Utilización de la prueba de amplificación de ácidos nucleicos

(NAAT) para el diagnóstico de Clamidia y Gonorrea.

Victor N. Torres Álvarez, BSTania N. Pérez Del Río, BS

Vilmarie Figueroa Nieves, BSKatian Meléndez González, BS 1

Objetivos• Dar una breve explicación sobre clamidia y gonorrea, su

patología y los métodos tradicionales de diagnóstico.

• Presentar técnicas alternas para el diagnóstico eficiente de clamidia y gonorrea. • NAAT

• Mostrar técnicas automatizadas para el diagnóstico de clamidia y gonorrea, tomando como base la técnica de amplificación de ácidos nucleídos

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Introducción

Chlamydia trachomatis & Neisseria gonorrhoeae:1. Bacterias comúnmente conocida por causar enfermedades de

transmisión sexual (ETS) que afectan a mujeres y hombre.

Neisseria gonorrhoeaeChlamydia trachomatis

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Introducción:

30% con infecciones no tratadas ♀ C. trachomatis desarrollados enfermedad inflamatoria pélvica (PID)

Si no se trata, el 20% de los que tienen PID

sintomático podría llegar a ser estériles.

18% experimentará dolor pélvico debilitante y

crónica.

9% tendrá un embarazo ectópico en peligro la vida

Chlamydia trachomatis (sintomas)

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Introducción:

Chlamydia trachomatis

♀ Infecciones durante el embarazo puede ocasionar al infante conjuntivitis, neumonía y endometritis posparto materna.

ConjuntivitisNeumonía

5

Introducción:

Chlamydia trachomatis

♀ Infecciones durante el embarazo puede ocasionar al infante conjuntivitis, neumonía y endometritis posparto materna.

En la uretritis es la enfermedad más común que resulta de la infección. Las ♂

complicaciones (por ejemplo, epididimitis) afectan a una minoría de hombres infectados y rara vez resultan en secuelas de salud reproductiva.

Uretritis Epididimitis

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Introducción

Chlamydia trachomatis

Infección rectal son típicamente asintomáticos pero pueden progresar a proctocolitis.

7

IntroducciónChlamydia trachomatis

Artritis reactiva adquirida sexualmente también se ha reportado como una posible consecuencia de la infección.

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Introducción:

Ti ende n a c a us ar una res pues ta i nflam atoria fuerte que C. tra c h om atis .

♀ típicamente asintomática con complicaciones tales como PID (inflamatoria pélvica )

♂ infección uretrales causan uretritis con dolor al orinar, la epididimitis o infección gonocócica diseminada

Neisseria gonorrhoeae

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Introducción: Recomendaciones del CDC.

IndividuosPersonas sexualmente activas la evaluación

rutinaria de laboratorios

ComunidadPromover la

Comunicación y Educación para la

prevención y tratamientos disponibles.

LaboratoriosLa Utilización de

diversos procedimientos de detección más específicos para

mejorar la identificación de las bacterias

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Técnicas de Detecciٴón Basadas en Cultivo

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Diagnósticos Básicos de Bacteriología

• Aislamiento e identificación de Chlamydia trachomatis• Swabs especial

• Uretra masculina

• Conducto cervical

• Almacenaje• ≤4 ° C dentro de 24 horas

• -70 ° C > 24 horas

• Inócula • Centrifugación en una monocapa• McCoy

• HeLa 229

• Buffalo Green Monkey Kidney Cells

http://www.mysynergylab.com/resources/microbiology_collection_appendix/genprobe.aspx

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• Cultivo para C. trachomatis• Método varía entre Laboratorios

• Prueba diagnóstica más sensible para la infección por clamidia hasta la introducción de NAAT.

• Sensibilidad baja prolonga el tiempo de entrega.

• Desventajas:• Labor• Complejidad• Transporte• Costoso

Diagnósticos Básicos de Bacteriología

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• Aislamiento e identificación de N. gonorrhoeae

• Swab especial• Eje de plástico o alambre (otro tipo podría inhibir)• Insertar uretra masculina• Canal endocervical

• Uretritis• Exudado

• Transporte• Hasta 48 horas a RT

Diagnósticos Básicos de Bacteriología

http://www.mysynergylab.com/resources/microbiology_collection_appendix/genprobe.aspx

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Inóculado con el swab directamente al medio

Requisitos nutricionales y ambientales

Incuba en atmósfera enriquecida con CO2 a la mayor brevedad

Diagnósticos Básicos de Bacteriología

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• Medios utilizados:

• Muestras en áreas no estériles• Medios selectivos• Thayer-Martin o Martin-Lewis

• Muestras áreas estériles• Medios no selectivos• Agar chocolate

• Medios para aislar N. gonorrhoeae • Agar chocolate + agar sangre

Diagnósticos Básicos de Bacteriología

http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0001-63652005000300003

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• Aislamiento e identificación de N. gonorrhoeae• Características presuntivas:

Diagnósticos Básicos de Bacteriología

Aislados de muestra genitales

en medios selectivos

Diplococos gram– oxidasa + N. gonorrhoeae.

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Diagnósticos Básicos de Bacteriología

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• Cultivo para N. gonorrhoeae • Económico• Especifico• Sensitivo

• El manejo es fastidioso• Recolección, transporte, tiempo

• Las cefalosporinas son la única clase de antibióticos recomendados para el tratamiento de las infecciones de N. gonorrhoeae.

Diagnósticos Básicos de Bacteriología

http://classroom.sdmesa.edu/eschmid/lecture15-microbio.htm

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Pruebas de sensibilidad a antibióticos

• Proporciona información limitada debido a cambios genéticos en el cromosoma• Resistencia a:• Penicilina• Tetraciclina• Espectinomicina • Fluoroquinolonas

• Mutaciones en el DNA gyrase (gyrA)

• Mutaciones en la topoisomerasa (ParC)

• Pruebas de las alteraciones genéticas • Conocer completamente • Asociación con la resistencia

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Pruebas de sensibilidad a antibióticos

• Prueba de sensibilidad

• Cepas viable para documentar los marcadores genéticos exactos

• Se prueba en placas de dilución

• Valores de concentración inhibitorias mínimas

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Pruebas de sensibilidad a antibióticos

• Métodos más simples para susceptibilidad

• Difusión en disco y E-test (Epsilometer test)

• No son aprobados por la FDA para su uso en los Estados Unidos.

• Pero parecen ser susceptibles

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Pruebas de sensibilidad a antibióticos

• C. trachomatis• Según el 2010 STD Treatment Guidelines

• Azitromicina frente a doxiciclina demostró que los tratamientos son igualmente eficaces

• La eritromicina puede ser menos eficaz • Efectos secundarios

• Levofloxacino y ofloxacino son alternativas de tratamiento efectivas, mas costosas

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NAAT (Nucleic Acid Amplification Test)

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NAAT

• Identifica secuencias de DNA o RNA especificas del organismo de interés • Sensitividad• Habilidad de producir una señal positiva con solo una

sola copia de DNA o RNA• No depende de organismos viables para la

recuperación de DNA• NAATs comerciales han sido aprobados para detectar

ambos microorganismos a partir de:• Muestras vaginales/endocervicales• Muestras uretrales• “First catch urine” (hombres y mujeres)

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NAAT

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Metodos• Polymerase Chain Reaction (PCR)• qRT-PCR• Amplificacion del 16s RNA

• Strand Displacement Amplification (SDA)

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Strand Displacement Amplification (SDA)

• No basada en PCR• Utiliza la polimerasa del fago phi 29 de Bacillus (Φ29 phage)• Provee la capacidad de amplificar segmentos largos con una

frecuencia de error minima (1 en 9000)• “Random Primers”• No hay la necesidad de usar un ciclador termal• Mayor producto que en un PCR

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Strand Displacement Amplification (SDA)

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http://www.nature.com/nrmicro/journal/v6/n3/fig_tab/nrmicro1862_F1.html

NAAT• Ventajas:• Por encima de 90% de sensitividad y mas de 98% de especificidad

• NAAT detecta de 20-50% mas infecciones causadas por clamidia que por cultivo

• Utilización es especímenes no-invasivos• Orina• Pacientes con restricciones culturales o religiosas

• Diagnostico confiable en pacientes sintomáticos y asintomáticos de gonorrea y clamidia• Critico para el control de la enfermedad

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NAAT• Desventajas• Alto Costo• Requerimientos altos en control de calidad• Contaminación• Problemas relacionados a la secuencia

• Falsos positivos• Secuencia podrían variar entre cepas

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• Identificacion de cepas resistentes a antibióticos• Mecanismos moleculares de resistencia

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Sistemas automatizados basados en NAAT

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Abbott RealTime m2000 CT/NG

• Ensayo de amplificación in-vitro (PCR): C. trachomatis y N. gonorrhoeae• Muestras son obtenidas con hisopos de vagina,

endocervix y uretra (hombres) y/o orinas.• C. trachomatis-• Regiones conservadas para tipos salvajes y nuevas

variantes.• Plásmidos (X06707) encontrados en todos las variantes.

• N. gonorrhoeae-• Regiones del gen Opa

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Roche cobas® 4800 CT/NG• Detección in-vitro mediante amplificación (PCR) e

hibridización de ácidos nucleícos.• Se basa en los siguientes pasos:• Preparación de la muestra• Amplicación de las secuencias utilizando primers con biotina• Hibridización de los amplicones con sondas específicas• Detección de los productos hibridizados por colorimetría

• C. trachomatis- secuencias del plásmido (CP102, 103) y ADN cromosomal (CTMP 101,102) en muestras de orinas, endocervicales o uretras.• N. gonorrhoeae- ADN bacterial (DR-9) en

orinas y uretras (hombres), y endocervix. 35

Cepheid Xpert® CT/NG Assay

• Detección mediante realtime PCR (cuantitativo).• C.trachomatis – región distintiva del ADN cromosomal.• N. gonorrhoeae- dos secuencias independientes de

ADN.• Se obtiene resultados en 90 minutos. • Pasos principales:

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Hologic Aptima Combo 2 Assay

• Detección de CT/NG por amplificación mediada de transcripción (TMA) de rRNA.• Muestras en hisopos, orinas o pruebas de Pap

(ThinPrep). • Se basa en:• Liberación y aislamiento de rRNA en el medio. • Amplifica regiones de 23S rRNA en CT y 16S rRNA en GC. • Detección de amplicones mediante hibridización de ácidos

nucleicos (sondas quimioluminiscentes).

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BD ProbeTec ET CT/NG

• Utiliza la tecnología de SDA (Strand Displacement Amplification)• C. trachomatis- secuencias del plásmido (7,500 pb) • N. gonorrhoeae- región de gen de proteína homóloga

de pili. • Detección mediante transferencia de energía

fluorescente (ET).

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Conclusión• Avances tecnológicos en el campo de diagnostico clínico han

permitido el diseño de técnicas moleculares para la detección de patógenos.

• Esto nos permite no depender tanto en técnicas de cultivo.

• Además, ha permitido la disminución del tiempo requerido para la identificación de un patógeno.• Ya no hay limitaciones debido a la cinética de crecimiento del

organismo.

• Disminuye el periodo de evaluación.• Por ende, pacientes pueden ser tratado con mayor efectividad y

rapidez, disminuyendo la progresión de la enfermedad y de transmisión.

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Referencias• Gaydos et al., 2004. Comparison of Three Nucleic Acid Amplification

Tests for Detection of Chlamydia trachomatis in Urine Specimens. J Clin Microbiol. Jul 2004; 42(7): 3041–3045.

• Jaton et al/. 2006. A Novel real-time PCR to detect Chlamydia trachomatis in first-void urine or genital swabs. Journal of Medical Microbiology (2006), 55, 1667–1674

• Lasken, R (2012). Genomic Sequencing of Uncultured Microorganims from Single Cells. Nature Reviews Microbiology 10, 631-640 (September 2012)

• Schachter et al., 2005. Confirming Positive Results of Nucleic Acid Amplification Tests (NAATs) for Chlamydia trachomatis: All NAATs are not Created Equal. Journal of Clinical Micriobiology, Mar. 2005, p. 1372–1373

• Walker et al., 2008. Single Cell Genomics. Nature Reviews Microbiology 6, 176-177

• Whiley et al., 2006. Nucleic Acid Amplification Testing for Neisseria gonorrhoeae. J Mol Diagn. Feb 2006; 8(1): 3–15.

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Referencias• Guidelines for Managing Sexually Transmitted Infections.

Recuperado de: http://silverbook.health.wa.gov.au/Default.asp?PublicationID=1&SectionID=54

• Recommendations for the Laboratory-Based Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae — 2014. Recuperado de: http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/rr6302a1.htm

• https://www.abbottmolecular.com/us/products/infectious-diseases/realtime-pcr/c-trachomatis-n-gonorrhoeae-ct-ng-assay.html

• http://molecular.roche.com/assays/Pages/cobas4800CTNGTest.aspx

• http://www.hologic.com/sites/default/files/package%20inserts/502487-IFU-PI.pdf

• https://www.bd.com/ds/technicalCenter/whitepapers/LR598.pdf

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GRACIAS POR SU ATENCIÓN. ¿PREGUNTAS?