VALIDACIÓN DE

MÉTODOS

ANALÍTICOS

¿Por qué validar?

2

¿Por qué validar?

La validación forma parte integral del sistema de

calidad.

Las BPM exigen que tanto los procesos como las

metodologías analíticas estén validadas.

Proporciona confianza y seguridad al método

analítico y calidad a los resultados.

Optimización del método.

Competitividad.

Y …

3

NTC 17025 REQUISITOS TÉCNICOS

5.4.2 Selección de los métodos.

.....Preferiblemente, se deben emplear

métodos publicados en normas

internacionales, regionales o nacionales. El

laboratorio debe garantizar que utiliza la

última edición válida de las normas, a

menos que sea apropiado o imposible de

hacerlo así.

4

5

NTC 17025 REQUISITOS TÉCNICOS

5.4.2 Selección de los métodos.

.... Los métodos desarrollados o

adoptados por el laboratorio también

pueden ser utilizados si resultan

adecuados para los fines propuestos

y si están validados. El cliente debe

ser informado sobre el método elegido

6

NTC 17025 REQUISITOS TÉCNICOS

5.4.3 métodos desarrollados por el

laboratorio.

La introducción de métodos de ensayo y

calibración desarrollados por el

laboratorio para su propio uso debe ser

una actividad planeada y se debe

asignar a personal calificado y equipado

con los recursos adecuados.

7

NTC 17025 ¿Qué es validar?

5.4.5 Validación de los Métodos.

5.4.5.1 Validación es la confirmación

por examen y suministro de evidencias

objetivas del cumplimiento de los

requisitos particulares para un uso

específico.

USP

Proceso por el cual se establece mediante

estudios de laboratorio que las características

de calidad del método analítico se adecuan a

los requerimientos y necesidades de la

aplicación analítica propuesta.

8

¿Qué es validar?

DEFINICIONES

TÉCNICA

Aplicación de un principio

científico del cual se ha

demostrado su utilidad para

proveer información analítica.

Ej.: AA , IR, CG, HPLC.

9

Taylor JK. Validation of analytical methods. 184th ACS National Meeting. Kansas. USA. 1982.

DEFINICIONES

MÉTODO

Adaptación de una técnica

para una medición específica

con un fin determinado.

10

Taylor JK. Validation of analytical methods. 184th ACS National Meeting. Kansas. USA. 1982.

DEFINICIONES

PROCEDIMIENTO

Conjunto de instrucciones detalladas

necesarias para llevar a la práctica un

método, presentadas en forma escrita.

11

Taylor JK. Validation of analytical methods. 184th ACS National Meeting. Kansas. USA. 1982.

FASES DE LA

VALIDACIÓN

12

FASE I : ESTANDARIZACIÓN

OPTIMIZACIÓN DE CONDICIONES Y

VARIABLES

FASE II : DETERMINACIÓN DE LAS

CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO DEL

MÉTODO

FASE III : EVALUACIÓN POR RESULTADO

VALIDACIÓN La documentación es parte esencial de la

validación

PROTOCOLO

DE VALIDACIÓN

REALIZACIÓN DE LA

VALIDACIÓN

EVALUACIÓN

RESULTADOS

ANALÍTICOS

INFORMES

TÉCNICOS CERTIFICADO

DE VALIDACIÓN

ESTANDARIZACIÓN

OPTIMIZACIÓN DE CONDICIONES

Y VARIABLES

PROTOCOLO DE

VALIDACIÓN

Conjunto de instrucciones que garantizan

resultados uniformes de un

procedimiento de validación, constituye la

planificación, ejecución, verificación y

control de la validación.

14

PROTOCOLO DE VALIDACIÓN

Generalidades

Objetivos

Alcance

Responsabilidad

Referencias

Factores críticos

Equipos, materiales y

reactivos

Preparación de Muestras

Método analítico

Parámetros a evaluar

Criterios de evaluación

15

VALIDACIÓN- Referencias

16

ICH USP

VALIDACION

17

Parámetro I II III IV

Cuan-

titativo

Ensayo

límite

Exactitud Si Si * * No

Precisión Si Si No Si No

Especificidad Si Si Si * Si

Límite de detección No No Si * No

Límite de

cuantificación

No Si No * No

Linealidad Si Si No * No

Rango Si Si * * No

* Puede ser requerido, dependiendo del ensayo

Especificidad vs Selectividad

Selectividad: la selectividad de un ensayo

es una medida del grado en que el método

puede determinar un compuesto particular en

las matrices analizadas sin interferencia de

los componentes de la matriz. Un método

que es perfectamente selectivo para un

analito o grupo de analitos es específico.

18

EURACHEM/WELEC Guidance. Document No. WGD2 (1993) Accreditation for chemical laboratories: Guidance on the

interpretation of the EN 45000 series of standards and ISO Guide 25. Laboratory of the Government Chemist, Teddington, UK

Especificidad vs Selectividad

Especificidad: capacidad del método para

evaluar inequívocamente el analito en

la presencia de otros componentes que

pueden estar presentes (por ejemplo, las

impurezas, productos de degradación y

componentes de la matriz).

19

International Conference on Harmonization, Validation of Analytical Methods: Definitions and terminology. European Agency for the

Evaluation of Medicinal Products, London, UK. 1995

SELECTIVIDAD

Metabolitos del analito.

Productos de degradación.

Matriz de la muestra. 20

Ricard Boqué. La selectividad en análisis

Químico. Grupo de Quimiometría y Cualimetría

Universidad Rovira i Virgili (Tarragona).

SELECTIVIDAD

¿Como se hace?

Analizar matriz sin activo.

Analizar por triplicado matriz adicionado

con los productos de degradación,

sustancias relacionadas y sustancias de

interés equivalente al 100%.

Analizar por triplicado muestras solas,

solo el analito de interés.

21

SELECTIVIDAD

¿Como se hace?

Someter al activo a condiciones de

degradación forzada.

Termólisis (105°C, 8 días)

Fotolisis (Luz natural o ultravioleta, 8 días)

Hidrólisis acida (HCl 0.1N, 24 horas)

Hidrólisis alcalina (NaOH 0.1N, 24 horas)

Oxidación (H2O2 4 %)

22

SELECTIVIDAD

Ensayos separativos

No se puede hacer identificación sólo con el tiempo de retención.

HPLC/DAD

HPLC/MS

HPLC/MS-MS

CG/MS

CG/FTIR

23

SELECTIVIDAD

Criterios de aceptación.

Al analizar el placebo no hay respuesta.

Resolución > 1.5

Factor de coleo < 2

Número de platos teóricos > 2000

Identidad del pico Pureza de pico.

Ausencia de coelución.

Recuperación del analito 98-102%

24

LINEALIDAD Y RANGO

Se refiere a la proporcionalidad entre la concentración del analito y su respuesta.

¿Como se hace? Solución patrón y Muestra problema 5 - 8 niveles de concentración, mínimo por

triplicado. Métodos bioanaliticos mínimo entre el 10 - 200 % de la concentración esperada.

Blanco de matriz (sin STD I)

Blanco de reactivos

STD 0: Blanco de matriz (con STD I)

25

LINEALIDAD Y RANGO

26

CONCENTRACION AREA

5 1.56

10 3.21

20 6.78

40 13.56

80 27.02

120 38.46

160 53.98

200 60.92

220 67.84

CONCENTRACION DE XXX

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 50 100 150 200 250

CONCENTRACIÓN

AR

EA

RECTA DE REGRESIÓN

Y = b X + a

LINEALIDAD Y RANGO

Criterios de aceptación

Coeficiente de correlación r y de determinación r2.

r: >= 0.999

r2: >= 0.990

Prueba para el intercepto (prueba t)

Prueba para la pendiente (prueba t)

Prueba para la regresión (Prueba F)

27

LIMITE DE DETECCIÓN

(LD)

Mínima cantidad de analito que puede ser detectada pero no necesariamente cuantificada, el límite de detección corresponde a tres veces la relación Señal – Ruido.

IMPORTANTE EN : análisis de trazas, contaminantes y productos de degradación.

28

LIMITE DE DETECCIÓN

(LD)

Evaluación visual: concentraciones crecientes hasta encontrar la respuesta inequívoca.

LD = Ruido * 2(3), se debe comprobar experimentalmente.

29

Limit of detection Limit of quantitation

Noise

Signal/Noise = 2 to 3 Signal/Noise = 10 to 20

LIMITE DE

CUANTIFICACIÓN (LC)

Mínima cantidad de analito que puede cuantificarse con precisión y exactitud adecuadas, el límite de cuantificación corresponde a diez veces la relación Señal – Ruido.

Se bebe comprobar experimentalmente con la preparación de tres muestras a una concentración que produzca la misma señal teórica. Analizada por duplicado, para calcular esta concentración se usara la ecuación de la curva de la prueba de la linealidad, tomando como valor “y” el valor teórico de la relación señal ruido (10 Np-p).

30

LIMITE DE

CUANTIFICACIÓN (LC)

MÉTODOS BIOANALÍTICOS

Menor valor de la curva de calibración con

exactitud y precisión en los valores límites

Número de réplicas: mayor 5

Si se calculó por varios métodos, se selecciona el

valor menor.

31

PRECISIÓN Y EXACTITUD

En (a), los disparos no son ni exactos ni precisos. En (b), son precisos pero

inexactos; el tirador dispara bien, pero es evidente una desviación

constante. En (c), los disparos son exactos pero imprecisos: la media de

los disparos estaría justo en el centro de la diana, pero cada uno de los

tiros se desvía significativamente. En (d), los disparos son exactos y

precisos.

ERRORES Y DISTRIBUCIÓN

NORMAL

Medición “Error” de medición

Valor de medición Incertidumbre de

medición

Resultado de

medición Valor de medición Incertidumbre de

medición

Error sistemático Error aleatorio

E.s. conocido E.s. desconocido

Corrección Error residual

*M. Roesslein, EMPA, Measurement Uncertainty in Analytical Chemistry, 2002

ERRORES EN LA MEDICIÓN

EXACTITUD

Grado de concordancia entre el valor que es

aceptado convencionalmente como valor verdadero

o un valor de referencia y el valor encontrado.

Indica que cerca se esta del valor verdadero

35

EXACTITUD

¿Como se hace?

Se recomienda un mínimo de 3 determinaciones por 3 niveles de concentración en todo el rango especificado. (80%-120%). Bioanálisis ([] alta, media y baja)

La exactitud se expresa como: Porcentaje de recuperación (%R)

%R = Xm/U*100 % ER (error relativo) = Xm-Ct/Ct*100

36

EXACTITUD

Criterios de aceptación

Materia Prima (pureza aproximada del 100%): 98.0 - 102.0%

Productos terminados: 97.0 - 103.0%

Contenidos de activo entre 0.1 – 1.0%: 95.0 – 105.0%

Métodos con procesos complejos de manipulación como extracciones y derivatización se pueden establecer recuperaciones entre 85.0 – 115.0%

Test De Cochran

Si G calculado < G tabulado se acepta Ho entonces las varianzas entre los niveles de concentración son equivalentes, es decir el factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados.

37

PRECISIÓN

Grado de concordancia (grado de dispersión)

entre una serie de medidas obtenidas de

múltiples muestras de una muestra homogénea

bajo condiciones prescritas.

Se presentan tres niveles de precisión

Repetibilidad

Precisión intermedia

Reproducibilidad

38

1

2

n

XXS

i

100% xX

SCV

REPETIBILIDAD

Expresa la precisión de la técnica analítica bajo las

mismas condiciones de operación en un intervalo

de tiempo corto.

Es llamada precisión intra-ensayo.

La repetibilidad esta dividida en dos niveles

Repetibilidad del sistema

Repetibilidad del método

39

PRECISIÓN

¿Como se hace?

Repetibilidad

Mínimo 6 muestras al 100% ó un mínimo de 3

muestras a tres niveles. (80%-120%)

Precisión intermedia

Se estudiara la variación de los factores día (2 o 3

días) y analista (2 analistas) al 100% de la

concentración.

40

PRECISIÓN Criterios de aceptación

Repetibilidad

Materia Prima: <= 2.0%

Productos terminados: <= 3.0%

Métodos de bioanalisis:15.0%

Precisión intermedia

Coeficiente de variación global: <= 2 CV de la

repetibilidad.

El resultado se presenta con intervalos de confianza para

cada nivel de concentración.

X t * s/√n

41

REPRODUCIBILIDAD

El objetivo, es verificar que el método de análisis

proporciona los mismos resultados en diferentes

laboratorios.

Es llamada precisión inter-laboratorios.

Se acepta una variación del

10% del valor promedio de los

resultados del laboratorio

primario.

42

ROBUSTEZ

Medida de la capacidad para permanecer

inalterado ante pequeñas pero deliberadas

variaciones en ciertos parámetros.

Proporciona idea de fiabilidad durante la

aplicación de rutina.

43

ROBUSTEZ

¿Como se hace?

La evaluación de la robustez se realiza mediante

diseños factoriales:

Diseño factorial completo y fraccionado

Diseño de Youden-Steiner

44

ROBUSTEZ

Criterio de aceptación

Cálculo del efecto:

|Vd-VD| = s+t+y+z - u+v+w+z

4 4

La influencia de un factor es relevante y se considera significativa, si al comparar el valor del efecto con la expresión s√2 donde s es la desviación estándar de la repetibilidad las diferencias son superiores en valor absoluto al resultado de esta expresión.

45

VALIDACIÓN DE

MÉTODOS

ANALÍTICOS

Cualitativos

ESPECIFICIDAD DE LOS

RESULTADOS

Capacidad de un método para detectar

como negativas aquellas muestras que

realmente no posean el elemento

analizado.

47

ESPECIFICIDAD DE LOS

RESULTADOS

48

Aplicar la tabla 2 x 2

E = d / b + d MUESTRAS

RESULTADOS

VP

FN VN

FP P

N

P N

a b

c d

SENSIBILIDAD DE LOS

RESULTADOS

Capacidad de un método para detectar como

positivas aquellas muestras que realmente

posean el elemento analizado.

49

SENSIBILIDAD DE LOS

RESULTADOS

50

• Aplicar la tabla 2 x 2

S = a / a + c MUESTRAS

RESULTADOS

VP P

N

P N

FN VN

FP a b

c d

VALORES PREDICTIVOS

POSITIVO

Es la probabilidad de que una muestra contenga el elemento de estudio cuando al aplicar la técnica analítica se obtiene un resultado positivo.

NEGATIVO

Es la probabilidad de que una muestra no contenga el elemento de estudio cuando al aplicar la técnica analítica se obtiene un resultado negativo.

VALOR PREDICTIVO

VPP = a / a + b MUESTRAS

VPN = d / d + c

RESULTADOS

VP P

N

P N

FN VN

FP a b

c d

PUNTO DE CORTE

Valor definido para un método determinado,

a partir del cual se considera positivo un

resultado, y por debajo del cual se considera

negativo.

Una prueba ideal debería ser 100 % sensible y

100 % específica, pero esto no es común.

La sensibilidad crece a expensas de la

especificidad y viceversa.

PUNTO DE CORTE

UMBRAL ( THRESHOLD)

Análisis de drogas de abuso en orina

Metabolitos de marihuana 100 ng / ml

Metabolitos de cocaína 300 ng / ml

Metabolitos de opiáceos 300 ng / ml

Atributos de calidad

métodos cualitativos

Itziar Ruisánchez, Esther Trullols y F. Xavier Rius. VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS CUALITATIVOS . Grupo de

Quimiometría y Cualimetría. Departamento de Química Analítica i Química Orgànica. Universitat Rovira i Virgili. Pl. Imperial

Tàrraco, 1, 43005 Tarragona.

CONCORDANCIA

Permite evaluar la concordancia de los

resultados entre métodos o analistas.

IC = (a + d) / t

IC = (87 + 13)/100 = 1.00

INDICE DE KAPPA

Ik = Concordancia observada – concordancia por azar

1 – concordancia Por azar

Concordancia observada = Índice de concordancia

(IC)

Concordancia por azar = [(w * y) + (x + z)]

t * t

INDICE DE KAPPA

Altman DG. Practical statistics for medical research. New York: Chapman and Hall; 1991.

López de Ullibarri Galparsoro I, Pita Fernández, S. Medidas de concordancia: el índice de Kappa. Unidad de Epidemiología

Clínica y Bioestadística. Complexo Hospitalario-Universitario Juan Canalejo. A Coruña (España). Cad Aten Primaria 1999; 6:

169-171.

VALIDACIÓN- Referencias

59

US FDA Guidance on method validation http://www.fda.gov/cder/guidance/2396dft.htm For US FDA data submissions

Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for Methods Validation Published by employees of the US FDA, February 1987, http://www.fda.gov/cder/guidance/ameth.htm

VALIDACIÓN- Referencias

60

Validation of chromatographic methods, Reviewer Guidance (FDA) http://www.fda.gov/cder/guidance/cmc3

Policies and Procedures Guide for the Official Methods Program (OMA)

http://www.aoac.org/vmeth/omamanual/omamanual.htm

VALIDACIÓN- Referencias

61

USP 34 NF 29. The United States Pharmacopeia – The

National Formulary. Capítulos generales <1010>,

Analytical data – interpretation and treatment y <1225>,

Validation of compendial procedures, United States of

America, 2011.

ICH Q2A: Validation of Analytical

Procedures: Methodology

http://www.fda.gov/cder/guidance/ichqa2.

ICH Publicaciones, Guías:

http://www.ich.org/UrlGrpServer.jser?@_ID=363&

@_TEMPLATE=272

VALIDACIÓN- Referencias

◦ Programas de Validación de Métodos

http://www.aoac.org/vmeth/page1.htm

62

http://www.ivthome.com/publications/index.htm

http://www.ivthome.com/free/index.htm

Aguirre L., Garcia J., Garcia T., Llera M., Juncadella M.

Lizondo M., et al., Validación de métodos analíticos.

Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria

A.E.F.I. 2001.

Miller N.J., Miller J.C., Estadística y quimiometría para

química analítica. Pearson educación S.A. Madrid 2002.