Valorizzazione dei prodotti agroalimentari di qualitàValorizzazione dei prodotti agroalimentari di qualità

Qualità e Sicurezza Chimica. Qualità e Sicurezza Chimica.

Concetti di base e Concetti di base e

tecniche analitichetecniche analitiche

La chimica analitica ed il suo impatto La chimica analitica ed il suo impatto sul comparto alimentaresul comparto alimentare

Dr. Manuel SergiDr. Manuel Sergi

msergi@unite.itmsergi@unite.it

Gli sforzi congiunti di tossicologi, epidemiologi, chimici (che da una parte creano il rischio e dall’altra cercano di porvi rimedio...) hanno portato negli anni ad una migliore comprensione dei fenomeni tossici

La limitazione del rischio correlato con sostanze tossiche avviene attraverso:

•Strumenti legislativi•Tecniche analitiche

Ricerca e Food Safety

Tipologie StrumentaliTipologie Strumentali

Nel controllo di processi (industriali) lo sviluppo tecnologico e Nel controllo di processi (industriali) lo sviluppo tecnologico e la ricerca applicata è maggiormente centrata sui sensori (varie la ricerca applicata è maggiormente centrata sui sensori (varie tipologie)tipologie)

Per il controllo di sostanze nocive ai sensori vengono Per il controllo di sostanze nocive ai sensori vengono affiancate anche tecniche strumentali più complesse, che affiancate anche tecniche strumentali più complesse, che consentono di ottenere maggiori informazioni quali-consentono di ottenere maggiori informazioni quali-quantitative, con la possibilità di valutare quantità molto piccole quantitative, con la possibilità di valutare quantità molto piccole

Questa caratteristica è molto importante in quanto alcune Questa caratteristica è molto importante in quanto alcune sostanze hanno una tossicità elevata già a bassissime sostanze hanno una tossicità elevata già a bassissime concentrazioni (pesticidi, endocrines disruptor...)concentrazioni (pesticidi, endocrines disruptor...)

SICUREZZA ALIMENTARESICUREZZA ALIMENTARE

RESIDUIRESIDUI

TRATTAMENTITRATTAMENTI CONTAMINAZIONICONTAMINAZIONI

ANIMALIANIMALI VEGETALIVEGETALI NATURALINATURALI ANTROPICHEANTROPICHE

CONTAMINAZIONICONTAMINAZIONI

NATURALINATURALI ANTROPICHEANTROPICHE

•MICOTOSSNINE•FUNGHI TOSSIGENI

•MICOTOSSNINE•FUNGHI TOSSIGENI

•POLICLOROBIFENILI (PCB)•DIOSSINE

•IDROCARBURI POLICICLICI AROMATICI(IPA)

•POLICLOROBIFENILI (PCB)•DIOSSINE

•IDROCARBURI POLICICLICI AROMATICI(IPA)

TRATTAMENTI(ANIMALI)

TRATTAMENTI(ANIMALI)

AUXINICIAUXINICI ANTIBATTERICIANTIBATTERICI FARMACI VARIFARMACI VARI

ORMONIBETA-AGONISTI

CORTICOSTEROIDITIREOSTATICI

ORMONIBETA-AGONISTI

CORTICOSTEROIDITIREOSTATICI

ANTIBIOTICISULFAMIDICIANTIBIOTICISULFAMIDICI

TRATTAMENTI(VEGETALI)

TRATTAMENTI(VEGETALI)

PESTICIDIPESTICIDI CONSERVANTICONSERVANTI STABILIZZANTISTABILIZZANTI

INSETTICIDIERBICIDI

FUNGICIDI

INSETTICIDIERBICIDI

FUNGICIDI

ANTIMICROBICIANTIOSSIDANTICONSERVANTI II

ANTIMICROBICIANTIOSSIDANTICONSERVANTI II

GELIFICANTI ADDENSANTICOLORANTI

GELIFICANTI ADDENSANTICOLORANTI

Gli Ormoni

• Vengono secreti dalle ghiandole degli animali superiori

• Regolano lo sviluppo, la crescita, la riproduzione, il comportamento

• Molecole naturali e sintetiche vengono usate in campo zootecnico per incrementare le rese produttive

Meccanismo di Azione

Agiscono su specifici recettori situati nel citoplasma delle cellule bersaglio per dare effetti:

• Anabolizzanti

• Progestinici

• Estrogeni

Effetto AnabolicoSTIMOLAZIONE DELLA PREIPOFISI

AUMENTO PRODUZIONE ORMONE SOMATOTROPO

MAGGIORE DISPONIBILITA’ DI AMMINOACIDI

INCREMENTO SINTESI PROTEICA

ACCRESCIMENTO TESSUTI

Progestinici

• Favoriscono la gravidanza

• Regolano l’estro

• Favoriscono l’aumento di peso

Esempi di studi sugli effetti di tali sostanze:

• In animali da allevamentoMcDonald, Farmacologia Veterinaria, 1987

• Su atleti dopatiPedròn, Life Sciences, 2001

Pedròn, Fertility and Sterility, 2000

• Testosterone nei bambini (holy terror)Dabbs, Personality and Individual Diff., 2000

• Terapia in AIDS Wasting SyndromeStrawford, Nutrition, 1997

SO2NHX

NHR

SULFAMIDICI

COOH

NH2

ACIDO p-AMINOBENZOICO (PABA)

SULFAMIDICI: MECCANISMO DI AZIONE

PABA +

PTERIDINA

ACIDO DIIDRO-

PTEROICO

ACIDO TETRA-FOLICO

RISCHI TOSSICOLOGICI LEGATI ALL’ASSUNZIONE DI RESIDUI ANTIBIOTICI

NEGLI ALIMENTI DI ORIGINE ANIMALE

1. RISCHI TOSSICOLOGICI DIRETTI

FENOMENI TOSSICI SENSIBILIZZAZIONE EFFETTI CANCEROGENI, MUTAGENI, TERATOGENI

2. RISCHI TOSSICOLOGICI INDIRETTI

ANTIBIOTICO-RESISTENZA

2377/90/CE

22/96/CE

23/96/CE

508/99/CE

657/02/CEMolte sostanze usate in zootecnia come promotori della crescita sono state messe al bando o ne è stato limitato l’utilizzo

NormativaLa UE ha creato un quadro normativo molto severo nel campo della sicurezza alimentare con una serie di provvedimenti atti a tutelare la salute dei consumatori

Sono state fissate regole precise per i controlli sia a livello di produzione che di distribuzione

The FDA (Food and Drug Administration ) established as acceptable levels in animal tissue the following concentrations:

USA LegislationUSA Legislation

• 0.120 ppb for oestradiol • 3.00 ppb for progesterone• 0.64 ppb for testosterone

ALLEGATO I DELLA DIRETTIVA 96/23/CE

CATEGORIA A - Sostanze a effetto anabolizzante e sostanze non autorizzate 1) Stilbeni, loro derivati e loro sali e esteri2) Agenti antitiroidei3) Steroidi4) Lattoni dell'acido resorcilico (compreso lo zeranolo)

CATEGORIA B - Medicinali veterinari e agenti contaminanti 1) Sostanze antibatteriche, compresi sulfamidici, chinoloni2) Altri prodotti medicinali veterinari3) Altre sostanze e agenti contaminanti per l'ambiente

Chimica AnaliticaChimica Analitica La La chimica analiticachimica analitica è la branca della è la branca della chimicachimica che copre le che copre le

attività volte all'identificazione, alla caratterizzazione chimico-attività volte all'identificazione, alla caratterizzazione chimico-fisica e alla determinazione qualitativa e quantitativa dei fisica e alla determinazione qualitativa e quantitativa dei componenti di un determinato campionecomponenti di un determinato campione

analisi qualitativaanalisi qualitativa: rivela la presenza e l'identità chimica : rivela la presenza e l'identità chimica dell'analita in un campione dell'analita in un campione

analisi quantitativaanalisi quantitativa: stabilisce in termini numerici la : stabilisce in termini numerici la quantità di uno o più analiti in un campione quantità di uno o più analiti in un campione

limite di rivelabilitàlimite di rivelabilità: è la minima quantità di analita : è la minima quantità di analita determinabile per mezzo di una tecnica analitica determinabile per mezzo di una tecnica analitica

Riferibilità: “proprietà del risultato di una misura che attesta una relazione con riferimenti stabiliti, generalmente campioni nazionali o internazionali, attraverso una catena ininterrotta di confronti, ognuno dei quali presenta un’incertezza definita”

Validazione: “conferma sostenuta da evidenze oggettive, che i requisiti relativi ad una specifica utilizzazione o applicazione prevista, sono stati soddisfatti”

Ricerca in Chimica analiticaRicerca in Chimica analitica

Le innovazioni volte a massimizzare le prestazioni analitiche Le innovazioni volte a massimizzare le prestazioni analitiche delle metodiche di conferma, in termini di delle metodiche di conferma, in termini di limite di rivelabilità e limite di rivelabilità e di capacità di identificazione,di capacità di identificazione, hanno una ricaduta diretta sulla hanno una ricaduta diretta sulla qualità della vita. qualità della vita.

Non si tratta solo di ricerche speculative, ma una migliore Non si tratta solo di ricerche speculative, ma una migliore qualità delle metodiche analitiche porta come conseguenza qualità delle metodiche analitiche porta come conseguenza una maggiore conoscenza in campo ambientale, una maggiore conoscenza in campo ambientale, merceologico, biomedico, etc.merceologico, biomedico, etc.

-METODI DI SCREENING: si tratta di metodi usati per rivelare la presenza di un analita o di una classe di analiti alla concentrazione che interessa. Questi metodi hanno un’elevata produttività e vengono usati per selezionare ampi quantitativi di campioni potenzialmente positivi. Il loro scopo è quello di evitare risultati erroneamente negativi.

- METODI DI CONFERMA: si tratta di metodi che forniscono informazioni complete o complementari che consentono l’identificazione dell’analita con certezza, alla concentrazione che interessa. Questi metodi sono intesi ad evitare risultati erroneamente positivi, nonché ridurre il più possibile risultati erroneamente negativi.

 

2.2. METODI DI SCREENING

In ottemperanza alla direttiva 96/23/CE, sono utilizzate per finalità di screening solo quelle tecniche analitiche la cui validazione può essere dimostrata in modo documentato e rintracciabile e che hanno un tasso di falsi conformi inferiore al 5 % (errore β) al livello di interesse.

Nel caso di un sospetto risultato non conforme, tale risultato è confermato per mezzo di un metodo di conferma.

2.3. METODI DI CONFERMA PER RESIDUI E CONTAMINANTI ORGANICI

I metodi di conferma per i residui o i contaminanti organici devono fornire informazioni sulla struttura chimica dell'analita.

Di conseguenza, i metodi basati esclusivamente sull'analisi cromatografica senza l'uso della rilevazione spettrometrica non sono adeguati all'impiego come metodi di conferma senza il ricorso ad altri metodi.

Se una singola tecnica non dispone di sufficiente specificità, la specificità desiderata deve essere ottenuta per mezzo di procedure analitiche consistenti in combinazioni adeguate.

Precisione e AccuratezzaPrecisione e Accuratezza

I termini I termini precisioneprecisione e e accuratezzaaccuratezzasono messi in sono messi in relazione con gli errori casuali e sistematici.relazione con gli errori casuali e sistematici.

Una misura è tanto più Una misura è tanto più precisaprecisa quanto più i singoli valori quanto più i singoli valori misurati in condizioni di misurati in condizioni di ripetitibilità ripetitibilità si concentrano intorno alla si concentrano intorno alla

media della serie di misure effettuate.media della serie di misure effettuate. La variabilità dei risultati viene quantificata nella deviazione La variabilità dei risultati viene quantificata nella deviazione

standard. standard. Si preferisce quantificare la precisione con il coefficiente di Si preferisce quantificare la precisione con il coefficiente di

variazione, in genere espresso in percentuale.variazione, in genere espresso in percentuale.

L'L'accuratezzaaccuratezza esprime invece l'assenza di errori sistematici esprime invece l'assenza di errori sistematici

nella misura:nella misura: una misura è tanto più accurata quanto più la media delle misure una misura è tanto più accurata quanto più la media delle misure

si approssima al valore vero della grandezza. si approssima al valore vero della grandezza. Anche l'accuratezza è spesso espressa come rapporto fra l'errore Anche l'accuratezza è spesso espressa come rapporto fra l'errore

sistematico e il valore della grandezza. sistematico e il valore della grandezza.

Precisione e accuratezza

Esempi di risultati ottenuti da misure di diverso grado di precisione e di accuratezza. Ad esempio il caso b) mostra misure effettuate con maggiore precisione, ma con peggiore accuratezze del caso c). Il caso d) è quello peggiore sia per quanto riguarda la precisione che l'accuratezza.

La Funzione GaussianaLa Funzione Gaussiana

Una Una funzione gaussianafunzione gaussiana è una è una funzionefunzione della della seguente forma:seguente forma:

dove µ e σ rappresentano la popolazione media e lo scarto quadratico medio (o deviazione standard). L'equazione della funzione di densità è costruita in modo tale che l'area sottesa alla curva rappresenti la probabilità. Perciò, l'area totale è uguale a 1.

La distribuzione normaleLa distribuzione normale

La La deviazione standarddeviazione standard

La La deviazione standarddeviazione standard o o scarto quadratico medioscarto quadratico medio è è una misura della variabilità di una una misura della variabilità di una variabilevariabile casualecasuale ed ed ha la stessa unità di misura dei valori osservati.ha la stessa unità di misura dei valori osservati.

In pratica misura la dispersione dei dati intorno al valore In pratica misura la dispersione dei dati intorno al valore atteso.atteso.

                             dove                                 è la media aritmetica.

La La deviazione standarddeviazione standard Se si conosce solo un campione della popolazione, si sostituisce il Se si conosce solo un campione della popolazione, si sostituisce il

fattore 1 / fattore 1 / nn con 1 / ( con 1 / (nn − 1), ottenendo come nuova definizione: − 1), ottenendo come nuova definizione:

A partire dalla deviazione standard si definisce anche la deviazione standard relativa come il rapporto tra σx e la media aritmetica dei valori:

COMMISSION DECISION 2002/657/CECOMMISSION DECISION 2002/657/CE 12 august 2002

on analytical methods performance

2.3 CONFIRMATORY METHODS FOR RESIDUES AND ORGANIC POLLUTANTS

… method based only on chromatographic analysis without spectrometric detection are not suitable as confirm methods …

Identification Points (Ips):

LR-MSn

HR-MSn

•Precursor Ion 1

•Product Ion 1.5

•Precursor Ion 2

•Product Ion 2.5

Develope an Analytical MethodDevelope an Analytical Method

• Extraction

• Analysis

Metodi analitici tradizionali

• Estrazione liquido/liquido (L/L) e analisi gascromatografica

(Busico, J.of H. R. Chrom., 1992)

• Estrazione (L/L) e determinazione in LC/MS

(Joos, Anal. Chem.,1999)

• Pretrattamento del campione, SPE, LC-MS/MS

(Draisci, J.Chromat., 2000)

Estrazione MSPDDispersione della Matrice in

Fase Solida:• Omogeneizzazione• Disgregazione cellulare• Purificazione

Vantaggi:• Procedura rapida e

semplice• Basso consumo di solventi

Procedura di EstrazioneProcedura di Estrazione

ASE (Accelerated Solvent Extraction)

Diagramma a blocchi di un generico spettrometro di massa.

Il campione, immesso nello spettrometro dal dispositivo d’introduzione viene ionizzato nella sorgente dando luogo ad un fascio di ioni positivi o negativi che vengono separati dall’analizzatore di massa in funzione al rapporto m/z e rivelati da un detector che trasforma il fascio ionico in un segnale elettrico; quest’ultimo viene registrato ed elaborato da un computer in uno spettro di massa

Spettrometria di massa tandem

• La Spettrometria di Massa MS/MS è una tecnica analitica potente ed altamente specifica

• Le molecole vengono ionizzate in una sorgente, che immette il flusso ionico nell’analizzatore

• Il sistema a quadrupoli seleziona le masse di interesse e le conduce al rivelatore (CEM)

• Questa tecnica consente di raggiungere livelli di sensibilità elevatissimi, quindi risulta essere particolarmente adatta per la ricerca di residui in tracce

Strumenti a Quadrupolo

Ionizzazione a Pressione Atmosferica

APCI

ESI

Meccanismo Triplo Quadrupolo

•Il primo quadrupolo (Q1) seleziona lo Ione Precursore

•Il secondo quadrupolo agisce come cella di frammentazione attraverso la collisione con molecole di Azoto

•Il terzo quadrupolo seleziona i frammenti di interesse per una identificazione inequivocabile

QqTOF SCHEME

ANALITAANALITA QqQQqQ QqTOFQqTOFTRENBTRENB 0.390.39 0.440.44

TESTTEST 0.060.06 0.350.35

TEST-MTEST-M 0.090.09 0.280.28

MELMEL 0.060.06 0.120.12

PROGPROG 0.150.15 0.560.56

TEST-PTEST-P 0.090.09 0.620.62

DES-PDES-P 0.480.48 1.301.30

-ZER-ZER 0.210.21 0.550.55

-ZER-ZER 0.180.18 0.480.48

-ESTR-ESTR 0.360.36 0.920.92

-ESTR-ESTR 0.390.39 0.980.98

DESDES 0.120.12 0.580.58

LOQ LOQ COMPARATI COMPARATI TRA IL TRIPLO TRA IL TRIPLO QUADRUPOLO QUADRUPOLO vs vs QUADRUPOLO/ QUADRUPOLO/ TOF (ng/g)TOF (ng/g)

ORMONI

ANALITA OMOGENEIZZATO CARNE FRESCAMSPD ASE MSPD ASE

SPD 0.13 1.2 0.20 1.4

SDZ 0.10 0.8 0.20 1.6

SMX 0.08 1.4 0.33 2.6

SMR 0.10 1.5 0.35 1.9

SMO 0.14 1.1 0.28 1.1

SMT 0.09 0.4 0.10 1.1

SIM 0.12 1.7 0.25 1.7

SMZ 0.08 1.6 0.28 2.1

SMP 0.10 0.4 0.20 0.7

SMM 0.13 0.9 0.23 0.9

SCP 0.06 0.5 0.13 1.3

SQX 0.08 1.2 0.25 1.2

SDM 0.10 0.5 0.23 0.6

LOQ (ng/g)SOLFONAMMIDI

TEST

Concentartion (ng/g)

0 50 100 150 200 250 300

Sig

nal

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

MATRIX MATCHED CALIBRATION

HOM

MEAT

SOL

COSA SONO GLI OGM

SONO ORGANISMI VIVENTI,ANIMALI E PIANTE,”IL CUI MATERIALE GENETICO E’ STATO MODIFICATO IN MODO

DIVERSO DA QUANTO SI VERIFICA IN NATURA MEDIANTE UN INCROCIO O CON LA RICOMBINAZIONE GENETICA

NATURALE” (DL 3/3/93 N°92)

CONSEGUENZE• PATRIMONIO GENETICO DIVERSO

NELL’ORGANISMO MODIFICATO• SINTESI DI NUOVE PROTEINE O ENZIMI CHE ESPRIMONO LE CARATTERISTICHE RICERCATE

QUALI E QUANTI SONO IN QUALI E QUANTI SONO IN COMMERCIOCOMMERCIO

66%

25%

6% 3%

• RESISTENZA A RESISTENZA A

DISERBANTI DISERBANTI

(MAIS,SOIA,COLZA)(MAIS,SOIA,COLZA)

• RESISTENZA AGLI RESISTENZA AGLI

INSETTI INSETTI

(PATATA,POMODORO)(PATATA,POMODORO)

• PRODUZIONE GRASSI PRODUZIONE GRASSI

INSATURI (COLZA)INSATURI (COLZA)

• RESISTENZA A RESISTENZA A

FUNGHI: (TABACCO)FUNGHI: (TABACCO)

PAESI PRODUTTORIPAESI PRODUTTORI

0

10

20

30

40

50

60

70

80

USA ARGEN CAN CINA UE

OLTRE 52 OGM AUTORIZZATI:61% COTONE54% SOIA25% MAIS

SI PREVEDE UN’ESPANSIONE DELLE COLTIVAZIONI IN: INDIA,AUSTRALIA FILIPPINE E SUDAFRICA

POSIZIONI DIVERGENTI:POSIZIONI DIVERGENTI:

EUROPAEUROPA PRINCIPIO PRINCIPIO PRECAUZIONALEPRECAUZIONALE

USAUSA((CANADA,ARGENTINA,CANADA,ARGENTINA,AUSTRALIA)AUSTRALIA)

PRINCIPIO PRINCIPIO SOSTANZIALESOSTANZIALEEQUIVALENZAEQUIVALENZA

METODICHE ANALITICHE PER OGM

PCR(POLYMERASE CHAIN REACTION)

DETERMINA LE MODIFICAZIONI A LIVELLO DEL DNA

HRMS*(SPETTROMETRIA DI MASSA AD ALTA RIS.)

DETERMINA LE MODIFICAZIONI A LIVELLO PROTEICO

*SPERIMENTALE