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I
Untersuchungen zur Biosynthese
und zum Wirkmechanismus der Abyssomicine
vorgelegt von
Diplom-Biochemikerin
Simone Keller
Von der Fakultät II – Mathematik und Naturwissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
Dr. rer. nat.
Genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. A. Grohmann
Berichter/Gutachter: Prof. Dr. R. D. Süssmuth
Berichter/Gutachter: PD Dr. U. Keller
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 24. April 2007
Berlin 2007
D83
II
für Heiko
I
Zusammenfassung
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, neue Erkenntnisse zum Wirkmechanismus und zur Bio-
synthese der Abyssomicine zu gewinnen. Ein wichtiger Meilenstein hierbei war die Ent-
deckung weiterer Mitglieder der Abyssomicin-Familie, insbesondere des atrop-Abyssomicin
C, welches ein wirksameres Antibiotikum als Abyssomicin C und zudem leichter aufzu-
reinigen ist. Besonders die Untersuchungen zur Abyssomicinbiosynthese wurden von dieser
Entdeckung entscheidend erleichtert. In die Abyssomicinbiosynthese, die im Rahmen dieser
Arbeit mittels Fütterungsexperimenten von 13C-markierten Vorläufern untersucht wurde,
konnten entscheidende Einblicke gewonnen werden. Es gelang die Zuordnung der Herkunft
aller Kohlenstoffatome des atrop-Abyssomicin C. Durch Fütterung von markiertem Acetat,
Propionat und Glucose konnte geklärt werden, dass C-1, C-2, C-7 bis C-13 sowie C-17 von
Acetat stammen, C-3 bis C-6 sowie C-18 und C-19 stammen von Propionat und C-14 bis
C-16 werden vermutlich über Enoylpyruvat-S-ACP in atrop-Abyssomicin C eingebaut.
Die Untersuchung des Wirkmechanismus wurde auf drei Säulen aufgebaut: Zunächst wurde
ein einfaches Modellsystem (Mercaptoethanol, N-Acetyl-Cystein) gewählt, das mit atrop-
Abyssomicin C umgesetzt wurde. So konnte gezeigt werden, dass atrop-Abyssomicin
nucleophil durch Schwefel angegriffen werden kann, und zudem eine Umlagerung zu einer
Abyssomicin D-artigen Struktur erfolgt. Die zweite Säule zur Untersuchung des
Wirkmechanismus war eine hemmkinetikische Untersuchung. Hierfür wurden zunächst die an
der Aminodesoxychorismatsynthese beteiligten Enzyme PabA (Klonierung und
Überexpression erfolgte bereits im Rahmen der Diplomarbeit) und PabB aus aus dem
Gesamtgenom des Abyssomicin-sensitiven B. subtilis in E. coli kloniert, überexprimiert und
eine Reinigungsstrategie etabliert. Zur Verfolgung der Enzymreaktion wurde ein geeignetes
Assay-System entwickelt, das eine direkte Beobachtung der ADC-Synthase Reaktion
ermöglichte. Es wurde eine LC-MS basierte MRM-Methode etabliert, mit der die Bildung von
ADC durch den MRM-Übergang von m/z 226 zu m/z 191 aufgezeichnet wird. Zur
Hemmkinetik wurden verschiedene atrop-Abyssomicinkonzentrationen unterschiedlich lange
mit ADC-Synthase inkubiert, die Enzymreaktion gestartet und mittels MRM quantifiziert.
Dabei ergab sich ein Hemmmuster, das einer irreversiblen Inhibition entspricht. Die dritte
Säule schließlich war die Untersuchung der Bindungsstelle von atrop-Abyssomicin C an
PabB. Diese erfolgte durch Verdau des mit Inhibitor inkubierten Enzyms sowie des
unbehandelten Enzyms durch Endoproteinase GluC, anschließender LC-MS und LC-MS/MS-
Analytik und Vergleich. Hierbei wurde herausgefunden, dass atrop-Abyssomicin C kovalent
an die Seitenkette von 263Cys des Peptids TPDFFQIICGSPE bindet.
Inhaltsverzeichnis
I
1 EINLEITUNG 1 1.1 Antibiotika, die auf den Folsäuremetabolismus wirken 2
1.1.1 Die Bedeutung der Folsäure 2 1.1.2 Die Folsäurebiosynthese 4 1.1.3 Beispiele für Antibiotika des Folsäuremetabolismus 4
1.2 Abyssomicin C 7 1.2.1 Die Screeningmethode 11 1.2.2 Die Biosynthesen des Shikimat-Stoffwechselweges 11
1.3 Die p-Aminobenzoesäurebiosynthese 13 1.3.1 Das Folat-Operon von Bacillus subtilis 13 1.3.2 Die Enzyme der p-Aminobenzoesäuresynthese 14 1.3.3 Abyssomicin C und die p-Aminobenzoesäurebiosynthese 21
1.4 Polyketidsynthese 23 1.4.1 Polyketidsynthasen vom Typ I 24 1.4.2 Der Synthesemechanismus 25 1.4.3 Die Biosynthese von Chlorothricin 26
2 GRUNDLAGEN 29 2.1 Chromatographie und Massenspektrometrie 29
2.1.1 Elektrospray-Ionisierung (ESI) 29 2.1.2 Der Triple Quadrupol Analysator 30 2.1.3 Applied Biosystems/MDS Sciex QTrap 2000 32 2.1.4 LC-ESI-MS-Kopplung 33 2.1.5 MS/MS-Experimente 33
2.2 Kernresonanzspektroskopie 35 2.2.1 Das COSY-Experiment 36 2.2.2 Das TOCSY-Experiment 37 2.2.3 Das HMQC-Experiment 39 2.2.4 Das HMBC-Experiment 39
2.3 Enzymkinetik 40
3 ZIELSETZUNG 44
4 MATERIAL UND METHODEN 45 4.1 Material 45
4.1.1 Geräte 45 4.1.2 Chemikalien 46 4.1.3 Enzyme 47 4.1.4 Medien 47 4.1.5 Medienzusätze 48 4.1.6 Lösungen 49 4.1.7 Bakterienstämme 56 4.1.8 Plasmide 57 4.1.9 Primer 57
4.2 Mikrobiologische Methoden 58 4.2.1 Lagerung und Anzucht von Verrucosispora AB-18-032 58 4.2.2 Fütterungsexperimente mit 13C-isotopenmarkierten Verbindungen 58 4.2.3 Isolierung der Abyssomicine aus Kulturen von Verrucosispora 58
Inhaltsverzeichnis
II
4.2.4 LC-ESI-MS und LC-DAD zur Untersuchung der Abyssomicine 59 4.2.5 Präparative HPLC-MS 60 4.2.6 Umsetzungen von Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C mit Nucleophilen 61 4.2.7 Testierung der Abyssomicine auf antibiotische Aktivität 63
4.3 Molekularbiologische Methoden 63 4.3.1 Isolierung von chromosomaler DNA aus B. subtilis DSM 10 63 4.3.2 Agarose-Gelelektrophorese 64 4.3.3 Polymerasekettenreaktion (PCR) 64 4.3.4 Restriktionsverdau, Phosphatase-Reaktionen und Ligationen 65 4.3.5 Reinigung von DNA-Fragmenten 65 4.3.6 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen 66 4.3.7 Transformation von kompetenten E. coli-Zellen mit Plasmid-DNA 66 4.3.8 Isolierung von Plasmid-DNA 66
4.4 Proteinchemische Methoden 67 4.4.1 Induktion und Überexpression 67 4.4.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 67 4.4.3 Reinigung von PabA 68 4.4.4 Reinigung von PabB 68 4.4.5 Proteinbestimmung 68 4.4.6 GluC-Verdau 69 4.4.7 Kinetik der ADC-Synthase-Reaktion 70
5 ERGEBNISSE 75 5.1 Strukturaufklärung neuer Abyssomicine 75
5.1.1 Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C 75 5.1.2 Abyssomicin B 79 5.1.3 Abyssomicin G 83 5.1.4 Abyssomicin H 90 5.1.5 Weitere Abyssomicine 94 5.1.6 Abyssomicin A 97 5.1.7 Zusammenfassung 97
5.2 Untersuchungen zur Biosynthese von atrop-Abyssomicin C 100 5.2.1 Fütterung von 1-13C markiertem Acetat 100 5.2.2 Fütterung von 1,2-13C-markiertem Acetat 101 5.2.3 Fütterung von 1-13C-markiertem Propionat 103 5.2.4 Die C3-Einheit der Tetronsäure 104 5.2.5 Zusammenfassung 106
5.3 Überexpression und Aufreinigung der Proteine PabA und PabB 108 5.3.1 Konstruktion des Plasmids 108
5.4 Untersuchungen zum Wirkmechanismus von Abyssomicin 111 5.4.1 Umsetzung von atrop-Abyssomicin C mit Mercaptoethanol und N-Acetylcystein 111 5.4.2 Umsetzung von atrop-Abyssomicin C mit PabB 115 5.4.3 Hemmkinetik von ADC-Synthase mit atrop-Abyssomicin C 116
6 DISKUSSION 123 6.1 neue Abyssomicine 123
6.1.1 Abyssomicin B und G 123 6.1.2 Abyssomicin D und H 124 6.1.3 Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C 125
6.2 Biosynthese der Abyssomicine 129 6.3 Wirkung von atrop-Abyssomicin C als irreversibler Inhibitor von PabB 134
Inhaltsverzeichnis
III
6.3.1 Vergleich von atrop-Abyssomicin C mit literaturbekannten irreversiblen Inhibitoren 135 6.3.2 Vergleich von B. subtilis PabB mit PabB anderer Organismen und mit der Anthranilatsynthase 139 6.3.3 Überlegungen zum Resistenzmechanismus von Verrucosispora AB-18-032 144
6.4 Zusammenfassung und Ausblick 146
7 LITERATUR 147
8 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 157
9 TABELLENVERZEICHNIS 162
Abkürzungsverzeichnis
IV
ACN Acetonitril
ACP Acyl Carrier Protein
ADC Aminodesoxychorismat
Amp Ampicillin
APS Ammoniumpersulfat
AT Acyltransferase
ATP Adenosintriphosphat
BCA Bicinchoninsäure
BSA Rinderserumalbumin
CRM Charged Residue Model
DH Dehydratase
DHF Dihydrofolsäure
DNA Desoxyribonucleinsäure
dNTP Desoxyribonucleosidtriphosphat
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
dTMP Desoxythymidinmonophosphat
DTT Dithiothreitol
dUMP Desoxyuridinmonophosphat
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EIC Extracted ion chromatogram
EMS Enhanced MS
EPI Enhanced Product Ion Scan
ER Enoylreduktase
ES Elektrospray
ESI Elektrospray-Ionisation
eV Elektronenvolt
GATase Glutamin-Amidotransferase
HPLC High performance liquid chromatography
IEM Ion Evaporation Model
IMP Inositolmonophosphat
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
kDa Kilodalton
KR Ketoreduktase
KS Ketosynthase
Abkürzungsverzeichnis
V
LC Liquid chromatography
MRM Multiple Reaction Monitoring
MCS Multiple cloning site
MS Massenspektrometrie
m/z Verhältnis Masse zu Ladung
NL Neutral Loss / Neutralverlust
OD Optische Dichte
ORF Open reading frame
pABA p-Aminobenzoesäure
PabA β-Untereinheit der ADC-Synthase
PabB α-Untereinheit der ADC-Synthase
PabC ADC-Lyase
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PC Precursor Ion Scan
PCR Polymerasekettenreaktion
PI Product Ion Scan / Produktionen Scan
PKS Polyketidsynthase
PLP Pyridoxalphosphat
RNA Ribonucleinsäure
rpm Revolutions per Minute
SDS Natriumdodecylsulfat
TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
TE Thioesterase
TFA Trifluoressigsäure
THF Tetrahydrofolsäure
TIC Totalionen-Chromatogramm
TRAP Tryptophan-RNA-Binding Attenuation Protein
Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Für Aminosäuren wurde entsprechend den Vorschlägen der IUPAC-IUB-Kommission (1984)
für biologische Nomenklatur der Ein- oder Dreibuchstaben-Code verwendet.
Einleitung
1
1 Einleitung „Da für die (…) Masse von Leichnamen, die täglich und fast stündlich zu jeder Kirche
gebracht wurden, die geweihte Erde für das Begräbnis nicht mehr ausreichte, besonders,
wenn man nach altem Brauch jedem sein eigenes Grab hätte geben wollen, wurden in den
Kirchhöfen, als jeder Platz belegt war, große Gräben ausgehoben und die Neuverstorbenen
zu Hunderten hineingelegt. Sie wurden dort schichtweise, wie im Schiffsraum die Waren,
übereinandergestapelt und mit wenig Erde bedeckt…“
So schreibt Giovanni Boccaccio in seinem Meisterwerk „Il Decamerone“ über das Jahr 1348
in Florenz, als die Pest in Europa so viele Opfer forderte wie nie zuvor und nie wieder seither
eine Seuchenkatastrophe. Heutzutage tritt die Pest im europäischen Raum höchst selten auf,
und falls doch, lässt sie sich hervorragend z. B. mit dem Antibiotikum Streptomycin
behandeln. Wie die Pest sind die meisten bakteriellen Infektionen mittlerweile gut durch
Antibiotika in den Griff zu bekommen. Dies ist um so beeindruckender, wenn man bedenkt,
dass noch zu Beginn des 20. Jahrhunderts die Heilungschancen einer schweren bakteriellen
Infektion kaum besser standen als heutzutage die eines bösartigen Tumors oder von HIV. Die
Tatsache, dass inzwischen eine Vielzahl hochwirksamer, routinemäßig einsetzbarer
Medikamente zur Behandlung von Infektionskrankheiten zur Verfügung steht, wäre nicht
vorstellbar ohne herausragende Arbeiten von Forschern der letzten zwei Jahrhunderte.
Der erste, der einen lebenden Mikroorganismus als Ursache einer Infektionskrankheit
identifizieren konnte, war Robert Koch, der 1876 das Milzbrandbazillus entdeckte. Er war es
auch, der die Grundlagen der Bakteriologie schuf, in dem er Methoden zur Züchtung und
Färbung von Bakterien entwickelte.
Sicherlich ein Meilenstein in der Geschichte der Antibiotika war Alexander Flemings
Entdeckung des Penicillins 1928 (Publikation 1929). Fleming hatte beobachtet, dass
Stoffwechselprodukte des Pilzes Penicillium notatum das Wachstum von Bakterienkolonien
hemmen. Kurze Zeit später (1932) entdeckte Gerhard Domagk die antibiotische Wirkung des
Azofarbstoffs Prontosil.
Im zweiten Weltkrieg zeigte sich der unschätzbar hohe Wert des Penicillins, dessen Isolierung
E. Chain und H.W. Florey 1940 gelang, im Kampf gegen verschiedenste
Infektionskrankheiten (Abraham, 1983). Dies regte die Suche nach neuen antibiotisch
wirksamen Naturstoffen und wirksamen chemischen Abwandlungen derselben an.
Heute verfügen wir über eine Vielzahl hochaktiver Antibiotika, denen unterschiedlichste
chemische Strukturen und Wirkorte zugrunde liegen. Die Suche nach neuen Antibiotika
Einleitung
2
jedoch ist aktuell geblieben. Allzuschnell vermögen die meisten Bakterien
Resistenzmechanismen zu entwickeln, durch die sie sich der antibiotischen Therapie
entziehen können. Die zukünftige Bekämpfung von bakteriellen Infektionskrankheiten wird
also immer ein Wettlauf mit der Zeit sein, bei dem der Mensch neue Wirkstoffe den sich
entwickelnden Resistenzen entgegensetzen muß.
1.1 Antibiotika, die auf den Folsäuremetabolismus wirken
1.1.1 Die Bedeutung der Folsäure
Folsäure gehört zu den Vitaminen der B-Gruppe. Während der menschliche Organismus
Folsäure nicht synthetisieren kann und seinen Bedarf über die Nahrung decken muss,
verfügen Pflanzen, Bakterien und einige Protozoen wie z.B. Plasmodien über die zur
Biosynthese erforderlichen Enzyme. Die im Organismus aktive Form ist die durch Reduktion
entstehende Tetrahydrofolsäure (Abbildung 1-1), die als Überträger von Methyl- und
Formylgruppen dient. Eine wichtige Rolle kommt der Tetrahydrofolsäure beim
Nucleotidstoffwechsel zu: Sowohl zum Aufbau der Purinnucleotide (Abbildung 1-2) als auch
zur Umwandlung von dUMP zu dTMP (Abbildung 1-3) wird Tetrahydrofolat benötigt.
N
N
HN
NH
H2N
O HN
HN
O
COO-H
COO-
H
10
5
p-Aminobenzoesäure
Glutamat
Abbildung 1-1. Struktur der Tetrahydrofolsäure.
Bei der Purinbiosynthese wird an zwei Stellen eine Formylgruppe von N10-Formyl-
Tetrahydrofolat auf eine Aminogruppe des Zwischenprodukts übertragen (Benkovic, 1984;
Mueller und Benkovic, 1981). Dabei wird N10-Formyl-Tetrahydrofolat zu Tetrahydrofolat
(s. Abbildung 1-2) umgewandelt.
Einleitung
3
HN
N N
N
P-Ribosyl
O
H2N
NH
N
N
P-Ribosyl
O
O
H
H2N
H2N N
N
P-Ribosyl
O
NH
HN
P-Ribosyl
O
H
ONH
NH2
P-Ribosyl
O
N10-Formyl-THF THF
GAR TFase
AICAR TFase
GAR FGAR
AICAR FAICAR IMP
5 Schritte
3 SchritteRibose-5'-P
N10-Formyl-THF THF
Abbildung 1-2. Schritte der Purinbiosynthese, an denen THF beteiligt ist. GAR = Glycinamid-β-D-ribofuranosyl-5’-monophosphat; FGAR = Formylglycinamid-β-D-ribofuranosyl-5’-mono-phosphat; GAR TFase = Glycinamidribonucleotid Transformylase; AICAR = 5-Amino-4-imidazolcarboxamid-β-1-D-ribofuranosyl-5’-monophosphat; FAICAR = 1’-[(5-Formylamino)-4-(aminocarbonyl)-1-imidazolyl]-β-D-ribofuranosyl-5’-monophosphat; AICAR TFase = 5-Amino-4-imidazolcarboxamid-ribonucleotid Transformylase
Im Hinblick auf mögliche Zielproteine oder Zielstrukturen für Antibiotika noch interessanter
ist die Biosynthese von Thymidylat (dTMP) aus dUMP (s. Abbildung 1-3). Die Umwandlung
von dUMP zu dTMP wird durch Thymidylat-Synthase katalysiert. Diese überträgt eine
Methylengruppe von N5,N10-Methylen-Tetrahydrofolat auf dUMP. Ungewöhnlich an dieser
Reaktion ist, dass bei der anschließenden Reduktion der Methylen- zur Methylgruppe
Tetrahydrofolat zu Dihydrofolat oxidiert wird und durch Dihydrofolat-Reduktase wieder zu
Tetrahydrofolat reduziert werden muss (Carreras und Santi, 1995).
Einleitung
4
O
HOH
HH
HH
HN
N
O
O
CH3
OP-O
O
O-O
OHOH
HH
HH
HN
N
O
O
OP-O
O
O-
N
N
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NH
H2N
O
CH2
H
NC RH
HN
N
N
NH
H2N
O HN R
N
N
HN
NH
H2N
O
CH2
HN R
H
dUMP dTMP
Thymidylat-Synthase
N5,N10-Methylen-
tetrahydrofolat
Dihydrofolat
Dihydrofolat-Reduktase
Tetrahydrofolat
Abbildung 1-3. Die Biosynthese von dTMP aus dUMP durch Thymidylat-Synthase. Alle drei Wasserstoffatome der Methylgruppe stammen von N
5,N
10-Methylentetrahydrofolat (grau hinterlegt). Deshalb muss das bei der dTMP-Biosynthese entstehende 7,8-Dihydrofolat durch Dihydrofolat-Reduktase wieder zu Tetrahydrofolat reduziert werden. Der mit Glutamat verknüpfte p-Aminobenzoesäure des Tetrahydrofolats ist in der Abbildung mit R bezeichnet.
1.1.2 Die Folsäurebiosynthese
Die Folsäurebiosynthese beginnt mit der Umwandlung von Guanosinmonophosphat zu
Dihydroneopterin (Mathis und Brown, 1980; Burg und Brown, 1986; Brown und Williamson,
1987; Bracher et al., 2001). Dieses wird durch Pyrophosphorylierung mit ATP aktiviert und
durch eine Reaktion mit p-Aminobenzoesäure zum Dihydropteroat verknüpft. Durch ATP-
abhängige Reaktion der Carboxygruppe mit der Aminogruppe von Glutamat entsteht
schließlich Dihydrofolsäure (Abbildung 1-5) (Green et al, 1996). Die aktive Form der
Folsäure ist die Tetrahydrofolsäure. Diese entsteht durch Reduktion der Dihydrofolsäure
durch Dihydrofolat-Reduktase (Charlton et al, 1979).
1.1.3 Beispiele für Antibiotika des Folsäuremetabolismus
Die Geschichte der Sulfonamid-Antibiotika begann 1932, als Gerhard Domagk bei der
Untersuchung neu synthetisierter Azofarbstoffe die antibiotische Wirkung des Prontosils
(Abbildung 1-5) auf Streptokokken entdeckte (Domagk, 1935). Prontosil selbst besitzt zwar
keine antibiotische Aktivität, wird jedoch nach Aufnahme durch den Säugetierorganismus
zum wirksamen Sulfanilamid (Abbildung 1-4) metabolisiert (Fuller, 1937). Domagk sollte
Einleitung
5
1939 den Nobelpreis für die Entdeckung der antibakteriellen Effekte des Prontosils erhalten,
die damalige nationalsozialistische Regierung gestattete ihm jedoch nicht, die Auszeichnung
anzunehmen. Erst 1947 konnte die Verleihung des Nobelpreises an Domagk stattfinden.
H2N
S
O
NH2
O
Abbildung 1-4. Struktur von Sulfanilamid, dem antibiotisch wirksamen Metaboliten des Prontosils.
Durch chemische Modifikation der Prontosil-Grundstruktur wurde eine große strukturelle
Vielfalt an Sulfonamiden entwickelt, die bei unterschiedlichen pharmakokinetischen und
toxikologischen Eigenschaften eine einheitliche Wirkung zeigten. Entscheidend für die
antibiotische Wirkung ist die freie Aminogruppe in para-Stellung (Northey, 1940). Wie aus
den chemischen Strukturen erkennbar ist, wirken Sulfonamide wie Sulfamethoxazol
(Abbildung 1-5) antibiotisch, indem sie kompetitiv die p-Aminobenzoesäure verdrängen.
Damit diese Verdrängung in ausreichendem Maße verläuft, müssen Sulfonamide in relativ
hohen Dosen (im Gramm-Bereich) verabreicht werden. Da Bakterien p-Aminobenzoesäure
zwar zur Vermehrung benötigen, durch einen Mangel aber nicht abgetötet werden, wirken
Sulfonamide bakteriostatisch und nicht bakterizid. Durch umfangreichen Einsatz von
Sulfonamidantibiotika bildeten sich rasch Resistenzen aus, so dass ihre Anwendung stark
eingeschränkt wurde. Heutzutage werden Sulfonamide nur noch in Kombination mit
Diaminobenzylpyrimidinen verabreicht.
Prominentester Vertreter der Diaminobenzylpyrimidine ist Trimethoprim (s. Abbildung 1-5).
Dieses hemmt die Dihydrofolsäurereduktase (Nichol und Welch, 1950; Burchall und
Hitchings, 1965), die, wie unter 1.1.1 beschrieben, vor allem bei der Synthese von Thymidin
eine entscheidende Rolle spielt, da sie die Reduktion der bei der Thymidinsynthese
entstehenden Dihydrofolsäure zur Tetrahydrofolsäure katalysiert. Wird die
Dihydrofolsäurereduktase gehemmt, so kann Tetrahydrofolsäure nicht regeneriert werden,
was eine Störung der Purin- und Thymidinbiosynthese verursacht. Da beides elementare
Bausteine der Replikation aber auch der Transkription sind, wird so das Bakterienwachstum
gehemmt. Die menschliche Dihydrofolsäurereduktase unterscheidet sich strukturell so stark
vom bakteriellen Enzym, dass sie durch Trimethoprim kaum gehemmt wird (Burchall und
Hitchings, 1965).
Die im medizinischen Einsatz verabreichte Wirkstoff-Kombination von Sulfonamiden mit
Trimethoprim zeichnet sich durch geringe Toxizität für den Wirtsorganismus sowie, als Folge
Einleitung
6
der Kombination der Hemmwirkung auf zwei unterschiedliche Schritte der
Folsäurebiosynthese, durch stärkere Wirksamkeit und verringerte Tendenz der
Resistenzbildung aus. Ein Hauptanwendungsgebiet für solche Kombinationen sind
Harnwegsinfektionen und, in höherer Dosis eingesetzt, die Pneumocystis carinii-Pneumonie.
Der breite Einsatz dieser Kombinationspräparate führte jedoch auch in den letzten Jahren in
starkem Maße zu Resistenzbildungen. Den Resistenzen gegen Sulfonamide und Trimethoprim
liegen mehrere verschiedene Mechanismen zu Grunde. So kann durch Überexpression von
p-Aminobenzoesäure eine Unempfindlichkeit des Bakteriums gegen Sulfonamide
hervorgerufen werden. Auch durch Überexpression der betroffenen Enzyme,
Dihydropteroatsynthase und Dihydrofolsäurereduktase, oder durch Veringerung ihrer
Affinität zu Sulfonamiden und Trimethoprim kann deren Wirkung herabgesetzt werden
(Sköld, 2001). Daneben existieren Resistenzen, die auf der Aufnahme von Folaten oder
Endprodukten wie Thymin aus der Umgebung basieren (Sköld, 2001). Auch Resistenzen, die
auf einer Undurchlässigkeit der äußeren Zellmembran für die beiden Substanzen beruhen
(Then, 1982), sind bekannt.
Dihydroneopterin
Dihydrofolat
Tetrahydrofolat
Dihydropteroat
6-OH-7,8-Dihydropterinpyrophosphat
Prontosil rubrum
N
N
H2C OCH3
OCH3
OCH3NH2
H2N
N
N
NH2
H2N
S
NH2
OO
NH2
S
NH
OO
SN
HN
N
O
H2N NH
HN CH2NH
O
HN
COOH
COOH
HN
N
O
H2N NH
N CH2NH
O
HN
COOH
COOH
HN
N
O
H2N NH
N CH2NH COOH
HN
N
O
H2N NH
N CH2O P-P
HN
N
O
H2N NH
N CH2OH
COOH
NH2
Chorismat
Trimethoprim
Sulfamethoxazol
Dihydroneopterin
Dihydrofolat
Tetrahydrofolat
Dihydropteroat
6-OH-7,8-Dihydropterinpyrophosphat
Prontosil rubrum
N
N
H2C OCH3
OCH3
OCH3NH2
H2N
N
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NH2
H2N
S
NH2
OO
NH2
S
NH
OO
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HN
N
O
H2N NH
HN CH2NH
O
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COOH
COOH
HN
N
O
H2N NH
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O
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COOH
COOH
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N
O
H2N NH
N CH2NH COOH
HN
N
O
H2N NH
N CH2O P-P
HN
N
O
H2N NH
N CH2OH
COOH
NH2
Chorismat
Trimethoprim
Sulfamethoxazol
Abbildung 1-5. Die Tetrahydrofolatbiosynthese und bekannte Inhibitoren.
Ein weiterer Wirkstoff, der in den Folsäurestoffwechsel eingreift, ist Methotrexat (Abbildung
1-6). Wie bei der Betrachtung der Strukturformel unschwer zu erkennen ist, handelt es sich
Einleitung
7
bei Methotrexat um einen Folsäureantagonisten. Methotrexat wird nicht als Antiinfektivum
eingesetzt, sondern zur Therapie von Autoimmunerkrankungen sowie, hoch dosiert, zur
Behandlung von Tumoren und Leukämie.
N
N
N
NH2N
NH2 N
HN
O
COO-H
COO-
10
5
H3C
Abbildung 1-6. Struktur des Folsäureantagonisten Methotrexat.
1.2 Abyssomicin C
Im Rahmen eines Screening-Programms basierend auf einer Idee von Prof. Hans Zähner in
Zusammenarbeit mit unserem Kooperationspartner Prof. Peter Fiedler und seiner
Arbeitsgruppe wurde durch gerichtetes biologisches Screening ein Naturstoff gefunden,
dessen antibiotische Wirkung auf eine Hemmung der Biosynthese von p-Aminobenzoesäure
(pABA) zurückzuführen ist (Riedlinger et al., 2004).
H3CCH3
O
HO
OO
O
CH3
HO
*
**
*
** **
*
H3C CH3
O O
OO
O
CH3
HO
*
*
*
** **
H3C CH3
OO
OO
O
CH3
HO
N
HO**
*
****
*
Abyssomicin B8 Sterozentren5 RingeC19H23O7N
Abyssomicin C7 Sterozentren4 RingeC19H22O6
Abyssomicin D9 Sterozentren5 RingeC19H24O7N
Abbildung 1-7. Strukturformeln der Abyssomicine B, C und D.
Die Substanzen wurden aus Kulturen des Actinomyceten Verrucosispora AB 18-032 isoliert,
der aus der Sagami Bay in der Japanischen See aus einer Tiefe von 289 m stammt. Drei
Sekundärmetabolite dieses Stammes, Abyssomicin B, C und D (Abbildung 1-7), wurden
isoliert und ihre Struktur aufgeklärt (Bister et al, 2004).
Einleitung
8
Die Untersuchung der analysenreinen Abyssomicine B, C und D durch einen
Agarplattendiffusionstest zeigte, dass nur Abyssomicin C antibiotisch aktiv ist und
inhibitorische Aktivität gegen Gram-positive Bakterien zeigt. Gram-negative Bakterien und
Pilze reagieren nicht sensitiv auf Abyssomicin C. Das Wirkspektrum von Abyssomicin C ist
in Tabelle 1-1 dargestellt.
Tabelle 1-1. Antibakterielles Spektrum von Abyssomicin C. Angegeben sind die Hemmhöfe des Plattendiffusionstests [mm] bei Verwendung von Komplexmedium (Riedlinger et al., 2004).
Abyssomicin C (mg/ml)
Organismus 1 0,3 0,1
Arthrobacter aurescens DSM 20166 14 10 -
Brevibacillus brevis DSM 30 17 12 9
Bacillus subtilis DSM 10 16 12 10
Micrococcus luteus ATCC 381 - - -
Mycobacterium phlei DSM 750 - - -
Staphylococcus aureus DSM 20231 19 11 9
Rhodococcus erythropolis DSM 1069 27 18 15
Streptomyces viridochromogenes Tü 57 11 9 -
Aufgrund der hochinteressanten Strukturen der Abyssomicine ist es nicht erstaunlich, dass
einige synthetisch arbeitende Gruppen sich an der Totalsynthese des Abyssomicin C versucht
haben. Drei erfolgreiche Synthesen wurden bisher publiziert. Die erste wurde von der Gruppe
Erik Sorensens veröffentlicht, die zweite und dritte von K.C. Nicolaou. Interessanterweise
gelang K.C. Nicolaou die Synthese eines zweiten dem Abyssomicin C sehr ähnlichen
Derivats, dem atrop-Abyssomicin C (Abbildung 1-8).
Einleitung
9
Abbildung 1-8: Röntgenstrukturen von Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C (Bister et al., 2004 und Nicolaou und Harris, 2006).
Es handelt sich hier um atrop-Isomere, die voneinander getrennt werden können und stabil
sind. Der Unterschied besteht in der Stellung der Doppelbindung zur Ketogruppe, die im Falle
des Abyssomicin C transoid (145°), im Falle des atrop-Abyssomicin C cisoid (26°) ist. Da die
Konjugation zwischen der Doppelbindung und der Carbonylgruppe beim atrop-Abyssomicin
C erhöht ist, handelt es sich bei atrop-Abyssomicin C um einen stärkeren Michael-Akzeptor.
Die physiko-chemischen Unterschiede zwischen Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C
sind geringfügig: Die Retentionszeiten unterscheiden sich in einem linearen
Standardgradienten von 5 auf 100 % wässriges ACN auf RP-C18 Phasen um 0,02 min, die
Masse ist identisch, die UV-Spektren ähnlich.
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
500
1000
1500
2000
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
500
1000
1500
2000
Abbildung 1-9: UV-Spektren von Abyssomicin C (links) und atrop-Abyssomicin C (rechts).
H3CCH3
O O
OO
O
CH3
HO
H
H
O=C7-C8=C9 26 °
cisoid
O
H
RO=C7-C8=C9 145 °
transoid
O R
H
Abyssomicin C atrop-Abyssomicin C
Einleitung
10
Einzig in NMR-Spektren sind deutliche Unterschiede bei den 13C-Verschiebungen von C-8
und C-9 sowie der 1H-Verschiebung von CH-9 auffällig. Die Kopplungsmuster in den
2D-Experimenten (COSY, TOCSY, HMBC) sind identisch. Aufgrund der hohen Ähnlichkeit
zwischen Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C gelang die Strukturaufklärung trotz
Identifizierung des atrop-Abyssomicin C in unserer Arbeitsgruppe nicht, bevor K.C. Nicolaou
Röntgenstruktur- und NMR-Daten veröffentlichte.
Einleitung
11
1.2.1 Die Screeningmethode
Die biologische Testierung war darauf ausgelegt, Inhibitoren der Biosynthese aromatischer
Aminosäuren und der p-Aminobenzoesäure zu finden. Es wurden 930 Extrakte von 201
Actinomyceten in einem zweistufigen Prozess getestet. Im ersten Schritt wurde ein
Hemmhoftest durchgeführt. Hierzu wurde Bacillus subtilis DSM 10 auf zwei verschiedenen
Agarplatten kultiviert. Für die erste Platte wurde Minimalmedium verwendet, für die zweite
Platte wurde dasselbe Minimalmedium mit L-Tryptophan (5 mM), L-Phenylalanin (5 mM),
L-Tyrosin (5 mM) und pABA (5 mM) supplementiert. Extrakte, die nur auf der ersten Platte
einen Hemmhof zeigten, nicht aber auf den supplementierten Platten, wurden einem zweiten
Test unterzogen, da bei diesen eine Hemmung einer der drei Biosynthesen zu erwarten war.
Im zweiten Schritt wurde ein Antagonismus-Test durchgeführt. Hierzu wurden zwei
Filterstreifen so auf eine Agarplatte gelegt, dass sie sich kreuzten. Einer der Filterstreifen
wurde mit dem antibiotischen Extrakt getränkt, der zweite Filterstreifen in einer Lösung des
vermuteten Antagonisten (Tyr + Phe, Trp, pABA). Die folgenden Kombinationen von
Antagonisten (jeweils 50 µl, Konzentration der einzelnen Komponenten = 5 mg/ml) wurden
verwendet: 1. Tyr + Trp + Phe + pABA (Kontrolle), 2. Tyr + Phe, 3. Trp, 4. pABA. Im Falle
eines vorliegenden Antagonismus wurde die Wachstumshemmung aufgehoben.
Im Falle des Extrakts aus dem Bakterienstamm Verrucosispora AB 18-032 wurde die
Aufhebung der Wachstumshemmung durch pABA beobachtet. Eine Zugabe von Tyr, Phe
oder Trp zeigte keinen antagonistischen Effekt. Dies ließ darauf schließen, dass ein Schritt in
der Biosynthese von pABA ausgehend von Chorismat inhibiert wurde.
1.2.2 Die Biosynthesen des Shikimat-Stoffwechselweges
Neben p-Aminobenzoesäure und den aromatischen Aminosäuren Tyrosin, Phenylalanin und
Tryptophan werden noch eine Reihe weiterer vorwiegend aromatischer Verbindungen wie
Ubichinon, Enterobactin und einige aromatische Sekundärmetabolite über den Shikimat-
Biosyntheseweg (Abbildung 1-10) gebildet. Shikimat wird bei Bakterien, Pilzen und Pflanzen
aus D-Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat synthetisiert und zu Chorismat
umgewandelt. Chorismat ist das letzte gemeinsame Zwischenprodukt der drei aromatischen
Aminosäuren und pABA. Fünf unterschiedliche Enzyme katalysieren die Reaktion von
Chorismat zu Prephenat, Anthranilat, Aminodesoxychorismat, Isochorismat und
p-Hydroxybenzoat (Dosselaere und Vanderleyden, 2001).
Einleitung
12
Chorismat
Biosynthese
Tryptophan
Ubichinon
Folat
TyrosinPhenylalanin
Shikimat
Enterobactin
Anthranilsäure
COOHO
COOH
NH2
COOHO
COOH
NH2
COOHO
COOH
OH
COOH
OH
OCOOH
COOH
NH2
COO H
OH
COO H
NH2
Pyruvat
Pyruvat
Pyruvat
p-Aminobenzoesäure
p-Hydroxybenzoesäure
Isochorismat
2-Amino-
2-desoxyisochorismat
COOH
OH
OH
2,3-Dihydroxybenzoesäure
4-Amino-4-desoxychorismat
Prephenat
NH3
NH3
NH3
NH3
H2O
H2O
H2O
H2O
Aminodesoxy-Chorismat-Synthase Aminodesoxy-
Chorismat-Lyase
ChorismatLyase
ChorismatMutase
AnthranilatSynthase
IsochorismatSynthase
COOHO
COOH
OH
Chorismat
Biosynthese
Tryptophan
Ubichinon
Folat
TyrosinPhenylalanin
Shikimat
Enterobactin
Anthranilsäure
COOHO
COOH
NH2
COO HO
COOH
NH2
COO HO
COOH
OH
COOH
OH
OCOO H
COO H
NH2
COO H
OH
COO H
NH2
Pyruvat
Pyruvat
Pyruvat
p-Aminobenzoesäure
p-Hydroxybenzoesäure
Isochorismat
2-Amino-
2-desoxyisochorismat
COOH
OH
OH
2,3-Dihydroxybenzoesäure
4-Amino-4-desoxychorismat
Prephenat
NH3
NH3
NH3
NH3
H2O
H2O
H2O
H2O
Aminodesoxy-Chorismat-Synthase Aminodesoxy-
Chorismat-Lyase
ChorismatLyase
ChorismatMutase
AnthranilatSynthase
IsochorismatSynthase
COOHO
COOH
OH
Abbildung 1-10. Biosynthesewege wichtiger Stoffwechselprodukte, die von Chorismat ausgehen.
Eine enge Verknüpfung besteht zwischen der Tryptophan- und der Folsäurebiosynthese.
Schon beim ersten Schritt, den Reaktionen der Anthranilat-Synthase und der
Aminodesoxychorismat-Synthase, besteht große Ähnlichkeit. In beiden Fällen wird
Chorismat mit Glutamin als Stickstoffquelle aminiert. Auch die Struktur der beiden Enzyme
ist ähnlich: Beide bestehen aus zwei nicht identischen Untereinheiten α und β, die zu
αβ-Dimeren assoziieren. Die kleinere β-Untereinheit ist eine Glutamin-Amidotransferase
(GATase), die die Amidgruppe von Glutamin zur größeren α-Untereinheit transferiert, die
diese auf Chorismat überträgt. Die größere α-Untereinheit kann auch ohne die β-Untereinheit
Chorismat aminieren, sofern NH3 zur Verfügung steht.
Die enge Verknüpfung der beiden Enzyme zeigt sich auch auf genetischer Ebene. Es wird
angenommen, dass die Gene der Enzyme durch Duplikation und divergente Entwicklung aus
einem gemeinsamen Vorläufer hervorgehen (Dosselaere und Vanderleyden, 2001).
Einleitung
13
1.3 Die p-Aminobenzoesäurebiosynthese
1.3.1 Das Folat-Operon von Bacillus subtilis
Während die Gene der p-Aminobenzoesäure-Synthese pabA, pabB und pabC bei E. coli ohne
Verbindung zueinander auf dem Chromosom liegen (Blattner et al., 1997), befinden sich
diese Gene bei B. subtilis in einem Operon (Slock et al., 1990). Das Folat-Operon von
B. subtilis (Abbildung 1-11) besteht aus neun Genen, von denen nur die ersten sechs an der
Folsäurebiosynthese beteiligt sind (Slock et al., 1990). Die 3’-Region des Operons enthält
drei zusätzliche ORFs: orf3, das vermutlich für ein DNA-bindendes Protein kodiert, orf4, das
zu orf1 des E. coli fis-Operons homolog ist und lysS, das für eine Lysyl-tRNA-Synthetase
codiert (de Saizieu et al., 1997).
Das Folat-Operon enthält zwei Promotoren, einer liegt vor dem ersten Gen pabB und der
zweite vor lysS. Bisher wurden vier mögliche Transkripte identifiziert, die die ersten zwei, die
ersten acht, alle neun bzw. das letzte Gen umfassen (de Saizieu et al., 1997).
pabB pabA pabC sul folKfolA lysSorf43
Lese-
rahmen
1412
2010
2891 3723 4085 4537 4746 5863
1426
2010
2873 37304082 4585
4752 5771
7362
pabB pabA pabC sul folKfolA lysSorf43
Lese-
rahmen
1412
2010
2891 3723 4085 4537 4746 5863
1426
2010
2873 37304082 4585
4752 5771
7362
Abbildung 1-11. Genorganisation des Folat-Operons. Die Richtung der Transkription ist von links nach rechts. Die kodierenden Sequenzen sind durch Pfeile gezeigt, die Zahlen bezeichnen die Position der ersten Base des Startcodons ATG und der letzten Base des Stoppcodons. Oberhalb des Folat-Operons sind die vier möglichen Transkripte eingezeichnet.
Die ersten drei Gene des Operons kodieren für Enzyme, die an der pABA-Synthese beteiligt
sind: pabB kodiert für die α-Untereinheit, pabA für die β-Untereinheit der
Aminodesoxychorismat-Synthase und pabC für die Aminodesoxychorismat-Pyruvat-Lyase.
Das Gen sul codiert für die Dihydropteroat-Synthase, folA für die Dihydroneopterin-Aldolase
und folK für die Pyrophosphokinase. Eine Übersicht über die Aufgabe dieser Enzyme in der
Folsäurebiosynthese samt der dazugehörigen Gene gibt Abbildung 1-12.
Einleitung
14
Dihydroneopterin
Dihydrofolat
Dihydropteroat
6-OH-7,8-Dihydropterin
6-OH-7,8-Dihydropterin-pyrophosphat
Chorismat + Glutamat
p-Aminobenzoesäure
Dihydroneopterin-Aldolase
Pyrophosphokinase
Dihydropteroat-
Synthase
Dihydrofolat-Synthase
folA
folK
sul
folC
AminodesoxychorismatSynthase
pabA
Aminodesoxychorismat
Lyase
pabC
pabB
Dihydroneopterin
6-OH-7,8-Dihydropterin
6-OH-7,8-
Chorismat + Glutamat
p-Aminobenzoesäure
folA
folK
sul
folC
Aminodesoxychorismat-Synthase
pabA
Aminodesoxychorismat-
Lyase
pabC
pabB
Dihydroneopterin
Dihydrofolat
Dihydropteroat
6-OH-7,8-Dihydropterin
6-OH-7,8-Dihydropterin-pyrophosphat
Chorismat + Glutamat
p-Aminobenzoesäure
Dihydroneopterin-Aldolase
Pyrophosphokinase
Dihydropteroat-
Synthase
Dihydrofolat-Synthase
folA
folK
sul
folC
AminodesoxychorismatSynthase
pabA
Aminodesoxychorismat
Lyase
pabC
pabB
Dihydroneopterin
6-OH-7,8-Dihydropterin
6-OH-7,8-
Chorismat + Glutamat
p-Aminobenzoesäure
folA
folK
sul
folC
Aminodesoxychorismat-Synthase
pabA
Aminodesoxychorismat-
Lyase
pabC
pabB
Abbildung 1-12. Ausschnitt aus der Folsäurebiosynthese. Unter den Enzymen sind jeweils die codierenden Gene aufgeführt, dabei sind die Gene aus dem Folat-Operon von B. subtilis grau hinterlegt.
1.3.2 Die Enzyme der p-Aminobenzoesäuresynthese
Die Biosynthese von pABA aus Chorismat erfordert zwei Enzyme: Die
Aminodesoxychorismat-Synthase (PabB; Gen Accession No. P28820; E.C. 6.3.5.8 für die
ADC-Synthase bestehend aus PabA und PabB) mit der Glutamin-Amidotransferase (pabA;
Gen Accession No. P28819) für die Synthese von Aminodesoxychorismat sowie die
Aminodesoxychorismat-Lyase (pabC; Gen Accession No. P28821; E.C. 4.1.3.38) für die
Bildung von pABA (Huang und Gibson, 1970; Ye et al., 1990; Green und Nichols, 1991).
Wie in Abschnitt 1.2.2 erwähnt wurde, weist die Aminodesoxychorismat-Synthase große
Ähnlichkeit zur Anthranilat-Synthase auf. Bei B. subtilis, Acinetobacter calcoaceticus und
Pseudomonas acidovorans (Sawula und Crawford, 1972; Sawula und Crawford, 1973;
Buvinger et al., 1981; Kane et al., 1972; Kane, 1977) existiert für beide Enzyme eine
amphibolische GATase, d. h. es gibt nur eine GATase, die sowohl mit Anthranilat-Synthase
als auch mit Aminodesoxychorismat-Synthase assoziieren kann.
Bei B. subtilis liegt das Gen, das für die amphibole GATase kodiert, im Folat-Operon (Kane
et al., 1972) und wird entweder mit pabA oder trpG bezeichnet. Interessanterweise erfolgt die
Regulation der Expression auf Translationsebene über TRAP (Tryptophan-RNA-Binding
Einleitung
15
Attenuation Protein), das auch die Transkription des trp-Operon reguliert. TRAP wird durch
L-Tryptophan aktiviert, das somit nicht nur seine eigene Biosynthese beeinflusst, sondern
auch die der p-Aminobenzoesäure (de Saizieu et al., 1997).
1.3.2.1 Die Glutamin-Amidotransferase (PabA)
Es gibt zwei Klassen von Glutamin-Amidotransferasen, die Ntn-Amidotransferasen und die
Triade-Amidotransferasen. Die Ntn-Amidotransferasen tragen als N-terminales Nucleophil
(Ntn) ein Cystein, während die Triade-Amidotransferasen eine katalytische Triade aus
Cystein, Histidin und Glutamat tragen. Einer älteren Nomenklatur folgend werden die Ntn-
Amidotransferasen als F-Typ und die Triade-Amidotransferasen als G-Typ bezeichnet. Dies
geht auf die E. coli-Gene purF, das für die Glutamin PRPP-Amidotransferase kodiert und
trpG, das für die Amidotransferase der Anthranilat-Synthase kodiert, zurück (Zalkin und
Smith, 1998).
Die etwa 20 kDa große GATase der Aminodesoxychorismat-Synthase (PabA) gehört zum
Typ der Triade-Amidotransferasen. Die katalytische Triade (Abbildung 1-13) besteht aus Cys,
His und Glu und ist vergleichbar mit der katalytischen Triade der Cysteinprotease Papain. Die
Cysteinseitenkette fungiert als Nucleophil, das am Glutamin angreift, der Histidinrest wirkt
als Protonendonor bei der Hydrolysereaktion, und der Glutamatrest stabilisiert das protonierte
Histidin (Zalkin und Smith, 1998).
NH
CHC
CH2
O
S
NH
CHC
H2C
O
N
NH
N
H
H
NH2
CH
C
H2C
OH
O
H2CCH2N
O
NH
CH
C
H2C
O
H2CCO
O
Cys
His
Glu
Abbildung 1-13. Die katalytische Triade von Glutamin-Amidotransferasen. Der Cysteinrest greift nucleophil am Glutamin an, der Histidinrest wirkt als Protonendonor bei der Hydrolysereaktion, und der Glutamatrest stabilisiert das protonierte Histidin.
Einleitung
16
Die GATase PabA ist nicht funktionsfähig, wenn sie nicht in einem – wenngleich schwachen
– 1:1-Komplex mit der α-Untereinheit der Aminodesoxychorismat-Synthase (PabB) assoziiert
vorliegt (Roux und Walsh, 1992; Viswanathan et al., 1995). PabB induziert vermutlich eine
Konformationsänderung bei PabA, die zur Aktivierung führt.
1.3.2.2 Die Aminodesoxychorismat-Synthase (PabB)
Während die β-Untereinheit der Aminodesoxychorismat-Synthase, die GATase PabA nur im
1:1-Komplex mit der α-Untereinheit PabB aktiv ist, kann PabB Chorismat auch ohne PabA
aminieren, sofern NH3 zur Verfügung steht, wenngleich dann die Umsatzrate geringer ist
(Dosselaere und Vanderleyden, 2001).
Die etwa 50 kDa große β-Untereinheit der ADC-Synthase katalysiert eine Mg2+-abhängige
Reaktion, die der Anthranilat-Synthase vermittelten Reaktion sehr ähnlich ist. In beiden
Fällen wird Chorismat aminiert, im ersten Fall zu 4-Amino-4-desoxychorismat (ADC), im
zweiten zu 2-Amino-2-desoxyisochorismat, die sich nur in der Position der Aminogruppe
unterscheiden. Dennoch verläuft die Reaktion der ADC-Synthase vermutlich nach einem
signifikant anderen Mechanismus unter Retention sowohl der Position als auch der
Stereochemie. Kozlowski et al. (1995) schlagen für das E. coli Enzym eine sequenzielle
1,3-Substitution vor, bei dem der nucleophile Angriff zunächst durch eine Lysinseitenkette an
C-2 erfolgt, dabei die Hydroxygruppe an C-4 abgespalten und dann eine Aminogruppe auf
C-4 übertragen wird (Abbildung 1-14).
COO
O
OH
COO
COO
O COO
Nu NuCOO
O
NH3
COO
Chorismat 4-Amino-4-desoxychorismat
NH3
EnzEnz
Abbildung 1-14. Möglicher Mechanismus von PabB nach Kozlowski et al. Die Reaktion verläuft über eine sequenzielle 1,3-Substitution unter Retention der Position und der Stereochemie. Der nucleophile Angriff erfolgt durch eine Aminosäure des Enzyms, begleitet von einer Dehydratisierung und dem nucleophilen Angriff von NH3.
Neuere Forschungsergebnisse der Gruppen von Chris Abell (Cambridge, UK) und Michael
Toney (Davis, Californien, USA) stützen und vertiefen die in Abbildung 1-14 dargestellte
Hypothese. He et al. (2004) konnten zeigen, dass eine Mutation von 274Lys zu Ala zu einem
Einleitung
17
etwa um das 250-fache reduzierten kcat für den Umsatz von Chorismat zu
Aminodesoxychorismat führt. 2006 konnten He und Toney, und zeitgleich auch Bulloch und
Abell (2006) durch ESI-MS direkt nachweisen, dass ein kovalentes Intermediat bei der
ADC-Synthase-Reaktion gebildet wird. Parsons et al. veröffentlichten 2002 eine
Kristallstruktur von PabB, die in Abbildung 1-15 gezeigt ist.
Abbildung 1-15. Bändermodell von PabB aus E. coli. Die Kristalle wurden in Ameisensäure gezüchtet. Im Kalottenmodell dargestellt sind ein Molekül Ameisensäure und ein Molekül Tryptophan, das möglicherweise stabilisierende Funktion besitzt (Quelle: Parsons et al., 2002).
In Abbildung 1-16 ist eine Überlagerung der aktiven Zentren der Kristallstrukturen von ADC-
Synthase und Anthranilatsynthase dargestellt. Grundlage des abgebildeten Modells mit
Chorismat ist die Kristallstruktur der Anthranilatsynthase mit Benzoat und Pyruvat, in die
Chorismat hineinmodeliert wurde. Anschließend wurde die Kristallstruktur der
ADC-Synthase überlagert und über least squares gefittet. Vergleicht man die Sequenzen von
E. coli und B. subtilis (Abbildung 1-17), so stellt man fest, dass das aktive Zentrum fast
vollständig konserviert ist. Einzige Ausnahme ist der wichtigste Rest der E. coli
ADC-Synthase, Lys-274, das kovalent an Chorismat bindet. An dieser Stelle steht bei B.
subtilis ein Alaninrest. Die ADC-vermittelte Katalyse bei B. subtilis wird also etwas anders
ablaufen als bei E. coli.
Einleitung
18
Abbildung 1-16: Überlagerung der Kristallstrukturen der ADC-Synthase (grau) und der Anthranilatsynthase (rosa) von E. coli. Das grüne Atom bezeichnet Magnesium, die Zahlen beziehen sich auf die ADC-Synthase. (Quelle: He et al, 2004)
B.s. : 219 FQVNLSIRQSQSLSVHPYQIYKTLREVNPSPYMAYLETPDFQIICGSPELLVSKKGKLLE 278
+QVNL+ R + S +Q + L + N +P+ A+L I+ SPE + ++
E.c. : 210 YQVNLAQRFHATYSGDEWQAFLQLNQANRAPFSAFLRLEQGAILSLSPERFILCDNSEIQ 269
B.s.: 279 TRPIAGTRSRGKTNEEDEALANELIHNEKERAEHVMLVDLERNDLGRVSRYGSVRVNEFM 338
TRPI GT R +ED A +L ++ K+RAE++M+VDL RND+GRV+ GSV+V E
E.c.: 270 TRPIKGTLPRLPDPQEDSKQAVKLANSAKDRAENLMIVDLMRNDIGRVAVAGSVKVPELF 329
B.s.: 339 AIEKYSHVMHIVSNVQGELQDGYDAVDIIHAVFPGGTITGAPKVRTMEIIEELEPTRRGL 398
+E + V H+VS + +L + A D++ A FPGG+ITGAPKVR MEII+ELEP RR
E.c.: 330 VVEPFPAVHHLVSTITAQLPEQLHASDLLRAAFPGGSITGAPKVRAMEIIDELEPQRRNA 389
B.s.: 399 YTGSIGWFGYNHDLQFNIVIRTIYATGGQAFMQSGAGVVIDSVPKHEYKESFKKAFAMQR 458
+ GSIG+ + ++ +I IRT+ A GQ F +G G+V DS + EY+E+F K + +
E.c.: 390 WCGSIGYLSFCGNMDTSITIRTLTAINGQIFCSAGGGIVADSQEEAEYQETFDKVNRILK 449
B.s.: 459 ALE 461
LE
E.c.: 450 QLE 452
x = übereinstimmende Reste der active site x = ähnlich der active site x = sich unterscheidende Reste der active site
x = 263Cys B. subtilis
Abbildung 1-17: Ausschnitt aus dem Alignment der PabB Sequenz von B. subtilis und E. coli.
Einleitung
19
1.3.2.3 Aminodesoxychorismat-Lyase (PabC)
Lange Zeit nahm man an, dass die ADC-Synthase das einzige Enzym der pABA-Biosynthese
wäre. Entsprechend nannte man den Komplex aus PabA und PabB ursprünglich
p-Aminobenzoatsynthase. Im Gegensatz zur Anthranilat-Synthase, die tatsächlich das
Zwischenprodukt 2-Amino-2-desoxyisochorismat unter Abspaltung von Pyruvat zu
o-Aminobenzoesäure aromatisiert, ist zur Biosynthese von p-Aminobenzoesäure noch ein
weiteres Enzym notwendig (Nichols et al., 1989). Ye und Mitarbeitern gelang es 1990,
„Enzym X als Aminodesoxychorismat-Lyase“ aufzureinigen und zu charakterisieren. Slock et
al. stellten 1990 die Vermutung auf, dass das im Folat-Operon von B. subtilis gefundene Gen
pabC ein dem Enzym X analoges Enzym kodiert, was durch Green et al. 1991 bestätigt
wurde, die in E. coli das entsprechende Gen pabC identifizierten. Im Jahr 2000
veröffentlichten Nakai et al. eine Kristallstruktur der ADC-Lyase von E. coli (s. Abbildung
1-18).
Abbildung 1-18. Bändermodell des PabC-Homodimers mit dem Cofaktor PLP. Eine der Untereinheiten ist in grau dargestellt, die große und kleine Domäne der anderen Untereinheit sind in weiß bzw. schwarz abgebildet (Quelle: Nakai et al., 2000).
Einleitung
20
Die etwa 30 kDa große Aminodesoxychorismat-Lyase ähnelt in ihrer Struktur und in der
Stereospezifität der Wasserstoffabstraktion stark der D-Aminosäure-Aminotransferase und der
verzweigtkettigen-L-Aminosäure-Aminotransferase. Alle drei Enzyme gehören zum Typ IV
der PLP-Enzyme, die entsprechend ihrer Sequenz und Sekundärstruktur in fünf Gruppen
eingeteilt werden. Im Gegensatz zur D-Aminosäure-Aminotransferase und zur
Verzweigtkettige-L-Aminosäure-Aminotransferase wird die ADC-Lyase mechanistisch als
αβ-Lyase klassifiziert.
Die ADC-Lyase katalysiert die Aromatisierung von 4-Amino-4-desoxychorismat zu
p-Aminobenzoesäure unter Abspaltung von Pyruvat. Das Enzym liegt als Homodimer vor
(Green et al., 1992; Nakai et al., 2000) und benötigt als Coenzym Pyridoxal-5’-phosphat
(PLP) (Green et al., 1992). Nach einem von Nakai et al. (2000) vorgeschlagenen
Mechanismus bildet Aminodesoxychorismat eine Schiff-Base mit PLP, wodurch ein
katalytisch aktives Lysin frei wird, das eine Wasserstoffbrücke mit einem Threoninrest
ausbildet. Die basische Aminoseitenkette des Lysins eliminiert ein Proton des ADC, wodurch
ein chinoides Zwischenprodukt entsteht. Aus diesem wird Pyruvat abgespalten, dabei wird ein
Proton von Threonin auf den olefinischen Teil des 4-Amino-4-desoxchorismat-Intermediat
übertragen (Abbildung 1-19).
Einleitung
21
NH
OPO3
O
HN
Lys
COO
O
NH2
OOC
NH
OPO3
O
Lys
COO
O
HN
OOC
NH2OH
Thr
H
NH
OPO3
O
Lys
COO
HN
NH2O
Thr
HH
O
CH3
O
O
NH
OPO3
O
HN
Lys
NH2
PLP
PLP
O
OOC
PLP
PLP
COO
NH2
COO
pABA
ADC
Abbildung 1-19. Mechanismus von PabC nach Nakai et al. (2000). Aminodesoxychorismat bildet eine Schiff-Base mit PLP, wodurch ein katalytisch aktives Lysin frei wird, das eine Wasserstoffbrücke mit einem Threoninrest ausbildet. Die basische Aminogruppe des Lysins eliminiert ein Proton des ADC, wodurch ein chinoides PLP-Zwischenprodukt entsteht. Nun kann nach Rearomatisierung des Cofaktors Pyruvat abgespalten werden, wobei ein Proton von Threonin auf den olefinischen Teil des 4-Amino-4-desoxychorismat-Intermediats übertragen wird.
1.3.3 Abyssomicin C und die p-Aminobenzoesäurebiosynthese
In den vorhergehenden Abschnitten wurde beschrieben, wie die zweistufige Biosynthese der
p-Aminobenzoesäure abläuft. Nun stellt sich die Frage, in welcher Weise Abyssomicin C in
die Biosynthese eingreifen kann. Erste Hinweise auf den Wirkmechanismus ergeben sich aus
dem Vergleich des Abyssomicin C mit Chorismat.
In wässriger Lösung liegt Chorismat zu 80 – 90 % in pseudo-diäquatorialer (Abbildung 1-20,
1) und zu 10 – 20 % in pseudo-diaxialer Konformation (Abbildung 1-20, 2) vor (Copley und
Knowles, 1987). Das Oxabicyclooctan-System von Abyssomicin C (Abbildung 1-20, 3) zeigt
große Ähnlichkeit zur pseudo-diaxialen Konformation des Chorismats. Bei der von der
Einleitung
22
Chorismat-Mutase vermittelten Reaktion von Chorismat zu Prephenat, die umfassend
untersucht wurde, liegt Chorismat im Übergangszustand in der diaxialen Konformation vor
(Copley und Knowles, 1985; Hur und Bruice, 2003 a / 2003 b; Marti et al., 2003; Ranaghan
et al., 2004). Die Reaktionen sowohl der Aminodesoxychorismat-Synthase als auch der
Aminodesoxychorismat-Lyase wurden bei weitem nicht so detailliert untersucht wie die der
Chorismat-Mutase, dennoch liegt die Vermutung nahe, es könnte sich bei Abyssomicin C um
ein Mimetikum des Übergangszustands handeln (Abbildung 1-20). Desweiteren wurde die
Hypothese aufgestellt, dass das Michaelsystem C(7)-C(9) eine Rolle bei der antibiotischen
Aktivität von Abyssomicin C spielen (Abbildung 1-21). Diese Hypothese zu überprüfen war
Teil der vorliegenden Arbeit.
OH
COOHO
COOH
OH
COOH
O
HOOC
pseudo-diäquatorial pseudo-diaxial
80 - 90 % 10 - 20 %
Abyssomicin CChorismat
H3C CH3
O O
OO
O
CH3
OH
Abbildung 1-20. Pseudo-diäquatoriale und pseudo-diaxiale Konformation von Chorismat in wässriger Lösung im Vergleich zur Struktur von Abyssomicin C.
H3CCH3
O
HO
OO
O
CH3
HO
CysS
H3C CH3
O O
OO
O
CH3
HO
CysS
H3C CH3
O O
OO
O
CH3
HO
a b
9
8
7
Abbildung 1-21. Zwei denkbare Möglichkeiten der Michael-Addition eines Nucleophils an Abyssomicin C.
Einleitung
23
1.4 Polyketidsynthese
Polyketide sind eine Gruppe von Naturstoffen, die eine bemerkenswerte strukturelle
Diversität aufweisen. Auch ihre Herkunft ist geprägt von Vielfalt: produziert werden sie von
so unterschiedlichen Organismen wie Bakterien, Pflanzen und Pilzen. Das breite
Wirkspektrum, das von Antibiotika über antifungale und antiparasitische bis hin zur
antitumoralen Wirkung reicht, macht Polyketide zu pharmakologisch interessanten
Verbindungen. Klinisch relevante Polyketide sind beispielsweise Tetracycline, Erythromycin,
Rapamycin und Lovastatin.
Die Biosynthese der Polyketide erfolgt – katalysiert von Polyketidsynthasen (PKS) – durch
schrittweise Addition von Bausteinen, die in der Regel zwei, drei oder vier
Kohlenstoffatomen bestehen, wie Acetyl-CoA (als Malonyl-CoA), Propionyl-CoA (als
Methylmalonyl-CoA) und Butyryl-CoA (als Ethylmalonyl-CoA). Die Polyketidsynthese
ähnelt stark der Fettsäurebiosynthese, unterscheidet sich jedoch dahingehend, dass die bei der
Fettsäurebiosynthese immer stattfindende Abfolge von Ketoreduktion, Dehydratisierung und
Enoylreduktion bei der Polyketidsynthese variabel gestaltet ist, sodass entweder alle, einige
oder keine dieser Modifikationen an der Ketogruppe stattfinden, woraus sich eine große
strukturelle Vielfalt ergibt (Staunton, J. und Weissman, K.J., 2001).
Polyketidsynthasen werden historisch gesehen in drei Typen eingeteilt, es hat sich jedoch
gezeigt, dass das Feld der Polyketidsynthese weitaus komplexer ist, und die Grenzen
zwischen den drei Typen fließend sind (Shen, 2003). Nichtsdestotrotz sollen hier die PKS
Typen I, II und III kurz vorgestellt werden, da sie ein für diese Arbeit hinreichendes
Modellsystem darstellen.
PKS I sind multifunktionelle Enzyme, die in Modulen organisiert sind, wobei jedes Modul für
einen Cyclus der Kettenverlängerung zuständig ist. Hingegen sind PKS II
Multienzymkomplexe, die aus einem einzigen Set von iterativ wirkenden Enzymaktivitäten
bestehen, und deren Produkte meist aromatische Polyketide sind. Sowohl Typ I als auch Typ
II verwenden Acylcarrierprotein (ACP), das eine Phosphopantetheingruppe besitzt, um die
Acyl-CoA-Substrate zu aktivieren und die wachsende Polyketidkette zu binden. Typ III PKS
hingegen benötigen kein ACP sondern wirken direkt auf die CoA-Substrate. Typ III PKS
werden oft auch als Chalcone-Synthase-like PKS bezeichnet, und wirken als iterativ
arbeitende Homodimere (Staunton, J. und Weissman, K.J., 2001).
Einleitung
24
1.4.1 Polyketidsynthasen vom Typ I
Für diese Arbeit relevant ist der PKS-Typ I, daher soll er im Folgenden näher beschrieben
werden. Wie bereits erwähnt, sind PKS I modular aufgebaut. Jedes Modul ist für einen
Kettenverlängerungsschritt zuständig. Vom N- zum C-Terminus sind die Module
folgendermaßen angeordnet: Start- oder Lademodul, Elongationsmodule und das
Terminierungsmodul. Jedes Modul besteht wiederum aus Domänen. Jeder Domäne lässt sich
eine bestimmte Funktion zuordnen: Acyltransferase (AT), Acyl Carrier Protein (ACP),
Ketosynthase (KS), Ketoreduktase (KR), Dehydratase (DH), Enoylreduktase (ER),
Thioesterase (TE). Das Start- oder Lademodul besteht aus den Domänen AT und ACP, das
Terminierungsmodul aus TE. Die dazwischen liegenden Elongationsmodule müssen über die
Mindestausstattung von KS, AT und ACP verfügen, um eine Kettenverlängerung zu
ermöglichen. Optional können noch DH, ER und KR enthalten sein. Die Reihenfolge vom N-
zum C-Terminus lautet dabei: KS-AT-[DH-ER-KR]-ACP. An dieser Stelle sei darauf
hingewiesen, dass die Modifikationen der Ketogruppe immer das im vorhergehenden
Kettenverlängerungsschritt angefügte Glied betreffen. Als Modellsystem für
Polyketidsynthasen des Typ I gilt die Erythromycin Polyketidsynthase, deren Aufbau
systematisch in Abbildung 1-22 dargestellt ist. Den drei Genen eryAI, eryAII und eryAIII
entsprechen die drei Proteine DEBS1, DEBS2 und DEBS3, die jeweils drei Modulen (load,
Module 1-6 und end) enthalten. Die Module selbst bestehen aus Domänen, die hier als Kreise
dargestellt sind.
Einleitung
25
O O
OH
O
OH
OH
eryAI eryAII eryAIII
DEBS 1 DEBS 2 DEBS 3
S S SS S S
load
Modul 1 Modul 3Modul 4Modul 2
Modul5Modul 6
end
ATACP KS ATKR
ACPKS ATKR
ACP KS AT ACP KS ATKR
ACP TEKS AT ACP
KRKS AT
DH
ACP
ERKR
S
O
OH
OH
O
O
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
O
O
O
OH
OH
O O
OH
O
OH
OH
eryAI eryAII eryAIII
DEBS 1 DEBS 2 DEBS 3
S S SS S S
load
Modul 1 Modul 3Modul 4Modul 2
Modul5Modul 6
end
ATACP KS ATKR
ACPKS ATKR
ACP KS AT ACP KS ATKR
ACP TEKS AT ACP
KRKS AT
DH
ACP
ERKR
S
O
OH
OH
O
O
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
O
O
O
OH
OH
Abbildung 1-22: Schematische Darstellung der Erythromycin Polyketidsynthese durch DEBS1 – DEBS3.
1.4.2 Der Synthesemechanismus
Die Polyketidsynthese beginnt mit der Übertragung einer Acylgruppe vom N-terminal
liegenden ACP auf einen Cysteinrest der Ketosynthase. Dann wird die C-terminal liegende an
ACP gebundene aktivierte Acylgruppe (Malonyl-S-ACP im Falle von Acetat) decarboxyliert,
wodurch ein Carbanion-Intermediat entsteht. Dieses fungiert als Nucleophil bei der
anschließenden Claisenkondensation. Dadurch wird die Kette verlängert und zugleich auf das
nächste C-terminal liegende ACP übertragen (Keating und Walsh, 1999). Eventuell
vorhandenen zusätzliche Domänen können noch die Ketogruppe zum Alkohol reduzieren
(Ketoreduktase, KR), eine Dehydratase (DH) kann dann unter Ausbildung einer
Doppelbindung Wasser abspalten, die schließlich zum Alkan reduziert werden kann.
Ist das letzte Modul erreicht, so wird es durch die Thioesterase-Domäne freigesetzt. Zwei
prinzipielle Möglichkeiten können dabei unterschieden werden: Intermolekulare Hydrolyse
setzt das (lineare) Molekül frei, während ein intramolekularer nucleophiler Angriff
beispielsweise durch Hydroxy- oder Aminogruppen zur Zyclisierung zum Makrolakton bzw.
Makrolactam führt (Cane und Walsh, 1999).
Einleitung
26
ACP KS AT ACP
S SHS
ACP KS AT ACP
SH SS
ACP KS AT ACP
SH SHS
R
O
R
O
O
OO
O
R
O O
ACP KS AT ACP
S SHS
ACP KS AT ACP
SH SS
ACP KS AT ACP
SH SHS
R
O
R
O
O
OO
O
R
O O
Abbildung 1-23: Kettenverlängerung bei Polyketidsynthasen. Die wachsende Kette wird von der ACP-Domäne (links) auf eine konservierte Cysteinseitenkette der KS-Domäne übertragen. Die Kettenverlängerung geschieht durch Decarboxylierung eines Malonyl- (im Falle von Propionat Methylmalonyl-) Thioesters an der nächsten ACP-Domäne (rechts). Das dabei entstehende Carbanion greift nucleophil die auf der KS befindliche Kette an. Dadurch erfolgt eine Translokation und Elongation der Polyketidkette. (Nach Keating und Walsh, 1999)
1.4.3 Die Biosynthese von Chlorothricin
Chlorotricin ist wie Abyssomicin ein Spirotetronat-Antibiotikum. Neben dem Chlorothricin-
Aglykon besitzt Chlorothricin zusätzliche Modifikationen mit zwei D-Olivosereste und
2-Methoxy-5-chloro-6-methylsalicylsäure. Interessant im Hinblick auf die Abyssomicin-
Biosynthese ist die Synthese des Aglykons, die von Jia et al 2006 beschrieben wurde.
Chlorothricin leitet sich von einer Polyketidkette ab, die aus 10 Acetatresten und 2
Propionatresten aufgebaut ist. Die noch verbleibenden drei Kohlenstoffe stammen vermutlich
aus einem Enoylpyruvat-Derivat. Vier Geneprodukte, ChlD1, ChlD2, ChlD3 und ChlD4 sind
an der Synthese dieses Enoylpyruvat-Derivats aus einer Zwischenstufe der Glykolyse beteiligt
(Abbildung 1-24).
Einleitung
27
O
H
HO
H
HO
H
HOHH
OH
OHO
OH
HO
O
OH
SACP
SACP
Glykolyse
ChlD1,ChlD2 ChlD3 ChlD4
Abbildung 1-24: Synthese des C3-Bausteins der Tetronsäureeinheit aus einem Glykolyseintermediat durch die Proteine ChlD1, ChlD2, ChlD3 und ChlD4.
ChlD1, ein dem FkbH ähnliches Protein, transferiert vermutliche das Glykolyseintermediat
auf das ACP Protein ChlD2. ChlD3, eine putative Dehydrogenase, katalysiert wahrscheinlich
die 2,3-Dehydrierung, wodurch Enoylpyruvoyl-S-ACP entsteht. Dieses wird vermutlich von
der putativen Acyltransferase ChlD4 vermittelt in das Chlorothricin-Aglykon eingebaut.
Die Synthese des Aglykons wird von einer Typ I Polyketidsynthase vermittelt, die aus einem
Lademodul und elf Kettenverlängerungsmodulen besteht (Abbildung 1-25). Jedes der Module
besteht zumindest aus den drei Domänen KS, AT, und ACP, die den passenden Baustein für
die Kettenverlängerung auswählen, aktivieren und an die wachsende Polyketidkette anfügen.
Einige der Module besitzen zusätzlich noch Domänen wie DH, ER und KR, die reduktive
Modifikationen durchführen.
Im Hinblick auf die Biosynthese des Chlorothricins schlagen Jia et al vor, dass das
Transdecalinsystem enantioselektiv durch eine [4+2]-Diels-Alder-Reaktion entsteht, indem
das C-4-C-5 Dienophil an das C-10-C-13 Dien addiert (Abbildung 1-25). Die Polyketidkette
wird dann unter Ausbildung des Tetronsäure-Fünfrings freigesetzt, wobei die Acyltransferase
ChlD4, die Enoylpyruvat-ACP übertragt, wohl beteiligt ist und die Hydroxygruppe des
Enoylpyruvats als Nucleophil dient. Eine zweite intramolekulare [4+2] Diels-Alder Reaktion
zwischen dem C-2’-C-3’ Dienophil (aus der Enoylpyruvateinheit) und dem C-20-C-23 Dien
führt zur Zyklisierung. Anschließend findet die Oxidation der C-20 Methylgruppe zur
Carbonsäure, die Glykosylierung mit zwei D-Olivoseresten und die Übertragung der
modifizierten Methylsalicylsäure statt (Abbildung 1-25).
Einleitung
28
Abbildung 1-25: Biosyntheseweg des Chlorothricins nach Jia et al, 2006.
Grundlagen
29
2 Grundlagen
2.1 Chromatographie und Massenspektrometrie
2.1.1 Elektrospray-Ionisierung (ESI)
Bei der Elektrospray Ionisation werden unter Atmosphärendruck Ionen erzeugt. Dies
geschieht durch die an der Ionisierungsquelle angelegte Hochspannung (2-6 kV), die zur
Ausbildung eines elektrischen Feldes zwischen der Kapillare und einer Gegenelektrode führt.
In der Analytlösung vorhandene Ionen bewegen sich aufgrund ihrer Ladung auf die
Gegenelektrode zu. Dabei bildet sich an der Spitze der Kapillare ein Überschuss gleichartig
geladener Ionen, die sich gegenseitig abstoßen und einen Taylor-Cone formen, bis sie
schließlich in Form feiner Tropfen die Kapillare verlassen.
Abbildung 2-1: Schematische Darstellung des ESI-Prozesses. Quelle: Lottspeich, F. und Zorbas, H., 1998.
Grundlagen
30
Häufig wird unterstützend ein neutrales Trägergas wie Stickstoff eingesetzt, das die
Vernebelung der Lösung und die Verdampfung des Lösungsmittels fördert. So verkleinert
sich die Tropfengröße, wobei zugleich die Dichte der Ladungen auf der Tropfenoberfläche
zunimmt. Wegen der Abstoßung gleichartiger Ladungen zerplatzen die Tropfen, sobald sie
eine kritische Größer erreicht haben (Rayleigh-Limit) durch Coulomb-Explosion in kleinere
Tröpfchen. Dieser Prozess wiederholt sich, bis aus den verbleibenden Tröpfchen freie Ionen
gebildet werden. Für diesen Prozess herrschen zwei Modelsysteme vor, das Charge Residue
Model (CRM) und das Ion Evaporation Model (IEM). Nach dem CRM finden so lange
Coulomb-Explosion und Verkleinerung der Tröpfchen statt, bis nur noch ein einziges
ionisiertes Analytmolekül übrig bleibt, das durch Verdampfen des restlichen Lösungsmittel
freigesetzt wird. Das IEM hingegen geht davon aus, dass die Freisetzung von Ionen in die
Gasphase bereits auf der Stufe größerer geladener Tropfen stattfindet. Durch Elektrospray-
Ionisierung war erstmals die massenspektrometrische Erfassung großer Biomolekülen
möglich, was 2002 mit der Verleihung des Nobelpreises an Fenn gewürdigt wurde.
2.1.2 Der Triple Quadrupol Analysator
Die Funktionsweise eines Quadrupols beruht auf der Anordnung von vier parallelen
Elektrodenstäben in einem quadratischen Querschnitt, an die Wechsel- und Gleichspannungen
angelegt werden. Gegenüberliegende Stäbe (A und C, B und D) haben sowohl die gleiche
Polarität der Gleichspannung als auch die gleiche Phase der Wechselspannung. Die
Ionentrennung erfolgt durch Ablenkung mittels elektrischer Felder. Das Prinzip des
Quadrupols lässt sich am besten verstehen, wenn man zunächst nur die zwei
gegenüberliegenden Stäbe A und C betrachtet. Wird an diese Stäbe eine Wechselspannung
gelegt, so bauen sich abwechsend positive und negative Felder relativ zur Mittelachse auf.
Positive Ionen, die sich in paralleler Richtung durch das Stabsystem bewegen, werden im
positiven Feld des Stabes zur Mittelachse und im negativen Feld zum am nächsten liegenden
Stab beschleunigt. Wie weit ein Ion von seiner geradlinigen Bahn seitlich abgelenkt wird,
hängt einerseits von der angelegten Spannung und der Frequenz und andererseits vom m/z–
Verhältnis ab. In der Regel wird bei Quadrupol-Analysatoren die Wechselspannung mit einer
positiven Gleichspannung überlagert. Diese bewirkt, aufgrund der Abstoßung gleichnamiger
Ladungen, eine generelle Ablenkung zur Mittelachse hin. Bei Ionen mit hohem m/z überwiegt
der Einfluss der Gleichspannung: Sie werden zur Mittelachse hin abgelenkt, und können das
Stabsystem passieren. Ionen mit niedrigem m/z hingegen schwingen so stark aus, dass sie auf
die Stäbe treffen und entladen werden.
Grundlagen
31
Nun sollen auch die beiden verbleibenden Stäbe B und D betrachtet werden. Hier wird eine
um π verschobene Wechselspannung und eine negative Gleichspannung angelegt. Durch die
negative Gleichspannung werden die positiv geladenen Ionen generell zu den Stäben B und D
hin abgelenkt. Wieder überwiegt bei Ionen mit hohem m/z der Einfluss der Gleichspannung,
sodass diese zu den Stäben B und D abgelenkt und entladen werden. Bei Ionen mit niedrigen
m/z reicht das positive Feld der Wechselspannung aus, sie in die Mitte des Stabsystems zu
bringen. Somit selektieren die Stäbe A und C niedrige m/z heraus, während B und D hohe m/z
ausfiltern. Durch geeignete Abstimmung der Gleich- und Wechselspannungen erreicht man,
dass jeweils nur Ionen eines m/z das Stabsystem durchfliegen können (Budzikiewicz und
Schäfer, 2005).
Der Triple-Quadrupol-Analysator besteht aus vier in Reihe geschalteten Quadrupolen, Q0,
Q1, Q2 und Q3. Die Quadrupole Q1 und Q3 werden als Messquadrupole bezeichnet, und
wenden das eben beschriebene Prinzip der Kombination von Gleich- und Wechselspannung
zur Selektion von Ionen eines bestimmten m/z-Verhältnisses und zum Durchscannen eines
bestimmten Massenbereichs an, indem sukzessive durch wechselnde Kombinationen aus
unterschiedlichen Gleich- und Wechselspannungen die Stabilitätsbedingungen für die Ionen
des Messbereichs verändert werden. Quadrupole können aber auch im
Totaltransmissionsmodus eingesetzt werden, d.h. es liegt nur eine Wechselspannung an (RF
only) und alle Ionen gelangen durch den Quadrupol. Dieses Prinzip kommt bei Q0 immer, bei
Q1, Q2 und Q3 im Bedarfsfall zum Einsatz. Q2 wird auch als Kollisionszelle bezeichnet, und
neben der Transmission aller Ionen (RF only) ist in diesen Quadrupol auch die
Fragmentierung von Ionen möglich. Aus der Kombination verschiedener Modi der drei
Quadrupole Q1, Q2 und Q3 ergibt sich die experimentelle Bandbreite des Triple-Quadrupo-
Analysators: Beim Full Scan wird entweder im Q1 ein Massenbereich gescannt, während Q2
und Q3 auf den Totaltransmissionsmodus eingestellt sind (Q1 Scan), oder im Q3 ein
Massenbereich gescannt, während Q1 und Q2 im Totaltransmissionsmodus sind (Q3 Scan).
Beim Produktionenscan (Product Ion Scan) wird in Q1 das Mutterion selektiert, in Q2
fragmentiert und in Q3 die Fragmente ausgescannt. Beim Vorläuferionenscan (Precursor Ion
Scan) wird in Q1 ein Massenbereich gescannt, in Q2 fragmentiert, während in Q3 ein
spezifisches Ion selektiert wird, das ein charakteristisches geladenes Fragment des Mutterions
darstellt. Ähnlich ist der Neutralverlustscan (Neutral Loss Scan). Hier wird wieder in Q1 ein
Massenbereich gescannt und in Q2 fragmentiert, in Q3 jedoch wird nun jedoch gescannt, um
Fragmente zu finden, die um die Masse eines bestimmten Neutralteilchens leichter sind.
Wichtig für Quantifizierungsexperimente ist das Multiple Reaction Monitoring (MRM). Hier
Grundlagen
32
wird in Q1 auf ein spezifisches m/z selektiert, in Q2 erfolgt die Fragmentierung dieses Ions,
und in Q3 wird das m/z eines spezifisches Fragment gefiltert. Dadurch kombiniert dieses
Experiment hohe Selektivität mit hoher Empfindlichkeit.
2.1.3 Applied Biosystems/MDS Sciex QTrap 2000
Bei dem hauptsächlich für diese Arbeit verwendeten Massenspektrometer handelt es sich um
eine QTrap 2000 von Applied Biosystems/MDS Sciex. Die Ionisierung erfolgt bei diesem
Gerät über eine TurboIon-Quelle, die eine spezielle Form der Elektrospray-Ionisation darstellt
und in Abbildung 2-2 schematisch dargestellt ist.
Abbildung 2-2: Schematische Abbildung der TurboIon Quelle der QTrap 2000. Quelle: W.M.A. Niessen, 1999.
Von der Spraykapillare gelangen die Ionen durch Orifice und Skimmer in den Quadrupol Q0,
an dem eine Wechselspannung anliegt. Q0 dient dem Transport der Ionen in den
Vakuumbereich. Die QTrap 2000 besteht aus vier in Reihe geschalteten Quadrupolen (Q0,
Q1, Q2, Q3), von denen der letzte, Q3, auch als linear ion trap (LIT) verwendet werden kann.
In der LIT können die Ionen in einem Potentialtopf gefangen werden, indem eine
Wechselspannung am Quadrupol angelegt wird, und eine Gleichspannung an den beiden
Enden des Quadrupols.
Mit der QTrap 2000 sind neben allen typischen Triple-Quadrupol-Experimenten wie
Produktionen-(PI), Neutralverlust-(NL), Vorläuferionenscans(PC) sowie Multiple Reaction
Monitoring (MRM) möglich. Zusätzlich können noch Experimente im Trap Modus
durchgeführt werden, die dann den Zusatz enhanced im Namen tragen, und eine höhere
Grundlagen
33
Auflösung ermöglichen, beispielsweise der Enhanced Product Ion Scan (EPI) oder der
Enhanced MS Scan (EMS, entspricht einem Full Scan).
2.1.4 LC-ESI-MS-Kopplung
Bei der HPLC-MS-Kopplung wird der Ausgang der Chromatographiesäule mit der fused-
silica-Kapillare als Bestandteil der ES-Quelle verbunden. Bei atmosphärischem Druck (API =
Atmospheric Pressure Ionisation) gelangen die aufgetrennten Komponenten in die Quelle,
und werden dort ionisiert. Die m/z-Verhältnisse werden in Form eines rekonstruierten
Totalionenstroms (TIC) registriert. Während oder im Anschluss an die Messung kann die
Masseninformation aller zu einem bestimmten Zeitpunkt eluierten Verbindungen, die als
Peak im TIC erkennbar sind, erhalten werden.
2.1.5 MS/MS-Experimente
Da Fragmentierungsexperimente für diese Arbeit eine große Rolle spielten, soll hier nochmals
genauer darauf eingegangen werden. Die beiden Experimente, die angewendet wurden, sind
zum einen der EPI (Enhanced Product Ion Scan) und der MRM (Multiple Reaction
Monitoring). Beim Produktionenscan (Product Ion Scan) wird in Q1 das Vorläuferion
selektiert. In Q2, der bei der QTrap 2000 auch als LINAC (Linear Accelerator)
Kollisionszelle bezeichnet wird, wird das in Q1 ausgewählte Ion durch N2 als CAD
(Collisionally Activated Dissociation) Gas fragmentiert, und in Q3 die Fragmente
ausgescannt.
Die große Bedeutung des MS/MS-Experiments für diese Arbeit sowie in der Proteinchemie
allgemein liegt in der Möglichkeit zur Sequenzierung von Peptiden. Fragmentierung erfolgen
hauptsächlich an der Peptidbindung. Befindet sich die Ladung nach der Spaltung auf der
N-terminalen Seite, so spricht man von a-, b- und c-Serien, befindet sich die Ladung auf der
C-terminalen Seite, so handelt es sich um x-, y- und z-Serien (siehe Abbildung 2-3). Die
Anzahl der Aminosäuren wird über einen Index angegeben. In der Praxis erhält man nur
selten einen kompletten Satz von Fragmentionen der verschiedenen Serien. Durch
Kombination der Signale vorzugsweise mit Computerprogrammen ist jedoch eine
Interpretation möglich.
Grundlagen
34
Abbildung 2-3. Fragmentierung von Peptiden (Nomenklatur nach Roepstorff und Fohlmann, 1984). Die Fragmente, die durch Bindungsbruch entstehen können, sind unten angegeben. Quelle: Lottspeich, F. und Zorbas, H., 1998, leicht modifiziert.
Das zweite wichtige Fragmentierungsexperiment für diese Arbeit ist das Multiple Reaction
Monitoring (MRM). Hier wird Q1 auf ein spezifisches m/z gesetzt, in Q2 erfolgt die
Fragmentierung dieses Ions, und Q3 wird auf das m/z eines bestimmten Fragments gesetzt.
Der Begriff Multiple wird verwendet, da mehrere Pärchen von m/z in Q1 und Q2 in einem
Experiment betrachtet werden können. Im Allgemeinen wird auch von MRM gesprochen,
wenn nur der Übergang eines einzigen Ions betrachtet wird. Eine alternative, wenn auch
weniger gebräuchliche Bezeichnung in diesem Falle ist Single Reaction Monitoring (SRM).
Grundlagen
35
2.2 Kernresonanzspektroskopie
Die NMR Spektroskopie ist neben Massenspektrometrie und Röntgenbeugung die Methode
der Wahl bei der Strukturaufklärung sowohl von Makromolekülen wie Proteinen und
Nucleinsäure als auch von kleinen organisch-chemischen Substanzen wie
Sekundärmetaboliten. Nach der Entdeckung der NMR im Jahr 1945 waren vor allem die
Einführung der gepulsten Fourier-Transform-NMR und der mehrdimensionalen NMR
wichtige Meilensteine.
Während das eindimensionale NMR-Spektrum aus einer Frequenzachse besteht, an der die
chemischen Verschiebungen abgelesen werden können mit der Signalintensität auf der
Ordinate, besteht das zweidimensionale NMR-Spektrum aus zwei Frequenzachsen, auf denen
z.B. chemische Verschiebungen dargestellt werden. Das zweidimensionale NMR-Experiment
basiert auf einer Abfolge von drei Zeitintervallen: Präparation, Evolution und Detektion
(Abbildung 2-4 a). Bei einer Reihe von Experimenten kommt als weiteres Element vor der
Detektion die Mischzeit hinzu (Abbildung 2-4 b).
Die zweidimensionalen Verfahren setzen eine Kopplung von Kerndipolen voraus. Dabei muss
es sich nicht unbedingt um eine skalare Kopplung handeln. Die Wechselwirkung kann wie
beim Kern-Overhauser-Effekt auch dipolarer Natur sein, d.h. sie erfolgt durch den Raum.
Damit eröffnet sich die Möglichkeit, die räumliche Struktur von Molekülen aufzuklären. Ein
weiteres zweidimensionales Verfahren, mit dem man dynamische Prozesse untersuchen kann,
beruht auf dem Magnetisierungstransfer durch chemischen Austausch.
a)
b) Präparation
Präparation Evolution
Evolution
Detektion
DetektionMischzeit
t1 t2tM
t1 t2
FID
FID
a)
b) Präparation
Präparation Evolution
Evolution
Detektion
DetektionMischzeit
t1 t2tM
t1 t2
FID
FID
Abbildung 2-4. Zeitskalen von zweidimensionalen NMR-Experimenten.
In der Präparationszeit wird das interessierende Spinsystem für das Experiment vorbereitet,
z.B. durch Anwendung eines Entkopplungsexperiments oder durch die Erzeugung
Grundlagen
36
transversaler Magnetisierung mit Hilfe eines 90°-Impulses. In der Evolutionszeit t1 entwickelt
sich das Spinsystem sodann unter dem Einfluss verschiedener Faktoren, z.B. der
Larmorpräzession oder der skalaren Spin-Spin-Kopplung, bevor das NMR-Signal in der
Detektionszeit t2 registriert wird. Die in manchen Experimenten eingefügte Mischzeit
überführt die während der Evolution entwickelte Magnetisierung in eine detektierbare
Magnetisierung. Die Evolutioszeit t1 wird inkrementiert, so dass man eine Reihe von
1D-NMR-Spektren erhält, die in ihren Signalamplituden und Signalphasen moduliert
(periodisch variiert) sind, was eine zweite Fourier-Transformation bezüglich t1 ermöglicht.
Diese zusätzliche Frequenzachse F1 enthält die Frequenzen derjenigen Mechanismen, die
während der Evolutionszeit t1 wirksam waren. Resonanzfrequenzen und Spin-Spin-
Kopplungsfrequenzen, die im konventionellen eindimensionalen NMR-Spektrum a priori
nicht unterscheidbar sind, lassen sich damit auf zwei getrennten Frequenzachsen darstellen
und somit separieren.
Aus der Fülle der heute verfügbaren und routinemäßig eingesetzten 2D-NMR-Experimente
sollen hier nur diejenigen kurz beschrieben werden, die in dieser Arbeit verwendet wurden.
2.2.1 Das COSY-Experiment
Das COSY-Experiment (Correlated Spectroscopy) war das erste zweidimensionale NMR-
Experiment und besitzt auch heute noch große Bedeutung für die Strukturaufklärung (Braun,
Kalinowski und Berger, 2000; Kapitel 10.3). Aus dem COSY-Experiment lässt sich die
Kopplung benachbarter Protonen (2J und 3J) ermitteln. Auf den Frequenzachsen F1 und F2 ist
jeweils die chemische Verschiebung aufgetragen. Das 1D-NMR-Spektrum ergibt sich als
Projektion der Diagonalen, während die sog. Kreuzsignale zeigen, welche Kerne miteinander
koppeln. Die COSY-Pulssequenz besteht lediglich aus zwei durch die Evolutionszeit t1
getrennten 90°-Impulsen (Abbildung 2-5).
t1 t2
90°x 90°x
FID
t1 t2
90°x 90°x
FID
Abbildung 2-5. Pulssequenz für das H,H-COSY.
Grundlagen
37
Für ein AX-System erhält man im 2D-Spektrum auf der Diagonale die bei den Koordinaten
νA, νA bzw. νX, νX zentrierten sog. Diagonalsignale sowie als Nichtdiagonalelemente die
Kreuzsignale, zentriert bei νA, νX und νX, νA. Das Zustandekommen der Diagonalsignale
erklärt sich ausgehend vom Singulettsignal eines Kerns A, der keine skalare Spin-Spin-
Kopplung besitzt: Der erste 90°-Impuls der COSY-Sequenz erzeugt die transversale
A-Magnetisierung MA in der x,y-Ebene, die um die z-Achse rotiert. Der zweite 90°-Impuls
invertiert den y-Anteil von MA in die negative z-Richtung, während der x-Anteil in der x,y-
Ebene erhalten bleibt und detektiert wird. Die Intensität des detektierten Signals hängt dann
von der jeweiligen Stellung des Vektors MA am Ende der Evolutionszeit ab, die wiederum von
der Larmor-Frequenz des A-Kerns bestimmt wird. Die Signalamplitude ist daher in t1 mit
dieser Frequenz moduliert, und die Fourier-Transformation liefert in beiden Dimensionen die
Frequenz νA und somit ein Diagonalsignal.
Bei der Spin-Spin-Kopplung führt der zweite 90°-Puls nicht nur zu einer Änderung der
transversalen A-Magnetisierung MA, sondern auch zu Populationsänderungen für andere
Übergänge im betreffenden Spinsystem. Auf diese Weise wird die Magnetisierung zwischen
all jenen Kernen ausgetauscht, die miteinander koppeln; die Signale dieser Kerne werden in
einer Serie von t1-Experimenten mit den Frequenzen der Nachbarkerne moduliert. Dies führt
zu den Kreuzsignalen im 2D-Spektrum bei νA, νX und νX, νA.
2.2.2 Das TOCSY-Experiment
Während in einem COSY-Experiment meist Kopplungen von geminalen oder vicinalen
Protonen als Kreuzsignale detektiert werden, lassen sich durch ein TOCSY-Experiment
(Total Correlation Spectroscopy) ganze Teilspinsysteme betrachten. Das TOCSY-Experiment
ist auch unter dem Namen HOHAHA (Homonuclear Hartmann-Hahn) bekannt (Braun,
Kalinowski und Berger, 2000; Kapitel 10.18).
Das Experiment beginnt mit einem „Soft Pulse“ (Abbildung 2-6), d.h. mit einem Impuls
geringer Leistung (einem schwaches Hochfrequenzfeld B1) und einer Impulslänge τ, die so
eingestellt ist, dass der Impulswinkel genau 90° beträgt. Während der Dauer des
darauffolgenden Spin-Locks, der den Mischpuls des COSY ersetzt, befinden sich die Kerne
nur im schwachen Hochfrequenzfeld B1. Dadurch werden die chemischen
Verschiebungsdifferenzen der Protonen sehr klein, und die skalaren Kopplungen überwiegen.
Dies führt dazu, daß sich die Spinzustände mischen und Magnetisierung übertragen werden
kann. Der Magnetisierungstransfer kann durch die Länge der Mischzeit gesteuert werden.
Grundlagen
38
Kurze Zeiten von 20-50 ms liefern vorwiegend Kreuzsignale von stark koppelnden Protonen,
während längeres Mischen von 100-300 ms den Magnetisierungstransfer zwischen entfernten
Protonen des Spinsystems begünstigt.
Wie beim COSY-Experiment werden n Experimente mit inkrementierten t1-Zeiten
durchgeführt. Der Spin-Lock besteht in seiner Form der nach ihrem Erfinder Malcom Levitt
benannten MLEV-Sequenz, die den durch herkömmliche Modulationstechniken (Rausch-,
Rechteckmodulation) erreichbaren entkoppelten Bereich des angeregten Kernes im Spektrum
bei gleicher Senderleistung um das Dreifache übertrifft.
t1 t2
90°x
FID
MLEV-17t1 t2
90°x
FID
MLEV-17
Abbildung 2-6. Pulsprogramm für das TOCSY-Experiment. MLEV-17 ist die Form des Spin-
Locks im TOCSY-Experiment.
Wie im COSY-Spektrum entsprechen die Diagonalpeaks denjenigen des normalen
1D-Spektrums, während die Außerdiagonalpeaks Korrelationen zwischen Protonen
entsprechen, die zum jeweils gleichen Spinsystem gehören. Durch die Wahl der Mischzeit
(10 ms bis einige 100 ms) erhält man ein dem COSY entsprechendes Spektrum oder ein „total
korreliertes“ Spektrum unter Wechselwirkung aller benachbarter Protonen, die nicht durch
quartäre C-Atome isoliert sind. Bei der Wahl einer optimierten Mischzeit können
Schwierigkeiten auftreten, wenn Spinsysteme mit unterschiedlicher Anzahl von Atomen (z.B.
substituierte Aromaten und Saccharide) in der zu charakterisierenden Substanz vorhanden
sind. Dann besteht die Problematik darin, dass bei zu langer Mischzeit auch Korrelationen
eines Teilsystems über quartäre C-Atome hinweg zustande kommen und deren Kreuzsignale
im Spektrum sichtbar sind.
Eine breite Anwendung finden TOCSY-Experimente bei der Strukturaufklärung von
Oligosacchariden und vor allem bei Peptiden, da mit diesem Experiment Spinsysteme
einzelner Aminosäuren zugeordnet werden können.
Grundlagen
39
2.2.3 Das HMQC-Experiment
Mit dem HMQC-Experiment (Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) lassen sich die
chemischen Verschiebungen von Kohlenstoffatomen mit daran gebundenen Protonen
korrelieren, es handelt sich also um ein inverses zweidimensionales heteronukleares
H,C-korreliertes NMR-Experiment (Braun, Kalinowski und Berger, 2000; Kapitel 10.13).
Charakteristisch für alle inversen Verfahren ist, dass Kohärenzen im Kanal der
unempfindlichen Kerne (13C, 15N) erzeugt und dann auf die empfindlichen Kerne (z.B. 1H)
übertragen werden, deren Resonanzen dann gemessen werden. Mit dem HMQC-Experiment
lassen sich die chemischen Verschiebungen von Protonen und deren direkt gebundenen
Kohlenstoffe (1J-Kopplungen) korrelieren.
2.2.4 Das HMBC-Experiment
In den C,H-korrelierten Spektren des HMQC-Experiments (Heteronuclear Multiple Bond
Correlation) werden keine Korrelationspeaks von Protonen mit quartären C-Atomen
gefunden, da diese Methoden auf große C,H-Kopplungskonstanten 1J(C,H) über eine Bindung
abgestimmt sind. Das HMBC-Experiment (Braun, Kalinowski und Berger, 2000; Kapitel
10.16) ist die empfindlichste Methode, um Konektivitäten zwischen 1H- und 13C-Kernen in
einem Kohlenstoffskelett zu bestimmen. Die Voraussetzung hierfür ist, dass das Molekül
genügend Protonen als Sonden für die inverse Detektion enthält. Die Bedeutung dieses
Experiments liegt außer in der Verknüpfungsbestimmung von CHn-Fragmenten auch noch in
der Möglichkeit, Heterokerne zuzuordnen. Bei Peptiden ist dieses Verfahren eine wichtige
Methode zur Zuordnung von Seitenkettenfunktionen von Aminosäuren zum Peptidrückgrat,
wenn diese durch quartäre C-Atome unterbrochen sind, sowie zur Bestimmung von
Peptidsequenzen
Grundlagen
40
2.3 Enzymkinetik
Die Enzyminhibition lässt sich in zwei Hemmtypen einteilen: reversible und irreversible
Inhibition. Charakteristisch ist für die reversible Hemmung, dass der Inhibitor I sich wieder
vom Enzym E lösen kann, beispielsweise durch das Substrat S des Enzyms verdrängt werden
kann, wodurch die Enzymaktivität wieder hergestellt wird. Bei der irreversiblen Inhibition
wird der Inhibitor so fest an das Enzym gebunden, dass er sich nicht mehr ablösen kann, d.h.
in der Regel kovalent. Zunächst soll die ungehemmte Enzymreaktion betrachtet und
anschließend mit verschiedenen Hemmtypen verglichen werden.
Die ungehemmte Enzymreaktion verläuft nach folgendem Schema:
E + S ES E + Pkcat
k1
k2
E + S ES E + Pkcat
k1
k2
Das Substrat reagiert mit der Geschwindigkeitskonstante k1 zum Enzym-Substrat-Komplex
ES, und dissoziiert mit der Geschwindigkeitskonstante k2 wieder vom Enzym ab. Der Umsatz
zum Produkt P erfolgt mit der Geschwindigkeitskonstante kcat. Die Michaelis-Menten-
Gleichung gibt dies wieder als
][
][max
SK
SVv
m += (Gleichung 1) mit
1
2
k
kkK cat
m
+= und ][max EkV cat=
Die beiden für ein Enzym charakteristischen Größen sind die Michaeliskonstante Km, die der
Substratkonzentration entspricht, bei der die Hälfte der Maximalgeschwindigkeit erreicht
wird, und der Geschwindigkeitskonstante kcat, die mit der Enzymkonzentration multipliziert
die Maximalgeschwindigkeit ergibt.
Die reversible Inhibition kann allgemein mit folgendem Schema beschrieben werden:
EI + P5
E + S ES E + Pkcat
k1
k2
E + S
+I
ES
+I
E + Pkcat
k1
k2
k3k4
EI + S ES9
k
kESI
kk
k6
k7k8
EI + P5
E + S ES E + Pkcat
k1
k2
E + S
+I
ES
+I
E + Pkcat
k1
k2
k3k4
EI + S ES9
k
kESI
kk
k6
k7k8
Grundlagen
41
Im Speziellen können folgende drei Typen der reversiblen Inhibition unterschieden werden,
die kompetitive, die nicht-kompetitive und die unkompetitive Inhibition. Alle drei Typen
sollen im Folgenden kurz beschrieben werden.
Bei der kompetitiven Inhibition konkurriert der Inhibitor – meist aufgrund einer hohen
Ähnlichkeit – mit dem Substrat um die Bindungsstelle am Enzym. Im Gegensatz zum
Substrat wird der Inhibitor jedoch nicht zum Produkt P umgesetzt. Die reversible Inhibition
folgt diesem Schema:
E + S ES E + Pkcat
k1
k2
E + S+I
ES E + Pkcat
k1
k2
k3k4
EI
E + S ES E + Pkcat
k1
k2
E + S+I
ES E + Pkcat
k1
k2
k3k4
EI
Das Enzym kann also Substrat und Inhibitor nicht gleichzeitig binden, EI und ES stehen in
einem Gleichgewicht. Wird das Substrat in genügend großem Überschuss zugegeben, so kann
der Inhibitor komplett verdrängt werden. Die Maximalgeschwindigkeit Vmax wird also von
einem kompetitiven Inhibitor nicht verändert, es ist jedoch eine höhere Substratkonzentration
erforderlich, um die halbmaximale Geschwindigkeit zu erreichen, Km erhöht sich also.
Der zweite wichtige Spezialfall der reversiblen Inhibition ist die nicht-kompetitive Inhibition.
Diese gehorcht folgendem Schema:
5
E + S ES E + Pkcat
k1
k2
E + S
+I
ES
+I
E + Pkcat
k1
k2
k3k4
EI + S ESk
kESI
k
k6
k7k8
5
E + S ES E + Pkcat
k1
k2
E + S
+I
ES
+I
E + Pkcat
k1
k2
k3k4
EI + S ESk
kESI
k
k6
k7k8
Im Gegensatz zum kompetitiven Inhibitor bindet der nicht-kompetitive Inhibitor unabhängig
vom Substrat an einer anderen Stelle des Enzyms. Deshalb bleibt Km auch unverändert, wenn
ein nicht-kompetitver Inhibitor anwesend ist. Vmax jedoch wird herabgesetzt, da aus dem
Enzym-Substrat-Inhibitor-Komplex kein Produkt freigesetzt werden kann, und somit der
Anteil Enzym, der als ESI-Komplex vorliegt, nicht an der Reaktion beteiligt ist.
Die unkompetitive Inhibition schließlich ist ein relativ seltener Hemmtyp, dem folgendes
Schema zugrunde liegt:
Grundlagen
42
E + S ES E + Pkcat
k1
k2
E + S ES+I
E + Pkcat
k1
k2
ESESI
k7k8
E + S ES E + Pkcat
k1
k2
E + S ES+I
E + Pkcat
k1
k2
ESESI
k7k8
In diesem Falle kann der Inhibitor nur an den Enzym-Substratkomplex binden. Sowohl Vmax
als auch Km werden durch Inhibitoren diesen Typs beeinflusst, das Verhältnis km/Vmax bleibt
jedoch gleich. Praktisch kommt die unkompetitve Inhibition beispielsweise bei Oxidasen vor,
wenn der Inhibitor nur mit dem Enzym reagieren kann, sofern sich dieses in einer bestimmten
Oxidationsstufe befindet.
Für diese Dissertationsschrift bedeutender ist jedoch die irreversible Hemmung. Im Gegensatz
zur reversiblen Inhibition ist bei der irreversiblen Inhibition die Inaktivierung des Enzyms
durch den Inhibitor von Dauer. Eine Dissoziation in freies Enzym und Inhibitor ist nicht
möglich, d. h. einmal inaktiviertes Enzym bleibt inaktiv. Die irreversible Inhibition verläuft
analog dazu nach folgendem Schema:
E + S ES E + Pkcat1
k2
E + S+
I
ES E + Pkcat1
k2
k3k4
EI
E-I
kinact
E + S ES E + Pkcat1
k2
E + S+
I
ES E + Pkcat1
k2
k3k4
EI
E-I
kinact
Die Bildung des irreversiblen E-I-Komplexes verläuft langsam verglichen zur Enzymreaktion
mit dem Substrat. Daher empfielt sich folgende experimentelle Strategie: Das Enzym wird für
verschiedene Zeitpunkte mit dem Inhibitor präinkubiert, bevor die Anfangsgeschwindigkeit
des Enzyms gemessen wird. Aus dem zeitabhängigen Verlust der Enzymaktivität lässt sich
die beobachtete Geschwindigkeitskonstante kobs bestimmen:
v/v0 = exp (-kobst) (Gleichung 2).
Aus obigem Reaktionsschema ergibt sich weiterhin folgende Gleichung für kobs:
][
][
IK
Ikk
appi
inactobs
+= (Gleichung 3)
Grundlagen
43
wobei appiK definiert ist als die scheinbare Konzentration des Inhibitors, bei der die
halbmaximale Rate der Inaktivierung erreicht wird. Wie das Reaktionsschema zeigt findet
zunächst eine reversible Bindung an das Enzym statt (durch appiK als Maß der Affinität des
Inhibitors zum Enzym wiedergegeben) bevor die irreversible Bindung erfolgt (durch kinact als
maximale Rate der Enzyminaktivierung wiedergegeben).
Zielsetzung
44
3 Zielsetzung Ziel der vorliegenden Arbeit war es, neue Erkenntnisse zum Wirkmechanismus und zur
Biosynthese der Abyssomicine zu gewinnen. Außerdem sollte versucht werden, neue
Abyssomicine zu identifizieren, zu isolieren und zu charakterisieren.
Die Abyssomicin-Biosynthese sollte im Rahmen dieser Arbeit mittels
Fütterungsexperimenten von 13C-markierten Vorläufern untersucht werden, um
herauszufinden, aus welcher Quelle die Kohlenstoffatome des Abyssomicins stammen. Die
Untersuchung des Wirkmechanismus von Abyssomicin wurde auf drei Säulen gestellt:
Zunächst wurde ein einfaches Modellsystem (Mercaptoethanol, N-Acetyl-Cystein) gewählt,
das mit atrop-Abyssomicin C umgesetzt werden sollte, um zu untersuchen, ob das
Michaelsystem des Abyssomicins von Thiolen nucleophil angegriffen wird. Zweitens sollte
eine Hemmkinetik von atrop-Abyssomicin C mit ADC-Synthase durchgeführt werden.
Hierfür mussten zunächst die an der Aminodesoxychorismatsynthese beteiligten Enzyme
PabA (Klonierung und Überexpression erfolgte bereits im Rahmen der Diplomarbeit) und
PabB aus aus dem Gesamtgenom von B. subtilis in E. coli kloniert, überexprimiert und eine
Reinigungsstrategie etabliert werden. Zur Verfolgung der Enzymreaktion musste zunächst ein
geeignetes Assay-System entwickelt werden, das eine direkte Beobachtung der ADC-
Synthase-Reaktion ermöglichte. Drittens sollte die kovalente Bindung von atrop-Abyssomicin
C an PabB untersucht werden, indem das mit Abyssomicin inkubierte Enzym sowie das
unbehandelte Enzym durch eine geeignete Protease verdaut, per LC-MS und LC-MS/MS
analysiert und verglichen werden.
Material und Methoden
45
4 Material und Methoden
4.1 Material
4.1.1 Geräte
Agarosegelkammern
BIO-RAD Mini-Sub Cell GT
Photometer
AMERSHAM BIOSCIENCES Ultrospec 2100 pro
PCR
PEQLAB Primus 96 advanced
Zentrifugen
HERMLE Z 383 K HERMLE Z 233 MK-2
Heizblock
EPPENDORF 1,5ml Thermomixer comfort
SDS-PAGE
BIO-RAD Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis
Western Blot
BIO-RAD Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell
Sterilbank
HOLTEN LaminaAr model 1,2
Brutschrank
BINDER
Schüttelinkubator
INFORS Multitron II
French Press
SIM-AMINCO, SLM Instruments, Inc. Rochester, NY, USA
HPLC und Massenspektrometer
HPLC: Agilent 1100 HPLC, Agilent Technologies, Waldbronn
Säulen: Phenomenex, Aschaffenburg
MS: Bruker Esquire3000+, Bruker Daltonics, Bremen
QTrap2000, Applied Biosystems / MDS Sciex, Darmstadt
Material und Methoden
46
4.1.2 Chemikalien
Agar Kobe I pulv., Roti®-Quant Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Ammoniumpersulfat (APS) Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg
Ampicillin Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg
BCA Protein Assay Kit PIERCE Biotechnology Inc., Rockford, IL, USA
Bromphenolblau Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg 13C-markierte Substanzen Eurisotop, Saint-Aubin Cedex, Frankreich
Dialysemembran Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg
Dithiothreitol (DTT) Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg
Ethidiumbromid Sigma Chemie, München
E.Z.N.A. Plasmid Miniprep Kit I PEQLAB Biotechnology GmbH, Erlangen
GeneRuler 1kb DNA Ladder Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)
Diagnostic Chemicals Limited Charlottetown Bio-Tech Trade & Service GmbH
H2Odest. Interne Wasserentsalzungsanlage
H2Odd Millipore Corporation, Billerica, MA, USA
Ni-NTA Agarose Qiagen GmbH, Hilden
Ni-NTA Spin Kit Qiagen GmbH, Hilden
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED)
Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg
NucleoSpin Extract Kit MACHEREY-NAGEL GmbH, Düren
Nutrient Broth BD Becton Dickinson GmbH, Sparks, MD, USA
Primer Biomers.net GmbH, Ulm
Prestained Proteinladder, 10-180 kDa Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
Proteinladder, 10-200 kDa Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
Rinderserumalbumin (BSA) Sigma Aldrich, Steinheim
Qiaex II Gel Extraction Kit Qiagen GmbH, Hilden
Roti®-Quant Reagenz Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Rotiphorese Gel A (30 %) Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Rotiphorese Gel B (2 %) Carl Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Serva Blau 250 Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg
TriDye 100 bp DNA Ladder New England Biolabs, Schwalbach
TriDye 2-log DNA Ladder New England Biolabs, Schwalbach
Trizma® base (Tris) Sigma Chemie, München
Alle hier nicht aufgeführten Chemikalien waren analysenreine Reagenzien der Firma Carl
Roth GmbH & Co, Karlsruhe
Material und Methoden
47
4.1.3 Enzyme
Antarctic Phosphatase New England Biolabs, Schwalbach
DNA Polymerase I Klenow Fragment New England Biolabs, Schwalbach
Endoprotease GluC New England Biolabs, Schwalbach
Glutamat-Dehydrogenase Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg
Lysozym Serva Feinbiochemica GmbH, Heidelberg
Proteinase K Roche, Basel
Pwo DNA-Polymerase und Puffer Roche, Basel
Quickligase New England Biolabs, Schwalbach
Restriktionsendonucleasen und –puffer Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
New England Biolabs, Schwalbach
T4-DNA-Ligase New England Biolabs, Schwalbach
T4-Polynucleotidkinase Fermentas GmbH, St. Leon-Rot
Trypsin Gold, Mass Spectrometry Grade Promega Corporation, Madison, WI, USA
4.1.4 Medien
DSMZ-Medium 1 Pepton 5 g
Malzextrakt 3 g
MnSO4 10 mg
H2O dest. ad 1 Liter
pH 7.0
KM 1-Medium Nutrient Broth 4 g
NaCl 2,5 g
H2O dest. ad 500 ml
MM 1-Medium Glucose* 5 g
tri-Na-Citrat x 2 H2O 0,5 g
KH2PO4 3 g
K2HPO4 7 g
MgSO4 x 7 H2O 0,1 g
(NH4)2SO4 1 g
Material und Methoden
48
H2O ad 1 Liter
SGG Stärke 10 g
Glucose* 10 g
Glycerin 10 g
Cornsteep Powder 2,5 g
Pepton 5 g
Hefeextrakt 2 g
NaCl 1 g
CaCO3 3 g
H2O ad 1 Liter
pH 7,2
TY-Medium Trypton 4 g
Yeast Extract 2,5 g
NaCl 2,5 g
H2O dest. ad 500 ml
* Glucose wird separat sterilisiert
4.1.5 Medienzusätze
Agar Agar Kobe I für Platten 7,5 g für 500 ml TY
Antibiotika Ampicillin (stock 25 mg/ml) in H2O 50 µg/ml
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalaktosid,
(stock 100 mM) in H2O
1 mM
Material und Methoden
49
4.1.6 Lösungen
4.1.6.1 Lösungen zur DNA-Isolierung
TE-Puffer 10 mM Tris/HCl 121,1 mg
1 mM EDTA 37 mg
H2O dest. ad 100 ml
pH 8,0
Lysozym-Lösung 100 mg/ml Lysozym in TE-Puffer
Proteinase K-Lösung 20 mg/ml Proteinase K in TE-Puffer
RNase A-Lösung 10 mg/ml RNase A in TE-Puffer
SB1-Puffer 50 mM EDTA 1,85 g
50 mM Tris/HCl 606 mg
0,5 % Tween-20 500 µl
0,5 % Triton X-100 500 µl
H2O dest. ad 100 ml
pH 8,0
SB1-Puffer 3 mM Guanidiniumhydrochlorid 29 mg
20 % Tween-20 20 ml
H2O dest. ad 100 ml
pH 5,5
Sämtliche weiteren benötigten Puffer stammten aus den entsprechenden Kits.
Material und Methoden
50
4.1.6.2 Puffer für Phosphorylierung und Ligation
10 x T4-DNA-Ligasepuffer 200 mM Tris/HCl 2,42 g
50 mM MgCl2 1,02 g
50 mM DTT 772 mg
500 µg/ml BSA 50 mg
ATP 1 mM
H2O dest. ad 100 ml
pH 7,6
4.1.6.3 Lösungen für Agarosegele
Auftragspuffer 5 x Saccharose 25 %
SDS 0,1 %
Bromphenolblau 0,05 %
Tris 50 mM
TAE-Puffer 10 x Tris 48, 4 g
Essigsäure (96 %) 11,4 g
EDTA 7,2 g
H2O dest. ad 1 l
pH 7,9
Ethidiumbromid-
Färbebad
5 µg/ml in 500 ml
H2Od
Material und Methoden
51
4.1.6.4 Lösungen für SDS-PAGE
Auftragspuffer 1 M Tris/HCl pH 6,8 3,75 ml
SDS 1,2 g
Glycerin 6 ml
Bromphenolblau 6 mg
H2O dest. ad 13,5 ml
Zugabe vor Verwendung: 1 M DTT 1,5 ml
Elektrophoresepuffer 10 x Tris 31 g
Glycin 144 g
SDS 10 g
H2O dest. ad 1 l
pH 8,3
Sammelgelpuffer Tris/HCl, pH 6,8 0,25 M
Trenngelpuffer Tris/HCl, pH 8,8 1,5 M
Sammelgel Rotiphorese Gel A (30 % Acrylamid) 1,25 ml
Rotiphorese Gel B (2 % Bisacrylamid) 0,5 ml
Sammelgelpuffer 6,3 ml
H2O dest. 4,0 ml
SDS (10 %) 120 µl
APS (100 mg/ml) 80 µl
TEMED 30 µl
Trenngel (12 %) Rotiphorese Gel A (30 % Acrylamid) 8 ml
Rotiphorese Gel B (2 % Bisacrylamid) 2,4 ml
Trenngelpuffer 5,0 ml
H2O dest. 7,5 ml
SDS (10 %) 400 µl
APS (100 mg/ml) 100 µl
TEMED 50 µl
Material und Methoden
52
Färbelösung Serva Blau R250 0,85 g
Ethanol 250 ml
Eisessig 50 ml
H2O dest. ad 500 ml
Entfärbelösung Ethanol 100 ml
Eisessig 100 ml
H2O dest. ad 1 l
4.1.6.5 Lösungen zur Proteinreinigung von PabA
Harnstoffpuffer 8 M Harnstoff 48,05 g
100 mM NaH2PO4 1,38 g
10 mM Tris/HCl 121 mg
H2O dest. ad 100 ml
pH 8,0
Zugabe vor Gebrauch: 1 M DTT (5 mM) 0,5 ml
Dialysepuffer 50 mM Tris/HCl 6,06 g
Glycerin 8 % 93 ml
H2O dest. ad 1 l
pH 8,0
Zugabe vor Gebrauch: 1 M DTT 1 ml
Puffer für Anionen-austauschchromatographie
Puffer A 50 mM Tris/HCl 6,06 g
Glycerin 8 % 93 ml
H2O dest. ad 1 l
pH 8,0
1 M DTT 1 ml
Material und Methoden
53
Puffer B 50 mM Tris/HCl 6,06 g
Glycerin 8 % 93 ml
1M NaCl 58 g
H2O dest. ad 1 l
pH 8,0
1 M DTT 1 ml
Gelfiltrationspuffer 50 mM Tris/HCl 6,06 g
Glycerin 8 % 93 ml
150 mM NaCl 8,7 g
H2O dest. ad 1 l
pH 8,0
Zugabe vor Gebrauch: 1 M DTT 1 ml
4.1.6.6 Lösungen zur Proteinreinigung von PabB
Lysis-Puffer: 50 mM NaH2PO4 780 mg
300 mM NaCl 1,75 g
10 mM Imidazol 68 mg
ad 100 ml H2Odd
pH 8,0
Wasch-Puffer: 50 mM NaH2PO4 780 mg
300 mM NaCl 1,75 g
20 mM Imidazol 136 mg
ad 100 ml H2Odd
pH 8,0
Elutions-Puffer: 50 mM NaH2PO4 780 mg
300 mM NaCl 1,75 g
250 mM Imidazol 1,7 g
ad 100 ml H2Odd
pH 8,0
Material und Methoden
54
Dialysepuffer 50 mM Tris/HCl 6,06 g
Glycerol 50 %
H2Odd ad 1 l
pH 8,0
Zugabe vor Gebrauch: 1 M DTT 1 ml
Gelfiltrationspuffer 50 mM Tris/HCl 6,06 g
Glycerin 8 % 93 ml
150 mM NaCl 8,7 g
H2Od ad 1 l
pH 8,0
Zugabe vor Gebrauch: 1 M DTT 1 ml
4.1.6.7 Lösungen zur Proteinbestimmung
Reagenzlösung BCA BCA Protein Assay Reagent A 50 Teile (v/v)
BCA Protein Assay Reagent B 1 Teil (v/v)
Reagenzlösung Bradford Bradford Reagenz 2 Teile (v/v)
H2Odd 5,5 Teile (v/v)
4.1.6.8 Puffer für die Kinetik
Ammoniumsulfat-Puffer 2 x 100 mM Tris/HCl 1,21 g
200 mM (NH3)2SO4 2,64 g
10 mM MgCl2 203 mg
10 % Glycerol 10 ml
H2Odd ad 100 ml
pH 8,5
Material und Methoden
55
Assay-Puffer Ammoniumsulfatpuffer 50 µl
1 M DTT (1 mM f.c.) 0,2 µl
Chorismat 10 µl
H2Odd 39,8 µl
4.1.6.9 Puffer für den GluC Verdau
Verdau-Puffer GluC-Puffer (Fermentas)
Trypsinlösung Endoproteinase GluC
H2OLCMS 50 µl
4.1.6.10 Laufmittel für die LC-ESI-MS-Kopplung
Laufmittel für Proteinverdau
Laufmittel A H2OLCMS
0,1 % HCOOH
Laufmittel B AcetonitrilLCMS
0,1 % HCOOH
Laufmittel für Enzymkinetik
Laufmittel A H2OLCMS
5 mM Ammoniumformiat 313,15 mg/l
0,1 % HCOOH 1 ml
Laufmittel B AcetonitrilLCMS
5 mM Ammoniumformiat 313,15 mg/l
0,1 % HCOOH 1 ml
Alle Bestandteile der Laufmittel stammten von der Firma Carl Roth GmbH
Material und Methoden
56
4.1.7 Bakterienstämme
Im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende Bakterienstämme verwendet:
Spezies Bezeichnung Merkmale Referenz
Verrucosispora
AB-18-032
Abyssomicin-Produzent Riedlinger et al, 2004
Bacillus subtilis DSM 10 sensitiv auf Abyssomicin DSMZ, Braunschweig
Escherichia coli DH5α supE44 ∆lacU169
(Φ80 lacZ∆M15)
hsdR17 recA1 endA1 gyrA
thi-1 relA1
Hanahan, 1983
Escherichia coli BL21(DE3) hsdS (rB-mB
-) gal dcm
ompTλ(DE3), T7-RNA-Poly-
merasegen unter Kontrolle des
lacUV5-Promotors
Studier und Moffat, 1986
Material und Methoden
57
4.1.8 Plasmide
Für diese Arbeit wurde das in Abbildung 4-1 dargestellte Plasmid PrSet_6His_PP verwendet,
das freundlicherweise von Prof. Michael Groll (Charité, Berlin) zur Verfügung gestellt wurde.
PrSet_6His_PP
2803 bps
500
1000
1500
2000
2500
EcoO109IBamHI
BlpIEcoO109I
T7 Promotor
bla
Start BamHI
ATG AGA GGA TCG CAT CAC CAT CAC CAT CAC CGT GAA GTT CTG TTC CAG GGG CCC GGA TCC M R G S H H H H H H L E V L F Q G P G S Hexa-His-Tag Erkennungssequenz für Prescission Protease
Abbildung 4-1. Schematische Darstellung des Plasmids PrSet_6His_PP. Eingezeichnet sind neben den Restriktionsschnittstellen der Hexa-His-Tag, die Erkennungssequenz der Prescission
Protease, die Promotorregion Φ10 und das für die Ampicillinresistenz verantwortliche β-Lactamasegen bla.
4.1.9 Primer
Oligo Name Sequenz PabB BamH1 forward tgtgttggatccgcacaacgcagacc PabB BlpI backward aggagtgctgagctcatctaatttttgtctcttcttcgc
Material und Methoden
58
4.2 Mikrobiologische Methoden
4.2.1 Lagerung und Anzucht von Verrucosispora AB-18-032
Zunächst wurden von dem Stamm Verrucosispora AB-18-032 Tiefkühlkulturen angelegt.
Hierzu wurde 1 ml einer Vorkultur in ein 2-ml-Kryoröhrchen vorgelegt, mit 1 ml steriler
Kryolösung (20% Glycerin, 10% Saccharose) versetzt und bei – 80 °C gelagert. Mit diesen
Kulturen wurde als Vorkultur ein 500 ml Schüttelkolben mit drei Schikanen, der 100 ml
SGG- Medium enthielt, beimpft. Die Inkubation erfolgte bei 27 °C auf einer Inforce-
Schüttelmaschine bei 120 Upm für 72 Stunden. Zur Herstellung von Hauptkulturen wurden
100 ml SGG-Medium in einem 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 3 ml Vorkultur inokuliert. Die
Inkubation erfolgte bei 27 °C und 120 Upm auf einer Inforce-Schüttelmaschine für
72 Stunden.
4.2.2 Fütterungsexperimente mit 13C-isotopenmarkierten Verbindungen
Wie in 4.2.1 beschrieben wurde 1 l Hauptkultur verteilt auf 10 Erlenmeyerkolben angesetzt.
Pro 100 ml Kultur wurden 50 mg der jeweiligen 13C-isotopenmarkierten Substanzen gefüttert
(fünfmaliger Puls je 10 mg pro 100 ml) im Abstand von 3 h. Die Puls-Fütterung begann nach
48 h und wurde nach 60 h beendet. Anschließend wurde die Kultur für 12 h weiter wachsen
gelassen, und nach 72 h entsprechend 4.2.3 aufgearbeitet.
4.2.3 Isolierung der Abyssomicine aus Kulturen von Verrucosispora
Die Isolierung der Abyssomicine erfolgte in abgewandelter Version nach Riedlinger et al
(2004) durch eine Kombination aus Adsorptions-, Größenausschluss- und
RP-Chromatographie.
Zunächst wurde das Mycel durch Zentrifugation in einer Hermle Z383.K-Zentrifuge mit
Ausschwingrotor 221.08 V01 für 10 min bei 4500 rpm vom Kulturfiltrat abgetrennt. Das so
gewonnene Kulturfiltrat wurde zunächst an Polystyrolharz Amberlite XAD-16 gereinigt. Die
hierzu verwendete Menge des XAD-Harzes entsprach dem Volumen von 10 % des
Kulturfiltrates (meist 100 – 200 ml). Der Fluß wurde auf 5 Bettvolumen pro Stunde
eingestellt. Nach dem Beladen der Säule wurde mit 5 Bettvolumen deionisiertem Wasser und
mit 40 % Methanol gewaschen, und anschließend mit 100 % Methanol eluiert.
Das Eluat wurde am Rotationsverdampfer bis zum wässrigen Rückstand eingeengt. Der
wässrige Rückstand wurde auf pH 4,0 eingestellt und dreimal mit Ethylacetat extrahiert. Der
Material und Methoden
59
Extrakt wurde in einem Spitzkölbchen am Rotationsverdampfer bis zur Trockene eingeengt.
Anschließend wurde der Extrakt in wenig Methanol aufgenommen und auf eine Sephadex
LH-20 Säule aufgetragen. Das Eluat wurde in Abständen von 20 min bei einem Fluss von
0,8 ml/min fraktioniert. Aufgrund von Analysen mittels HPLC-DAD wurden die
Abyssomicin-haltigen Fraktionen bestimmt, vereinigt und in einem Spitzkölbchen erneut bis
zur Trockene eingeengt. Der letzte Schritt war eine präparative RP-HPLC mit einem
Lösungsmittelsystem aus Wasser und Acetonitril, das unbedingt säurefrei sein muss. Die
Gradienten wurden jeweils an das Trennproblem angepasst und optimiert.
4.2.4 LC-ESI-MS und LC-DAD zur Untersuchung der Abyssomicine
Alle LC-ESI-MS-Experimente wurden mit einer Agilent 1100 HPLC-Anlage (Agilent
Technologies, Waldbronn) gekoppelt an eine QTRAP 2000 (MDS Sciex/Applied Biosystems,
Darmstadt) durchgeführt. Wurde die analytische HPLC verwendet, so lag die Flussrate bei
1,5 ml/min, wurde die Kapillar-HPLC verwendet, lag die Flussrate bei 60 µl/min. Das
Massenspektrometer wurde mit der Analyst-Software gesteuert und alle LC-ESI-MS-Daten
wurden mit dieser Software ausgewertet. Für LC-DAD-Experimente wurde die analytische
HPLC mit einer Flussrate von 1,5 ml/min verwendet.
Als mobile Phase diente H2O (LCMS grade) mit 0,1 % Ameisensäure (Laufmittel A) und
ACN (LCMS grade) mit 0,1 % Ameisensäure (Laufmittel B). Für LC-ESI-MS- und
LC-DAD-Untersuchungen wurden die in Tabelle 4-1 und Tabelle 4-2 angegebenen
Routinegradienten und die in Tabelle 4-3 angegebenen Säulen verwendet.
Tabelle 4-1. LC-MS Routinegradient.
Zeit [min] Solvent B [%] Flußrate analytische HPLC Flußrate Kapillar-HPLC
0,00 10 1,5 ml/min 60 µl/min
10,00 100 1,5 ml/min 60 µl/min
Tabelle 4-2. LC-DAD Routinegradient.
Zeit [min] Solvent B [%] Flussrate
0,00 5 1,5 ml/min
10,00 100 1,5 ml/min
Material und Methoden
60
Tabelle 4-3. HPLC-Säulen.
Dimension Säule Sorbent Partikelgröße
[µm]
Porengröße
[A] Länge
[mm]
ID
[mm]
Part. Nr. Hersteller
Luna RP-C18 3 90 50 1 00B-
4251-A0 Phenomenex
Luna RP-C18 5 100 100 4,6 00D-
4252-E0 Phenomenex
4.2.5 Präparative HPLC-MS
Präparative Trennungen wurden auf einer Agilent 1100 HPLC-Anlage (Agilent Technologies,
Waldbronn) durchgeführt. Die Flussrate lag bei 15 ml/min. Die HPLC wurde mit der
ChemStation-Software gesteuert. Als mobile Phase diente H2Odd (Laufmittel A) und
ACNgrad.grade (Laufmittel B). Die verwendete Säule ist in Tabelle 4-4 dargestellt. Die während
der Trennung aufgefangenen Fraktionen wurden per HPLC-DAD analysiert. Anschließend
wurden die Fraktionen vereinigt und gefriergetrocknet.
Tabelle 4-4. Präparative HPLC-Säule.
Dimension Säule Sorbent Partikelgröße
[µm] Länge
[mm]
ID
[mm]
Part. Nr. Serien Nr.
Hersteller
GROM-SIL
300 ODS-5 RP-C18 10 250 20
GSOD
51130R2520 25070091 Grom
In Tabelle 4-5 sind die verwendeten präparativen HPLC-Gradienten angegeben. Es wurden
Flußraten von jeweils 15 ml/min verwendet. Am Ende eines Chromatographie-Laufs wurde
mit 100 % ACN gespült. Die Trennungen wurden im analytischen Maßstab etabliert und auf
die präparative Trennung wie in Tabelle 4-5dargestellt übertragen.
Material und Methoden
61
Tabelle 4-5. Gradienten der präparativen HPLC-MS-Läufe.
Trennung Zeit
[min]
Solvent B
[%]
Flußrate
[ml/min]
Detektion,
Wellenlänge [nm]
0 20 15 230 a) Aufreinigung von atrop-
Abyssomicin C
35 100 15
0 40 15 260 b) Aufreinigung von Abyssomicin B,
G, H
20 100 15
0 20 15 260 c) Aufreinigung der Produkte der
Umsetzung mit Mercaptoethanol
und N-Acetylcystein
20 100 15
4.2.6 Umsetzungen von Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C mit Nucleophilen
Abyssomicin und atrop-Abyssomicin C wurden mit verschiedenen Nucleophilen (NaBH4,
Na(CN)BH3, NH2OH, NH3, Mercaptoethanol und N-Acetylcystein) umgesetzt. Folgende
Stammlösungen wurden verwendet, sofern nicht anders angegeben in Tetrahydrofuran, die
Reaktionen liefen jeweils 2 h bei Raumtemperatur:
Abyssomicin / Atrop-Abyssomicin 50 mM 17,35 mg/ml
Triethylamin 500 µg/ml
NaBH4 100 mM: 3,78 mg/ml
Na(CN)BH3 Lösung (100 mM)
NH2OH HCl 100 mM: 6,94 mg/ml
NH3 100 mM: 10 µl 25% Lsg + 1490 µl H2O
Mercaptoethanol 40 µg/ml in ACN
N-Acetylcystein 8,16 mg/ml
Material und Methoden
62
1. H-Nucleophile: NaBH4 Abyssomicin/ atrop-Abyssomicin
NaBH4 Triethylamin Tetrahydro-furan
1 eq (0,36 µmol) 1,5 eq (0,54 µmol) 1 eq 7,2 µl 5,4 µl 29,2 µl 430 µl 7,2 µl 5,4 µl 29,2 µl 430 µl
2. H-Nucleophile: Na(CN)BH3 Abyssomicin/ atrop-Abyssomicin
Na(CN)BH3 Triethylamin Tetrahydro-furan
1 eq (0,36 µmol) 1,5 eq (0,54 µmol) 1 eq 7,2 µl 5,4 µl 29,2 µl 430 µl 7,2 µl 5,4 µl 29,2 µl 430 µl
3. N-Nucleophile: NH2OH HCl Abyssomicin/ atrop-Abyssomicin
NH2OH HCl Triethylamin Tetrahydro-furan
1 eq (0,36 µmol) 1,5 eq (0,54 µmol) 1 eq 7,2 µl 5,4 µl 29,2 µl 430 µl 7,2 µl 5,4 µl 29,2 µl 430 µl
4. N-Nucleophile: NH3 Abyssomicin/ atrop-Abyssomicin
NH3 Tetrahydro-furan
1 eq (0,36 µmol) 1,5 eq (0,54 µmol) 7,2 µl 5,4 µl 430 µl 7,2 µl 5,4 µl 430 µl
5. S-Nucleophile: N-Acetylcystein präparativer Ansatz atrop-Abyssomicin
N-Acetylcystein Triethylamin Tetrahydro-furan
1 eq 1,5 eq 1 eq 200 µl 300 µl 811 µl 10 ml
6. S-Nucleophile: Mercaptoethanol präparativer Ansatz atrop-Abyssomicin
Mercaptoethanol Triethylamin Tetrahydro-furan
1 eq 1,5 eq 1 eq 200 µl 1070 µl 811 µl 10 ml
Material und Methoden
63
4.2.7 Testierung der Abyssomicine auf antibiotische Aktivität
Als Testorganismus wurde Bacillus subtilis verwendet, der in Agarplatten eingegossen wurde.
Hierzu wurden 200 ml Minimalmedium-Agar mit 2 ml Sporensuspension angeimpft und
anschließend Petrischalen mit 10 ml des beimpften Agar beschickt.
Die Herstellung der Sporensuspension erfolgte durch Kultivierung von B. subtilis DSM 10 in
DSM 1-Medium (500 ml Erlenmeyerkolben, 3 Schikanen, 100 ml Medium) für 10 d auf der
rotierenden Schüttelmaschine bei 37°C und 120 rpm. Die Kultur wurde abzentrifugiert und
zweimal mit Saline gewaschen, in Saline/Glyerin (1:1) resuspendiert und die OD587 nm auf 1,0
eingestellt.
Es wurden MM1-Testplatten mit und ohne Zusatz von jeweils 5 mM L-Tryptophan (Trp),
L-Phenylalanin (Phe), L-Tyrosin (Tyr) und para-Aminobenzoesäure (pABA) hergestellt. Je
zwei Filterrondelle wurden mit 10 µl des zu testenden Extrakts bzw. der zu testenden
Substanz (meist 1 mg/ml) beträufelt, ½ h getrocknet und auf eine Platte mit
Aminosäurenzusatz, sowie auf eine Platte ohne Aminosäurenzusatz gelegt. Die Platten
wurden anschließend bei 37 °C für 16 h inkubiert.
Als zweite Stufe der antibiotischen Testierung wurden Kreuztests durchgeführt. Auf
MM1-Testplatten wurde je ein Filterstreifen aufgelegt, der zuvor mit 100 µl der zu testenden
Substanz getränkt und danach getrocknet wurde. Von Trp, Phe und pABA wurde jeweils eine
Lösung in sterilem deionisiertem Wasser in einer Konzentration von 5 mg/ml hergestellt. Tyr
wurde in der gleichen Konzentration in 1 mM Ammoniak gelöst. Es wurden Filterstreifen
vorbereitet, die mit den verschiedenen Aminosäurelösungen beträufelt und getrocknet
wurden. Die Filterstreifen mit getränkten Aminosäuren wurden quer über die
substanzgetränkten Filterstreifen gelegt und anschließend bei 37 °C für 16 h inkubiert.
4.3 Molekularbiologische Methoden
4.3.1 Isolierung von chromosomaler DNA aus B. subtilis DSM 10
Die Isolierung der Gesamt-DNA aus B. subtilis erfolgte mit Hilfe von NucleoSpin-Säulchen
(Macherey-Nagel, Düren) nach einem Protokoll von Silke I. Patzer (persönl. Mitteilung). Das
der Isolierung und Reinigung zugrunde liegende Prinzip ist die Affinität der DNA zur
Silicamatrix der Säulchen.
5 ml einer Übernachtkultur in KM1-Medium wurde für 8 min bei 4000 rpm in einer Heraeus
Instruments Megafuge 1,0 R abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Die pelletierten
Material und Methoden
64
Bakterien wurden in 500 µl SB1-Puffer aufgenommen und 10 µl RNase, 11,5 µl Lysozym
und 14,5 µl Proteinase K zugegeben. Nach 30 min Inkubation bei 37 °C wurden 172 µl
SB2-Puffer zugegeben, gründlich gemischt und für 15 min bei 50 °C inkubiert. Der gesamte
Ansatz wurde auf ein NucleoSpin-Säulchen gegeben und 30 s bei 9000 rpm in der Eppendorf
Centrifuge 5415 C zentrifugiert. Anschließend wurde zuerst mit 500 µl PB-Puffer und dann
mit 750 µl PE-Puffer gewaschen, wobei jeweils 30 s bei 13000 rpm zentrifugiert wurde.
Getrocknet wurde die Säule durch 1 min Zentrifugieren im geleerten Sammelgefäß bei
13000 rpm. Zur Elution wurde 45 µl 40 °C warmer TE-Puffer direkt auf die Matrix pipettiert,
1 min inkubiert und anschließend 1 min bei 14000 rpm zentrifugiert. Die Lagerung der
Gesamt-DNA erfolgte bei 4 °C.
4.3.2 Agarose-Gelelektrophorese
Mit Agarose-Gelelektrophorese wurden die Ergebnisse von DNA-Isolierungen, Polymerase-
kettenreaktionen sowie Restriktionsspaltungen überprüft. Das Laufverhalten der DNA im
elektrischen Feld in der Agarosematrix beruht auf den negativen Ladungen der DNA, die von
der Anode angezogen werden. Die Wandergeschwindigkeit der DNA hängt ab von folgenden
Parametern: Von der Länge der DNA, der Konformation (einzelsträngig, doppelsträngig,
offen zirkulär, supercoiled, linear), der Maschenweite der Agarose sowie der angelegten
Feldstärke. Durch die Agarosekonzentration kann die Maschenweite, d. h. das Laufverhalten
eingestellt werden. Die Größe unbekannter DNA-Fragmente kann – sofern es sich um
linearisierte DNA handelt – durch Vergleich mit linearen Fragmenten definierter Länge,
einem sog. DNA-Längenstandard bestimmt werden. Als Längenmarker wurde hier die TriDye
2-log DNA Ladder (New England Biolabs, Schwalbach) verwendet.
Die elektrophoretische Auftrennung von DNA-Fragmenten im Agarosegel erfolgte in der
Flachbett-Elektrophoreseapparatur BIO-RAD Mini-Sub Cell GT (Bio-Rad, München) für
30 min bei einer Spannung von 80 V. Die hierzu verwendeten Gele enthielten 0,9 % Agarose
in TAE-Puffer. Durch Inkubation im Ethidiumbromid-Färbebad, wurden die DNA-Banden
nach der Elektrophorese durch langwelliges UV-Licht sichtbar gemacht.
4.3.3 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die auf Saiki et al. (1988) zurückgehende Polymerasekettenreaktion dient der zyklischen
Amplifizierung von DNA-Abschnitten unter Verwendung einer thermostabilen Polymerase.
Hierzu sind zwei Oligonucleotid-Primer notwendig, die jeweils an einem Ende des zu ampli-
Material und Methoden
65
fizierenden DNA-Stückes hybridisieren können. Das in dieser Arbeit verwendete pabA-Gen
wurde durch PCR aus dem Gesamtgenom von B. subtilis DSM 10 amplifiziert.
Pro Ansatz wurde in ein PCR-Tube pipettiert:
5 µl 10 x Reaktionspuffer
0,3 µl Gesamt-DNA
1,6 µl dNTP (10 mM)
je 2,5 µl Primer (10 pmol/µl)
0,25 µl Pwo DNA-Polymerase (Roche)
H2Odd ad 50 µl
Für die PCR wurde folgendes Programm eingesetzt:
Reaktion Temperatur Zeit
1. Denaturierung 94 °C 3 min
30 Zyklen:
2. Denaturierung 94 °C 45 s
3. Annealing 54 °C 50 s
4. Polymerisation 72 °C 1 min 20 s
5. Polymerisation 72 °C 10 min
6. Ende 6 °C ∞
4.3.4 Restriktionsverdau, Phosphatase-Reaktionen und Ligationen
Restriktionsverdau, Dephosphorylierung und Ligation wurde bei der jeweils nach
Empfehlung des Herstellers im mitgelieferten Puffer durchgeführt. Bei Bedarf wurden die
Ansätze auf ein Agarosegel aufgetragen und mittels QIAEX II-DNA-Extraktionskit (Qiagen,
Hilden) aufgereinigt.
4.3.5 Reinigung von DNA-Fragmenten
PCR-Produkte, Restriktionsfragmente und Dephosphorylierungsprodukte wurden mit Hilfe
des QIAEX II-DNA-Extraktionskit (Qiagen, Hilden) aus dem Agarosegel entsprechend der
Material und Methoden
66
Anleitung aufgereinigt. Die Menge des PCR-Produkts wurde anhand von Agarosegelen
abgeschätzt.
4.3.6 Herstellung kompetenter E. coli-Zellen
Die Herstellung kompetenter Zellen erfolgte nach der von Dagert und Ehrlich (1979)
beschriebenen CaCl2-Methode, die logarithmisch wachsenden E. coli-Zellen die Fähigkeit
verleiht, freie DNA aus dem umgebenden Medium aufzunehmen.
Hierzu wurden 40 ml TY-Medium mit 0,4 ml einer Übernachtkultur des entsprechenden E.
coli-Stammes angeimpft und bei 37 °C unter Schütteln etwa 2 h bis zu einer OD578 von 0,5
inkubiert. Die Bakterien wurden in einem sterilen 50 ml Falcon Tube 10 min auf Eis gestellt
und anschließend in einer auf 4 °C gekühlten Hermle Z383.K Zentrifuge mit Ausschwingrotor
221.08 V01 für 10 min bei 3500 rpm zentrifugiert. Die Bakterien wurden in 20 ml eiskaltem
0,1 M CaCl2 resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert und anschließend erneut bei 4 °C
10 min bei 4300 rpm abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 ml eiskalter CaCl2–Lösung
aufgenommen und weitere 30 min auf Eis gestellt, anschließend sofort zur Transformation
(siehe Absatz 4.3.7) verwendet.
4.3.7 Transformation von kompetenten E. coli-Zellen mit Plasmid-DNA
Die Transformation wurde nach Sambrook und Russel (2001) durchgeführt. Hierzu wurden
zwischen 100 und 250 µl kompetente Zellen mit 5 µl Ligationsansatz bzw. 1 µl Plasmid-
DNA-Lösung versetzt und zunächst 30 min auf Eis gestellt. Anschließend erfolgte der
Hitzeschock für 1,5 min bei 42 °C, dann wurden die Zellen erneut auf Eis gestellt. Der
gesamte Ansatz wurde auf ampicillinhaltigen TY-Platten ausplattiert und über Nacht bei
37 °C inkubiert.
4.3.8 Isolierung von Plasmid-DNA
Die Isolierung von Plasmid-DNA erfolgte unter Verwendung des E.Z.N.A. Plasmid Miniprep
Kit I (PEQLAB Biotechnology GmbH, Erlangen) entsprechend den Angaben des Herstellers.
Material und Methoden
67
4.4 Proteinchemische Methoden
4.4.1 Induktion und Überexpression
Zur heterologen Expression von Proteinen in E. coli eignen sich besonders solche Systeme,
die eine gezielte Induktion der Expression erlauben. Ein Beispiel ist der hier verwendete pT7-
7-Vektor, in den das zu exprimierende Gen unter der Kontrolle des T7-Promotors eingebracht
wird. Der Expressionswirt E. coli BL21 (DE3) besitzt eine chromosomale Kopie der T7-
RNA-Polymerase unter der Kontrolle des lac-Operators. Durch Zugabe von IPTG lässt sich
die Expression der T7-RNA-Polymerase und somit auch des gewünschten Gens induzieren.
Zunächst wurde die Expression im Testansatz durchgeführt. Hierzu wurden 20 ml ampicillin-
haltiges TY-Medium mit 400 µl einer Übernachtkultur von E. coli BL21(DE3) mit dem
jeweiligen Plasmid angeimpft und die Zellen unter Schütteln bei 37 °C zu einer OD578 von 0,5
wachsen gelassen. Davon wurde 1 ml als Negativkontrolle entnommen, abzentrifugiert und in
50 µl Probenpuffer aufgenommen. Der Rest wurde mit IPTG der Endkonzentration 1 mM
induziert und bei 37 °C weitergeschüttelt. Nach 1, 2, 3 und 4 h wurde jeweils die OD578
gemessen und 1 ml entnommen, abzentrifugiert und in Probenpuffer aufgenommen. Die
Proben wurden über SDS-PAGE analysiert.
Zur Expression des Proteins im größeren Maßstab wurden 250 ml ampicillinhaltiges TY-
Flüssigmedium mit 4 ml Übernachtkultur angeimpft, zu einer OD578 von 0,5 angezogen und
mit IPTG der Endkonzentration 1 mM induziert. Nach 4 h Schütteln bei 37 °C wurden die
Zellen in 50 ml Falcontubes durch Zentrifugieren für 10 min mit der Hermle Z383.K
Zentrifuge mit Ausschwingrotor 221.08 V01 bei 3500 rpm und 4 °C geerntet. Wurden die
Bakterien nicht sofort aufgearbeitet, so wurde das Pellet bei -80 °C aufbewahrt. Vor dem Auf-
schluss der Zellen wurden diese 15 min auf Eis aufgetaut, in 3 ml Lysepuffer aufgenommen
und mit der French Press aufgeschlossen.
4.4.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die Auftrennung der Proteine wurde nach der auf Lugtenberg et al. (1975) zurückgehenden
Methode in einer Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Gelelektrophoresekammer von BIO-
RAD im 12 %igen Trenngel für 30 min bei 15 mA/Gel und 45 min bei 20 mA/Gel
durchgeführt. Hierzu wurden jeweils 20 µl gelöstes Protein aufgetragen, das zuvor in
Material und Methoden
68
Auftragspuffer aufgenommen und für 3 min bei 95 °C erhitzt wurde. Zur Identifizierung
einzelner Proteinbanden wurden diverse Proteinmarker der Fermentas GmbH (St. Leon-Roth)
eingesetzt. Die Gele wurden mit Färbelösung gefärbt und mit Entfärbelösung entfärbt.
4.4.3 Reinigung von PabA
Zur Reinigung von PabA wurde die Tatsache ausgenutzt, dass sich bei der Überexpression
Proteinaggregate bilden. Die Reinigung erfolgte bei 4 °C im Kühlraum. Nach Aufschluss der
Bakterien in der French Press bei 11000 psi wurde zunächst 15 min bei 600 g und 4 °C
zentrifugiert, um Zelltrümmer abzutrennen. Die im Überstand enthaltenen „Inclusion bodies“
wurden durch 15 min Zentrifugieren bei 7000 g pelletiert und anschließend in Harnstoffpuffer
aufgenommen. Diese Lösung wurde für 10 min bei 4000 g zentrifugiert und der Überstand
zweimal gegen Dialysepuffer dialysiert. Anschließend wurde die bereits stark mit PabA-
angereicherte Probe mittels Anionenaustausch-Chromatographie und Gelfiltration
weitergereinigt.
4.4.4 Reinigung von PabB
Die Reinigung von PabB erfolgte bei 4 °C im Kühlraum. Nach Aufschluss der Bakterien in
der French Press bei 11000 psi wurde zunächst 20 min bei 10000 g und 4 °C zentrifugiert,
um Zelltrümmer abzutrennen. Der Überstand wurde auf eine Ni-NTA-Agarose-Säule
aufgetragen, mit Lysispuffer und Waschpuffer gewaschen und mit Elutionspuffer eluiert. Die
so erhaltenen Proben waren nahezu sauber und wurden nur im Bedarfsfall über Gelfiltration
weitergereinigt.
4.4.5 Proteinbestimmung
4.4.5.1 Proteinbestimmung nach Bradford
Die Proteinbestimmung nach Bradford (1976) beruht auf einer Farbänderung des Farbstoffs
Coomassie von braun nach blau nach Bindung in saurem Medium an Proteine. Die anionische
Form des Farbstoffs wird sowohl durch hydrophobe als auch durch ionische
Wechselwirkungen stabilisiert. Die Verschiebung des Absorptionsmaximums von λ = 465 nm
nach λ =595 nm lässt sich fotometrisch verfolgen.
Material und Methoden
69
Die Proteinbestimmung nach Bradford erfolgte unter Verwendung des Roti®-Quant Reagenz
(Carl Roth GmbH + Co., Karlsruhe). Die Standard-Verdünnungsreihe wurde entsprechend der
Vorschrift aus einer BSA-Stammlösung (400 µg/ml) hergestellt und umfasste einen
Konzentrationsbereich von 20 µg/ml bis 100 µg/ml. Von den zu bestimmenden
Proteinkonzentrationen wurden verschiedene Verdünnungen hergestellt, wobei meist eine
Verdünnung von 1:20 bis 1:40 ausreichend war. In Mikrotiterplatten wurden je 50 µl Standard
bzw. Probe vorgelegt und mit 200 µl Bradfordreagenz versetzt. Nach 5 min Inkubation wurde
die Absorption bei λ = 595 nm gemessen.
4.4.5.2 Proteinbestimmung durch UV-Absorption
Bei Kenntnis des Extinktionskoeffizienten lässt sich anhand des Lambert-Beerschen Gesetzes
die Konzentration eines Proteins aus seiner Absorption bei λ = 280 nm errechnen:
lcI
IE ⋅⋅=−= 280
0
280 log ε
mit I (Intensität des transmittierten Lichtes), I0 (Intensität des einfallenden Lichtes), c
(Konzentration der absorbierenden Substanz), ε280 (molarer Extinktionskoeffizient bei λ =
280 nm) und l (Weglänge des Lichtes in cm). Der Extinktionskoeffizient der Proteine wurde
auf der Webpage http://www.scripps.edu/~cdputnam/protcalc.html mit dem PROTEIN
CALCULATOR v3.3 berechnet.
4.4.6 GluC-Verdau
Endoproteinase GluC (Staphylococcus aureus Protease V8) ist eine Serinprotease, die
spezifisch C-terminal von Glutamat schneidet. Dadurch entstehen Peptidfragmente, die
massenspektrometrisch analysiert werden können und zur Identifizierung eines Proteins
herangezogen werden können.
Entsprechend dem von der Firma NEB (Schwalbach) empfohlenen Protokoll wurde
Endoproteinase GluC durch Zufügen von 50 µl sterilem LC-MS Wasser rekonstituiert. Da
Endoproteinase GluC in aufgelöstem Zustand auch tiefgefroren rasch autolysiert wird, kann
diese Lösung maximal zwei Wochen verwendet werden, sofern sie bei -80°C gelagert wurde.
Das zu verdauende Protein (in Dialysepuffer) wurde 1:1 mit GluC Reaction Buffer
(50 mM Tris-HCl; 0.5 mM Glu-Glu; pH 8,0) verdünnt. Als gut handhabbar erwies sich ein
Material und Methoden
70
Probenvolumen von insgesamt 40 µl. Hierzu wurden 2 µl GluC pipettiert, und 16 h bei 25°C
im Eppendorff-Heizblock inkubiert.
4.4.6.1 LC-ESI-MS und LC-ESI-MS/MS-Untersuchung des GluC-Verdaus
Die Detektion und Identifizierung der entstandenen Fragmente des tryptischen Verdaus er-
folgte mittels LC-ESI-MS an einer Agilent 1100 HPLC-Anlage, die mit einem QTRAP 2000 -
Massenspektrometer gekoppelt war. Auf der Chromatographieseite wurde eine Phenomenex
Jupiter-Säule (4u, 300 A, 150 x 1 mm) verwendet. Als mobile Phase dienten Wasser/0,1 %
HCOOH (Laufmittel A) und Acetonitril/0,1 % HCOOH (Laufmittel B). Das
Injektionsvolumen betrug 1 µl. Der verwendete Gradient ist in Tabelle 4-6 dargestellt.
Tabelle 4-6. Gradient zur Analyse des GluC-Verdaus
Zeit [min] Solvent B [%] Flussrate Kapillar-HPLC
0 5 50 µl/min
60 80 50 µl/min
65 100 50 µl/min
4.4.7 Kinetik der ADC-Synthase-Reaktion
Die Schwierigkeit bei der Quantifizierung der Enzymreaktion liegt im geringen strukturellen
Unterschied zwischen Substrat und Produkt. Wie in Abbildung 4-2 dargestellt ist, besteht der
Unterschied darin, dass Chorismat eine OH-Gruppe an C-4 trägt, während 4-Amino-4-
desoxychorismat statt dessen eine NH2-Gruppe an der 4-Position besitzt.
COOHO
COOH
OH
Chorismat
COOHO
COOH
NH2
ADC
NH3
NH3
H2O
H2O
ADC-Synthase
COOHO
COOH
OH
Chorismat
COOHO
COOH
NH2
ADC
NH3
NH3
H2O
H2O
ADC-Synthase
Abbildung 4-2. Biosynthese von 4-Amino-4-desoxychorismat (ADC) aus Chorismat durch das
Enzym ADC-Synthase.
Material und Methoden
71
Damit fallen einfache Möglichkeiten der Detektion für Enzymassays wie beispielsweise die
Absorptionsspektroskopie weg. Auch einfache gekoppelte Assays sind nicht möglich, da das
entstehende Nebenprodukt Wasser ist. Für das zweite Produkt 4-Amino-4-desoxychorismat
wäre lediglich ein gekoppelter Assay mit der ADC-Lyase möglich. Diese ist jedoch nicht
kommerziell erhältlich. Der Versuch, die ADC-Lyase selbst zu überexprimieren scheiterte
daran, dass das Enzym nicht aktiv war. Die Charakterisierung des Enzyms gestaltete sich
zudem schwierig, da das Substrat dieses Enzyms, ADC, nicht zugänglich ist. Grundlage für
die Kopplung an eine zweite Enzymreaktion ist aber, ein aktives und zudem charakterisiertes
Enzym zu haben. Aus diesem Grunde wurde eine massenspektrometrische MRM-Methode
etabliert, die den Molekülmassenunterschied von 1 Da zwischen Chorismat und ADC
ausnutzt.
4.4.7.1 MRM zur Quantifizierung der Enzymreaktion
Beobachtet wird der Übergang von m/z = 226 zu m/z = 191. Der verwendete Gradient
(Tabelle 4-7) ist ebenso wie die verwendete Säule (Tabelle 4-8) kurz gehalten, da sie lediglich
der Abtrennung von Pufferbestandteilen und Protein dienen. Wegen der Proteine ist es
wichtig, darauf zu achten, dass die Porengröße 300 A beträgt, da es sonst nach wenigen LC-
MS-Läufen zu Verstopfungen der Säule kommt.
Tabelle 4-7. LC-MS Gradient für MRM.
Zeit [min] Solvent B [%] Flussrate [µl/min]
0 5 60
3 50 60
4 5 60
7 5 60
Material und Methoden
72
Tabelle 4-8. verwendete HPLC-Säulen.
Dimension Säule Sorbent Partikel-
größe
[µm]
Porengröße
[A] Länge
[mm]
ID
[mm]
Part. Nr. Hersteller
Jupiter RP-C18 5 300 50 1 00B-
4053-A0 Phenomenex
Die Herausforderung dieser Experimente bestand ferner darin, die Methode so zu optimieren,
dass Peaks mit maximaler Ionenintensität erhalten wurden. Neben der Optimierung der
Laufmittel (Laufmittel A: Wasser mit 5 mM NH4Formiat und 0,1 % HCOOH; Laufmittel B:
Methanol mit 5 mM NH4Formiat und 0,1 % HCOOH) zur optimalen Unterstützung der
Ionisierung und des Gradienten spielte die Optimierung der massenspektrometrischen
Parameter eine wichtige Rolle. Die wichtigsten Parameter sind in Tabelle 4-9 dargestellt.
Tabelle 4-9. Parameter des Massenspektrometers zum MRM
Polarity: Positive Resolution Q1: Unit Resolution Q3: Unit Intensity Thres.: 0.00 cps Settling Time: 0.0000 msec MR Pause: 5.0070 msec MCA: No Step Size: 0.00 amu Dwell Time 400 msec CUR: 30 IS: 5000 TEM: 200 GS1: 30 GS2: 65 ihe: ON CAD: 5 DP 20 EP 10 CE 20 CXP 2
Material und Methoden
73
4.4.7.2 Enzymreaktion
Ziel der Kinetik war es, die Art der Interaktion von (atrop-)Abyssomicin C mit PabB zu
untersuchen. Da eine irreversible Hemmung vermutet wurde, basierte der Assay auf einer
Präinkubation des Enzyms mit dem Inhibitor für unterschiedlich lange Zeiten mit
unterschiedlichen Inhibitorkonzentrationen. Die Versuche wurden entsprechend Copeland
durchgeführt. Es zeigte sich, dass folgende Inhibitorkonzentrationen (2.5 mM, 2 mM,
1.5 mM, 1 mM, 0.75 mM, 0,5 mM, 0,25 mM) und folgende Präinkubationszeiten (0 min,
1 min, 2.5 min, 5 min, 10 min) ein geeignetes Zeit- und Konzentrationsfenster abdecken.
Wichtig war, dass (atrop-)Abyssomicin zunächst in DMSO gelöst und mit Wasser verdünnt
wurde (Endkonzentration DMSO 1%), da eine Inkubation des Enzyms mit DMSO alleine
schon zu einem schnellen Aktivitätsverlust führte. Zweiter wichtiger Punkt ist, dass PabB mit
PabA zusammen präinkubiert wurde, da PabB alleine instabil ist: Eine Inkubation von Pab B
mit der Kontrolle (2% DMSO in Wasser) führt zu einem raschen Aktivitätsverlust.
Der Reaktionspuffer setzte sich aus folgenden Reagenzien zusammen: 2 x
Ammoniumsulfatpuffer pH 8,5 (Endkonzentration NH4+ = 100 mM), Chorismat-
Stammlösung (Endkonzentration 1 mM), DTT (Endkonzentration 2 mM), ADC-Synthase
5 µM (Endkonzentration. 0,25 µM), H2OLCMS, atrop-Abyssomicin in 2 % DMSO in Wasser.
Unmittelbar vor Beginn des Versuchs wurden diese Reagenzien in folgender
Zusammensetzung pipettiert:
50 µl AS-Puffer 2x 29,8 µl H2O 0,2 µl DTT 10 µl Chorismat
Der Puffer wurde als Mastermix angesetzt für die geplante Anzahl von Ansätzen und auf Eis
aufbewahrt, da Chorismat nur unter diesen Bedingungen stabil ist. Jeweils exakt 5 min vor
Reaktionsstart wurde ein Aliquot von 90 µl bei 37°C im Thermoblock temperiert, bevor es
zum Präinkubationsmix bestehend aus 5 µl atrop-Abyssomicin und 5 µl ADC-Synthase
gegeben wurde. Da keine kontinuierliche Beobachtung der Reaktion möglich war, musste
sichergestellt werden, dass die Reaktion analysiert wurde, solange noch der lineare Bereich
der Anfangsgeschwindigkeit gewährleistet war. Die Analyse erfolgte über LC-MS, wobei
durch die Chromatographie zugleich auch die Enzymreaktion gestoppt wurde (siehe Abschnitt
4.4.7.1).
Durch den LC-MS-Lauf wurden Peaks in einer Breite von 0,3 min erhalten, die dem MRM
von 226 auf 191 entsprechen. Die Peaks wurden mit der Quantifizierungssoftware
Material und Methoden
74
Quantitation Wizard im Programm Analyst 1.4.1 anhand des Algorithmus Analyst Classic
integriert. Ein Beispiel für solch einen Peak ist in Abbildung 4-3 dargestellt.
Abbildung 4-3: Chromatogramm des MRM 226/191 mit integriertem ADC-Peak.
Ergebnisse
75
5 Ergebnisse
5.1 Strukturaufklärung neuer Abyssomicine
Die erneute Fermentation von Verrucosispora AB-18-032 und die nachfolgende
Aufreinigung von Abyssomicinen im Rahmen dieser Arbeit führten sowohl zu neuen
Erkenntnissen zu den bisher beschriebenen Abyssomicinen B, C und D als auch zur
Entdeckung weiterer neuer Metabolite.
5.1.1 Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C
Die wohl bedeutsamste Entwicklung auf dem Gebiet der Abyssomicine war die
Entdeckung des von K. C. Nicolaou erstmals beschriebenen atrop-Abyssomicins durch
Totalsynthese im Jahr 2006. Bei Abyssomicin und atrop-Abyssomicin handelt es sich um
Atropisomere, die chromatographisch voneinander getrennt werden können und bei
Raumtemperatur in verschiedenen inerten Lösungsmitteln stabil sind. Der Unterschied
besteht in der Stellung der Doppelbindung zur Ketogruppe, die im Falle des Abyssomicin
C transoid (145°), im Falle des atrop-Abyssomicin C cisoid (26°) ist.
O=C7-C8=C926 °
cisoid
O=C7-C8=C9145 °
transoid
Abyssomicin C atrop-Abyssomicin C
O=C7-C8=C926 °
cisoid
O=C7-C8=C9145 °
transoid
Abyssomicin C atrop-Abyssomicin C
Abbildung 5-1: Röntgenstrukturen von Abyssomicin C (Bister et al., 2004) und atrop-Abyssomicin C(Nicolaou und Harrison, 2006).
Ergebnisse
76
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
500
1000
1500
2000
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
500
1000
1500
2000
Abbildung 5-2: UV-Spektren von Abyssomicin C (links) und atrop-Abyssomicin C (rechts).
In Abbildung 5-2 dargestellt sind die UV-VIS-Spektren von Abyssomicin C und atrop-
Abyssomicin C. Da sich im unter 4.2.4 beschriebenen Standardgradienten die
Retentionszeiten nur um 0,02 min unterscheiden, kann es zu einer Überlagerung der
Spektren kommen, wobei die Summe der beiden Spektren fast genauso aussieht, wie das
Spektrum des atrop-Abyssomicins. Aus diesem Grunde wurde zunächst das Vorliegen
einer zweiten Substanz nicht bemerkt. Deutliche Unterschiede zwischen Abyssomicin C
und atrop-Abyssomicin C finden sich jedoch im NMR. Besonders die Unterschiede bei den 13C-Verschiebungen von C-8 und C-9 sowie der 1H-Verschiebung von CH-9 sind auffällig
(Abbildung 5-3 und Abbildung 5-4). Die Kopplungsmuster in den 2D-Experimenten
(COSY, TOCSY, HMBC) sind identisch. Aufgrund der hohen Ähnlichkeit zwischen
Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C gelang die Strukturaufklärung trotz
Identifizierung eines neuen, der Substanz C ähnlichen Abyssomicins nicht, bevor K.C.
Nicolaou Röntgenstruktur- und NMR-Daten veröffentlichte.
20406080100120140160180200 ppm
17.4
31
8.5
61
9.3
02
6.7
6
34.8
53
9.7
04
4.6
2
51.7
0
68.0
7
82.2
18
5.5
8
107
.31
130
.12
141
.35
171
.93
180
.54
201
.62
204
.66
Abbildung 5-3: 13C-Übersichtsspektrum von atrop-Abyssomicin C in MeOD.
C-7 C-1
C-9 C-11 C-4
C-3 C-16
C-8
C-2
C-12
C-15 C-10 C-14
C-5
C-17 C-19 C-18 C-13
C-6
Ergebnisse
77
MeOD
C7
C13
C19
C17
C18
C5
C11
C2
C10
C14C4
C6
C15
C12
C1
C8 , C 9
C3 C16
MeOD
C7
C13
C19
C17
C18
C5
C11
C2
C10
C14C4
C6
C15
C12
C1
C8 , C 9
C3 C16
Abbildung 5-4: 13C-Übersichtsspektrum von Abyssomicin C. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Bojan Bister aus „Abyssomicin C- ein neues Antibiotikum aus dem marinen Micromonospora-Stamm AB-18-032 als Inhibitor der p-Aminobenzoesäure/Tetrahydrofolat-Biosynthese – Isolierung und Strukturaufklärung“
Da sich atrop-Abyssomicin durch Inkubation mit Säure (z.B. durch präparative HPLC) in
Abyssomicin umwandelt, wurde zunächst nicht bemerkt, dass der Haupt-Metabolit atrop-
Abyssomicin C ist. In antibiotischen Testierungen ist dieses zudem wesentlich aktiver als
Abyssomicin C.
Ergebnisse
78
Tabelle 5-1: 1H und 13C-NMR-chemische Verschiebungen von atrop-Abyssomicin C und Abyssomicin C in MeOD.
atrop-Abyssomicin C Abyssomicin C Nr. 1H, δ [ppm] 13C, δ [ppm] 1H, δ [ppm] 13C, δ [ppm] 1 - 171,5 - 171,5 2 - 106,9 - 104,6 3 - 201,2 - 200,6 4 2,65 44,7 3,50 43,0 5 1,85
1,44 39,2 1,98
1,40 40,1
6 2,50 50,0 2,90 48,1 7 - 204,2 - 206,3 8 6,52 129,8 6,52 135,1 9 6,65 140,3 5,95 135,3 10 3,18 51,1 2,96 49,2 11 4,40 67,6 5,03 73,8 12 4,62 85,1 4,54 86,8 13 2,79 26,7 2,70 25,9 14 2,69
1,45 34,6 2,67
1,25 37,4
15 - 81,8 - 78,9 16 - 180,1 - 187,5 17 1,16 18,8 1,16 19,4 18 1,11 16,9 1,04 17,2 19 1,14 18,0 1,08 21,0
Ergebnisse
79
5.1.2 Abyssomicin B
Da im Rahmen der Dissertation von Herrn Dr. Bojan Bister die Isolierung von
Abyssomicin B nicht endgültig gelang, konnte eine eindeutige Zuordnung der NMR-
Signale damals nicht erfolgen. Da aber Einkristalle erhalten wurden, erfolgte die
Strukturaufklärung mittels Röntgenbeugung. Die Umstellung auf säurefreie Aufarbeitung
im Rahmen dieser Arbeit ermöglichte die problemlose Abtrennung der von Dr. Bojan
Bister als Abyssomicin B’ bezeichneten Komponente und somit eine eindeutige
Zuordnung der NMR-Signale zur von Bister et al. vorgeschlagenen Struktur.
H3C CH3
OO
OO
O
CH3
HO
N
HO
Abyssomicin B
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O
(atrop-)Abyssomicin C
1 2
3
45
6
7
8
9
10
11 12 13
17
16
15 14
1819
1 2
3
45
6
7
8
9
10
11 12 13
17
16
15 14
1819
Abbildung 5-5: Abyssomicin B (links) und C (rechts) im Vergleich.
Während Abyssomicin C als charakteristisches Strukturmerkmal eine Doppelbindung (C-8
und C-9) aufweist, die in Konjugation mit einer Ketogruppe (C-7) steht, enthält
Abyssomicin B an dieser Stelle einen ungewöhnlichen Heterocyclus (Abbildung 5-5). Die
Abwesenheit der Doppelbindung bei Abyssomicin B ist schon auf den ersten Blick im 1H-NMR-Spektrum zu sehen. Die beiden olefinischen Protonen zwischen 6 und 7 ppm des
Abyssomicin C bzw. atrop-Abyssomicin C sind hier nicht vorhanden (Abbildung 5-6).
Die wesentlichen Unterschiede zwischen (atrop-)Abyssomicin C und Abyssomicin B
liegen auch im 13C-NMR-Spektrum (Abbildung 5-7) zumeist im Bereich > 100 ppm: C-7,
das bei (atrop-)Abyssomicin C ein Carbonylkohlenstoff ist, besitzt eine chemische
Verschiebung von etwa 200 ppm, während C-7 im Abyssomicin B mit 116 ppm deutlich
hochfeldverschoben ist. C-8 ist bei (atrop-) Abyssomicin C Teil einer Doppelbindung mit
130 ppm bzw. 135 ppm, während die Verschiebung im Abyssomicin B lediglich 42 ppm
beträgt. C-9 hingegen ist bei Abyssomicin B mit fast 160 ppm tieffeldverschoben im
Vergleich zu 140 bzw. 135 ppm im (atrop-)Abyssomicin C.
Ergebnisse
80
12345 p p m5 4 3 2 1 ppm
H-12
H-11
H-4
H-10
H-8,H-13
H-14
H-17,H-19H-18
H-5
H-14H-6
H-8
12345 p p m5 4 3 2 1 ppm
H-12
H-11
H-4
H-10
H-8,H-13
H-14
H-17,H-19H-18
H-5
H-14H-6
H-8
Abbildung 5-6: 1H-NMR-Übersichtsspektrum von Abyssomicin B in MeOD.
20406080100120140160180 ppm
18
.56
26
.14
34
.55
37
.37
40
.61
42
.48
42
.82
48
.50
48
.67
48
.84
49
.01
49
.18
49
.29
49
.35
49
.52
50
.56
67
.76
78
.89
85
.47
10
4.4
5
11
6.2
9
15
9.2
4
17
1.8
1
18
5.3
5
19
9.8
6
Abbildung 5-7: 13C-NMR-Übersichtsspektrum von Abyssomicin B in MeOD
Die eindeutige Zuordnung der Signale erfolgte über 2D-NMR (Abbildung 5-9), die
entscheidende Information stammt aus dem HMBC-Experiment. Deutlich zu sehen sind in
Abbildung 5-8 die Kontakte von H-11, H-10 und H-8 zu C-9 sowie von H-6 und H-8 zu
C-7. Die anderen NMR-chemischen Verschiebungen von Abyssomicin B und C sind sich
sehr ähnlich, wie aus dem Vergleich von Tabelle 5-1 und Tabelle 5-2 hervorgeht.
C-3 C-16 C-9 C-1 C-2
C-12 C-11
C-15 C-10
C-4
C-5
C-13 C-17 C-18 C-19
C-6
C-7 C-8
Ergebnisse
81
ppm
2.02.22.42.62.83.03.23.43.63.84.04.2 ppm
110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
Abbildung 5-8: Ausschnitt aus dem HMBC-Spektrum von Abyssomicin B in MeOD.
H3C CH3
OO
OO
O
CH3
HO
N
HO
1 2
3
4
9
1017
1819
H3C CH3
OO
OO
O
CH3
HO
N
HO
1 2
3
45
6
7
8
9
1017
16
15
1819
H3C CH3
OO
OO
O
CH3
HO
N
HO
1 2
3
4
9
1017
1819
H3C CH3
OO
OO
O
CH3
HO
N
HO
1 2
3
45
6
7
8
9
1017
16
15
1819
H3C CH3
OO
OO
O
CH3
HO
N
HO
1 2
3
45
6
7
8
9
1017
16
15
1819
Abbildung 5-9: H,H-COSY-Kontakte (links) und Korrelationen aus dem HMBC-Spektrum (rechts) des Abyssomicin B
H-8 /C-9 H-8 /C-9 H-10 /C-9 H-11 /C-9
H-6 /C-7
Ergebnisse
82
Tabelle 5-2: 1H und 13C-NMR-chemische Verschiebungen von Abyssomicin B in MeOD und DMSO-d6
Abyssomicin B (MeOD) Abyssomicin B (DMSO-d6) Nr. 1H, δ [ppm] 13C, δ [ppm] 1H, δ [ppm] 13C, δ [ppm] 1 - 172,0 - 169,7 2 - 104,5 - 102,5 3 - 200,2 - 197,1 4 3,36 43,0 3,22 40,9 5 1,32
1,18 40,6 1,19
1,05 39,0
6 1,91 37,4 1,74 35,5 7 - 116,1 7,01 (OH) 114,4 8 2,86
2,26 42,4 2,82
2,00 41,1
9 - 159,1 - 157,3 10 3,16 50,6 3,09 48,7 11 4,21 67,7 4,10
6,25 (OH) 65,9
12 4,81 85,6 4,85 85,5 13 2,83 26,2 2,67 24,1 14 2,67
1,41 34,4 2,64
1,34 32,7
15 - 79,1 - 77,3 16 - 185,3 - 183,7 17 1,14 18,6 1,02 17,8 18 1,05 17,0 0,95 16,7 19 1,08 14,4 0,96 14,2
Ergebnisse
83
5.1.3 Abyssomicin G
Im Rahmen der Aufreinigung von Abyssomicin B konnte auch die in der Dissertation von
Herrn Dr. Bojan Bister als Abyssomicin B’ bezeichnete zweite Komponente isoliert und
strukturaufgeklärt werden.
0%
25%
50%
75%
100%
rel. In
tensity
(%)
0%
25%
50%
75%
100%
rel. In
tensity
(%)
Time, min
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Zeit, min
10%
25%
50%
75%
100%
rel. In
tensity
(%)
0%
25%
50%
75%
100%
rel. In
tensity
(%)
0%
25%
50%
75%
100%
rel. In
tensity
(%)
0%
25%
50%
75%
100%
rel. In
tensity
(%)
Time, min
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Zeit, min
1
Time, min
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Zeit, min
1
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
Abyssomicin GAbyssomicin B
Abbildung 5-10: a) HPLC-DAD-Chromatogramm von Abyssomicin B (Rt = 5,13 min) und B’ (Rt = 5,32 min); b) UV-Spektren von Abyssomicin G (links) und B (rechts).
In Abbildung 5-10a dargestellt ist das HPLC-DAD-Chromatogramm der angereinigten
Abyssomicine B und B’ vor ihrer vollständigen Trennung voneinander. Abbildung 5-10 b
zeigt die UV-Spektren, die sich sehr ähnlich sind, und sich vor allem im Hinblick auf die
Extinktion bei λ = 230 nm unterscheiden. Die Aufreinigung war zunächst gescheitert, was
zu der Annahme geführt hatte, dass es sich bei diesen beiden Substanzen um
Gleichgewichtstautomere ((R)- und (S)-Stereoisomere des Isoxazolins) handeln würde
(Abbildung 5-11).
A
B mAU mAU
Ergebnisse
84
O
N
HO
NHO
NHO
OHO
NO
HO
NO
O O
N
HO(S) (R)
Abyssomicin B Abyssomicin B'
Abbildung 5-11. Ursprüngliche Hypothese zur Struktur von Abyssomicin B’. Die vermuteten Gleichgewichtstautomere des Isoxazolinrings sind in Klammern gefasst (Bojan Bister, 2004)
Diese Hypothese konnte jedoch nicht bestätigt werden, es handelt sich bei Abyssomicin B’
um eine eigenständige Verbindung, und so wurde Abyssomicin B’ in Abyssomicin G
umbenannt.
In Abbildung 5-12 dargestellt ist der extrahierte Ionenstrom von m/z = 378. Im
Massenspektrum beider Peaks deutlich zu erkennen ist das [M+H]+-Signal bei m/z = 378,3
und das um 22 Da zu höheren m/z verschobene [M+Na]+-Signal bei m/z = 400,3. Es
handelt sich also um isobare Verbindungen.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time, min
4,76
5,00
25%
75%
50%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
25%
50%
75%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
m/z
378,4
400,325%
50%
75%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
m/z
378,4
400,3
GB
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
4,76
5,00
25%
75%
50%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Zeit, min
4,76
5,00
25%
75%
50%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
rel. I
nte
nsity
(%)
m/z
378,4
400,325%
50%
75%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
m/z
378,4
400,3
G
[M+Na]+
[M+Na]+
[M+H]+ [M+H]+
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time, min
4,76
5,00
25%
75%
50%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Time, min
4,76
5,00
25%
75%
50%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
25%
50%
75%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
m/z
378,4
400,325%
50%
75%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
m/z
378,4
400,325%
50%
75%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
m/z
378,4
400,3
GB
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
4,76
5,00
25%
50%
75%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
m/z
378,4
400,3
GB
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
4,76
5,00
25%
75%
50%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Zeit, min
4,76
5,00
25%25%
75%
50%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Zeit, min
4,76
5,00
25%
75%
50%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
rel. I
nte
nsity
(%)
m/z
378,4
400,325%
50%
75%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
m/z
378,4
400,325%
50%
75%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
m/z
378,4
400,3
G
[M+Na]+
[M+Na]+
[M+H]+ [M+H]+
Abbildung 5-12: LC-MS Chromatogramm / extrahierter Ionenstrom von m/z = 378 des Ethylacetatextrakts. Die Spektren zu den Retentionszeiten 4,76 min (Abyssomicin B) und 5,00 min (Abyssomicin G) sind ebenfalls abgebildet. Beide Substanzen zeigen ein [M+H]+ Signal bei m/z = 378,4 sowie ein [M+Na]+ Signal bei m/z = 400,3.
Ergebnisse
85
Nach erfolgreicher Aufreinigung des Abyssomicin G durch präparative HPLC wurden
hochauflösende Massenspektren mit hoher Messgenauigkeit aufgenommen. Aufgrund der
geringen relativen Messfehler und der exakten Nominalmassen der Metabolite wurden
Analysen zur Ermittlung der Summenformeln durchgeführt. Das Natriumaddukt von
Abyssomicin G zeigte die exakte Molekülmasse von 400.13646 Da. In Abbildung 5-13 ist
der Bereich des [M+Na]+–Signals vergrößert dargestellt.
Ergebnisse
86
397 399 401 403 405 m/z
400.13646
[M+Na]+
1 Da1 Da
397 399 401 403 405 m/z
[M+Na]+
1 Da1 Da
397 399 401 403 405 m/z
400.13646
[M+Na]+
1 Da1 Da
397 399 401 403 405 m/z
[M+Na]+
1 Da1 Da
m/z397 399 401 403 405 m/z
400.13646
[M+Na]+
1 Da1 Da
397 399 401 403 405 m/z
[M+Na]+
1 Da1 Da
397 399 401 403 405 m/z
400.13646
[M+Na]+
1 Da1 Da
397 399 401 403 405 m/z
[M+Na]+
1 Da1 Da
m/z
Abbildung 5-13: ESI-FT-ICR-Massenspektrum von Abyssomicin G.
Aus dieser Messung wurde für Abyssomicin G die Summenformel C19H23NO7
[(M+Na)+theor = 400.13667, ∆m = 0.5 ppm] ermittelt, es handelt sich also wie vermutet um
ein Isomeres von Abyssomicin B. Die weitere Strukturaufklärung basierte auf 2D-NMR-
Spektren. Die NMR-Spektren aus COSY-, TOCSY-, HMQC- und HMBC-Experimenten
weisen eine große Ähnlichkeit zu den Daten des Abyssomicin B auf (Abbildung 5-9,
Abbildung 5-17). Beispielhaft ist in Abbildung 5-14 das HMQC-Spektrum von
Abyssomicin G gezeigt. Die 1J-H-C-Kopplungen von Abyssomicin G sind zugeordnet und
eingezeichnet.. Abweichungen ergeben sich nur im Bereich von C-7 bis C-9. Wichtige
Kontakte aus dem HMQC-Spektrum für die Strukturermittlung sind die der beiden
Methylenprotonen H-8a (3,77 ppm) und H-8b (3,48 ppm) mit C-8 (46,8 ppm).
Ergebnisse
87
ppm
1.01.52.02.53.03.54.04.55.0 ppm
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Abbildung 5-14: HMQC-Spektrum von Abyssomicin G
Der auffälligste Unterschied liegt in der chemischen Verschiebung von C-7, die für
Abyssomicin B bei 116 ppm liegt, während sie im Abyssomicin G 211 ppm beträgt. In
Abbildung 5-15 dargestellt sind die Korrelationen der Protonen H-8a (3,77 ppm), H-8b
(3,48 ppm), H-6 (2,94 ppm) H-5a (1,95 ppm), H-5b (1,40 ppm) und H-19 (1,07 ppm) zu
C-7 (211,3 ppm). Damit liegt die Vermutung nahe, dass es sich bei C-7 des Abyssomicin G
wie auch in Abyssomicin C um den Carbonylkohlenstoff eines Ketons handelt.
Die 1H- und 13C-chemischen Verschiebungen von Abyssomicin G in MeOD sind in
Tabelle 5-3 zusammengefasst, die Struktur, die sich unter Berücksichtigung der FT-ICR-
Messungen und der NMR-Daten für Abyssomicin G ergibt, ist in Abbildung 5-16 im
Vergleich zu Abyssomicin B dargestellt. Es handelt sich bei Abyssomicin G um die
offenkettige Form von Abyssomicin B.
CH-12
CH-11
CH-10
CH-8a CH-4
CH-8b
CH-6
CH-13
CH-14a CH-14b
CH-5a CH-5b
CH-19 CH-17
CH-18
MeOH
tert. BuOH
Ergebnisse
88
ppm
1.01.21.41.61.82.02.22.42.62.83.03.23.43.63.8 ppm
210
215
Abbildung 5-15: Ausschnitt aus dem HMBC-Spektrum von Abyssomicin G in MeOD. Abgebildet ist der Bereich von 0,8 - 4 ppm im 1H-NMR-Spektrum und von 205 - 218 ppm des 13C-NMR-Spektrums (Bereich von C-7).
H3C CH3
HO
O
OO
O
CH3
HO
N
O
H3C CH3
OO
OO
O
CH3
HO
N
HO
1 2
3
45
6
7
8
9
10
11 12 13
17
16
15 14
1819
1 2
3
45
6
7
8
9
10
11 12 13
17
16
15 14
1819
Abyssomicin B Abyssomicin G
Abbildung 5-16: Abyssomicin B und G im Vergleich.
H-8a/ C-7 H-8b/ C-7 H-6/ C-7 H-5a/ C-7 H-5b/ C-7
H-19/ C-7
Ergebnisse
89
H3C CH3
HO
O
OO
O
CH3
HO
N
O 1 2
3
8
9
1017
16
15
1819
H3C CH3
HO
O
OO
O
CH3
HO
N
O 1 2
3
45
6
7
8
9
1017
16
15
1819
H3C CH3
HO
O
OO
O
CH3
HO
N
O 1 2
3
8
9
1017
16
15
1819
H3C CH3
HO
O
OO
O
CH3
HO
N
O 1 2
3
45
6
7
8
9
1017
16
15
1819
Abbildung 5-17: H,H-COSY-Kontakte (links) und Korrelationen aus dem HMBC-Spektrum (rechts) des Abyssomicin G.
Tabelle 5-3: 1H- und 13C-NMR-chemische Verschiebungen von Abyssomicin G in MeOD
Nr. 1H, δ [ppm] 13C, δ [ppm] 1 - 172,0 2 - 102,2 3 - 200,0 4 3,58 43,1 5 1,95
1,40 40,9
6 2,94 46,0 7 - 211,3 8 3,77
3,48 46,8
9 - 151,7 10 3,73 47,4 11 4,52 70,4 12 4,64 85,6 13 2,79 26,2 14 2,74
1,21 38,3
15 - 78,1 16 - 187,9 17 1,13 19,0 18 1,04 16,9 19 1,07 21,4
Ergebnisse
90
5.1.4 Abyssomicin H
Eine weitere Verbindung, die im Rahmen dieser Arbeit isoliert und analysiert wurde, ist
Abyssomicin H. In Abbildung 5-18 dargestellt ist das HPLC-DAD-Chromatogramm von
Abyssomicin H sowie sein UV-Spektrum. Auffällig ist die hohe Ähnlichkeit sowohl der
Retentionszeiten der Abyssomicine B, G und H (Abyssomicin B: 5,13 min; Abyssomicin
H: 5,24 min; Abyssomicin G: 5,32 min im Standardgradienten, der in 4.2.4 beschrieben
wurde) als auch der UV/VIS-Spektren. Alle drei Substanzen weisen ein Minimum bei
230 nm und Maxima bei 210 nm bzw. 254 nm auf.
Abbildung 5-18: HPLC-DAD Chromatogramm von Abyssomicin H (Rt = 5,24 min), Abyssomicin B, G und C sowie das UV-Spektrum von Abyssomicin H.
Mit Hilfe von LC-MS konnte die nominale Molekülmasse von Abyssomicin H bestimmt
werden ([M+H]+ m/z = 349). In Abbildung 5-19 dargestellt ist der extrahierte Ionenstrom
von m/z = 349 eines LC-MS-Laufs des Ethylacetatextrakts vom Kulturfiltrat. Es erscheinen
zwei Peaks zu den Retentionszeiten Rt = 5,66 min und 7,15 min. Im Massenspektrum
beider Peaks deutlich zu erkennen ist das [M+H]+-Signal bei m/z = 349, d.h. es handelt sich
also auch hier um zwei isobare Abyssomicine. Bei der mit Rt = 5,66 min eluierenden
Verbindung handelt es sich um das strukturell bisher unbekannte Abyssomicin H, bei der
mit Rt = 7,15 min eluierenden Verbindung um das bereits beschriebene Abyssomicin D.
Mittels ESI-FT-ICR wurden hochauflösende Massenspektren mit hoher Messgenauigkeit
aufgenommen. Abyssomicin G zeigte die exakte Molekülionenmasse von 349.16389 Da,
daraus wurde die Summenformel C19H24O6 [(M+H)+theor = 349.16457, ∆m = 1.9 ppm]
ermittelt.
0%
25%
50%
75%
100%
rel. In
tensity
(%)
0%
25%
50%
75%
100%
rel. In
tensity
(%)
Time, min
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Zeit, min
10%
25%
50%
75%
100%
rel. In
tensity
(%)
0%
25%
50%
75%
100%
rel. In
tensity
(%)
0%
25%
50%
75%
100%
rel. In
tensity
(%)
0%
25%
50%
75%
100%
rel. In
tensity
(%)
Time, min
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Zeit, min
1
Time, min
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Zeit, min
1
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
Ergebnisse
91
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Zeit, min
7,15
5,66
25%
75%
50%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
7,15
5,66
25%
75%
50%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
25%
50%
75%
100%
349,3re
l. I
nte
nsity
(%)
m/z
25%
50%
75%
100%
349,3re
l. I
nte
nsity
(%)
m/z95%
100%
105%
110%
25%
50%
75%
100%349,4
rel. I
nte
nsity
(%)
m/z95%
100%
105%
110%
25%
50%
75%
100%349,4
rel. I
nte
nsity
(%)
m/z
DH[M+H]+ [M+H]+
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Zeit, min
7,15
5,66
25%
75%
50%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
7,15
5,66
25%
75%
50%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
25%
50%
75%
100%
349,3re
l. I
nte
nsity
(%)
m/z
25%
50%
75%
100%
349,3re
l. I
nte
nsity
(%)
m/z95%
100%
105%
110%
25%
50%
75%
100%349,4
rel. I
nte
nsity
(%)
m/z95%
100%
105%
110%
25%
50%
75%
100%349,4
rel. I
nte
nsity
(%)
m/z
DH
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Zeit, min
7,15
5,66
25%
75%
50%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
7,15
5,66
25%
75%
50%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
25%
50%
75%
100%
349,3re
l. I
nte
nsity
(%)
m/z
25%
50%
75%
100%
349,3re
l. I
nte
nsity
(%)
m/z95%
100%
105%
110%
25%
50%
75%
100%
349,3re
l. I
nte
nsity
(%)
m/z
25%
50%
75%
100%
349,3re
l. I
nte
nsity
(%)
m/z95%
100%
105%
110%
25%
50%
75%
100%349,4
rel. I
nte
nsity
(%)
m/z95%
100%
105%
110%
25%
50%
75%
100%349,4
rel. I
nte
nsity
(%)
m/z95%
100%
105%
110%
25%
50%
75%
100%349,4
rel. I
nte
nsity
(%)
m/z
DH[M+H]+ [M+H]+
Abbildung 5-19: LC-MS Chromatogramm (XIC 349) des Ethylacetatextrakts. Die Spektren zu den Retentionszeiten 5,66 min (Abyssomicin H) und 7,15 min (Abyssomicin D) sind ebenfalls abgebildet. Beide Substanzen zeigen ein [M+H]+-Signal bei m/z = 349,4 bzw. 349,3.
Abyssomicin H besitzt somit dieselbe Summenformel wie Abyssomicin D, was die
Vermutung nahe legt, dass es sich um ein Konstitutions- oder Konfigurationsisomeres
handelt. Neben einem deutlichen Unterschied in der Retentionszeit – Abyssomicin D
eluiert wesentlich später auf einer RP-C18 Säule – gleichen die 1D- und 2D-Spektren eher
den Abyssomicinen B, C, G und atrop-Abyssomicin C (Abbildung 5-22).
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ppm
16.57
18.22
18.49
19.35
19.99
24.07
25.98
26.75
32.17
33.15
34.64
34.99
37.03
38.07
38.53
38.96
39.10
39.24
39.38
39.51
39.65
39.79
41.82
43.59
44.36
45.63
45.97
47.88
51.67
65.94
68.80
72.44
75.99
77.87
84.35
99.66
169.37
184.46
197.02
211.54
Abbildung 5-20: 13C-NMR-Übersichtsspektrum von Abyssomicin H in DMSO-d6.
Ergebnisse
92
Der wesentliche Unterschied liegt im Bereich von C-8 und C-9. Während die 1H-chemische Verschiebung bei (atrop-)Abyssomicin C für H-8 6,52 ppm und für H-9 6,65
bzw. 5,95 ppm beträgt, liegt sie beim Abyssomicin H bei 2,60 ppm (H-8) bzw. 2,04 (H-9a)
und 1,80 (H-9b). Auch die Verschiebung im 13C-NMR unterscheidet sich deutlich,
129,8 ppm (C-8 atrop-Abyssomicin) bzw. 135,1 ppm (C-8 Abyssomicin) und 140,3 ppm
(C-9 atrop-Abyssomicin) bzw. 135,3 ppm (C-9 Abyssomicin) stehen 34,8 ppm (C-8) und
19,5 ppm (C-9) beim Abyssomicin H gegenüber (Abbildung 5-3, Abbildung 5-4,
Abbildung 5-20). Während C-8 und C-9 im (atrop-) Abyssomicin C eine Doppelbindung
bilden, sprechen die 13C-NMR-Verschiebungen des Abyssomicin H für Methylengruppen
(Abbildung 5-21).
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O
(atrop-)Abyssomicin C Abyssomicin H
9
8
9
8
Abbildung 5-21: (atrop-) Abyssomicin C und Abyssomicin H im Vergleich.
Ergebnisse
93
Tabelle 5-4: 1H- und 13C-NMR-chemische Verschiebungen von Abyssomicin H in MeOD-d4 und DMSO-d6
Abyssomicin H (MeOD-d4) Abyssomicin H (DMSO-d6) Nr. 1H, δ [ppm] 13C, δ [ppm] 1H, δ [ppm] 13C, δ [ppm] 1 - 172.1 - 169,6 2 - 101.7 - 99,9 3 - 200.2 - 197,3 4 3.33 44.1 3,21 42,0 5 1.99
1.43 40.6 1,80
1,34 38,7
6 2.73 47.6 2,61 745,8 7 - 214.4 - 211,7 8 2.65 36.5 2,60 34,8 9 2.17
1.91 21.0 2,04
1,80 19,5
10 2.24 45.6 2,19 43,8 11 4.44 71.0 4,27 69,0 12 4.55 86.7 4,58 84,5 13 2.67 26.0 2,54 24,2 14 2.60
1.13 39.0 2,57
1,01 37,2
15 - 79.9 - 78,0 16 - 187.0 - 187,7 17 1.11 19.1 1,00 18,6 18 1.08 17.0 1,04 16,3 19 1.04 21.2 0,97 20,1
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O 1 28
9
1017
16
15
1819
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O 1 2
3
45
6
7
8
9
1017
16
15
1819
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O 1 28
9
1017
16
15
1819
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O 1 2
3
45
6
7
8
9
1017
16
15
1819
Abbildung 5-22: H,H-COSY-Kontakte des Abyssomicin H.
Ergebnisse
94
5.1.5 Weitere Abyssomicine
Durch die HPLC-MS-Analyse von Ethylacetatextrakten des Kulturüberstandes konnten
noch weitere Abyssomicinderivate identifiziert werden, die allerdings in so geringen
Mengen vorkamen, dass eine Isolierung und Strukturaufklärung nicht möglich war. Von
einigen dieser Derivate gelang jedoch eine Zuordnung der Struktur auf der Basis von
LC-MS und exakter Massenbestimmung durch FT-ICR-MS sowie chemischen
Umsetzungen im Mikromaßstab. In LC-MS-Läufen des Ethylacetatextraktes fielen bei
genauerem Suchen zwei Molekülmassen auf, von denen vermutet wurde, dass es sich um
ein Aminoaddukt (m/z = 364) und um ein Hydroxyaminoaddukt (m/z = 380) von
Abyssomicin C handelte (Abbildung 5-23).
0%
25%
50%
75%
100%
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Time, min
0%
25%
50%
75%
100%
1
AminoabyssomicinRt= 4,1 min
HydroxylaminoabyssomicinRt= 5,4 min
Time, min
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Time, min
1
rel. I
nte
nsity
(%)
rel. I
nte
nsity
(%)
Time, min
0%
25%
50%
75%
100%
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Zeit, min
0%
25%
50%
75%
100%
1
AminoabyssomicinRt = 4,1 min
HydroxyaminoabyssomicinRt = 5,4 min
Time, min
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Zeit, min
1
rel. I
nte
nsity
(%)
rel. I
nte
nsity
(%)
0%
25%
50%
75%
100%
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Time, min
0%
25%
50%
75%
100%
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Time, min
0%
25%
50%
75%
100%
1
AminoabyssomicinRt= 4,1 min
HydroxylaminoabyssomicinRt= 5,4 min
Time, min
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Time, min
1
rel. I
nte
nsity
(%)
rel. I
nte
nsity
(%)
Time, min
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Time, min
1
rel. I
nte
nsity
(%)
rel. I
nte
nsity
(%)
Time, min
0%
25%
50%
75%
100%
0%
25%
50%
75%
100%
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Zeit, min
0%
25%
50%
75%
100%
1
AminoabyssomicinRt = 4,1 min
HydroxyaminoabyssomicinRt = 5,4 min
Time, min
0 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Zeit, min
1
rel. I
nte
nsity
(%)
rel. I
nte
nsity
(%)
Abbildung 5-23: HPLC-MS- (oben) und HPLC-DAD- (unten) Chromatogramm des Ethylacetatextrakts des Kulturfiltrats von Verrucosispora AB-18-032. Markiert sind Amino- und Hydroxyaminoabyssomicin mit den Retentionszeiten 4,1 bzw. 5,4 min.
Die beiden Substanzen wurden angereinigt und ihre Molekülmassen mittels ESI-FT-ICR-
MS bestimmt. Für Aminoabyssomicin ergab sich eine exakte Masse von 364.17564 amu,
was einer Summenformel von C19H26NO6 [(M+H)+theor = 364.17546 amu, ∆m = 0.5 ppm]
entspricht, und für Hydroxyaminoabyssomicin ergab sich eine Masse von 380.16994 Da,
was einer Summenformel von C19H26NO7 [(M+H)+theor = 380.17038 amu, ∆m = 1.2 ppm]
entspricht. Daraus ergeben sich vermutlich die in Abbildung 5-24 dargestellten
Strukturformeln für Amino- und Hydroxyaminoabyssomicin.
Ergebnisse
95
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O
H2NHOHN
Abbildung 5-24: Strukturformeln des Hydroxyamino- und des Aminoabyssomicins.
Die Biosynthese von Aminoabyssomicin und Hydroxyaminoabyssomicin wurde durch
Inkubation von atrop-Abyssomicin C mit NH3 und NH2OH in Tetrahydrofuran simuliert.
Hierzu wurde eine Lösung des Nucleophils in Tetrahydrofuran (5,4 µmol) zu einer Lösung
von atrop-Abyssomicin C (0,36 µmol) und Triethylamin (0,36 µmol) im Falle des
Hydroxyamins in 400 µl Tetrahydrofuran gegeben. Der Ansatz wurde 2 h bei 25 °C
geschüttelt und mittels LC-ESI-MS analysiert. Der extrahierte Ionenstrom von
Aminoabyssomicin (m/z = 364) ist in Abbildung 5-25 dargestellt, der von
Hydroxyaminoabyssomicin (m/z = 380) in Abbildung 5-26.
364,3
366,3362,2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Time, min
0%
25%
50%
75%
100%
4,79364,3
366,3362,2
m/z,
364,3
rel. I
nte
nsity
(%)
rel. I
nte
nsity
(%)
25%
50%
75%
100%
0%
364,3
366,3362,2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Time, min
364,3
366,3362,2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Zeit, min
0%
25%
50%
75%
100%
4,79364,3
366,3362,2
m/z
364,3
rel. I
nte
nsity
(%)
rel. I
nte
nsity
(%)
25%
50%
75%
100%
0%
[M+H]+
364,3
366,3362,2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Time, min
0%
25%
50%
75%
100%
4,79364,3
366,3362,2
m/z,
364,3
rel. I
nte
nsity
(%)
rel. I
nte
nsity
(%)
25%
50%
75%
100%
0%
364,3
366,3362,2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Time, min
364,3
366,3362,2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Zeit, min
0%
25%
50%
75%
100%
4,79364,3
366,3362,2
m/z
364,3
rel. I
nte
nsity
(%)
rel. I
nte
nsity
(%)
25%
50%
75%
100%
0%
364,3
366,3362,2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Time, min
364,3
366,3362,2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Time, min
0%
25%
50%
75%
100%
4,79364,3
366,3
0%
25%
50%
75%
100%
4,79364,3
366,3362,2
m/z,
364,3
rel. I
nte
nsity
(%)
rel.
362,2
m/z,
364,3
rel. I
nte
nsity
(%)
rel. I
nte
nsity
(%)
25%
50%
75%
100%
0%
364,3
366,3362,2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Time, min
Inte
nsity
(%)
25%
50%
75%
100%
0%
364,3
366,3362,2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Time, min
364,3
366,3362,2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Zeit, min
364,3
366,3362,2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Zeit, min
0%
25%
50%
75%
100%
4,79
0%
25%
50%
75%
100%
4,79364,3
366,3362,2
m/z
364,3
366,3362,2
m/z
364,3
rel. I
nte
nsity
(%)
rel. I
nte
nsity
(%)
25%
50%
75%
100%
0%
[M+H]+
Abbildung 5-25: Extrahierter Ionenstrom von m/z 364 des synthetisch erzeugten Aminoabyssomicin mit dazugehörigem Massenspektrum. Die Retentionszeit (Rt = 4,1 min) entspricht dem aus dem Kulturfiltrat detektierten Aminoabyssomicin.
Ergebnisse
96
364,3
366,3362,2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Zeit, min
0%
25%
50%
75%
100%
5,35364,3
366,3362,2m/z
380,3re
l. I
nte
nsity
(%)
rel. I
nte
nsity
(%)
25%
50%
75%
100%
0%
[M+H]+
364,3
366,3362,2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Zeit, min
364,3
366,3362,2
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Zeit, min
0%
25%
50%
75%
100%
5,35364,3
366,3362,2m/z
380,3re
l. I
nte
nsity
(%)
rel. I
nte
nsity
(%)
25%
50%
75%
100%
0%
[M+H]+
Abbildung 5-26: Extrahierter Ionenstrom von m/z 380 des synthetisch erzeugten Hydroxyaminoabyssomicin mit dazugehörigem Massenspektrum. Die Retentionszeit (Rt = 5,4 min) entspricht dem aus dem Kulturfiltrat detektierten Hydroxyaminoabyssomicin.
Da beide Substanzen hervorragend ionisieren, war eine Detektion problemlos möglich, die
Aufreinigung der chemisch synthetisierten Substanzen, die NMR-Analyse sowie
biologische Testierung scheiterte jedoch an der geringen Ausbeute der Reaktion sowie an
der mangelnden Stabilität bei der präparativen Aufreinigung.
Ein weiteres Abyssomicin-Derivat, das in Kulturfiltraten identifiziert werden konnte, ist
ein Dimer, bestehend aus zwei Abyssomicinen, die über eine NH-O-Bindung miteinander
verbrückt sind (Abbildung 5-27). Die exakte Masse wurde mit 726.31138 amu bestimmt,
was einer Summenformel von C38H48NO13 ([M+H]+theor = 726.31202, ∆m = 0.88 ppm)
entspricht. Eine weitere Strukturaufklärung konnte wie im Fall des Aminoabyssomicin und
Hydroxyaminoabyssomicin in Ermangelung von Substanz nicht durchgeführt werden.
H3C CH3
O O
OO
O
CH3
HO
O
CH3H3C
OO
O O
O
H3C
OH
NH
Abbildung 5-27: Strukturformel des hypothetischen Abyssomicin-Dimers.
.
Ergebnisse
97
5.1.6 Abyssomicin A
In Zusammenarbeit mit Frau Dipl.-Chem. Kathrin Schneider gelang die Strukturaufklärung
von Abyssomicin A. Es zeigte sich, dass Abyssomicin A fälschlicherweise aufgrund seines
UV-Spektrums der Familie der Abyssomicine zugeordnet worden war, in Wirklichkeit
aber einer anderen Substanzklasse angehört. Daher wurde die Substanz umbenannt in
Proximicin C (Abbildung 5-28). Es handelt sich um ein Furan-Analogon von Netropsin
und Distamycin (Abbildung 5-28), Oligopeptid-Antibiotika, deren Wirkmechanismus auf
der Bindung and die kleine Furche der DNA beruht.
H2N NH
HN O
N CH3
HN
O
N CH3HN
O
HN
H2N
HN
H2N O
O
HN
O
OHN
OO
H3C
H2N NH
HN O
N CH3
HN
O
N CH3HN
ON
CH3
HNH
O
Abbildung 5-28: Strukturformel von Netropsin, Distamycin und Proximicin C, vormals Abyssomicin A.
Die Strukturaufklärung und Untersuchung des Wirkmechanismus der Proximicine wird in
Kürze veröffentlicht werden. Eine detaillierte Beschreibung wird in die Dissertation von
Frau Dipl.-Chem. Kathrin Schneider Eingang finden.
5.1.7 Zusammenfassung
Zusätzlich zu den bereits von Dr. Bojan Bister beschriebenen drei Abyssomicinen wurden
im Rahmen dieser Arbeit noch drei weitere Derivate gefunden, sodass derzeit sechs
Abyssomicine spektroskopisch umfassend charakterisiert sind: Abyssomicin B, C, D, G, H
und atrop-Abyssomicin C (Abbildung 5-29). Die charakteristischen analytischen Daten
sind in Tabelle 5-5 zusammengefasst. Eine antibiotische Wirkung weisen nur Abyssomicin
C und atrop-Abyssomicin C auf, letzteres ist stärker antibiotisch aktiv.
Ergebnisse
98
H3C CH3
HO
O
OO
O
CH3
HO
N
O
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O
G
H3CCH3
O
HO
OO
O
CH3
HO
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O
O
atrop-Abyssomicin C
H3C CH3
OO
OO
O
CH3
HO
N
HO
8
9 17
1819
1
16
13
15
C DB
H
Abbildung 5-29: Strukturformeln der bisher spektroskopisch umfassend charakterisierten Abyssomicine B, C, D, G, H und atrop-Abyssomicin C.
Tabelle 5-5: [M+H]+, Summenformel, Retentionszeit auf der Analytischen HPLC sowie die chemischen Verschiebungen von C-8 und C-9 als herausragende Unterscheidungsmerkmale der bisher charakterisierten Abyssomicine.
Substanz [M+H]+
[amu] Summen-formel
Retentionszeit [min]
13C-8, [ppm]
13C-9, [ppm]
Abyssomicin B : 378,2 C19H23NO7 5,13 42,4 159,1 Abyssomicin C : 347,2 C19H22O6 5,64 135,1 135,3 Atrop-Abyssomicin C : 347,2 C19H22O6 5,66 129,8 140,3 Abyssomicin D : 349,2 C19H24O6 6,89 60,2 28,2 Abyssomicin G : 378,2 C19H23NO7 5,32 46,8 151,7 Abyssomicin H : 349,2 C19H24O6 5,24 36,5 21,0 Eine schnelle Unterscheidung der Derivate ist durch HPLC-DAD über die Retentionszeit
in Verbindung mit dem UV/VIS-Spektrum möglich, daher sind in Abbildung 5-30 die
UV-Spektren der Abyssomicine nochmals abgebildet.
Ergebnisse
99
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
500
1000
1500
2000
Abyssomicin C
atrop-Abyssomicin C
450 500
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
nm2 50 300 350 4 00 450 500
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
Abyssomicin B
450 500
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
nm2 50 300 350 4 00 450 500
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
Abyssomicin B
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
Abyssomicin G
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
Abyssomicin G Abyssomicin H
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
Abyssomicin D
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
500
1000
1500
2000
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
500
1000
1500
2000
Abyssomicin C
atrop-Abyssomicin C
450 500
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
nm2 50 300 350 4 00 450 500
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
Abyssomicin B
450 500
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
nm2 50 300 350 4 00 450 500
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
Abyssomicin B
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
Abyssomicin G
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
Abyssomicin G Abyssomicin H
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
Abyssomicin DAbyssomicin C Abyssomicin B Abyssomicin D
Abyssomicin HAbyssomicin GAtrop-Abyssomicin C
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
500
1000
1500
2000
Abyssomicin C
atrop-Abyssomicin C
450 500
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
nm2 50 300 350 4 00 450 500
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
Abyssomicin B
450 500
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
nm2 50 300 350 4 00 450 500
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
Abyssomicin B
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
Abyssomicin G
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
Abyssomicin G Abyssomicin H
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
Abyssomicin D
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
25
50
75
100
125
150
175
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
500
1000
1500
2000
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
500
1000
1500
2000
Abyssomicin C
atrop-Abyssomicin C
450 500
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
nm2 50 300 350 4 00 450 500
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
Abyssomicin B
450 500
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
nm2 50 300 350 4 00 450 500
mAU
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
Abyssomicin B
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
Abyssomicin G
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
Abyssomicin G Abyssomicin H
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
nm250 300 350 400 450 500
mAU
0
10
20
30
40
50
60
Abyssomicin DAbyssomicin C Abyssomicin B Abyssomicin D
Abyssomicin HAbyssomicin GAtrop-Abyssomicin C
Abbildung 5-30: UV/VIS-Spektren der bisher vollständig charakterisierten Abyssomicine im Vergleich.
Ergebnisse
100
5.2 Untersuchungen zur Biosynthese von atrop-Abyssomicin C
Die Biosynthese der Abyssomicine erfolgt gemäß unserer Hypothese auf dem Polyketid-
Synthase-Weg. Arbeiten zur Aufklärung des Genclusters erfolgen derzeit in der
Arbeitsgruppe durch Frau Mag. rer. nat. Elvira Gottardi und Frau Dipl. Biol. Hanna von
Suchodoletz. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der atrop-
Abyssomicin-Biosynthese durch Fütterung 13C-Isotopen-markierter Substanzen und
anschließender NMR-Analytik der angereicherten Kerne.
5.2.1 Fütterung von 1-13C markiertem Acetat
Naheliegend bei Polyketiden ist die Fütterung von 1-13C-markiertem Acetat. Dieses wurde
erfolgreich eingebaut. Eine deutliche Signalverstärkung wurde für die Kohlenstoffatome
C-1, C-7, C-8, C-11 und C-13 (Abbildung 5-31) beobachtet. Nicht zu sehen sind die
anderen C-Atome des Abyssomicin-Grundgerüsts, die nicht angereichert waren, aufgrund
der kurzen Messzeit.
20406080100120140160180200 ppm
26.2
6
48.3
74
8.5
84
8.7
94
9.0
14
9.2
24
9.4
34
9.6
46
7.5
5
140
.84
171
.44
204
.16
Abbildung 5-31: 13C-NMR-Spektrum von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1-13C-Acetat. Deutlich sichtbar ist die Anreicherung von 13C in C-1 (171,4 ppm), C-7 (204,2 ppm), C-9 (140,8 ppm), C-11 (67,6 ppm) und C-13 (26,3 ppm).
C-7
C-1
C-9 C-11
C-13
Ergebnisse
101
Eine Fütterung von 1-13C-Acetat gibt lediglich Auskunft über die Lage des C-1 des Acetats
(Abbildung 5-32), lässt aber keinerlei Rückschlüsse auf die Orientierung der Acetat-
Einheit im atrop-Abyssomicin zu. Es kann also keine Aussage getroffen werden, ob
beispielsweise C-13 aus derselben Acetateinheit stammt wie C-12, C-14 oder C-17.
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O 1 2
3
45
6
7
8
9
10
11 12 13
17
16
15 14
1819
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O 1 2
3
45
6
7
8
9
10
11 12 13
17
16
15 14
1819
Abbildung 5-32: Einbau von 1-13C-Acetat in atrop-Abyssomicin C
5.2.2 Fütterung von 1,2-13C-markiertem Acetat
Die Aufklärung der Orientierung des Einbaus der Acetateinheit gelang über die Fütterung
von 1,2-13C-markiertem Acetat (Abbildung 5-33). Zu sehen ist einerseits eine
Signalverstärkung von C-1 und C-2 sowie aller C-Atome von C-7 bis C-13. Ein weiteres
auffälliges Merkmal dieses Spektrums ist die Aufspaltung der Signale in Tripletts
(Abbildung 5-34).
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm
26.2
52
6.4
33
1.1
23
4.3
43
9.1
94
4.1
14
8.3
74
9.6
44
9.8
55
0.9
65
1.1
95
1.3
96
7.3
46
7.5
56
7.7
47
8.1
48
1.7
18
4.8
88
5.0
88
5.2
71
06
.44
107
.16
129
.33
129
.60
129
.84
140
.62
140
.84
141
.05
171
.08
171
.80
201
.13
203
.92
204
.17
204
.42
Abbildung 5-33: 13C-NMR-Übersichtsspektrum von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1,2-13C-Acetat.
Ergebnisse
102
Die Ursache für diese Aufspaltung in Tripletts liegt in der Kopplung benachbarter 13C-
Kerne. Das Signal des von Natur aus vorhandenen 13C in den Substanzmolekülen, in die
aus statistischen Gründen kein markiertes Acetat eingebaut wurde, wird flankiert durch
zwei 13C-13C Kopplungssatelliten aus den Substanzmolekülen, in die 1,2-13C-Acetat
eingebaut wurde (Simpson, 1998). Je nach 13C-Anreicherungsgrad kann das Verhältnis der
beiden Satelliten zum natürlich vorhandenen Signal variieren. Die beiden 13C-Atome aus
1,2-13C-Acetat koppeln nur dann miteinander (Abbildung 5-34), sofern das Acetat als
intakte Einheit eingebaut wird. Die Wahrscheinlichkeit, dass zwei 13C-Atome, die nicht aus
der selben Acetateinheit stammen, nach der Biosynthese nebeneinander liegen und
miteinander koppeln, ist trotz der Anreicherung aufgrund der immer noch sehr großen
Isotopenverdünnung nahezu ausgeschlossen. Durch dieses Experiment lässt sich also auch
untersuchen, ob während der Biosynthese eine Acetat-Einheit gespalten wurde. In diesem
Falle würde man nur Signalverstärkung, aber keine Kopplung beobachten. Im Falle des
atrop-Abyssomicins wurden alle 1,2-13C markierten Acetate als vollständige Einheit
eingebaut, und zwar an folgenden Stellen: C-1 und C-2, C-7 und C-8, C-9 und C-10, C-11
und C-12 sowie C-13 und C-17 (Abbildung 5-32).
124126128130132134136138140142144146148 ppm
12
9.3
31
29.6
01
29.8
4
14
0.6
21
40.8
41
41.0
5
Abbildung 5-34: Ausschnitt aus dem 13C-NMR-Spektrum (120 ppm – 150 ppm, C-8 und C-9) von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1,2-13C-Acetat. Gut zu sehen ist die Aufspaltung in Tripletts, bedingt durch die Kopplung der benachbarten 13C-Atome aus der Acetateinheit. Zu beachten ist hier, dass die Kopplung zwischen C-7 und C-8 sowie zwischen C-9 und C-10 erfolgt.
Ergebnisse
103
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O 1 2
3
45
6
7
8
9
10
11 12 13
17
16
15 14
1819
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O 1 2
3
45
6
7
8
9
10
11 12 13
17
16
15 14
1819
Abbildung 5-35: Einbau von 1,2-13C-Acetat in atrop-Abyssomicin C (grün).
5.2.3 Fütterung von 1-13C-markiertem Propionat
Die Vermutung, dass die über Acetatfütterung nicht abgedeckte Nordhälfte des atrop-
Abyssomicins (C-3 – C-6, C-18, C-19) aus Propionateinheiten stammt, wurde durch
Fütterung von 1-13C-Propionat überprüft. Tatsächlich führte dieses Experiment zu einer
Signalverstärkung von C-3 und C-5 (Abbildung 5-36).
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 ppm
39.6
9
201
.65
Abbildung 5-36: 13C-NMR-Spektrum von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1-13C-Propionat. Deutlich sichtbar ist die Markierung von C-3 (201,7 ppm) und C-5 (39,7 ppm).
Deutlich erkennbar wird in Abbildung 5-37 damit eine zusammenhängende Kette von C-1
bis C-17, bestehend aus 5 Acetat- und 2 Propionateinheiten, deren Biosynthese auf dem
Polyketidbiosyntheseweg erfolgen muss.
C-3
C-5
Ergebnisse
104
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O 1 2
3
45
6
7
8
9
10
11 12 13
17
16
15 14
1819
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O 1 2
3
45
6
7
8
9
10
11 12 13
17
16
15 14
1819
Abbildung 5-37: Einbau von 1-13C-Propionat (rot, graue Kreise) und 1,2-13C-Acetat (grün, schwarze Quadrate) in atrop-Abyssomicin C
5.2.4 Die C3-Einheit der Tetronsäure
Damit bleiben lediglich drei Kohlenstoffe der Tetronsäureeinheit (C-14, C-15 und C-16)
übrig, die bisher nicht zugeordnet werden können. Ein in der Literatur häufig
beschriebener Vorläufer dieser C3-Einheit der Tetronsäure ist Glycerol. Auch im Falle des
Chlorothricins ist Glycerol der Vorläufer, im Falle des atrop-Abyssomicins wurde Glycerol
jedoch nicht eingebaut. Aufschlüsse über die Herkunft dieser drei Kohlenstoffe ergaben
sich aus der Fütterung von 1,2-13C-markierter Glucose (Abbildung 5-38). Sowohl C-15 als
auch C-14 sind markiert und weisen ein typisches Kopplungsmuster auf. Die Tatsache,
dass es sich um Tripletts handelt (Abbildung 5-39 und Abbildung 5-40), spricht dafür, dass
die Bindung der beiden Kohlenstoffe während der Biosynthese nicht getrennt wurde. Wie
aus Glucose der Vorläufer der C3-Einheit der Tetronsäure biosynthetisiert wird, ist in
Abbildung 5-41 dargestellt. Die Glucose wird auf dem Glycolyseweg abgebaut zu
Phosphoenolpyruvat, aus dem schließlich Enoylpyruvat-S-ACP gebildet wird.
Ergebnisse
105
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 ppm
16
.94
18
.07
18
.61
18
.80
18
.97
26
.08
26
.26
26
.43
34
.15
34
.34
34
.51
39
.20
44
.12
48
.37
48
.58
48
.79
49
.01
49
.22
49
.29
49
.43
49
.65
49
.70
51
.19
51
.39
67
.56
67
.74
81
.72
81
.90
84
.88
85
.08
85
.28
10
6.8
21
29.3
41
29.6
01
29.8
41
40.8
51
71.4
51
80.0
52
01.1
52
04.2
0
Abbildung 5-38: 13C-Übersichtsspektrum von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1,2-13C-Glucose.
7677787980818283 ppm
81.5
38
1.7
28
1.9
0
Abbildung 5-39: Ausschnitt aus dem 13C-NMR-Spektrum (C-15) von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1,2-13C-Glucose. Die Aufspaltung in Tripletts, bedingt durch die Kopplung der benachbarten 13C-15 und 13C-14, beweist, dass hier C-1 und C-2 der Glucoseeinheit eingebaut wurden.
Ergebnisse
106
29303132333435363738 ppm
34.1
53
4.3
43
4.5
1
Abbildung 5-40: Ausschnitt aus dem 13C-NMR-Spektrum (C-14) von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1,2-13C-Glucose. Die Aufspaltung in Tripletts, bedingt durch die Kopplung der benachbarten 13C-15 und 13C-14, beweist, dass hier C-1 und C-2 der Glucoseeinheit eingebaut wurden.
O
H
HO
H
HO
H
H
OHHOH
OH
OH
O
OP
O
OH
SACP
Abbildung 5-41: Biosynthese des Vorläufers der 3-Kohlenstoff-Einheit der Tetronsäure aus Glucose unter Berücksichtigung der 13C-Markierug und deren Verbleib im Vorläufer.
5.2.5 Zusammenfassung
Durch Fütterung von markiertem Acetat, Propionat und Glucose gelang es im Rahmen
dieser Arbeit, die Herkunft aller Kohlenstoffatome von atrop-Abyssomicin C aufzuklären.
C-1, C-2, C-7 bis C-13 sowie C-17 stammen aus Acetat, C-3 bis C-6 sowie C-18 und C-19
stammen aus Propionat und C-14 bis C-16 werden vermutlich über Enoylpyruvat-S-ACP
in atrop-Abyssomicin C eingebaut (Abbildung 5-42).
Ergebnisse
107
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O 1 2
3
45
6
7
8
9
10
11 12 13
17
16
1514
1819
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O 1 2
3
45
6
7
8
9
10
11 12 13
17
16
1514
1819
Abbildung 5-42: Einbau von 1-13C-Propionat (rot, graue Kreise), 1,2-13C-Acetat (grün, schwarze Quadrate) und 1,2-13C-Glucose (blau, gestreifte Fünfecke) in atrop-Abyssomicin C.
Ergebnisse
108
5.3 Überexpression und Aufreinigung der Proteine PabA und PabB
5.3.1 Konstruktion des Plasmids
Das Plasmid zur Überexpression von PabA war im Rahmen der Diplomarbeit des Autors
(Keller, 2003) hergestellt worden. Pab A wird ohne Tag im Plasmid pT7-7 vom
Wirtsstamm E. coli BL21 (DE3) über ein T7-Expressionssystem überexprimiert
(Abbildung 5-43).
B. subtilis
3065 bps
500
1000
1500
2000
2500
3000
pabA
bla
Nucleotidsequenz: ATGATTTTAA TGATTGATAA CTACGATTCA TTCACGTACA ACTTGGTACA GTATTTGGGC
GAGCTTGGGG AAGAGCTGGT TGTGAAACGC AATGACAGCA TCACAATCGA TGAAATTGAA
GAACTGTCTC CGGACTTTCT GATGATATCT CCCGGACCGT GCAGCCCTGA TGAGGCGGGA
ATCAGCCTCG AAGCAATTAA ACATTTCGCA GGGAAAATTC CTATTTTCGG TGTATGTCTC
GGACATCAGT CCATCGCACA AGTGTTCGGT GGTGATGTTG TTAGGGCAGA ACGGCTTATG
CACGGGAAAA CCTCGGATAT CGAGCATGAC GGCAAAACCA TTTTTGAAGG GTTGAAAAAT
CCCCTTGTTG CGACGCGATA CCACTCGCTG ATCGTAAAAC CTGAGACGCT GCCAAGCTGT
TTTACAGTAA CAGCACAAAC GAAAGAAGGA GAAATCATGG CTATTCGCCA CAATGACCTC
CCGATAGAGG GTGTGCAATT TCACCCAGAG TCTATTATGA CCTCCTTTGG GAAAGAAATG
CTCAGAAATT TTATTGAGAC ATATCGCAAG GAAGTTATTG CGTGA
Aminosäuresequenz: MILMIDNYDS FTYNLVQYLG ELGEELVVKR NDSITIDEIE ELSPDFLMIS PGPCSPDEAG
ISLEAIKHFA GKIPIFGVCL GHQSIAQVFG GDVVRAERLM HGKTSDIEHD GKTIFEGLKN
PLVATRYHSL IVKPETLPSC FTVTAQTKEG EIMAIRHNDL PIEGVQFHPE SIMTSFGKEM
LRNFIETYRK EVIA
Abbildung 5-43: Plasmid pT7-7 mit pabA aus B. subtilis. Darunter die Nucleotid- und die Proteinsequenzen.
Auch die Überexpression von PabB wurde mit dem Wirtsstamm E. coli BL21 (DE3) über
ein T7-Expressionssystem durchgeführt. Als Expressionskonstrukt diente das Plasmid
PrSet_6His_PP bei dem das jeweils benötigte Gen unter der Kontrolle des T7-Promotors
steht. Dazu wurde das Plasmid PrSet_6His_PP in der Multiple Cloning Site (MCS) mit
Ergebnisse
109
geeigneten Restriktionsenzymen geschnitten. PabB wurden über PCR aus der
chromosomalen DNA von B. subtilis DSM 10 amplifiziert.
B. subtilis
4219 bps
1000
2000
3000
4000
BamHI
BamHI
pabB
bla
Nucleotidsequenz: ATGAGAGGAT CGCATCACCA TCACCATCAC CTGGAAGTTC TGTTCCAGGG GCCCGGATCC
GCACAACGCA GACCGGCAGG CAAAAAAATA CCTTTTCAAA AAGACTCATT CTTACAACAA
TTTGAGAAAC TTGCGCAATC CCGGAAACAT CATGTACTTC TCGAAAGTGC AAGAGGCGGC
AGATATAGTA TAGCCGGTCT TGATCCAATT GCGACTGTGA AAGGAAAAGA CGGAATAACT
ACAATTAAGC ATGGTGATGA GATGCTGTTT AAAGAAGGTG ATCCATTACG GGCCTTCCAC
AGCTGGTTTA AAACACTGGA AACAGAAACG AATCATGAGT TCCCTGACTT TCAAGGCGGG
GCAATCGGGT TTCTCAGCTA TGATTACGCA CGGTACATTG AAAATTTTAA AATGCTCTCA
TTAGATGATT TAGAAACACC AGATATTTAT TTTCTTGTTT TTGATGATAT AGCAGTTTAT
GACCATCAAG AAGAGTCTCT ATGGCTGATT ACTCATGTTA ATGGTTCTGA TCAGGAAACA
GCGGATGTGA AGCTATCTGA GTTAGAGCAG ATGTGGTTGA CTGAGCTTCC CGCTGTCACT
TCGCGAGAGA TGAAGCCTGA AACAGCTGGT TCTTTCGCGG CGCCATTTAC CGAGGATGGG
TTCTCACAAG CTGTAGAGAA AATCAAACAA TACATTGCCA GCGGAGATGT GTTTCAAGTC
AATCTATCAA TAAGGCAGTC ACAGTCACTG TCTGTCCACC CATATCAAAT TTACAAAACC
TTGAGAGAAG TAAATCCTTC TCCTTATATG GCGTATTTAG AAACACCTGA TTTCCAAATC
ATTTGCGGAT CGCCTGAACT GCTTGTCAGC AAAAAGGGCA AGCTATTAGA GACGAGACCG
ATTGCGGGCA CCCGTTCCAG AGGGAAAACA AATGAAGAAG ACGAGGCGCT TGCAAACGAA
TTGATACACA ATGAAAAAGA ACGCGCGGAA CATGTCATGC TGGTTGATCT TGAGCGAAAT
GATCTGGGAA GAGTATCACG TTACGGGTCT GTGCGCGTAA ATGAATTCAT GGCAATTGAA
AAATACTCGC ATGTGATGCA CATTGTGTCT AATGTCCAAG GTGAACTGCA GGATGGGTAT
GATGCTGTAG ATATTATTCA TGCTGTGTTT CCCGGAGGAA CCATTACTGG TGCACCGAAA
GTAAGAACGA TGGAAATTAT AGAAGAACTT GAGCCGACAC GCCGAGGGCT TTATACTGGA
TCTATAGGAT GGTTTGGATA TAATCACGAT CTGCAGTTTA ATATCGTCAT TCGAACCATT
TATGCAACCG GAGGGCAGGC ATTTATGCAG TCCGGTGCAG GAGTTGTGAT TGATTCTGTT
CCGAAGCACG AATACAAGGA ATCATTCAAA AAAGCTTTTG CGATGCAAAG AGCATTAGAG
CTGAGCGAAG AAGAGACAAA AATTAGATGA
Aminosäuresequenz: MRGSHHHHHH LEVLFQGPGS MAQRRPAGKK IPFQKDSFLQ QFEKLAQSRK HHVLLESARG
GRYSIAGLDP IATVKGKDGI TTIKHGDEML FKEGDPLRAF HSWFKTLETE TNHEFPDFQG
GAIGFLSYDY ARYIENFKML SLDDLETPDI YFLVFDDIAV YDHQEESLWL ITHVNGSDQE
TADVKLSELE QMWLTELPAV TSREMKPETA GSFAAPFTED GFSQAVEKIK QYIASGDVFQ
VNLSIRQSQS LSVHPYQIYK TLREVNPSPY MAYLETPDFQ IICGSPELLV SKKGKLLETR
PIAGTRSRGK TNEEDEALAN ELIHNEKERA EHVMLVDLER NDLGRVSRYG SVRVNEFMAI
EKYSHVMHIV SNVQGELQDG YDAVDIIHAV FPGGTITGAP KVRTMEIIEE LEPTRRGLYT
GSIGWFGYNH DLQFNIVIRT IYATGGQAFM QSGAGVVIDS VPKHEYKESF KKAFAMQRAL
ELSEEETKIR
Abbildung 5-44: Plasmid PrSet_6His_PP mit pabB aus B. subtilis. Darunter die Nucleotid- und die Proteinsequenz.
Ergebnisse
110
Die Ligation wurde entsprechend dem Protokoll von Abschnitt 4.3.4 durchgeführt. Nach
der Ligation wurden nach dem in Abschnitt 4.3.7 beschriebenen Protokoll kompetente
Zellen des Stamms DH5α mit dem Plasmid transformiert und auf TY/Amp-Platten
ausplattiert. Am nächsten Tag wurden Kolonien gepickt und Übernachtkulturen angeimpft.
Das Plasmid wurde entsprechend der Vorschrift in Abschnitt 4.3.8 aus diesen Kulturen
isoliert. Die Ligation von Vektor und Insert in der gewünschten Orientierung wurde mittels
Restriktionsanalyse überprüft, und die Sequenz mittels Sequenzierung durch die Firma
GATC bestätigt.
5.3.1.1 Expression und Reinigung von PabA
PabA wurde überexprimiert und aufgereinigt wie zuvor in der Diplomarbeit des Autors
(Keller, 2003) beschrieben. Zusätzlich wurde noch Ionenaustauschchromatographie und
Gelfiltration durchgeführt. Das Enzym wurde aliquotiert und bei -80°C in Puffer (50 mM
Tris-HCl pH 8,0; 50 % Glycerin, 1 mM DTT) gelagert. Die Proteinbestimmung, die
sowohl nach Bradford als auch direkt über das Lambert-Beersche Gesetz durchgeführt
wurde, ergab Konzentrationen von etwa 150 µM.
50 kDa
40 kDa
30 kDa
25 kDa
20 kDa
60 kDa
M A
50 kDa
40 kDa
30 kDa
25 kDa
20 kDa
60 kDa
M A
Abbildung 5-45. PabA nach Reinigung. M: Protein Marker; A: gereinigtes PabA, 21,4 kDa.
5.3.1.2 Expression und Reinigung von PabB
Bei PabB erfolgte die Induktion der Hauptkultur bei einer OD578 von etwa 0,5 mittels
IPTG (1mM Endkonzentration) für 4 h bei 37 °C. Danach wurden die Bakterien geerntet
Ergebnisse
111
und bis zur weiteren Aufreinigung bei -80°C eingefroren. Die Bakterien wurden mittels
French-Press aufgeschlossen. Zelltrümmer wurden durch 20-minütige Zentrifugation bei
10.000 g und 4°C abgetrennt. Der Überstand wurde über Ni-NTA-Agarose gereinigt und in
50 mM Tris/HCl pH 8,0, 50 % Glycerin, 1 mM DTT dialysiert, um das im Elutionspuffer
enthaltene Imidazol abzutrennen und um das Protein aufzukonzentrieren. Versuche, den
Dialyseschritt durch eine Kombination aus PD-10-Sephadex Säulchen (zum Abtrennen des
Imidazols) und Vivaspin-Konzentratoren (zur Aufkonzentrierung des Proteins) zu ersetzen
scheiterten daran, dass die Aktivität des Enzyms durch diese Schritte drastisch abnahm. Da
zusätzliche Reinigungsschritte die Enzymaktivität stark verringerten, wurde darauf
verzichtet. Es wurde zudem beobachtet, dass Einfrieren und Auftauen rasch zu einem
Aktivitätsverlust führen, weshalb das Enzym aliquotiert wurde, auf Trockeneis
schockgefroren und bei -80°C in Puffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0; 50 % Glycerin, 1 mM
DTT) gelagert.
M PabB
50 kDa
40 kDa
30 kDa
25 kDa
60 kDa
20 kDa
70 kDa
85 kDa100 kDa
M PabB
50 kDa
40 kDa
30 kDa
25 kDa
60 kDa
20 kDa
70 kDa
85 kDa100 kDa
Abbildung 5-46: PabB nach Reinigung. M: Protein Marker; gereinigtes PabB, 55,5 kDa
5.4 Untersuchungen zum Wirkmechanismus von Abyssomicin
5.4.1 Umsetzung von atrop-Abyssomicin C mit Mercaptoethanol und N-
Acetylcystein
Die Untersuchung des Wirkmechanismus wurde basierend auf drei Säulen durchgeführt:
Zunächst wurde ein einfaches Modellsystem (Mercaptoethanol, N-Acetyl-Cystein)
gewählt, das mit atrop-Abyssomicin C umgesetzt werden sollte, um herauszufinden, ob das
Michaelsystem von Schwefel nucleophil angegriffen wird. Desweiteren sollte eine
Hemmkinetik von atrop-Abyssomicin C mit ADC-Synthase durchgeführt werden.
Schließlich wurde die kovalente Bindung von atrop-Abyssomicin C an PabB untersucht.
Ergebnisse
112
Für die Umsetzung mit den Modellverbindungen wurden je 10 µmol (3,46 mg) atrop-
Abyssomicin C umgesetzt und durch präparative HPLC aufgereinigt. Die so isolierten
Reinsubstanzen wurden über LC-MS und NMR charakterisiert. Zwei mögliche
Reaktionswege sind hier denkbar analog der Reaktion von atrop-Abyssomicin C mit
NaBH4 zu Abyssomicin D und Abyssomicin H (Abbildung 5-47).
H3CCH3
O
HO
OO
O
CH3
HO
H3C CH3
O O
OO
O
CH3
HO
H3C CH3
O O
OO
O
CH3
HO
H3CCH3
O
HO
OO
O
CH3
HO
CysS
H3C CH3
O O
OO
O
CH3
HO
CysS
H3C CH3
O O
OO
O
CH3
HO
a b
Abbildung 5-47: Bildung von Abyssomicin H und D durch Umsatz von atrop-Abyssomicin C mit NaBH4 (oben). Mögliche Bildung zweier N-Acetylcystein-Abyssomicin-Addukte durch a) einfache Michael-Addition oder b) zweifache Michaeladdition.
Es zeigte sich, dass sowohl bei der Reaktion mit Meraptoethanol als auch mit
N-Acetylcystein eine Umlagerung zu einer Abyssomicin D-artigen Struktur stattfand. In
den NMR-Spektren äußerte sich dies unter anderem in charakteristisch unterschiedlichen 13C-NMR-chemischen Verschiebungen von C-3, C-8 und insbesondere C-16. Während die
entsprechenden 13C-NMR-chemischen Verschiebungen bei Abyssomicin H bei 200 ppm
(C-3), 36,5 ppm (C-8) und 187 ppm (C-16) liegen, weist Abyssomicin D Verschiebungen
von 182 ppm (C-3), 60 ppm (C-8) und 86 ppm (C-16) auf. Sowohl das Mercaptoethanol-
Addukt (C-3: 182,1 ppm; C-8: 67,5 ppm; C-16: 86,6 ppm) als auch das N-Acetylcystein-
Addukt (C-3: 182,2 ppm; C-8: 66,8 ppm; C-16: 86,36 ppm) gleichen mehr dem
Abyssomicin D (Abbildung 5-48, Tabelle 5-6).
Ergebnisse
113
H3CCH3
O
HO
OO
O
CH3
HO
H3CCH3
O
HO
OO
O
CH3
HO
H3CCH3
O
HO
OO
O
CH3
HO
S
HO
S
HN
O
HO
O
Abbildung 5-48: Strukturformeln von Abyssomicin D sowie den Mercaptoethanol- und N-Acetylcystein-Addukten von atrop-Abyssomicin C.
ppm
1.01.52.02.53.03.54.04.5 ppm
80
90
Abbildung 5-49: Ausschnitt aus dem HMBC-Spektrum von N-Acetylcystein-Abyssomicin im 13C-Bereich von ca. 75 - 95 ppm mit C-15 (88,0 ppm) und C-16 (86,3 ppm).
Desweiteren wurden aus dem HMBC-Experiment wichtige Informationen gewonnen. In
Abbildung 5-50 dargestellt ist der diesbezüglich interessante Ausschnitt aus dem HMBC-
Spektrum mit C-15 bei 88,0 ppm und C-16 mit 86,3 ppm. Zu sehen sind die Kopplungen
von H-C-8, H-C-10, H-C-12 und H-C-14 zu C-16. Insbesondere die H-C Kopplung von
H-C-8 zu C-16 ist nur bei einer Abyssomicin D-artigen Struktur zu erwarten.
H3CCH3
O
HO
OO
O
CH3
HO
SCys
H3C CH3
HO O
OO
O
CH3
HO
CysS
H3C CH3
O O
OO
O
CH3
HO
CysSH
Abbildung 5-50: Mechanismus der Umsetzung von N-Acetylcystein mit atrop-Abyssomicin C.
Ergebnisse
114
Abbildung 5-50 zeigt den hypothetischen Mechanismus, nach dem die Reaktion von
N-Acetylcystein mit atrop-Abyssomicin C verläuft. An die Michaeladdition der
Thiolgruppe an C-9 von atrop-Abyssomicin C schließt sich eine intramolekulare zweite
Michaeladdition an C-16 als Teil des zweiten Michaelsystems an.
Tabelle 5-6: NMR Daten von Abyssomicin D, dem Abyssomicin-Mercaptoethanol-Addukt und dem Abyssomicin-N-acetylcystein-Addukt (in MeOD-d4, 298 K)
Abyssomicin D Abyssomicin -
Mercaptoethanol-Addukt Abyssomicin -
N-Acetylcystein-Addukt
Nr 1H, δ [ppm] 13C, δ [ppm] 1H, δ [ppm] 13C, δ [ppm] 1H, δ [ppm] 13C, δ [ppm]
1 - 176.0 - n.b. - n.b.
2 - 100.0 - 99.6 - 99.7
3 - 182.0 - 182.1 - 182.2
n.b. (OH) - n.b. (OH) - n.b. (OH) -
4 2.48 41.7 2.48 41.2 2.46 41.8
5 1.67 (a) 34.9 1.67 (a) 34.7 1.67 (a) 34.8
2.83 (b) 2.70 (b) 2.68 (b)
6 2.26 49.7 2.29 48.9 2.26 49.0
7 - 213.7 - 211.4 - 211.2
8 3.56 60.2 3.24 67.5 3.15 66.8
9 1.63 (a) 28.2 3.67 43.9 3.72 44.5
2.21 (b)
10 2.35 49.7 2.47 53.7 2.52 53.4
11 4.15 74.8 4.49 71.0 4.51 70.2
n.b. (OH) n.b. (OH) n.b. (OH)
12 3.63 78.3 3.67 78.4 3.66 77.9
13 2.49 26.0 2.59 26.0 2.53 26.0
14 1.06 (a) 33.6 1.09 (a) 33.6 1.03 (a) 33.6
2.36 (b) 2.35 (b) 2.32 (b)
15 - 89.1 - 88.4 - 88.0
16 - 86.1 - 86.6 - 86.3
17 1.02 19.2 1.02 18.8 1.00 19.2
18 1.36 20.1 1.34 19.8 1.33 20.2
19 1.09 19.6 1.08 18.7 1.05 19.1
20 - - 2.70 35.8 2.97 35.5
- - 3.09
21 - - 3.68 62.6 4.51 55.9
22 - - - - - 175.9
23 - - - - - 172.8
24 - - - - 2.00 22.6
n.b. = nicht bestimmt
Ergebnisse
115
5.4.2 Umsetzung von atrop-Abyssomicin C mit PabB
Die kovalente Bindung von atrop-Abyssomicin C an PabB wurde untersucht, indem atrop-
Abyssomicin C mit PabB inkubiert wurde, nicht gebundenes atrop-Abyssomicin C
sorgfältig abgetrennt und das Enzym mit Endoproteinase GluC verdaut wurde. Die aus
dem Verdau resultierenden Peptide wurden per LC-MS und LC-MSMS analysiert und mit
einer Probe von verdautem PabB (ohne atrop-Abyssomicin) verglichen. Bei der mit atrop-
Abyssomicin inkubierten Probe zeigte sich ein zusätzliches Peptid von m/z 827, das in der
unbehandelten Probe nicht detektiert wurde (Abbildung 5-51).
20,10
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Time, min
31,10
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Time, min
0%
25%
50%
75%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
0%
25%
50%
75%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
20,10
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Zeit, min
31,10
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Zeit, min
0%
25%
50%
75%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
0%
25%
50%
75%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
20,10
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Time, min
20,10
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Time, min
31,10
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Time, min
0%
25%
50%
75%
100%
31,10
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Time, min
0%
25%
50%
75%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
0%
25%
50%
75%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
20,10
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Zeit, min
rel. I
nte
nsity
(%)
0%
25%
50%
75%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
20,10
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Zeit, min
31,10
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Zeit, min
31,10
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Zeit, min
0%
25%
50%
75%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
0%
25%
50%
75%
100%
rel. I
nte
nsity
(%)
Abbildung 5-51: HPLC-MS-Chromatogramm der Peptide aus dem GluC-Verdau von PabB (oben) und PabB + atrop-Abyssomicin C (unten). Mit dem Pfeil markiert ist das zusätzlich auftretende Peptid von m/z 827 bei der Retentionszeit Rt = 31 min.
Dieses Peptid wurde anhand eines MS/MS-Experiments sequenziert, und das in Abbildung
5-52 dargestellte Fragmentionenspektrum erhalten. Anhand der b- und der y-Serie ließ sich
zeigen, dass es sich um das Peptid 256TPDFQIICGSPE handelt, das am Cystein atrop-
Abyssomicin gebunden hat. Dass atrop-Abyssomicin am 263Cys gebunden hat, beweisen
sowohl die beiden Fragmente b7 (m/z = 815,5) und b8 (1264,4) als auch die Fragmente y4
(m/z = 389,2) und y5 (m/z = 838,2) der y-Serie, deren Massendifferenz jeweils 449 berträgt,
was der Masse von Cystein und atrop-Abyssomicin entspricht. Unter geeigneten
Inkubationsbedingungen (5 min, 500 µM atrop-Abyssomicin) wurde keine Bindung an
Lysin, Serin oder Threoninreste beobachtet, wurde jedoch mehr atrop-Abyssomicin
Ergebnisse
116
(2 mM) eingesetzt und länger inkubiert (2 h), so konnte auch eine Bindung an Lysinreste
festgestellt werden.
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400
702,3
589,3 815,6
838,3
1408,6827,0 951,4
389,2
1264,51321,6
rel. In
tensity
(%)
100
50
0
m/z
[M+2H]2+ b10
b8
b6
b7
y5
y6
b9
y4
T P D F Q I I C G S P E
b10
y6
b9b8b7b6
y5
b5 b5
y4
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400
702,3
589,3 815,6
838,3
1408,6827,0 951,4
389,2
1264,51321,6
rel. In
tensity
(%)
100
50
0
m/z
[M+2H]2+ b10
b8
b6
b7
y5
y6
b9
y4
T P D F Q I I C G S P E
b10
y6
b9b8b7b6
y5
b5 b5
y4
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400
702,3
589,3 815,6
838,3
1408,6827,0 951,4
389,2
1264,51321,6
rel. In
tensity
(%)
100
50
0
m/z
[M+2H]2+ b10
b8
b6
b7
y5
y6
b9
y4
T P D F Q I I C G S P E
b10
y6
b9b8b7b6
y5
b5 b5
y4
300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400
702,3
589,3 815,6
838,3
1408,6827,0 951,4
389,2
1264,51321,6
rel. In
tensity
(%)
100
50
0
m/z
[M+2H]2+ b10
b8
b6
b7
y5
y6
b9
y4
T P D F Q I I C G S P E
b10
y6
b9b8b7b6
y5
b5 b5
y4
Abbildung 5-52: MS/MS-Spektrum des atrop-AbyssomicinC-Adduktpeptids m/z 827.
5.4.3 Hemmkinetik von ADC-Synthase mit atrop-Abyssomicin C
5.4.3.1 Enzymkinetische Charakterisierung der ADC-Synthase
Bevor mit der Hemmkinetik begonnen werden konnte, musste der PabA-PabB-
Enzymkomplex zunächst enzymkinetisch charakterisiert werden. Literaturbekannt war bis
zu diesem Zeitpunkt nur das homologe E. coli-Enzym (Vishwanathan et al., 1995; Nichols
et al., 1989; Ye et al., 1990; Parsons et al., 2002), das Enzym aus B. subtilis wurde im
Rahmen dieser Arbeit erstmals kloniert, überexprimiert und enzymkinetisch untersucht.
Zunächst wurde die pH- und die Temperaturabhängigkeit von PabA-PabB charakterisiert.
Es ergab sich ein pH-Optimum von 8,5 und ein Temperaturoptimum um 40°C (Abbildung
5-53). Daher wurden alle folgenden Versuche bei pH 8,5 und der physiologisch relevanten
Temperatur 37°C, bei der auch die antibakteriellen Test mit B. subtilis stattgefunden
hatten, durchgeführt.
Ergebnisse
117
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60 70
Temperatur, °C
Akti
vit
ät,
%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
5,0 7,0 9,0 11,0 13,0
pH-Wert
Akti
vit
ät,
%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60 70
Temperatur, °C
Akti
vit
ät,
%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
5,0 7,0 9,0 11,0 13,0
pH-Wert
Akti
vit
ät,
%
Abbildung 5-53: pH-Wert- und Temperaturabhängigkeit der ADC-Synthase.
Die Bestimmung der wichtigen Parameter KM und kcat erwies sich als schwierig, da es
nicht möglich war, Aminodesoxychorismat in ausreichender Menge als Reinsubstanz zu
erhalten, so dass keine Kalibriergerade erstellt werden konnte. Für die Bestimmung von
KM spielt dies keine Rolle, für die Bestimmung von kcat ist dies jedoch eine essenzielle
Voraussetzung.
0 2 4 6 8 10
0
2000
4000
6000
8000
10000
v,
AU
C/m
in
[Chorismat], mM
0 2 4 6 8 10
0
2000
4000
6000
8000
10000
v,
AU
C/m
in
[Chorismat], mM Abbildung 5-54: Bestimmung des KM-Wertes der ADC-Synthase.
Ergebnisse
118
0
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
0,007
0,008
0 2 4 6 8 10 12 14
1/[Chorismat], 1/mM
1/V
, m
in/A
UC
0
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
0,007
0,008
0 2 4 6 8 10 12 14
1/[Chorismat], 1/mM
1/V
, m
in/A
UC
Abbildung 5-55: Lineweaver-Burk Plot der Michaelis-Menten-Kinetik der ADC-Synthase.
Die Quantifizierung erfolgte also relativ in AUC/min, was der Zunahme der Fläche unter
der Kurve des MRM in Abhängigkeit von der Reaktionszeit entspricht (Tabelle 5-7). Die
so ermittelten Werte wurden gegen die Chorismatkonzentration (in mM) aufgetragen, und
die Werte entsprechend den gängigen Konventionen direkt an die Michaelis-Menten-
Kurve (least square) gefittet. Ein Lineweaver-Burk-Plot der Daten ist in Abbildung 5-55
dargestellt, auf eine Ermittlung der Konstanten aus dieser Darstellungsweise musste
verzichtet werden, da kein Programm zur Verfügung stand, mit dem eine korrekte
Gewichtung der Messpunkte unter Beachtung des Einflusses der zum Zwecke der
Linearisierung durchgeführten mathematischen Transformation möglich war. Ein sog.
einfacher Linear Fit ist bei reziproker Auftragsweise nicht zulässig (Copeland, 2000). Der
erhaltene KM-Wert der ADC-Synthase von B. subtilis für Chorismat bei der
ammoniumabhängigen Reaktion von etwa 6 mM scheint (Abbildung 5-54) unrealistisch
hoch zu sein.
Tabelle 5-7: Rohdaten der KM-Bestimmung als AUC (area under the curve) aus LC-MS Messungen.
AUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC AUC
Zeit t, min
0,078 mM
0,156 mM
0,313 mM
0,625 mM
1,25 mM 2,5 mM 5 mM 10 mM
0,00 0 358 1050 1300 2420 3390 6820 7020
8,08 1120 3240 9320 13800 26900 43900 59800 96600
16,17 2430 5410 13000 23700 36300 71100 129000 160000
24,25 3510 7250 16700 32100 51000 115000 167000 227000
32,33 4200 8030 - 38600 72400 137000 181000 308000
40,42 4190 7920 20800 41600 74400 146000 199000 354000
48,50 4160 7780 19500 46600 81800 160000 247000 345000
Ergebnisse
119
5.4.3.2 Hemmkinetik
Die Hemmkinetik von atrop-Abyssomicin C und ADC-Synthase wurde bei pH 8,5 und
37°C mit einer konstanten Konzentration von Chorismat (1 mM) und Ammoniumsulfat
(200 mM) durchgeführt. Es wurde nur die PabB-Aktivität (Umsetzung von Chorismat und
NH4+ zu ADC) betrachtet. PabA musste jedoch auch zum Präinkubationsmix dazugegeben
werden, da eine Inkubation von PabB alleine mit der Kontrolle (1 % DMSO in Wasser) zu
einem raschen Aktivitätsverlust führte (ca. 20 % Aktivitätsverlust / min). PabA übt einen
stabilisierenden Effekt auf PabB aus, so dass eine Inkubation mit der Kontrolle (1 %
DMSO in Wasser) nicht mehr zu einem Aktivitätsverlust führte. Auch eine Inkubation von
PabA mit der Kontrolle (1 % DMSO in Wasser) resultierte nicht in einem
Aktivitätsverlust. Zunächst wurde überprüft, welchen Effekt die Inkubation von atrop-
Abyssomicin C mit PabA alleine auf die Aktivität von PabB zeigte (Kontrolle). Wie
erwartet führte eine Inkubation von PabA alleine mit atrop-Abyssomicin C nicht zu einem
Verlust der PabB-Aktivität. Die Inkubation des vorgebildeten ADC-Synthase-Komplexes
(PabA und PabB) mit atrop-Abyssomicin C führte hingegen zu einer zeitabhängigen
Abnahme der Enzymaktivität. Eine Serie von Experimenten bei variierender
Inhibitorkonzentration (50 bis 500 µM) und konstanter Enzymkonzentration (5 µM) wurde
mit verschiedenen Präinkubationszeiten (0 min - 10 min) gemessen. Die Restaktivität
wurde bestimmt durch Quantifizierung der ADC Bildung via MRM. In Abbildung 5-56
dargestellt ist der zeit- und konzentrationsabhängige Verlust der Enzymaktivität durch
Inkubation mit atrop-Abyssomicin C.
Ergebnisse
120
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
0 5 10 15
Zeit, min
Re
sta
kti
vit
ät
AD
C S
yn
tha
se
500 µM
400 µM
300 µM
200 µM
100 µM
50 µM
Abbildung 5-56: Enzyminaktivierung der ADC-Synthase durch atrop-Abyssomicin in Abhängigkeit von der Präinkubationszeit und der Inhibitorkonzentration.
Wird die Geschwindigkeitskonstante für die Enzyminaktivierung kobs gegen die
Inhibtitorkonzentration aufgetragen, so erhält man entsprechend Gleichung 2 die für
irreversible Inhibitoren typische hyperbole Kurve (Abbildung 5-57). Aus dieser Kurve
lassen sich die Inhibitionskonstanten grob abschätzen, appiK liegt bei etwa 390 µM und
kinact bei 0,8 min-1.
0 100 200 300 400 500
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
kob
s
[atrop-Abyssomicin C], µM
Ergebnisse
121
Abbildung 5-57: Plot der Geschwindigkeitskonstante kobs gegen die Inhibitorkonzentration.
Tabelle 5-8: Rohdaten der Inhibitionskinetik.
0,5 mM atrop-Abyssomicin C Zeit [min] Reaktionszeit
[min] AUC AUC/min %
0 4,78 1,98E+04 4139 100,0 1 4,77 1,14E+04 2392 57,8 2,5 4,75 7,34E+03 1545 37,3 5 4,98 5,37E+03 1078 26,0 10 4,70 3,18E+03 677 16,3 20 4,67 2,53E+03 542 13,1
0,4 mM atrop-Abyssomicin C Zeit [min] Reaktionszeit
[min] AUC AUC/min %
0 4,88 2,19E+04 4485 100,0 1 4,77 1,24E+04 2601 58,0 2,5 4,87 8,02E+03 1648 36,7 5 5,35 6,57E+03 1228 27,4 10 4,60 4,22E+03 917 20,5 20 4,60 3,48E+03 757 16,9
Ergebnisse
122
0,3 mM atrop-Abyssomicin C Zeit [min] Reaktionszeit
[min] AUC AUC/min %
0 4,78 2,21E+04 4620 100,0 1 4,93 1,45E+04 2939 63,6 2,5 4,73 8,69E+03 1836 39,7 5 4,77 6,08E+03 1276 27,6 10 4,83 4,88E+03 1010 21,9 20 4,80 3,55E+03 740 16,0
0,2 mM atrop-Abyssomicin C Zeit [min] Reaktionszeit
[min] AUC AUC/min %
0 4,85 2,44E+04 5031 100,0 1 4,82 1,59E+04 3301 65,6 2,5 4,97 1,27E+04 2557 50,8 5 4,80 9,57E+03 1994 39,6 10 4,85 7,24E+03 1493 29,7 20 4,88 6,50E+03 1331 26,5
0,1 mM atrop-Abyssomicin C Zeit [min] Reaktionszeit
[min] AUC AUC/min %
0 4,88 2,32E+04 4751 100,0 1 4,88 1,95E+04 3993 84,1 2,5 4,83 1,61E+04 3331 70,1 5 5,05 1,44E+04 2851 60,0 10 4,95 1,37E+04 2768 58,3 20 5,13 1,38E+04 2688 56,6
0,05 mM atrop-Abyssomicin C Zeit [min] Reaktionszeit
[min] AUC AUC/min %
0 4,00 1,55E+04 3875 100,0 1 4,58 1,67E+04 3644 94,0 2,5 4,37 1,52E+04 3481 89,8 5 7,20 2,43E+04 3375 87,1 10 3,87 1,28E+04 3310 85,4 20 4,58 1,47E+04 3207 82,8
Diskussion
123
6 Diskussion
6.1 neue Abyssomicine
6.1.1 Abyssomicin B und G
Abyssomicin G (Abbildung 5-16) ist ein Strukturanaloges des Abyssomicin B, das jedoch
keinen Isoxazolinring besitzt. Abyssomicin G ist stabil in DMSO und lagert sich entgegen der
Erwartung einer begünstigten Fünfringbildung nicht spontan in die korrespondierende
Halbacetalform von Abyssomicin B um. Die Biosynthese von Abyssomicin B und G verläuft
vermutlich über die Addition von Ammoniak an (atrop-)Abyssomicin C zu Amino-
Abyssomicin. Eine dem Amino-Abyssomicin C entsprechende Molekülmasse konnte mit
LC-MS und FT-ICR-MS im Kulturfiltrat (Ethylacetatextrakt) nachgewiesen werden.
Anschließend ist eine Oxidation des Amino-Abyssomicin durch eine Monooxygenase zu
Hydroxyamino-Abyssomicin, dessen Molekülmasse ebenfalls nachgewiesen werden konnte,
denkbar (Abbildung 6-1). Alternativ könnte auch direkt Hydroxylamin an (atrop-
)Abyssomicin C addiert werden, wenngleich diese Möglichkeit weniger wahrscheinlich
scheint, da in umfangreichen Literaturrecherchen keine Hinweise auf ein Vorkommen von
Hydroxylamin in Zellen gefunden werden konnten.
H3C CH3
HO
O
OO
O
CH3
HO
NH
O
H3C CH3
OO
OO
O
CH3
HO
N
HO
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O
NH2
OH
H3C CH3
HO
O
OO
O
CH3
HO
N
O
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O
NH3
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
H2N
O
B)
A)
Cyp
Cyp
Abssomicin C
Abssomicin G Abssomicin B
Abbildung 6-1. Hypothese zur Biosynthese von Abyssomicin G und B durch Michaeladdition von Ammoniak und anschließender Oxidation, vermutlich durch eine Monooxygenase (Weg A) oder alternativ durch Michaeladdition von Hydroxylamin (Weg B) an Abyssomicin C / atrop-Abyssomicin C.
N-oxidierte Naturstoffe werden häufig durch Flavinmonooxygenasen über ein
Hydroxylamino-Intermediat biosynthetisiert (Thariath et al., 1993; Parry et al., 1997).
Diskussion
124
Alternativ denkbar wäre auch eine N-Oxidation mit darauffolgender Oximbildung analog der
Biosynthese von Nocardicin A, die von Kelly und Townsend 2003 beschrieben wurde und
durch ein Cytochrom P450-Enzym vermittelt wird. Kelly und Townsend schlagen vor, dass
der Stickstoff sukzessive zweifach hydroxyliert wird, dann zu einer Nitrosoverbindung
dehydratisiert wird und schließlich zum Oxim tautomerisiert (Abbildung 6-2). Da
Stickstoffoxidationen durch Cytochrom P450-Enzyme ungewöhnlich sind, ist der detaillierte
Katalysemechanismus bisher noch nicht sehr gut verstanden.
R R'
NH2
R R'
HNOH
R R'
NOHHO
R R'
NO
R R'
NOH
Abbildung 6-2: Von Kelly und Townsend (2002) vorgeschlagener Biosyntheseweg für ein N-Oxim durch Oxidation mit Cytochrom P450-Enzymen.
6.1.2 Abyssomicin D und H
Abyssomicin D und H (Abbildung 6-3) sind Metabolite, die möglicherweise durch die
Addition eines Hydridionenäquivalents, beispielsweise aus NADPH, entstehen. Im Falle des
Abyssomicin H findet eine einfache Michaeladdition statt, während für Abyssomicin D eine
transannulare intramolekulare Michaeladdition (Bister et al., 2004) vorgeschlagen wurde
(Abbildung 6-3). Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden Abyssomicin C und atrop-
Abyssomicin C modellhaft mit NaBH4 in THF inkubiert und die Reaktion via LC-MS
analysiert. Es konnten sowohl Abyssomicin H als auch Abyssomicin D detektiert werden.
Interessanterweise ist Abyssomicin H, das bis auf die Abwesenheit des Michaelsystems
strukturell identisch mit (atrop-)Abyssomicin C ist, komplett inaktiv in antibakteriellen
Testierungen.
Diskussion
125
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O
H3CCH3
O
HO
OO
O
CH3
HO
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O
H
H
A)
B)
(atrop-)Abyssomicin C
Abyssomicin D
Abyssomicin H
Abbildung 6-3: Hypothese zur Biosynthese der Abyssomicine D und H. Durch einfache Michaeladdition eines Hydrogenäquivalents (vermutlich NADPH) an Abyssomicin C / atrop-Abyssomicin C entsteht Abyssomicin H (Weg B), im Falle von Abyssomicin D schließt sich eine Umlagerung an (Weg H).
6.1.3 Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C
Die Entdeckung von atrop-Abyssomicin C in bakteriellen Kulturfiltraten von Verrucosispora
sowie unabhängig davon durch Totalsynthese (Nicolaou und Harrison, 2006) lieferte die
Grundlage für sämtliche im Rahmen dieser Arbeit durchgeführte Experimente. Der
Unterschied liegt zunächst in der stärkeren antibiotischen Aktivität des atrop-Abyssomicin C
im Vergleich zu Abyssomicin C (Nicolaou und Harrison, 2006). Strukturell unterscheiden
sich Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C in der Stellung der Doppelbindung zur
Ketogruppe, die im Falle des Abyssomicin C transoid (145°), im Falle des atrop-Abyssomicin
C cisoid (26°) ist (Nicolaou und Harrison, 2006). Eine Überlagerung der Röntgenstrukturen
von atrop-Abyssomicin C und Abyssomicin C ist in Abbildung 6-4 dargestellt (Nicolaou und
Harrison, 2006). Zu sehen ist, dass durch die veränderte Stellung der Doppelbindung zur
Ketogruppe auch die Methylgruppen C-18 und C-19 beeinflusst werden.
Diskussion
126
Abbildung 6-4: Überlagerung der Röntgenstrukturen von atrop-Abyssomicin C (gelb) und Abyssomicin C (blau). Quelle: Nicolaou und Harrison, 2007.
Hierin begründet liegt auch eine Erklärung für die stärkere antibiotische Aktivität von atrop-
Abyssomicin C: Durch die Konjugation der Doppelbindung und der Carbonylgruppe beim
atrop-Abyssomicin C erhöht ist, handelt es sich bei atrop-Abyssomicin C um einen stärkeren
Michael-Akzeptor (Nicolaou und Harrison, 2006). Aus diesem Grunde wurde das
antibakteriell aktivere atrop-Abyssomicin C zur Untersuchung des Wirkmechanismus
ausgewählt. Zudem wurde die Aufklärung der Biosynthese durch Fütterungsexperimente erst
möglich durch die Zuordnung der NMR-Signale, da es sich bei atrop-Abyssomicin C um den
Hauptmetaboliten handelt. Bei allen im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Kultivierungen
von Verrucosispora AB-18-032 konnte kein Abyssomicin C isoliert werden, sondern
ausschließlich atrop-Abyssomicin C. Da im Laufe der Arbeit festgestellt wurde, dass sich
atrop-Abyssomicin C durch Kontakt mit Säure in Abyssomicin C umwandelt, darf vermutet
werden, dass in den Arbeiten von Bister et al. (2004) durch präparative Aufreinigung mit
säurehaltigen Lösungsmitteln Abyssomicin C aus dem ursprünglich gebildeten atrop-
Abyssomicin C entstand. Die säurekatalysierte Umwandlung von Abyssomicin C in atrop-
Abyssomicin C wurde 2007 von Nicolaou und Harrison systematisch untersucht (Tabelle
6-1).
Diskussion
127
Tabelle 6-1: Säurekatalysierte Isomerisierung von atrop-Abyssomicin C und Abyssomicin C nach Nicolaou und Harrison (2007).
Nr. Bedindungen Zeit [h] Verhältnis atrop-Abyssomicin C / Abyssomicin C
1 unstabilisiertes CDCl3 24 1:2
2 d4-1,2-dichlorobenzol, 180 °C 12 1:1
3 TFA/CH2Cl2 (1:1) 24 n.r.
4 BF3 OEt2 (1 eq)/CH2Cl2 24 n.r.
5 CSA (1 eq)/CH2Cl2 24 n.r.
6 1M aq HCl/Tetrahydrofuran (1:3) 24 n.r.
7 1M HCl in Et2O (0,2 eq)/d6-Tetrahydrofuran 1 1,6:1
8 1M HCl in Et2O (0,2 eq)/CD3CN 1 1,4:1
9 1M HCl in Et2O (0,2 eq)/ CD2Cl2 1 1:2,2
10 1M HCl in Et2O (0,2 eq)/ CDCl3 1 1:2,5
11 p-TsOH (1eq), LiCl (5eq)/ CD3CN, 50 °C 2 2:1
Sofern nicht anders angegeben, wurden die Reaktionen bei 25°C durchgeführt. n.r. = no reaction
Nicolaou und Harrison (2007) stellen die Hypothese auf, dass die Stabilität von atrop-
Abyssomicin C und Abyssomicin C bei Raumtemperatur auf eine hohe thermische Barriere
der Umwandlung zurückzuführen ist, die durch einen ungünstigen Übergangszustand
verursacht wird. Durch Säurezugabe wird der Übergangszustand günstiger. Drei mögliche
Mechanismen zur Umwandlung wurden von Nicolaou und Harrison (2007) vorgeschlagen
(Abbildung 6-5). Die erste Möglichkeit (Weg a) geschieht durch Protonierung am Tetronat
durch HCl. Dadurch wird das Tetronat zu einer ausreichend guten Abgangsgruppe, so dass
die Hydroxygruppe an C-11 ein Epoxid mit C-12 bilden kann. Das so gebildete Epoxid ist so
flexibel, dass eine Rotation von C-6–C-7 und C-7–C-8 möglich ist. Gegen diese erste
Hypothese spricht, dass Nicolaou und Harrison kein Epoxid nachweisen konnten. Die zweite
Möglichkeit (Weg b) sieht eine Protonierung eines Sauerstoffatoms des Tetronats vor, durch
die C-16 ein Elektronendefizit erhält. Dadurch zieht C-16 Elektronendichte durch den Raum
von dem Olefin C-8–C-9 ab. Hierdurch würde C-8 näher an das Tetronat kommen und den
Übergangszustand stabilisieren. Die dritte, von Nicolaou und Harrison (2007) favorisierte
Hypothese (Weg c) sieht vor, dass die Protonierung an C-2 geschieht, was zu einem
Oxocarbenium-Ion führt. Dieses würde das bereits deformierte sp2-Zentrum in ein komplett
Diskussion
128
pyramidales Zentrum konvertieren, wodurch die Spannung in dem makrozyklischen System
aufgehoben, und die Rotation möglich wird.
atrop-Abyssomicin C Abyssomicin C
Weg aWeg a
Weg bWeg b
Weg cWeg c
27
1013
27
1012
28
1012
16
16
168
8atrop-Abyssomicin C Abyssomicin C
Weg aWeg a
Weg bWeg b
Weg cWeg c
27
1013
27
1012
28
1012
16
16
168
8
Abbildung 6-5: Hypothese zur Umwandlung von atrop-Abyssomicin C in Abyssomicin C (Quelle: Nicolaou und Harrison (2007), leicht modifiziert.
Diskussion
129
6.2 Biosynthese der Abyssomicine
Durch Fütterung von markiertem Acetat, Propionat und Glucose gelang es im Rahmen dieser
Arbeit, die Zuordnung aller Kohlenstoffatome aus den Biosynthesevorläufern für atrop-
Abyssomicin C aufzuklären. C-1, C-2, C-7 bis C-13 sowie C-17 stammen aus Acetat, C-3 bis
C-6 sowie C-18 und C-19 stammen aus Propionat und C-14 bis C-16 werden vermutlich über
Enoylpyruvat-S-ACP in atrop-Abyssomicin C eingebaut (Abbildung 6-6). Auf der Basis
dieser Ergebnisse und durch Analogieschluss aus der Chlorothricin-Biosynthese (Abbildung
1-25) erscheint die in Abbildung 6-7 und Abbildung 6-8 dargestellte Hypothese zur
Biosynthese des linearen Vorläufers wahrscheinlich.
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O 1 2
3
45
6
7
8
9
10
11 12 13
17
16
1514
1819
H3C CH3
O
OO
O
CH3
HO
O 1 2
3
45
6
7
8
9
10
11 12 13
17
16
1514
1819
Abbildung 6-6: Einbau von 1-13C-Propionat (rot, graue Kreise), 1,2-13C-Acetat (grün, schwarze Quadrate) und 1,2-13C-Glucose (blau, gestreifte Fünfecke) in atrop-Abyssomicin C.
loadModul 1
Modul 2Modul 3
Modul 4Modul 5
Modul 6
ATACP KS AT ACP KS ATACPKS AT
DH
ACP
KR
KS AT
DH
ACP
KR
KS AT ACPKS
DH KR
AT
DH
ACP
ERKR
KS
S
O
O
O
S
O
O
S
O
O
S
OS
O
S
O
S
O
loadModul 1
Modul 2Modul 3
Modul 4Modul 5
Modul 6
ATACP KS AT ACP KS ATACPKS AT
DH
ACP
KR
KS AT
DH
ACP
KR
KS AT ACPKS
DH KR
AT
DH
ACP
ERKR
KS
S
O
O
O
S
O
O
S
O
O
S
OS
O
S
O
S
O
Abbildung 6-7: Hypothese zum Aufbau der Abyssomicin-Polyketidsynthase auf der Basis der Fütterungsversuche und des Chlorothricinbiosyntheseclusters.
Das Kohlenstoffgerüst des Abyssomicins, bestehend aus aus Acetat- und Propionateinheiten
wird vermutlich von PKS I-Modulen aufgebaut, wobei auf vier Acetateinheiten zwei
Diskussion
130
Propionateinheiten und eine weitere Acetateinheit folgen. Die ersten drei Acetateinheiten
werden zum Alken reduziert, bei der vierten bleibt das Keton erhalten. Eine der
Propionateinheiten wird zum Alkan reduziert, während bei der anderen Propionateinheit und
der letzten Acetateinheit das Keton erhalten bleibt (Abbildung 6-7). Zuletzt wird die
Enoylpyruvateinheit angehängt (Abbildung 6-8). Für Chlorothricin (Jia et al, 2006) wurde
vorgeschlagen, dass die Freisetzung der linearen Polyketidkette durch den nucleophilen
Angriff der Hydroxygruppe des Enoylpyruvats stattfindet, bei der ein Ester gebildet wird.
Anschließend findet die Cyclisierung zur Tetronsäureeinheit statt. Ein analoger Mechanismus
scheint auch für Abyssomicin möglich. Ein alternativer Biosyntheseweg ist in Abbildung 6-8
dargestellt. Hier erfolgt ein nucleophiler Angriff der Polyketidkette auf die
Enoylpyruvateinheit unter Ausbildung einer Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung. Daran
anschließend könnte die Bildung des Lactons stattfinden. Die Zyklisierung des linearen
Vorläufers durch eine [4+2] Diels-Alder Reaktion analog dem von Jia et al.vorgeschlagenen
Mechanismus für Chlorothricin ist in Abbildung 6-9 dargestellt.
H3C
O
CH3 CH3
O
O
O
OH
H3C
O
CH3 CH3
O
O S
H3C
O
CH3 CH3
O
O S
ACP
Glycolyse
HO
SOACP
OH
OH
H3C
O
CH3 CH3
O
O
O
OH
H3C
O
CH3 CH3
O
O O
SOACP
H3C
O
CH3 CH3
O
O S
ACP
Glycolyse
HO
SOACP
1
23
45
67
8
9
10
11
12
13
1716 15
14
1819
1
23
45
67
8
9
10
11
12
13
1716 15
14
1819
1
234
56
78
9
10
11
12
13
17
16
15
14
1819
1
23
45
67
8
9
10
11
12
13
17
16
15
14
1819
1
234
56
78
9
10
11
12
13
17
16
15
141819
1
23
45
67
8
9
10
11
12
13
17
1615
14
1819
ACP
Abbildung 6-8: Hypothese zur Biosynthese des linearen Vorläufers von atrop-Abyssomicin C auf der Basis der Fütterungsversuche (grün: Acetat, rot: Propionat, blau: Enoylpyruvat aus Glucose). Das Flussschema links entspricht dem von Jia et al. (2006) vorgeschlagenen Mechanismus, das Schema rechts entspricht einer von unserer Arbeitsgruppe aufgestellten Alternativroute.
Diskussion
131
O
O
O
H3C
H3C O
CH3O
O
O
HOH3C
H3C O
CH3
O
CH2
OO
O
OH
H3C
H3C
O
CH3
[4+2]Diels-Alder Reaktion Epoxidierung, Ringöffnung
OH
Abbildung 6-9: Hypothese zur Zyklisierung des linearen Vorläufers analog zur Chlorothricin-Biosynthese (Jia et al., 2006).
Beteiligt wären in diesem Falle das En gebildet von C-15 und C-16 und das Dien gebildet von
C-10 bis C-13. Dadurch wird ein Grundkörper erhalten, der dem Chlorothricin ähnlich ist
insofern dass ein Spirotetronat mit Cyclohexenring vorhanden ist. Dieses bleibt beim
Chlorothricin erhalten, während bei Abyssomicin zunächst noch zwei Hydroxygruppen
eingeführt werden müssen, möglicherweise über Epoxidierung (Abbildung 6-9), die von einer
Monooxygenase katalysiert werden könnten. Anschließend findet ein Ringschluss statt durch
Veretherung der Hydroxygruppe von C-16 der Tetronsäureeinheit mit der Hydroxygruppe an
C-12.
COOH
OR
O
HOO
O
OO
O
O
O
HO
1
2
11
18
8
25
26
23
1
3
7
19
18
10
12
16
14
Abbildung 6-10: Strukturformeln von Chlorothricin (R entspricht zwei mal D-Olivose und einer modifizierten Methylsalicylsäure, siehe Einleitung) und atrop-Abyssomicin C in einer Darstellungsweise, die die strukturelle Verwandtschaft der beiden Substanzen aufzeigt.
Diskussion
132
Chlorothricolid Abysomicin CChlorothricolid Abyssomicin CChlorothricolid Abysomicin CChlorothricolid Abyssomicin C
Abbildung 6-11: Röntgenstrukturen des Chlorothricin-Aglycons und von Abyssomicin C. (abgewandelt nach Bister, 2004). Der Pfeil zeigt auf den Ring der Tetronsäure.
In Abbildung 6-10 und Abbildung 6-11 sind eine Darstellungsweisen gewählt, bei denen die
Ähnlichkeit und die Unterschiede von Chlorothricin und Abyssomicin deutlich zu sehen sind.
Ähnlich sind die Spirotetronsäure mit dem Cyclohexan- bzw. Cyclohexenring, wobei neben
der zusätzlichen Etherbrücke zwischen C-12 und C-16 bei Abyssomicin auch die OH-Gruppe
(C-11 Abyssomicin) bzw. die Carboxygruppe (Chlorothricin) sofort ins Auge fällt. Die
Carboxygruppe des Chlorothricin stammt aus Propionat, das im späteren Verlauf der
Biosynthese oxidiert wird. Bei Abyssomicin wird hier stattdessen eine Acetat-Einheit
eingebaut. Gleich ist weiterhin die rechts unten angrenzende Propionateinheit (C-3, C-4 und
C-18 bei Abyssomicin), die in beiden Fällen als Keton erhalten bleibt. Links an den
Cyclohexan- bzw. –hexenring angrenzend folgen zwei weitere Acetateinheiten, die in beiden
Fällen zunächst eine Doppelbindung (C-8 und C-9 bei Abyssomicin) bilden, wobei beim
atrop-Abyssomicin C in Konjugation hierzu ein Keton steht (C-7), während der entsprechende
Kohlenstoff beim Chlorothricin gesättigt ist. Während beim Chlorothricin dann eine weitere
Acetateinheit folgt, wird beim atrop-Abyssomicin C eine Propionateinheit (C-5, C-6 und C-
19) eingebaut. Weiterhin fehlt dem atrop-Abyssomicin C der gesamte bizyklische Südteil des
Chlorothricins samt Glycosylierung. Bemerkenswert ist auch, dass die Konfiguration an der
Spirotetronsäure und am Cyclohexan- bzw. Cyclohexenring unterschiedlich sind.
In Abbildung 6-12 ist die Biosyntheseabfolge des Einbaus der Monomereinheiten graphisch
nochmals verdeutlicht. Beim Chlorothricin wird der lineare Vorläufer gebildet, indem
zunächst ein Acetat, dann ein Propionat, dann acht Acetate, ein Propionat, ein Acetat und am
Diskussion
133
Ende Enoylpyruvat aneinanderkondensiert werden, während atrop-Abyssomicin C aus vier
Acetaten, zwei Propionaten, einem Acetat und Enoylpyruvat synthetisiert wird. Der
Unterschied liegt also darin, dass der zweite Baustein im Falle des Chlorothricins ein
Propionat, im Falle des Abyssomicins ein Acetat ist, und dass sechs Acetateinheiten des
Chlorothricins durch eine Propionateinheit beim atrop-Abyssomicin C ersetzt sind. Genauere
Einblicke in die Biosynthese, vor allem auch bezüglich der Zyklisierung des linearen
Vorläufers und der Herkunft der Sauerstoffatome an C-11 und C-12 werden in Kürze durch
die Aufklärung des Biosynthesegenclusters und die Erzeugung entsprechender Mutanten
erwartet.
Acetat PropionatEnoyl-
pyruvatPropionat AcetatAcetat Acetat Acetat AcetatAcetatAcetatAcetat Acetat
Enoyl-
pyruvatPropionat AcetatAcetatAcetatAcetat Acetat Propionat
A)
B)
Acetat PropionatEnoyl-
pyruvatPropionat AcetatAcetat Acetat Acetat AcetatAcetatAcetatAcetat Acetat
Enoyl-
pyruvatPropionat AcetatAcetatAcetatAcetat Acetat Propionat
A)
B)
Abbildung 6-12: Schematische Darstellung des Einbaus von Acetat- und Propionateinheiten sowie von Enoylpyruvat bei A) Chlorothricin und B) atrop-Abyssomicin C.
Diskussion
134
6.3 Wirkung von atrop-Abyssomicin C als irreversibler Inhibitor von PabB
Die Untersuchung des Wirkmechanismus wurde auf drei Säulen aufgebaut: Zunächst wurde
ein einfaches Modellsystem (Mercaptoethanol, N-Acetyl-Cystein) gewählt, das mit atrop-
Abyssomicin C umgesetzt wurde, um herauszufinden, ob das Michaelsystem von Schwefel
nucleophil angegriffen wird. Desweiteren sollte eine Hemmkinetik von atrop-Abyssomicin C
mit ADC-Synthase durchgeführt werden. Schließlich wurde die kovalente Bindung von atrop-
Abyssomicin C an PabB untersucht.
Alle drei Versuchsreihen deuten darauf hin, dass 263Cys der Aminodesoxychorismat-Synthase
PabB kovalent von atrop-Abyssomicin C modifiziert wird. Bei der der Umsetzung von
N-Acetyl-Cystein mit atrop-Abyssomicin konnte mit NMR-Experimenten gezeigt werden,
dass eine Umlagerung zu einer Abyssomicin D-artigen Struktur stattfindet. Durch Inkubation
von atrop-Abyssomicin C mit PabB und anschließendem Verdau mit der Endoproteinase
GluC ließ sich der Ort der Modifikation auf 263Cys einschränken. Dies wurde durch MS/MS-
Experimente bestätigt. Die Kinetik der ADC-Synthase mit atrop-Abyssomicin C bestätigte
schließlich, dass es sich um irreversible Inhibition handelt. Die Hemmkonstanten konnten
bestimmt werden zu appiK = 390 µM und kinact = 0,8 min-1. Auf den ersten Blick mag app
iK
hoch erscheinen, versucht man doch im Bereich reversibler Inhibitoren Verbindungen mit
einem KI im niedrigen nanomolaren Bereich zu finden. Bei irreversiblen Inhibitoren jedoch
müssen Inhibitionskonstanten ganz anders bewertet werden. Bindet ein Molekül des
Inhibitors an das Enzym, wird es sich nicht wieder lösen. So kann auch bei hohen appiK -
Werten eine komplette Inaktivierung erreicht werden, wenn das Enzym dem Inhibitor lange
genug ausgesetzt ist.
Diskussion
135
6.3.1 Vergleich von atrop-Abyssomicin C mit literaturbekannten irreversiblen Inhibitoren
Vergleicht man die Werte appiK = 390 µM und kinact = 0,8 min-1 mit denen des bisher
potentesten beschriebenen irreversiblen Inhibitor der (E. coli) ADC-Synthase,
Fluorochorismat (Bulloch et al., 2004), die bei appiK = 130 µM und kinact = 1 min-1 liegen, so
sieht man, dass appiK etwa um einen Faktor drei höher ist, und kinact um 20 % niedriger ist. Mit
einem Verhältnis kinact/appiK = 0,0077 min-1µM-1 ist Fluorochorismat etwa drei bis vier mal
potenter als atrop-Abyssomicin C mit einem kinact/appiK = 0,0021 min-1µM-1. Angesichts der
Tatsache, dass Fluorchorismat strukturell dem Chorismat sehr ähnlich ist, ist es nicht
verwunderlich, dass Fluorchorismat insgesamt ein etwas besserer Inhibitor ist als atrop-
Abyssomicin C (Abbildung 6-13). Man kann sich leicht vorstellen, dass Fluorchorismat -
ähnlich dem Chorismat - besser in die Bindungstasche des Enzyms passt als atrop-
Abyssomicin C mit dem relativ großen Rest auf der Nord-Seite des Moleküls.
COOHO
COOH
OH
H
COOHO
COOH
OH
F
H3C CH3
O O
OO
O
CH3
OH
Abbildung 6-13: Strukturen von Chorismat, Fluorchorismat und (atrop-)Abyssomicin C.
Interessant ist weiterhin ein Vergleich des Wirkmechanismus von Fluorchorismat und atrop-
Abyssomicin C, der komplett unterschiedlich ist (Abbildung 6-14). Während beim atrop-
Abyssomicin eine Cysteinseitenkette (von PabB aus B. subtilis) nucleophil an der
Doppelbindung des Michaelsystems angreift, findet beim Fluorchorismat ein nucleophiler
Angriff einer Lysinseitenkette (von PabB aus E. coli) statt, und zwar an derselben Stelle, an
der normalerweise auch Chorismat von eben dieser Lysinseitenkette angegriffen wird. Im
Gegensatz zur Reaktion von Chorismat zu Aminodesoxychorismat folgt jedoch auf die
Elimination der OH-Gruppe nicht der nucleophile Angriff von NH3, der zur Abspaltung des
Enzyms führt, sondern das Fluor wird – vermutlich als HF – eliminiert, wobei das Enzym
kovalent gebunden bleibt und nicht mehr abgespalten werden kann. Somit handelt es sich bei
Fluorchorismat um einen Suicidinhibitor.
Diskussion
136
H3C CH3
O
HO
OO
O
CH3
HO
SCys
H3C CH3
HO O
OO
O
CH3
HO
CysS
H3C CH3
O O
OO
O
CH3
HO
CysSH
COO-
OH
O COO-
F
Lys-274
H2N COO-
O COO-
NH
Lys-274
F
COO-
O COO-
NH
Lys-274
Abbildung 6-14: Wirkmechanismus von atrop-Abyssomicin und Fluorchorismat im Vergleich.
Weitere Inhibitoren der ADC-Synthase von E. coli wurden 2006 von Dixon et al. im Rahmen
einer kombinatorischen Bibliothek synthetisiert und untersucht. Die Bibliothek war
folgendermaßen konzipiert: ein einfaches Chorismat-Analogon (Payload) wurde über Lysin
(Spacer) an einen variablen Rest (Combi) geknüpft. Die so erhaltenen Inhibitoren waren
allesamt reversible, kompetitive Inhibitoren der ADC-Synthase. Der stärkste Inhibitor, der
gefunden wurde (Abbildung 6-15), zeigte einen KI von 360 µM. Ein Vergleich dieses
reversiblen Inhibitors, dessen KI eine Dissoziationskonstante darstellt, mit dem irreversiblen
Inhibitor atrop-Abyssomicin C mit appiK =390 µM ist nur insofern zulässig, dass beide
Inhibitionskonstanten ein Maß für die Affinität des Inhibitors zum Enzym darstellen. Der
Hemmtyp unterscheidet sich, die Affinität der beiden Inhibitoren zur ADC-Synthase (für den
synthetischen Inhibitor L5 von E. coli, für atrop-Abyssomicin C von B. subtilis) liegt in der
gleichen Größenordnung.
Diskussion
137
OHN
O
COOH
HN
O
NH
O
NH2
CN
O
HO
NO2
Abbildung 6-15: Der kompetitive Inhibitor L5 der E. coli ADC-Synthase aus dem Screening
Programm von Dixon et al. (2006) mit einem KI von 360 µM.
Atrop-Abyssomicin C stellt also einen irreversiblen Inhibitor der ADC-Synthase von
B. subtilis dar, der in einer Größenordnung hemmt, die vergleichbar ist mit bekannten
Inhibitoren der ADC-Synthase von E. coli. Der potenteste bislang beschriebene Inhibitor ist
etwa um einen Faktor drei bis vier besser als atrop-Abyssomicin C. Da die ADC-Synthase
von B. subtilis im Rahmen dieser Arbeit erstmalig überexprimiert wurde, existieren keine
Literaturwerte zur Hemmung ADC-Synthase von B. subtilis.
Zur Einordnung der Hemmkonstanten in einen Gesamtzusammenhang scheint es dem Autor
sinnvoll, einen Vergleich zu bekannten irreversiblen Inhibitoren zu ziehen. Mit Sicherheit
einer der bedeutendsten irreversiblen Inhibitoren ist Acetylsalicylsäure (Handelsname
Aspririn). Aspirin hemmt die Prostaglandinsynthase durch Acetylierung eines bestimmten
Serinrests, 530Ser für Cycloogygenase-1 (COX-1) und 516Ser für Cyclooxygenase-2 (COX-2).
Rome und Lands ermittelten 1975 für die Fatty Acid Oxygenase (vermutlich handelt es sich
dabei um COX-1) die Inhibitionskonstanten KI = 14000 µM und kinact/KI = 0,0003 min-1µM-1.
Die Affinität zur Bindungsstelle ist also etwa 36 mal niedriger und insgesamt sind die
Inhibitionskonstanten etwa um einen Faktor 10 schlechter als die des atrop-Abyssomicin C.
Trotz dieser scheinbar schlechten Inhibitionskonstanten – wer will bestreiten, dass es sich bei
Aspirin um ein sehr gutes Medikament handelt? Neuere Inhibitionswerte zu Aspirin liegen
von Kalgutkar et al. (1998) für COX-2 vor, sie bestimmten das Verhältnis kinact/KI =
0,003 min-1µM-1. Von dieser Grundlage aus betrachtet ist atrop-Abyssomicin C immerhin
noch um 50 % potenter als Aspirin. Als zweites bekanntes Literaturbeispiel soll Penicillin
angeführt werden. Penicillin acyliert ein Serin im aktiven Zentrum von Penicillin-binding
proteins (PBPs). Lu et al. (2001) untersuchten die Wirkung von Penicillin G auf PBP2x aus
dem humanpathogenen Stamm Streptococcus pneumoniae, der Lungenentzündungen
Diskussion
138
verursacht. Da in diesem Fall keine Enzymreaktion stattfindet, wurde die Bindung von
Penicillin an PBP2x beobachtet. Daher wurden statt KI Kd und statt kinact k2 ermittelt: Kd =
0,9 mM, k2 = 180 s-1 und k2/Kd = 12 min-1µM-1 (Lu et al. 2001). Die Bindungsgeschwindigkeit
ist in diesem Falle mit k2 = 180 s-1 = 10800 min-1 extrem hoch, die Bindungsaffinität Kd =
900 µM ist jedoch verglichen mit atrop-Abyssomicin C etwa um einen Faktor zwei bis drei
niedriger.
Die für atrop-Abyssomicin C erhaltenen Inhibitionskonstanten sind also im Vergleich zu
irreversiblen Inhibitoren im Allgemeinen sowie zu Inhibitoren von PabB im Speziellen
durchaus konkurrenzfähig.
Diskussion
139
6.3.2 Vergleich von B. subtilis PabB mit PabB anderer Organismen und mit der Anthranilatsynthase
Vergleicht man die Proteinsequenz von PabB aus B. subtilis mit PabB aus anderen
Organismen (Abbildung 6-16), so fallen zwei Dinge auf: Die active site ist bei allen
betrachteten Organismen sehr ähnlich, und die wichtigste Aminosäure des aktiven Zentrums, 274Lys bei E. coli (He et al., 2004; He und Toney, 2006; Bulloch und Abell, 2006), die den
nucleophilen Angriff am Chorismat ausführt, ist konserviert. Einzig bei B. subtilis steht
anstelle eines Lysins ein Alanin. Dies ist sehr ungewöhnlich, da das aktive Zentrum der ADC-
Synthase streng konserviert ist.
E.coli ------------------------------------------------------------ S.venezuelae MRTLLIDNYDSFTHNLFQYIGEATGQPPVVVPNDADWSRLPVE-DFDAIVVSPGPGSPDR C.glutamicum1 MRVLIIDNYDSFTFNLATYVEEVTGQAPVVVPNDQEIDEM----LFDAVILSPGPGHAGV S.avermitilis MKTLLIDNYDSYTYNLFQLIAEVNGEEPVVVLNDAPPDDIPDLRDFANVVVSPGPGHPAK B.subtilis ------------------------------------------------------------ M.tuberculosis ----------------MGISCAVDGMAGLPIAFSGP--------RWLALLLQPLSGPPST E.coli ------------------------------------------------------------ S.venezuelae ERDFGISRRAITDSGLPVLGVCLGHQGIAQLFGGTVGLAPEPMHGRVSEVRHTGEDVFRG C.glutamicum1 AADFGICAGVIERARVPILGVCLGHQGIALAYGGDVDLAPRPVHGEVSQITHDGSGLFAG S.avermitilis RRDFGIVGELLAAAPVPVLGVCLGHQGIAAGERAWVTPAPEPRHGHLSTVRHNGQDLFEG B.subtilis ------------------------------------------------------------ M.tuberculosis SAKHTTTPSVLFLLLKTIATSRSHRASTSRGQRETALALAARTATPPGTETGAGHGLN-- E.coli ---------------MKTLSPAVITLLWRQDAAEFYFSRLSHLPWAMLLHSGYADHPY-- S.venezuelae LPSPFTAVRYHSLAATD-LPDELEPLAWSDDGVVMGLRHREKPLWGVQFHPESIGSDFGR C.glutamicum1 IPETFEAVRYHSMVATR-LPESLKATATSDDGLIMALAHEVLPQWGVQFHPESIGGQFGH S.avermitilis LPQQFTAVRYHSLSVREPLPLSLEPTAWAEDGVLMGLRHRSRPLWGVQFHPESVLTEFGH B.subtilis ---------------MAQRRPAGKKIPFQKDSFLQQFEKLAQSRKHHVLLESARGGRYS- M.tuberculosis -----------LAWELSTRTKSPRSHLRCENPQFCQARTVRIDRLGDLGGAPAVLRAVG- .: E.coli ------------------------------------------------------------ S.venezuelae EIMANFRDLALAHHRARRHGAD-------------------------------------S C.glutamicum1 QIIKNFLNLARTYR---------------------------------------------- S.avermitilis RMFVNFRELTASRARETRTAKARTSGTRTTEPPVRPPSPSAEGAGAAPAVLVPRPRRVAP B.subtilis ------------------------------------------------------------ M.tuberculosis ------------------------------------------------------------ E.coli ------SRFDIVVAEPICTLTTFG-----------------------KETVVSESEKRTT S.venezuelae PYELHVRRVDVLPDAEEVRRGCLPGEGTTFWLDSSSVLEGASRFSFLGDDRGPLAEYLTY C.glutamicum1 -WQLTEKTIPLSVDSAAVFETFFAHSSHAFWLDD------AQGTSYLGDASGPLARTKTH S.avermitilis SHRLHTRRIDVAVDAEAAFTRMYTDAPRAFWLDSSRVEEGQSRFSFFGDGTGPLAEFVRY B.subtilis ----------IAGLDPIATVKGKD-----------------------GITTIKHGDEMLF M.tuberculosis -----RATSRLDLPPPAALTGEWFG------------------------ALAVIAPSVSI : . E.coli TTDDP------------------LQVLQQVLDRADIRPTHNEDLPFQGGALGLFGYDLGR S.venezuelae RVADGVVSVRGSDGTTTRTRRPFFNYLEEQLERRRVPVAPELPFEFNLGYVGYLGYELKA C.glutamicum1 NVGEG----------------DFFTWLKEDLAAN--SVAPGQ--GFRLGWVGYVGYELKA S.avermitilis DVESGLCEIERPGRPVRKVRASVFDYLKRQLVTR-QVDATGLPFDFTGGYVGYFGYEVKA B.subtilis KEGDP------------------LRAFHSWFKTLETETNHEFP-DFQGGAIGFLSYDYAR M.tuberculosis QPVSG----------------------DDVFSGPPGTGGPDATGAVGGGWVGYLSYPDAG . . : . * :* ..* E.coli RFESLPEIAEQDIVLPDMAVGIYDWALIVDHQRHTVSLLSHNDVN-----ARRAWLESQQ S.venezuelae ETT---GDPAHRSPHPDAAFLFADRAIALDHQEGCCYLLALDRRG--HDDGARAWLRETA C.glutamicum1 EAG---ARAAHTSSLPDAHLIFADRAIAVESDQ--VRLLALGE----QDE----WFEETI S.avermitilis DCG---SVNRHRARTPDACWLFADRLIAVDHQDGATYAVCLAENTRQGAQQAADWLDAAM B.subtilis YIENFKMLSLDDLETPDIYFLVFDDIAVYDHQEESLWLITHVNGS-DQETADVKLSELEQ M.tuberculosis ADG-------RPHRIPEAAGGWTDCVLRR-DRDGQWWYESLSGAP------IADWLASAL *: *
Diskussion
140
E.coli FS--------------------PQEDFTLTSDWQSNMTREQYGEKFRQVQEYLHSGDCYQ S.venezuelae ETLTGLAVRAPAEPTPAMVFGIPEAAAGFGPLARARHDKDAYLKRIDECLKEIRNGESYE C.glutamicum1 KKLHNLVA--------------PRIPASGHLALQVRDSKDEYLDKIRRAQELITRGESYE S.avermitilis AQLSFVSSAKPTAPPR------PTAPRLDAVEPWLVRDRTTYLADIGTCKRELKDGTSYE B.subtilis MWLTELPAVTS-----------REMKPETAGSFAAPFTEDGFSQAVEKIKQYIASGDVFQ M.tuberculosis ATTRASVAR----------------PAPACRIDWEPADRAAHRDGVLACLEAIGAGEVYQ . . . . : * :: E.coli VNLAQRFHATYSGDEWQAFLQLNQANRAPFSAFLRLEQGAILSLSPERFILCDNS-EIQT S.venezuelae ICLTNMVTAPTEATALPLYSALRAISPVPYGALLEFPELSVLSASPERFLTIGADGGVES C.glutamicum1 ICLTTKLQGTTDVAPLAAYLALRGANPTAYGAYLQLGDTSILSSSPERFITIDSAGYVES S.avermitilis ICLTNAARLPAPYDPYDFYRVLRRLDPAPYAAYLRFGDLDVAGSSPERFLRITRDGVAEA B.subtilis VNLSIRQSQSLSVHPYQIYKTLREVNPSPYMAYLETPDFQIICGSPE-LLVSKKGKLLET M.tuberculosis ACVCTQFAGTVTGSPLDFFIDGFGRTAPSRSAFVAGPWGAVASLSPELFLRRRGS-VVTS : . : . * : : *** :: : E.coli RPIKGTLPRLPDPQEDSKQAVKLANSAKDRAENLMIVDLMRNDIGRVAVAGSVKVPELFV S.venezuelae KPIKGTRPRGGTAEEDERLRADLAGREKDRAENLMIVDLVRNDLNSVCAIGSVHVPRLFE C.glutamicum1 KPIKGTRPRGRTAQEDQEIIAELRSNPKDRAENLMIVDLVRNDLARGALPTTVKTSKLFD S.avermitilis RPVKGTAPRGERPEEDARLRDALTTDDKTRAENLVIVDLLRNDLGRVCRTGTVKVTRLMA B.subtilis RPIAGTRSRGKTNEEDEALANELIHNEKERAEHVMLVDLERNDLGRVSRYGSVRVNEFMA M.tuberculosis SPIKGTLPLDAPP-------SALRASAKEVAENIMIVDLVRNDLGRVAVTGTVTVPELLV *: ** . * * **::::*** ***: . :* . .:: E.coli VEPFPAVHHLVSTITAQLPEQLHASDLLRAAFPGGSITGAPKVRAMEIIDELEPQRRNAW S.venezuelae VETYAPVHQLVSTIRGRLRPGTSTAACVRAAFPGGSMTGAPKKRTMEIIDRLEEGPRGVY C.glutamicum1 VETYATVHQLVSTVSAELGP-RSPIECVRAAFPGGSMTGAPKLRTMEIIDELEAAPRGIY S.avermitilis TETCATVHQLVSTVEGRLREGIGAVDCVRVCFPGGSVTGAPKLRTMEIIDSLETEARGVY B.subtilis IEKYSHVMHIVSNVQGELQDGYDAVDIIHAVFPGGTITGAPKVRTMEIIEELEPTRRGLY M.tuberculosis VRPAPGVWHLVSTVSARVPLEEPMSALLDAAFPPASVTGTPKLRARQLISQWERYRRGIY . . * ::**.: ..: : . ** .::**:** *: ::*. * *. : E.coli CGSIGYLSFCGNMDTSITIRTLTAING-QIFCSAGGGIVADSQEEAEYQETFDKVNRILK S.venezuelae SGALGWFALSGAADLSIVIRTIVLADG-QAEFGVGGAIVSLSDQEEEFTETVVKARAMVT C.glutamicum1 SGGLGYFSLDGAVDLSMVIRTLVIQNN-HVEYGVGGALLALSDPEAEWEEIRVKSRPLLN S.avermitilis SGAIGYFGCSGGADLAIASRTAVFTDG-EMHLGAGGAIVLGSDPVGEYDEMLLKTAAPMR B.subtilis TGSIGWFGYNHDLQFNIVIRTIYATGG-QAFMQSGAGVVIDSVPKHEYKESFKKAFAMQR M.tuberculosis CGTVGLASPVAGCELNVAIRTVEFDTAGNAVLGVGGGITADSDPDAEWAECLHKAAPIVG * :* . : :. ** . *..: * *: * * E.coli QLEK------------------- S.venezuelae ALDGSAVAGAR------------ C.glutamicum1 LFG---VEFP------------- S.avermitilis AHRDRIAGLRPAARTLPLKEAVR B.subtilis ALELSEEETKIR----------- M.tuberculosis LPAATRTTPARLASKVR------
Abbildung 6-16: Sequenzvergleich von PabB aus E. coli, S. venezuelae, C. glutamicum, S.
avermitilis, B. subtilis und M. tuberculosis. Farblich markiert sind Cystein (gelb), die konservierten Aminosäuren der active site auf der Basis des E. coli-Enzyms (grün) und die Aminosäuren, die sich von der active site des E. coli-Enzyms unterscheiden (rosa).
Bei der Anthranilatsynthase der meisten Organismen ist 274Lys durch ein Alanin ersetzt (He et
al., 2004). Nach einer von He et al. (2004) aufgestellten Hypothese verlaufen die Reaktionen
der ADC-Synthase und der Anthranilatsynthase sehr ähnlich, wobei einer der entscheidenden
Unterschiede dadurch zustande kommt, dass die ADC-Synthase an Position 274 ein Lysin
trägt, während an der entsprechenden Stelle der Anthranilatsynthase ein Alanin steht. Bei der
ADC-Synthase greift zunächst 274Lys nucleophil an C-2 an. Hingegen findet der nucleophile
Angriff an C-2 bei der Anthranilatsynthase durch Ammoniak statt (Abbildung 6-17).
2-Amino-2-desoxychorismat reagiert bei der von der Anthranilatsynthase katalysierten
Reaktion sofort zu Anthranilat weiter. Die beiden Reaktionen, die bei der pABA-Synthese
von zwei Enzymen (ADC-Synthase und ADC-Lyase) katalysiert werden, werden im analogen
Diskussion
141
Fall der Anthranilatsynthese von der Anthranilatsynthase allein katalysiert. Das
Zwischenprodukt 2-Amino-2-desoxychorismat kann im Normalfall nicht isoliert werden
(Morollo und Bauerle, 1993). Vergleicht man die ADC-Synthase von B. subtilis mit der
Anthranilatsynthase, so fällt auf, dass das aktive Zentrum komplett identisch ist (Abbildung
6-18). Dies steht scheinbar in Widerspruch zu der von He et al. (2004) aufgestellten
Hypothese. Es darf jedoch vermutet werden, dass der Katalysemechanismus der ADC-
Synthase bei B. subtilis grundsätzlich nach demselben Mechanismus verläuft, und
möglicherweise eine andere Lysinseitenkette den nucleophilen Angriff auf C-2 des
Chorismats übernimmt. Dieser signifikante Unterschied des B. subtilis Enzyms zum E. coli
Enzym könnte auch die Ursache dafür sein, dass der Km für Chorismat bei der
ammoniumabhängigen Reaktion des B. subtilis Enzyms mit Km = 5 mM höher ist als der des
E. coli Enzyms, der in verschiedenen Publikationen von Km = 20 µM bis Km = 0,5 mM
variiert (Viswanathan et al., 1995, He et al., 2003, Dixon et al., 2006). Eine weitere denkbare
Ursache für den ungewöhnlich hohen Km-Wert ist, dass sich das artifizielle System, in dem
als Co-Substrat zu Chorismat Ammoniumsulfat verwendet wird anstelle von Glutamin, auf
die B. subtilis ADC-Synthase stärker auswirkt als auf die E. coli ADC-Synthase, deren Km-
Wert für Chorismat ebenfalls um einen Faktor fünf niedriger wird, wenn Glutamin statt
Ammoniumsulfat als Cosubstrat verwendet wird (Vishwanathan et al., 1995).
COO-
OH
O COO-
Lys
H2N COO-
O COO-
NH
LysCOO- H2N
Lys-274
NH3NH2
COO-
OH
O COO-
NH3 COO-
O COO-
NH2
COO-
NH2
a)
b)
Abbildung 6-17: Katalysemechanismus von ADC-Synthase (a) und Anthranilatsynthase (b).
TrpE 33 IQMIEKL--DREITYLLESKDDTSTWSRYSFIGLNPFLTIKEEQGRFSAADQDSKSLYTG 90
+Q EKL R+ LLES + RYS GL+P T+K + G + D G
PabB 19 LQQFEKLAQSRKHHVLLES----ARGGRYSIAGLDPIATVKGKDGITTIKHGDEMLFKEG 74
TrpE 91 NELKEVLNWMNTTYKIKTPELGIPFVGGAVGYLSYDMIPLIEPSVPSHTKETDMEKCMLF 150
+ L+ +W T + +T F GGA+G+LSYD IE + +
PabB 75 DPLRAFHSWFKTL-ETETNHEFPDFQGGAIGFLSYDYARYIENFKMLSLDDLETPDIYFL 133
Diskussion
142
TrpE 151 VCRTLIAYDHETKNVHFIQYARLTGEETKNEKMDVFHQNHL-ELQNLIEKMMDQKNIKEL 209
V + YDH+ +++ I + + +ET + K+ Q L EL + + M +
PabB 134 VFDDIAVYDHQEESLWLITHVNGSDQETADVKLSELEQMWLTELPAVTSREMKPE----- 188
TrpE 210 FLSADSYKTPSFETVSSNYEKSAFMADVEKIKSYIKAGDIFQGVLSQKFEVPIKADAFEL 269
+A S+ P + + F VEKIK YI +GD+FQ LS + + +++
PabB 189 --TAGSFAAP--------FTEDGFSQAVEKIKQYIASGDVFQVNLSIRQSQSLSVHPYQI 238
TrpE 270 YRVLRIVNPSPYMYYMKLLDREIVGSSPERLIHVQDGHLEIHPIAGTRKRGADKAEDERL 329
Y+ LR VNPSPYM Y++ D +I+ SPE L+ + LE PIAGTR RG EDE L
PabB 239 YKTLREVNPSPYMAYLETPDFQIICGSPELLVSKKGKLLETRPIAGTRSRGKTNEEDEAL 298
TrpE 330 KVELMKDEKEKAEHYMLVDLARNDIGRVAEYGSVSVPEFTKIVSFSHVMHIISVVTGRLK 389
EL+ +EKE+AEH MLVDL RND+GRV+ YGSV V EF I +SHVMHI+S V G L+
PabB 299 ANELIHNEKERAEHVMLVDLERNDLGRVSRYGSVRVNEFMAIEKYSHVMHIVSNVQGELQ 358
TrpE 390 KGVHPVDALMSAFPAGTLTGAPKIRAMQLLQELEPTPRETYGGCIAYIGFDGNIDSCITI 449
G VD + + FP GT+TGAPK+R M++++ELEPT R Y G I + G++ ++ I I
PabB 359 DGYDAVDIIHAVFPGGTITGAPKVRTMEIIEELEPTRRGLYTGSIGWFGYNHDLQFNIVI 418
TrpE 450 RTMSVKNGVASIQAGAGIVADSVPEAEYEESCNKAGALLKTIHIAED 496
RT+ G A +Q+GAG+V DSVP+ EY+ES KA A+ + + ++E+
PabB 419 RTIYATGGQAFMQSGAGVVIDSVPKHEYKESFKKAFAMQRALELSEE 465
Abbildung 6-18: Sequenzvergleich der Anthranilatsynthase TrpE und der ADC-Synthase PabB von B. subtilis. Farblich markiert sind: das Cystein aus PabB, an dessen Stelle bei TrpE Glycin steht (gelb), die konservierten Aminosäuren der active site auf der Basis des E. coli-Enzyms, die komplett identisch sind zwischen TrpE und PabB (grün) und der wichtigste Rest der active site des E. coli-Enzyms, das sowohl bei TrpE als auch bei PabB ein Alanin anstelle eines Lysins ist (rosa).
Die zweite Auffälligkeit beim Sequenzvergleich von PabB verschiedener Bakterienstämme
(Abbildung 6-16) betrifft 263Cys von B. subtilis, an dem die Bindung von atrop-Abyssomicin
C stattfindet. An dieser Stelle steht bei den meisten anderen Organismen ein Serin, dessen
Reaktion mit atrop-Abyssomicin C aufgrund der weitaus geringeren Nucleophilie eher
unwahrscheinlich ist. Denkbar ist, dass andere in der Nähe befindliche Cysteinseitenketten
von atrop-Abyssomicin C angegriffen werden könnten - die hier dargestellten Sequenzen
anderer Mikroorganismen verfügen jeweils über drei bis zwölf Cysteinseitenketten. Der
einzige Stamm, bei dem erwiesen ist, dass eine Wachstumshemmung durch atrop-
Abyssomicin eintritt, ist C. glutamicum. Bei E. coli konnte keine antibiotische Wirkung
festgestellt werden (Riedlinger et al., 2004). Dies mag darauf zurückzuführen sein, dass es
sich bei E. coli um einen Gram-negativen Organismus handelt, allerdings wurde auch bei E.
coli, dessen Zellwand durch Perforierung durchgängig gemacht wurde, keine antibiotische
Wirkung erzielt.
Abgesehen von der Inhibition der ADC-Synthase besteht auch die Wahrscheinlichkeit, dass
die antibiotische Wirkung des atrop-Abyssomicin C noch auf weiteren Mechanismen beruht.
Geplant ist in der Arbeitsgruppe derzeit eine Untersuchung der Wirkung von atrop-
Abyssomicin C auf das dritte Enzym der pABA-Biosynthese, PabC. Desweiteren besteht
Diskussion
143
Grund zur Annahme, dass neben der pABA-Biosynthese noch weitere Targets für atrop-
Abyssomicin C existieren. So beginnen beispielsweise Caco-2-Zellen, die bekanntermaßen
nicht über die Enzyme der pABA-Biosynthese verfügen, bereits bei einer Konzentration von
100 µM atrop-Abyssomicin C abzusterben (Dipl.-Biochem. Heiko Schadt, persönliche
Mitteilung). Angesichts der hohen Reaktivität von atrop-Abyssomicin C gegenüber
Nucleophilen ist anzunehmen, dass neben PabB eine Reihe von cysteinhaltigen Proteinen
kovalente Bindungen eingehen.
Diskussion
144
6.3.3 Überlegungen zum Resistenzmechanismus von Verrucosispora AB-18-032
Eine wichtige Rolle bei der Erforschung des Wirkmechanismus von atrop-Abyssomicin C
spielt die Frage nach der Selbstresistenz von Verrucosispora AB-18-032 gegen atrop-
Abyssomicin C. Es gibt drei Hauptwege, durch die sich Bakterien vor von ihnen produzierten
Antibiotika schützen (Hopwood, 2007): Die chemische Modifizierung des Antibiotikums
(Cundliffe, 1989), die Änderung der Zielstruktur sowie die Ausschleusung des Antibiotikums
aus dem Organismus. So verfügen Actinomyceten über einen ganzen Satz an Antibiotika-
modifizierenden Enzymen, durch die z.B. Aminoglycoside phosphoryliert, acetyliert oder
adenyliert werden können (Benveniste und Davies, 1973). Ein Beispiel für die Änderung der
Zielstruktur ist am Beispiel des Erythromycin-Produzenten verwirklicht. Dieser produziert ein
Enzym, das eine Methylgruppe an eine bestimmte Stelle der ribosomalen RNA hängt, so dass
das Ribosom unempfindlich gegenüber dem Inhibitor wird (Hopwood, 2007). Ein Beispiel für
den dritten Selbstschutzmechanismus liefern die Produzenten von Tetracyclinen. Diese
koppeln den Export des Antibiotikums mit einem Protonenimport (Hopwood, 2007). Egal,
mit welchem Selbstschutzmechanismus sich ein Antibiotika-Produzent schützt, allen gemein
ist, dass die Produktion des Antibiotikums erst erfolgt, wenn das Wachstum des Bakteriums
nachlässt und eine stationäre Phase erreicht. Die Steuerung der Aktivierung des
Selbsschutzmechanismus in Abhängigkeit von der Produktion des Antibiotikums ist komplex
(Bibb, 2005). Wichtig ist, dass die für die Resistenz erforderlichen Proteine in ausreichend
hoher Konzentration vorhanden sind, wenn die Biosynthese des Antibiotikums beginnt.
Für den Selbstschutz von Verrucosispora AB-18-032 gegen atrop-Abyssomicin C sind
mehrere Möglichkeiten denkbar. Neben der Ausschleusung von atrop-Abyssomicin C durch
spezifische Transporter aus dem Organismus ist auch die Selbstresistenz durch chemische
Modifizierung denkbar. Sowohl die Bildung von Abyssomicin H und D, die vermutlich durch
enzymatische Hydrierung entstehen, als auch die Bildung von Abyssomicin B und G durch
Aminierung und anschließende N-Oxidation könnten dem Zwecke des Selbstschutzes dienen,
da alle vier Abyssomicin-Derivate antibiotisch inaktiv sind, und bislang noch keine andere
biologische Funktion zugeordnet werden konnte. Weiterhin denkbar ist die reversible
Bindung an ein Protein. Auffällig bei Kultivierungen und Aufreinigungen von atrop-
Abyssomicin C ist, dass aus dem Kulturfiltrat direkt kein atrop-Abyssomicin C nachgewiesen
werden kann. Erst nach Ansäuern auf pH 4,0 und Extraktion mit Ethylacetat lässt sich atrop-
Abyssomicin C detektieren. Wird bereits isoliertes atrop-Abyssomicin C mit Kulturfiltrat
verdünnt, so ist es ebenfalls nicht nachweisbar. Bei gleicher Konzentration durch Verdünnung
mit Wasser oder Medium bleibt atrop-Abyssomicin C detektierbar. Als weitere Möglichkeit
Diskussion
145
schließlich bleibt die Modifizierung der Zielstruktur, der ADC-Synthase. So ist es einerseits
denkbar, dass PabB keine Cysteinseitenkette enthält, und somit keine Bindung von atrop-
Abyssomicin C möglich ist. Versuche, PabB aus Verrucosispora AB-18-032 zu klonieren
waren bislang noch nicht erfolgreich. Eine Schwierigkeit besteht in der großen Ähnlichkeit
von PabB zur Anthranilatsynthase TrpE. Aus dieser Schwierigkeit, PabB in Verrucosispora
AB-18-032 zu finden, ergibt sich eine weitere denkbare Möglichkeit. Porat et al. (2006)
beschrieben einen alternativen Weg für die pABA-Biosynthese, die nicht von Chorismat
ausgeht (siehe auch: Xie et al., 2003 und Gosset et al., 2001). Im Genom des Stammes
Methanococcus maripaludis kommen die Gene pabA, pabB und pabC nicht vor
(Hendrickson, 2004). Statt dessen erfolgt die Biosynthese von pABA auf einem alternativen
Weg ausgehend von 6-Desoxy-5-ketofruktose-1-phosphat (DKFP) und L-Aspartat-
semialdehyd. Das Genprodukt von aroA katalysiert die Reaktion von DKFP und L-Aspartat-
semialdehyd zu 2-Amino-3,7-didesoxy-D-threohept-6-ulosonat (ADTH), das in einer vom
Genprodukt von aroB katalysierten Reaktion zu 3-Dehydrochinonsäure (DHQ) wird. Daran
schließen sich 5 Reaktionen an, die schließlich zur pABA führen. Porat et al. (2006) schlagen
vor, dass diese Reaktionen von der 3-Dehydrochinat-Aminotransferase (1), der
4-Aminodehydroshikimat-Synthase (2), der 4-Aminoshikimat-Dehydrogenase (3), der
4-Aminoshikimat-Dehydratase (4) und der 4-Aminobenzoesäure-Synthase (5) katalysiert
werden (Abbildung 6-19).
OH
COO
NH3
O OH
HO COO
NH3
O OH
HO COO
NH3
O OH
COO
NH3
HO OH
COO
NH3
OH
COO
1 2 3
COO
O
H3N
CH2OP
HO
O
OH
O
DKFP L-Aspartat-semialdehyd
COO
HO
H3N
O
OHPyruvat
4 5
ADTH
DHQ
Abbildung 6-19: Von Porat et al. (2006) vorgeschlagener Biosyntheseweg von pABA, ausgehend von 6-Desoxy-5-ketofruktose-1-phosphat (DKFP) und L-Aspartat-semialdehyd, als Alternative zur von Chorismat ausgehenden pABA-Synthese.
Diskussion
146
6.4 Zusammenfassung und Ausblick
Im Rahmen dieser Arbeit gelang es, neben der Entdeckung neuer Mitglieder der
Abyssomicinfamilie wichtige Erkenntnisse zur Biosynthese und zum Wirkmechanismus zu
gewinnen. Durch Fütterung von markiertem Acetat, Propionat und Glucose gelang die
Zuordnung aller Kohlenstoffatome für atrop-Abyssomicin C. Auf der Basis dieser Ergebnisse
und durch Analogieschluss aus der Chlorothricin-Biosynthese konnte eine Hypothese zur
Abyssomicin-Biosynthese aufgestellt werden. Diese Hypothese wird derzeit durch die
Sequenzierung sowie durch die Generierung und Analytik von Knock-Out-Mutanten durch
Frau Mag. rer. nat. Elvira Gottardi und Frau Dipl.-Biol. Hanna von Suchodoletz überprüft. Im
Bereich des Wirkmechanismus konnte eine Zielstruktur von atrop-Abyssomicin C
identifiziert werden, die ADC-Synthase von B. subtilis, die von atrop-Abyssomicin C
irreversibel gehemmt wird. Ziel weiterer Arbeiten durch Herrn Dipl.-Biochem. Heiko Schadt
wird eine Co-Kristallisation von atrop-Abyssomicin C mit ADC-Synthase sein. Desweiteren
sollen Untersuchungen zum Resistenzmechanismus durchgeführt werden, zum einen durch
die Generierung und Evaluierung einer 263Cys->Ala-Mutante von PabB, zum anderen durch
die Analyse der an der pABA-Biosynthese beteiligten Enzyme des Abyssomicin-Produzenten
Verrucosispora AB-18-032. Da die Vermutung nahe liegt, dass die ADC-Synthase nicht das
einzige Target von atrop-Abyssomicin C ist, wird der Fokus weiterer Arbeiten darauf liegen,
zusätzliche Angriffsorte von atrop-Abyssomicin C zu identifizieren.
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Abbildungsverzeichnis
157
8 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1-1. Struktur der Tetrahydrofolsäure........................................................................ 2 Abbildung 1-2. Schritte der Purinbiosynthese, an denen THF beteiligt ist. GAR =
Glycinamid-β-D-ribofuranosyl-5’-monophosphat; FGAR = Formylglycinamid-β-D-ribofuranosyl-5’-mono-phosphat; GAR TFase = Glycinamidribonucleotid Transformylase; AICAR = 5-Amino-4-imidazolcarboxamid-β-1-D-ribofuranosyl-5’-monophosphat; FAICAR = 1’-[(5-Formylamino)-4-(aminocarbonyl)-1-imidazolyl]-β-D-ribofuranosyl-5’-monophosphat; AICAR TFase = 5-Amino-4-imidazolcarboxamid-ribonucleotid Transformylase ............................................................................................ 3
Abbildung 1-3. Die Biosynthese von dTMP aus dUMP durch Thymidylat-Synthase. Alle drei Wasserstoffatome der Methylgruppe stammen von N5,N10-Methylentetrahydrofolat (grau hinterlegt). Deshalb muss das bei der dTMP-Biosynthese entstehende 7,8-Dihydrofolat durch Dihydrofolat-Reduktase wieder zu Tetrahydrofolat reduziert werden. Der mit Glutamat verknüpfte para-Benzoylrest des Tetrahydrofolats ist in der Abbildung mit R bezeichnet........................................................................................................................... 4
Abbildung 1-4. Struktur von Sulfanilamid, dem antibiotisch wirksamen Metaboliten des Prontosils............................................................................................................................ 5
Abbildung 1-5. Die Tetrahydrofolatbiosynthese und bekannte Inhibitoren. ............................ 6 Abbildung 1-6. Struktur des Folsäureantagonisten Methotrexat. .............................................. 7 Abbildung 1-7. Strukturformeln der Abyssomicine B, C und D. .............................................. 7 Abbildung 1-8: Röntgenstrukturen von Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C. ................ 9 Abbildung 1-9: UV-Spektren von Abyssomicin C (links) und atrop-Abyssomicin C (rechts). 9 Abbildung 1-10. Biosynthesewege wichtiger Stoffwechselprodukte, die von Chorismat
ausgehen. .......................................................................................................................... 12 Abbildung 1-11. Genorganisation des Folat-Operons. Die Richtung der Transkription ist von
links nach rechts. Die kodierenden Sequenzen sind durch Pfeile gezeigt, die Zahlen bezeichnen die Position der ersten Base des Startcodons ATG und der letzten Base des Stoppcodons. Oberhalb des Folat-Operons sind die vier möglichen Transkripte eingezeichnet. ................................................................................................................... 13
Abbildung 1-12. Ausschnitt aus der Folsäurebiosynthese. Unter den Enzymen sind jeweils die codierenden Gene aufgeführt, dabei sind die Gene aus dem Folat-Operon grau hinterlegt........................................................................................................................................... 14
Abbildung 1-13. Die katalytische Triade von Glutamin-Amidotransferasen. Der Cysteinrest greift nucleophil am Glutamin an, der Histidinrest wirkt als Protonendonor bei der Hydrolysereaktion, und der Glutamatrest stabilisiert das protonierte Histidin. ............... 15
Abbildung 1-14. Möglicher Mechanismus von PabB nach Kozlowski et al. Die Reaktion verläuft über eine sequenzielle 1,3-Substitution unter Retention der Position und der Stereochemie. In Version A erfolgt der nucleophile Angriff durch eine Aminosäure des Enzyms, in Version B durch die Enolpyruvyl-Seitenkette. Weiterhin könnte auch Wasser als Nucleophil dienen (nicht dargestellt).......................................................................... 16
Abbildung 1-15. Bändermodell von PabB aus E. coli. Die Kristalle wurden in Ameisensäure gezüchtet. Im Kalottenmodell dargestellt sind ein Molekül Ameisensäure und ein Molekül Tryptophan, das möglicherweise stabilisierende Funktion besitzt (Parsons et al., 2002)................................................................................................................................. 17
Abbildung 1-16: Überlagerung der Kristallstrukturen der ADC-Synthase (grau) und der Anthranilatsynthase (rosa) von E. coli. Das grüne Atom ist Magnesium, die Zahlen beziehen sich auf die ADC-Synthase. (Quelle: He et al, 2004)....................................... 18
Abbildung 1-17: Ausschnitt aus dem Alignment der PabB Sequenz von B. subtilis und E. coli........................................................................................................................................... 18
Abbildungsverzeichnis
158
Abbildung 1-18. Bändermodell des PabC-Homodimers mit dem Cofaktor PLP. Eine der Untereinheiten ist in grau dargestellt, die große und kleine Domäne der anderen Untereinheit sind in weiß bzw. schwarz abgebildet (Nakai et al., 2000)......................... 19
Abbildung 1-19. Mechanismus von PabC nach Nakai et al.. Aminodesoxychorismat bildet eine Schiff-Base mit PLP, wodurch ein katalytisch aktives Lysin frei wird, das eine Wasserstoffbrücke mit einem Threoninrest ausbildet. Die neutrale Aminogruppe des Lysins eliminiert ein Proton des ADC, wodurch ein chinoides PLP-Zwischenprodukt entsteht. Nun kann nach Rearomatisierung des Cofaktors Pyruvat abgespalten werden, wobei ein Proton von Threonin auf den olefinischen Teil des ADC übertragen wird.. 21
Abbildung 1-20. Pseudo-diäquatoriale und pseudo-diaxiale Konformation von Chorismat in wässriger Lösung im Vergleich zur Struktur von Abyssomicin C................................... 22
Abbildung 1-21. Michael-Addition eines Nucleophils an Abyssomicin C.............................. 22 Abbildung 1-22: Schematische Darstellung der Erythromycin Polyketidsynthase. ................ 25 Abbildung 1-23: Synthese des C-3 Bausteins der Tetronsäureeinheit aus einem
Glykolyseintermediat durch die Proteine ChlD1, ChlD2, ChlD3 und ChlD4. ................ 27 Abbildung 1-24: Biosyntheseweg des Chlorothricins nach Jia et al. ....................................... 28 Abbildung 2-1: Schematische Darstellung des ESI-Prozesses. Quelle: Bioanalytik.
(Lottspeich, F. und Zorbas, H.(Hrsg.)) Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg-Berlin 1989. S. 349........................................................................................ 29
Abbildung 2-2: Schematische Abbildung der TurboIon Quelle der QTrap 2000. Quelle: W.M.A. Niessen, J. Chromatogr. A 856 (1999) 179 –197............................................... 32
Abbildung 2-3. Fragmentierung von Peptiden (Nomenklatur nach Roepstorff und Fohlmann, 1984). Die Fragmente, die durch Bindungsbruch entstehen können, sind unten angegeben. Modifiziert nach Eckerskorn (1998). ............................................................ 34
Abbildung 2-4. Zeitskalen von zweidimensionalen NMR-Experimenten. .............................. 35 Abbildung 2-5. Pulssequenz für das H,H-COSY..................................................................... 36 Abbildung 2-6. Pulsprogramm für das TOCSY-Experiment. MLEV-17 ist die Form des Spin-
Locks im TOCSY-Experiment. ........................................................................................ 38 Abbildung 4-1. Schematische Darstellung des Plasmids PrSet_6His_PP. Eingezeichnet sind
neben den Restriktionsschnittstellen der Hexa-His-Tag, die Erkennungssequenz der Prescission Protease, die Promotorregion Φ10 und das für die Ampicillinresistenz verantwortliche β-Lactamasegen bla. .............................................................................. 57
Abbildung 4-2. Biosynthese von Aminodesoxychorismat (ADC) aus Chorismat durch das Enzym ADC-Synthase ..................................................................................................... 70
Abbildung 4-3: Chromatogramm des MRM 226/191 mit integriertem ADC-Peak. ............... 74 Abbildung 5-1: Röntgenstrukturen von Abyssomicin C und atrop-Abyssomicin C. .............. 75 Abbildung 5-2: UV-Spektren von Abyssomicin C (links) und atrop-Abyssomicin C (rechts).
.......................................................................................................................................... 76 Abbildung 5-3: 13C-Übersichtsspektrum von atrop-Abyssomicin C in MeOD. ...................... 76 Abbildung 5-4: 13C-Übersichtsspektrum von Abyssomicin C. Mit freundlicher Genehmigung
von Dr. Bojan Bister aus „Abyssomicin C- ein neues Antibiotikum aus dem marinen Micromonospora-Stamm AB-18-032 als Inhibitor der p-Aminobenzoesäure/Tetrahydrofolat-Biosynthese – Isolierung und Strukturaufklärung“ 77
Abbildung 5-5: Abyssomicin B und C im Vergleich. .............................................................. 79 Abbildung 5-6: 1H-Übersichtsspektrum von Abyssomicin B in MeOD.................................. 80 Abbildung 5-7: 13C-Übersichtsspektrum von Abyssomicin B in MeOD................................. 80 Abbildung 5-8: Ausschnitt aus dem HMBC-Spektrum von Abyssomicin B in MeOD .......... 81 Abbildung 5-9: a) HPLC-DAD Chromatogramm von Abyssomicin B (RT = 5,13 min) und B’
(RT = 5,32 min); b) UV-Spektren von Abyssomicin G (links) und B (rechts)............... 83 Abbildung 5-10. Hypothese zur Struktur von Abyssomicin B’. Die vermuteten
Gleichgewichtstautomere des Isoxazolinrings sind in Klammern gefaßt. (Mit
Abbildungsverzeichnis
159
freundlicher Genehmigung von Dr. Bojan Bister aus „Abyssomicin C- ein neues Antibiotikum aus dem marinen Micromonospora-Stamm AB-18-032 als Inhibitor der p-Aminobenzoesäure/Tetrahydrofolat-Biosynthese – Isolierung und Strukturaufklärung“).......................................................................................................................................... 84
Abbildung 5-11: LC-MS Chromatogramm (XIC 378) des Ethylacetatextrakts. Die Spektren zu den Retentionszeiten 4,76 min (Abyssomicin B) und 5,00 min (Abyssomicin G) sind ebenfalls abgebildet. Beide Substanzen zeigen ein [M+H]+ Signal bei m/z = 378,4 sowie ein [M+Na]+ Signal bei m/z = 400,3. ............................................................................... 84
Abbildung 5-12: ESI-FT-ICR-Massenspektrum von Abyssomicin G. .................................... 86 Abbildung 5-13: HMQC-Spektrum von Abyssomicin G ........................................................ 87 Abbildung 5-14: Ausschnitt aus dem HMBC-Spektrum von Abyssomicin G in MeOD.
Abgebildet ist der Bereich von 0,8 bis 4 ppm im 1H und von 205 bis 218 ppm im 13C (Bereich des C-7). ............................................................................................................ 88
Abbildung 5-15: Abyssomicin B und G im Vergleich............................................................. 88 Abbildung 5-16: HPLC-DAD Chromatogramm von Abyssomicin H (RT = 5,24 min),
Abyssomicin B, G und C sowie das UV-Spektrum von Abyssomicin H. ....................... 90 Abbildung 5-17: LC-MS Chromatogramm (XIC 349) des Ethylacetatextrakts. Die Spektren
zu den Retentionszeiten 5,66 min (Abyssomicin H) und 7,15 min (Abyssomicin D) sind ebenfalls abgebildet. Beide Substanzen zeigen ein [M+H]+ Signal bei m/z = 349,4 bzw. 349,3. ................................................................................................................................ 91
Abbildung 5-18: : 13C-Übersichtsspektrum von Abyssomicin H in DMSO............................ 91 Abbildung 5-19: (atrop-) Abyssomicin C und Abyssomicin H im Vergleich. ........................ 92 Abbildung 5-20: HPLC-MS (oben) und HPLC-DAD (unten) Chromatogramm des
Ethylacetatextrakts des Kulturfiltrats von Verrucosispora AB-18-032. Markiert sind Amino- und Hydroxylaminoabyssomicin mit den Retentionszeiten 4,1 bzw. 5,4 min. .. 94
Abbildung 5-21: Strukturformeln des Hydroxylamino- und des Aminoabyssomicins............ 95 Abbildung 5-22: Extrahierter Ionenstrom von m/z = 364 des synthetisch erzeugten
Aminoabyssomicin mit dazugehörigem Massenspektrum. Die Retentionszeit (4,1 min) entspricht dem natürlichen Aminoabyssomicin. .............................................................. 95
Abbildung 5-23: Extrahierter Ionenstrom von m/z = 380 des synthetisch erzeugten Hydroxylaminoabyssomicin mit dazugehörigem Massenspektrum. Die Retentionszeit (5,4 min) entspricht dem natürlich vorkommenden Hydroxylaminoabyssomicin........... 96
Abbildung 5-24: Strukturformel eines Abyssomicindimers. ................................................... 96 Abbildung 5-25: Strukturformel von Netropsin, Distamycin und Proximicin C, vormals
Abyssomicin A. ................................................................................................................ 97 Abbildung 5-26: Strukturformeln der bisher charakterisierten Abyssomicine B, C, D, G, H
und atrop-Abyssomicin C................................................................................................. 98 Abbildung 5-27: UV-Spektren der bisher vollständig charakterisierten Abyssomicine im
Vergleich. ......................................................................................................................... 99 Abbildung 5-28: 13C Spektrum von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1-13C-Acetat.
Deutlich sichtbar ist die Markierung von C-1 (171,4 ppm), C-7 (204,2 ppm), C-9 (140,8 ppm), C-11 (67,6 ppm) und C-13 (26,3 ppm)................................................................ 100
Abbildung 5-29: Einbau von 1-13C-Acetat in atrop-Abyssomicin C ..................................... 101 Abbildung 5-30: 13C-Übersichtsspektrum von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1,2-
13C-Acetat....................................................................................................................... 101 Abbildung 5-31: Ausschnitt aus dem 13C-Spektrum (120 ppm – 150 ppm, C-8 und C-9) von
atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1,2-13C-Acetat. Gut zu sehen ist die Aufspaltung in Tripletts, bedingt durch die Kopplung der benachbarten 13C aus der Acetateinheit. Zu beachten ist hier jedoch, dass die Kopplung zwischen C-7 und C-8 sowie zwischen C-9 und C-10 erfolgt. ........................................................................... 102
Abbildung 5-32: Einbau von 1,2-13C-Acetat in atrop-Abyssomicin C .................................. 103
Abbildungsverzeichnis
160
Abbildung 5-33: 13C Spektrum von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1-13C-Propionat. Deutlich sichtbar ist die Markierung von C-3 (201,7 ppm) und C-5 (39,7 ppm). .............................................................................................................................. 103
Abbildung 5-34: Einbau von 1-13C-Propionat (rot, graue Kreise) und 1,2-13C-Acetat (grün, schwarze Quadrate) in atrop-Abyssomicin C................................................................. 104
Abbildung 5-35: 13C-Übersichtsspektrum von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1,2-13C-Glucose. ................................................................................................................... 105
Abbildung 5-36: Ausschnitt aus dem 13C-Spektrum (C-15) von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1,2-13C-Glucose. Die Aufspaltung in Tripletts, bedingt durch die Kopplung der benachbarten 13C-15 und 13C-14, beweist, dass hier C-1 und C-2 der Glucoseeinheit eingebaut wurden. ................................................................................. 105
Abbildung 5-37: Ausschnitt aus dem 13C-Spektrum (C-14) von atrop-Abyssomicin C nach Fütterung von 1,2-13C-Glucose. Die Aufspaltung in Tripletts, bedingt durch die Kopplung der benachbarten 13C-15 und 13C-14, beweist, dass hier C-1 und C-2 der Glucoseeinheit eingebaut wurden. ................................................................................. 106
Abbildung 5-38: Biosynthese des Vorläufers der 3-Kohlenstoff-Einheit der Tetronsäure aus Glucose unter Berücksichtigung der 13C-Markierug und deren Verbleib im Vorläufer.106
Abbildung 5-39: Einbau von 1-13C-Propionat (rot, graue Kreise), 1,2-13C-Acetat (grün, schwarze Quadrate) und 1,2-13C-Glucose (blau, gestreifte Fünfecke) in atrop-Abyssomicin C. .............................................................................................................. 107
Abbildung 5-40: Plasmid pT7-7 mit pabA aus B.subtilis. Darunter die Nucleotid- und die Aminosäuresequenzen.................................................................................................... 108
Abbildung 5-41: Plasmid PrSet_6His_PP mit pabB aus B. subtilis. Darunter die Nucleotid- und die Aminosäuresequenz........................................................................................... 109
Abbildung 5-42. PabA nach Reinigung. M: Protein Marker; A: gereinigtes PabA, 21,4 kDa......................................................................................................................................... 110
Abbildung 5-43: PabB nach Reinigung. ................................................................................ 111 Abbildung 5-44: Bildung von Abyssomicin H und D durch Umsatz von atrop-Abyssomicin C
mit NaBH4 (oben) sowie die mögliche Bildung zweier N-Acetylcystein-Abyssomicin-Addukte. ......................................................................................................................... 112
Abbildung 5-45: Strukturformeln von Abyssomicin D sowie den Mercaptoethanol- und N-Acetylcysteinaddukten von atrop-Abyssomicin C. ........................................................ 113
Abbildung 5-46: Ausschnitt aus dem HMBC-Spektrum des N-Acetylcystein-Abyssomicin im 13C-Bereich von ca. 75 bis 95 ppm mit C-15 (88,0 ppm) und C-16 (86,3 ppm)............ 113
Abbildung 5-47: Mechanismus der Umsetzung von N-Acetylcystein mit atrop-Abyssomicin C. .................................................................................................................................... 113
Abbildung 5-48: HPLC-MS Chromatogramm der Peptide aus dem GluC-Verdau von PabB (oben) und PabB + atrop-Abyssomicin C (unten). Mit dem Pfeil markiert ist das zusätzlich auftretende Peptid von m/z = 827 bei der Retentionszeit 31 min.................. 115
Abbildung 5-49: MS/MS Spektrum des Peptids m/z = 827. .................................................. 116 Abbildung 5-50: pH-Wert- und Temperaturabhängigkeit der ADC-Synthase ...................... 117 Abbildung 5-51: Bestimmung des KM-Wertes der ADC-Synthase ....................................... 117 Abbildung 5-52: Enzyminaktivierung der ADC-Synthase durch atrop-Abyssomicin in
Abhängigkeit von der Präinkubationszeit und der Inhibitorkonzentration. ................... 120 Abbildung 5-53: Plot der Geschwindigkeitskonstante kobs gegen die Inhibitorkonzentration.
........................................................................................................................................ 121 Abbildung 6-1. Hypothese zur Biosynthese von Abyssomicin G und B via Michaeladdition
von Ammoniak und anschließender Oxidation, vermutlich durch eine Monooxygenase (Weg A) oder alternative via Michaeladdition von Hydroxylamin (Weg B) an abyssomicin C / atrop-abyssomicin C............................................................................ 123
Abbildungsverzeichnis
161
Abbildung 6-2: Von Townsend vorgeschlagener Mechanismus zur Biosynthese eines N-Oxims. ............................................................................................................................ 124
Abbildung 6-3: Hypothese zur Biosynthese der Abyssomicine D und H. Die erste Möglichkeit ist die Michaeladdition eines Hydrogenäquivalents (vermutlich NADPH) an Abyssomicin C / atrop-Abyssomicin C, im Falle von Abyssomicin D gefolgt von einer Umlagerung (Weg A). Denkbar, wenn auch weniger wahrscheinlich wäre die Synthese von Abyssomicin H durch eine fehlfunktionierende Enoylreduktase eines PKS-Moduls der Abyssomicinbiosynthese.......................................................................................... 125
Abbildung 6-4: Einbau von 1-13C-Propionat (rot, graue Kreise), 1,2-13C-Acetat (grün, schwarze Quadrate) und 1,2-13C-Glucose (blau, gestreifte Fünfecke) in atrop-Abyssomicin C. .............................................................................................................. 129
Abbildung 6-5: Hypothese zum Aufbau der Abyssomicin-Polyketidsynthase auf der Basis der Fütterungsversuche und des Chlorothricinbiosyntheseclusters...................................... 129
Abbildung 6-6: Hypothese zur Biosynthese des linearen Vorläufers von atrop-Abyssomicin C auf der Basis der Fütterungsversuche (schwarze Quadrate: Acetat, graue Kreise: Propionat, gestreifte Fünfecke: Enoylpyruvat aus Glucose). ......................................... 130
Abbildung 6-7: Hypothese zur Zyklisierung des linearen Vorläufers analog zur Chlorothricin-Biosynthese. ................................................................................................................... 131
Abbildung 6-8: Strukturformeln von Chlorothricin und Abyssomicin in einer Darstellungsweise, die die Analogie der beiden Substanzen aufzeigt. .......................... 131
Abbildung 6-9: Schematische Darstellung des Einbaus von Acetat- und Propionateineheiten sowie von Enoylpyruvat bei A) Chlorothricin und B) Abyssomicin. ............................ 133
Abbildung 6-10: Strukturen von Chorismat, Fluorchorismat und (atrop-) Abyssomicin C. . 135 Abbildung 6-11: Wirkmechanismus von atrop-Abyssomicin und Fluorchorismat im
Vergleich. ....................................................................................................................... 136
Tabellenverzeichnis
162
9 Tabellenverzeichnis Tabelle 1-1. Antibakterielles Spektrum von Abyssomicin C. Angegeben sind die Hemmhöfe
des Plattendiffusionstests in mm bei Verwendung von Komplexmedium (Riedlinger et al., 2004). ........................................................................................................................... 8
Tabelle 4-1. LC-MS Routinegradient....................................................................................... 59 Tabelle 4-2. LC-DAD Routinegradient.................................................................................... 59 Tabelle 4-3. HPLC-Säulen. ...................................................................................................... 60 Tabelle 4-4. Präparative HPLC-Säule. ..................................................................................... 60 Tabelle 4-5. Gradienten der präparativen HPLC-MS-Läufe.................................................... 61 Tabelle 4-6. Gradient zur Analyse des GluC-Verdaus............................................................. 70 Tabelle 4-7. LC-MS Gradient für MRM.................................................................................. 71 Tabelle 4-8. HPLC-Säulen. ...................................................................................................... 71 Tabelle 4-9. Parameter des Massenspektrometers zum MRM................................................. 72 Tabelle 5-1: 1H und 13C-NMR-chemische Verschiebungen von atrop-Abyssomicin C und
Abyssomicin C in MeOD................................................................................................. 78 Tabelle 5-2: 1H und 13C-NMR-chemische Verschiebungen von Abyssomicin B in MeOD und
DMSO .............................................................................................................................. 82 Tabelle 5-3: 1H und 13C-NMR-chemische Verschiebungen von Abyssomicin G in MeOD ... 89 Tabelle 5-4: 1H und 13C-NMR-chemische Verschiebungen von Abyssomicin H in MeOD und
DMSO .............................................................................................................................. 93 Tabelle 5-5: [M+H]+, Summenformel, Retentionszeit auf der Analytischen HPLC sowie die
chemischen Verschiebungen von C-8 und C-9 als herausragende Unterscheidungsmerkmale der bisher charakterisierten Abyssomicine........................... 98
Tabelle 5-6: NMR Daten von Abyssomicin D, dem Abyssomicin-Mercaptoethanol Addukt und dem Abyssomicin-N-acetylcysteine Addukt (in MeOD[D4], 298 K) .................... 114
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Danksagung
Bei Prof. Dr. Roderich Süßmuth möchte ich mich herzlich bedanken für die Überlassung des
interessanten Themas, für die Möglichkeit, selbstständig zu arbeiten und für sein
unerschöpfliches Vertrauen in mich.
PD Dr. Ullrich Keller danke ich für interessante und anrengende Diskussionen.
Prof. Dr. Volkmar Braun und Frau Dr. Silke Patzer danke ich für das Bereitstellen eines
Arbeitsplatzes zu Tübingener Zeiten und für die Möglichkeit, dort molekularbiologische
Arbeiten durchzuführen.
Prof. Dr. Hans-Peter Fiedler und seiner Arbeitsgruppe danke ich für die hervorragende
Kooperation.
Herrn Ingo Ortel danke ich für die Hilfe und Unterstützung bei der Aufreinigung der Proteine.
Herrn Dr. Reinhard Zeisberg, Herrn Paul Schuler und Dr. Peter Schmieder danke ich für viele
gute Tipps bei den NMR-Messungen.
Frau Kathrin Schneider danke ich für die gute und erfolgreiche Zusammenarbeit bei mehreren
Projekten und für viele hilfreiche Diskussionen rund um die Strukturaufklärung.
Bei Falko Wolter bedanke ich mich für die Synthese von Naturstoffen für einige Projekte und
für unzählige Tipps und Informationen zum Thema Organische Chemie
Elvira Gottardi und Hanna von Suchodoletz danke ich für die gute und sehr produktive
Zusammenarbeit bei den Arbeiten zur Aufklärung der Abyssomicin-Biosynthese.
Allen Praktikanten, die an dem Projekt mitgewirkt haben, danke ich für ihre Hilfe, besonders
hervorheben möchte ich Louise Aigran, die drei Monate lang sehr gute Arbeit geleistet hat.
Den „Massenspektrometrikern“ der Gruppe, Diane Butz, Timo Schmiederer und Kathrin
Schneider danke ich für die gute Zusammenarbeit an der QTrap, für ihr Verständnis und ihre
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Kooperationsbereitschaft, insbesondere für die Möglichkeit, in den letzten Monaten dieser
Arbeit quasi ständig das MS blockieren zu dürfen.
Allen Kollegen aus dem Süßmuth-Labor möchte ich danken: Dr. Stefan Weist, Dr. Bojan
Bister, Dr. Marcelo Bertasso, Dr. Andreas Reicke, Suada Turkanovic, Heiko Schadt, Kathrin
Schneider, Falko Wolter, Diane Butz, Timo Schmiederer, Elvira Gottardi, Stefan Pohle,
Hanna von Suchodoletz, Dr. Christian Appelt, Frank Dettner, Dr. Sven Feifel, Carolin
Schlosser, Maik Henkel, Georg Sambeth, Anne Hänchen, Dr. Walter Affo, Pierre-Henri
Berriere.
Meinen Kommilitonen danke ich für schöne gemeinsame Studienzeit, insbesondere für die
großartigen Tage im Winter auf der Hütte im Schwarzwald, für’s sommerliche Zelten am
Bodensee und die Wandertouren in den Dolomiten.
Bei meiner Freundin Leah Herrgen bedanke ich mich für die ihre Freundschaft über die
gemeinsame Studienzeit und über die Distanz Berlin-Köln hinaus.
Meinem Freund Heiko Schadt danke ich für seine Unterstützung und Hilfe, für viele gute
Ideen, und für unsere wunderschöne gemeinsame Zeit in Tübingen und Berlin!
Meiner lieben Großmutter danke ich für ihre Unterstützung.
Meinem Bruder Michael danke ich für seelisch-moralische Unterstützung (und dafür, dass er
mir als permanent bis in die frühen Morgenstunden lernender Pharmaziestudent immer wieder
vor Augen geführt hat, dass ich es trotz Promotionsstress und viel Arbeit eigentlich doch ganz
gut habe…).
Nicht zuletzt möchte ich meinen lieben Eltern danken für ihr Vertrauen und für die
bedingungslose Unterstützung zu jeder Zeit meines Lebens, insbesondere während meines
Studiums und meiner Promotion!
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Lebenslauf
Schulbildung
Grundschule Ochsenhausen 09/1986 – 07/1990 Gymnasium Ochsenhausen 09/1990 – 06/1999 Abitur Studium
Universität Tübingen 10/1999 – 07/2004 Studium der Biochemie Diplomprüfung 03/2003 ● Organische Chemie (2. Hauptfach) 09/2003 ● Immunologie (Wahlfach) 11/2003 ● Biochemie (1. Hauptfach) 11/2003 – 07/2004 Diplomarbeit Arbeitsgruppe PD Dr. Roderich Süßmuth Überexpression der β-Untereinheit der Aminodesoxychorismatsynthase PabA aus Bacillus subtilis Universität Tübingen Dissertation seit 07/2004 Arbeitsgruppe Prof. Dr. Roderich Süßmuth Technische Universität Berlin seit 07/2005
Boehringer Ingelheim Post-Doc Pharma GmbH und Co. KG seit 02/2007