Untersuchungen zur bakteriellen Erkrankung an Feldsalat...von Inga Braje aus Wilhelmshaven 2012 2 Die vorliegende Arbeit wurde am 16.03.2012 von der Fakultät Agrarwissenschaften der

Aus dem Institut für Phytomedizin Universität Hohenheim

Fachgebiet Phytomedizin Privatdozent Dr. Jan Hinrichs-Berger

In Zusammenarbeit mit dem Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum – Rheinpfalz

Abteilung Gartenbau Neustadt an der Weinstraße

Untersuchungen zur bakteriellen Erkrankung Acidovorax valerianellae an Feldsalat

Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors

„Doktor der Agrarwissenschaften“ (Dr.sc.agr./ Ph.D. in Agricultural Sciences)

vorgelegt

der Fakultät Agrarwissenschaften

von

Inga Braje aus Wilhelmshaven

2012

2

Die vorliegende Arbeit wurde am 16.03.2012 von der Fakultät Agrarwissenschaften

der Universität Hohenheim als „Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors

der Agrarwissenschaften“ angenommen.

Tag der mündlichen Prüfung: 16.04.2012

1. Prodekan: Prof. Dr. A. Fangmeier

1. Prüfer: Dr. J. Hinrichs-Berger

2. Prüfer: Prof. Dr. W. Claupein

Prüfer: Prof. Dr. M. Kruse

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Die Arbeit wurde unter dem Titel „Untersuchungen zur Biologie und Entwicklung praxis-relevanter Nachweismethoden für bakterielle Erkrankungen an Feldsalat [Valerianella locusta (L.)] als Grundlage für die Selektion von Resistenzquellen gegen den Erreger von Blattflecken (Acidovorax valerianellae sp. nov.)“ vom

Bundesministerium für Wirtschaft und Technologie über die AiF als Forschungsvorhaben AiF-Nr. 15235 BG/2 der Forschungsvereinigung Gemeinschaft zur Förderung der privaten deutschen Pflanzenzüchtung e.V. (GFP) im Programm

zur Förderung der „Industriellen Gemeinschaftsforschung (IGF)“ finanziell gefördert.

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DANKSAGUNG

Herrn Prof. Dr. H. Buchenauer, Herrn Prof. Dr. R. Blaich und Herrn Dr. J. Hinrichs-

Berger möchte ich an dieser Stelle für die Überlassung des Themas, für die

zahlreichen Diskussionen und die hilfreiche Kritik bei der Abfassung der Arbeit

sowie für die Unterstützung als Betreuungsteam im Promotionsstudiengang

Agrarwissenschaften herzlich danken.

Herrn Dr. J. Hinrichs-Berger, Herrn Prof. Dr. W. Claupein und Herrn Prof. Dr.

M. Kruse danke ich neben Herrn Prof. Dr. A. Fangmeier für die Übernahme der

Gutachten dieser Dissertation und die Begleitung im Promotionsverfahren.

Ganz besonders möchte ich mich beim Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum –

Rheinpfalz für die Bereitstellung der Arbeitsplätze, die Hilfsbereitschaft bei der

Versuchsgestaltung, -durchführung und -auswertung und für das stets freundliche

Arbeitsklima bedanken. Insbesondere gilt mein Dank Herrn Dr. N. Laun und allen

„Queckis“ des Lehr- und Versuchsbetriebes Gemüsebau Queckbrunnerhof und Herrn

Dr. H.-J. Krauthausen und den „Phytos“ der Abteilung Phytomedizin sowie Herrn

M. Jutzi.

Ein bedeutender Teil der Arbeiten erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Julius Kühn-

Institut in Quedlinburg. Herrn Dr. F. Rabenstein und Frau K. Thiele danke ich für die

stete Bereitschaft zur kollegialen und fairen Zusammenarbeit sowie für ein stets

offenes Ohr für meine Fragen und die Unterstützung beim Erlernen der TAS-ELISA-

gestützten Untersuchungsmethode.

Danken möchte ich auch Frau A. Schieder, Frau U. Miersch, Frau J. Oosterhof,

Herrn G. Hiddink stellvertretend für die Firmen Enza Zaden und Rijk Zwaan für die

Bereitstellung von Saatgut und für die vielfältige Unterstützung der Arbeit. Ebenso

gilt den Firmen Clause Tézier und Nunhems/Hild mein aufrichtiger Dank.

DANKSAGUNG

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Ein Dankeschön gehört auch Frau Dr. E. Moltmann, Landwirtschaftliches

Technologiezentrum Augustenberg, sowie der Deutschen Sammlung für

Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig für die freundliche Überlassung

von A. valerianellae-Isolaten.

Schließlich möchte ich mich bei Herrn P. Krämer für die aktive Mitarbeit bedanken,

die er im Rahmen seines Berufpraktischen Projektes geleistet hat.

Ein herzliches Dankeschön für die Korrekturarbeiten und die vielfach fachliche,

moralische und private Unterstützung an Jan, Dr. Crus, Dr. Arnold, Dr. Örschel,

Dr. Börger und Dr. E sowie an Gabi, Usanne, Elke, Ewald, Pit, Stephan, inKa,

Adelinde, Christof, Lothar, Angela, Tino, Isabelle, Janine, Matthias, Jörg, Suse, NO,

Frank, Sabine, Saschi-Spatz, Marco, Patte, Basti und Mama Ki. - Ihr seid die Besten.

Die Anfertigung der vorliegenden Arbeit wäre nicht ohne finanzielle Unterstützung

der Universität Hohenheim, der Gemeinschaft zur Förderung der privaten deutschen

Pflanzenzüchtung e.V. (GFP), der Arbeitsgemeinschaft industrieller

Forschungsvereinigungen e.V. (AiF) und den Firmen Enza Zaden und Rijk Zwaan

möglich gewesen. Ihnen gilt deshalb mein besonderer Dank!

Nicht zuletzt möchte ich mich an dieser Stelle bei meinen Eltern bedanken, die mir

die gewünschte Ausbildung ermöglichten und mich während meiner Zeit als

Doktorandin unterstützten.

DANKSAGUNG

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INHALTSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .......................................................... I ABBILDUNGSVERZEICHNIS ..........................................................IV TABELLENVERZEICHNIS...............................................................IX

1 Einleitung..................................................................................................... 1 2 Material und Methoden..............................................................................7

2.1 Chemikalien ............................................................................................ 7 2.1.1 Nährmedien .....................................................................................7 2.1.1.1 Kings medium B (King-Agar B)................................................. 7 2.1.1.2 Tryptic Soy Agar (TSA-Agar) .................................................... 7

2.1.2 Natriumchlorid-Lösung................................................................... 8 2.1.3 Pflanzenschutzmittel ....................................................................... 8

2.2 Versuchssteuerung .................................................................................. 8 2.2.1 Gewächshaus................................................................................... 8 2.2.2 Klimaschränke und Klimakammern ............................................... 9

2.3 Isolierung und Charakterisierung von Acidovorax valerianellae- Bakterien .................................................................................................. 9

2.3.1 Fluoreszenz ................................................................................... 10 2.3.2 Gramreaktions-Test (nach SUSLOW et al., 1982) ......................... 10 2.3.3 Mikrobiologie Bactident® Oxidase-Test (nach KOVACS, 1956).. 10 2.3.4 Hypersensitivitätsreaktion (nach GARDAN et al., 2003)............... 11 2.3.5 Indirekter ELISA (TAS Triple antibody sandwich)...................... 12

2.4 Verwendete Acidovorax valerianellae-Stämme ................................... 15 2.5 Verwendetes Valerianella locusta (L.) – Saatgut ................................. 16 2.6 Keimfähigkeit........................................................................................ 19 2.7 Aussaat von Feldsalatpflanzen.............................................................. 19 2.8 Herstellung von A. valerianellae - Inokulum........................................ 20 2.9 Inokulation der Feldsalatpflanzen......................................................... 21 2.10 Bonitur von Feldsalatpflanzen .......................................................... 23 2.11 Statistische Auswertung der Daten ................................................... 23 2.12 Untersuchungen zu Infektionsbedingungen von Acidovorax valerianellae....................................................................................... 24

2.12.1 Einfluss der Temperatur auf die Infektion in vivo.................... 24 2.12.2 Einfluss des Blattalters und der Blattnässedauer auf die Infektion………………………………… …………………….24 2.12.3 Einfluss der Blattnässedauer auf die Infektion beziehungsweise die Symptomentwicklung .............................. 25 2.12.3.1 Einfluss der Blattnässedauer auf die Symptomentwicklung..... 25 2.12.3.2 Einfluss der Blattnässedauer unmittelbar nach der Inokulation 27

2.12.4 Einfluss der Inokulumdichte auf die Infektion.......................... 28 2.13 Untersuchungen zur Sortenanfälligkeit............................................. 29

2.13.1 Einfluss der Sorte auf die Infektion .......................................... 29 2.13.2 Einfluss der Sorte und des Isolates auf die Infektion................ 29

INHALTSVERZEICHNIS

7

2.13.3 Einfluss der Inokulumdichte und der Sorte auf die Infektion ... 30 2.14 Versuche zum Übertragungsweg von Acidovorax valerianellae...... 31

2.14.1 Boden ........................................................................................ 31 2.14.2 Alternative Wirtspflanzen ......................................................... 33 2.14.2.1 Alternative Wirtspflanzen I....................................................... 34 2.14.2.2 Alternative Wirtspflanzen II ..................................................... 37 2.14.2.3 Alternative Wirtspflanzen III .................................................... 39

2.14.3 Saatgut.......................................................................................40 2.15 Saatgutuntersuchungen ..................................................................... 47

2.15.1 Nachweismethoden von Acidovorax valerianellae am Saatgut 47 2.15.1.1 Sweatbox-Test in der Klimakammer ........................................ 47 2.15.1.2 Aufwuchstest im Gewächshaus................................................ 48 2.15.1.3 Ankeimmethode auf Papier...................................................... 49 2.15.1.4 Bestimmungen durch Fremdfirmen ......................................... 49

2.15.2 Dekontaminationsmaßnahmen (Warmwasserbehandlung und Dampfdesinfektion).................................................................... 50

3 Ergebnisse.................................................................................................. 52

3.1 Untersuchungen zu Infektionsbedingungen.......................................... 52 3.1.1 Einfluss der Temperatur auf die Infektion (in vivo) ..................... 52 3.1.2 Einfluss des Blattalters und der Blattnässedauer auf die Infektion59 3.1.3 Einfluss der Blattnässedauer auf die Infektion beziehungsweise die Symptomausprägung.............................................................. 63 3.1.3.1 Einfluss der Blattnässedauer auf die Symptomentwicklung..... 63 3.1.3.2 Einfluss der Blattnässedauer unmittelbar nach der Inokulation 67

3.1.4 Einfluss der Inokulumdichte auf die Infektion.............................. 72 3.2 Untersuchungen zur Sortenanfälligkeit................................................. 75

3.2.1 Einfluss der Sorte auf die Infektion .............................................. 75 3.2.2 Einfluss der Sorte und des Isolates auf die Infektion.................... 77 3.2.3 Einfluss der Inokulumdichte und der Sorte auf die Infektion ....... 84

3.3 Infektionsversuche von Acidovorax valerianellae zu Übertragungswegen................................................................................ 87

3.3.1 Boden ............................................................................................ 87 3.3.2 Alternative Wirtspflanzen ............................................................. 92 3.3.2.1 Alternative Wirtspflanzen I....................................................... 92 3.3.2.2 Alternative Wirtspflanzen II ..................................................... 95 3.3.2.3 Alternative Wirtspflanzen III .................................................... 97

3.3.3 Saatgut......................................................................................... 102 3.4 Saatgutuntersuchungen ....................................................................... 105

3.4.1 Nachweismethoden von Acidovorax valerianellae am Saatgut.. 105 3.4.1.1 Sweatbox-Test in der Klimakammer und Aufwuchstest im Gewächshaus............................................................................ 105 3.4.1.2 Ankeimmethode auf Papier..................................................... 109 3.4.1.3 Bestimmungen durch Fremdfirmen ........................................ 112

3.4.2 Dekontaminationsmaßnahmen.................................................... 115 3.4.2.1 Überprüfungen einer Warmwasserbehandlung....................... 115 3.4.2.2 Überprüfungen einer Dampfdesinfektion ............................... 122 3.4.2.3 Überprüfungen einer weiteren Dekontaminationsmaßnahme. 128

INHALTSVERZEICHNIS

8

4 Diskussion ................................................................................................ 131 4.1 Untersuchungen zu Infektionsbedingungen........................................ 131 4.2 Sortenanfälligkeit ................................................................................ 139 4.3 Übertragungswege............................................................................... 140

4.3.1 Boden ..........................................................................................140 4.3.2 Alternative Wirtspflanzen ........................................................... 142 4.3.3 Saatgut......................................................................................... 145

4.4 Dekontamination von Saatgut ............................................................. 152 5 Zusammenfassung...................................................................................158 6 Summary.................................................................................................. 160 7 Literaturverzeichnis ............................................................................... 162 8 Anhang..................................................................................................... 167

8.1 Publikationen ...................................................................................... 167 8.2 Lebenslauf ........................................................................................... 168 8.3 Versicherung ....................................................................................... 169 8.4 Erklärung............................................................................................. 169

INHALTSVERZEICHNIS

I

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS % Prozent

® registered trademark (gesetzlich geschützte Marke)

°C Grad Celsius

µl Mikroliter

Abb. Abbildung

ad. auffüllen auf

Aqua dest. / dest. aqua destillata (lateinisch), Destilliertes Wasser

ca. circa (lateinisch), in etwa

cfu colony forming unit (Koloniebildende Einheit)

dpi days past inoculation (Tage nach Inokulation)

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

et al. et alia (lateinisch), und andere

g Gramm

GmbH Gesellschaft mit beschränkter Haftung

GmbH & Co. KG Gesellschaft mit beschränkter Haftung & Compagnie Kommanditgesellschaft

H2O Chemische Summenformel für Wasser

ha Hektar

HCl Chemische Summenformel für Salzsäure

IgG Immunglobulin G

k.A. keine Angabe

KB King-Agar B (Kings medium B)

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

II

KCl Kaliumchlorid

KH2HPO4 * 2 H2O Chemische Summenformel für Kaliumdihydrogenphosphat Dihydrat

KOH Chemische Summenformel für Kaliumhydroxid

mAK Monoklonaler Antikörper

mg Milligramm

min. Minute

ml Milliliter

mm Millimeter

n Pflanzenanzahl

Na2CO3 Chemische Summenformel für Dinatriumcarbonat

NaCl Chemische Summenformel für Natriumchlorid

NaHCO3 Chemische Summenformel für Natriumhydrogencarbonat

NaOH Chemische Summenformel für Natronlauge

nm Nanometer

OD-Wert Wert der optischen Dichte am ELISA-Meßgerät

PCR Polymerase Chain-Reaction (Polymerase Kettenreaktion)

pH-Wert pondus Hydrogenii (lateinisch), Maß für eine saure oder alkalische Reaktion einer wässrigen Lösung

pv. Pathovar von patho (griechisch) und varia (griechisch), Krankheitserreger

RLF (rel. Luftf.) Relative Luftfeuchte

rpm rounds per minute (Umdrehung pro Minute)

sp. nov. species nova (latein), neue Art

subsp. subspecies (latein), Unterart

ssp. weitere Bezeichnung für die Abkürzung subsp.


III

Tab. Tabelle

TAS-ELISA triple antibody sandwich ELISA

var. varia (latein), Variation

well Vertiefung auf der ELISA-Mikrotiter-Platte


IV

ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abbildung 1.1: Bildung schwarzer Blattflecken nach Inokulation von Feldsalat mit A. valerianellae. ........................................................................................................... 4 Abbildung 1.2: A. valerianellae-Symptome in einem Feldsalatbestand .................... 4 Abbildung 2.1: Mikrobiologie Bactident® Oxidase-Test zum Nachweis Oxidase-positiver A. valerianellae-Bakterien anhand eines Farbumschlages auf dem Teststäbchen............................................................................................................... 11 Abbildung 2.2: Schwache Hypersensitivitätsreaktion an Tabak im Bereich der Infiltrationsstellen (innerhalb der Kreise) am Beispiel des A. valerianellae-Isolates 6.1.a (Infiltration mit einer Konzentration von 108 cfu/ml). ...................................... 12 Abbildung 2.3: Gekeimte und nicht gekeimte Feldsalatsamen auf angefeuchtetem Filterpapier zur Überprüfung der Keimfähigkeit. ...................................................... 19 Abbildung 2.4: Inokulation von Feldsalatpflanzen mit A. valerianellae. (A): Verwendung eines Feinzerstäubers. (B): Sprühfilm zerstäubter A. valerianellae-Suspension auf der Oberseite von Feldsalatblättern.................................................. 22 Abbildung 2.5: Container mit kontaminiertem und nicht kontaminiertem Boden (durch Einarbeitung von nicht-infiziertem und infiziertem Blattmaterial) für sukzessive Probenentnahme (einmal pro Monat) über einen Zeitraum von bis zu einem Jahr (Standort Schifferstadt, Deutschland)......................................................32 Abbildung 2.6: Aussaat von gesundem Saatgut (Sorte Favor) in mit A. valerianellae kontaminierten und nicht-kontaminierten Boden (durch Einarbeitung von nicht-infiziertem und infiziertem Blattmaterial) zur Überprüfung der Überdauerung von A. valerianellae-Bakterien im Boden. Die Abdeckung der Samen erfolgte mit Perlitte. ....................................................................................................................... 33 Abbildung 2.7: Versuchsanordnung der Saatgutproduktion aus gesundem (rechts) und mit A. valerianellae-infiziertem Saatgut (links) mit Aussaat im Jahr 2007 im Folienhaus in Deutschland. Abgrenzung durch einen Folienzaun. Beregnung über Kopf. .......................................................................................................................... 43 Abbildung 2.8: Versuchsanordnung der Saatgutproduktion aus gesundem (links) und mit A. valerianellae-infiziertem Saatgut (rechts) mit Aussaat im Jahr 2007 im Freiland in Frankreich. ............................................................................................... 44

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

V

Abbildung 2.9: Versuchsanordnung der Saatgutproduktion aus gesundem (links) und mit A. valerianellae-infiziertem Saatgut (rechts) mit Aussaat im Jahr 2008 im Folienhaus in Deutschland. Abgrenzung durch einen Folienzaun. Beregnung über Kopf. .......................................................................................................................... 44 Abbildung 2.10: Versuchsanordnung der Saatgutproduktion aus gesundem und mit A. valerianellae-infiziertem Saatgut mit Aussaat im Jahr 2009 im gleichen Schiff eines Gewächshauses, Abgrenzung durch Folienzäune. (A): Wasserversorgung mittels Kreisregner, gesundes Saatgut rechts, kontaminiertes Saatgut links. (B): Wasserversorgung mittels Tropfbewässerung, gesundes Saatgut links, kontaminiertes Saatgut rechts. ............................................................................................................ 45 Abbildung 2.11: Benennung der gewonnenen Saatgutpartien aus der gesunden Feldsalat-Saatgutpartie (AV-60, Ausgangssaatgut) und einer kontaminierten Feldsalat-Saatgutpartie (AV-75, Ausgangssaatgut) mit Aussaaten in verschiedenen Jahren (2007 bis 2009). Die Vermehrung des Ausgangssaatguts fand mit Aussaat im Jahr 2007 in Deutschland und Frankreich statt, mit Aussaat im Jahr 2008 in Deutschland. Mit der Aussaat im Jahr 2009 wurde das Ausgangssaatgut gebeizt verwendet, die Bewässerung erfolgte über das Tröpfchenverfahren und über Kopf mit Kreisregnern......................................................................................................... 46 Abbildung 2.12: Sweatbox zum Nachweismethode von A. valerianellae am Saatgut........................................................................................................................ 48 Abbildung 2.13: Aufwuchstest im Gewächshaus zum Nachweis von A. valerianellae am Saatgut. ...................................................................................... 49 Abbildung 3.1: Einfluss der Inkubationstemperatur auf die Symptombildung von A. valerianellae (A: Befallstärke in %, B: Befallshäufigkeit in %) an Feldsalatpflanzen 4, 6, 10 und 12 Tage nach Inokulation (dpi) mit A. valerianellae (Isolatemix, Konzentration 109 cfu/ml). .................................................................... 55 Abbildung 3.2: Einfluss der Inkubationstemperatur auf die Symptombildung von A. valerianellae (A: Befallstärke in %, B: Befallshäufigkeit in %) an Feldsalatpflanzen nach 10, 14, 19 und 25 Tage Inokulation (dpi) mit A. valerianellae (Isolatemix, Konzentration 109 cfu/ml). .................................................................... 56 Abbildung 3.3: Einfluss der Inkubationstemperatur auf die Symptombildung von A. valerianellae (A: Befallstärke in %, B: Befallshäufigkeit in %) an Feldsalatpflanzen 4, 8, 10 und 14 Tage nach Inokulation (dpi) mit A. valerianellae (Isolatemix, Konzentration 109 cfu/ml). .................................................................... 57 Abbildung 3.4: Einfluss der Inkubationstemperatur auf die Symptombildung von A. valerianellae (A: Befallstärke in %, B: Befallshäufigkeit in %) an Feldsalatpflanzen 4, 6, 10, 12 und 17 Tage nach Inokulation (dpi) mit A. valerianellae (Isolatemix, Konzentration 109 cfu/ml). ..........................................58


VI

Abbildung 3.5: Anteil an befallenen Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) zwischen 5 und 35 dpi (A) beziehungsweise zwischen 4 und 32 dpi (B) mit A. valerianellae (Isolat 709/2, 106 cfu/ml) im Keimblattstadium (A) beziehungsweise Laubblattstadium (B) in Abhängigkeit der Blattnässedauer (einmalig, wöchentlich, dauerhaft). .................................................................................................................. 60 Abbildung 3.6: Anteil Symptom tragender Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) sowie der Anteil befallener Blattfläche je Pflanze (Befallsstärke in %) zwischen 7 und 34 dpi mit einem A. valerianellae-Gemisch (105 cfu/ml) von Pflanzen im Laubblattstadium bei dauerhafter Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte........... 62 Abbildung 3.7: Auswirkungen auf die Befallsstärke (in %) unterschiedlicher Kultivierungsphasen unter trockenen und feuchten Bedingungen nach Inokulation mit A. valerianellae.................................................................................................... 64 Abbildung 3.8: Befallsstärke (%) zwischen Tag 9 und Tag 27 nach der Inokulation (dpi) mit einem A. valerianellae-Gemisch (Konzentration 108 cfu/ml) unter dauerhafter Kultivierung bei gesättigten Luftfeuchten. Die Pflanzen wurden entweder sofort Wechseltemperaturen (15 °C Nacht, 20 °C Tag) ausgesetzt beziehungsweise für die ersten 96 Stunden nach der Inokulation bei konstant 20 °C kultiviert. .......... 69 Abbildung 3.9: Auswirkungen unterschiedlich langer Kultivierungsphasen bei gesättigter Luftfeuchte nach Sprühinokulation mit A. valerianellae (zwischen null und 72 Stunden plus 5 Stunden Antrocknungsdauer) auf die Befallsentwicklung bei Feldsalat. Versuch A. ................................................................................................. 70 Abbildung 3.10: Auswirkungen unterschiedlich langer Kultivierungsphasen bei gesättigter Luftfeuchte nach Sprühinokulation mit A. valerianellae (zwischen null und 72 Stunden plus 5 Stunden Antrocknungsdauer) auf die Befallsentwicklung bei Feldsalat. Versuch B. ................................................................................................. 71 Abbildung 3.11: Anteil Symptom tragender Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) zwischen Tag fünf und Tag 19 nach der Inokulation (dpi) mit sechs verschiedenen Konzentrationen zwischen 102 cfu/ml und 107 cfu/ml des A. valerianellae-Isolates 6.1.a (A), 16619 (B), 552 (C)..................................................................................... 74 Abbildung 3.12: Befallsstärke (% nekrotische Blattfläche je Pflanze) von unterschiedlichen Feldsalatsorten 18 Tage nach Inokulation eines A. valerianellae-Gemisches (Konzentration 106 cfu/ml). Der Versuch wurde bei 13 °C – 24 °C (1. Versuch) und bei 20 °C – 29 °C (2. Versuch) durchgeführt................................. 76 Abbildung 3.13: Anteil an befallenen Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) bei unterschiedlichen Feldsalatsorten 18 Tage nach Inokulation eines A. valerianellae-Gemisches (Konzentration 106 cfu/ml). Der Versuch wurde bei 13 °C – 24 °C (1. Versuch) und bei 20 °C – 29 °C (2. Versuch) durchgeführt................................. 77


VII

Abbildung 3.14: Anteil an befallenen Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) von drei Feldsalatsorten (AV-1, AV-5, AV-3) und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation zweier A. valerianellae-Isolate (16619, IV2) mit einer Konzentration von 104 cfu/ml bei Kultur unter gesättigter Luftfeuchte. .................................................. 80 Abbildung 3.15: Anteil an befallenen Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) von drei Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation zweier A. valerianellae-Isolate (6.1.a, 553) mit einer Konzentration von 106 cfu/ml und Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte................................................................. 82 Abbildung 3.16: Anteil an befallener Blattfläche je Pflanze (Befallsstärke in %) von drei Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation von vier A. valerianellae-Isolaten (6.1.a, 553, 16619, IV2) mit einer Konzentration von 105 cfu/ml und Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte. ....................................... 83 Abbildung 3.17: Anteil an befallenen Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) von drei Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation von vier A. valerianellae-Isolaten (6.1.a, 553, 16619, IV2) mit einer Konzentration von 105 cfu/ml und Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte. ....................................... 84 Abbildung 3.18: Anteil Symptom tragender Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) von zwei verschiedenen Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 neun Tage nach Inokulation eines A. valerianellae-Isolategemisches mit fünf verschiedenen Konzentrationen zwischen 102 cfu/ml und 106 cfu/ml............................................... 85 Abbildung 3.19: Anteil Symptom tragender Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) von zwei verschiedenen Feldsalatsorten (AV-1 und AV-5) und der Wildart AV-13 zwischen Tag sieben und Tag 20 nach Inokulation (dpi) eines A. valerianellae-Isolategemisches mit einer Konzentrationen von 106 cfu/ml..................................... 86 Abbildung 3.20: Verteilung von A. valerianellae-Symptome tragende Pflanzen (mit x gekennzeichnet) aus A. valerianellae-infiziertem Saatgut, 40 Tage nach der Aussaat im Jahr 2007 in Deutschland, in drei jeweils 1 m² großen abgesteckten Parzellen, die aus je neun Aussaatreihen bestanden, in denen zwischen 18 und 26 Pflanzen wuchsen (grau hinterlegte Fläche). ......................................................... 1170 Abbildung 3.21: Feldsalatpflanzen aus infiziertem Saatgut 69 Tage (A) und 135 Tage (B) nach der Aussaat im Jahr 2008 in einem Folienhaus......................... 104 Abbildung 3.22: Sichtbare typische A. valerianellae-Symptome 25 Tage nach der Aussaat in Vermiculit (Sweatbox-Test) bei Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte .............................................................................................................. 106 Abbildung 3.23: Keimfähigkeit von warmwasserbehandelten Samen aus dem Jahr 2009. . ............................................................................................................... 120 Abbildung 3.24: OD-Wert im TAS-ELISA (nach 60 Minuten) nach 0, 4, 9 und 14 Tagen Inkubation in der Ankeimmethode auf Papier von warmwasserbehandelten Samen der A. valerianellae-kontaminierten Sorten AV-17 (A) und AV-219 (B). .. 121


103

119

VIII

Abbildung 3.25: Keimfähigkeit (in % bei 4 °C unter Lichtausschluß) drei verschiedener Feldsalatsorten nach Behandlung mit Dampf bei (A) 66 °C für 90 beziehungsweise 105 Sekunden und bei (B) 64 °C für 120 beziehungsweise 150 Sekunden im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. ............................................ 126 Abbildung 3.26: OD-Wert im TAS-ELISA (nach 60 Minuten) nach Homogenisierung von dampfbehandelten Samen der A. valerianellae-kontaminierten Sorten AV-17 (A) und AV-219 (B) (Ankeimmethode auf Papier).......................... 127 Abbildung 3.27: Keimfähigkeit (in % 4 °C unter Lichtausschluß) drei verschiedener Feldsalatsorten nach Behandlung durch einen Dienstleister im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. ......................................................................................... 129 Abbildung 3.28: OD-Wert im TAS-ELISA (nach 60 Minuten) der mit A. valerianellae-kontaminierten Sorten AV-17 (A) und AV-219 (B) zwischen Tag null und Tag 14 nach Aussaat auf angefeuchtetem Filterpapier und Inkubation bei Raumtemperatur (Ankeimmethode auf Papier). Die Samen waren unbehandelt beziehungsweise durch einen Dienstleister behandelt worden. ............................... 130


IX

TABELLENVERZEICHNIS Tabelle 2.1: Verwendetes Saatgut für die Versuche zur Sortenanfälligkeit. ............ 18 Tabelle 2.2: Verwendete Pflanzen aus elf Familien zur Überprüfung ihrer Eignung als alternative Wirtspflanzen von A. valerianellae nach Infiltration und Sprühinokulation. ....................................................................................................... 35 Tabelle 2.3: Verwendete Pflanzen aus sieben Familien zur Überprüfung der Eignung als Wirtspflanzen von A. valerianellae nach Sprühinokulation. ................. 38 Tabelle 2.4: Verwendete Pflanzen aus sechs Familien zur Überprüfung ihrer Eignung als alternative Wirtspflanzen von A. valerianellae nach Stichinokulation.. 40 Tabelle 2.5: Verwendete Temperaturen (°C) und Inkubationszeiten (Minuten) bei einer Warmwasserbehandlung von Feldsalatsaatgut. ................................................ 51 Tabelle 3.1: Befallsstärke (% nekrotische Blattfläche) 9, 16, 23, 30 und 37 Tage nach Inokulation (dpi) mit einem A. valerianellae-Gemisch (Konzentration 108 cfu/ml). Bis 9 dpi erfolgte die Kultur bei gesättigter Luftfeuchte, anschließend ohne erhöhte Luftfeuchtigkeit.. .................................................................................. 66 Tabelle 3.2: Befallsstärke (% nekrotische Blattfläche) 38, 43 und 51 Tage nach Inokulation (dpi) mit einem A. valerianellae-Gemisch (Konzentration 108 cfu/ml). Einer zu Beginn neuntägigen Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte folgten Phasen unterschiedlicher Dauer unter normal vorherrschenden Luftfeuchten (zwischen 7 und 28 Tagen), bevor sich eine erneute Kultur unter gesättigter Luftfeuchte anschloss................................................................................................. 67 Tabelle 3.3: Auftreten erster Symptome (in Tagen) nach Inokulation einzelner A. valerianellae-Isolate in Abhängigkeit von der Konzentration. ............................. 73 Tabelle 3.4: Anteil an befallener Blattfläche je Pflanze (Befallsstärke in %) von drei Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation zweier A. valerianellae-Isolate (16619, IV2) mit einer Konzentration von 104 cfu/ml bei Kultur unter gesättigter Luftfeuchte........................................................................... 79 Tabelle 3.5: Anteil an befallener Blattfläche je Pflanze (Befallsstärke (BS) in %) von drei Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation zweier A. valerianellae-Isolate (6.1.a, 553) mit einer Konzentration von 106 cfu/ml und Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte................................................................. 81 Tabelle 3.6: Anteil symptomtragender Pflanzen (%) und TAS-ELISA-Nachweis von A. valerianellae in Symptom tragenden Pflanzen. Die Pflanzen wurden zu verschiedenen Zeiten (über ein Jahr) in zuvor durch Einarbeitung von befallenem A. valerianellae-Pflanzenmaterial kontaminierten Boden gesät (Standort Schifferstadt). ............................................................................................................. 89

TABELLENVERZEICHNIS

X

Tabelle 3.7: Anteil symptomtragender Pflanzen (%) und TAS-ELISA-Nachweis von A. valerianellae in Symptom tragenden Pflanzen. Die Pflanzen wurden zu verschiedenen Zeiten (über acht Monate) in zuvor durch Einarbeitung von befallenem A. valerianellae-Pflanzenmaterial kontaminierten Boden gesät (Standort Quedlinburg). ............................................................................................................. 90 Tabelle 3.8: Temperaturwerte (in 2 Meter Höhe) und Niederschlagswerte im Monatsmittel im Zeitraum von September 2009 bis September 2010 in Schifferstadt und von März 2010 bis November 2010 in Quedlinburg.......................................... 91 Tabelle 3.9: Krankheitssymptome nach Infiltration und Sprühinokulation mit A. valerianellae (Konzentration 108 cfu/ml) 7, 13 und 20 dpi bei verschiedenen Pflanzenarten.............................................................................................................. 93 Tabelle 3.10: Krankheitssymptome nach Sprühinokulation mit A. valerianellae (Konzentration 108 cfu/ml) 10, 25 und 30 dpi bei verschiedenen Pflanzenarten....... 96 Tabelle 3.11: Veränderungen in der Blattstruktur um die Einstichstelle bei verschiedenen Pflanzenarten nach Stichinokulation mit A. valerianellae (Konzentration 108 cfu/ml) an unterschiedlichen Tagen nach der Inokulation (dpi)................................................................................................................................... 100 Tabelle 3.12: Nachweis von lebensfähigen A. valerianellae-Bakterien in injizierten und nicht-injizierten Blatthälften verschiedener Pflanzenarten 12, 19, 26 und 33 dpi................................................................................................................................... 101 Tabelle 3.13: Nachweis von A. valerianellae in zwölf Saatgutpartien im Sweatbox-Test und im Aufwuchstest. Der Nachweis erfolgte durch klassisches Isolieren und mittels TAS-ELISA in Pflanzen mit verdächtigen A. valerianellae-Symptomen.. . 107 Tabelle 3.14: OD-Wert von Proben verschiedener Saatgutpartien im TAS-ELISA bei der Ankeimmethode auf Papier.......................................................................... 110 Tabelle 3.15: Nachweis von A. valerianellae in zwölf Saatgutpartien im Sweatbox-Test in Kombination mit einer PCR bei den Firmen Enza Zaden und Rijk Zwaan..................................................................................................................................... 113 Tabelle 3.16: Keimfähigkeit (in % bei 20 °C und 12 Stunden Licht pro Tag) drei verschiedener Feldsalatsorten nach Behandlung mit Dampf bei 66 °C für 90 beziehungsweise 105 Sekunden und bei 64 °C für 120 beziehungsweise 150 Sekunden im Vergleich zur nicht-behandelten Kontrolle........................................ 125

TABELLENVERZEICHNIS

EINLEITUNG

1

1 EINLEITUNG

Die Ursprünge des heutigen Feldsalates [Valerianella locusta (L.)] - Gemeiner

Feldsalat - gehen auf eine in Mitteleuropa wildwachsende Form zurück. Mit dem

aufkommenden Ackerbau siedelte sich der Feldsalat als Unkraut in Wintergetreide

und in Weinbergen an und wurde als Wildpflanze geerntet. Er wurde erstmals im

Mittelalter in Kultur genommen und eine erste Eignung als Blattgemüse wird

beschrieben. Seit Anfang des 19. Jahrhunderts mit der Einführung der mineralischen

Düngung wird Feldsalat erwerbsmäßig angebaut (MEYER-REBENTISCH, 2011). Seit

Ende der 1990er Jahre hat Feldsalat einen starken Anbauzuwachs erfahren, wobei

vor allem vorverpackter und gewaschener Feldsalat hoch im Kurs liegt, da er den

Konsumentenwunsch nach einfacher Zubereitung und langer Haltbarkeit, verbunden

mit gutem Geschmack und hohem Gesundheitswert erfüllt (persönliche Mitteilung

N. Laun, Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum - Rheinpfalz). Wilden Feldsalat

findet man heutzutage kaum noch.

Der Beginn des kommerziellen Feldsalatanbaus lag in Frankreich, wo auch heute

noch die Hauptanbaugebiete liegen. Von Frankreich aus kam der Feldsalat über die

Schweiz nach Deutschland. Der Anbau konzentriert sich in Deutschland im

Wesentlichen auf zwei Bundesländer: Rheinland-Pfalz und hier schwerpunktmäßig

die Pfalz, die als größtes zusammenhängendes Anbaugebiet Deutschlands gilt, sowie

Baden-Württemberg mit Schwerpunkten im Stuttgarter Raum und in Südbaden.

Aus der Literatur sind unterschiedliche Angaben zu den Anbauflächen und dem

Produktionswert, auf denen Feldsalat kultiviert wird, zu entnehmen. So beschreiben

SCHLAGHECKEN (2010) und BEHR (2009), dass in der franzözischen Region um

Nantes (Loire Atlantique und Vendée) auf einer Fläche von 6000 ha rund 75 % der

Weltproduktion und 85 % der französischen Erzeugung an Feldsalat angebaut

werden. Nach RAMPOLD (2004) betrug die Anbaufläche in Deutschland im Jahr

2003 rund 1590 ha und 270 ha in Unterglasanlagen (davon 705 ha in Rheinland-Pfalz

und 660 ha in Baden-Württemberg). Der Produktionswert der europäischen

Feldsalaterzeugung betrug ca. 118 Millionen Euro auf einer 6750 ha großen

Anbaufläche (Stand: Oktober 2004). Im Jahr 2008 lag der deutsche Produktionswert

EINLEITUNG

2

bei knapp 24.000 Tonnen, wovon circa 10 % aus Unterglasanbau stammen. Die

französische Produktion lag bei 32.300 Tonnen (BEHR, 2009).

Feldsalat gehört zu der Familie der Valerianaceae und ist eine winterannuelle

Pflanze, die Temperaturen von bis zu -15 °C bis -20 °C aushält. Er ist eine klassische

Winterkultur und wird vorwiegend im Herbst ausgesät beziehungsweise gepflanzt.

Gut 85 % des Feldsalatkonsums im Jahr konzentrieren sich in Deutschland und

Frankreich auf die Monate Oktober bis April (BEHR, 2009). Ein ganzjähriger Anbau

ist jedoch möglich, unter anderem durch die Verwendung von Schattierungsnetzen

(in den Sommermonaten), die ein Schießen der Pflanzen verhindern. In der

französischen Region um Nantes begann die Sommerproduktion im Jahr 1985

(PÉRON und REES, 1998).

Je nach Jahreszeit steht für den Anbau die Direktsaat mittels Saatgut oder das

Pflanzen von Jungpflanzen im Vordergrund. Feldsalat-Direktsaat erfolgt ab Mitte

August bis Anfang Oktober, während von März bis Juli in der Regel gepflanzt wird.

Die Anzuchtdauer für die Jungpflanzen beträgt zwischen vier und sechs Wochen.

Der Vorzug einer Pflanzung ist, dass Jungpflanzen in Einzeltöpfen bereits größer und

weniger anfällig sind und so eine sicherere Produktion ermöglichen, des Weiteren

kann die Ernte besser terminiert werden. Zudem wird ein deutlicher Unterschied

zwischen den verwendeten Sorten für die Direktsaat und für die Pflanzung gemacht.

Das wichtigste Kriterium ist für den Sommeranbau die Produktion „kurzstieliger“

Sorten, die zudem langsam wachsen sollten.

In der Produktionstechnik von Feldsalat wurden in den letzten Jahren offene Fragen

bezüglich der Unkrautkontrolle und der Pflanzenernährung geklärt. Ungelöst ist

bisher dagegen die Frage, wie Schäden durch Acidovorax valerianellae sp. nov., den

Erreger bakterieller Blattflecken bei Feldsalat, vermieden werden können.

Das Bakterium Acidovorax valerianellae an Feldsalat wurde in Frankreich

(Feldsalatanbaugebiet um Nantes) zum ersten Mal 1990 diagnostiziert und zunächst

als nicht-fluoreszierende Pseudomonas-Art beschrieben (RAT und GARDAN, 1993).

WILLEMS et al. (1992) transferierten einige Pseudomonas-Arten in die Gattung

Acidovorax. Die neue Artbezeichnung Acidovorax valerianellae sp. nov. erfolgte

EINLEITUNG

3

durch GARDAN et al. (2003). 1998 wurde A. valerianellae in Belgien identifiziert

(GRONDEAU et al., 2001), ein Nachweis für Deutschland erfolgte erstmals 1999 an

Feldsalatproben aus der Pfalz (BARCHEND, 2003, MOLTMANN et al., 2000).

A. valerianellae gehört zu der Gruppe der Gram- und Arginin-negativen, Oxidase-,

Catalase- und Urease-positiven, aeroben Pseudomonaden. Die Bakterien besitzen

eine Geißel, fluoreszieren nicht und bilden kein Levan auf saccharosehaltigen

Nährmedien. Die Bakterien wachsen auf Nährböden langsam und erreichen nach vier

Tagen einen Durchmesser von zwei Millimeter. Unter 4 °C und über 41 °C findet

kein Wachstum der Zellen statt. Das Wachstumsoptimum liegt bei einer Temperatur

von 28 °C. Aufgrund ihres langsamen Wachstums in vitro werden sie leicht von

saprophytischen Bakterien überwachsen (BRAJE, 2005, JASU, 2004).

Die Symptome einer A. valerianellae-Infektion von Feldsalat äußern sich zunächst

als sehr kleine Punkte von dunkelgrüner Färbung, die im Gegenlicht wässrig bis ölig

durchscheinen (Abb. 1.1). Bei Fortschreiten des Befalls werden die Flecken größer

und können einen Durchmesser von bis zu 4 mm erreichen, sie färben sich dabei

schwarz und sind etwa drei bis vier Tage nach der Infektion gut sichtbar. Zunächst

weisen die Flecken keinen Hof auf. Im Verlauf der Krankheit kann sich aber ein

chlorotischer Hof um die dunklen Flecken bilden. Die über die Blattspreite verteilten

oder am Blattrand lokalisierten Flecken sind unregelmäßig geformt bis rund und

scharf zum gesunden Gewebe abgegrenzt. Es können Blätter jeglichen Alters

infiziert werden, das heißt sowohl die Keimblätter als auch Blätter erntereifer

Pflanzen. Werden die Blätter sehr früh in der Blattentfaltung infiziert, so

verkrümmen sie sich oft bei fortschreitendem Wachstum (BRAJE, 2005, MOLTMANN ,

1999).

Eine Infektion mit A. valerianellae führt nicht zum Absterben der Feldsalatpflanzen,

tritt aber insbesondere bei feuchter Witterung vor allem an den unteren Blättern auf

und führt zu massiven qualitativen Schäden (Abb. 1.2). Der Umbruch ganzer

Feldsalatanbauflächen kann die Folge sein (GRONDEAU et al., 2007). Auch schwach

befallene Ware ist für eine Vermarktung ungeeignet, da der Befall sich in den oft

folienumhüllten Verkaufsgebinden weiterentwickelt und im fortgeschrittenen

Stadium in Fäulnis übergehen kann.

EINLEITUNG

4

Abbildung 1.1: Bildung schwarzer Blattflecken nach Inokulation

von Feldsalat mit A. valerianellae.

Abbildung 1.2: A. valerianellae-Symptome in einem

Feldsalatbestand

Als Infektionsquellen werden der Boden und das Saatgut diskutiert. So überdauert

A. valerianellae, laut HINRICHS-BERGER et al. (2005), eine gewisse Zeit im Boden.

Untersuchungen, bei denen Feldsalat in kontaminiertem Boden ausgesät wurde,

führen mit jeder Kultur zu einem Anstieg an Symptom tragenden Pflanzen. Die

Ausbreitung erfolgt dabei zunächst in der Reihe, sobald sich die Blätter benachbarter

EINLEITUNG

5

Pflanzen berühren. Eine Ausbreitung über Saatreihen hinweg ist nach

Bestandesschluss festzustellen. Blattkontakt und Wasserspritzer sind vermutlich für

diese Übertragung verantwortlich. GRONDEAU et al. (2007) berichten, dass

A. valerianellae-Bakterien bis zu 39 Tage nach der Ernte von infizierten Pflanzen an

deren Pflanzenresten im Boden nachweisbar sind und der Boden somit eine

Inokulumquelle für weitere Aussaaten darstellt.

Feldsalatsaatgut ist zunächst, laut RAT und GARDAN (1993), keine Inokulumquelle

von A. valerianellae. Die Isolierung des Bakteriums aus kommerziellem Saatgut

gelingt nicht, während der Nachweis nach künstlicher Saatgutinfektion funktioniert

(BARCHEND, 2003 und 2004). Im Jahr 2006 wird, nach Untersuchungen von sechs

Saatgutpartien, eine Saatgutbelastung mit A. valerianellae nachgewiesen

(GRONDEAU und SAMSON, 2009) und die Saatgutübertragung erscheint möglich.

Verstärkt tritt die Krankheit in den französischen beziehungsweise süddeutschen

Anbaugebieten auf (MOLTMANN et al., 2000, PERON und REES, 1998), wo die

Hauptanbaugebiete von Feldsalat liegen. Die Krankheit stellt zurzeit die wichtigste

und gefährlichste Erkrankung an Feldsalat in Frankreich dar (GRONDEAU et al.,

2007) und Bekämpfungsmöglichkeiten sind rar. Die französischen Feldsalatanbauer

verhindern derzeit eine Bodenübertragung durch eine Desinfektion des Bodens mit

Metam-Natrium. Diese Entseuchungsmaßnahme erfordert einen hohen Aufwand in

Form von Spezialgeräten und garantiert lediglich eine Befallsminderung aber keine

Befallsfreiheit (persönliche Mitteilung, T. Weinheimer, BOLAP GmbH). Gegen

diese Krankheit sind in Deutschland bisher keine chemischen Pflanzenschutzmittel

zugelassen, noch kann damit gerechnet werden, dass Antibiotika zur Bekämpfung

zugelassen werden.

Erste Hinweise auf eine mögliche Saatgutübertragung liegen vor (HINRICHS-BERGER

et al., 2005, GRIMAULT et al., 2006, GRONDEAU und SAMSON, 2009) und eine

weitere Ausdehnung der Befallsfläche auf diesem Weg wird befürchtet. Dieser

Ausbreitungsweg bedroht eine wirtschaftliche Saatgutproduktion und die

Feldsalatzüchtung.

Eine sinnvolle Bekämpfungsstrategie von A. valerianellae beruht auf Kenntnis der

Epidemiologie des Bakteriums (HINRICHS-BERGER et al., 2005). Als

Regulierungsmöglichkeiten bieten sich vor allem pflanzenbauliche Maßnahmen an.

EINLEITUNG

6

So sollte nach FRANKENBERG (2005) zunächst gesundes Saatgut verwendet werden.

Auf einen Anbau in der wärmeren Jahreszeit sollte bei Bakterienbefall weitestgehend

verzichtet werden, ebenso wie auf Beregnungen in den Abendstunden. Treten

infizierte Feldsalatpflanzen auf, sollte eine Anbaupause von zwei Jahren für Feldsalat

angestrebt werden. Nach GRONDEAU et al. (2003, 2006) überdauert das Bakterium

nämlich im Boden und kann erneute Aussaaten schädigen.

.

TOMIHAMA et al. (2006) beschreiben braune Flecken an Teeblättern in Japan, die

von A. valerianellae verursacht werden. Ebenfalls durch A. valerianellae verursachte

Blattflecken kommen an der Gartenhortensie (Hydrangea macrophylla) vor (IKEDA

et al., 2009).

Neben A. valerianellae an Feldsalat, Teeblättern und Gartenhortsensie gibt es noch

weitere phytopathogene Acidovorax-Arten, die an verschiedenen Wirtspflanzen

vorkommen. Nach WILLEMS et al. (1992) kommen Acidovorax avenae subsp.

cattleyae-Bakterien an Orchideen vor, wo sie braune Flecken hervorrufen, während

Acidovorax konjaci-Bakterien an der Konjakknolle vorkommen. Acidovorax avenae

subsp. avenae und Acidovorax avenae subsp. citrulli verursachen an Cucurbitaceae

bakteriellen Flecken an Blättern und Früchten.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Aufklärung biologischer und

epidemiologischer Grundlagen von A. valerianellae an Feldsalat. Vor allem die

Erregeransprüche an Temperatur, Blattalter, Inokulumdichte, Feldsalatsorte und

Blattnässedauer sollten geklärt werden, um dabei kritische Infektionsbedingungen

charakterisieren zu können und darauf aufbauend geeignete Maßnahmen zur

Vermeidung von Schäden zu entwickeln. Die einzelnen Übertragungswege waren zu

bewerten, insbesondere die Bedeutung und das Ausmaß der Saatgutübertragung in

Abgrenzung zu befallenen Boden oder alternativen Wirtspflanzen. Verschiedene

Saatgutbehandlungen wurden in ihrer Dekontaminationswirkung geprüft. Die

gewonnenen Erkenntnisse dienen der Erarbeitung praxisorientierter Lösungsansätze

zur Vermeidung und Bekämpfung der Blattfleckenkrankheit an Feldsalat.

MATERIAL UND METHODEN

7

2 MATERIAL UND METHODEN

2.1 Chemikalien

2.1.1 Nährmedien

2.1.1.1 Kings medium B (King-Agar B)

Zum Herstellen von King-Agar B (KB)-Platten wurden 16,5 g Fertig-Agar der Firma

Sigma-Aldrich Chemie GmbH laut Anweisung mit 500 ml destilliertem Wasser

gemischt und zunächst in der Mikrowelle vorgewärmt. Nachdem das Pulver

vollständig gelöst war, wurden 6,5 g Glycerin der Firma neoLab Migge Laborbedarf-

Vertriebs GmbH zugesetzt. Das Medium wurde anschließend bei 121 °C für

20 Minuten autoklaviert. Sobald es auf ca. 60 °C abgekühlt war, wurde es unter

sterilen Bedingungen in Petrischalen gegossen (etwa 10 ml je Schale).

Bei KB-Agar-Schalen mit fungiziden Antibiotikum, wurde dem 60 °C warmen

Medium (500 ml) 1 ml Cycloheximid (1 g Cycloheximid gelöst in 10 ml 75 %-igem

Methanol, steril filtriert) zugesetzt und unter sterilen Bedingungen in Petrischalen

gegossen (etwa 10 ml je Schale). Die fertigen Schalen wurden bei 4 °C bis zur

Verwendung gelagert.

2.1.1.2 Tryptic Soy Agar (TSA-Agar)

Zum Herstellen von TSA-Agar-Platten wurden 20 g Fertig-Agar der Firma BD

Diagnostic Systems laut Anweisung mit 500 ml destilliertem Wasser gemischt und

zunächst in der Mikrowelle vorgewärmt. Das Medium wurde anschließend bei

121 °C für 20 Minuten autoklaviert. Sobald es auf ca. 60 °C abgekühlt war, wurde es

unter sterilen Bedingungen in Petrischalen gegossen (etwa 10 ml je Schale).


8

2.1.2 Natriumchlorid-Lösung

Zur Herstellung der A. valerianellae-Suspension wurde in allen Versuchen eine

0,85 %-ige Natriumchlorid (NaCl)-Lösung verwendet.

2.1.3 Pflanzenschutzmittel

Auftretender Mehltau der Gattung Erysiphe wurde mit den Mitteln „Euparen M WG“

(Wirkstoff Tolylfluanid) der Firma Bayer oder „Bayfidan“ (Wirkstoff Triadimenol)

der Firma Bayer behandelt. Als Breitbandfungizide gegen Botrytis cinerea und

Rhizoctonia solani wurden die Mittel „Signum WG“ (Wirkstoffe F 500

(Pyraclostrobin) und Boscalid) und „Rovral WP“ (Wirkstoff Iprodion) der Firma

BASF im Wechsel verwendet. Auftretender Befall mit freifressenden

Schmetterlingsraupen wurde mit dem Mittel „Steward WG“ (Wirkstoff Indoxacarb)

der Firma DuPont behandelt. Der Einsatz der Pflanzenschutzmittel erfolgte jeweils

nach den Anwendungshinweisen des Herstellers.

2.2 Versuchssteuerung

2.2.1 Gewächshaus

Die Feldsalatpflanzen wurden für die Dauer der Anzucht, das heißt nach dem

Ankeimen bis zur Verwendung für Versuche, im Gewächshaus kultiviert. Eine

Bewässerung wurde manuell bei Bedarf durchgeführt, ebenso wie die Verwendung

eines Energieschirmes und die Ausbringung von Pflanzenschutzmitteln. In den

Wintermonaten wurde zusätzlich ein Kunstlicht eingesetzt.

Versuche zu Untersuchungen der Sortenanfälligkeit (Kapitel 2.13) wurden im

Gewächshaus durchgeführt.


9

2.2.2 Klimaschränke und Klimakammern

Soweit nicht anders erwähnt, wurden alle Versuche in Klimaschränken

beziehungsweise Klimakammern durchgeführt, wobei die Temperatur- sowie

Lichteinstellung je nach Versuch variierten. Die Bewässerung erfolgte manuell bei

Bedarf. Verwendet wurden dabei eine geräumige, begehbare Klimakammer des Typs

VEKZ 05/440 der Firma Vötsch Industrietechnik GmbH, Balingen, Deutschland, ein

Pflanzenwachstumsschrank des Typs KBWF 720 der Firma Binder GmbH,

Tuttlingen, Deutschland und Klimaschränke der Firma Rubarth Apparate GmbH,

Laatzen, Deutschland. Des Weiteren wurde ein Kühlbrutschrank der Marke Friocell

von der Firma IUL Instruments GmbH, Königswinter, Deutschland verwendet.

2.3 Isolierung und Charakterisierung von Acidovorax

valerianellae-Bakterien

Bei Auftreten von Blattsymptomen, die durch das Bakterium A. valerianellae

verursacht sein könnten, wurde versucht, die Bakterien aus diesen Blattbereichen zu

isolieren. Dafür wurden die Symptom tragenden Blätter zunächst mit 70 %-igem

Alkohol und danach mit destilliertem Wasser abgespült und so von anhaftenden

Schmutzpartikeln und möglicherweise vorkommenden Epiphyten befreit und

oberflächendesinfiziert. Die Blätter wurden anschließend mit Zellstoff getrocknet

und dann in einem Mörser mit 1 ml 0,85 %-iger NaCl-Lösung homogenisiert. Das

Homogenat wurde 1:100 und 1:1000 verdünnt. Jeweils 20 µl des unverdünnten

Homogenats sowie der beiden Verdünnungen wurden auf eine KB-Agar-Schale mit

Cycloheximid in dreifacher Wiederholung aufgetragen und mittels Drigalskispatel

gleichmäßig verteilt. Nach ein- bis dreitägigem Wachstum bei 20 °C wurden

Verdünnungsausstriche mit Hilfe einer sterilen Impföse angefertigt, um reine

Bakterienkulturen auf KB-Agar-Schalen zu erzeugen. Dieser Schritt wurde bei

Bedarf mehrmals wiederholt. Anschließend wurden die Bakterienkolonien näher

charakterisiert (Fluoreszenz, Gramreaktions-Test, Mikrobiologie Bactident®

Oxidase-Test, Hypersensitivitätsreaktion, indirekter ELISA).

A. valerianellae besitzt einen typischen Geruch, der darüber hinaus die

Identifizierung unterstützte.


10

2.3.1 Fluoreszenz

Zur Prüfung der Fluoreszenz wurden die auf KB-Agar-Platten wachsenden Kolonien

unter eine Schwarzlichtlampe gehalten. Handelt es sich bei den zu testenden

Kolonien um A. valerianellae-Bakterien, so fluoreszieren sie nicht. Sie sind daher

deutlich von den fluoreszierenden Pseudomonaden zu unterscheiden.

2.3.2 Gramreaktions-Test (nach SUSLOW et al., 1982)

Zum Test der Gramreaktion wurden zu testende Einzelkolonien beziehungsweise

Reinkulturen auf einer Impföse in einen Tropfen 1 %-iger Kaliumhydroxid (KOH)-

Lösung auf einem Objektträger verrieben. Handelt es sich um A. valerianellae-

Bakterien, so bildet sich aufgrund der Zellwandzusammensetzung des Gram-

negativen Bakteriums ein Faden, wenn man die Impföse langsam aus dem Tropfen

hebt.

2.3.3 Mikrobiologie Bactident® Oxidase-Test (nach KOVACS,

1956)

Zum Test der Oxidase-Tätigkeit, wobei es sich um einen Nachweis der

Cytochromoxidase in Mikroorganismen handelt, werden Einzelkolonien

beziehungsweise Reinkulturen auf einer Impföse auf die Reaktionszone eines

Teststäbchens aufgetragen und verrieben. Die Teststäbchen stammen von der Firma

Merck KGaA aus Darmstadt. Nach 20 bis 60 Sekunden wird die Reaktion mit einer

Farbskala verglichen (Abb. 2.1). In Anwesenheit molekularen Sauerstoffs kann das

Cytochromoxidase/Cytochrom c-System eine ganze Reihe von organischen

Substanzen reduzieren, unter anderem das sogenannte NaDi-Reagenz (1-Naphthol +

Dimethyl-paraphenylendiamin) unter Bildung des Kondensationsmoleküls

Indophenolblau. Diese Reaktion wird zur Klassifizierung und Identifizierung von

Bakterien verwendet. Handelt es sich bei der zu testenden Kultur um

A. valerianellae-Bakterien, so färbt sich die Reaktionszone blau bis blauviolett und

die Kultur gilt als Oxidase-positiv.


11

Abbildung 2.1: Mikrobiologie Bactident® Oxidase-Test zum

Nachweis Oxidase-positiver A. valerianellae-Bakterien

anhand eines Farbumschlages auf dem Teststäbchen.

2.3.4 Hypersensitivitätsreaktion (nach GARDAN et al., 2003)

Bei Prüfung der Hypersensitivitätsreaktion wird die zu testende Bakteriensuspension

mit einer Konzentration von 108 cfu/ml (Herstellung in Kapitel 2.8 beschrieben) in

Tabakblätter (Nicotiana tabacum) der Sorte Samsun infiltriert. Handelt es sich bei

der zu testenden Bakterienlösung um eine Suspension von A. valerianellae, so ist

nach zwei bis drei Tagen eine sehr schwache bis schwache

Hypersensitivitätsreaktion im Bereich der Infiltrationsstelle zu beobachten

(Abb. 2.2).


12

Abbildung 2.2: Schwache Hypersensitivitätsreaktion an Tabak

im Bereich der Infiltrationsstellen (innerhalb der Kreise) am

Beispiel des A. valerianellae-Isolates 6.1.a (Infiltration mit einer

Konzentration von 108 cfu/ml).

2.3.5 Indirekter ELISA (TAS Triple antibody sandwich)

Der TAS-ELISA wurde 2009 von Frau K. Thiele, Institut für Epidemiologie und

Pathogendiagnostik des Julius Kühn-Instituts, Quedlinburg, entwickelt und

freundlicherweise für diese Arbeit zur Verfügung gestellt. Hierzu gehörte das

polyklonale Immuglobulin G (IgG) 44 und der monoklonale Antikörper 7C10ESB10

aus dem Hybridomüberstand. Das Serum (IgG 44) und der monoklonale Antikörper

wurden gegen das A. valerianellae-Isolat 16619 der Deutschen Sammlung von

Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig entwickelt.

Die zu beschichtenden Maxisorpplatten mit 96 Vertiefungen (442404, F96 Maxisorp,

Nunc-Immuno-Plate, Lot. 111276) stammen von der Firma Thermo Fisher Scientific,

Dänemark. Das verwendete Ziege-Anti-Maus-Anti-Körper (ZAMAK) - Konjugat

wurde unter dem Namen Alkaline Phosphatase-conjugated AffiniPure Goat Anti-

Mouse IgG + IgM (H+L) (Code: 115-055-044, Lot: 81251) von der Firma Jackson

ImmunoResearch Europe Ltd, Suffolk CB8 1JX bezogen. Als Substrat diente

4-Nitrophenyl phosphate-disodium salt (p-NPP) (No. 00130/025,

C 180506) der Firma LOEWE Biochemica GmbH, Deutschland.


13

Die für den TAS-ELISA verwendeten Puffer wurden wie folgt selbst hergestellt:

Coatingpuffer:

1,59 g Na2CO3

2,93 g NaHCO3

ad. 1000 ml H2O dest.

pH-Wert 9,6 wurde eingestellt mit NaOH/HCl

Waschpuffer (PBS):

8 g NaCl

0,2 g KH2PO4

1,46 g Na2HPO4 * 2 H2O

0,2 g KCl

0,5 ml Tween 20

ad. 1000 ml H2O dest.

pH-Wert 7,4 wurde eingestellt mit NaOH/HCl

Extraktionspuffer:

20 g Polyvinylpyrrolidinone 25

2 g Trockenmilch

ad. 1000 ml Waschpuffer

Der für den letzten Schritt verwendete Substratpuffer (Substrate Buffer 5 *,

No. 07602/025) stammte von der Firma LOEWE Biochemica GmbH, Deutschland

und wurde vor Verwendung 5-fach mit Aqua dest. verdünnt.

Der TAS-ELISA wurde folgendermaßen durchgeführt:

1. Coating:

Polyklonales Immunglobulin G (IgG) 44 wurde 1:100 in Coatingpuffer

verdünnt und 100 µl wurden in je eine Vertiefung aufgetragen. Die folgende

Inkubation wurde für zwei Stunden bei 37 °C durchgeführt. Vor dem

nächsten Schritt wurden die Platten dreimal mit Waschpuffer (PBS)

gewaschen.


14

2. Blockierung:

200 µl Waschpuffer (PBS) mit 1 % Trockenmilch (TM) wurden in jede

Vertiefung pipettiert. Die Platten wurden anschließend für eine Stunde bei

37 °C inkubiert. Für den folgenden Schritt wurden die Platten nicht

gewaschen, sondern nur Blockierungspuffer entfernt.

3. Pflanzensaft beziehungsweise Probe:

Die zu untersuchenden Pflanzenblätter oder gewachsenen Bakterienkolonien

wurden 1:10 oder 1:20 (je nach Materialmenge) in Extraktionspuffer

homogenisiert und entweder direkt verwendet oder eingefroren. 100 µl der

Probe (frisch oder aufgetaut) wurde in je eine Vertiefung gefüllt, wobei jede

Probe als Doppelbestimmung aufgetragen worden ist. Die Inkubation

erfolgte bei 4 °C über Nacht. Am darauf folgenden Tag wurden die Platten

viermal mit Waschpuffer (PBS) gewaschen.

4. monoklonaler Antikörper:

100 µl des 1:2000 in Waschpuffer mit 1 % Trockenmilch verdünnten

monoklonalen Antikörpers 7C10ESB10 wurde in jede Vertiefung pipettiert.

Die Platten wurden anschließend bei 37 °C inkubiert. Nach zwei Stunden

wurden die Platten viermal mit Waschpuffer (PBS) gewaschen.

5. Konjugat (Ziege Anti Maus-Anti-Körper (ZAMAK):

Für diesen Schritt wurde das verwendete Konjugat im Verhältnis von 1:2000

in Waschpuffer mit 1 % Trockenmilch verdünnt. Die Inkubation von 100 µl

pro Vertiefung wurde für eine Stunde bei 37 °C durchgeführt. Danach wurden

die Platten viermal mit Waschpuffer gewaschen.

6. Substrat:

200 µl 1 mg p-Nitrophenyldihydrogenphosphat je 1 ml Substratpuffer wurde

pro Vertiefung aufgetragen. Die Inkubation erfolgte für eine Stunde bei

Raumtemperatur unter Lichtausschluss. Am ELISA-Reader wurden

Messungen bei 405 nm und 490 nm Wellenlänge durchgeführt.

Nicht-inokulierte, symptomlose Blätter wurden als Negativkontrolle und inokulierte,

Symptom tragende Blätter als Positivkontrolle 1:50 in Extraktionspuffer verdünnt

und in die erste Spalte (gesund) und in die letzte verwendete Spalte (infiziert) auf der

Platte aufgetragen, um ein Verschleppen während des Auftragens beziehungsweise


15

Waschens zu verhindern. Jeweils die Hälfte der aufgetragenen Kontroll-Spalten

(Vierfachbestimmung) wurde mit monoklonalem Antikörper befüllt (Negativ-

beziehungsweise Positivkontrolle), die andere Hälfte nur mit Waschpuffer plus 1 %

Trockenmilch (sogenannte Blindwerte, Schritt 4). Der Mittelwert der Blindwerte

wurde von allen Messwerten abgezogen. Der Mittelwert der Negativkontrollen

zuzüglich des zweifachen Wertes der Standardabweichung dieser Messwerte

(mean + 2 * s) wurde für jede ELISA-Platte als Schwellenwert festgelegt.

Mehrfachbestimmungen derselben Probe wurden gemittelt und mit dem

Schwellenwert verglichen.

Als A. valerianellae-positive Proben galten alle, deren gemittelte Messwerte

abzüglich des Blindwertes oberhalb des Schwellenwertes einer Maxisorpplatte lagen.

2.4 Verwendete Acidovorax valerianellae-Stämme

Für die Versuche wurde, wenn nicht anders benannt, ein Isolategemisch aus den

Isolaten 6.1.a, 16619, 709/2, 552 und IV2 verwendet. Das Isolat 6.1.a stammt aus der

Gegend um Karlsruhe, Deutschland. Dieses wurde freundlicherweise von Frau Dr.

Esther Moltmann von dem Landwirtschaftlichen Technologiezentrum Augustenberg,

Außenstelle Stuttgart, Deutschland zur Verfügung gestellt. Das Isolat 16619 stammt

aus der Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,

Braunschweig, Deutschland und wurde dort unter der DSM-Nummer 16619

beziehungsweise CFBP 4730, NCPPB 4283 bestellt. Das Isolat 709/2 stammt aus

dem Raum Neustadt an der Weinstraße, Deutschland und wurde dankenswerterweise

von Herrn Dr. Hermann-Josef Krauthausen von dem Dienstleistungszentrum

Ländlicher Raum Rheinpfalz, Neustadt an der Weinstraße, Deutschland zur

Verfügung gestellt. Die Firma Enza Zaden, Enkhuizen, Niederlande war so

freundlich die Isolate 552 und 553 zur Verfügung zu stellen, während das Isolat IV2

von der Firma Rijk Zwaan, Frasem, Frankreich freundlicherweise bereit gestellt

wurde.

Die Isolate wurden bei -75 °C in einer CryobankTM, einem Stammhaltungssystem zur

Langzeitlagerung für Mikroorganismen der Firma Mast Diagnostica Laboratoriums-


16

Präparate GmbH, Reinfeld, Deutschland aufbewahrt und je nach Bedarf auf KB-

Agar-Schalen rekultiviert.

2.5 Verwendetes Valerianella locusta (L.) – Saatgut

Für alle Feldsalatversuche mit Ausnahme der Sortenversuche, den Versuchen zur

Saatgutübertragung, den Versuchen von Nachweismethoden von A. valerianellae am

Saatgut und den Dekontaminationsmaßnahmen wurde die Sorte AV-1

(Kalibergröße 2,00-2,25, 2006) der Firma Enza Zaden Deutschland GmbH & Co.

KG, Dannstadt-Schauernheim, verwendet.

Das Saatgut der Sorten und der Wildart V. rimosa (AV-13) für die Versuche zur

Sortenanfälligkeit (Tab. 2.1) wurde sowohl von der Firma Enza Zaden, der Firma

Clause (Nickerson Zwaan), Edemissen, Deutschland, der Firma Nunhems/Hild,

Marbach/Neckar, Deutschland als auch von der Firma Rijk Zwaan De Lier,

Niederlande zur Verfügung gestellt. Das Saatgut für diese Versuche wurde vor der

Aussaat einer Warmwasserbeize unterzogen. Hierbei wurde das Saatgut für

20 Minuten in ein 42 °C bis 45 °C warmes Wasserbad gelegt (persönliche

Mitteilung, A. Schieder, Enza Zaden). Anschließend wurde das Saatgut auf

Filterpapier bei einer Temperatur von 27 °C für 24 bis 48 Stunden zurückgetrocknet.

Für die Versuche zur Saatgutübertragung mit Aussaat in den Jahren 2007 und 2008

wurden die nicht-infizierte, gesunde Sorte AV-60 (2006, Kalibergröße 2,00-2,25)

und die infizierte Sorte AV-75 (2005, Kalibergröße 2,00-2,25) von der Firma Enza

Zaden, Enkhuizen, Niederlande zur Verfügung gestellt. Für den Folgeversuch zur

Saatgutübertragung mit Aussaat im Jahr 2009 wurden die gleichen Sorten eingesetzt,

allerdings waren beide Sorten mit Thiram, Metalaxyl und Iprodion gebeizt.

Für die Versuche von Nachweismethoden von Acidovorax valerianellae am Saatgut

(Kapitel 2.15.1) wurden sowohl die Ausgangssaatgutpartien als auch die

selbstproduzierten Partien aus den Versuchen zur Saatgutübertragung herangezogen.

Für die Dekontaminationsmaßnahmen (Kapitel 2.15.2) wurden zwei Sorten

verschiedener Züchterhäuser benutzt. Als Vergleichssorte wurde die Sorte AV-220

(2009, Kalibergröße 2,00-2,25) von der Firma Enza Zaden, Enkhuizen, Niederlande


17

verwendet. Als kontaminierte Sorten wurden die Sorten AV-219 (2009, Kalibergröße

2,00-2,25) von der Firma Enza Zaden, Enkhuizen, Niederlande und die Sorte AV-17

(2009, Kalibergröße 2,00-2,25) von der Firma Rijk Zwaan De Lier, Niederlande

verwendet.


18

Tabelle 2.1: Verwendetes Saatgut für die Versuche zur Sortenanfälligkeit.

k.A.: keine Angabe

Sorte Züchter Kalibrierung Beizung

AV-2 2,25-2,5 Thiram, Carbendazim,

Metalaxyl-M

AV-3

Rijk Zwaan

2,00-2,25 -

AV-4 2,25-2,5 -

AV-5 1,75-2,00 -

AV-6

Clause

2,50-2,75 -

AV-7 2,25-2,50 -

AV-8

Nunhems/Hild

1,75-2,00 -

AV-9 2,00-2,25 -

AV-10 2,00-2,25 Thiram, Iprodion,

Metalaxyl-M

AV-11 2,00-2,25 -

AV-12 2,00-2,25 Thiram, Iprodion+,

Metalaxyl-M

AV-13

V. rimosa k.A. -

AV-14 k.A. -

AV-15

Enza Zaden

k.A. -


19

2.6 Keimfähigkeit

Zur Überprüfung der Keimfähigkeit wurden 4 * 100 Samen je Saatgutpartie auf

gefaltetem, mit Leitungswasser angefeuchtetem Filterpapier ausgelegt und unter

kühlen, dunklen Bedingungen (4 °C, Kühlschrank) inkubiert (Abb. 2.3). Die Samen

wurden mehrmals auf ihre Keimung hin überprüft (innerhalb von vier Wochen),

wobei jeweils die Anzahl an gekeimten Samen festgestellt wurde. Der Endwert der

Keimfähigkeit (nach 28 Tagen) je Partie wurde aus vier Wiederholungen gemittelt.

Abbildung 2.3: Gekeimte und nicht gekeimte Feldsalatsamen auf

angefeuchtetem Filterpapier zur Überprüfung der Keimfähigkeit.

(Foto: P. Krämer)

2.7 Aussaat von Feldsalatpflanzen

Die Aussaat des Feldsalates für die Gewächshaus- und Klimakammerversuche

erfolgte, wenn nicht anders erwähnt, in 4-er beziehungsweise 5-er Erdpresstöpfe, die

aus einem Anzuchtsubstrat mit organischer Aufdüngung für Gemüsejungpflanzen

(KKS Bio Potgrond) der Firma Klasmann-Deilmann GmbH, Geeste, Deutschland

hergestellt wurden. Die Erdpresstöpfe wurden mittels einer Erdpresstopfmaschine


20

der Firma Unger, Landmaschinen, Heidelberg-Dossenheim, Deutschland hergestellt

und in Aussaatkisten abgelegt. Bis zur weiteren Verwendung wurden fertige Kisten

im Kühlhaus gelagert. Die Aussaat des Feldsalates erfolgte entweder von Hand um

eine definierte Kornablage zu gewährleisten (für die Versuche zur Sortenanfälligkeit)

beziehungsweise über ein Handsähgerät, mit dem bei jeder Betätigung drei bis fünf

Körner in den Topf abgelegt wurden. Um ein Austrocknen der Töpfe zu verhindern

und eine gleichmäßige Befeuchtung zu gewährleisten wurden die Töpfe abschließend

mit Sand abgestreut. Fertig ausgesäte Kisten wurden für die ersten fünf bis sechs

Tage zum Ankeimen bei konstanten Temperaturen von 15 °C gelagert. Nach dem

Ankeimen wurden die Feldsalatpflanzen im Gewächshaus weiterkultiviert. Eine

Bewässerung erfolgte, wenn nicht anders erwähnt, über Kopf nach Bedarf. Vor einer

weiteren Verwendung der Feldsalatpflanzen wurde jeder Erdpresstopf auf eine gut

entwickelte Pflanze vereinzelt.

2.8 Herstellung von A. valerianellae - Inokulum

Zur Herstellung einer A. valerianellae-Suspension wurden Bakterienzellen von zwei

bis drei Tage alten Kulturen von KB-Agar-Platten abgenommen und in eine

Natriumchloridlösung (0,85 %) suspendiert. Die optische Dichte wurde dabei anhand

des Standards für Gram-negative Bakterien des BIOLOG-Verfahrens (GN-NENT)

mittels Turbidimeter auf eine Bakterienkonzentration von ungefähr 3*108 cfu/ml

eingestellt. Da die Konzentrationseinstellung über diesen Weg nicht genauer

bestimmt werden konnte, war ein zusätzliches Ausplattieren der Bakteriensuspension

unerlässlich. Zunächst wurde die Konzentration auf einen Wert von in etwa

103 cfu/ml verdünnt und anschließend auf acht bis zehn KB-Agar-Platten zu je 20 µl

ausplattiert. Die Schalen wurden für drei bis vier Tage bei 20 °C beziehungsweise für

zwei bis drei Tage bei 25 °C inkubiert und abschließend fand ein Auszählen der

Kolonien statt und die Umrechnung auf Bakterienanzahl pro Milliliter in der

Ausgangssuspension.

Ausgehend von einer A. valerianellae-Konzentration von ungefähr 108 cfu/ml

(Einstellung über das Turbidimeter des BIOLOG-Verfahrens) wurden die

Konzentrationen 102 cfu/ml, 103 cfu/ml, 104 cfu/ml, 105 cfu/ml, 106 cfu/ml,

107 cfu/ml für die Verdünnungsreihe mit 0,85 %-iger NaCl-Lösung eingestellt. Die


21

Suspension mit der höchsten Konzentration von 108 cfu/ml wurde dabei zunächst in

einem Verhältnis von 1:10 verdünnt. Das so entstandene Inokulum mit der

Konzentration von 107 cfu/ml wiederum als Ausgangssuspension zur Herstellung der

Konzentration von 106 cfu/ml verwendet, wobei die Suspension im Verhältnis von

1:10 verdünnt wurde. Die Bakteriensuspensionen für die anderen Konzentrationen

wurden nach dem gleichen Verfahren hergestellt.

2.9 Inokulation der Feldsalatpflanzen

Das Bakterium A. valerianellae wurde, wenn nicht anders erwähnt, in allen

Versuchen als Suspension eines Isolategemisches (aus den Isolaten 6.1.a, 16619,

IV2, 552 und 709/2) und mit einer Konzentration von 108 cfu/ml verwendet. Die

Inokulation erfolgte, wenn nicht anders erwähnt, durch Sprühinokulation auf die

nicht verletzte, trockene Pflanzenoberfläche mittels Feinzerstäuber. Die

Bakteriensuspension wurde bis zum Ablaufen des Sprühfilms auf die Pflanzen

ausgebracht (Abb. 2.4).

Nach der Inokulation wurden die Pflanzen unter einer Haube beziehungsweise Folie

bei annähernd gesättigter Luftfeuchtigkeit weiterkultiviert. Die Dauer der Abdeckung

war je nach Versuchsfrage unterschiedlich.


22

Abbildung 2.4: Inokulation von Feldsalatpflanzen mit A. valerianellae.

(A): Verwendung eines Feinzerstäubers. (B): Sprühfilm zerstäubter

A. valerianellae-Suspension auf der Oberseite von Feldsalatblättern.

(Foto (A): G. Hörner, Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum -

Rheinpfalz)

A

B


23

2.10 Bonitur von Feldsalatpflanzen

Die Bonitur von Feldsalatpflanzen wurde, wenn nicht anders erwähnt, mehrmals zu

verschiedenen Zeitpunkten nach der Inokulation bis Versuchende vorgenommen. Es

wurden sowohl die Anzahl von Symptom tragenden Pflanzen (Befallshäufigkeit

in %) ermittelt als auch der Anteil nekrotischer Blattfläche je Einzelpflanze

(Befallsstärke in %) geschätzt.

Bei der Bonitur der Pflanzen im Bodenüberdauerungsversuch wurden sowohl die

Gesamtanzahl der aufgelaufenen Feldsalatpflanzen als auch die Zahl der Symptom

tragenden Pflanzen beurteilt und in Prozent angegeben (Befallshäufigkeit in %).

Bei der Bonitur der Pflanzen des Ausgangssaatgutes bei der Saatgutproduktion (mit

Aussaat in den Jahren 2007 bis 2009) wurden zunächst Symptom tragende Pflanzen

mit einem Holzstab markiert und anschließend wurde die Gesamtanzahl an Symptom

tragenden Pflanzen geschätzt.

2.11 Statistische Auswertung der Daten

Die Daten wurden mit dem Statistikpaket XLSTAT von MS Excel, Version 6,

ausgewertet. Mit allen Daten wurde eine Varianzanalyse durchgeführt, vorausgehend

wurden die Residuen mit dem Shapiro Wilk Test auf Normalverteilung geprüft. Die

Unterschiede zwischen normalverteilten Behandlungen wurden mit dem Tukey`s

HSD-Test auf Signifikanz bei p < 0,05 geprüft (und sind nachfolgend in den

Abbildungen nochmals gesondert beschriftet). Nicht normalverteilte Stichproben

wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verglichen und auf

Signifikanz bei p < 0,05 nachgerechnet. Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind

nicht signifikant voneinander verschieden.


24

2.12 Untersuchungen zu Infektionsbedingungen von

Acidovorax valerianellae

2.12.1 Einfluss der Temperatur auf die Infektion in vivo

Die Versuche wurden in Klimaschränken bei konstanten Temperaturen von 10 °C,

15 °C, 20 °C, 25 °C und 30 °C im 12 Stunden Tag- (mit Beleuchtung) und

12 Stunden Nachtrhythmus (ohne Beleuchtung) durchgeführt. Feldsalatpflanzen im

2- bis 4-Blattstadium wurden direkt nach der Inokulation mit einem A. valerianellae-

Gemisch (siehe Kapitel 2.4) in einer Konzentration von 109 cfu/ml bei genannten

Temperaturen unter gesättigter Luftfeuchte aufgestellt und bis Versuchende

mehrmals bonitiert. Die Bewässerung der Pflanzen erfolgte über das

Anstauverfahren, um eine Ausbreitung des Erregers über Spritzwasser zu vermeiden.

Bonitiert wurde der Anteil an befallener Blattfläche (Befallsstärke in %) und die

Anzahl an Symptom tragenden Pflanzen (Befallshäufigkeit in %).

2.12.2 Einfluss des Blattalters und der Blattnässedauer auf die

Infektion

Für diesen Versuch wurden Feldsalatpflanzen (n=20) in verschiedenen Stadien

(Keim- und Laubblattstadium) mit dem Isolat 709/2 mit einer Konzentration von

106 cfu/ml inokuliert und anschließend unter gesättigter Luftfeuchte kultiviert. Die

Dauer der Abdeckung zur Erhöhung der Luftfeuchtigkeit wurde variiert. In der ersten

Variante wurden die Pflanzen unmittelbar nach der Inokulation einmalig für

48 Stunden bei gesättigter Luftfeuchte kultiviert (einmalige Abdeckung). In der

zweiten Variante wurden die Pflanzen direkt nach der Inokulation für 48 Stunden bei

gesättigter Luftfeuchte und nach einer jeweils fünftägigen Phase ohne Abdeckung

erneut für 48 Stunden bei gesättigter Luftfeuchte kultiviert. Das erfolgte im

wöchentlichen Abstand, so dass über 35 Tage jeweils an zwei von sieben Tagen

gesättigte Luftfeuchtigkeiten herrschten. In Variante drei wurden die Pflanzen bis

Versuchende, 35 Tage nach der Inokulation, dauerhaft bei gesättigter Luftfeuchte


25

gehalten (dauerhafte Abdeckung). Die Klimakammerführung wurde auf 20 °C und

18 °C im 12-Stundenwechsel mit 16 Stunden Licht eingestellt.

An verschiedenen Tagen nach der Inokulation wurden Bonituren vorgenommen, bei

denen ermittelt wurde, wie viele Pflanzen von den 20 inokulierten Pflanzen

Symptome zeigten. Begonnen wurde am vierten Tag nach der Inokulation, während

die letzte Bonitur nach 35 Tagen stattfand.

In einer Versuchswiederholung wurden Pflanzen im Laubblattstadium mit einem

Isolategemisch (Konzentration 105 cfu/ml) inokuliert und anschließend, wie oben

beschrieben kultiviert.

2.12.3 Einfluss der Blattnässedauer auf die Infektion

beziehungsweise die Symptomentwicklung

Um zu testen, ob die Dauer der Blattnässe beziehungsweise die Dauer des

Vorhandenseins einer hohen (gesättigten) Luftfeuchte einen Einfluss auf eine

Infektion von A. valerianellae besitzt, wurden mehrere Versuche angelegt. Bei allen

Versuchen zum Einfluss der Blattnässedauer auf die Infektion erfolgte die

Inokulation von Pflanzen im 2- bis 4-Blattstadium mit einer A. valerianellae-

Suspension aus einem Isolategemisch mit einer Konzentration von 108 cfu/ml, wenn

nicht anders erwähnt. Die Bewässerung erfolgte über das Anstauverfahren, um eine

Erregerausbreitung durch Spritzwasser zu vermeiden. Erfasst wurden Befallsstärke

und Befallshäufigkeit an verschiedenen Tagen nach der Inokulation bis Versuchende.

2.12.3.1 Einfluss der Blattnässedauer auf die Symptomentwicklung

In einem ersten Versuchsansatz unter Klimakammerbedingungen bei Temperaturen

von 25 °C für 12 Stunden und 18 °C für 12 Stunden bei 16 Stunden Licht wurde der

Einfluss einer zwischengeschalteten Trockenphase von sieben beziehungsweise acht

Tagen auf die Symptomausprägung bereits befallener Feldsalatpflanzen untersucht.

Nach der Inokulation wurden alle Versuchspflanzen bei gesättigter Luftfeuchte

kultiviert, um zunächst einen 100 %-igen Befall zu erreichen. Dies geschah an Tag

sieben nach der Inokulation. Diese erste Phase unter gesättigten Luftfeuchten wurde,

den Versuchsgliedern entsprechend, bis zum Tag 18 nach Inokulation ausgeweitet.


26

Nach einer jeweils zwischengeschalteten Trockenphase von sieben beziehungsweise

acht Tagen bei normal vorherrschenden Luftfeuchten von 88 % relativer Luftfeuchte,

wurde die Pflanzenanzahl je Versuchsglied halbiert. Eine Hälfte der Pflanzen wurde

weiterhin „trocken“ (bei normal vorherrschender Luftfeuchte) und die andere Hälfte

erneut „feucht“ (bei gesättigter Luftfeuchte) kultiviert.

Pflanzen des Versuchsgliedes 08/15 wurden demnach wie folgt behandelt: die ersten

acht Tage nach der Inokulation wurden die Pflanzen unter gesättigter Luftfeuchte

kultiviert, dann folgte eine siebentägige Kultivierung bis Tag 15 nach Inokulation

unter normal vorherrschender Luftfeuchte und ab Tag 15 erfolgte eine Zweiteilung

der Versuchspflanzen. Das heißt, die Versuchspflanzen wurden bis Versuchende

(32 Tage nach der Inokulation) entweder weiterhin bei normal vorherrschender

Luftfeuchte „trocken“ beziehungsweise unter gesättigter Luftfeuchte „feucht“

kultiviert.

Pflanzen des Versuchsgliedes 10/18 wurden für die ersten zehn Tage unter

gesättigten Bedingungen kultiviert. Es folgte eine Kultivierung unter normal

vorherrschender Luftfeuchte (Trockenphase) von acht Tagen Dauer, mit

anschließender Weiterkultivierung (ab Tag 18) entweder unter trockenen

beziehungsweise gesättigten Luftfeuchten, bis zum 32. Tag nach der Inokulation.

Entsprechendes gilt für die anderen Versuchglieder (12/19, 14/22 und 18/25). Die

erste Zahl steht für die erste Phase der Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte, die

zweite Zahl benennt den Tag nach Inokulation, ab dem die Versuchspflanzen

zweigeteilt wurden und entweder weiterhin „trocken“ beziehungsweise erneut

„feucht“ kultiviert wurden.

In einem weiteren Versuch unter Klimakammerbedingungen (20 °C für 14 Stunden

und 15 °C für zehn Stunden bei 16 Stunden Licht) wurden inokulierte

Feldsalatpflanzen bis zum sichtbaren Befall an allen Pflanzen (neun Tage nach

Inokulation) bei gesättigter Luftfeuchte kultiviert. In der daran anschließenden

Trockenphase wurden alle Pflanzen der Versuchsglieder bei 88 % relativer

Luftfeuchte kultiviert und die darauffolgende, erneute Kultivierung der Pflanzen

unter gesättigter beziehungsweise normal vorherrschender Luftfeuchte (bei jeweils

der Hälfte der Pflanzen) wurde im wöchentlichen Abstand bis Tag 37 nach der

Inokulation ausgeweitet. Das heißt befallene, Symptom tragende Pflanzen wurden


27

bis 16, 23, 30 und 37 Tage nach Inokulation bei trockenen Bedingungen kultiviert.

Daran anschließend wurden die Hälfte der Pflanzen weiterhin trocken und die andere

Hälfte erneut unter gesättigten Luftfeuchten kultiviert (wie oben bereits beschrieben)

und zu verschiedenen Tagen nach der Inokulation bonitiert.

2.12.3.2 Einfluss der Blattnässedauer unmittelbar nach der Inokulation

In einem zweiten Versuchsansatz wurde die Dauer der vorherrschenden Luftfeuchte

in der Klimakammer nach der Inokulation variiert. Die Klimakammer wurde dabei

auf Temperaturen von 20 °C für 14 Stunden und 15 °C für 10 Stunden bei

16 Stunden Licht eingestellt. Die Pflanzen wurden 0, 6, 9, 12, 24, 48 und 72 Stunden

nach der Inokulation unter gesättigter Luftfeuchte kultiviert. Nach jeweils sieben

Tagen „Trockenheit“ bei 85 % relativer Luftfeuchte wurde die Hälfte der Pflanzen

der jeweiligen Versuchsglieder bei gesättigter Luftfeuchte kultiviert.

Die Pflanzen wurden ab dem neunten Tag nach der Inokulation bonitiert. Bonitiert

wurden dabei sowohl die Pflanzen, die nach einer Trockenphase erneut bei

gesättigter Luftfeuchte kultiviert wurden, als auch die Pflanzen, die bis Versuchende

bei normal vorherrschender Luftfeuchte wuchsen. Die Bonitur von Pflanzen, die

zunächst für 48 und 72 Stunden bei gesättigter Luftfeuchte kultiviert wurden, wurde

am neunten Tag nach der Inokulation lediglich an Pflanzen innerhalb der

Trockenperiode vorgenommen. Ab der zweiten Bonitur (13 dpi) wurden die Pflanzen

aus allen Varianten entweder als trocken oder feucht weiterkultiviert und bonitiert.

Dieser Versuch wurde ebenfalls bei einer konstanten Temperatur von 20 °C mit

12 Stunden Licht am Tag für die ersten 96 Stunden nach der Inokulation und danach

mit einem Tag/Nacht-Rhythmus von 20 °C Tag und 15 °C Nacht durchgeführt.

Als Vergleich zu beiden Temperaturvarianten wurden inokulierte Pflanzen, die über

die gesamte Zeit des Versuches dauerhaft bei gesättigter Luftfeuchte kultiviert

wurden, ebenfalls hinsichtlich der Befallsstärke bonitiert.


28

2.12.4 Einfluss der Inokulumdichte auf die Infektion

Es wurden Feldsalatpflanzen im Laubblattstadium mit einzelnen

A. valerianellae-Isolaten (6.1.a, 16619, 552) in verschiedenen Konzentrationen

inokuliert und in der Klimakammer unter gesättigter Luftfeuchte aufgestellt. Die

Konzentration der Isolate lag dabei zwischen 102 cfu/ml und 107 cfu/ml. Zwischen

dem 5. und dem 19. Tag nach der Inokulation wurde die Anzahl an Symptom

tragenden Pflanzen ermittelt. Die Bewässerung erfolgte über das Anstauverfahren.


29

2.13 Untersuchungen zur Sortenanfälligkeit

2.13.1 Einfluss der Sorte auf die Infektion

Es wurden für diesen Versuch die Sorten AV-2, AV-3, AV-4, AV-5, AV-6, AV-7,

AV-8, AV-9, AV-10, AV-11, AV-12, AV-14 und AV-15 der Züchterhäuser Clause

Tézier, Enza Zaden, Rijk Zwaan und Nunhems untersucht. Des Weiteren war die

Wildform V. rimosa (AV-13) Gegenstand der Untersuchungen zum Einfluss der

Sorte auf die Infektion. Die Aussaat fand am 16.11.2007 (erste Wiederholung) und

am 14.01.2008 (zweite Wiederholung) statt. Am 31. (1. Wiederholung)

beziehungsweise 35. (2. Wiederholung) Tag nach der Aussaat wurden die Pflanzen

im Laubblattstadium inokuliert. Für die Sprühinokulation wurde ein Isolategemisch

mit einer Konzentration von 106 cfu/ml verwendet. Die Pflanzen wurden für 18 Tage

bei gesättigter Luftfeuchte im Gewächshaus randomisiert kultiviert (zwischen 13 °C

und 24 °C bei 12 Stunden Kunstlicht im ersten Versuch, höhere Temperaturen

zwischen 20 °C bis 29 °C bei 12 Stunden Kunstlicht im zweiten Versuch) und

abschließend bezüglich Befallstärke und Befallshäufigkeit ausgewertet.

2.13.2 Einfluss der Sorte und des Isolates auf die Infektion

Um zu testen, ob einzelne Isolate unterschiedlicher Herkunft bei verschiedenen

Feldsalatsorten zu unterschiedlichen Symptomausprägungen führen, wurden drei

Sorten (AV-1, AV-5, AV-3) und eine Wildart V. rimosa (AV-13) im

Laubblattstadium mit jeweils vier Isolaten (6.1.a, 553, 16619, IV2) inokuliert. Nach

der Sprühinokulation (am 10.03.2009 in der ersten Wiederholung und am 30.03.2009

in der zweiten Wiederholung) wurden die Pflanzen in einer randomisierten

Blockanlage unter Gewächshausbedingungen (zwischen 9 °C und 34 °C in der ersten

Wiederholung beziehungsweise zwischen 2 °C und 45 °C in der zweiten

Wiederholung) bis Versuchende dauerhaft unter gesättigter Luftfeuchte kultiviert.

Die Konzentration der am 10.03.2009 verwendeten Isolate belief sich auf 104 cfu/ml

(Isolate 16619, IV2) und 106 cfu/ml (Isolate: 6.1.a, 553). Bei der Inokulation 20 Tage

später wurde eine Konzentration von 105 cfu/ml für alle Isolate verwendet. Die


30

Endbonitur von Befallsstärke und Befallshäufigkeit fand für beide Wiederholungen

16 Tage nach der Inokulation statt.

2.13.3 Einfluss der Inokulumdichte und der Sorte auf die Infektion

In einem Versuch zum Einfluss der Inokulumdichte und der Sorte auf die Infektion

wurden Feldsalatpflanzen zweier unterschiedlicher Sorten (AV-9 und AV-5) und die

Wildart V. rimosa (AV-13) im Laubblattstadium mit einem Isolategemisch (aus

6.1.a, 16619, IV2, 553) inokuliert und anschließend unter gesättigter Luftfeuchte im

Gewächshaus aufgestellt. Die Konzentrationen der Inokula lagen dabei zwischen

102 cfu/ml und 106 cfu/ml. Es wurde an drei Boniturterminen (zwischen Tag sieben

und Tag 20) die Anzahl an Symptom tragenden Pflanzen ermittelt. Die Pflanzen

wurden über das Anstauverfahren bewässert.


31

2.14 Versuche zum Übertragungsweg von Acidovorax

valerianellae

2.14.1 Boden

Bei der Überprüfung, wie lange das Bakterium im Boden überdauern kann, wurden

am 09.09.2009 nicht-infiziertes und infiziertes Blattmaterial mit A. valerianellae

jeweils in Boden (Schifferstadt, Pfalz, Deutschland) eingemischt. Die Böden wurden

anschließend in Containern im Erdreich eingesenkt (Abb. 2.5). Damit sollten die

natürlichen Bodenverhältnisse in Abhängigkeit der bodenbiologischen Aktivität und

Umsetzung mit der gegebenen Witterung nachgeahmt werden. Der Nachweis

erfolgte im monatlichen Abstand durch die Aussaat von gesundem Saatgut (Sorte

AV-1) in Proben dieser Böden (Abb. 2.6), die jeweils in Einheiten von ca. 800 g

Boden entnommen wurden. In vier Reihen wurden jeweils 15 Samen abgelegt und

mit Perlitte abgedeckt. Die sich entwickelnden Pflanzen wurden in der Klimakammer

bei 20 °C Tag- und 15 °C Nachttemperatur bei 16 Stunden Licht unter gesättigten

Luftfeuchten bis Versuchende (etwa 12 Wochen nach der jeweiligen Aussaat)

inkubiert. Die Pflanzen wurden bei Bedarf gegossen, so dass es teilweise zum

Hochspritzen von Bewässerungstropfen und Bodenpartikeln kommen konnte.

Blattbereiche mit für A. valerianellae typischen Symptomen wurden mittels TAS-

ELISA auf einen A. valerianellae-Befall untersucht.

Dieser Versuchsansatz wurde mit Boden vom Julius Kühn-Institut, Quedlinburg,

Deutschland freundlicherweise von Frau Katja Thiele im März 2010 für die Dauer

von acht Monaten wiederholt.


32

Abbildung 2.5: Container mit kontaminiertem und nicht

kontaminiertem Boden (durch Einarbeitung von nicht-

infiziertem und infiziertem Blattmaterial) für sukz essive

Probenentnahme (einmal pro Monat) über einen Zeitraum von

bis zu einem Jahr (Standort Schifferstadt, Deutschland).


33

Abbildung 2.6: Aussaat von gesundem Saatgut (Sorte Favor) in mit

A. valerianellae kontaminierten und nicht-kontaminierten Boden (durch

Einarbeitung von nicht-infiziertem und infiziertem Blattmaterial) zur

Überprüfung der Überdauerung von A. valerianellae-Bakterien im Boden. Die

Abdeckung der Samen erfolgte mit Perlitte.

2.14.2 Alternative Wirtspflanzen

Um den Wirtspflanzenkreis von A. valerianellae einzugrenzen, wurden

Infektionsversuche mit verschiedenen Pflanzenarten durchgeführt. Als mögliche

Wirtspflanzen von A. valerianellae wurden Gemüse- und Ackerbaukulturen, die in

einem unter Praxisbedingungen vorkommenden Fruchtwechsel mit Feldsalat

angebaut werden, sowie verschiedene Unkräuter geprüft. Der Befall potentieller

alternativer Wirtspflanzen wurde zunächst visuell und später mittels TAS-ELISA

geprüft.


34

2.14.2.1 Alternative Wirtspflanzen I

In einem ersten Versuch wurde bei einem breiten Artenspektrum (Tab. 2.2) und

Feldsalat als anfälligem Standard in einzelne Blätter die A. valerianellae-Suspension

eines Isolategemisches mit einer Konzentration von 108 cfu/ml infiltriert und auf die

gesamte Pflanze gesprüht. Anschießend erfolgte die Kultivierung der Pflanzen bei

gesättigter Luftfeuchte in der Klimakammer (20 °C Tag-, 15 °C Nachttemperatur bei

16 Stunden Licht). Zwischen dem 1. Tag und 20. Tag nach Infiltration

beziehungsweise Sprühinokulation wurden die Pflanzen auf eine Veränderung der

Blattstrukturen im Vergleich zur Kontrolle (Infiltration und Sprühinokulation mit

0,85 %-iger Natriumchloridlösung) visuell überprüft. Die Überprüfung erfolgte dabei

sowohl an infiltrierten Blattbereichen als auch an Blattbereichen, die durch Sprühen

inokuliert wurden.


35

Tab 2.2: Verwendete Pflanzen aus elf Familien zur Überprüfung ihrer Eignung als alternative

Wirtspflanzen von A. valerianellae nach Infiltration und Sprühinokulation. 1 diese Pflanzen konnten aufgrund der kleinen Blattfläche nicht in einzelne Blätter infiltriert

werden.

Familie Art

Valerianaceae

(Baldriangewächse)

Valerianella locusta (L.)

(Feldsalat)

Amaranthus retroflexus (L.)

(Zurückgekrümmter Fuchsschwanz)

Chenopodium hybridum (L.)

(Bastard-Gänsefuß)

Amaranthaceae

(Fuchsschwanzgewächse)

Chenopodium album (L.)

(Weißer Gänsefuß)

Lactuca sativa (L.)

(Batavia-Salat)

Lactuca sativa (L.)

(Eissalat)

Matricaria chamomilla (L.)1

(Kamille)

Asteraceae

(Korbblütler)

Senecio vulgaris (L.)

(Gemeines Kreuzkraut)

Brassica rapa ssp. pekinensis (Lour.) Hanelt

(Chinakohl) Brassicaceae

(Kreuzblütengewächse) Capsella bursa-pastoris (L.) Medik.

(Hirtentäschel)

Caryophyllaceae

(Nelkengewächse)

Stellaria media (L.) Vill.

(Vogelmiere)

Phaseolus vulgaris (L.)

(Buschbohne) Fabaceae

(Hülsenfrüchtler) Pisum sativum (L.)

(Markerbse)


36

Tab 2.2 – Fortsetzung:

Familie Art

Hydrophylloideae

(Wasserblattgewächse)

Phacelia tanacetifolia (Juss.)1

(Rainfarn-Phacelie)

Lamiaceae

(Lippenblütler)

Lamium album (L.)

(weiße Taubnessel)

Plantago major (L.)

(Breitwegerich) Plantaginaceae

(Wegerichgewächse) Veronica persica (Poir.)

(Persischer Ehrenpreis)

Poaceae

(Süßgräser)

Eleusine coracana (L.) Gaertn.

(Fingerhirse)

Portulaceae

(Portulakgewächse)

Portulaca oleracea (L.)

(Portulak)


37

2.14.2.2 Alternative Wirtspflanzen II

In einem zweiten Versuch wurden Pflanzen aus sechs Familien (Tab. 2.3) und

Feldsalat als anfälligem Standard mittels Sprühinokulation mit einer

A. valerianellae-Suspension eines Isolategemisches mit einer Konzentration von

108 cfu/ml inokuliert. Für die ersten 48 Stunden sowie 28 bis 30 Tage nach

Inokulation wurden die Pflanzen bei gesättigter Luftfeuchte im Gewächshaus

kultiviert. Am 10. Tag nach der Inokulation sowie am 25. und 30. Tag nach der

Inokulation wurden die Pflanzen visuell auf eine Veränderung in der Blattstruktur

bonitiert. Als Vergleich wurden entsprechende mit 0,85 %-iger

Natriumchloridlösung inokulierte Kontrollpflanzen herangezogen.


38

Tab 2.3: Verwendete Pflanzen aus sieben Familien zur Überprüfung der Eignung als

Wirtspflanzen von A. valerianellae (Alternative Wirtspflanzen II) nach Sprühinokulati on.

Familie Art

Valerianaceae

(Baldriangewächse)


(Feldsalat) Beta vulgaris subsp. vulgaris var. conditiva (L.)

(Rote Bete) Amaranthaceae

(Fuchsschwanzgewächse) Spinacia oleracea (L.)

(Spinat) Foeniculum vulgare (L.) Mill.

(Fenchel) Daucus carota subsp. sativus (Hoffm.) Schübl. et G.

Martens (Möhre)

Apiaceae

(Doldenblütler)

Petroselium crispum (Mill.) Nyman & A.W. Hill

(Petersilie, glatt und kraus) Raphanus sativus subsp. oleiformes (L.)

(Ölrettich) Raphanus sativus subsp. sativus (L.)

(Radies) Raphanus sativus (L.)

(Rettich)

Brassicaceae

(Kreuzblütengewächse)

Eruca sativa (L.)

(Rucola) Phaseolus vulgaris (L.)



(Markerbse) Poaceae

(Süßgräser)

Zea mays (L.)

(Mais) Solanaceae

(Nachtschattengewächse)

Capsicum annuum (L.)

(Paprika)


39

2.14.2.3 Alternative Wirtspflanzen III

In einem dritten Versuchsansatz wurde geprüft, wie lange das Bakterium in sieben

Pflanzenarten aus fünf Familien (Tab. 2.4) lebensfähig ist und ob diese Pflanzen als

potentielle Wirte für das Bakterium geeignet sind. Dazu wurde in jeweils acht Blätter

jeder Versuchspflanze sowie Feldsalat als anfälligem Standard eine A. valerianellae-

Suspension aus einem Isolategemisch mit der Konzentration von 108 cfu/ml injiziert.

Die Injektion erfolgte über Nadelstiche nur auf einer Blatthälfte. Als Kontrolle wurde

0,85 %-ige Natriumchloridlösung in Blatthälften weiterer Versuchspflanzen infiziert.

Die Pflanzen wurden insgesamt fünf Wochen auf Veränderungen im Vergleich zur

Kontrolle untersucht. Die ersten 12 Tage nach der Inokulation wurden die Pflanzen

bei gesättigter Luftfeuchte kultiviert, um den Bakterien eine optimale Umgebung zu

bieten. Danach erfolgte die Kultur bei der im Gewächshaus vorherrschenden

Luftfeuchtigkeit. Nach 12 Tagen unter gesättigten Bedingungen erfolgte eine erste

Untersuchung der inokulierten Blätter. Der Nachweis lebensfähiger Bakterien

erfolgte über Ausplattieren von Pflanzensaftproben von den mit 70 %-igem Alkohol

oberflächendesinfizierten, injizierten und den nicht-injizierten Blatthälften auf KB-

Agarschalen (plus Cycloheximid). Gewachsene Bakterienkolonien wurden

anschließend näher charakterisiert (Fluoreszenz, Gramreaktions-Test, Mikrobiologie

Bactident® Oxidase-Test, Hypersensitivitätsreaktion, indirekter TAS-ELISA).

Die Pflanzen wurden über die Dauer des Versuches so gegossen, dass die injizierten

Blattbereiche weder berührt noch feucht wurden.


40

Tab. 2.4: Verwendete Pflanzen aus sechs Familien zur Überprüfung ihrer Eignung als

alternative Wirtspflanzen von A. valerianellae nach Stichinokulation.

Familie Art

Valerianaceae

(Baldriangewächse)


(Feldsalat)

Beta vulgaris subsp. vulgaris var. conditiva (L.)

(Rote Bete) Amaranthaceae

(Fuchsschwanzgewächse) Spinacia oleracea (L.)

(Spinat)

Apiaceae

(Doldenblütler)

Petroselium crispum (Mill.) Nyman & A.W. Hill

(Petersilie, kraus)

Asteraceae

(Korbblütler)

Lactuca sativa (L.)

(Eissalat)

Raphanus sativus subsp. oleiformes (L.)

(Ölrettich)

Raphanus sativus subsp. sativus (L.)

(Radies)

Brassicaceae

(Kreuzblütengewächse)

Raphanus sativus (L.)

(Rettich)

Phaseolus vulgaris (L.)



(Markerbse)

2.14.3 Saatgut

Um zu überprüfen, ob es bei der Saatgutproduktion von mit A. valerianellae-

infiziertem Saatgut der Sorte AV-75 zu einer Übertragung des Bakteriums auf die

Tochtergeneration kommt, wurde je ein Versuch in den Jahren 2007, 2008 und 2009

angelegt. Im Vergleich dazu wurde jedes Mal eine nicht-infizierte Saatgutpartie der

Sorte AV-60 ausgesät und ebenfalls bis zur Saatgutproduktion kultiviert.


41

Die Aussaat des Feldsalates erfolgte sowohl im Jahr 2007 als auch im Jahr 2008 im

Monat Mai in einem Folienhaus mittels Feldsaatmaschine Type Miniair S der Firma

Accord-Landmaschinen H. Weiste & Co. GmbH, Soest, Deutschland. Jede

Saatgutpartie wurde in einem Abstand von 4,2 cm in der Reihe und 12,5 cm

zwischen den Reihen ausgesät (10 Reihen je Saatgutpartie), wobei zuerst die nicht-

infizierte Partie in die Erde abgelegt wurde, um ein Verschleppen bei der Aussaat zu

verhindern. Um eine Übertragung von A. valerianellae mittels Spritzwasser bei der

Beregnung (Gießwagen) zu vermeiden wurden zwischen den infizierten und nicht-

infizierten Saatgutpartien Folienzäune in Höhe von einem Meter aufgebaut

(Abb. 2.7, Abb. 2.9).

Der Versuch zur Saatgutproduktion mit Aussaat im Jahr 2007 wurde zusätzlich in

Frankreich im Freiland durchgeführt. Die Fläche wurde von der Firma Enza Zaden,

Allonnes, Frankreich zur Verfügung gestellt. Die Versuchsdurchführung (Aussaat,

Beregnung, Bonitur, Ernte) wurde freundlicherweise von den dort ansässigen

Mitarbeitern durchgeführt. Die Beregnung erfolgte zusätzlich zu natürlichem Regen

über Kreisregner. Ein Folienzaun wurde nicht aufgebaut (Abb. 2.8).

Die Aussaat für die Saatgutproduktion 2009 erfolgte im November 2009 mittels einer

Handsämaschine HS der Firma Sembdner Maschinenbau GmbH, Germering,

Deutschland in einem Gewächshaus, wobei die Kornablage wie in den Aussaatjahren

zuvor erfolgte (4,2 cm in der Reihe, 12,5 cm zwischen den Reihen). Begonnen wurde

auch hier mit der Aussaat der nicht-infizierten Saatgutpartie. Beide Saatgutpartien

wurden gebeizt verwendet (Beize aus Thiram, Metalaxyl und Iprodion). Die

Wasserversorgung der Pflanzen erfolgte zum einen über Kopf mit Kreisregnern

(das heißt plus Spritzwasser) zum anderen über Tropfbewässerung (das heißt ohne

Spritzwasser). Um eine Übertragung von A. valerianellae mittels Spritzwasser zu

vermeiden, wurde sowohl zwischen der infizierten und nicht-infizierten

Saatgutpartie, die über Kopf beregnet wurde, ein ein Meter hoher Folienzaun

aufgebaut als auch zwischen den Varianten Kopfberegnung und

Tropfschlauchbewässerung (die Zaunhöhe entsprach hier der Gewächshaushöhe,

Abb. 2.10).


42

Die Feldsalatpflanzen wurden für die Dauer der Saatgutproduktion auf einen

A. valerianellae-Befall hin visuell überprüft und die Befallshäufigkeit (%) gezählt

(Aussaat im Jahr 2007, Deutschland und Frankreich) beziehungsweise geschätzt

(Aussaat in den Jahren 2008 und 2009, Deutschland).

Die Ernte der Samen fand in den Jahren nach der Aussaat im Mai beziehungsweise

Juni statt. Das Saatgut wurde nach der Trocknung zunächst für vier bis acht Wochen

bei 4 °C gelagert, anschließend gereinigt und bis zur weiteren Verwendung bei

Raumtemperatur aufbewahrt. Die Saatgutpartien (Abb. 2.11) wurden mit

verschiedenen Verfahren (siehe 2.15.1) auf Kontamination beziehungsweise

Befallsfreiheit geprüft. Parallel wurden bei den Firmen Enza Zaden und Rijk Zwaan

die dort etablierten Routineprüfungen (Sweatbox-Test, anschließend Nachweis mit

PCR) auf A. valerianellae-Befall durchgeführt (siehe 2.15.1.4).

Die Bodenart in den Häusern war ein sandiger Lehm.


43

Abbildung 2.7: Versuchsanordnung der Saatgutproduktion aus

gesundem (rechts) und mit A. valerianellae-infiziertem Saatgut

(links) mit Aussaat im Jahr 2007 im Folienhaus in Deutschland.

Abgrenzung durch einen Folienzaun. Beregnung über Kopf.


44

Abbildung 2.8: Versuchsanordnung der Saatgutproduktion aus gesundem

(links) und mit A. valerianellae-infiziertem Saatgut (rechts) mit Aussaat im Jahr

2007 im Freiland in Frankreich. (Foto: A. Schieder, Enza Zaden)


(links) und mit A. valerianellae-infiziertem Saatgut (rechts) mit Aussaat im

Jahr 2008 im Folienhaus in Deutschland. Abgrenzung durch einen

Folienzaun. Beregnung über Kopf.


45


und mit A. valerianellae-infiziertem Saatgut mit Aussaat im Jahr 2009 im

gleichen Schiff eines Gewächshauses, Abgrenzung durch Folienzäune. (A):

Wasserversorgung mittels Kreisregner, gesundes Saatgut rechts,

kontaminiertes Saatgut links. (B): Wasserversorgung mittels

Tropfbewässerung, gesundes Saatgut links, kontaminiertes Saatgut rechts.

A

B


46

Ausgangssaatgut AV-60 (gesund)

Ausgangssaatgut

AV-75 (kontaminiert)

Aussaatjahr 2007

AV-61 (Deutschland)

aus AV-60

AV-63 (Frankreich)

aus AV-60

AV-76 (Deutschland)

aus AV-75

AV-78 (Frankreich)

aus AV-75

Aussaatjahr 2008

AV-62

aus AV-60

AV-77

aus AV-75

Aussaatjahr 2009

(Verwendung von gebeiztem

Saatgut)

AV-64 (Tröpfchen)

aus AV-60 (gebeizt)

AV-65 (Regner)

aus AV-60 (gebeizt)

AV-79 (Tröpfchen)

aus AV-75 (gebeizt)

AV-80 (Regner)

aus AV-75 (gebeizt)

Abbildung 2.11: Benennung der gewonnenen Saatgutpartien aus der gesunden Feldsalat-

Saatgutpartie (AV-60, Ausgangssaatgut) und einer kontaminierten Feldsalat-Saatgutpartie

(AV-75, Ausgangssaatgut) mit Aussaaten in verschiedenen Jahren (2007 bis 2009). Die

Vermehrung des Ausgangssaatguts fand mit Aussaat im Jahr 2007 in Deutschland und

Frankreich statt, mit Aussaat im Jahr 2008 in Deutschland. Mit der Aussaat im Jahr 2009

wurde das Ausgangssaatgut gebeizt verwendet, die Bewässerung erfolgte über das

Tröpfchenverfahren und über Kopf mit Kreisregnern.


47

2.15 Saatgutuntersuchungen

2.15.1 Nachweismethoden von Acidovorax valerianellae am Saatgut

Alle verwendeten Saatgutpartien sowie die neu gewonnenen Partien aus der

Saatgutproduktion (siehe 2.14.3) wurden mittels verschiedener Methoden auf eine

A. valerianellae-Kontamination hin untersucht.

2.15.1.1 Sweatbox-Test in der Klimakammer

Für den Sweatbox-Test wurden in geschlossenen Kunststoff-Schalen zwei Liter

Vermiculit ausgebracht und mit 1000 ml Wasser befeuchtet (Abb. 2.12). 5000 Samen

je Saatgutpartie und Schale wurden großflächig ausgebreitet und abschließend mit

einer Vermiculit-Schicht von einem Liter bedeckt. Die Schalen wurden bei nahezu

100 % rel. Luftfeuchte bei 18 °C Nacht- (12 Stunden) und 25 °C Tagtemperaturen

(12 Stunden, mit Licht) für bis zu 28 Tage aufgestellt. Nach dem Auflaufen wurde

eine erste Befallshäufigkeit je Schale geschätzt. Bis Versuchende (28 Tage) nach

Aussaat erfolgten weitere Bonituren der Befallshäufigkeit. Pflanzen mit verdächtigen

Symptomen wurden im indirekten TAS-ELISA geprüft.


48

Abbildung 2.12: Sweatbox zum Nachweis von A. valerianellae am Saatgut.

(Foto: P. Krämer)

2.15.1.2 Aufwuchstest im Gewächshaus

Das auf einen A. valerianellae Befall zu überprüfende Saatgut wurde in

Erdpresstöpfe ausgesät. Mit Beginn des sich entwickelnden Laubblatts (ca. drei bis

vier Wochen nach der Aussaat) wurden die Pflanzen für bis zu 55 Tage bei

gesättigter Luftfeuchte im Gewächshaus kultiviert. Die Pflanzen wurden visuell auf

einen Befall mit A. valerianellae-Symptomen hin begutachtet (Abb. 2.13). Die

Beobachtung der Befallshäufigkeit wurde bis zum Versuchende fortgeführt.

Auffällige Pflanzen wurden mittels indirekten TAS-ELISA untersucht.


49

Abbildung 2.13: Aufwuchstest im Gewächshaus zum Nachweis von

A. valerianellae am Saatgut.

2.15.1.3 Ankeimmethode auf Papier

0,2 g der auf A. valerianellae-Befall zu untersuchenden Saatgutpartien wurden mit

0,3 ml Probenpuffer homogenisiert (Tag null) und eingefroren. Am gleichen Tag

wurden die Samen (zu je 0,2 g) in jeweils drei Petrischalen, die zuvor mit

Leitungswasser angefeuchtetem Filterpapier auslegt worden waren, ausgesät und bei

Raumtemperatur (zwischen 20 °C und 22 °C) inkubiert. Nach vier, neun und

14 Tagen nach der Aussaat wurden diese Samen beziehungsweise Keimlinge mit

jeweils 0,3 ml Probenpuffer homogenisiert und ebenfalls eingefroren. Eine

Untersuchung der gewonnenen Proben wurde zum gleichen Zeitpunkt mittels

indirektem TAS-ELISA durchgeführt, indem Proben als Zweifachbestimmung

aufgetragen, gemessen und gemittelt wurden (siehe Kapitel 2.3.5).

2.15.1.4 Bestimmungen durch Fremdfirmen

Die Firmen Enza Zaden und Rijk Zwaan untersuchten dankenswerterweise das

Saatgut aus der Saatgutproduktion mittels dort etablierter Routineprüfungen auf

einen A. valerianellae-Befall (Sweatbox-Test mit anschließender PCR verdächtiger


50

Pflanzen mit A. valerianellae-Symptomen). Über genauere Informationen zur

Methode geben die Firmen Auskunft.

2.15.2 Dekontaminationsmaßnahmen (Warmwasserbehandlung

und Dampfdesinfektion)

Zur Prüfung von Dekontaminationsmaßnahmen am Saatgut wurden die Samen der

Sorten AV-220 (gesund), AV-17 (kontaminiert) und AV-219 (kontaminiert) bei einer

Warmwasserbehandlung in einen Teebeutel verpackt und in einem Wasserbad für

eine bestimmte Zeit mit einer definierten Temperatur eingetaucht (Tab. 2.5). Nach

dem Tauchen wurden die Samen zunächst zwischen eine Lage Handtücher gelegt,

um überschüssiges Wasser zu entfernen. Anschließend wurden die Samen bei 27 °C

und ca. 30 % rel. Luftfeuchte für 24 bis 48 Stunden zurückgetrocknet.

Alle Samen wurden nach erfolgter Behandlung auf ihre Keimfähigkeit hin überprüft

sowie mit der Ankeimmethode auf Papier und anschließendem TAS-ELISA auf eine

Reduktion beziehungsweise Eliminierung der A. valerianellae-Kontamination

untersucht (siehe Kapitel 2.15.1.3).

Die Interpretation der OD-ELISA-Werte wurde wie folgt durchgeführt: die

Mittelwerte der Tage null der jeweiligen Behandlung wurden als Schwellenwerte für

die nachfolgenden Mittelwerte der Tage vier, neun und vierzehn jeder Behandlung

herangezogen. Einzelne Probenwerte (unabhängig vom Aussaattermins), die deutlich

über diesem Schwellenwert lagen, galten als weiterhin A. valerianellae-positive

Werte und die Probe war noch immer mit A. valerianellae belastet und nicht

dekontaminiert.

Des Weiteren konnte dankenswerterweise auf zwei andere Arbeitsweisen

zurückgegriffen werden. Bei der ersten Methode handelte es sich um eine

Dampfdesinfektionsmaßnahme des Eidgenössischen Volkswirtschaftsdepartement

EVD, Forschungsanstalt Agroscope Changins-Wädenswil ACW, bei der die Samen

der Sorten AV-220, AV-17 und AV-219 einer Applikationstemperatur von 66 °C für

90 beziehungsweise 105 Sekunden oder bei 64 °C für 120 beziehungsweise

150 Sekunden ausgesetzt waren. Anschließend wurden die Samen bei 25 - 28 °C für

36 Stunden rückgetrocknet.


51

Die zweite Methode wurde von einer für Saatgut spezialisierten Firma durchgeführt.

Zu der Methode können allerdings keine weiteren Angaben gemacht werden, da sie

ein Betriebsgeheimnis der Firma ist.

Abschließend fanden auch hier eine Überprüfung der Keimfähigkeit sowie die

dekontaminierende Wirkung der Methode mittels Ankeimmethode auf Papier und

TAS-ELISA statt.

Tabelle 2.5: Verwendete Temperaturen (°C) und Inkubationszeiten (Minuten) bei einer

Warmwasserbehandlung von Feldsalatsaatgut.

Warmwasserbehandlung

Temperatur (°C) Zeit (Minuten)

43 20

47 45

50 10

50 20

55 10

55 20

60 5

ERGEBNISSE

52

3 ERGEBNISSE

3.1 Untersuchungen zu Infektionsbedingungen

3.1.1 Einfluss der Temperatur auf die Infektion (in vivo)

Bei den Untersuchungen wurden Feldsalatpflanzen am vierten, sechsten, zehnten und

zwölften Tag nach Inokulation (dpi) bonitiert, um den Einfluss der Temperatur auf

die Infektion zu erfassen (Kapitel 2.12.1). Sowohl Befallsstärke als auch

Befallshäufigkeit stiegen im zeitlichen Verlauf in allen drei Temperaturvarianten an.

Dabei stiegen die Befallsstärke sowie Befallshäufigkeit mit der

Inkubationstemperatur an. Pflanzen, die bei 10 °C kultiviert wurden, erreichten zwölf

Tage nach der Inokulation eine maximale Befallstärke von 3,3 % und eine

Befallshäufigkeit von 60 %, während Pflanzen, die bei 20 °C kultiviert wurden, eine

Befallstärke von 13,8 % und eine Befallshäufigkeit von 98,3 % erreichten. Zwölf

Tage nach der Inokulation konnten Pflanzen, die bei 30 °C wuchsen, nicht mehr

ausgewertet werden, da diese den hohen Temperaturen bei gesättigter Luftfeuchte

nicht standhielten. Zehn Tage nach der Inokulation fand bei der 30 °C-Variante die

letzte Bonitur statt, bei der die Pflanzen eine maximale Befallsstärke von 18,2 % und

Befallshäufigkeit von 96,7 % erreichten (Abb. 3.1).

In einer zweiten Wiederholung wurden lediglich die Pflanzen, die bei Temperaturen

von 10 °C und 20 °C wuchsen, bonitiert. Die Pflanzen, die bei 30 °C kultiviert

wurden, brachen bereits vor der ersten Bonitur zusammen und konnten somit nicht

zur Auswertung herangezogen werden. Die Bonituren fanden nach zehn, 14, 19 und

25 Tagen statt. 25 dpi war bei Pflanzen, die bei 20 °C kultiviert wurden, eine

Schätzung der Befallsstärke nicht mehr möglich, da sie stark mit Echtem Mehltau

befallen waren. Die Befallsstärke stieg bei Pflanzen, die bei 10 °C inkubiert wurden,

von 0,3 % am zehnten Tag nach der Inokulation auf 5,5 % am 25. Tag nach der

Inokulation konstant an. Ebenso stieg der Wert der Symptom tragenden Blattfläche

bei Pflanzen, die bei 20 °C inkubiert wurden, an. Der Anteil an Symptom tragenden

Pflanzen betrug am zehnten Tag nach der Inokulation 18,3 % und stieg über die

Dauer des Versuches an, wobei die Pflanzen aus dieser Gruppe an einzelnen

Boniturtagen eine etwas höhere Anzahl an infizierten Pflanzen aufwiesen als die

ERGEBNISSE

53

Pflanzen aus der Gruppe, die bei 10 °C inkubiert wurden (Abb. 3.2). Tendenziell

verhielten sich die Ergebnisse aus der ersten und der zweiten Wiederholung gleich:

Bei höheren Temperaturen waren sowohl Befallsstärken als auch Befallshäufigkeiten

höher, allerdings war der Befall in der zweiten Wiederholung zeitlich deutlich

verzögert gegenüber der ersten Wiederholung. Erste Symptome waren hier nicht wie

bei der ersten Wiederholung bereits nach vier Tagen nach der Inokulation sichtbar,

sondern erst 10 dpi. Des Weiteren war der Befall in der zweiten Wiederholung

deutlich vermindert.

Um zu überprüfen, wie der Einfluss von Temperaturen von 15 °C und 25 °C

hinsichtlich Befallsstärke und Befallshäufigkeit auf die Infektion war, wurden

Feldsalatpflanzen mit einem Isolategemisch (Konzentration 109 cfu/ml) inokuliert

und bei den genannten Temperaturen unter gesättigter Luftfeuchte kultiviert. In der

ersten Wiederholung wurden die Pflanzen zwischen Tag vier und Tag 14 nach der

Inokulation bonitiert. Die Befallsstärke und die Befallshäufigkeit stiegen bei beiden

Inkubationstemperaturen mit zunehmender Dauer unter gesättigter Luftfeuchte an,

wobei erste Symptome bei Pflanzen, die bei 25 °C kultiviert wurden, vier Tage

früher sichtbar waren als bei Pflanzen, die bei 15 °C kultiviert wurden. Zudem

erreichten sowohl Befallsstärke als auch Befallshäufigkeit von inokulierten Pflanzen,

die bei höheren Temperaturen kultiviert wurden, höhere Werte. So wurden bereits

10 dpi eine Befallsstärke von 19,7 % und eine Befallshäufigkeit von 96,7 % erreicht,

im Vergleich zu 5,6 % beziehungsweise 70 % bei der niedrigeren

Inkubationstemperatur von 15 °C. 14 Tage nach der Inokulation wurden lediglich die

Pflanzen, die bei einer niedrigeren Temperatur kultiviert wurden, zur Auswertung

herangezogen. Pflanzen, die bei 25 °C kultiviert wurden, waren 14 dpi zu stark mit

Echtem Mehltau befallen und konnten nicht bonitiert werden (Abb. 3.3).

In der zweiten Wiederholung wurden diese Ergebnisse weitestgehend bestätigt:

Pflanzen, die bei höheren Inkubationstemperaturen kultiviert wurden, zeigten höhere

Befallsstärken und Befallshäufigkeiten als Pflanzen, die bei 15 °C inkubiert wurden.

Zudem lagen die Werte in dieser zweiten Wiederholung insgesamt über denen, die

bei der ersten Wiederholung erreicht wurden.

ERGEBNISSE

54

Vier Tage nach der Inokulation waren bei 25 °C Inkubationstemperatur auch hier die

ersten Symptome sichtbar und somit zwei Tage früher als bei Pflanzen, die einer

Temperatur von 15 °C ausgesetzt waren. 17 Tage nach der Inokulation waren alle

Pflanzen bei einer Inkubationstemperatur von 25 °C infiziert und zeigten knapp 30 %

Symptome auf der Blattfläche, während Pflanzen, die bei 15 °C kultiviert wurden,

lediglich eine Befallsstärke von 15 % und eine Befallshäufigkeit von 95 % zeigten

(Abb. 3.4).

Die Temperatur besaß einen Einfluss auf die Infektion. Je höher die Temperatur war,

bei der inokulierte Pflanzen kultiviert wurden, desto höher waren auch Befallsstärken

und Befallshäufigkeiten. Beide Parameter nahmen innerhalb jeder gewählten

Temperaturstufe, mit fortschreitender Dauer nach der Inokulation, zu.

Es waren bei allen Temperaturstufen zwischen 10 °C und 30 °C nach der Inokulation

Symptome an Feldsalatpflanzen sichtbar, eine Infektion demnach möglich.

ERGEBNISSE

55

a a aab

ab abab

b

b

b

b

02468

1012141618202224

10 °C 20 °C 30 °C

Inkubationstemperatur

Bef

alls

stär

ke in

%

4 dpi 6 dpi 10 dpi 12 dpi

a

aa

abab

ab

bb

ab

b

b

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

10 °C 20 °C 30 °C


Bef

alls

häuf

igke

it in

%


Abbildung 3.1: Einfluss der Inkubationstemperatur auf die Symptombildung von

A. valerianellae (A: Befallstärke in %, B: Befallshäufigkeit in %) an Feldsalatpflanzen 4, 6, 10

und 12 Tage nach Inokulation (dpi) mit A. valerianellae (Isolatemix, Konzentration 109 cfu/ml).

Bei 30 °C konnte keine Bonitur nach zwölf Tagen vorgenommen werden, da die Pflanzen

abgestorben waren. Behandlungen mit gleichen Buchstaben (Boniturtage) sind nicht

signifikant voneinander verschieden. Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns

Prozedur) verrechnet (p < 0,05).

A

B

ERGEBNISSE

56

aa

abab

bbc c

02468

1012141618202224

10 °C 20 °C


Bef

alls

stär

ke in

%


aa

a

a

a

b

c

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

10 °C 20 °C


Bef

alls

häuf

igke

it in

%



A. valerianellae (A: Befallstärke in %, B: Befallshäufigkeit in %) an Feldsalatpflanzen 10,

14, 19 und 25 Tage nach Inokulation (dpi) mit A. valerianellae (Isolatemix, Konzentration

109 cfu/ml).

Bei 20 °C konnte keine Bonitur nach 25 Tagen vorgenommen werden, da die Pflanzen

abgestorben waren. Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant

voneinander verschieden. Die Daten der Inkubationstemperatur von 20 °C wurden mit dem

Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verrechnet (p < 0,05). Die Daten der

Inkubationstemperatur von 10 °C wurden mit dem Tukey`s HSD-Test verrechnet (p < 0,05).

B

A

ERGEBNISSE

57

a

a

ab

ab

b

b

b

0

5

10

15

20

25

30

35

15 °C 25 °C


Bef

alls

stär

ke in

%


a

a

ab

ab

b

b

b

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

15 °C 25 °C


Bef

alls

häuf

igke

it in

%



A. valerianellae (A: Befallstärke in %, B: Befallshäufigkeit in %) an Feldsalatpflanzen 4,


109 cfu/ml).

Bei 25 °C konnte keine Bonitur nach 14 Tagen vorgenommen werden, da die Pflanzen

abgestorben waren. Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant

voneinander verschieden. Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns

Prozedur) verrechnet (p < 0,05).

B

A

ERGEBNISSE

58

a

a

ab

ab

ab

abc

ab

bc

b

c

0

5

10

15

20

25

30

35

15 °C 25 °C


Bef

alls

stär

ke in

%

4 dpi 6 dpi 10 dpi 12 dpi 17 dpi

a

a a

ab

ab ab ab

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

15 °C 25 °C


Bef

alls

häuf

igke

it in

%

4 dpi 6 dpi 10 dpi 12 dpi 17 dpi


A. valerianellae (A: Befallstärke in %, B: Befallshäufigkeit in %) an Feldsalatpflanzen 4, 6,


109 cfu/ml).

Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander verschieden. Die

Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verrechnet (p < 0,05).

B

A

ERGEBNISSE

59

3.1.2 Einfluss des Blattalters und der Blattnässedauer auf die

Infektion

Der Einfluss des Balttalters sowie der Blattnässedauer auf die Ausprägung von

Symptomen nach Inokulation von Feldsalatpflanzen mit A. valerianellae wurde in

den hier vorgestellten Untersuchungen geprüft (Kapitel 2.12.2).

Bei der einmaligen Kultur für 48 Stunden nach Inokulation unter gesättigter

Luftfeuchte waren weder an den Keimblättern noch an den Laubblättern

A. valerianellae typische Symptome erkennbar (Abb. 3.5).

Bei einer wöchentlich wiederkehrenden Kultur unter gesättigter Luftfeuchte von

48 Stunden zeigten viele der inokulierten Pflanzen im Laubblattstadium Symptome.

Bereits neun Tage nach der Inokulation waren 16 Pflanzen befallen und zeigten

Symptome (Abb. 3.5 B). Bei Pflanzen, die im Keimblattstadium inokuliert wurden,

zeigten sich 16 Tage nach der Inokulation die ersten Symptome (an zwei Pflanzen).

Ein Wert von maximal vier Symptom tragenden Pflanzen wurde aber über die Dauer

von 35 Tagen nicht überschritten (Abb. 3.5 A). Die Befallshäufigkeit nahm sowohl

bei Pflanzen im Keimblattstadium als auch bei Pflanzen im Laubblattstadium nach

21 dpi ab und stieg bei Pflanzen im Laubblattstadium bis zu Versuchende leicht

wieder an.

Eine dauerhafte Abdeckung unter gesättigter Luftfeuchte hatte den größten Einfluss

auf die Symptomausprägung. Pflanzen, die im Keimblattstadium inokuliert wurden,

zeigten bereits nach fünf Tagen erste Symptome, wobei der Anteil an Symptom

tragenden Pflanzen 12 dpi stark anstieg, 23 dpi waren alle Pflanzen befallen und

zeigten Symptome (Abb. 3.5 A). Bei Pflanzen, die im Laubblattstadium inokuliert

wurden, zeigten sich erste Symptome bereits nach vier Tagen und alle Pflanzen

wiesen 11 dpi typische Krankheitssymptome auf (Abb. 3.5 B).

ERGEBNISSE

60

aaaaaaaaaaaaa

bb

bb b b b b b

bbbb

bbbbbbbbbb

b

bb

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

5 8 12 14 16 19 21 23 26 28 30 33 35

Tage nach Inokulation

Bef

alls

häuf

igke

it in

%

einmalig wöchentlich dauerhaft

aaaaaaaaaaaa

bbb

bbbbb

bb

bbb

b

bb b b b b b bbb

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

4 6 9 11 14 16 18 21 23 25 28 32


Bef

alls

häuf

igke

it in

%

einmalig wöchentlich dauerhaft

Abbildung 3.5: Anteil an befallenen Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) zwischen 5 und

35 dpi (A) beziehungsweise zwischen 4 und 32 dpi (B) mit A. valerianellae (Isolat

709/2, 106cfu/ml) im Keimblattstadium (A) beziehungsweise Laubblattstadium (B) in

Abhängigkeit der Blattnässedauer (einmalig, wöchentlich, dauerhaft).

Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander

verschieden. Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur)

verrechnet (p < 0,05).

A

B

ERGEBNISSE

61

Auch das Ergebnis aus der Versuchswiederholung zeigte bei dauerhafter Inkubation

unter gesättigter Luftfeuchte einen charakteristischen Verlauf von Befallsstärke und

Befallshäufigkeit. So waren nach zehn Tagen bereits 70 % der Pflanzen befallen und

zeigten Symptome, 2,7 % der Blattfläche einzelner Pflanzen waren dabei mit

Symptomen bedeckt. Nach 19 Tagen unter dauerhaft feuchter Kultivierung waren

bereits 95 % der Pflanzen Symptom tragend, während sich die Befallsstärke

vervierfacht (10,6 %) hatte. Zu Versuchende (34 dpi) waren 100 % der Pflanzen

infiziert und zeigte auf 1/5 der Blattfläche (20,4 %) Symptome (Abb. 3.6).

Pflanzen, die nach der Inokulation im wöchentlichen Abstand unter gesättigter

Luftfeuchte kultiviert wurden, zeigten über die Dauer des Versuches (bis Tag 34

nach Inokulation) keine Symptome (Daten nicht gezeigt).

Die Versuche zeigten, dass sowohl das Blattalter als auch die Dauer der Blattnässe

einen Einfluss auf die Infektion haben. Pflanzen im Keim- und im Laubblattstadium

wiesen nach erfolgter Inokulation keine Symptome auf, wenn die Blätter lediglich

einmalig 48 Stunden nass waren. Waren die Blätter hingegen in wöchentlichem

Abstand für 48 Stunden nass, so waren Symptome an Pflanzen sichtbar. Bei im

Keimblattstadium inokulierten Pflanzen war dies zu einem späteren Zeitpunkt nach

der Inokulation der Fall als bei Pflanzen, die im Laubblattstadium inokuliert worden

waren. Die Befallshäufigkeit lag bei im Keimblattstadium inokulierten Pflanzen über

die Dauer des Versuches auf einem niedrigeren Niveau als bei Pflanzen, die im

Laubblattstadium inokuliert worden waren. Eine dauerhafte Kultivierung bei

gesättigten Luftfeuchten führte bei allen inokulierten Pflanzen, unabhängig vom

Blattalter, zu Symptomen. Der Zeitpunkt, zu dem alle Pflanzen Symptome zeigten,

war jedoch bei Pflanzen im Laubblattstadium früher erreicht.

ERGEBNISSE

62

bababab

abab

a

AB

B

AB

AB

AB

ABA0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

7 10 13 19 21 26 34


Bef

alls

häuf

igke

it in

%

0

5

10

15

20

25

30

Bef

alls

stär

ke in

%

Befallshäufigkeit in % Befallsstärke in %

Abbildung 3.6: Anteil Symptom tragender Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) sowie der

Anteil befallener Blattfläche je Pflanze (Befallsstärke in %) zwischen 7 und 34 dpi mit

einem A. valerianellae-Gemisch (105 cfu/ml) von Pflanzen im Laubblattstadium bei

dauerhafter Kultivierung unter gesättigter Luftfeuc hte.

Behandlungen mit gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander verschieden.

Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verrechnet (p < 0,05).

ERGEBNISSE

63

3.1.3 Einfluss der Blattnässedauer auf die Infektion

beziehungsweise die Symptomentwicklung

3.1.3.1 Einfluss der Blattnässedauer auf die Symptomentwicklung

Die Prüfung des Einflusses der Blattnässedauer auf die Infektion wurde mit

inokulierten Feldsalatpflanzen durchgeführt (Kapitel 2.12.3.1). Je länger die erste

Phase unter gesättigten Luftfeuchten dauerte, desto höher war die Befallsstärke zu

Beginn der trockenen Phase von sieben Tagen (Abb. 3.7). So lag nach acht Tagen

unter gesättigten Luftfeuchten die Befallsstärke bei 12,4 % (Versuchsglied 08/15;

Abb. 3.7 A), während dieser Wert innerhalb von vier Tagen auf bis zu 25,1 % anstieg

(nach zwölf Tagen, Versuchsglied 12/19; Abb. 3.7 C). Nach weiteren sechs Tagen

(Tag 18, Versuchsglied 18/25, Abb. 3.7 E) fiel die Befallsstärke wieder auf 16,3 %

zurück, war aber immer noch deutlich höher als zu Beginn nach acht Tagen nach der

Inokulation. Die Werte waren zu diesen Zeitpunkten signifikant voneinander

verschieden.

Innerhalb der siebentägigen Phase unter trockenen Luftfeuchten blieb der Wert der

Befallsstärke entweder annähernd konstant (Versuchsglied 08/15; Abb. 3.7 A) oder

fiel immer schneller ab, je länger die erste Phase der Kultivierung unter gesättigter

Luftfeuchte war (Abb. 3.7 B-E). Bei einer anschließenden Kultivierung unter

gesättigten Luftfeuchten stiegen die Werte der Befallsstärke deutlich an, bei

Versuchsglied 08/15 sogar dreimal so hoch wie zum Ende der Trockenphase. Der

Anfangswert der Befallstärke wurde in den drei Versuchsgliedern 12/19, 14/22 und

18/25 trotz erneuter Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte nicht erneut erreicht

(Abb. 3.7).

Auch hier waren die Werte zu diesen Zeitpunkten signifikant voneinander

verschieden, ebenso wie die Werte des Versuchsglieds 10/18 (ohne Tabelle).

ERGEBNISSE

64

Versuchsgl ied 08/15

0

5

10

15

20

25

30

35

40

8 10 12 14 15 18 22 25 28 32


Bef

alls

stä

rke

in %

t rocken feucht

Versuchsgl ied 10/18

0

5

10

15

20

25

30

35

40

10 12 14 18 22 25 28 32


Be

falls

stä

rke

in %

t rocken feucht

Versuchsglied 12/19

0

5

10

15

20

25

30

35

40

12 14 18 19 22 25 28 32


Bef

alls

stä

rke

in %

trocken feucht

Versuchsglied 14/22

0

5

10

15

20

25

30

35

40

14 18 22 25 28 32


Bef

alls

stä

rke

in %

trocken feucht

Versuchsglied 18/25

0

5

10

15

20

25

30

35

40

18 22 25 28 32


Bef

alls

stä

rke

in %

trocken feucht

Abbildung 3.7: Auswirkungen auf die Befallsstärke (in %) unterschiedlicher

Kultivierungsphasen unter trockenen und feuchten Bedingungen nach Inokulation mit

A. valerianellae.

Die Pflanzen wurden bis 8 (A), 10 (B), 12 (C), 14 (D), und 18 (E) dpi feucht kultiviert, ab

15 (A), 18 (B), 19 (C), 22 (D), und 25 (E) dpi wurde die Hälfte der Pflanzen trocken, die

andere Hälfte feucht weiterkultiviert.

A B

C D

E

ERGEBNISSE

65

In dem zweiten Versuchsansatz waren 9 dpi an allen Pflanzen Symptome sichtbar.

Die Anfangsbefallstärke lag dabei bei 1,6 %. Über die Dauer von 37 Tagen nach der

Inokulation (davon neun Tage unter gesättigter Luftfeuchte) nahm die Befallsstärke

lediglich um 1 % auf 2,6 % zu (Tab. 3.1). Wurde eine Hälfte der Pflanzen erneut bei

gesättigter Luftfeuchte kultiviert, so stieg die Befallsstärke wieder an. Der Anstieg

war umso höher, je länger die zweite Phase der Kultur bei gesättigter Luftfeuchte

dauerte, mit Ausnahme der Pflanzen, bei denen eine kurze trockene Phase von sieben

Tagen Dauer, dazwischen geschalten wurde. Auffallend war, dass selbst nach einer

28-tägigen Kultivierung unter trockenen Bedingungen die Befallsstärke anstieg. So

wurde am 38. Tag nach der Inokulation eine Befallsstärke von 3,5 % beobachtet, die

innerhalb von 13 Tagen (51 dpi) auf einen Wert von 4,7 % zunahm (Tab. 3.2).

Eine, nach erfolgter Inokulation von Feldsalatpflanzen, erste Kultivierungsphase

unter gesättigten Luftfeuchten führte mit zunehmender Dauer zu höheren

Befallsstärken und bestätigte vorangegangene Ergebnisse. In einer sich daran

anschließenden Phase, bei der die Pflanzen bei normal vorherrschender Luftfeuchte

kultiviert wurden, blieb der Wert der Befallsstärke entweder auf dem Niveau

bestehen oder fiel ab, das heißt die Schwere der Symptome war rückläufig. Bei einer

sich an diese Trockenperiode anschließenden erneuten Kultivierung unter gesättigten

Luftfeuchten stiegen die Werte der Befallsstärke erneut an.

Deutlich sichtbare und typische A. valerianellae-Symptome an Feldsalatpflanzen

wurden durch für Bakterien ungünstige, kurzfristige Bedingungen (normal

vorherrschende Luftfeuchte) nicht vollständig eliminiert. Traten anschließend erneut

günstige Bedingungen (gesättigte Luftfeuchte) für A. valerianellae auf, so führte dies

zu einem sich fortsetzenden Krankheitsverlauf und die Befallsstärke nahm zu.

Trockenperioden von bis zu 28 Tagen überlebte das Bakterium somit in

Feldsalatpflanzen.

ERGEBNISSE

66

Tabelle 3.1: Befallsstärke (% nekrotische Blattfläche) 9, 16, 23, 30 und 37 Tage nach

Inokulation (dpi) mit einem A. valerianellae-Gemisch (Konzentration 108 cfu/ml). Bis 9 dpi

erfolgte die Kultur bei gesättigter Luftfeuchte, anschließend ohne erhöhte Luftfeuchtigkeit.




(dpi) Befallsstärke in % Signifikanz (p < 0,05)

9 1,6 a

16 2,1 a

23 1,9 a

30 2,5 a

37 2,6 a

ERGEBNISSE

67

Tabelle 3.2: Befallsstärke (% nekrotische Blattfläche) 38, 43 und 51 Tage nach Inokulation (dpi)

mit einem A. valerianellae-Gemisch (Konzentration 108 cfu/ml). Einer zu Beginn neuntägigen

Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte folgten Phasen unterschiedlicher Dauer unter

normal vorherrschenden Luftfeuchten (zwischen 7 und 28 Tagen), bevor sich eine erneute

Kultur unter gesättigter Luftfeuchte anschloss.


Daten wurden mit dem Tukey`s HSD-Test verrechnet (p < 0,05).

Tage nach

Inokulation

(dpi), davon 9

Tage unter

gesättigter

Luftfeuchte

Davon Tage

unter

normaler

Luftfeuchte

Davon Tage

unter

erneuter

gesättigter

Luftfeuchte

Befallsstärke

in %

Signifikanz

(p < 0,05)

7 22 9,2 ab

14 15 10,8 b

21 8 4,1 a 38

28 1 3,5 a

7 27 8,3 ab

14 20 11,3 b

21 13 5,9 a 43

28 6 4,5 a

7 35 9,2 ab

14 28 12,1 b

21 21 8,6 ab 51

28 14 4,7 a

3.1.3.2 Einfluss der Blattnässedauer unmittelbar nach der Inokulation

Inokulierte Feldsalatpflanzen wurden mit einer Blattnässedauer von bis zu 72

Stunden kultiviert (Kapitel 2.12.3.2).

Die Antrocknungsdauer des Bakteriensprühnebels nach der Inokulation betrug in

etwa fünf Stunden.

ERGEBNISSE

68

Bei Pflanzen, die nach der Inokulation dauerhaft unter gesättigter Luftfeuchte

kultiviert wurden, zeigte sich eine kontinuierlich ansteigende Befallsstärke zwischen

dem neunten und 27. Tag nach der Inokulation (Abb. 3.8). So stieg diese von einem

Anfangsbefall von 0,4 % (konstante Temperaturen für die ersten 96 Stunden)

beziehungsweise 1,4 % (Wechseltemperaturen) auf 21 % beziehungsweise 29,9 %

an. Pflanzen, die sofort nach der Inokulation unter gesättigter Luftfeuchte bei

Wechseltemperaturen kultiviert wurden, zeigten eine höhere Befallsstärke, wobei der

Wert sogar drei bis vier Tage früher erreicht wurde als bei Pflanzen, die zunächst bei

einer konstanten Temperatur von 20 °C kultiviert wurden. So wurde beispielsweise

eine Befallsstärke von 5,3 % (unter Wechseltemperaturen) am 13. Tag nach der

Inokulation erreicht, während sie bei zunächst unter konstanten Temperaturen

kultivierten Pflanzen erst nach 16 Tagen (5,2 %) erreicht wurde.

Bei Pflanzen, die nach der Inokulation für bis zu 72 Stunden bei gesättigter

Luftfeuchte kultiviert wurden und anschließend unter trockenen Bedingungen

wuchsen, zeigten sich in keinem Fall Symptome (Abb. 3.9 und 3.10). Pflanzen, die

nach einer jeweils wöchentlichen Trockenperiode erneut dauerhaft bei gesättigter

Luftfeuchte kultiviert wurden, zeigten, unabhängig von der ersten

Temperaturführung während der ersten 96 Stunden, ein einheitliches Bild: alle

Pflanzen zeigten zwischen dem 20. und 27. Tag nach der Inokulation Symptome.

Die Ergebnisse zeigten, dass die Temperaturführung einen gewissen Einfluss auf den

zeitlichen Krankheitsverlauf inokulierter Pflanzen besaß. So wurde eine

Befallshäufigkeit von 100 % unter Wechseltemperaturen schneller erreicht als bei

Pflanzen, die erst nach 96 Stunden bei konstanten Temperaturen den

Wechseltemperaturen ausgesetzt waren. Dies deckt sich mit den Ergebnissen von

Pflanzen, die dauerhaft bei gesättigter Luftfeuchte kultiviert wurden. Die Variante

ohne zusätzliche feuchte Abdeckung bei konstant 20 °C bildete hier allerdings eine

Ausnahme, hier waren am Tag 20 nach der Inokulation lediglich knapp 85 % der

Pflanzen Symptom tragend. Dieser Wert ging innerhalb von weiteren sieben Tagen

unter gesättigter Luftfeuchte sogar auf 82 % zurück (Abb. 3.10).

Aus den Ergebnissen wurde deutlich, dass eine Blattnässedauer unter gesättigter

Luftfeuchte einen großen Einfluss auf inokulierte Pflanzen und deren

Befallsausprägung besitzt, wobei bereits eine Dauer von ca. 5 Stunden für das

ERGEBNISSE

69

Antrocknen des Sprühfilms nach Inokulation für eine Infektion ausreichend war und

die Infektion nicht durch eine siebentägige Trockenperiode gestoppt wurde.

a

ab

abc

abc

bc

c

a

ab

abc

abc

bc

c

0 10 20 30 40

9 dpi

13 dpi

16 dpi

20 dpi

23 dpi

27 dpi

Tag

e na

ch In

okul

atio

n

Befallsstärke in %

Wechseltemperaturen konstante Temperaturen für die ersten 96 Stunden

Abbildung 3.8: Befallsstärke (%) zwischen Tag 9 und Tag 27 nach der Inokulation (dpi)

mit einem A. valerianellae-Gemisch (Konzentration 108 cfu/ml) unter dauerhafter

Kultivierung bei gesättigten Luftfeuchten. Die Pflanzen wurden entweder sofort

Wechseltemperaturen (15 °C Nacht, 20 °C Tag) ausgesetzt beziehungsweise für die

ersten 96 Stunden nach der Inokulation bei konstant 20 °C kultiviert.


Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verrechnet

(p < 0,05).

ERGEBNISSE

70

ohne zusätzliche feuchte Inkubation nach Inokulationaa

a

a

a a

0102030405060708090

100

9 13 16 20 23 27


Bef

alls

häuf

igke

it in

%trocken feucht

6 Stunden feuchte Inkubation nach Inokulationaaaa

a

a

0102030405060708090

100

9 13 16 20 23 27


Bef

alls

häuf

igke

it in

%

trocken feucht

9 Stunden feuchte Inkubation nach Inokulationaaaaa

a

0102030405060708090

100

9 13 16 20 23 27


Bef

alls

häuf

igke

it in

%trocken feucht


a

0102030405060708090

100

9 13 16 20 23 27


Bef

alls

häuf

igke

it in

%

trocken feucht

24 Stunden feuchte Inkubation nach Inokulationaaa

a

a

a

0102030405060708090

100

9 13 16 20 23 27


Bef

alls

häuf

igke

it in

%

trocken feucht 48 Stunden feuchte Inkubation nach Inokulation

a

a

aa

a a

0102030405060708090

100

9 13 16 20 23 27


Bef

alls

häuf

igke

it in

%

trocken feucht


a

a

0102030405060708090

100

9 13 16 20 23 27


Bef

alls

häuf

igke

it in

%

trocken feucht

Abbildung 3.9: Auswirkungen unterschiedlich langer Kultivierungsphasen bei gesättigter

Luftfeuchte nach Sprühinokulation mit A. valerianellae (zwischen null und 72 Stunden plus 5

Stunden Antrocknungsdauer) auf die Befallsentwicklung bei Feldsalat. Versuch A.

Nach einer sich an die Inokulation jeweils anschließenden Trockenphase von 7 Tagen wurde die

Befallshäufigkeit (in %) ab dem neunten Tag bis zum 27. Tag nach der Inokulation unter

gesättigten Luftfeuchte-Bedingungen („feucht“) und normalen Luftfeuchte-Bedingungen

(„trocken“) erhoben. Die Kultivierung der Pflanzen erfolgte in der Klimakammer bei

Wechseltemperaturen (20 °C Tag, 15 °C Nacht) mit 16 Stunden Licht. Behandlungen mit

gleichen Buchstaben sind nicht signifikant voneinander verschieden. Die Daten wurden mit dem

Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verrechnet (p < 0,05).

ERGEBNISSE

71

ohne zusätzliche feuchte Inkubation nach Inokulationa

a

a

a

a

a

0102030405060708090

100

9 13 16 20 23 27


Bef

alls

häu

figke

it in

%

trocken feucht


a

0102030405060708090

100

9 13 16 20 23 27


Bef

alls

häuf

igke

it in

%

trocken feucht

9 Stunden feuchte Inkubation nach Inokulationaaa

a

a

a

0102030405060708090

100

9 13 16 20 23 27


Bef

alls

häuf

igke

it in

%


aaaaa

a

0102030405060708090

100

9 13 16 20 23 27


Bef

alls

häuf

igke

it in

%

trocken feucht


a

a

0102030405060708090

100

9 13 16 20 23 27


Bef

alls

häuf

igke

it in

%


aaaa

a

a

01020

3040506070

8090

100

9 13 16 20 23 27


Bef

alls

häuf

igke

it in

%

trocken feucht


a

a

0102030405060708090

100

9 13 16 20 23 27


Bef

alls

häuf

igke

it in

%

trocken feucht

Abbildung 3.10: Auswirkungen unterschiedlich langer Kultivierungsphasen bei gesättigter

Luftfeuchte nach Sprühinokulation mit A. valerianellae (zwischen null und 72 Stunden plus 5

Stunden Antrocknungsdauer) auf die Befallsentwicklung bei Feldsalat. Versuch B.

Nach einer sich daran jeweils anschließenden Trockenphase von 7 Tagen wurde die

Befallshäufigkeit (in %) ab dem neunten Tag bis zum 27. Tag nach der Inokulation unter

gesättigten Luftfeuchte-Bedingungen („feucht“) und normalen Luftfeuchte-Bedingungen

(„trocken“) erhoben. Die Kultivierung der Pflanzen erfolgte in der Klimakammer bei

Wechseltemperaturen (20 °C Tag, 15 °C Nacht) mit 16 Stunden Licht, wobei die erste

Kultivierungsphase (96 Stunden nach der Inokulation) bei konstant 20 °C erfolgte.


Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verrechnet

(p < 0,05).

ERGEBNISSE

72

3.1.4 Einfluss der Inokulumdichte auf die Infektion

Die Versuche zum Einfluss der Inokulumdichte auf die Infektion sollten zeigen, ob

eine Infektion auch bei schwachen Inokulumkonzentrationen möglich ist und wann

erste Symptome auftreten (Kapitel 2.12.4).

Das Auftreten erster Symptome war sowohl vom verwendeten Isolat als auch von der

Konzentration der Isolate abhängig (Tab. 3.3). Mit kleinen Abweichungen waren

generell bei höheren Konzentrationen Symptome eher sichtbar als bei niedrigeren

Konzentrationen. Das Isolat 16619 zeigte bei einer Konzentration von 107 cfu/ml

eine schwächere Aggressivität als die Isolate 6.1.a und 552, da hier nicht bereits nach

fünf Tagen Symptome sichtbar waren, sondern erst nach sieben Tagen. Sichtbare

Symptome waren allerdings bei einer Konzentration von 104 cfu/ml bereits nach fünf

Tagen vorhanden. Bei niedrigeren Konzentration von 102 cfu/ml war das Isolat 552

aggressiver (12 Tage nach Inokulation erste Symptome) als die Isolate 6.1.a und

16619 (19 Tage nach Inokulation erste Symptome).

Das Ergebnis des Einflusses der Inokulumdichte auf die Infektion zeigte einen für

Inokulumdichten typischen Gradienten in Hinblick auf den Anteil an befallenen

Pflanzen. Dies gilt für alle drei verwendeten Isolate (Abb. 3.11). Die Häufigkeit der

Symptomausprägung war, mit kleinen Abweichungen, umso höher, je höher die

Konzentration des A. valerianellae-Inokulms war. So zeigten bei der geringen

Inokulumkonzentration von 102 cfu/ml zwischen 15 % und 35 % der Pflanzen

Symptome (19 Tage nach der Inokulation), während bei der hohen

Inokulumkonzentration von 107 cfu/ml zum gleichen Zeitpunkt 85 % bis 100 % der

Pflanzen Symptome aufwiesen.

Mit zunehmender Zeit nach der Inokulation waren mehr Symptom tragende Pflanzen

auch bei kleineren Konzentrationen vorhanden, was sich durch die Vermehrung von

A. valerianellae in der Pflanze beziehungsweise der Ausbreitung zwischen den

Pflanzen eines Versuchsglieds erklären lässt.

ERGEBNISSE

73

Tabelle 3.3: Auftreten erster Symptome (in Tagen) nach Inokulation einzelner A. valerianellae-

Isolate in Abhängigkeit von der Konzentration.

Erste sichtbare Symptome (in Tagen) nach Inokulation in Abhängigkeit der

verwendeten Konzentration

Isolat 102

cfu/ml

103

cfu/ml

104

cfu/ml

105

cfu/ml

106

cfu/ml

107

cfu/ml

6.1.a 19 7 7 7 12 5

16619 19 12 5 7 7 7

552 12 12 7 7 5 5

ERGEBNISSE

74

a a a a a

a

a

abab

ab

a

ab

a

ab

ab

b

ab

b

a

b b

b

b

b

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Verdünnungsstufe in cfu/ml

Bef

alls

häuf

igke

it in

%


aaaa

aaa

ab

ab

ab

aa

ab

bab

b

ab

a

bbb

ab

b

a

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


Bef

alls

häuf

igke

it in

%


a a a a

a

a

a a

aba

ab

ab

a

ab

ab

a

b b

a

b

b ab b

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


Bef

alls

häuf

igke

it in

%

5 dpi 7 dpi 12 dpi 19 dpi Abbildung 3.11: Anteil Symptom tragender Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) zwischen Tag fünf und Tag 19 nach der Inokulation (dpi) mit sechs

verschiedenen Konzentrationen zwischen 102 cfu/ml und 107 cfu/ml des A. valerianellae-Isolates 6.1.a (A), 16619 (B), 552 (C). Behandlungen mit gleichen

Buchstaben sind nicht signifikant voneinander verschieden. Die Daten wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test (Dunns Prozedur) verrechnet (p < 0,05).

102 103 104 105 106 107

102 103 104 105 106 107 102 103 104 105 106 107

A B

C

ER

GE

BN

ISS

E

74

ERGEBNISSE

75

3.2 Untersuchungen zur Sortenanfälligkeit

3.2.1 Einfluss der Sorte auf die Infektion

In den Untersuchungen zum Einfluss der Sorte auf die Infektion wurden elf Sorten

unterschiedlicher Züchter sowie zwei Hobbyanbausorten und die resistente Wildart

V. rimosa (AV-13) auf ihre Anfälligkeit gegenüber A. valerianellae untersucht

(Kapitel 2.13.1).

Alle Sorten zeigten in der ersten Wiederholung bei Temperaturen zwischen 13 °C

und 24 °C einen deutlichen Befall und wiesen charakteristische Symptome mit 3 %

bis 10 % befallener Blattfläche auf (Abb. 3.12). Die Befallshäufigkeiten lagen

zwischen 70 % und 98 % (Abb. 3.13). Sowohl die Befallsstärken als auch die

Befallshäufigkeiten wiesen dabei signifikante Sortenunterschiede auf. So waren die

Sorten AV-3, AV-5, AV-6, AV-14, AV-4, AV-2, AV-7, AV-9 und AV-8 bezüglich

der Befallsstärke deutlich von den stärker befallenen Sorten AV-12, AV-11, AV-10

und AV-15 zu unterscheiden. Die Sorten AV-3 und AV-5 waren bezüglich der

Befallshäufigkeit signifikant zu den übrigen Sorten unterschiedlich. Alle Sorten

waren jedoch anfällig für A. valerianellae. Lediglich die Wildform AV-13 zeigte

keine Symptome.

Die Ergebnisse aus der ersten Wiederholung wurden in einem zweiten Versuch bei

etwas höheren Temperaturen von 20 °C bis 29 °C bestätigt. Die Befallsstärken

(zwischen 2 % und 9 %) und Befallshäufigkeiten (zwischen 38 % und 91 %) lagen

etwas niedriger als im ersten Versuchsansatz. Sortenunterschiede waren wiederum

sichtbar und die Wildform AV-13 zeigte auch hier wieder keine sichtbaren

Symptome. Deutlich signifikante Unterschiede in der Befallsstärke und der

Befallshäufigkeit zeigten, wie bereits in der ersten Wiederholung, die Sorten AV-3,

AV-5, AV-14 und AV-4 im Gegensatz zu der anfälligen Sorte AV-15 (Abb. 3.12 und

Abb. 3.13).

ERGEBNISSE

76

a

abab

ab

bcbc

bcbcbc

bcbcbccd

d

a

abcabc

abc

ababc

abcabc

bcbc

abc

bc

cd

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

AV-13

AV-3AV-5

AV-6

AV-14

AV-4AV-2

AV-7AV-9

AV-8

AV-12

AV-11

AV-10

AV-15

Sorte

Bef

alls

stär

ke in

%

1. Versuch, 13 °C - 24 °C 2. Versuch, 20 °C - 29 °C

Abbildung 3.12: Befallsstärke (% nekrotische Blattfläche je Pflanze) von

unterschiedlichen Feldsalatsorten 18 Tage nach Inokulation eines A. valerianellae-

Gemisches (Konzentration 106 cfu/ml). Der Versuch wurde bei 13 °C – 24 °C

(1. Versuch) und bei 20 °C – 29 °C (2. Versuch) durchgeführt.




ERGEBNISSE

77

d

cbc

abcabc abc abc

ab abab

abab ab a

d

c

bc

abc

bc

bc

abc abc abc ab

abcabc

abc a

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

AV-13

AV-3AV-5

AV-6

AV-14

AV-4AV-2

AV-7AV-9

AV-8

AV-12

AV-11

AV-10

AV-15

Sorte

Bef

alls

häuf

igke

it in

%

1. Versuch, 13 °C - 24 °C 2. Versuch, 20 °C - 29 °C

Abbildung 3.13: Anteil an befallenen Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) bei

unterschiedlichen Feldsalatsorten 18 Tage nach Inokulation eines A. valerianellae-

Gemisches (Konzentration 106 cfu/ml). Der Versuch wurde bei 13 °C – 24 °C (1. Versuch)

und bei 20 °C – 29 °C (2. Versuch) durchgeführt.



3.2.2 Einfluss der Sorte und des Isolates auf die Infektion

Es wurden die Interaktionen zwischen A. valerianellae-Isolaten verschiedener

Herkünfte einerseits und andererseits zwischen zweier Sorten und einer Wildart

(V. rimosa) bezüglich der Symptomausprägung geprüft (Kapitel 2.13.2).

V. rimosa konnte wie in den Versuchen zum Einfluss der Inokulumdichte auf die

Infektion (Kapitel 3.1.4) und zum Einfluss der Sorte auf die Infektion (Kapitel 3.2.1)

nicht infiziert werden (Tab. 3.4, Abb. 3.14, Tab. 3.5, Abb. 3.15, Abb. 3.16,

Abb. 3.17), so dass sie als resistent gelten kann.

Die Isolate 16619 und IV2 wurden dabei mit einer niedrigen Konzentration von

104 cfu/ml aufgesprüht und führten insgesamt zu sehr geringen Befallsstärken

zwischen 0,1 % (Isolat IV2) und 0,3 % (Isolat 16619) an den drei Feldsalatsorten

AV-1, AV-5 und AV-3 (Tab. 3.4). Bei der Sorte AV-3 waren nach Inokulation mit

ERGEBNISSE

78

dem Isolat IV2 zudem keine sichtbaren Symptome vorhanden (Tab. 3.5). Die

Befallshäufigkeiten lagen zwischen 2 % und 22 % (Abb. 3.14). Aufgrund eines

starken Befalls mit Echtem Mehltau konnte nur eine sehr kleine Pflanzenmenge

bonitiert werden. Dies erklärt das Fehlen der statistischen Auswertung für die Isolate

16619 und IV2 mit der geringeren Konzentration von 104 cfu/ml.

Nach Inokulation mit einer Konzentration von 106 cfu/ml (Isolate: 6.1.a, 553) lag der

Anteil an befallener Blattfläche je Pflanze zwischen 0,8 % und 4 % (Tab. 3.5), die

Befallshäufigkeiten lagen zwischen 50 % und 92 % (Abb. 3.15).

Mit steigender Konzentration der Bakterienisolate 6.1.a und 553 war die Sorte AV-3

weniger anfällig in Bezug auf Befallsstärke und Befallshäufigkeit als die Sorten

AV-1 und AV-5.

Die Ergebnisse wurden in einem zweiten Versuch bei einer weiter auseinander

liegenden Temperaturspanne zwischen 2 °C bis 45 °C weitestgehend bestätigt,

obwohl die Isolate mit einer höheren (Isolate 16619 und IV2) beziehungsweise

niedrigeren Konzentration (Isolate 6.1.a und 553) von 105 cfu/ml inokuliert wurden.

Auch hier zeigte sich die Sorte AV-3 als etwas weniger anfällig gegenüber

A. valerianellae und eine maximale Befallsstärke von 9 % (Isolat IV2) wurde nicht

überschritten (Abb. 3.16). Die Befallsstärken der Sorten AV-1 und AV-5 lagen

zwischen knapp 3 % und 19 %, während die Befallshäufigkeiten zwischen 79 % und

100 % lagen (Abb. 3.17). Vermutlich aufgrund der höheren Temperaturen im

zweiten Versuch lagen auch die Befallsstärke und Befallshäufigkeit deutlich höher

als im ersten Versuchsansatz.

Die Isolate variierten in der Virulenz. Nach Inokulation geringerer

Bakterienkonzentrationen (104 cfu/ml) war das Isolat 16619 aggressiver als das Isolat

IV2, während sich die Aggressivität bei höheren Bakterienkonzentrationen

(105 cfu/ml) umkehrte. Die höhere Aggressivität des Isolates 553 bestätigte sich

sowohl nach Inokulation mit einer Konzentration von 106 cfu/ml als auch bei etwas

geringeren Konzentrationen (105 cfu/ml). Die Versuche zeigten, dass eine Infektion

mit sichtbaren Symptomen an Feldsalatpflanzen nicht ausschließlich von der

verwendeten Isolatkonzentration abhängig war, sondern auch vom verwendeten

ERGEBNISSE

79

Isolat selber, so dass die Verwendung eine Isolategemisches zur Inokulation zur

Vermeidung von Isolat-Sorten-Interaktionen von Vorteil ist.

Tabelle 3.4: Anteil an befallener Blattfläche je Pflanze (Befallsstärke in %) von drei

Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation zweier A. valerianellae-Isolate

(16619, IV2) mit einer Konzentration von 104 cfu/ml bei Kultur unter gesättigter Luftfeuchte.

Befallsstärke (in %) Sorte

Isolat 16619 Isolat IV2

AV-1 0,34 0,08

AV-5 0,31 0,02

AV-3 0,28 0

AV-13 0 0

ERGEBNISSE

80

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

16619 AV 2

Isolat

Bef

alls

häuf

igke

it in

%

AV-1 AV-5 AV-3 AV-13

Abbildung 3.14: Anteil an befallenen Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) von drei

Feldsalatsorten (AV-1, AV-5, AV-3) und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation

zweier A. valerianellae-Isolate (16619, IV2) mit einer Konzentration von 104 cfu/ml bei

Kultur unter gesättigter Luftfeuchte.

IV2

ERGEBNISSE

81

Tabelle 3.5: Anteil an befallener Blattfläche je Pflanze (Befallsstärke (BS) in %) von drei

Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation zweier A. valerianellae-Isolate

(6.1.a, 553) mit einer Konzentration von 106 cfu/ml und Kultivierung unter gesättigter

Luftfeuchte.



Isolat 6.1.a Isolat 553

Sorte

BS (%) Signifikanz

(p < 0,05) BS (%)

Signifikanz

(p < 0,05)

AV-1 1,35 b 3,95 c

AV-5 1,51 b 2,52 bc

AV-3 0,79 a 1,74 b

AV-13 0 a 0 a

ERGEBNISSE

82

b

b

b

b b

b

aa0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

6.1.a 553

Isolat

Bef

alls

häuf

igke

it in

%



Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation zweier A. valerianellae-

Isolate (6.1.a, 553) mit einer Konzentration von 106 cfu/ml und Kultivierung unter

gesättigter Luftfeuchte.



(p < 0,05).

ERGEBNISSE

83

c

b

c

c

b

a

bc

b

b

a

b

b

aaaa02468

1012141618202224

6.1.a 553 16619 AV2

Isolat

Bef

alls

stär

ke in

%


Abbildung 3.16: Anteil an befallener Blattfläche je Pflanze (Befallsstärke in %) von drei

Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation von vier

A. valerianellae-Isolaten (6.1.a, 553, 16619, IV2) mit einer Konzentration von 105 cfu/ml

und Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchte.



(p < 0,05).

IV2

ERGEBNISSE

84

bbbc b

b

bbc

bbb

b

aaaa0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

6.1.a 553 16619 AV2

Isolat

Bef

alls

häuf

igke

it in

%



Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 16 Tage nach Inokulation von vier A. valerianellae-

Isolaten (6.1.a, 553, 16619, IV2) mit einer Konzentration von 105 cfu/ml und Kultivierung

unter gesättigter Luftfeuchte.



3.2.3 Einfluss der Inokulumdichte und der Sorte auf die Infektion

In Versuchen zum Einfluss der Inokulumdichte und der Sorte auf die Infektion

(Kapitel 2.13.3) konnte aufgrund eines starken Befalls mit Echtem Mehltau nur eine

sehr kleine Pflanzenmenge bonitiert werden. Dies erklärt das Fehlen der statistischen

Auswertung.

Das Ergebnis zeigte 9 dpi einen für Inokulumdichten typischen Gradienten in

Hinblick auf die Befallshäufigkeit. Die Häufigkeit der Symptomausprägung war, mit

kleinen Abweichungen, umso höher, je höher die verwendete Konzentration des

A. valerianellae-Inokulums war. Die Wildart AV-13 zeigte, auch nach Inokulation

mit einer hohen Bakterienkonzentration, keine Symptome (Abb. 3.18).

Nach Inokulation mit der höchsten Konzentration von 106 cfu/ml zeigten sich

lediglich am ersten und am zweiten Boniturtermin (7 dpi und 9 dpi) Unterschiede in

IV2

ERGEBNISSE

85

der Befallshäufigkeit. 13 und 20 Tagen nach der Inokulation zeigten alle Pflanzen

der Sorten Symptome. Zwischen den Feldsalatsorten AV-1 und AV-5 waren keine

großen Sortenunterschiede zu erkennen (Abb. 3.19).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


Bef

alls

häuf

igke

it in

%

AV-13 AV-1 AV-5 Abbildung 3.18: Anteil Symptom tragender Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) von zwei

verschiedenen Feldsalatsorten und der Wildart AV-13 neun Tage nach Inokulation eines

A. valerianellae-Isolategemisches mit fünf verschiedenen Konzentrationen zwischen

102 cfu/ml und 106 cfu/ml.

102 103 104 105 106

ERGEBNISSE

86

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

AV-13 AV-1 AV-5

Sorte

Bef

alls

häuf

igke

it in

%


Abbildung 3.19: Anteil Symptom tragender Pflanzen (Befallshäufigkeit in %) von zwei

verschiedenen Feldsalatsorten (AV-1 und AV-5) und der Wildart AV-13 zwischen Tag

sieben und Tag 20 nach Inokulation (dpi) eines A. valerianellae-Isolategemisches mit einer

Konzentrationen von 106 cfu/ml.

ERGEBNISSE

87

3.3 Infektionsversuche von Acidovorax valerianellae zu

Übertragungswegen

3.3.1 Boden

Ziel des Versuches war es herauszufinden, ob das Bakterium A. valerianellae im

Boden überdauern kann und wie lange es infektiös ist. Durch die Einarbeitung

gesunder und mit A. valerianellae-infizierter Feldsalatblätter in den Boden und die

anschließende Einsenkung ins Erdreich (Freiland) erfolgte unter annähernd

natürlichen Bodenverhältnissen die Umsetzung beziehungsweise der Abbau von

Pflanzenmaterial (siehe Kapitel 2.14.1).

Nach Aussaat von gesundem Saatgut in Proben von Böden, in die zuvor gesundes

Feldsalat-Blattmaterial eingearbeitet wurde, zeigten sich über die Dauer des

einjährigen (Schifferstadt) beziehungsweise achtmonatigen (Quedlinburg) Versuches

keine A. valerianellae-Symptome an Feldsalatpflanzen (nicht dargestellt).

In der ersten Zeit nach Beginn der monatlichen Probennahme von mit

A. valerianellae-infizierten Feldsalat-Blattmaterial durchmischten Böden und

anschließender Aussaat von gesundem Saatgut in diese Böden wurde ein

A. valerianellae-Befall sowohl in Schifferstadt als auch in Quedlinburg festgestellt.

Die Symptome zu Beginn der Untersuchungen waren in beiden Fällen mit 28,3 % an

Symptom tragenden Pflanzen im Monat September 2009 (Tab. 3.6) und 100 % im

Monat März 2010 (Tab. 3.7) am höchsten und nahmen innerhalb von drei Monaten

nahezu konstant ab.

So zeigten sich am Standort Schifferstadt einen Monat nach Versuchsbeginn mit

28,3 % genauso viele Symptom tragende Pflanzen wie direkt nach der Einarbeitung

von infiziertem Blattmaterial in den Boden (September 2009) mit anschließender

Aussaat. Bei Pflanzen, die zwei Monate nach Versuchbeginn ausgesät wurden, zeigte

sich ein Befall an einem Fünftel aller Pflanzen (20,2 % Symptom tragende Pflanzen),

während einen Monat später (3. Monat nach Kontamination) nur noch 8,4 % der

Pflanzen A. valerianellae-Symptome aufwiesen. Aussaaten nach vier

beziehungsweise fünf Monaten zeigten zunächst bei 1,6 % der Pflanzen

A. valerianellae-verdächtige Symptome, ein A. valerianellae-Befall konnte

ERGEBNISSE

88

allerdings im anschließenden TAS-ELISA nicht bestätigt werden (Tab. 3.6). Ebenso

verhielt es sich bei Pflanzen mit verdächtigen Symptomen (11,1 %), die im 9. Monat

nach Kontamination ausgesät worden waren. Auch hier wurde A. valerianellae an

den verdächtigen Pflanzen nicht nachgewiesen. Pflanzen aus dem 10. Monat zeigten

keine Symptome, während im 11. Monat an 4,5 % der gewachsenen Pflanzen

untypische A. valerianellae-Symptome vorhanden waren, die sich nach TAS-ELISA-

Untersuchung als positiv erwiesen. Zu Versuchende (September 2010) waren keine

Symptome an Pflanzen sichtbar.

Am Standort Quedlinburg konnte zu Beginn der Untersuchungen im März 2010

lediglich eine Pflanze beobachtet und näher untersucht werden. A. valerianellae

wurde an dieser Pflanze visuell ermittelt und im TAS-ELISA bestätigt. Pflanzen, die

ein, zwei und drei Monate nach Kontamination des Bodens ausgesät wurden, zeigten

einen Befall von 60 % (1. Monat), 41,6 % (2. Monat) und 50 % (3. Monat), der im

TAS-ELISA bestätigt wurde. Pflanzen, die in den Bodenproben sechs

beziehungsweise sieben Monate nach Kontamination ausgesät worden waren, zeigten

untypische A. valerianellae-Symptome und ein A. valerianellae-Befall wurde nicht

nachgewiesen (Tab. 3.7). Zu Versuchende (November 2010) waren hier keine

Symptome an Pflanzen sichtbar.

An beiden Standorten herrschten zum Zeitpunkt der Versuche unterschiedliche

Klimabedingungen. In Schifferstadt wurde der Versuch im September 2009

begonnen, in Quedlinburg im März 2010, so dass unterschiedliche Temperatur- und

Niederschlagswerte vorlagen (Tab. 3.8).

A. valerianellae konnte in diesen Versuchen bis zu elf Monate im Boden überdauern

und eine neue Feldsalatkultur befallen.

ERGEBNISSE

89

Tabelle 3.6: Anteil symptomtragender Pflanzen (%) und TAS-ELISA-Nachweis von

A. valerianellae in Symptom tragenden Pflanzen. Die Pflanzen wurden zu verschiedenen Zeiten

(über ein Jahr) in zuvor durch Einarbeitung von befallenem A. valerianellae-Pflanzenmaterial

kontaminierten Boden gesät (Standort Schifferstadt).

Zeit nach Einarbeitung Symptom tragende

Pflanzen in %

TAS-ELISA-Nachweis

von A. valerianellae

Start (September 2009) 28,3 positiv

1. Monat 28,3 positiv



4. Monat 1,6 (untypisch) negativ


6. Monat 0 negativ

7. Monat 0 negativ

8. Monat 0 negativ


10. Monat 0 negativ

11. Monat 4,5 (untypisch) positiv

Ende (September 2010) 0 negativ

ERGEBNISSE

90

Tabelle 3.7: Anteil symptomtragender Pflanzen (%) und TAS-ELISA-Nachweis von

A. valerianellae in Symptom tragenden Pflanzen. Die Pflanzen wurden zu verschiedenen Zeiten

(über acht Monate) in zuvor durch Einarbeitung von befallenem A. valerianellae-

Pflanzenmaterial kontaminierten Boden gesät (Standort Quedlinburg).

Zeit nach Einarbeitung Symptom tragende

Pflanzen in %

TAS-ELISA-Nachweis

von A. valerianellae

Start (März 2010) 100

(eine gewachsene Pflanze) positiv

1. Monat 60 positiv


3. Monat 50 positiv




7. Monat 4 (untypisch) negativ

Ende (November 2010) 0 negativ

ERGEBNISSE

91

Tabelle 3.8: Temperaturwerte (in 2 Meter Höhe) und Niederschlagswerte im Monatsmittel im

Zeitraum von September 2009 bis September 2010 in Schifferstadt und von März 2010 bis

November 2010 in Quedlinburg.

Quelle Schifferstadt: Dienstleistungszentren Ländlicher Raum Rheinland Pfalz,

Agrarmeteorologie

Quelle Quedlinburg: Julius Kühn-Institut

Standort Schifferstadt

Standort Quedlinburg

Jahr

Monat Temperatur

(°C)

Niederschlag

(mm)

Temperatur

(°C)

Niederschlag

(mm)

September 17 30,3

Oktober 10,8 42,7

November 9,2 56,2 2009

Dezember 2,9 84,8

Januar -0,8 21,7

Februar 2,6 28,5

März 6,9 25,1 4,9 26,4

April 11,9 30,1 8,6 24,2

Mai 13,1 123,1 10,3 142,2

Juni 19,4 68,2 16,2 35,6

Juli 22,5 48,3 20,6 60,8

August 18,7 125,3 17,5 104

September 14,1 54 13,1 127,8

Oktober 9 25,8

2010

November 5 93,1

ERGEBNISSE

92


3.3.2.1 Alternative Wirtspflanzen I

Die Untersuchungen wurden mit Pflanzen aus zehn Familien (Amaranthaceae,

Asteraceae, Brassicaceae, Caryophyllaceae, Fabaceae, Hydrophylloideae,

Lamiaceae, Plantaginaceae, Poaceae und Potulaceae) und Feldsalat als anfälligem

Standard durchgeführt. Zur Inokulation dieser Pflanzen wurden verschiedene

Verfahren (Infiltration und Sprühinokulation) eingesetzt (siehe Kapitel 2.14.2).

Bei den Kontrollpflanzen waren über die Dauer des Versuches keinerlei

Veränderungen an den Pflanzen durch die Inokulation zu erkennen (nicht

dargestellt).

Nach Infiltration mit einer A. valerianellae-Suspension in einzelne Blätter zeigten

mehrere Blattbereiche 20 Tage nach Inokulation (dpi) unterschiedliche Reaktionen

im Vergleich zur Kontrolle in Form von feuchten, aufgehellten oder nekrotischen

Blattveränderungen. Feldsalatpflanzen zeigten dabei die für A. valerianellae

typischen Symptome. Diese Veränderungen waren bei Amaranthus retroflexus (L.),

Chenopodium album (L.), Lactuca sativa (L.) (Batavia-Salat und Eissalat), Senecio

vulgaris (L.), Brassica rapa ssp. pekinensis (Lour.) Hanelt, Capsella bursa-pastoris

(L.) Medik., Stellaria media (L.) Vill., Lamium album (L.), Plantago major (L.) und

Veronica persica (Poir.) sichtbar. Keine sichtbaren Veränderungen an infiltrierten

Blattbereichen waren zum gleichen Zeitpunkt (20 dpi) bei Chenopodium hybridum

(L.), Phaseolus vulgaris (L.), Pisum sativum (L.), Eleusine coracana (L.) Gaertn.

und Portulaca oleracea (L.) vorhanden.

Auch nach Sprühinokulation kam es zu Veränderungen im Blattgewebe. Behandelte

Pflanzen zeigten an besprühten Blattbereichen nach sieben Tagen bereits

Auffälligkeiten durch diese Inokulation. Bei Chenopodium album (L.) und Lactuca

sativa (L.) (Batavia-Salat und Eissalat) waren dunkle Verfärbungen auf der

Blattspreite zu erkennen, die teilweise mit schwarzen Rändern zum gesunden

Gewebe abgegrenzt waren. Außerdem waren bei Matricaria chamomilla (L.) und

Senecio vulgaris (L.) aufgehellte Blattbereiche 13 dpi sichtbar. Die Pflanzen mit

auffälligen Blattbereichen waren vor allem nach Sprühinokulation zu finden und

besonders bei Arten aus der Familie der Asteraceae (Tab. 3.9).

ERGEBNISSE

93

Tabelle 3.9: Krankheitssymptome nach Infiltration und Sprühinokulation mit A. valerianellae

(Konzentration 108 cfu/ml) sieben, 13 und 20 dpi bei verschiedenen Pflanzenarten.

+ = feuchte, aufgehellte oder nekrotische Blattveränderungen

- = keine Krankheitssymptome erkennbar

Inokulierte Pflanze Krankheitssymptome nach

Inokulation an Blättern

Familie Art Infiltration

(20 dpi)

Sprühinokulation

(7 und 13 dpi)

Valerianaceae Valerianella

locusta (L.) + +

Amaranthus

retroflexus (L.) + -

Chenopodium

hybridum (L.) - - Amaranthaceae

Chenopodium

album (L.) + +

Lactuca sativa (L.)

(Batavia-Salat) + +

Lactuca sativa (L.)

(Eissalat) + +

Matricaria

chamomilla (L.) nicht infiltriert +

Asteraceae

Senecio

vulgaris (L.) + +

Brassica rapa ssp.

pekinensis (Lour.)

Hanelt

+ -

Brassicaceae

Capsella bursa-

pastoris (L.) Medik. + -

Caryophylloideae Stellaria media (L.)

Vill. + -

ERGEBNISSE

94

Fortsetzung Tab. 3.9

Inokulierte Pflanze Krankheitssymptome nach

Inokulation an Blättern

Familie Art Infiltration

(20 dpi)

Sprühinokulation

(7 und 13 dpi)

Phaseolus

vulgaris (L.) - -

Fabaceae

Pisum sativum (L.) - -

Hydrophylloideae

Phacelia

tanacetifolia

(Juss.)

nicht infiltriert -

Lamiaceae Lamium album

(L.) + -

Plantago major

(L.) + -

Plantaginaceae Veronica persica

(Poir.) + -

Poaceae Eleusine coracana

(L.) Gaertn. - -

Portulaceae Portulaca

oleracea (L.) - -

ERGEBNISSE

95

3.3.2.2 Alternative Wirtspflanzen II

Pflanzen aus sieben verschiedenen Pflanzenfamilien wurden inokuliert

(Sprühinokulation) und für die ersten 48 Stunden bei gesättigter Luftfeuchte und

danach bis Versuchende bei normal vorherrschenden Luftfeuchten im Gewächshaus

kultiviert. Eine visuelle Bonitur auf eine Veränderung an den Blättern erfolgte 10, 25

und 30 dpi. Zu keinen auffälligen Veränderungen im Blattgewebe kam es nach

Inokulation mit 0,85 %-iger Natriumchloridlösung. Ebenso waren keinerlei

Veränderungen nach Inokulation von A. valerianellae bei Beta vulgaris subsp.

vulgaris var. conditiva (L.), Spinacia oleracea (L.), Foeniculum vulgare (L.) Mill.,

Petroselium crispum (Mill.) Nyman & A.W. Hill (kraus), Eruca sativa (L.), Pisum

sativum (L.) und Capsicum annuum (L.) zu beobachten (nicht dargestellt).

Pflanzen aus den Familien Apiaceae (Möhre), Brassicaceae (Radies), Fabaceae

(Buschbohne) und Poaceae (Mais) zeigten am zehnten Tag nach der Inokulation mit

A. valerianellae Auffälligkeiten gegenüber mit Kochsalzlösung inokulierten

Pflanzen, die allerdings an späteren Terminen (25 und 30 dpi) nicht mehr sichtbar

waren. Ebenso wurden auffällige Blattbereiche an Ölrettich (Brassicaceae) 25 dpi

beobachtet. Durch eine erneute Kultur bei gesättigter Luftfeuchte, die für das

Bakterium A. valerianellae eine optimale Bedingung für eine Infektion darstellt,

veränderten sich die Symptome.

An Petroselium crispum (Mill.) Nyman & A.W. Hill (glatt) wurden zu allen drei

Beobachtungsterminen Blätter mit gelblichen Aufhellungen beobachtet, bei

Raphanus sativus (L.) wurden Blattränder mit schwarzen Punkten sichtbar

(Tab. 3.10). Feldsalatpflanzen zeigten über die Dauer des Versuches die für

A. valerianellae typischen Symptome.

ERGEBNISSE

96

Tabelle 3.10: Krankheitssymptome nach Sprühinokulation mit A. valerianellae (Konzentration

108 cfu/ml) 10, 25 und 30 dpi bei verschiedenen Pflanzenarten.

- = keine sichtbaren Krankheitssymptome erkennbar

Krankheitssymptome nach Sprühinokulation an Blättern Inokulierte

Pflanze Nach 10 Tagen Nach 25 Tagen Nach 30 Tagen

Valerianella

locusta (L.)

typische

A. valerianellae-

Symptome

typische

A. valerianellae-

Symptome

typische

A. valerianellae-

Symptome

Daucus carota

subsp. sativus

(Hoffm.) Schübl.

et G. Martens

ein Blatt mit einem

schwarzen Punkt;

mehrere

pergamentartige

Stellen mit

dunklen Punkten

- -

Petroselium

crispum (Mill.)

Nyman & A.W.

Hill (glatt)

Blätter mit

gelblichen

Aufhellungen

Blätter mit

gelblichen

Aufhellungen

Blätter mit

gelblichen

Aufhellungen

Raphanus sativus

subsp. oleiformes

(L.)

-

Blattrand eines

Blattes mit

schwarzen

Punkten

-

ERGEBNISSE

97


Krankheitssymptome nach Sprühinokulation an Blättern Inokulierte

Pflanze Nach 10 Tagen Nach 25 Tagen Nach 30 Tagen

Raphanus sativus

subsp. sativus

(L.)

2 Blätter mit

schwarzen Rändern - -

Raphanus sativus

(L.) -

Blattränder mit

schwarzen

Punkten

Blattränder mit

schwarzen

Punkten

Phaseolus

vulgaris (L.)

pergamentartige

Flecken - -

Zea mays (L.) Ränder an Blattenden

teilweise gelb - -

ERGEBNISSE

98

3.3.2.3 Alternative Wirtspflanzen III

Der Versuch wurde mit Pflanzenarten aus fünf Familien und Feldsalat durchgeführt.

Es sollte nach Stichinokulation auf einer Blatthälfte der Pflanzen überprüft werden,

ob und wie lange das Bakterium A. valerianellae lebensfähig war (siehe Kapitel

2.14.2.3).

Pflanzen, die lediglich mit einer 0,85 %-igen Natriumchloridlösung inokuliert

wurden, zeigten über die Dauer des gesamten Versuches, außer einer Verletzung

durch die Nadel, keine visuellen Veränderungen im Aussehen der Blätter um die

Einstichstelle. Zudem wurde die Befallsfreiheit von diesen Pflanzensaftproben

mittels Ausplattierung auf KB-Agar und Untersuchung im TAS-ELISA bestätigt

(nicht dargestellt).

Ab dem 12. Tag nach der Stichinokulation mit A. valerianellae wurden erste

Veränderungen in der Blattstruktur um die Einstichstelle beobachtet (Tab. 3.11). An

Feldsalatpflanzen waren über die fünfwöchige Dauer des Versuches (bis Tag 33 nach

der Inokulation, 33 dpi) typische A. valerianellae-Symptome in Form von schwarzen

Flecken sichtbar. Bei Beta vulgaris subsp. vulgaris var. conditiva (L.) und

Petroselium crispum (Mill.) Nyman & A.W. Hill (kraus) waren lediglich

Verletzungen zu erkennen, während bei Raphanus sativus subsp. sativus (L.),

Raphanus sativus subsp. oleiformes (L.), Phaseolus vulgaris (L.), Pisum sativum (L.)

und Raphanus sativus (L.) der Bereich um die Einstichstelle schwarz verfärbt war.

Lediglich anfänglich sichtbare Verletzungen entwickelten sich bei Spinatpflanzen ab

dem 19. Tag nach der Inokulation zu wässrigen dunklen Läsionen. Bei

Eissalatpflanzen waren wässrige dunkle Läsionen bereits zu Anfang der

Untersuchungen (12 dpi) erkennbar.

Lebensfähige Bakterien aus injizierten Blattbereichen wurden am 12. Tag nach der

Stichinokulation in Radies-, Ölrettich-, Buschbohne-, Rettich- und

Eissalatsaftproben nach Ausplattierung auf KB-Agarschalen nachgewiesen und

mittels TAS-ELISA als A. valerianellae identifiziert. In Feldsalatproben wurden

lebensfähige Bakterien sowohl nach 12, 26 und 33 Tage nach der Stichinokulation

ERGEBNISSE

99

auf KB-Agarschalen detektiert und mittels TAS-ELISA als A. valerianellae

diagnostiziert.

Lebensfähige Bakterien aus nicht-injizierten, aber den injizierten Blatthälften

benachbarten Blattbereichen, wuchsen 12 Tage nach Stichinokulation auf

KB-Agarschalen sowohl bei Feldsalat als auch bei Petersilie. Nach 19 Tagen

wuchsen Bakterien aus Proben von Markerbse und Petersilie, nach 26 Tagen bei

Feldsalat, Buschbohne und Markerbse und nach 33 Tagen lediglich bei Markerbse

(Tab. 3.12). Alle Bakterienkolonien wurden abschließend mittels TAS-ELISA als

A. valerianellae-Bakterien identifiziert.

Das Bakterium A. valerianellae war über die Dauer von bis zu 33 Tagen in

inokulierten Pflanzen lebensfähig und nachweisbar. Diese befallenen Pflanzen

wiesen auch Krankheitssymptome auf.

ERGEBNISSE

100

Tabelle 3.11: Veränderungen in der Blattstruktur um die Einstichstelle bei verschiedenen

Pflanzenarten nach Stichinokulation mit A. valerianellae (Konzentration 108 cfu/ml) an

unterschiedlichen Tagen nach der Inokulation (dpi).

Veränderungen nach Stichinokulation an Blättern Inokulierte Pflanze

12 dpi 19 dpi, 26 dpi, 33 dpi

Valerianella locusta (L.) typische A. valerianellae-Symptome

Beta vulgaris subsp.

vulgaris var. conditiva

(L.)

Verletzung sichtbar

Spinacia oleracea (L.) Verletzung sichtbar wässrige dunkle Läsionen

Petroselium crispum

(Mill.) Nyman & A.W.

Hill (kraus)

Verletzung sichtbar

Lactuca sativa (L.) wässrige dunkle Läsionen

Raphanus sativus subsp.

oleiformes (L.) Bereich um Einstichstellen schwarz


sativus (L.) Bereich um Einstichstellen schwarz

Raphanus sativus (L.) Bereich um Einstichstellen schwarz

Phaseolus vulgaris (L.) Bereich um Einstichstellen schwarz

Pisum sativum (L.) Bereich um Einstichstellen schwarz

ERGEBNISSE

101

Tabelle 3.12: Nachweis von lebensfähigen A. valerianellae-Bakterien in injizierten und nicht-

injizierten Blatthälften verschiedener Pflanzenarten 12, 19, 26 und 33 dpi.

Nachweis von A. valerianellae (+) beziehungsweise kein Nachweis von A. valerianellae (-) in

inokulierten und nicht-inokulierten Blatthälften.

dpi Potentieller Wirt Injizierte

Blatthälfte

Nicht-injizierte

Blatthälfte

Valerianella locusta (L.) + +

Petroselium crispum (Mill.)

Nyman & A.W. Hill + -

Lactuca sativa (L.) + -


oleiformes (L.) + -


sativus (L.) + -

Raphanus sativus (L.) + -

12

Phaseolus vulgaris (L.) + -

Petroselium crispum (Mill.)

Nyman & A.W. Hill + -

19

Pisum sativum (L.) + -

Valerianella locusta (L.) + +

Phaseolus vulgaris (L.) + - 26


Valerianella locusta (L.) + -

33


ERGEBNISSE

102

3.3.3 Saatgut

Die Versuche zum Übertragungsweg Saatgut wurden mit einer gesunden und einer

mit A. valerianellae-kontaminierten Saatgutpartie und deren Tochtergenerationen in

verschiedenen Jahren durchgeführt. Es sollte gezeigt werden, ob eine Übertragung

von A. valerianellae über das Saatgut auf die Tochtergeneration möglich ist.

Weiterhin wurde geprüft, ob die verwendete Bewässerungsstrategie einen Einfluss

auf die Kontamination der Samen hat. Die Pflanzen wurden in allen Aussaatjahren

visuell bis zur Samenernte auf einen A. valerianellae-Befall untersucht.

Abschließend erfolgte, nach Samenreifung und dem Bruch der Dormanz, die

Untersuchung der Saatgutpartien auf Befall mit A. valerianellae (siehe Kapitel

3.4.1).

A. valerianellae-Schadsymptome traten im Jahr 2007 nur sporadisch zu Kulturbeginn

und ausschließlich an den Pflanzen aus infiziertem Saatgut auf. Der Anteil Symptom

tragender Pflanzen lag bei den in Deutschland kultivierten Pflanzen 40 Tage nach der

Aussaat bei 4,7 % und war gleichmäßig im Bestand verteilt (Abb. 3.20). In

Frankreich waren lediglich an 1,1 % der Pflanzen sichtbare Symptome nach sechs

Monaten nach der Aussaat vorhanden (nicht dargestellt).

Pflanzen, die im Oktober 2008 ausgesät wurden, zeigten 69 Tage nach der Aussaat

von infiziertem Saatgut einen geschätzten Befallswert von 10 % (Abb. 3.21 A).

Dieser Schätzwert erhöhte sich innerhalb von einem Monat auf 15 % (103 Tage nach

der Aussaat). 135 Tagen nach der Aussaat lag der Befallswert bei 30 % bis 35 %

(Abb. 3.21 B).

An Pflanzen, die im Jahr 2009 ausgesät wurden, war zu keiner Zeit der

Kulturführung beziehungsweise Saatgutproduktion ein Befall sichtbar.

Die Befallswerte schwankten zwischen den einzelnen Jahren stark, obwohl immer

die gleiche kontaminierte Saatgutpartie ausgesät wurde. Allerdings erfolgte die

Aussaat an verschiedenen Standorten unter verschiedenen Kulturbedingungen

(Gewächshaus, Folienhaus, Freiland) und zu verschiedenen Jahreszeiten.

ERGEBNISSE

Parzelle 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 261 x2 x3 x4 x5 x6 x x x x7 x8 x x x9 x

Parzelle 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 261 x x x23 x4 x x x5 x x x678 x9 x

Parzelle 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 261 x234 x5 x6 x789

Pflanze

Rei

heR

eihe

Rei

he

Abbildung 3.20: Verteilung von A. valerianellae-Symptome tragende Pflanzen (mit x gekennzeichnet) aus A. valerianellae-infiziertem

Saatgut, 40 Tage nach der Aussaat im Jahr 2007 in Deutschland, in drei jeweils 1 m² großen abgesteckten Parzellen, die aus je neun

Aussaatreihen bestanden, in denen zwischen 18 und 26 Pflanzen wuchsen (grau hinterlegte Fläche).

ER

GE

BN

ISS

E

103

ERGEBNISSE

104

Abbildung 3.21: Feldsalatpflanzen aus infiziertem Saatgut

69 Tage (A) und 135 Tage (B) nach Aussaat im Jahr 2008 in

einem Folienhaus. Pflanzen mit A. valerianellae-Symptomen

wurden mit einem Stab gekennzeichnet.

B

A

ERGEBNISSE

105

3.4 Saatgutuntersuchungen

3.4.1 Nachweismethoden von Acidovorax valerianellae am Saatgut

Die Saatgutpartien stammten aus den Versuchen zum Übertragungsweg Saatgut

(Kapitel 2.13.3). Sowohl das gesunde und infizierte Ausgangssaatgut sowie die

daraus gewonnenen zehn Partien aus verschiedenen Jahren wurden auf einen Befall

mit A. valerianellae überprüft.

3.4.1.1 Sweatbox-Test in der Klimakammer und Aufwuchstest im

Gewächshaus

Samen aus verschiedenen Versuchsvarianten zur Saatgutübertragung von

A. valerianellae wurden für den Sweatbox-Test in Vermiculit (5000 Samen pro zwei

Liter Vermiculit) und für den Aufwuchstest in Erde ausgesät. Die Kultur erfolgte für

den Sweatbox-Test ab Aussaat und für den Aufwuchstest mit Beginn des sich

entwickelnden Laubblattstadiums der Pflanzen unter gesättigter Luftfeuchte.

Aufgelaufene Pflanzen wurden auf einen Befall von A. valerianellae an

verschiedenen Terminen visuell bonitiert (Abb. 3.22). Die Befallshäufigkeit wurde

an mehreren Tagen erfasst. Die Endbonitur fand bei Pflanzen im Sweatbox-Test

28 Tage nach der Aussaat statt und für die Pflanzen im Aufwuchstest nach 28 Tagen

unter gesättigter Luftfeuchte. Von Pflanzen mit verdächtigen oder typischen

Symptomen wurden Bakterien isoliert und mittels TAS-ELISA näher bestimmt.

Die gesunde Ausgangspartie (AV-60) war sowohl nach dem Sweatbox-Test als auch

nach dem Aufwuchstest im Gewächshaus als frei von Acidovorax anzusehen. Das

wurde auch durch die Überprüfung mittels TAS-ELISA bestätigt. In der infizierten

Ausgangspartie (AV-75) wurden sowohl im Sweatbox-Test als auch im

Aufwuchstest Pflanzen mit typischen A. valerianellae-Symptomen bonitiert.

A. valerianellae-Bakterien wurden in diesen Symptom zeigenden Pflanzen

nachgewiesen.

Die in den Folgejahren aus der gesunden Ausgangspartie produzierten Saatgutpartien

(mit Aussaaten in den Jahren 2007 bis 2009) zeigten weder im Sweatbox-Test noch

ERGEBNISSE

106

im Aufwuchstest Symptome und ein Befall mit A. valerianellae wurde nicht

nachgewiesen.

Die Saatgutpartien aus der infizierten Ausgangspartie zeigten hingegen nach Aussaat

im Jahr 2007 in Deutschland (AV-76) und nach Aussaat im Jahr 2008 (AV-77)

typische Symptome. Ein eindeutiger Nachweis von A. valerianellae-Bakterien

erfolgte mittels TAS-ELISA. Pflanzen aus Saatgutpartien, die in Frankreich und in

Deutschland produziert wurden (AV-78 (Frankreich), AV-79 (Tröpfchen), AV-80

(Regner)), zeigten keinen nachweisbaren Befall (Tab. 3.13).

Demnach lieferte eine infizierte Ausgangspartie, die Symptome sowohl im

Sweatbox-Test als im Aufwuchstest zeigt, nicht zwangsläufig A. valerianellae

kontaminiertes Saatgut. Aus einer gesunden symptomlosen Ausgangspartie entstand

wiederum gesundes Saatgut.

Abbildung 3.22: Sichtbare typische A. valerianellae-Symptome 25 Tage nach der

Aussaat in Vermiculit (Sweatbox-Test) bei Kultivierung unter gesättigter

Luftfeuchte.

ERGEBNISSE

107

Tabelle 3.13: Nachweis von A. valerianellae in zwölf Saatgutpartien im Sweatbox-Test und im

Aufwuchstest. Der Nachweis erfolgte durch klassisches Isolieren und mittels TAS-ELISA in

Pflanzen mit verdächtigen Symptomen.

Nachweis von A. valerianellae

Saatgutpartie

Sweatbox-Test Aufwuchstest

AV-60

(gesund) - -

Ausgangssaatgut

(ungebeizt) AV-75

(kontaminiert) + +

AV-60

(gesund) - -

Ausgangssaatgut

(gebeizt) AV-75

(kontaminiert) - -

AV-61,

Deutschland

(gesund)

- -

AV-76,

Deutschland

(kontaminiert)

+ +

AV-63,

Frankreich

(gesund)

- -

Aussaat 2007

AV-78,

Frankreich

(kontaminiert)

- -

ERGEBNISSE

108



Saatgutpartie

Sweatbox-Test Aufwuchstest

AV-62

(gesund) - -

Aussaat 2008 AV-77

(kontaminiert) + +

AV-64,

Tröpfchen

(gesund)

- -

AV-65,

Regner

(gesund)

- -

AV-79,

Tröpfchen

(kontaminiert)

- -

Aussaat 2009

AV-80,

Regner

(kontaminiert)

- -

ERGEBNISSE

109

3.4.1.2 Ankeimmethode auf Papier

Mit der Ankeimmethode auf Papier wurden Saatgutpartien auf eine Belastung mit

A. valerianellae untersucht.

Die Nachweisgrenzen lagen bei diesen Untersuchungen bei einem OD-Wert von

0,076 für die Beurteilung des Ausgangssaatgutes sowie für die Saatgutpartien mit

Aussaat 2007 beziehungsweise bei einem OD-Wert von 0,098 für die Saatgutpartien,

die im Jahr 2008 und 2009 ausgesät wurden.

Die OD-Werte der gesunden Ausgangspartie (AV-60) lagen zu allen Zeitpunkten

nach der Aussaat unterhalb der Nachweisgrenze von 0,076. Die infizierte, ungebeizte

Ausgangspartie (AV-75) erreichte am Tag null der Untersuchung einen OD-Wert

von 0,15 und war somit mit A. valerianellae belastet. Beide Saatgutpartien keimten

jedoch nicht, so dass eine Befallsfreiheit beziehungsweise Kontamination mit

A. valerianellae nicht im Keimverlauf nachgewiesen wurde.

Bei der Untersuchung aller anderen Saatgutpartien wurden ab dem vierten Tag

Keimlinge zur Untersuchung herangezogen. So lagen, mit Ausnahme der

Saatgutpartie „AV-76 (Deutschland, kontaminiert)“ und „AV-64 (Tröpfchen,

gesund)“ alle Saatgutpartien zu allen vier Zeitpunkten unterhalb der

Nachweisgrenzen. Die beiden Saatgutpartien “AV-76 (Deutschland)“ und „AV-64

(Tröpfchen)“ lagen am vierzehnten Tag nach der Aussaat mit OD-Werten von 1,765

beziehungsweise 2,094 deutlich über den Nachweisgrenzen von 0,076

beziehungsweise 0,098 (Tab. 3.14).

ERGEBNISSE

110

Tabelle 3.14: OD-Wert von Proben verschiedener Saatgutpartien im TAS-ELISA bei der

Ankeimmethode auf Papier.

OD-Werte über einer Nachweisgrenze von 0,076 (Ausgangssaatgut, Aussaat 2007)

beziehungsweise 0,098 (Aussaat 2008, Aussaat 2009) galten als A. valerianellae-positiv

(gekennzeichnet durch ein +).

OD-Wert (TAS-ELISA) nach

feuchter Inkubation der Samen für

verschiedene Tage nach Aussaat Saatgutpartie

Tag 0 Tag 4 Tag 9 Tag 14

AV-60 (gesund, ungebeizt) 0 0 0 0

AV-60 (gesund, gebeizt) 0,01 0 0 0

Aus

gang

ssaa

tgut

AV-60 (gesund, entbeizt) 0 0 0 0

AV-75 (kontaminiert, ungebeizt) 0,15+ 0 0 0

AV-75 (kontaminiert, gebeizt) 0,03 0 0 0,03

Aus

gang

ssaa

tgut

AV-75 (kontaminiert, entbeizt) 0,04 0,01 0,01 0,04

AV-61, Deutschland (gesund) 0 0 0 0,02

AV-76, Deutschland

(kontaminiert) 0,03 0 0,03 1,76+

AV-63, Frankreich (gesund) 0 0 0 0,01

Aus

saat

200

7

AV-78, Frankreich

(kontaminiert) 0 0 0 0,01

ERGEBNISSE

111


OD-Wert (TAS-ELISA) nach

feuchter Inkubation der Samen für

verschiedene Tage nach Aussaat Saatgutpartie


AV-62 (gesund) 0 0 0 0

Aus

saat

200

8

AV-77 (kontaminiert) 0 0,03 0 0

AV-64, Tröpfchen

(gesund) 0 0 0 2,09+

AV-79, Tröpfchen

(kontaminiert) 0 0 0 0

AV-65, Regner

(gesund) 0 0 0 0

Aus

saat

200

9

AV-80, Regner

(kontaminiert) 0 0 0 0

ERGEBNISSE

112

3.4.1.3 Bestimmungen durch Fremdfirmen

Freundlicherweise wurden Saatgutpartien aus dem Versuch zum Übertragungsweg

Saatgut von zwei Fremdfirmen auf ihre Kontamination mit A. valerianellae

untersucht.

So wurde das Saatgut bei den Firmen Enza Zaden und Rijk Zwaan im Sweatbox-Test

in Kombination mit einer PCR-Methode auf eine A. valerianellae-Belastung

untersucht. Beide Firmen bonitierten das nicht-infizierte Ausgangssaatgut (AV-60)

als nicht-symptomzeigend und entnommene Pflanzenproben waren PCR-negativ.

Pflanzen aus der kontaminierten Partie (AV-75) zeigten Symptome und im PCR-

Verfahren war A. valerianellae nachweisbar.

Bei den nach Aussaat im Jahr 2007 produzierten und 2008 geernteten Partien in

Deutschland und Frankreich war bei Enza Zaden keine Untersuchung der Samen

möglich. Zum einen keimte das Saatgut aus Deutschland (AV-61 (gesund) und

AV-76 (kontaminiert)) nicht, zum anderen wurde das gekeimte Saatgut aus

Frankreich (AV-63 (gesund) und AV-78 (kontaminiert)) zu schnell von Pilzen

überwachsen. Bei Rijk Zwaan war ebenfalls keine Untersuchung der Saatgutpartien,

die in Deutschland produziert wurden, möglich. Die Saatgutpartien, die in Frankreich

produziert wurden, wurden von Rijk Zwaan als nicht befallen (AV-63 (gesund))

beziehungsweis als befallen (AV-78 (kontaminiert)) identifiziert.

Die nach Aussaat im Jahr 2008 im Folgejahr geernteten Saatgutpartien (AV-62

(gesund) und AV-77 (kontaminiert)) waren nach Untersuchung von Enza Zaden mit

A. valerianellae belastet, während die Saatgutpartie, die aus gesundem

Ausgangssaatgut produziert wurde, laut Rijk Zwaan gesund und die, die aus

infiziertem Saatgut produziert wurde, infiziert war.

Die im Jahr 2010 geernteten vier Saatgutpartien (Aussaat 2009) waren laut

Untersuchung von Enza Zaden alle negativ. Die Untersuchung derselben

Saatgutpartien bei Rijk Zwaan erbrachte keine Ergebnisse, da die Proben zu stark mit

Pilzen kontaminiert waren (Tab. 3.15).

ERGEBNISSE

113

Tabelle 3.15: Nachweis von A. valerianellae in zwölf Saatgutpartien im Sweatbox-Test in

Kombination mit einer PCR bei den Firmen Enza Zaden und Rijk Zwaan. 1 keine Keimung des Saatgutes, daher keine visuelle Bonitur und Probenahme möglich 2 gekeimtes Saatgut stark von Pilzen überwachsen, keine Auswertung möglich


Saatgutpartie

Enza Zaden Rijk Zwaan

AV-60

(gesund) - -

Ausgangssaatgut

(ungebeizt) AV-75

(kontaminiert) + +

AV-61,

Deutschland

(gesund)

AV-76,

Deutschland

(kontaminiert)

1 1

AV-63,

Frankreich

(gesund)

-

Aussaat 2007

AV-78,

Frankreich

(kontaminiert)

2

+

AV-62

(gesund) + -

Aussaat 2008 AV-77

(kontaminiert) + +

ERGEBNISSE

114

Fortsetzung Tab 3.15


Saatgutpartie

Enza Zaden Rijk Zwaan

AV-64,

Tröpfchen

(gesund)

-

AV-65,

Regner

(gesund)

-

AV-79,

Tröpfchen

(kontaminiert)

-

Aussaat 2009

AV-80,

Regner

(kontaminiert)

-

2

ERGEBNISSE

115

3.4.2 Dekontaminationsmaßnahmen

3.4.2.1 Überprüfungen einer Warmwasserbehandlung

In den Jahren von 2006 bis 2009 wurden zunächst an gesundem Saatgut der Sorte

AV-1 (Kalibrierung 2,00-2,25) Behandlungen mittels Warmwasserbeize und deren

Wirkungen auf die Keimfähigkeit überprüft, um Grenzwerte zu ermitteln, ab denen

ein nicht tolerierbarer Keimfähigkeitsverlust auftrat. So wurden Behandlungen bei

30 °C für 120 Minuten, 35 °C für 90 Minuten, 40 °C für 60 Minuten, 50 °C für

40 Minuten, 55 °C für 30 und 40 Minuten und bei 60 °C für 10 und 20 Minuten

durchgeführt, die sich aufgrund hoher Verluste in der Keimfähigkeit als ungeeignet

erwiesen (Ergebnisse nicht dargestellt). Außerdem war der mit den Jahren natürliche

Verlust an Keimfähigkeit durch die Lagerung der Samen zu erkennen. Erstaunlich

war, dass ein und dieselbe Behandlung (gleiche Temperatur und Einwirkzeit) in

verschiedenen Jahren einen unterschiedlichen Einfluss auf die Keimfähigkeit hatte

(Ergebnisse nicht dargestellt). Grundsätzlich nahm die Keimfähigkeit mit steigenden

Temperaturen und steigenden Einwirkzeiten tendenziell ab.

Behandlungen bei 43 °C für 20 Minuten, 47 °C für 45 Minuten, 50 °C und 55 °C für

jeweils 10 und 20 Minuten und bei 60 °C für 5 Minuten erwiesen sich hingegen als

tolerierbar in Bezug auf die Keimfähigkeit. So kam es bei der Warmwasserbeizung

bei 55 °C für 20 Minuten zu einer Abnahme der Keimfähigkeit von 20 %, die

Keimfähigkeiten der Samen der anderen Warmwasserbehandlungen reduzierten sich

lediglich um 3,2 % (Abb. 3.23 A).

Dieses Ergebnis wurde mit den Saatgutsorten AV-220 (Kalibergröße 2,00-2,25),

AV-17 (Kalibergröße 2,00-2,25) und AV-219 (Kalibergröße 2,00-2,25) überprüft. So

war die Keimfähigkeit der Samen der Sorte AV-220 nach Behandlung bei 55 °C für

20 Minuten lediglich um 2,5 % in ihrer Keimfähigkeit (89,8 %) in Bezug auf die

unbehandelte Variante (Kontrolle, Keimfähigkeit 92,3 %) reduziert, während die

Keimfähigkeit durch die anderen sechs Behandlungen teilweise auf 98,3 %

(Behandlung für 20 Minuten bei 43 °C) gesteigert wurde (Abb. 3.23 B). Das gleiche

Bild zeigte sich nach entsprechender Behandlung der Samen bei der Sorte AV-17.

Eine deutliche Reduzierung der Keimfähigkeit zeigte sich auch hier nur bei den

ERGEBNISSE

116

Samen, die bei 55 °C für 20 Minuten warmwasserbehandelt wurden. So keimten

78 % dieser Samen gegenüber gekeimten Samen in der Kontrolle (93 %). Andere

warmwasserbehandelte Samen zeigten eine Steigerung der Keimfähigkeit. Bei den

Behandlungen bei 50 °C für 20 Minuten und bei 60 °C für 5 Minuten steigerte sich

die Keimfähigkeit auf 98 % (Abb. 3.23 C). Die Keimfähigkeit der Samen der Sorte

AV-219 wurde nach 20-minütiger Behandlung bei 43 °C minimal gesteigert (von

97,3 % in der Kontrolle auf 98,8 %). Die Behandlungen bei höheren Temperaturen

führten insgesamt zur Reduzierung der Keimfähigkeit. Nach einer Behandlung bei

47 °C für 45 Minuten keimten 49,5 % der Samen. Eine Behandlung bei 50 °C für

20 Minuten (62,3 %) sowie bei 55 °C für 10 (58 %) und 20 Minuten Behandlungszeit

(33 %) und bei 60 °C für 5 Minuten (69,5 %) führte zu Keimfähigkeitsreduzierungen

(Abb. 3.23 D).

Ebenso wurden diese Warmwasserbehandlungen auf ihre Eignung als

Dekontaminationsmaßnahme an den infizierten Sorten AV-17 (2009, Kalibergröße

2,00-2,25) und AV-219 (2009, Kalibergröße 2,00-2,25) überprüft. Die

Dekontaminationswirkung wurde mittels Ankeimmethode auf Papier und TAS-

ELISA geprüft. Die Samen beziehungsweise Keimlinge wurden an den Tagen null,

vier, neun und 14 nach der Aussaat mit Extraktionspuffer homogenisiert (je 0,2 g

Samen plus 3 ml Puffer) und im ELISA analysiert. Als kontaminiert galten die

Saatgutproben von Keimlingen, die nach vier, neun oder 14 Tagen höhere OD-Werte

als zum Zeitpunkt null erreichten, da steigende OD-Werte auf eine Vermehrung von

A. valerianellae deuten.

Unbehandelte Samen der Sorte AV-17 erreichten einen OD-Wert von 0,132 am Tag

null, vier Tage nach der Aussaat wurde ein OD-Wert von 0,091 gemessen, während

die Werte für den neunten (OD-Wert 0,807) und 14. Tag (OD-Wert 2,88) nach

Aussaat deutlich oberhalb des ursprünglichen Wertes von 0,132 lagen. Samen, die

für 20 Minuten bei 43 °C warmwasserbehandelt wurden, zeigten einen Anfangs-OD-

Wert von 0,224. Am Tag vier reduzierte sich der OD-Wert auf 0,068, um am neunten

Tag deutlich anzusteigen (OD-Wert 1,498) und erneut auf einen OD-Wert von 0,193

am Tag 14 zurückzufallen. Ebenso reagierten die Samen, die für 45 Minuten bei

47 °C behandelt wurden. Auch hier fiel der OD-Wert von zunächst 0,046 (Tag null)

ERGEBNISSE

117

auf 0,032 (Tag vier) ab, stieg auf einen OD-Wert von 0,213 (Tag neun) an und fiel

erneut ab (OD-Wert 0,099, Tag 14). Nach einer Behandlung bei 50 °C für

10 Minuten lagen die OD-Werte bei 0,153 (Tag null), 0,11 (Tag vier), 0,735 (Tag

neun) und 0,324 (Tag 14). Nach 20-minütiger Behandlung bei 50 °C stiegen die OD-

Werte kontinuierlich von 0,132 (Tag null) auf 0,363 (Tag 14) an. Eine 10-minütige

Behandlung bei 55 °C lieferte ebenfalls eine Zunahme der OD-Werte von Beginn

0,068 (Tag null) auf 0,257 am 14. Tag. OD-Werte von Samen, die für 20 Minuten in

55 °C warmem Wasser behandelt wurden, lagen anfangs bei 0,353, fielen auf über

die Hälfte auf 0,148 (Tag vier) ab, stiegen deutlich auf 0,392 (Tag neun) an und

fielen erneut auf 0,184 (Tag 14). Bei 60 °C für 5 Minuten behandelte Samen lieferten

einen kontinuierlichen Anstieg der OD-Werte von Tag null zu Tag 14 von 0,073 auf

0,932 (Abb. 3.24 A).

Alle OD-Werte behandelter Samen, mit Ausnahme der für 20 Minuten bei 55 °C

durchgeführten Behandlung, waren an mindestens einem Termin zwischen Tag vier

und 14 im Vergleich zu Tag null eindeutig angestiegen und galten somit als

A. valerianellae belastet.

OD-Werte unbehandelter Samenproben der Sorte AV-219 zeigten einen

kontinuierlichen und eindeutigen Anstieg von Tag null (OD-Wert 0,118) auf Tag 14

(OD-Wert 1,585). Samen, die für 20 Minuten bei 43 °C warmwasserbehandelt

wurden, wiesen einen kurzfristigen Anstieg der OD-Werte von 0,013 (Tag null) auf

0,092 (Tag vier) und 0,079 am neunten Tag auf, während der OD-Wert am vierten

Auswertungstag auf 0,013 abfiel (Tag 14). Innerhalb der vierzehntägigen

Untersuchungsdauer stiegen die OD-Werte von Samen, die für 45 Minuten bei 47 °C

behandelt wurden, von 0,063 (Tag null) über 0,068 (Tag neun) auf 0,394 (Tag 14)

an. Nach Behandlung bei 50 °C für eine 10-minütige Dauer lag der OD-Wert zu

Beginn bei 0,044, fiel etwas innerhalb von vier Tagen auf 0,033 (Tag vier) ab und

stieg am neunten und 14. Tag auf OD-Werte von 0,964 und 1,785 an. Nach einer 20-

minütigen Behandlungszeit bei 50 °C stieg der OD-Wert ebenfalls an, von anfänglich

0,108 (Tag null) auf 1,356 (Tag 14). Nach einer Behandlung bei 55 °C für 10 und 20

Minuten stiegen die OD-Werte ebenso innerhalb der vierzehntägigen

Untersuchungsdauer an. Anfängliche OD-Werte von 0,013 (55 °C, 10 Minuten)

beziehungsweise 0,094 (55 °C, 20 Minuten) stiegen auf 1,469 (Tag 14 nach

ERGEBNISSE

118

10-minütiger Behandlung) beziehungsweise 0,833 (Tag neun nach 20-minütiger

Behandlung) an. Die 5-minütige Samenbehandlung bei 60 °C führte zu geringen OD-

Werten. Am ersten Untersuchungstag (Tag null) wurde ein OD-Wert von 0,03

gemessen, am Tag vier ein OD-Wert von 0,015, am Tag neun ein OD-Wert von

0,004 und 14 Tage nach Untersuchungsbeginn ein OD-Wert von 0,056. Alle OD-

Werte behandelter Samen, mit Ausnahme der für 20 Minuten bei 43 °C und für

5 Minuten bei 60 °C durchgeführten Behandlungen, waren an mindestens einem der

drei Untersuchungstage zwischen Tag vier und 14 im Vergleich zu Tag null

eindeutig angestiegen. Die entsprechenden Saatgutpartien waren demzufolge

weiterhin als mit A. valerianellae anzusehen (Abb. 3.24 B).

Warmwasserbehandlungen haben somit einen Einfluss auf gesundes und mit

A. valerianellae kontaminiertes Saatgut in Bezug auf die Keimfähigkeit und den

A. valerianellae-Befall. Die Keimfähigkeiten nahmen mit steigenden Temperaturen

und Einwirkzeiten grundsätzlich ab, dennoch reagierten die behandelten

Saatgutpartien der Sorten unterschiedlich. Die Untersuchungen im TAS-ELISA

lieferten in der Regel geringere OD-Werte als die unbehandelte Kontrolle. Das deutet

auf Befallsreduzierungen durch die Warmwasserbehandlungen hin. Der

befallsreduzierende Effekt war sortenabhängig.

ERGEBNISSE

119

a

a

aaaaaa

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

20 Min. 45 Min. 10 Min. 20 Min. 10 Min. 20 Min. 5 Min.

Kontrolle 43 °C 47 °C 50 °C 50 °C 55 °C 55 °C 60 °C

Behandlung

Kei

mfä

higk

eit i

n %

ba

ababababbab

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100



Behandlung

Kei

mfä

higk

eit i

n %

Abbildung 3.23: Keimfähigkeit von warmwasserbehandelten Samen aus dem Jahr

2009. (A): Sorte AV-1, gesund, 2006, Kalibrierung 2,00 – 2,25. (B): Sorte AV-220,

gesund, 2009, Kalibrierung 2,00 – 2,25. (C): Sorte AV-17, kontaminiert mit

A. valerianellae, 2009, Kalibrierung 2,00 – 2,25. (D): Sorte AV-219, kontaminiert

mit A. valerianellae, 2009, Kalibrierung 2,00 – 2,25.




A

B

ERGEBNISSE

120

b

a

abbabababab

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100



Behandlung

Kei

mfä

higk

eit i

n %

bc c

ab

abc

abcabc

a

abc

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100



Behandlung

Kei

mfä

higk

eit i

n %

Fortsetzung Abbildung 3.23:

C

D

ERGEBNISSE

121

0

0,5

1

1,5


feuchte Inkubation

OD

-Wer

t

unbehandelt 43 °C 20 Min. 47 °C 45 Min. 50 °C 10 Min.

50 °C 20 Min. 55 °C 10 Min. 55 °C 20 Min. 60 °C 5 Min.

0

0,5

1

1,5


feuchte Inkubation

OD

-Wer

t

unbehandelt 43 °C 20 Min. 47 °C 45 Min. 50 °C 10 Min.

50 °C 20 Min. 55 °C 10 Min. 55 °C 20 Min. 60 °C 5 Min.

Abbildung 3.24: OD-Wert im TAS-ELISA (nach 60 Minuten) nach 0, 4, 9 und 14 Tagen

Inkubation in der Ankeimmethode auf Papier von warmwasserbehandelten Samen der

A. valerianellae-kontaminierten Sorten AV-17 (A) und AV-219 (B).

B

A 2,88

1,785 1,585

Inkubationsdauer (Tage)

Inkubationsdauer (Tage)

0 4 9 14

14 0 4 9

ERGEBNISSE

122

3.4.2.2 Überprüfungen einer Dampfdesinfektion

Dankenswerterweise wurde das gesunde Saatgut (AV-220, 2009) und das mit

A. valerianellae kontaminierte Saatgut (AV-17, 2009 und AV-219, 2009) durch das

Eidgenössische Volkswirtschaftsdepartement EVD, Forschungsanstalt Agroscope

Changins-Wädenswil ACW mit der Dampfdesinfektion behandelt. Die

Dampfdesinfektionsmaßnahme wurde sowohl bei 66 °C für 90 und für 105 Sekunden

(am 13.07.2010) als auch bei 64 °C für 120 und 150 Sekunden (am 14.09.2010)

durchgeführt. Nach der Rücktrocknung wurde die Keimfähigkeit (auf Wasseragar bei

20 °C) und die A. valerianellae-Kontamination des Saatguts untersucht.

Diese Dampfdesinfektionen beeinflussten die Keimfähigkeit der Samen

weitestgehend positiv (Tab. 3.16 und Abb. 3.25). So betrug der Wert der

Keimfähigkeit der gesunden Saatgutpartie (AV-220) vor der Dampfdesinfektion

98 %, während er nach Desinfektion bei 66 °C leicht verringert (94 % nach

90-sekündiger Behandlung) beziehungsweise erhöht (100 % nach 105-sekündiger

Desinfektion) war. Die Keimfähigkeit der kontaminierten Sorte AV-219 wurde nicht

(94 % vor und nach Behandlung bei 66 °C für 90 Sekunden) oder nur geringfügig

abgeschwächt (88 % nach Behandlung bei 66 °C für 105 Sekunden), während die

Keimfähigkeit der Sorte AV-17 nach jeder Behandlung erhöht war. So wurde die

Ausgangskeimfähigkeit von 86 % auf 94 % (90-sekündige Behandlung)

beziehungsweise 100 % (105-sekündige Behandlung) erhöht.

Durch die Dampfdesinfektion bei 64 °C wurden Keimfähigkeiten reduziert. So

wurde bei der Sorte AV-220 eine Ausgangskeimfähigkeit von 92 % ermittelt, bei der

Sorte AV-219 keimten 84 % und bei der Sorte AV-17 88 %. Nach 120-sekündiger

Behandlung mit 64 °C heißem Dampf keimten 96 % (nach 120-sekündiger

Behandlung) der Samen der Sorte AV-220, während nach 150-sekündiger

Behandlung 90 % der Samen keimten. Die Samen der Sorte AV-219 erreichten durch

beide Dampfdesinfektionen nicht den Keimfähigkeitswert vor der Behandlung. Nach

120 Sekunden keimten 80 %, nach 150 Sekunden 74 % der Samen. Die

Keimfähigkeit der Samen der Sorte AV-17 wurde erhöht (auf 96 % nach

120-sekündiger Behandlung und auf 98 % nach 150-sekündiger Desinfektion).

Nach beiden Dampfdesinfektionen wurde beobachtet, dass der Befall mit

anhaftenden Pilzen (Phoma, Cladosporium, Stemphylium, Rhizopus) rückläufig war.

ERGEBNISSE

123

Sie waren nach der Behandlung kaum beziehungsweise gar nicht mehr vorhanden

(nicht dargestellt).

Eine Überprüfung der Keimfähigkeit dampfbehandelter Samen auf Filterpapier und

bei kühlen, dunklen Bedingungen (wie in Kapitel 2.6 beschrieben) lieferte ein

ähnliches Ergebnis (Abb. 3.25). Die Keimfähigkeit der Sorte AV-220 betrug vor der

Behandlung 92 %, die durch die Dampfdesinfektion bei 66 °C sowohl für 90 als auch

für 105 Sekunden auf 96 % (90 Sekunden) beziehungsweise 93 % (105 Sekunden)

gesteigert werden konnte. Eine Dampfdesinfektion bei 64 °C (bei 120- und

150-sekündiger Behandlung) hatte eine Reduzierung der Keimfähigkeit auf 87 % zu

Folge. Die Keimfähigkeit der Sorte AV-219 wurde sowohl nach Behandlung bei

66 °C als auch nach Behandlung bei 64 °C reduziert. Bei beiden Temperaturen

wurde jeweils eine geringere Keimfähigkeit bei länger einwirkender

Desinfektionsphase erzielt. Stärkste Einbußen waren nach Behandlung bei 64 °C für

150 Sekunden (auf 79 %) sichtbar.

Die Keimfähigkeit der Sorte AV-17 wurde durch eine Dampfdesinfektion in allen

Fällen gesteigert. Vor der Behandlung betrug die Keimfähigkeit 90 %, nach der

Behandlung bei 66 °C hingegen 98 % beziehungsweise nach Behandlung bei 64 °C

97 % (120 Sekunden) oder 93 % (nach 150 Sekunden).

Die Dekontaminationswirkung der Dampfdesinfektion wurde ebenso wie die

Warmwasserbehandlung an den Sorten AV-17 und AV-219 mittels Ankeimmethode

auf Papier im Vergleich zu unbehandelten Samen kontrolliert.

OD-Werte der Tage null bei jeder Dampfbehandlung wurden als Schwellenwerte für

die jeweilig erzielten OD-Werte der Behandlungen für den vierzehntägigen

Versuchszeitraum für die Ankeimmethode auf Papier herangezogen. Unbehandelte

Samen der Sorte AV-17 erreichten am Tag null einen OD-Wert von 0,904. Dieser

hohe Wert verringerte sich zunächst am vierten Tag auf einen OD-Wert von 0,362,

steigerte sich jedoch auf einen OD-Wert von 3,279 (Tag neun) und auf 3,317

(Tag 14). Dampfbehandelte Samen, die für 90 Sekunden bei 65 °C behandelt wurden

zeigten zu Beginn einen OD-Wert von 0,468 (Tag null), vom vierten über den

neunten bis zum 14. Tag verringerten sich jedoch die OD-Werte von 0,741 über

0,315 auf 0,105. Die Behandlung, die ebenfalls bei 65 °C und für 105 Sekunden

ERGEBNISSE

124

durchgeführt wurde, zeigte einen kontinuierlichen Anstieg der OD-Werte von

anfänglich 0,625 (Tag null) auf 2,566 (Tag 14). Nach einer Dampfbehandlung bei

64 °C für 120 Sekunden wurde am Tag null ein OD-Wert von 0,361 erreicht, der

dann auf 0,243 (Tag vier) abfiel, um nach neun beziehungsweise 14 Tagen auf einen

OD-Wert von 0,72 und 2,851 anstieg. Nach einer Behandlung bei 64 °C für

150 Sekunden ergab sich zu Beginn ein OD-Wert von 0,628. Nach vier Tagen fiel

der OD-Wert auf 0,577, um nach neun Tagen auf 1,055 anzusteigen und nach

14 Tagen erneut auf einen OD-Wert von 0,061 abzufallen (Abb. 3.26 A).

Bei der Untersuchung von Keimlingen beziehungsweise Pflanzen aus unbehandelten

Samen der Sorte AV-219 zeigte sich ein ähnliches Bild wie bei der Sorte AV-17.

OD-Werte unbehandelter Samen der Sorte AV-219 stiegen über den vierzehntägigen

Zeitraum der Untersuchung für die Ankeimmethode auf Papier nahezu kontinuierlich

an. Zu Beginn wurde ein OD-Wert von 0,497 (Tag 0) gemessen, der sich auf einen

hohen OD-Wert von 3,143 (Tag 14) steigerte. Samen, die nach einer

Dampfbehandlung bei 66 °C für 90 Sekunden untersucht wurden, erreichten

geringere OD-Werte. Zum Zeitpunkt null wurde dabei ein anfänglicher OD-Wert von

0,117 gemessen, am vierten Tag nach Aussaat wurde ein OD-Wert von 0,069

gemessen. Zum neunten Tag nach Aussaat wurde ein OD-Wert von 0,266 ermittelt

während am Tag 14 lediglich ein OD-Wert von 0,007 erzielt wurde. Nach einer

Dampfbehandlung für 105 Sekunden (bei 66 °C) wurde zunächst ein OD-Wert von

0,191 (Tag 0) gemessen, nach vier Tagen von 0,077, nach neun Tagen von 0,031 und

abschließend (Tag 14) von 0,175. OD-Werte nach einer 120-sekündigen Behandlung

bei 64 °C lagen bei 0,188 (Tag 0), 0,437 (Tag 4), 0,027 (Tag 9) und bei 0,0003 (Tag

14). Nach einer 150-sekündigen Behandlung bei 64 °C stiegen die OD-Werte von

0,081 (Tag 0) kontinuierlich auf 2,658 (Tag 14) an (Abb. 3.26 B).

Die Behandlung mit Dampf hatte bezüglich Keimfähigkeit und Dekontamination

einen Einfluss auf die Samen. Die Keimfähigkeit war nach Dampfbehandlung

lediglich bei der Sorte AV-219 signifikant von den unbehandelten Samen

verschieden und führte zu verminderten Keimfähigkeiten. Nach Durchführung der

Ankeimmethode auf Papier wurden bei der Sorte AV-17 keine durchgängigen

Verringerungen der OD-Werte erzielt, während bei der Sorte AV-219 die

ERGEBNISSE

125

Behandlung bei 66 °C für 105 Sekunden einen positiven, dekontaminierenden

Einfluss zu haben schien.

Tabelle 3.16: Keimfähigkeit (in % bei 20 °C und 12 Stunden Licht pro Tag) drei verschiedener

Feldsalatsorten nach Behandlung mit Dampf bei 66 °C für 90 beziehungsweise 105 Sekunden

und bei 64 °C für 120 beziehungsweise 150 Sekunden im Vergleich zur nicht-behandelten

Kontrolle.

Keimfähigkeit (%)

Dampfdesinfektion AV-17,

kontaminiert

AV-219,

kontaminiert

AV-220,

gesund

unbehandelt

(vor Behandlung bei 66 °C) 86 94 98

66 °C,

90 Sekunden 94 94 94

66 °C,

105 Sekunden 100 88 100

unbehandelt

(vor Behandlung bei 64 °C) 88 84 92

64 °C,

120 Sekunden 96 80 96

64 °C,

150 Sekunden 98 74 90

ERGEBNISSE

126

a a a b ab a aa a

0102030405060708090

100

unbe

hand

elt

66

°C,

90S

eku

nde

n

66

°C

, 105

Sek

und

en

unbe

hand

elt

66

°C,

90S

eku

nde

n

66

°C

, 105

Sek

und

en

unbe

hand

elt

66

°C,

90S

eku

nde

n

66

°C

, 105

Sek

und

en

AV-17 AV-219 AV-220

Sorte

Kei

mfä

higk

eit i

n %

aaa

aab

ba

aa

0102030405060708090

100

unb

ehan

del

t

64 °

C,

120

Sek

und

en

64 °

C,

150

Sek

und

en

unb

ehan

del

t

64 °

C,

120

Sek

und

en

64 °

C,

150

Sek

und

en

unb

ehan

del

t

64 °

C,

120

Sek

und

en

64 °

C,

150

Sek

und

en

AV-17 AV-219 AV-220

Sorte

Kei

mfä

higk

eit i

n %

Abbildung 3.25: Keimfähigkeit (in % bei 4 °C unter Lichtausschluß) drei verschiedener

Feldsalatsorten nach Behandlung mit Dampf bei (A) 66 °C für 90 beziehungsweise

105 Sekunden und bei (B) 64 °C für 120 beziehungsweise 150 Sekunden im Vergleich

zur unbehandelten Kontrolle.



(p < 0,05).

B

A

ERGEBNISSE

127

0

0,5

1

1,5

2


feuchte Inkubation

OD

-Wer

t

unbehandelt 66 °C 90 Sek. 66 °C 105 Sek.

64 °C 120 Sek. 64 °C 150 Sek.

0

0,5

1

1,5

2


feuchte Inkubation

OD

-Wer

t

unbehandelt 66 °C 90 Sek. 66 °C 105 Sek.

64 °C 120 Sek. 64 °C 150 Sek.

Abbildung 3.26: OD-Wert im TAS-ELISA (nach 60 Minuten) nach Homogenisierung von

dampfbehandelten Samen der A. valerianellae-kontaminierten Sorten AV-17 (A) und

AV-219 (B) (Ankeimmethode auf Papier).

A

B

3,317 2,851

2,566

3,143 2,658

ERGEBNISSE

128

3.4.2.3 Überprüfungen einer weiteren Dekontaminationsmaßnahme

Das Saatgut der drei Sorten AV-220, AV-219 und AV-17 wurden von einer für

Saatgutbehandlungen spezialisierten Firma behandelt. Zur Firma und zu der

Methodik der Behandlung dürfen keine Angaben gemacht werden.

Die Keimfähigkeiten der drei Sorten lagen vor der Behandlung über einem Wert von

90 %, während die Keimfähigkeiten nach Behandlung etwas erhöht (Sorte AV-220

und Sorte AV-17) beziehungsweise erniedrigt (Sorte AV-219) waren. So war bei der

Sorte AV-220 ein um 2 Prozentpunkte erhöhter Wert in der Keimfähigkeit auf 94 %

vorhanden, während bei der Sorte AV-17 die Keimfähigkeit von 90 % auf 97 %

gesteigert wurde. Die Sorte AV-219 zeigte durch die Behandlung eine

Keimfähigkeitsreduzierung von 98 % auf 95 %. Diese Behandlung führte jedoch bei

allen drei Sorten zu keinen signifikanten Unterschieden in der Keimfähigkeit

(Abb. 3.27).

Eine Überprüfung der Dekontaminationswirkung durch diese Maßnahme erfolgte

mittels Ankeimmethode auf Papier im Vergleich zur unbehandelten Variante.

Vor einer Behandlung wurden bei der Sorte AV-17 hohe OD-Werte von 0,904 zum

Zeitpunkt null und nach 14 Tagen von 3,317 gemessen. Nach einer Behandlung

durch den Dienstleister stiegen die OD-Werte von 0,645 (Tag null) auf 2,898

(Tag neun) und auf 3,075 am 14. Tag nach Aussaat (Abb. 3.28 A).

Die mittels TAS-ELISA erzielten Ergebnisse lieferten über den vierzehntägigen

Zeitraum bei den unbehandelten Samen der Sorte AV-219 einen Anfangs-OD-Wert

von 0,497 (Tag null), der sich kontinuierlich auf 3,143 (Tag 14) steigerte. OD-Werte

behandelter Samen lagen an Tag null bei 0,108, nach vier Tagen bei einem OD-Wert

von 0,048 und stiegen dann ebenfalls kontinuierlich auf 3,016 (Tag 14) an

(Abb. 3.28 B).

Die Saatgutbehandlung durch den Dienstleister führte im Gegensatz zu

Warmwasserbehandlungen und Dampfbehandlungen lediglich zu geringen Effekten.

ERGEBNISSE

129

So kam es zu einer zu vernachlässigbaren Veränderung in der Keimfähigkeit. Aber

auch eine Dekontaminationswirkung war nicht festzustellen.

aaaa aa

0102030405060708090

100

unb

ehan

delt

Beh

andl

ung

Die

nstle

iste

r

unb

ehan

delt

Beh

andl

ung

Die

nstle

iste

r

unb

ehan

delt

Beh

andl

ung

Die

nstle

iste

r

AV-17 AV-219 AV-220

Sorte

Kei

mfä

higk

eit i

n %

Abbildung 3.27: Keimfähigkeit (in % bei 4 °C unter Lichtausschluß) drei verschiedener

Feldsalatsorten nach Behandlung durch einen Dienstleister im Vergleich zur

unbehandelten Kontrolle.



ERGEBNISSE

130

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4


feuchte Inkubation

OD

-Wer

t

unbehandelt Behandlung Dienstleister

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4


feuchte Inkubation

OD

-Wer

t

unbehandelt Behandlung Dienstleister

Abbildung 3.28: OD-Wert im TAS-ELISA (nach 60 Minuten) der mit A. valerianellae-

kontaminierten Sorten AV-17 (A) und AV-219 (B) zwischen Tag null und Tag 14 nach

Aussaat auf angefeuchtetem Filterpapier und Inkubation bei Raumtemperatur

(Ankeimmethode auf Papier).

Die Samen waren unbehandelt beziehungsweise durch einen Dienstleister behandelt

worden.

A

B

DISKUSSION

131

4 DISKUSSION

Mit den durchgeführten Untersuchungen zu Acidovorax valerianellae an Feldsalat

wurden Erkenntnisse im Bereich der Erregerbiologie und Epidemiologie sowie des

Einflusses von Infektionsbedingungen auf den Krankheitsverlauf gewonnen. Zudem

wurden grundlegende Erkenntnisse zu Übertragungswegen und zu

Bekämpfungsstrategien von A. valerianellae gewonnen.

4.1 Untersuchungen zu Infektionsbedingungen

In den Untersuchungen zu den Infektionsbedingungen des Bakteriums wurden die

Einflüsse von Temperatur, Blattalter, Blattnässedauer und Inokulumdichte erforscht.

Nach GARDAN et al. (2003) und HINRICHS-BERGER et al. (2004) kann das Bakterium

A. valerianellae Pflanzen sowohl im Keimblattstadium als auch Pflanzen im

Laubblattstadium infizieren und zu Symptomen führen. Dies bestätigte sich in den

Versuchen, in denen Pflanzen unterschiedlichen Blattalters inokuliert wurden

(Kapitel 3.1.2). Der Befall an Feldsalatpflanzen war zudem innerhalb der

Infektionsversuche sehr von den vorherrschenden Luftfeuchtigkeiten

beziehungsweise der Blattnässedauer abhängig. Die Versuchspflanzen wurden

einmalig für 48 Stunden, wöchentlich wiederkehrend (jeweils von 48-stündiger

Dauer) oder dauerhaft unter gesättigter Luftfeuchte kultiviert (Kapitel 2.12.2).

Allgemein fiel ein starker Unterschied zwischen der Symptomatik inokulierter

Pflanzen auf, sobald sie weitestgehend trocken kultiviert beziehungsweise bei nahezu

100 % relativer Luftfeuchte mit lang andauernder Blattnässe kultiviert wurden.

Gerade bei feuchter Witterung traten vermehrt Symptome auf. GRONDEAU und

SAMSON (2009) fanden heraus, dass ein sichtbarer A. valerianellae-Befall stark von

einem für 90 Stunden andauernden Wert von über 85 % relativer Luftfeuchtigkeit

gefördert wird. Daher sollten Feldsalatbestände möglichst trocken gehalten werden,

um einen Befall mit A. valerianellae zu vermeiden beziehungsweise zu vermindern

(MOLTMANN et al., 2000). Alle Pflanzen, die bei eigenen Versuchen nach der

Inokulation lediglich für die ersten 48 Stunden bei gesättigter Luftfeuchte kultiviert

DISKUSSION

132

wurden, zeigten keine Symptome. Alle Pflanzen, die dauerhaft bei gesättigter

Luftfeuchte kultiviert wurden, waren zu Versuchende Symptom tragend. Bei

Pflanzen, die im wöchentlichen Abstand bei hoher Luftfeuchtigkeit (das heißt für die

ersten 48 Stunden erfolgte die Kultivierung nach der Inokulation bei gesättigter

Luftfeuchte, dann fünf Tage bei normal vorherrschender Luftfeuchte, danach erneut

für 48 Stunden bei gesättigter Luftfeuchte und so fort) kultiviert wurden, zeigten sich

ebenfalls Symptome. Eine 100 %-ige Befallshäufigkeit wurde dabei aber nicht

erreicht. Es war ein deutlicher Unterschied zwischen den im Keimblatt und den im

Laubblatt inokulierten Pflanzen sichtbar, was mit einer unterschiedlichen

Blattoberfläche und -masse zusammenhing. Je weniger Blattmasse vorhanden war,

desto schneller trockneten die Blätter ab. Die Feuchtigkeit ist für die Bakterien von

enormer Wichtigkeit. So überstanden sie eine fünftägige Zeitspanne bei trockenen

Bedingungen ohne Blattnässe (wöchentlicher Abstand), wohl aber nicht eine

Trockenperiode von 30 Tagen beziehungsweise 33 Tagen bei einmaliger Kultur für

48 Stunden unter gesättigten Luftfeuchten nach der Inokulation, da zu Versuchende

keine Symptome sichtbar waren (Abb. 3.5).

Aus den Versuchen, wie sie in Kapitel 3.1.3 beschrieben sind, wird diese

Abhängigkeit zwischen Blattnässe beziehungsweise einer hohen relativen

Luftfeuchte und Symptomatik an inokulierten Feldsalatpflanzen deutlich. Nach einer

28-tägigen Kultivierung unter trockenen Bedingungen führte eine Weiterkultur bei

gesättigter Luftfeuchte zwischen 38 dpi und 51 dpi zu einer leichten Zunahme der

Befallsstärke von 3,5 % auf 4,7 % (Tab. 3.2). Ebenfalls wurde gezeigt, dass die

Bakterien innerhalb von fünf Stunden in die Pflanze eindringen und mindestens

sieben Tage unter ungünstigen, trockenen Bedingungen überleben, bevor sie bei

gesättigter Luftfeuchte zu Symptomen führen (Abb. 3.9 und Abb 3.10). Die

Bakterien lebten bei trockener Kultur der inokulierten Pflanzen nicht epiphytisch auf

der Blattoberfläche, da Symptome bereits neun Tage nach Inokulation sichtbar

waren. Wären die Bakterien erst innerhalb von zwei Tagen (ab 7 dpi) bei für sie

günstigen, feuchten Bedingungen in das Blatt eingedrungen, so wären Symptome

frühestens nach vier Tagen nach Wiederbefeuchtung beziehungsweise 11 dpi

sichtbar gewesen. Die Ergebnisse in den Abbildungen 3.1, 3.3, 3.4 und 3.5 B

belegen, dass sichtbare Symptome frühestens 4 dpi, bei Kultur unter gesättigter

DISKUSSION

133

Luftfeuchte, an Pflanzen vorhanden sind. MOLTMANN (1999) beschrieb hingegen,

dass Xanthomonas campestris pv. vitians Kopf- und Eissalatpflanzen sowie viele

Unkrautarten epiphytisch besiedelt. So kann sich diese bakterielle

Blattfleckenkrankheit so lange ohne Symptome auf der Pflanzenoberfläche halten,

wie die Witterungsbedingungen für sie zunächst ungünstig sind. Erst nach längeren

Regenperioden oder häufiger, starker Taubildung kommt es zu einem

Befallsausbruch.

Zu erkennen waren zwei grundsätzliche Ergebnisse: Der sichtbare Befall an Pflanzen

war stark von der Blattnässedauer beziehungsweise der relativen Luftfeuchte

abhängig. Ist keine für Bakterien günstige, annähernd gesättigte Luftfeuchte

vorhanden, so führt eine Inokulation nicht zu einem sichtbaren Befall an Pflanzen

(Abb. 3.5, 3.9, 3.10).

Die starke Abhängigkeit zwischen Feuchtigkeit in Form von Blattnässe und

Krankheitssymptomen wurde bei vielen Pflanzenpathogenen beschrieben. So zeigt

der Forschungsauftrag des BUNDESMINISTERIUM FÜR ERNÄHRUNG,

LANDWIRTSCHAFT UND FORSTEN (2001), dass die Krankheitsentwicklung des Pilzes

Septoria petroselini an Petersilieblättern stark von der relativen Luftfeuchtigkeit

abhängig ist. Bei einer relativen Luftfeuchte von 65 % kommt es zu einer geringen

Krankheitsentwicklung, während der Befall bei einer Erhöhung der Luftfeuchte auf

85 % deutlich ansteigt. Förderlich für den Befall ist zudem eine zeitlich direkt auf die

Inokulation folgende hohe Luftfeuchtigkeit. Aber auch nach einer längeren

Trockenphase von bis zu 72 Stunden nach der Inokulation werden hohe

Befallsstärken erzielt, wenn danach wieder feuchte Bedingungen herrschen.

LEBEN (1988) berichtet, dass sich an inokulierten Gurkenknospen keine

Pseudomonas syringae pv. lachrymans- und P. syringae pv. syringae-Bakterien

isolieren lassen, sobald die Pflanzen nach der Inokulation bei relativen Luftfeuchten

zwischen 30 % und 50 % kultiviert werden. Werden sie im Tag-/Nachtrhythmus bei

unterschiedlichen Luftfeuchten zwischen 50 % bis 60 % und 90 % kultiviert, so ist

der Nachweis intermediär. Nach Kultivierung zwischen 80 % und 90 % relativer

Luftfeuchte lassen sich jedoch aus nahezu allen Knospen Bakterien isolieren.

Eine starke Abhängigkeit zwischen dem Befall von Xanthomonas smithii ssp. citri an

Zitrusgewächsen und der Blattnässedauer wird ebenfalls berichtet. So reichen vier

DISKUSSION

134

Stunden Blattnässe aus, um bei optimalen Temperaturen zwischen 25 °C und 35 °C,

einen 100 %-igen Befall an Pflanzen hervorzurufen (PRIA et al., 2006)

Diese Ergebnisse lassen sich auf die hier vorgestellten Ergebnisse übertragen. Die

Feldsalatpflanzen zeigten, trotz zeitweiliger Verringerung der Luftfeuchtigkeit, eine

teilweise starke Erhöhung der Krankheitsentwicklung bezüglich Befallsstärke und

Befallshäufigkeit, sobald anschließend wieder feuchte Bedingungen herrschten

(Abb. 3.5, 3.7, 3.9, 3.10, Tab. 3.2). Dieser Anstieg des Kranheitsverlaufs bei erneuter

Kultivierung unter gesättigter Luftfeuchtigkeit war jedoch von der Dauer der ersten

Phase unter gesättigter Luftfeuchtigkeit abhängig. Dies wird aus den Ergebnissen der

Abbildung 3.7 deutlich. Je länger die erste Phase unter feuchten Bedingungen

andauerte, desto geringer war der Anstieg der Befallsstärke nach Wiederbefeuchten

der Feldsalatpflanzen. Inokulierte Pflanzen, die in der ersten Phase 14 Tage

beziehungsweise 18 Tage feucht inkubiert wurden (Abb. 3.7, Versuchsglieder D und

E), zeigten nach siebentägiger Kultivierung unter trockenen Bedingungen bei

Wiederbefeuchtung nur eine sehr schwache oder keine Zunahme der Befallsstärke.

Normalerweise sind geschwächte Pflanzen anfälliger gegenüber Pathogenen und

zeigen mehr Symptome. Dies trifft in diesem Fall jedoch nicht zu. Auf welchen

Grund dieses Ergebnis zurückzuführen war, konnte abschließend nicht geklärt

werden.

CAVALCANTI et al. (2005) beschreiben, dass Acidovorax avenae subsp. citrulli-

Bakterien zwischen 1 °C und 42 °C wachsen, wobei ihr Optimum bei 32 °C liegt.

A. valerianellae-Bakterien weisen hingegen auf Nährmedium ein

Wachstumsoptimum bei 28 °C auf, während unter einer Minimumtemperatur von

4 °C und über einer Maximumtemperatur von 41 °C kein Wachstum stattfindet

(GARDAN et al., 2003, JASU, 2004). Aus vorherigen Versuchen war bekannt, dass

Infektionsversuche im Bereich zwischen 10 °C bis 25 °C (GRONDEAU und SAMSON,

2009), 15 ° C (BARCHEND, 2006) und 18 °C (BRAJE, 2005) erfolgreich waren. Um

den Temperatureinfluss in vivo zu ermitteln, wurden inokulierte Feldsalatpflanzen

bei Temperaturen zwischen 10 °C und 30 °C bei gesättigten Luftfeuchten kultiviert

und hinsichtlich Befallsstärke und Befallshäufigkeit bonitiert (Kapitel 3.1.1). Da in

den letzten Jahren die Züchtung von Sommersorten zugenommen hat und somit ein

ganzjähriger Anbau möglich ist, waren diese Untersuchungen innerhalb dieser

DISKUSSION

135

Temperaturspanne sinnvoll. Im Feldsalatanbau werden durchaus tiefere (vor allem

im Winter im Freiland) beziehungsweise höhere (vor allem im Sommer bei Anbau

im Gewächshaus) Temperaturen erzielt.

Unter den getesteten Temperaturen gab es keine, bei der die inokulierten Pflanzen

keine A. valerianellae-Symptome zeigten. Eine Kultivierung der Pflanzen führte bei

allen Temperaturen unter gesättigter Luftfeuchtigkeit zu einem sichtbaren Befall. Es

waren jedoch in der Symptomausprägung und in der Symptomhäufigkeit

Unterschiede zwischen den einzelnen Temperaturstufen während der Inkubation

festzustellen. So nahmen beide Parameter mit zunehmender Temperatur während des

Versuches zu. Innerhalb einer Inkubationstemperaturstufe nahmen die Werte mit

zunehmender Dauer der Kultivierung ebenfalls zu. Eine Korrelation zwischen Befall

und Temperatur war deutlich zu erkennen. Je höher die Temperatur desto höher war

der sichtbare Befall an Feldsalatpflanzen (Abb. 3.1 und 3.2). Dies bestätigen auch

GRONDEAU und SAMSON (2009), die zeigten, dass die Anzahl befallener

Feldsalatpflanzen zunimmt, wenn die Temperatur steigt und die Phase mit

Luftfeuchten über 85 % länger als 90 Stunden andauert.

Weiterhin war in eigenen Versuchen zu erkennen, dass bei höheren Temperaturen

und gesättigter Luftfeuchte das Pflanzenwachstum nicht optimal war. Die Pflanzen

wuchsen zum einen bei höheren Temperaturen schneller, zum anderen waren sie

durch den sich weiterentwickelnden Befall geschwächt und konnten daher zur

Bonitur teilweise nicht herangezogen werden (Abb. 3.1, 30 °C, 12 dpi und Abb. 3.2,

20 °C, 25 dpi). Eine Überprüfung des Einflusses von Temperaturen zwischen 15 °C

und 25 °C auf die Infektion von Feldsalat mit A. valerianellae lieferte ein

entsprechendes Ergebnis: Befallsstärken und Befallshäufigkeiten waren umso höher,

je höher die Inkubationstemperatur lag (Abb. 3.3 und 3.4). Diese Beobachtung lässt

sich auch in anderen Wirt-Parasit-Systemen machen. So beschreiben FUKUI et al.

(1999) eine lineare Beziehung zwischen höherer Temperatur (zwischen 19 °C und

35 °C) und der in Prozent befallenen Blattfläche an Anthurium andraeanum nach

Inokulation mit Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae. LATORRE et al.

(2002 b) berichten von einer signifikant positiven Beziehung zwischen der

Temperatur (innerhalb von 5 °C und 20 °C) und dem Auftreten des Brand-Befalls an

Birnenblüten durch Pseudomonas syringae pv. syringae.

DISKUSSION

136

Die Ergebnisse, die bei Versuchen zum Einfluss auf die Infektion mit

A. valerianellae in Abhängigkeit der Temperatur, dem Blattalter von

Feldsalatpflanzen, der Blattnässedauer und der Inokulumkonzentration (Kapitel 3.1.4

und 3.2.3) erzielt wurden, waren wie erwartet. Generell waren bei höheren

Konzentrationen der verwendeten Einzel-Isolate beziehungsweise des

Isolategemisches mehr Pflanzen sichtbar erkrankt als bei geringeren Konzentrationen

(Tab. 3.3 und Abb. 3.11). Das gilt auch für die Feldsalatsorten AV-1 und AV-5

(Abb. 3.18). Die Symptome waren zudem nach Inokulation mit höheren

Inokulumdichten schneller sichtbar als nach Inokulation mit niedrigen

Konzentrationen (Tab. 3.3). Das Ergebnis zeigte einen für Inokulumdichten

typischen Gradienten. Da die inokulierten Pflanzen dauerhaft bei gesättigten

Luftfeuchten kultiviert wurden, scheint das Ergebnis nicht weiter verwunderlich. So

wurden schon mit einer geringen Konzentration von 102 cfu/ml Feldsalatpflanzen

inokuliert und zeigten sichtbare Symptome. Mit zunehmender Zeit nach der

Inokulation gleicht sich der Befall, wie er nach Inokulation mit niedrigen

Isolatkonzentrationen erreicht wurde, mehr und mehr dem Befall nach Inokulation

mit höheren Isolatkonzentrationen an (Abb. 3.11). Durch das stetige Wachstum aller

Versuchspflanzen während der Versuche kam es vermehrt zu Berührungen zwischen

einzelnen Symptom tragenden Blättern mit zunächst symptomlosen Blättern

benachbarter Pflanzen. Eine sekundäre Ausbreitung war vermutlich die Folge.

LESSL et al. (2007) beschreiben ebenfalls einen positiven Zusammenhang zwischen

einer höheren Inokulumkonzentration und der Besiedlung von Wassermelonenblüten

durch Acidovorax avenae ssp. citrulli. Durch Bonitur des A. valerianellae-Befalls

nach Inokulation mittels verschiedener Methoden (Infiltration, Sprühinokulation,

Bodeninokulation und Stichinokulation) durch JASU (2004) wird auch ein für

Inokulumdichten typischer Gradient beobachtet. BRAJE (2005) berichtet, dass höhere

Konzentrationen nach Bodeninokulation vermehrt zu sichtbarem Befall an

Feldsalatpflanzen führen: so wiesen 75 % der Pflanzen nach Inokulation mit einer

Konzentration von 108 cfu/ml Symptome auf gegenüber 3 % befallene Pflanzen bei

102 cfu/ml.

Über den positiven Einfluss von Inokulumkonzentrationen in Abhängigkeit von der

Temperatur auf einen Befall berichteten LATORRE et al. (2002 a). Es kommt

vermehrt zu Frucht- und Zweiginfektionen an Süßkirsche durch Pseudomonas

DISKUSSION

137

syringae pv. syringae, sobald die Bakterienkonzentration einen Wert von mindestens

103 cfu/ml übersteigt und gleichzeitig Temperaturen von mindestens 5 °C

(Zweiginfektionen) beziehungsweise 10 °C (Fruchtinfektionen) herrschen. Weiterhin

zeigen sie, dass der Befall an Früchten und Zweigen stark von der Dauer einer

gesättigten Luftfeuchtigkeit abhängig ist. Je länger die Phase mit erhöhter

Luftfeuchte andauert, desto mehr Frucht- und Zweigbefall ist bei geringeren

Temperaturen von 5 °C und gleichzeitig erhöhten Inokulumkonzentrationen

(107 cfu/ml) vorhanden. Temperatur und hohe Luftfeuchtigkeiten stellen die

kritischen Faktoren für ein Überleben und die Krankheitsentwicklung dar, wobei die

Temperatur bei P. syringae pv. syringae an Kirsche das größere Gewicht hat. Bei

A. valerianellae stellte hingegen die Luftfeuchtigkeit den größten Einfluss auf die

Infektion dar.

Auch bei anderen Bakterienarten wie zum Beispiel Xanthomonas campestris pv.

campestris an Brassica werden sowohl die Keimlinge als auch Pflanzen im Blüh-

oder Fruchtstadium befallen. Zudem können hier Samen, Früchte, Blätter oder die

Sprossachsen Symptome zeigen. Normalerweise zeigen infizierte Pflanzen erst ab

einer Konzentration von mindestens 105 cfu/ml Symptome. Die optimale

Wachstumstemperatur liegt bei 25 °C bis 30 °C, bei der nach sieben bis 14 Tagen

Symptome sichtbar werden. Bei Temperaturen unter 18 °C bis 20 °C entwickeln sich

keine sichtbaren Symptome an Kohlpflanzen (ANONYM , 2001).

Die Ergebnisse tragen dazu bei, die Infektionsbiologie des Bakteriums

A. valerianellae besser zu verstehen. Grundsätzlich entsprachen die

Versuchsergebnisse den Erwartungen, insbesondere bei der Frage nach den

Infektionstemperaturen, dem Blattalter und der Inokulumdichte. Die Ergebnisse des

Einflusses der Blattnässedauer überraschten allerdings. Hier entsprachen die

Ergebnisse der Erwartung, dass eine längere Blattnässedauer zu einem höheren

Befall in Form von sichtbaren Symptomen führt, nur zum Teil. Aus den Ergebnissen

wie sie in Kapitel 3.1.2 und 3.1.3 dargestellt wurden, ließ sich ein neues Phänomen

in der Symptomatik erkennen. Es kam teilweise zu einem Rückgang in der

Symptomausprägung an einzelnen Pflanzen und Blättern (siehe Abb. 3.5 und

Abb. 3.7). Die Erklärung hierfür lieferte eine Betrachtung des Symptomverlaufs in

Vorversuchen (zuvor nicht dargestellt). Es wurden Feldsalatpflanzen mit

DISKUSSION

138

A. valerianellae-Suspension inokuliert und bei wechselfeuchten (an zwei

aufeinanderfolgenden von sieben Tagen in der Woche war die Luftfeuchtigkeit

regelmäßig gesättigt) und dauerhaft bei feuchten (nahezu 100 % Luftfeuchtigkeit)

Bedingungen kultiviert. Die entstandenen Symptome wurden für jede Blattetage (von

den Keimblättern bis zum zweiten Laubblattpaar) über die Dauer des Versuches in

ihrem Aussehen und ihrer Anzahl ausgewertet. Die Symptome waren zunächst als

wässrige, ölige, dunkelgrüne Flecken zu erkennen und konnten lediglich in dieser

Stufe wieder verschwinden (Stufe 1). Die Flecken verfärbten sich nach und nach

dunkler bis sie eine schwarze Farbe annahmen (Stufe 2). Bei fortschreitendem Befall

wurden die schwarzen Flecken in einem weiteren Entwicklungsschritt nekrotisch und

es entstand eine bräunliche Verfärbung mit chlorotischen Höfen (Stufe 3).

Dies beschrieben neben MOLTMANN et al. (2000) auch GRONDEAU et al. (2007) und

FRANKENBERG (2005). Die Anzahl an Symptom tragenden Pflanzen nahm bei

Kultur unter gesättigter Luftfeuchte bis zum Versuchende kontinuierlich zu. Die

Anzahl der Symptom tragenden Pflanzen, die unter wechselfeuchten Bedingungen

kultiviert wurden, nahm grundsätzlich ebenfalls zu, es wurde jedoch auch ein

partieller Rückgang der Anzahl befallener Pflanzen beobachtet. Sobald die

Luftfeuchtebedingungen nicht mehr den für das Bakterium optimalen

Infektionsbedingungen entsprachen, konnten Symptome, die sich in der ersten

Entwicklungsstufe (Stufe 1) befanden, wieder verschwinden. Bei Wiederauftreten

von gesättigten Luftfeuchten entwickelten sich die Bakterien im Blattgewebe jedoch

weiter und der Befall war in Form von Symptomen erneut sichtbar. Haben sich die

Bakterien schon so weit entwickelt, dass die Symptome die erste Entwicklungsstufe

überschritten haben, so ist ein Verschwinden der Symptome nicht mehr möglich,

auch wenn ungünstige Bedingungen herrschen. Der Befall bleibt sichtbar.

DISKUSSION

139

4.2 Sortenanfälligkeit

Bei einem Vergleich von verschiedenen Feldsalatsorten zeigte sich, dass alle

getesteten Sorten nach Inokulation typische A. valerianellae-Symptome aufwiesen

und keine Sorte eine vollständige Resistenz zeigte (Kapitel 3.2). Dies deckt sich mit

Beobachtungen aus dem Feld (persönliche Mitteilung T. Brand, Nützlingseinsatz

Baden e.V.). Signifikante Unterschiede gab es jedoch in der Befallsstärke und

Befallshäufigkeit inokulierter Pflanzen verschiedener Sorten (Abb. 3.12 und 3.13).

Die getestete Wildform V. rimosa (AV-13) war hingegen in allen Versuchen

befallsfrei und damit hoch resistent gegen A. valerianellae (Abb. 3.12 und 3.13). Bei

der Verwendung von einzelnen Isolaten und Inokulumdichten (Kapitel 3.2.2 und

3.2.3) wurde ebenfalls kein Befall an diesen Pflanzen hervorgerufen (Abb. 3.14,

3.15, 3.16, 3.17, 3.18 und 3.19, Tab. 3.4 und 3.5). Auch BRAJE (2005) berichtet, dass

alle acht getesteten Sorten nach Bodeninokulation ohne signifikante Unterschiede

anfällig für A. valerianellae waren.

Die Ergebnisse der Resistenzprüfung von Feldsalat gegen A. valerianellae bestätigen

ebenfalls eine Resistenz der Wildformen (BARCHEND 2006): V. rimosa und

V. dentata erweisen sich als nicht infizierbar, während alle 15 getesteten Sorten aus

dem Sortiment des Jahres 2002 anfällig waren.

Für die zukünftige Züchtung von resistenten Sorten erscheint daher ein Rückgriff auf

diese Wildarten zum Einkreuzen am vielversprechendsten.

DISKUSSION

140

4.3 Übertragungswege

4.3.1 Boden

GRONDEAU et al. (2003) berichten, dass das Bakterium A. valerianellae als

bodenübertragbar gilt und den Wirt (Feldsalat) in einem frühen Wachstumsstadium

infiziert. Weiterhin berichten sie von einer Befallszunahme bei erneuter

Feldsalataussaat je mehr A. valerianellae-Inokulum anfangs im Boden vorhanden ist

und dass Metam Sodium bei hoher Dosierung signifikant die Anzahl an Symptom

tragenden Pflanzen im Vergleich zum unbehandelten Boden reduziert. In

aufeinanderfolgenden Feldsalataussaaten nimmt mit jeder Aussaat die

Befallshäufigkeit zu, wenn die infizierten Pflanzen in den Boden eingearbeitet

werden. Ein direkter Nachweis des Inokulumanstiegs im Boden wurde durch

Ausplattieren von Bodenproben auf semiselektivem Medium (nach GRONDEAU

et al., 2007) geführt. Auch HINRICHS-BERGER et al. (2004) bestätigten eine Zunahme

an infizierten, Symptom tragenden Pflanzen mit jeder Kultur, die unmittelbar

nacheinander auf derselben zuvor kontaminierten Fläche erfolgte.

Untersuchungen von BRAJE (2005) bestätigen die Überdauerung ebenfalls. Nach

Einarbeitung von Ernterückständen befallener Feldsalatpflanzen und erneuter

Aussaat von gesundem Feldsalatsaatgut zeigen dort gewachsene Pflanzen bereits im

Keimblattstadium typische A. valerianellae-Symptome. Der gesamte Bestand zeigt

acht Wochen nach der Aussaat an allen Pflanzen Symptome. Eine Kalkstickstoffgabe

und eine Hitzeeinwirkung durch Abflammen des Oberbodens haben A. valerianellae

nicht eliminiert.

Die eigenen Versuche des Bodenüberdauerungsversuches über einen Zeitraum von

acht beziehungsweise zwölf Monaten an zwei Standorten ergaben, dass die

Befallshäufigkeiten in den ersten Monaten nach Einarbeitung von infiziertem

Feldsalatblattmaterial in die Böden und nachfolgender Aussaat von gesundem

Saatgut in diese Böden höher waren als mit längerem zeitlichem Abstand zur

Einarbeitung (Tab. 3.6 und 3.7). Diese Beobachtung der Symptomatik wurde mittels

TAS-ELISA-Ergebnisse bestätigt. Am Standort Quedlinburg wurden fünf Monate

nach Kontamination an neuen Feldsalataussaaten sichtbare A. valerianellae-

Symptome festgestellt und auch der Nachweis im TAS-ELISA an den Pflanzen war

DISKUSSION

141

positiv. Am Standort Schifferstadt wurden zunächst über einen Zeitraum von drei

Monaten nach Kontamination positive Nachweise geführt. Nach elf Monaten wurden

jedoch erneut an 4,5 % der Pflanzen untypische A. valerianellae-Symptome im TAS-

ELISA als positiv detektiert. Eine Überdauerung über einen Zeitraum von

mindestens elf Monaten scheint somit wahrscheinlich. Aufgrund unterschiedlicher

Rottebedingungen kam es vermutlich zu einer ungleichmäßigen Verteilung des

Inokulums im Boden und neue Aussaaten wurden befallen.

Neben A. valerianellae sind noch andere Bakterienarten bodenübertragbar. So

berichtet HSU (1991) davon, dass Pseudomonas solanacearum umso länger im

Boden überdauert, je nasser dieser ist. Eine Infektion von Nachtschattengewächsen

ist dabei umso höher, je höher die Inokulumdichte im Boden ist. Xanthomonas

campestris pv. campestris überdauert ebenfalls im Boden. KOCKS et al. (1998)

beschreiben eine dreijährig durchgeführte Studie, bei der Erntereste von infizierten

Kohlbeständen in den Boden eingearbeitet wurden. Bakterien aus dem Boden

wurden anschließend isoliert und in Kohlpflanzen infiltriert (Koch`sche Postulate).

Die Wiederfindungsrate lag bei 58 %, wobei das Verschwinden der Bakterien aus

dem Boden von dem Rottegrad abhängig ist und durch höhere Temperaturen

(> 5 °C) gefördert wird. Ein kontinuierlicher Kohlanbau von Jahr zu Jahr wäre

aufgrund der zeitlichen Abnahme des Bodeninokulums und dem völligen

Verschwinden nach dem Winter möglich. Aus der Literatur sind unterschiedliche

Angaben zu der Dauer des Überlebens von Xanthomonas campestris pv. campestris

im Boden zu entnehmen. So wird von ANONYM (2001) berichtet, dass das Bakterium

so lange im Boden überdauert wie unverrottete Pflanzenreste vorhanden sind, ohne

Wirt bis zu 14 Tage im Sommer und bis zu 42 Tage im Winter. Nach SCHAAD und

WHITE (1974) überdauert das Bakterium allerdings bis zu 244 Tage, während

STRANDBERG (1973) sogar einen Zeitraum von zwei Jahren in kühlen Klimaten

angibt.

Die Infektionskette von Xanthomonas campestris pv. vitians an Salat kann durch

eine möglichst schnelle und vollständige Verrottung der Pflanzenreste unterbrochen

werden (MOLTMANN , 1999). WÖLK und SARKAR (1994) beschreiben, dass

Xanthomonas campestris pv. pelargonii in Komposterde bis zu 26 Monate

DISKUSSION

142

überdauert und der Bakteriengehalt mit zunehmender Zersetzung der

Pelargoniestücke abnimmt.

Die Literatur zeigt, dass eine Überdauerung von Pathogenen oft nur so lange

nachweisbar ist, wie sich Wirte oder befallene Pflanzenreste im Boden vorfinden.

Die Umsetzung der Pflanzenreste ist stark von den klimatischen Gegebenheiten und

somit vom Standort abhängig. Der Standort hat somit auch einen wesentlichen

Einfluss auf die Überdauerung von A. valerianellae im Boden.

Für Feldsalat ist aufgrund des kleineren Habitus und dem weicheren Gewebe eine

kürzere Verrottungszeit anzunehmen als bei Kohl. Die Überdauerungszeit von

A. valerianellae im Boden beträgt mindestens elf Monate, abhängig von Inokulum

und Standort. Dass der Standort auf den Zersetzungsgrad einen großen Einfluss hat,

zeigten die Nachweise, die über elf (Schifferstadt) beziehungsweise fünf Monate

(Quedlinburg) durchgeführt wurden. Zudem wurden die Versuche zu

unterschiedlichen Zeitpunkten im Jahr angelegt. In Schifferstadt erfolgte die

Einarbeitung im Herbst (September), in Quedlinburg im Frühjahr (März). Aufgrund

der klimatischen Unterschiede an den beiden Standorten (Tab. 3.8) und der

Unterschiede in der biologischen Bodenaktivität, die vom Bodenleben abhängig ist,

erscheint es nicht verwunderlich, dass Pflanzenreste schneller oder langsamer

abgebaut wurden. Niederschlag, Temperatur und Bodenaktivität stellten die

kritischen Faktoren für das Überleben der Bakterien beziehungsweise für den

Fortschritt der Zersetzung dar, wobei der Niederschlag und die Bodenaktivität hier

die größeren Einflussfaktoren waren.


Als weitere potentielle Wirtspflanzen neben Feldsalat wurden insgesamt

30 Pflanzenarten aus zwölf Familien geprüft (Kapitel 3.3.2). Alle Pflanzen wurden

dazu durch Infiltrieren, Sprühen oder Stichverletzungen inokuliert. Die Auswertung

erfolgte zum einen durch visuelle Bonituren (bei zwei Versuchsansätzen), zum

anderen zusätzlich zu den visuellen Bonituren mittels Isolationen und anschließender

Durchführung des TAS-ELISA (dritter Versuchansatz). Eine Schwierigkeit bei der

Frage nach alternativen Wirtspflanzen war die methodische Umsetzung.

DISKUSSION

143

A. valerianellae blieb im TAS-ELISA nachweisbar, auch wenn die entsprechenden

Blattabschnitte zuvor mit 70 %-igem Alkohol oberflächendesinfiziert wurden. Somit

ließ sich zwar durch TAS-ELISA feststellen, dass die Inokulation erfolgt war und

dass es sich um A. valerianellae-Bakterien handelte, nicht aber, ob eine Infektion

oder sogar eine Vermehrung der Bakterien im alternativen Wirtspflanzengewebe

stattfand und diese Pflanzen Wirtspflanzen von A. valerianellae sein könnten.

Die Ergebnisse basierten daher bei zwei Versuchsansätzen ausschließlich auf

visueller Bonitur (Kapitel 3.3.2.1 und 3.3.2.2). Dass es zu sichtbaren

Blattveränderungen durch die Infiltration bei verschiedenen Pflanzenarten kam,

erschien nicht weiter verwunderlich, da massiv in das Pflanzengewebe eingegriffen

wurde. Die Bonitur sprühinokulierter intakter Blattbereiche erschien dagegen

aufschlussreicher zu sein. So zeigten Pflanzen der Familien Amaranthaceae

(Chenopodium album (L.)), Apiaceae (Daucus carota subsp. sativus (Hoffm.) Schübl

et. G. Martens., Petroselium crispum (Mill.) Nyman & A. W. Hill), Fabaceae

(Phaseolus vulgaris (L.)) und Poaceae (Zea mays (L.)) nach Sprühinokulation

Krankheitssymptome wie auch Pflanzen, die aus den Familien Asteraceae (Lactuca

sativa (L.), Matricaria chamomilla (L.), Senecio vulgaris (L.)) und Brassicaceae

(Raphanus sativus subsp. oleiformes (L.), Raphanus sativus subsp. sativus (L.),

Raphanus sativus (L.)) stammten. Da die bonitierten Krankheitssymptome den

typischen A. valerianellae-Symptomen an Feldsalat aber nicht in Form und Farbe

glichen, wurde die Frage nach einer potentiellen Wirtspflanzeneignung nicht

abschließend beantwortet. Es wurde weder bestätigt noch entkräftet, dass die

sichtbaren Veränderungen von A. valerianellae verursacht wurden und dass es zu

einer Anreicherung des Pathogens im alternativen Pflanzengewebe kam. Es muss

daher davon ausgegangen werden, dass die untersuchten Pflanzen als Wirtspflanzen

deutlich weniger geeignet waren als der Feldsalat oder keine Wirtspflanzen von

A. valerianellae waren.

Da sich bei der methodischen Umsetzung und der Probenaufbereitung in den ersten

beiden Versuchsansätzen Schwierigkeiten ergaben, wurde ein dritter Versuchsansatz

durchgeführt (Kaitel 3.3.2.3). Hier wurden lediglich einzelne Blatthälften von

Pflanzen aus fünf Familien und Feldsalat mit A. valerianellae-Suspension inokuliert

(Stichinokulation). Nachweise wurden sowohl durch visuelle Veränderungen im

DISKUSSION

144

Blattgewebe als auch durch die Isolation von Bakterien aus diesen Bereichen geführt.

Die Bakterienkolonien wurden anschließend im TAS-ELISA als A. valerianellae-

positiv oder -negativ bestimmt. In den inokulierten Blatthälften von

Feldsalatpflanzen waren lebensfähige Bakterien nach zwölf, 26 und 33 Tagen

nachweisbar. Nach Isolationen aus den gegenüberliegenden nicht inokulierten

Blatthälften von Feldsalat wurden ebenfalls nach zwölf und 26 Tagen lebensfähige

A. valerianellae-Bakterien nachgewiesen. Das heißt, dass Bakterium hat sich in den

nicht-inokulierten Blattbereich ausgebreitet.

Zwölf bis 26 Tage nach der Stichinokulation waren an Pflanzenblättern der Familien

Asteraceae (Lactuca sativa (L.)), Apiaceae (Petroselium crispum (Mill.) Nyman &

A.W. Hill), Brassicaceae (Raphanus sativus subsp. oleiformes (L.), Raphanus

sativus subsp. sativus (L.), Raphanus sativus (L.)) und Fabaceae (Phaseolus vulgaris

(L.), Pisum sativum (L.)) Veränderungen sichtbar, aus denen zudem lebensfähige

Bakterien isoliert wurden. Ein Nachweis lebensfähiger Bakterien war somit an allen

untersuchten Pflanzen, mit Ausnahme der Pflanzen der Familie Amaranthaceae,

möglich. Da sich das Bakterium bei diesen Pflanzen aber nicht in den nicht-

inokulierten Blattbereich ausgebreitet hatte, wie es bei Feldsalatpflanzen der Fall

war, muss davon ausgegangen werden, dass keine der untersuchten Pflanzen

Wirtspflanzen von A. valerianellae waren.

Bei den untersuchten Pflanzen handelte es sich sowohl um weitverbreitete Unkräuter

als auch um Gemüsepflanzen. Im Pfälzer Anbaugebiet kommt es zu einer

wechselnden Bewirtschaftung gleicher Flächen durch verschiedene Anbauer. Somit

kann Feldsalat im Fruchtfolgewechsel eine Vor- oder Nachfrucht von Möhre-,

Petersilie-, Erbse-, Zuckermais-, Eissalat-, Bataviasalat-, Radies-, Rettich- und

anderen Beständen sein (persönliche Mitteilung J. Kreiselmaier, DLR Rheinpfalz).

Ein Anbau von Feldsalat auf der gleichen Fläche wird von den Anbauern in der

Regel in einem Abstand von zwei Jahren durchgeführt (persönliche Mitteilung

J. Geil, Pfälzer Anbauer). Eine Eignung dieser Pflanzen als potentielle Wirte wäre

somit theoretisch denkbar, wurde aber in diesen Versuchen nicht nachgewiesen.

Als Bekämpfungsmaßnahme wären eine weite und abwechselnde Fruchtfolge zu

nennen, wie sie auch MOLTMANN (1999) als Bekämpfungsmaßnahme von

DISKUSSION

145

Xanthomonas campestris pv. vitians an Salat rät. Weiterhin rät sie zu einer

sorgfältigen Unkrautbekämpfung. Die Adernschwärze, verursacht durch

Xanthomonas campestris pv. campestris, kann an vielen Arten der Brassica-Familie

vorkommen, zu denen auch Unkräuter gehören. So können Symptome an

Hirtentäschelkraut (Capsella bursa-pastoris), Acker-Rettich (Raphanus

raphanistrum) und Acker-Schmalwand (Arabidopsis thaliana) vorkommen. Das

Pathogen sitzt dabei an Früchten, Blättern, Wurzeln, Sprossachsen und Samen

(ANONYM, 2001).

Da A. valerianellae vermutlich in Feldsalatpflanzen und Rückständen von

Feldsalatpflanzen überdauert, erscheint eine Unkrautbekämpfung zur Unterbindung

der Ausbreitung von A. valerianellae nicht unbedingt erforderlich. Es sei denn,

Feldsalatpflanzen kommen in der Fruchtfolge oder zusätzlich in bestehender

Feldsalatkultur als Unkräuter und somit als Inokulumquelle vor.

4.3.3 Saatgut

Um Feldsalatsaatgut auf eine Kontamination mit A. valerianellae zu untersuchen und

in diesem Zusammenhang die Frage nach einer möglichen Saatgutübertragung zu

beantworten, standen verschiedene Methoden zur Verfügung. So wurden die zu

untersuchenden Samen entweder in Vermiculit (Sweatbox-Test, Kapitel 2.15.1.1), in

Erde (Aufwuchstest im Gewächshaus, Kapitel 2.15.1.2) oder auf Papier

(Ankeimmethode auf Papier, Kapitel 2.15.1.3) ausgesät und an verschiedenen Tagen

nach Aussaat bonitiert, wobei die Ankeimmethode auf Papier im November 2010

von Frau K. Thiele (Julius Kühn-Institut) bereitgestellt wurde.

Die drei verwendeten Nachweisverfahren besaßen zwei Gemeinsamkeiten: die

Notwendigkeit einer hohen Luftfeuchtigkeit nach Aussaat der Samen und eine

Untersuchung von Keimlingen beziehungsweise Pflanzen im TAS-ELISA.

Unterschiedlich waren hingegen die für die Keimlinge verfügbaren Nährstoffe und

somit auch ihre Entwicklung und Widerstandsfähigkeit gegenüber A. valerianellae

und anderen Pathogenen wie beispielsweise Pilzen.

Die Durchführung und Handhabung des Aufwuchstests im Gewächshaus war

einfach. So wurde eine geringe, nicht abgezählte Samenanzahl in Erde ausgesät und

nach Kultivierung bei gesättigter Luftfeuchte wurden die Symptome an den

DISKUSSION

146

aufgelaufenen Pflanzen bonitiert. Von Pflanzen mit sichtbaren Symptomen wurden

Pflanzensaftproben im TAS-ELISA überprüft. Diese Methode wurde zu

unterschiedlichen Jahreszeiten und bei unterschiedlichen Temperaturbedingungen im

Gewächshaus durchgeführt und war nicht standardisierbar, so dass die Ergebnisse

kaum reproduzierbar waren. Sie eignet sich daher nicht für eine im Routineverfahren

eingesetzte Nachweismethode, zumal das gesamte Nachweisverfahren nahezu zwei

Monate dauern würde. Zudem fehlte die Nachweissicherheit. Kontaminierte

Saatgutpartien, die zuvor in verschiedenen Versuchen nach Aussaat A. valerianellae-

Symptome an Pflanzen zeigten, wurden im Aufwuchstest im Gewächshaus als nicht-

kontaminiert ausgewiesen.

Besser geeignet erschien hingegen der Sweatbox-Test, der unter standardisierten

Bedingungen in der Klimakammer durchgeführt wurde. Diese Nachweismethode

wird derzeit als Routineverfahren bei Saatgutzüchtern eingesetzt. Die Pflanzen

werden dabei visuell auf einen A. valerianellae-Befall untersucht und bei

verdächtigen beziehungsweise typischen Symptomen werden diese mittels PCR-

Untersuchung näher geprüft. Sobald eine Saatgutbelastung detektiert wird, wird diese

Saatgutpartie nicht für den weiteren Vertrieb zugelassen (persönliche Mitteilung,

A. Schieder, Enza Zaden). Die Kultivierung der Pflanzen wurde in eigenen

Versuchen in Vermiculit durchgeführt. Nach Aussaat von 5000 Samen wurde der

Test für maximal 28 Tage durchgeführt, was nur der Hälfte der Zeit gegenüber dem

Aufwuchstest im Gewächshaus entspricht. Teilweise wurden die Pflanzen sehr stark

von Pilzen überwachsen, so dass eine Bonitur nicht mehr durchzuführen war.

Kontaminierte Saatgutpartien zeigten im Sweatbox-Test zudem nicht immer einen

Befall an Pflanzen.

Für die Ankeimmethode auf Papier mit anschließendem TAS-ELISA wurden zu

untersuchende Samen als Einzelproben für bis zu 14 Tage auf feuchtem Filterpapier

ausgelegt und zu vier verschiedenen Zeitpunkten für die ELISA-Untersuchung

herangezogen. Dies entspricht der Hälfte der Zeit gegenüber dem Sweatbox-Test und

dem Viertel der Zeit gegenüber dem Aufwuchstest im Gewächshaus. Ein leichter

Rückgang der OD-Werte innerhalb des vierzehntägigen Untersuchungszeitraumes

war aufgrund des Schwankungsbereichs der Probennahme (Einzelansätze) erklärbar.

Nach Berechnung des Kontaminationsschwellenwertes (mean + 2 * s) jeder

Maxisorpplatte gab der gemessene OD-Wert der zu untersuchenden Saatgutprobe

DISKUSSION

147

Aufschlüsse über die Kontamination beziehungsweise über eine Befallsfreiheit. Das

Verfahren war schnell, einfach durchzuführen, nachweissicher und reproduzierbar.

Zudem konnte auch bei hoher Pilzbelastung ein zufriedenstellendes Ergebnis erzielt

werden. Diese Methode eignet sich daher für ein Routineverfahren.

Eine Keimlingsentwicklung war für diese Untersuchung unerlässlich. Nach

persönlicher Mitteilung von K. Thiele (Julius Kühn-Institut) erreicht eine schwach

belastete Partie nach neun bis dreizehn Tagen ihren maximalen OD-Wert im TAS-

ELISA, während der OD-Wert bei einer stark belasteten Partie nach fünf bis sieben

Tagen am höchsten sei. Nach neuesten Untersuchungen am Julius Kühn-Institut ist

für einen Saatgutnachweis eine Homogenisierung angekeimter Samen nach sieben

Tagen ausreichend. Bei geringer Pathogenlast ergibt eine weitere Messung nach zehn

Tagen weiterhin Aufschluss über die Befallsfreiheit beziehungsweise Kontamination

des zu testenden Saatgutes. Die Untersuchung am Tag null ist für eine

Routinetestung nicht nötig.

Die Befallsfreiheit der gesunden Ausgangssaatgutpartie „AV-60“ und die

Kontamination der infizierten Ausgangssaatgutpartie „AV-75“ wurden mit allen drei

Methoden (Sweatbox-Test, Aufwuchstest im Gewächshaus, Ankeimmethode auf

Papier) bestätigt. Da die Samen der beiden Ausgangspartien, egal ob ungebeizt,

gebeizt oder mit entfernter Beize, mit der Ankeimmethode auf Papier zu einem

späteren Zeitpunkt (ab November 2010) untersucht wurden, keimten diese kaum

noch (> 5 %) oder gar nicht mehr. Im Fall der untersuchten Ausgangssaatgutpartien

ähneln daher die Auswertungstage vier, neun und 14 dem Ergebnis der am Tag null

durchgeführten Untersuchung und lassen keinen sicheren Nachweis zu, aber eine

Tendenz erkennen (Tab 3.18 und 3.19).

Da bei der Ankeimmethode auf Papier für jeden der vier Auswertungstage eine

gesonderte Menge des zu untersuchenden Saatgutes untersucht wurde (vier

Einzelansätze) und die Probenmenge von 0,2 g gering war, wurde schwach

kontaminiertes Saatgut nicht immer sicher nachgewiesen. So konnten die durch Rijk

Zwaan nachgewiesene Kontamination des Partie „AV-78 (Frankreich)“ und durch

Enza Zaden nachgewiesene Kontamination der Partie „AV-62“ (Tab. 3.15) weder

mit dem Aufwuchstest im Gewächshaus, dem Sweatbox-Test noch mit der

Ankeimmethode auf Papier bestätigt werden. Die im Sweatbox-Test und im

Aufwuchstest im Gewächshaus nachgewiesene Kontamination der Partie „AV-76

DISKUSSION

148

(Deutschland)“ wurde lediglich am vierten Untersuchungstag (Tag 14) durch die

Ankeimmethode auf Papier und dem TAS-ELISA bestätigt (Tab. 3.14).

Die Ergebnisse zeigen, dass eine Saatgutübertragung von A. valerianellae möglich

war und auch mit verschiedenen Nachweismethoden diagnostiziert wurde.

GRIMAULT et al. (2006) sowie GRONDEAU und SAMSON (2009) bestätigen ebenfalls

eine Saatgutübertragung von A. valerianellae bei Feldsalatsaatgut. Zu untersuchende

Saatgutpartien werden hier nach einem Nachweisverfahren, das von GRIMAULT

et al. (2006) entwickelt wurde, entweder auf Papier (8 * 450 Samen) ausgelegt oder

in Substrat (jeweils 4 * 250 Samen) ausgesät. Die Kulturführung der Substratvariante

war unterschiedlich. Die Hälfte der Kisten wird bei normalen Bedingungen

kultiviert, die übrigen bei gesättigter Luftfeuchte. Alle Methoden ergeben einen

sichtbaren Befall mit A. valerianellae, wobei mehr Pflanzen sichtbar befallen sind,

wenn sie auf Papier ausgelegt werden. Für Saatgutpartien mit hoher saprophytischer

Belastung ist eine Aussaat in Substrat von Vorteil. GRONDEAU und SAMSON (2009)

beschreiben eine qualitative Untersuchung von Feldsalatsaatgut. Dafür werden die zu

untersuchenden Samen in Wasser geschüttelt (eine Stunde bei 4 °C). Der Überstand

der Schüttelkultur wird auf Nährmedium ausplattiert. Die sich entwickelnden

Bakterien werden danach näher bestimmt.

Ob Feldsalatpflanzen, die sich aus kontaminiertem Saatgut entwickelt haben, das

Bakterium an die Folgegeneration weitergeben, scheint von mehreren Faktoren

abhängig zu sein. Zum einen trägt der entsprechende Standort, an dem die Pflanzen

das Folgesaatgut produzieren, wesentlich zu einer Übertragung bei, da an jedem

Standort unterschiedliche klimatische Bedingungen vorherrschen. So unterschieden

sich die Standorte Deutschland und Frankreich deutlich voneinander. Zum anderen

tragen das verwendete Saatgut und seine Kontamination wesentlich zu einer

Saatgutübertragung bei. Es wurde in diesen Versuchen sowohl ungebeiztes als auch

gebeiztes Saatgut einer Sorte eingesetzt. Im Allgemeinen wird eine Saatgutbeize

gegen pilzliche samenübertragbare Krankheitserreger eingesetzt und kann

Ertragsausfälle und Qualitätseinbußen minimieren.

Weiterhin lässt sich ein Zusammenhang zwischen der A. valerianellae-

Befallshäufigkeit im Saatgutproduktionsbestand und der Nachweishäufigkeit im

DISKUSSION

149

Saatgut erkennen. Sind an vielen Pflanzen des Produktionsbestandes

A. valerianellae-Symptome sichtbar, dann weisen auch die Einzelergebnisse

verschiedener Methoden auf eine höhere Belastung des produzierten Saatguts hin.

So wurde die Saatgutpartie „AV-76 (Deutschland)“ mit allen drei Methoden

(Sweatbox-Test, Aufwuchstest im Gewächshaus, Ankeimmethode auf Papier) als

kontaminiert ausgewiesen (Tab. 3.13 und 3.14), im Produktionsbestand zeigten

4,7 % der Pflanzen A. valerianellae-Symptome (Abb. 3.20). Die Saatgutpartie „AV-

78 (Frankreich)“ wurde nur in der Untersuchung der Firma Rijk Zwaan als belastet

eingestuft, im Produktionsbestand wiesen 1,1 % der Pflanzen Symptome auf. Eine

sekundäre Ausbreitung als Ursache für die Befallsrate der beiden Saatgutpartien

(„AV-76 (Deutschland)“ und „AV-78 (Frankreich)“) erscheint jedoch

unwahrscheinlich, da die befallenen Pflanzen gleichmäßig im Bestand verteilt

auftraten und keine Ausbreitungsherde zu beobachten waren.

Nach Aussaat der kontaminierten Ausgangspartie im Jahr 2008 wurde ein

zunehmender A. valerianellae-Befall (bis 35 %) innerhalb von 66 Tagen an Pflanzen

bonitiert (Abb. 3.21). Eine sekundäre Ausbreitung war hierfür die Ursache und

Ausbreitungsherde wurden beobachtet. Die produzierte Saatgutpartie „AV-77“

wurde lediglich mit dem Sweatbox-Test und dem Aufwuchstest im Gewächshaus als

kontaminiert nachgewiesen (Tab. 3.13), mit der Ankeimmethode auf Papier war die

Saatgutpartie befallsfrei (Tab. 3.14).

Ob eine Saatgutpartie kontaminiert wird und ob die Kontamination schwach oder

stark ist, hängt somit von der im Produktionsbestand vorkommenden

Befallshäufigkeit ab. Ein hoher Befall scheint eine hohe Kontaminationsrate des

Tochtersaatguts zur Folge zu haben.

Ob es aber auch zu einer Übertragung kommt, wenn im Produktionsbestand kein

Befall sichtbar war, ließ sich weder bestätigen noch ausschließen. Bei der

samenübertragbaren Krankheit Xanthomonas campestris pv. campestris an Kohl

können auch symptomlose Pflanzen infizierte Samen produzieren (ANONYM, 2001).

WALCOTT et al. (2003) berichten ebenfalls, dass es ohne sichtbaren Befall zu einer

Saatgutübertragung von Acidovorax avenae ssp. citrulli an Wassermelonen kommt.

Nach WALKER (1952) findet die Saatgutkontamination vor allem bei hoher

Luftfeuchtigkeit und Beregnung statt, weniger durch vaskulären Transport.

DISKUSSION

150

In elektronenmikroskopischen Untersuchungen mit Goldpartikelmarkierung, die am

Julius Kühn-Institut von mit A. valerianellae-kontaminierten Feldsalatsamen

durchgeführt wurden, waren vermehrt Bakterien am äußeren Rand eines

Saatgutkornes zu finden und nur sehr vereinzelt im Inneren des Kornes lokalisiert

(persönliche Mitteilung K. Thiele, Julius Kühn-Institut). Dies deutet darauf hin, dass

die Saatgutkontamination durch A. valerianellae vermehrt durch äußere Einflüsse als

durch vaskulären Transport geschieht. Durch die im Jahr 2009 durchgeführte Aussaat

der gebeizten Ausgangssaatgutpartien sollte vor allem ein Einfluss der

Bewässerungsstrategie auf die Saatgutübertragung von A. valerianellae ermittelt

werden. Verwendet wurde hier gebeiztes Saatgut, da das ungebeizte Saatgut nicht

mehr im ausreichenden Maße zur Verfügung stand. Die Bestände wurden zum einen

mittels Tröpfchenbewässerung gewässert, zum anderen durch eine Beregnung über

Kopf, wie sie auch in den Vorjahren stattfand. Die Vermutung, dass eine

Saatgutübertragung nur dann zustande kommt, wenn es über die Bewässerung zu

einem Hochspritzen von Bakterien aus Symptom tragenden Blättern in die Blüte und

somit von außen an das Saatgut kommt, konnte jedoch auf Basis der Ergebnisse nicht

bestätigt werden.

Alle untersuchten Saatgutpartien waren gesund, mit Ausnahme der Saatgutpartie

„AV-64 (Tröpfchen)“. Diese war nach Untersuchung mittels Sweatbox-Test und

Aufwuchstest im Gewächshaus frei von A. valerianellae (Tab. 3.13), während sie

nach Durchführung der Ankeimmethode auf Papier als kontaminiert ausgewiesen

wurde (Tab. 3.14). Bewässerungsunabhängig traten im Produktionsbestand keine

A. valerianellae-Symptome auf, weder bei Pflanzen der gesunden Ausgangspartie

noch bei Pflanzen der kontaminierten Ausgangspartie, so dass das Ergebnis der

Ankeimmethode auf Papier als falsch-positiv zu bewerten ist.

Verantwortlich für dieses Ergebnis scheint dennoch weder das Aussaatjahr noch die

Bewässerung zu sein, sondern die Beize des Saatguts. Eine chemische Saatgutbeize

kann einen A. valerianellae-Befall mindern. So bestätigten Untersuchungen der

gebeizten Ausgangssaatgutpartien im Sweatbox-Test eine Befallsfreiheit (Tab. 3.13).

Nach persönlicher Mitteilung von G. Hiddink (Enza Zaden) kann eine Beizung mit

Thiram, Metalaxyl und Iprodion einen bakteriellen A. valerianellae-Befall an

Pflanzen überraschend abschwächen. Ergebnisse eigener Vorversuche (Ergebnisse

nicht dargestellt) konnten dies ebenso bestätigen. Aus der Literatur ist bekannt, dass

DISKUSSION

151

eine Samenbehandlung mit Thiram die Vermehrung von schnell-wachsenden

Bakterien verhindern und zum Tod von langsam-wachsenden Bakterien führen kann

und so den Ertrag von Sojabohnen steigert (TIL’BA et al., 2011, Abstract).

Um den Einfluss der Bewässerungstechnik auf eine Saatgutübertragung eindeutig zu

untersuchen und damit auch die Frage nach der Lokalisierung von A. valerianellae

am oder im Samen zu beantworten, müsste dieser Versuch mit ungebeiztem Saatgut

einer stark kontaminierten Saatgutpartie wiederholt werden.

DISKUSSION

152

4.4 Dekontamination von Saatgut

Die eigenen Ergebnisse und die Ergebnisse aus der Literatur zeigen, dass es sich bei

A. valerianellae um eine saatgutübertragbare Krankheit an Feldsalat handelt. Eine

Strategie für die Produktion gesunden Saatguts ist daher von enormer Wichtigkeit.

Um eine solche Strategie für gesundes Saatgut zu realisieren, müssen laut ROBERTS

(2009) folgende Maßnahmen beachtet werden: Die Saatgutproduktion muss zunächst

in Gebieten stattfinden, die frei von bestimmten Pathogenen sind. Saatgutpartien

sollen mittels Saatguttests auf ihre Pathogenbelastung untersucht werden.

Möglicherweise müssen die Partien, bei positivem Befund, verworfen oder mittels

Dekontaminationsmethode behandelt werden. Eine weitere Maßnahme wäre,

unabhängig vom gesundheitlichen Status, eine generelle Saatgutbehandlung mit dem

Ziel das Pathogen im Saatgut zu eliminieren beziehungsweise das Inokulum auf ein

nicht schädliches Niveau zu reduzieren. Dabei sollte die Keimfähigkeit und

Lebensfähigkeit der Samen nicht reduziert werden. Die Behandlung sollte darüber

hinaus für Mensch und Tier sowie Umwelt unschädlich sein.

Mit Blick auf diese Punkte wurden zwei kontaminierte Partien (AV-219 und AV-17)

für die Untersuchungen herangezogen (Kapitel 3.4.2). Es sollte eine geeignete

Dekontaminationsmaßnahme für mit A. valerianellae-kontaminiertes Saatgut

ermittelt werden.

Die Ausgangsbelastung des unbehandelten Saatguts wurde zunächst mit der

Ankeimmethode auf Papier und anschließendem TAS-ELISA überprüft. Das

kontaminierte Ausgangssaatgut wurde sicher nachgewiesen, wobei die

Nachweisgrenze bei < 10 % infizierter Samen lag. Die Nachweisgrenze wurde nach

Untersuchung von gesunden und kontaminierten Saatgutpartien unterschiedlicher

Belastung in Form eines Ringtests durch verschiedene Labore bestätigt (Ergebnis

nicht dargestellt).

Über drei Strategien (Warmwasserbehandlungen, Dampfbehandlungen und eine

unbekannte Behandlung durch einen Dienstleister) wurde versucht, diese Belastung

zu verringern oder sogar zu eliminieren. Das Saatgut wurde vor und nach einer

DISKUSSION

153

Behandlung zudem auf seine Keimfähigkeit überprüft. Eine gute Keimfähigkeit ist

mit über 90 % gegeben (persönliche Mitteilung A. Schieder, Enza Zaden).

Aus den Ergebnissen der Dekontaminationswirkungen und mit Blick auf die

erzielten Keimfähigkeiten war ersichtlich, dass die Behandlungen unterschiedliche

Einflüsse auf das zu dekontaminierende Feldsalatsaatgut hatten.

OD-Werte unbehandelter, kontaminierter Feldsalatsamen stiegen normalerweise über

die Dauer der Kultivierung an und lagen spätestens ab dem dritten Auswertungstag

(Tag neun nach Aussaat) deutlich oberhalb des errechneten ELISA-Grenzwertes

(mean + 2 * s). Für den ersten Untersuchungstag (Tag null) wurde das Saatgut ohne

vorheriges Ankeimen für den TAS-ELISA aufgearbeitet und gemessen. Für die

Untersuchungstage vier, neun und 14 wurde das Saatgut entsprechend vier, neun und

14 Tage lang auf feuchtem Filterpapier angekeimt, bevor es für den TAS-ELISA

aufgearbeitet wurde.

In dieser Arbeit wurde für die Ankeimmethode auf Papier eine Probenmenge von

0,2 g je Auswertungstag eingesetzt, was sich als ausreichend erwies. Die Sorten

AV-17 und AV-219 wiesen nämlich eine A. valerianellae-Ausgangskontaminationen

von 17 % beziehungsweise 10 % auf. Bei einer zu untersuchenden schwächer

kontaminierten Partie könnte sich diese Probenmenge als zu gering erweisen. Es

sollten daher mindestens 0,5 g, was je nach Korngewicht 215 bis 430 Samen

entspricht, ausgelegt werden. Die Gefahr, dass nur gesunde Samen ausgelegt und das

Ergebnis verfälschen würden, wäre umso höher, je geringer die

Ausgangskontamination und die eingesetzte Probenmenge ist.

Für die Frage, ob es durch eine Behandlung (Warmwasser, Dampf und

Dienstleisterbehandlung) zu einer Dekontamination der Samen kam, wurde eine

andere Interpretation der Messergebnisse vorgenommen. Die Inanspruchnahme einer

berechneten Nachweisgrenze (mean + 2 * s), ab welcher höhere OD-Werte eindeutig

A. valerianellae-positiv und niedrigere OD-Werte eindeutig A. valerianellae-negativ

waren, erfolgte hier nicht. Grund dafür waren die Schwankungen der Kontamination

mit A. valerianellae bei einzelnen Saatgutkörnern. Ausschlaggebend für eine

Interpretation der Ergebnisse waren daher OD-Werte, die am ersten

DISKUSSION

154

Untersuchungstag nach Dekontamination (Tag null, ohne Ankeimen der Samen)

erzielt und als Schwellenwerte herangezogen wurden. Eine Dekontamination wurde

angenommen, wenn die OD-Werte der Tage vier, neun und 14 nach dem Ankeimen

alle unterhalb des Schwellenwertes beziehungsweise am Schwellenwert (um 0,01

Messwerte verschieden) lagen. Die Dekontamination war unzureichend, wenn

mindestens einer der OD-Werte der Tage vier, neun oder 14 deutlich oberhalb des

Schwellenwertes (mindestens doppelter Messwert) lag. Aufgrund des getrennten

Ankeimens der Samen für die Tage vier, neun und 14 kam es vor, dass lediglich ein

Messergebnis angekeimter Samen über dem Schwellenwert lag und eine

unzureichende Dekontamination auswies.

Eine alleinige Betrachtung vor und nach Behandlung einer kontaminierten

Saatgutpartie jeweils zum Zeitpunkt des ersten Untersuchungstages ohne Ankeimen

(Tag null) reicht nicht aus, um einen Dekontaminationserfolg der Methode zu

ermitteln, da der A. valerianellae-Befall möglicherweise unter der Nachweisgrenze

liegt. Durch eine Aussaat und Kultur unter feuchten Bedingungen vermehrt sich das

möglicherweise nicht abgetötete Bakterium und wird so nachweisbar.

Die Behandlung durch einen Dienstleister führte an Samen zu keinen

Keimfähigkeitsverlusten (AV-17: 97 %, AV-219: 95 %) und erfüllte damit eine

positive Erwartung (Abb. 3.27). Im Hinblick auf die Dekontamination zeigte sich

jedoch keine zufriedenstellende Wirkung. Proben beider Saatgutpartien erreichten

hohe OD-Werte, die dem Verlauf der unbehandelten kontaminierten Samen nahezu

identisch folgten (Abb. 3.28). Somit ergab sich eine mangelnde

Dekontaminationswirkung der Behandlung und eine solche Behandlung ist eindeutig

als nicht sinnvoll einzustufen.

Nach Dampfbehandlung waren bei der Sorte AV-219 Keimfähigkeitsverluste auf bis

zu 80 % (64 °C, 150 Sekunden) zu verzeichnen, während die Sorte AV-17 positiv in

ihrer Keimfähigkeit beeinflusst wurde (Abb. 3.25 und Tab. 3.16). Nach

Durchführung der Ankeimmethode auf Papier wurde ersichtlich, dass lediglich die

Sorte AV-219 nach einer Behandlung bei 66 °C für 105 Sekunden tendenziell gute

Erfolge erzielte, nicht jedoch nach einer Behandlung bei 64 °C für 150 Sekunden

(Abb. 3.26 B). Die Sorte AV-17 wurde durch keine Dampfbehandlung ausreichend

DISKUSSION

155

dekontaminiert (Abb. 3.26 A). Die Erforschung und Weiterentwicklung einer

Dampfbehandlung als Dekontaminationsmaßnahme verspricht im Allgemeinen

dennoch gute Erfolge. So beschreiben KOCH et al. (2010), dass bei der Untersuchung

von Karottensamen unterschiedlicher Sorte und Saatgutpartie, die mit Alternaria

dauci und A. radicina befallen sind, eine Dampfbehandlung die besten

Wirkungsergebnisse erzielt. Auch SCHMITT et al. (2009) beschreiben höchste

Wirksamkeiten mit bis zu 90 % an Reduktion des Ausgangsbefalls von Phoma

valerianellae an Feldsalat durch Behandlungen mit Heißluft.

Nach Durchführung der Warmwasserbehandlungen bei verschiedenen Temperaturen

und Einwirkzeiten wurde ersichtlich, dass einzelne Sorten auf gleiche Behandlungen

deutlich unterschiedlich in ihrer Keimfähigkeit reagierten, wobei die Sorte AV-17

weniger stark als die Sorte AV-219 reagierte (Abb. 3.23). Beide Sorten wurden

jedoch von der Behandlung bei 55 °C für 20 Minuten deutlich in ihrer Keimfähigkeit

geschwächt (AV-17: 78 %, AV-219: 33 %). Bei beiden Sorten wurde jedoch keine

Warmwasserbehandlung mit komplettem Wirkungserfolg in Form einer

Dekontamination erzielt. So beschreibt dies auch ROBERTS (2009) bei der

Untersuchung von mit Xanthomonas campestris pv. campestris belastetem

Kohlsaatgut. Eine Reduzierung durch Heißwasser wird erzielt, nicht aber eine

vollständige Elimination.

Bei der Sorte AV-17 stellte sich die Behandlung bei 55 °C für 20 Minuten als am

vielversprechendsten heraus, während es bei der Sorte AV-219 die Behandlungen bei

43 °C für 20 Minuten und bei 60 °C für 5 Minuten waren (Abb. 3.24).

Bei der Untersuchung von Feldsalatsamen unterschiedlicher Sorte und Saatgutpartie,

die mit Phoma valerianellae befallen sind, führt eine Behandlung mit Heißwasser bei

50 °C für 20 Minuten und bei 53 °C für 10 Minuten zu den höchsten

Wirkungsergebnissen zwischen 19 % und 40 % (SCHMITT et al., 2009). Die

Erforschung und Weiterentwicklung einer Warmwasserbehandlung erscheint

demnach auch hier sinnvoll.

Aus den Keimfähigkeitsergebnissen nach Durchführung der drei Behandlungen war

ersichtlich, dass jede Saatgutpartie anders reagierte. Die Sorte AV-17 reagierte mit

geringeren Keimfähigkeitseinbußen als die Sorte AV-219. Am stärksten

DISKUSSION

156

beeinträchtigt war die Keimfähigkeit nach Durchführung der

Warmwasserbehandlungen bei höheren Wassertemperaturen und längeren

Einwirkzeiten (55 °C, 20 Minuten), weniger durch Dampfdesinfektion und durch die

unbekannte Behandlung eines Dienstleisters. Dies deutet darauf hin, dass die

Warmwasserbehandlung auch tiefere Samenschichten erfasste und den Keimling

schädigte. Das Saatgut scheint bei der Dauer der Behandlung aufgequollener zu sein,

je mehr Wasser es umgeben hat. Der Keimvorgang wurde dadurch vermutlich

schneller eingeleitet als durch Dampfbehandlung und durch die Behandlung eines

Dienstleisters. Die Wärmebelastung am Saatgut war dadurch höher, so dass das

Saatgut empfindlicher reagierte und schlechter keimte.

Dass eine Behandlung mit heißem Dampf beziehungsweise heißer Luft zu weniger

Keimfähigkeitseinbußen führt als eine Warmwasserbehandlung, ist auch aus der

Literatur bei anderen Samenarten bekannt. So beschreiben GRONDEAU et al. (1992)

einen höheren Keimfähigkeitsverlust bei Erbsensamen durch eine Behandlung mit

Heißwasser als mit Heißluft. Die Behandlungen für 72 Stunden bei 65 °C (Heißluft)

beziehungsweise 15 Minuten bei 55 °C Wassertemperatur führen zu 5 % bis 20 % an

Keimfähigkeitsverlusten im Gegensatz zu unbehandelten Erbsensamen. Eine

Heißwasserbehandlung für 15 Minuten bei 60 °C führt sogar zu 20 % bis 45 % an

Keimfähigkeitsverlusten. Eine Befallsminderung von Pseudomonas syringae pv. pisi

wird durch beide Behandlungen erzielt, wobei die Behandlung mit Heißwasser die

Bakterienwerte an Erbsensamen einer schwach kontaminierten Partie stärker

reduziert, teilweise unterhalb der Nachweisgrenze. Bei einer stark kontaminierten

Erbsenpartie führt die Heißwasserbehandlung nur zu einer Halbierung der

Ausgangskontamination.

Die bei GRONDEAU et al. (1992) beschriebene Befallsminderung durch eine

Warmwasserbehandlung, im Gegensatz zu einer Heißluftbehandlung, scheint von der

vermehrten Auswaschung des Pathogens abhängig zu sein. Pathogene an der äußeren

Samenschale werden abgewaschen und im Inneren lokalisierte Pathogene werden

vermutlich durch die Einwirkung des heißen Wassers geschädigt. Bei den durch

heiße Luft behandelten Samen wurde eine geringere Befallsminderung festgestellt,

was darauf schließen lässt, dass diese Behandlung zwar Pathogene an der

Samenoberfläche mindert, die Pathogene im Inneren des Samens jedoch nicht

DISKUSSION

157

vollständig gehemmt wurden. Beim Quellprozess nach der Aussaat konnten sich

diese Pathogene vermehren und zu einem stärkeren Befall führen.

Die nachgewiesene Befallsminderung von A. valerianellae mittels

Dampfdesinfektion und Warmwasserbehandlung waren erste Erfolge dieser

Dekontaminationsmaßnahmen, eine vollständige Dekontamination wurde aber nicht

erreicht.

Aus der Literatur sind neben physikalischen Desinfektionsmethoden (Heißwasser,

Dampf, Elektronenbehandlung) auch reine Oberflächensterilisationen

(Natriumhypochlorit, verschiedene Öle und Säuren) bekannt, die gute Erfolge bei

samenbürtigen Pathogenen besitzen. Da die Lokalisierung von A. valerianellae am

oder im Saatgut unklar ist, sollten Kombinationen aus Behandlungen, die Pathogene

innerhalb des Samens und Behandlungen, die vermehrt die Samenoberfläche

angreifen, für zukünftige Untersuchungen ebenso berücksichtigt werden wie

Einzelbehandlungen.

Für den Feldsalatanbau sind keine Bakterizide zugelassen, daher sollte die

Ausbreitung von A. valerianellae in Beständen mit pflanzenbaulichen Maßnahmen

kontrolliert werden. Dazu gehört, dass zunächst gesundes Saatgut ausgesät wird.

Resistente Feldsalatsorten sind derzeit nicht vorhanden. Des Weiteren soll darauf

geachtet werden, dass Feldsalat in einer Fruchtfolge angebaut wird, bei der auf

gleicher Fläche Feldsalat nicht direkt auf Feldsalat folgt, sondern mit mindestens

einjährigem Abstand, um einer Bodenüberdauerung entgegenzuwirken. Die

Feldsalatkultur soll zudem entsprechend der Erregeransprüche so trocken wie

möglich geführt werden, um eine Infektion zu vermeiden. Das heißt, dass man auf

ein rasches Abtrocknen der Blätter achten muss, indem der Bestand gut durchlüftet

wird. Beregnungen in den Abendstunden sind nach Möglichkeit nicht durchzuführen.

Da die Vermehrung von A. valerianellae bei höheren Temperaturen umso schneller

erfolgt, kann ein Feldsalatanbau in der wärmeren Jahreszeit nicht befallsreduzierend

wirken (HINRICHS-BERGER et al., 2005, MOLTMANN et al., 2000).

ZUSAMMENFASSUNG

158

5 ZUSAMMENFASSUNG

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen Beitrag zur Aufklärung der Epidemiologie

des phytopathogenen Bakteriums Acidovorax valerianellae an Feldsalat

[Valerianella locusta (L.)] zu leisten, indem Untersuchungen zu

Infektionsbedingungen, zur Sortenanfälligkeit, zum Übertragungsweg und

Saatgutuntersuchungen durchgeführt wurden. Darauf aufbauend sollten

Bekämpfungsmöglichkeiten aufgezeigt werden.

Die Ergebnisse der Untersuchungen zu den Infektionsbedingungen zeigten, dass die

Infektion von A. valerianellae von der Temperatur, dem Blattalter, der

Inokulumdichte und der Blattnässedauer abhängig war. Eine Inokulation war bei

Temperaturen zwischen 10 °C und 30 °C erfolgreich. Infizierbar waren sowohl

Keim- als auch Laubblätter. Zudem war die Infektion unabhängig von der

Inokulumdichte zwischen 102 cfu/ml und 107 cfu/ml möglich. Die

Infektionsgeschwindigkeit und Symptomausprägung nahmen dabei zu, je höher die

Temperatur, je älter die Blätter und je konzentrierter das Inokulum waren. Die

Blattnässedauer beziehungsweise die relative Luftfeuchtigkeit waren für die

Infektion von enormer Wichtigkeit. Bei ausschließlich trockenen Bedingungen

wurde kein Befall an inokulierten Feldsalatpflanzen hervorgerufen. Ein Auftreten

beziehungsweise Wiederauftreten feuchter Bedingungen nach der Inokulation

förderte hingegen den Befall maßgeblich. Für eine Infektion waren fünf Stunden

Blattnässedauer ausreichend. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass eine gezielte

Kulturführung mit kurzen Blattnässezeiten eine Möglichkeit zur Kontrolle des

Schaderregers A. valerianellae darstellt.

Alle der 13 getesteten kommerziellen Feldsalatsorten waren anfällig, die Resistenz

der Wildart V. rimosa wurde hingegen bestätigt. Ein Rückgriff auf diese Wildart zum

Einkreuzen mit kommerziellen Sorten erscheint geboten.

A. valerianellae überdauerte einen Zeitraum von bis zu elf Monaten im Boden.

Feldsalatkulturen, die unmittelbar beziehungsweise ein bis elf Monate nach

infiziertem Feldsalat angebaut wurden, waren teilweise in erheblichen Umfang

ZUSAMMENFASSUNG

159

befallen. Die Anzahl an Symptom tragenden Pflanzen war mit zunehmender

Verrottung von infiziertem Feldsalatmaterial abnehmend. Eine Anbaupause von

mindestens zwölf Monaten und ein Fruchtfolgewechsel stellen somit eine geeignete

Methode zur Eliminierung von A. valerianellae aus dem Boden dar.

Alternative Wirtspflanzen von A. valerianellae wurden neben Feldsalat in den

vorgestellten Untersuchungen nicht gefunden und sind in der Literatur auch nicht

beschrieben.

A. valerianellae ist saatgutübertragbar. Um eine weitere Ausbreitung dieser

gefährlichen Krankheit des Feldsalats auf neue Flächen zu unterbinden, ist ein

besonderes Gewicht auf den Einsatz gesunden Saatgutes zu legen.

Die Ergebnisse der Dekontaminationsmaßnahmen zeigten, dass die A. valerianellae-

Belastung von Saatgut durch eine Warmwasser- (43 °C für 20 Minuten, 55 °C für

20 Minuten, 60 °C für 5 Minuten) oder Dampfbehandlung (66 °C für 105 Sekunden)

reduziert wurde. Eine vollständige Elimination des Bakteriums wurde allerdings

nicht erreicht.

Auf Grundlage der vorliegenden Arbeit ergeben sich folgende

Bekämpfungsmöglichkeiten: Durch die Aussaat von gesundem Saatgut auf Flächen,

auf denen mindestens zwölf Monate zuvor kein infizierter Feldsalat stand und durch

eine trockene Kulturführung kann der A. valerianellae-Befall von Feldsalat reduziert

werden.

SUMMARY

160

6 SUMMARY

The aim of this study was to contribute to clarifying the epidemiology of the

phytopathogenic bacterium Acidovorax valerianellae on corn salad [Valerianella

locusta (L.)]. To this end, research was conducted on infection conditions, cultivar

sensitivities, transmission paths and seeds. Based on these results, control strategies

shall be demonstrated.

The tests performed under infectious conditions revealed that the infection of

A. valerianellae is dependent on temperature, leaf age, inoculum concentration and

leaf moisture, as well as the relative humidity. Inoculation was possible at

temperatures between 10 °C and 30 °C. It was possible for leaves of any age to be

infected. Moreover, infection was independent of the inoculum concentration, and

occurred between 102 and 107 cfu/ml. The speed of infection and the characteristics

of the symptoms increased with increasing temperature, leaf age and inoculum

concentration. Both the duration of leaf moisture and the relative humidity played a

crucial role in the infection process. Under dry conditions, inoculated corn salad

plants developed no symptoms. However, infestation increased significantly under

humid conditions or during humid periods. Five hours of leaf moisture sufficed for

an infection to occur.

It was demonstrated that targeted dry growth conditions with short leaf moisture

periods constitute an option for controlling A. valerianellae.

All 13 tested commercial corn salad cultivars were prone to A. valerianellae.

However, the resistance of the wild type V. rimosa was confirmed.

For this reason, it seems advisable to cross the wild type with commercial cultivars.

A. valerianellae endured for up to eleven months in the soil. Some of the corn salad

cultivars cultivated immediately (and one up to eleven months, respectively) after

infected plants were severely infected. The number of infected plants decreased in

line with increased rotting of infected old plant material.

A cultivation break of at least twelve months and the rotation of crops therefore

appear to be appropriate ways to eliminate A. valerianellae from the soil.

SUMMARY

161

No alternative hosts were detected in the experiments or in the literature.

In addition, this study revealed that A. valerianellae is transmitted via seeds.

It is therefore important to focus on healthy seeds to prevent the further

dissemination of this hazardous disease to uncontaminated crop land.

Seeds with natural A. valerianellae contamination were tested using a variety of

decontamination methods. Warm water treatment (43 °C for 20 minutes, 55 °C for

20 minutes, 60 °C for 5 minutes) or hot steam treatment (66 °C for 105 seconds)

managed to reduce the contamination rate. However, it was not possible to

completely eliminate the bacterium.

In summary, sowing healthy seeds after a cultivation break of at least twelve months

and under dry growth conditions may reduce the infestation of corn salad with

A. valerianellae.

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162

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ANHANG

167

8 ANHANG

8.1 Publikationen

THIELE, K., BRAJE, I., RABENSTEIN, F., LAUN, N., SMALLA , K. (2011):

Untersuchungen zur Biologie und Entwicklung praxis-relevanter Nachweismethoden für bakterielle Erkrankungen am Feldsalat [Valerianella locusta (L.)] als Grundlage für die Selektion von Resistenzquellen gegen den Erreger von Blattflecken (Acidovorax valerianellae sp. nov), 18. Innovationstag Mittelstand des Bundesministeriums für Wirtschaft und Technologie in Berlin, Posterbeitrag.

THIELE, K., SMALLA , K., BRAJE, I., RABENSTEIN, F. (2010): Nachweis und

molekulare Charakterisierung von Acidovorax valerianellae, dem Erreger von bakteriellen Blattflecken an Feldsalat (Valerianella locusta (L.) Laterr., 57. Deutsche Pflanzenschutztagung in Berlin, Posterbeitrag.

BRAJE, I., ALBRECHT, A., LAUN, N., KRAUTHAUSEN, H.-J., BARCHEND, G.,

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LEINHOS, G., BRAJE, I., HÖRENER, G., KRAUTHAUSEN, H.-J. (2006): Falscher

Mehltau an Petersilie: Vorkommen, Biologie und Kontrollstrategien, 55. Deutsche Pflanzenschutztagung in Göttingen, Posterbeitrag.

BRAJE, I. (2005): Untersuchungen zur Epidemiologie des phytopathogenen

Bakteriums Acidovorax valerianellae an Feldsalat [Valerianella locusta (L.)], Diplomarbeit, Universität Hohenheim, Deutschland.

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Neues über diesen bakteriellen Schaderreger: Acidovorax – ernstes Problem bei Feldsalat, Gemüse, 3, 32-34.

HINRICHS-BERGER, J., BERGER, S., BRAJE, I., JASU, H., BUCHENAUER, H. (2004):

Zur Epidemiologie des phytopathogenen Bakteriums Acidovorax valerianellae an Feldsalat, 54. Deutsche Pflanzenschutztagung in Hamburg, 73-74.

.

ANHANG

168

8.2 Lebenslauf

Name Inga Braje

Geburtsdatum 16.07.1979

Geburtsort Wilhelmshaven

Schulausbildung

1986 – 1990 Grundschule Voslapp, Wilhelmshaven

1990 - 1992 Orientierungsstufe Nogatstrasse, Wilhelmshaven

1992 – 1999 Gymnasium Käthe-Kollwitz-Schule, Wilhelmshaven

Abschluß: Abitur

Universität

10/2000 – 03/2005 Agrarbiologie, Universität Hohenheim

Abschluß: Diplom (Dipl. Agr.-Biol.)

seit 04/2006 Promotion, Universität Hohenheim, Fachgebiet Phytomedizin

(extern am Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum

Rheinpfalz, Neustadt an der Weinstrasse)

Berufstätigkeit

04/2005 – 12/2005 Dienstleistungszentrum Ländlicher Raum Rheinpfalz,

Queckbrunnerhof, Schifferstadt

01/2006 – 03/2006 Enza Zaden Deutschland, Dannstadt-Schauernheim

Praktika

08/1999 – 08/2000 Freiwilliges Ökologisches Jahr, Verein Umwelterziehung

Iffens e.V., Butjadingen

08/2002 – 09/2002 Demeter-Hof Friedhard Bühler, Murr

08/2003 – 09/2003 Nitratlabor Heidelberg und Betreuungsdienst Nützlingseinsatz

Nordbaden e. V., Heidelberg

___________________

Inga Braje

ANHANG

169

8.3 Versicherung

Hiermit versichere ich, Inga Braje, dass ich nicht bereits früher oder gleichzeitig

einen Antrag auf Eröffnung eines Promotionsverfahrens unter Vorlage der hier

eingereichten Dissertation gestellt habe.

Böhl-Iggelheim, 24.10.2011

___________________

Inga Braje

8.4 Erklärung

Hiermit erkläre ich, Inga Braje, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig

angefertigt und nur die angegebenen Quellen als Hilfsmittel benutzt habe. Wörtlich

und inhaltlich übernommene Stellen sind als solche in der Arbeit gekennzeichnet.

Böhl-Iggelheim, 24.10.2011

___________________

Inga Braje

Documents

Untersuchungen zur bakteriellen Erkrankung an Feldsalat...von Inga Braje aus Wilhelmshaven 2012 2 Die vorliegende Arbeit wurde am 16.03.2012 von der Fakultät Agrarwissenschaften der