Validacija sterilizacije - določitev roka uporabeValidacija sterilizacije – določitev roka uporabe steriliziranega materiala 2 Zahvala Zahvaljujem se mentorici red.prof.dr. Andreji

Damir Salajko

Validacija sterilizacije - določitev roka uporabe

steriliziranega materiala

Diplomsko delo

Maribor, april 2013

Validacija sterilizacije – določitev roka uporabe steriliziranega

materiala

Diplomsko delo visokošolskega strokovnega študijskega programa

Študent: Damir Salajko

Študijski program: visokošolski strokovni študijski program I. stopnje

Kemijska tehnologija

Predvideni strokovni naslov: diplomirani inţenir kemijske tehnologije (VS)

Mentor: red. prof. dr. Andreja Goršek

Somentor: doc. dr. Darja Pečar

Maribor, april 2013

Validacija sterilizacije – določitev roka uporabe steriliziranega materiala

1

IZJAVA

Izjavljam, da sem diplomsko delo izdelal sam, prispevki drugih so posebej označeni. Pregledal sem literaturo s področja diplomskega dela po naslednjih geslih: sterilizacija, avtoklav, validacija.

Maribor, april 2013 Damir Salajko


2

Zahvala

Zahvaljujem se mentorici red.prof.dr. Andreji Goršek za nasvete pri izdelavi diplomske naloge, kakor tudi somentorici doc.dr. Darji Pečar za mentorstvo. Zahvaljujem se tudi izvajalcem validacijskih meritev, podjetju Valfor, ki sta ga zastopala Borut Fink, dipl.inţ. in Jernej Kmet, dipl.inţ.

Posebna zahvala gre tudi podjetju Lek d.d. in nadrejeni vodji, Anči Svečak, dipl.inţ. za razumevanje ob moji odsotnosti z delovnega mesta. Nenazadnje gre zahvala moji druţini, ki je izkazala veliko mero potrpeţljivosti pri mojih odsotnostih z »druţinskega delovnega mesta«.


3


Povzetek

Namen diplomskega dela je bil z validacijo dokazati, da material (oprema), steriliziran po predpisanem postopku v parnem sterilizatorju - avtoklavu, ohrani sterilnost tudi po 30 dnevih hranjenja. V sklopu raziskav smo pripravili pakete z deli opreme, ki so nujno potrebni v proizvodnem procesu in jih vstavili v sterilizacijske posode poleg materiala (opreme), ki se uporablja v proizvodnem procesu. Te pakete smo nato izpostavili sterilizaciji s paro v avtoklavu. Po ohladitvi paketov na sobno tempeaturo smo izbrane dele steriliziranih paketov hranili v proizvodnih prostorih razreda čistosti D. Po 30 dnevih hranjenja smo na teh delih steriliziranih paketov določali sterilnost. Rezultati v diplomskem delu kaţejo, da je ustrezno sterilizirane in zapakirane pakete materiala (opreme) moţno hraniti 30 dni, ne da bi bila pri tem kakorkoli ogroţena njegova kvaliteta oz. sterilnost.

Ključne besede: validacija, sterilizacija, avtoklav, biološki indikatorji, distribucija temperature, rok uporabe, oprema

UDK: 614.48:615.014.4(043.2)


4

Validation of sterilization - determination of sterilization material`s usage time

Abstract

The purpose of our work was validation of sterilization which demonstrate that material (equipment) sterilized according to the prescribed procedure in a steam steriliser - autoclave maintains the sterility even after 30 days of storage.

In the context of this thesis, we have prepared packages with items of equipment that are necessary in the production process and inserted it into sterilization containers loaded with the material (equipment) used in the production process. These packets were exposed to steam sterilization in an autoclave and than stored in the production area with cleanliness grade D. After 30 days of storage sterilized packages were analyzed to determine sterility.

The results in this thesis show that properly sterilized and packed material (equipment) can be stored for 30 days, without being in any way compromised its quality or sterility.

Key words: validation, sterilisation, autoclave, biological indicators, temperature distribution, shelf life, equipment

UDK: 614.48:615.014.4(043.2)


5

Kazalo

Seznam tabel.................................................................................................................................... 7

Seznam slik...................................................................................................................................... 8

1 Uvod ................................................................................................................................. 10

2 Teoretični del .................................................................................................................... 11

2.1 Sterilizacija ......................................................................................................................... 11

2.2 Vrste sterilizacij .................................................................................................................. 11

2.2.1 Sterilizacija s čisto paro .............................................................................................. 11

2.2.2 Ostale pomembnejše metode sterilizacije ................................................................... 11

2.2.3 Osnove sterilizacijske kinetike .................................................................................... 12

2.2.4 Stopnja zagotavljanja sterilnosti ................................................................................. 13

2.2.5 Vrednost D – toplotna odpornost ................................................................................ 13

2.2.6 Z vrednost - vpliv temperature na D vrednost............................................................. 14

2.2.7 Vrednost L – stopnja smrtnosti ................................................................................... 15

2.2.8 F0 vrednost - učinkovitost sterilizacijskega procesa ................................................... 15

2.3 Validacija............................................................................................................................ 16

2.3.1 Definicija validacije .................................................................................................... 16

2.3.2 Validacija sterilizacije ................................................................................................. 16

3 Materiali in metode ........................................................................................................... 17

3.1 Oprema, naprave za izvedbo sterilizacijskega cikla ........................................................... 17

3.1.1 Avtoklav ...................................................................................................................... 17

3.1.2 Sterilizacijske posode .................................................................................................. 18

3.1.3 Nadzorni sistem........................................................................................................... 19

3.2 Oprema za izvedbo validacije ............................................................................................ 20

3.2.1 Večkanalni registrator temperature - validator ........................................................... 20

3.2.2 Termočleni (termometri) ............................................................................................. 21

3.2.3 Biološki indikatorji ..................................................................................................... 23

3.2.4 Termoblok (termokopel) z referenčnim merilnikom temperature .............................. 24

3.2.5 Kalibriran merilnik tlaka s sondo za merjenje tlaka ................................................... 25

3.2.6 Bowie & Dick testni paket .......................................................................................... 25

3.3 Sterilizirana oprema ........................................................................................................... 26

3.4 Sterilizacijski cikel ............................................................................................................. 27

3.4.1 Zgradba sterilizacijskega cikla .................................................................................... 27

3.4.2 Parametri sterilizacijskega cikla in parametri pri validaciji ........................................ 28

3.5 Obseg testiranja sterilizacijskega cikla pri validaciji ......................................................... 29

4 Eksperimentalni del .......................................................................................................... 29

4.1 Načrt izvajanja testiranja .................................................................................................... 29

4.2 Spremljanje parametrov sterilizacijskega cikla pri validacijski študiji ............................. 30


6

4.2.1 Test tesnosti avtoklava (vakuum test) ......................................................................... 30

4.2.2 Test sveţnja (bundle test) ............................................................................................ 30

4.2.3 Testiranje nasičenosti pare med fazo sterilizacije (Bowie & Dick test) ..................... 31

4.2.4 Test distribucije temperatur v prazni komori avtoklava ............................................. 32

4.2.5 Test distribucije temperature - napolnjena komora avtoklava .................................... 33

4.2.6 Najslabši primeri ......................................................................................................... 35

4.3 Test sterilnosti izbranih delov opreme ............................................................................... 35

5 Rezultati in diskusija ......................................................................................................... 36

5.1 Rezultati meritev, grafični prikaz ....................................................................................... 36

5.1.1 Kalibracija/verifikacija kalibracije TČ pred/po merjenju ........................................... 36

5.1.2 Uvodne meritve ........................................................................................................... 36

5.1.3 Distribucija temperature – prazna komora .................................................................. 38

5.1.1 Distribucija temperature – napolnjena komora (1. cikel) ........................................... 40

5.1.2 Distribucija temperature – napolnjena komora (2. cikel) ........................................... 42

5.1.3 Distribucija temperature s termočleni – napolnjena komora (3. cikel) ....................... 44

5.1.4 Rezultati testiranja bioloških indikatorjev ................................................................. 45

5.1.5 Rezultati testa sterilnosti izbranih delov opreme po minimalno 30 dneh hranjenja ... 47

6 Zaključek .......................................................................................................................... 51

7 Literatura ........................................................................................................................... 52


7

Seznam tabel

Tabela 3 - 1: Parametri sterilizacijskega cikla in parametri pri validaciji. ....................................... 28

Tabela 5 - 1: Kalibracija TČ pred merjenjem. .................................................................................. 36

Tabela 5 - 2: Verifikacija kalibracije termočlenov po merjenju sterilizacijskega cikla. ................... 36

Tabela 5 - 3: Rezultati testa tesnosti, testa sveţnja in Bowie & Dick testa. ..................................... 37

Tabela 5 - 4: Rezultati testa distribucija temperature – prazna komora. ........................................... 38

Tabela 5 - 5: Najslabši primeri. ......................................................................................................... 39

Tabela 5 - 6: Distribucije temperature s termočleni – napolnjena komora (1. cikel). ...................... 40



Tabela 5 - 9: Rezultati testiranja mikrobioloških indikatorjev. ....................................................... 45

Tabela 5 - 10: Rezultati testa sterilnosti na materialu, minimalno 30 d hranjenja. ........................... 47


8

Seznam slik

Slika 2 - 1: Kinetika sterilizacije. ...................................................................................................... 12

Slika 2 - 3: Vpliv različnih D vrednosti na stopnjo smrtnosti (last Fedegari Autoclavi). ................. 14

Slika 2 - 4: Grafično določanje Z vrednosti. ..................................................................................... 15

Slika 3 - 1: Princip delovanja avtoklava. .......................................................................................... 17

Slika 3 - 2: Moderni avtoklav. .......................................................................................................... 18

Slika 3 - 3: Sterilizacijska posoda (imenovana tudi »doboš«). ......................................................... 19

Slika 3 - 4: SCADA nadzorni sistem . .............................................................................................. 20

Slika 3 - 5: Validator Kaye 2000. ..................................................................................................... 21

Slika 3 - 6: Seebeckov tokokrog . ..................................................................................................... 22

Slika 3 - 7: Območja najpogosteje uporabljenih termočlenov . ........................................................ 22

Slika 3 - 8: Biološki indikatorji parne sterilizacije. .......................................................................... 24

Slika 3 - 9: Termoblok LTR-25/140 GE Kaye Instruments in referenčni merilnik .......................... 25

Slika 3 - 10: Območje uporabe Pt100 sonde. .................................................................................... 25

Slika 3 - 11: Testni paket Bowie & Dick. ......................................................................................... 26

Slika 3 - 12: Materiali (oprema) razporejeni po sterilizacijskih posodah pred sterilizacijo. ............ 26

Slika 3 - 13: Sterilizacijski cikel z značilnimi vakuumskimi pulzacijami na začetku ...................... 28

Slika 4 - 1: Termočleni, povezani v sveţenj pred testiranjem. ......................................................... 31

Slika 4 - 2: Obarvanost testne slojnice Bowie & Dick po vrsti: ....................................................... 32

Slika 4 - 3: Test distribucije temperature - razporeditev termočlenov (prazna komora). ................. 33

Slika 4 - 4: Test distribucije temperature - postavitev termočlenov in testnega paketa (napolnjena komora). ............................................................................................................................................ 34

Slika 4 - 5: Material (deli opreme), na katerem izvajamo test sterilnosti. ........................................ 35

Slika 5 - 1: Test tesnosti avtoklava – meritev tlaka. ......................................................................... 37

Slika 5 - 2: Rezultat Bowie & Dick testa. ......................................................................................... 38

Slika 5 - 3: Graf poteka sterilizacije prazne komore avtoklava. ....................................................... 39

Slika 5 - 4: Graf poteka sterilizacije napolnjene komore avtoklava (1. cikel). ................................. 41



Slika 5 - 7: Analitski izvid – biološki indikatorji. ............................................................................. 46

Slika 5 - 8: Rezultat testa sterilnosti, 1. testni paket. ........................................................................ 48

Slika 5 - 9: Rezultat testa sterilnosti, 2. testni paket. ........................................................................ 49

Slika 5 - 10: Rezultat testa sterilnosti, 3. testni paket. ...................................................................... 50


9

Uporabljeni simboli in kratice

T temperatura (°C)

N0 začetno število mikroorganizmov pred sterilizacijo

N število mikroorganizmov v določenem času sterilizacije, t

K konstanta hitrosti reakcije pri sterilizacijski kinetiki (min-1

)

F smrtnost procesa (min)

D merilo termične odpornosti (min)

F(T,Z) F vrednost, izraţena v smislu enakovrednega časa v minutah pri

referenčni temperaturi T, z uporabo temperaturnega koeficienta Z (min)

F0 F vrednost izraţena v smislu enakovrednega časa v minutah pri

temperaturi 121°C, z uporabo Z je 10 (min)

Z sprememba temperature, ki je potrebna za spremembo D vrednosti za faktor 10 (°C)

L stopnja smrtnosti (/)

SAL Serility Assurance Level (stopnja zagotavljanja sterilnosti) (št. mikroorganizmov/

enoto)

α koeficient termoelektrične napetosti ali tudi Seebeckov koeficient (μV/K)

rH relativna vlaga (%)

TDT Thermal death time (merilo toplotne odpornosti mikroorganizmov v minutah pri

temperaturi T (°C)

Grški simboli

koeficient termoelektrične napetosti, Seebeckov koeficient

gama ţarčenje gray (Gy)

Kratice

TČ termočleni, termočlen

EC European Commission (Evropska komisija)

FDA U.S. Food and Drug Administration (Agencija za hrano in zdravila v ZDA)

PIC/S Pharmaceutical Inspection Convention/Pharmaceutical Inspection Co-operation

Scheme (Farmacevtsko zdruţenje inšpektorjev)

GMP Good Manufacturing Practice (dobra proizvodna praksa)

USP United States Pharmacopeia (farmakopeja ZDA)

IRTD Intelligent Resistance Temperature Detectors (inteligentni temperaturni uporovni

detektor)

MPC miniature protective connector (mala zaščitna spojka)

LAF laminar air flow (laminarno gibanje zraka, uporaba v komorah)


10

1 Uvod

Sterilizacija opreme v čisti farmacevtski proizvodnji predstavlja vitalni del procesa, saj sterilizirana oprema v večini primerov prihaja v direktni stik s produktom. Poznamo več načinov sterilizacije (s čisto paro, z vročim zrakom, kemično, z γ ţarčenjem), vendar najpogosteje uporabljamo sterilizacijo s čisto paro v parnih sterilizatorjih oz. avtoklavih. Tak tip sterilizacije je zelo učinkovit, saj čista para doseţe tudi najteţje dostopne kotičke v neki opremi, proces pa je manj energetsko potraten od sterilizacije z vročim zrakom (potrebne višje temperature), bolj varen od sterilizacije z γ ţarčenjem in material je manj korozijsko obremenjen, kot pri kemični sterilizaciji (peroksiocetna kislina, vodikov peroksid). Ker je narava dela na proizvodnem obratu taka, da se delovne operacije hitro izmenjujejo, število osebja pa je omejeno na toliko, kot je v proizvodnem procesu nujno potrebno, nam prekratek rok uporabe lahko predstavlja »ozko grlo«. Temu se lahko izognemo npr. z večjim številom kompletov opreme, ki morajo imeti daljši rok uporabe. Glede na izkušnje v proizvodnem procesu se je ţe večkrat pokazalo, da je prekratek rok uporabe vitalne opreme lahko vzrok za zastoj. To še posebej pride do izraza ob raznih nepredvidenih dogodkih (izpad el. energije, izpad stroja pri katerem se ta oprema uporablja, kontaminacija). S podaljšanjem roka uporabe steriliziranega materiala imamo lahko več take opreme na zalogi in s tem prispevamo k odpravi ozkih grl v proizvodnji. Ob vpeljavi dveh vzporednih linij bi namreč opremo pripravili, kadar nam bi to proces dopuščal.

Trenutno se v svetu še vedno uporabljata dva načina avtoklaviranja. Prvi način je starejši in temelji na odstranjevanju zraka iz komore avtoklava na osnovi izpodrivanja zaradi mase (Gravity displacement), drugi način pa temelji na osnovi odstranjevanja zraka na osnovi izpodrivanja z vakuumom (Vacuum air removal) (1). V primeru uporabe avtoklava z gravitacijskim izpodrivanjem je lahko steriliziran material moker. To predstavlja določeno stopnjo tveganja kontaminacije z bakterijami ali njihovimi razpadlimi produkti (endotoksini), ne glede na to, da je material zavit. Posledično se v svetu vedno bolj uveljavlja drugi način, to je avtoklaviranje z vakuumiranjem. Ob pravilnem in ne pregostem nalaganju materiala v komoro avtoklava dobimo po končanem postopku suh material (2).

Trendi v bolnišnicah in ostalih medicinskih ustanovah sledijo zahtevam po doseganju boljše splošne oskrbe, vzdrţevanju visoke ravni varnosti bolnikov in osebja ter zmanjševanju stroškov. Ti trendi se neposredno odraţajo v neprekinjenem razvoju medicinskih pripomočkov in materialov, iz katerih so le ti narejeni. Primer je Lexan HPH4504H, prozoren, na visoko temperaturo odporen polikarbonat, ki je dobro obstojen in ohranja dobro razteznost tudi pri avtoklaviranju pri temperaturi 134 °C (3) .

Na drugi strani imamo farmacevtsko industrijo, ki se ves čas sooča z zniţevanjem stroškov v proizvodnji. Trendi pri avtoklaviranju gredo tako vedno bolj tudi v smeri uporabe krajših ciklov sterilizacije in višjih temperatur (134 °C).


11

2 Teoretični del

2.1 Sterilizacija

Sterilnost pomeni odsotnost vseh ţivih mikroorganizmov in njihovih spor. Sterilnosti opreme ali izdelka ne moremo zagotoviti s preiskušanjem ampak jo moramo zagotoviti z ustrezno validiranim postopkom sterilizacije (4). Sterilizacija je postopek, s katerim zagotavljamo sterilnost nekega izdelka, opreme ali učinkovine. Zaradi tega razloga mora biti sterilizacijski proces pred uporabo validiran, izvedba se mora spremljati rutinsko in oprema redno vzdrţevati (4).

2.2 Vrste sterilizacij

Poznamo več vrst sterilizacij. V diplomskem delu se ukvarjamo samo s sterilizacijo z visokotlačno paro, zato ostalih vrst sterilizacij ne obravnavamo podrobno.

2.2.1 Sterilizacija s čisto paro

Sterilizacijo izvajamo s paro, ki smo jo pripravili s pomočjo parnega generatorja z uparevanjen pitne, prečiščene ali deionizirane vode. Sterilizacija s čisto paro je najpogostejša metoda sterilizacije v farmacevtski industriji, hkrati pa tudi ena od najzanesljivejših metod za uničevanje mikroorganizmov in spor, predvsem zaradi velike sposobnosti penetracije. Sterilizacija z visokotlačno paro za uničevanje mikroorganizmov je pogosta metoda za sterilizacijo instrumentov. Voda pri višjem tlaku zavre pri višji temperaturi: pri nadtlaku 2 MPa tako vre pri 121 ˚C. Ta temperatura uniči vse oblike ţivljenja v 20 min ali manj. Visok tlak omogoča visoko temperaturo pare in s tem poveča njeno toploto in uničevalno moč. Večina toplotne moči izhaja iz izparilne toplote. To je količina energije, potrebna za pretvorbo vrele vode v paro. 1 mol pare ima skoraj sedemkrat več energije, kot ista mnoţina vrele vode. Ko para pride v stik s hladnejšo površino, kondenzira, njena prostornina pa se zmanjša 1 870-krat. To ustvari negativni tlak na mestu kondenzacije in pritegne še več pare. Kondenzacija poteka, dokler je temperatura površine, na kateri se para utekočinja, niţja od temperature pare. Para ubije mikroorganizme tako, da prenese svojo energijo njihovim proteinom in jih denaturira. Smrt je tako posledica ireverzibilne denaturacije proteinov in s tem prekinitve metabolnih procesov v organizmu. Čas, potreben za usmrtitev znane populacije mikroorganizmov v specifični suspenziji pri določeni temperaturi, je imenovan TDT (thermal death time). Povečanje temperature zmanjša TDT in obratno. Delo v biotehnologiji zahteva aseptičnost in tehnike sterilizacije omogočajo doseganje takih pogojev. Med sterilizacijami je sterilizacija z nadtlakom s paro še vedno med najbolj učinkovitimi, čeprav je energetsko zelo potratna (5).

2.2.2 Ostale pomembnejše metode sterilizacije

Od pomembnejših metod v tem delu omenjamo še sterilizacijo z vročim zrakom, kemično sterilizacijo in sterilizacijo z ţarčenjem. V primeru sterilizacije z vročim zrakom le tega s pomočjo električnih grelcev ogrejemo na temperaturo sterilizacije (najpogosteje izbrana je temperatura 160°C) in nato material, ki ga ţelimo sterilizirati, izpostavimo procesu sterilizacije. V primeru, da steriliziran material prihaja v neposreden kontakt s produktom, ki ga proizvajamo in ta produkt vstopa v paranteralno obliko zdravila, se posluţujemo tudi višjih temperatur (200 °C in več). Temu postopku pravimo depirogenizacija in sluţi za odstranjevanje pirogenov (endotoksini). Sterilizacijo z vročim zrakom v zadnjem desetletju v veliki meri izpodrivajo manj energetsko potratne metode, kot je kemična sterilizacija. Pri slednji je najpogostejša metoda sterilizacija z


12

vodikovim peroksidom. V preteklosti je bila pogosto uporabljana sterilizacija z etilenoksidom, ki pa jo v novejšem času vse bolj nadomešča sterilizacija z γ ţarčenjem. Pri tej sterilizaciji predmet, opremo ali neko drugo snov obsevamo s sevalno dozo 25 kGy. To metodo največkrat uporabimo v primeru sterilizacije temperaturno občutljivih snovi (polietilenske vrečke za pakiranje produkta). V aseptični proizvodnji kot metodo sterilizacije uporabljamo sterilno filtracijo raztopin skozi filter, katerega membrana ima pore velikosti 0,22 µm.

2.2.3 Osnove sterilizacijske kinetike

Kinetika uničenja homogene kulture mikroorganizmov, ki jo pri postopku sterilizacije izpostavimo konstantnemu letalnemu stresu, je oblike eksponencialne reakcije prvega reda. Stopnja mikrobiološkega uničenja je funkcija temperaturne odpornosti mikroorganizmov in letalnega stresa ter je neodvisna od števila le teh v postopku. Slika (2 - 1) kaţe kinetiko uničenja mikroorganizmov. Kinetika uničenja mikroorganizmov je logaritemska skala krivulje preţivetja, ki nikoli ne doseţe vrednosti nič. To pomeni, da pri nobeni temperaturi, ob kateremkoli času, ne moremo zagotoviti, da bodo uničeni vsi mikroorganizmi.

.

Slika 2 - 1: Kinetika sterilizacije.

Sterilizacijski proces mora zaradi varnosti pacienta zagotavljati dovolj nizko preţivetje mikroorganizmov . Doseči moramo predpisano število mikroorganizmov glede na sterilizirano enoto, SAL = 10

-6. Linearna oblika krivulje preţivetja pove, da je sterilizacija s paro napovedljiv

proces. Na podlagi tega lahko s poznavanjem števila in temperaturne odpornosti mikroorganizma razvijemo sterilizacijske specifikacije in parametre, ki zagotavljajo učinkovit in napovedljiv proces, poznan kot krivulja preţivetja mikroorganizma. Krivuljo preţivetja mikroorganizma lahko opišemo s semilogaritemskim modelom prvega reda (6). Obstaja linearni odnos med logaritemsko vrednostjo preţivetja izpostavljenih mikroorganizmov in časom izpostavljenosti pri določeni temperaturi (1):

0

( 0) (en.1)


13

kjer je:

N0: začetno število mikroorganizmov

N: število mikroorganizmov v času t

k: konstanta hitrosti reakcije (min-1

)

t0: začetek (min)

2.2.4 Stopnja zagotavljanja sterilnosti

Sterilnosti v katerikoli enoti populacije elementov, ki jih izpostavimo postopku sterilizacije, ni moţno kontrolirati, niti je ni moţno dokazati. Uničenje mikroorganizmov s fizikalnimi in kemijskimi metodami sledi eksponentnemu zakonu, zato vedno obstaja statistična verjetnost, da lahko mikroorganizem preţivi postopek sterilizacije. Za dani proces se verjetnost preţivetja določi glede na število, vrsto in odpornost mikroorganizmov, ki so prisotni in glede na okolje , v katerem organizmi obstajajo. Stopnja zagotavljanja sterilnosti (v nadaljevanju SAL) sterilizacijskega procesa je stopnja verjetnosti, do katere določen proces zagotavlja sterilnost izdelkov. SAL za določen proces je izraţen kot verjetnost prisotnosti nesterilne enote v populaciji. SAL 10

-6

mikroorganizmov na enoto izraţa verjetnost, da v 1x106 steriliziranih enot ni prisoten več kot 1 ţiv

mikroorganizem. Celoten proces, vključno s proizvodnjo, shranjevanjem in prodajo, mora zagotoviti SAL enak ali boljši kot 10

-6 mikroorganizmov na enoto. SAL postopka za dani proizvod

je določen s primernimi validacijskimi postopki (6).

2.2.5 Vrednost D – toplotna odpornost

D vrednost je merilo termične odpornosti mikroorganizmov. Pomeni čas v minutah, ki je potreben, da pri določeni T uničimo 90 % začetnega števila mikroorganizmov (različne D vrednosti prikazane na sliki 2 - 2). Izraţeno v log enotah to pomeni zmanjšanje začetnega števila mikroorganizmov za 1 log (1).

(en.2)

kjer je:

D: merilo termične odpornosti mikroorganizmov (min)

k: konstanta hitrosti reakcije (min-1

)

Vrednost D določamo za oceno temperaturne odpornosti izdelka, ko ţelimo ugotoviti vpliv spremembe formulacije na toplotno odpornost, za določanje toplotne odpornosti mikroorganizmov, ki smo jih izolirali iz proizvodnega okolja in za določanje vrednosti D bioloških indikatorjev (7). Vrednost D določimo s pomočjo krivulje preţivetja. D je obratno sorazmeren z naklonom premice semilogaritemskega modela. D lahko izračunamo z metodo direktnega štetja ali z metodo negativne frakcije (7). Pri metodi direktnega štetja določamo število preţivelih spor v vzorcih, ki smo jih različno dolgo časa izpostavljali določeni temperaturi. Čas, ki je potreben, da se populacija mikroorganizmov zmanjša za 1 log, lahko določimo grafično iz krivulje preţivetja, lahko pa ga izračunamo po enačbi, ki jo dobimo iz naklona krivulje preţivetja z uporabo linearne regresije (7). Pri metodi negativne frakcije večje število vzorcev s sporami izpostavimo enakim pogojem temperature in časa. Izberemo več časov sterilizacije in po inkubaciji določamo število sterilnih in nesterilnih vzorcev ob določenih časih sterilizacije. Z metodo Spearman - Karber določamo povprečen pričakovan čas, ki je potreben, da vzorec z mikroorganizmi postane sterilen. Z metodo Stumbo- Murphy-Cochran (7) pa analiziramo najverjetnejše število preţivelih mikroorganizmov.


14

Slika 2 - 2: Vpliv različnih D vrednosti na stopnjo smrtnosti (last Fedegari Autoclavi) (1).

2.2.6 Z vrednost - vpliv temperature na D vrednost

Pri parni sterilizaciji »Z« vrednost kaţe vpliv spremembe temperature na toplotno odpornost (vrednost D) mikroorganizmov. »Z” vrednost predstavlja negativni naklon premice. To je tista sprememba temperature, ki je potrebna, da se vrednost D spremeni za faktor 10 (1). Proces sterilizacije s paro največkrat izvajamo v ozkem območju temperatur (od 110 do 135 °C), zato iz praktičnih razlogov uporabljamo »Z« vrednost kot konstanto in sicer 10 °C (6).

»Z« vrednost najlaţje določamo grafično in sicer tako, da določimo temperaturi pri spremembi vrednosti D za faktor 10, kar prikazuje slika 2 - 3 in izračun (6):

( 2 1) ( 1 2)⁄ (en.3)

kjer je:

Z : negativni naklon premice

D1: D vrednost mikroorganizmov pri temperaturi T1 (min)

D2: D vrednost mikroorganizmov pri temperaturi T2 (min)


15

Slika 2 - 3: Grafično določanje Z vrednosti.

2.2.7 Vrednost L – stopnja smrtnosti

Določanje učinkovitosti sterilizacijskega procesa temelji na povezavi med časom pri točno določeni temperaturi in uničenjem mikroorganizmov. Pri praktičnem izvajanju sterilizacije temperature lahko malo nihajo okrog določene nastavljene (referenčne) temperature, ki je običajno 121 °C lahko pa tudi več (122,5 °C). Ta nihanja so navadno majhna, lahko pa imajo velik vpliv na smrtnost procesa (vrednost F). Zato za vsako temperaturo, ki jo izmerimo v določenih časovnih intervalih, izračunamo stopnjo smrtnosti (6):

( ) ( ) ⁄ (en.4)

kjer je:

L: eksponentna funkcija temperature in ţe majhne spremembe v temperaturi pomenijo velike spremembe v stopnji smrtnosti.

Z: temperaturni koeficient, po predpostavki enak 10 °C (negativni naklon premice) (6).

2.2.8 F0 vrednost - učinkovitost sterilizacijskega procesa

F0 meri učinkovitost nekega sterilizacijskega procesa. Je seštevek letalnosti serije temperatur po času (1):

0 ∫ ( ) (en.5)

kjer je:

dt: časovni interval med dvema meritvima temperature,

T: temperatura steriliziranega predmeta v nekem času t

Z : temperaturni koeficient, po predpostavki enak 10 °C


16

Kot standardno temperaturo za preračunavanje so izbrali 121 °C. Pri tej temperaturi je nasičena vodna para pod tlakom dovolj učinkovita, hkrati pa je temperatura še ekonomična (1).

Vrednost F označuje čas sterilizacije z enakovrednim učinkom mikrobiološkega uničenja, kot pri določeni referenčni temperaturi. Skupna vrednost F upošteva faze segrevanja in ohlajanja in se lahko izračuna z integriranjem stopnje smrtnosti glede na čas v določenih temperaturnih intervalih (en.5) (6).

V praksi časovne odvisnosti temperature niso na voljo, zato F0 izračunamo po sledeči enačbi :

0 ∑ ( ) ⁄ (en.6)

kjer je:

Δt: časovni interval med dvema meritvima temperature,

T: temperatura steriliziranega predmeta v nekem času t

Z: temperaturni koeficient, po predpostavki enak 10 °C

Če predpostavimo, da traja sterilizacija konstantno 15 min, pri temperaturi 121 °C dobimo:

F0 = 15 *10 121-121/10

= 15 *100 = 15*1= 15 min

Če bi sterilizacija potekala 15 min pri konstantni temperaturi 111 °C, bi dobili:

F0 = 15 *10 111-121/10

= 15 *10 -10/10

= 15-1

= 1,5 min (8).

V našem primeru imamo nastavljeno temperaturo sterilizacije v avtoklavu na 122,5 °C. Teoretično

bi bil naš F0 enak:

F0 = 15 *10 122,5-121/10

= 15 *10 1,5/10

= 15*10 0,15

= 15 * 1,41 = 21 min.

Ta trditev bi popolnoma drţala, če bi bila temperatura konstantna in če bi se material na vseh

mestih ogreval enako hitro.

2.3 Validacija

Z validacijo sterilizacije pri vnaprej določenih parametrih (sprejemljivih kriterijih) dokumentirano zagotovimo in potrdimo učinkovitost ter ponovljivost procesa sterilizacije (7).

Validiramo vse kritične postopke, procese, sisteme in ljudi. Izdanih je vrsta standardov ter priporočil za izvajanje validacij posameznih sistemov s strani EC, PIC/S, FDA, (9) (10) (11).

2.3.1 Definicija validacije

Po Annex 15, EU GMP (9) se definicija validacije glasi:

»Validacija je dokumentiran postopek preizkušanja in potrjevanja, da katerikoli material, proces, postopek, aktivnost, sistem, oprema ali mehanizem – uporabljen pri razvoju, proizvodnji, kontroli in distribuciji – lahko dosega, dosega in bo dosegal predpisane rezultate.« Z validacijo potrjujemo ustreznost procesa!

2.3.2 Validacija sterilizacije

Učinkovita validacija sterilizacije prispeva k zagotavljanju ţeljene kakovosti izdelka ali farmacevtske učinkovine. Ker kakovosti samo s končnim testiranjem izdelka ne moremo ustrezno


17

zagotoviti, moramo zato nadzorovati vse bistvene stopnje v proizvodnem procesu. Na tak način zagotavljamo, da bo izdelek ali farmacevtska učinkovina ustrezal vsem zahtevam po kakovosti. Za proizvajalce farmacevtskih izdelkov in učinkovin je ključno upoštevanje načel GMP (dobre proizvodne prakse). Proizvajalec farmacevtskih izdelkov ali učinkovin na osnovi ocene tveganja določi kritične procese nekega proizvodnega postopka, ki jih je potrebno validirati (6).

Glede na kritičnost procesa in tam, kjer je to smiselno, validacije izvajamo periodično (najpogosteje 1 x letno). Validacijo moramo ponoviti v primeru vsake spremembe, ki bi lahko kakorkoli vplivala na naš izdelek ali učinkovino. Taki validaciji pravimo revalidacija, obseg testiranja pa določimo glede na naravo spremembe in v dogovoru z oddelkom za kakovost v nekem podjetju.

3 Materiali in metode

Pri validaciji sterilizacije uporabljamo različne tehniške metode in materiale, ki so navedeni v poglavjih, ki sledijo.

3.1 Oprema, naprave za izvedbo sterilizacijskega cikla

3.1.1 Avtoklav

Avtoklav / sterilizator sta leta 1884, v Franciji odkrila Charles Chamberland in Louis Pasteur (12). Para vstopa v glavno posodo in se ob zadnji steni pomika navzdol; izstopanje pare se regulira z ventilom, ki nadzoruje tlak. Notranji pogoji so termostatsko kontrolirani, tako da se ob dosegu 121 ˚C temperatura določen čas ohranja.

Slika 3 - 1: Princip delovanja avtoklava (5).

1679 je francoski fizik Denis Papin (13) (sicer eden od izumiteljev parnega stroja) izumil predhodnika avtoklava, parni tlačni kuhalnik, znan tudi kot ekonom lonec. Papin je svoj izum poimenoval »Papinov razkuţevalnik« in je postal priljubljen pri pripravi hrane med francosko burţoazijo. Prvi komercialni sistem za steriliziranje s paro je bil na voljo šele leta 1889 (5).


18

Razcvet so avtoklavi dosegli v zadnjih tridesetih letih, z razvojem elektronike. Način sterilizacije se je v veliki meri avtomatiziral, saj celoten proces sterilizacije sedaj krmili računalnik. Zelo pomemben je napredek pri odstranjevanju zraka iz komore avtoklava, saj nam avtomatika omogoča vakuumske pulzacije. S takimi pulzacijami učinkovito odstranimo morebitne zračne ţepe iz komore. Avtoklavi se razlikujejo po velikosti in namembnosti. V farmacevtski proizvodnji se v večini primerov uporabljajo takoimenovani »čisti« avtoklavi. Taki avtoklavi se nahajajo v prostorih z različno kvaliteto filtriranega zraka, zato so narejeni tako, da imajo dvoje vrat. Tak način omogoča, da material, ki ga ţelimo sterilizirati, vstavimo v avtoklav v prostoru z niţjo kvaliteto zraka (pralnica) in ga po sterilizaciji vzamemo v prostor z višjo kvaliteto zraka (na mestu uporabe). Zunanjost takih avtoklavov je ravna, z čim manj odprtinami in predvsem gladka (kot lahko vidimo na sliki 3 - 2). S tem po eni strani omogočamo laţje čiščenje, na drugi strani pa laţje vzdrţujemo mikrobiološko kvaliteto površin. Pomembnejši svetovni proizvajalci avtoklavov so: Belimed, Fedegarri, Steris, Gettinge. Pri nas izdeluje avtoklave podjetje Kambič, iz včasih skupne domovine Jugoslavije pa so nam ostali v spominu avtoklavi Sutjeska.

Slika 3 - 2: Moderni avtoklav.

3.1.2 Sterilizacijske posode

Sterilizacijske posode so lahko različnih oblik in velikosti. Narejene so iz aluminija ali neerjavečega jekla, pokrov pa je narejen iz umetne mase, kot je naprimer poliuretan. V pokrov je integriran permanentni filter (pri večjih dimenzijah tudi dva, kot kaţe slika 3 - 3) s katerim zagotavljamo sterilnost notranjosti. V notranjosti posode se nahaja mreţasta košara iz neerjavečega jekla, ki zagotavlja, da sterilizirani predmeti ne leţijo na dnu, hkrati pa omogočajo, da para doseţe vse dele, ki jih steriliziramo.


19

Slika 3 - 3: Sterilizacijska posoda (imenovana tudi »doboš«).

Pri vsakdanjem delu in pri validaciji smo uporabili sterilizacijske posode proizvajalca Aesculap, Germany.

3.1.3 Nadzorni sistem

Med potekom sterilizacije se podatki o izbranem programu, operaterju, temperaturi, tlaku in času ves čas prenešajo na nadzorni sistem. Ta deluje v tako imenovanem SCADA programu. Program SCADA (Supervisory Control And Data Acquisition) sluţi za nadzor in kontrolo procesa preko osebnega računalnika. Glavni lastnosti SCADA sistemov sta zanesljivost in večopravilnost, saj z enim SCADA sistemom lahko nadziramo več naprav ali objektov (14). Slika 3 - 4 prikazuje primer SCADA sistema za nadzor avtoklava, Tascomp Limited, UK.


20

Slika 3 - 4: SCADA nadzorni sistem .

3.2 Oprema za izvedbo validacije

- Večkanalni registrator temperature, - Termočleni (v nadeljevanju TČ) tipa T ali J razporejeni v komori avtoklava, - Biološki indikatorji, - Termoblok ali referenčna visokotemperaturna kopel, - Referenčni merilnik temperature (IRTD sonda), - Kalibriran merilnik tlaka v kombinaciji s sondo za merjenje tlaka, - BOWIE & DICK testni paket.

3.2.1 Večkanalni registrator temperature - validator

Za validacijo uporabljamo večkanalni registrator temperature (slika 3 - 5), ki ima moţnost priključitve termočlena (TČ) in zaznava temperaturo z ločljivostjo ≤ 0,1 C ter deluje z negotovostjo merilnega sistema boljšo od 0,5 C. Validator (Validator 2000, GE Kaye Instruments, USA) je samostojen instrument, ki ga sestavljata vgrajena zelo natančna merilna in zanesljiva snemalna enota. Ima 36 priključnih mest za TČ in eno priključno mesto za referenčno temperaturno sondo. Del naprave je tudi tiskalnik, za tiskanje surovih podatkov (»raw data«). Poleg vsega naštetega ima validator tudi vgrajen USB priključek in zaslon. V primeru izpada električnega napajanja, sistem deluje še 30 min in ta čas ohranimo vse posnete podatke (15).

Validator mora izpolnjevati vsa priporočila glede izvajanja elektronskih podpisov, ki jih predpisuje dokument FDA Regulation 21 CFR part 11, Electronic records; Electronic signatures (16).

Priporočila so naslednja:

- Dva nivoja identifikacije – uporabniško ime in geslo,

- Unikatno uporabniško ime,

- Uporabnik si sam kreira svoje geslo,


21

- Za vsako dejanje, ki vpliva na varnost in integriteto podatkov je potrebna uporaba uporabniškega imena in gesla,

- Elektronski podpis identificira uporabnika ter datum in čas posega v sistem.

- V primeru poskusa spremembe podatkov mora datoteka postati nedostopna.

- Čas veljavnosti gesla je nastavljiv,

- Sistemski administrator lahko nastavi minimalno dolţino gesla,

- Moţnost onesposobitve uporabniškega računa v primeru treh neuspešnih prijav uporabniškega imena,

- Sledljivost mora omogočati popoln pregled dogodkov, ki so povezani z integriteto programa validatorja in naprave,

- Podatki o sledljivosti morajo vsebovati vse dogodke, vrsto posega, datum in čas ter odgovornega operaterja,

- Validatorjeva programska oprema mora zaznati vsako naknadno dodajanje ali brisanje datotek.

Slika 3 - 5: Validator Kaye 2000.

3.2.2 Termočleni (termometri)

Termočlen (imenovan tudi termopar) je sklenjen električni krog iz dveh različnih vodnikov, po katerem steče električni tok, če sta na spojnih mestih različni temperaturi. Termočleni (TČ) se veliko uporabljajo v elektroniki kot temperaturna zaznavala. Glavna omejitev je natančnost. Toka v električnem krogu ni, če je na spojnih mestih enaka temperatura. TČ uporabljamo tudi kot termometre. Spojno mesto TČ je zelo majhno, kar je ugodno. TČ ima majhno toplotno kapaciteto in ga je moč uporabljati na širokem temperaturnem območju, na primer pri segrevanju kovin. (17)

Thomas Johann Seebeck je leta 1821 (18), po naključju odkril, da kadar je vodnik (kot je na primer kovina ali polprevodnik) podvrţen temperaturnemu gradientu, se bo v njem pojavila električna napetost. Ta pojav je kot eden od termoelektričnih pojavov, znan kot Seebeckov pojav. Seebeck je odkril tudi, da se je igla v kompasu odklonila, če je bila v bliţini zanka iz dveh kovin s temperaturno razliko na spojih. Kovini se namreč na temperaturno razliko odzoveta različno, kar povzroči električni tok in ta magnetno polje. Slika 3 - 6 kaţe zgradbo Seebeckovega kroga. Gonilna napetost v termoparu je sorazmerna s temperaturnim gradientom ΔT, če je dovolj majhen (17).


22

(en.7)

kjer je:

α: koeficient termoelektrične napetosti ali tudi Seebeckov koeficient (μV/K)

ΔT: razlika temperatur tople in hladne kovine (K)

Slika 3 - 6: Seebeckov tokokrog (17).

.

Poznamo več tipov TČ. Pri validaciji sterilizacije v avtoklavu, kjer nam kot sterilizacijsko sredstvo sluţi čista para, največkrat uporabljamo TČ tipa T, zaradi dobre odpornosti na vlago. Slika 3 - 7 prikazuje vrste najpogosteje uporabljenih TČ in njihova območja delovanja.

Slika 3 - 7: Območja najpogosteje uporabljenih termočlenov (19).

TČ tipa T je sestavljen iz dveh ţic, od katerih je ena iz bakra (Cu), druga iz konstantana (zlitina Cu-Ni). Kot je razvidno iz slike 3 - 7, je njena lastnost, da ima v temperaturnem območju od -250 °C


23

do 350 °C zanesljivost večjo od 0,5 °C ali 0,4 %. Ţici sta izolirani. TČ morajo biti kalibrirani v skladu s postopkom za kalibracijo. Odstopanje celotnega merilnega sistema skupaj s termočleni mora biti ≤ 0,5 C (20). Etalonska oprema mora biti ustrezno kalibrirana. TČ v avtoklav namestimo skozi skozi posebno cev imenovano uvodnica.

3.2.3 Biološki indikatorji

Biološki indikator je na splošno definiran kot karakteriziran pripravek specifičnih mikroorganizmov, ki zagotavlja definirano in stabilno odpornost na določen postopek sterilizacije.

Mikroorganizmi, ki so primerni za biološke indikatorje so sporogene bakterije. Ti mikroorganizmi so bistveno bolj odporni na proces sterilizacije, kot običajna mikroflora.

Biološke indikatorje uporabljamo:

- Kot pomoč pri razvoju in vzpostavitvi ustrezno validiranega sterilizacijskega procesa.

- V procesih sterilizacije končnega izdelka v embalaţi (terminalna sterilizacija), kot tudi za sterilizacijo opreme, materialov in pakirnih komponent, ki se uporabljajo v aseptični proizvodnji.

- Za spremljanje sterilizacijskih ciklov pri periodičnih validacijah sterilizacij.

- V procesu dekontaminacije izolatorjev.

Poznanih je več tipov bioloških indikatorjev. Vsaka vrsta indikatorjev vključuje znane vrste mikroorganizmov v znani odpornosti na sterilizacijo. Nekateri biološki indikatorji lahko vsebujejo tudi dve različni vrsti in koncentraciji mikroorganizmov. V biološkem indikatorju smejo biti prisotni samo navedeni testni mikroorganizmi.

Najpogostejši tipi bioloških indikatorjev so:

- Indikatorji s sporami na nosilcu (filter papir, steklo, plastika) in zapakirani, da se ohrani njihova integriteta. Nosilec in primarno pakiranje morata biti odporna na sterilizacijski proces, njuna oblika pa lahko le minimalno vpliva na izgubo originalnega inokuluma med transportom in hranjenjem.

- Suspenzija spor, ki je inokulirana na ali v reprezentativno enoto izdelka, ki ga steriliziramo. Namesto dejanskega produkta, lahko uporabimo tudi simuliran produkt, kadar inokulacija dejanskega produkta ni praktična. Simuliran produkt je pripravek, ki se razlikuje v eni ali več moţnosti od dejanskega izdelka, obnaša pa se kot aktualen produkt. V takih primerih je pogosto priporočljivo določiti D in z vrednost specifičnega mikroorganizma v biološkem indikatorju. Ne glede na to, ali uporabljamo aktualen ali simuliran produkt, je temu potrebno določiti populacijo spor, D vrednost, z vrednost (če je izvedljivo) in L stopnjo smrtnosti.

- Samostojni (vse v enem) biološki indikator. Zasnovan je tako, da primarni paket, poleg spor vsebuje tudi rastni medij za rast testnega mikroorganizma in barvilo, ki spremeni barvo v primeru pozitivne inkubacije (pomeni, da naša sterilizacija ni bila uspešna).

Ne glede na tip biološkega indikatorja, mora oblika biološkega indikatorja omogočati dobro penetracijo sterilizacijskega sredstva (para). Po sterilizaciji je potrebno biološke indikatorje inkubirati pri različnih pogojih. V našem primeru bomo uporabljali tretji tip bioloških indikatorjev, katerih prednost je tudi enostavna vizualna identifikacija. Prikazani so na sliki 3 - 8. Vse postopke, povezane s pripravo bioloških indikatorjev mora proizvajalec obvladovati z dokumentiranim sistemom kakovosti. Pravilna izbira biološkega indikatorja zahteva dobro poznavanje


24

mikroorganizma in njegovo rezistenco na postopek sterilizacije. To bo zagotovilo, da izbran biološki indikator predstavlja večji izziv za postopek sterilizacije, kot je prirast mikroorganizmov v ali na proizvodu. Pri načrtovanju procesa sterilizacije uporabljamo v glavnem dve metodi in sicer metodo, temelječo na osnovi prirasta mikroorganizmov (»bioburden«) in metodo pretiranega uničenja (»overkill«). V primeru uporabe »overkill« principa pri načrtovanju validacije štetje in določitev števila mikroorganizmov (»bioburden«) ni potrebno (21) .

Pri sterilizaciji z nasičeno paro kot testni mikroorganizem pogosto uporabljamo spore mikroorganizma Bacillus stearothermophilus, ki so komercialno na voljo. Ostali, na toploto odporni mikroorganizmi, ki so tudi komercialno na voljo, so še Clostridium sporogenes, Bacillus subtilis, and Bacillus coagulans (20).

V našem primeru bomo uporabili biološke indikatorje za parno sterilizacijo s populacijo spor G.Stearothermophilus. Populacija spor bo večja od 1x10

6 in bo imela D vrednost pri 121 °C ≥ 1,5

min (20). Uporabili bomo princip pretiranega uničenja (»overkill«)

Slika 3 - 8: Biološki indikatorji parne sterilizacije.

3.2.4 Termoblok (termokopel) z referenčnim merilnikom temperature

Termoblok vsebuje večje število uvodnic – priključkov, ki so narejene tako, da minimizirajo ohlajanje TČ zaradi toplotne prevodnosti ter zagotavljajo merilno negotovost 0,1 °C. Ţeljena lastnost termobloka je, da se hitro ogreje in hitro ohladi. Imeti mora moţnost priključitve vsaj 24 TČ. Pri validaciji uporabimo suh termoblok LTR-25/140, proizvajalca Ge Kaye Instruments, USA. Uporaba suhega termobloka je zelo praktična saj so ti ponavadi manjše izvedbe in jih zato lahko prenašamo. Na ta način lahko TČ kalibriramo kar na mestu uporabe. Kalibracija TČ na mestu uporabe zagotavlja najvišjo stopnjo zanesljivosti saj s tem eliminiramo napake, ki lahko nastanejo različnih zaradi temperaturnih koeficientov (22). Kot referenčni merilnik temperature uporabimo sondo IRTD-400, proizvajalca GE Kaye Instruments, USA. Slika 3 - 9 kaţe primer priročnega termobloka in referenčnega merilnika temperature, ki se zelo pogosto uporablja pri merjenju na različnih proizvodnih lokacijah. Izbira primernega referenčnega merilnika temperature zagotavlja natančnost in ponovljivost merjenja. Delujejo na osnovi spremembe upora v odvisnosti od temperature. Senzorji tipa uporovni temperaturni detektorji (RTD) imajo ţično opleten uporovni senzorski element iz platine. Lastnost uporovnega elementa iz platine je linearno spreminjanje upora glede na merjeno temperaturo (23). Značilnost RTD detektorjev je tudi, da imajo integrirano elektroniko in jih zato lahko kalibriramo kot samostojen inštrument. Pretvorbo analognega signala


25

v digitalni signal izvaja integrirana elektronika zato ni potrebna ročna interpolacija (24). Na sliki 3 - 10 vidimo območje uporabe PT100 in RTD sonde.

Slika 3 - 9: Termoblok LTR-25/140 GE Kaye Instruments in referenčni merilnik

temperature IRTD-400 GE Kaye instruments.

Slika 3 - 10: Območje uporabe Pt100 sonde.

3.2.5 Kalibriran merilnik tlaka s sondo za merjenje tlaka

Kalibriran merilnik tlaka uporabljamo v kombinaciji s sondo za merjenje tlaka. Merilni interval mora biti med 0 kPa in 400 kPa. Sistem mora zaznavati tlak z ločljivostjo ≤ 4 kPa (0,04 bar). Merilnik mora delovati z negotovostjo merilnega sistema boljšo od 2 kPa (0,02 bar) (25). Merilnik tlaka priključimo na avtoklav preko uvodnice za termočlene. V našem primeru bomo uporabili merilnik Sensotec 7780, proizvajalca Honeywell Sensotec, USA.

3.2.6 Bowie & Dick testni paket

Bowie & Dick testni paket sestavlja testna slojnica, ki jo z obeh strani obdajajo papirnati lističi. Vse skupaj je zavito v paket. Do uporabe moramo Bowie & Dick testne pakete hraniti pri sobnih pogojih, (15-25) C, (30-70) % rH. Ob izvajanju Bowie & Dick testa moramo paket, namenjen temu testu, postaviti na sredino komore avtoklava, na perforirano dno. Po zaprtju vrat avtoklava zaţenemo sterilizacijo po posebnem programu, katerega parametre predpisuje izdelovalec testnih paketov Bowie & Dick. Videz testnih slojnic in celotnega paketa vidimo na sliki 3 - 11.


26

Slika 3 - 11: Testni paket Bowie & Dick proizvajalca Browne, USA.

3.3 Sterilizirana oprema

Za validacijo sterilizacije je potrebno pripraviti štiri male sterilizacijske posode z materialom in dve večji. Način razporeditve materialov in opreme namenjene sterilizaciji prikazuje slika 3 - 12 .

Slika 3 - 12: Materiali (oprema) razporejeni po sterilizacijskih posodah pred sterilizacijo.


27

Vsaka od štirih malih sterilizacijskih posod vsebuje:

Dihalni filter C3PFRP1B, blok ventil 2x, MPC konekti 5 x, Tri-Clamp konekti 10 x, Tri-Clamp spojke 10 x, tesnila 10 x, T kosi 3 x, Y kosi 3 x, filter Sartopore 1x, flexibilne cevi 4 x, zaslonka 5 x, Tri-Clamp reducirka 5 x, ventil 3x.

Vsaka od dveh velikih sterilizacijskih posod vsebuje:

blok ventili 3x, filter XL2, filter XL10, MPC konekti 5 x, Tri-Clamp konekti 10 x, Tri-Clamp spojke 10 x, tesnila 10 x, T kosi 7 x, Y kosi 3 x, flexibilne cevi 7 x, zaslonka 5 x, Tri-Clamp reducirka 5 x, ventil 3x, grabljice 1x.

3.4 Sterilizacijski cikel

S sterilizacijskim ciklom opisujemo vse faze sterilizacije, ki potekajo znotraj sterilizacijskega postopka.

3.4.1 Zgradba sterilizacijskega cikla

Sterilizacijski cikel najpogosteje sestavljajo faze (prikazano na sliki 3 - 13):

- Vakumske pulzacije,

- Gretje,

- Plato perioda – sterilizacija,

- Odzračenje in vakuumiranje,

- Sušenje,

- Odzračenje.


28

Slika 3 - 13: Sterilizacijski cikel z značilnimi vakuumskimi pulzacijami na začetku

3.4.2 Parametri sterilizacijskega cikla in parametri pri validaciji

Parametre sterilizacijskega cikla določimo ob izdelavi sterilizacijskega programa. Te parametre moramo nato, skladno z dobro proizvodno prakso, validirati pri začetni validaciji. Tabela 3 - 1 prikazuje nastavitvene parametre za redno delo in parametre, ki jih nato uporabimo pri validaciji.

Tabela 3 - 1: Parametri sterilizacijskega cikla in parametri pri validaciji.

Nastavitveni parametri Parametri pri validaciji

T = 122,5 C,

Čas = 30 min,

Št. vakuumskih pulzacij = 5

Glob. vakuum. pulzacij (1.,2.,3.,4.,5.)=

70, 120, 120, 120, 120 mbar,

Sušenje z vakuumom = 3 pulzacije z

zadrţevalnim časom 6 min

T = 122,5 C

Čas = 20 min,

Št. vakuu. pulzacij = 5,

Glob. vakuum. pulzacij (1.,2.,3.,4.,5.) =

70,120,120,120, 120 mbar, Sušenje z vakuumom = 3 pulzacije z zadrţevalnim časom 6 min

Kot je razvidno iz tabele 3 - 1, pri validaciji sterilizacije v avtoklavu uporabljamo identičen program, kot ga bomo uporabili pri rednih sterilizacijah z izjemo časa, ki je za 1/3 krajši. Tak način validacije omogoča laţjo odločitev o ustreznosti sterilizacije, če se zgodi, da se iz nepredvidenih razlogov (npr. nihanje tlaka čiste pare) cikel sterilizacije prekine prej, kot je predvideno. Vzemimo za primer, da se cikel sterilizacije med rednim delom prekine po 28 min, naša nastavitev časa sterilizacije pa je 30 min - če imamo validiran čas sterilizacije 20 min, to pomeni, da je bila naša sterilizacija ustrezna. Seveda je potrebno v takem primeru imeti tudi ustrezno izvedeno fazo vakuumiranja in sušenja, sicer je sterilnost naše opreme (sploh, če je zavita v sterilizacijski papir)


29

zaradi vlage lahko kompromitirana. Dogodek, kot je ta, smatramo kot odstop od dobre proizvodne prakse in ga moramo vedno raziskati, ugotoviti vzroke za odstop ter predpisati in izvesti korektivne ukrepe.

3.5 Obseg testiranja sterilizacijskega cikla pri validaciji

V sklopu validacije sterilizacije izvajamo sledeča testiranja:

- Predkalibracija termočlenov 1 x, v treh temperaturnih točkah (70,121 in 140 °C),

- Vakuum test prazne komore avtoklava 1x,

- Test sveţnja 1x,

- Bowie & Dick test 1 x,

- Test distribucije temperature v prazni komori avtoklava 1x,

- Test distribucije in penetracije temperature v polni komori avtoklava 3x (samo maksimalno, z opremo napolnjena komora),

- Verifikacija kalibracije termočlenov (postkalibracija) po kočanih meritvah 1 x, v eni točki (121 °C),

- Hranjenje sterilizirane opreme – 30 d, število testnih paketov – 3,

- Test sterilnosti testnih paketov.

4 Eksperimentalni del

V tem poglavju opisujemo zaporedje in vrste testiranja pri izvedbi validacije sterilizacije.

4.1 Načrt izvajanja testiranja

Postopek testiranja procesa sterilizacije je predpisan z validacijskim protokolom. Validacijski protokol vsebuje namen in cilj validacije, opis sistema, ki ga validiramo, pogoje za pričetek testiranja, odgovorne nosilce, izvedbo testiranja, kritične faze, število ciklov merjenja in sprejemljive kriterije. Lahko predpisuje tudi izvedbo revalidacije ali periodične validacije.

Na avtoklavu, na katerem bomo izvajali validacijo, je bilo pri predhodnjih testiranjih ţe izvedeno temperaturno mapiranje, na podlagi katerega smo določili hladne točke. Le te nam bodo sluţile za postavitev termočlenov pri naših validacijskih merjenjih. Pred začetkom testiranja moramo izvesti predkalibracijo termočlenov za merjenje.

Testiranje avtoklava in pripadajočega sterilizacijskega cikla bomo začeli z izvedbo testa tesnosti. Z njim dokaţemo, da naša komora tesni. Po uspešno izvedenem testu tesnosti, bomo v avtoklav vstavili paket s testno slojnico in izvedli sterilizacijo po programu za Bowie & Dick test. Preverili bomo obarvanost testne slojnice (enakomerno temno modro obarvana, brez prisotnih madeţev). S tem testom bomo dokazali, da v čisti pari, ki se uporablja za sterilizacijo, ni prisotnega zraka, ki bi ustvarjal zračne ţepe.

Sledil bo Bundle test (test sveţnja), s katerim dokazujemo ustrezno delovanje termočlenov med potekom merjenja in preverimo morebiten negativen vpliv pare na posamezen termočlen.


30

Distribucijo toplote v prazni komori avtoklava izvedemo tako, da vanjo namestimo 12 TČ na mesta, ki smo jih pri začetni validaciji določili kot najhladnješa in zaţenemo cikel sterilizacije poljubnega programa. Ves čas spremljamo temperaturo in tlak v notranjosti komore. V primeru, da doseţemo zahtevane kriterije, s testiranjem nadaljujemo.

V komoro avtoklava namestimo sterilizacijske posode, v katerih je oprema in v sterilizacijsko posodo, v kateri smo pri predhodnjih študijah dokazali, da vsebuje največ hladnih točk, vstavimo še testne paketke. To naredimo zaradi tega, ker je testiranje celotne opreme, zaradi velikih dimenzij v manjših laboratorijskih LAF komorah, praktično nemogoče. V posameznem testnem paketku si zato pripravimo 5 delov opreme, katerih dimenzije ne smejo presegati 5 cm. Testni paketek naj sestavljajo sledeči deli: silikonska cev manjšega premera, silikonska cev večjega premera, gumijasto tesnilo, kovinska TC (tri clamp) spojka in plastična spojka. Testni paketek je narejen iz materiala s polprepustno membrano, ki omogoča penetracijo pare do vsa kakega dela opreme.

Pripravimo si 24 TČ. V hladne točke, v opremi namestimo 12 TČ, preostalih 12 TČ pa razporedimo po komori na enak način, kot je bilo to pri distribuciji toplote v prazni komori. Poleg vsakega TČ, ki se nahaja v opremi, namestimo biološki indikator. Zaţenemo cikel sterilizacije. Z registratorjem ves čas spremljamo temperaturo in tlak v notranjosti komore.

Po vsakem končanem sterilizacijskem ciklu iz komore poberemo biološke indikatorje in testni paket. Postopek ponovimo še dvakrat. Biološke indikatorje iz vseh treh sterilizacij pošljemo na analizo v mikrobiološki laboratorij.

Po končanih merjenjih testne pakete shranimo v sterilizacijskih posodah, le te pa pustimo v proizvodnih prostorih do preteka časa najmanj 30 d , ko testne pakete pošljemo v mikrobiološki laboratorij in jih testiramo na sterilnost. V primeru ustreznega rezultata testa sterilnosti lahko pripravimo predlog za spremembo in po odobritvi le tega izvedemo revizijo navodil za delo, v katerih predpišemo daljše hranjenje materiala (opreme).

Izvedenim meritvam sledi izdelava validacijskega poročila, v katerega napišemo povzetek dobljenih rezultatov, doseganje sprejemljivih kriterijev ter komentiramo morebitna opaţena odstopanja. Oblikujemo zaključke, ki lahko vsebujejo tudi priporočene spremembe in ukrepe, potrebne za odpravo odstopanj.

4.2 Spremljanje parametrov sterilizacijskega cikla pri validacijski študiji

4.2.1 Test tesnosti avtoklava (vakuum test)

Tesnost sistema preverjamo s testom tesnosti (Leak test) pod vplivom vakuuma. Poteka po posebnem programu, ki predvideva vakuumiranje notranjosti komore avtoklava, čas stabilizacije in čas merjenja. Merjenje tlaka poteka 10 min nato preidemo v fazo odzračevanja in mirovanja. Test je ustrezen, če prirast tlaka ni večji od 1,3 mbar/min (26).

4.2.2 Test svežnja (Bundle test)

Z Bundle testom preverjamo vpliv pare, povišane temperature in mehanskih stresov na merjene vrednosti. Termočlene, s katerimi bomo izvajali meritve temperatur namestimo v komoro (skozi validacijsko odprtino) avtoklava in poveţemo v snop (prikazano na sliki 4 - 1). Zaţenemo kratek program sterilizacije in po stabilizaciji temperatur evidentiramo temperature (27) v komori najmanj 5 min. Evidentirana razlika temperatur med TČ znotraj spremljanega obdobja sme biti največ 1 °C.


31

Slika 4 - 1: Termočleni, povezani v sveţenj pred testiranjem.

4.2.3 Testiranje nasičenosti pare med fazo sterilizacije (Bowie & Dick test)

Kakovost pare v avtoklavu preverjamo s testiranjem nasičene pare z Bowie & Dick testom. Bowie & Dick test je bil zasnovan kot test, s katerim preverjamo uspešno odstranjevanje zraka (vakuumiranje) v sterilizatorjih za sterilizacijo poroznih naloţitev. Uspešno izveden Bowie & Dick test je znak hitre in celovite penetracije pare v testni paket. Neustrezne rezultate dobimo v primeru, da se v testnem paketu zadrţi zrak, ki je lahko posledica:

- Prekratke faze odstranjevanja zraka,

- puščanja med fazo odstranjevanja zraka,

- prisotnosti nekondenzirajočih plinov v pari.

Na rezultate testa lahko vplivajo tudi drugi dejavniki, ki zavirajo penetracijo paro. Neustrezen rezultat tako ni nujno samo posledica neustreznega odstranjevanja zraka (28). Test izvajamo tudi med rednim obratovanjem avtoklava. Ustrezno obarvano testno slojnico vidimo na sliki 4 - 2.


32

Slika 4 - 2: Obarvanost testne slojnice Bowie & Dick po vrsti:

neuporabljena, neustrezna, ustrezna.

4.2.4 Test distribucije temperatur v prazni komori avtoklava

V komoro sterilizatorja namestimo TČ, porazdeljene po celotni prostornini komore (koti, ob kontrolno in merilno sondo, ob vratih, sredina komore…) in določimo temperaturni profil za komoro ( Tmin, Tmax, hladno točko-mesto z najniţjo F0 vrednostjo), najtoplejšo točko (mesto z najvišjo F0 vrednostjo ob koncu sterilizacije), pri normalni temperaturi sterilizacije. Glede na USP (U.S. Pharmacopeia) (29) je referenčna temperatura sterilizacije 121 °C in čas sterilizacije 15 min, če ni drugače zahtevano. V primeru naše validacije so zahteve, min. 121 °C/15 min in dodatna zahteva F0 minimalno 20 min.

Bioloških indikatorjev pri testu distribucije ne uporabimo. Test distribucije temperatur v prazni komori izvajamo na enem ciklu sterilizacije, s pomočjo dvanajstih TČ (od TČ1 do TČ12). Poloţaj TČ pri testu je določen na sliki 4 - 3.


33

Slika 4 - 3: Test distribucije temperature - razporeditev termočlenov (prazna komora).

4.2.5 Test distribucije temperature - napolnjena komora avtoklava

Test distribucije temperature napolnjene komore avtoklava in penetracije toplote v material (opremo) izvedemo istočasno. S tem testom določimo temperaturni profil za napolnjeno komoro in sposobnost mikrobiološke inaktivacije steriliziranega materiala ter vpliv toplote na izdelek. Pri tej validaciji izvedemo najmanj tri sterilizacijska merjenja z ustreznimi rezultati in sicer za maksimalno napolnjeno komoro. TČ vstavimo na mesta, ki smo jih dobili pri predhodnem določanju najslabših mest v opremi oz. materialu, s katerim smo napolnili komoro avtoklava. Testu določanja najslabših mest pravimo tudi temperaturno mapiranje. Najslabša mesta pa imenujemo tudi hladne točke. Za steriliziran material uporabimo vsaj 12 TČ, ostale pa namestimo v hladne točke, ki smo jih določili pri testu distribucije temperatur v prazni komori avtoklava. Poleg delov materiala, kjer smo vstavili TČ, namestimo tudi biološke indikatorje. Postavitev TČ in bioloških indikatorjev v napolnjeni komori nam prikazuje slika 4 - 4. Biološke indikatorje uporabimo pri vsakem testu distribucije temperatur in penetracije toplote v opremo oz. material. Vsako testiranje z biološkimi indikatorji spremlja tudi biološki indikator, ki ga ne izpostavimo procesu sterilizacije. Biološke indikatorje in TČ namestimo skladno s shemo postavitve za posamezno polnitev opreme oz. materiala. Ker izvajamo zaporedoma tri testiranja, moramo zaradi zagotavljanja enakih startnih pogojev, opremo oz. material, ki ga testiramo, pred vsako sterilizacijo ohladiti na temperaturo najmanj 70 °C.


34

Sprejemljivi kriteriji :

Minimalna temperatura v opremi oz. materialu: 121 °C

Minimalni čas, ko je temperatura v opremi oz. materialu najmanj od 121 °C: 15 min

Minimalna F0 vrednost v v opremi oz. materialu: 20 min

Glede na USP je referenčna temperatura sterilizacije 121 °C in čas sterilizacije 15 min, če ni drugače zahtevano. V primeru naše validacije je dodatna zahteva, da mora biti F0 minimalno 20 min. F0 začnemo računati, ko temperatura v opremi oz. materialu doseţe 120 °C. Takrat je sterilizacijski cikel še v fazi ogrevanja.

Slika 4 - 4: Test distribucije temperature - postavitev termočlenov in testnega paketa (napolnjena komora).


35

Namestitev TČ in bioloških indikatorjev: k vsakemu termočlenu, nameščenemu v opremi, priloţimo tudi po en biološki indikator.

4.2.6 Najslabši primeri

Pri validaciji sterilizacije posamezne teste izvedemo z dodatnimi sterilizacijskimi programi, ki so enaki originalnim, z izjemo časa sterilizacije, ki mora biti za 1/3 krajši od časa pri rednih programih. Prilagojeni programi morajo prav tako zagotavljati ustreznost procesa sterilizacije! V praksi to pomeni, da če imamo pri rednem delu čas sterilizacije nastavljen na 30 min, mora biti pri validaciji čas sterilizacije 20 min.

4.3 Test sterilnosti izbranih delov opreme

Test sterilnosti izvedemo na delih opreme, ki smo jo predhodno hranili najmanj 30 d pri sobnih pogojih. Ti deli opreme morajo predstavljati značilnosti opreme, ki smo jo sterilizirali (enak material). Testni paketi se morajo sterilizirati skupaj s preostalo opremo, po principu en testni paket na eno sterilizacijo opreme. Test sterilnosti izvedemo tako, da vsebino testnega paketa razdelimo v razmerju 2:3 in nato potopimo v dve različni gojišči in po 14 d inkubiranja preverimo videz gojiščne raztopine. Testiranje sterilnosti traja 14 d. V tekočem tioglikolatnem gojišču inkubiranje testnega materiala izvajamo pri temperaturi (32,5 ± 2,5) °C, v soy tekočem gojišču pa na temperaturi (22,5 ± 2,5) °C (30). Na sliki 4 - 5 je prikazan material, ki ga uporabimo za dokazovanje sterilnosti. Test je ustrezen, če je gojiščna raztopina po namakanju bistra.

Slika 4 - 5: Material (deli opreme), na katerem izvajamo test sterilnosti.


36

5 Rezultati in diskusija

V poglavju so zbrani rezultati vseh meritev, ki smo jih izvedli tekom validacije. Rezultate smo podali tabelarično, poteke posameznih testiranj tudi grafično. Priloţili smo kopije analitskih izvidov za biološke indikatorje in analitski izvid testa sterilnosti na opremi, ki smo jo starali minimalno 30 d po sterilizaciji.

5.1 Rezultati meritev, grafični prikaz

5.1.1 Kalibracija/verifikacija kalibracije TČ pred/po merjenju

Pred začetkom izvajanja validacijskih meritev je izvajalec merjenja kalibriral vse predvidene TČ. Kalibracijo je izvajal v treh točkah in sicer pri temperaturah 70 °C, 121 °C in 140 °C. Dobljene rezultate kalibracije TČ in ustreznost teh rezultatov prikazujemo v tabeli 5 - 1. Vsi termočleni so pred začetkom validacijskega merjenja ustrezali zahtevanemu kriteriju maksimalnega dovoljenega odstopanja.

Tabela 5 - 1: Kalibracija TČ pred merjenjem.

Stanje po koncu merjenja prikazuje tabela 5 - 2. Tudi po končanih validacijskih merjenjih so bila odstopanja uporabljenih TČ še vedno v okviru sprejemljivega kriterija.

Tabela 5 - 2: Verifikacija kalibracije termočlenov po merjenju sterilizacijskega cikla.

Verifikacija kalibracije termočlenov Sprejemljiv

kriterij Rezultat Ustreznost

Točka preverjanja: T (121 °C) T ≤ 0,3 C -0,26 °C Ustreza

5.1.2 Uvodne meritve

Pri testu tesnosti avtoklava (vakuum test), katerega graf poteka kaţe slika 5 - 1 , med merjenjem nismo imeli prirasta tlaka, kar pomeni, da je celoten avtoklav ustrezno tesnil. Rezultat prirasta tlaka je bil enak nič (tabela 5 - 3). To je zelo dober rezultat, saj v praksi le redkokrat dobimo tako nizko vrednost. Te vrednosti so lahko zaradi prisotnih kondenziranih vodnih kapljic, ki potem motijo izvedbo testa, pogostokrat povišane.

Kalibracija termočlenov Sprejemljiv


Točke preverjanja:

T (70 °C / 121 °C / 140 °C) T ≤ 0,5 C ±0,02 °C/0,07 °C / ±0,02 °C Ustreza


37

Slika 5 - 1: Test tesnosti avtoklava – meritev tlaka.

Ko smo izvajali test sveţnja, so se temperature TČ znotraj meritvenega intervala razlikovale za 0,86 °C, kar pomeni, da so uporabljeni TČ ustrezali zahtevi iz validacijskega protokola (tabela 5 - 3). Po izvedbi Bowie & Dick testa je bila testna slojnica enakomerno temno modro obarvana, brez prisotnih madeţev ali lis. S tem smo dokazali, da je naš sterilizacijski medij, nasičena čista para ustrezne kakovosti. Test smo po pregledu obarvanosti testne slojnice, ki jo prikazuje slika 5 - 2 , smatrali kot ustrezen.

Tabela 5 - 3: Rezultati testa tesnosti, testa sveţnja in Bowie & Dick testa.

TEST Sprejemljiv kriterij Rezultat Ustreznost

Test tesnosti avtoklava Max. prirast tlaka 1,3

mbar/min 0 mbar/min Ustreza

Bundle test Razlika temperatur med

termočleni znotraj najmanj

5 minutnega intervala:

max. 1 °C.

0,86 °C Ustreza

Test nasičenosti pare med fazo

sterilizacije

(BOWIE & DICK TEST)

Sprememba barve

indikatorja je enakomerna

in v skladu z barvo, ki jo

določa proizvajalec

testnega paketa.

Testna slojnica

enakomerno

obarvana brez

prisotnih lis in v

skladu z določili

proizvajalca

Ustreza


38

Slika 5 - 2: Rezultat Bowie & Dick testa.

5.1.3 Distribucija temperature – prazna komora

Kot je razvidno iz tabele 5 - 4, smo pri testu distribucije temperature v prazni komori dosegli vse zahtevane parametre. Najhladnejšo točko (najmanjši F0) smo dosegli na poziciji TČ12, ki se je nahajal v odtoku avtoklava. To je povsem logično, saj se to mesto zaradi kondenza čiste pare, ki se zbira na dnu komore avtoklava, najpočasneje segreje (ko ves kondenz odteče). Na sliki 5 - 3 je grafično prikazan celotni sterilizacijski cikel testa distribucije temperature v prazni komori.

Tabela 5 - 4: Rezultati testa distribucija temperature – prazna komora.

Testi distribucije temperatur v prazni

komori

Sprejemljiv


Sterilizacija prazne komore v skladu s

programom 122,5 °C/20 min DA, 122,5 °C/20 min Ustreza

T na mestu iztoka kondenza Informativno 122,92 °C Ustreza

Maksimalna razlika med najvišjo in

najniţjo T znotraj komore ≤ 1.5 °C 1,25 °C Ustreza

Minimalna T sterilizacije 121 °C 122,76 °C Ustreza

Hladna točka / F0 min 20 min 31,43 min Ustreza

Maksimalna T sterilizacije Informativno 124,01 °C Ustreza

Najtoplejša točka / F0 max Informativno 36,08 min Ustreza

Povprečna T sterilizacije Informativno 123,19 °C Ustreza


39

Tabela 5 - 5 prikazuje potrditev preverjanja, da smo pri sterilizaciji res izbrali za 1/3 krajši čas sterilizacije od časa, ki se uporablja pri rednem delu. Namen uporabe principa »najslabši primeri« je pojasnjen v točki 6.2.6.

Tabela 5 - 5: Najslabši primeri.

Najslabši primeri Sprejemljiv


Čas sterilizacije pri validacijskem

programu mora biti za 1/3 krajši od časa

pri redni sterilizaciji (30 min pri rednem

delu).

20 min 20 min Ustreza

Slika 5 - 3: Graf poteka sterilizacije prazne komore avtoklava.


40

5.1.1 Distribucija temperature – napolnjena komora (1. cikel)

Po izvedbi validacijskih meritev smo rezultate zbrali v tabelah. Rezultati meritev prvega validacijskega cikla sterilizacije so ustrezali zahtevanim kriterijem. Pri validaciji smo upoštevali kriterij pretiranega uničenja mikroorganizmov. Na vseh TČ, ki smo jih namestili na hladne točke v materialu in/ali v notranjosti komore, smo pri prvem sterilizacijskem ciklu dosegli temperaturo višjo ali enako 121 °C, v trajanju najmanj 15 min. Najniţjo temperature Tmin smo dobili na TČ, ki je bil nameščen v filtru. Gre za pozicijo materiala, ki najpočasneje doseţe temperaturo sterilizacije 121 °C in ima med fazo sterilizacije najniţjo temperaturo. Filter sestavljata plastično ohišje in celulozna membrana, zaradi tega je tu slabša toplotna prevodnost in se zaradi tega to mesto počasneje segreva. Ker je zgradba filterne membrane porozna predstavlja ta lastnost opreme velik upor našemu sterilizacijskemu mediju. To je glavni razlog za počasnejšo distribucijo temperature na tem mestu. Na vseh TČ smo presegli najniţjo dovoljeno vrednost F0 20 min. Najniţjo vrednost parametra F0 smo dobili pri termočlenu, ki je bil nameščen v filtru. V tem primeru gre za mesto, ki je dobilo najniţjo količino toplotne energije preko celotnega postopka sterilizacije. Dobljeni rezultati merjenja prvega sterilizacijskega cikla so zbrani v tabeli 5 - 6.

Tabela 5 - 6: Distribucije temperature s termočleni – napolnjena komora (1. cikel).

Testi distribucije temperatur v

napolnjeni komori Sprejemljiv kriterij Rezultat Ustreznost

Sterilizacija komore v skladu s

programom 122,5 °C/20 min 122,5 °C/20 min Ustreza

Temperatura avtoklava pred sterilizacijo ≤ 70 °C ≤ 70 °C Ustreza

Najhladnejša točka v avtoklavu (F0 min) Informativno TČ10 Informativno

Minimalen čas v naloţitvi s T ≥ od

najniţje predpisane T min. 15 minut / min. 121 °C 19 min 10 s Ustreza

Minimalna F0 vrednost v naloţitvi min. 20 minut 26,70 min Ustreza

Minimalna T sterilizacije naloţitve min. 121 °C 122,36 °C Ustreza

Maksimalna F0 vrednost v naloţitvi Informativno 34,05 min Informativno

Maksimalna T sterilizacije naloţitve Informativno 123,59 °C Informativno

T na mestu iztoka kondenza Informativno 122,93 °C Informativno

Pozicija TČ

Vsi TČ morajo biti po

koncu sterilizacije na isti

poziciji kot pred

sterilizacijo.

Vsi TČ so bili

na isti poziciji

kot pred

sterilizacijo

Ustreza

Pregled poročila avtoklava

Izpis avtoklava je ustrezen –

ni prisotnih atipičnih

rezultatov

DA Ustreza


41

Na sliki 5 - 4 je prikazan grafični potek prvega validacijskega cikla sterilizacije napolnjene komore (zapis TČ). Vidimo lahko, da temperature in tlak med plato periodo nihajo minimalno. To pomeni, da ima avtoklav ustrezno izvedeno regulacijo tlaka čiste pare med sterilizacijo.

Slika 5 - 4: Graf poteka sterilizacije napolnjene komore avtoklava (1. cikel).


42

5.1.2 Distribucija temperature – napolnjena komora (2. cikel)

Rezultati meritev drugega validacijskega cikla sterilizacije so ustrezali zahtevanim kriterijem. Na vseh TČ, ki smo jih namestili na hladne točke v materialu in/ali v notranjosti komore, smo pri drugem sterilizacijskem ciklu na vseh mestih dosegli temperaturo višjo ali enako 121 °C, v trajanju najmanj 15 min. Najniţjo temperature Tmin smo pri drugem ciklu dobili na TČ, ki je bil nameščen v filtru. Na vseh TČ smo presegli najniţjo dovoljeno vrednost F0 20 min. Najniţjo vrednost parametra F0 smo dobili pri termočlenu, ki je bil nameščen v filtru. Dobljeni rezultati merjenja drugega sterilizacijskega cikla so zbrani v tabeli 5 - 7.





programom 122,5 °C/20 min 122,5 °C/20 min Ustreza


Najhladnejša točka v avtoklavu (min. F0) Informativno TČ10 Informativno


najniţje predpisane T min. 15 min / min. 121 °C 19 min 20 s Ustreza

Minimalna F0 vrednost v naloţitvi min. 20 minut 27,80 minut Ustreza

Minimalna T sterilizacije naloţitve min. 121 °C 122,45 °C Ustreza

Maksimalna F0 vrednost v naloţitvi Informativno 34,24 minut Informativno


T na mestu iztoka kondenza Informativno 122,96 °C Informativno

Pozicija TČ



poziciji kot pred

sterilizacijo.

Vsi TČ so bili

na isti poziciji

kot pred

sterilizacijo

Ustreza


Izpis avtoklava je ustrezen –

ni prisotnih atipičnih

rezultatov

DA Ustreza


43

Na sliki 5 - 5 je prikazan grafični potek drugega validacijskega cikla sterilizacije napolnjene komore (zapis TČ). Vidimo lahko, da je potek sterilizacije drugega validacijskega cikla (T, p) primerljiv s prvim.



44

5.1.3 Distribucija temperature s termočleni – napolnjena komora (3. cikel)

Rezultati meritev tretjega cikla sterilizacije so ustrezali zahtevanim kriterijem. Na vseh TČ, ki smo jih namestili na hladne točke v materialu in/ali v notranjosti komore, smo pri tretjem sterilizacijskem ciklu na vseh mestih dosegli temperaturo višjo ali enako 121 °C, v trajanju najmanj 15 min. Najniţjo temperature Tmin smo pri tretjem ciklu dobili na TČ, ki je bil nameščen v tanki silikonski cevki. Ker je notranji premer silikonske cevke 2 mm, predstavljata ta lastnost opreme velik upor našemu sterilizacijskemu mediju in niţja temperatura na tem mestu je posledica manjšega zastoja kondenza čiste pare, ki kasneje odhlapi. To je v tem primeru glavni razlog za počasnejšo distribucijo temperature na tem mestu. Na vseh TČ smo tako kot v prvih dveh primerih, presegli najniţjo dovoljeno vrednost F0 20 min. Najniţjo vrednost parametra F0 smo dobili pri TČ, ki je bil nameščen v filtru. Dobljeni rezultati merjenja tretjega sterilizacijskega cikla so prikazani v tabeli 5 - 8.





programom 122,5°C/20 min 122,5°C/20 min Ustreza


Najhladnejša točka v avtoklavu (min F0) Informativno TČ10 Informativno


najniţje predpisane T

min. 15 min / min. 121

°C 19 min 10 s Ustreza

Minimalna F0 vrednost v naloţitvi min. 20 min 28,07 minut Ustreza

Minimalna T sterilizacije naloţitve min. 121 °C 122,41°C Ustreza

Maksimalna F0 vrednost v naloţitvi Informativno 34,40 minut Informativno


T na mestu iztoka kondenza Informativno 122,98°C Informativno

Pozicija TČ



poziciji kot pred

sterilizacijo.

Vsi TČ so bili na

isti poziciji kot

pred sterilizacijo

Ustreza


Izpis avtoklava je

ustrezen – ni prisotnih

atipičnih rezultatov

DA Ustreza

Na sliki 5 - 6 je prikazan grafični potek tretjega validacijskega cikla sterilizacije napolnjene komore (zapis TČ). Potek sterilizacije tretjega validacijskega cikla (T, p) je primerljiv s prvim in drugim validacijskim ciklom.


45


5.1.4 Rezultati testiranja bioloških indikatorjev

Rezultati testiranja uporabljenih bioloških indikatorjev v vseh treh validacijskih serijah sterilizacij, na vseh mestih, so bili ustrezni. Rezultati vseh kontrolnih indikatorjev so bili prav tako ustrezni. Rezultati testiranja bioloških indikatorjev so prikazani na sliki 5 - 7 (kopija analitskega izvida iz mikrobiološkega laboratorija). Sprejemljiv kriterij in rezultat testiranja mikrobioloških indikatorjev je prikazan v tabeli 5 - 9.

Tabela 5 - 9: Rezultati testiranja mikrobioloških indikatorjev.

Vrsta testiranja Sprejemljiv kriterij Rezultat Ustreznost

Sterilnost

bioloških

indikatorjev

Vsi biološki indikatorji, ki so bili

izpostavljeni procesu sterilizacije morajo

biti sterilni medtem, ko je neizpostavljen

referenčni biološki indikator nesterilen.

Vsi izpostavljeni

biološki indikatorji

so bili sterilni,

neizpostavljen pa

nesterilen.

Ustreza


46

Slika 5 - 7: Analitski izvid – biološki indikatorji.


47

5.1.5 Rezultati testa sterilnosti izbranih delov opreme po minimalno 30 dneh hranjenja

Rezultati testiranja sterilnosti na materialu, ki je bil najprej izpostavljen sterilizacijskemu procesu, nato hranjen minimalno 30 d v proizvodnih prostorih, so zbrani v tabeli 5 - 10 in kot prikazujejo slike 5 - 8, 5 - 9 in 5 - 10 (kopije analitskih izvidov), smo na vseh treh testnih paketih dosegli ustrezen rezultat, to je sterilno. To je pomembna ugotovitev, ki nam bo prišla prav v prihodnosti, ko bodo zahteve po daljšem času hranjenja zaradi velikega obsega del aktualne.

Tabela 5 - 10: Rezultati testa sterilnosti na materialu, minimalno 30 d hranjenja.

Rok uporabe steriliziranega

materiala Sprejemljiv kriterij Rezultat Ustreznost

Vsak testni paket mora biti hranjen

minimalno 30 dni v proizvodnih

prostorih, v zato namenjenem

dobošu (sterilizacijski posodi)

Vsa testirana oprema, v

vseh treh testnih paketih

mora biti sterilna.

Sterilno Ustreza


48

Slika 5 - 8: Rezultat testa sterilnosti, 1. testni paket.


49



50



51

6 Zaključek

V diplomskem delu smo ţeleli dokazati, da je steriliziran material, ki ga uporabljamo pri vsakdanjem delu v enoti Biofarmacevtika, po sterilizaciji moţno hraniti 30 d. Na tak način lahko osebje, ki sodeluje v proizvodnem procesu močno razbremenimo. Delovne operacije namreč potekajo v različnem obsegu in različno dolgo, zato lahko proizvodno osebje na podlagi naše študije material (opremo), ki je namenjen sterilizaciji pripravi takrat, ko mu to dopuščajo razmere in v takem obsegu, da se lahko izognemo »ozkim grlom« v proizvodnji. Pri tej validaciji smo uporabili način testiranja, ki ga nismo zasledili drugje, seveda dopuščamo moţnost, da se je to ţe kje izvajalo. Gre namreč za to, da smo testni material zapakirali v vrečke s polprepustno membrano, ki se po sterilizaciji zapre. Te paketke z opremo smo potem vstavili v sterilizacijske posode z materialom, ki se uporablja med redno proizvodnjo. Material, ki se je nahajal v testnih paketkih, je bil enake sestave, kot material v sterilizacijski posodi (silikon, nerjaveče jeklo, plastika, guma). Vzrok, da smo se tega lotili na tak način je v tem, da oprema v mikrobiološkem laboratoriju ne omogoča testiranja sterilnosti na velikih oz. dolgih kosih opreme. Pred samim testiranjem je obstajala bojazen, da bo kombinacija filtra na sterilizacijski posodi in polprepustne membrane testnega paketa, ki se nahaja v sterilizacijski posodi, predstavljala prevelik upor za paro in s tem moţnost, da vsi deli materiala v testnem paketu ne bodo ustrezno sterilizirani. S tem namenom smo pred začetkom validacije izvedli meritev temperature notranjosti testnega paketa s termočlenom. Ugotovili smo, da tudi v notranjosti testnega paketa doseţemo temperaturo najmanj 121 °C in F0 najmanj 20 min. Kasnejši, pri validaciji sterilizacije dobljeni ustrezni testi sterilnosti na materialu, ki se je nahajal v testnih paketih, so to potrdili. Tako lahko rečemo, da je naš način dela s sterilizacijskimi paketi predstavljal »worst case« scenarij za testiran material (opremo).

V farmacevtski proizvodnji učinkovin se neprestano srečujemo z zahtevami za povečanje obsega proizvodnje, kar je mogoče le, če temu povečanju sledijo spremljevalne tehnološke operacije, kot je sterilizacija. V prihodnosti bi način sterilizacije s testnimi paketki v sterilizacijskih posodah lahko izkoristili tudi za to, da bi na tak način lahko sterilizirali več opreme. Dokler avtoklavi niso imeli moţnosti pulznih vakuumiranj (starejše modeli), tak način dela ni bil mogoč. Novejši modeli avtoklavov taka pulziranja omogočajo, zato ni bojazni, da iz večje količine paketov materiala ne bi odstranili prisotnega zraka, ki bi nam kasneje predstavljal hladne ţepke z neustrezno sterilizacijsko temperaturo.


52

7 Literatura

1 Izr.prof. dr. Mirjana Gašperlin, oktober 2004, Predavanja pri izbirnem predmetu Bolnišnična farmacija. http://ebookbrowse.com/bofa-sterilizacija-o4-ppt-d214400524, dostop 13.1.2013.

2 PRWEB, januar 2013, Top Three Dangerous Myths About Autoclaves and Sterilization. http://www.prweb.com/releases/2013/1/prweb10379378.htm, dostop 10.4.2013.

3 Ton Hermans, MDT, april 2012. http://www.mdtmag.com/articles/2012/04/thermoplastic-material-solutions-high-heat-sterilization-capability, dostop 10.4.2013.

4 Council of Europe: General Texts on Sterility. In: European Pharmacopoeia 7th edition, European Pharmacopoeia Laboratory, 2011, 445-450.

5. Raspor P.; Biotehnologija in bioetika, http://www.bf.uni-lj.si/zt/bioteh/pedag/ biotehnologija/1_letnik/seminar/04b_Seminar_avtoklav.pdf, dostop 13.1.2013.

6 Luţnar Saša, Diplomska naloga, 2012. http://www.ffa.uni-lj.si/fileadmin/datoteke/ Knjiznica/diplome/2012/Luznar_Sasa_dipl_nal_2012.pdf, dostop 10.3.2013.

7 Agalloco J.P. et al.: Validation of Moist Heat Sterilization Process: Cycle Design, Development, Qualification and Ongoing Control, Technical Report No. 1, PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 2007, 61: 4-28.

8 J. K. Kumar, F0 value, avgust 2007. http://www.scribd.com/doc/377248/Fo-value, dostop 21.2.2013.

9 Final Version of Annex 15 to the EU Guide to Good Manufacturing Practice, 2001: 1-11.

10 Pharmaceutical inspection, conventionpharmaceutical inspection co-operation scheme, Guide to Good Manufacturing Practice for medicinal products, Annexes, PE 009-7 (Annexes) 1 September 2007, 85.

11 http://www.fda.gov/MedicalDevices/DeviceRegulationandGuidance/PostmarketRequirements/ QualitySystems Regulations/MedicalDeviceQualitySystemsManual/ucm122439.htm, dostop 7.4.2013.

12 CHAMBERLAND, C. Sur un filtre donnant de l’eau physiologiquement pure. Compt. Rend. Acad. d. sc. Paris. 1884, XCIX, 247.

13 Chelsey Parrott-Sheffer, ENCIKLOPEDIA BRITANICA , november 2008, http://www.britannica.com/EBchecked/topic/44765/autoclave, dostop 10.4.2013.

14 FERI UNI-MB, PROGRAMSKI PAKETI SCADA Oktober 2006 http://lpa.feri.uni-mb.si/Pedagosko_delo/Snovanje_sistemov_vodenja/5teden2.pdf, dostop 4.2.2013.

15 Kaye Validator user's manual, M4350E Rev. E, 2012.

16 http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?CFRPart =11&showFR=1, Revised as of April 1, 2012 dostop 10.4.2013.

17 Wikipedija, Termopar, marec 2013. http://sl.wikipedia.org/wiki/Termopar, dostop 10.4.2013.

18 PRINCETON, A. Chaney, marec 2013. http://www.princeton.edu/~achaney/tmve/wiki100k/ docs/Thomas_Johann_Seebeck.html, dostop 10.4.2013.

19 OMEGA, Thermocouples - An introduction 2003 – 2013, http://www.omega.com/ prodinfo/

thermocouples.html, dostop 4.2.2013

http://www.prweb.com/releases/2013/1/prweb10379378.htm

http://www.mdtmag.com/articles/2012/04/thermoplastic-material-solutions-high-heat-sterilization-capability

http://www.mdtmag.com/articles/2012/04/thermoplastic-material-solutions-high-heat-sterilization-capability

http://www.bf.uni-lj.si/zt/bioteh/pedag/

http://www.ffa.uni-lj.si/fileadmin/datoteke/%20Knjiznica/diplome/2012/Luznar_Sasa_dipl_nal_2012.pdf

http://www.ffa.uni-lj.si/fileadmin/datoteke/%20Knjiznica/diplome/2012/Luznar_Sasa_dipl_nal_2012.pdf

http://www.scribd.com/doc/377248/Fo-value

http://www.britannica.com/EBchecked/topic/44765/autoclave

http://lpa.feri.uni-mb.si/Pedagosko_delo/Snovanje_sistemov_vodenja/5teden2.pdf

http://lpa.feri.uni-mb.si/Pedagosko_delo/Snovanje_sistemov_vodenja/5teden2.pdf

http://sl.wikipedia.org/wiki/Termopar

http://www.princeton.edu/~achaney/tmve/wiki100k/%20docs/Thomas_Johann_Seebeck.html

http://www.princeton.edu/~achaney/tmve/wiki100k/%20docs/Thomas_Johann_Seebeck.html

http://www.omega.com/prodinfo/thermocouples.html


53

20 Health Technical Memorandum 2010, Part3: Validation and verification, Sterilization, 1998, 37.

21 US PHARMACOPEIA on line, ˂1035˃ BIOLOGICAL INDICATORS FOR STER ILIZ ATI ON, 2013. http://www.pharmacopeia.cn/v29240/usp29nf24s0_c1035.html, dostop 10.4.2013.

22 GE Kaye, Temperature Dry Wells (-40 to 400°C), 2004 http://www.kayeinstruments.com/ validationproducts/drywell.htm, dostop 10.4.2013.

23 TERMOTEL, Boris Ţgajnar, november 2013 Izbira ustrezne sonde. http://www.termotel.si /index.php?option=com_content&view=article&id=240:sonde&catid=32:rocne-vbodne-sonde &Itemid=54, dostop 18.2.2013.

24 GE Kaye, Temperature Dry Wells (-40 to 400°C), 2004. http://www.kayeinstruments.com/ validationproducts/irtd.htm , 10.4.2013.

25 SIST EN 285:2006, Sterilizacija - Parni sterilizatorji – Veliki sterilizatorji, 2006, 60.


27 Health Technical Memorandum 2010, Part 3: Validation and verification, Sterilization, 1998, 41-42.


29 US PHARMACOPEIA on line, ˂1211˃ STERILIZATION AND STERILITY ASSURANCE OF COMPENDIAL ARTICLES, 2013. http://www.uspbpep.com/usp32/pub/data /v32270 /usp32nf27s0_c1211.html#usp32nf27s0_c2s1211-f2, dostop 11.4.2013.

30 US PHARMACOPEIA on line, ˂71˃ STERILITY TESTS, 2013 http://www.uspbpep.com/

usp32/pub /data/v32270/usp32nf27s0_c71.html#usp32nf27s0_c71 , 10.4.2013.

http://www.pharmacopeia.cn/v29240/usp29nf24s0_c1035.html

http://www.kayeinstruments.com/validationproducts/drywell.htm

http://www.termotel.si/index.php?option=com_content&view=article&id=240:sonde&catid=32:rocne-vbodne-sonde&Itemid=54

http://www.termotel.si/index.php?option=com_content&view=article&id=240:sonde&catid=32:rocne-vbodne-sonde&Itemid=54

http://www.kayeinstruments.com/%20%20%20%20validationproducts/irtd.htm

http://www.kayeinstruments.com/%20%20%20%20validationproducts/irtd.htm

http://www.uspbpep.com/usp32/pub/data%20%20/v32270%20/usp32nf27s0_c1211.html#usp32nf27s0_c2s1211-f2

http://www.uspbpep.com/usp32/pub/data%20%20/v32270%20/usp32nf27s0_c1211.html#usp32nf27s0_c2s1211-f2

http://www.uspbpep.com/usp32/pub%20%20/data/v32270/usp32nf27s0_c71.html#usp32nf27s0_c71

Documents

Validacija sterilizacije - določitev roka uporabeValidacija sterilizacije – določitev roka uporabe steriliziranega materiala 2 Zahvala Zahvaljujem se mentorici red.prof.dr. Andreji