--~-----------------------------¥v~

Pyrogenbestimmung: Ein Vergleich verschiedener Methoden

Jutta MeiselHoechst AG, D-Frankfurt am Main

Zusammenfassung

Bei Pyrogenen handelt es sich um eine Gruppe chemischsehr verschiedener Substanzen. die bei parenteralerApplikation Fieber und in schweren Fallen sogar Schockauslosen konnen. Die wichtigsten Pyrogene in derpharmazeutischen Industrie sind Bakterien-Endotoxine,bei denen es sich um Zellwandbestandteile gramnegati-ver Bakterien handelt. Es gibt zwei Nachweismethoden:Der Pyrogentest beruht auf der Messung der Korpertem-peratur von Kaninchen vor und nach Injektion derProbe, der LAL- Test basiert auf der Reaktion einesEnzymkomplexes aus Zellen des Pfeilschwanzkrebses inGegenwart von Endotoxinen (in vitro Test). Vor- undNachteile beider Tests werden nachfolgend verglichen.Obwohl der LAL-Test mittlerweile im grojJen MajJeeingesetrt wird, ist ein vollstdndiger Ersatz des Pyrogen-tests bis heute noch nicht moglich. Der Grund liegtinsbesondere darin, daj3 einerseits mit dem LAL-Testlediglicli Endotoxine nachgewiesen werden konnen undandererseits einige Substanzen im LAL-Test nichtgemessen werden konnen, da sie den Test storen. EinBeispiel wird mit dem Vergleich der Ergebnisse aus derPriifung dreier verwandter Cephalosporine mit demPyrogentest und verschiedenen Methoden des LAL-Tests(Geltest, kinetisch-turbidimetrische und kinetisch-chromogene Methode) gegeben.

1 Einleitung

Als Pyrogene werden alle Stoffebezeichnet, die, einmal in der Blut-bahn, Reaktionen beim Menschenauslosen, die vorn einfachen Fiebermit Schiittelfrost bis hin zu todli-chern Kreislaufversagen reichen. Zudiesen Stoffen gehoren die Bakteri-en-Endotoxine als wirksamste allerPyrogene, bei denen es sich urnZellwandbestandteile gramnegativerBakterien handelt. Sie machen denGroBteil der Pyrogene aus, die inArzneimitteln gefunden werden. Alsseltenere und weniger wirksame Py-rogene sind neben etlichen Vireneinige wenige synthetische Substan-zen und Schwermetalle (z.B. Orga-nozinnverbindungen) zu nennen. Bei

ALTEX 12,2/95

Summary: Determination of Pyrogens: Comparison ofDifferent Methods.

Pyrogens are a group of chemically diverse substancesthat cause fever and shock in severe cases. The mostimportant pyrogenic substances in pharmaceuticalindustry are bacterial endotoxins. Bacterial endotoxinsare part of the cell wall of gram negative bacteria. Thereare two methods of detection: the Pyrogen test is basedupon the measurement of body temperature of rabbitsbefore and after injection of the specimen, the LAL-testis based upon the clotting reaction of an enzyme complexof cells of the horseshoe crab together with bacterialendotoxins (in vitro test). Advantages and disadvantagesof the two tests have been compared. Although the LAL-test is widly used a total replacement of the Pyrogen teststill is not possible since on the one hand the LAL-testwill only detect bacterial endotoxins and on the otherhand not all specimen can be tested with the LAL-testbecause of interference with the test. An example hasbeen given by comparing the test results of three relatedcephalosporins in the Pyrogen test and different methodsof the LAL-test (gel clot, turbidimetric kinetic, chromo-genic kinetic).

Keywords: pyrogen determination, LAL-tests, gel clotLAL, turbidimetric LAL, chromogenic kinetic LAL,bacterial endotoxins, cephalosporin

der Verabreichung grolserer Mengenyon Pyrogenen konnen schwerwie-gende Zwischenfalle auftreten. Ausdiesem Grund wird in allen Pharma-kopoen die Priifung auf Pyrogenebzw. Endotoxine gefordert.

2 Vergleich der unterschiedlichenNachweismethoden

In den fur uns relevanten Pharma-kopoen (DAB, EUAB, USP) sind diePrufung auf Pyrogene und die Pru-fung auf Endotoxine aufgefuhrt, wo-bei die altere Monographie der Pyro-gentest ist. Dieser wird am Kanin-chen durchgefuhrt und bietet einigeSchwierigkeiten, da die Tiere aufjegliche Storung zunachst einmal mit

Temperaturerhohung reagieren. Des-halb wird erst nach einer Anlaufpha-se, in der die Tiere sich beruhigensollen, das Produkt gespritzt und dieKorpertemperatur jedes Tieres danniiber mehrere Stunden iiberpriift. DieGrenzwerte fur Temperaturerhohun-gen, die auftreten diirfen bzw. eineWiederholung erlauben, fallen imVergleich der Pharmakopoen sehrunterschiedlich aus, so daB bei inter-nationalem Verkauf die strengstenAnforderungen zu ermitteln sind.Das ist sicherlich auch ein Grund fiirdie fehlende Standardisierbarkeit desPyrogentestes.Die Prufung auf Bakterien-Endo-

toxine wird mit Hilfe des LAL-Testes durchgefiihrt, bei dem einExtrakt aus Blutzellen des Pfeil-

89

~~ w~

------------------------h~'--~c~

••~?

schwanzkrebses Limulus polyphe-mus in Gegenwart yon Endotoxinmit Triibung oder Gelbildung rea-giert. Aus dieser Reaktion sind dieuntersehiedliehsten Methoden desLAL-Tests entwickelt worden. Dieeinfaehste ist sieher der Geltest, beidem die Misehung aus Pruflosungund LAL naeh Inkubation auf Gel-bildung hin untersueht wird. Dabeiergibt sich eine ja/nein-Aussage, dieRuckschlusse dariiber zulallt, ob diePruflosung einen Endotoxingehaltoberhalb der Empfindlichkeit desLysates aufweist oder nicht. In jun-gerer Zeit wurden neben der halb-quantitativen des Geltests aueh quan-titative Methoden entwickelt. Dazugehoren einerseits die Methoden derEndpunktbestimmung, bei denen dieTriibung oder Farbentwicklung einerProbe gemeinsam mit einer Stan-dardreihe zu einem festen Zeitpunktnaeh Inkubation gemessen werden.Andererseits gibt es kinetisehe Me-thoden, bei denen die Entwieklungder Triibung bzw. einer Farbungeiner Probe zusammen mit einerStandardreihe in Abhangigkeit vonder Zeit ermittelt wird. Die Zeit, dieeine Pruflosung benotigt, urn einebestimmte Extinktion zu erreichen,ist ein MaB fur deren Endotoxinge-halt.Jede Methode - Pyrogen test und

LAL-Test - hat Vor- und Nachteile,die naehfolgend noeh einmal aufge-fiihrt werden sollen. Besonders her-vorzuheben ist beim Pyrogentest derVorteil, daB aIle Pyrogene, also auehNicht-Endotoxin-Pyrogene erfaBtwerden. Urn eine Kontamination desProduktes mit den zuletzt genanntenStoffen auszusehlieBen, sollte des-halb neben dem LAL-Test an einigenChargen aueh der Pyrogen test ange-wendet werden. Dieses Vorgehenerweist sich heute insbesondere beider Neuentwieklung eines Produktesals wertvoll, da hierdureh moglicheKontaminationen reehtzeitig erkanntwerden, und der Prozef gegebenen-falls umgestellt werden kann. Alsbesonders gravierender Naehteil desPyrogen tests ist dagegen die Tatsa-ehe zu nennen, daB es sieh dabei urneinen Tierversueh handelt, der auf-

90

grund der Komplexitat des Organis-mus Tier im allgemeinen schwer zustandardisieren ist. Daraus ergibtsieh die Verpflichtung zu uberpru-fen, ob mit einer Ersatzmethode glei-ehe Ergebnisse erzielt werden kon-nen. Da der LAL-Test zwar diewiehtigsten Pyrogene, also die Endo-toxine erkennt, nieht aber die we-sentlieh weniger haufig vorkommen-den restlichen Pyrogene, kann aufden Pyrogentest als Mittel zur Vali-dierung der Pyrogenfreiheit einesProduktes bis heute noeh nieht ver-ziehtet werden. Dem tragt die Ver-lautbarung des BGA bzw. BMAReehnung, in der die parallele Prii-fung yon drei Chargen eines Produk-tes im Pyrogentest und LAL-Testgefordert wird. Wurde dabei dieAbwesenheit yon Nicht-Endotoxin-Pyrogenen gezeigt, ist es dann imSinne des Tiersehutzgesetzes alsdurehaus sinnvoll anzusehen, denPyrogen test fur ein Produkt durehden in vitro LAL-Test zu ersetzen.Zusatzlich ist dann die Validierungjedes Produktes im LAL-Test unbe-dingte Voraussetzung, weil - wienaehher noeh erlautert wird -, niehtalle Produkte fur die Prufung imLAL-Test geeignet sind.Naeh Uberwindung all dieser An-

fangsschwierigkeiten bietet derLAL-Test eine ganze Reihe un-schatzbarer Vorteile. Insbesondereist zu erwahnen, dass sieh mit demLAL-Test ein wesentlieh weiteresProbenspektrum, also z.B. aueh vieleInprozels-Kontrollen, die nieht amTier testbar sind, mit zugleieh hohe-rer Empfindliehkeit priifen laBt, waseine ProzeBvalidierung in bezug aufEndotoxinabreieherung oder eineFehlersuehe in nieht zu unterschat-zendem MaBe erst erleiehtert.Zunachst einmal ist grundsatzlich

davon auszugehen, daBjedes zu pru-fende Produkt den LAL-Test stort.Eine der einfaehsten Methoden, dieStorung in den Griff zu bekommen,ist die Verdiinnung. 99 % unsererProdukte lassen sieh auf diese Weiseohne Probleme validieren und da-naeh priifen. Die Ubereinstimmungder Ergebnisse des LAL-Tests mitdenen des Pyrogentests ist ebenfalls

gegeben. Wie untersehiedlieh aberselbst eng verwandte Stoffe im LAL-Test reagieren konnen, solI naehfol-gend anhand yon drei versehiedenenCephalosporinen dargestellt werden.

3 Drei verschiedene Cephalo-sporine im Vergleich

Antibiotika sind eine Substanzklas-se, die aueh im Kaninehentest niehtganz einfaeh zu prufen sind, dainsbesondere bei mehrfaeher Prii-fung am gleiehen Tier Nebeneffektedureh die Storung der Darmfloraauftreten konnen. Das ist aueh beiden Cephalosporinen nieht anders,so daB hier der Umstieg auf denLAL-Test besonders wiinsehenswerterseheint. Wir haben versueht, unse-re drei versehiedenen Cephalospori-ne zunachst wie alle unsere Endpro-dukte mit Hilfe des Geltests zuvalidieren (Tab. 1). Das klappte auehohne Probleme bei zwei Proben,wobei Cephalosporin 1 bereits beieiner Verdiinnung, die weit unter derMVD liegt, gepriift werden kann,Cephalosporin 2 dagegen an derMVD gepruft werden muB (MVD istdie hochste Verdiinnung, auf die einProdukt eingestellt werden darf, urnnoch eine Endotoxinkonzentration inder Ausgangslosung erkennen zukonnen, die dem Limit entspricht).Aueh Cephalosporin 3 lieB sich ander MVD noeh validieren, jedochnur unter soleh groBen Sehwierigkei-ten, daB uns die Prufung im Geltestals nieht haltbar ersehien. Tab. 2azeigt aueh schon die Tendenz derReaktion des Geltests auf unser Pro-dukt: Es geht hier eindeutig urn eineVerstarkung des Tests. So reiehengeringste Mengen endogenes Endo-toxin aus, urn in der ValidierungGelbildung auBerhalb der 2A.-Grenzezu erhalten. Wir haben es hier alsomit dem seltenen Fall eines "Enhan-cements" zu tun.Urn die Prufung yon Cephalospo-

rin 3 trotzdem vorn Pyrogen test aufden LAL-Test umzustellen, wurdenquantitative Tests zur Priifung ange-wendet, da diese im allgemeinendurch eine hohere Empfindlichkeit

ALTEX 12,2/95

wl":'\ MEISEL--~~~-----------------------------~v~

des Lysates gekennzeichnet sind(Tab. 2a). Daftir untersuehten wirdas Produkt zunachst mit dem kine-tiseh-turbidimetrisehen Test desLAL-5000. Das Ergebnis wies sichdurch stark schwankende Wiederfin-dungsraten des Endotoxins in derPositivkontrolle auch noch bei hohe-ren Verdunnungen als der MVD(1 :59) aus, die zu einem groBen TeilauBerhalb des erlaubten Bereichesvon fruher ± 25 % bzw. heute ± 50 %lagen (Tab. 3).Die hier anhand von zwei Chargen

exemplarisch dargestellten Ergebnis-se konnten mit einer ganzen Reiheweiterer Chargen bestatigt werden.Das Enhancement durch Cepha-losporin 3, das bereits im Geltestbeobachtet wurde, bestatigt sich alsoauch im kinetisch-turbidimetrischenTest. Interessanterweise bleibt dieseReaktion auch bei grofsten Verdun-nungen bestehen. Daneben ist dieWirkung des Produktes auf die Wie-derfindungsrate nicht konstant, d.h.daf das Enhancement einer Verdun-nungsstufe bei der nachsthoherenaufgehoben ist, bei weiteren Verdiin-nungsstufen jedoch wieder auftritt.Eine weitere Moglichkeit, das Pro-

blem in den Griff zu bekommen,ware sieher der Einsatz einer Pro-dukt-Standardkurve gewesen. Wirhaben dies en Ansatz nieht ausge-fuhrt, da bei diesen stark schwanken-den Wiederfindungsraten nicht zuerwarten war, daB die vorgeschriebe-nen Parameter fur interne Standard-kurven gehalten worden waren.Der Versuch, mittels Ultrafiltration

das Problem zu losen, scheiterteentweder an der Beschaffenheit derFilter, die Glucane abgaben und da-mit den Test storten, oder an zweifel-haften Abtrennleistungen derselben.Zur Zeit wird bei uns das Cepha-

losporin 3 aus diesen Grunden wei-terhin im Kaninchen getestet. Dane-ben untersuchen wir die Validierbar-keit des Produktes im kinetisch-chro-mogenen Test. Wie in der folgendenTabelle 4 zu sehen, scheinen dieseVersuche auch erfolgreich zu sein.Aus diesem Vortest kann der

Schluf gezogen werden, daB ab einerVerdunnung von 1:20 bei einer

ALTEX 12,2/95

Tabe//e 1: PrOfbarkeit der drei Cepha/osporine im Ge/test

Cephalosporin validierbare Verdunnung MVD

123

1 : 501 : 161 : 16

1 : 3331 : 161 : 16

Tabefle 2a: Validierung des Cephalosporin 3 im Geltest (deklarierte Ernpfindlich-keit: 0,03 EE/ml)

Charge Verdunnunq 0,0625 0,0313 0,0156 0,0078 Negativ-EE/ml EE/ml EE/ml EE/ml Kontrollen

1 : 16 + + ++ + ++ + ++ + +

2 1 : 16 + + ++ + ++ + ++ + +

3 1 : 16 + + ++ + ++ + ++ + +

Tabefle 2b: Lysat-Validierung:

0,0625 EE/ml 0,0313 EE/ml 0,0156 EE/ml 0,0078 EE/ml Negativ-Kontrollen

++++ ++++

Tabefle 3: Verhalten von Cephalosporin 3 im kinetisch-turbidimetrischen Test

Charge Verdunnunq Spike (theoret.: Wiederfindung Wiederfindungsrate0,0312 EU/ml) (EU/ml) (%)

1 : 10 0,0267 0,0519 1661 : 20 0,0267 0,0397 1271 : 40 0,0267 0,0422 1351 : 80 0,0267 0,033 1051 : 160 0,0296 0,0318 1011 : 320 0,0296 0,0576 1841 : 640 0,0296 0,0398 1271 : 1280 0,0296 0,0354 113

2 1 : 160 0,0372 0,0912 2921 : 320 0,0372 0,0767 2451 : 640 0,0372 0,096 3071 : 1280 0,0372 0,0899 288

Tabefle 4: Verhalten von Cephalosporin 3 im kinetisch-chromogenen Test

Verdunnunq Spike (theoret.) Spike (gefunden) Wiederiindungsrate (%)

1 : 10 0,02 0,019 95,61 : 20 0,02 0,021 102,61 : 40 0,02 0,020 99,81 : 80 0,02 0,020 98,4

91

MEISEL r:"\------------------------------~~~--~~~~.

Pyrogentest

Tabelle 5: Vor- und Nachteile von Pyrogen- und LAL-Test

LAL-Test

Vorteile

1 Jahrzehntelang weltweit erprobtes undanerkanntes Verfahren

2 Die Empfindlichkeit und Reaktion des Kaninchensgegen Pyrogene ahnelt der des Menschen

3 Erfassung aller Pyrogene - nicht nur der Endotoxine

Nachteile

1 Hoher Aufwand fur Tierhaltung, MeBstation und Labor

2 Zeitaufwendig3 Tierversuche4 Nicht standardisierbar

Vorteile

1 In vitro Test

2 Geringer Aufwand an Laborausstattung und Personal

3 Schnelles Vorliegen der Ergebnisse4 Hohere Empfindlichkeit als der Pyrogentest5 PrOfung eines weiteren Produktspektrums als beim

Pyroqentest rnoqllch (IPC, THS, Filter, Wirk- und Hilfsstoffe,medizinische Gerate, Radiopharmaka, Uberwachung vonProzeBwasser)

6 Standardisierbarkeit

Nachteile

1 Nachweis lediglich von Bakterien-Endotoxinen,nicht von allen Pyrogenen

2 Kann nicht bei allen Arzneimitteln angewendet werden

MVD von 1:46 der Test validierbarist. Desgleichen entsprachen auchdie bis jetzt durchgefuhrten Validie-rungslaufe den giiltigen Richtlinien.Sollte diese Methode yon den Behor-den fur die Endproduktprufung zuge-lassen werden, sehen wir gute Chan-cen, den Test fur dieses Produkt aufLAL umzustellen.An diesem Beispiel wird deutlich,

daB manche Produkte nur unterSchwierigkeiten auf den LAL- Testzu bringen sind. Bekannt ist schonseit geraumer Zeit, daB stark protein-haltige Produkte bis heute Schwie-rigkeiten im LAL- Test machen.Auch fur unsere oligen Produkte wardie Umstellung bis heute noch nichtmoglich. Die Nichtanwendbarkeitdes LAL- Tests fur eine ganze Reiheyon Produkten verhindert also bis

92

heute den Verzicht auf den Pyrogen-test. AuBerdem halten wir den voll-standigen Ersatz des Pyrogen testsdurch den LAL-Test ohne gegensei-tigen Abgleich fur unmoglich, dawie oben bereits ausgefuhrt, der Py-rogentest zwar unempfindlicher ge-gen Endotoxine reagiert, dafur aberaile pyrogenen Substanzen entdeckt.Damit ist eine Uberprufung einigerChargen eines Produktes im Pyro-gentest auf alle Hille anzuraten, eheauf den LAL- Test umgestellt wird.

KorrespondenzadresseJutta MeiselHoechst AG, PharmaQualitatskontrolleQBV, H785D-65926 Frankfurt am Main

Vorschau auf AL TEX 3/95(erscheint August/September):

T. Rieg und C.-M. Loblein(Fortsetzung): Schranken derLehrfreiheit, Fazit und Ausblick

G. Folkers: ModeUierung vonProtein-Ligand Komplexen alsBasis einer rationalenArzneistoffentwicklung

D. Keller: Pharmakokinetik-Simulationen im Unterricht

c. Striibing et al.: Etablierungeines in vitro Modellsystems zurDifferenzierung synaptisch ver-knupfter Nervenzellen aus pluripo-tenten embryonalen Stammzellender Maus

M. Schulz et aI.: Fischzellinien inder toxikologischen Bewertung vonAbwasserproben

A. Vedani, SlAT-Newsletter 6:Pseudo- und Toxorezeptoren in der3R-Forschung

D. Schimmel und D. van Truong:Pasteurellen in bebrutetem Huhner-ei II

ALTEX 12,2/95