64
VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL DARAH ORANG JAWA DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE TERBALIK SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi Oleh: Suryatmoko Agung NIM : 138114009 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2017 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

  • Upload
    lengoc

  • View
    274

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL DARAH

ORANG JAWA DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA

TINGGI FASE TERBALIK

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Suryatmoko Agung

NIM : 138114009

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2017

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 2: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

i

VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL DARAH

ORANG JAWA DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA

TINGGI FASE TERBALIK

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Suryatmoko Agung

NIM : 138114009

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2017

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 3: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 4: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

iii

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 5: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

When life is good do not take it for granted as it will pass.

Be mindfull, be compassionate and nurture the circumstances that find you in this

good time so it will last longer.

When life falls apart always remember that this to will pass.

Life will have its unexpected turns.

-Ajahn Brahm-

“Success is not the key to happiness. Happiness is the key to success.

If you love what you are doing, you will be successfull”

-Albert Schweitzer-

Kupersembahkan karya ini untuk,

Buddha, Dhamma, Sangha,

Keluargaku yang selalu mendoakanku dan memberikan kasih sayang yang berlimpah,

Untuk teman-teman yang selalu setia mendukungku,

dan tentunya,

Almamaterku Universitas Sanata Dharma

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 6: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Echo
Rectangle
Page 7: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Echo
Rectangle
Page 8: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

vii

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas segala

berkat, kekuatan, dan karunia-Nya sehingga penelitian dan penyusunan skripsi yang

berjudul “Validasi Metode Bioanalisis Kafein dalam Sampel Darah Orang Jawa dengan

Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik” dapat selesai dengan baik.

Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana Farmasi

(S.Farm) di Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Dalam perjalanan penelitian hingga skripsi selesai, penulis mendapatkan banyak

dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin

menyampaikan terimakasih kepada :

1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta, dan juga selaku Dosen Pembimbing Akademik.

2. Ibu Dr. Sri Hartati Yuliani, Apt., selaku Ketua Program Studi Farmasi Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

3. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt., selaku dosen pembimbing yang telah

memberikan kesabaran, semangat, bimbingan, dan pengarahan, serta saran selama

berjalannya penelitian hingga berakhirnya penyusunan skripsi selesai.

4. Bapak Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc., selaku dosen pembimbing yang telah

memberikan kesabaran, semangat, bimbingan, dan pengarahan, serta saran selama

berjalannya penelitian hingga berakhirnya penyusunan skripsi selesai.

5. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt., selaku dosen penguji atas segala masukan,

kritik, dan saran hingga skripsi ini tersusun.

6. Ibu Dr. Dewi Setyaningsih, M.Sc., Apt., selaku dosen penguji atas segala masukan,

kritik, dan saran hingga skripsi ini tersusun.

7. Laboran Laboratorium Kimia Analisis Instrumentasi (Mas Bimo), Biokimia (Pak

Kayat), Kultur Jaringan (Pak Wagiran) Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

yang telah menemani serta membantu proses penelitian di laboratorium.

8. Papa, Mama, serta adik-adikku Martin, Trisnia, dan Hanna yang selalu memberikan

dukungan, semangat, dan kebahagiaan serta suasana yang hangat di rumah.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 9: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

viii

9. Rekan penelitian ini, Jonathan Ronny Kurniawan atas dukungan, semangat,

pengertian, bantuan, dan suka-duka yang telah dilewati bersama dalam proses

menyelesaikan skripsi ini.

10. Pihak yang tidak dapat saya sebutkan satu per satu.

Penulis menyadari bahwa banyak kekurangan dan ketidaksempurnaan dalam

penulisan skripsi ini, mengingat keterbatasan kemampuan dan ilmu pengetahuan

penulis. Untuk hal itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dari

semua pihak agar penulisan skripsi ini menjadi lebih baik lagi. Akhir kata, semoga

skripsi ini dapat berguna bagi pembaca dan ilmu pengetahuan.

Yogyakarta, 5 Januari 2017

Penulis

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 10: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

ix

ABSTRAK

Serangkaian metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) telah banyak

dilakukan untuk mengukur kadar kafein dalam darah. Namun, belum ada penelitian

yang menggunakan sampel plasma darah orang jawa. Pada penelitian ini dilakukan

metode KCKT fase terbalik untuk mengetahui parameter validasi metode bioanalisis

kafein dalam sampel darah orang jawa. Sampel plasma darah orang jawa didapatkan

dengan kuisioner Donor Darah di PMI Kota Yogyakarta. Plasma darah ditambahkan

dengan baku kafein dan standar internal asetanilida. Setelah itu, dideproteinasi dengan

menggunakan metanol. Setelah itu, dipisahkan dengan kolom C18 menggunakan fase

gerak aqua bidestilata dan metanol (50:50), kecepatan alir 1 mL/menit, dengan detektor

UV pada panjang gelombang 256 nm. Hasil kurva kalibrasi menyatakan hubungan

antara konsentrasi kafein dan rasio area under curve (AUC) sudah linear pada

konsentrasi 6-20 g/mL. Penelitian ini mendeteksi limit of detection pada 2 g/mL,

lower limit of quantification pada 3 ppm, limit of quantification pada 4 ppm, rata-rata

uji akurasi dalam rentang 100 ± 15 %, persen perolehan kembali diluar rentang 100 ±

15 %, dengan koefisien variasi (KV) < 13%. Dari hasil uji presisi interday didapatkan

standar deviasi dibawah 1,3 dan KV dibawah 10%. Metode ini telah gagal mengukur

kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel.

Kata kunci: KCKT, darah keturunan jawa, validasi metode, bioanalisis

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 11: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

x

ABSTRACT

A series of high-performance liquid chromatography (HPLC) has been

widely performed to measure the levels of caffeine in the blood. However, no studies

have used javanese blood sample to measure caffeine level. In this research, reversed-

phase HPLC method have been used to determine the bioanalytical method validation

parameters of the caffeine in javanese blood sample. Javanese blood plasma obtained

using a blood donation questionnaire at PMI Kota Yogyakarta. Blood plasma is added

with caffeine and acetanilide internal standard. After that, It deproteinated by methanol

and then it separated by a C18 column using a mobile phase aquabidestilata and methanol

(50:50), and monitored by UV detector, with the wavelength set at 256 nm. The

relationship between caffeine concentrations and peak ratio (caffeine-IS) was linear

over the range of 6-20 g / mL. Limit of detection was detected at 2 g / mL, lower

limit of quantification at 3 g / mL, and the limit of quantification at 4 g / mL.

Accuracy test average was at 100 ± 15%. coefficient of variation (CV) in intra-run and

Inter-run <13% and <10%. This method has been successfull to measure the levels of

caffeine in the blood sample Java people with valid and reliable.

Keywords: HPLC, Javanese blood, method validation, bioanalysis

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 12: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ii

HALAMAN PENGESAHAN iii

HALAMAN PERSEMBAHAN iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH

UNTUK UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS vi

PRAKATA vii

ABSTRAK ix

ABSTRACT x

DAFTAR ISI xi

DAFTAR TABEL xii

DAFTAR GAMBAR xiii

DAFTAR LAMPIRAN x iv

PENDAHULUAN 1

METODE PENELITIAN 2

HASIL DAN PEMBAHASAN 5

KESIMPULAN 9

SARAN 9

DAFTAR PUSTAKA 10

LAMPIRAN 11

BIOGRAFI PENULIS 47

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 13: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

xii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Penentuan LOD, LLOQ, dan LOQ 6

Tabel II. Penentuan LOD, LLOQ, dan LOQ 7

Tabel III. Presisi kadar terukur LOD, LLOQ, dan LOQ 8

Tabel IV. Akurasi dan Presisi Kadar Kafein dalam Plasma 8

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 14: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

xiii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Overlay kromatogram dari 0.6 mL plasma darah yang dispike

dengan 7 seri konsentrasi kafein : 0, 6, 8, 12, 16, 18, dan 20

µg/mL menggunakan standar internal asetanilida (SI, 8 µg/mL) 6

Gambar 2. Kurva kalibrasi kafein (6, 8, 12, 16, 18, 20 µg/mL) dalam

plasma dengan penambahan standar asetanilida 8 µg/mL 6

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 15: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Contoh Kuisioner Donor Darah PMI 11

Lampiran 2. Surat Izin Penelitian 12

Lampiran 3. Sertifikat Analisis Kafein 13

Lampiran 4. Hasil pembacaan absorbansi senyawa kafein dan SI asetanilida

menggunakan spektrofotometer UV 14

Lampiran 5. Kromatogram Blangko Plasma A 15

Lampiran 6. Kromatogram Blangko Plasma B 16

Lampiran 7. Kromatogram Blangko Plasma C 17

Lampiran 8. Kromatogram Blangko Plasma D 18

Lampiran 9. Kromatogram Blangko Plasma E 19

Lampiran 10. Kromatogram Kurva Kalibrasi Blangko 20

Lampiran 11. Kromatogram Kurva Kalibrasi Sampel Zero 21

Lampiran 12. Kromatogram Kurva Kalibrasi Kafein konsentrasi 6 µg/mL

dengan penambahan SI Asetanilida 8 µg/mL 22

Lampiran 13. Kromatogram Kurva Kalibrasi Kafein konsentrasi 8 µg/mL

dengan penambahan SI Asetanilida 8 µg/mL 23

Lampiran 14. Kromatogram Kurva Kalibrasi Kafein konsentrasi 12 µg/mL

dengan penambahan SI Asetanilida 8 µg/mL 24

Lampiran 15. Kromatogram Kurva Kalibrasi Kafein konsentrasi 16 µg/mL

dengan penambahan SI Asetanilida 8 µg/mL 25

Lampiran 16. Kromatogram Kurva Kalibrasi Kafein konsentrasi 18 µg/mL

dengan penambahan SI Asetanilida 8 µg/mL 26

Lampiran 17. Kromatogram Kurva Kalibrasi Kafein konsentrasi 20 µg/mL

dengan penambahan SI Asetanilida 8 µg/mL 27

Lampiran 18. Kromatogram Penentuan LOD, LLOQ, dan LOQ Kafein

konsentrasi 1 µg/mL dengan penambahan SI Asetanilida

8 µg/mL 28

Lampiran 19. Kromatogram Penentuan LOD, LLOQ, dan LOQ Kafein

konsentrasi 2 µg/mL dengan penambahan SI Asetanilida

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 16: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

xv

8 µg/mL 29

Lampiran 20. Kromatogram Penentuan LOD, LLOQ, dan LOQ Kafein

konsentrasi 3 µg/mL dengan penambahan SI Asetanilida

8 µg/mL 30

Lampiran 21. Kromatogram Penentuan LOD, LLOQ, dan LOQ Kafein

konsentrasi 4 µg/mL dengan penambahan SI Asetanilida

8 µg/mL 31

Lampiran 22. Kromatogram Penentuan Akurasi dan Presisi Kafein

konsentrasi 6 µg/mL dengan penambahan SI Asetanilida

8 µg/mL 32

Lampiran 23. Kromatogram Penentuan Akurasi dan Presisi Kafein

konsentrasi 12 µg/mL dengan penambahan SI Asetanilida

8 µg/mL 33

Lampiran 24. Kromatogram Penentuan Akurasi dan Presisi Kafein

konsentrasi 17 µg/mL dengan penambahan SI Asetanilida

8 µg/mL 34

Lampiran 25. Kromatogram Penentuan Presisi Inter-run 1 Kafein

konsentrasi 6 µg/mL dengan penambahan SI Asetanilida

8 µg/mL 35

Lampiran 26. Kromatogram Penentuan Presisi Inter-run 1 Kafein

konsentrasi 12 µg/mL dengan penambahan SI Asetanilida

8 µg/mL 36

Lampiran 27. Kromatogram Penentuan Presisi Inter-run 1 Kafein

konsentrasi 17 µg/mL dengan penambahan SI Asetanilida

8 µg/mL 37

Lampiran 28. Kromatogram Penentuan Presisi Inter-run 2 Kafein

konsentrasi 6 µg/mL dengan penambahan SI Asetanilida

8 µg/mL 38

Lampiran 29. Kromatogram Penentuan Presisi Inter-run 2 Kafein

konsentrasi 12 µg/mL dengan penambahan SI Asetanilida

8 µg/mL 39

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 17: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

xvi

Lampiran 30. Kromatogram Penentuan Presisi Inter-run 2 Kafein

konsentrasi 17 µg/mL dengan penambahan SI Asetanilida

8 µg/mL 40

Lampiran 31. Contoh perhitungan konsentrasi kafein dan asetanilida dari

penimbangan hingga larutan seri 41

Lampiran 32. Contoh Perhitungan pengenceran konsentrasi kafein dan

asetanilida yang dispike dalam plasma darah hingga

diinjeksikan ke sistem KCKT 42

Lampiran 33. Perhitungan kurva kalibrasi 43

Lampiran 34. Penentuan LOD, LLOQ, dan LOQ 44

Lampiran 35. Perhitungan Akurasi dan Presisi Intraday 45

Lampiran 36. Perhitungan Presisi Interday 1 46

Lampiran 37. Perhitungan Presisi Interday 2 46

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 18: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

1

PENDAHULUAN

Kafein merupakan zat psikoaktif yang berperan sebagai stimulan sistem saraf pusat

(Kalmar, 2005). Zat ini banyak terkandung dalam minuman kopi, teh, coklat, minuman cola,

dan minuman berenergi yang diminati di berbagai kalangan usia di pulau jawa. Kafein

memiliki waktu paruh ± 3,5 jam, akan tetapi kecepatan metabolismenya juga dipengaruhi

hal-hal lain, yaitu induksi enzim, inhibisi enzim, usia, serta polimorfisme genetik (Neal,

2016).

Polimorfisme genetik adalah adanya variasi genetik yang menyebabkan perbedaan

aktivitas dan kapasitas suatu enzim dalam menjalankan fungsinya (Shenfield, 2004). Enzim

CYP2A6 merupakan enzim yang memiliki peran penting dalam metabolisme senyawa di

dalam tubuh, misalnya senyawa-senyawa seperti kafein, nikotin, efavirenz, letrozole,

pilocarpine dan tegafur (Raunio et al., 2001). Enzim CYP2A6 memiliki alel yang

menurunkan kecepatan metabolisme obat di dalam tubuh yaitu alel CYP2A6*4 (Benowitz

et al., 2006). Pada genetik darah keturunan jawa terdapat polimorfi enzim CYP2A6, yaitu

frekuensi alel CYP2A6*4 yang tinggi. Hal ini dapat menyebabkan metabolisme kafein

cenderung lebih lambat pada darah keturunan jawa (Patramurti dkk, 2015). Metabolisme

kafein yang lambat memungkinkan terjadinya peningkatan kadar kafein dalam darah. Kadar

kafein yang melewati batas kadar toksisitas minimal (KTM) akan mengakibatkan gejala

klinis, maka perlu dilakukan pemantauan obat terapeutik (Dasgupta, 2012). Pemantauan

obat terapeutik dilakukan dengan cara mengukur konsentrasi obat dalam plasma untuk

mengoptimumkan dan melakukan individualisasi dosis sehingga sesuai untuk pasien

(Hiemke, 2011). Pemantauan obat terapeutik memerlukan suatu metode bioanalisis yang

valid dan reprodusibel.

Penelitian tentang analisis kafein dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi

(KCKT) telah banyak dilakukan pada berbagai sampel dan hampir semua menggunakan

metode KCKT (Patil, 2012), namun belum ada penelitian bioanalisis kafein pada darah

orang jawa. Bioanalisis adalah suatu metode yang biasanya digunakan untuk

mendeskripsikan pengukuran kadar kuantitatif dari campuran obat pada cairan biologis

khususnya darah, plasma, serum, urin, atau ekstrak jaringan (Evans, 2004). Pada penelitian

Alvi dan Hamami (2011) telah dilakukan validasi metode KCKT untuk bioanalisis kafein

dalam plasma darah sintetik dengan standar internal antipirin, fase gerak larutan penyangga

fosfat : asetonitril (83:17 v/v), kecepatan alir 1.0 mL/menit pada panjang gelombang 274 nm

didapatkan metode yang sensitif, akurat, dan presisi. Pada penelitian Irmanto (2009) telah

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 19: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

2

dipisahkan campuran parasetamol, propifenazon, dan kafein dengan beberapa variasi

perbandingan komposisi fase gerak metanol : aquabidestilata (70:30 ; 60:40 ; 50:50)

menggunakan metode KCKT.

Validasi metode ditujukan untuk memberikan jaminan bahwa metode bioanalisis

kafein pada darah orang jawa sudah memenuhi parameter-parameter validasi yang meliputi

selektivitas, akurasi, presisi, linearitas, Limit of Detection (LOD), Limit of Quantification

(LOQ), dan Lower Limit of Quantification (LLOQ). Validasi metode dilakukan agar metode

ini dapat dilanjutkan ke tahap penetapan kadar dengan memberikan hasil yang valid, dapat

dipercaya, dan dapat dipertanggungjawabkan.

METODE PENELITIAN

Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain sampel plasma darah orang

jawa dari PMI Kota Yogyakarta, metanol (p.a. grade) (Merck), aquabidestilata, baku kafein

(sertifikat analisis working standard, no. 002/WS/RD/I/2012, MA USP 34), dan standar

internal asetanilida.

Alat

Instrumen yang digunakan dalam penelitian ini adalah LC-2010C (SHIMADZU)

dengan detektor UV, kolom C18 dengan dimensi 250 x 4,6 mm dan ukuran pori 5µm

(Phenomenex®), seperangkat komputer (Dell) B6RDZIS Connexant system RD01-D850

A03-0382 JP France S.A.S, printer merek HP Deskjet 1000 J110a), Spektrofotometer UV-

1800 (SHIMADZU), ultrasonikator (RETSCH), timbangan analitis SCALTEC (max 60/210

g, min 0,001 g; d = 0,01/0,1 mg), jarum suntik (TERUMO), syringe filter 0,45 µm

(Minisart®), penyaring Whatman 0,45 µm, sentrifugator (Thermo scientific Heraeus Pico),

alat vakum GAST (Merck), dan peralatan-peralatan gelas yang umum digunakan di

laboratorium analisis.

Metode

Validasi metode bioanalisis kafein dengan metode KCKT fase terbalik

menggunakan fase gerak metanol dan aquabidestilata (50:50) dan kecepatan alir 1,0

mL/menit pada kondisi isokratik. Kromatogram direkam pada 255 nm dengan jangka waktu

10 menit. Volume injeksi sejumlah 20 µg/mL. Plasma darah yang didapatkan dari PMI Kota

Yogyakarta disimpan pada suhu -70 C untuk digunakan pada penelitian (Alvi, 2011).

Larutan stok kafein dan asetanilida dibuat baru setiap awal penelitian. Parameter validasi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 20: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

3

metode analisis yang ditentukan yaitu : Linearitas kurva kalibrasi, LOD, LLOQ, LOQ,

akurasi, serta presisi.

Pembuatan Pelarut

Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah campuran metanol dan

aquabidest dengan perbandingan 50:50. Pelarut disimpan pada suhu ± 5C di lemari

pendingin.

Pembuatan larutan stok dan intermediet kafein

Sejumlah kafein ditimbang seksama lebih kurang 20 mg dan dilarutkan dengan

pelarut dalam labu ukur 5 mL, sehingga didapatkan larutan stok kafein 4 mg/mL. Larutan

stok kafein 4 mg/mL digunakan untuk membuat larutan intermediet kafein dengan

konsentrasi 800 µg/mL.

Pembuatan larutan standar internal (SI) asetanilida

Sejumlah asetanilida ditimbang seksama lebih kurang 20 mg dan dilarutkan dengan

pelarut dalam labu ukur 5 mL, sehingga didapatkan larutan asetanilida 4 mg/mL. Satu mL

larutan stok asetanilida 4 mg/mL diencerkan dengan pelarut dalam labu ukur 5 mL, sehingga

konsentrasi menjadi 320 µg/mL. Larutan asetanilida 320 µg/mL digunakan untuk membuat

larutan asetanilida 160 µg/mL. Larutan asetanilida 160 µg/mL digunakan sebagai larutan

standar internal asetanilida pada penelitian.

Penentuan panjang gelombang pengamatan larutan baku kafein dan larutan standar

internal asetanilida yang digunakan

Larutan seri kafein dibuat dengan mengencerkan larutan intermediet kafein 800

µg/mL menggunakan pelarut, sehingga didapatkan larutan seri kafein dengan konsentrasi 5;

10; dan 15 µg/mL. Masing-masing larutan seri kafein dibaca absorbansinya pada panjang

gelombang 200-400 nm menggunakan spektrofotometer UV.

Larutan seri standar internal (SI) asetanilida dibuat dengan mengencerkan larutan

intermediet asetanilida 320 µg/mL menggunakan pelarut, sehingga didapatkan larutan seri

asetanilida dengan konsentrasi 4; 8; dan 12 µg/mL. Masing-masing larutan seri asetanilida

dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 200-400 nm menggunakan spektrofotometer

UV. Spektrum yang dihasilkan ditumpang-tindihkan, kemudian dipilih panjang gelombang

yang akan digunakan untuk mendeteksi kafein dan asetanilida pada sistem KCKT.

Pembuatan larutan seri kafein kurva kalibrasi

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 21: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

4

Larutan intermediet kafein 800 µg/mL diencerkan dalam pelarut untuk memperoleh

larutan seri kafein dengan konsentrasi 120, 160, 240, 320, 360, dan 400 µg/mL. Larutan seri

kafein siap dispike ke dalam plasma untuk membuat kurva kalibrasi.

Preparasi plasma darah kurva kalibrasi

Sampel plasma darah beku dicairkan pada suhu ruangan sebelum digunakan.

Sebanyak 600 µL plasma darah diambil, dipindahkan ke tube 1,5 mL, ditambahkan 200 µL

larutan standar internal asetanilida 8 µg/mL dan 200 µL larutan kafein seri kurva kalibrasi,

lalu divortex 30 detik.

Preparasi cairan supernatan

Sebanyak 500 µL plasma darah yang sudah dipreparasi diambil dari tube 1,5 mL,

dipindahkan ke tube 2 mL, ditambahkan 1500 µL metanol, divortex selama 30 detik dan

disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit. Cairan supernatan dipisahkan,

disaring dengan millipore, dipindahkan ke tabung KCKT dan didegassing selama 5 menit

dengan ultrasonicator, sehingga didapatkan cairan supernatan kurva kalibrasi yang

mengandung seri kafein konsentrasi 6; 8; 12; 16; 18; dan 20 µg/mL dan SI asetanilida 8

µg/mL. Larutan supernatan siap diinjeksikan pada sistem KCKT dengan kondisi optimum.

Preparasi sampel blank dan zero

Sebanyak 600 µL plasma darah, ditambahkan 400 µL pelarut, kemudian dibuat

seperti pada poin preparasi cairan supernatan untuk mendapatkan sampel blank. Sebanyak

800 µL plasma darah, ditambahkan 200 µL larutan standar internal asetanilida 8 µg/mL,

kemudian dibuat seperti pada poin preparasi cairan supernatan untuk mendapatkan sampel

zero.

Kurva kalibrasi

Sebanyak 20 µL sampel blank, zero, dan cairan supernatan kurva kalibrasi yang

mengandung seri kafein dengan konsentrasi 6; 8; 12; 16; 18; dan 20 µg/mL dan SI asetanilida

8 µg/mL diinjeksikan ke sistem KCKT. Kurva kalibrasi direplikasi 3 kali dan nilai area

under curve (AUC) dicatat dari masing-masing seri kadar kafein dan asetanilida. Hasil data

rasio AUC kafein : asetanilida dibuat kurva kalibrasi secara regresi linier dengan fungsi

sumbu x sebagai konsentrasi dari kafein dan fungsi sumbu y sebagai AUC kafein banding

AUC asetanilida. Dari kurva kalibrasi, dihitung r (korelasi antara konsentrasi dan respon),

a (intercept), dan b (slope), kemudian dipilih kurva kalibrasi dengan nilai r mendekati 1 dan

nilai noise terkecil.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 22: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

5

Penentuan LOD, LLOQ, dan LOQ

Sebanyak 25; 50; 75; 100 µL larutan intermediet kafein diencerkan ke dalam pelarut

hingga 1 mL, divortex, sehingga diperoleh seri larutan kafein 20; 40; 60; 80 µg/mL.

Sebanyak 600 µL plasma darah disiapkan di tube 1,5 mL, ditambahkan 200 µL larutan seri

kafein dan 200 µL larutan SI asetanilida 160 µg/mL, lalu dibuat seperti pada poin preparasi

cairan supernatan, sehingga diperoleh cairan supernatan yang mengandung kafein dengan

konsentrasi 1; 2; 3; 4 µg/mL dengan penambahan SI asetanilida konsentrasi 8 µg/mL. Cairan

supernatan siap diinjeksikan ke dalam sistem KCKT. Nilai AUC dicatat dari masing-masing

seri kadar kafein dan asetanilida. Penentuan LOD, LOQ, dan LLOQ dihitung dengan

pendekatan signal to noise dari AUC kafein, kemudian dihitung akurasi dan presisi.

Penentuan akurasi dan presisi

Sebanyak 150; 300; 340 µL larutan intermediet kafein diencerkan menggunakan

pelarut hingga 1 mL, sehingga diperoleh larutan seri kafein dengan konsentrasi 120; 240;

340 µg/mL. Sebanyak 600 µL plasma darah disiapkan di tube 1,5 mL, ditambahkan 200 µL

larutan seri kafein dan 200 µL larutan SI asetanilida, lalu dibuat seperti pada poin preparasi

cairan supernatan, sehingga diperoleh cairan supernatan yang mengandung kafein dengan

konsentrasi 6; 12; 17 µg/mL dengan penambahan SI asetanilida konsentrasi 8 µg/mL,

kemudian diinjeksikan ke sistem KCKT. Nilai AUC dicatat dari masing-masing seri kadar

kafein dan asetanilida kemudian diplotkan ke kurva kalibrasi hingga didapatkan kadar

terukur dan dihitung nilai akurasi, presisi intraday dan interday.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Optimalisasi kondisi kromatografi

Pada kondisi optimum dengan menggunakan fase gerak aquabidestilata dan metanol

(50:50), dan kecepatan alir 1,0 mL/menit, kafein dan asetanilida dapat terpisah dengan baik

(Resolusi > 1,5) dalam rentang waktu 10 menit. Waktu retensi dari kafein dan standar

internal asetanilida berada di sekitar 4 menit dan 6,2 menit.

Linearitas

Plasma darah orang jawa yang mengandung seri larutan kafein (6, 8, 12, 16, 18, 20

µg/mL) dengan penambahan standar internal asetanilida 8 µg/mL diinjeksikan ke sistem

HPLC. Overlay kromatogram dari 0,6 mL plasma darah yang dispike 7 seri konsentrasi

kafein (0, 6, 8, 12, 16, 18, 20 µg/mL) dengan standar internal asetanilida 8 µg/mL

ditunjukkan pada Gambar 1. Konsentrasi kafein (sumbu X) dan rasio AUC kafein terhadap

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 23: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

6

AUC asetanilida (sumbu Y) dibuat regresi linier, sehingga diperoleh 3 kurva kalibrasi dan

dipilih kurva kalibrasi dengan nilai r yang paling mendekati 1 dan nilai noise terkecil. Kurva

kalibrasi yang digunakan adalah kurva kalibrasi dengan persamaan y = 0.0662x - 0.0207

dan nilai koefisien korelasi (r) =0,9940 dilihat pada Gambar 1. Hal ini menunjukkan bahwa

metode ini belum memenuhi kriteria linearitas yaitu r > 0,995 (U.S Department of Health

and Human Services, 2013), sedangkan nilai koefisien korelasi yang didapatkan < 0,995.

Rentang konsentrasi yang dipilih untuk uji linearitas adalah 6-20 µg/mL.

Gambar 1. Overlay kromatogram KCKT dari 0,6 mL plasma darah yang dispike dengan 7 seri

konsentrasi kafein : 0, 6, 8, 12, 16, 18, dan 20 µg/mL menggunakan standar internal asetanilida (SI, 8

µg/mL).

Gambar 2. Kurva kalibrasi kafein (6, 8, 12, 16, 18, 20 µg/mL) dalam plasma dengan penambahan

standar asetanilida 8 µg/mL.

Tabel I. Nilai linearitas kurva kalibrasi

Replikasi Koefisien korelasi Noise

1 0,994 10947

2 0,974 148333

3 0,992 60762

Penentuan LOD, LLOQ, dan LOQ

Lima kali replikasi seri konsentrasi kafein dalam plasma (1, 2, 3, 4 µg/mL) dengan

penambahan standar internal asetanilida 8 µg/mL diinjeksikan ke sistem HPLC untuk

menentukan LOD, LLOQ, dan LOQ. LOD didefinisikan sebagai konsentrasi terkecil yang

y = 0,0662x - 0,0207

r = 0,9940

0

0.4

0.8

1.2

1.6

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Ra

sio

AU

C

Konsentrasi kafein (µg/mL)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 24: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

7

dapat dideteksi, LLOQ dan LOQ sebagai batas terendah konsentrasi kafein yang dapat

dihitung dengan akurasi dan presisi yang dapat diterima (koefisien variasi <20%). Dalam

bioanalisis diperlukan suatu metode yang cukup sensitif. Semakin kecil nilai LOD, LLOQ,

dan LOQ menunjukkan sensitivitas metode yang tinggi. Pendekatan signal-to-noise (S/N)

digunakan untuk menentukan LOD, LLOQ, dan LOQ. LOD dapat terpenuhi jika nilai S/N

> 3, LLOQ terpenuhi jika S/N > 5, dan LOQ terpenuhi jika S/N >10 (Flanagan et al., 2007).

S adalah sinyal (AUC kafein) dan nilai N merupakan nilai noise sekitar peak kafein yang

nilainya didapatkan dari kurva kalibrasi sebesar 10947. Hal ini dihitung dengan cara

memasukkan nilai x = 0 pada kurva kalibrasi dan didapatkan nilai y/rasio AUC sebesar

0,0207 (intercept kurva kalibrasi), kemudian dicari nilai sinyal kafein yang terdeteksi

sebagai noise dengan cara mengalikan nilai intercept dan rata-rata AUC asetanilida.

Tabel II. Penentuan LOD, LLOQ, dan LOQ

Konsentrasi

Kafein Replikasi

AUC

Kafein S/N LOD* LLOQ* LOQ*

1 µg/mL

1 96871 8,8493 Memenuhi Memenuhi Tidak Memenuhi

2 66803 6,1025 Memenuhi Memenuhi Tidak Memenuhi

3 45095 4,1195 Memenuhi Tidak Memenuhi Tidak Memenuhi

4 54419 4,9712 Memenuhi Tidak Memenuhi Tidak Memenuhi

5 43212 3,9475 Memenuhi Tidak Memenuhi Tidak Memenuhi

2 µg/mL

1 83983 7,6719 Memenuhi Memenuhi Tidak Memenuhi

2 105212 9,6112 Memenuhi Memenuhi Tidak Memenuhi

3 96980 8,8592 Memenuhi Memenuhi Tidak Memenuhi

4 96277 8,7950 Memenuhi Memenuhi Tidak Memenuhi

5 86296 7,8832 Memenuhi Memenuhi Tidak Memenuhi

3 µg/mL

1 125233 11,4402 Memenuhi Memenuhi Memenuhi

2 133124 12,1610 Memenuhi Memenuhi Memenuhi

3 140649 12,8484 Memenuhi Memenuhi Memenuhi

4 171130 15,6329 Memenuhi Memenuhi Memenuhi

5 164644 15,0404 Memenuhi Memenuhi Memenuhi

4 µg/mL

1 163103 14,8996 Memenuhi Memenuhi Memenuhi

2 160687 14,6789 Memenuhi Memenuhi Memenuhi

3 190242 17,3788 Memenuhi Memenuhi Memenuhi

4 219945 20,0922 Memenuhi Memenuhi Memenuhi

5 186556 17,0421 Memenuhi Memenuhi Memenuhi

* Konsentrasi kafein dinyatakan memenuhi LOD jika S/N > 3, LLOQ jika S/N > 5, dan LOQ jika S/N > 10

Menurut U.S Department of Health and Human Services (2013), konsentrasi kadar

terukur kafein harus memiliki presisi < 20%. Presisi pada konsentrasi 1 µg/mL > 20%,

sehingga tidak ditetapkan sebagai LOD. Pada saat pengenceran kadar 1 µg/mL terdapat

sedikit perbedaan warna agak kekuningan, hal ini memungkinkan nilai AUC lebih tinggi

dari yang sebenarnya, sehingga kadar 1 µg/mL replikasi 1 dan 2 dapat terdeteksi memenuhi

parameter LLOQ. Dari perhitungan LOD, LLOQ, dan LOQ (Tabel II), serta presisi kadar

terukurnya (Tabel III) disimpulkan bahwa LOD kafein dalam plasma darah orang jawa pada

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 25: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

8

konsentrasi 2 µg/mL, dan LLOQ pada konsentrasi 3 µg/mL, dan LOQ pada konsentrasi 4

µg/mL.

Tabel III. Presisi kadar terukur LOD, LLOQ, dan LOQ

Konsentrasi kafein

Rata-Rata

Kadar Terukur

(n=5)

Kadar Terukur

SD KV

1 µg/mL 1,8672 µg/mL 0,5453 29.21 %

2 µg/mL 2,7986 µg/mL 0,2636 9.42 %

3 µg/mL 4,0000 µg/mL 0,6246 15.62 %

4 µg/mL 4,9554 µg/mL 0,7206 14.54 %

Akurasi dan Presisi

Akurasi merupakan ketepatan antara kadar terukur dibandingkan kadar sebenarnya

dan presisi merupakan ketepatan terulang yang diamati pada koefisien variasi dan dilakukan

secara intra-run dan inter-run. Akurasi dan presisi telah dilakukan pada 5 replikasi dengan

3 konsentrasi kafein dalam plasma pada rentang yang ditentukan (6, 12, 17 µg/mL). Hasil

akurasi dan presisi telah ditampilkan pada Tabel IV. Rata-rata nilai akurasi kadar kafein

dalam rentang nilai akurasi pada bioanalisis yaitu 80-120 % dengan presisi dibawah 15%,

sehingga dapat dikatakan bahwa metode ini akurat dan presisi. Persen perolehan kembali

dari kafein tidak mendekati 100% masih diperbolehkan apabila kadar yang terukur tetap

konsisten, akurat, dan presisi (U.S Department of Health and Human Services, 2013). Dari

perhitungan kadar kafein pada uji persen perolehan kembali didapatkan nilai kadar terukur

kafein yang presisi dan akurat, sehingga metode ini dapat terapkan dalam pemantauan

terapeutik obat.

Tabel IV. Akurasi dan Presisi Kadar Kafein dalam Plasma

Kadar teoritis

kafein

Kadar kafein terukur

Rata-rata

(n=5) SD KV Akurasi

Intra-run

6 µg/mL

12 µg/mL

17 µg/mL

7,02 µg/mL

13,14 µg/mL

18,17 µg/mL

0,69

0,53

0,86

9,8 %

4,0 %

4,7 %

118 %

110 %

107 %

Inter-run 1

6 µg/mL

12 µg/mL

17 µg/mL

6,67 µg/mL

12,94 µg/mL

18,49 µg/mL

0,51

0,97

0,61

7,7 %

7,5 %

3,3 %

107 %

103 %

104 %

Inter-run 2

6 µg/mL

12 µg/mL

17 µg/mL

6,72 µg/mL

13,57 µg/mL

17,50 µg/mL

0,44

1,05

0,92

6,6 %

7,7 %

5,3 %

109 %

110 %

100 %

Rata-rata 6,3 % 107 %

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 26: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

9

KESIMPULAN

Metode bioanalisis kafein dalam sampel darah orang jawa dengan KCKT fase

terbalik menggunakan detektor UV, kolom C18 (dimensi 250 x 4,6 mm, ukuran pori 5 µm),

dan fase gerak metanol : aquabidestilata (50:50) sudah valid memenuhi kriteria linearitas

pada konsentrasi 6-20 g/mL dengan LOD sebesar 2 g/mL, LLOQ sebesar 3 g/mL, LOQ

sebesar 4 g/mL, akurasi dalam rentang 100 ± 15 % dengan koefisien variasi (KV) < 13%.

SARAN

Perlu adanya penelitian penetapan kadar kafein dalam darah orang jawa untuk

melakukan pengujian metode bioanalisis kafein langsung pada pasien dengan kadar kafein

dalam darah yang tinggi, sehingga nantinya dapat diaplikasikan ke pemantauan terapi obat.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 27: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

10

DAFTAR PUSTAKA

Alvi, S.N., dan Hammami, M.M., 2011. Validated HPLC Method for Determination of

Caffeine Level in Human Plasma using Synthetic Plasma:Application to

Bioavailability Studies. Journal of Chromatographic Science, (49), 292-296.

Benowitz, N.L., Swan, G.E., Jacob, P.3rd., Lessov-Schlaggar, C.N., Tyndale, R.F., 2006.

CYP2A6 genotype and the metabolism adn disposition kinetics of nicotine.,

Clinical Pharmacology and Therapeutics, 80(5), 457-467.

Dasgupta, A., 2012. Therapeutic Drug Monitoring : New Drug and Biomarker. Elsevier Inc.,

Oxford, 23.

Evans, G., 2004. A Handbook of Bioanalysis and Drug Metabolism. CRC Press, New York.

Flanagan, R.J., Taylor, A., Watson, I.D., Whelpton, R., 2007, Fundamentals of Analytical

Toxicology, John Wiley & Sons Inc., Chichester.

Hiemke, C., Baumann, P., Bergemann, N., Conca, A., Dietmaier, O., Egberts, K., et al.,

2011. AGNP Consensus Guidelines for Therapeutic Drug Monitoring in

Psychiatry: Update 2011, Pharmacopsychiatry. (44), 196.

Irmanto, A.R., 2009. Validasi Penetapan Kadar Campuran Parasetamol, Propifenazon, dan

Kafein dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik, Skripsi,

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta, 47.

Kalmar, J. M., 2005. The Influence of Caffeine on Voluntary Muscle Activation. Medicine

and Science in Sport and Exercise, 12 (37), 2113-2119.

Neal, M. J., 2016. Medical Pharmacology at a Glance. 8th Edition, John Wiley & Sons, Ltd.,

Oxford, 9.

Patil, P.N., 2012. Caffeine in various samples and their analysis with HPLC – a review.

International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 16 (2), 76-

83.

Raunio, H., Rautio, A., Gullstén, H., Pelkonen, O., 2001. Polymorphisms of CYP2A6 and

its practical consequences. British Journal of Clinical Pharmacology, 52(4), 357-

363.

Shenfield, G.M., 2004. Genetic Polymorphisms, Drug Metabolism and Drug

Concentrations. The Clinical Biochemist Reviews, 25 (4), 203-206.

U.S Department of Health and Human Services, 2013. Guidance for Industry Bioanalytical

Method Validation : Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and

Research (CDER), Rockville, New Hampshire.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 28: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

11

LAMPIRAN

Lampiran 1. Contoh Kuisioner Donor Darah PMI

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 29: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

12

Lampiran 2. Surat Izin Penelitian

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 30: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

13

Lampiran 3. Sertifikat Analisis Kafein

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 31: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

14

Lampiran 4. Hasil pembacaan absorbansi senyawa kafein dan SI asetanilida menggunakan

spektrofotometer UV

Asetanilida 8 µg/mL

Kafein 10 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 32: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

15

Lampiran 5. Kromatogram Blangko Plasma A

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 33: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

16

Lampiran 6. Kromatogram Blangko Plasma B

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 34: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

17

Lampiran 7. Kromatogram Blangko Plasma C

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 35: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

18

Lampiran 8. Kromatogram Blangko Plasma D

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 36: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

19

Lampiran 9. Kromatogram Blangko Plasma E

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 37: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

20

Lampiran 10. Kromatogram Kurva Kalibrasi Blangko

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 38: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

21

Lampiran 11. Kromatogram Kurva Kalibrasi Sampel Zero

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 39: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

22

Lampiran 12. Kromatogram Kurva Kalibrasi Kafein konsentrasi 6 µg/mL dengan penambahan SI

Asetanilida 8 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 40: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

23

Lampiran 13. Kromatogram Kurva Kalibrasi Kafein konsentrasi 8 µg/mL dengan penambahan SI

Asetanilida 8 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 41: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

24

Lampiran 14. Kromatogram Kurva Kalibrasi Kafein konsentrasi 12 µg/mL dengan penambahan SI

Asetanilida 8 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 42: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

25

Lampiran 15. Kromatogram Kurva Kalibrasi Kafein konsentrasi 16 µg/mL dengan penambahan SI

Asetanilida 8 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 43: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

26

Lampiran 16. Kromatogram Kurva Kalibrasi Kafein konsentrasi 18 µg/mL dengan penambahan SI

Asetanilida 8 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 44: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

27

Lampiran 17. Kromatogram Kurva Kalibrasi Kafein konsentrasi 20 µg/mL dengan penambahan SI

Asetanilida 8 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 45: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

28

Lampiran 18. Kromatogram Penentuan LOD, LLOQ, dan LOQ Kafein konsentrasi 1 µg/mL dengan

penambahan SI Asetanilida 8 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 46: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

29

Lampiran 19. Kromatogram Penentuan LOD, LLOQ, dan LOQ Kafein konsentrasi 2 µg/mL dengan

penambahan SI Asetanilida 8 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 47: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

30

Lampiran 20. Kromatogram Penentuan LOD, LLOQ, dan LOQ Kafein konsentrasi 3 µg/mL dengan

penambahan SI Asetanilida 8 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 48: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

31

Lampiran 21. Kromatogram Penentuan LOD, LLOQ, dan LOQ Kafein konsentrasi 4 µg/mL dengan

penambahan SI Asetanilida 8 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 49: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

32

Lampiran 22. Kromatogram Penentuan Akurasi dan Presisi Kafein konsentrasi 6 µg/mL dengan

penambahan SI Asetanilida 8 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 50: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

33

Lampiran 23. Kromatogram Penentuan Akurasi dan Presisi Kafein konsentrasi 12 µg/mL dengan

penambahan SI Asetanilida 8 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 51: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

34

Lampiran 24. Kromatogram Penentuan Akurasi dan Presisi Kafein konsentrasi 17 µg/mL dengan

penambahan SI Asetanilida 8 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 52: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

35

Lampiran 25. Kromatogram Penentuan Presisi Inter-run 1 Kafein konsentrasi 6 µg/mL dengan

penambahan SI Asetanilida 8 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 53: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

36

Lampiran 26. Kromatogram Penentuan Presisi Inter-run 1 Kafein konsentrasi 12 µg/mL dengan

penambahan SI Asetanilida 8 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 54: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

37

Lampiran 27. Kromatogram Penentuan Presisi Inter-run 1 Kafein konsentrasi 17 µg/mL dengan

penambahan SI Asetanilida 8 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 55: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

38

Lampiran 28. Kromatogram Penentuan Presisi Inter-run 2 Kafein konsentrasi 6 µg/mL dengan

penambahan SI Asetanilida 8 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 56: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

39

Lampiran 29. Kromatogram Penentuan Presisi Inter-run 2 Kafein konsentrasi 12 µg/mL dengan

penambahan SI Asetanilida 8 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 57: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

40

Lampiran 30. Kromatogram Penentuan Presisi Inter-run 2 Kafein konsentrasi 17 µg/mL dengan

penambahan SI Asetanilida 8 µg/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 58: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

41

Lampiran 31. Contoh perhitungan konsentrasi kafein dan asetanilida dari penimbangan hingga

larutan seri

Perhitungan konsentrasi larutan stok kafein/SI

20 mg kafein/SI dilarutkan dengan pelarut hingga 5 mL

Konsentrasi larutan stok kafein/SI = 20 mg / 5 mL

= 4 mg/mL

Perhitungan konsentrasi larutan intermediet kafein 800 g/mL

1000 L larutan stok kafein 4 mg/mL diencerkan dengan pelarut hingga 5 mL

Konsentrasi larutan intermediet kafein = 4 mg/mL x 1000 L / 5mL

= 800 g/mL

Contoh perhitungan larutan seri kafein 120 g/mL

150 L larutan intermediet kafein 800 g/mL diencerkan dengan pelarut hingga 1 mL

Konsentrasi larutan seri kafein = 800 g/mL x 150 L / 1mL

= 120 g/mL

Perhitungan konsentrasi larutan intermediet asetanilida 320 g/mL

1000 L larutan stok asetanilida 4 mg/mL diencerkan dengan pelarut hingga 5 mL

Konsentrasi larutan intermediet asetanilida = 4 mg/mL x 1000 L / 5mL

= 800 g/mL

Contoh perhitungan larutan SI asetanilida 160 g/mL

1 mL larutan intermediet asetanilida 320 g/mL diencerkan dengan pelarut hingga 2 mL

Konsentrasi larutan asetanilida = 320 g/mL x 1 mL / 2mL

= 160 g/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 59: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

42

Lampiran 32. Contoh Perhitungan pengenceran konsentrasi kafein dan asetanilida yang dispike dalam

plasma darah hingga diinjeksikan ke sistem KCKT

Pada tahap preparasi plasma darah :

200 µL larutan seri kafein/SI diencerkan hingga 1000 µL = 5x Pengenceran

Pada tahap preparasi cairan supernatan :

500 µL larutan seri kafein/SI diencerkan hingga 2000 µL = 4x Pengenceran

Total Pengenceran = 5 x 4

= 20

Contoh perhitungan konsentrasi kafein sebenarnya yang diinjeksikan :

Jika dilakukan penambahan kafein dengan konsentrasi 120 g/mL, maka konsentrasi

kafein yang diinjeksikan adalah :

120 g/mL x 200 L = 48 g/mL dalam 1000 L

48 g/mL x 500 L = 12 g/mL dalam 2000 L

Sehingga didapatkan konsentrasi kafein yang diinjeksikan pada sistem KCKT yaitu

12 g/mL

Jika dilakukan penambahan kafein dengan konsentrasi 120 g/mL, maka konsentrasi

kafein yang diinjeksikan adalah :

160 g/mL x 200 L = 32 g/mL dalam 1000 L

32 g/mL x 500 L = 8 g/mL dalam 2000 L

Sehingga didapatkan konsentrasi SI asetanilida yang diinjeksikan pada sistem KCKT

yaitu 8 g/mL

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 60: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

43

Lampiran 33. Perhitungan kurva kalibrasi

No (ppm) Konsentrasi Teoritis KafeinAUC Kafein AUC Asetanilida Rasio AUC

0 0 0 468658 0

6 6.159 206266 491638 0.419549

8 8.212 255481 524532 0.487065

12 12.318 428079 564635 0.758152

16 16.424 591080 529822 1.11562

18 18.477 636064 515905 1.232909

20 20.53 708427 546445 1.296429

Rata-Rata 528829.5

Noise 10946.7707

Kurva Kalibrasi I

KURVA KALIBRASI YANG DIGUNAKAN

y = 0.0662x - 0.0207R² = 0.9881

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Ras

io A

UC

Konsentrasi kafein

Kurva Kalibrasi I

Kurva Kalibrasi I Linear (Kurva Kalibrasi I)

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 61: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

Lampiran 34. Penentuan LOD, LLOQ, dan LOQ

Replikasi 1

Kadar Teoritis Kafein AUC Kafein Kadar Terukur S/N LOD LLOQ LOQ Noise 10947

1.002 96871 2.70 8.8493 PASS PASS FAIL LOD jika AUC Kafein > 32840

2.004 83983 2.45 7.6719 PASS PASS FAIL LLOQ jika AUC Kafein > 54734

3.006 125233 3.29 11.4402 PASS PASS PASS LOQ jika AUC Kafein > 109468

4.008 163103 4.09 14.8996 PASS PASS PASS

Replikasi 2

Kadar Teoritis Kafein AUC Kafein Kadar Terukur S/N LOD LLOQ LOQ

0.9885 66803 2.12 6.1025 PASS PASS FAIL

1.977 105212 3.02 9.6112 PASS PASS FAIL

2.966 133124 3.73 12.1610 PASS PASS PASS

3.954 160687 4.67 14.6789 PASS PASS PASS

Replikasi 3

Kadar Teoritis Kafein AUC Kafein Kadar Terukur S/N LOD LLOQ LOQ

0.9985 45095 1.51 4.1195 PASS FAIL FAIL

1.997 96980 2.80 8.8592 PASS PASS FAIL

2.996 140649 3.68 12.8484 PASS PASS PASS

3.994 190242 5.00 17.3788 PASS PASS PASS

Replikasi 4

Kadar Teoritis Kafein AUC Kafein Kadar Terukur S/N LOD LLOQ LOQ

0.9850 54419 1.65 4.9712 PASS FAIL FAIL

1.970 96277 3.08 8.7950 PASS PASS FAIL

2.955 171130 4.75 15.6329 PASS PASS PASS

3.940 219945 6.07 20.0922 PASS PASS PASS

Replikasi 5

Kadar Teoritis Kafein AUC Kafein Kadar Terukur S/N LOD LLOQ LOQ

0.9860 43212 1.35 3.9475 PASS FAIL FAIL

1.972 86296 2.63 7.8832 PASS PASS FAIL

2.958 164644 4.56 15.0404 PASS PASS PASS

3.944 186556 4.95 17.0421 PASS PASS PASS

SD CV << PRESISI

1 1.867237327 0.545365266 29.21%

2 2.798606774 0.263655285 9.42% LOD

3 4.000028569 0.624624491 15.62% LLOQ

4 4.955392238 0.720697993 14.54% LOQ

Kadar TerukurKonsentrasi kafein (ppm)

Rata-Rata

Kadar Terukur

PENENTUAN LOD LLOQ DAN LOQ

PRESISI KADAR TERUKUR LOD, LLOQ, DAN LOQ

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Echo
Textbox
44
Echo
Accepted set by Echo
Page 62: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

Lampiran 35. Perhitungan Akurasi dan Presisi Intraday

Konsentrasi Kafein Replikasi AUC Kafein AUC Asetanilida AUC Kafein : AUC Asetanilida Kadar Teoritis Kafein Kadar Terukur Kafein Akurasi SD CV

1 218689 486183 0.45 5.937 7.11 119.71%

2 247703 546344 0.45 5.757 7.16 124.39%

3 223421 557534 0.40 5.964 6.37 106.74%

4 212419 525933 0.40 6.078 6.41 105.52%

5 286053 557749 0.51 5.958 8.06 135.28%

534748.6 Rata-rata 118.33%

Konsentrasi Kafein Replikasi AUC Kafein AUC Asetanilida AUC Kafein : AUC Asetanilida Kadar Teoritis Kafein Kadar Terukur Kafein Akurasi SD CV

1 486872 600099 0.81 11.874 12.57 105.85%

2 400756 455324 0.88 11.514 13.61 118.19%

3 502430 617906 0.81 11.928 12.60 105.60%

4 468085 529341 0.88 12.156 13.67 112.46%

5 487243 567683 0.86 11.916 13.28 111.43%

554070.6 Rata-rata 110.70%

Konsentrasi Kafein Replikasi AUC Kafein AUC Asetanilida AUC Kafein : AUC Asetanilida Kadar Teoritis Kafein Kadar Terukur Kafein Akurasi SD CV

1 613976 536598 1.14 16.8215 17.60 104.61%

2 631545 571517 1.11 16.3115 17.01 104.25%

3 680469 546341 1.25 16.898 19.13 113.19%

4 584426 486586 1.20 17.221 18.46 107.17%

5 654271 537638 1.22 16.881 18.70 110.75%

535736 Rata-rata 107.99%

4.73%

9.83%

4.07%

Akurasi Presisi Intraday

6 ppm

12ppm

17ppm

AKURASI PRESISI

0.69

0.53451

0.8601

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Echo
Textbox
45
Echo
Accepted set by Echo
Page 63: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

46

Lampiran 36. Perhitungan Presisi Interday 1

Lampiran 37. Perhitungan Presisi Interday 2

Konsentrasi Kafein Replikasi AUC Kafein AUC Asetanilida AUC Kafein : AUC Asetanilida Kadar terukur SD CV

1 235941 521931 0.45 7.14

2 260523 578433 0.45 7.12

3 212343 541747 0.39 6.23

4 245594 565934 0.43 6.87

5 195945 519085 0.38 6.01

RATA-RATA 6.67

Konsentrasi Kafein Replikasi AUC Kafein AUC Asetanilida AUC Kafein : AUC Asetanilida Kadar terukur SD CV

1 395785 536690 0.74 11.45

2 476863 585690 0.81 12.61

3 477027 556130 0.86 13.27

4 502809 552192 0.91 14.07

5 476438 553514 0.86 13.31

RATA-RATA 12.94

Konsentrasi Kafein Replikasi AUC Kafein AUC Asetanilida AUC Kafein : AUC Asetanilida Kadar terukur SD CV

1 666889 586638 1.14 17.48

2 665592 556619 1.20 18.38

3 620365 508083 1.22 18.76

4 664920 535979 1.24 19.05

5 687626 561919 1.22 18.80

RATA-RATA 18.49

PRESISI INTERDAY 1Presisi Interday I

6 ppm

12ppm

17ppm 0.6135 3.3173%

0.5196 7.7851%

0.9799 7.5710%

Konsentrasi KafeinReplikasi AUC Kafein AUC Asetanilida AUC Kafein : AUC Asetanilida Kadar Terukur SD CV

1 234716 508160 0.46 7.29

2 210522 552409 0.38 6.07

3 210733 488068 0.43 6.83

4 217173 501269 0.43 6.86

5 194011 467566 0.41 6.58

Rata-Rata 6.73

Konsentrasi KafeinReplikasi AUC Kafein AUC Asetanilida AUC Kafein : AUC Asetanilida Kadar Terukur SD CV

1 465726 505947 0.92 14.22

2 472280 506620 0.93 14.39

3 435047 493303 0.88 13.63

4 455232 506992 0.90 13.88

5 385496 508387 0.76 11.77

Rata-Rata 13.58

Konsentrasi KafeinReplikasi AUC Kafein AUC Asetanilida AUC Kafein : AUC Asetanilida Kadar Terukur SD CV

1 600790 535982 1.12 15.93

2 640693 511024 1.25 17.74

3 628650 509703 1.23 17.47

4 650267 505442 1.29 18.19

5 651041 506450 1.29 18.18

Rata-Rata 17.50

6 ppm

12ppm

17ppm

PRESISI INTERDAY 2

0.9284 5.3044%

0.4470 6.6456%

1.0545 7.7662%

Presisi Interday II

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Page 64: VALIDASI METODE BIOANALISIS KAFEIN DALAM SAMPEL … · pengertian, bantuan, dan suka ... kadar kafein dalam sampel darah orang jawa dengan valid dan reliabel. ... Polimorfisme genetik

47

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul “Validasi Metode Bioanalisis Kafein dalam

Sampel Darah Orang Jawa dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi Fase Terbalik” yang memiliki nama lengkap Suryatmoko

Agung, lahir di Lubuklinggau pada tanggal 5 Februari 1996. Penulis

merupakan anak pertama dari empat bersaudara, dari pasangan Johan

Wijaya dan Cynthia Ratna Dewi Tan. Pendidikan formal yang pernah

ditempuh oleh penulis adalah TK Xaverius Lubuklinggau (1999-2001),

pendidikan tingkat Sekolah Dasar di SD Xaverius Lubuklinggau (2001-

2007), pendidikan tingkat Sekolah Menengah Pertama di SMP Xaverius

Lubuklinggau (2007-2010), pendidikan tingkat Sekolah Menengah Atas di SMA Xaverius

Lubuklinggau (2010-2013). Penulis kemudian melanjutkan pendidikan sarjana di Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta (2013). Penulis aktif dalam berbagai

kepanitiaan, organisasi, serta kegiatan semasa menempuh pendidikan sarjana, antara lain

Kepanitiaan Acara Seminar Vegetarian Gobind Vashdev “Your Health, Your Happiness

2013” sebagai divisi konsumsi, Kepengurusan GMCBP 2014/2015 di Vihara Buddha Prabha

sebagai Koordinator Puja, Kepanitiaan Waisak GMCBP 2558 BE/2014 “Buddha Memimpin

Kita Hidup Berkesadaran” sebagai Koordinator Puja, Kepanitiaan Inisiasi Universitas

Sanata Dharma (Insadha) 2014 sebagai Anggota Divisi Medis, Kepanitiaan Makrab

GMCBP 2014 “Have Fun with Kalyanamitta” sebagai divisi konsumsi, Kepanitiaan Cara

Belajar Insan Aktif (CBIA) 2015 sebagai Koordinator divisi PubDekDok. Penulis juga

berperan aktif sebagai asisten praktikum yakni asisten praktikum Kimia Dasar 2015/2016.

Penulis juga aktif dalam organisasi fakultas, yakni Herbal Garden Team dan UKF

Badminton. Penulis juga pernah terlibat sebagai ketua tim dalam Program Kreativitas

Mahasiswa Pengabdian Masyarakat yang didanai Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI