiedlichen Wirkungsweisen der beiden Medika-

mente erscheint eine Kombinationstherapie zum Beispiel auch in

Form einer Lokaltherapie als adjuvante Behandlung des Cholesteat-

oms sinnvoll. Weiterführende Studien sollten diese Möglichkeit oder

auch die Kombination einer systemischen Anwendung von Calzitonin

und einer Lokaltherapie mit Zoledronat untersuchen.

4.6 Klinische Relevanz Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Gabe von Zoledronat

und Calzitonin lokal oder systemisch, einzeln oder aber auch in

Kombination eine sinnvolle Ergänzung der chirurgischen Therapie

des Cholesteatoms sein könnte. Weiterführende Studien sollten sich

mit dieser Möglichkeit auseinandersetzen. Die zu erwartenden Ne-

benwirkungen wären jedoch abzuwägen.

Die chirurgische Therapie des Cholesteatoms bleibt jedoch nach wie

vor in jedem Falle indiziert.

Zusammenfassung 51

5. Zusammenfassung

Ziele der vorliegenden Arbeit sind die Darstellung des Knochenab-

baus im Cholesteatom, der Rückschluss von der Morphologie auf die

Pathogenese des Knochenabbaus und die Untersuchung von Mög-

lichkeiten seiner medikamentösen Inhibition.

Die Arbeit gliedert sich in einen morphologisch-deskriptiven und

einen experimentellen Teil. Für den morphologischen Teil wurden im

Rahmen cholesteatomsanierender Mittelohreingriffe entnommene

Gehörknöchelchen rasterelektronenmikroskopisch untersucht und

die Spuren der Knochenresorption dargestellt. Hierbei zeigte sich,

dass der Knochenabbau im Cholesteatom zum einen in verschie-

denen Stadien auf der Oberfläche der Ossikel abläuft. Dies führt über

die Ausbildung von Resorptionslakunen bis hin zur vollständigen

Destruktion von Teilen der Ossikel. Zum anderen tritt auch eine deut-

liche Erweiterung der Haversschen Kanäle auf, was auf eine Kno-

chenresorption in den Markräumen ausgehend von Blutgefäßen

hindeutet.

Im experimentellen Teil wurden Zellkulturen resorbierender Osteo-

klasten etabliert. Der Vergleich der auf diese Weise in vitro entstan-

denen Resorptionslakunen mit den durch das Cholesteatom in vivo

entstandenen Resorptionsspuren zeigte große morphologische Ähn-

lichkeiten. Dies deutet auf eine osteoklastäre Genese der Knochen-

destruktion im Cholesteatom hin.

Im nächsten Schritt sollten Möglichkeiten der medikamentösen

Inhibition der Knochenresorption untersucht werden. Hierzu wurde in

der Osteoklasten-Zellkultur die Wirkung des Polypeptidhormons

Calzitonin einerseits und des Bisphosphonats Zoledronat anderer-

seits untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl Calzitonin

als auch Zoledronat in vitro wirksame Inhibitoren der Knochenresorp-

tion sind. Sie haben unterschiedliche Wirkungsmechanismen und

wären somit auch in Kombination sinnvoll einsetzbar.

Zusammenfassung 52

Im letzten Schritt sollte die Wirkung von Zoledronat in vivo untersucht

werden. Hierzu wurde ein Maus-Modell zum osteoklastären Kno-

chenabbau verwendet. Es zeigte sich, dass Zoledronat bei systemi-

scher Gabe in vivo eine deutliche dosisabhängige Reduktion des

osteoklastären Knochenabbaus bewirkt.

Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Gabe von Zoledronat

und Calzitonin lokal oder systemisch eine sinnvolle Ergänzung der

chirurgischen Therapie des Cholesteatoms darstellen könnte.

Literatur 53

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(Bundesrepublik Deutschland), Chapman & Hall GmbH, 1997.

Danksagung 60

7. Danksagungen

Mein herzlicher Dank gilt allen, die mich bei der Durchführung und

Fertigstellung der Arbeit unterstützt haben.

Herrn PD Dr. Holger Sudhoff danke ich besonders herzlich für die

Überlassung des Themas, die Einführung in die Methodik und

diverse Hilfestellungen bei der Durchführung.

Herrn Prof. Dr. Hildmann danke ich für gute Ratschläge und die

freundliche Unterstützung.

Sehr herzlicher Dank gebührt Jae Jung (St. Louis, MO, USA) für

unzählige wertvolle Tipps und praktische Hilfe.

Prof. Dr. R. Chole (St. Louis, MO, USA) danke ich für die freundliche

Aufnahme in seinem Forschungslabor.

Die Arbeit wurde von der DFG (Su 226 2/1) unterstützt.

Nicht zuletzt geht ein ganz besonderer Dank an meine Frau Umay

für ihre unendliche Geduld und moralische Unterstützung.

Lebenslauf 61

8. Lebenslauf

PERSÖNLICHE DATEN: Name: Jörg Ebmeyer Geburtsdatum/-ort: 23.02.1974 in Tübingen

Ehefrau: Umay Ebmeyer, geb. Dalkesen

Eltern: Dr. med. Wolf Ebmeyer Dr. med. Ingrid Ebmeyer, geb. Brenner

Geschwister: Michael Ebmeyer

Leoni Kuhn, geb. Ebmeyer Jana Ebmeyer Lennart Ebmeyer

B BISHERIGER WERDEGANG:

1980-1984 Frölenberg Grundschule, Bielefeld 1984-1993 Ratsgymnasium Bielefeld,

Abitur am 18. Juni 1993 1993-1994 Zivildienst beim Deutschen Roten Kreuz

Bielefeld 1994-2000: Studium der Medizin an der Ruhr-Uni-

Bochum: 10.09.1996: Physikum 28.08.1997: erster Abschnitt der Ärztlichen

Prüfung 14.09.1999: zweiter Abschnitt der

Ärztlichen Prüfung 16.10.2000: dritter Abschnitt der Ärztlichen

Prüfung

26.10.2000: Approbation zum Arzt im Praktikum

11/2000 – 12/2001: Arzt im Praktikum am St. Elisabeth Hospital Bochum, HNO-Universitätsklinik, Leiter: Prof. Dr. med. H. Hildmann

seit 12/2001: Arzt im Praktikum an der HNO-Klinik der

Julius Maximilian Universität Würzburg, Leiter: Prof. Dr. med. J. Helms