LAPORAN PRAKTIKUM

Nama Pengujian/Analisis/Materi : Pembuatan Media

Mata Kuliah : Mikrobiologi

Semester : II / Genap

PJMK/Dosen Praktikum : Woeryanto, M.si

Asisten Praktikum : Endang Sri Lestari

Disusun oleh

Sisilia Rindi Kurniasari 25010111130189

LABORATORIUM TERPADU

FAKULTAS KESEHATAN MASYARAKAT

UNIVERSITAS DIPONEGORO

SEMARANG

1

2012

HALAMAN PENGESAHAN

1. Nama Penguji/Analisis/Materi : Pembuatan Media

2. Penyusun :

Sisilia Rindi Kurniasari 25010111130189

3. Lokasi Kegiatan : Laboratorium Terpadu FKM UNDIP

Semarang , 6 Juni 2012

Mengetahui, Asisten Praktikum

PJMK/Dosen Praktikum

Woeryanto, M. Si Endang Sri Lestari

NIP. 130606878 NIM E2A00909

2

DAFTAR ISI

COVER..................................................................................................................i

HALAMAN

PENGESAHAN......................................................................................................ii

DAFTAR

ISI.........................................................................................................................iii

DAFTAR

TABEL..................................................................................................................iv

DAFTAR

GAMBAR..............................................................................................................v

DAFTAR

LAMPIRAN...........................................................................................................vi

PRAKATA............................................................................................................vii

PENDAHULUAN...................................................................................................1

DASAR

TEORI..................................................................................................................3

METODE

PRAKTIKUM......................................................................................................20

HASIL DAN

PEMBAHASAN...................................................................................................22

PENUTUP...........................................................................................................24

DAFTAR

PUSTAKA...........................................................................................................25

LAMPIRAN..........................................................................................................27

3

DAFTAR TABEL

No tabel halaman

1. Tabel 1. Hasil pengamatn 22

4

DAFTAR GAMBAR

No Gambar halaman

1. Gambar.1. media endo agar 7

2. Gambar 2. Media nutrient agar 9

3. Gambar 3. TCBS medium 11

4. Gambar 4. Media glucose 11

5. Gambar 5. Media SS 15

6. Gambar 6. Autoclave 19

7. Gambar 7. Pembuatan media nutrient agar 21

8. Gambar 8. Hasil pengamatan 22

5

DAFTAR LAMPIRAN

1. Tabel 1. Hasil pengamatn 22

2. Gambar.1. media endo agar 7

3. Gambar 2. Media nutrient agar 9

4. Gambar 3. TCBS medium 11

5. Gambar 4. Media glucose 11

6. Gambar 5. Media SS 15

7. Gambar 6. Autoclave 19

8. Gambar 7. Pembuatan media nutrient agar 21

9. Gambar 8. Hasil pengamatan 22

6

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT yang telah melimpahkan

rahmat, tauhid serta hidayah-Nya kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan

Laporan Praktikum Mikrobiologi ini. Laporan praktikum ini disusun guna memenuhi

tugas mata kuliah Mikrobiologi semester II.

Pada kesempatan ini penulis ingin menyampaikan terima kasih banyak

kepada semua pihak yang telah membantu dalam penyelesaian laporan praktikum

ini yaitu:

1. Orangtua yang sangat membantu pemberian motivasi serta nasehat yang

bermanfaat dalam proses penyelesaian penulisan laporan

2. Bapak Woeryanto, M.Si dan Ibu Ir. Martini, Msi yang memberikan bimbingan dan

saran selama praktikum

3. Asisten Praktikum yang memberikan bimbingan selama praktikum dan

penyusunan laporan praktikum

4. Teman-teman yang telah memberi motivasi bagi penyusunan laporan praktikum

ini.

Penulis menyadari bahwa laporan praktikum ini memerlukan kritik dan saran

yang bersifat membangun untuk penyempurnaanya. Akhir kata, berharap semoga

laporan praktikum ini dapat bermanfaat dan menambah wawasan bagi pembaca.

Semarang, Juni 2012

penulis

7

BAB 1

PENDAHULUAN

A. TUJUAN

1. Pembuatan media Endo agar

Mengetahui teknik pembuatan media endo agar

2. Pembuatan media Nutrient agar (NA)

Mengetahui teknik pembuatan media nutrient agar

3. Pembuatan media Lactose broth (LB)

Mengetahui teknik pembuatan media lactose broth

4. Pembuatan media TCBS

Mengetahui teknik pembuatan media TCBS

5. Pembuatan media Glucose

Mengetahui teknik pembuatan media glucose

6. Pembuatan media LJ

Mengetahui teknik pembuatan media LJ

7. Pembuatan media BHI

Mengetahui teknik pembuatan media BHI

8. Pembuatan media SS

Mengetahui teknik pembuatan media SS

B. MANFAAT

1. Pembuatan media Endo agar

Agar dapat mengetahui dan membedakan berbagai macam media yang

digunakan untuk mengisolasi bakteri

2. Pembuatan media Nutrient agar (NA)

Agar dapat mengetahui dan membedakan berbagai macam media yang

digunakan untuk mengisolasi bakteri

3. Pembuatan media Lactose broth (LB)

Agar dapat mengetahui dan membedakan berbagai macam media yang

digunakan untuk mengisolasi bakteri

8

4. Pembuatan media TCBS

Agar dapat mengetahui dan membedakan berbagai macam media yang

digunakan untuk mengisolasi bakteri

5. Pembuatan media Glucose

Agar dapat mengetahui dan membedakan berbagai macam media yang

digunakan untuk mengisolasi bakteri

6. Pembuatan media LJ

Agar dapat mengetahui dan membedakan berbagai macam media yang

digunakan untuk mengisolasi bakteri

7. Pembuatan media BHI

Agar dapat mengetahui dan membedakan berbagai macam media yang

digunakan untuk mengisolasi bakteri

8. Pembuatan media SS

Agar dapat mengetahui dan membedakan berbagai macam media yang

digunakan untuk mengisolasi bakteri

9

BAB II

DASAR TEORI

A. Media

Media adalah suatu tempat yang berguna untuk pertumbuhan dan

berkembangnya mikroba. Agar mikroba dapat tumbuh dan berkembang, media

harus memenuhi syarat-syarat tertentu yaitu media harus mengandung unsur

hara yang berguna untuk pertumbuhan dan perkembangan, memiliki tekanan

osmotik, memiliki tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan

mikroba, serta sebelum digunakan media harus dalam keadaan steril, yang

berarti tidak ada pertumbuhan mikroba lain yang tidak diharapkan. Didalam

nedia oun sudah terdapat bahan-bahan makanan yang berguna untuk

pertumbuhan mikroba yang bentuknya alami dan bahan kimianya berbentuk

senyawa-senyawa organik.(Suriawiria, 2005, 74 : 172)

Pada pembuatan medium sebaiknya menggunakan air suling atau

aquadest. Mikroorganisme memiliki kebutuhan dasar hidup diantaranya adalah

air, energi, karbon, mineral, dan faktor tumbuh. Faktor tumbuh adalah komponen

yang esensial tidak dapat disintesis sendiri oleh organisme. Selain itu, keasaman

(pH) medium juga sangat penting bagi pertumbuhan mikroorganisme dan

sebagian besar tumbuh optimal pada pH 7.

Tipe-tipe medium:

1. Medium serbaguna

Paling umum digunakan pada bakteriologi, contohnya kaldu nutrien.

2. Medium selektif

Mengandung zat kimia tertentu yang dapat menghambat pertumbuhan

sekelompok atau lebih bakteri tanpa harus menghambat pertumbuhan

organisme yang dibutuhkan.

3. Medium diferensial

Mengandung zat kimia tertentu untuk membedakan berbagai macam bakteri.

10

(Hadioetomo, 1993, 44-46:163).

Macam-macam medium berdasarkan konsistensinya:

1. Medium cair

Berguna untuk pembiakan organisme dalam jumlah yang besar, fermentasi,

dan uji-uji yang lain. Contohnya adalah Nutrient Broth dan Glucose Broth.

2. Medium setengah padat

Digunakan untuk menguji keberadaan motilitas serta kemampuan fermentasi.

Medium ini serungkali mengandung gelatin ataupun agar-agar, namun

konsentrasinya lebih kecil daripada medium padat.

3. Medium padat

Berguna untuk menumbuhkan mikroba pada permukaan, sehingga koloninya

dapat dihitung, diamati, dan diisolasi. Contoh medium padat adalah Nutrient

Agar (NA), Plate Count Agar, Potato Dextrose Agar (PDA). (Hadioetomo,

1993, 46:163).

Macam-macam bentuk media :

1. Media alami

Tersusun dari bahan-bahan organik (alami). Yang paling banyak digunakan

adalah bentuk kultur jaringan pada tumbuhan dan hewan. Contohnya adalah

telur sebagai pertumbuhan virus.

2. Media sintetik

Media sintetik tersusun oleh senyawa kimia, dipergunakan untuk membuat

kultur bakteri Clostridium. Contoh: K2HPO4, KH2PO4, NaCl, CaCO3, dll.

3. Media semi sintetik

Medianya tersusun dari bermacam-macam campuran bahan alami dan

bahan sintetik. (Suriawiria, 2005, 76-77 : 172)

Bahan pembuat medium menjadi padat adalah agar-agar, gelatin

atau gel silika. Dan yang paling sering digunakan adalah agar-agar. Bahan

11

utama dari agar-agar adalah galaktan yang merupakan kompleks karbohidrat

yang telah diekstraksi dari alga marin genus Gelidium, namun sebagian

besar mikroorganisme tidak menggunakannya sebagai bahan makanan,

sehingga agar-agar dapat berguna sebagai bahan pemadat. Agar akan larut

atau mencair bila dipanaskan pada suhu 100oC dan akan tetap berbentuk

cair bila didingunkan sampai suhu 43oC. Jika gelatin, sekali memadat harus

dipanaskan kembali sampai kurang lebih 100oC untuk cair kembali. Namun,

pada media agar tidak dianjurkan untuk mencair kembali lebih dari dua kali

karena akan mengakibatkan hasilnya kurang baik. (Hadioetomo, 1993,

46:163).

Dalam pembuatan media padat, pada proses pemanasan media cair

harus diaduk secara terus-menerus dengan stirrer (pengaduk magnet) yang

berfungsi untuk mencegah hangusnya atau meluapnya medium. Pada

pembuatan media dengan cawan petri, medium tidak boleh bersuhu terlalu

tinggi ketika dituang karena akan mengakibatkan kondensasi air yang

berlebihan pada tutup cawan petri dan air akan kembali menetes pada agar

yang telah memadat. Pemindahan medium dari tabung reaksi ke cawan petri

harus dilakukan secara aseptis untuk mencegah tercemarnya biakan murni.

Biakan murni adalah biakan yang hanya terdiri dari satu spesies tunggal.

(Anonim, 2008)

Pembuatan media agar miring berfungsi untuk mendapatkan

permukaan media yang lebih luas sehingga mikroorganisme yang tumbuh

bisa lebih banyak dan tersebar. Sedangkan pada agar tegak berfungsi untuk

kebutuhan gas dari mikroorganisme. Media agar cawan bertujuan

menyediakan permukaan yang luas untuk proses isolasi. Tabung durham

berbentuk sama dengan tabung reaksi, tetapi lebih kecil ukurannya dan

berfungsi menampung gas yang terbentuk akibat dari metabolisme bakteri

yang diuji. Penempatannya harus terendam sempurna dalam media dan

tidak boleh ada gelembung udara (Anonim, 2008).

B. Contoh – contoh Media

12

1. Endo agar

Endo agar adalah media padat (solid plating media), digunakan untuk

menumbuhkan bakteri yang hidup di usus. Media ini mengandung natrium

sulfit dan “basic fuchsin” yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram

positif.  Asam yang dihasilkan dari perombakan laktosa dapat dideteksi

dengan asetaldehida dan natrium sulfit. (Pelczar, 1986).   

Endo agar adalah medium pertumbuhan mikrobiologi dengan warna

pink, pada umumnyadigunakan dalam mengembangkan bakteri salmonella

dan kini banyak digunakan pula untuk mengembangkan bakteri koliform.

Biasanya bakteri gram negative dapat tumbuh dengan baik  pada medium ini

sedangkan bakteri gram positive cenderung terhambat pertumbuhannya.

Bakteri koliform memfermentasikan laktosa pada medium ini

dan menimbulkan warna merah (Eschericha coli) sedangkan bakteri

tanpa fermentasi laktosa menghasilkan warna bening. (Pelczar, 1986).

Endo Agar dikembangkan oleh Endo untuk membedakan bakteri

gram negative berdasarkan fermentasi laktosa, sedangkan menghambat

bakteri gram positif. Penghambatan nanti dicapai tanpa menggunakan garam

empedu seperti yang digunakan secara tradisional. Endo berhasil dalam

menghambat bakteri gram positif pada medianya dengan penggabungan

sulfit natrium dan fuchsin dasar. Pada Agar Endo yang dihasilkan, juga

dikenal sebagai sulfit fuchsin dan Infusion agar, digunakan untuk mengisolasi

basil tifus. Endo Agar direkomendasikan oleh APHA sebagai media penting

dalam pemeriksaan mikrobiologi air dan air limbah, produk susu dan

makanan. Endo Agar digunakan untuk mengkonfirmasi deteksi dan

enumerasi bakteri coliform mengikuti tes dugaan air minum. Hal ini juga

digunakan untuk deteksi dan isolasi coliform dan fecal coliform dari susu,

produk susu dan makanan. Media berisi mencerna lambung dari jaringan

hewan yang menyediakan nitrogen, karbon, vitamin dan mineral yang

dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri. Natrium sulfit dan fuchsin dasar

membuat media  selektif dengan menekan organisme gram positif. Coliform

13

menghasilkan koloni merah muda di fermention laktosa sementara laktosa

non fermentor menghasilkan koloni berwarna pada media. Dengan

Escherichia coli, reaksi ini sangat terasa sebagai mengkristal fuchsin, yang

menunjukkan kalau logam permanen kehijauan (fuchsin kilau) ke koloni.

Sedang harus disimpan jauh dari cahaya untuk menghindari foto-oksidasi.

(Pelczar, 1986).

Gambar.1. media endo agar

2. Nutrient agar

Nutrien agar adalah medium umum untuk uji air dan produk

dairy. NA juga digunakan untuk pertumbuhan mayoritas dari mikroorganisme

yang tidak selektif, dalam artian mikroorganisme heterotrof. Media ini

merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan

agar. Na merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam

prosedur bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk

membawa stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk

mengisolasi organisme dalam kultur murni. Pada pembuatan medium NA ini

ditambahkan pepton agar mikroba cepat tumbuh, karena mengandung

banyak N2 (Dwidjoseputro, 1994). Agar yang digunakan dalam proses ini

untuk mengentalkan medium sama halnya dengan yang digunakan pada

medium PDA yang juga berperan sebagai media tumbuh yang ideal bagi

mikroba (Schlegel, 1993). Agar dilarutkan dengan komposisi lain dan

disterilisasi dengan autoklaf pada 121°C selama 15 menit. Kemudian siapkan

wadah sesuai yang dibutuhkan.

14

Dalam percobaan warna NA sebelum dilarutkan dalam aquades

adalah coklat, dan setelah dilarutkan dalam aquades berubah menjadi

kekuning-kuningan dan terdapat endapan. Jadi untuk menghilangkan

endapan tersebut maka dipanaskan dalam penangas air dengan tabung

Erlenmeyer disumbat dengan alat penyumbat. Setelah sterilisasi warna

medium menjadi agak coklat

Nutrient Agar merupakan suatu medium yang mengandung

sumber nitrogen dalam jumlah cukup, yaitu 0,3 % ekstrak daging sapi, 0,5 %

peptone tetapi tidak mengandung sumber karbohidrat, jadi baik untuk

pertumbuhan bakteri, namun kapang dan khamir tidak dapat tumbuh dengan

baik (Fardiaz,1993).

Menurut Omalu (2011) komposisi dari NA adalah pepton dari

daging 5,0 gram/liter, ekstrak daging 3,0 gram/liter, agar-agar 12,0 gram/liter.

Media ini digunakan untuk menumbuhkan bakteri. Langkah untuk membuat

media NA adalah dimulai dengan menimbang NA bubuk sebanyak 4 gram

lalu dimasukkan ke dalam aquades 200 ml dan diaduk rata. Kemudian

dimasukkan stirrer guna mencegah hangusnya dan meluapnya larutan

kemudian dipanaskan di atas hot plate hingga larutan berwarna jernih. Lalu

larutan tersebut dimasukkan ke dalam 5 tabung reaksi berisi masing-masing

5 ml, 3 tabung reaksi masing-masing 10 ml, dan 13 tabung reaksi dengan

masing-masing 10 ml. Tabung reaksi ditutup mulut tabungnya dengan kapas

agar tetap steril, dibungkus menggunakan plastik bening dan diikat

menggunakan karet gelang untuk mencegah kontaminasi oleh

mikroorganisme lain yang tidak diharapkan sesuai dengan teori Volk &

Wheeler (1993). Seluruh tabung reaksi tersebut dimasukkan ke dalam

autoklaf untuk disterilisasikan selama 15 menit pada suhu 121oC. Setelah

proses sterilisasi, 5 tabung yang berisi 5 ml larutan dibuat agar miring dan

setelah dingin berwarna kuning emas dan berbentuk cair, sedangkan 3

tabung yang berisi 10 ml larutan dibuat agar tegak setelah dingin berwarna

kuning bening dan wujudnya padat. Menurut Anonim (2008) pembuatan agar

miring bertujuan untuk mendapatkan media yang lebih luas sehingga

15

mikroorganisme yang diharapkan tumbuh dapat lebih banyak dan menyebar,

sedangkan pada agar tegak bertujuan dalam kebutuhan gas dari

mikroorganisme. Kemudian 13 tabung reaksi yang berisi 10 ml, dipindahkan

ke dalam cawan petri secara aseptis untuk mencegah kontaminasi dari

mikroorganisme lain yang tidak diinginkan dan hal tersebut sesuai dengan

teori Anonim (2008). Setelah dingin warna dari media adalah kuning emas

dan wujudnya padat. Sesuai dengan pendapat Hadioetomo (1993),

pembuatan media menggunakan NA termasuk dalam medium padat yang

berguna untuk menumbuhkan mikroba pada permukaan, sehingga koloninya

dapat dihitung, diamati, dan diisolasi (Hadioetomo ,1993).

Gambar 2. Media nutrient agar

3. Lactose broth

Media yang digunakan untuk mengetahui ada tidaknya kehadiran

bakteri coliform (bakteri Gram negatif) berdasarkan terbentuknya asam dan

gas yang disebabkan karena fermentasi laktosa oleh bakteri golongan coli.

Terbentuknya asam dilihat dari kekeruhan pada media laktosa dan gas yang

dihasilkan dapat dilihat dalam tabung Durham berupa gelembung udara.

Tabung dinyatakan positif coliform jika terbentuk gas sebanyak 10% atau

lebih dari volume di dalam tabung Durham. (Suriawiria, 1996).

Lactose Broth (LB) termasuk kedalam medium cair. Medium ini

berguna untuk memperbanyak koliform. Komposisinya adalah ekstrak beef

0,3% yang berfungsi sebagai sumber karbohidrat dan nitrogen yang

16

dibutuhkan bakteri, pepton 0,5% yang berfungsi sebagai sumber protein,

nitrogen dan karbohidrat, serta laktosa 0,5% sebagai sumber energi,

karbohidrat dan aquades yang merupakan sumber oksigen dan pelarut.

(Anonim, 2010).

4. TCBS

TCBS agar atau Thiosulfate Citrate Bile salt Sucrose agar

termasuk media selektif yang biasanya digunakan untuk menumbuhkan atau

mengisolasi bakteri Vibrio spp. Media ini disebut juga Vibrio Selective agar.

TCBS agar memiliki keselektifitas tinggi untuk menumbuhkan dan

mengisolasi bakteri Vibrio cholera dan Vibrio parahaemolitycus.

TCBS agar mengandung sodium citrate, sodium thiosulfate, sodium

cholate, dan oxbile sebagai media selektif, membuat pH menjadi basa untuk

menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan menekan bakteri

coliform. Meningkatkan pH juga berguna untuk menumbuhkan bakteri Vibrio

cholera karena organisme ini sangat sensitif terhadap lingkungan yang

sifatnya asam. Media ini mengandung sukrosa sebagai bahan frementasi

untuk metabolisme bakteri Vibrio spp.karena bakteri ini dapat memfermentasi

sukrosa. Media ini mengandung sodium chloride untuk menstimulasi

pertumbuhan bakteri dan menjaga keseimbangan tekanan osmotik. Sodium

thiosulfate juga merupakan sumber sulfur (Soemarno, 2000)

Gambar 3. TCBS medium

5. Glucose

17

Media Glukosa terdiri dari agar-agar, glukosa, pepton dan indikator pH. 

Setelah inokulasi dengan strain baik di bawah penutup uji satu menempatkan

cukup minyak mineral dalam satu tabung untuk mencegah oksigen mencapai

itu. Tabung sekarang terlihat seperti set 1 di bawah ini. Menetaskan tabung

dan memeriksa kembali 

6.

Jika mereka sekarang terlihat seperti set 2 organisme mengoksidasi

glukosa. Di bagian atas tabung beraspal itu telah berkembang dengan

mengoksidasi glukosa, ini membentuk asam dan indikator mendaftarkan

penurunan pH dengan memutar kuning.Oksigen tidak menembus ke bagian

bawah tabung terbuka dan sebagainya wilayah ini tetap hijau 

Jika tabung terlihat seperti set 3 organisme adalah

fermentasi. Organisme ini dapat metabolisme glukosa dengan fermentasi

itu. Fermentasi tidak membutuhkan oksigen dan menghasilkan asam,

indikator menunjukkan asam yang telah dihasilkan sepanjang kedua

tabung. (Skierka.2010)

Jika terlihat seperti diset 4 organisme tidak menggunakan glukosa

sama sekali.Media O / F mengandung pepton serta glukosa. Organisme

yang tidak menggunakan glukosa oksidatif atau fermentively dapat

memperoleh energi dengan mengoksidasi pepton tersebut. Ini hanya dapat

terjadi secara oksigen dapat mencapai hasil dalam produksi alkali dengan

produk. PH naik dan indikator menjadi biru. (Skierka.2010)

Pada uji gula-gula hanya terjadi perubahan warna pada media

glukosa yang berubah menjadi warna kuning, artinya bakteri ini membentuk

asam dari fermentasi glukosa. Pada media glukosa juga terbentuk

gelembung pada tabung durham yang diletakan terbalik didalam tabung

18

Gambar 4. Media GlukosaSumber : www. Wikimedia.org

media, artinya hasil fermentasi berbentuk gas. Pada uji laktosa dan sukrosa

memperlihatkan hasil yang negatif yaitu tidak terjadinya perubahan warna

dan tidak terlihat adanya pembentukan gelembung gas pada tabung Durham.

Perubahan warna yang terjadi menandakan bahwa bakteri ini membentuk

asam dari fermentasi glukosa. Pembentukan gelembung gas yang terjadi

pada tabung Durham disebabkan oleh adanya reaksi permentasi karbohidrat

(Hadioetomo, 1985).

Media ini disteril di autoclave, media ini disimpan pada suhu 37˚C,

digunakan sebagai pelarut gula-gula dan uji test reaksi indol dengan

ditambahkan reagent kovac. TB 4% 1ml.Media ini disteril di autoclave,

disimpan pada suhu 37˚C, media ini digunakan untuk mengetahui fermentasi

karbohidrat. (Hadioetomo, 1985).

6. LJ

Media  Lowenstein - Jensen, lebih dikenal sebagai media LJ,  adalah

medium pertumbuhan khusus digunakan untuk kultur Mycobacterium ,

terutama  Mycobacterium tuberculosis . Ketika ditanam di LJ menengah,

M. TBC  muncul sebagai coklat, koloni granular (kadang-kadang disebut

"penggemar, kasar dan keras"). Media harus diinkubasi untuk jangka waktu

yang signifikan, biasanya empat minggu, karena waktu penggandaan

lambat M. TB dibandingkan dengan bakteri lain (15 - 20 jam). ( Anonym.

2011). Dalam 600 ml air Lowenstein jensen medium mengandung:

a. Asparagine-3,60 g

b.  Monopotasium phosphate-2,50 g

c.  Magnesium citrate-0,50 g

d.  Magnesium sulfate-0,24 g

e.  Potato flour-30,00 g

f.  Malasit green-0,40 g

g. Egg(fresh,whole)-1000,00 ml

h.  Glyserol-12,00 g (Resti pratita.2012).

7. BHI

19

Brain Hearth Infusion Agar (BHI Agar) merupakan media non-selektif

diperkaya untuk isolasi dan penanaman bakteri anaerobik dan

mikroorganisme lainnya. Sifat nutrisi dasar BHI dari padatan serta peptones

daging, dengan penambahan ekstrak ragi. Media ini dilengkapi dengan

hemin dan vitamin K1 sebagai faktor pertumbuhan yang paling berpengaruh

bagi bakteri anaerob. Media ini disusun, dibagikan, disimpan dan dikemas di

bawah kondisi bebas oksigen untuk mencegah pembentukan produk

teroksidasi sebelum digunakan (mimin.2010).

a. Rumus:

a) BHI-37,0 g

b) Ragi Extrac- 5,0 g

c) Hemin (0,1% Sol'n)-5,0 ml

d) Vitamin K 1 (1 Sol'n%)-0,05 ml

e) Agar-15,0 g

f) Distilasi Air-1000.0 ml

g) L-Sistei- 0,5 ml

h) PH akhir 7,2 + / - 0,2 pada 25 derajat C.

i) Bobot akhir 16,0 g + / - 1,6.

b. Prosedur

Koleksi spesimen: Spesimen untuk kultur anaerobik harus dilindungi

dari udara (oksigen) selama pengumpulan, transportasi dan

pengolahan. Konsultasikan referensi yang tepat untuk rincian petunjuk

tentang pengumpulan dan pengangkutan anaerob.  

Metode untuk Penggunaan: BHI AGAR harus diinokulasi langsung

dengan bahan klinis atau kaldu yang sebelumnya telah diinokulasi dari bahan

klinis. Piring diinokulasi harus melesat untuk mendapatkan koloni terisolasi,

segera ditempatkan dalam suasana anaerob dan diinkubasi pada 35-37 o C

selama 18 - 48 jam. Periode inkubasi tambahan mungkin diperlukan untuk

memulihkan beberapa anaerob. Instruksi lengkap untuk pengolahan budaya

anaerob dapat ditemukan dalam referensi yang sesuai. (Anonym.2008)

20

Kegunaan : Untuk pertumbuhan bermacam-macam mikroorganisme

phatogenik(bakteri).

Prinsip kerja : Berisi irisan kecil dari jaringan otak dan dapat digunakan

untuk menumbuhkan banyak bakteri seperti streptococcus, staphylococcus,

Kandunan : Nutrien substrat, glukosa, NaCl, Dinatrium hydrogen phospat

Hasil positif :Media berubah menjadi keruh (mimin.2010)

8. SS

Salmonella Shigella (SS) agar merupakan media agar diferensial

yang digunakan untuk mengisolasi Enterobacteriaceae patogen, khususnya

Salmonella spp. dan Shigella spp. dari makanan, alat-alat kesehatan lain,

dan bahan percobaan klinik. Aksi penghambatan pada bakteri koliform dan

gram-positif dilakukan oleh campuran garam bile dan brilliant green pada

medium. Sodium sitrat menghambat bakteri gram-positif. Neutral red

merupakan pH indikator bagi bakteri yang memfermentasi laktosa akan

menghasilkan koloni berwarna merah jambu. Beberapa Salmonella and

Proteus spp. menghasilkan bulatan hitam (presipitat ferri sulfat) di tengah

koloni sebagai hasil produksi gas H2S. Morfologi khas kolonial pada

Salmonella Shigella Agar adalah : E.coli pertumbuhan, merah muda atau

merah, Enterobacter / Klebsiella Sedikit, pertumbuhan, pink Proteus tak

berwarna, biasanya dengan pusat hitam, Salmonella tak berwarna, biasanya

dengan pusat hitam, Shigella berwarna, Pseudomonas beraturan, sedikit

pertumbuhan, Salmonella typhi: tak berwarna koloni, pusat hitam ( Anonim.

2009)

21

Gambar 5. media SS

C. Sterilisasi

Sterilisasi adalah suatu proses untuk memusnahkan seluruh organisme yang

terdapat pada suatu benda dan juga berarti membebaskan tiap benda dari semua

kehidupan dalam bentuk apapun. Mikroorganisme dapat dimatikan setempat oleh

panas (kalor), gas (formaldehida, etilen oksida, dan lain-lain), serta oleh sinar ultra

atau sinar gamma. Mikroorganise dapat juga disingkirkan dengan cara mekanik oleh

sentrifugasi kecepatan tinggi oleh filtrasi. (Irianto, 2006, 75:256)

Tiga cara utama yang umum digunakan dalam proses sterilisasi adalah:

1. Penggunaan panas

Terbagi menjadi 2 jenis :

a. Sterilisasi panas lembab (sterilisasi basah)

Menggunakan panas dari uap air jenuh bertekanan pada suhu 121oC

selama 15 menit. (Hadioetomo, 1993, 55:163).

b. Sterilisasi panas kering (sterilisasi kering)

Proses sterilisasi tanpa menggunakan kelembaban. Alat yang digunakan

mempunyai suhu oven 160-175ºC selama 10 menit untuk dapat

mematikan mikroorganise. Bahan yang biasanya disterilkan dengan cara

22

ini adalah pecah belah, seperti pipet, tabung reaksi, cawan petri dari

kaca, botol sampel. (Hadioetomo, 1993, 57:163).

2. Penggunaan bahan kimia

Sterilisasi ini menggunakan gas atau radiasi. Bahan kimia yang digunakan

yaitu etilena oksida, asam perasetat, formaldehida, dan glutaraldehida

alkalin. Sterilisasi dengan radiasi dapat menggunakan sinar gama (sinar

ultraviolet).

3. Penyaringan (filtrasi)

Filtrasi dilakukan pada suhu kamar. Larutan atau suspensi dibebaskan dari

semua organisme hidup dengan melewatkannya di saringan dengan ukuran

pori (0,45 atau 0,22μm ) sehingga bakteri dan sel yang lebih besar dapat

tertahan diatasnya, sedangkan filtratnya ditampung pada wadah yang steril.

(Hadioetomo, 1993, 55-58:163).

Sterilisasi kering dapat dilakukan dengan beberapa cara, yaitu:

a. Pemijaran

Diterapkan pada ose ujung-ujung pinset dan sudip (spatula) logam,

b. Jilatan api (flaming)

Diterapkan terhadap skalpel, jarum, mulut tabung biakan, kaca objek dan

kaca penutup. Benda-benda tersebut dijilatkan pada api bunsen tanpa

membiarkannya memijar. Dapat juga dilakukan dengan cara mencelupkan ke

dalam spiritus bakar, tetapi cara ini tidak menghasilkan suhu yang tinggi

untuk sterilisasi. Biasanya diterapkan pada permukaan baskom dan mortir.

c. Tanur Uap Panas (Hot-Air oven)

Sebagian besar sterilisasi kering dilakukan dengan alat ini. Digunakan pada

suhu 160-165oC selama 1 jam. Baik dilakukan untuk alat-alat kering yang

terbuat dari kaca, seperti tabung reaksi, pinggan petri, labu, pipet, pinset,

23

skalpel, gunting, kapas hapus tenggorok, alat suntik dari kaca. Masuknya

panas ke dalam bahan-bahan berjalan lambat, jadi harus disterilkan dalam

jumlah sedikit dan dalam lapisan tipis tidak lebih dari 0,5 cm dalam pinggan

petri. Kadang-kadang dilakukan sterilisasi pada suhu 170oC selama 2 jam.

(Irianto, 2006, 86, 256)

Sterilisasi basah dilakukan dengan cara-cara sebagai berikut:

a. Perebusan dalam air

Cara tersebut hanya cukup untuk mematikan mikroorganisme yang tidak

berspora. Cara ini tidak menjamin sterilitas, tetapi dianggap cukup

memuaskan untuk tujuan sterilitas mutlak tidak esensial dan cara lain pun

tidak mungkin dilakukan.

b. Uap mengalir

Cara ini bebas digunakan dalam tempat yang tidak tertutup rapat yang dapat

menahan uap tanpa tekanan. Air mendidih dan uap bebas tidak pernah

mencapai suhu lebih dari 100oC (212oF). Keuntungan dengan cara ini adalah

tidak membutuhkan alat yang khusus, tetapi kerugiannya yaitu memakan

waktu lama dan dalam beberapa cairan seperti air, sporanya tidak segera

tergerminasi dan mungkin saja terbawa spora anaerob yang tidak tumbuh

kontak dengan oksigen atmosfer.

c. Uap dalam tekanan

Cara ini dilakukan dengan autoklaf. Di dalam autoklaf, uapnya dalam

keadaan jenuh dan meningkatnya tekanan menyebabkan suhu menjadi lebih

tinggi, yaitu di bawah tekanan 15 lb (2 atm). Suhunya dapat meningkat

sampai 121oC. Bila uapnya bercampur dengan udara sama banyak, pada

tekanan yang sama, maka suhunya hanya tercapai 110oC. Karena itu udara

dalam autoklaf harus dikeluarkan sampai habis untuk memperoleh suhu yang

diinginkan. Pada suhu tersebut semua mikroorganisme vegetatif maupun

24

spora dapat mati dalam waktu yang tidak lama, yaitu sekitar 15-20 menit.

(Irianto, 2006, 86-87, 256)

Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam menggunakan autoklaf:

1. Sterilisasi bergantung pada uap, karena itu udara harus dikosongkan dari

ruang sterilisator.

2. Semua bagian bahan yang disterilkan harus terkena uap.

3. Bahan yang berpori atau yang berbentuk cair harus permeable terhadap uap

4. Suhu yang terukur oleh termometer harus mencapai 121oC selama 15 menit.

(Hadioetomo, 1993, 56:163).

Ketika melakukan sterilisasi, cawan petri lazimnya ditempatkan dalam kaleng

atau dibungkus kertas, tabung uji dan botol disumbat dengan kapas untuk

mencegah kontaminasi oleh mikroorganisme dalam atmosfir. (Volk & Wheeler, 1993,

39:396). Sterilisasi panas-lembab lebih efektif dan efisien dalam mematikan

mikroorganisme karena membutuhkan suhu tidak setinggi metode panas-kering.

(Volk, W.A. & M.F. Wheeler ,1993)

D. Autoclave

Autoclave digunakan untuk mensterilkan alat-alat maupun medium

mikroorganisme.

25

Gambar di bawah adalah contoh jenis autoclave yang paling sederhana. Prinsip

kerja alat ini sama dengan prinsip kerja kukusan (alat sederhana untuk menanak

nasi) hanya saja memiliki tekanan sehingga menghasilkan panas yang lebih tinggi.

Hal ini bertujuan untuk lebih menyempurnakan proses sterilisasi. Tahap sterilisasi

sebenarnya cukup singkat yaitu dengan suhu 121 derajat celsius selama 15 menit.

Namun waktu keseluruhan mulai dari pemanasan awal (kenaikan suhu) sampai

pendinginan (penurunan suhu) bisa mencapai kurang lebih 2 jam-an. Yang perlu

diperhatikan selama mengoperasikan alat ini adalah tutupnya jangan diletakkan

sembarangan dan dibuka-buka karena isi botol atau tempat medium akan meluap

dan hanya boleh dibuka ketika manometer menunjukkan angka 0. Medium yang

mengandung vitamin, gelatin atau gula, maka setelah sterilisasi medium harus

segera didinginkan. Cara ini untuk menghindari zat tersebut terurai. Medium dapat

langsung disimpan di lemasi es jika medium sudah dapat dipastikan steril

(Dwidjoseputro, 1994).

Gambar 6 autoclave

BAB II

METODE PRAKTIKUM

A. ALAT DAN BAHAN

Kolve erlenmeyer

26

Kapas

Timbangan

Inkubator

Lampu spirtus / bunsen

Autoclave

Tabung reaksi

Tabung durham

Piring petri

Pengaduk

Kapas

Aquades

Media powder

1. Endo agar

2. Nutrient agar (NA)

3. Lactose broth ( LB )

4. TCBS

5. Glucose

6. LJ

7. BHI

8. SS

B. CARA KERJA

1. Pembuatan media nutrient agar

a. Memasukan reagen NA ke dalam tabung erlenmayer

b. Menambahkan 50 cc air kedalam tabung erlenmayer

c. Mengaduk dan menghomogenkan sampai kembali jernih

d. Menutup tabung erlenmayer dengan kapas kemudian

memasukkannya kedalam autoclave selama 1 jam dengan suhu 121

c

e. Menuangkan media kedalam piring petri

C. Skema kerja

27

Pembuatan media nutrient agar

Reagen NA dimasukkan kedalam tabung erlenmayer

500 cc air ditambahkan kedalam tabung erlenmayer

Regen diaduk dan dihomogenkan sampai kembali jernih

Tabung erlenmayer ditutup dengan kapas kemudian dimasukkan

kedalam autoclave selama 1 jam dengan suhu 121 C

Media dituangkan kedalam piring petri

Gambar 7. Pembuatan media nutrient agar

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

28

Mulai

selesai

A. HASIL PENGAMATAN

Media Warna sebelum

di homogenkan

Warna setelah

dihomogenkan

Fungsi

Nutrient agar

(NA)

Keruh Orange Media pertumbuhan

kuman gram (+) dan

gram (-)

Tabel 1. Hasil pengamatan

Sebelum dihomogenkan setelah dihomogenkan

Gambar 8. Hasil pengamatan

B. PEMBAHASAN

Media nutrient agar adalah salah satu dari banyak media yang digunakan

untuk menumbuhkan bakteri. Media nutrient agar adalah media yang digunakan

untuk pertumbuhan kuman gram (+) dan kuman gram (-). Warna media ini sebelum

dihomogenkan adalah keruh dan setelah diaduk dan dihomogenkan akan berubah

warna menjadi orange.

            Berdasarka hasil percobaan didapatka hasil bahwa sebelum disterilkan

warna medium cokelat dan setelah disterilkan warnanya berubah menjadi merah

bata. Konsistensi sebelum disterilkan adalah cair dan setelah disterilkan medium

menjadi padat. Hal ini terjadi karena medium ini menggunakan bacto agar yang

29

berfungsi memadatkan media. Dengan demikian, berdasarkan konsistensinya

medium tersebut termasuk dalam medium padat yang dicairkan yang berarti bahwa

pada keadaan panas berbentuk cair dan jika didinginkan berbentuk padat.  Adapun

fungsi dari masing-masing bahan dalam membuat medium ini adalah Ekstrak daging

berfungsi sebagai sumber lemak/lipid, Pepton berfungsi sebagai sumber nitrogen,

Bacto agar berfungsi untuk memadatkan media, Aquades berfungsi sebagai pelarut

universal. Selain itu, air juga diperlukan untuk berlangsungnya reaksi-reaksi

enzimatik dalam sel. Media ini digunakan untuk pembiakan bakteri. Semua media

berubah warna menjadi lebih keruh dan terkontamisasi oleh mikroorganisme yang

berbentuk bulat.

30

BAB V

PENUTUP

A. KESIMPULAN

1. Dari percobaan pembuatan media ini dapat diambil kesimpulan yaitu

terdapat beberapa media yang digunakan untuk pertumbuhan bakteri

antara lain :

a. Endo agar : untuk pertumbuhan kuman gram (-) misalnya

proteus, psedomonas, cytobacter, introbacter, e. colli

b. Nutrient agar : untuk pertumbuhan kuman gram (+) dan (-)

c. Lactose agar : digunakan untuk material dari benda – benda cair

seperti jus , susu, jamu gendong, es batu , es teh, dawet, air isi ulang

d. TCBS : digunakan untuk pertumbuhan kuman Vibrio cholera

e. Glucose : digunakan khusus untuk pertumbuhan jamur

f. LJ : digunakan untuk pertumbuhan kuman TB ( TB

medium )

g. BHI : digunakan untuk media transport

h. SS : digunakan untuk media pertumbuhan Salmonella

shigela

2. Pada pembuatan media NA larutan reagen NA yang sebelumnya keruh

berubah menjadi orange setelah dihomogenkan.

B. SARAN

1. pada saat membuat media harus diperhatikan kesterilan media , jangan

sampai terkontaminasi dengan bakteri lain

2. saat menggunakan pembakar spirtus sebaiknya berhati – hati agar tidak

terjadi hal – hal yang tidak diinginkan.

3. Setelah selesai praktikum sebaiknya semua alat dan bahan di bersihkan

agar tidak ada kuman yang tertinggal

31

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. (2010). Sterilisasi Media Kultur.

http://fpk.unair.ac.id/webo/kuliah-pdf/sterilisasi-2010%20%5BCompatibility%20Mode

%5D.pdf. Universitas Airlangga. Surabaya. Diakses tanggal 15 Mei 2011.

Anonim. (2001). Peptone Yeast Glucose Broth. http://www.dalynn.com/docs/AN104-

5.pdf. Research Dalynn Biologycal. Diakses 15 Mei 2011.

Anonim. (2008). Petunjuk Praktikum Mikrobiologi Dasar.

http://www.freewebs.com/mikrodas/PETUNJUK%20PRAKTIKUM.pdf. Laboratorium

Mikrobiologi Fakultas Biologi. Universitas Jenderal Soedirman. Purwokerto. Diakses

tanggal 15 Mei 2011.

Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan, Jakarta.

Hadioetomo, R. S. (1993). Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia. Jakarta.

Irianto, K. (2006). Mikrobiologi : Menguak Dunia Mikroorganisme Jilid I. CV. Yrama

Widya. Bandung.

Machmud, M. 2008. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba. Balai

Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan, Bogor.

http://anekaplanta.wordpress.com/2008 /03/02/teknik-penyimpanan-dan-

pemeliharaan-mikroba/. Diakses pada tanggal 1 juni 2012

Omalu, C. J., V. A. Ayanwale, A. B. Ajalaruru, A. Z. Mohammed, J. D. Bala & V.

Chukwuemeka. (2011). Isolation Of Fungi And Bacteria From Housefly (Musca

Domestica L.)

Larvae .http://www.ispub.com/journal/the_internet_journal_of_microbiology/

32

volume_9_number_1_19/article_printable/isolation-of-fungi-and-bacteria-from-

housefly-musca-domestica-l-larvae.html. The Internet Journal of Microbiology 2010 :

Volume 9 Number 1. Diakses 1 juni 2012.

Pelczar, M.1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi I. Erlangga : Jakarta.

Suriawiria, Unus. 2005. Mikrobiologi Dasar. Jakarta: Papas Sinar Sinanti. Volk, W. A.

& M. F. Wheeler. (1993). Mikrobiologi Dasar. Erlangga. Jakarta.

Volk, W. A. & M. F. Wheeler. (1993). Mikrobiologi Dasar. Erlangga. Jakarta.

Setyawati ,Gita Novianti .2012).Endo agar dan EMBA..http://www.scribd. com/

doc/55707829/Endo-Agar-Dan-EMBA. Diakses tanggal 30 Mei 2012.

Soemarno. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Klinik. 2000. Akademi Analis Kesehatan

Yogyakarta. Yogyakarta

33