Universidad de Costa Rica Facultad de Microbiología y Química Clínica

Validación de la inactivación vira1 de suero antiofídico polivalente con respecto a variaciones en el pH de

preparación final.

Trabajo Final de Graduación para optar por el titulo de Licenciatura cn Microbiología y Química Clínica

Calliandra de Souza Silva, A01382 Ana Cristina Monge Montero, A02682

Ciudad Universitaria Rodrigo Facio San José, Costa Rica

Julio del 2005.

UNIVERSIDAD DE COSTA RICA VICERRECTOR~A DE DOCENCIA

FACULTAD DE MICROBIOLOG~ CIUDAD UNIVERSITARIA RODRIGO FACIO

Acta de presentación de Requisito Final de Graduación

Sesión del Tribunal Examinador celebrada el siete de julio del ano 2005, con el objeto de recibir el informe oral de las estudiantes ANA CRISTINA MONGE MONTERO Y CALLIANDRA MARÍA DE SOUZA SILVA , carnés A02682 y A01382, según corresponde, quienes se acogen al Reglamento de Trabajos Finales de Graduación bajo la modalidad de PRACTICA DE GRADUACIÓN, para optar por el grado académico de LICENCIADAS EN MICROBIOLOGÍA Y QUÍMICA cLÍNIcA y el título profesional de DOCTORAS E N MICRGBIOLOG~ Y QUÍMICA CLÍMCA.

Están presentes los siguientes miembros del tribunal:

Dra. Lizeth Taylor Castillo PRESIDENTE Dra. Elizabeth Abrahams Sandí Dra. Libia Herrero Uribe Dr. José María Gutiérrez Gutiérrez Dra. Laya Hun Opfer

ARTICULO í

El presidente informa que los expedientes de ANA CRISTINA MONGE MONTERO Y CALLIANDRA MARÍA DE SOUZA SILVA, contienen todos los documentos de rigor, incluyendo el recibo de pago de los derechos de graduación. Declara que las postulantes cumplieron con todos los demás requisitos del plan de estudios correspondientes, y por lo tanto, se solicita que proceda a hacer la exposición.

ARTICULO 2

Las postulantes ANA CRISTINA MONGE MONTERO Y CALLIANDRA MARÍA DE SOUZA SILVA, hacen la exposición oral de su trabajo de graduación titulo "Validación antiviral de suero antioñdico polivalente a diferentes pH".

ARTICULO 3

Terminada la disertación, los miembros del Tribunal Examinador interrogan a las Postulantes durante el tienipo reglamentario y, una vez concliiido el interrogatorio, el Tribunal se retira a deliberar.

ARTICULO 4

El tribunal considera el trabajo final de graduación satisfactorio y le confiere la calificación de: 50

ARTICULO 5

El presidente del Tribunal comunica a las Postulantes el resultado de la deliberación y las declara acreedoras al grado de Licenciadas en Microbiología y Química Clínica y al título profesional de Doctoras en Microbiología y Química Clínica.

Se le indica la obligación de presentarse al acto público de juramentación al que serán oportunamente convocadas. Se da lectura al acta que firman los Miembros del Tribunal Examinador y las Postulantes, a las horas.

Calliandra h a r í a $6 s o u k Silva E'ost,ulante

Dedicatoria Agradecimientos Resunien Justificación Objetivos Marco Teórico Matesiales y Métodos Resultados Discusión Conciusiones Bibliografia Anexos:

Anexo I Anexo 11 Anexo 111 Anexo IV

Dedicatoria

Para todos acl~iellos en A111érica Latina, que no se consideran meros receptores de modelos consti-~iidos

lejos de nuestro contexto, sin ningíin compromiso con nuestro fut~iro. Para los que ya no creen que lo

releiiante exista apenas en ciertos idiomas, sea generado sólo por ciertos actores y nos llegan solamente de

ciertos lugares. Para los que prefieren aprender inventando desde lo local, que perecer imitando desde lo

global. Para los que practican una cierrcicc corl cw~cie?lc.ici. colocando su imiiginación. capacidad y

conlpromiso al servicio primero de nuestras sociedades. Para todos ellos. les dedicamos nuestro esfirci-zo.

Agradecimientos

"La rrieta prirzcipul tle lrz etlucució?~ es crear seres Iztoriurlos que sean capaces de hacer cosas rlueva.~, rro

sirnple?nente (le repetir lo que otrcis generaciones israri hecho; seres hht~rnanos que sean creutivos,

itiventore.~ y ~1e.scubritio1.e.v. La .segzrrrtin rneta de la educación e.s llu de.fbrnzar rrierrtev que .searr c.ritic.cl.s,

que puedc~n verqicur-y 110 aceptar to~lo 1 0 que se les ofrece"

Jearr Pir~get

Este trabajo no se hubiera logrado de no ser por la ayuda y comprensión de nuestras familias y amigos,

que nos han apoyado incondicionalmente durante tantos años en los buenos y malos momentos. Pasa ellos

es este trabajo. fruto de nuestro esfuerzo por dos años, y que con orgullo se los ofrecemos. Muchas gracias

sobre todo a nuestros padres, que se han preocupado siempre de nuestro desai-rollo no sólo como

profesionales, sino también como personas de bien para la sociedad.

Del mismo modo, no habríamos podido salir adelante sin todas las personas que nos ayudaron a

concretarlo. Agradecemos a la Dra. Libia Herrero por habernos permitido participar en este proyecto, por

ayudainos las muchas veces que lo necesitamos y por continuar con nosotros hasta el linal. A la Ili-a. Laya

Hun y al Dr. José María Gutiérrez. les agradecemos todas sus correcciones y aportes que ayudaron a

transformar nuesh-o trabajo en una investigación con sentido, la cual esperamos sea de utilidad pasa el

futliso.

De manera muy especial queremos ay-adecerle a nuestro gran amigo Francisco Vega "Chico", porque sin

él esta empresa nunca se hubiera podido concluir. Le agradecemos su infinita paciencia, su ayuda

desinteresada y su guía en la oscuridad.. . siempre vamos a estar en deuda con él.

A los miembros del Instituto Clodoiniro Picado de la Universidad de Costa Kica, les agradecemos el

brindamos la oportunidad de colaboras en esta iniciativa, que esperamos -por lo menos- sea un precedente

para realizar investigaciones posteriores y de este modo lograr más meritos para destacarse dentro del

ámbito internacional como líderes en su campo.

A la Sección de Virologia de la Facultad de Microbiolo-ia. les agradecemos toda la ayuda técnica que nos

brindaron durante el trabajo.

Por último pero no menos importante. queremos agradecer a Dios, por T01)O

Resumen

Los sueros antiofidicos, o antivenenos. son productos biofarmacéuticos cruciales para el tratamiento de las mordeduras de serpientes. Sin embargo, conllevan el riesgo de contener virus provenientes del caballo, que podrían ser dañinos cuando son introducidos en humanos. En consecuencia, se han iniciado estudios de validación de los diferentes pasos del proceso de pi-oducción de sueros antiotidicos, para ratificar la seg~iridad del producto.

El trabajo busca establecer el efecto de la acidificación del suero antiofidico polivalente en la inactivación de los virus Polio y Herpes Simplex-1 (MSV-I), dilucidar el tiempo de exposición para la inactivación viral y así determinar su seguridad viral.

Para lograr esta meta se realizaron di\.ersos ensayos: a) En la primera fase se ajustaron los sueros antiofidicos -donados los sueros por el Instituto

Clodomir-o Picado de la Universidad de Costa Rica- a diferentes pHs (4.3, 7.0, y una muestra de cuero sin tratamiento) y estos se incubaron con ambos virus para determinar el titulo viral en placas de cultivo celular.

b) Se investigó el efecto del suero con presei-vantes y sin ellos a los diferentes pl-i sobre la infectividad de los vir~is.

C) Por ~iltimo, se analizó el efecto del suero con prescrvantes y sin ellos, sobre los virus antes mencionados. en cl s~ici-o con el pH original.

No se encontró ningún efecto citot6sico del suero antiofidico polivalente sin preservantes a una dilución de 1:70. pero si sc determinó toxicidad en los sueros con pi-eservantes a diferentes pH. No se pudo determinar ninguna diferencia en los títulos de los virus en las distintas condiciones estudiadas. En el caso de¡ virus Polio, hubo un descenso en su título en más de 6 Logaritmos a los diferentes ticmpos expuestos a los diferentes pH, inclusive a tiempo O. lo que nos indica que el factor pH no influye en esta disminución. En e1 caso del lIcrpes Siniplex. ta:-i-ii)oco ~ L I C posible detectar efecto citopático en la dilución más baja (10- ' ) utilizada para el ensayo. Estos resultados claramente nos demuestran que existe algún otro factor -o factores- que inactivan los virus al contacto con el suero antiofidico a diferentes pH.

Consecuentemente, el tratan-iiento del suero con pl-1 ácido como método de inactivacibn viral no pudo ser valorado para garantizar la seguridad del producto final. Se logra concluir que el suero antiofidico polivalente preparado en el Instituto Clodomiro Picado, tiene inhibidores inespecíficos propios de su constitución, que inactivan los virus estudiados, por lo tanto, sugiere ser seguro desde el punto de vista viral. Sin embargo, se recomienda hacer estos mismos estudios con el producto final, una vez reconstitiiido con agiia desti lada.

Justificación

Los países industi-ialmente avanzados y las industrias fannacéuticas internacionales no incluyen entrc sus

prioridades el tratamiento de las mordeduras de serpientes. En consecuencia, los sueros antiofidicos no se

producen en cantidades suficientes para suplir la necesidad de los países industrialmente menos

desarrollados. En los últimos años, se le ha dado una importancia creciente al tema de la posible

transmisión de virus por la administración de hemoderivados de diverso tipo; ello ha llevado a que el tema

de la inactivacióniremoción de virus en los procesos de producción de hemoderivados adquiera gran

relevancia. Aunque no se ha demostrado que los sueros antiofidicos de origen equino sean transrnisorcs de

virus 3 humanos, se plantea actualmente la necesidad de validar diversos medios en la

remoción/inactivación de virus en el proceso de producción de sueros antiotidicos. Una de las alternativas

quc se han planteado es la inactivación de virus mediante acidificación de los sueros, aunque, en el caso de

los sueros antiofidicos de origen equino. no existen estudios que demuestren la eficacia dc este

procedimiento. El Instituto Clodomiro Picado produce sueros antiofidicos, o antivenenos, que se utilizan

en toda la región centroamericana para el tratamiento de los envenenamientos por mordeduras de

serpientes. Con ci En de garantizar la segliridad vira1 de este medicamento, es necesario validar los

diversos pasos involucrados en la producción de los antivenenos en cuanto a su eficacia para inactivai- o

removcr virus de diversa índole. De esta necesidad surge la motivación para desarrollar este trabajo de

graduación.

Objetivas

Objetivo Geiieral

Establecer el efecto de la exposicion de suero antiotidico polivalente equino a pH bajo (4.3),

en la inactivación de los virus de la Polio y del llerpes Simplex-1.

Determinar el efecto del tiempo de exposición a ptI bajo í.4.3) en el grado de inactivacihn

viral.

Objetivos Específicos

Preparar scmillas virliles de ambos virus. Polio y Herpes Simplex-l.

Efect~iar la titulacibn de las semillas virales antes mencionadas

liealizar ensayos in vitro para determinar la dismin~icion del titulo viral en los sueros equinos

inoculados a diferentes pH (4.3, 5.0 y 7.0)

Examinar el efecto tóxico del suero con preservantes y sin ellos sobre los cultivos celulares y su

efecto inhibitorio sobre los virus.

Valorar la adecuación del tratamiento de pH ácido para la inactivación viral, con el fin de

evidenciar la segiii-idad del pi-od~icto final.

Marco Teórico

Los sueros antiofidicos son productos biofarmaceiiticos y, como todos los hemoderivados existentes,

conllevan el riesgo de contener agentes infecciosos perjudiciales a los seres humanos, debido a su

producción en un ente biológico. En el caso de productos hemoderivados de origen humano, se plantea la

posibilidad de contaniinación con los virus de la Inmunodeficiencia Humana 1 y 11 (HIV 1 y 11), Hepatitis

A (HAV), B (HBV) y C (HCV), Parvovirus B19 y Hepatitis G (CDC, 2002). Cuando los hemoderivados

provienen de animales como el caballo y la oveja, es necesario considerar la posibilidad de transmisión de

otros agentes infecciosos. En las últimas décadas se ha dado un aumento en los reportes de enfermedades

zoonóticas y emergentes, lo cual ha generado una preocupación creciente acerca de la seguridad de estos

productos. Muchos paises ya exigen. dentro de los requisitos para productos de uso hcimano, una

validación de que su pi-odiicci0n se encuenti-e libre o qiie tenga iina probabilidad rnininia de transinitir este

tipo de infecciones. En consecuencia con lo anterior, instituciones como la Organización Mundial de la

Salud (OMS), Food and Ilrcig Adininisti-ation (FDA) de los Estados Unidos y la Agencia Europea para la

Aprobación de Producros Médicos, aclaran la necesidad de realizar- est~idios para asegurar qcie los

diferentes procesos de mancifactura contemplen la remoción e inactivación de potenciales agentes virales

en los derivados sangciincos, considerando que las f~ientes de contaminación varían a lo largo del proceso.

I,a OMS, por inedio del Comité de Expertos en Estandarización Biológica. ha elaborado distintos

requerimientos para el LISO adeciiado de estos productos dc mancra segura entre la población. Algunas de

estas normas datan de los años 60. Fue, sin embargo, en 1999 c~iando se logró establecer los estándai-cs

para la inactivacion y aclaramiento de agentes infecciosos en la manufactura de derivados del plasma de

fuentes no hcimanas para LISO parenteral (Burnouf, 2004). No obstante, en el año 2004, durante diferentes

reuniones emergieron riuevas opinioncs y preocupaciones que llevaron a la OMS a tomar medidas, no sólo

en lo referente a agentcs irifccciosos virales, sino tainbién en otras variantes como la enfermedad de

Creutzfeld-Sacob, cuyo agente causal son los priones. siendo su incidencia y patología preoccipante dentro

de la comunidad (Riirnouf ct al.. 2004).

En consecuencia, es necesario que el Instituto Clodomiro Picado, perteneciente a la Facultad de

Microbiología de la Universidad de Costa Rica, tome dentro de sus nuevas prioridades establecer que su

prcducto principal, el suero antiofídico, sea seguro para uso humano. Además, si el Instituto deseara -en

algíin momento- expandir su mercado fiiera de América Central. las reglamentaciones internacionales

exigen que dicho prod~icto cuente con la misma validación viral. Así, el propósito de este trabajo de

investigación es poder validar, al menos, la inocuidad vira1 en el proceso de manufactura del suero

antiofidico.

Entre los requerimientos establecidos para la producción de sueros hiperinmunes, como los antiofídicos,

cabe resaltar lo importante de la escogencia del animal usado. Los animales deberán ser sanos, por lo tanto

deben mantenerse en observación. por lo menos, siete días antes de la inmunización. Si se demuestra una

infección o se hallan signos de una enfermedad persistente, no relacionada con la inmunización, el suero

no debe ser utilizado y debe llamarse a las autoridades reguladoras para que dirijan las posibles medidas

que surjan como consecuencia de tal situación.

En la producción del suero antiotidico polivalente se utilizan caballos, dado que son de fácil manejo.

Además, permiten grandes volúmenes de sangría. L,a producción empieza al inmunizar los caballos con

dosis crecientes de una mezcla de \-enenos de serpientes venenosas de Costa Rica. Estas dosis incluyen

adyiivantes inmunológicos que propician una liberación lenta y constituyen un estímulo inmunológico

constante, ocasionando el menor daño al receptor. Generalmente, se sigue un esquema de inmunización

durante algunos meses y se inyectan dosis crecientes por vía subcutánea (Barquero, 1998). Para más

información consultar el Anexo 1.

A pesar de que no se ha repor-tado la transmisión de enfermedades infecciosas a través dc los antisueros de

origen equino, la posibilidad teórica dc transmisión de agentes de los caballos a los seres humanos debe

ser considerada. El hecho de clue se hayan reportado transmisiones de enfermedades zoonóticas en los

íiltimos años, abre una ventana de posibilidades en este tema, ya que pueden dar cambios en los

reservorios nat~irales, esistieiido un riesgo de enfermedades emergentes. Dentro de muchos ejemplos se

pueden citar los vircis de! i<hola. Marburg, Hantaan, Lassa, Nipah. HIV, Paramyxovircis, Morbilivirus

equino. Virus del Oeste del Nilo y la reciente epidemia de Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS),

del cual es responsable un col-onavirus. Sin olvidar la posibilidad de la contaminación posterior con virus,

como lo fue el caso del virus SV40. el cual se conoce como contaminante de vacunas de polio, lo que

produjo una administr-ación inad\-el-tida del virus, con sus potenciales secuelas para el individuo

(Theakston et al.. 2003). Según estudios hechos en 1961 se demostró que el virus SV40 podría causar el

cáncer en roedores, tales como hánistcres. El virus SV40 también ha sido asociado con cánceres raros en

seres humanos con10 el niesotelioma. osteosarcoma y ependimoma (Health Canada, 2004).

Para solucionar cstci problcniática. es necesario conocer los posibles virus equinos susceptibles de

transmitirse y así determinar las necesidades que deben ser cumplidas al realizar la validación viral. Existe

un número apreciable de vil-cis equinos que pueden llegar a afectar a los sei-es humanos -de diversas

formas- y cada uno con una sintoniatologia d~ferente (para mas información consultar el Anexo JJ, el cual

contiene un cuadro con los virus encontrados en Equinos). Por otro lado, existen casos en los cuales se ha

demostrado la presencia del virus y se ha relacionado con un problema claro, pero no se ha logrado una

asociación definitiva, como sucede con el Virus de Borna. Otros virus, por el contrario, son muy

conocidos por su papel en la infección en seres humanos, por ejemplo, los virus de las Encefalitis Eq~iinas

del Oeste, Este y de Venezuela, donde se producen alteraciones a nivel del sistema nervioso central, con

hiperexcitabilidad, cólicos, anorexia y cambios en el sistema sensorial, entre otros. Algunos virus ya son

considerados enfermedades emergentes dentro del marco de salud pública humana, tal es el caso del virus

del Oeste del Nilo (Gould y Fikrig, 2004), del Nipah y del Hendra (Choi, 2004).

Un caso interesante es el Moi-bilivirus eq~iino en Australia (Virus Hendra), donde en 1994, cerca de 14

caballos murieron conio resultado de una infección por su causa. I,a muerte f ~ i e como consecuencia de los

daños severos a los pulmones, debido a una acumulación masiva de fluidos provocados por la infección.

Además. dos personas que estuvieron en contacto directo con los animales enfermos se infectaron con el

virus y desarrollaron síntomas respiratorios. Uno de estos casos resultó fatal. Luego, en 1995 se sig~iieron

reportando casos humanos por el contacto con caballos mal diagnosticados (Barclay, 2000).

Lo que se plantea son estrategias que eviten cualquiei. riesgo, e involuci-eri medidas como:

m Selección de las f~lentes de hernoderivados y monitorización de la salud de los animales.

Pruebas serológicas y moleculares para excluir posibles fuentes ya contaminadas

m Pasos de purificación y procesos para inactivai- y remover virus

m Aplicación de Buenas Prácticas de Manufactura.

Cabe destacar que muchos de los sitios donde se están produciendo estos antisueros, no han realizado aún

procesos de validación, ya sea por falta de recUrsos i) por falta de iniciativa, lo que atrae la preociipación

de la OMS y la Agencia Europea de Evaluación Médica por la Salud del Usuario. (Burnouf et al., 2004).

En lo referente al Control de Calidad. éste se etkctúa antes y después del envase final. Lo realiza tin

Laboratorio especializado para ello. Los análisis del laboratorio se encuentran incluidos en la farmacopea

de los Estados Unidos, dentro de las normas internacionales. Estos análisis consisten en pruebas físicas,

químicas y biológicas, en las cuales se analizan la potencia, los pirógenos, la esterilidad y la seguridad.

El pasado es un buen ejemplo de los errores cometidos por falta de vigilancia y control en lo referente a

productos de origen sanguíneo. A nivel mundial (incluyendo Costa Rica) muchos heniotilicos se

contaminaron con HIV y Virus Hepatitis B (HBV) presentes en la sangre que recibieron (Berger, 2002). A

nivel mundial siguen siendo numerosos los casos como éste (CDC, Morbidity Mortality Weekly Report),

de manera que es un problema de interés mundial. Para controlar estos riesgos deben adoptarse ciertas

medidas como analizar la materia prima. en este caso la sangre o el plasma equino y verificar los procesos

de producción para confirmar la eficacia de estos como removedores o inactivadores virales'. Lo ideal es

que todo se evalúe como un conjiinto, pero existen limitantes como las encontradas en trabajos anteriores

(Loftus, 1997), por lo que debe recurrirse a validar sólo ciertos puntos críticos dentro del proceso. Para

esto es necesario tener un diseño de todo el proceso y a partir de ahí, distinguir los posibles puntos de

control, los cuales. al final, serán valorados mediante ensayos independientes para evaluar todo el proceso.

El término validación se refiere al establecimiento de documentos y evidencias de que un sistema está

funcionando bien para lo que se supone es su fin último. Al parecei- este término se popularizó lucgo de

que la FDA, en 1976, implenientó las Buenas Prácticas de Manufactura, que estipulan que es necesaria la

documentación del proceso, y de ahí una necesidad de la validación cualitativa (Lof'tus, 1997). L,a prueba

de la validación se obtiene a través de la colección y evaluación de datos, preferiblemente iniciando desde

la fase de desarrollo del proceso hasta la tase de producción final. Sin embargo la 17DA ahora lo define

como un programa documentado, el cual provee un alto grado de seguridad de que un proceso específico

producirá consistentcmente un producto de acuerclo con especificacioncs prcdeterrninadas y atributos

cualitativos (L20ftus, 1997).

La validaciOn vira1 incluye métodos complejos, aplicables a muchos productos. [,a elección dcl mktodo

necesario depende de lo que se desea evaluar. Tratándose de ias inmunoglobulinas, es ncccsario anal:zri:- e!

tamaño y labilidad de la proteína preparada, del método de purificación que se ~itiliza, así como la

naturaleza y el tít~ilo de los virus que se emplearán como modelos. Debe haber una clara docunientación

de todos los procedimientos que permitan un análisis correcto de la naturaleza de los virus. en lo reScrentc

a las medicioncs y cuantificación. Existen métodos que buscan la remoción/separación iisicü de los vi1.u~

del producto, mientras que otros buscan la inactivación/destrucción del virus, donde ya el virus no es

capaz de realizar una infección. Coino ejemplos de pi-ocedimientos de inactivación vir-al sc dispone del pl l

ácido. con la ventaja de que desnat~iraliza ciertas proteínas virales y no las inmunoglobuliiias. CJn pH de

4.0 inactivará la gran mayoría de virus envueltos; otros virus, como el de polio, son más resistentes a bajo

pH. No obstante. debe tomarse en consideración que tanto la temperatura como el tiempo de exposición

pueden influencini el efecto del p!-l (Eupert Committee on Riological Standardization RS/01/194; y

Octaaf, 1998). Dentro de los mismos ácidos quc se han demostrado importantcs en la inactivación viral.

' Se cntieiide como removedores virales aquellos agentes q~ic disininuyeri el título del agente infeccioso. Mientras que inactivactotes virales disnii~i~iyen SLI potencial iritkccioso.

cabe destacar el ácido caprílico, el cual se utiliza para la precipitación de inmunoglobulinas provenientes

del plasma (Gamboa y Varela; 2003).

La inactivación viral es una opción que permite obtener productos con alta seguridad. El tratamiento

térmico, :a fotoinactivación, el uso de derivados del ácido propiónico (como la P-propiolactona), el pl-1

bajo (alrededor de 4). el tratamiento enzimático (con pepsina), la pasteurización, el uso de detergentes

solventes (inactivan viriis con envoltura lipídica) y la combinación solventeldetergente son los métodos de

mayor aplicación en la inactivación viral. En general, los métodos de inactivación conocidos, además de

caiisar una disminución significativa de la carga viral, pueden provocar daños a los diversos cornponentcs

de la sangre y disminuir SLI actividad terapéutica. Nuevos métodos se evalúan en la actualidad; no

obstante, los i-esultados muestran la necesidad de continuar trabajando en la bíisqueda de otros más

efectivos, sencillos y de mcnor costo.

1.0s estudios de validación vira1 son experimentos a baja escala ("scale down"), que estiman la reducción

viral en el proceso de manufactura y determinan los pasos y puntos críticos de control durante el proceso,

controlando así desde la materia prima hasta los posibles contaminantes a través del sistema. Consiste en

i-ealizar un ensayo dc carga viral antes y uno después de efectuado el tratamiento, simulando el proceso dc

producción. y \risualizar al final un factor de reducción viral. Para ser un paso válido debe haber una

rediicción vira1 de al menos 4 logaritnios (Espert Committec on Biological Standarization BSl01ll941.

3001). Para csto, se Lisan modelos virales. utilizando agentes como el HIV 1 y 11, uno o más virus no

envueltos como Virus Hepatitis A (HAV). Virus de la Encefalomielitis (EMCV) y Parvovirus Porcino; uri

virus ADN envuelto co~iio el de la Pseudorabia o HBV de patos; un modelo para el estudio del Virus

tlepatitis C (HC'V) como cl virus Sindbis o el virus de la diarrea Bovina (BVDV) (Vil-al Safety of Plasma

Derivatives. Karolinska Institute, 1997). En el aclaramiento viral es necesario considerar que si se altera

algún punto del sistema es necesario hacer una revalidación del proceso.

La selección de los viriis es iin factor crítico al validar, ya que deben escogerse no solamente aquellos que

podrían estar presentes, conocidos como los relevantes, sino también viriis modelo, que normalniente n o

están presentes. pero son buenos indicadores de la eficiencia del proceso en la remoción. Para más

información, el anexo 111 contiene una lista de los posibles modelos a utilizar para estas pruebas.

Los virus que se escojan como modelos, deben ser lo más semejantes posible a los patógenos, como MBV,

HCV. HIV, HAV y Parvovirus B19. Es necesario trabajar con un exceso de virus, porque así se obtiene

mayor precisión y scgiiridad durante los análisis, evitando además el problema que podria surgir por

algunos virus encontrados en la muestra. Se establece que el volumen viral no debe exceder el 10% del

volumen de materia prima que se utiliza (Comunicación personal con los Drs. José Maria Gutiérrez y

Guillenno ~ e ó n ' , 6 de Agosto 2004). A la vez, es necesario que los virus utilizados sufran la menor

cantidad de manipulaciones, en lo referente a almacenamiento, descongelamiento u otro factor que p~ieda

alterar su infectividad viral.

En este trabajo, se seleccionaron dos virus: el de la cepa vacuna1 de Polio Virus (cepa Sabin 3) y el de la

cepa de Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1), como modelos virales para otros virus infecciosos para el ser

humano por ejemplo los virus de las hepatitis. El primero va a representar una partícula viral desnuda de

ARN y el segundo una partícula viral de ADN doble banda envuelta. Para más información sobre las

propiedades de estos virus consultar el anexo IV.

La técnica escogida para realizar la determinación debe ser precisa y confiable, y se prefiere usar altos

tit~ilos virales. Deben incluirse los controles adecuados para evitar problemas debidos a la matriz

(producto a evaluar) y a los modelos virales a utilizar, además de comprobar los títulos virales y los

cultivos de células empleadas. Las técnicas más usadas son ir1 vitro, gracias la facilidad de su manejo,

aunque también se pueden usar modelos animales. sobre todo en caso de virus cuyo crecimiento en cultivo

celular no se da, o no es óptimo.

Cuando la niuestra presente anticuerpos u otra sustancia inhibidora inespecífica de la actividaci viral. debe

recurrirse a técnicas para corregir esta situación, ya que no se podría distinguir si esta inactivación t.h

debida al proceso evaluado para la remoción/inactivación viral. o a estos factores.

Instituto Clodomiro Picado, Facultad de Microbiologia, Universidad de Costa Rica.

Materiales y Métodos

A. Elección de los Cepas Virales a Utilizar

Se eligió trabajar con cepas virales de HSV-1 (HF: ATCC VR-260) y Poliovirus 3 cepa vacuna1

(Sabin.; ATCC VR-193), como modelos virales para la validación, dadas sus características

físico-químicas, su facilidad de manejo y su semejanza con virus potencialmente presentes en el

suero estudiado. Estos dos modelos virales son parte del grupo de virus propuestos para tal fin

por la OMS, la FDA, la Agencia Europea de Productos Médicos y el Centro de Control de

Enlermedades.

B. Elección de las líneas celulares y los medios de cultivo

Se ~itilizaron las líneas celulares Hep-2C (ECACC 85020207) y Vero (ATCC CCL-81). debido

a que estas células son permisibles a la infección por estos virus. se obtienen tít~ilos altos y

t:;icilmenre observables por su efecto citopático (ECP) característico. El medio de cultivo

escogido es el Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM), marca Signia, que se con~plen~enta

con penicilina 100 IJImL, estreptomicina !OO pgImL, L-glutamina 2 mMIL, bicarbonato de

sodio al 0.22" y suero de bovino recién nacido. marca Sigma, al 2% o 1 O')/;, según con-esponda.

C. Suero antiotidico polivalente no estéril, del Instituto Clodomiro Picado, y que ha sido

iorm~ilado con fenol al 0.25%, NaCl al 0.9% y timerosal al 0.005'1/0 como presei-vantes.

Además. para la última parte de la investigación, se utilizó suero antiofidico polivalente sin

preservantes, también proveniente del Instituto Clodomiro Picado.

Efecto citotóxico del suero antiotidico polivalente.

Se trabajó con las siguientes muestras:

a) Suero sin preservantes (ni tinierosal ni fenol)

b) Suero con prcservantes

1. Se trabajaron ambos a pH 7 y a pH 4.3, del mismo modo que se trabajó en la parte

de Preparucióii de .sernill~ls virales a aiiferentes pH y diJerentes tiempos en lo que

respecta al ajuste del pH.

2. Se diluyeron los sueros del siguiente modo: 1 :20, 1 :80, 1 : 160, 1 :320 y 1 :640.

3. Se inocularon 5 pocillos de la placa con la monocapa confluente por cada dilución.

4. Se incubaron a 37' C y una atmósfera de 5%) de C o z . Se realizaron las

observaciones y se calculó el título vira1 (TCIDjO/100 pL) mediante la Fórmula de

Reed-Muench (Feigel, 1970) de acuerdo con las lecturas efectuadas.

Producción de la semilla viral y determinación del ti&

1 . Se prepai-al-on las semillas virales de ambos virus

Se inoculó 1 ml de cepa viral ATCC en una botella de 75 cm2 con una monocapa celular

confluente. dependiendo del tipo de virus sera la línea celular a utilizar (Vero con HSV-1 y tlep-

2C con Polio). Despuks de 1 hora a 37" C, en una atmósfera de 5% de C a z , con una agitación

suave cada 10 minutos, se agregaron 15-20 ml de hlEM al 2%. Se observaron por una semana y

cuando el ECP fiie total. se congelaron a -70'.

Se cfcctuaron trcs procesos de ccingclaciónldcscongelación; se centrífugo 10 minutos a 5.000

rpm y el sobrenadante se guardó en alícuotas de 2 ml, en viales debidamente rotulados y se

congeló a -70°C para su posterior empleo.

2. 'fitulación de las semillas.

Se realizó a tt-aves de un ensayo de microtitulación en placa.

i . Líneas celulares: Las células se conservan congeladas en nitrógeno líqirido en M E M

con 20% de suero fetal bovino y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO). Para su uso

frecuente se mantienen en el laboratorio en MEM al 10%. Al realizar un subcultivo de

las mismas. para que crezcan. se utilizó MEM al 10% y luego para mantenerlas se

iitilizó el MEM al 2%.

i i . Cultivo Celular: Se prepararon placas de 96 hoyos con monocapas contluentes de las

respectivas líneas celcrlares, según sea la semilla viral que se empleará. Para esto se

tienen monocapas confluentes en botellas de plástico, las cuales fueron sometidas a

procesos con TripsindEDTA, para separarlas y poder sembrarlas proporcionalmente en

los respectivos pocillos de las placas. . . . 111. Inoculación Semilla viral: Se realizaron diluciones decimales en serie del virus en

MEM al 2%, inoculando O.lml de cada dilución en los diferentes pocillos de la placa de

96 hoyos, se incluyó siempre el control celular de hlEM al 2% sin virus.

iv. Determinación del título: Se incubaron a 37" C en una atmósfera con 5% de COZ. Se

observaron durante 4 días, anotando los cambios y verificando la aiisencia de

contaminantes. Se efectuó una lectura final al quinto día. En el caso del virus Polio, se

comprobó la existencia del ECP al teñir la placa con cristal violeta ( 1 : 1000) durante 45

minutos a temperatura ambiente. Mientras que, para el HSV-1 la lectura sc realizó

únican~ente observando su ECP.

v. Se calculó el títiilo vil-al (TCID5,,/100 pL) mediante la Fórmula de Reed-Muench

(Feigel, 1970), de acuerdo con las lecturas efectuadas.

Preparación de semillas viirales a diferentes pH y diferentes tiempos.

1 . Se trabajó el siiero antiofidico polivalente en cámara de flujo laminar. Se dividió éste en 3

erlenmeyers, con 50 m1 de suero cada uno.

2. Se ajustó el pH con Hidróxido de Sodio 1M (NaOH) o con Ácido Clorhídrico 1M (HCI) para

obtener los pHs a analizar (pH de 7 y pH de 4.3). Se dejó el último erlenmeyer sin cambio de

ptr ( p ~ 5).

3. Se tomaron 10 m1 de cada el-lenmeyer. se filtraron con una membrana de 0.22 pm. se

repartieron en alícuotas de 1 m1 en 6 viales diferentes y se congelarori a -70°C. Estos viales se

tomaron como controles para observación del efecto del pH y el efecto de los componentes del

suero antiofidico cn las líneas celulares.

4. Seguidamente se inociiló 1 ml de la semilla viral en 10 m1 de suero antiofidico a los diferentes

pHs y se tomaron muestras a los siguientes tiempos: Tiempo cero (To, inmediatamente después

de inocular y agitar), Tiempo tres (T<), Tiempo seis (T6) y Tiempo veinticuatro (T,,) horas. Se

filtraron iitilizando iina membrana de 0.22 pm y se repartieron en alícuotas. para ser

posteriormente congeladas a -70" C hasta su ensayo.

Análisis de la Cinética de Inactivación Vira1

2. Se realizó una titulación de la semilla para cada prueba.

3. Se realizaron diluciones decimales seriadas con MEM al 2% de las siguientes muestras:

a. Suero pH 7 con virus

b. Suero pH 4.3 con virus

c. Suero sin cambio de pkl con virus

4. Se tomaron, apartir de estas diluciones, loop1 para cada pocillo seleccionado de cada dilución.

Esto se realizó para cada tiempo.

5 . Se inocularon 100 p1 de los sigiiientes controles por cada hoyo en la distribución escogida:

a. Suero pH 7

b. Suero pH 4.3

c. Suero sin cambio de pH

6. Se incubaron a 37" C y una atmósfera de 5% de Coz. Se realizaron las observaciones y los

cálculos para la obtención del título viral, de la misma forma que en la primera fase.

Posterioi-mente se trabajó con Suero Antioi7dico Producto Final con preservantes y sin ellos. En este

caso se contempló una dilución de 1 :20 previa al análisis de las muestras y controles.

Resultados

El efecto citotóxico del suero antiofídico polivalente se determinó utilizando diferentes diluciones en

cultivos celulares de Vero y Hep 2C. Como se observa en el Cuadro 1, se produce un efecto tóxico en las

células cuando se prueba el suero antiofidico con preservantes a pHs 4.3 y 7 en una dilución 1:20. En

cambio, el suero sin preservantes no daña las células utilizadas a esa dilución. Ya que la citotoxicidad es

baja, los siguientes experimentos se realizaron sin hacer dilución previa de la muestra pues la dilución más

concentrada a probar sería 10.' en ambos casos.

Cuadro 1: Efecto Citotóxico del Suero Antiofídico Polivalente a diferentes condiciones sobre

monocapas celiilares (Línea celular Vero y Hep-2C).

Células VERO*

Células HEPZC*

Suero sin Preservantes Suero con Preservantes Suero pH 4.3 con Preservantes

Suero sin vreservantes

I 1

*O% equivale a la ausencia de efecto citotóxico y 100% a un efecto citotóxico e n todos los pocillos.

0%) 0% O'%,

Suero con Preservantes

r - -

Suero pH 4.3 sin Preservantes 1 100').;l 1 O':%I / O'% 1 0% O'!/;i 1

En el cuadro 11 se muestran ios resultados obtcnidob de ;a ciiiiiica de la inactivación de !os virus a

0% 100% 1 00%"

0%) 1 00%~ I O'Y0 O'%l

Suero vH 7 con t'reservarites

diferentes pHs y diferentes tiempos de exposición. ('omo se puede observar, los títulos de ambos virus

Suero pH 4.3 sin Preservantes Suero pH 7 con Preservantes Suero pM 7 stn Preservantes

0%) 070 --- 20%

O%, 090 O'%

O 1 O'% 1 O'% /« 0% 0% 1 O'%)

Suero pH 4.3 con Presrrvantes 1 1 0O'X1

fueron altos y ficilcs dc determinai- poi- el método escogido: 10'' ' I ' ( ' 1 I ) 501 100 p1 para el virus Polio y

TClD 501 100 p1 en el caso del t lSV-l. No se pudo determinar ninguna diferencia en los títulos de

I

O'%) O'%) O'%)

0%) 0% O'%,

1001/;1

ambos virus en las diferentes condiciones estudiadas. Con respecto al virus Polio, hubo un descenso de su

100% 1 0O0/11 1 00%1

O'%) 0%) 0'!0

O 46

título en más de 6 logaritmos en los distintos pHs y tiempos expuestos, inclusive a tiempo O, lo que nos

O'% ! O%>

indica que el factor pH no influye en esta disn~inución. En el caso del tISV-1, no fue posible detectar

O'%/;> 1 O(K1

0'!41 1 OOh

efecto citopático en la dilucihn más baja (10. ') ~itilizada para el ensayo (inhibicihn total al contacto con el

0%)

O'Xl

O"/ / O

suero).

O?,?l

0';'~ I

O'!<> O'XI

Cuadro 11: Resultados de la inactivación de los virus a diferentes pHs y a diferentes

tiempos.

-- - -

Semilla

Ya que el suero antiotidico es tratado con preser\-antes, sc pensó que éstos podrían estar inactivando los

.,.,-., ;, ,,s. pcr lo tanto se reri!izó el mismo experimento con sueros con preservantes y sin ellos obteniendo los

mismos datos. sin encontrar iina diferencia significativa en lo que respecta a la presencia o aiisencia de

preservante.

Estos rcsuitadoc claramente 119s deniuestran qge cxiste a'.gún otro factor -o factores- que i~activan los

virus al contacto con el suero antiotidico a diferentes pHs y sin alteración.

Discusión

Este estudio busca establecer el efecto de las variaciones del pH de los sueros antiofidicos en la

inactivación de los virus de la Polio y del HSV-1, los cuales son utilizados como modelos virales

para la validación de hemoderivados. De este modo. se intenta verificar si hay una ventaja en la

modificación del pH a la hora de la formulación del producto final en lo que respecta a la seguridad

viral. Además de analizar si el tiempo de exposición del virus a diferentes pHs, influye en la

inactivación y por ende en la validación del proceso. Se propone que al realizar una variación en la

acidez del suero, conllevará a la modificación de componentes virales, necesarios para la infección

de células, debido a los can~bios fisicoquímicos que se pudieran dar dentro de las estructuras de las

proteínas y de los ácidos nucleicos, que conforniaii los principales componentes virales (Nelson, y

Cox, 2000). Se ha probado la inactivación a bajos pHs en muchos modelos de virus envueltos (Bos,

1998; Hamalainen, 1992), contribuyendo esto a la seguridad viral de preparados de

inmunoglobulina G humana (Reid, 1988: Yap, 1996). Por ejemplo se han probado disminuciones de

5-8 Log por inactivación de virus como HIV, HSV, Varicella-Zoster (VZV) y Citomegalovirus

(CMV), los tres últimos pertenecientes a la familia Herpetoviridae. Mientras que virus como Polio y

otros virus no envueltos parecen ser n ~ á s resistentes (Rurnouf et al. 2004).

En estudios anteriores se ha planteado el papel del pfl iicido como posible paso de renioción de 2.8-

3.5 logaritmos de virus como el Virus Equino de Anemia Infecciosa, el Virus Sindbis, Poliovirus y

Parvovirus Porcino (Grandgeorge et al., 1996). Asimismo, se ha reportado una disminución en ios

títulos de virus envueltos como HSV-1 en presencia de ácido caprílico -pH 5- siendo el pH ácido el

posible agente inactivador de este virus con membrana (Korneyeva M. 2002; Gamboa y Varela;

2003)

Trabajos anteriores también discuten el hecho de que el cambio en el pH, por si solo, no logra una

inactivacióii vil-al total, sino que esta condición se \.e influenciada por factores como el tiempo de

exposición, la temperatura, la osmolaridad y la cantidad de iones denti-o del sistema (Rurnoufet al.,

2004).

Por ende. se busca validai- un plinto de control tinal, dentro del proceso de la formulación del

producto, con lo que, el ajuste a un pH puede lograr la inactivación viral buscada para la seguridad

viral. (Ver Anexo 1). En la actualidad, se ajusta el pH a 7.0, y al formularse se le agregan

preservantes y sales, con el fin de aumentar la vida útil del producto, evitar ciertas contaminaciones

y mantener una osmolaridad adecuada.

Se ha probado que almacenar preparaciones de inmunoglobulinas a pH 4.25 durante 21 días a 20" C

causa disminución de la infectividad de virus como HCV (Louie, 1994). No obstante, si se llegara a

probar una disminución en la infectividad. se podría considerar como un paso de seguridad viral

antes del almacenamiento, lo cual se propone que no afectaría la actividad biológica, eficacia clínica

ni seguridad -en general- del producto (Rurnouf et al., 2004). Sin embargo, se debe evaluar

posteriormente si podrían existir otras implicaciones a futuro para el producto, como mantener los

anticuerpos a un pH ácido durante un largo periodo de tiempo y en condiciones ambientales

variables. A pesar de muchos estudios, actualmente no se ha utilizado ampliamente una f'onnulaci6n

a un bajo pH en este tipo de productos ni en otros hemoderivados.

Los virus utilizados se seleccionaron de una lista de virus empleados como modelos para la

validación de este tipo de procesos (ICH, 1999). Para este trabajo se escogieron lo de más fácil

acceso y manipulación dentro de las condiciones del laboratorio. El método asignado presenta

ventajas tales como la necesidad de cantidades mínimas de virus, poca cantidad de reactivos, bajo

costo y resultados en corto tiempo, debido al rápido crecimiento de los virus (Gamboa y Vai-ela,

2003). Es importante recalcar que éstos tienen propiedades fisicoquímicas similares a virus

potencialmente infecciosos al ser humano. e incluso. existe un riesgo de transmisión a través dc

productos provenientes de la sangre. Por ejemplo, Virus Polio, al ser una partícula ARN desriiida,

sirve como modelo para el HAV, y HSV-l. por sus características de ADN doble banda con

envoltura, serviría para el caso del Citomegalovirus (CMV) y otros.

Se realizó un experimento con la finalidad de evaluar el efecto de los preservantes sobre las células,

pues el fenol y el thimerosal son conocidos por sus diversos efectos biológicos. (Theakston et al.,

2003). Se encontró un efecto tóxico sobre las células cuando se probo el suero antiofidico con

preservantes a los diferentes pHs en una dilución 1:20. Sin embargo, este problema se evitó

trabajando con diluciones donde este efecto no interfería con los análisis.

Segírn los resultados analizados anteriormente. se concluye que efectivamente cxiste una

inactivación viral completa del HSV-1 y una inactivación parcial del virus de la polio, ya que la

inactivación fue mayor a 6 Log. No obstante, esta inactivación parece ser resultado de otras

propiedades propias del suero equino o factores que se adquieren durante su producción -no

evaluadas en este trabajo- y no debido al cambio de pH, dado que la baja en el titulo viral es similar

en ambos pH. Se planteo el posible efecto de los preservantes en la disminución del titulo viral, sin

embargo, los experimentos demuestran que en la disminución del titulo no hubo diferencia

significativa de acuerdo a la presencia o ausencia de preservantes; por lo cual se reafirma la

posibilidad de la presencia de otros factores intrínsecos presentes en el suero.

Además, es importante recalcar que la diferencia en la baja de la inactivación del virus de la Polio,

podría deberse a diferentes factores. Es importante recalcar la procedencia de los sueros, donde se

tiene tanto diferentes lotes de suero como mezclas de sueros de distintos caballos, aumentando así

las variables del ensayo y de los i-esiiltados.

En realidad, con el virus Polio no se esperaba que existiera ninguna baja en el títiilo, debido a que

según la literatura consultada, este virus es resistente a un ptI mayor o igual a 3 , y en este

experimento siempre se utilizaron pHs superiores. (Ver Anexo IV). Además, a la hora de analizar el

cuadro 11, se nota que la disminución fue semejante a los diferentes pHs, comprobando una vez

más, la existencia de otro factor que inactivara la infectividad viral.

Es importante mencionar que para estas titulaciones se empleó la técnica de monocapas celulares

seleccion3dus de acuerdo con los virus escogidos como modelos virales. Para trabalar con

monocapas celulares se recurre a medios de crecin~iento y mantenimiento especiales, los cuales

cuentan con diferentes aditivos para asemejar la situación in vivo de las il~ismas. Dentro de los

componentes que portan, se cuenta con amortipadores de la acidez, esto principalmente para evitar

efectos tóxicos c a ~ s a d u s por productos mt-tabóliccis dc las mismas cél~ilris. sobre tocio en lo

referente a la oxidación de carbohidratos y producción de ácidos como el pirúvico y láctico. L,a

mayoría de las células tienen iin ámbito de pH en el cual se mantienen de manera óptima. y que se

maneja generalmente entre 7.2 y 7.4. Como indicador se utiliza el Rojo de Fenol. (Flint SJ et al.

1999). Durante este trabajo se utilizó un amortiguador de bicarbonatos, que a pesar de tener baja

capacidad amortiguadoi-a, se emplea mucho dada su accesibilidad; sin embargo, los sistemas

amortigiiadores de este tipo, dependen de la presión parcial de dióxido de carbono, lo cual a la vez

limita su capacidad. A pesar de ello. es poco probable que los cambios de pH i-ealizados en los

sueros, no fueran amortiguados al diluirse en los medios de cultivo celular, aunque existe una

probabilidad de que los resultados se pudieran afectar por condiciones ambientales de la incubadora

de dióxido de carbono.

En trabajos anteriores, se demostró que la precipitación con el ácido caprílico no es la responsable

de la inactivación viral, debido a que el título viral disminuye casi inmediatamente al agregársele la

semilla viral al suero antiofídico equino (Gamboa y Varela; 2003), esto antes de realizar la

precipitación. Sin embargo en otros trabajos, también se ha comprobado el papel del ácido caprílico

como inactivador viral ("ournouf, 2004). Consecuentemente, se acentúa la probabilidad de que sean

propiedades intrínsecas o factores inhibidores del suero los que causan la inactivación de los virus

aquí analizados y esto lo comprueba la disminución del título de virus Polio a pH 4.3, ya que son

resistentes a este pl l .

Gamboa y Varela. 2003, observaron igualmente una disminución del titulo. tanto para el \;¡rus

Polio. como para el HSV-l. Se plantea qiie en el caso del HSV-1 -dado qUe pertenece a la familia

Herpetoviridae- es factible la presencia de anticuerpos neutralizantes, ya que los caballos

normalmente están expuestos a virus de esta familia, sea de manera natural o artificial, en lo qiie

respecta a la vacunación que se les brinda (Monanty y Dutta, 1983). Un ejemplo de exposición

natural sería al Herpes Virus Equino-1 (EHV-1) -perteneciente al grupo alpha iierpesviridac- lo cual

es genéticamente y estructuralmente muy similar al HSV-1 (Karlin, Mocarski y Schachtel. ! 094:

Montaguc y Hutchison, 3000).

En cuanto al virus Polio, se plantea el efecto de factores inhibidores intrínsecos en el plasma, cliie

vor sí misnios producen una disminución en el título, de manera variable. Aunque, en la familia

Picuriiaviridae, existan virus ecjuinos (Rhir:o\:irus Equino-l. Virus de la Rhinitis A Ecluino. Virus de

la Rhinitis B Eqiiino, Rhinovirus Equino-111, entre otros) estos pertenecen a otro género diferente al

del viriis Polio, considerado un enterovirus (Hughes, 2004). Pese a esto. no se descarta por

completo la posibilidad de la existencia de epitopos similares que podrían dar lugar a anticiici-pos

neutralizantes, debido a una reacción cruzada (Hughes, 2004).

Con el trabajo aquí realizado, se contribuye a reforzar la idea de la presencia de estos tactores

inhibidores. también presentes durante el trabajo de Gamboa y Varela. para cl Virus I'olio, y para el

HSV-l. sólo se encontraron resultados similares. situación que contrasta con otros trabajos

realizados en el exterior (Ros, 1998; Hamalainen, 1992; Reid, 1988; Yap, 1996; Burnouf et al..

2004), donde se logra validar procesos a diferentes pHs, sin nombrar la presencia de inhibidores de

este tipo. Pero es importante recalcar que, así como cambian las formas de obtener el producto -en

todo el mundo- también varían las condiciones presentes en los animales utilizados para la

producción (Theakston et al., 2003), lo que produce una gran variabilidad en los resultados,

localmente y entre regiones.

Los posibies factores inhibidores no evaluados en el presente trabajo no permiten validar el cambio

a pH bajo como inactivador viral, dentro del proceso de producción del suero antiofidico.

Conclusiones

SegUn reportes, se estima que la mortalidad mundial por mordeduras de serpientes ronda el ámbito

entre 50'000 - 100'000 casoslaño (Chippaux, 1998), de allí la importancia de la producción de

sueros antiofidicos accesibles a todas las personas que los requieran. Con el uso de antisueros se ha

reducido la mortalidad de más del 50% a menos del 5% (Chippaux, 1998). Igual trascendencia es

garantizar que su necesidad será suplida con los mejores estándares posibles, incluyendo lo

referente a su seguridad, siendo de vital importancia la seguridad ante la presencia de agentes

infecciosos como las bacterias, los hongos y los virus, e incluso los parásitos.

Además, debe contemplarse la necesidad de la vigilancia de a los animales utilizados para

inmunización, sean equinos u ovejas, en lo concerniente al monitoreo de su salud, a exámenes de

qiiimica sanguínea y hematologia de rutina, junto con análisis post mortem. Debe guardarse cuidado

con enfermedades endémicas, como la tripanosomiasis ("durina"), encefalitis equinas, anemias

infecciosas equinas, "muermo" y demás, las cuales excluyen ciertas regiones y zonas geográficas,

para lo que respecta a su uso en la cría de animales como productores de sueros (Theakstonet al.,

2003). Asimismo. deberán implementarse medidas para el diagnóstico rápido de estas enfermedades

para evitar que se propague entre la población, tomando en cuenta lo difícil que es mantener

aislados a individuos de estas poblaciones y lo poco que se conoce acerca de la virología de estos

animales. El riesgo de contaminación vira1 existe, y es real.

A pesar de que la vigilancia (precauciones y tamizaje) de los animales productores, es muy

importante también la demostración de que el proceso que lleva al producto final, es hábil en

remover o inactivar ciertos virus importantes (Theakston et al., 2003). Es decir, debe evaluarse el

proceso productivo desde varios puntos; primero, estableciendo cuáles son los riesgos presentes, los

posibles patógenos perjiidiciales y las medidas correctivas, para evitar su presencia dentro del

producto, establecer Lin riesgo y una especificación final (Theakston et al., 2003). Aunque muchas

veces es casi imposible prevenir la existencia de riesgos de agentes patógenos, se hace necesaria la

validación de un plinto de control que asegure su eliminación o inactivación. Se habla de la

ricccsidad dc que cada productor valide su propio proceso, de acuerdo con las grandes diferencias

entre los pequerios y gi-andes productores, así como en las variables de s ~ i prodiiccicín.

Todo el experimento realizado para validar la producción de suero antiofídico en el Instituto

Clodomiro Picado, apunta a que existen factores intrínsecos de este suero -no contemplados en este

proyecto- que inactivan completamente a virus similares a HSV-1 y que disminuyen virus similares

a Polio, al menos 6 log, pero no necesariamente debido cambios del pH como fue inicialmente

propuesto. En consecuencia, el tratamiento del suero a pH ácido no ha podido ser validado como

paso de inactivación viral en el presente trabajo.

Cabe dcstacar la necesidad de un trabajo de seguimiento, para dilucidar cuales factores del suero

antiofídico equino polivalente causan esta reducción en el título viral y la búsqueda de métodos para

su eliminación que permitan una validación que garantice un bajo riesgo de transmisión viral.

Es importante recalcar las medidas regulatorias impiiestas por la Organización Mundial de la Salud,

que plantean los siguientes puntos que se deben considerar a fiituro (Theakston et al., 2003):

1. Biiscar la utilización de animales libres de enfermedades, en la medida de lo posible.

2. Considerar la existencia a futuro de nuevos patógenos, como los priones y nuevos virus.

3. Eliminar otros patógenos por la microfiltración con un filtro de 0.22 p n ~ .

4. Evaluar procesos de producción "genéricos" o pasos críticos de control, para la remoción o

inactivación de potenciales virus contaminantes. Estos estudios deben usar modelos virales

de agentes con membrana lipídica y sin ella.

5 . Evaluar primero el proceso en miniatura y Iiiego evaluarlo en la producción real, para así

confirn~ar los resultados.

6. Poder implementar el proceso con entrenamiento y metodologías durante la producción

lucgo que ha sido validado.

Por último, se deja abierta la posibilidad de distintos nuevos puntos de control o de posibles

métodos por implementar, para asegurar así una inactivación/remoción viral, los cuales son muy

diversos y cada uno se adapta a las necesidades y diferencias de cada proceso. Lo anterior se

efectuará siempre basándose en trabajos anteriores y en un análisis profundo de los componentes de

cada suero en particular.

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Anexos 1

Cuadro 1. Esquema - básico de Manufactura:

S 1. Recolección de los Venenos

- l 1

j 2. Inmuoüación de los animales

Sarigria de los caballos y qaracÍÓ~i del ylaniia i Pwificacióti de las Iiuriuiioglobulitias o 1 .411ticuqms utilizaiido Ácido Cq~Ílico

5. Ultrafiliraciori para elú~iitiar los restos de Acido

de nitrocelulosa de 0.22pii y enva-do

a 7. Fomrulación

. 8. Control de Calidad del Suero htiofidico

1

9. Presentación, almacenamiento o estabilidad del suero antiofidico ea las diferentes pmsentaciones.

I a C o teirrperamra d i e n t e .

1

l

*(~oiiiwiicacioii Perm~ial coti Dr. José María Gutiérrez y Dr. Guilienno L&ii. 2004)

Anexos 11

Los quinos pueden contener tanto vánis envueltos como no. Un resumen de los posi'bles virus se presenta aContinuaCión.

Cuadro 11: V i encontrada

No reportada 1 - Sí Sí

V. Encefalitis equina de Venezuela V. Estomatitis Vesicdar V. Oeste del Nilo

Encefáíosis equina 1 Re* V. Rinitis equina A y B l 3 c m m w i k

RotaWus equino 1 Re*

T m

1

( B u m e marry. 2004)

ds-RNA 1 No reportada SS-RNA 1 No reportada ds-RNA 1 No reportada

I

SS-RNA

- - -

Sí Si SS-RNA f Si SS-RNA 1 Si

Sí Sí

Anexos 111

VEstomatitisvesiaiiar 1 - 1 Sí 1 ARN Bqa 1 Virelevaate . .

1 1 1 v i r e l e v a o t e , ~ o d e l o V Oeste del Nilo 1 - 1 Sí ARN 1 Baja 1 de EEE

- . -

S i s 1 Tm& 1 Sí ARN Baja EFE,EEOyEEV V. diarrea v i d bovina

Reowus tipo 3 PoliovÜus Sabin - 1, HAV

No 1 ADN Muyaha

Anexos IV

- de Herpcs Simpkx-L

vinis Polio 1 HSV-1 Relativa estabilidad Pérdidas insignificantes de infí-a-700por- a -200 por largos períodos, a 4Oporsenianasya

ambiente por varios día!$. La infídvidad se destruye a >500 C. SonestablaapH3porl-3 horas de mcubación, a pH mfeñor se destruye la mfectMdad

Mantiene altos títulos en medios de cultivo a 25O O 37" C por 18 horas La termolabilidad se acelera a pH diferentes al neutro y se afecta por la composición del medio. Prolongado a -700 en medio de 4 v o del 2 - 1 O?? de Suen, Fetal Bovino. Pmsmación óptima de la infíéctividad al agregar soluciones can proteínas: Suero F d Bovino, clara de huevo, gelaíina o leche descremada

Colorantesvitalesse imoqmmalaestracturadel vñus y lo hacen susceptibla a la luz visible. La radiación ultravioleta y el desecadoráipidamemte iuactivan el virus.

Noseafectanporel clorofm, alcohol 7% Lysol5%, amani0 cuatenialio 1%- Susceptiilesaéter, deoxicolato y mucbos ~ e n t e s q n e m a c t i v a n virus envueltos

r Lo ñiactivan d f d d e h í d o 0.3% cloro y otros halógmos (0.3-0.5 ppm) Compuestos orgánicos pueden mterferir en la

El calor (56")o inacíiva rápidamente luego de 30 minutosOS Aunque el ADN a relativamente estable al calor. Se inactiva cuando es mcubada a 25Opor 10mmutosapH 3,5 o 11. La termolabilidad se afecta por el pH y la composición del medio. La luz ultravioleta lo inactiva parcialmente. Radiación gamma, rayos X y los microondas por 4 minatos lo inactivan La fotosensibilidad a la luz se aumenta por los colorantes. Potentes inactivadores serían de monoglicéridos msaturados, alcoholes msaturados, éter, c l o r o f o ~ . cloro domésbco ocupa 10 minutos a 2000 ppm para m a c t i v a r c ~ m p l ~ t e . -gentes catiónicos ck amonio CuaterMlio, quillilonas, báa propiolacmas y d a s proteolíticas.