UOC Anatomia Patologica Azienda Ospedaliera - Università degli Studi di Padova

Dipartimento di Scienze Statistiche - Università degli Studi di Padova

L’attività proliferativa nel carcinoma della mammella: come valutarla?

Dott. Enrico Orvieto

4° CONFRONTO INTERISTITUZIONALE IN PATOLOGIA MAMMARIA DA SCREENING

Padova 23-24 novembre 2011

Ki-67: Figlio di un Dio minore

www.google.com

Viale: SIAPEC Palermo 2011

Ki67 immunohistochemistry: a valuable marker inprognostication but with a risk of misclassification:proliferation subgroups formed based on Ki67immunoreactivity and standardized mitotic index Jalava et al 2006

• Valori ≤15; >16 e ≤30; >30 discriminavano nelle pazienti endocrino responsive diverse categorie di rischio.

• Valutazione effettuata su area periferica della neoplasia, con maggior proliferazione, contando 200 cellule

St. Gallen 2009

Ki67 Index, HER2 Status, and Prognosis of Patients With Luminal B Breast Cancer

Maggie C. U. Cheang et al. J Natl Cancer Inst. 2009

Nei 144 casi identificati come luminal (dalla metodica molecolare) si è individuato il cut-off del Ki67 (14%) in grado di separare i casi luminal A dai luminal B

357 tumori della mammella studiati con gene expression profiles (50-gene PAM50)

La distinzione tra Luminal A e B avviene prevalentemente sulla base dell’espressione di geni coinvolti nella proliferazione

L’espressione IHC di ER, PgR, HER2 e di Ki67 (cut-off 14%), è stata utilizzata come surrogato alla classificazione molecolare dei Luminal in una casistica di oltre 4000 casi

St. Gallen 2011

Ki67 Index, HER2 Status, and Prognosis of Patients With Luminal B Breast CancerCheang et al 2009

•Un core di 0,6 mm selezionato casualmente nel tessuto neoplastico•Percentuale di cellule positive sul totale delle cellule neoplastiche

“This study has several limitations. The main weaknesses ofimmunohistochemical approaches are limited technical reproducibility,subjective interpretation, and qualitative readouts .To facilitate analysis of suffi ciently large cohorts of samples, theimmunostaining panel was trained and validated on tissue microarrays,whereas clinical implementation would likely occur on wholesections.” Cheang et al 2009

Eppure…

• Quantità di dati sul valore prognostico e predittivo di KI-67

• A dispetto di:– Uso di diversi materiali (TMA vs core

biopsies vs intere sezioni)– Differenti protocolli di colorazione– Differente valutazione dei risultati

• Possiamo migliorare standardizzazione e riproducibilità?

Viale: SIAPEC Palermo 2011

Le raccomandazioni internazionali

J Natl Cancer Inst 2011; 103:1656-1664Viale: SIAPEC Palermo 2011

Gradiente di Ki-67

Viale: SIAPEC Palermo 2011

Gradiente & hot spots

Viale: SIAPEC Palermo 2011

Gradiente & hot spots

?

Viale: SIAPEC Palermo 2011

The approach to scoring hot spots varies across studies; some investigators have focused in particular on the analysis of hot spots, others have included hot spots in a general assessment of Ki67 across the section, and yet others have recommended avoiding them altogether.

This issue needs clarification, and a working party of the International Ki67 in Breast Cancer Working Group has been established to assess which method is more robust.

In the meantime, for the purposes of consistency, when hot spots are present, an approach that assesses the whole section and records the overall average score is recommended.

J Natl Cancer Inst 2011; 103:1656-1664

J Natl Cancer Inst 2011; 103:1656-1664

Spot 1: 90% Ki67

Spot 2: 30% Ki67

Valore medio tra spot 1 e 2 = 60% ki67

Spot 1: 180 cell Ki67 +/200 cell tumorali = 90% Ki67Spot 2: 45 cell Ki67 +/150 cell tumorali = 30% Ki67

Somme delle cell positive per ki67 tra i due spot: 225/350 = 64% ki67

Cut points for prognosis, prediction, and monitoring should only be applied if the results from local practice have been validated against those in studies that have defined the cutoff for the intended use of the Ki67 result.

Data handling

A threshold that is appropriate for determination of prognosis may not pertain to one that is used for eligibility for a neoadjuvant trial or for use of Ki67 as a pharmacodynamic marker.

Currently, in the absence of harmonized methodology, the International Ki67 in Breast Cancer Working Group was unable, therefore, to come to consensus regarding the ideal cut point(s) that might be used in clinical practice.

Recommendations

Ki67 Ki67 Ki67 Ki67

TV MIB1 DAKO

2020 GSP6

VENTANA

15(20)

PMIB1 DAKOBONDMAX

9(20)

Z30-9 VENTANA

40

ASP6 NEOMARKER

LEICABOND

15(20)

H30-9 VENTANA

30(20)

Q NP

BMIB1 DAKOBONDMAX

20 IMIB1 DAKO

10(20)

RSP6

5(20)

CMIB1 DAKO

25 LMIB1 DAKOBONDMAX

20 SMIB1 DAKOBONDMAX

10(15)

DSP6 NEOMARKER

LEICABOND

10(20)

M30-9 VENTANA

10(35)

TMIB1 DAKOBONDMAX

10

EMIB1 DAKOBONDMAX

8(20)

N30-9 VENTANA

24 UMIB1 DAKO

10(20)

F30-9 VENTANA

25 O 30-9 VENTANA

30 V 25

Ventana + 30-9 = alto LI; score superiore: pregio o difetto? Necessaria correlazione clinicaMIB1 e SP6 sovrapponibili

Valutazione: 10 casi basso LI (rosa)

• Il nostro studio prevedeva di valutare l’attività proliferativa con metodica immunoistochimica in 50 casi di carcinoma della mammella

• Cercando di evidenziare il metodo più corretto ed efficace per valutare l’attività proliferativa mediante l’espressione di ki67

Confronto tra metodiche di valutazione dell’attività proliferativa nel carcinoma

della mammella

Ki67 colorazioni nella linea cellulare MCF-7 . A mitosi; dalla B alla F la fase precoce (G1); Nella G assente; da H a L confinate nei nucleoli. Dalla M alla Q con presenza congiunta nel nucleo e nella matrice nucleare ; R una cellula in profase caratterizzata da condensazione cromosomica

•Tre regioni del diametro di 3mm ciascuna che sono state evidenziate con inchiostro permanente•Queste aree erano selezionate cercando di rappresentare l’eterogenea espressione dell’attività proliferativa della neoplasia.

Valutazione con reticolo

Reticolo di 10 mm di lato diviso in 100 celle inserito nell’oculare del microscopio

Per ogni regione vengono contati 3 reticoli

Analizzatore digitaleValutazione effettuata su ogni regione

L’analizzatore è tarato per valutare un massimo di 350 cellule per area

Valutazione routinaria

Valutazione in percentuale di cellule proliferanti sul totale delle cellule

Vengono valutate approssimativamente 500 cellule per area

Significatività differenze (p)

Differenza complessiva

Valutazione clinica routinaria

Vsvalutazione routinaria

Valutazione clinica routinaria

vs Valut

Analizzatore digitale

Valutazione clinica routinaria

Vs Valut con griglia

Valutazione clinica routinaria 0,0137 0,0026 0,4273 0,0402

Confronto con dato clinico dell’attività proliferativa

 

Percentuali medieSignificatività differenze

(p)

ValutAnalizzatore digitale

Valut. routinari

a

Valut con

griglia

Differenza complessi

va

Digitale vs

routine

Digitale vs

griglia

Griglia vs

routine

Percentuale totale 23,0 23,2 25,0 0,024 0,739 0,012 0,029

Media percentuali 3 aree 23,9 25,7 24,9 0,082

0,026

0,206 0,325

 

Percentuali medieSignificatività differenze

(p)

ValutAnalizzatore digitale

Valut. routinar

ia

Valut con

griglia

Differenza

complessiva

Digitale vs

routine

Digitale vs

griglia

Griglia vs

routine

Grading 1 (% totale) 12,7 10,4 10,8 0,281 0,146 0,220 0,802

Grading 2 (% totale) 15,6 17,8 17,6 0,274 0,904 0,187 0,151

Grading 3 (% totale) 41,9 43,2 47,1 0,017 0,219 0,005 0,091

Grading 1 (media medie) 13,0 11,4 10,8 0,347 0,321 0,166 0,672

Grading 2 (media medie) 16,6 17,9 18,2 0,351 0,278 0,170 0,768

Grading 3 (media medie) 35,4 39,2 37,2 0,037 0,011 0,206 0,172

Il confronto tra la valutazione con analizzatore di immagini e la

valutazione “manuale” effettuata con il metodo descritto si è

dimostrata significativamente correlata

La valutazione di una singola griglia era sufficiente per valutare correttamente

l’espressione dell’attività proliferativa dell’intero campo identificato sul vetrino

Era necessario esaminare l’area con 3 reticoli o si poteva diminuire il numero di

reticoli contati?

stabilito un livello di precisione si è calcolato quante griglie servono per arrivare alla stima della percentuale

giusta col margine d'errore prefissato.

L’unità “griglia” (100 celle contate) era il minimo da contare

Il numero medio di cellule contate nelle griglie del nostro studio

variava da 180 a 570

Per conoscere l’attività proliferativa dell’intera neoplasia sarebbe necessario suddividere la porzione infiltrante periferica della neoplasia in campi da 3mm di diametro e valutare una singola “griglia” per campo

Valutazione estremamente onerosa in termini di tempo-lettura

Selezionato 20 dei 50 casi

Selezione è avvenuta in maniera casuale bilanciando i diversi casi in funzione del grading

Abbiamo valutato interamente la periferia della neoplasia

costruito un algoritmo che individua, facendo tutte le possibili combinazioni casuali di aree, quante aree si

devono contare per avere un margine d'errore accettabile.

1 area 2 aree 3 aree 4 aree 5 aree

Errore medio 0.30 0.37 0.29 0.18 0.12

Obbiettivo è quello di individuare il numero minore di aree, selezionate, in maniera casuale, che consentano di raggiungere il valore della conta di tutta l’area di

proliferazione

Quanti campi, selezionati casualmente, sono necessari per ottenere il valore corretto dell’attività

proliferativa dell’intera sezione neoplastica?

Considerando una popolazione con differente attività proliferativa, per ottenere il valore dell’attività

proliferativa più “corretto” è necessario valutare con il metodo descritto almeno 5 aree.

Un “errore” di valutazione del 10% dell’attività proliferativa può avere differente impatto clinico alla luce

dei cut off che stanno emergendo dalla letteratura

una variazione dal 40% al 44% del valore dell’attività proliferativa è dal punto di vista clinico ininfluente

una variazione dal 13% al 14,3% del valore dell’attività proliferativa può essere discriminante

La valutazione dell’attività proliferativa con metodica immunoistochimica sembra

assumere un significato clinico rilevante

Cosa valutare?La massima attività proliferativa della neoplasia?

L’attività proliferativa dell’intera neoplasia?Quali anticorpi anti ki-67 usare?

Metodi automatici o valutazione “manuale?

Necessaria la standardizzazione della valutazione

•La valutazione “manuale” se basata su concetti condivisi e con parametri certi è efficace quanto la valutazione con analizzatori di immagini computerizzati

•Dal nostro studio emerge che per ottenere una valutazione più corretta dell’attività proliferativa è necessario valutare almento 5 regioni selezionate casualmente alla periferia della neoplasia

•Che per ogni regione è sufficiente contare le cellule incluse nell’area di un reticolo, o in alternativa in un’area equivalente (0.0625 mm2 a 400x)

•Che il numero di cellule contate è un parametro meno significativo rispetto ad un campionamento appropriato della regione proliferante della neoplasia

Conclusioni

Conclusioni

Le considerazioni espresse vanno comunque validate anche con una riproducibilità

interlaboratorio

In attesa di ulteriori “decisioni” delle linee guida

In attesa della definizione di cut-off correlati a metodiche standard

Dott.ssa Giovanna BoccuzzoDipartimento di Scienze Statistiche dell’Università di Padova

Prof. Massimo RuggeDott Marcello Lo Mele

Dott.ssa Rajshree SangapurDott. Luciano GiacomelliUOC Anatomia PatologicaUOC Anatomia Patologica

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