Upload
others
View
17
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
VALIDASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR
KURKUMIN DALAM EKSTRAK RIMPANG KUNYIT
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Yosua Agung Santoso
NIM : 168114018
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
i
VALIDASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR
KURKUMIN DALAM EKSTRAK RIMPANG KUNYIT
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Yosua Agung Santoso
NIM : 168114018
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
Persetujuan Pembimbing
VALIDASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR
KURKUMIN DALAM EKSTRAK RIMPANG KUNYIT
Skripsi yang diajukan oleh:
Yosua Agung Santoso
NIM : 168114018
Telah disetujui oleh:
Pembimbing Utama
Dr. Christine Patramurti, Apt. tanggal 25 November 2019
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
Pengesahan Skripsi Berjudul
VALIDASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR
KURKUMIN DALAM EKSTRAK RIMPANG KUNYIT
Oleh:
Yosua Agung Santoso
NIM : 168114018
Dipertahankan di hadapan Pantia Penguji Skripsi
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
pada tanggal: 17 Desember 2019
Mengetahui
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Dekan
Dr. Yustina Sri Hartini, Apt.
Panitia Penguji: Tanda tangan
1. Dr. Christine Patramurti, Apt. ….……................
2. Dr. Dewi Setyaningsih, Apt. ……………….....
3. Michael Raharja Gani, M.Farm., Apt. ………………….
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini
tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan
dalam kutipan dan daftar pustaka, dengan mengikuti ketentuan sebagaimana
layaknya karya ilmiah.
Apabila di kemudian hari ditemukan indikasi plagiatisme dalam naskah
saya, maka saya bersedia menanggung segala sanksi sesuai peraturan perundang-
undangan yang berlaku.
Yogyakarta, 25 November 2019
Penulis
Yosua Agung Santoso
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI
KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Saya yang bertanda tangan dibawah ini, mahasiswa Universitas Sanata Dharma:
Nama : Yosua Agung Santoso
Nomor Mahasiswa : 168114018
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan
Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:
VALIDASI METODE ANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR
KURKUMIN DALAM EKSTRAK RIMPANG KUNYIT
beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan
kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,
mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan
data, medistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau
media lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta izin dari saya
maupun memberikan royalty kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya
sebagai penulis.
Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta
Pada tanggal : 25 November 2019
Yang menyatakan
(Yosua Agung Santoso)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
ABSTRAK
Dalam proses memenuhi syarat standarisasi bahan baku produk bahan
alam menjadi produk obat herbal terstandar, diperlukan metode analisis yang
reliabel dan mampu memenuhi kebutuhan proses standarisasi bahan baku yang
akan dibuat produk obat herbal terstandar. Proses standarisasi bahan baku ekstrak
rimpang kunyit memerlukan metode analisis yang optimum dan valid guna
menetapkan kadar kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit. Kurkumin di dalam
ekstrak rimpang kunyit yang memiliki tiga bentuk senyawa yaitu kurkumin,
demetoksikurkumin dan bis-demetoksikurkumin, sehingga diperlukan metode
analisis dengan selektivitas dan sensitivitas yang cukup tinggi. Oleh karena itu,
metode analisis kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit yang reliabel perlu
ditetapkan.
Metode analisis kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit menggunakan
HPLC telah dioptimasi dalam penelitian sebelumnya. Pada penelitian ini,
dilakukan validasi metode analisis kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit
menggunakan HPLC fase terbalik dengan fase gerak asetonitril:metanol:air
(65:5:30 v/v), fase diam oktadesilsilan (C-18), serta laju alir 1,0 mL/menit.
Penelitian ini bertujuan untuk memvalidasi parameter selektivitas, linearitas,
rentang, akurasi, dan presisi.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode yang diuji memiliki
koefisien korelasi dan koefisien determinasi 0,999 (≥ 0,99) dan nilai resolusi
1,533 (≥ 1,5). Selain itu, akurasi intra-day dan inter-day adalah antara 97,03-
100,08% dan 96,11-99,88% (di dalam 85%-110%) dan presisi intra-day dan inter-
day adalah antara 0,10-1,65% dan 0,31-2,59% (≤ 4%). Metode yang diuji realibel
sehingga dapat digunakan untuk menetapkan kadar kurkumin dalam ekstrak
rimpang kunyit.
Kata Kunci: Ekstrak rimpang kunyit, HPLC, Kurkumin, Validasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
ABSTRACT
In the process of meeting the standardization requirements of product raw
materials to become standardized herbal medicine, a reliable analysis method is
needed for standardization process for the raw material that will be make into a
standardized herbal medicinal products. The process of standardization of
turmeric rhizome extract raw materials requires an optimal and valid analytical
method to determine curcumin levels in turmeric rhizome extract. Curcuminoid in
turmeric rhizome extract which has three forms of compounds namely curcumin,
demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin, so that analytical methods with
high selectivity and sensitivity are needed. Therefore, the method of curcumin
analysis in a reliable turmeric rhizome extract needs to be established.
Curcumin analysis method in turmeric extract using HPLC has been
optimized in previous studies. In this study, the method of analysis of curcumin in
turmeric rhizome extract was validated using reverse phase HPLC with the mobile
phase of acetonitrile:methanol:water (65:5:30 v/v), octadesilsilan (C-18)
stationary phase, and flow rate 1,0 mL / minute. This study aims to validate the
parameters of selectivity, linearity, range, accuracy, and precision.
The results showed that the method tested had a correlation coefficient and
determination coefficient of 0.999 (≥ 0.99) and a resolution value of 1.533 (≥ 1.5).
In addition, intra-day and inter-day accuracy is between 97.03-100.08% and
96.11-99.88% (within 85% -110%) and intra-day and inter-day precision is
between 0,10-1.65% and 0.31-2.59% (≤ 4%). The tested method is reliable so it
can be used to determine the level of curcumin in turmeric rhizome extract.
Keywords: Curcumin, HPLC, Turmeric Rhizome Extract, Validation
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
HALAMAN PERSEMBAHAN
Successful and unsuccessful people do not vary greatly in their abilities. They
vary in their desires to reach their potential.
-John Maxwell-
Sujud syukurku kusembahkan kepadaMu ya Allah, Tuhan Yang Maha Esa
Dengan in saya persembahkan karya ini untuk
Kedua orang tua saya yang telah memberikan kasih sayang
Setiap guru dan dosen, yang dengan sabar mendidik saya selama ini
Teman-teman yang selalu mendukung, merajut memori setiap harinya, tawa yang
setiap hari kita miliki, dan solidaritas yang luar biasa
Almamater Universitas Sanata Dharma yang telah menjadi tempat saya menimba
ilmu selama ini melalui pembelajaran kontekstual dan aplikatif.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
PRAKATA
Puji dan Syukur pada Tuhan Yang Maha Esa penulis panjatkan atas
berkat dan penyertaan-Nya dari awal penyusunan sampai tahap akhir penelitian
sehingga naskah skripsi berjudul Validasi Metode Analisis High Performance
Liquid Chromatography Fase Terbalik Pada Penetapan Kadar Kurkumin Dalam
Ekstrak Rimpang Kunyit dapat terselesaikan. Skripsi ini merupakan bagian dari
penelitian Dr. Dewi Setyaningsih, Apt. yang berjudul “Micropaticles to
Potentially Improve Bioavailability of Curcumin and Antidiabetic Activities in Pre
Clinical Studies: Combining Solid Dispersion Technology and Metabolism
Suppressors” berdasarkan SK nomor 035b/LPPM USD/IV/2019.
Dalam proses penyelesaian naskah skripsi, penulis menerima banyak
dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin
mengucapkan banyak terima kasih kepada:
1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma
2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt., selaku Ketua Program Studi Farmasi
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dan dosen pembimbing yang
telah berperan seperti orang tua dan senantiasa memberikan masukan, arahan,
serta pendampingan dengan sabar selama proses penyusunan skripsi.
3. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, Apt., selaku Dosen Pembimbing Akademik dan
dosen penguji yang selalu memberikan masukan, pendampingan, dan kritik
yang membangun.
4. Bapak Michael Raharja Gani, M.Farm., Apt., selaku dosen penguji yang
senantiasa memberikan kritik, masukan, dan saran yang membangun.
5. Mas Bimo (Laboran Laboratorium Kimia Instrumen Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma), Bapak Bimo (Laboran Laboratorium Analisis
Pusat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma), dan Bapak Kayat
(Laboran Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma) yang telah membantu dan memfasilitasi kegiatan penelitian di
laboratorium.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
6. Rekan penelitian Maria Philomia Christanti Raga, Sinta Susanti, dan Christin
Nesia Sukma Wijayanti atas dukungan, solidaritas, suka-duka, dan kerja sama
selama proses penelitian.
7. Pihak lain yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.
Selama proses penyusunan skripsi penulis menyadari bahwa masih
terdapat banyak kekurangan dalam naskah ini. Oleh karena itu, penulis sangat
terbuka terhadap segala masukan, saran dan kritik yang membangun agar naskah
skripsi ini dapat menjadi lebih baik dan bermanfaat. Akhir kata, semoga naskah
skripsi ini dapat bermanfaat dan berguna bagi pembaca.
Yogyakarta, 25 November 2019
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL……………………………………………..…..
i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING…………………...…
HALAMAN PENGESAHAN………………………………………..
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA……………………………...
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI…………………….
ABSTRAK…………………………………………………………...
ABSTRACT…………………………………………………………...
HALAMAN PERSEMBAHAN……………………………………...
PRAKATA…………………………………………………………...
ii
iii
iv
v
vi
vii
vii
ix
DAFTAR ISI………………………………………………………… xi
DAFTAR TABEL.....………………………………………………... xii
DAFTAR GAMBAR………………………………………………… xiii
DAFTAR LAMPIRAN…………………………………………….... xiv
PENDAHULUAN…………………………………………………… 1
METODE PENELITIAN…………….……………..…….................. 4
HASIL DAN PEMBAHASAN……..…...…………...……………… 9
KESIMPULAN………..….…………...……………………….……. 16
SARAN………………….....…..………………………...................... 16
DAFTAR PUSTAKA………………...…...…………………………. 17
LAMPIRAN…………….…..…………...…………….……………..
BIOGRAFI PENULIS………………………………………………..
19
39
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I. Data waktu retensi, resolusi dan tailing factor senyawa
kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit ……….............
10
Tabel II. Data perolehan AUC dari 3 replikasi 7 seri konsentrasi
baku kurkumin ………………...…..………………........
11
Tabel III. Data rentang………………………………...…………...
Tabel IV. Data intra-day akurasi dan presisi kurkumin …………...
Tabel V. Data inter-day akurasi dan presisi kurkumin …………...
13
15
15
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Kromatogram larutan baku kurkumin konsentrasi 0,5
µg/mL …………………………………………………
Gambar 2. Kromatogram ekstrak rimpang kunyit konsentrasi 0,5
µg/mL …………………………………………………
Gambar 3. Stacking kromatogram kurva baku kurkumin replikasi
ketiga……......................................................................
Gambar 4. Kurva baku kurkumin replikasi ketiga ………..……....
Gambar 5. Stacking kromatogram adisi baku kurkumin…………..
9
10
12
12
14
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Kromatogram rentang dan kurva baku kurkumin…….
Lampiran 2. Kromatogram perolehan kembali……………………..
Lampiran 3. Kromatogram ekstrak rimpang kunyit konsentrasi 0,5
µg/mL………………………………………………....
Lampiran 4. Data AUC perolehan kembali dan presisi…………….
19
32
36
37
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
PENDAHULUAN
Sampai saat ini telah banyak pemanfaatan tanaman obat tradisional oleh
masyarakat Indonesia untuk menanggulangi beberapa penyakit. Manfaat
penggunaan obat tradisional tersebut secara luas telah dirasakan oleh masyarakat.
Hal ini juga tercermin dengan semakin meningkatnya penggunaan obat
tradisional, sehingga memberi dampak meningkatnya produksi obat dari industri
obat tradisional. Penggunaan senyawa bahan alam tersebut giat dilakukan sebagai
alternatif pengobatan di samping obat sintesis (Pulido et al., 2016).
Badan Pengawasan Obat dan Makanan (BPOM) mendorong
perkembangan obat herbal sampai tingkat obat herbal terstandar bahkan sampai ke
tingkat fitofarmaka yang bertujuan untuk menjamin keamanan obat herbal yang
akan digunakan oleh masyarakat. Obat herbal terstandar adalah sediaan obat
bahan alam yang telah dibuktikan keamanan dan khasiatnya secara ilmiah dengan
uji praklinik dan bahan bakunya telah di standarisasi (BPOM, 2014). Proses
pengembangan produk bahan alam menjadi produk obat herbal terstandar
memerlukan proses standarisasi bahan baku yang dilanjutkan dengan proses uji
praklinik pada hewan untuk membuktikan keamanan dan khasiatnya secara ilmiah
(BPOM, 2014). Dalam proses memenuhi syarat standarisasi bahan baku ekstrak
rimpang kunyit menjadi produk obat herbal terstandar, diperlukan metode analisis
yang reliabel dan mampu memenuhi kebutuhan proses standarisasi bahan baku
yang akan dibuat produk obat herbal terstandar.
Proses standarisasi bahan baku ekstrak rimpang kunyit memerlukan
metode analisis yang optimum dan valid guna menetapkan kadar kurkumin dalam
ekstrak rimpang kunyit. Kurkuminoid di dalam ekstrak rimpang kunyit memiliki
tiga bentuk senyawa yaitu kurkumin, demetoksikurkumin dan bis-
demetoksikurkumin, sehingga diperlukan metode analisis dengan selektivitas dan
sensitivitas yang cukup tinggi. Metode analisis diharapkan selektif sehingga
mampu memisahkan senyawa kurkumin yang ada di dalam ekstrak rimpang
kunyit dari bentuk turunan lainnya yaitu demetoksikurkumin dan bis-
demetoksikurkumin dengan baik. Metode analisis diharapkan mampu mengukur
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
kadar kurkumin dengan sensitivitas yang baik sehingga dapat lebih baik dalam
penetapan kadar kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit.
Dalam berbagai penelitian yang pernah ada sebelumnya menunjukkan
bahwa kadar kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit dapat ditetapkan dengan
metode Spektrofotometri UV-Vis, KLT-Densitometer dan HPLC fase terbalik.
Beberapa metode spektrofotometri UV-Vis telah dikembangkan untuk analisis
kadar kurkumin (Setyaningsih et al., 2016; Jankun et al., 2016). Pada penelitian
menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis didapat hasil berupa kadar
kurkuminoid total karena metode tersebut tidak mampu memisahkan kurkumin
dari bentuk turunan lainnya yaitu demetoksikurkumin dan bis-
demetoksikurkumin. Metode spektrofotometri UV-Vis kurang selektif dibanding
dengan metode kromatografi lapis tipis dan kromatografi cair yang mampu
memisahkan kurkumin dari bentuk turunan lainnya.
Beberapa metode kromatografi lapis tipis telah dikembangkan untuk
menyediakan kebutuhan metode yang lebih selektif dibanding metode
spektrofotometri UV-Vis yang dapat diandalkan untuk penentuan kadar kurkumin
dalam ekstrak rimpang kunyit (Phattanawasin et al., 2009; Gantait et al., 2011;
Setyaningsih et al., 2016). Metode kromatografi lapis tipis terbukti mampu
memisahkan kurkumin dari bentuk turunan lainnya yaitu demetoksikurkumin dan
bis-demetoksikurkumin. Pada penelitian menggunakan metode kromatografi lapis
tipis mampu memberikan pemisahan sempurna puncak kurkumin dari puncak
senyawa derivat kurkumin dengan Rf 0,50 dan Rs 2,62. Linearitas metode
ditunjukkan oleh nilai r sebesar 0,996. Metode KLT ini memberikan presisi dan
akurasi sesuai dengan regulasi yaitu RSD ≤ 3,50 dan perolehan kembali 94-105%.
Metode kromatografi lapis tipis memiliki sensitifitas yang cukup tinggi, mampu
mengukur kadar terendah kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit hingga 1,3
μg/mL. Metode kromatografi lapis tipis kurang sensitif dibanding dengan metode
kromatografi cair yang mampu mengukur kadar sampel hingga satuan ng/mL
(ppb).
Beberapa metode Reverse Phase High Performance Liquid
Chromatography (RP-HPLC) telah dikembangkan untuk menyediakan kebutuhan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
metode yang selektif dan sensitif yang dapat diandalkan untuk penentuan
kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit (Wichitnithad et al., 2009; Ali et al.,
2014; Monton et al., 2016; Setyaningsih et al., 2016; Fonseca et al., 2017;
Khismatrao et al., 2018). Pada penelitian menggunakan metode RP-HPLC mampu
memberikan pemisahan sempurna puncak kurkumin dari puncak senyawa derivat
kurkumin dengan Tf 0,9-1,2 dan Rs 1,5-2,0. Linearitas metode ditunjukkan oleh
nilai r sebesar 0,99. Metode RP-HPLC mampu memberikan presisi dan akurasi
sesuai dengan regulasi yaitu RSD ≤ 4% dan perolehan kembali 92,47-105,70%.
Metode RP-HPLC juga memiliki sensitifitas yang tinggi, mampu mengukur kadar
terendah kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit hingga 6 ng/mL. Penelitian
mengenai deteksi kadar kurkumin dilakukan oleh Ali, Haque, dan Saleem dengan
menggunakan fase diam C-18 dan komposisi fase gerak asetonitril:metanol:air
dengan perbandingan 40:20:40 v/v (Ali, et al., 2014). Pada penelitian kali ini,
penulis mengacu pada penelitian Ali, Haque, dan Saleem dengan menggunakan
modifikasi sistem fase gerak yang sudah dioptimasi pada penelitian sebelumnya.
Penelitian ini merupakan bagian dari rangkaian penelitian penetapan
kadar kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit dengan menggunakan metode
HPLC fase terbalik yang terdiri dari tahap optimasi dan validasi. Penulis akan
melakukan validasi terhadap metode tersebut. Proses validasi metode analisis
dilakukan untuk memastikan bahwa parameter kinerja metode analisis mampu
mengatasi masalah analisis dan menunjukkan bahwa metode analisis yang
digunakan layak digunakan untuk analisis senyawa kurkumin (ICH, 2005).
Validasi metode dilakukan ketika metode baru diterapkan untuk mengatasi
permasalahan analisis tertentu, ketika metode yang sudah baku direvisi, ketika
metode baku diterapkan di laboratorium yang berbeda, mendemonstrasikan
kesetaraan dua metode, serta apabila adanya perubahan instrumen dan analit
(Gandjar dan Rohman, 2007). Beberapa parameter validasi yang digunakan
meliputi selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi (USP, 2017).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
METODE PENELITIAN
Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini memiliki kualitas pro
analysis, meliputi ekstrak rimpang kunyit dengan kandungan kurkuminoid 95%
(PT. Phytocemindo Reksa), baku kurkumin tingkat kemurnian 98% (Nacalai Inc.),
metanol grade for liquid chromatography (E. Merck), asetonitril grade for liquid
chromatography (E. Merck), dan aquabidestilata. Bahan lainnya diperoleh dari
Laboratorium Kimia Analisis Instrumen Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penilitian ini meliputi seperangkat HPLC
merk Shimadzu dengan detektor UV (LC-2010C HT Shimadzu), kolom C-18
(Knaurer) dengan dimensi 250 x 4,6 mm dan ukuran pori 5 µm; seperangkat
komputer (Dell B6RDZIS Connexant system RD01-D850 A03-0382 JP France
S.A.S); printer (HP Deskjet 1000 J110a); ultrasonikator (RETSCH); neraca
analitis ultramicro (RADWAG®) seri UYA 2.3Y dengan kapasitas timbang
maksimal 2,1 g, minimal 0,01 mg, dan d = 0,1 µg; neraca analitis (Scaltec) dengan
kapasitas timbang maksimal 60/210 g, minimal 0,001 g, d = 0,01 mg, dan e = 1
mg; jarum suntik (Terumo); syringe filter 0,45 µm (Ministar®); pompa vakum;
whatman membrane filter dengan ukuran pori sebesar 0,45 µm dan diameter
sebesar 47 mm; corong buchner; mikropipet (Socorex); dan peralatan-peralatan
yang biasa digunakan di dalam laboratorium analisis farmasi.
Tata Cara Penelitian
Pembuatan fase gerak
Fase gerak terbuat dari asetonitril, metanol dan air dengan perbandingan
65:5:30 v/v. Setiap komponen disaring dengan menggunakan kertas saring
whatman pada corong buchner, dibantu dengan pompa vakum, kemudian
diawaudarakan selama 15 menit dengan ultrasonikator. Pencampuran komponen
fase gerak dilakukan di dalam instrumen HPLC.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
Pembuatan Larutan Baku Kurkumin
Pembuatan larutan stok kurkumin 1000 µg/mL
Sebanyak kurang lebih 1,0 mg baku kurkumin yang ditimbang seksama
dilarutkan dalam mikrotube dengan metanol sampai tanda batas 1 ml sehingga
diperoleh larutan stok kurkumin 1000 µg/mL.
Pembuatan larutan intermediet baku kurkumin 100 µg/mL
Sebanyak 100 µL larutan stok baku kurkumin 1000 µg/mL diambil
kemudian dilarutkan dengan menggunakan metanol sampai tanda batas 1 ml
sehingga diperoleh larutan intermediet baku kurkumin 100 µg/mL.
Pembuatan larutan intermediet baku kurkumin 10 µg/mL
Sebanyak 100 µL larutan intermediet baku kurkumin 100 µg/mL diambil
kemudian dilarutkan dengan menggunakan metanol sampai tanda batas 1 ml
sehingga diperoleh larutan intermediet baku kurkumin 10 µg/mL.
Pembuatan seri larutan baku kurkumin
Pembuatan seri larutan baku kurkumin (konsentrasi 40; 35; 30; 25; 20; 15;
dan 10 µg/mL)
Sebanyak 400 µL; 350 µL; 300 µL; 250 µL; 200 µL; 150 µL; 100 µL
larutan intermediet baku kurkumin 100 µg/mL masing-masing dimasukkan dalam
mikrotube, kemudian diencerkan dengan metanol sampai tanda batas 1 ml
sehingga diperoleh seri larutan baku kurkumin dengan konsentrasi 40 µg/mL; 35
µg/mL; 30 µg/mL; 25 µg/mL; 20 µg/mL; 15 µg/mL; dan 10 µg/mL.
Pembuatan seri larutan baku kurkumin (konsentrasi 5,0; 2,5; 1,0; 0,5; 0,1;
dan 0,05 µg/mL)
Sebanyak 500 µL; 250 µL; 100 µL; 50 µL; 10 µL; 5 µL larutan
intermediet baku kurkumin 10 µg/mL masing-masing dimasukkan dalam
mikrotube, kemudian diencerkan dengan metanol sampai tanda batas 1 ml
sehingga diperoleh seri larutan baku kurkumin dengan konsentrasi 5,0 µg/mL; 2,5
µg/mL; 1,0 µg/mL; 0,5 µg/mL; 0,1 µg/mL; dan 0,05 µg/mL.
Preparasi larutan ekstrak rimpang kunyit
Ditimbang kurang lebih 10 mg ekstrak rimpang kunyit dengan seksama,
kemudian dilarutkan dalam labu takar 10,0 mL dengan metanol hingga tanda
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
batas sehingga diperoleh larutan ekstrak rimpang kunyit dengan konsentrasi 1000
µg/mL (larutan A). Sebanyak 1,0 mL larutan A diambil kemudian dilarutkan
dengan menggunakan metanol dalam labu takar 10,0 mL sampai tanda batas
sehingga diperoleh larutan ekstrak rimpang kunyit dengan konsentrasi 100 µg/mL
(larutan B). Sebanyak 100 µL larutan B diambil kemudian dilarutkan dengan
menggunakan metanol pada mikrotube sampai tanda batas 1 ml sehingga
diperoleh larutan ekstrak rimpang kunyit dengan konsentrasi 10 µg/mL (larutan
C). Sebanyak 50 µL larutan C diambil kemudian dilarutkan dengan menggunakan
metanol pada mikrotube sampai tanda batas 1 ml sehingga diperoleh larutan
ekstrak rimpang kunyit dengan konsentrasi 0,5 µg/mL (larutan D).
Validasi Metode Analisis
Selektivitas
Larutan baku kurkumin konsentrasi 0,5 µg/mL diinjeksikan ke dalam
HPLC fase terbalik dengan fase gerak asetonitril:metanol:air (65:5:30 v/v) serta
fase diam oktadesilsilan (C-18) dan laju fase gerak 1,0 mL/menit, kemudian
larutan ekstrak kurkumin dengan konsentrasi 0,5 µg/mL diinjeksikan ke dalam
HPLC fase terbalik dengan fase gerak asetonitril:metanol:air (65:5:30 v/v) serta
fase diam oktadesilsilan (C-18) dan laju fase gerak 1,0 mL/menit. Replikasi
dilakukan sebanyak 3 kali, sehingga diperoleh waktu retensi senyawa kurkumin
dan nilai daya resolusi.
Kurva Baku Kurkumin
Larutan seri baku kurkumin dengan konsentrasi 25 µg/mL; 20 µg/mL; 15
µg/mL; 10 µg/mL; 5,0 µg/mL; 2,5 µg/mL; 1,0 µg/mL yang telah dibuat disaring
dengan syringe filter lalu diawaudarakan selama 5 menit. Setiap larutan
diinjeksikan ke dalam HPLC fase terbalik dengan fase gerak
asetonitril:metanol:air (65:5:30 v/v) serta fase diam oktadesilsilan (C-18) dan laju
fase gerak 1,0 mL/menit. Luas area kurkumin akan ditunjukkan oleh
kromatogram. Kurva baku diperoleh dengan memplotkan luas area kurkumin
dengan kadar baku kurkumin.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
Linearitas dan Rentang
Larutan seri baku kurkumin dengan konsentrasi 40 µg/mL; 35 µg/mL; 30
µg/mL; 25 µg/mL; 20 µg/mL; 15 µg/mL; 10 µg/mL; 5,0 µg/mL; 2,5 µg/mL; 1,0
µg/mL; 0,5 µg/mL; 0,1 µg/mL; dan 0,05 µg/mL yang telah dibuat disaring dengan
syringe filter lalu diawaudarakan selama 5 menit. Setiap larutan diinjeksikan ke
dalam HPLC fase terbalik dengan fase gerak asetonitril:metanol:air (65:5:30 v/v)
serta fase diam oktadesilsilan (C-18) dan laju fase gerak 1,0 mL/menit.
Pembacaan seri baku kurkumin dilakukan sebanyak 3 kali replikasi.
Akurasi dan Presisi
Intra-day dan inter-day presisi dan akurasi dilakukan dengan
menggunakan sampel ekstrak rimpang kunyit kosentrasi 0,5 µg/mL yang
ditambahkan tiga tingkatan konsentrasi baku kurkumin yang berbeda, dilakukan
replikasi 3 kali untuk masing-masing konsentrasi dan mengulangi penelitian
selama tiga hari berturut-turut pada. Baku kurkumin yang ditambahkan memiliki
tingkat konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi yaitu 1 µg/mL, 10 µg/mL, 20
µg/mL secara berurutan. Sebanyak 50 µL larutan ekstrak rimpang kunyit dengan
konsentrasi 10 µg/mL diambil kemudian ditambahkan 100 µL larutan intermediet
baku kurkumin 10 µg/mL, dilarutkan dengan menggunakan metanol pada
mikrotube sampai tanda batas 1 ml (Larutan Adisi 1). Sebanyak 50 µL larutan
ekstrak rimpang kunyit dengan konsentrasi 10 µg/mL diambil kemudian
ditambahkan 100 µL larutan intermediet baku kurkumin 100 µg/mL, dilarutkan
dengan menggunakan metanol pada mikrotube sampai tanda batas 1 ml (Larutan
Adisi 2). Sebanyak 50 µL larutan ekstrak rimpang kunyit dengan konsentrasi 10
µg/mL diambil kemudian ditambahkan 200 µL larutan intermediet baku kurkumin
100 µg/mL, dilarutkan dengan menggunakan metanol pada mikrotube sampai
tanda batas 1 ml (Larutan Adisi 3). Setiap larutan disaring dengan syringe filter
dan diawaudarakan selama 5 menit, kemudian diinjeksikan ke dalam HPLC fase
terbalik dengan fase gerak asetonitril:metanol:air (65:5:30 v/v) serta fase diam
oktadesilsilan (C-18) dan laju fase gerak 1,0 mL/menit. Semua percobaan
dilakukan dalam 3 replikasi untuk setiap tingkatan konsentrasi, kemudian nilai
recovery dan koefisien variasi dapat dihitung.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
Analisis Hasil
Selektivitas
Parameter ini ditentukan dengan nilai resolusi puncak dari senyawa
kurkumin yang didapat. Perbandingan waktu retensi yang sama antara baku
kurkumin dan senyawa kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit membuktikan
bahwa puncak tersebut adalah benar merupakan puncak dari senyawa kurkumin.
Metode analisis yang diuji dikatakan selektif apabila memiliki nilai resolusi ≥ 1,5
(AOAC, 2019).
Linearitas dan Rentang
Nilai koefisien korelasi (r) merupakan nilai yang menentukan linearitas
suatu metode. Koefisien korelasi diperoleh dari plot perbandingan AUC baku
kurkumin terhadap konsentrasi baku kurkumin. Metode analisis dikatakan linear
apabila memiliki nilai koefisien korelasi lebih besar dari 0,99 (AOAC, 2019).
Rentang diperoleh dengan melakukan penambahan 3 konsentrasi di atas titik
tertinggi kurva baku dan 3 konsentrasi dibawah titik terendah kurva baku. Nilai
koefisien determinasi (R2) didapat dari pengkuadratan koefisien korelasi rentang
baku kurkumin dengan konsentrasi 0,05 µg/mL-40 µg/mL. Rentang yang baik
memiliki nilai koefisien determinasi lebih besar dari 0,99 menunjukkan metode
analisis mampu memastikan kadar kurkumin dalam analit tidak mengalami
ekstrapolasi (AOAC, 2019).
Akurasi dan Presisi
Akurasi suatu metode ditunjukkan dengan nilai perolehan kembali. Nilai
tersebut dapat diperoleh dengan membandingkan konsentrasi sampel yang
didapat dengan konsentrasi analit sebenarnya melalui rumus perolehan kembali.
Syarat nilai perolehan kembali yang dapat diterima sesuai dengan konsentrasi
baku kurkumin yang ditambahkan adalah 85-110% (AOAC, 2019). Presisi suatu
metode ditunjukkan dengan nilai koefisien variasi. Syarat nilai koefisien variasi
yang dapat diterima sesuai dengan konsentrasi baku kurkumin yang ditambahkan
adalah ≤ 4% (AOAC, 2019).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
HASIL DAN PEMBAHASAN
Validasi metode analisis kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit
dilakukan dengan menggunakan kolom C18; perbandingan fase gerak
asetonitril:metanol:air sebesar 65:5:30; laju alir 1,0 mL/menit; pembacaan pada
panjang gelombang 420 nm; volume injeksi 20 µL; dan waktu pembacaan selama
7 menit. Seluruh prosedur tersebut telah dioptimasi dalam penelitian sebelumnya
dengan nilai tailing factor sebesar 1,180; resolusi pada konsentrasi 45 µg/mL
sebesar 1,739; dan waktu retensi sebesar 5,289. Parameter yang divalidasi dalam
penelitian ini meliputi selektivitas, linearitas, rentang, akurasi, dan presisi.
Penentuan Selektivitas
Selektivitas adalah parameter yang menunjukkan kemampuan metode
analisis dalam membedakan dan menghitung analit dari senyawa lain dalam
sampel. Selektivitas merupakan informasi yang menunjukkan bahwa substansi
yang diukur adalah substansi yang dikehendaki untuk dianalisis (FDA, 2018).
Gambar 1. Kromatogram larutan baku kurkumin konsentrasi 0,5 µg/mL; “A” merupakan
puncak senyawa kurkumin.
Pada Gambar 1 di atas, tampak bahwa setelah menit ketiga, tidak ada puncak dan
tidak ada gangguan yang ditemukan sehingga tidak akan menganggu hasil analisis
puncak senyawa kurkumin. Pada Gambar 1 dan Gambar 2, tampak bahwa
perbandingan waktu retensi yang sama antara baku kurkumin dan senyawa
kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit yang sama yaitu pada 5,3 menit
membuktikan bahwa puncak tersebut adalah benar merupakan puncak dari
senyawa kurkumin.
A
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
Gambar 2. Kromatogram ekstrak rimpang kunyit konsentrasi 0,5 µg/mL; “A”, “B”, dan “C”
merupakan puncak kurkumin, demetoksikurkumin, dan bis-demetoksikurkumin secara berurutan.
Selektivitas metode dapat dilihat dari nilai resolusi peak senyawa yang
hendak dianalisis. Daya resolusi bernilai paling tidak 1,5 di antara dua puncak
akan mengkonfirmasi bahwa senyawa dalam sampel sepenuhnya terpisah
sehingga jumlah masing-masing senyawa dapat diukur secara akurat (AOAC,
2019). Keterpisahan senyawa kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit konsentrasi
0,5 µg/mL dengan peak yang berada disebelahnya dapat dilihat pada
kromatogram Gambar 2. Data resolusi senyawa kurkumin dalam ekstrak rimpang
kunyit konsentrasi 0,5 µg/mL disajikan dalam Tabel I. Daya resolusi rata-rata
senyawa kurkumin dalam ekstrak kurkumin konsentrasi 0,5 µg/mL bernilai
sebesar 1,533. Metode memiliki nilai resolusi lebih dari 1,5 sehingga metode yang
diuji memenuhi parameter selektivitas.
Tabel I. Data waktu retensi, resolusi dan tailing factor senyawa kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit
Konsentrasi
(µg/mL)
Rata-rata
Waktu
Retensi
RSD
(%)
Rata-rata
Resolusi
RSD
(%)
Rata-rata
Tailing
factor
RSD
(%)
0,5 µg/mL 5,326 ± 0,01 0,21 1,533 ± 0,01 0,57 1,289 ± 0,01 0,85
15 µg/mL 5,345 ± 0,02 0,42 1,801 ± 0,01 0,82 1,256 ± 0,01 1,00
30 µg/mL 5,333 ± 0,01 0,25 1,778 ± 0,03 1,61 1,255 ± 0,01 0,76
45 µg/mL 5,304 ± 0,02 0,28 1,696 ± 0,04 2,45 1,208 ± 0,01 1,07
A
B
C
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
Penentuan Kurva Baku
Kurva baku diperoleh dari hubungan respon instrumen yang berupa nilai
Area Under Curve (AUC) terhadap konsentrasi baku kurkumin. Seri konsentrasi
baku yang terdapat dalam kurva baku harus mampu menjangkau kadar sampel
analit. Pembuatan kurva baku pada penelitian ini menggunakan seri konsentrasi
baku kurkumin 1 µg/mL; 2,5 µg/mL; 5 µg/mL; 10 µg/mL; 15 µg/mL; 20 µg/mL;
dan 25 µg/mL.
Tabel II. Data perolehan AUC dari 3 replikasi 7 seri konsentrasi baku kurkumin
Konsentrasi
(µg/mL)
AUC
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
1 196744 208490 208132
2,5 513113 481414 517977
5 981099 954252 1036290
10 1980578 2095571 2018970
15 2903036 3009783 2988214
20 4037150 4041326 4270044
25 4765075 4714627 5259697
a 25754,061 45726,009 -35472,449
b 193586,198 193444,343 210797,849
Koefisien korelasi 0,9991 0,9990 0,9992
Dari data tiga replikasi seri konsentrasi baku kurkumin yang disajikan
pada Tabel II, seri konsentrasi kurva baku yang digunakan adalah seri kurva baku
dengan nilai koefisien korelasi paling mendekati 1,0, yaitu seri konsentrasi kurva
baku replikasi ketiga dengan nilai a sebesar -35472,449; nilai b sebesar
210797,849; dan koefisien korelasi 0,9992. Kurva baku dapat dikatakan linear
ketika memiliki nilai koefisien korelasi lebih besar dari 0,99 (AOAC, 2019).
Kurva baku yang digunakan memiliki nilai koefisien korelasi lebih dari 0,99 yaitu
sebesar 0,9992 sehingga kurva baku bersifat linear.
Persamaan kurva baku diperoleh dari plot perbandingan AUC baku
kurkumin terhadap konsentrasi baku kurkumin. Hubungan antara konsentrasi
baku kurkumin dengan nilai AUC kurkumin dapat dilihat pada Gambar 2.
Semakin tinggi konsentrasi baku kurkumin, maka respon instrumen berupa nilai
AUC akan meningkat. Hubungan tersebut dapat dilihat secara visual pada Gambar
3 dan Gambar 4. Persamaan berupa y=bx+a didapat dari kurva baku (b adalah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
slope; a adalah intercept; y adalah AUC; dan x adalah kadar kurkumin).
Persamaan yang didapatkan dari seri konsentrasi baku kurkumin replikasi ketiga
adalah y = 210797,849 x – 35472,450. Kadar kurkumin (x) didapat dengan
memasukkan nilai AUC ke dalam y pada persamaan.
Gambar 3. Stacking kromatogram kurva baku kurkumin replikasi ketiga
Gambar 4. Kurva baku kurkumin replikasi ketiga
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 min
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
uV
y = 210797,849x - 35472,450
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
0 5 10 15 20 25 30
AU
C
Konsentrasi (µg/mL)
Kurva Baku Kurkumin
25 µg/mL
20 µg/mL
15 µg/mL
10 µg/mL
5 µg/mL
2,5 µg/mL
1 µg/mL
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
Linearitas dan Rentang
Rentang kurva baku diperoleh dengan menambahkan tiga seri konsentrasi
di atas titik tertinggi kurva baku dan tiga konsentrasi di bawah titik terendah dari
seri konsentrasi baku yang telah ditetapkan. Tujuan dari dibuatnya rentang kurva
baku adalah untuk memastikan respon instrumen terhadap analit yang berada di
luar kurva tetap berada dalam rentang yang ditetapkan dan kadar kurkumin dalam
analit tidak mengalami ekstrapolasi. Pada penelitian ini, seri konsentrasi baku 0,05
µg/mL; 0,1 ng/mL; 0,5 µg/mL; 1 µg/mL; 2,5 µg/mL; 5 µg/mL; 10 µg/mL; 15
µg/mL; 20 µg/mL; 25 µg/mL; 30 µg/mL; 35 µg/mL; dan 40 µg/mL digunakan
sebagai rentang. Data ketiga replikasi rentang dapat dilihat pada Tabel III.
Tabel III. Data rentang
Konsentrasi
(µg/mL)
AUC
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
0,05 10751 9783 11199
0,1 17310 19974 18748
0,5 107333 107388 112155
1 196744 208490 208132
2,5 513113 481414 517977
5 981099 954252 1036290
10 1980578 2095571 2018970
15 2903036 3009783 2988214
20 4037150 4041326 4270044
25 4765075 4714627 5259697
30 6113689 6046586 6077211
35 6910579 6979475 6956811
40 7959603 7984655 7977384
Koefisien
korelasi
(r)
0,9996
0,9995
0,9994
Koefisien
determinasi
(R2)
0.9992
0,9990
0,9988
Dari data tiga replikasi rentang yang disajikan pada Tabel III, digunakan
rentang replikasi pertama dengan nilai koefisien korelasi paling mendekati 1,0.
Dari data rentang replikasi pertama diperoleh nilai koefisien korelasi (r) sebesar
0,9996 dan koefisien determinasi (R2) sebesar 0,9992. Data hasil penelitian
menunjukkan metode memiliki koefisien korelasi ≥ 0,99 (0,9996) dan koefisien
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
determinasi ≥ 0,99 yaitu sebesar 0,9992 yang berarti peningkatan konsentrasi
kurkumin mempengaruhi peningkatan AUC kurkumin sebesar 99,92%. Kurva
kalibrasi standar baku kurkumin menunjukkan linearitas yang sangat baik dan
koefisien korelasi yang tinggi selama rentang 0,05-40 µg/mL. Dengan demikian,
dapat disimpulkan bahwa metode analisis kurkumin yang diuji bersifat linear serta
peningkatan konsentrasi kurkumin memiliki pengaruh yang signifikan terhadap
peningkatan AUC kurkumin.
Akurasi dan Presisi
Akurasi suatu metode ditunjukkan dengan nilai perolehan kembali,
sedangkan presisi suatu metode ditunjukkan dengan nilai koefisien variasi dari
tiga tingkatan konsentrasi yang berbeda. Nilai perolehan kembali didapat dengan
menggunakan larutan ekstrak rimpang kunyit dan larutan ekstrak rimpang kunyit
yang diadisi baku kurkumin. Nilai perolehan kembali ditetapkan dengan paling
sedikit tiga konsentrasi (rendah, sedang, dan tinggi) dan paling sedikit tiga kali
pengukuran tiap konsentrasi dengan penambahan baku kurkumin. Pada penelitian
ini, dilakukan penentuan akurasi dan presisi intra-day dan inter-day untuk
kuantifikasi kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit. Penambahan baku kurkumin
dilakukan dengan tiga tingkatan konsentrasi, yaitu 1 µg/mL (rendah), 10 µg/mL
(sedang), dan 20 µg/mL (tinggi). Penambahan baku kurkumin dilakukan sebanyak
tiga replikasi untuk setiap tingkatan konsentrasi dan dilakukan selama tiga hari
berturut-turut.
Gambar 5. Stacking kromatogram adisi baku kurkumin
1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 min
0
2500
5000
7500
10000
12500
15000
17500
20000
22500
uV
Adisi baku kurkumin
Non adisi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
Tabel IV. Data intra-day akurasi dan presisi kurkumin
Senyawa
Intra-day
Konsentrasi
baku yang
ditambahkan
(µg/ml)
Konsentrasi
yang didapat
kembali
(µg/ml)
Perolehan
Kembali
(%)
RSD
(%)
Kurkumin
1,00 0,97 ± 0,016 97,03 1,65
10,00 9,78 ± 0,010 97,75 0,10
20,00 20,02 ± 0,045 100,08 0,22
Tabel V. Data inter-day akurasi dan presisi kurkumin
Senyawa
Inter-day
Konsentrasi
baku yang
ditambahkan
(µg/ml)
Konsentrasi
yang didapat
kembali
(µg/ml)
Perolehan
Kembali
(%)
RSD
(%)
Kurkumin
1,00 0,96 ± 0,025 96,11 2,59
10,00 9,78 ± 0,031 97,76 0,31
20,00 19,98 ± 0,409 99,88 2,00
Berdasarkan data perolehan kembali kurkumin yang disajikan pada Tabel
IV dan Tabel V, nilai persen perolehan kembali intra-day dan inter-day untuk
kurkumin adalah antara 97,03-100,08% dan 96,11-99,88% secara berurutan.
Berdasarkan nilai-nilai tersebut, dapat disimpulkan bahwa metode analisis
kurkumin yang diuji memenuhi parameter akurasi.
Berdasarkan AOAC 2019, suatu metode analisis yang duji dikatakan
memenuhi parameter presisi ditunjukkan dari nilai persen koefisien variasi atau
persen relative standard deviation. Berdasarkan data yang disajikan pada Tabel
IV dan Tabel V, nilai persen koefisien variasi atau persen relative standard
deviation intra-day dan inter-day untuk kurkumin adalah antara 0,10-1,65% dan
0,31-2,59% secara berurutan. Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa metode
analisis kurkumin yang diuji memenuhi parameter presisi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
KESIMPULAN
Metode analisis kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit menggunakan
HPLC fase terbalik dengan kolom C18; fase gerak asetonitril:metanol:air (65:5:30
v/v); laju alir 1,0 mL/menit yang telah dioptimasi dan divalidasi pada penelitian
ini memiliki waktu retensi senyawa kurkumin yang lebih cepat dengan
keterpisahan senyawa kurkumin dalam sampel ekstrak rimpang kunyit yang
sepenuhnya terpisah sehingga jumlah senyawa kurkumin dapat diukur secara
akurat, memiliki waktu kerja dan pemakaian fase gerak yang lebih efisien
dibandingkan dengan metode yang pernah ada pada penelitian-penelitian
sebelumnya serta memiliki linearitas, akurasi dan presisi yang baik.
Metode analisis kurkumin dalam ekstrak rimpang kunyit menggunakan
HPLC fase terbalik dengan kolom C18; fase gerak asetonitril:metanol:air (65:5:30
v/v); laju alir 1,0 mL/menit memenuhi parameter validitas linearitas (r=0,9996
dan R2=0,9992), selektivitas (nilai resolusi pada ekstrak rimpang kunyit
konsentrasi 0,5 µg/mL sebesar 1,531), akurasi intra-day dan inter-day (persen
perolehan kembali adalah 97,03-100,08% dan 96,11-99,88% secara berurutan)
serta presisi (persen relative standard deviation antara 0,10-1,65% dan 0,31-
2,59% untuk intra-day dan inter-day precision secara berurutan) sehingga metode
analisis kurkumin yang diuji dapat digunakan untuk penetapan kadar kurkumin
dalam ekstrak rimpang kunyit.
SARAN
Penelitian terkait penetapan kadar kurkumin dalam sampel ekstrak
rimpang kunyit dapat menggunakan metode yang telah divalidasi ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
DAFTAR PUSTAKA
Aggarwal, B.B., Bhatt, I.D., Ichikawa, H., Ahn, K.S., Sethi, G., Sundaram, C.,
Seeram, N., Shisodia, S., 2006. Curcumin-Biological and Medicinal
Properties. Turmeric: The Genus Curcuma, 1(6), 297-368.
Ali, I., Haque, A., Saleem, K., 2014. Separation and Identification of
Curcuminoids in Turmeric Powder by HPLC Using Phenyl Column.
Analytical Methods, 6(8), 2526-2536.
AOAC, 2019. AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical
Methods for Dietary Supplements and Botanicals. 1-27.
BPOM, 2014. Pedoman Uji Klinik Obat Herbal. Badan Pengawas Obat dan
Makanan Republik Indonesia.
Fonseca, B., Gremião, M.P.D., Chorilli, M., 2017. A Simple Reversed Phase High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) Method for Determination of
In Situ Gelling Curcumin-loaded Liquid Crystals in In Vitro Performance
Tests. Arabian Journal of Chemistry, 10(7), 1029-1037.
Gandjar, I.G., Rohman, A., 2007. Kimia Farmasi: Analisis. Pustaka Pelajar,
Yogyakarta.
Gantait, A., Barman, T., Mukherjee, P.K., 2011. Validated Method for Estimation
of Curcumin in Turmeric Powder. Indian Journal of Traditional Knowledge,
10(2), 247–250.
Günzler, H., Williams, A., 2008. Handbook of Analytical Techniques. Wiley-
VCH, Germany.
International Conference on Harmonization, 2005. Harmonized Tripartite
Guideline Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology.
International Conference on Harmonization, Genova.
Jankun, J., Wyganowska, M., Dettlaff, K., JelinSka, A., Surdacka, A., Watróbska,
D., Jankun, E., 2016. Determining Whether Curcumin Degradation is
Actually Bioactivation. International Journal of Molecular Medicine, 37(5),
1151–1158.
Jayaprakasha, G.K., Jagan Mohan Rao, L., Sakariah, K.K., 2002. Improved HPLC
Method for the Determination of Curcumin, Demethoxycurcumin, and
Bisdemethoxycurcumin. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50,
3668-3682.
Kazakevich, Y., LoBrutto, R., 2007. HPLC for Pharmaceutical Scientists. Wiley-
Interscience, Hoboken.
Khismatrao, A., Bhairy, S., Hirlekar, R., 2018. Development and Validation of
RP-HPLC Method for Simultaneous Estimation of Curcumin and Piperine.
International Journal of Applied Pharmaceutics, 10(5), 43.
Meyer, V., 2010. Practical High-Performance Liquid Chromatography, 5th
ed.
John Wiley and Sons Ltd, Switzerland.
Monton, C., Charoenchai, L., Suksaeree, J., Sueree, L., 2016. Quantitation of
Curcuminoid Contents, Dissolution Profile, and Volatile Oil Content of
Turmeric Capsules Produced at Some Secondary Government Hospitals.
Journal of Food and Drug Analysis, 24(3), 493-499.
Murti, Y.B., Hartini, Y.S., Hinrichs, W.L.J., Frijlink, H.W., Setyaningsih, D.,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
2019. UV-Vis Spectroscopy to Enable Determination of the Dissolution
Behavior of Solid Dispersions Containing Curcumin and Piperine. Journal of
Young Pharmacists, 11(1), 26–30.
Narayani, S.S., Aravanan, S., Bharathiaraja, S. Mahendran, S., 2016. Extraction,
Partially Purification and Study on Antioxidant Property of Fucoxanthin
from Sargassum cinereum. Journal of Chemical and Pharmaceutical
Research, 8(3), 610-616.
Phattanawasin, P., Sotanaphun, U., Sriphong, L., 2009. Validated TLC-Image
Analysis Method for Simultaneous Quantification of Curcuminoids in
Curcuma longa. Chromatographia, 69(3), 397–400.
Pulido, M., Moreno, J., Ramirez, C., Ramirez, M.C., 2016. Curcumin and Health.
Molecules, 21(3), 1-22.
Setyaningsih, D., Murti, Y.B., Fudholi, A., Wouter, L.J., Mudjahid, R., Martono,
S., Hertiani, T., 2016. Validated TLC Method for Determination of
Curcumin Concentrations in Dissolution Samples Containing Curcuma longa
Extract. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 14(2), 147–157.
Setyaningsih, D., Murti, Y.B., Martono, S., Hinrichs, W.L.J., Hertiani, T.,
Fudholi, A., 2016. A Novel Reversed Phase High Performance Liquid
Chromatography Method To Accurately Determine Low Concentrations Of
Curcumin In Rat Plasma. International Journal of Pharmaceutical and
Clinical Research, 8(5), 377–386.
Unites States Pharmacopeial Convention, 2017. The United States Pharmacopeia
40 National Formulary 35 (USP40-NF35). Unites States Pharmacopeial
Convention Inc, USA.
Wichitnithad, W., Jongaroonngamsang, N., Pummangura, S., Rojsittthisak, P.,
2009. A Simple Isocratic HPLC Method for the Simultaneous Determination
of Curcuminoids in Commercial Turmeric Extracts. Phytochem. Anal., 20(3),
314-319.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
Lampiran 1. Kromatogram rentang dan kurva baku kurkumin
1. Konsentrasi 0,05 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
2. Konsentrasi 0,1 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
3. Konsentrasi 0,5 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
4. Konsentrasi 1 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
5. Konsentrasi 2,5 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
6. Konsentrasi 5 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
7. Konsentrasi 10 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
8. Konsentrasi 15 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
9. Konsentrasi 20 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
10. Konsentrasi 25 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
11. Konsentrasi 30 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
12. Konsentrasi 35 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
13. Konsentrasi 40 µg/mL replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
Lampiran 2. Kromatogram perolehan kembali
1. Non Adisi replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
2. Adisi 1 (rendah) replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
3. Adisi 2 (sedang) replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
4. Adisi 3 (tinggi) replikasi 2
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
Lampiran 3. Kromatogram ekstrak rimpang kunyit konsentrasi 0,5 µg/mL
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
Lampiran 4. Data AUC perolehan kembali dan presisi
Hari ke-1
Konsentrasi
(µg/mL)
AUC
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
Non Adisi 61.140 55.207 59.584
Adisi 1 255.555 270.817 266.107
Adisi 2 2.128.933 2.121.389 2.112.352
Adisi 3 4.314.040 4.284.998 4.297.718
Hari ke-2
Konsentrasi
(µg/mL)
AUC
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
Non Adisi 66.312 67.427 62.451
Adisi 1 264.025 267.789 269.075
Adisi 2 2.125.597 2.124.012 2.117.891
Adisi 3 4.271.521 4.290.006 4.282.694
Hari ke-3
Konsentrasi
(µg/mL)
AUC
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
Non Adisi 57.397 60.079 68.172
Adisi 1 257.957 268.193 261.569
Adisi 2 2.127.297 2.115.848 2.130.882
Adisi 3 4.193.744 4.102.837 4.419.138
Senyawa
Hari ke-1
Konsentrasi
baku yang
ditambahkan
(µg/ml)
Konsentrasi
yang didapat
kembali
(µg/ml)
Perolehan
Kembali
(%)
RSD
(%)
Kurkumin
1,00 0,96 ± 0,037 95,92 3,87
10,00 9,77± 0,039 97,67 0,40
20,00 20,10 ± 0,069 100,50 0,34
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
Senyawa
Hari ke-2
Konsentrasi
baku yang
ditambahkan
(µg/ml)
Konsentrasi
yang didapat
kembali
(µg/ml)
Perolehan
Kembali
(%)
RSD
(%)
Kurkumin
1,00 0,97 ± 0,012 97,25 1,28
10,00 9,77 ± 0,019 97,75 0,20
20,00 20,02 ± 0,044 100,08 0,22
Senyawa
Hari ke-3
Konsentrasi
baku yang
ditambahkan
(µg/ml)
Konsentrasi
yang didapat
kembali
(µg/ml)
Perolehan
Kembali
(%)
RSD
(%)
Kurkumin
1,00 0,95 ± 0,025 95,17 2,59
10,00 9,79 ± 0,037 97,85 0,38
20,00 19,81 ± 0,773 99,07 3,90
Contoh perhitungan perolehan kembali pada adisi 1 replikasi pertama:
Persen perolehan kembali = (Cf – Cu) x 100/Cu
= (1,421 – 0,467) x 100/1
= 95,36%
Contoh perhitungan koefisien variasi pada adisi 1:
Koefisien variasi (CV) = SD/rata-rata x 100%
= 0,016/0,97 x 100%
= 1,65%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi yang berjudul Validasi Metode Analisis
High Performance Liquid Chromatography Fase
Terbalik Pada Penetapan Kadar Kurkumin Dalam
Ekstrak Rimpang Kunyit ini bernama lengkap Yosua
Agung Santoso. Penulis dilahirkan di Magelang pada
tanggal 11 Oktober 1997 sebagai anak pertama dari dua
bersaudara, dari pasangan Lewi Santoso Wibowo dan
Melasari Lestyodewi. Pendidikan formal yang telah
dienyam penulis yakni pendidikan tingkat Sekolah Dasar
di SD Kristen Indonesia Magelang (2003- 2009),
pendidikan tingkat Sekolah Menengah Pertama di SMP
Negeri 1 Magelang (2009-2012), dan pendidikan tingkat
Sekolah Menengah Atas di SMA Negeri 1 Magelang
(2012-2015). Penulis kemudian melanjutkan studi Strata-1 di Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2016. Selama menempuh
pendidikan di Fakultas Farmasi Universitas Santa Dharma penulis aktif dalam
berbagai kegiatan dan organisasi. Di bidang akademik, penulis pernah menjadi
Asisten Dosen Praktikum Kimia Dasar 2017/2018, Asisten Dosen Praktikum
Biokimia 2018/2019, dan Asisten Dosen Praktikum Kimia Analisis 2018/2019.
Selain itu pada tahun 2018, penulis pernah mengikuti lomba Olimpiade Nasional
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam bagi Mahasiswa Perguruan Tinggi (ON
MIPA-PT) Bidang Kimia Tahun 2018.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI