Untersuchungen zur Anordnung von Makro- und ...habermann.userweb.mwn.de/publications/fah_diss.pdf · Einleitung 1 1 Einleitung Höher entwickelte Organismen bestehen aus mehreren

Aus dem Institut für Anthropologie und Humangenetik der

Universität München

Vorstand: Prof. Dr. med. Thomas Cremer

Untersuchungen zur Anordnung von

Makro- und Mikrochromosomen

im Zellkern

embryonaler Fibroblasten und Neuronen

von Gallus domesticus

Dissertation

zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin

an der Medizinischen Fakultät der

Ludwig-Maximilians-Universität zu München

vorgelegt von

Felix A. Habermann

aus

München

2000

Mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät

der Universität München

Betreuer: Prof. Dr. T. Cremer

Berichterstatter: Prof. Dr. J. Murken

Mitberichterstatter: Prof. Dr. H.-G. Klobeck

Prof. Dr. H. Künzle

Dekan: Prof. Dr. K. Peter

Tag der mündlichen Prüfung: 12.10.2000

II

1 Einleitung 11.1 Die Gliederung des Zellkerns in Chromosomenterritorien ................11.2 Nach welchen Regeln ordnen sich die Chromosomenterritorien im

Zellkern an? .............................................................................................31.2.1 Ist die Lage eines Chromosomenterritoriums im Zellkern abhängig von der

Chromosomengröße?....................................................................................................4

1.2.2 Ist die Lage eines Chromosomenterritoriums im Zellkern abhängig von derGendichte bzw. dem Replikationszeitpunkt in der S-Phase? .......................................5

1.2.3 Gibt es feste, zufällige oder statistisch bevorzugte Lagebeziehungen zwischenbestimmten Chromosomenterritorien? .........................................................................5

1.2.4 Gibt es in differenzierten Zellen zelltypabhängige bevorzugte oder festgelegteLagebeziehungen zwischen Chromosomenterritorien?................................................6

1.3 Ziele dieser Arbeit ...................................................................................71.4 Genom und Karyotyp von Gallus domesticus ......................................81.5 Die Darstellung von Chromosomenterritorien im Zellkern .............101.5.1 Die Herstellung chromosomenspezifischer DNA-Proben..........................................101.5.1.1 Isolierung spezifischer Chromosomen ................................................................................... 101.5.1.2 Amplifikation der aus isolierten Chromosomen gewonnenen DNA...................................... 101.5.2 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ................................................................11

1.5.3 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie ...................................................................13

2 Material und Methoden ..........................................................152.1 Zellkultur................................................................................................152.1.1 Anzucht embryonaler Fibroblasten ............................................................................15

2.1.2 Kultivierung embryonaler Neuronen..........................................................................16

2.2 Herstellung chromosomenspezifischer DNA-Proben mitDurchflußzytometrie und DOP-PCR ..................................................17

2.2.1 Durchflußzytometrische Sortierung von Chromosomen............................................172.2.1.1 Herstellung einer Chromosomen-Suspension ........................................................................ 172.2.1.2 Chromosomen-Sortierung ...................................................................................................... 182.2.2 Primäre DOP-PCR-Amplifikation sortierter Chromosomenfraktionen .....................18

2.2.3 Sekundäre DOP-Amplifikation sortierter Chromosomenfraktionen..........................19

2.3 Markierung von DNA-Proben für die Fluoreszenz in situHybridisierung.......................................................................................20

2.3.1 Probenmarkierung mit DOP-PCR ..............................................................................20

2.3.2 Probenmarkierung mit Nicktranslation ......................................................................21

2.3.3 Herstellung von DNA-Sonden-Pools für Mehrfarben Fluoreszenz in situHybridisierung............................................................................................................22

III

2.3.4 Präparation genomischer DNA von Gallus domesticus .............................................23

2.3.5 Präparation von Cot-1-DNA aus genomischer DNA .................................................24

2.4 Präparation gespreiteter Metaphasechromosomen...........................252.5 Präparation von Zellkernen für 3D-FISH ..........................................262.6 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH).........................................272.6.1 Hybridisierung............................................................................................................27

2.6.2 Detektion ....................................................................................................................28

2.7 Mikroskopie und digitale Bildverarbeitung .......................................302.7.1 Epifluoreszenz-Mikroskopie ......................................................................................30

2.7.2 Konfokale Laserscanning-Mikroskopie .....................................................................31

2.7.3 Allgemeine Bildverarbeitung .....................................................................................31

2.7.4 3D-Bildverarbeitung...................................................................................................31

2.8 Quantitative Auswertung und Statistik...............................................33

3 Ergebnisse ................................................................................343.1 Herstellung chromosomenspezifischer Sonden von Gallus

domesticus ..............................................................................................343.2 Die Anordnung von Makro- und Mikrochromosomen im Zellkern 353.2.1 DNA-Sonden-Pools....................................................................................................35

3.2.2 Makro- und Mikrochromosomen in kultivierten embryonalen Fibroblasten .............36

3.2.3 Makro- und Mikrochromosomen während der Mitose ..............................................36

3.2.4 Makro- und Mikrochromosomen in kultivierten embryonalen Neuronen .................37

3.2.5 Quantitative Auswertung............................................................................................37

3.3 Verschiedenfarbige Darstellung der Makrochromosomen 1 – 6 + Zim Zellkern .............................................................................................39

3.3.1 DNA-Sonden-Pools....................................................................................................39

3.3.2 Die Chromosomen 1 – 6 + 7 in embryonalen Fibroblasten........................................39

3.3.3 Die Chromosomen 1 – 6 + Z in embryonalen Neuronen ...........................................41

3.4 Farbabbildungen ...................................................................................42

IV

4 Diskussion ................................................................................684.1 Herstellung chromosomenspezifischer DNA-Proben für Gallus

domesticus ..............................................................................................684.2 Methodische Probleme der dreidimensionalen Fluoreszenz in situ

Hybridisierung (3D-FISH) ...................................................................694.2.1 DNA-Sonden / Sonden-Pools/Nachweisverfahren.....................................................69

4.2.2 Zellkernpräparation für 3D-FISH...............................................................................70

4.2.3 3D-M-FISH ................................................................................................................71

4.3 Methodische Probleme einer 3D-Mikroskopie und quantitativenBildanalyse .............................................................................................72

4.3.1 Optimierung der Bildaufnahme..................................................................................72

4.3.2 Auflösungsgrenzen und Abbildungsfehler der konfokalen Mikroskopie ..................72

4.3.3 Verbesserung der Auflösungsgrenzen durch digitale Bildverarbeitung: Entfaltung(Dekonvolution) .........................................................................................................73

4.3.4 Objekt-Segmentierung und 3D-Rekonstruktion.........................................................74

4.4 Die Anordnung von Chromosomenterritorien im Zellkern..............754.4.1 Die Morphologie von Chromosomenterritorien im Zellkern embryonaler

Fibroblasten und embryonaler Neuronen von Gallus domesticus..............................75

4.4.2 Die relative Anordnung der Territorien von Makrochromosomen bei Gallusdomesticus ..................................................................................................................75

4.4.3 Unterschiedliche Verteilung von Makro- und Mikrochromosomen im Zellkern und inder Prometaphaserosette.............................................................................................76

4.5 Gründe für eine unterschiedliche Verteilung der Makro- undMikrochromosomen ..............................................................................78

4.5.1 Der Einfluß physikalischer Parameter auf die Verteilung vonChromosomenterritorien im Zellkern........................................................................78

4.5.2 Der Einfluß der Gendichte und des Replikationsverhaltens auf die Verteilung vonChromosomenterritorien im Zellkern.........................................................................79

5 Zusammenfassung ...................................................................81

6 Literatur ...................................................................................83

Danksagung ........................................................................................93

Lebenslauf ...........................................................................................94

Einleitung 1

1 Einleitung

Höher entwickelte Organismen bestehen aus mehreren Billionen Zellen, die im wesentlichenalle dasselbe Genom enthalten, jedoch ganz unterschiedliche Aufgaben erfüllen müssen. Umeine gewebs- bzw. organspezifische Funktion zu erfüllen, sind in einem Zellkern ganzbestimmte Gene aktiv, während viele andere Gene stillgelegt sind. Die Regulation derGenexpression in einem Zellkern eines vielzelligen Organismus unterliegt komplizierten undin weiten Teilen noch nicht verstandenen Mechanismen. Die Expression der einzelnen Geneist ein mehrstufiger Prozeß, der die Transkription, eine komplizierte Verarbeitung derprimären Transkripte und den Transport der reifen Messenger-RNA ins Zytoplasma umfaßt.Das haploide Genom umfaßt etwa 3000 Milliarden Basenpaare, was einem DNA-Faden von2 Metern Länge entspricht und enthält circa einhunderttausend Gene. In einem um denFaktor 10 000 vergrößerten Modell eines Zellkerns als einer Kugel von 10 cm Durchmessermüßten 46 Fäden mit einem Durchmesser von einem Tausendstel Millimeter und einerGesamtlänge von 40 km untergebracht werden. Die Basenpaarabfolge der DNA-Fäden mußvor jeder Zellteilung fehlerfrei reproduziert werden und bei der Zellteilung muß jeweils einvollständiger Satz der einzelnen DNA-Fäden korrekt in die beide Tochterzellen übertragenwerden. Damit das vollständige Genom in einem Zellkern untergebracht werden kann, faltetsich die lineare DNA mit Histonen und anderen Proteinen zu Chromatin, das seinerseits mitübergeordneten Proteinenstrukturen reagiert, die das Chromatin weiter kompaktieren.

Im Vergleich zur Menge verfügbarer Daten zur DNA-Sequenz von Genen undregulatorischen Elementen ist unser Wissen über die höhere räumliche Organisation derDNA im Zellkern, die für die ungeheuer komplexen Vorgänge im Zellkern wie derregulierten gewebs- und entwicklungsspezifischen Expression von tausenden von Genen unddie DNA-Replikation erforderlich ist, noch sehr gering.

1.1 Die Gliederung des Zellkerns in Chromosomenterritorien

Bereits vor etwa einhundert Jahren formulierten Carl Rabl und Theodor Boveri die Vor-stellung, daß jedes Chromosom ein umschriebenes Territorium in einem tierischen Zellkerneinnimmt (Rabl 1885, Boveri 1909). Dieses Konzept wurde später unter dem Eindruckelektronenmikroskopischer Untersuchungen in den 50iger Jahren weitgehend aufgegeben.Elektronenmikroskopische Schnitte durch einen typischen Säugetierzellkern, mit einer Auf-lösung von wenigen Nanometern (ein Nanometer entspricht einem millionstel Millimeter),zeigen ein Gewirr von Chromatinfasern mit dichter gepacktem Heterochromatin in derKernperipherie. Während nur der Nukleolus durch eine dichte fibrilläre Struktur leicht zuerkennen ist, gibt es keinerlei Belege für die Existenz abgegrenzter Chromosomenterri-torien (Übersicht bei Wischnitzer et al. 1973). Dies führte zur über längere Zeitvorherrschenden Ansicht, daß sich die DNA-Fäden der einzelnen Chromosomen jeweils imgesamten Kernraum ausbreiten könnten (Übersichten bei Comings 1968, Vogel undSchroeder 1974, Okada und Comings 1979).

Die Entwicklung der Fluoreszenzmikroskopie (siehe 1.5.3), der Fluoreszenz in situHybridisierung (siehe 1.5.2) sowie die Herstellung chromosomenspezifischer Proben (siehe1.5.1) machten es schließlich möglich, selektiv die DNA einzelner Chromosomen imZellkern sichtbar zu machen.

Einleitung 2

Der erste direkte Nachweis von Chromosomen-Territorien im Zellkern gelang mittelsHybridisierung von gesamtgenomischer menschlicher DNA auf somatische Hybrid-Zellinien, die ein oder mehrere menschliche Chromosomen enthielten (Manuelidis 1985,Schardin et al. 1985, Pinkel et al. 1986).

Die Darstellung einzelner menschlicher Chromosomen im Zellkern menschlicher Zellensetzte zum einen die Verfügbarkeit chromosomenspezifischer Proben (sog. chromosomepainting probes) voraus (s. Abschnitt 1.5.1), die den DNA-Gehalt eines spezifischenChromosoms weitgehend repräsentieren. Zum anderen mußte eine Hybridisierung ubiqitärvorkommender repetitiver Sequenzen effektiv unterdrückt werden. Dies gelang mit dem alschromosomale in situ Supressions-Hybridisierung (CISS) bezeichneten Verfahren, bei demdurch Zugabe eines hohen Überschusses an nichtmarkierter hochrepetitiver DNA die aufallen Chromosomen vorhandenen repetitiven Sequenzen abgedeckt werden und so diemarkierte Sonde nur mehr mit ihren chromosomenspezifischen Sequenzen bindet.

Die Darstellung ganzer menschlicher Chromosomen im Interphasezellkern machte deutlich,daß Chromosomen im Zellkern distinkte Territorien einnehmen, die keine Überlappung(intermingling) mit anderen Territorien oder allenfalls im äußersten Randbereich aufweisen(Cremer et al. 1988, Lichter et al. 1988, Pinkel et al. 1988, Cremer et al. 1993, Dietzel etal. 1998). Folgende Arbeiten mit chromosomenarm- und –bandenspezifischen DNA-Sondenkonnten belegen, daß Chromosomensegmente innerhalb eines Chromosomenterritoriumsjeweils getrennte Subterritorien besetzen (Cremer et al. 1993, Dietzel et al. 1998). Eswurde gezeigt, daß die Gestalt von Chromosomenterritorien nicht starr festgelegt, sondernvielmehr in bestimmten Grenzen variabel ist (Cremer et al. 1995, Eils et al. 1996, Dietzel etal. 1998). Am Beispiel des aktiven und des inaktiven X-Chromosoms in weiblichenFruchtwasserzellen wurde gezeigt, daß die Gestalt von Chromosomenterritorien inAbhängigkeit von der Transskriptionsaktivität variiert (Bischoff et al. 1993, Eils et al.1996, Dietzel et al. 1999).

Untersuchungen der letzten Jahre an menschlichen Zellen bzw. Säugerzellen ergabenwesentliche Informationen zur Organisationsstruktur von Chromosomenterritorien. Durcheine Puls-Markierung von Zellen während der S-Phase mit halogenierten Nukleotiden wieBromdesoxyuridin (BrdU), Ioddesoxyuridin (IdU) sowie Chlordesoxyuridin (CldU) und denanschließenden Nachweis mit spezifischen Antikörpern können Bereiche aktiver DNA-Replikation (replication sites oder replication foci) dargestellt werden (Nakamura et al.1986, Nakayasu und Berezney 1989). Schätzungen zufolge enthalten die replication foci imDurchschnitt einen Cluster aus 5 – 6 gleichzeitig aktiven Replikons oder 0,8 bis 1 Mbp(1 Mbp = 1 Milliarde Basenpaare) (Jackson und Pombo 1998, Ma et al. 1998). Diegranulären replication foci besitzen einen Durchmesser von 300 bis 800 nm. Verlaufs-beobachtungen an einfach und doppelt pulsmarkierten Zellen wiesen nach, daß sich diemarkierten replication foci über mehrere Zellzyklen hinweg unabhängig vom Zellzyklus-stadium nachweisen lassen (Berezney et al. 1995, Jackson und Pombo 1998, Zink et al.1998, 1999). Es ist sehr wahrscheinlich, daß die replication foci den granulärenChromatindomänen entsprechen, die bei der Darstellung von Chromosomenterritorien mitFISH zu beobachten sind. Daraus ergibt sich die begründete Annahme, daß sichChromosomenterritorien aus granulären Chromatindomänen mit einer Größe von 300 bis800 nm aufbauen, die im Mittel etwa 1 Mbp enthalten und in der S-Phase jeweils einemreplication focus entsprechen.

Einleitung 3

Untersuchungen mit Doppelmarkierungen mit IdU und CldU konnten zeigen, daß inproliferierenden Zellen frühreplizierende DNA, die genreichen R-Banden derMetaphasechromosomen entspricht, und später replizierende DNA, die genarmen G/C-Banden entspricht, im Zellkern unterschiedliche Kompartimente besetzen (Ferreira et al.1997) und in Chromosomenterritorien abgegrenzte subchromosomale Domänen(subchromosomal foci) bilden (Zink et al. 1998, 1999). Genarmes spätreplizierendesChromatin ordnet sich bevorzugt in der Kernperipherie und perinukleolär an, genreichesfrühreplizierendes Chromatin bevorzugt in einem Bereich zwischen peripherem undperinukleolärem Chromatin. Dabei wurde eine polare Anordnung der früh- und späterreplizierenden subchromosomalen Domänen in getrennten Bereichen innerhalb derTerritorien beobachtet, die zu einer überchromosomalen Kompartimentierung von früh-und spätreplizierender DNA im Zellkern führt (Zink et al. 1999).

1.2 Nach welchen Regeln ordnen sich die Chromosomen-territorien im Zellkern an?

Nach wie vor sind entscheidende Fragen zur Anordnung der Chromosomenterritorien imZellkern weitgehend ungeklärt. Dies betrifft etwa die Frage, ob Chromosomen im Zellkernabsolut festgelegte, bevorzugte oder variable Anordnungen einnehmen, die Lagebeziehungzwischen homologen Chromosomen, die Assoziation definierter nicht-homologerChromosomen oder die Lagebeziehung zwischen den paternal und maternal ererbtenhaploiden Chromosomensätzen (sog. Genomseparation). Die territoriale Organisation vonChromosomen im Zellkern spielt vermutlich eine wichtige Rolle bei der Entstehungchromosomaler Translokationen. Spezifische Translokationen sind mit der Entwicklungspezifischer maligner hämatologischer Erkrankungen korreliert (Heim und Mitelman 1995,Rowley 1999). Die Bildung derartiger Translokationen erfordert eine enge Nachbarschaftder entsprechenden Bruchpunktregionen im Zellkern zum Zeitpunkt der fehlerhaftenRekombination (Cremer C. et al. 1996).

Topologische Untersuchungen zu Nachbarschaftsbeziehungen individueller Chromosomenkönnten auch Aufschluss über die Frage geben, warum die Translokationsraten individuellerChromosomen nach Bestrahlung nicht proportional zu ihrem DNA-Gehalt sind (Tanaka etal. 1996, Knehr et al. 1996) und warum in bestimmten Zelltypen spezifische Trans-lokationen besonders häufig beobachtet werden können.

Vor der Entwicklung der FISH-Technik und der Verfügbarkeit chromosomenspezifischerProben konnten Untersuchungen zur Verteilung von Chromosomen im Zellkern nur indirektan Metaphasechromosomen durchgeführt werden. Dabei ist nicht klar, inwieweit dieAnordnung der kondensierten Chromosomen in der Metaphase Aussagen zur Anordnungder Chromosomenterritorien im Zellkern zuläßt. Bei Untersuchungen an Präparationengespreiteter Metaphasen ist darüber hinaus vor allem fraglich, in wieweit die Chromoso-menposition auf dem Objektträger der tatsächlichen Anordnung der Chromosomen in derintakten Metaphase entspricht.

Um Informationen über Lagebeziehungen von Chromosomen im Zellkern zu erhalten wurdeauch wiederholt mittels FISH die zweidimensionale Chromosomenanordnung in derPrometaphaserosette untersucht. Die Prometaphaserosette entspricht der Aufsicht auf die in

Einleitung 4

der Metaphaseebene angeordneten Chromosomen. Bei der Kultivierung von Zellen auf einerebenen Unterlage wie einem mikroskopischen Deckglas kann die Rosette für einen kurzenZeitraum parallel zur Unterlage liegend (für Fibroblasten ca. 5 – 10 min) beobachtetwerden. Im weiteren Verlauf der Mitose wird die Rosette durch Trennung derSchwesterchromatiden in zwei Anaphasefiguren geteilt. Die relative Anordnung derChromosomen in der Rosette bleibt über den Abschluß der Zellteilung hinaus erhalten undbildet den Ausgangspunkt für die Chromosomenanordnung in den beiden Tochterzellen. Sobeobachteten Sun und Yokota (1999) in Tochterzellpaaren menschlicher Fibroblasten in derG1-Phase nahezu identische Zentromerpositionen homologer Chromosomen.

1.2.1 Ist die Lage eines Chromosomenterritoriums im Zellkernabhängig von der Chromosomengröße?

Bereits in den 30er Jahren wurde an Quetsch-Präparaten von Metaphasen vom Huhn undeinigen Insekten-, Amphibien- und Reptilienarten die bevorzugte Lage kleinerChromosomen im Zentrum der Metaphasen und die bevorzugte Lage grosser Chromosomenin der Peripherie dokumentiert (Zusammenstellung bei White 1961).

Die gleiche Tendenz wurde auch für menschliche Zellen beschrieben: In Messungen anmehr als 2000 gespreiteten Metaphasen menschlicher Fibroblasten zeigten die Zentromerekleiner Chromosomen ebenfalls die deutliche Tendenz zu einer mehr zentralen Lage und dievon grossen Chromosomen zu einer peripheren Lage (Wollenberg et al. 1982). Hens et al.(1982) kamen in einer entsprechenden Studie an 700 Metaphasen zu dem gleichen Ergebnis.Eine mehr zentrale Zentromerposition der kleinen Chromosomen in der Metaphaseplattewurde auch an Fibroblasten in elektronenmikroskopischen Serienschnitten dokumentiert, dieallerdings nur die Analyse von zehn Zellkernen beinhalten (Leitch et al. 1994, Mosgoller etal. 1991).

Hinweise auf eine mögliche Beziehung zwischen der Größe eines Chromosoms und seinerLage im Zellkern lieferten auch – zweidimensionale - FISH-Experimente an(proliferierenden) menschlichen Fruchtwasserzellen. In ca. 12.000 Kernen wurde mittelsFISH systematisch die Verteilung der Zentromerpositionen unterschiedlich großerChromosomen in menschlichen Fruchtwasserzellen mit zentromerspezifischen Proben fürdie Chromosomen 1,3,4,7,8,12, 15-18, X und Y untersucht (Volm, Dissertation 1994).Nach Einfach- und Doppelhybridisierungen wurden die Distanzen der einzelnenHybridisierungssignale zur Zellkernmitte ermittelt sowie die Signalabstände zwischenhomologen und nicht-homologen Chromosomen gemessen und mit den bei einer zufälligenVerteilung erwarteten Distanzen verglichen. Dabei ergab sich für die großen Chromosomenunabhängig vom Zellzyklusstadium eine weitgehend zufällige Verteilung, während diekleinen Chromosomen signifikant weiter im Inneren des Zellkerns lagen als unter derAnnahme einer zufälligen Verteilung erwartet wurde.

A. Brero (Brero, Diplomarbeit 1999) untersuchte mit zwei DNA-Sondenpools auschromosomenspezifischen Paint-Proben die Verteilung der großen Chromosomen 1-5 und Xsowie der kleinen nicht-akrozentrischen Chromosomen 17-20 in ruhenden menschlichenFibroblasten. Die Untersuchung der Territorienverteilung erfolgte anhand vonProjektionsbildern aus Serien lichtoptischer Schnitte, die mit einem Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen wurden. Die aus 82 Kernen gemittelten Daten ergaben einen

Einleitung 5

signifikanten Unterschied in der Verteilung der Territorien beiden Chromosomengruppen:die Gruppe der kleine Chromosomen zeigten eine signifikante Präferenz für eine zentralePosition, während die großen Chromosomen signifikant weiter peripher (am Kernrand)lagen (A. Brero, Diplomarbeit 1999). Die Untersuchung der gleichen Territorien in nichtproliferierenden menschlichen Lymphozyten, die eine annähernd kugelförmige Gestaltbesitzen, zeigte diesen Unterschied in der Verteilung der großen und der kleinen Territoriennoch deutlicher (M. Cremer, unveröffentlichte Befunde).

1.2.2 Ist die Lage eines Chromosomenterritoriums im Zellkernabhängig von der Gendichte bzw. dem Replikationszeitpunkt inder S-Phase?

Bereits in den beiden Studien von Wollenberg et al. (1982) und Hens et al. (1982) an Meta-phasepräparaten menschlicher Fibroblasten (siehe oben) lag das relativ genreicheChromosom 1 mehr zentral, das relativ genarme Chromosom 18 weiter peripher, als es diePosition der anderen Chromosomen gleicher Größe erwarten ließ.

Croft et al. (1999) verglichen mittels FISH die Verteilung des besonders genreichenChromosoms 19, das fast ausschließlich früh repliziert und des genarmen, vorwiegend spätreplizierenden Chromosoms 18 (Dutrillaux 1976) im Zellkern proliferierender menschlicherFibroblasten und fanden signifikante Unterschiede: Während Chromosom 19 fast immereine zentrale Position im Zellkern einnimmt, lag Chromosom 18 ganz vorwiegend in derKernperipherie. Durch eine simultane Darstellung mit dem pKi-67 Antigen, das im Verlaufdes Zellzyklus charakteristische Verteilungsmuster zeigt (Verheijen et al., 1989), konnte dasPersistieren der peripheren Position von Chromosom 18 in proliferierenden Zellen von derfrühen G1-Phase an über den gesamten Zellzyklus nachgewiesen werden. Noch ist nichtgeklärt, in wieweit die unterschiedliche Kernlage von Chromosom 18 und 19 sich aufproliferierende Zellen beschränkt, oder auch charakteristisch für differenzierte, nichtteilungsaktive Zellen ist. So fanden Bridger et al. (2000) in Fibroblasten, die durchSerumentzug oder Alterung nicht mehr proliferierten, eine Aufgabe der peripheren Lagevon Chromosom 18 und eine Verlagerung in Richtung Kernzentrum. Entsprechende Unter-suchungen an nichtstimulierten peripheren Lymphozyten ergaben hingegen eine signifikantunterschiedliche Verteilung von Chromosom 18 (peripher) und Chromosom 19 (zentral) indiesen differenzierten, ebenfalls nicht proliferierenden Zellen (M.Cremer, unveröffentlichteDaten).

1.2.3 Gibt es feste, zufällige oder statistisch bevorzugte Lage-beziehungen zwischen bestimmten Chromosomenterritorien?

Bevor Chromosomen im Zellkern angefärbt werden konnten, wurde beobachtet, daß NORs(nucleolus organizing regions) tragende akrozentrische Chromosomen, die sich in derInterphase um die Nukleolen angeordnen, häufig in Metaphase-Präparaten eng benachbartlagen. Daneben wurde an Metaphase-Präparaten eine häufige Assoziation vonzentromerischem und telomerischem Heterochromatin benachbart liegender Chromosomenbeschrieben. Daraus wurde eine Anziehung zwischen diesen Heterochromatinbereichen imZellkern vermutet (Schmid et al. 1975, Kirsch-Volders et al. 1980).

Einleitung 6

Zur Frage einer festen Anordnung der Chromosomen in Prometaphase-Rosetten liegenwidersprüchliche Aussagen aus FISH-Untersuchungen an menschlichen Zellen vor:Ausgehend von Ein- und Zweifarben-FISH-Experimenten an Prometaphaserosetten (sieheoben) menschlicher Fibroblasten sowie HeLa-Zellen und Winkelmessungen zwischenhomologen Chromosomen postulierten Nagele et al. 1995 in der Zeitschrift Science einedefinierte speziesspezifische und zelltypunabhängige Anordnung der homologen Chromo-somen in zwei haploiden Sets in einer mehr oder weniger konstanten antiparallelenReihenfolge. Aus weiteren Untersuchungen an Rosetten embryonaler und adulter sowietriploider Fibrobroblasten wurde eine während der gesamten embryonalen Entwicklung undim adulten Organismus konservierten festen Ordnung der Chromosomen in der Mitose undeiner Segregation homologer Chromosomen in haploide Sets entsprechend ihres maternalenoder paternalen Ursprungs abgeleitet (Nagele et al. 1998). Eine derartige Separationhaploider Chromosomensätze war mittels in situ Hybridisierung von genomischer DNA inMetaphasen und im Zellkern von Gras-Hybriden nachgewiesen worden (Leitch et al.1990). Im Gegensatz dazu fanden Allison und Nestor (1999) in Rosetten diploiderFibroblasten und Lymphozyten eine hoch variable, weitgehend zufällige relative Positionhomologer Chromosomen.

In Zweifarben-FISH-Experimenten an Zellkernen von ruhenden diploiden und triploidenFibroblasten, beobachteten Nagele et al. (1999) „nichtzufällige“ Abstände zwischen denHomologen der Chromosomen 7, 8, 16, X und Y, ohne jedoch eine spezifische Anordnungheterologer Chromosomen nachweisen zu können.

In einer Reihe von dreidimensionalen FISH-Untersuchungen an Zellkernen proliferierenderZellen wie kultivierten Fruchtwasserzellen, Fibroblasten und PHA-stimuliertenLymphozyten wurden hoch variable räumliche Lagebeziehungen zwischen homologen undheterologen Chromosomenterritorien beobachtet (Emmerich et al. 1989, Cremer et al.1993, Popp et al. 1990, Dietzel et al. 1995).

1.2.4 Gibt es in differenzierten Zellen zelltypabhängige bevorzugteoder festgelegte Lagebeziehungen zwischen Chromosomenterri-torien?

Zur Frage, ob es zelltypabhängige bevorzugte oder festgelegte Lagebeziehungen zwischenspezifischen Chromosomenterritorien in differenzierten, nicht proliferierenden Zellen gibt,liegen derzeit nur vereinzelte Daten vor. So ist die Häufigkeit, mit der homologe Chromo-somen im Zellkern unmittelbar benachbart liegen, möglicherweise abhängig vom Zelltyp.Chandley et al. (1996) untersuchten die Lage der Chromosomen 3, 7, 8, 13, 17 und 21sowie X und Y mit Chromosomen-Painting-Proben in adulten Sertolizellen und peripherenLymphozyten. Dabei beobachteten sie in der Mehrzahl der Sertolizellen eine Assoziationder untersuchten homologen Chromosomen mit Ausnahme der Geschlechtschromosomen.Im Gegensatz dazu fanden sie in proliferierenden Lymphozyten aus dem peripheren Blutganz überwiegend eine getrennte Lage der homologen Chromosomen mit Ausnahme derakrozentrischen Chromosomenpaare 13 und 21. Eine Analyse der Abstände zwischen denhomologen und heterologen Zentromeren der Chromosomen 7, 11 und 13 in peripherenLymphozyten ergab keine Hinweise auf eine nichtzufällige Verteilung (Lesko et al. 1991).Kozubek et al. (1999) fanden eine präferentielle Lokalisierung der Chromosomen 9 und 22

Einleitung 7

im Zentrum von Kernen von Go-Lymphozyten und darüberhinaus eine überdurchschnittlichhäufige unmittelbare Nachbarschaft dieser beiden Chromosomen. Dieser Befund könnte inBeziehung stehen zur Entstehung einer Translokation der Chromosomen 9 und 22 t(9;22)mit Involvierung der BCR/ABL Regionen, die ein charakteristischer Befund bei der chroni-schen myeloischen Leukämie sowie bei der adulten akuten lymphoblastoiden Leukämie(Kurzrock et al. 1988) ist.

1.3 Ziele dieser Arbeit

Die Genome aller heute lebenden Arten entwickelten sich über hunderte von MillionenJahren aus gemeinsamen Vorstufen. Die vergleichende Genomforschung, d. h. die ver-gleichende Analyse von Genstruktur und Genomorganisation bei entwicklungsgeschichtlichunterschiedlich weit entfernten Spezies ist ein Schlüssel für die Aufklärung der Funktionvon Genen und der Regulation der Genexpression. Der Transfer genetischer Daten zwischenverschiedenen Spezies erwies sich nicht nur für die Grundlagenforschung als außer-ordentlich wichtig, sondern gewinnt auch in der anwendungsorientierten biomedizinischenForschung immer mehr an Bedeutung (O’Brien et al. 1999). So führen genetische Daten,die beispielsweise am Menschen gewonnen wurden zur direkten Identifizierungkorrespondierender Gene bei einer Vielzahl anderer Spezies. Dies ermöglicht dieEtablierung von Tiermodellen, mit deren Hilfe die Ursachen für Erkrankungen desMenschen aufgeklärt und Therapieverfahren entwickelt werden können.

Befunde von entwicklungsgeschichtlich weiter entfernten Spezies mit stark abweichendenKaryotypen könnten helfen, fundamentale Gesetzmäßigkeiten der Zellkernarchitekturaufzuklären, die auch für den Menschen gültig sind.

Im Rahmen dieser Dissertation sollten erstmals Morphologie und Verteilung von Makro-und Mikrochromosomen im Zellkern einer Vogelart, des Haushuhns Gallus domesticusuntersucht werden. Das Huhn besitzt wenige, insgesamt genarme Makrochromosomen,deren Größe im Bereich menschlicher Chromosomen liegt, und viele insgesamt sehrgenreiche Mikrochromosomen mit einem DNA Gehalt von jeweils nur etwa 5 bis 25Millionen Basenpaaren (siehe 1.4). Die Chromosomen von Gallus domesticus zeichnen sichim Vergleich zu menschlichen Chromosomen durch extreme Unterschiede in ihrer Größeund in ihrer Gendichte aus.

Dieser entwicklungsgeschichtliche Ansatz sollte Antworten zu folgenden Fragen geben:

• Unterscheiden sich die Territorien von Makro- und Mikrochromosomen bei Vögeln inwesentlichen Strukturmerkmalen untereinander oder im Vergleich zu Chromosomen-territorien von Säugern?

• Korrelliert die Lage eines Chromosomenterritoriums im Zellkern mit derChromosomengröße und bzw. oder den Anteilen von genarmem und genreichemChromatin?

• Liegt der Zellkernarchitektur eine eindeutig festgelegte oder eine variable relativeAnordnung der Chromosomenterritorien zugrunde?

Einleitung 8

Das erste Ziel bestand in der Herstellung chromosomenspezifischer DNA-Sonden(Chromosomen-Paints) mittels durchflußzytometrischer Sortierung von Chromosomen undDNA-Amplifikation mit DOP-PCR (siehe 1.5.1). Mit diesen DNA-Sonden, Mehrfarben-Fluoreszenz in situ Hybridisierung (siehe 1.5.2), konfokaler Laserscanning-Mikroskopie(siehe 1.5.3) und digitaler Bildverarbeitung sollten Chromosomenterritorien im Zellkern invitro kultivierter embryonaler Fibroblasten und embryonaler Neuronen dreidimensionaldargestellt werden. Die beiden Zelltypen sollten Hinweise auf die Bandbreite möglicherErscheinungsformen in Abhängigkeit von Proliferationsaktivität und zellulärerDifferenzierung geben. Im Gegensatz zu den Fibroblasten teilen sich die embryonalenNeuronen unter den gewählten Kulturbedingungen nicht, sondern bilden als Ausdruck ihrerzellulären Differenzierung ein dichtes Netz verzweigter Neuriten.

Um die grundsätzliche Verteilung von Makro- und Mikrochromosomen im Zellkern zuuntersuchen, wurden die Chromosomen nach ihrer Größe in drei Gruppen zusammengefaßtund die drei Chromosomengruppen mittels entsprechender DNA-Sondenpools mit dreiFluorochromen im Zellkern angefärbt.

Zur Frage einer eindeutig festgelegten oder variablen relativen Anordnung derChromosomenterritorien wurden die Makrochromosomen 1 bis 6 und Z, die zusammenetwa 75 % des Genoms enthalten, durch eine kombinatorische Markierung mit dreiFluorochromen verschiedenfarbig dargestellt.

1.4 Genom und Karyotyp von Gallus domesticus

Das Haushuhn Gallus domesticus ist als Nutztier von hoher ökonomischer Bedeutung.Riesige Zuchtpopulationen und kurze Generationszeiten bieten die Basis zur Identifizierungvon Genen, die für die Ausprägung phänotypischer Merkmale verantwortlich sind. In denletzten Jahren wurde bei Gallus domesticus eine große Anzahl von Einzelgenen undpolygenen Markern, sowie von phänotypisch wirksamen Mutationen entdeckt undbeschrieben. Darüberhinaus ist das Huhn aufgrund des einfachen Zugriffs auf den frühenEmbryo ein wichtiger Modellorganismus für die Erforschung der Embryonalentwicklung.Vorliegenden Fossilienfunden zufolge trennte sich die Entwicklung der Vögel und derSäugetiere vor 300 – 350 Millionen Jahren (Hedges et al. 1996). Die Sequenzierunghomologer Gene zwischen Mensch und Huhn offenbart einen hohen Grad derKonservierung über diesen langen Zeitraum unabhängiger Entwicklung. Die vergleichendeGenkartierung macht darüber hinaus klar, daß sogar die Gruppierung der Gene und ihreAnordnung innerhalb der Gruppen weit höher konserviert ist, als es die Divergenz derKaryotypen vermuten läßt. Der Grad der Konservierung homologer chromosomalerSegmente zwischen Huhn und Mensch ist vermutlich höher als zwischen Maus und Menschund ermöglicht die wechselseitige Vorhersage von Genorten (Burt et al. 1999).

Das haploide Genom von Gallus domesticus umfaßt mit etwa 1,2 Milliarden Basenpaarenrund ein Drittel des menschlichen Genoms (Smith und Burt 1998). Die Genomgröße ist beiden Vögeln im Gegensatz zu den anderen Vertebratenklassen sehr konstant, wieUntersuchungen an 135 Arten aus 17 Ordnungen ergaben (Tiersch und Wachtel 1991). Dieim Vergleich zu Säugern geringere Genomgröße beruht vor allem auf einer geringerenMenge an verstreuten repetitiven Sequenzen, die bei Säugern etwa 50 % des Genoms, aber

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weniger als 15 % eines Vogelgenoms bilden (Burt et al. 1999). Daneben ergab derSequenzvergleich an 33 Genen im Vergleich zum Menschen bei gleicher Exonlängesignifikant kürzere Introns (Burt et al. 1999).

Das Genom von Gallus domesticus besteht aus 78 Chromosomen: 9 PaarMakrochromosomen (Chr. 1 – 8, Z, W) und 30 Paar Mikrochromosomen, die ohnespezifische DNA-Sonden nicht unterschieden werden können (Nomenklatur: InternationalCommittee for the Standardization of the Avian Karyotype, Guelph, Canade 1993). Dabeigibt es zwischen Makro- und Mikrochromosomen keine klare, durch die Größe odermorphologische Kriterien vorgegebene Trennlinie. Die Größenunterschiede derChromosomen sind enorm: Während das Chromosom 1 mit 250 Millionen Basenpaarenetwa so groß ist wie das menschliche Chromosom 1, liegt die Größe derMikrochromosomen vermutlich zwischen 7 und 23 Millionen Basenpaaren (Bloom et al.1993). Zum Vergleich: das kleinste menschliche Chromosom 21 enthält rund 55 MillionenBasenpaare. Ein Karyotyp aus wenigen Makrochromosomen und zahlreichenMikrochromosomen ist typisch für die meisten der bisher untersuchten Vogelarten(Rodionov et al. 1996). Die Geschlechtsbestimmung erfolgt bei Vögeln über das ZW-System: Männchen sind homogamet mit zwei Z-Chromosomen, Weibchen heterogamet miteinem Z- und einem W-Chromosom.

Die Gene verteilen sich asymmetrisch auf Makro- und Mikrochromosomen: Die Mikro-chromosomen bilden nur rund 35 % des Genoms, tragen jedoch insgesamt vermutlich etwa75 % der Gene (McQueen et al. 1998).

Die Mikrochromosomen sind durch eine hohe Dichte an CpG-Inseln gekennzeichnet(McQueen et al. 1996). Nach Screening von Cosmiden wurde für die Mikrochromosomeneine Gen-Dichte von einem Gen auf 10.000 Basenpaare berechnet (McQueen et al. 1998).Dieser Wert kommt der Gendichte des japanischen Pufferfischs (Fugu rubrides) nahe, derunter den Vertebraten das kompakteste bisher bekannte Genom besitzt und daher dervergleichenden Genomforschung als Modellorganismus dient (Elgar 1996). Daneben zeigendie Mikrochromosomen insgesamt eine amino-terminale Hyperacetylierung von Histon H4,einem Kennzeichen transkriptional aktiven Chromatins (Überblick bei Turner 1993, 1998).Dennoch zeigt die C-Bandenfärbung bei den meisten Mikrochromosomen Heterochromatin-Blöcke, viele der kleinsten erscheinen vollständig heterochromatisch (Schmid et al. 1989).Insgesamt bestehen die Mikrochromosomen überwiegend aus frühreplizierender DNA(McQueen et al. 1998), enthalten jedoch auch spätreplizierende DNA (Ponce de Leon et al.1992). Elektronenmikroskopische Untersuchungen an synaptonemalen Komplexen konntenaufdecken, daß alle Mikrochromosomen ein Zentromer besitzen und überwiegendakrozentrisch sind (Kaelbling und Fechheimer 1983).

Die autosomalen Makrochromosomen bestehen überwiegend aus AT-reicher DNA, weisennur eine schwache R-Bänderung und gleichzeitig nur eine schwache C-Bänderung durchzentromerisches und telomerisches Heterochromatin auf. Die Telomerregion des langenArms des Z-Chromosoms und das gesamte W-Chromosom erscheinen in der C-Banden-färbung als konstitutives Heterochromatin (Schmid et al. 1989).

Einleitung 10

1.5 Die Darstellung von Chromosomenterritorien imZellkern

1.5.1 Die Herstellung chromosomenspezifischer DNA-Proben

1.5.1.1 Isolierung spezifischer Chromosomen

Der erste Schritt zur Herstellung chromosomenspezifischer DNA-Sonden ist die Isolierungder gewünschten Chromosomen. Das heute wichtigste Verfahren ist die Sortierung vonMetaphasechromosomen nach ihrer Größe und ihrer Basenzusammensetzung mittelsDurchflußztytometrie (Davies et al. 1981, Carter 1990, 1994).Nach Anfärbung mit einem bevorzugt an Adenin und Thymin (AT) sowie einem bevorzugtan GC (Guanin und Cytosin) bindenden Fluoreszenzfarbstoff passieren die in einer Lösungsuspendierten Chromosomen in einem kontinuierlichen Strom einzeln einen fokussiertenLaserstrahl, der die Farbstoffe anregt und einen Photomultiplier, der die emittiertenFluoreszenzintensitäten mißt. Chromosomen mit einer gewählten Fluoreszenzintensitätwerden in einem elektromagnetischen Feld aus dem Strom abgelenkt und in einem Gefäßaufgefangen. Diese Methode wurde in den vergangenen Jahren erfolgreich zur Sortierungvon Chromosomen verschiedener Spezies eingesetzt und als Ausgangsmaterial zurGenerierung von Sätzen chromosomen-spezifischer DNA-Bibliotheken für den Menschen(Vooijs et al. 1993) und zahlreicher anderer Spezies verwendet. (Langford et al. 1993,Rabbits et al. 1995, Burkin et al. 1997)

Alternativ können einzelne Chromosomen und Chromosomemfragmente mit Hilfe feinerGlasnadeln von mikroskopischen Metaphasepräparaten aufgenommen werden. Dieses Ver-fahren wurde erstmals 1981 von Scalenghe et al. an polytänen Chromosomen vonDrosophila beschrieben. In der Folge konnten mittels Mikrodissektion Metaphase-chromosomen verschiedener Spezies mikrodisseziert werden. (Röhme et al. 1984, Bates etal. 1986, Lüdecke et al. 1989, Guan et al. 1994, 1996). Eine weitere Alternative bietet diekürzlich entwickelte Isolierung einzelner Chromosomen mittels Laser Pressure Catapulting(Schermelleh et al.1999).

1.5.1.2 Amplifikation der aus isolierten Chromosomen gewonnenen DNA

Die Generierung chromosomenspezifischer DNA-Proben gelang zunächst durch Restrik-tionsverdau der chromosomenspezifischen DNA und anschliessender Klonierung derFragmente in Phagen (phage libraries) (Fisher et al. 1985, Bates et al. 1986) oder Plasmiden(plasmid libraries) (Lüdecke et al. 1989, Senger et al. 1990). Diese Klonierungsverfahrenwaren aufwendig und technisch anspruchsvoll und die Klonierungseffizienz relativ gering.Zudem erforderte die Herstellung dieser Sonden die Kultivierung entsprechend trans-formierter Bakterienstämme. Insgesamt waren diese Proben aber qualitativ ausreichend füreine spezifische Darstellung einzelner Chromosomen.

Ein wichtiger Fortschritt für die Generierung von komplexen DNA-Sonden für dieFluoreszenz in situ Hybridisierung gelang mit der Entwicklung derPolymerasekettenreaktion (PCR), die eine universelle Amplifikation durchflußytometrisch

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sortierter bzw. mikrodissezierter Chromosomen ermöglicht. Unter den verschiedenen PCR-Techniken für eine sequenzunabhängige Amplifikation einer Ziel-DNA brachte neben dersog. linker-adapter-PCR, bei der Restriktionsfragmente isolierter DNA mit einem linker-adapter-Oligonukleotid ligiert und anschliessend mit einem linker-spezifischen Primeramplifiziert werden (Voojis et al 1993) vor allem die Entwicklung der DOP-PCR(„degenerate oligonucleotide primed PCR“) (Telenius et al. 1992) eine entscheidendeVerbesserung. Die Sequenz des von Telenius beschriebenen 6MW-DOP-Primers enthält am5´ und 3´-Ende je 6 spezifische Nukleotide, während sie im mittleren Abschnitt"degeneriert" ist, d. h. eine zufällige Sequenz von 6 Basen enthält und somit 46

unterschiedliche Sequenzen enthält. Das ermöglicht eine grosse Anzahl an statistisch imGenom verteilten Bindungsstellen. Ein DOP-PCR-Amplifikat repräsentiert einen Großteilder Ausgangs-DNA als Fragmente von etwa 200 – 2000 Basenpaaren. Im ersten Zyklusbindet bei niedriger Annealing-Temperatur der DOP-Primer partiell mit seinem spezifischen3´-Ende und dem degenerierten mittleren Abschnitt an die Template-DNA. In denfolgenden PCR-Zyklen mit niedriger Annealing-Temperatur werden Fragmente erzeugt, diean einem Ende von einer vollständigen DOP-Primer-Sequenz und am anderen Ende von derdazu komplementären Primer-Sequenz begrenzt werden. Diese Fragmente werden in denanschließenden stringenten Zyklen weiter amplifiziert, in denen die Annealing Temperaturso hoch ist, daß nur noch eine spezifische Primerbindung in voller Länge möglich ist. DieGenerierung von chromosomenspezifischen Sonden mittels DOP-PCR ist grundsätzlichtechnisch einfach und erfordert keine vorherige Aufbereitung der DNA. MinimaleAusgangsmengen an genomischer DNA von weniger als 0,1 Picogramm können auf dieseWeise nahezu unbegrenzt amplifiziert werden.

1.5.2 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)

Fluoreszenzfarbstoffe absorbieren Licht einer bestimmten Wellenlänge und emittieren einenTeil der aufgenommenen Energie als Licht einer längeren, energieärmeren Wellenlänge.Werden solche Farbstoffmoleküle mit Licht der absorbierten Wellenlänge bestrahlt unddurch ein Filter betrachtet, sieht man sie vor einem dunklen Hintergrund leuchten. In einemkonventionellen Auflicht-Fluoreszenzmikroskop liefern eine Quecksilber- oder Xenonlampeund ein entsprechender Filter (Exzitationsfilter) Licht der benötigten Wellenlänge, im Falledes Laser-Scanning-Mikroskops erzeugt ein fokussierter Laser monochromatisches Licht.Ein Emissionsfilter läßt nur Wellenlängen, die von dem fluoreszierenden Farbstoff emittiertwerden, zum Okular, zu einer Kamera oder einem Photomultiplier gelangen.

Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) ermöglicht es, in Metaphasepräparaten oderZellkernen ganze Chromosomen sowie subchromosomale Regionen bis hinunter zueinzelnen Genorten anzufärben. Die in situ Hybridisierung beruht darauf, daß sicheinzelsträngige DNA oder RNA im Bereich komplementärer Basensequenzen zu einemDoppelstrang zusammenlagert.

Die Anfärbung spezifischer Chromosomen bzw. subchromosomaler Regionen mittels FISH(„chromosome painting“) erlangte in den letzten Jahren ein breites Einsatzspektrum in derklinischen Zytogenetik (Überblick bei Lichter 1997 und Ried et al. 1998). Chromosomepainting eröffnete darüber hinaus neue Möglichkeiten für die vergleichende Zytogenetik unddie Erforschung der Evolution verschiedenster Spezies (Wienberg et al. 1997, Chowdharyet al. 1998, Müller et al. 1999). Durch Hybridisierung Chromosomen-spezifischer Probeneiner Spezies auf Metaphase-Präparate einer anderen Spezies („Zoo FISH“) lassen sich

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direkt konservierte homologe Chromosomen, Chromosomenarme und –Segmente anfärbenund auch komplexe chromosomale Umbauten charakterisieren, die sich einer Analysedurch herkömmliche Bandenfärbungen entziehen.

Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung umfaßt folgende Schritte:

Die DNA-Sonde wird direkt mit einem Fluorochrom markiert oder indirekt mit einemHapten wie Biotin, Digoxigen oder Östradiol markiert, das nach der Hybridisierung mittelsspezifisch an das Hapten bindender Fluorochrom-markierter Antikörper oder Avidinnachgewiesen wird. Die indirekte Markierung mit anschließendem Nachweis durchImmunfluoreszenz- ermöglicht in der Regel eine höhere Signalintensität d. h. eine höhereSensitivität. Die Markierung der DNA-Sonde kann durch den enzymatischen Einbauchemisch veränderter Nukleotide (dNTPs), vor allem über eine Nicktranslation oder beiChromosomen-Paints eine stringente DOP-PCR erfolgen. Letztere besitzt den großenVorteil, daß die Sonden-DNA gleichzeitig mit der Markierung amplifiziert wird.

Damit die markierte Sonden-DNA auf komplementäre Sequenzen der Ziel-DNAhybridisieren kann, werden die Ziel-DNA d. h. die DNA der Metaphasechromosomen oderdes Zellkerns und die Sonden-DNA durch Erhitzen denaturiert. Bei komplexen Sonden, dieauch repetitive ubiquitär auftretende Sequenzen enthalten, wird vor der eigentlichenHybridisierung eine sogenannte Vorhybridisierung zwischen Sonden-DNA und nicht-markierter hochrepetitiver DNA wie der Cot-1-Fraktion einfügt, um eine unspezifischeHybridisierung auf entsprechende repetitive Sequenzen der Ziel-DNA zu verhindern.Anschließend wird die Sonden-DNA auf Metaphasechromosomen oder Zellkerneaufgebracht. Nach der Hybridisierung werden in einer Reihe von Waschschritten nichtgebundene Sondenmoleküle entfernt. Über die Waschbedingungen – die Zugabe vonFormamid, Salzkonzentration und Temperatur – kann die Stringenz der Hybridisierunggesteuert werden, d. h. wie genau die korrespondierenden Sequenzen von Sonden- und Ziel-DNA aufeinander passen sollen. Im Falle einer indirekten Markierung wird eineHybridisierung der Sonden-DNA beispielsweise über Fluorochrom-markierte Antikörpernachgewiesen, die spezifisch an das in die Sonde eingebaute Hapten binden.

Die Fluoreszenzsignale der hybridisierten DNA-Sonden werden mit einer CCD-(chargecoupled device)-Kamera oder – für dreidimensionale Untersuchungen an Zellkernen - miteinem konfokalen Laserscanning-Mikroskop aufgenommen. Die digitalen Bilder können mitSoftware bearbeitet und analysiert werden.

Grundsätzlich können in einem FISH-Experiment durch den Einsatz mehrererFluorochrome, die sich in ihrem Anregungs- und Emissionsspektrum hinreichendunterscheiden, mehrere DNA-Sonden gleichzeitig unabhängig voneinander in verschiedenenFarben dargestellt werden. Dazu wird eine entsprechende Ausrüstung des Mikroskopsbenötigt, um die entsprechenden Kombinationen von Anregungs- und Emissionsspektrumrealisieren zu können. Aus technischen Gründen ist in der Praxis die Zahl derFluoreszenzfarbstoffe, die gleichzeitig zuverlässig eingesetzt werden kann, begrenzt. Soerfordert die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie für jede Anregungswellenlänge eineneigenen Laser.

Die Anzahl der Zielsequenzen, die gleichzeitig dargestellt werden soll, kann über zweigrundsätzliche Strategien über die Zahl der eingesetzten Fluorochrome hinaus erhöhtwerden: die kombinatorische Markierung („combinatorial labeling“, Nederlof et al. 1989)

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und die Verhältnis-Markierung („ratio labeling“, Nederlof et al. 1990). Bei derkombinatorischen Markierung wird jede Ziel-DNA mit einer bool‘schen Kombination vonFluorochromen markiert. So werden Ziel 1 mit Farbstoff A, Ziel 2 mit Farbstoff B und Ziel3 mit beiden Farbstoffen A und B markiert. Die Anzahl der möglichen Kombinationen für nFluorochrome ist 2n – 1, d. h. 7 für 3 Fluorochrome, 15 für 4 etc.. Bei der Verhältnis-Markierung werden die DNA-Sonden mit einer Kombination aus Fluorochromen inverschiedenen Mengenverhältnissen markiert. So werden beispielsweise 3 Sonden mitjeweils 2 Farbstoffen A und B markiert: Sonde 1 im Verhältnis 1 : 4 (A : B), Sonde 2 imVerhältnis 1 : 1 und Sonde 3 im Verhältnis 4 : 1.

Über eine kombinatorische Markierung mit 5 Fluorochromen gelang gleichzeitig zweiArbeitsgruppen unabhängig voneinander die simultane Darstellung aller unterschiedlichermenschlichen Chromosomen in verschiedenen Farben (Speicher et al. 1996, Schröck et al.1996). Bei der „multiplex fluorescence in situ hybridization“ (Speicher et al. 1996) wirdmittels fluorochrom-spezifischen Anregungs- und Emissionsfiltern separat für jedes der 5Fluorochrome mit einer CCD(charge-coupled-device)-Kamera ein Bild aufgenommen. Ausden Einzelkanalbildern wird mit Hilfe von Software ein zusammengesetztes Bild erzeugt,das jedem Chromosom je nach Signalkombination eine Falschfarbe zuweist. DieMarkierung der DNA-Sonden für M-FISH wurde durch Bildung von Probenpools undMarkierung der Pools mittels DOP-PCR entscheidend vereinfacht (Roberts et al. 1999,Speicher et al. 1999). Bei dem „spectral karyotyping“ (SKY) Verfahren (Schröck et al.1996) wird eine Bildaufnahme mittels CCD-Kamera mit der Fourier-Spektroskopiekombiniert: dabei wird für jeden Bildpunkt das Emissionsspektrum analysiert. Softwareklassifiziert das Bild, indem es Pixel mit identischen Spektren identifiziert und ihnen eineentsprechende Falschfarbe zugeweist.

Die Kombination aus einer Kombinations- und Verhältnis-Markierung combined binaryratio labeling (COBRA-)FISH (Tanke et al. 1999) verspricht eine weitere Steigerung dergleichzeitig differenziell anfärbbaren Zielsequenzen.

1.5.3 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie

Das Prinzip eines konfokalen Mikroskops wurde von Marvin Minsky erfunden und 1957 inden USA zum Patent angemeldet (Minsky 1961). Erst 30 Jahre später ermöglichtenEntwicklungen der Computer- und Lasertechnologie die Konzeption und die Realisierungder konfokalen Mikroskopie für die dreidimensionale Untersuchung fluoreszierenderObjekte (Cremer und Cremer 1978, Wijnaends van Resandt et al. 1985). 1979 wurdenerste konfokale Aufnahmen mit Objektiven mit hoher numerischer Apertur veröffentlicht(Brakenhoff et al. 1979). 1985 wurden in der Zeitschrift Nature erstmals konfokaleAufnahmen des Chromatins in Neuroblastomzellkernen vorgestellt (Brakenhoff et al. 1985).

Bei der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie wird das Präparat rasterförmig von einemfokussierten Laserstrahl abgetastet. Mit Hilfe einer konfokal zum Laserfokus angeordnetenLochblende im Emissionsstrahlengang werden selektiv nur aus der momentanen lateralenund axialen Position des Laserfokus emittierte Lichtsignale von einem Detektor registriert.Auf diese Weise lassen sich Serien optischer Schnitte durch einen Zellkern herstellen, ausdenen dreidimensionale Bilder rekonstruiert werden können. In der Praxis liegt dasphysikalische Auflösungsvermögen des Laser-Scanning-Mikroskops für Fluores-zenzmarkierungen in Zellkernen bei etwa 280 - 330 nm lateral und 610 - 760 nm axial

Einleitung 14

(Edelmann et al. 1999). Das Potential der Laser-Scanning-Mikroskopie wurde in denletzten Jahren durch Entwicklungen der digitalen Bildverarbeitung zur Korrektur vonAbbildungsfehlern, der Eliminierung extrafokaler Signale (Dekonvolution) und drei-dimensionalen Rekonstruktion entscheidend weiter verbessert.

Material und Methoden 15

2 Material und Methoden

2.1 Zellkultur

Für die Anzucht embryonaler Zellen wurden Bruteier von einer weißen Leghorn-Henne undeinem Araucana-Hahn verwendet (Bezug: L. Hölzl, Moosburg).

2.1.1 Anzucht embryonaler Fibroblasten

Material:

50 ml, 250 ml und 750 ml Kulturflaschen (Falcon, Becton Dickinson, UK)Quadriperm Gewebekulturschalen (Heraeus, Hanau)Mikroskopische Deckgläser 76 x 26 mm, Dicke 0,17 ± 0,01 mm(Hecht Assistent No. 1014, Bezug: Labor Schubert, München)

DMEM (Dulbecco’s minimal essential medium) mit3,7 g/l NaHCO3 , 4,5 g/l Glucose, N-Acetyl-L-Alanyl-Glutamin(Kat.-Nr. FG0435, Biochrom, Berlin)FCS (fetal calf serum) (Kat.-Nr. S0115, Biochrom)Penicillin/Streptomycin, 10 000 U/10 000 µg/ml (Kat.-Nr. A2213, Biochrom)

10x Trypsin/EDTA 0,5 % / 0,2 % (Kat.-Nr. L2153, Biochrom)PBS (phosphate buffered saline), autoklaviert

Kulturmedium: 500 ml DMEM 50 ml FCS 5 ml Penicillin/Streptomycin

Durchführung:

• Bebrütung der Eier 5 - 6 Tage bei 38,5 °C• Sterile Entnahme des Embryos• Nach Waschen in PBS Zerkleinerung von Rumpf und Gliedmaßen mit Skalpel• Aufnahme des zerkleinerten Gewebes mit einer 2 ml Pipette in 2 ml Zellkulturmedium

und Dispergierung in einer 50 ml Gewebekulturflasche mit 8 ml Medium.• Kultivierung bei 39 °C, 100 % Luftfeuchte und Begasung mit 3 – 5 % CO2

• Nach 24 h Absaugen des Mediums und vorsichtiges Spülen der Flasche mit PBS,Ablösung und Dissoziation der die am Flaschenboden angehefteten Zellen und Gewebe-stückchen durch Inkubation mit 1,5 ml 0,05%/0,02% Trypsin/EDTA für 5 min bei37 ° C und Aussaat in neue 50 ml Flasche mit 8 ml Kulturmedium.

• Bei einer Zelldichte von etwa 80 % 24 – 48 h später erneut Abtrypsinieren der Zellenund Verteilung auf zwei 50 ml Flaschen. Die Kultur besteht nun weitestgehend ausEinzelzellen mit fibroblastärem Erscheinungsbild.

• Weitere Kultivierung in 250 ml Zellkulturflaschen


Metaphasepräparationen und die Anzucht für 3D-FISH wurden zwischen der 5. und 16.Passage durchgeführt. In späteren Passagen war eine zunehmende Alterung der Kulturenmit Abnahme der Teilungsaktivität zu beobachten.

Für dreidimensionale Untersuchungen an Zellkernen wurden Fibroblasten auf 76 x 26 mmgroße mikroskopische Deckgläser mit jeweils 5 ml Medium in Quadripermschalen ausgesätund für 72 – 96 h kultiviert.

2.1.2 Kultivierung embryonaler Neuronen

Mit dem von Pettmann et al. (1979) beschriebenen Verfahren können von 7 Tage altenEmbryonen reine Populationen neuronaler Zellen der Großhirn-Hemisphären isoliert undkultiviert werden.

Material:

Nylonnetz, Maschenweite 48 nm (Nylon-Monofilament Blutex 120T/204 von tripette etrenaud, Villeneuve-La-Garonne, Frankreich)

Quadriperm Gewebekulturschalen (Heraeus, Hanau)Mikroskopische Deckgläser 76 x 26 mm, Dicke 0,17 ± 0,01 mm(Hecht Assistent No. 1014, Bezug: Labor Schubert, München)Polylysin-Hydrobromid, Mol.Wt. 70.000 – 100.000 (Kat.-Nr. P1274, Sigma)Beschichtung der Deckgläser: am Vortag der Aussaat über Gasflamme sterilisieren, inQuadripermschalen einlegen und mit 1,0 mg Poly-Lysin-Hydrobromid in 100 ml 0,1 MBorsäure-NaOH-Puffer pH 8,4 über 24 h bei Raumtemperatur inkubieren, Absaugen undzweimaliges Spülen der Deckgläser mit serumfreiem DMEM.

DMEM (Dulbecco’s minimal essential medium) mit 3,7 g/l NaHCO3 , 1,0 g/l Glucose(Biochrom, Berlin)

Kulturmedium: 500 ml DMEM100 ml FCS 5 ml Penicillin/Streptomycin

Durchführung:

• Bebrütung der Eier 7 Tage• sterile Entnahme der Embryonen• Dissoziierung der Hemisphären über Passierung durch Nylonnetz• Homogenisierung der Zellsuspension mit steriler Spritze• Aussaat der Zellen einer halben Hemisphaere pro Deckglas in Quadriperm-

Kulturschalen mit jeweils 5 ml Medium• Kultivierung bei 39 °C, 100 % Luftfeuchte und Begasung mit 3 – 5 % CO2

• Mediumwechsel alle 24 h• nach 2 – 3 Tagen Auswachsen von Neuriten erkennbar, im Verlauf von 7 Tagen bilden

die neuronalen Zellen ein Netz verzweigter Neuriten aus.


• 6 Tage nach Aussaat Fixierung in 1,3 % Paraformaldehyd, 0,5 x PBS, 15 min bei RT• zweimaliges Waschen in PBS• Lagerung bei 4 °C in PBS und 0,04 % Na-Acid

2.2 Herstellung chromosomenspezifischer DNA-Proben mitDurchflußzytometrie und DOP-PCR

2.2.1 Durchflußzytometrische Sortierung von Chromosomen

2.2.1.1 Herstellung einer Chromosomen-Suspension

Reaganzien:

Colcemid 10 mg/mlTrypsin/EDTA 0,05 %/0,02 % in1xPBSVersene-Lösung

Hypotone Lösung, Ansatz:2,35 ml 800 mM KCl12,5 µl 0,4 M Spermine12,5 µl 0,1 M Spermidine22,65 ml steriles destilliertes H2O, filtrieren mit 0,2 µM-Filter

PAB-Puffer, Ansatz:10 µl 0,4 M Spermine10 µl 1 M Spermidine2 ml 800 mM KCl1 ml 200 mM NaCl2 ml 20 mM EDTA in 75 mM Tris-Puffer ph 8,02 ml 5 mM EGTA in 75 mM Tris-Puffer ph 8,07 ml H2O20 µl ß-mercaptoethanolRühren50 µl Triton X-100Einstellen des pH auf 7,2 mit 1N HClAuffüllen mit H2O auf 20 ml und filtrieren durch 0,2 µM-Filter

400 µg /ml Chromomycin A320 µg/ml Hoechst 33258

Durchführung:

750 ml Kulturflaschen (Wachstumsfläche 175 cm²) in der exponentiellen Wachstumsphaseund ca. 85 % Dichte wurden für 6 h mit Colcemid (Endkonzentration 100 ng/µl) inkubiert.


• Abgießen des Mediums in 50 ml-Röhrchen, vorsichtiges Spülen mit 10 ml Versene-Lösung, Zugabe 5 ml Trypsin/EDTA, Inkubation 30 sec bei RT, Stop der Trypsin-Wirkung durch Rückgabe des Mediums, Abschüttelung der Mitosen durch kräfigenSchlag auf die Kulturflasche

• Abgießen des Mediums mit den abgelösten Mitosen in 50 ml Röhrchen undZentrifugieren mit 250 g für 10 min

• Absaugen des Mediums bis zum Pellet, Trocknenlassen des Pellets für 5 min bei RT• Zugabe von 10 ml 75 mM KCl-Lösung und vorsichtiges Resuspendieren mit

Plastikpipette• Inkubation 15 min bei Raumtemperatur• Zentrifugieren mit 400 g 10 min• Absaugen des Überstandes und kurze Trocknung des Pellets bei RT• Resuspension des Pellets in 2 ml PAB-Puffer.• Inkubation auf Eis für mindestens 10 min• heftiges Aufziehen der Suspension mit 10 ml Einmalspritze mit 22-gauge-Nadel zur

Freisetzung der Chromosomen• Test unter dem Mikroskop durch Ausstreichen eines kleinen Aliquots und Färben mit

Propidiumiodid auf Objektträger• Zugabe von 10 µl 15 % Natriumacid pro ml PAB-Puffer• Lagerung für wenige Tage bei 4 °C möglich• Färbung der Chromosomen mit Hoechst 33258 (Endkonzentration 2 µg/ml) und

Chromomycin A3 (Endkonzentration 40 µg/ml) durch Zugabe von je 200 µl undInkubation 2 h bei RT

2.2.1.2 Chromosomen-Sortierung

Die Sortierung der Chromosomen wurde von Patricia O`Brian am Department ofPathology, Cambridge, UK (Leitung: Prof. Malcolm Ferguson-Smith) an einem FACStarPlus, Becton Dickinson Immunocytometry Systems, UK durchgeführt (nach Carter et al.1990). Dabei wurden pro Peak wurden 250 – 400 Chromosomen in 27 µl sterilem dH2O ineinem PCR-Reaktionsröhrchen gesammelt.

2.2.2 Primäre DOP-PCR-Amplifikation sortierter Chromosomen-fraktionen

Material:

5x PCR-Puffer D (Invitrogen PCR-Kit K-1220-02D)Taq-Polymerase 15 U/µl (SUPER TAQ TP05a, HT Biotechnology LTD Cambridge, UK)W1-Detergens (Polyoxyethelene ether, Kat.-Nr. P 7516 , Sigma )6-MW-Primer 2,5 mM (Oligo‘s-U-Like, Cambridge, UK):Sequenz: 5‘ CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG G‘ , N= A, C, G oder T (nachTelenius et al. 1992)dNTP-Mix: dATP, dCTP, dTTP, dGTP je 2,5mM (PCR-Kit K-1220-02D, Invitrogen)

PCR-Maschine: Hybaid Touchdown, Heidelberg


50 µl PCR-Ansatz Volumen Endkonzentration5 x PCR-Puffer D 10 µl pH 8,5

60 mM Tris/HCl3,5 mM MgCl215 mM (NH4)2SO3

20 µM 6-MW-Primer 5 µl 2 µMd NTP-Mix: jeweils 2,5mMdATP, dCTP, dGTP, dTTP

5 µl jeweils 250 µMdATP, dCTP, dGTP, dTTP

0,05% W1-Detergens 2,5 µl 0,0025 %Taq-Polymerase 0,3 µl 0,09 U/µl~200 - 400 Chromosomenin H2O bidest.

27 µl

PCR-Programm: Start-Denaturierung 94 °C 5 min

9 niedrig stringente Amplifikationszyklen 94 °C 1 min 3030 °C 1 min 3072 °C 3 min

29 hoch stringente Zyklen 94 °C 1 min 3062 °C 1 min 3072 °C 1 min 30

72 °C 8 min

2.2.3 Sekundäre DOP-Amplifikation sortierter Chromosomen-fraktionen

Die PCR-Produkte der primären DOP-PCR wurden in einer stringenten „sekundären“DOP-PCR weiter amplifiziert. Dabei wurden in einen 50 µl-Ansatz 2 µl Template ein-gesetzt. Dieses PCR-Protokoll wurde auch bei der Amplifikation von Sonden-Pools fürMehrfarben-FISH (siehe 2.2.7) verwendet.

Material:

10x PCR-Puffer (Amersham)Taq-DNA-Polymerase 5U/µl (Amersham)W1-Detergens (Polyoxyethelene ether, Kat.-Nr. P 7516, Sigma)6-MW-Primer 2,5 mM (Oligo‘s-U-Like, Cambridge, UK)dNTP-Mix: dATP, dCTP, dTTP, dGTP je 2,5mM (PCR-Kit K-1220-02D, Invitrogen)


Sekundäre DOP-PCR50 µl Ansatz

Volumen Endkonzentration

10x PCR-Puffer 5 µl pH 9,0Tris-HCl 10 mMKCl 50 mMMgCl2 1,5 mM

25 mM MgCl2 1 µl 0,5 mM (gesamt 2 mM)20 µM 6-MW-Primer 5 µl 2 µMd NTP-Mix: jeweils 2,5 mMdATP, dCTP, dGTP, dTTP

5 µl jeweils 250 µMdATP, dCTP, dGTP, dTTP

0,05% W1-Detergens 2,5 µl 0,0025 %Taq-Polymerase 0,3 µl 0,09 U/µlH2O bidest. 29,2 µlTemplate 2 µl


30 hoch stringente Zyklen: 94 °C 1 min 3062 °C 1 min 3072 °C 1 min 30

72 °C 8 min

2.3 Markierung von DNA-Proben für die Fluoreszenz in situHybridisierung

2.3.1 Probenmarkierung mit DOP-PCR

Material:

10x PCR-Puffer (Pharmacia)Taq-DNA-Polymerase 5U/µl (Pharmacia)25 mM MgClW1-Detergens (Polyoxyethelene ether, Kat.-Nr. P 7516, Sigma)6-MW-Primer 2,5 mM (Oligo‘s-U-Like Cambridge, UK)dATP, dCTP, dGTP, dTTP (Boehringer Mannheim)

Biotin-16-dUTP (Kat.-Nr. 1 093 070, Boehringer Mannheim)Digoxigenin-11-dUTP (Kat.-Nr. 1 093 088, Boehringer Mannheim)Cy3-AP3-dUTP (Kat.- Nr. PA53022, Amersham)Cy5-AP3-dUTP (Kat.- Nr. PA55022, Amersham)


Markierungs-DOP-PCR50 µl PCR-Ansatz

Volumen Endkonzentration

10x PCR-Puffer 5 µl pH 9,0Tris-HCl 10 mMKCl 50 mMMgCl2 1,5 mM

25 mM MgCl2 1 µl 0,5 mM (gesamt 2 mM)20 µM 6-MW-Primer 5 µl 2 µMdNTP-Mix: jeweils 2 mMdATP, dCTP, dGTP,1,6 mM dTTP

5 µl jeweils 200 µMdATP, dCTP, dGTP,160 µM dTTP

1 mM dUTP* 2 µl* / 4 µl° 40 µM* / 80 µM°0,05% W1-Detergens 2,5 µl 0,0025 %Taq-Polymerase 0,3 µl 0,01 U/µlH2O bidest. 27,2 µl* / 25,2 µl°Template (ca. 200 ng) 2 µl

* Markierung mit Biotin-dUTP, Digoxigenin-dUTP° Markierung mit Cy3-dUTP, Cy5-dUTP


25 hoch stringente Zyklen: 94 °C 1 min 3062 °C 1 min 3072 °C 1 min 30

72 °C 8 min

2.3.2 Probenmarkierung mit Nicktranslation

Eine Markierung mit Estradiol-dUTP, das im alkalischen Milieu der PCR nicht stabil ist,wurde ebenso wie die Biotin-Markierung von Cot-1-DNA über eine Nicktranslation durch-geführt.

Material:

10x NT-Puffer: 0,5 M Tris-HCl pH 7,5, 50 mM MgCl2, 0,5 mg/ml BSA0,1 M Mercaptoethanol0,5 M EDTAdATP, dCTP, dGTP, dTTP (Boehringer, Mannheim)

Estradiol-15-dUTP (Kat.-Nr. 1 966 430, Boehringer Mannheim)Biotin-16-dUTP (Kat.-Nr. 1 093 070, Boehringer Mannheim)

DNAse I (Kat.-Nr. 104159, Boehringer Mannheim)Stammlösung: 1 mg/ml in 0,5 ml 0,3 M CaCl + 0,5 ml GlycerolDNA-Polymerase I , Kornberg-Fragment 5 units/µl(Kat.-Nr. 104485, Boehringer Mannheim)


100 µl-Nicktranslations-Ansatz Volumen Endkonzentration10x NT-Puffer 10 µl 1 x :

50 mM Tris-HCl , pH 7,55 mM MgCl250 µg/ml BSA

0,1 M Mercaptoethanol 10 µl 10 mMdNTP-Mix:je 0,5 mM dATP, dCTP, dGTP0,1 mM dTTP

10 µl jeweils50 µM dATP, dCTP, dGTP10 µM dTTP

1 mM Est-dUTP 2 µl 20 µMDNAse 1:1000 (=1 µg/ml) 2 µl 20 ng/mlDNA-Polymerase I 2 µl 0,1 units/µl = 100 units/ml 2 µg DNA-Probe 20 µl 20 µg /mlH2O bidest. 44 µl

Durchführung:

• Inkubation 90 min bei 15 °C• Asservierung des Ansatzes auf Eis• Test der Probenlänge in 1% Agarosegel - Ziel: Fragmentlänge 300 – 800 Bp• Stop der Reaktion mit 1 µl 0,5 M EDTA

2.3.3 Herstellung von DNA-Sonden-Pools für Mehrfarben Fluoreszenzin situ Hybridisierung

Die Generierung von DNA-Sonden-Pools für Mehrfarben-FISH folgte im wesentlichen demRoberts et al. 1999 beschriebenen Ansatz. Von sekundären PCR-Amplifikaten wurdenProben-Pools mit dem Ziel einer gleichmäßigen Signalintensität aller Einzelproben herge-stellt. In die Proben-Pools wurden pro Einzelprobe je nach Chromosomengröße undSignalintensität zwischen 2 und 6 µl eingesetzt. Die primären Pools, bestehend aus n Ein-zelproben, wurden mit Ethanol präzipitiert und in n x 2µl H2O bidest. gelöst. Von jedemPool wurden jeweils 2 µl in eine weitere DOP-PCR eingesetzt. Die dadurch gewonnenensekundären Pools wurden durch DOP-PCR mit Biotin oder Digoxigenin markiert oder nacheiner zweiten unmarkierten DOP-PCR-Amplifikation durch Nicktranslation mit Estradiolmarkiert (siehe 2.2.8).

Die markierten Proben-Pools wurden zunächst einzeln auf Metaphasechromosomen hybridi-siert und hinsichtlich der Signalintensität ihrer Einzelproben überprüft. Bei zu geringerSignalstärke wurden die Einsatzmengen der Einzelproben entsprechend variiert.


Ansatz von Sonden-Pools zur Darstellung von Makro-, Mikro- und intermediärenChromosomen:

Makrochromosomen 1–5+Z 5 intermediäre Chromosomen 9 MikrochromosomenProbe Volumen [µl] Probe Volumen [µl] Probe Volumen [µl]F1 6 F13 2 F14 2F2 6 F15 2 F16 2F3 4 F9 2 F17 2F18 2 F10 2 F11 2F6 2 F12 2 F8 2

Ansatz von Sonden-Pools für M-FISH zur verschiedenfarbigen Darstellung derChromosomen 1 – 6 + Z mit drei Fluorochromen:

Pool 1 Pool 2 Pool 3Chr. (Probe) Menge [µl] Chr. (Probe) Menge [µl] Chr. (Probe) Menge [µl]1 (F1) 6 2 (F2) 6 3 (F3) 44 (F4) 4 4 (F4) 4 Z (F18) 25 (F6) 2 Z (F18) 2 5 (F6) 26 (F13) 2 6 (F13) 2 6 (F13) 2

Ansatz von Sonden-Pools für M-FISH zur verschiedenfarbigen Darstellung derChromosomen 1 – 8 +Z + 2 Mikrochromosomen mit 4 Fluorochromen:

Pool1 Pool 2 Pool 3 Pool 4Probe Menge[µl] Probe Menge[µl] Probe Menge[µl] Probe Menge[µl]F1 6 F2 6 F3 4 F4 4F18 4 F6 4 F6 4 F18 4F13 4 F13 2 F15 2 F15 2F9 2 F9 2 F9 2 F10 2F12 2 F10 2 F10 2 F12 2

F12 2

2.3.4 Präparation genomischer DNA von Gallus domesticus

Material:

Lysis-Puffer: 2 % SDS0,1 M EDTA0,2 M Tris-HCl, pH 8,0

Proteinase K (Boehringer Mannheim)2 % RNAse A (Kat.-Nr. 109 169, Boehringer Mannheim,) in 10 mM Tris-HCl pH 7,5 und15mM NaCl, erhitzt auf 90 °C über 15 min zur Inaktivierung von DNAse-Aktivität


Durchführung:

• Inkubation von je 4g zerkleinerte Hühnerleber in 50 ml Röhrchen in 25 ml Lysis-Puffer1 h bei 37 °C

• Zugabe von Protease K, Endkonzentration 0,1 mg/ml, Inkubation 24 h bei 50 °C inRollerinkubator.

• Zugabe von 10 ml 5 M NaCl-Lösung, Vortexen 15 Sekunden• Zentrifugation 15 min bei 3 800 U/min• Überführen des Überstandes je zur Hälfte in zwei neue 50 ml Röhrchen• Zugabe von 2 Vol EtOH, vorsichtiges Mischen durch Invertieren des Röhrchens und

Fischen der DNA mit sterilem Glashaken, zweimaliges Waschen in 70 % Ethanol, kurzeTrocknung bei RT

• Lösung der DNA in TE-Puffer pH 8,0 in Rollerinkubator bei 37 °C über ca.12 h• RNAse-Verdau, Endkonzentration 20 µg/ml, Inkubation 2 h bei 37 °C• Kontrolle der DNA in 1 % Agarose-Gel• Photometrische Messung der DNA-Konzentration• Ausbeute: ca. 5 mg DNA /g Gewebe

2.3.5 Präparation von Cot-1-DNA aus genomischer DNA

Als Cot-1-DNA wird die Fraktion doppelsträngiger DNA-Stücke bezeichnet, die manerhält, wenn man fragmentierte gesamtgenomische DNA denaturiert und bei definierterSalzkonzentration und Temperatur solange renaturieren läßt, bis Co × t = 1.Co = DNA-Ausgangskonzentration in Mol/l, t = Zeit in sec.Cot-1-DNA besteht so überwiegend aus hochrepetitiven Sequenzen der Ausgangs-DNA.

Material:

Nuklease S1 , Aktivität 400 U/µl, Boehringer Mannheim(1U = Abbau von 1 µg einzelsträngiger DNA pro Minute)2x Nuklease S1-Puffer, pH 4,2: 0,5 M NaCl, 2 mM ZnSO4, 60 mM Na-Acid,10 %Glycerol

PhenolChloroformIsoamylalkoholTE-Puffer pH 8,0: 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA

Ultraschall-Sonicator Model W220F, Heat Systems-Ultrasonic, USA

Durchführung:

• Ausgangsmenge 75 mg DNA in 10 ml TE-Puffer pH 8,2• Zerkleinerung der DNA in 50 ml Röhrchen auf Eis durch fraktionierte Ultrabeschallung

über 6 x 2 min und jeweils 2 min Abkühlung auf 300 – 600 bp Fragmente /Längenbestimmung in 1% Agarose-Gel

• DNA-Denaturierung bei 96 °C 6 min• Äquilibrierung bei 65°C 4 min


• Zugabe von 640 µl 5 M NaCl auf Endkonzentration 0,3 M• Reassoziation der DNA in 0,3 M NaCl bei 65 °C 45 sec• Stop der Reassoziation durch Zugabe von 10,6 ml eiskaltem 2x Nuclease-S1-Puffer• Zugabe von 10.000 U 25 Nuclease S1 und Inkubation 30 min bei 37 °C zur

Eliminierung nicht reassoziierter einzelsträngiger DNA• Phenolextraktion• Ethanol-Fällung• Resuspension in TE-Puffer auf Endkonzentration von 10 mg/ml

2.4 Präparation gespreiteter Metaphasechromosomen

Material:

Zellkultur siehe 2.1.1Demecolcine (Kat.-Nr. D1925, Sigma)

Durchführung:

Fibroblasten-Kulturen der 6. - 14. Passage in der exponentiellen Wachstumsphase in 250 mlKulturflaschen bei einer Dichte von ca. 85 % wurden 30 min mit Demecolcine, Endkon-zentration 100 ng/µl, inkubiert.

• Abgießen des Mediums in 50 ml Röhrchen• Spülen der Zellen mit 10 ml PBS• Ablösen der Zellen mit 5 ml Trypsin-EDTA 2 – 5 min bei 37 °C• Aufnahme der abgelösten Zellen mit 10 ml Medium in 15 ml Röhrchen• Zentrifugieren mit 1100 U/min 10 min• Absaugen des Mediums bis auf ca. 0,5 ml• langsame Zugabe von 9 ml 0,075 M KCl (37 °C)• Inkubation 10 min bei 37 °C• langsame Zugabe von 5 ml Fixativ = Methanol/Eisessig 1:3, vorsichtig mischen durch

Invertieren des Röhrchens• Abzentrifugieren mit 1100 U/min 7 min• Absaugen des Überstandes auf 0,5 ml, resuspendieren• tropfenweise Zugabe von Fixativ unter leichtem Schütteln bis auf 10 ml• Zentrifugieren mit 1100 U/min 7 min• Verringerung der Fixativmenge je nach Zahl der Metaphasen auf 2 – 4 ml• Lagerung der Suspension bei –20 °C• Auftropfen der –20 °C kalten Suspension auf mit Ethanol gereinigte Glasobjektträger• „Alterung“ der Metaphasepräparate für FISH

2 h bei 56 °C oder 1 – 2 Tage bei RT• Lagerung der Metaphase-Präparate mit Siccativ in versiegelter Kunsttoff-Box

bei –20 °C


2.5 Präparation von Zellkernen für 3D-FISH

Anzucht embryonaler Fibroblasten siehe 2.2.1Anzucht embryonaler Neuronen siehe 2.2.2

Material:

Paraformaldehyd (Merck, Braunschweig)1 x PBS (phosphate buffered saline) pH 7,4:140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 6,5 mM Na2HPO4,1,5 mM KH2PO4

Saponin (Serva, Heidelberg)Triton X-100 (Merck)Glycerol (Merck)Flüssigstickstoff1 N HCl

Durchführung:

• Isotone Fixierung in 1,3 % Paraformaldehyd in 0,5 x PBS, pH 7,4, 15 min bei RT• Waschen in PBS 3 x 3 min• Inkubation 0,5 % Saponin, 0,5 % Triton X-100 zur 20 min bei RT• 20 % Glycerol in PBS 30 min bei RT• dreimaliges Einfrieren in Flüssigstickstoff und Auftauen ohne Trocknung des Präparats• Waschen in PBS 3 x 3 min• 0,1 M HCl 5 min bei RT• 2 x SSC 1 x 5 min• 50 % Formamid , 50 % 2 x SSC, mindestens 30 Minuten, Lagerung bei 4 °C über

Monate möglich


2.6 Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)

2.6.1 Hybridisierung

Material:

Cot-1-DNA-Fraktion aus genomischer DNA von Gallus domesticus, 10 mg/ml (siehe 2.2.9)EthanolFormamid2xSSC (standard saline citrate) pH 7,0: 300 mM NaCl, 30 mM Na-CitratHybridisierungsmix: 50 % deionisiertes Formamid (v/v) in 10 % Dextransulfat / 1xSSCDeckgläser 15 x 15 mm, 18 x 18 mm, 22 x 22 mmFixogum, Marabuwerke GmbH, Tamm

Ansatz der Hybridisierungslösung:

Die Zugabe von unmarkierter Cot-1-DNA zur DNA-Sonde und die Inkubation bei 37 °C(nach der Proben-Denaturierung) vor der Hybridisierung (Preannealing) ermöglicht eineeffektive Suppression unerwünschter nicht-chromosomenspezifischer Hybridisierungs-signale. In der DNA-Sonde enthaltene hochrepetitive Sequenzen bilden Doppelsträngeuntereinander und mit den entsprechenden, im Überschuß vorhandenen Sequenzen derCot-1-DNA.

• Mischen von DNA-Sonden und Cot-1-DNA mit dem 2,5fachen Volumen Ethanol• Präzipitation 30 min bei –20 °C• Zentrifugation mit 13.500 U/min 20 min• Abpipettieren des Überstandes• Trocknung des Pellets und Lösung in Hybridisierungsmix in Schüttlerinkubator bei

45 °C in ca. 30 – 60 min

DNA-Endkonzentrationen der Hybridisierungslösung:

Sonden-Pool EinzelsondeMetaphase-FISH C = n x 20 ng/µl C = 10 - 20 ng/µlKonzentration

DNA-Sonde 3D-FISH C = n x 20 ng/µl C = 20 - 40 ng/µlGesamtkonzentration markierter DNA Cgesamt = m x C Cgesamt = m x CKonzentration Cot-1-DNA Cgesamt x 10 Cgesamt x 10

n = Zahl der in einem Pool enthaltenen chromosomenspezifischen Einzelproben m = Zahlder Sonden-Pools bzw. EinzelsondenDirektmarkierte Proben wurden jeweils in der doppelten Menge eingesetzt.

Je nach Hybridisierungsfläche (Deckglasgröße) wurden 3 (15x15 mm) – 10 µl (22x22 mm)Hybridisierungslösung aufgetragen.


Durchführung der Hybridisierung:

• DNA-Denaturierung der Hybridisierungslösung 5 min bei 75 °C• Inkubation der Hybridisierungslösung 30 min bei 37 °C für Preannealing

Metaphase-Präparate:• DNA-Denaturierung 90 sec in 70 % Formamid, 30 % 2x SSC pH 7,0 bei 70 °C• Dehydrieren in eiskaltem Ethanol 70 %, 90 %, 100 % jeweils 2 min• Aufbringen von10 µl Hybridisierungslösung auf den trockenen Objektträger unter Deck-

glas 22 x 22 mm und Versiegelung mit Fixogum.

3D-fixierte Zellkernpräparate:• DNA-Denaturierung 3D-fixierten Zellkern-Präparaten in 70 % Formamid, 30 % 2x SSC

2 min bei 70 °C• Abkühlung in eiskaltem 50 % Formamid, 50 % 2 x SSC• Auftragen von 5 µl Hybridisierungsansatz auf das von einem dünnen Flussigkeitsfilm

überzogene Präparat unter einem Deckglas 18 x 18 mm und Versiegelung mit Fixogum.

• Hybridisierung in einer feuchten Kammer 48 – 72 h bei 37 °C.

2.6.2 Detektion

Material:

2xSSC, (standard saline citrate) pH 7,0: 300 mM NaCl, 30 mM Na-Citrat0,1xSSC pH 7,0: 15 mM NaCl, 1,5 mM Na-Citrat2xSSCT = 2xSSC + 0,05 % Tween 204 % BSA (Rinderserumalbumin) (BSA Fraktion V, Boehringer Mannheim) in 2xSSCT

Avidin-Cy3 (Kat.-Nr. 003-160-083, Dianova/Jackson ImmunoResearch)Avidin-Cy3.5 (Amersham)Avidin-Cy5 (Kat.-Nr. 003-170-083, Dianova/Jackson ImmunoResearch)

Monoklonal Maus-anti-Digoxigenin (Kat.-Nr. D8165, Sigma)Polyklonal Kaninchen-anti-Estradiol (Kat.-Nr. D7782, Sigma)

Schaf-anti-MausIgG-FITC (Kat.-Nr. F-3008, Sigma)Schaf-anti-MausIgG-Cy3 (Kat.-Nr. 515-165-062, Dianova/Jackson ImmunoResearch)Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Cy5 (Kat.-Nr. PA 45004, Amersham)

DAPI (Kat.-Nr. Sigma)Einbettungsmedium: Vectashield (Vector, Burlingame, UK)

Die Konzentrationen der einzelnen Nachweiskomponenten wurden so gewählt, daß Negativ-Kontrollen (d. h. Detektion nach leerer Hybridisierung ohne DNA-Sonde) kein Signal imZellkern zeigten.


Detektionsschema bei simultaner Verwendung von 3 Fluorochromen:

Markermolekül Layer 1 Layer 2Biotin-dUTP Avidin-Cy3

1:500Digoxigenin-dUTP Maus-anti-Digoxigenin

1:500Schaf-anti-Maus-FITC1:500

Estradiol-dUTP Kaninchen-anti-Estradiol1:200

Ziege-anti-Kaninchen-Cy51:400

Detektionsschema bei kombinatorischer Markierung mit 4 Fluorochromen zurDarstellung der Chromosomen 1 – 8 + Z und 2 Mikrochromosomen in 11 Farben:

Markermolekül Layer 1 Layer 2Cy3-dUTPCy5-dUTPBiotin-dUTP Avidin-Cy3.5

1:500Digoxigenin-dUTP Maus-anti-Digoxigenin

1:500Schaf-anti-Maus-FITC1:500

Durchführung:

• Waschen der Präparate in 2 x SSC 2 x 5 min, 37 °C• Stringentes Waschen in 0,1 x SSC 2 x 5 min, 60 °C• Waschen in 2 x SSC 2 x 5 min, 37 °C

• Inkubationen unter Parafilm in feuchter Kammer bei 37 °C:• 5 % BSA in 2 x SSCT 15 min• Layer 1 und 2 jeweils 30 min

Nach Layer 1 und 2 jeweils 3 x 3 min Waschen in 2x SSC

• Gegenfärbung: DAPI 0,02 µg/ml in 2 x SSC 3 – 5 min

Metaphasepräparate wurden nach der Gegenfärbung mit dest. Wasser abgespült, inDunkelheit bei RT getrocknet und mit Vectashield eingebettet.

3D-Zellpräparate auf Deckgläsern 76 x 26 mm wurden nach der Gegenfärbung in 2xSSCgewaschen. Die feuchten Hybridisierungsareale wurden mit Vectashield und einem Deck-glas 60 x 24 mm eingedeckt und nach Trocknung des umgebenden Randes mit Nagellackversiegelt. Das große, die Zellen tragende Deckglas wurde abschließend mit der leeren Seitenach außen mit Fixogum auf einem Objektträger fixiert.

Die Präparate wurden unter Lichtabschluß bei 4 °C aufbewahrt.


2.7 Mikroskopie und digitale Bildverarbeitung

2.7.1 Epifluoreszenz-Mikroskopie

Zweidimensionale Fluoreszenz-Bilder wurden an einem Zeiss Axioplan 2 mit fünffachFilterrad, Zeiss Oberkochen, 100 Watt Quecksilberdampflampe, einem 63 x PlanApo-chromat Ölimmersions-Objektiv und einer Peltier-gekühlte CCD-Kamera CoolView,Photonic Science, Auflösung 753 x 576 Pixel, aufgenommen. Mikroskop und Bildaufnahmewurden gesteuert über einen Unix-Rechner mit der Software CytoVision, Applied ImagingCorporation, Sunderland, UK.

Filterblöcke für Zeiss-Axioplan 2:

Fluorochrom Absorptions-maximum[nm]

Emissions-maximum[nm]

Excitations-Filter [nm]

Strahlenteiler[nm]

Emissions-Filter[nm]

DAPI 358 461 Bandpass365 ± 12

FT 395 Langpass397

FITC 490 520 Bandpass450 - 490

FT 510 Bandpass515 - 565

Cy3 554 568 Bandpass546 ± 12


Cy5 652 672 Bandpass575 - 625


11-Farben M-FISH auf Metaphase-Präparaten wurden aufgenommen an einem LeicaDMRXA 550 CW Epifluoreszenz-Mikroskop, einem 63x PlanApochromat Ölimmersions-Objektiv und einer gekühlten s/w CCD-Kamera Sensys KAF 1400 von Photometrics,Tuxon, Arizona, Auflösung 1317 x 1035 Pixel unter Verwendung der QFISH-Software(Leica).

Filterblöcke für Leica DMRXA 550 CW:

Fluorochrom Absorptions-maximum[nm]

Emissions-maximum[nm]

Excitations-Filter [nm]

Strahlenteiler[nm]

Emissions-Filter[nm]

FITC 490 520 Bandpass475 ± 15

400 Bandpass522 ± 7,5

Cy3 554 568 Bandpass546 ± 5,5

557 Bandpass567 ± 15

Cy3.5 581 588 Bandpass580 ± 5


Cy5 652 672 Bandpass602 ± 19



2.7.2 Konfokale Laserscanning-Mikroskopie

Optische Serienschnitte von Zellkernen wurden mit einem inversen Zeiss LSM 410 Laser-Scanning-Mikroskop, Zeiss Jena, und einem 63x PlanApochromat Ölimmersions-Objektiv(numerische Apertur 1,4) mit der Steuerungssoftware LSM, Version 3.98 von Zeiss aufeinem PC unter Windows 95 aufgenommen.

Laser-Filter-Kombinationen des Zeiss LSM 410 Laser-Scanning-Mikroskops:

Laser Anregungs-Wellenlänge EmissionsfilterArgon 488 nm Bandpaß 510 - 525NeNe 543 nm Bandpaß 575 - 640HeNe 633 nm Langpaß > 665

In jeder Focus-Ebene wurden nacheinander Bilder für FITC, Cy3 und Cy5 aufgenommen.Das Makro für diesen Scan-Modus wurde von Dipl. Phys. Joachim Walter am Inst. f.Anthropologie und Humangenetik der LMU München programmiert. Die Laserleistung zurAnregung der Fluorochrome wurde so niedrig gesetzt, daß ein signifikantes Bleichenwährend des Scanvorgangs nicht auftrat. Für jeden Farbkanal wurde die Bildfläche 32 malabgerastert, und die Werte für jeden Bildpunkt gemittelt, um das Verhältnis von Signal undRauschen (= Effekt zufällig auf den Photomultiplier treffender Photonen) zu verbessern.Nachteil: bei einer Scan-Zeit von 34,8 Sekunden pro Fluorochrom und Bildebene dauertedas Scannen dickerer Zellkerne mehr als 1 h. Für jeden Farbstoff wurde so ein Stapel von8 Bit Grauwertbildern (256 Gaustufen) aus 512 x 512 Pixeln bei einer Pixelgröße von50 x 50 nm und einem Abstand von 250 nm zwischen den Schnitten erzeugt.

2.7.3 Allgemeine Bildverarbeitung

Die Einzelkanalbilder von Mehrfarben in situ Hybridisierungen wurden unter Zuweisungvon Falschfarben zu Farbbildern übereinandergelegt und im TIFF-Format gespeichert. BeiM-FISH-Experimenten mit vier Fluorochromen erfolgte dies mit QFISH-Software (Leica),bei FISH mit drei Fluorochromen wurden die Einzelbilder mit Hilfe von Adobe Photoshop,Version 4 zu RGB-Bildern zusammengefügt.

2.7.4 3D-Bildverarbeitung

Bei der Aufnahme konfokaler Serienschnitte mit dem Zeiss LSM 410 traten bauartbedingtzeitabhängige irreguläre Verschiebungen des Objekts im Bildausschnitt bis zu mehrerenMikrometern zwischen den einzelnen Scan-Ebenen auf („laterale Drift“). DieseVerschiebungen wurden mit Hilfe des Software-Tools Khoros 2.2, Khoral Research Inc.Albuquerque, New Mexico, USA und einem damit von Rainer Heintzmann am Institut f.angewandte Physik in Heidelberg (AG Prof. C. Cremer) entwickelten Programmausgeglichen. Gleichzeitig wurde die von der emitierten Wellenlänge abhängige Ver-schiebung der Signale in den einzelnen Farbkanälen gegeneinander („chromatischer Shift“)korrigiert. Khoros lief auf einem Intel-PC unter Linux.


Dekonvolution bezeichnet mathematische Verfahren zur Verbesserung der Bildinformation,der Korrektur von Verzerrungen und Unschärfen, die von außerhalb des Focus stammendenSignalanteilen hervorgerufen werden. Um die Rechenzeit zu verkürzen wurden die konfo-kalen Schnittbilder zuvor auf den Bereich des Zellkerns verkleinert (Software: Imaris,Version 2.7, Bitplane AG, Zürich). An den korrigierten und verkleinerten Bildstapelnwurde Dekonvolution unter Verwendung eines iteratativen Algorithmus, der MaximumLikelihood Estimation (MLE) durchgeführt (Software: Huygens 2, Scientific VolumeImaging b. v., Hilversum, The Netherlands). Da eine hinreichend genaue Messung derPointspread-Function aufgrund der „lateralen Drift“ (siehe oben) nicht möglich war wurdeeine theoretische Pointspread-Function zugrunde gelegt, die folgende Kenngrößen des opti-schen Systems berücksichtigte:• Pixelauflösung• Abstand der optischen Schnitt-Ebenen• numerischer Apertur des Objektivs• Pinhole-Größe (rückprojezierter Radius)• Refraktionsindex des Einbettungsmediums• Refraktionsindex des Immersions-Öls• Verhältnis von Signal zu Rauschen

Aus den restaurierten Bildstapeln wurden durch Isosurface-Rendering dreidimensionale, inallen Richtungen drehbare Computermodelle berechnet (Software: Imaris, Version 2,7,Bitplane AG, Zürich). Die Setzung des Schwellenwerts für das Rendering erfolgte interaktivim Vergleich mit den entsprechenden restaurierten optischen Schnittbildern. Die Modellewurden im Open-Inventor und im VRML-2-Format abgespeichert. Von den virtuellenModellen wurden Schnappschüsse aus einzelnen Blickwinkeln im TIFF-Format erstellt(Software: Amira, Konrad-Zuse-Institut, Berlin).

Imaris, Huygens2 und Amira liefen auf einer Silicon Graphics O2 Workstation unter IRIX6.5.


2.8 Quantitative Auswertung und Statistik

Die Verteilung von Makro- und Mikrochromosomen im Zellkern wurde von Johann vonHase am Institut für angewandte Physik der Universität Heidelberg (Arbeitsgruppe Prof. C.Cremer) an nicht entfalteten Rohbildern quantitativ analysiert. Die Auswertung erfolgtenach Korrektur von fokaler Drift und chromatischem Shift (siehe 2.6.3) an Projektionen vonzwei (Neuronen) bzw. drei (Fibroblasten) zentralen optischen Schnitten.

Um Unterschiede in der Gesamtsignalintensität zwischen den einzelnen Farbkanälen undverschiedenen Zellkernen auszugleichen wurden die Signalintensitäten normiert, d. h. derhöchste Intensitätswert wurde jeweils auf 255 gesetzt, die Abstufung der übrigen Werte ent-sprechend gespreizt. Für die Segmentierung der Zellkerngrenze wurden als Ersatz für eineKerngegenfärbung die Projektionen der drei Farbkanäle addiert. Die Segmentierung erfolgteausgehend vom Bildmittelpunkt durch eine Kantendetektion über einen Signalabfallzwischen benachbarten Pixeln. Alle außerhalb gelegenen Pixel wurden auf 0 gesetzt. DerMittelpunkt der segmentierten Fläche wurde als Kernmittelpunkt definiert. Die Kernflächewurde als Ellipse betrachtet und in 101 konzentrische Ringe mit jeweils konstantem Ver-hältnis zwischen kleinstem und größtem Radius unterteilt. Die Fläche der Ringe nimmt voninnen nach außen zu. Um die Werte der einzelnen Ringe vergleichen zu können, wurden fürjeden Farbkanal die Intensitätswerte der einzelnen Ringe summiert und durch die Anzahlder Pixel dividiert. Dies ergibt die mittlere Signalintensität der einzelnen Kernringe. Dane-ben wurde die mittlere Signalintensität der gesamten Kernfläche bestimmt. Die über dieFläche gemittelte Signalintensität repräsentiert die Dichte der markierten DNA. Die mittlereSignalintensität der einzelnen Kernringe wurde durch die mittlere Signalintensität der Kern-fläche dividiert. Dies ergibt die relative (mittlere) Signalintensität der einzelnen Kernringe.Nach Mittelung der Werte aller Zellkerne wurden die im Verhältnis zur mittleren Signal-intensität der gesamten Kernfläche relative Signalintensität der einzelnen Kernringe mitwachsendem Abstand zum Kernmittelpunkt graphisch dargestellt.

Für beide Zelltypen wurden die Verteilungskurven der Signalintensitäten bzw. der DNA-Dichte der drei Chromosomengruppen in einem zweiseitigen Kolmogorov-Smirnoff-Testpaarweise auf Gleichheit getestet.

Ergebnisse 34

3 Ergebnisse

3.1 Herstellung chromosomenspezifischer Sonden von Gallusdomesticus

Mit Hilfe der durchflußzytometrischen Sortierung wurden 17 Chromosomen-Fraktionengewonnen (Abb. 3.1). Zu ihrer Charakterisierung wurden im Flowsort-Karyogrammbenachbarte Sonden paarweise auf Metaphasen hybridisiert (Abb. 3.2). Dabei wurde dieHybridisierung hochrepetitiver, nicht für einzelne Chromosomen spezifischer Sequenzen mitunmarkierter Huhn-spezifischer Cot-1-DNA supprimiert. Die Sortierung lieferte 12chromosomenspezifische Sonden für die Makrochromosomen 1 – 8 + Z und drei großeMikrochromosomen. Drei Sonden detektieren jeweils zwei Mikrochromosomen, eineSonde drei, und eine Sonde 10 Mikrochromosomen (Tabelle 3.1). 9 kleine Microchro-mosomen sind in keiner Sonde erfaßt.

Abb. 3.1: Flowsort-Diagramm. Hoechst 33258 bindet an AT, Chromomycin A3 an GC.Mi = Mikrochromosom.

Tabelle 3.1: Chromosomenspezifische DNA-Sonden

Sonde Chromosom Sonde ChromosomF1 1 F10 Mi1F2 2 F12 Mi2F3 3 F14 Mi3, Mi4F4 4 F16 Mi5F18 Z F17 Mi6, Mi7F6 5 F11 Mi7, Mi8F13 6 F8 Mi9, Mi10, Mi11F15 7 F7 10 MicrochromosomenF9 8

Ergebnisse 35

Die Hybridisierung von Biotin-markierter Cot-1-DNA auf gespreitete Metaphase-chromosomen zeigt die Blöcke hochrepetitiver Sequenzen, die in der Cot-1-Fraktiongesamtgenomischer DNA repräsentiert sind und auf diese Weise supprimiert werden können(Abb. 3.3). Auffällig sind neben dem großen heterochromatischen Block am langen Armdes Z-Chromosoms Ausmaß und Heterogenität der Hybridisierung der Cot-1-Fraktion aufden insgesamt sehr gendichten Mikrochromosomen. 8 (Paar) Mikrochromosomen erschei-nen vollständig angefärbt, 19 enthalten intensiv gefärbte Blöcke unterschiedlicher Größe,nur drei lassen keine Hybridisierung erkennen.

Aus den chromosomenspezifischen Proben wurde ein Set von DNA-Sonden zur Darstellungder Makrochromosomen 1 – 8 und des Z-Chromosoms sowie der beiden größtenMikrochromosomen in 11 Farben durch kombinatorische Markierung mit vierFluorochromen hergestellt (Tab. 3.2, Abb. 2.4).

Tabelle 3.2: Markierungsschema für 11-Farben-FISH

ChromosomMarkierung1 2 3 4 5 6 7 8 Mi1 Mi2 Z

FITC + + + + + +Cy3 + + + + +Cy3.5 + + + + +Cy5 + + + + +

3.2 Die Anordnung von Makro- und Mikrochromosomen imZellkern

3.2.1 DNA-Sonden-PoolsFür die Untersuchung der größenabhängigen Verteilung von Chromosomen im Zellkernwurden aus den oben gewonnenen Sonden drei Pools gebildet:

• der Pool der größten Chromosomen (Pool 1) umfaßt die Makrochromosomen 1 – 5 + Z• der Pool mittelgroßer Chromosomen (Pool 2) die Chromosomen 6 – 10• 19 Mikrochromosomen wurden zum Pool 3 zusammengefaßt.

Zwischen Chr. 5 und 6 gibt es einen deutlichen Größensprung, ebenso zwischen Chromo-som 10 und den übrigen Mikrochromosomen. Die Chromosomen 1 – 5 + Z enthalten ca.69 %, die beiden anderen Gruppen repräsentieren jeweils etwa 13 % des Genoms (geschätztnach Smith und Burt 1998). 9 kleine Mikrochromosomen und damit rund 5 % dernukleären DNA sind nicht angefärbt.

Bei Suppression repetitiver Sequenzen mit Cot-1-DNA überschneiden sich auf Metaphase-chromosomen die Hybridisierungsbereiche der drei Sondenpools nicht (Abb. 3.5).

Ergebnisse 36

3.2.2 Makro- und Mikrochromosomen in kultivierten embryonalenFibroblasten

Die drei Sonden-Pools zeigen auch in den konfokalen Serienschnitten von Zellkernen –nachder Korrektur von fokaler „Drift“ und chromatischem „Shift„ (siehe 2.6.3) keine über diemikroskopische Auflösungsgrenze hinausgehende Signalüberlagerung.Bei hoher Signalintensität und Mittelung der Bildinformation aus multiplen Scanvorgängenliefern bereits die Rohbilder optischer Schnitte des Laserscanning-Mikroskops detailreichecharakteristische Signalmuster mit granulären Verdichtungen (Abb. 3.6). DieDekonvolution der Bildstapel zeichnet klare Konturen einer Chromatinstruktur aus Granulamit einem Durchmesser von 400 – 800 nm, die über Brücken miteinander verbunden sind(Abb. 3.6).

Aus den entfalteten Bildstapeln wurden durch Surface-Rendering dreidimensionale virtuelleModelle berechnet, die in alle Richtungen gedreht und von allen Seiten betrachtet werdenkönnen. Alle Voxel mit einer Signalintensität oberhalb eines Schwellenwerts werden voneiner Oberfläche, konstruiert aus einer großen Anzahl kleiner Dreiecke, überspannt. Abb.3.7 zeigt einer Serie optischer Schnitte durch einen Fibroblastenkern und das darausberechnete Modell, das veranschaulicht, wie sich die drei Chromosomengruppen an derunter der Kernmembran gelegenen Oberfläche verteilen.

Die auf Deckgläsern kultivierten embryonalen Fibroblasten sind heterogen hinsichtlich ihrerProliferationsaktivität und Zellzyklusposition. So ergab die Puls-Markierung parallelerKulturen mit BrdU unter identischen Wachstumsbedingungen eine S-Fraktion zwischen 5und 15 %. Nicht selten sind polyploide Kerne zu beobachten. Die große Variabilität vonKernform- und Größe wird ebenso wie die Bandbreite der möglichen Verteilungsmuster derdrei Chromosomengruppen an einer Galerie von zentralen Schnittbilder und dazugehörigenModellansichten zufällig ausgewählter Kerne deutlich (Abb. 3.8 ). Bei aller Vielfalt sindMakro- und Mikrochromosomen nicht wahllos im Kern verteilt: Die Makrochromosomendehnen sich entlang der Innenseite der Kernhülle aus und ragen unterschiedlich weit insKerninnere. Mikrochromosomen liegen nicht verstreut im Zellkern vor, sondern formenCluster, die sich überwiegend um die Nukleoli herum und im Bereich zwischen denNukleoli anordnen, jedoch zum Teil auch bis zur Kernoberfläche reichen und dort zwischenden bevorzugt peripher liegenden Makrochromosomen sichtbar werden (Abb. 3.7 und 3.8.)

3.2.3 Makro- und Mikrochromosomen während der Mitose

Die Anordnung von Makro- und Mikrochromosomen in Prometaphase-Rosetten ist ausge-sprochen einheitlich: In Prometaphase-Rosetten bilden die Mikrochromosomen einenzentralen, gelegentlich runden, häufig sternförmigen Cluster, der von einem mehr oderweniger geschlossenen Kranz aus Makrochromosomen umgeben ist (Abb. 3.9). DieseAnordnung bleibt auch noch während Ana- und Telophase erhalten (Abb. 3.10). DieGruppe der Chromosomen 6 – 10 hat Anteile am Rosettenzentrum und –Rand entsprechendihrer Zusammensetzung aus kleinen Makro- und großen Mikrochromosomen (Abb. 3.9).Aus dem Vergleich der Prometaphase-Rosetten mit den Zellkernen läßt sich das Außmaßvon Chromatin-Umlagerungen vor und nach der Zellteilung ablesen.

Ergebnisse 37

3.2.4 Makro- und Mikrochromosomen in kultivierten embryonalenNeuronen

Die auf Deckgläsern ausgesäten embryonalen Neuronen teilten sich unter den gegebenenKulturbedingungen nicht. Die sessilen Zellen bildeten im Verlauf von 7 Tagen nach Aussaatein Netzwerk verzweigter Neuriten. In dieser Zeit mußte das Kulturmedium aufgrund einesraschen pH-Abfalls als Zeichen hoher Stoffwechselaktivität alle 24 h erneuert werden. DieZellkerne der neuronalen Zellen sind im Vergleich zu den Fibroblasten gekennzeichnetdurch eine relativ einheitliche halbkugelige Form. Die der Schnittfläche der Halbkugelentsprechende Kernseite ist der Glasoberfläche zugewandt. Es finden sich homogeneVerteilungsmuster der drei Chromosomengruppen: Die Mikrochromosomen formen Clusterum die großen Nukleolen mit Verbindung zur Kernoberfläche. Die Makrochromosomenerscheinen bis auf wenige Ausläufer, die weiter ins Kerninnere ragen, an den Kernrandgedrückt (Abb. 3.11 und 3.12).

3.2.5 Quantitative Auswertung

Von Johann von Hase (Arbeitsgruppe Prof. C. Cremer , Institut für angewandte Physik derUniversität Heidelberg) wurde an zentralen optischen Schnittbildern von 28 embryonalenFibroblasten und 21 embryonalen Neuronen die Verteilung der drei Chromosomengruppenim Zellkern quantitativ analysiert. Die Verteilung der Chromosomen in axialer Richtungwurde dabei vernachlässigt. Die Kernfläche wurde als Ellipse betrachtet und in 100konzentrische Ringe mit jeweils konstantem Verhältnis zwischen kleinstem und größtemRadius unterteilt. Für jede Chromosomengruppe wurden die mittlere Signalintensität dergesamten Kernfläche und der einzelnen Kernringe bestimmt. Die über die Fläche gemittelteSignalintensität repräsentiert die Dichte der markierten DNA.

Abb. 3.13 zeigt die relative Signalintensität der drei Chromosomengruppen in Abhängigkeitvon der Entfernung zum Kernmittelpunkt. Die Signalintensitäten der drei Chromosomen-gruppen weichen drastisch von einer gleichmäßigen Verteilung ab. Bei der Interpretationder Verteilungskurven ist die Kernmorphologie zu berücksichtigen. So ist die Verteilung derDNA-Dichte über die Kernfläche abhängig von Lage und Form der Nukleolen. Die Fibro-blasten zeigen eine große Heterogenität der Kerngröße und –form in Abhängigkeit vonProliferations-Aktivität und Zellzyklusposition. Sie sind verhältnismäßig flach, die an denlichtoptischen Medianschnitten durch die Zellkerne bestimmte Kernfläche ist im Mittel2,75fach größer als die der Neuronen. Die Position der beiden Nukleolen ist höchst varia-bel, sie liegen überwiegend getrennt und außerhalb des Kernmittelpunkts. In den imVergleich zu den Fibroblasten hinsichtlich Größe und Morphologie homogenen, halb-kugeligen Neuronen wird der Kernmittelpunkt überwiegend von den Nukleolen besetzt,entsprechend gering ist die DNA-Dichte in den zentralen Kernringen.

In beiden Zelltypen liegt die höchste DNA-Dichte der Mikrochromosomen näher am Kern-mittelpunkt als die der größeren Chromosomen. In beiden Zelltypen sind dieVerteilungskurven der Signalintensität bzw. der DNA-Dichte der drei Chromosomen-gruppen hoch signifikant voneinander verschieden. Ein paarweise durchgeführterzweiseitiger Kolmogorov-Smirnoff-Test ergab jeweils für alle drei Verteilungspaare eineWahrscheinlichkeit für die Hypothese einer gleichförmigen Verteilung des Chromatins der

Ergebnisse 38

drei Chromosomengruppen von weniger als 0,006 %. Diese Hypothese war also abzu-lehnen.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110relativer Radius

rela

tive

Inte

nsitä

t

Makrochromosomen 1 - 5 + Z Chromosomen 6 - 10 19 Mikrochromosomen

Embryonale Fibroblastenn=28

00,25

0,50,75

11,25

1,51,75

22,25

2,5

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110relativer Radius

rela

tive

Inte

nsitä

t

Makrochromosomen 1 - 5 + Z Chromosomen 6 - 10 19 Mikrochromosomen

Embryonale Neuronenn=21

Abbildung 3.13: relative mittlere Signalintensität (Intensitätsdichte) der dreiChromosomengruppen in Abhängigkeit von der Entfernung zum Kernmittelpunkt. DieAbszisse zeigt den relativen Radius (Radius der gesamten Kernfläche = 100), die Ordinatezeigt die relative mittlere Signalintensität der einzelnen Kernringe ± Standardabweichung(mittlere Signalintensität der gesamten Kernfläche = 1).

Ergebnisse 39

Die Verteilung der Chromosomen 6 – 10 entspricht ihrer Zusammensetzung aus kleinenMakro- und großen Mikrochromosomen. Bei den Fibroblasten weist die DNA-Dichte einzentrales und ein peripheres Maximum auf, in den Neuronen liegt das Dichte-Maximumzwischen dem der Makro- und Mikrochromosomen.

3.3 Verschiedenfarbige Darstellung der Makrochromosomen1 – 6 + Z im Zellkern

3.3.1 DNA-Sonden-Pools

Das Markierungsschema zur Darstellung der Makrochromosomen 1 – 6 + Z in 7 Farbenzeigt Tabelle 3.3. An Metaphasechromosomen sind die 7 homologen Chromosomenpaareproblemlos zu unterscheiden (Abb. 3.14). Bei zwei- und dreifach markierter Chromosomensind die Einzelsignale deutlich schwächer als das Signal der einfach markierten Chromo-somen. Gleichzeitig zeigen zwei- und dreifach markierte Chromosomen ein scheckigesAnfärbungsmuster der einzelnen Fluorochrome.

Tabelle 3.3: Markierungsschema 7-Farben-FISH

ChromosomMarkierung1 2 3 4 Z 5 6

FITC + + + +Cy3 + + + +Cy5 + + + +

3.3.2 Die Chromosomen 1 – 6 + 7 in embryonalen Fibroblasten

Die dargestellten Chromosomen zeigen alle eine territoriale Anordnung. Alle 7 Chromo-somenpaare können auch im einzelnen konfokalen Schnittbild eines Paraformaldehyd-fixierten Zellkerns identifiziert werden (Abb. 3.15 A). Zwei- und dreifach markierteChromosomen weisen ein scheckiges Anfärbungsmuster der einzelnen Fluorochromen auf,die nach Dekonvolution der Bildstapel noch deutlicher hervortreten (Abb. 3.15 B). Neben-einander liegende zwei- und dreifach markierte Chromosomenterritorien lassen sich gutabgrenzen. Die Identifizierung und sichere Abgrenzung von zwei- und dreifach markierten,übereinanderliegenden Chromosomen bereitet dagegen aufgrund der geringen axialenmikroskopischen Auflösung Schwierigkeiten.

Insbesondere nach Dekonvolution der Bildstapel erscheinen die Makrochromosomen auf-gebaut aus Granula mit einem Durchmesser von 400 – 800 nm, die über Brückenmiteinander verbunden sind und deren Packungsdichte lokal variiert (Abb. 3.15 und 3.16).Diese Architektur bedingt komplex gefaltete Oberflächen der Chromosomenterritorien. DieDekonvolution liefert ein Bild klar begrenzter Chromosomen-Territorien, deren Grenz-flächen jedoch teilweise eine Verzahnung randständiger Granula bis hin zu einemausgeprägten Ineinandergreifen tiefer Ein- und Ausstülpungen von „Chromatinzungen“aufweisen.

Ergebnisse 40

Die relative Anordnung der Chromosomenterritorien in diploiden Zellkernen

Die untersuchten Fibroblastenkerne lassen keine starre wechselseitige Anordnung derMakrochromosomen erkennen. Vielmehr erscheinen die Lagebeziehungen zwischen deneinzelnen polymorphen Makrochromosomen höchst variabel. Dies läßt sich auch amwechselnden Auftreten einer Zusammenlagerung homologer Chromosomen ablesen (Abb.3.15, 3.16). Tabelle 3.4 gibt die Häufigkeit einer solchen Homologen-Assoziation derChromosomen 1 – 5 in 20 diploiden Fibroblastenkernen an. Möglicherweise unterscheidensich die einzelnen Makrochromosomen in der Häufigkeit, mit der ihre Homologen direktaneinander grenzen. So wurde nur in 2 von 20 Kernen eine Homologen-Assoziation vonChromosom 5, jedoch in 11 von 20 Kernen eine Homologen-Assoziation von Chromosom 4beobachtet. In 4 Kernen fanden sich keine, in immerhin 5 von 20 Kernen gleichzeitig3 Homologen-Assoziationen (Tab. 3.5).

Die relative Anordnung der Chromosomenterritorien in tetraploiden Zellkernen

Die sehr variable Anordnung der Makrochromosomen in tetraploiden Zellkernen lassenkeine Separation der beiden diploiden Chromosomensätze erkennen (Abb. 3.18).

Tabelle 3.4: Homologen-Assoziation der Chromosomen 1 – 5 in 20 Fibroblasten

Chromosom Homologen-Assoziation1 62 63 54 115 2

Tabelle 3.5 Anzahl von Homologen-Assoziationen der Chromosomen 1 – 5 pro Zellkern

Anzahl derKerne

Anzahl der Homologen-Assoziationen

4 07 14 25 3

Die relative Anordnung der Chromosomenterritorien in Geschwisterkernendoppelkerniger Zellen

Eine identische bzw. symmetrische Anordnung der Makrochromosomen in Geschwister-kernen doppelkerniger Zellen ist ein starkes Indiz dafür, daß die zirkuläre Anordnung bzw.Abfolge der Makrochromosomen in der Ursprungs-Prometaphase-Rosette noch erhalten ist.Diese Geschwisterkerne können so Aufschluß über die Anordnung der Makrochromosomenin der Prometaphase-Rosette geben. Diese Zellkerne vermitteln auch einen Eindruck, wiesich die Chromosomenterritorien allmählich gegeneinander verschieben. Im Vergleich

Ergebnisse 41

verschiedener Kernpaare ist die zirkuläre Abfolge der Makrochromosomen ganzunterschiedlich (Abb. 3.18). Dies spricht klar gegen die Annahme einer festgelegtenAnordnung der Chromosomen in der Prometaphaserosette.

3.3.3 Die Chromosomen 1 – 6 + Z in embryonalen Neuronen

In den embryonalen Neuronen ist die topographische Analyse der Chromosomen aufgrundder halbkugeligen Form, des kleineren Querschnitts und der größeren Dicke schwieriger alsin den Fibroblasten. Darüberhinaus ist die Form der Chromosomen noch unregelmäßiger,die Oberfläche noch komplexer gefaltet. Dekonvolution enthüllt auch bei den Neuronenüber Brücken verbundene Chromatingranula mit einem Durchmesser von 300 – 800 nm.Die einzelnen Granula erscheinen insgesamt im Vergleich zu den Fibroblasten insbesonderein perinukleolären Bereichen lockerer gepackt (Abb. 3.18). Chromatinausläufer können weitaus dem übrigen Chromosomenterritorium heraus- und in Einfaltungen von Nachbar-chromosomen hineinragen. Die Makrochromosomen erstrecken sich großflächig an derInnenseite der Kernhülle mit Ausläufern, die ins Kerninnere vorstoßen. BenachbarteChromosomen zeigen typischerweise eine Verzahnung randständiger Chromatingranula.

Wie bei den Fibroblasten erscheint die relative Anordnung der Makrochromosomenzueinander höchst variabel. Sie ist jedoch aufgrund der zum Teil hochkomplexen Form dereinzelnen Chromosomenterritorien noch schwieriger zu erfassen. Auch bei den Neuronen isthäufig ein Kontakt homologer Makrochromosomen zu beobachten.

Ergebnisse 42

3.4 Farbabbildungen

Abbildung 3.2: Überprüfung der DNA-Sonden auf ihre Spezifität. Über eine durchfluß-zytometrische Sortierung wurden 17 Chromosomenfraktionen gewonnen und mittels DOP-PCR amplifiziert. Zu ihrer Charakterisierung wurden im Flowsort-Karyogrammbenachbarte Sonden paarweise auf Metaphasen hybridisiert. Eine Hybridisierung derSonden auf hochrepetitive, nicht für einzelne Chromosomen spezifische Sequenzen wurdemit unmarkierter Cot-1-DNA, die aus genomischer Hühner-DNA gewonnen wurde,supprimiert. Am DAPI-gefärbten Präparat sind bereits die Makrochromosomen 6 – 8 häufignicht mehr sicher zu identifizieren. FITC = grün, Cy3 = rot. Mi = Mikrochromosom.Links jeweils FISH, rechts Gegenfärbung mit DAPI.

Ergebnisse 43

Ergebnisse 44

Abbildung 3.3: Hybridisierung von Huhn-spezifischer Cot-1-DNA auf Metaphase. DieHybridisierung von Biotin-markierter Cot-1-DNA auf gespreitete Metaphasechromosomenzeigt die Blöcke hochrepetitiver Sequenzen, die in der Cot-1-Fraktion gesamtgenomischerDNA repräsentiert sind und auf diese Weise supprimiert werden können. Auffällig sindneben dem großen heterochromatischen Block am langen Arm des Z-Chromosoms Ausmaßund Heterogenität der Cot-1-Hybridisierung auf den insgesamt sehr gendichtenMikrochromosomen. 8 (Paar) erscheinen vollständig angefärbt, 19 enthalten intensivangefärbte Blöcke unterschiedlicher Größe, nur 3 lassen keine sichere Hybridisierungerkennen. (A) Signal Cot-1-DNA rot (Cy3), DAPI blau. (B) Signal Cot-1. (C) DAPI.

Ergebnisse 45

Ergebnisse 46

Abbildung 3.4 (oben): 11-Farben-FISH auf Metaphase. Aus den chromosomenspe-zifischen Proben wurde ein Set von DNA-Sonden zur Darstellung der Makrochromosomen1 – 8 und des Z-Chromosoms sowie der beiden größten Mikrochromosomen in 11 Farbendurch kombinatorische Markierung mit vier Fluorochromen hergestellt. Dazu wurden ausden Einzelsonden vier Pools gebildet und durch DOP-PCR-Amplifikation markiert.(A) FISH, Farbbild, für das die vier digitalen Einzelkanalbilder unter der Zuweisung vonFalschfarben übereinander gelegt wurden (QFISH-Software, Leica). (B) GegenfärbungDAPI.

Markierungsschema für 11-Farben-FISH:

ChromosomMarkierung1 2 3 4 5 6 7 8 Mi1 Mi2 Z

FITC + + + + + +Cy3 + + + + +Cy3.5 + + + + +Cy5 + + + + +

Abbildung 3.5 (unten): Selektive Anfärbung von Makro- und Mikrochromosomen sowieChromosomen mittlerer Größe auf Metaphase. Für die Untersuchung der größenab-hängigen Verteilung von Chromosomen im Zellkern wurden aus den einzelnen Sonden dreiPools gebildet und jeweils unterschiedlich markiert. Nach Suppression repetitiver Sequenzenmit Cot-1-DNA zeigen die drei Sondenpools keine Überschneidung in ihrer Hybridisierung.(A) Makrochromosomen 1 – 5 + Z rot (Cy3), Chromosomen 6 – 10 blau (Cy5) und 19Mikrochromosomen grün (FITC). (B) Gegenfärbung DAPI. (C) Die Einzelkanalbilder.

Ergebnisse 47

Ergebnisse 48

Abbildung 3.6: Die Chromatinstruktur von Makro- und Mikrochromosomen imZellkern eines embryonalen Fibroblasten im konfokalen Rohbild und nachBildrestaurierung. Chromosomen 1 – 5 + Z rot (Cy3), 6 – 10 blau (Cy5) und Mikro-chromosomen grün (FITC). (A) Transmissionsbild. Deutlich sind die Nukleolen zu sehen.Gallus domesticus besitzt zwei, auf einem Mikrochromosomenpaar gelegene Nukleolenbil-dungsorte (NORs, „nucleolus organizing regions“). Zellkerne weisen somit zwei Nukleolenauf, die konfluieren können. (B) Zentraler optischer Schnitt, Rohbild. (C) Optischer Schnittnach Dekonvolution. (D) Rohbilder der einzelnen Farbkanäle. (E) Bilder der Einzelkanälenach Dekonvolution. Sowohl die insgesamt genarmen Makrochromosomen als auch die ins-gesamt gendichten Mikrochromosomen erscheinen aufgebaut aus granulärenChromatindomänen von etwa 400 – 800 nm. Die Makrochromosomen besetzen dieKernperipherie und erstrecken sich unregelmäßig weit ins Kerninnere, während dieMikrochromosomen einen zentralen an die Nukleolen grenzenden Cluster bilden, der sichstellenweise bis zum Kernrand ausbreitet.

Ergebnisse 49

Ergebnisse 50

Abbildung 3.7: Makro- und Mikrochromosomen im Zellkern eines kultiviertenembryonalen Fibroblasten. Aus den restaurierten (entfalteten) konfokalen Serienschnittenwurden mittels Surface-Rendering dreidimensionale Computermodelle der kollektivenTerritorien der drei Chromosomengruppen unterschiedlicher Größe berechnet. Dabeiwurden alle Bildpunkte oberhalb eines bestimmten Schwellenwerts mit einer Oberflächeüberzogen. Ein zusammengesetztes Modell der drei Chromosomengruppen ermöglichtgleichsam den Blick auf die unter der Kernmembran gelegene Chromatin-Oberfläche.Chromosomen 1 – 5 + Z rot (Cy3), 6 – 10 blau (Cy5) und Mikrochromosomen grün(FITC). (A) Serie optischer Schnitte im Abstand von 250 nm nach Dekonvolution.(B)Transmissions-Bild. (C) Surface-Rendering-Modell. Links: Schrägsicht auf eine isolierteRekonstruktion der Mikrochromosomen. Mitte: Schrägsicht auf die Kernoberseite. Rechts:Sicht auf die abgeflachte, dem Deckglas zugewandte Kernunterseite.

Ergebnisse 51

Ergebnisse 52

Abbildung 3.8: Verteilungsmuster von Makro- und Mikrochromosomen in Zellkernenembryonaler Fibroblasten. Die auf Deckgläsern kultivierten Zellen bildeten eine Misch-population aus nicht-proliferierenden und proliferierenden Zellen. In den polymorphen,meist flachen und länglichen Fibroblastenkernen dehnen sich die Makrochromosomen inder Kernperipherie aus und ragen unterschiedlich weit ins Kerninnere, während die Mikro-chromosomen nicht disseminiert im Zellkern liegen, sondern sich zu einem oder mehreren,getrennten Clustern zusammenlagern, die schwerpunktmäßig im Kerninneren um dieNukleolen angeordnet sind. Dabei grenzen regelmäßig Mikrochromosomen in wechselndemAusmaß auch an den Kernrand. Chromosomen 1 – 5 + Z rot (Cy3), 6 – 10 blau (Cy5) undMikrochromosomen grün (FITC). (A) Zentrale optische Schnitte nach Dekonvolution. (B)Dreidimensionale Computermodelle (Surface-Rendering). Schrägsicht auf die Kernoberseite(links), Schrägsicht auf die abgeflachte Unterseite, mit der die Zellen auf dem Deckglassitzen (rechts). Dabei ist die im Vergleich zur lateralen Auflösung deutlich geringere axialeAuflösung des konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops zu erkennen.

Ergebnisse 53

Ergebnisse 54

Abbildung 3.9 (oben): Anordnung von Makro- und Mikrochromosomen inPrometaphase-Rosetten embryonaler Fibroblasten. In Prometaphaserosetten bilden dieMikrochromosomen stets einen zentralen, teils runden, häufig sternförmigen Cluster,umgeben von einem mehr oder weniger geschlossenen Kranz aus Makrochromosomen.

(A) Beispielhafte Rosetten in Epifluoreszenz-Aufnahmen. Rechts FISH: Makro-chromosomen 1 – 5 + Z rot (Cy3), und Mikrochromosomen grün (FITC), links jeweilsDAPI-Färbung.

(B – D) Prometaphase-Rosette. (B) DAPI-Färbung, Epifluoreszenz-Aufnahme. (C) Zen-traler konfokaler optischer Schnitt nach Dekonvolution. Chromosomen 1 – 5 + Z rot(Cy3), Chromosomen 6 – 10 blau (Cy5), Mikrochromosomen grün (FITC). Die Gruppe derintermediären Chromosomen verteilt sich auf Zentrum und Peripherie der Rosette.(D) SurfaceRendering-Modell, Blick auf die Oberseite (links) und die dem Deckglaszugewandte Unterseite (rechts).

Abbildung 3.10 (unten): Anaphase. Die strikte Anordnung von Makro- und Mikro-chromosomen in der Prometaphase kennzeichnet auch die Anaphase. (A) DAPI-Färbung,Epifluoreszenz-Mikroskopie. (B) zentraler optischer Schnitt nach Dekonvolution, Chromo-somen 1 – 5 + Z rot (Cy3), Mikrochromosomen grün (FITC). (C) Computermodell inAufsicht auf die dem Deckglas abgewandte Oberseite (links) und Seitenansicht (rechts). Inder Seitenansicht ist die im Vergleich zur lateralen Auflösung deutlich geringere vertikaleAuflösung des Laser-Scanning-Mikroskops zu erkennen.

Ergebnisse 55

Ergebnisse 56

Abbildung 3.11: Makro- und Mikrochromosomen im Zellkern eines kultiviertenembryonalen Neurons. Die neuronalen Zellen wurden aus dem Großhirn sieben Tage alterEmbryonen isoliert und über sieben Tage auf mikroskopischen Deckgläsern kultiviert. DieNeuronen teilten sich unter den Kulturbedingungenen nicht, sondern bildeten in dieser Zeitein Netzwerk verzweigter Neuriten aus. In den halbkugeligen Zellkernen, die mit ihrerflachen Unterseite dem Deckglas aufsitzen, bilden die Makrochromosomen einen äußeren,nach innen zu komplex begrenzten Chromatinmantel, während die Mikrochromosomeneinen stellenweise bis zum Kernrand reichenden Cluster um die großen Nukleolen formen.Aus restaurierten (entfalteten) konfokalen Serienschnitten wurden ebenfalls dreidimensionaleComputermodelle erstellt. Chromosomen 1 – 5 + Z rot (Cy3), Chromosomen 6 – 10 blau(Cy5) und Mikrochromosomen grün (FITC). (A) Zentraler optischer Schnitt, Rohbild.(B) Zentraler optischer Schnitt nach Dekonvolution. (C) Serie optischer Schnitte im Abstandvon 250 nm. (D) Transmissionsbild. (E) Surface-Rendering-Modell, Ansicht von oben(links) und unten (rechts).

Ergebnisse 57

Ergebnisse 58

Abbildung 3.12: Verteilungsmuster von Makro- und Mikrochromosomen in kultivier-ten embryonaler Neuronen. Im Vergleich zu den kultivierten embryonalen Fibroblastensind die neuronalen Zellen durch eine einheitliche Zellkernform und eine einheitlicheVerteilung von Makro- und Mikrochromosomen gekennzeichnet. Die Gruppe derintermediären Chromosomen 6 – 10 folgt in ihrer Verteilung teils den Makro-, teils denMikrochromosomen. Durch die großen Nukleolen erscheint je nach Schnittebene teilweisedas gesamte Chromatin an den Rand gedrückt. Chromosomen 1 – 5 + Z rot (Cy3),Chromosomen 6 – 10 blau (Cy5) und Mikrochromosomen grün (FITC). (A) Zentraleoptische Schnitte nach Dekonvolution. (B) Dazugehörige dreidimensionale Modelle, Sichtauf die unter der Kernmembran gelegene Chromatin-Oberfläche von oben (links) und vonunten (rechts).

Ergebnisse 59

Ergebnisse 60

Abbildung 3.14 (oben): Verschiedenfarbige Darstellung der Makrochromosomen 1 – 6+ Z durch kombinatorische Markierung mit drei Fluorochromen auf einer Metaphase(ZZ). An Metaphasechromosomen können die sieben Chromosomenpaare eindeutig überihre jeweilige Markierungskombination identifiziert werden. Eine genauere Betrachtungzeigt, daß im Gegensatz zu den homogen intensiv angefärbten einfach markiertenChromosomen (1, 2, 3) bei zwei- oder dreifach markierten Chromosomen dieSignalintensität der Einzelsignale ( C – E) teilweise deutlich geringer ist als bei den einfachmarkierten Chromosomen. Gleichzeitig ist die Anfärbung mit den einzelnen Fluorochromenteilweise unregelmäßig, und es entsteht im Farbbild, das aus den übereinander gelegtenEinzelkanalbildern besteht, ein scheckiges Mischfarbenmuster. (A) FISH, Farbbild. (B)DAPI-Gegenfärbung. (C – D) Einzelkanalbilder: (C) Cy-3-Signal, (D) FITC-Signal, (E)Cy5-Signal.

Abbildungen 3.15 (unten): Verschiedenfarbige Darstellung der Makrochromosomen 1 –6 + Z im Zellkern eines Fibroblasten durch kombinatorische Markierung mit dreiFluorochromen. Zentraler optischer Schnitt im Rohbild (A) und nach Dekonvolution (B).Die sieben dargestellten Chromosomenpaare besetzen abgegrenzte Territorien desZellkerns, die alle auch im Rohbild eines einzelnen konfokalen Schnittes eindeutigidentifiziert werden können, falls sie nebeneinander liegen. Liegen unterschiedlich zwei-bzw. dreifach markierte Territorien übereinander, bereitet die Identifizierung und sichereAbgrenzung aufgrund der geringen axialen Auflösung des konfokalen MikroskopsSchwierigkeiten. Zwei- oder dreifach markierte Territorien weisen durch ungleichmäßigeAnfärbung mit den einzelnen Fluorochromen ein scheckiges Mischfarbenmuster auf,dadurch wird die Abgrenzung der Territorien teilweise zusätzlich erschwert. NachBildrestaurierung (Dekonvolution) treten die Grenzen der Territorien und ihr Aufbau ausgranulären Chromatindomänen mit einem Durchmesser von 400 – 800 nm deutlich hervor.

Unten rechts: Markierungsschema.

Ergebnisse 61

Ergebnisse 62

Abbildung 3.16 (oben): Verschiedenfarbige Darstellung der Makrochromosomen 1 – 6+ Z im Zellkern eines diploiden embryonalen Fibroblasten. Zentraler konfokaler Schnittdurch einen diploiden Zellkern im Rohbild (A) und nach Dekonvolution (B). DieMakrochromosomen besetzen die Kernperipherie und ragen unregelmäßig weit insKerninnere vor. Die Dekonvolution zeichnet ein Bild klar begrenzter, unregelmäßiggeformter, aus lokal unterschiedlich dicht gepackten granulären Chromatindomänenaufgebauten Chromosomenterritorien mit komplex gefaltete Oberflächen. Die Grenzflächenzwischen benachbarten Territorien sind teilweise durch eine ausgeprägte Verzahnungrandständiger Granula bis hin zu tief ineinander greifenden Ein- und Ausstülpungengekennzeichnet sind. Die relative Anordnung der Makrochromosomen ist sehr variabel.Homologe Chromosomen können unmittelbar benachbart und weit voneinander getrenntliegen. Möglicherweise unterscheiden sich die verschiedenen Makrochromosomen in derHäufigkeit, mit der ihre Homologen direkt aneinander grenzen („Homologen-Assoziation“).So wurde nur in 2 von 20 Kernen eine Homologen-Assoziation von Chromosom 5, jedochin 11 von 20 Kernen eine Homologen-Assoziation von Chromosom 4 beobachtet. (C)Transmissionsaufnahme, N = Nukleolen.

Abbildung 3.17 (unten): Verschiedenfarbige Darstellung der Makrochromosomen 1 – 6+ Z in tetraploiden embryonalen Fibroblasten. Zentrale konfokale Schnitte durch zweitetraploide Zellkerne im Rohbild (A) und nach Dekonvolution (B). In tetraploidenZellkernen besetzen die Makrochromosomen in Form und Anordnung sehr variableTerritorien. Homologe Chromosomen lassen keine festgelegten Lagebeziehungen erkennen.Eine Separation der beiden diploiden Chromosomensätze ist nicht nachweisbar.

Unten: Markierungsschema.

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Ergebnisse 64

Abbildung 3.18: Anordnung der Chromosomen 1 – 6 + Z in Geschwisterkernendoppelkerniger Fibroblasten. Zentrale optische Schnitte zeigen die Anordnung der jeweilsunterschiedlich gefärbten Makrochrochromosomen 1 – 6 + Z in Geschwisterkernen doppel-kerniger Zellen (Links). Rechts: Transmissionsaufnahme der entsprechenden Zelle. InGeschwisterkernen mit weitgehend identischer bzw. symmetrischer Anordnung der Makro-chromosomen ist noch die Anordnung in der vorangegangenen Prometaphase-Rosetteablesbar. Die Tochterkerne der mittleren Zelle (B) vermitteln einen Eindruck, wie sich dieChromosomenterritorien im Kern allmählich gegeneinander verschieben (siehe Chr. 1).Vergleicht man die drei Zellen miteinander (A, B und C), ist die zirkuläre Anordnung derMakrochromosomen jeweils ganz unterschiedlich. So liegen beispielsweise in der oberenZelle (A) die beiden Homologen von Chromosom 1 weit getrennt am gegenüberliegen Kern-rand, in der unteren Zelle (C) unmittelbar benachbart. Diese Befunde sprechen gegen dieAnnahme einer festgelegten Anordnung der Chromosomen in der Prometaphaserosette.

Obere Zelle (A): Der rechte Kern wurde 180° gegen den Uhrzeigersinn gedreht. MittlereZelle (B): Originale Kernorientierung. Untere Zelle (C): Der rechte Kern wurde horizontalgespiegelt und gedreht.


Ergebnisse 65

Ergebnisse 66

Abbildung 3.19: Verschiedenfarbige Darstellung der Chromosomen 1 – 6 + Z imZellkern eines embryonalen Neurons. Die Makrochromosomen erstrecken sichgroßflächig am Kernrand und ragen unregelmäßig weit ins Kerninnere. Im Vergleich zu denFibroblasten erscheinen die Territorien der Makrochromosomen in den neuronalen Zellen inihrer Gestalt noch variabler, noch unregelmäßiger. Oberflächen. Die Dekonvolutionzeichnet über Brücken verbundene Chromatingranula mit einem Durchmesser von 300 –800 nm, die im Vergleich zu den Fibroblasten lockerer gepackt erscheinen.Chromatinausläufer können weit aus dem übrigen Chromosomenterritorium heraus und inEinfaltungen von Nachbarterritorien hineinragen.

In den Kernen der Neuronen erscheint die relative Anordnung der Makrochromosomen wiebei den Fibroblasten sehr variabel. Aufgrund des kleineren Querschnitts und der größerenDicke sowie der komplexeren Oberflächen der Chromosomenterritorien sind dieLagebeziehungen zwischen homologen und heterologen Chromosomen noch schwieriger zuerfassen.

(A) zentraler optischer Schnitt, Rohbild. (B) zentraler optischer Schnitt nachDekonvolution. (C) Serie optischer Schnitte im Abstand von 250 nm, nach Dekonvolution.(D) Transmissions-Aufnahme.


Ergebnisse 67

Diskussion 68

4 Diskussion

4.1 Herstellung chromosomenspezifischer DNA-Proben fürGallus domesticus

Der Karyotyp von Gallus domesticus, der aus den Makrochromosomen 1 – 8, Z und Wsowie 30 Paaren von Mikrochromosomen besteht, hat bisher die physikalische Genkartie-rung dieser Spezies wesentlich begrenzt. Nur die Chromosomen 1 – 5 und Z sind mitklassischen zytogenetischen Verfahren regelmäßig eindeutig zu identifizieren, bereits dieMakrochromosomen 6 – 8 sind in DAPI-gefärbten Metaphasepräparaten häufig nicht sicherzu unterscheiden. Aus diesem Grund liegen Daten für die physikalische Kartierung derGene von Gallus domesticus mittels FISH bislang nur für die Makrochromosomen vor.Gleichzeitig tragen die Mikrochromosomen den überwiegenden Teil der Gene (McQueen etal. 1998). Es sind bereits zahlreiche Koppelungsgruppen von Genen bekannt, die Mikro-chromosomen zuzuordnen sind. Chromosomenspezifische DNA-Sonden sind einewesentliche Voraussetzung für die weitere physikalische Gen-Kartierung bei Gallusdomesticus.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden erstmals chromosomenspezifische DNA-Proben für Gallusdomesticus mittels einer durchflußzytometrischen Chromosomensortierung hergestellt. Beidiesem Verfahren können jeweils bis zu mehreren hundert homologe Chromosomengesammelt werden. Die große Ausgangsmenge an Template ermöglicht eine hohe Kom-plexität des DOP-PCR-Amplifikats. Dies zeigte sich in einer homogenen und intensivenAnfärbung der Chromosomen mit FISH, die mit Proben, die aus einzelnen mikroseziertenChromosomen gewonnen wurden, kaum zu erzielen ist. Wie Hybridisierungen auf Meta-phasechromosomen zeigten, konnten spezifische DNA-Sonden für die Makrochromosomen1 – 8 + Z und drei größere Mikrochromosomen hergestellt werden. Die übrigen Mikro-chromosomen konnten aufgrund ihrer geringen Größe mit diesem Verfahren nicht mehr reinsortiert werden. Immerhin konnten fünf Sonden gewonnen werden, die sich als spezifischfür jeweils 2 bis 10 Paar Mikrochromosomen erwiesen. Die Auflösungsgrenze der Sortie-rung lag damit bei einer Chromosomengröße von etwa 25 Mb. Die Herstellung spezifischerDNA-Sonden für die kleineren Mikrochromosomen erfordert die Isolierung von jeweilseinem einzelnen Mikrochromosom mit anschließender DOP-PCR-Amplifikation vonweniger als 0,1 Pikogramm Ausgangs-DNA. Die dafür erforderliche hohe Sensitivität derDNA-Amplifikation ist sehr anfällig gegenüber einer Kontamination mit Fremd-DNA.Dennoch konnten sowohl mit Hilfe der Glasnadelmikrosektion (Griffin et al. 1999) als auchdurch durchflußzytometrische „Sortierung“ eines einzelnen Mikrochromosoms (Griffin,persönliche Mitteilung) bereits Paint-Proben für einen Teil der Mikrochromosomenhergestellt werden. Eine weitere Alternative zur Identifizierung einzelnerMikrochromosomen bieten derzeit BAC-, PAC- und Cosmid-DNA-Sonden (Villon et al.1999).

Eine nicht chromosomenspezifische Hybridisierung auf Zentromere oder Heterochromatinwie dem heterochromatischen Block des Z-Chromosoms konnte durch Zugabe von Cot-1-DNA von Gallus domesticus in 10fachem Überschuß zur Sonden-DNA und eine

Diskussion 69

Vorhybridisierung (preannealing) vor der FISH-Hybridisierung vollständig unterdrücktwerden.

Die im Rahmen dieser Arbeit hergestellten DNA-Sonden werden in der vergleichendenZytogenetik und der Erforschung der Evolution innerhalb der Klasse der Vögel eingesetztund ermöglichen die Charakterisierung von Karyotypen mit komplexen Umbauten.

4.2 Methodische Probleme der dreidimensionalenFluoreszenz in situ Hybridisierung (3D-FISH)

Bei der 3D-FISH an Zellkernen müssen zwei konträre Ziele vereint werden: Zum einen solldie durch Kernproteine bedingte dreidimensionale Struktur des Zellkerns in vivo erhaltenbleiben, andererseits muß die Kern-DNA für eine effiziente Hybridisierung denaturiert alsEinzelstrang und zugänglich für die DNA-Sonde vorliegen. Gleichzeitig erfordern konfokaleSchnittbilder hoher Qualität d. h. hohem Kontrast und hoher Auflösung eine sehr hoheSignalintensität (siehe 4.3.1), da im Gegensatz zu Epifluoreszenzaufnahmen von FISH-Hybridisierungen auf Metaphasechromosomen nur die aus der Focusebene stammendeEmission detektiert wird.

Um die Möglichkeiten der konfokalen Mikroskopie auszuschöpfen, wurden sukzessive dieQualität der DNA-Sonden, der Zellfixation, der Hybridisierung, der Bildaufnahme und derdigitalen Bildverarbeitung einschließlich der Korrektur mikroskopischer Abbildungsfehlerund der Bildrestaurierung (Dekonvolution) verbessert.

4.2.1 DNA-Sonden / Sonden-Pools/Nachweisverfahren

Um die Grenzen und Strukturmerkmale eines Chromosomenterritoriums sinnvollanalysieren zu können, sollte selektiv die DNA des entsprechenden Chromosoms intensivund homogen angefärbt werden. Voraussetzung dafür sind eine ausreichend hoheKomplexität, eine geeignete Fragmentlänge und eine effektive Markierung der DNA-Sonde. Die Spezifität der Hybridisierungssignale hängt von der zuverlässigenUnterdrückung ubiquitärer repetitiver Sequenzen der Sonden-DNA durch Zugabe einergeeigneten nichtmarkierten hochrepetitiven DNA ab. Zunächst wurden daher dieChromosomen-Paint-Sonden und die daraus gebildeten Sondenpools über Hybridisierungenauf Metaphasechromosomen optimiert.

Für die Vielfarbendarstellung von Chromosomen mittels kombinatorischer Markierung soll-ten alle chromosomenspezifischen Sonden innerhalb eines Pools idealerweise die gleicheSignalintensität aufweisen, damit jeweils unterschiedlich markierte Chromatinanteile ein-deutig voneinander abgegrenzt werden können. Für diese Balancierung der Sondenpoolsmußten die Zugabemengen der Einzelsonden entsprechend angepaßt werden. Dabei spielteinsbesondere die Chromosomengröße eine Rolle: für große Chromosomen mußte stets einegrößere DNA-Menge eingesetzt werden.

Diskussion 70

Versuche einer Direktmarkierung der Proben mit Cy3-dUTP und Rhodamin-110-dUTPergaben auf Metaphasechromosomen spezifische, im Vergleich zu einer indirektenMarkierung mittels Biotin- bzw. Digoxigenin-dUTP jedoch erheblich schwächereHybridisierungssignale. Für 3D-FISH war die Signalintensität zu gering. Infolgedessenwurden alle 3D-FISH Experimente mit indirekt markierten Proben durchgeführt. Das damitverbundene Risiko einer unspezifischen Hintergrundsanfärbung des Zellkerns stellte auchbei Einsatz von zwei Antikörperlagen kein echtes Problem dar: Negativkontrollen ohnevorangegangene DNA-Hybridisierung mit dem entsprechend markierten Nukleotid führte inkeinem Fall zu einer Anfärbung im Zellkern. Für das Ziel einer gut erhaltenenKernmorphologie durch eine schonende Zellkernpräparation, bei der das Zytoplasmaweitgehend erhalten blieb, wurden eine gewisse Anfärbung im Zytoplasma, insbesonderevon Avidin-Cy3 in Kauf genommen. Die im Zytoplasma auftretenden Signale waren jedochfür die konfokalen optischen Schnitte durch den Zellkern ohne Bedeutung. DieKomponenten des Detektionssystems wurden in Konzentrationen verwendet, bei denenkeine Kreuzreaktionen zwischen den Komponenten der einzelnen Detektionssystemeauftraten.

Idealerweise sollte bei kombinatorischer Färbung die Intensität der Einzelsignale in mehr-fachmarkierten Bereichen jeweils in allen Bildpunkten gleich hoch sein. In den M-FISH-Experimenten zeigte sich, daß bei gleichzeitiger Hybridisierung aller drei Sondenpools beizwei- oder dreifach markierten Chromosomen die Intensität der Einzelsignale insgesamtabnahm, teilweise verbunden mit einer ungleichmäßigen Verteilung der Einzelsignalintensi-täten. Daraus resultierte auch nach Korrektur von chromatischen Abbildungsfehlern einscheckiges Mischfarbenmuster, das bei konfokalen Schnittbildern deutlicher hervortritt alsauf Epifluoreszenzbildern von Metaphasechromosomen. Dieses Phänomen erschwert dieSegmentierung der verschiedenfarbig markierten Chromosomen. Ursächlich könnteneinerseits eine ungleichmäßige Hybridisierung der DNA-Sonden sein, anderseits dasNachweissystem, d, h. die Fluorochrom-markierten Antikörper bzw. Avidin.

Bei dem verwendeten Verfahren der kombinatorischen Markierung sind die einzelnen DNA-Stränge jeweils nur mit einem Hapten markiert. Soll ein Target gleichzeitig mit zwei oderdrei Fluorochromen markiert werden, konkurrieren die jeweils nur einfach markierten Son-denstränge um die Bindungsstellen und hybridisieren nebeneinander auf die Ziel-DNA. Indiesem Fall könnte die Entwicklung von Markierungsverfahren Abhilfe schaffen, die einenDNA-Strang gleichzeitig mit mehreren Haptenen bzw. Fluorochromen markieren. Eineandere Ursache könnte jedoch darin liegen, daß sich die einzelnen Komponenten desNachweissystems, d. h. Antikörper und Avidin, bei der Bindung an die Haptene derSonden-DNA aus sterischen Gründen gegenseitig behindern.

4.2.2 Zellkernpräparation für 3D-FISH

Die Fixierung der Zellen erfolgte in einer isotonen 1.3%igen Paraformaldehyd-Lösung in0,5 x PBS (phosphate buffered saline). Die fixierende Wirkung von Paraformaldehydbesteht im wesentlichen in der Vernetzung von Proteinen durch eine Reaktion mit Amino-säureresten unter Ausbildung von Methylenbrücken (Hopwood 1969). Von entscheidenderBedeutung ist, daß die Präparate von der Entnahme aus der Kultur bis zur Versiegelung mitdem (wässrigen) mikroskopischen Einbettungsmedium feucht gehalten werden. Eine Aus-

Diskussion 71

trocknung der Präparate führt unweigerlich zum Kollabieren der Zellkerne und dem Verlustder dreidimensionalen Zellkernstruktur (Emmerich et al. 1989).

Eine effiziente Fluoreszenz in situ Hybridisierung erfordert nach der Fixierung die Permea-bilisierung der Zellmembran und des Zytoplasmas sowie der Kernmembran und desKaryoplasmas und schließlich die Denaturierung der DNA, damit die Sonden-DNA an diekorrespondierenden DNA-Sequenzen des Zellkerns binden kann. Diese Schritte erfolgenmittels einer sukzessiven Behandlung der fixierten Präparate mit Detergenzien,wiederholtem Einfrieren in flüssigem Stickstoff sowie einer Inkubation in Salzsäure. DieseAufzählung führt zur Frage, inwieweit durch die Fixierung und die nachfolgenden Schrittedie Kernstruktur verändert bzw. zerstört wird. Zur Beantwortung dieser Frage liegen nurwenige konkrete experimentelle Daten vor. An Formaldehyd-fixierten menschlichenFruchtwasserzellen konnte immerhin gezeigt werden, daß die Position von Zentromeren,dargestellt mit einem gegen Kinetochor-spezifischen Antikörper auch nach FISHunverändert erhalten blieb und mit dem Hybridisierungsmuster einer Zentromer-spezifischen DNA-Sonde kolokalisierte (Cremer et al. 1993). Einen neuen Ansatz zu einerobjektiven Beurteilung über mögliche Auswirkungen der Zellfixierung und –Präparation fürFISH auf die Erhaltung der Chromatinstruktur ermöglicht die vor kurzem beschriebeneDarstellung von Chromosomenterritorien in vivo über eine Replikationsmarkierung mitfluorochrommarkierten Nukleotiden (Zink et al 1998). An Hand eines Vergleichs vonBildstapeln, die in vivo, d. h. im unfixierten Zustand, nach der Fixierung und nach den fürdie Hybridisierung notwendigen Schritten jeweils an einer identischen Zelle aufgenommenwurden, konnte gezeigt werden, daß Gestalt und Anordnung der markiertenChromatinstrukturen, bis hin zu Form und Position einzelner granulärer Chromatin-Domänen (sogenannter subchromosomaler Foci) im Zellkern im Rahmen der optischenAuflösung des konfokalen Lasers-Scanning-Mikroskops erhalten bleiben (Solovei et al.,Manuskript in Vorbereitung). Diese Untersuchungen bestätigen, daß Messungen vonChromatinstrukturen zumindest oberhalb dieser Größenordnung auch nach FISH dieSituation im Zellkern in vivo zuverlässig abbilden.

4.2.3 3D-M-FISH

Die vorliegende Arbeit zeigt, daß eine kombinatorische Markierung mit drei Fluorochromenauch für eine Vielfarbendarstellung von Chromosomenterritorien mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie eingesetzt werden kann und neue Möglichkeiten für dreidimensio-nalen Untersuchungen der Zellkernarchitektur eröffnet. Aufgrund der limitierten axialenAuflösung ergaben sich Abgrenzungsprobleme zwischen übereinander liegenden,unterschiedlich zwei- oder dreifach markierten Chromosomenterritorien. Für die besonderenProbleme, die mit der Aufnahme und Bildverarbeitung der kombinatorischen Mehrfarben-FISH verbunden sind, siehe 4.3.

Insgesamt konnten nach Optimierung der Probenaufbereitung, der Zellkernpräparation, derHybridisierung und der entsprechenden Nachweisschritte an einer Reihe dreidimensionalerhaltener Zellkerne an einzelnen konfokalen Schnitten die Territorien von siebenChromosomenpaaren identifiziert werden.

Diskussion 72

4.3 Methodische Probleme einer 3D-Mikroskopie undquantitativen Bildanalyse

4.3.1 Optimierung der Bildaufnahme

Die Bildaufnahme im konfokalen Mikroskop erfolgt durch rasterförmiges Abtasten der Bild-ebene, während ein Photomultiplier für jeden Bildpunkt über einen Zeitraum von wenigenMikrosekunden die Anzahl von Photonen registriert, die vom Präparat emittiert werden.Entscheidend für die Qualität der konfokalen Bilder ist das Verhältnis der Intensität derFluoreszenzsignale zum statistischen Rauschen (engl. signal to noise ratio, SNR). DiesesRauschen resultiert zum einen aus der statistischen Natur der Fluoreszenzemission und zumanderen aus optischem und elektronischem Hintergrundsignal. Die Signalintensität resultiertaus den chemischen Eigenschaften des Fluoreszenzfarbstoffs, der Anzahl derFluoreszenzfarbstoffmoleküle im Präparat und der Energie des anregenden Laserlichtes.Hohe Laserleistung führt zu einer starken Signalemission, jedoch gleichzeitig zu einemraschen Ausbleichen (Fading) des Fluoreszenzfarbstoffs, bevor alle Bildebenen abgescanntsind. Niedrige Intensität des anregenden Laserlichts vermeidet vorzeitiges Ausbleichen derFluoreszenzfarbstoffe, führt jedoch zu einer niedrigen Emission und einer geringen SNR.Durch Mittelung der Signalwerte nach wiederholten Scanvorgängen kann die SNR unddamit die Bildqualität erheblich verbessert werden. Mit dem verwendeten mikroskopischenSystem wurde die höchste Bildqualität mit 32facher Abtastung erzielt. Bei der dabei ein-gesetzten Laserleistung trat kein signifikantes Ausbleichen auf. Der aufwendige Scanmoduserwies sich insbesondere bei der Darstellung von Chromosomen mittels kombinatorischerMarkierung als wichtig. Der Preis für die hohe Bildqualität waren eine Verlängerung desScanvorgangs auf über eine Stunde pro Zellkern.

4.3.2 Auflösungsgrenzen und Abbildungsfehler der konfokalenMikroskopie

Bedingt durch die physikalischen Grenzen des Abbildungsprozesses (Pawley, 1995) ist dieAuflösung der konfokalen Mikroskopie anisotrop und liegt für den Wellenlängenbereichsichtbaren Lichts bei etwa 250 nm lateral und 700 nm axial. Dies bewirkt eine Verschmie-rung des Signals in lateraler und axialer Richtung. Insbesondere nimmt das Bild einespunktförmigen Objektes nicht nur einen Bildpunkt ein, sondern umfaßt einen durch dieoptische Auflösung bestimmten Bereich mit variabler Signalintensität um den geometrischenBildpunkt herum. Der genaue dreidimensionale Verlauf der Signalintensität eines punkt-förmigen Objektes wird als Punktabbildungsfunktion (point spread function, PSF)bezeichnet. Ungenügende Signalstatistik, d.h. geringe SNR, verringert die Auflösung weiter(Sheppard et al. 1995).

Bei den heutzutage verwendeten Plan-Apochromaten mit hoher numerischer Apertur sindgeometrische Aberrationen auf ein Minimum reduziert und treten vor allem am Bildfeldrandauf. Trotz der weitgehenden Korrektur chromatischer Aberrationen bei diesen Objektiventreten noch leichte Verschiebungen zwischen den Farbkanälen auf. Diese resultieren aus derimmer noch vorhandenen chromatischen Aberration des Objektivs sowie aus leichtenDejustierungen optischer Elemente im Lichtweg des Mikroskops und treten besonders inaxialer Richtung auf. Bei dem für diese Arbeit verwendeten Mikroskop (Zeiss LSM 410)wurden sie durch Aufnahmen multispektraler Latexkügelchen gemessen. Die axiale

Diskussion 73

Abweichung betrug zwischen den drei Anregungs-Wellenlängen 488 nm, 543 nm und633 nm jeweils etwa 200 nm. Sie wurde systematisch korrigiert, indem die betreffendenBildstapel um eine Ebene verschoben wurden.

Des weiteren zeigte sich bei dem verwendeten konfokalen Mikroskop eine zeitabhängigeirreguläre laterale Verschiebung („Drift“) des Objekts in aufeinanderfolgenden Schnitt-bildern. Da sie zeitlich in nicht vorhersagbarer Weise schwankte, war sie nicht durch eineinfaches Zurückverschieben zu korrigieren. Eine weitgehende Korrektur konnte jedochtrotzdem durchgeführt werden, da sich wegen der begrenzten lateralen Auflösung derMikroskopabbildung die Signale unmittelbar aufeinanderfolgender Schnittebenen bei einemEbenen-Abstand von 250 nm nur wenig voneinander unterscheiden. Mit Hilfe eines von R.Heintzmann am Institut für angewandte Physik der Universität Heidelberg (AG Prof. C.Cremer) entwickelten iterativen Algorithmus wurden aufeinanderfolgende Schnittebenenderart verschoben, daß sie maximale Korrelation zeigten.

4.3.3 Verbesserung der Auflösungsgrenzen durch digitaleBildverarbeitung: Entfaltung (Dekonvolution)

Die begrenzte Auflösung des Lichtmikroskops kann durch numerische Algorithmen verbes-sert werden. Da die fluoreszenzoptische Abbildung eines Objektes im mathematischen Sinneeiner Faltung (Konvolution) der Objektintensität mit der PSF (siehe oben) des Mikroskopsentspricht, werden solche Algorithmen als Entfaltungs-(Dekonvolutions-)Algorithmenbezeichnet. Bei den Dekonvolutionsalgorithmen lassen sich nicht-iterative und iterativeVerfahren unterscheiden. Iterative Verfahren benötigen im Vergleich zu den nicht-iterativenVerfahren mehr Rechenzeit, ermöglichen aber eine getreuere und rauschfreiereRekonstruktion des Objekts. Es existieren verschiedene iterative Verfahren, die sich in derverwendeten Qualitätsfunktion unterscheiden, mit der die Güte der entfalteten Datenbestimmt wird (van Kempen et al. 1997, Verveer et al. 1999). Mathematische Verfahrender Dekonvolution versprechen für die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie eineeffektive Verbesserung der Auflösung um den Faktor 2 – 3 auf 100 nm lateral und 250 nmaxial (Van der Voort 1995).

In dieser Arbeit wurden die Bilddaten von Zellkernen mit einem (iterativen) MaximumLikelihood (MLE) Verfahren entfaltet. Dabei wurde anhand der physikalischen Kenndatendes optischen Systems (Numerische Apertur des Objektivs, Brechungsindex von Mikro-skopieröl, Deckglas und Einbettungsmedium) eine theoretische PSF berechnet und zurEntfaltung verwendet. Eine - grundsätzlich vorzuziehende - Messung der realen PSF, dieauch die tatsächlichen sphärischen Aberrationen des verwendeten Mikroskops erfaßt, waraufgrund der irregulären „lateralen Drift“ (siehe 4.3.2) des LSM 410 nicht möglich.

Die Entwicklung von Dekonvolutionsalgorithmen und ihre Überprüfung erfolgen an synthe-tischen Objekten mit einer einfachen bekannten Struktur wie etwa fluoreszenzmarkiertenKügelchen. Bei der Anwendung von Dekonvolution an Objekten, deren Struktur a priorinicht bekannt ist, kann die Generierung von Bildartefakten nicht ohne Weiteres ausge-schlossen werden. Daher müssen die Ergebnisse vorsichtig interpretiert werden,idealerweise unter Vergleich unterschiedlicher Bildrestaurierungsverfahren. Bei deniterativen Verfahren kann die Beobachtung des Resultats mit zunehmender Anzahl vonIterationsschritten Hinweise auf die Entstehung von Bildartefakten liefern. Ansätze für eineobjektive Beurteilung von Dekonvolutionsverfahren versprechen Aufnahmeserien von

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hochauflösender 4pi-Mikroskopie vor und nach Restaurierung mit Aufnahmeserien derselben Objekte mit konventioneller konfokaler Mikroskopie (Schrader er al.1998). DieKlärung der Frage, inwieweit quantitative Auswertungen an Rohbilddaten oder anrestaurierten Bildstapeln durchgeführt werden sollten, bedarf noch entsprechenderexperimenteller Untersuchungen.

4.3.4 Objekt-Segmentierung und 3D-Rekonstruktion

Die Dreidimensionale Darstellung ("rendering") durch Computermodelle, die beliebiggedreht und von allen Seiten her betrachtet werden können, ist ein wichtiges Hilfsmittel, umdie räumliche Verteilung von Genomanteilen und anderen Strukturen im Zellkern zu unter-suchen. Grundsätzlich unterscheidet man Volumen- und Oberflächen-Rendering. BeimVolumen-Rendering wird das Objekt durch einen simulierten Fluoreszenzprozess darge-stellt, d.h. jeder Datenpunkt im Objekt trägt mit seiner jeweiligen Intensität zur Darstellungbei. Dahingegen wird beim Oberflächen-Rendering das Objekt durch eine es einhüllendeFläche dargestellt. Die Fläche ("Isofläche") ist so gewählt, dass sie Bildelemente, die übereinem gewissen Schwellwert liegen von Bildelementen, die darunter liegen, trennt. Infor-mationen aus dem Innern des Objektes gehen nicht in die Darstellung ein.

Der hier für die 3-Farben-FISH verwendete Ansatz zur Darstellung bestand in Dekonvo-lution und anschließendem Oberflächen-Rendering. Die Dekonvolution veränderte dieGrauwertverteilung so, dass sich eine Schwellenwertverschiebung über einen weiten Bereichverhältnismäßig gering auf die Größe der rekonstruierten Objekte auswirkte.

Die verschiedenfarbige Anfärbung der Makrochromosomen 1 – 6 + Z durchkombinatorische Färbung mit drei Fluorochromen liefert zwar eindrucksvolle Bilder, eineAnalyse per Auge an Schnittbildserien ist allerdings insbesondere bei den embryonalenNeuronen in ihren Möglichkeiten begrenzt. Die oft – je nach Zelltyp und Aktivitätszustand– komplexen Formen von Chromosomenterritorien, die teilweise tief ineinander greifen,erfordern eine dreidimensionale Segmentierung mit mathematischen Verfahren unterKombination der Einzelkanalbilder und eine nachfolgende 3D-Rekonstruktion, um diekomplizierten Lagebeziehungen von Chromosomenterritorien weitergehend zu analysieren.Die dreidimensionale Segmentierung kombinatorisch gefärbter Chromosomenterritorien imZellkern wird durch eine ungleichmäßige Intensität der Einzelsignale in mehrfachmarkierten Territorien (siehe 4.2.1) und die geringe axiale Auflösung des konfokalenMikroskops erschwert. Entsprechende Software stand im Rahmen dieser Dissertation nochnicht zur Verfügung.

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4.4 Die Anordnung von Chromosomenterritorien imZellkern

4.4.1 Die Morphologie von Chromosomenterritorien im Zellkernembryonaler Fibroblasten und embryonaler Neuronen von Gallusdomesticus

Im Rahmen dieser Dissertation wurden am Beispiel von Gallus domesticus erstmals beieiner Vogelart Morphologie und Verteilung von Chromosomenterritorien im Zellkernuntersucht. In Zellkernen von embryonalen Fibroblasten und Neuronen zeigten sichabgegrenzte polymorphe Chromosomenterritorien mit komplex gefalteten Oberflächen,aufgebaut aus granulären Chromatineinheiten mit einem Durchmesser von 300 – 800 nm.Durch Mittelung der Bilddaten aus multiplen Scan-Wiederholungen, die zu einerVerbesserung der Bildqualität durch Verbesserung der signal-to-noise ratio führt (siehe4.3.1) und durch Bildrestaurierung (Dekonvolution) konnten die Konturen deutlich verstärktwerden. Makro- und Mikrochromosomen ließen auf der Ebene der erreichten Auflösungkeine grundsätzlichen Unterschiede in ihrem Aufbau aus derartigen granulärenChromatineinheiten erkennen. Dabei ist zunächst zu klären, ob es sich bei den granulärenVerdichtungen der Hybridisierungssignale um ein Artefakt oder eine realeChromatinstruktur handelt. Gegen ein Artefakt sprechen die Regelhaftigkeit des Mustersund die Beobachtung, daß einfach markierte DNA-Sonden Metaphasechromosomendurchwegs homogen anfärbten. Gegen ein Artefakt sprechen auch konfokale Schnittbildervon Propidiumiodid-gefärbten Fibroblastenkernen, die nach Mittelung der Bilddaten ausmultiplen Scan-Wiederholungen und nach Dekonvolution ebenfalls derartige granuläreDNA-Verdichtungen erkennen lassen.

Der in den beiden Zelltypen von Gallus domesticus gefundene Aufbau der Chromosomen-territorien aus granulären Substrukturen entspricht - im Rahmen der mikroskopischenAuflösung - dem Aufbau von Chromosomenterritorien in Säugerzellen, wie er sowohl nachFISH am fixierten Zellkern beobachtet werden kann als auch im lebenden Zellkern, in demChromosomenterritorien mit Fluorochrom-markierten Nukleotiden sichtbar gemacht wurden(Zink et al. 1998, siehe auch 4.2.2). Die Belege verdichten sich, daß Chromosomen-territorien – zumindest bei Vertebraten – grundsätzlich aus subchromosomalen Chromatin-domänen aufgebaut sind, die im Durchschnitt etwa 1 Mbp enthalten und in der S-Phase alsreplication foci Cluster gleichzeitig aktiver Replikons darstellen (siehe1.1, Berezney et al.1995, Jackson und Pombo 1998, Zink et al.1998, 1999).

4.4.2 Die relative Anordnung der Territorien von Makrochromosomenbei Gallus domesticus

Über eine kombinatorische Markierung mit drei Fluorochromen wurden dieMakrochromosomen 1 – 6 + Z in kultivierten embryonalen Fibroblasten und Neuronenverschiedenfarbig dargestellt. In beiden Zelltypen zeigten sich abgegrenzteChromosomenterritorien mit sehr variabler Gestalt. Bei einer teilweise ausgeprägten

Diskussion 76

Verzahnung randständiger granulärer Chromatindomänen benachbarter Territorien ist imRahmen der mikroskopischen Auflösung keine oder nur geringe Überlappung zu erkennen.Die Frage, in wieweit Chromatinschleifen (loops) aus der Oberfläche aneinander grenzenderChromosomenterritorien herausragen und sich gegenseitig durchdringen, ist im Rahmen derAuflösung der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie nicht zu klären. Die Territorien derMakrochromosomen in den Neuronen zeigten im Vergleich zu den meist kompakterenChromosomenterritorien der Fibroblasten insgesamt eine komplexere Form mitausgeprägten Ein- und Ausstülpungen, durch die sie jeweils mit vielen anderen Territorienin Kontakt treten können. Ausmaß und Faltung der Chromosomenterritorien könnten dieEntstehung chromosomaler Translokationen wesentlich beeinflussen.

In beiden Zelltypen erscheinen die Lagebeziehungen zwischen den Makrochromosomen sehrvariabel. Die komplexen Kompaktzonen der Chromosomenterritorien in den embryonalenNeuronen mit ausgedehnten Ein- und Ausstülpungen und die geringe axiale Auflösung beiunterschiedlich markierten übereinander liegenden Chromosomenterritorien verhinderteneine weitergehende Analyse der Lagebeziehungen ohne entsprechende Software-Unterstützung. Die Variabilität der Lagebeziehungen läßt sich am Verhalten homologerChromosomen ablesen, die teils aneinandergrenzen, aber auch weit entfernt amgegenüberliegenden Kernrand liegen können. Eine Auswertung an 20 embryonalenFibroblastenkernen ergab eine relativ häufige Assoziation homologer Chromosomen undHinweise, daß sich die einzelnen Chromosomen möglicherweise in der Häufigkeitunterscheiden, mit der ihre Homologen assoziiert gefunden werden können.

Postmitotische Geschwisterkerne wiesen typischerweise eine nahezu identische bzw.spiegelbildliche Anordnung der Makrochromosomen auf als Zeichen der noch erhaltenenChromosomenanordnung der vorangegangenen Prometaphase. Der Vergleich verschiedenerGeschwisterkernpaare zeigte jedoch ganz unterschiedliche Anordnungen. Dies deckt sichmit Beobachtungen an menschlichen Fibroblasten (Sun und Yokota, 1999).

Diese Befunde an Fibroblasten von Gallus domesticus stimmen mit zahlreichenUntersuchungen an menschlichen Zellkernen überein, die stets hoch variable Anordnungenvon Chromosomenterritorien fanden (siehe Einleitung 1.2.3, Emmerich et al. 1989, Cremeret al. 1993, Popp et al. 1990, Dietzel et al. 1995). Die Befunde sprechen klar gegen das ausWinkelbestimmung nach Untersuchungen Einfach- und Zweifach-FISH an menschlichenPrometaphaserosetten abgeleitete Postulat einer festgelegten Chromosomenanordnung inPrometaphaserosetten und Zellkernen (siehe Einleitung 1.2.3, Nagele et al. 1995, 1998).

Die Form des Zellkerns sowie die Form und die Anordnung von Chromosomenterritorienim Zellkern sind ein dynamischer Prozeß. Durch eine Markierung mitfluorochrommarkierten Nukleotiden können Bewegungen von Chromosomenterritorien undeinzelnen subchromosomalen Domänen in lebenden Zellen über die Zeit beobachtet werden(Zink et al. 1998, Manders 1999).

4.4.3 Unterschiedliche Verteilung von Makro- und Mikrochromosomenim Zellkern und in der Prometaphaserosette

An den ausgewerteten zentralen Schnittbildern ergab sich sowohl bei den teilungsaktivenFibroblasten sowie bei den sich nicht teilenden Neuronen eine signifikante größenabhängigeVerteilung der Chromosomen: In beiden Zelltypen haben die Mikrochromosomen ihre

Diskussion 77

größte Dichte um den Bereich des Kernmittelpunkts, während die größte Dichte derMakrochromosomen 1 bis 5, Z im peripheren Zellkernbereich gefunden wird. Die inter-mediären Chromosomen 6 -10 verhalten sich in ihrem Verteilungsmuster nicht ganz analog:während ihr Dichtemaximum in den Neuronen zwischen dem der Mikro- und Makro-chromosomen liegt, findet man in den Fibroblasten zumindest angedeutet eine zweigipfligeKurve mit einem Maximum in der Kernmitte und einem weniger ausgeprägten im Kern-randbereich. Bei diesen statistisch signifikanten Unterschieden im Verteilungsmuster solltedie Variabilität der einzelnen Zellkerne nicht außer acht gelassen werden, wie die sechs inverschiedenen Perspektiven dargestellten Beispiele der Abb. 3.8 zeigen.

In diesem Zusammenhang ist auf grundsätzliche Probleme der quantitativen Auswertunghinzuweisen. Die Auswertung (Abb. 3.13) erfolgte an Projektionen von zwei (Neuronen)bzw. drei zentralen Schnitten (Fibroblasten), die einen z-axialen Bereich von 250 nm bzw.500 nm umfassen, während die etwa gesamte Ausdehnung eines Fibroblastenkerns in Z-Richtung 3 - 5 µm beträgt. Somit wurde die Verteilung der Chromosomen bezüglich desoberen und des unteren Zellkernrandes nicht berücksichtigt. DreidimensionaleAuswertungen werden derzeit am Institut für angewandte Physik der Univ. Heidelberg (AGC. Cremer) durchgeführt. Damit wird ein Vergleich mit den bisher vorhandenen aufzentrale Schnitte beschränkte Daten möglich und evtl. Verzerrungen der vorliegendenAuswertung erkennbar werden. Diese Daten können im Rahmen der vorliegendenDissertation nicht mehr berücksichtigt werden. Die Genauigkeit dreidimensionalerAuswertungen wird begrenzt durch die geringe axiale Auflösung des konfokalenMikroskops.

Bei der quantitativen Auswertung stellt die unregelmäßige Form der Zellkerne insbesonderebei den Fibroblasten, die sich geometrisch schwer definieren läßt, ein grundsätzlichesProblem dar. So ist im Gegensatz zu den annähernd kugelförmigen Lymphozyten bei diesenZellen die Entfernung eines Punktes im Inneren des Zellkerns zwischen Kernzentrum undKernrand nicht ohne weiteres zu definieren. Eine zusätzliche Variable ist die sehrunterschiedliche, oft exzentrische Position der Nukleoli. Ein Ansatz zur Lösung diesesProblems könnte eine geometrie-unabhängige Auswertung liefern, bei der die Lage einesSignalpunktes im Zellkern durch den Abstand zum nächstgelegenen Kernrand bzw. zumnächstgelegenen Nukleolus definiert wird.

Die in der vorliegenden Arbeit an zwei sehr unterschiedlichen Zelltypen von Gallusdomesticus gewonnenen Befunde bestätigen die an kultivierten menschlichenFruchtwasserzellen, Fibroblasten und Lymphozyten gefundene Tendenz einer bevorzugtenLokalisation kleiner Chromosomen in der Zellkernmitte und großer Chromosomen in derKernperipherie (Volm 1994, Brero 1999, F. Habermann, Manuskript in Vorbereitung, sieheEinleitung 1.2.1).

Prometaphaserosetten embryonaler Fibroblasten zeigten stets, wie in Abb. 3.9 dargestellt,eine im Vergleich zur Variabilität der in Zellkernen embryonaler Fibroblasten beobachtetenVerteilungsmuster eine auffallend strikte Chromosomen-Anordnung von der Chromosomen-größe abhängige präferentielle Position der Territorien. Die untersuchten Fibroblastenstellten eine Mischpopulation proliferierender und nicht proliferierender Zellen dar (siehe3.2.2). Die Variabilität der Kernformen und der unterschiedlichen Verteilungsmuster vonMakro- und Mikrochromosomen dürften Ausdruck unterschiedlicher Zellzyklusphasen oderzellulärer Differenzierung sein. Die einheitliche strenge Anordnung der Makro- undMikrochromosomen in der Prometaphase impliziert spezifische Chromatinbewegungen im

Diskussion 78

Zellkern vor der Mitose oder bei der Anordnung der Chromosomen in der Metaphaseselbst.

4.5 Gründe für eine unterschiedliche Verteilung der Makro-und Mikrochromosomen

Die Befunde an embryonalen Fibroblasten und Neuronen von Gallus domesticus und anFibroblasten und peripheren Lymphozyten des Menschen verführen zu der Schlußfolgerung,daß in weit entfernten Spezies bei ganz unterschiedlichen Zelltypen statistisch die Lage einesChromosoms im Zellkern mit der Größe des Chromosoms korreliert. Gibt es tatsächlicheinen gemeinsamen Mechanismus für diese Befunde, eine – zumindest für Vertebraten -allgemein gültige Gesetzmäßigkeit? Welche Faktoren könnten einer solchengrößenabhängigen Verteilung von Chromosomen zugrunde liegen? Im folgenden sollen zweiAspekte diskutiert werden: der Einfluß physikalischer Parameter und der Einflußgenetischer Parameter, insbesondere dem Anteil an gendichten und genarmenChromosomenabschnitten.

4.5.1 Der Einfluß physikalischer Parameter auf die Verteilung vonChromosomenterritorien im Zellkern

Ein Weg, den Einfluß physikalischer Parameter theoretisch zu testen, ist der Zugang überComputersimulationen. Durch Vorgabe definierter Parameter, wie Größe, Verformbarkeit,Gestalt von Chromosomenterritorien oder ihre Bindung an nukleäre Strukturen wie dieKernmembran, kann das Verhalten von Territorien im Zellkern modelliert werden, unduntersucht werden, ob sich unter diesen Einschränkungen unter sonst "zufälligen" Bedin-gungen eine größenabhängige Verteilung einstellt. Entsprechende Simulationen an abstra-hierten sphärischen und ellipsoiden Kernmodellen werden derzeit in der Arbeitsgruppe vonC. Cremer (Institut für angewandte Physik der Universität Heidelberg) durchgeführt. Vor-läufige Ergebnisse dieser Simulationsexperimente ließen keine derartigen Unterschiede inder Verteilung großer und kleiner Chromosomenterritorien erkennen (Diss. G. Kreth,Institut für angewandte Physik der Universität Heidelberg, unveröffentlichte Daten). Derzeitgibt es keine Hinweise dafür, daß die in unterschiedlichen Spezies und Zelltypenbeobachtete größenabhängige Verteilung von Chromosomenterritorien primär eine Folgeder Chromosomengröße selbst ist.

Die Beobachtungen zu einer größenabhängigen Anordnung von Chromosomen in der Meta-phaserosette bei weit entfernten Spezies führen auch zur Frage, ob primär Abläufe imRahmen der Mitose selbst, wie die Funktionsweise des Spindelapparates, mechanischeZugkräfte und die Chromosomenmasse diese - bei Gallus domesticus und anderen Speziesmit unterschiedlich großen Chromosomen dokumentierte (White 1961) - auffallend strikteChromosomenanordnung in der Prometaphaserosette mitbestimmen könnten, dieanschließend im Zellkern mehr oder weniger beibehalten wird.

Diskussion 79

4.5.2 Der Einfluß der Gendichte und des Replikationsverhaltens aufdie Verteilung von Chromosomenterritorien im Zellkern

Ein anderer Zugang für eine mögliche Erklärung dieser beobachteten größenabhängigenVerteilung von Chromosomenterritorien könnte im unterschiedlichen Gengehalt von kleinenund großen Chromosomen liegen, der im Genom von Gallus domesticus sehr ausgeprägt ist.Die Mikrochromosomen von Gallus domesticus, die etwa 35% des Genoms bilden,enthalten nach Burt et al. (1999) etwa 75% aller Gene mit einer hohen Dichte an CpG-Inseln und bestehen in ihrer Gesamtheit überwiegend aus frühreplizierendem GC-reichemChromatin (McQueen et al. 1998). Im Vergleich zu den Mikrochromosomen sind dieMakrochromosomen genarm, AT-reich und enthalten einen großen Teil desspätreplizierenden Chromatins. Die bevorzugte Anordnung der insgesamt genarmenMakrochromosomen in der Kernperipherie und die zentrale Lage der insgesamt genreichenMikrochromosomen stimmt mit Beobachtungen zur Verteilung von früh- undspätreplizierendem Chromatin in proliferierenden Säugerzellen überein: Genarmesspätreplizierendes, G-Banden entsprechendes Chromatin ordnet sich vorwiegend entlang derKernperipherie und perinukleolär an, genreiches frühreplizierendes, R-Bandenentsprechendes Chromatin besetzt bevorzugt einen Bereich zwischen perinukleolärem undperipherem Chromatin (Ferreira et al. 1997, Sadoni et al. 1999). Als Hintergrund für diepolarisierte Verteilung von genarmem und genreichem Chromatin im Zellkern wurde einepolare Anordnung früh- und später replizierender subchromosomaler Domänen ingetrennten Bereichen innerhalb der einzelnen Chromosomenterritorien beschrieben, die zueiner überchromosomalen Kompartimentierung von früh- und spätreplizierender DNA imZellkern führt (Zink et al. 1999).

Unter diesem Aspekt müssen auch die Befunde zur unterschiedlichen Verteilung derTerritorien der großen Chromosomen 1 - 5 und X sowie der kleinen Chromosomen 17 - 20in menschlichen Zellkernen diskutiert werden. Von Craig und Bickmore (1994) konntegezeigt werden, daß der Gehalt an CpG-Inseln, die vorwiegend mit dem frühreplizierenden, auf Metaphasechromosomen den R-Banden zuzuordnenden Chromatin asso-ziiert sind, in den kleinen Chromosomen 16 bis 22 deutlich höher ist als in den großenChromosomen, die dadurch in ihrer Gesamtheit einen größeren relativen Anteil an spätreplizierender DNA enthalten. Eine Ausnahme bildet bei den großen Chromosomen dasChromosom 1, das verhältnismäßig reich an CpG–Inseln ist und auf der anderen Seite dasChromosom 18, das wenige CpG-Inseln besitzt (Craig und Bickmore, 1994), genarm ist(Deloukas 1998) und vorwiegend aus spätreplizierender DNA besteht (Dutrillaux et al 1976,Korenberg und Rykowsky 1988). Somit könnte man insgesamt auch die beobachtetegrößenabhängige Verteilung menschlicher Chromosomenterritorien mit ihrer Gendichte undihrem unterschiedlichen Replikationsverhalten in Zusammenhang bringen. Am Beispielzweier gleichgroßer Chromosomen wurden in proliferierenden Fibroblasten signifikanteUnterschiede gefunden: Während das gendichte, überwiegend frühreplizierende Chromosom19 fast immer eine zentrale Position im Zellkern einnahm, lag das genarme, überwiegendspätreplizierende Chromosom 18 ganz vorwiegend in der Kernperipherie (Croft et al. 1999,siehe Einleitung 1.2.2). Diese Beobachtungen konnten an nichtstimulierten Lymphozytenbestätigt werden (M. Cremer, unveröffentlichte Befunde).

Aus den bisher vorliegenden Daten läßt sich ableiten, daß das Lageprofil einesChromsomenterritoriums im Zellkern – unabhängig von der Spezies - sowohl mit derChromosomengröße, als auch mit dem Anteil von genreichem, frühreplizierendemChromatin sowie dem Anteil von genarmem, spätreplizierendem Chromatin korreliert.

Diskussion 80

Inwieweit wird nun die Verteilung des Chromatins im Zellkern vom Karyotyp, d. h. vonAnzahl, Form und Größe der einzelnen Chromosomen beeinflußt? Diese Frage könntenweitere FISH-Experimente beantworten: Die im Rahmen dieser Arbeit hergestellten chro-mosomenspezifischen Proben von Gallus domesticus können sogar die homologenChromosomen des australischen Emu Dromaius novaehollandiae ungeachtet einer übermindestens 80 Millionen Jahre getrennten Entwicklung identifizieren (Shetty et al. 1999).Die chromosomenspezifischen DNA-Sonden von Gallus domesticus und die darausgebildeten Pools könnten dazu verwendet werden, die Verteilung homologer Genomanteileim Zellkern verschiedener Vogelarten zu analysieren, deren Karyotyp erheblich von Gallusdomesticus abweicht. So besitzt die Schleiereule tyto alba bei einer Gesamtzahl von über 90Chromosomen mit Ausnahme des Z-Chromosoms nur noch Mikrochromosomen, währendbeispielsweise der peregrinische Falke falcus peregrinus nur 25 Paar Chromosomenmittlerer Größe aufweist (Rodionov 1996). Wenn primär Faktoren wie Gendichte undReplikationsverhalten die Anordnung des Chromatins im Zellkern bestimmen, sollte die beiGallus domesticus beobachtete charakteristische Verteilung des jeweils Makro- undMikrochromosomen entsprechenden Genomanteils auch bei Spezies mit stark abweichendemKaryotyp erhalten sein.

Zusammenfassung 81

5 Zusammenfassung

Im Rahmen dieser Dissertation wurde mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung, konfokalerLaserscanning-Mikroskopie und digitaler Bildverarbeitung erstmals Morphologie undVerteilung von Makro- und Mikrochromosomen im Zellkern einer Vogelart, des HaushuhnsGallus domesticus untersucht. Das Huhn besitzt wenige, insgesamt genarmeMakrochromosomen, deren Größe im Bereich menschlicher Chromosomen liegt, und vieleinsgesamt sehr genreiche Mikrochromosomen mit einem DNA Gehalt von jeweils nur etwa5 bis 25 Millionen Basenpaaren. Die Chromosomen von Gallus domesticus zeichnen sich imVergleich zu menschlichen Chromosomen durch extreme Unterschiede in ihrer Größe undin ihrer Gendichte aus.

Mit Hilfe dieses evolutionären Ansatzes sollte festgestellt werden, welche Prinzipien derZellkernarchitektur zumindest für Vertebraten allgemeine Gültigkeit besitzen könnten. Eineevolutionäre Konservierung bestimmter Chromatinverteilungsmuster wäre ein wichtigerHinweis auf eine noch unverstandene funktionelle Bedeutung. Folgende Fragen solltenbeantwortet werden:

• Unterscheiden sich die Territorien von Makro- und Mikrochromosomen bei Vögeln inwesentlichen Strukturmerkmalen untereinander oder im Vergleich zu Chromosomen-territorien von Säugern?

• Korrelliert die Lage eines Chromosomenterritoriums im Zellkern mit derChromosomengröße und bzw. oder den Anteilen von genarmem und genreichemChromatin?

• Liegt der Zellkernarchitektur eine eindeutig festgelegte oder eine variable relativeAnordnung der Chromosomenterritorien zugrunde?

Über eine durchflußzytometrischen Chromosomensortierung und DNA-Amplifikation mitDOP-PCR wurden chromosomenspezifische Sonden für die Makrochromosomen 1 bis 8 undZ, sowie Fraktionen von Mikrochromosomen hergestellt. Die Spezifität der Sondenwurde in FISH-Experimenten („Chomosome Painting“) auf Metaphasepräparaten vonHühnerfibroblasten nachgewiesen.

Mit Hilfe von drei unterschiedlich markierten Sonden-Pools wurde versucht, die größen-abhängige Verteilung von Chromosomen im Zellkern aufzuklären: Pool 1 umfaßte dieMakrochromosomen 1 bis 5 und Z, Pool 2 die größenmäßig zwischen den Makro- undMikrochromosomen gelegenen Chromosomen 6 bis 10 und Pool 3 umfaßte 19 Mikro-chromosomen.

Die mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommenen digitalen Rohbilderlichtoptischer Serienschnitte von Zellkernen wurden mit Hilfe mathematischer Verfahrenzur Korrektur von Abbildungsfehlern und zur Verbesserung der Bildinformation bearbeitet.An Hand der restaurierten lichtoptischen Serienschnitte von Zellkernen wurdendreidimensionale Computermodelle erstellt.

Zusammenfassung 82

Painting der Hühnerchromosomen im Zellkern zeigt klar voneinander abgegrenzteChromosomenterritorien. Makro- und Mikrochromosomen erscheinen aufgebaut ausunterschiedlich dicht gepackten, teils durch Brücken miteinander verbundenenChromatindomänen von 400 bis 800 nm. Die Territorien der Makrochromosomen breitensich unterhalb der Kernoberfläche aus mit unterschiedlich weit ins Kerninnere reichendenAusläufern. In Fibroblasten und neuronalen Zellen liegen die Mikrochromosomen nichtdisseminiert im Zellkern, sondern lagern sich zu Clustern zusammen, die schwerpunktmäßigim Inneren des Zellkerns um einen oder zwei Nukleoli angeordnet sind. Regelmäßiggrenzen jedoch auch Mikrochromosomencluster bzw. einzelne Mikrochromosomen an denKernrand. Die meist flachen, elliptoiden Fibroblastenkerne, die in Mischpopulationen ausprolifierenden und nichtproliferierenden Zellen analysiert wurden, zeigten eine ausgeprägteVariabilität der Form und häufig mehre getrennte Mikrochromosomenkluster, während dieeinheitlich rundlichen Zellkerne der nicht proliferierenden neuronalen Zellen einenzusammenhängenden, um große Nukleolen angeordneten Mikrochromosomenclusterbesitzen.

Eine quantitative Auswertung zeigte, daß die Gruppe der Mikrochromosomen in Zell-kernen beider Zelltypen eine statistisch signifikant zentralere Position einnimmt als dieGruppen der größeren Chromosomen. Die Mikrochromosomenfraktion macht etwa 35%des Hühnergenoms aus, enthält jedoch etwa 75% der Gene und besteht überwiegend ausfrühreplizierendem Chromatin. Die bevorzugte Positionierung dieses Chromatins im Zell-kerninneren korrespondiert gut mit der auch in menschlichen Zellkernen gefundenenVerteilung des genreichen, frühreplizierenden Chromatins.

Prometaphaserosetten embryonaler Fibroblasten zeigten stets einen zentralen runden bissternförmigen Mikrochromosomencluster, umgeben von einem mehr oder wenigergeschlossenen Kranz von Makrochromosomen. Diese zweidimensionale Anordnung bleibtbis zur Telophase erhalten.

Mit Hilfe einer kombinatorische Markierung mit drei Fluorochromen wurden dieMakrochromosomen 1 bis 6 und Z in kultivierten embryonalen Fibroblasten und Neuronenverschiedenfarbig dagestellt. Dabei zeigten sich exklusive Chromosomenterritorien mitsehr variabler Gestalt und komplex gefalteten Rändern. Insbesondere bei den Neuronenwurden komplexe Kontaktzonen zwischen benachbarten Territorien mit ausgedehnte In- undEvaginationen und einer Verzahnung randständiger Chromatin-Domänen gefunden. In denFibroblastenkernen wurden dagegen meist kompaktere Formen der Chromosomen-territorien beobachtet. In beiden Zelltypen erscheinen die Lagebeziehungen derMakrochromosomen sehr variabel. Territorien homologer Chromosomen können anein-andergrenzen oder auch weit voneinander entfernt liegen. Postmitotische Schwesterkernezeigten eine weitgehend identische bzw. spiegelsymmetrische Anordnung der Makro-chromosomen 1 bis 6 und Z, die jedoch in verschiedenen Schwesterkernpaaren starkvariierte.

Diese Befunde sprechen klar gegen eine eindeutig festgelegte Chromosomenanordnung imZellkern, sondern insgesamt für statistisch bevorzugte Kernpositionen individuellerChromosomenterritorien in Abhängigkeit von ihrer Größe sowie ihrer Zusammensetzungaus genarmem, spätreplizierendem sowie genreichem, frühreplizierendem Chromatin.

Literatur 83

6 Literatur

Allison D. C., and Nestor A. L. (1999). Evidence for a Relatively Random Array ofHuman Chromosomes on the Mitotic Ring. Journal of Cell Biology 145: 1 - 14.

Bates G. P., Wainwright B. J., Williamson R., and Brown S. D. (1986). Microdissection ofand microcloning from the short arm of human chromosome 2. Molecular Cell Biology 6:3826 - 3830.

Berezney R., Dubey D., and Huberman J. (2000). Heterogeneity of eukaryotic replicons,replicon clusters, and replication foci. Chromosoma 108: 471 - 484.

Berezney R., Mortillaro M. J., Ma H., Wei X., and Samarabandu J. (1995). The nuclearmatrix: a structural milieu for genomic function. International Reviews of Cytology: 1 - 65.

Bin S. H., and Hiroki Y. (1999). Correlated positioning of homologous chromosomes indaughter fibroblast cells. Chromosome Research 7: 603 - 610.

Bischoff A., Albers J., Kharboush I., Stelzer E. H., Cremer T., and Cremer C. (1993).Differences of size and shape of active and inactive X-chromosome domains in humanamniotic fluid cell nuclei. Microscopy Research and Technique 25: 68 - 77.

Boveri T. (1909). Die Blastomerenkerne von Ascaris megalocephala und die Theorie derChromosomenindividualität. Arch. Zellforschung 3: 181 - 286.

Brakenhoff G. J., Blom P., and Barends P. (1979). Confocal scanning light microscopywith high aperture immersion lenses. Journal of Microscopy 117: 219 - 232.

Brakenhoff G. J., van der Voort H. T. M., van Spronsen E. A., Linnemans W. A. M., andNanninga N. (1985). Three-dimensional chromatin distribution in neuroblastoma nucleishown by confocal scanning laser microscopy. Nature 317: 748 - 749.

Brero A. (1999). Grössenabhängige Verteilung von Chromosomenterritorien inmenschlichen Fibroblasten. Diplomarbeit, Institut für Anthropologie und Humangenetik derLudwig-Maximilians-Universität München.

Bridger J. M., Boyle S., Kill I. R., and Bickmore W. A. (2000). Re-modelling of nucleararchitecture in quiescent and senescent human fibroblasts. Current Biology 10: 149 - 152.

Burkin D. J., O'Brian P., Broad T. E., Hill D. F., Jones C. A., Wienberg J., andFerguson-Smith M. (1997). Isolation of chromosome-specific paints from high-resolutionflow karyotypes of the sheep (Ovis aries). Chromosome Research 5: 102 - 108.

Burt D. W., Bruley C., Dunn I. C., Jones C. T., Ramage A., Law A. S., Morrice D. R.,Paton I. R., Smith J., Windsor D., Sazanov A., Fries R., and Waddington D. (1999). Thedynamics of chromosome evolution in birds and mammals. Nature 402: 411 - 413.

Carter N. P. (1994). Cytogenetic analysis by chromosome painting. Cytometry 18: 2 - 20.

Literatur 84

Carter N. P., Ferguson-Smith M. E., Affara N. A., Briggs H., and Ferguson-Smith M. A.(1990). Study of X chromosome abnormality in XX males using bivariate flow karyotypeanalysis and flow sorted dot blots. Cytometry 11: 202 - 207.

Chandley A. C., Speed R. M., and Leitch A. R. (1996). Different distributions ofhomologous chromosomes in adult human Sertoli cells and in lymphocytes signify nucleardifferentiation. Journal of Cell Science 109: 773 - 776.

Chowdhary B. P., Raudsepp T., Frönicke L., and Scherthan H. (1998). Emerging patternsof comparative genome organization in some mammalian species as revealed by ZOO-FISH. Genome Research 8: 577 - 589.

Craig J. M., and Bickmore W. A. (1994). The distribution of CpG islands in mammalianchromosomes. Nature Genetics 7: 376 - 382.

Cremer C., and Cremer T. (1978). Considerations on a laser-scanning-microscope withhigh resolution and depth of field. Microscopica Acta 81: 31 - 44.

Cremer C., Münkel C., Granzow M., Jauch A., Dietzel S., Eils R., Guan X.-Y., MeltzerP. S., Trent J. M., Langowski J., and Cremer T. (1996). Nuclear architecture and theinduction of chromosomal aberrations. Mutation Research.

Cremer T., Dietzel S., Eils R., Lichter P., and Cremer C. (1995). Chromosome territories,nuclear matrix filaments and interchromatin channels: A topological view on nucleararchitecture and function. In "Kew Chromosome Conference IV" (P. E. Bradham, and M.D. Benett, Eds.), pp. 63 - 81, Royal Botanic Gardens, Kew.

Cremer T., Kurz A., Zirbel R., Dietzel S., Rinke B., Schröck E., Speicher M. R., MathieuU., Jauch A., Emmerich P., Scherthan H., Ried T., Cremer C., and Lichter P. (1993).Role of Chromosome Territories in the Functional Compartmentalization of the CellNucleus. In "Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Volume LVIII", pp.pp. 777 - 792, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Croft J. A., Bridger J. M., Boyle S., Perry P., Teague P., and Bickmore W. A. (1999).Differences in the Localization and Morphology of Chromosomes in the Human Nucleus.Journal of Cell Biology 145: 1119 - 1131.

Davies K. E., Young B. D., Elles R G., Hill M. E., and Williamson R. (1981). Cloning ofa representative genomic library of the human X chromosome after sorting by flowcytometry. Nature 293: 374 - 376.

Deloukas P., Schuler G. D., Gyapay G., Beasley E. M., Soderlund C., Rodriguez-TomeP., Hui L., Matise T. C., McKusick K. B., Beckmann J. S., Bentolila S., Bihoreau M.,Birren B. B., Browne J., Butler A., Castle A. B., Chiannilkulchai N., Clee C., Day P. J.,Dehejia A., Dibling T., Drouot N., Duprat S., Fizames C., and Bentley D. R. e. a. (1998).A physical map of 30.000 human genes. Science 282: 744 - 746.

Dietzel S., Jauch A., Kienle D., Qu G., Holtgreve-Grez H., Eils R., Münkel C., BittnerM., Meltzer P. S., Trent J. M., and Cremer T. (1998). Separate and variably shapedchromosome arm domains are disclosed by chromosome arm painting in human cell nuclei.Chromosome Research 6: 25 - 33.

Literatur 85

Dietzel S., Schiebel K., Little G., Edelmann P., Rappold G. A., Eils R., Cremer C., andCremer T. (1999). The 3D Positioning of ANT2 and ANT3 Genes within Female XChromosome Territories Correlates with Gene Activity. Experimental Cell Research 252:363 - 375.

Dietzel S., Weilandt E., Eils R., Münkel C., Cremer C., and Cremer T. (1995). Three-dimensional distribution of centromeric or paracentromeric heterochromatin ofchromosomes 1, 7, 15 and 17 in human lymphocyte nuclei studied with light microscopicaxial tomography. Bioimaging 3: 121 - 133.

Dutrillaux B., Couturier J., Richer C.-L., and Viegas-Pequignot E. (1976). Sequence ofDNA replication in 277 R- and Q-bands of human chromosomes using a BrdU treatment.Chromosoma 58: 51 - 61.

Edelmann P., Esa A., Hausmann M., and Cremer C. (1999). Confocal laser-scanningfluorescence microscopy: In situ determination of the confocal point-spread function and thechromatic shifts in intact cell nuclei. Optik 110: 194 - 198.

Eils R., Dietzel S., Bertin E., Schröck E., Speicher M. R., Ried T., Robert-Nicoud M.,Cremer C., and Cremer T. (1996). Three-dimensional reconstruction of painted humaninterphase chromosomes: active and inactive X chromosome territories have similarvolumes but differ in shape and surface structure. Journal of Cell Biology 135: 1427 - 1440.

Elgar G. (1996). Quality not quantity: The pufferfish genome. Humen Molecular Genetics5: 1437 - 1442.

Emmerich P., Loos P., Jauch A., Hopman A. H., Wiegant J., Higgins M., White B. N.,van der Ploeg M., Cremer C., and Cremer T. (1989). Double in situ hybridization incombination with digitized image analysis. Experimental Cell Research 181: 126 - 140.

Ferguson-Smith M. A. (1997). Genetic analysis by chromosome sorting and painting:phylogenetic and diagnostic applications. Human Genetics 5: 253 - 265.

Ferreira J., Paolella G., Ramos C., and Lamond A. I. (1997). Spatial Organization ofLarge-Scale Chromatin Domains in the Nucleus: A Magnified View of Single ChromosomeTerritories. Journal of Cell Biology 139: 1597 - 1610.

Fillon V., Morisson M., Zoorob R., Auffray C., Douaire M., Gellin J., and Vignal A.(1998). Identification of 16 chicken microchromosomes by molecular markers using two-colour fluorescence in situ hybridization (FISH). Chromosome Research 6: 307 - 313.

Fisher E. M. C., Cavanna J. S., and Brown S. D. M. (1985). Microdissection andmicrocloning of the mouse X chromosome. Proceedings of the National Academy ofScience 82: 5846 - 5949.

Griffin D. K., Habermann F., Masabanda J., O'Brien P., Bagga M., Sazanov A., Smith J.,Burt D. W., Ferguson-Smith M., and Wienberg J. (1999). Micro- and macrochromosomepaints generated by flow cytometry and microdissection: tools for mapping the chickengenome. Cytogenetics and Cell Genetics 87: 278 - 281.

Literatur 86

Groenen M. A. M., Cheng H. H., Bumstead N., Benkel B. F., Briles B. E., Burke T.,Burt D. W., Crittenden L. B., Dodgson J., Hillel J., Lamont S., Ponce de Leon A., SollerM., Takahashi H., and Vignal A. (2000). A Consensus Linkage Map of the ChickenGenome. Genome Research 10: 137 - 147.

Guan X.-Y., Meltzer P. S., and Trend J. M. (1994). Rapid generation of wholechromosome painting probes (WPCs) by chromosome microdissection. Genomics 22: 101 -107.

Guan X.-Y., Trend J. M., and Melzer P. S. (1993). Generation of band-specific paintingprobes from a single microdissected chromosome. Human Molecular Genetics 2: 1117 -1121.

Guan X.-Y., Zhang H., Bittner M., Jiang Y., Meltzer P. S., and Trend J. M. (1996).Chromosome arm painting probes. Nature Genetics 12: 10 - 11.

Guillier-Gencik Z., Bernheim A., and Coullin P. (1999). Generation of whole-chromosomepainting probes specific to each chicken macrochromosome. Cytogenetics and Cell Genetics87: 282 - 285.

Hedges S. B., Parker P. H., Sibley C. G., and Kumar S. (1996). Continental breakup andthe ordinal diversification of birds and mammals. Nature 381: 226 - 229.

Hens L., Kirsch-Volders M., Verschaeve L., and Susanne C. (1982). The centrallocalization of the small and early replicating chromosomes in human diploid metaphasefigures. Human Genetics 60: 249 - 256.

Hopwood D. (1969). Fixatives and fixation: a review. Histochemical Journal 1: 323 - 360.

Hughes A. L., and Hughes M. K. (1995). Small genomes for better flyers. Nature 377:391.

Jackson D. A., and Pombo A. (1998). Replication Clusters Are Stable Units ofChromosome Structure: Evidence That Nuclear Organization Contributes to the EfficientActivation and Propagation of S Phase in Human Cells. Journal of Cell Biology 140: 1285 -1295.

Kaelbling M., and Fechheimer N. S. (1983). Synaptenomal complexes and the chromosomecomplement of domestic fowl, Gallus domesticus. Cytogenetics and Cell Genetics 75: 87 -92.

Kirsch-Volders M., Hens L., and Susanne C. (1980). Telomere and Centromer associationtendencies in the human male metaphase complement. 1980: 69 - 77.

Knehr S., Zitzelsberger M., Braselmann H., Nahrstedt U., and Bauchinger M. (1996).Chromosome analysis by fluorescence in situ hybridization: further indications for a non-DNA-proportional involvement of single chromosomes in radiation-induced structuralaberrations. International Journal of Radiation Biology 70: 385 - 392.

Korenberg J. R., and Rykowski M. C. (1988). Human genome organization: Alu, Lines,and the molecular structure of metaphase chromosome bands. Cell 53: 391 - 400.

Literatur 87

Kozubek S., Lukasova E., Mareckova A., Skalnikova M., Kozubek M., Bartova E., KrohaV., Krahulcova E., and Slotova J. (1999). The topological organization of chromosomes 9and 22 in cell nuclei has a determinative role in the induction of t(9,22) translocations and inthe pathogenesis of t(9,22) leukemias. Chromosoma 108: 426 - 435.

Kumar S., and Hedges B. (1998). A molecular timescale for vertebrate evolution. Nature392: 917 - 920.

Kurzrock R., Gutterman J. U., and Talpaz M. (1988). The molecular genetics ofPhiladelphia chromosome-positive leukemias. New England Journal of Medicine 319: 990 -998.

Lamond A. I., and Earnshaw W. C. (1998). Structure and function in the nucleus. Science280: 547 - 553.

Langford C. F., Telenius H., Miller N. G., Thomsen P. D., and Tucker E. M. (1993).Preparation of chromosome-specific paints and complete assignment of chromosomes in thepig flow karyotype. Animal Genetics 24: 261 - 267.

Leitch A. R., Brown J. K., Mosgoller W., Schwarzacher T., and Heslop-Harrison J.(1994). The spatial localization of homologous chromosomes in human fibroblasts atmitosis. Human Genetics 93: 275 - 280.

Leitch A. R., Mosgoller W., Schwarzacher T., Bennet M. D., and Heslop-Harrison J.(1990). Genomic in situ hybridization to sectioned nuclei shows chromosome domains ingrass hybrids. Journal of Cell Science 95: 335 - 341.

Lengauer C., Eckelt A., Weith A., Endlich N., Ponelies N., Lichter P., Greulich K. O.,and Cremer T. (1991). Painting of defined chromosomal regions by in situ suppressionhybridization of libraries from laser-microdissected chromosomes. Cytogenetics and CellGenetics 56: 27 - 30.

Lesko S. A., Callahan D. E., LaVilla M. E., Wang Z.-P., and Ts'o P. O. P. (1995). Theexperimental Homologous and Heterologous Separation Distance Histograms for theCentromeres of Chromosomes 7, 11, and 17 in Interphase Human T-Lymphocytes.Experimental Cell Research 219: 499 - 506.

Lichter P. (1997). Multicolor FISHing: what's the catch? Trends in Genetics 13: 475 - 479.

Lichter P., Cremer T., Borden J., Manuelidis L., and Ward D. C. (1988). Delineation ofindividual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppressionhybridization using recombinant DNA libraries. Human Genetics 80: 224 - 234.

Lüdecke H.-J., Senger G., Claussen U., and Horsthemke B. (1989). Cloning definedregions of the human genome by microdissection of banded chromosomes and enzymaticamplification. Nature 338: 348 - 350.

Ma H., Samarabandu J., Devdhar R. S., Acharya R., Cheng P.-c., Meng C., and BerezneyR. (1998). Spatial and Temporal Dynamics of DNA Replication Sites in Mammalian Cells.Journal of Cell Biology 143: 1415 - 1425.

Literatur 88

Manders E. M. (1999). Direct imaging of DNA in living cells reveals the dynamics ofchromosome formation. Journal of Cell Biology 144: 813 - 821.

Manuelidis L. (1985). Individual interphase chromosome domains revealed by in situhybridization. Human Genetics 71: 288 - 293.

McQueen H. A., Fantes J., Cross S. H., Clark V. H., Archibald A., and Bird A. P.(1996). CpG islands of chicken are concentrated on michrochromosomes. Nature Genetics12: 321 - 324.

McQueen H. A., Siriaco G., and Bird A. P. (1998). Chicken Microchromosomes AreHyperacetylated, Early Replicating, and Gene Rich. Genome Research 8: 621 - 630.

Minsky M. (1961). Microscopy Apparatus, US Patent #3.013.467, Dec. 19, 1961, (FiledNov. 7, 1957).

Mosgoller W., Leitch A. R., Brown J. K., and Heslop-Harrison J. (1991). Chromosomearrangements in human fibroblasts at mitosis. Human Genetics 88: 27 - 33.

Müller S., Stanyon R., O'Brien P. C., Ferguson-Smith M. A., Plesker R., and Wienberg J.(1999). Defining the ancestral karyotype of all primates by multidirectional chromosomepainting between tree shrews, lemurs and humans. Chromosoma 108: 393 - 400.

Nagele R. G., Freeman T., Fazekas J., Lee K.-M., Thomson Z., and Lee H.-Y. (1998).Chromosome spatial order in human cells: evidence for early origin and faithfulpropagation. Chromosoma 107: 330 - 338.

Nagele R. G., Freeman T., McMorrow L., and Lee H.-Y. (1995). Precise SpatialPositioning of Chromosomes during Prometaphase: Evidence for Chromosomal Order.Science 270: 1831 - 1835.

Nagele R. G., Freeman T., McMorrow L., Thomson Z., Kitson-Wind K., and Lee H.(1999). Chromosomes exhibit preferential positioning in nuclei of quiescent human cells.Journal of Cell Science 112: 525 - 535.

Nakamura H., Morita T., and Sato C. (1986). Structural organizations of replicationdomains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. Experimental CellResearch 165: 291-297.

Nakayasu H., and Berezney R. (1989). Mapping replicational sites in the eucaryotic cellnucleus. Journal of Cell Biology 108: 1-11.

Nanda I., Shan Z., Schartl M., Burt D. W., Michael K., Nothwang H.-G., Grützner F.,Paton I. R., Windsor D., Dunn I. C., Engel W., Staeheli P., Mizuno S., Haaf T., andSchmid M. (1999). 300 million years of conserved synteny between chicken Z and humanchromosome 9. Nature Genetics 21: 258 - 259.

Nederlof P. M., Robinson D., Abunesha R., Wiegant J., Hopman A. H., Tanke H. J., andRaap A. K. (1989). Three-color fluorescence in situ hybridization for the simultaneousdetection of multiple nucleic acid sequences. Cytometry 10: 10 - 27.

Literatur 89

Nederlof P. M., Wiegant S., Raap A. K., Tanke H. J., Ploem J. S., and van der Ploeg M.(1990). Multiple fluorescence in situ hybridization. Cytometry 11: 126 - 131.

O'Brien S. J., Menotti-Raymond M., Murphy W. J., Nash W. G., Wienberg J., StanyonR., Copeland N. G., Jenkins N. A., Womack J. E., and Marshall Graves J. A. (1999). Thepromise of comparative genomics in mammals. Science 286: 458 - 481.

Pawley J. B. (1995). Fundamental limits in confocal microscopy. In "Handbook ofbiological confocal microscopy" (J. B. Pawley, Ed.), pp. 19 - 37, Plenum Press, NewYork.

Peruche B., Ahlemeyer B., Brungs H., and Krieglstein J. (1990). Cultured neurons fortesting antihypoxic drug effects. Journal of Pharmacological Methods 23: 63 - 77.

Pettmann B., Louis J. C., and M S. (1979). Morphological and biochemical maturation ofneurones cultured in the absence of glial cells. Nature 281: 378 - 380.

Pinkel D., Landegent J., Collins C., Fuscoe J., Segraves R., Lucas J., and Gray J. W.(1988). Fluorescence in situ hybridization with human chromosome-specific libraries:detection of trisomy 21 and translocations of chromosome 4. Proceedings of the NationalAcademy of Science 85: 9138 - 9142.

Pinkel D., Straume T., and Gray J. W. (1986). Cytogenetic analysis using quantitative,high sensitivity, fluorescence hybridization. Proceedings of the National Academy ofScience 83: 2934 - 2938.

Ponce de Leon F. A., Li Y., and Weng Z. (1992). Early and Late ReplicativeChromosomal Banding Patterns of Gallus domesticus. Journal of Heredity 83: 36 - 42.

Popp S., Scholl H. P., Loos P., Jauch A., Stelzer E., Cremer C., and Cremer T. (1990).Distribution of Chromosome 18 and X Centric Heterochromatin in the Interphase Nucleusof Cultured Human Cells. Experimental Cell Research 189: 1 - 12.

Pyrpasopoulou A., Meier J., Maison C., Simos G., and Georgatos S. D. (1996). The laminB receptor (LBR) provides essential chromatin docking sites at the nuclear envelope. EMBOJournal 15: 7108 - 7119.

Rabbitts P., Impey H., Heppel-Parton A., Langford C., Tease C., Lowe N., Bailey D.,Ferguson-Smith M., and Carter N. P. (1995). Chromosome specific paints from a highresolution flow karyotype of the mouse. Nature Genetics 9: 369 - 375.

Rabl C. (1885). Über Zelltheilung. In "Morphologisches Jahrbuch", pp. 214 - 330.

Ried T., Schröck E., Ning Y., and Wienberg J. (1998). Chromosome painting: a useful art.Human Molecular Genetics 7: 1619 - 1626.

Roberts I., Wienberg J., Nacheva E., Grace C., Griffin D. K., and Coleman N. (1999).Novel Method for the Production of Multiple Colour Chromosome Paints for Use inKaryotyping by Fluorescence in situ Hybridisation. Genes, Chromosomes & Cancer 25: 241- 250.

Literatur 90

Rodionov A. V. (1996). Micro versus Macro: A Review of Structure and Functions ofAvian Micro- and Macrochromosomes. Russian Journal of Genetics 32: 517 - 527.

Rodionov A. V. (1997). Evolution of Avian Chromosomes and Linkage Groups. RussianJournal of Genetics 33: 605 - 617.

Röhme D., Fox H., Frischauf A. N., Edström J.-E., Maius P., Silver L. M., and LeharchH. (1984). Molecular clones of the mouse t complex derived from microdissectedmetaphase chromosomes. Cell 36: 783 - 788.

Rowley J. (1999). The role of chromosome translocations in leukemogenesis. Seminars inHematology 36: 59 - 72.

Sadoni N., Langer S., Fauth C., Bernardi G., Cremer T., and Turner B. M. (1999).Nuclear Organization of Mammalian Genomes: Polar Chromosome Territories Build UpFunctionally Distinct Higher Order Compartments. Journal of Cell Biology 146: 1211 -1226.

Scalenghe F., Turco E., Edström J.-E., Pirotta V., and Melli M. L. (1981).Microdissection and cloning of DNA from a specific region of Drosophila melanogasterpolytene chromosomes. Chromosoma 82: 205 - 216.

Schardin M., Cremer T., Hager H. D., and Lang M. (1985). Specific staining of humanchromosomes in Chinese Hamster x man hybrid cell lines demonstrates interphasechromosome territories. Human Genetics 71: 281 - 287.

Schmid M., Enderle E., Schindler D., and Schempp W. (1989). Chromosome banding andDNA replication patterns in bird karyotypes. Cytogenetics and Cell Genetics 52: 239 - 146.

Schmid M., Vogel W., and Krone W. (1975). Attraction between centric heterochromatinof human chromosomes. Cytogenetics and Cell Genetics 15: 66 - 80.

Schrader M., Hell S. W., and van der Voort H. T. M. (1998). Three-dimensional super-resolution with a 4Pi-confocal microscope using image restoration. Journal of applied Pysics84: 4033 - 4042.

Schröck E., du Manoir S., Veldman T., Schoell B., Wienberg J., Ferguson-Smith M. A.,Ning Y., Ledbetter D. H., Bar-Am I., Soenksen D., Garini Y., and Ried T. (1996).Multicolor Spectral Karyotyping of Human Chromosomes. Science 273: 494 - 497.

Senger G., Lüdecke H.-J., Horsthemke B., and Claussen U. (1990). Microdissection ofbanded human chromosomes. Human Genetics 84: 507 - 511.

Sheppard C. J. R., Gan X., Gu M., and Roy M. (1995). Signal-to-noise in confocalmicroscopes. In "Handbook of Biological Confocal Microscopy" (J. B. Pawley, Ed.), pp.pp. 363 - 371, Plenum Press, New York.

Shetty S., Griffin D. K., and JA G. (1999). Comparative painting reveals strongchromosome homology over 80 million years of bird evolution. Chromosome Research 7:289 - 295.

Literatur 91

Smith J., and Burt D. W. (1998). Parameters of the chicken genome (Gallus gallus).Animal Genetics 29: 290 - 294.

Speicher M. R., Ballard S. G., and Ward D. C. (1996). Karyotyping human chromosomesby combinatorial multifluor FISH. Nature Genetics 12: 368 - 375.

Sun H. B., and Yokota H. (1999). Correlated positioning of homologous chromosomes indaughter fibroblast cells. Chromosome Research 7: 603 - 610.

Tanaka K., Kamada N., Ohkita T., and Kuramoto A. (1983). Nonrandom distribution ofchromosome breaks in lymphocytes of atomic bomb survivors. Journal of RadiationResearch 24: 291 - 304.

Tanaka K., Popp S., Fischer C., van Kaick G., Kamada N., Cremer T., and Cremer C.(1996). Biological dosimetry in atomic bomb survivors and Thorotrast patients using two-and three-color chromosome painting of chromosomal subsets. International Journal ofRadiation Biology 70: 95 - 108.

Tanke H. J., Wiegant J., van Gijlswijk R., Bezrookove V., Pattenier H., Heetebrij R.,Talman E., Raap A. K., and Vrolijk J. (1999). New strategy for multi-colour fluorescencein situ hybridisation: COBRA: COmbined Binary RAtio labelling. European Journal ofHuman Genetics 7: 2 - 11.

Telenius H., Carter N. P., Bebb C. E., Nordenskjöld M., Ponder B. A. J., and TunnacliffeA. (1992a). Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNAby a single degenerate primer. Genomics 13: 718 - 725.

Telenius H., Pelmear A. H. P., Tunnacliffe A., Carter N. P., Behmel A., Ferguson-SmithM. A., Nordenskjöld M., Pfragner R., and Ponder B. A. J. (1992b). Cytogenetic analysisby chromosome painting using DOP-PCR amplified flow-sorted chromosomes. Genes,Chromosomes & Cancer 4: 257 - 263.

Tiersch T. R., and Wachtel S. S. (1991). On the evolution of genome size of birds. Journalof Heredity 82: 363 - 368.

van der Voort H. T. M., and Strasters K. C. (1995). Restoration of Confocal Images forQuantitative Image Analysis. Journal of Microscopy 178: 165 -.

van Kempen G. M. P., van Vliet P. J., Verveer P. J., and van der Voort H. T. M. (1997).A quantitative comparison of image restoration methods for confocal microscopy. Journal ofMicroscopy 185: 354 - 365.

Verveer P. J., Gemkow M. J., and Jovin T. M. (1999). A comparison of image restorationapproaches applied to three-dimensional confocal and wide-field fluorescence microscopy.Journal of Microscopy 193: 50 - 61.

Visser A. E., Eils R., Jauch A., Little G., Bakker P. J. M., Cremer T., and Aten J. A.(1998). Spatial distributions of early and late replicating chromatin interphase chromosometerritories. Experimental Cell Research 243: 398 - 407.

Literatur 92

Volm T. (1992). Gibt es eine größenabhängige Verteilung von Chromosomen inmenschlichen kultivierten Fruchtwasserzellkernen? In "Fakultät der Theoretischen Medizinder Medizinischen Gesamtfakultät", Rupprecht-Karls-Universität Heidelberg.

Vooijs M., Yu L.-C., Tkachuk D., Pinkel D., Johnson D., and Gray J. W. (1993).Libraries for each human chromosome, constructed from sorter-enriched chromosomes byusing linker-adaptor PCR. American Journal of Human Genetics 52: 586 - 597.

White M. J. D. (1961). "Methuen's Monographes on Biological subjects: TheChromosomes," Methuen & Co Ltd., Londen.

Wienberg J., and Stanyon R. (1997). Comparative painting of mammalian chomosomes.Current Opinion in Genetics & Development 7: 784 - 791.

Wijnaends van Resandt R. W., Marsman H. J. B., Kaplan R., Davoust J., Stelzer E. H.K., and Stricker R. (1985). Optical fluorescence microscopy in 3 dimensions:microtomoscopy. Journal of Microscopy 138: 29 - 34.

Wischnitzer S. (1973). The submicroscopic morphology of the interphase nucleus.International Reviews of Cytology 34: 1 - 48.

Wollenberg C., Kiefaber M. P., and Zang K. D. (1982). Quantitative studies on thearrangement of human metaphase chromosomes. IX. Arrangement of chromosomes withand without spindle apparatus. Human Genetics 62: 310 - 315.

Zink D., Bornfleth H., Visser A., Cremer C., and Cremer T. (1999). Organization of earlyand late replicating DNA in human chromosome territories. Experimental Cell Research 25:176 - 188.

Zink D., Cremer T., Saffrich R., Fischer R., Trendelenburg M. F., Ansorge W., andStelzer E. H. (1998). Structure and dynamics of human interphase chromosome territoriesin vivo. Human Genetics 102: 241 - 151.

Danksagung 93

Danksagung

Ich bedanke mich bei Prof. Thomas Cremer dafür, daß er es mir ermöglichte, in diesemfaszinierenden Forschungsgebiet zu arbeiten, und vor allem für seine Hilfe in schwierigenSituationen.

Ich bedanke mich bei Priv.-Doz. Dr. Johannes Wienberg. Er ermöglichte im Rahmen seinesForschungsprojekts zur Evolution des Genoms der Vertebraten mittels Fluoreszenz in situHybridisierung, einem Projekt des Deutschen Humangenomprojekts (DHGP), dieFinanzierung meiner Arbeit und meinen Aufenthalt am Department of Pathology inCambridge.

Diese Arbeit ist das Ergebnis einer Zusammenarbeit mit vielen Menschen unterschiedlicherHerkunft, Ausbildung und Fachrichtung:

Die Herstellung der chromosomenspezifischen DNA-Sonden von Gallus domesticus erfolgteam Department of Pathology der University of Cambridge. Ich bedanke mich bei Prof.Malcolm Ferguson-Smith und den Mitarbeitern, die mich so freundlich aufnahmen und michmit großer Hilfsbereitschaft unterstützten, insbesondere bei Trish O’Brien, die sehrerfolgreich die durchflußzytometrische Chromosomensortierung durchführte, bei Dr.Darren Griffin, Meena Bagga, Dr. Wim Rens und Dr. Andrea Kofler.

Ich bedanke mich bei Johann von Hase aus der Arbeitsgruppe von Prof. Christoph Cremeram Institut für angewandte Physik der Universität Heidelberg für die quantitativen undstatistischen Auswertungen.

Ich bedanke mich bei den Kollegen der Arbeitsgruppe Thomas Cremer am Institut fürAnthropologie in München für die wunderbare Arbeitsatmospäre. Ich bedanke mich bei Dr.Irina Solovei, von der ich viel gelernt habe, bei Dr. Marion Cremer, die mir mit ihrerPragmatik sehr geholfen hat, bei Dr. Satoshi Tashiro, Dr. Stefan Müller, LotharSchermelleh, Florian Karpf, Sandro Brero, Michaela Neusser, bei Robert Martin für seinestets geduldige und kundige Hilfe bei Problemen mit MAC-Computern, Standardsoftwareetc...Besonderem Dank schulde ich Dipl.-Phys. Joachim Walter: Ohne seine zuverlässige undkluge Hilfe wäre vieles nicht möglich gewesen. Er programmierte u. a. die Steuerung deskonfokalen Laser-Scanning-Mikroskops, brachte jede Art von Software zum Laufen etc.und erklärte geduldig einem Nicht-Physiker physikalische Sachverhalte.

Lebenslauf 94

Lebenslauf

Felix A. Habermann, geboren am 16.04.1959 in Münchenverheiratet, 1 Sohn

1965 – 1978 Grundschule in Buchendorf bei MünchenLudwigs-Gymnasium in München

1978 Abitur

1978 – 1980 Studium der Kunstgeschichte an derLudwig-Maximilians-Universität München

1980 – 1986 Studium der Humanmedizin an derLudwig-Maximilians-Universität MünchenFreies Fach: Kinderheilkunde

1986 Approbation als Arzt

1987 – 1992 Wissenschaftlicher Mitarbeiter am Pathologischen Institutder Ludwig-Maximilians-Universität MünchenAbteilung für Experimentelle MedizinLeitung: Prof. Dr. med. H. M. Rabes

1992 – 1994 Ausbildung medizinische Informatik bei derISP data GmbH, München

1994 Praktikum im Medis-Institut im GSF Forschungszentrum fürUmwelt und Gesundheit, Oberschleißheim

1994 – 1997 Hausmann

Sept. 1997 – Dez. 1999 Doktorand amInstitut für Anthropologie und Humangenetikder Ludwig-Maximilians-Universität MünchenLeitung: Prof. Dr. med. Thomas Cremer

seit Jan. 2000 Wissenschaftlicher Mitarbeiter amLehrstuhl für Tierzucht der Technischen Universität München,Freising-WeihenstephanLeitung: Prof. Dr. R. Fries

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Untersuchungen zur Anordnung von Makro- und ...habermann.userweb.mwn.de/publications/fah_diss.pdf · Einleitung 1 1 Einleitung Höher entwickelte Organismen bestehen aus mehreren