Simplexa™ CMV

REF MOL2200

Rev. E

Ensaio de PCR em tempo real para quantificação in vitro de citomegalovírus (CMV).

Uso diagnóstico in vitro

USO PRETENDIDO

O teste diagnóstico Focus Diagnostics Simplexa™ CMV foi criado para quantificação in vitro de ácidos nucléicos de

citomegalovírus (CMV) em amostras de plasma e sangue total usando o ciclador 3M Integrated Cycler.

O ensaio foi projetado para uso em conjunto com a avaliação do quadro clínico e de outros marcadores laboratoriais da doença, visando ao tratamento clínico e monitoramento de pacientes infectados por CMV.

O exame não foi concebido para triagem de CMV em sangue doado ou hemoderivados e deve ser usado exclusivamente por profissionais.

RESUMO E EXPLICAÇÃO

O citomegalovírus humano (CMV) é um herpesvírus beta pertencente à família dos herpesvírus humanos1 e a infecção pelo CMV

é encontrado em todas as populações humanas. Cerca de 70% ou mais dos adultos são soropositivos para anticorpos anti-CMV, que indicam infecção prévia por CMV. Em indivíduos hígidos, a infecção primária por CMV causa doença branda e inespecífica e pode até ser assintomática; em mulheres grávidas, porém, o CMV pode causar infecção congênita do feto ou do recém-nascido; e receptores de transplantes de órgãos sólidos podem desenvolver formas graves da doença após infecção primária.

2, 3 Assim como todos herpesvírus, o CMV permanece latente no hospedeiro após a resolução da infecção inicial e pode se reativar após imunossupressão ou outras doenças, sendo uma causa bem descrita de morbimortalidade em pacientes imunocomprometidos.

4 Em pacientes de alto risco, a detecção da replicação do CMV através da dosagem de vírus é essencial

para permitir o início precoce do tratamento. Se as concentrações séricas ou plasmáticas de vírus atingirem um determinado nível, pode-se indicar o uso de antivirais ou modificar os esquemas imunossupressores para evitar o surgimento de sintomas. Após o diagnóstico, o tratamento requer um ensaio capaz de monitorar e quantificar níveis sanguíneos e plasmáticos de CMV para ser eficiente e eficaz.

5, 6

O ensaio Simplexa™ CMV foi ajustado de acordo com as normas para CMV da OMS

7 e a carga viral do ensaio Simplexa™ CMV

é apresentada em Unidades Internacionais/ml (UI/ml). PRINCÍPIOS DO PROCEDIMENTO

O ensaio consiste em um sistema de amplificação e detecção por PCR que emprega como sonda um primer fluorescente bifuncional para detectar DNA de citomegalovírus em sangue total ou plasma. O teste consiste em duas etapas básicas: (1) extração de DNA de amostras do paciente e (2) aplicação de uma sonda/primer fluorescente bifuncional e um primer reverso para amplificar um segmento específico para análise (tanto no analito como em um controle interno). O alvo do ensaio é uma região bem conservada do gene UL83 do genoma do CMV, que permite identificar DNA viral na amostra. O processo de extração é monitorado por um controle interno que também detecta eventuais inibições da reação de PCR. Os sinais de amplificação obtidos das amostras são comparados a uma curva de calibragem e quantificados.

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MATERIAL FORNECIDO

O kit Focus Diagnostics SimplexaTM

CMV kit contém reagentes em quantidade suficiente para 100 reações.

Descrição do kit

Nome do componente REF SÍMBOLO EC NO RÓTULO

Nome abreviado

Cor da tampa

Nº. de frascos

Reações por frasco

ou kit

Volume por

frasco

Simplexa™ CMV Primer Mix MOL2201 REAG A PM Marrom 2 50/100 50 µl Simplexa™ Master Mix MOL2000 REAG B MM Verde 2 50/100 200 µl Simplexa™ Extraction & Amplification Control DNA

MOL9001 CONTROL IC IC Azul 3 50/150 250 µl

Simplexa™ CMV Low Positive Control MOL2202 CONTROL + LPC Branca 6 1/6 200 µl Simplexa™ CMV High Positive Control MOL2203 CONTROL ++ HPC Vermelha 6 1/6 200 µl

Descrição dos componentes

Componente Descrição

Simplexa™ CMV Primer Mix (PM) (Mistura de primer)

Primers fluorescentes marcados com corante para quantificação de CMV e controle interno

Alvo Fluoróforo da sonda (corante)

Excitação Emissão Gene visado

CMV FAM 495 nm 520 nm Gene UL83

Controle interno Q670 495 nm 520 nm Gene de A. thaliana

Simplexa™ Master Mix (MM) (Mistura Principal) DNA polimerase, tampão e dNTPs

Simplexa™ Extraction & Amplification Control DNA (IC) (DNA de controle para extração e amplificação)

Fragmento de DNA com 577 pares de bases DNA derivado do gene que codifica a unidade maior da ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase oxigenase (N-metiltransferase) da planta Arabidopsis thaliana.

Simplexa™ CMV Low Positive Control (LPC) (Controle positivo baixo)

CMV inativado em matriz de base humana

Simplexa™ CMV High Positive Control (HPC) (Controle positivo alto)

CMV inativado em matriz de base humana

Simplexa™ CMV Barcode Card (Cartão de código de barras)

Parâmetros específicos do ensaio.

MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS

1. Simplexa™ CMV Quantitation Standards REF MOL2210

2. Ciclador 3M Integrated Cycler com o aplicativo Integrated Cycler Studio versão 5.0 ou superior

3. Universal Discs para utilização no ciclador integrado

4. Universal Disc Cover Tape

5. a Roche MagNA Pure LC System e material de consumo associado.

6. a Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit (Nº. cat. Roche 03038505001)

7. b Instrumento bioMérieux NucliSENS® easyMAG™, material de consumo e reagentes associados.

8. b Pipeta multicanal Biohit/bioMérieux

9. b Placa em tira para ELISA

10. Micropipeta(s) de um ou vários canais ou de repetição com precisão de 1-10 µl, 10-100 µl e 100-1000 µl

11. Freezer (descongelamento manual) a temperaturas entre -10 e -30°C (para o armazenamento dos componentes congelados do kit)

12. Refrigerador a temperaturas entre 2ºC e 8°C (para amostras e componentes descongelados do kit)

13. Capela de biossegurança (fluxo laminar) para processamento de amostras

14. Microcentrífuga

15. Misturador de vórtex

16. Ponteiras para micropipetas estéreis, descartáveis, sem RNase/DNase e com proteção contra aerossóis.

17. Tubos e estantes de polipropileno de 1,5 ml para microcentrífugas (recomenda-se, mas não se exige, tubos sem RNase/DNase)

18. Luvas descartáveis sem talco

19. Água sem nuclease (para extração e como No-Template Control (NTC)) 20. Estantes de resfriamento para tubos de microcentrífugas de 1,5 ml a Para uso com o método de extração Roche MagNA Pure LC

b Para uso com o método de extração bioMérieux easyMAG

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VALIDADE E MANUSEIO

1. Armazene os reagentes a temperaturas entre -10 e -30 ºC e não utilize congeladores do tipo frost-free.

2. Antes do uso, deixe os reagentes descongelarem à temperatura ambiente (entre 18 e 25 °C, aproximadamente). 3. Não utilize kits ou reagentes fora das datas de validade.

4. Após o preparo da Reaction Mix, use-a em até uma hora. Armazene a Reaction Mix entre 2 e 8 °C até estar pronta para preparar o PCR.

5. Após descongelar, armazene o Primer Mix, a Master Mix, o Positive Control e a Extraction & Amplification Control DNA entre 2 e 8 °C por um prazo máximo de 30 dias.

6. Não recongele o Primer Mix, a Master Mix, a Extraction & Amplification Control DNA nem o Positive Control.

7. Não misture os reagentes de diferentes lotes de kits.

ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES

1. Todo material de origem humana deve ser considerado potencialmente infeccioso. Os materiais-fonte (incluindo os controles) utilizados neste produto foram testados usando métodos aprovados pelo FDA para antígeno de superfície de hepatite B, anticorpo contra hepatite C e HIV-1/2 (AIDS). Embora todos os testes tenham sido negativos, nenhum método é 100% eficaz em descartar a possibilidade de transmissão destes ou de outros agentes infecciosos por hemoderivados de origem humana. Todos os controles, amostras de soro e equipamentos que entrarem em contato com as amostras devem ser considerados potencialmente infectantes e descontaminados ou descartados de acordo com procedimentos adequados para risco biológico. O CDC e o National Institutes of Health recomendam que agentes potencialmente infecciosos sejam manuseados sob condições de biossegurança de nível 2.

8, 9

2. Use equipamentos de proteção individual como luvas e aventais de laboratório ao manusear os reagentes do kit e lave bem as mãos ao terminar.

3. Não pipete com a boca.

4. Não fume, beba, coma, manipule lentes de contato ou passe maquiagem em áreas onde os reagentes do kit ou amostras de origem humana forem manipulados.

5. Descarte os reagentes do kit e amostras de origem humana não utilizadas de acordo com as normas locais, estaduais e federais.

6. O trabalho no laboratório deve ser organizado de forma unidirecional, começando pelas áreas de pré-amplificação e segundo em direção à área de amplificação/detecção. A sequência de eventos entre a extração da amostra e a amplificação por PCR em tempo real é a seguinte:

Extração da amostra, configuração do equipamento de PCR em tempo real, preparo dos reagentes e amplificação por PCR em tempo real.

Recomenda-se evitar movimentação cruzada de materiais ou equipamentos entre as diferentes áreas do laboratório.

Os suprimentos e equipamentos utilizados para preparar as amostras não devem ser usados para preparar reagentes ou para processar DNA amplificado ou outras fontes de ácido nucleico a serem detectados.

Todos os suprimentos e equipamentos de amplificação devem ser mantidos na área reservada ao equipamento de PCR em tempo real.

Os equipamentos de proteção individual (p.ex. aventais de laboratório e luvas descartáveis) devem ser separados para cada área.

7. A contaminação de amostras de pacientes ou reagentes pode falsificar os resultados; portanto, use sempre técnica asséptica.

8. Pipete e manuseie cuidadosamente os reagentes para evitar misturar amostras entre cavidades adjacentes.

9. Empregue técnicas de pipetagem apropriadas e mantenha sempre o mesmo padrão de pipetagem ao longo de todo o procedimento, para garantir valores exatos e reproduzíveis.

10. Não substitua ou misture reagentes de diferentes lotes do kit nem de outros fabricantes.

11. Não troque as tampas dos tubos de reagentes para evitar contaminação, que pode comprometer os resultados do teste.

12. Utilize exclusivamente o protocolo descrito nestas instruções. Alterações do protocolo ou o uso de intervalos de tempo ou de temperaturas diferentes dos especificados podem produzir resultados errados.

13. O teste deve ser configurado em temperatura ambiente (18°C a 25°C aproximadamente). Enquanto estiver misturando os reagentes, utilize um bloco de resfriamento para refrigerar as enzimas.

14. Não reutilize Universal Discs já expostos a reagentes ou a amostras de pacientes.

15. Descarte os discos usados sem destacar a faixa de cobertura.

16. Se forem configurados diferentes kits ou lotes de Simplexa™

no mesmo disco, é necessário testar os Positive Controls e No Template Controls de cada kit.

17. A Master Mix contém glicerol em concentrações superiores a 1%, que pode causar irritação se for inalado ou entrar em contato com a pele. Nestes casos, devem-se tomar medidas de primeiros socorros. Observe as regras gerais de segurança ao manusear produtos químicos. Este produto não está sujeito aos regulamentos de identificação previstos pelas diretivas sobre materiais perigosos.

18. A armazenagem prolongada de amostras extraídas entre 2ºC e 8°C não é recomendada, pois não se sabem os efeitos deste procedimento sobre o desempenho do teste.

19. Não utilize o kit se a embalagem parecer estar quebrada ou danificada. Neste caso, procure a Focus Diagnostics. As informações para contato estão na última página deste documento.

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INSTRUÇÕES DE USO

A. COLETA DE AMOSTRAS

Os tipos de amostra aceitáveis são o sangue total e o plasma colhidos por punção venosa. Não use tubos de coleta com o anticoagulante heparina, pois a heparina inibe o PCR.

B. ÁREA DE EXTRAÇÃO DE AMOSTRAS

A extração de DNA de amostras e controles deve ser feita em uma área separada, e as amostras devem ser preparadas para extração em uma capela de biossegurança.

Extração pelo método Roche MagNA Pure LC

1. O DNA de amostras de pacientes e de controles do ensaio deve ser extraído com o kit Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid Isolation Kit usando o extrator Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor. Para informações sobre como utilizar o kit, consulte as instruções fornecidas pelo fabricante.

2. Na caixa de listagem “Protocol (Protocolo)”, do MagNA Pure LC System, selecione “Total NA” e depois “Total NA Variable_elution_volume.blk” na lista. As configurações apropriadas para a sequência serão carregadas.

3. O protocolo de amostra deve ser “Total NA Variable_elution_volume”.

4. O volume da amostra (Sample Volume) deve ser 200 µl e o volume de eluição 50 µl.

5. O volume de diluição deve ser zero para todas as amostras.

6. Verifique se o Post Elution Protocol está em “None”.

7. Verifique se as amostras e os controles estão posicionados corretamente no Cartucho de amostra

8. Agite em vórtex as amostras, LPC e HPC por 2 a 4 segundos e centrifugue rapidamente para depositar o conteúdo na parte inferior do tubo.

9. Pipete 200 µl de cada amostra (LPC, HPC e NTC) na posição correspondente no cartucho de amostra.

10. Inspecione visualmente o nível de amostra e dos controles no cartucho de amostra para verificar se a(s) amostra(s) foram adicionadas.

11. Agite a Extraction & Amplification Control DNA (IC) no vórtex brevemente duas vezes e centrifugue rapidamente para depositar o conteúdo na parte inferior do tubo.

12. Para cada conjunto de 16 amostras (1 a 16 amostras), pipete 100 µl do (IC) em 6 ml de tampão de lise em um tubo cônico. Agite brevemente em vórtex para misturar. Coloque na bandeja apropriada do equipamento de extração MagNA Pure.

o P.ex. se forem extraídas mais de 16 amostras (17 a 32 amostras), pipete 200 µl do IC em 12ml de tampão de lise em um tubo cônico. Agite brevemente em vórtex para misturar. Coloque na bandeja apropriada do equipamento de extração MagNA Pure.

13. Coloque o cartucho de amostra no MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor e inicie a sequência de extração.

14. Ao final da extração de ácidos nucleicos, o cartucho com os controles extraídos e as amostras do paciente podem ser extraídas do MagNA Pure e seladas. Armazene o DNA extraído entre 2ºC e 8ºC antes de usar. Recomenda-se não armazenar amostras a esta temperatura por períodos prolongados e mantê-las em um bloco refrigerado ao carregar o disco.

Extração pelo método bioMérieux NucliSENS® easyMAG™

1. O Manual de Instruções NucliSENS® easyMAG™ User Manual contém instruções sobre como usar o equipamento e o

software. 2. Selecione o template Generic no software NucliSENS

® easyMAG™ com as seguintes configurações:

Default Request (Solicitação default):

Generic 2.0.1 (or equivalent) (ou equivalente)

Run Name Prefix (Prefixo do nome da sequência):

(as appropriate) (conforme apropriado)

Sample ID prefix (Prefixo da ID da sequência):

(as appropriate) (conforme apropriado)

Sample Type (Tipo de amostra): Primary (Primária ) Workflow Defaults (Defaults da sequência):

On-board lysis Incubation (Incubação de lise on-board) On-board Silica Incubation (Incubação de sílica on-board) Sample Addition Guidance Off (Desligar orientação para adição de amostra)

Reagent Tracking (Rastreamento de reagentes):

Lysis, Silica, Internal Control reagent tracking disabled (Lysis, Silica, Internal Control reagent tracking desabilitado)

3. Digite as seguintes informações sobre amostras individuais na tela Extraction Request.

Sample ID (ID da amostra): (Enter sample name)( Digitar nome da amostra) Request (Solicitação): Generic 2.0.1 (or equivalent) (ou equivalente) Volume (ml): 0,200 Eluate (Eluído) (µl): 50 Type (Tipo): Primary (Primária) Priority (Prioridade): Normal Matrix (Matriz): Other (Outros)

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4. Crie a sequência de extração no NucliSENS® easyMAG™ conforme descrito no Manual do Usuário.

5. Agite em vórtex as amostras e os controles LPC e HPC por 2 a 4 segundos e centrifugue rapidamente para depositar o conteúdo na parte inferior do tubo.

6. Pipete 200 µl da amostra e dos controles (LPC, HPC ou NTC) no(s) recipiente(s) de amostra. 7. Agite a IC no vórtex brevemente duas vezes e centrifugue rapidamente para depositar o conteúdo na parte inferior do

tubo. 8. Pipete 5 µl de IC nas cavidades com amostras e nas cavidades de controle usando uma ponteira separada para cada

amostra. 9. Coloque o(s) recipiente(s) com amostra(s), o material descartável usado para aspiração e os reagentes no easyMAG™

de acordo com as instruções no Manual do Usuário. 10. Inicie a lise no equipamento e incube as amostras lisadas por dez minutos antes de adicionar a mistura com sílica

magnética. 11. Durante o período de incubação e lise, prepare e mistura de sílica magnética. Misture a sílica e dilua em água sem

nuclease misturando 1 parte de sílica magnética para cada 3 partes de água sem nuclease (p.ex. 270 µl de sílica magnética + 810 µl de água sem nuclease). Prepare pelo menos 135 µl de mistura de sílica magnética por amostra.

12. Para transferir a mistura de sílica para as cavidades na tira de ELISA, misture a sílica magnética utilizando uma ponteira no modo de operação P2 da pipeta Biohit. Pressione Start para aspirar 1050 µl da mistura de sílica magnética e Start novamente para dispensar a primeira parte de volta no tubo de mistura de sílica. Em seguida, pressione Start para

dispensar 125 µl da mistura de sílica magnética em oito cavidades diferentes da placa ELISA. Repita conforme necessário para novas placas ELISA.

13. Após incubação de lise por 10 minutos, use a pipeta Biohit com 8 ponteiras (para uma tira de ELISA) e no modo de operação P3 para transferir 100 µl da mistura de sílica magnética a cada amostra do recipiente de amostras. Coloque as ponteiras nas cavidades da tira de ELISA e pressione Start para misturar e aspirar a mistura de sílica magnética.

14. Coloque a mistura de sílica magnética nos recipientes apropriados e posicione a(s) ponta(s) da(s) pipeta(s) nas amostras abaixo do nível do líquido. Pressione Start para aspirar, dispensar e misturar (3 vezes) a sílica magnética e as

amostras. Mantenha as pontas das pipetas abaixo do nível do líquido para garantir a mistura correta. 15. Repita as etapas 13 e 14 para os outros recipientes com amostras. 16. Após adicionar sílica magnética a todos os recipientes com amostra, inicie a sequência de extração. 17. Ao final da sequência, retire os recipientes com amostra do instrumento. Se não for usar imediatamente as amostras,

coloque-as em tubos separados para reduzir as chances de a sílica magnética cair de volta na amostra. Armazene o DNA extraído entre 2ºC e 8ºC antes de usar. Recomenda-se não armazenar amostras a esta temperatura por períodos prolongados. Mantenha o DNA extraído em um bloco de refrigeração ao carregar o disco.

C. CONFIGURAÇÃO DO EQUIPAMENTO DE PCR EM TEMPO REAL

1. O Manual do Operador do Integrated Cycler contém instruções sobre como configurar o programa Integrated Cycler Studio e incluir definições de ensaios, programar e analisar sequências no equipamento.

Observação: Antes de iniciar sequências de teste, deve-se obter uma curva-padrão válida (sequência de calibração).

D. ÁREA DE PREPARO DOS REAGENTES

Área exclusiva para preparo da mistura de reagentes SimplexaTM

CMV.

1. Descongele o Primer Mix e a Master Mix à temperatura ambiente (entre 18 e 25 °C, aproximadamente). Cada frasco de componente do kit contém quantidade suficiente de reagentes para 50 reações. Antes de cada uso, misture suavemente os componentes da Primer Mix e da Master Mix e centrifugue rapidamente para precipitar os conteúdos no fundo do tubo.

2. Pipete o volume de cada componente, conforme indicado na tabela a seguir, para preparar o volume necessário da Reaction Mix em um tubo de microcentrifugação de polipropileno e de tamanho adequado.

Volumes de Reaction Mix

Reagente Reaction Mix Volume / 1 reação

Reaction Mix Volume / 10 reações

Simplexa™Master Mix 4,0 µl 40 µl Simplexa™ CMV Primer Mix 1,0 µl 10 µl Volume Total 5,0 µl 50 µl

3. Misture suavemente a Reaction Mix pipetando 8 a 10 vezes. 4. Centrifugue rapidamente para precipitar os conteúdos no fundo do tubo. 5. Configure a PCR. 6. A Reaction Mix deve ser usada em no máximo uma hora após o preparo e armazenada entre 2ºC e 8°C se não for

preparada logo antes do PCR.

E. ÁREA DE AMPLIFICAÇÃO POR PCR EM TEMPO REAL

Prepare o Universal Disc de 96 cavidades para o teste Simplexa™ CMV em uma área separada.

1. Adicione 5,0 µl da mistura reativa em cada cavidade. 2. Adicione 5,0 µl dos Positive Controls extraídos às cavidades “HPC” e “LPC”. 3. Adicione 5,0 µl da amostra extraída do paciente à cavidade “S” apropriada. 4. Adicione 5,0 µl do No-Template Control à cavidade “NTC”. 5. Cubra o disco com a fita de vedação do Universal Disc Cover Tape. 6. Abra a tampa do Integrated Cycler.

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7. Coloque o Universal Disc selado sobre a plataforma. 8. Feche a tampa com cuidado. 9. Clique em Run (Iniciar sequência) 10. Clique em Start (Iniciar).

F. ANÁLISE DE DADOS

1. O Manual do Operador do Integrated Cycler descreve em detalhes a análise dos dados e como exportar as sequências conforme necessário.

CONTROLE DE QUALIDADE

Cada laboratório deve estabelecer suas próprias faixas de controle de qualidade e a frequência de execução dos testes de controle de qualidade tendo como base as leis e regulamentos locais aplicáveis, bem como as boas práticas padrão de laboratório.

COMO RELATAR OS RESULTADOS

1. Teste de validade

Para verificar se a sequência foi válida, observe os resultados de CMV e Internal Control (IC) do Low Positive Control (LPC), High Positive Control (HPC) e No-Template Control (NTC). Uma sequência só será válida se os três controles atenderem aos critérios de aceitação. Se uma sequência for considerada inválida, todas as amostras deverão ser retestadas.

Critérios de aceitação

Controle CMV Extraction & Amplification Control DNA (IC) No Template Control (NTC) Não detectado Detectado Low Positive Control (LPC) Dentro da tolerância indicada na

documentação do lote Não se aplica

High Positive Control (HPC) Dentro da tolerância indicada na documentação do lote Não se aplica

Para o NTC ser considerado aceitável, os resultados devem ser CMV Not Detected e IC Detected. A detecção de CMV no NTC significa que as amostras podem ter sido contaminadas durante o processamento.

Para o LPC ser considerado aceitável, os resultados devem ser CMV Detected e LPC dentro dos limites de tolerância indicados na documentação do lote. O resultado do IC pode ser Detected, mas isto não é obrigatório.

Para o HPC ser considerado aceitável, os resultados devem ser CMV Detected dentro dos limites de tolerância indicados na documentação do lote no HPC. O resultado do IC pode ser Detected, mas isto não é obrigatório.

2. Interpretação dos resultados

Interpretação dos resultados

Exemplo Valor de CMV Valor de IC* Interpretação

1 Não detectado Detectado CMV não detectado

2 < 713 UI/ml Não se aplica CMV detectado abaixo do LLoQ (Limite inferior de quantificação).

3 X UI/ml Não se aplica CMV detectado a uma concentração específica

4 > 3,96 × 108 UI/ml Não se aplica CMV detectado acima do ULoQ (Limite superior de

quantificação). 5 Não detectado Não detectado Resultado inválido; realizar nova extração e repetir o ensaio.

3. Resultado da validação de amostras

Uma amostra será considerada validada se atender aos três critérios abaixo:

1. CMV não detectado e IC detectado.

2. CMV detectado; um resultado positivo para CMV não requer detecção de IC.

3. As curvas de amplificação devem ser analisadas para cada resultado, sobretudo se houver uma mensagem “Data Quality” (qualidade dos dados). As curvas de amplificação válidas crescem exponencialmente e com pouca variação. Consulte o manual do operador sobre as ações recomendadas.

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LIMITAÇÕES 1. Somente para uso diagnóstico in vitro.

2. Somente para exportação.

3. Os operadores devem ser treinados e adquirir familiaridade com os procedimentos do ensaio e da interpretação dos resultados antes de executarem o teste.

4. O aplicativo Integrated Cycler Studio armazena o último arquivo de calibração válido usado para quantificar amostras de pacientes. Os padrões de quantificação e as amostras de pacientes devem ser extraídas usando-se a mesma metodologia de extração, ou o ensaio pode produzir resultados incorretos.

5. Ao se monitorar um paciente, o mesmo método de extração deve ser usado em todos os ensaios, ou poderá não ser possível comparar os resultados.

6. Todos os resultados deste e de outros testes devem ser correlacionados com o quadro clínico, dados epidemiológicos e outras informações disponíveis ao clínico responsável pelo paciente.

7. A prevalência da infecção afeta o valor preditivo do teste.

8. Assim como em outros testes, resultados negativos não descartam infecção por CMV.

9. Os resultados podem ser falsos negativos se o agente infeccioso apresentar mutações, inserções, deleções ou rearranjos de seu genoma.

10. Resultados falsos negativos podem ocorrer se houver quantidade insuficiente de microorganismos na amostra devido a baixa carga viral, fase precoce da doença, técnica de coleta, transporte ou manuseio inadequados.

11. Assim como em outros testes, os resultados podem ser falsos positivos. Em algumas circunstâncias, pode-se repetir o teste ou realizar um ensaio com outro dispositivo.

12. O desempenho deste teste não demonstrado para triagem de CMV em amostras de sangue doado ou de hemoderivados.

13. Este teste não descarta a possibilidade de doenças causadas por outros patógenos bacterianos ou virais.

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CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENHO

COMPARAÇÃO ENTRE MÉTODOS

O teste foi comparado com um dispositivo de referência com marca CE por meio de análise de regressão linear de Passing-Bablok ao longo da faixa de resposta linear de ambos os ensaios. Os parâmetros de regressão linear (inclinação e interceptação) e os respectivos intervalos de 95% de confiança foram calculados pelo método Passing-Bablok.

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REPRODUTIBILIDADE

Foi realizado um estudo de reprodutibilidade em um painel com amostras de plasma extraído ou de sangue semeadas com concentrações variáveis de uma cepa de CMV. Cada matriz do painel continha uma séria de amostras negativas (não semeadas), positivas fracas (cerca de 2 a 4 vezes o LOD), positivas médias (cerca de 8 a 10 vezes o LOD) ou positivas fortes (próximo do limite superior do ensaio). Além disso, alguns níveis de calibragem tirados de um lote de Quantitation Standard (QS) de CMV (n=5) foram incluídos no painel para serem testados como ‘desconhecidos’.

O painel de amostras (n=13) continha Low Positive Control (LPC), High Positive Control (HPC) e um No Template Control (NTC) e foi extraído uma vez por dia por cada operador com instrumentos MagNA Pure LC, o kit de isolamento MagNA Pure Total Nucleic Acid e o sistema NucliSENS easyMAG™ usando os reagentes necessários. Em seguida, o painel de DNA extraído foi testado em quadruplicata usando-se o Integrated Cycler. Os resultados são mostrados na tabela abaixo.

O NTC, o plasma negativo, o sangue total negativo e um padrão de quantificação foram testados como parte do painel de reprodutibilidade. Todos os resultados foram reproduzíveis, mas seus valores estavam fora do intervalo do resultado do ensaio, e, portanto, não foram incluídos na avaliação de reprodutibilidade quantitativa.

Reprodutibilidade quantitativa (qCMV)

Componentes dos desvios padrão

Tipo de amostra

Nome da amostra

Método de extração

Concentração esperada

(UI/ml)

Concentração esperada

Log (UI/ml)

Média geométrica observada

(UI/ml)

Média observada

(UI/ml)

Nº. de resuiltados

mensuráveis

Variação entre

instrumntos

Variação entre dias

Variação entre

sequências

Variação entre

ensaios Total

CONTROLES

HPC

MagNA Pure

2,00E+06 6,301

2,00E+06 6,300 80 0,060 0,000 0,056 0,029 0,087

easy MAG 2,53E+06 6,402 80 0,022 0,039 0,042 0,016 0,064

LPC

MagNA Pure

2,00E+04 4,301

2,00E+04 4,301 80 0,000 0,000 0,090 0,066 0,112

easy MAG 2,14E+04 4,330 80 0,000 0,024 0,045 0,037 0,063

PLASMA

REPRO 6

MagNA Pure

5,00E+07 7,699

1,05E+08 8,021 80 0,048 0,034 0,064 0,023 0,090

easy MAG 3,19E+08 8,504 72 0,000 0,053 0,050 0,026 0,077

REPRO 7

MagNA Pure

7,10E+03 3,851

9,72E+03 3,988 80 0,094 0,033 0,063 0,063 0,133

easy MAG 3,42E+04 4,534 80 0,000 0,033 0,069 0,036 0,084

REPRO 8

MagNA Pure

2,84E+03 3,453

3,11E+03 3,493 80 0,121 0,042 0,000 0,150 0,197

easy MAG 1,26E+04 4,099 80 0,000 0,000 0,065 0,036 0,075

AQ

REPRO 2

MagNA Pure

2,05E+07 7,312

2,18E+07 7,338 80 0,000 0,000 0,056 0,020 0,059

easy MAG 2,02E+07 7,305 80 0,011 0,018 0,023 0,015 0,035

REPRO 3

MagNA Pure

2,10E+05 5,322

2,24E+05 5,351 80 0,000 0,000 0,046 0,025 0,053

easy MAG 2,06E+05 5,313 80 0,013 0,000 0,027 0,023 0,037

REPRO 4

MagNA Pure

1,87E+04 4,272

2,15E+04 4,333 80 0,047 0,000 0,040 0,079 0,100

easy MAG 1,91E+04 4,282 80 0,000 0,000 0,029 0,047 0,055

REPRO 5

MagNA Pure

4,74E+03 3,676

4,25E+03 3,629 80 0,000 0,000 0,000 0,138 0,138

easy MAG 5,13E+03 3,710 80 0,000 0,022 0,029 0,088 0,095

SANGUE TOTAL

REPRO 10

MagNA Pure

7,10E+03 3,851

1,47E+04 4,168 80 0,085 0,000 0,090 0,069 0,142

easy MAG 4,08E+03 3,611 77 0,060 0,071 0,322 0,093 0,348

REPRO 11

MagNA Pure

2,84E+03 3,453

5,97E+03 3,776 80 0,069 0,000 0,099 0,101 0,157

easy MAG 2,23E+03 3,348 73 0,126 0,118 0,162 0,117 0,264

REPRO 9

MagNA Pure

5,00E+07 7,699

1,22E+08 8,087 80 0,083 0,068 0,066 0,038 0,132

easy MAG 3,78E+07 7,578 80 0,137 0,000 0,231 0,016 0,269

Simplexa™ CMV Página 11

SENSIBILIDADE ANALÍTICA E LIMITE DE DETECÇÃO

A amostras no limite de detecção (LoD, Limit of Detection) usadas neste estudo foram obtidas de uma solução de estoque com uma cepa quantificada de CMV usada para inocular matrizes clinicamente negativas de plasma e sangue total. O painel incluía uma amostra negativa (sem inóculo) e concentrações variáveis de CMV próximas do LoD esperado, conforme determinado por testes de verificação.

O estudo consistiu em testar várias sequências para avaliar o LoD do kit CMV Simplexa™ usando-se dois métodos de extração.

Para determinar o LoD, foram realizadas três extrações e sequências de PCR separadas. Cada amostra extraída foi avaliada em octuplicada (uma extração e 8 cavidades) junto com os controles do ensaio (um teste) Cada elemento do painel foi testado em um total de 24 recipientes. O LoD é a menor concentração associada a taxa de detecção ≥ 95% na análise de probitos. O protocolo do LoD foi executado para cada tipo de amostra em cada um dos dois métodos de extração. Os valores individuais de LoD são apresentados na tabela abaixo. O LoD para o ensaio CMV baseado no LoD mais elevado para todos os tipos de amostras e métodos de extração foi determinado como 711 UI/ml.

Plasma Sangue Total

MagNA Pure EasyMag MagNA Pure EasyMag

UI/ml 711 99* 568 585

Cópias/ml 180 25* 145 148

* O LoD para este tipo de amostra foi determinado como a menor concentração com > 95% de detecção em 24 réplicas.

LIMITE INFERIOR DE QUANTIFICAÇÃO (LLoQ, Lower Limit of Quantitation)

O LLoQ foi definido como o menor valor de concentração em que o desvio padrão era ≤ 0,3 log UI/ml para todos os tipos de amostra e métodos de extração. O LLoQ foi determinado como sendo de 713 UI/ml.

LINEARIDADE

A linearidade foi determinada a partir de amostras obtidas de uma solução de estoque contendo uma cepa quantificada de CMV usada para inocular matrizes clinicamente negativas de plasma e sangue total. O painel consistia em pelo menos 10 agregados de cópias conhecidas em todo o intervalo onde se esperava desempenho linear. Nos agregados, pelo menos três concentrações estavam próximas do limite inferior de quantificação (LLoQ), duas estavam próximas do limite superior de quantificação (ULoQ, Upper Limit of Quantitation) e as restantes apresentaram distribuição aproximadamente uniforme entre o LLoQ e o ULoQ. Cada amostra foi testada aleatoriamente em pelo menos três ensaios. O protocolo de linearidade foi executado para cada tipo de amostra em cada um dos dois métodos de extração. Os valores individuais da faixa linear são apresentados na tabela abaixo.

Plasma Sangue Total

MagNA Pure EasyMag MagNA Pure EasyMag

UI/ml 713 a 3,96 × 108 396 a 3,96 × 10

8 396 a 3,96 × 10

8 396 a 3,96 × 10

8

Cópias/ml 180 a 1,00 × 108 100 a 1,00 × 10

8 100 a 1,00 × 10

8 100 a 1,00 × 10

8

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Gráfico de linearidade do plasma após extração easyMAG

Gráfico de linearidade do sangue total após extração easyMAG

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Gráfico de linearidade do plasma após extração MagNA Pure

Gráfico de linearidade do sangue total após extração MagNA Pure

Simplexa™ CMV Página 14

INTERVALO DE RESULTADO

Todos os métodos de extração e tipos de amostras foram lineares até < 3,96 × 108 UI/ml. A faixa inferior reportável do ensaio foi

baseada no tipo de amostra e de método de extração com o valor mais elevado para o limite inferior de quantificação (LLoQ) em UI/ml que estava também na faixa linear. O intervalo do resultado do ensaio foi determinado como ≥ 713 cópias/ml a ≤ 3,96 × 10

8

UI/ml. Amostras acima do intervalo linear devem ser descritas como > 3,96 × 108 UI/ml., Amostras superiores à faixa linear serão

reportadas como > 3,96 × 108 UI/ml e as amostras inferiores à faixa reportável serão reportadas como <713 UI/ml.

REATIVIDADE ANALÍTICA/ REATIVIDADE CRUZADA

A especificidade analítica e a reatividade cruzada do ensaio Simplexa™ foram avaliadas. Os estudos indicaram que os primers são específicos para CMV e não apresentaram reação cruzada com outros vírus e bactérias causadores de sintomas clínicos semelhantes ou encontrados na flora normal dos tipos de amostras analisados. Cada possível agente causador de reação cruzadas foi testado em triplicata.

Microorganismo

(plasma) Resultado Microorganismo

(sangue total) Resultado

HBV (materiais de controle sem diluição)

Não detectado NA NA

HCV (materiais de controle sem diluição)

Não detectado NA NA

Adenovírus Não detectado Adenovírus Não detectado HIV-1 Não detectado HIV-1 Não detectado HIV-2 Não detectado HIV-2 Não detectado HSV-1 Não detectado HSV-1 Não detectado HSV-2 Não detectado HSV-2 Não detectado HHV-6 Não detectado HHV-6 Não detectado Vírus JC Não detectado Vírus JC Não detectado HHV-7 Não detectado HHV-7 Não detectado HHV-8 Não detectado HHV-8 Não detectado Rubéola Não detectado Rubéola Não detectado Parvovírus Não detectado Parvovírus Não detectado Toxoplasma gondii Não detectado Toxoplasma gondii Não detectado VZV Não detectado VZV Não detectado EBV Não detectado EBV Não detectado HTLV-1 Não detectado HTLV-1 Não detectado

INTERFERÊNCIAS

O ensaio Simplexa™ CMV é específico para detecção de DNA de CMV na presença de agentes causadores de interferência, que incluem substâncias passíveis de serem encontradas em amostras de pacientes, substâncias exógenas presentes em amostras ou introduzidas durante a coleta. O estudo consistiu em ensaios para vírus CMV e agentes de interferência introduzidos em amostras negativas de sangue total e matriz plasmática. Não foi observada interferência com os agentes azatioprina, ciclosporina, ganciclovir, hidroxicloroquinae, prednisona, abacavir, efavirenz e darunavir. Nenhuma interferência foi observada.

CONTAMINAÇÃO CRUZADA

A contaminação por material amplificado foi avaliada para este equipamento e para o Universal Disc em outros testes. Os estudos procuraram a presença de contaminação em amostras negativas altas e consistiram em colocar alternadamente uma amostra positiva alta e outra negativa alta em cada disco. A contaminação cruzada foi avaliada comparando-se a taxa de resultados obtidos com a amostra negativa alta com a taxa esperada sob condições de reprodutibilidade normais. Os testes anteriores não mostraram efeitos de contaminação cruzada.

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REFERÊNCIAS

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3. Grundy JE, Lui SF, Super M, Berry NJ, Sweny P, Fernando ON, Moorhead J, Griffiths PD. Symptomatic cytomegalovirus infection in seropositive kidney recipients: reinfection with donor virus rather than reactivation of recipient virus. Lancet. 1988 Jul 16;2(8603):132-5.

4. Griffiths, P. D. and Emery, V.C. (2002) Cytomegalovirus, p 433-461 In D. D. Richman, R. J. Whitley, and F. G. Hayden (ed), Clinical Virology second edition. ASM Press, Washington, D.C.

5. Kalpoe, J. S., et al or (A. C. M. Kroes, M. D. de Jong, J. Schinkel, C. S. de Brouwer, M. F. C. Beersma, and E. C. J. Claas) (2004) Validation of Clinical Application of Cytomegalovirus Plasma DNA Load Measurement and Definition of Treatment Criteria by Analysis of Correlation to Antigen Detection p. 1498–1504 Vol. 42, No. 4 JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY

6. Baldanti F, Lilleri D, Gerna G. Monitoring human cytomegalovirus infection in transplant recipients. J Clin Virol. 2008;41(3):237-41.

7. Fryer JF. Heath AB, Anderson R, Minor PD and the collaborative study group. Collaborative study to evaluate the proposed 1st WHO International Standard for human cytomegalovirus (HCMV) for nucleic acid amplification (NAT)-based assays. WHO ECBS Report 2010; WHO/BS/10.2138.

8. NCCLS H18-A2. Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline. 2nd Ed. (1999). 9. CDC-NIH Manual. (1999) Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 4th ed. And National Committee for

Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Protection of Laboratory Workers from Instruments, Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue (NCCLS M29-A).

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