LA SAPIENZA UNIVERSITA’ DI ROMA

DOTTORATO DI RICERCA IN CHIRURGIA

XXV Ciclo

Tesi di Dottorato

“VALUTAZIONE DI PTEN E Nm23 QUALI FATTORI

PROGNOSTICI ED INDICATORI DI REMISSIONE

NEL CANCRO DELLA MAMMELLA STADIO T1”

Tutor: Dottorando:

Prof. Antonio Bolognese Dott. Federico Pugliese

A.A. 2012-2013

2

INDICE

INTRODUZIONE Pag. 3

1.1 Aspetti generali 3

1.2 PTEN e Nm23: struttura e funzione 5

1.3 Alterazioni di PTEN e Nm23 nella patologia neoplastica 9

SCOPO DELLA RICERCA 11

MATERIALI E METODO 12

RISULTATI 16

DISCUSSIONE 18

CONCLUSIONI 24

ICONOGRAFIA 26

BIBLIOGRAFIA 35

3

INTRODUZIONE

1.1 Aspetti generali

Il carcinoma della mammella costituisce, nei paesi occidentali, la

prima causa di morte per tumore nel sesso femminile e la prima causa

assoluta di mortalità fra i 40 e 60 anni.2 L’incidenza è in lieve e

costante aumento, mentre la mortalità ha fatto registrare una

inversione di tendenza, con una riduzione di circa l’8%.3 Questa

diminuzione di mortalità è legata ai progressi della terapia chirurgica

e radiante e, soprattutto, all’uso di trattamenti adiuvanti sempre più

efficaci.

In accordo con la settima edizione dell’American Joint Committe on

Cancer (2009) sono definiti T1 i tumori che hanno una dimensione

massima di 2 cm e sono ulteriormente divisi in base al diametro in:

T1mic (microinvasione < 0,1 cm nella dimensione massima), T1a (tra

0,1cm e 0,5 cm), T1b (tra 0,6 cm e 1 cm) e T1c (tra 1,1 cm e 2 cm). Il

numero delle diagnosi di carcinoma della mammella in stadio T1 è

notevolmente aumentato negli ultimi anni grazie all’uso della

mammografia di screening. Secondi i dati del programma SEER

(Surveillance, Epidemiology and End Results) il tasso di tumori T1

4

diagnosticati nelle donne tra 50 e 60 anni è passato dal 42.5% nel

2005 al 56.2% nel 2008. Come dimostrato dalla meta-analisi dell’

Early Breast Cancer Trialist’s Collaborative Group (EBCTCG)1, la

prognosi di queste neoplasie in fase iniziale migliora

significativamente in termini di sopravvivenza con l’impiego della

terapia adiuvante, chemioterapia e ormonoterapia, la cui finalità è

l’eradicazione delle micrometastasi occulte, presenti alla diagnosi nel

25-30% delle pazienti N0 e nel 75% delle pazienti N+, e responsabili

nel tempo della ripresa di malattia. La selezione delle pazienti che

potranno ottenere beneficio dalla terapia adiuvante è guidata dai

fattori prognostici, quali lo stato linfonodale, le dimensioni tumorali,

il grado istologico, i marcatori di proliferazione, l’istotipo, lo stato

recettoriale.

La ricerca di altri fattori prognostici è fondamentale per una più

accurata selezione delle pazienti con tumori in fase iniziale da

destinare alla terapia adiuvante dopo trattamento locale. In

quest’ottica PTEN e Nm23 sono state considerate in questo studio

quali possibili nuovi fattori prognostici nelle pazienti con tumore T1 .

5

1.2 PTEN e Nm23: struttura e funzione

Il gene PTEN (Phosphatase And Tensin Homolog), localizzato sul

cromosoma 10q23, codifica per una fosfatasi lipidica di 403

aminoacidi che gioca un ruolo fondamentale nella regolazione del

ciclo cellulare e dei meccanismi di apoptosi23

. PTEN si oppone ai

meccanismi di trasduzione del segnale mediati dalla fosfatidilinositolo

3 chinasi (PI -3K) mediante la defosforilazione del

fosfatidilinositolo3,4,5 trifosfato (PIP3) in fosfatidilinositolo 4,5

bifosfato (PIP2). Il PIP3 lega con elevata affinità i domini PH

(Pleckstrin Homology) di diverse proteine citosoliche, la più

importante delle quali è la serin-treoninchinasi Akt, nota anche come

proteinchinasi B (PKB)22

. L’interazione di PIP3 con i domini PH di

Akt ne consente la doppia fosforilazione tra altre due chinasi, PDK1 e

PDK2. Una volta attivata, Akt provvede a fosforilare una serie di

proteine substrato con vari effetti sulla cellula, tra cui inibizione

dell’apoptosi e stimolazione della crescita e proliferazione cellulare24

.

Studi su cellule staminali embrionali hanno dimostrato che mutazioni

inattivanti il gene PTEN si associano ad un incrementato tasso di

proliferazione cellulare, con accelerata transizione dalla fase G1 alla

6

fase S del ciclo cellulare. Il gene PTEN agisce pertanto come

oncosoppressore, mantenendo bassa la concentrazione intracellulare di

PIP3 nelle cellule che si trovano in stato di quiescenza (Fig.5).

Il gene Nm23 appartiene alla categoria dei “geni soppressori di

metastasi” ed è stato scoperto per la prima volta da Stegg nel 1988 su

cellule di melanoma murino37

. Le metastasi rappresentano la più

comune causa di morte per cancro. La cascata metastatica è un

processo complesso e richiede l’attivazione o l’inattivazione di

numerosi geni nelle varie fasi della progressione neoplastica (Fig.6).

Nell’uomo sono stati identificati 10 geni che appartengono alla

famiglia di Nm23 (conosciuti anche come geni NME), dei quali i due

più espressi sono Nm23H1 e Nm23H2 che mappano sul cromosoma

17q21.338

. Essi codificano rispettivamente per le isoforme A e B di

una proteina distribuita in maniera ubiquitaria nella cellula con attività

di nucleotide difosfatochinasi (NDPK). NDPK catalizza il

trasferimento del fosfato da un nucleoside trifosfato, come il GTP

(guanosina 5’ trifosfato), a un nucleoside difosfato accettore, come

l’ADP (adenosina 5’-difosfato) mediante un meccanismo di

transfosforilazione. Oltre all’attività di nucleotide difostatochinasi,

altre due fondamentali attività enzimatiche di Nm23 sono state

dimostrate: istidina chinasi39

e 3’-5’ esonucleasi40

. L’isoforma NDPK

7

B agisce come una istidina chinasi fosforilando la subunità delle

proteine G, contribuendo così alla regolazione dei livelli di cAMP

intracellulari. Altri substrati dell’attività di istidina chinasi di Nm23

includono l’aldolasi C, ATP citrato-liasi e la chinasi soppressore di

Ras39

. Le 3’-5’ esonucleasi sono enzimi che catalizzano l’idrolisi dei

legami fosfodiesterici del DNA iniziando la loro azione dall'estremità

OH-3' libera della catena polinucleotidica e procedendo gradualmente

in direzione 3'→5', liberando un singolo nucleoside monofosfato per

volta. L’attività di 3’-5’ DNA esonucleasi di Nm23H1 è stata

dimostrata su cellule di melanoma dove sembra giocare un ruolo

essenziale nella riparazione dei danni del DNA UV-indotti, riducendo

così l’acquisizione delle mutazioni che promuovono la transizione

delle cellule verso il fenotipo metastatico41

. L’attività di esonucleasi è

stata implicata anche nell’apoptosi mediata dai linfociti T dove Nm23

sembra agire come granzima A39,52

.

Oltre alla funzione di enzima, Nm23 interagisce fisicamente con varie

proteine modulando, in senso positivo o negativo, la loro attività.

Nm23-H1 interagisce con le proteine Rad, Tiam1 e KSR49

, coinvolte

nel pathway Ras-MAPK, suggerendo un ruolo regolatorio di Nm23

nella trasduzione del segnale mediato da Ras.

Nm23H1 potenzia l’attività di h-Prune42,53

, una proteina con funzione

8

cAMP-fosfodiesterasica, che favorisce la motilità cellulare e la

diffusione metastatica. Nm23H1 inibisce la trasmissione del segnale

mediata dal TGF- legandosi con STRAP, una chinasi che interagisce

con il recettore di TGF- . NM23H2 facilità la motilità cellulare

legando e inattivando ICAP1-a, un regolatore negativo dell’adesione

cellulare mediata dall’integrina 154

. Studi genetici hanno dimostrato

che l’omologo della drosofila di NM23, il gene Awd, è coinvolto nella

regolazione dei meccanismi di endocitosi delle vescicole sinaptiche e

del turnover degli omologhi dei recettori FGF e PDGF/VEGF. È stato

evidenziato in cellule epiteliali umane che l’espressione di NM23H1

facilita l’endocitosi della E-caderina durante i processi di

disassemblaggio delle giunzioni aderenti e sopprime la motilità

cellulare mediante down-regulation del recettore acido lisofosfatidico

EDG254

.

Un’ultima funzione di Nm23 sembra essere la regolazione della

trascrizione genica, come è stato evidenziato per Nm23H2 che

interagisce nel nucleo con il recettore degli estrogeni o con membri

della famiglia dei recettori nucleari orfani ROR/RZR51

.

9

1.2 Alterazioni di PTEN e Nm23 nella patologia neoplastica

Mutazioni del gene PTEN sono state riscontrate in svariate neoplasie.

Mutazioni germinali sono caratteristiche della sindrome di Cowden4,11

,

caratterizzata da amartomi multipli e da un elevato rischio di

carcinomi della mammella, endometrio e tiroide. Frequenti mutazioni

somatiche sono presenti in tumori quali i gliomi di alto grado7, il

carcinoma dell’endometrio5, del colon

6 e nel carcinoma metastatico

della prostata8. Al contrario sono poco comuni nel melanoma

15, nei

gliomi di basso grado7, nel carcinoma dell’ovaio

16 e nel carcinoma

prostatico non metastatico8.

Nel carcinoma della mammella è stato osservato che, mentre è

frequente la perdità di eterozigosità del locus di PTEN (30-40% dei

casi), le mutazioni del gene sono poco comuni (meno del 5%)9,10

.

Tuttavia numerosi studi immunoistochimici hanno dimostrato che una

ridotta espressione della proteina PTEN è presente nel 30-50% dei

casi di carcinoma della mammella18,27

. E’ stato evidenziato che la

ridotta espressione di PTEN non è dovuta soltanto a mutazioni o

delezioni del gene, ma anche a meccanismi epigenetici, come la

metilazione del promoter. In uno studio di Garcia et al17

. è stato

dimostrato che il promoter di PTEN era ipermetilato nel 48% di 90

tumori della mammella e che l’espressione dell’mRNA di PTEN era

10

più bassa nei tumori con metilazione aberrante. La correlazione tra la

metilazione del gene PTEN e la ridotta espressione della proteina

PTEN è stata dimostrata anche in tumori della cervice20

e colorettali21

.

L’espressione di Nm23 è stata valutata in diversi tipi di neoplasie e

con risultati contrastanti. Una ridotta espressione di Nm23H1 è stata

evidenziata nelle cellule metastatiche di carcinomi dello stomaco43,45

,

ovaio e utero37

, mammella48

e melanoma46

; al contrario elevati livelli

di Nm23H1 sono stati riscontrati in pazienti con neuroblastoma47

,

osteosarcoma36

e neoplasie ematologiche37

ed associati ad una

significativa riduzione di sopravvivenza.

11

SCOPO DELLA RICERCA

Questo studio ha analizzato con metodica immunoistochimica

l’espressione delle proteine PTEN e Nm23 nel tessuto neoplastico di

pazienti affette da carcinoma della mammella. Lo scopo è stato quello

di valutarne il significato prognostico nei tumori in stadio T1,

verificando la correlazione tra l’espressione tissutale di PTEN e

NM23 con altri fattori prognostici noti, quali lo stato dei linfonodi, le

dimensioni del tumore, il grado istopatologico, lo stato recettoriale, e

con la storia clinica delle pazienti.

La potenziale applicazione di questo studio potrebbe consistere

nell’impiegare PTEN e Nm23 quali possibili nuovi fattori

prognostico-predittivi per la scelta della terapia adiuvante nelle

pazienti con tumore della mammella in fase iniziale.

12

MATERIALI E METODO

Pazienti

Questo studio ha analizzato i preparati istologici di 37 pazienti con

carcinoma della mammella che sono state sottoposte ad intervento

chirurgico presso il Dipartimento di Chirurgia “Pietro Valdoni” del

Policlinico Umberto I di Roma dal Gennaio 2003 al Gennaio 2009

L’età delle pazienti era compresa tra 33 e 81 anni (mediana di 56.2

anni).

I criteri di inclusione nello studio sono stati:

1. diametro del tumore < 2 cm (T1)

2. istotipo duttale infiltrante

3. assenza di malattia metastatica alla diagnosi

4. trattamento chirurgico radicale del tumore (R0)

I parametri clinico-patologici che abbiamo correlato con l’espressione

di PTEN e NM23 sono stati: il grado istopatologico, il diametro del

tumore, lo stato dei recettori ormonali e di HER2, la presenza di

metastasi linfonodali, l’insorgenza di recidiva loco-regionale o di

metastasi a distanza.

_

13

Metodica immunoistochimica

Per l’analisi immunoistochimica sono stati utilizzati i seguenti

anticorpi: anti PTEN (monoclonale, diluizione 1:50, SPRING), anti

NM23 (monoclonale, prediluito, SCYTEK).

Lo studio immunoistochimico è stato effettuato su sezioni di 4 m di

spessore di tessuto fissato in formalina ed incluso in paraffina.

Le sezioni sono state raccolte su vetrini portaoggetti a carica positiva e

poste in stufa per 5 minuti a 50 °C e quindi sono state sparaffinate in

xilolo e reidratate utilizzando alcool a scalare fino a giungere

all’acqua corrente.

I siti antigenici sono stati messi in evidenza mediante trattamento al

calore utilizzando il forno a microonde a 750 W, per 3 cicli da 5

minuti ciascuno, in una soluzione di tampone TRIS/EDTA citrato, a

ph 7.8 per entrambi gli anticorpi, seguito poi da un periodo di

raffreddamento di 20 minuti a temperatura ambiente.

E’ stato quindi effettuato il blocco delle perossidasi endogene con un

bagno di 5 minuti in acqua ossigenata al 3%,

Dopo risciacquo con acqua distillata le sezioni sono state ricoperte con

siero normale diluito (UltraTEK HRP anti-polivalent, SCYTEK), per

14

10 minuti e poi incubate con 100 l di anticorpo primario per 30

minuti per l’anti-NM23 e 60 minuti per l’anti-PTEN a temperatura

ambiente.

Ogni vetrino, dopo risciacquo con PBS (Phosphate Buffered Saline,

tampone Fosfato in soluzione salina), per 2 volte da 5 minuti ciascuna,

é stato messo ad incubare con due/tre gocce di anticorpo secondario

biotilinato (UltraTEK HRP anti-polivalent, SCYTEK) e dopo

risciacquo con PBS é stato messo ad incubare per 10 minuti con

due/tre gocce di siero contenente il complesso Avidina/Biotina

(UltraTEK HRP anti-polivalent, SCYTEK).

Le sezioni, nuovamente risciacquate con PBS, per 2 volte da 5 minuti

ciascuna, sono state incubate per 5 minuti con soluzione di substrato

cromogeno, diaminobenzidina (DAB, UltraTEK HRP anti-polivalent,

SCYTEK) ed infine le sezioni sono state contro colorate in

ematossilina per 10 secondi, deidratate in serie alcolica crescente,

chiarificate in xilolo e montate in resina sintetica.

L’espressione di PTEN35

è stata così misurata:

- score 0: assente

- score 1: media positività

- score 2: intensa positività

15

L’espressione di Nm2348

è stata così misurata:

- score 0-3: espressione assente o lieve (< 5% delle cellule)

- score 4-6: espressione moderata (5-75%)

- score 7-9: espressione intensa (> 75%)

16

RISULTATI

Le pazienti arruolate nel nostro studio sono state sottoposte a

mastectomia (14 pazienti) o a un trattamento chirurgico conservativo

(23 pazienti).In tutti i casi l’intervento chirurgico è stato radicale (R0).

Per quanto riguarda il parametro T, 2 pazienti (5.4%) presentavano un

tumore in stadio T1a (tra 0.1 e 0.5 cm), 6 pazienti (16.21%) T1b (tra

0.5 e 1 cm) e 29 pazienti (78.37%) T1c (tra 1 e 2 cm). In 10 casi

(27.02%) erano presenti metastasi nei linfonodi ascellari (N+).

Nessuna paziente mostrava metastasi a distanza alla diagnosi.

Il grading istologico è stato G1 (neoplasia ben differenziata) in 11

pazienti (29.72%), G2 (neoplasia moderatamente differenziata) in 20

(54.05%) e G3 (neoplasia scarsamente differenziata) in 6 (16.21%).

Per quanto riguarda lo stato dei recettori ormonali e di HER2, 5

pazienti hanno riportato un assetto triplo negativo. (Tab.1)

22 pazienti hanno sono state sottoposte a RT postoperatoria. La

terapia adiuvante è stata effettuata in 34 casi. In particolare 8 pazienti

hanno ricevuto una chemioterapia, 20 ormonoterapia, 6 chemio-

ormono-terapia. Il trattamento con trastuzumab è stato effettuato in 6

casi.

17

Espressione immunoistochimica di PTEN e NM23

L’espressione immunoistochimica di PTEN è risultata normale (score

2) in 19 pazienti (51.36%), ridotta o assente (score 0-1) in 18

(48.64%). Per quanto riguarda Nm23 è risultato iperespresso (score 7-

9) in 20 pazienti (54.07%), in 11 casi (29.72%) l’immunoreattività è

stata di intensità media (score 4 - 6) e in 6 (16.21%) bassa o assente

(score 0 – 3). (Tab.2)

Follow-up

Dopo cinque anni dall’intervento chirurgico 32 pazienti sono viventi e

libere da malattia. L’espressione di PTEN era ridotta o assente (score

0-1) in 13 casi e normale (score 2) in 19; Nm23 era iperespresso

(score 9) in 20 casi, di media intensità (score 4 – 6) in 9 e bassa o

intensità (score 3) in 3.

Cinque pazienti (13,5%) hanno sviluppato una recidiva locale di

malattia. Quattro pazienti presentavano alla diagnosi metastasi ai

linfonodi ascellari; in 3 di esse PTEN e Nm23 erano entrambi assenti

(score 0). Nelle altre due pazienti Nm23 e PTEN erano entrambi

espressi ma con intensità medio-bassa (rispettivamente score 6 e1)

(Fig.1 e 2).

18

DISCUSSIONE

Lo scopo della nostra ricerca è stato quello di studiare l’espressione

immunoistochimica di PTEN e Nm23 in pazienti con carcinoma della

mammella in fase iniziale (stadio T1), al fine di verificarne una

possibile correlazione con alcuni fattori prognostici noti e la storia

clinica delle pazienti. Nella presente discussione analizzeremo

separatamente i risultati ottenuti per PTEN e Nm23 confrontandoli

con quelli della letteratura internazionale.

Nel nostro studio una ridotta o assente espressione

immunoistochimica di PTEN (score 0-1) è stata riscontrata nel 48% di

37 casi di carcinoma della mammella invasivo. Questo dato è in

accordo con quanto riportato dai lavori molti autori quali Depowski et

al. 13

(48% di 151 casi), Perren et al. 12

(33% di 33 casi), Shi et al29

.

(36% di 77 casi), Tsutsui et al. 34

(28% di 236 casi), Zhu et al.

26(35,8% di 53) e Bose et al.

14(38% di 34). In particolare nella

casistica di Bose et al. è stata evidenziato che una ridotta espressione

immunoistochimica si verifica solo nell’11% dei casi di carcinoma in

situ, suggerendo che l’inattivazione di PTEN si verifichi in uno stadio

più tardivo della progressione del tumore.

In letteratura è dimostrato che nel carcinoma della mammella invasivo

19

esiste una significativa associazione tra la perdita di espressione di

PTEN e la presenza di metastasi linfonodali e che tale associazione

assume un ruolo prognostico sfavorevole in termini di sopravvivenza.

Nella casistica di Depowski et al. il 60% dei casi di carcinoma della

mammella con N+ sono risultati PTEN negativi (p <0.001) con tasso

di recidiva di malattia del 57%13

; risultati simili sono riportati da

altri autori: Chung et al. 25

(43% di casi PTEN negativi e N+) , Tsutsui

et al. 34

(35%), Gonzalez-Angulo et al 30

(26.8%) e Zhu et al. il quale

dimostrato anche una significativa correlazione tra la perdita di PTEN

e la presenza di micrometastasi nel linfonodo sentinella (83.4%,

p<0.001) 26

.

Nel nostro studio 10 pazienti presentavano metastasi linfonodali alla

diagnosi e il 70% mostravano un’espressione immunoistochimica

ridotta o assente di PTEN (score 0-1). Inoltre 3 pazienti con N+ e

immunoistochimica negativa per PTEN (score 0) hanno sviluppato

una recidiva locale di malattia entro 5 anni dall’intervento chirurgico.

Per quanto riguarda le dimensioni del tumore e il grado istopatologico,

non è dimostrata in letteratura una correlazione significativa con la

perdita di PTEN. Tuttavia tale correlazione è stata evidenziata da

diversi autori con lo stato dei recettori ormonali e di HER2. Nella

casistica di Shi et al29

viene documentata una significativa

20

correlazione tra perdita di PTEN e recettori ER e PR negativi, con una

DFS a 3 anni del 67% rispetto al 93% dei casi con recettori positivi.

In un lavoro di Knowles et al. la perdita di PTEN è associata

significativamente (p<0.001) con il fenotipo “basal like” (ER -, PR -,

HER2 -, CK5/6+ e/o EGFR+) mentre un’espressione alta con il

fenotipo “luminale A” (ER + e/o PR +, HER2-)19

. La metilazione del

promoter di PTEN, quale causa di mancata espressione della proteina,

è stata associata ad una resistenza alla terapia con tamoxifen in

pazienti con recettori per gli estrogeni positivi33

. La perdita di PTEN è

stata inoltre associata ad una resistenza al trastuzumab in pazienti con

carcinoma della mammella metastatico con iperespressione di HER 2

e recettori ormonali negativi che hanno ricevuto il trastuzumab quale

terapia di prima linea28,31

. Nella nostra casistica cinque pazienti (13%)

si presentavano con assetto triplo negativo, di cui 2 con PTEN non

espresso (score 0) , 2 con espressione bassa (score 1) e un paziente

con score 2. Inoltre le due pazienti con score 0 hanno sviluppato una

recidiva di malattia.

In letteratura l’espressione di Nm23 è stata valutata in prevalenza su

linee cellulari metastatiche. Bal et al48

ha studiato l’espressione

immunoistochimica di Nm23 in un ampio spettro di lesioni epiteliali

della mammella, benigne e maligne, e ha dimostrato che esiste una

21

progressiva downregulation di Nm23 con l’avanzamento della

trasformazione e progressione neoplastica, fino ad arrivare ad una

perdita completa (score 0) nel fenotipo metastatico. Inoltre ha

evidenziato che esiste una significativa correlazione tra la perdita

progressiva di Nm23 con la comparsa di metastasi nei linfonodi (p <

0.001). Questa correlazione inversa tra perdita di Nm23 e la presenza

di metastasi nei linfonodi è stata dimostrata anche da altri autori:

Tokunaga et al (p < 0.01)57

, Heimann et al. 32

(p <0.05), Royds et 56

(p

< 0.01). Nel nostro studio abbiamo considerato pazienti con

carcinoma della mammella in fase iniziale, senza metastasi a distanza.

L’espressione di Nm23 è risultata nell’54% normale (score 6-9), nel

29.7% moderata (score 3-6) e solo nel 16.3% estremamente ridotta o

assente (score 0-3). Per quanto riguarda lo stato linfonodale, su 27

pazienti N0 nessuna ha presentato una perdita completa di Nm23, che

bensì è risultato normalmente espresso (score 6-9) in 18 casi (66%) e

moderatamente (score 4-6) in 9 casi (34%). Invece su 10 pazienti N+

Nm23 è risultato assente o debolmente espresso (score 0-3) in 6 casi

(60%) e normale solo in un caso. L’entità dell’espressione

immunoistochimica di Nm23 sembra avere anche un significato

prognostico. Charpin et al55

ha evidenziato che un’espressione > 3%

è correlata ad una migliore sopravvivenza libera da metastasi, in

22

pazienti con linfonodi positivi e negativi. Heimann et al.32

ha

documentato una DFS a 5, 10 e 15 anni del 91% in pazienti con

normale espressione di Nm23 e del 70% in quelli con bassa

espressione (p< 0.008). Nel nostro studio le 3 pazienti con N+ che

hanno sviluppato una recidiva di malattia presentavano una perdita

totale di Nm23 (score 0).

Come per PTEN, anche per Nm23 non è dimostrata in letteratura una

correlazione significativa con stadio e grado istologico, sebbene

Heimann et al32

abbia segnalato, in maniera non statisticamente

significativa, un trend inverso tra grado e Nm23 score.

Per quanto riguarda lo stato recettoriale, Heimann et al.32

ha

dimostrato una correlazione diretta tra la positività per gli estrogeni e

una normale espressione di Nm23 (P < 0.008). Dong et al. ed ha

evidenziato inoltre una correlazione inversa tra l’espressione negativa

di HER2 con la positività per gli estrogeni e normali livelli di Nm23.

Nel nostro studio in 24 pazienti ER+ Nm23 è risultato normalmente

espresso (score 9) nel 66.6% dei casi rispetto al 38.4% nelle pazienti

ER -. Nelle 26 pazienti HER2 negative, l’espressione di Nm23 è stata

normale (score 9) in 15 casi (57.69%).

Da quanto sopra esposto si evincono due dati importanti: 1) il

parametro clinico-patologico maggiormente correlato ad una ridotta

23

espressione PTEN e/o Nm23 è risultato essere la presenza di metastasi

nei linfonodi; 2) la contemporanea perdita completa sia di PTEN che

di Nm23 si è verificata solo nelle pazienti con linfonodi positivi che

hanno avuto successivamente una ripresa di malattia.

24

CONCLUSIONI

L’incidenza del carcinoma della mammella in fase iniziale è in

continuo aumento e il trattamento locale della malattia in questo stadio

è attualmente chirurgico conservativo. E’ oggi dimostrato che la

prognosi delle pazienti migliora significativamente con le terapie

adiuvanti, il cui impiego è condizionato dalla corretta interpretazione

dei fattori prognostici, sia clinici che patologici. L’introduzione nella

pratica clinica di nuovi fattori prognostici non può che migliorare la

selezione delle pazienti.

Lo scopo della nostra ricerca è stato quello di valutare il possibile

ruolo prognostico di PTEN e Nm23 nel carcinoma della mammella,

misurandone l’espressione nel tessuto neoplastico mediante metodica

immunoistochimica.

Il nostro studio presenta la duplice novità di aver vagliato

l’espressione di PTEN insieme a quella di Nm23 e in pazienti con

tumore esclusivamente in fase iniziale (T1) , laddove in letteratura la

maggioranza dei lavori hanno valutato separatamente questi due

marcatori e in casistiche che, sebbene più ampie, includevano anche

tumori in fase localmente avanzata o metastatica. Le conclusioni cui

siamo giunti sono le seguenti:

25

1) una ridotta espressione di PTEN e/o Nm23 è riscontrabile non solo

in tumori in fase avanzata o metastatica, ma anche nelle forme in

fase iniziale;

2) il fattore clinico-patologico che sembra maggiormente correlato ad

una ridotta espressione di PTEN e Nm23 è la presenza di metastasi

linfonodali;

3) la simultanea perdita sia di PTEN che di Nm23 in pazienti con

linfonodi positivi potrebbe costituire un fattore prognostico

importante per predire lo sviluppo di una recidiva di malattia .

Certamente il nostro si deve considerare, per la ridotta casistica, uno

studio pilota che tuttavia lascia ben sperare sulla possibilità di

validare, con ulteriori studi prospettici, il ruolo prognostico di PTEN e

Nm23 nel carcinoma della mammella.

26

ICONOGRAFIA

Tabella 1

età 33-81 (media 56.2)

quadrantectomia 23 (62.16%) mastectomia 14 (37.83%)

terapia adiuvante 34 (91.89%) chemioterapia 8 (23.52%) ormonoterapia 20 (58.82%) chemio+ormonoterapia 6 (17.64%) trastuzumab 6 (17.64%)

diametro del tumore T1a 2 (5.4%) T1b 6 (16.21%) T1c 29 (78.37%)

linfonodi N+ 10 (27.02%) N- 27 (72.97%)

grading G1 11 (29.72%) G2 20 (54.05%) G3 6 (16.21%)

Recettore estrogeni positivo 24 (68.86%) negativo 13 (35.13%)

Recettore progesterone positivo 25 (67.56%) negativo 12 (32.43%)

HER 2 (valutato con metodica IHC) positivo 11 (29.72%) negativo 26 (70.27%)

triplo negativi 5 (13.51%)

Follow-up pazienti viventi 37 liberi da malattia 32 (86.49%) con recidiva 5 (13.51%)

27

Tabella 2

espressione di PTEN

0-1 18 (48.64%) 2 19 (51.36%)

espressione di Nm23

0-3 6 (16.21%) 4-6 11 (29.72%) 7-9 20 (54.07%)

28

Tabella 3

Parametri clinici e istologici

N° casi

espressione PTEN espressione Nm23

score 0 - 1 score 2 0-3 4-6 7-9

T1a 2 - 2 - 1 1 T1b 6 2 4 2 1 3 T1c 29 16 13 4 9 16 linfonodi N+ 10 7 3 5 4 1 linfonodi N- 27 13 14 1 7 19 G1 11 4 7 - 4 7 G2 20 12 8 1 7 12 G3 6 2 4 1 2 3 estrogeni positivi 24 12 12 2 7 15 estrogeni negativi 13 7 6 4 4 5 HER 2 positivo 11 7 4 1 5 5 HER 2 negativo 26 11 15 5 6 15 triplo negativi 5 4 1 2 2 1

29

Figura 1

Figura 2

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

score 0-1 score 2

score PTEN

N+

N-

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

score 0-3 score 4-6 score 7-9

score Nm23

N+

N-

30

Figura 3

Figura 4

0,00%

20,00%

40,00%

60,00%

80,00%

100,00%

120,00%

score 0-1 score 2

score PTEN

liberi

con recidiva

0,00%

10,00%

20,00%

30,00%

40,00%

50,00%

60,00%

70,00%

score 0-3 score 4-6 score 7-9

score Nm23

liberi

con recidiva

31

Figura 5

32

Figura 6

33

Figura 7 Assenza di espressione di NM23

Figura 8 NM23 iperespresso

34

Figura 9 Presenza di PTEN

Figura 10 Assenza di espressione di PTEN

35

BIBLIOGRAFIA

1. Clarke M. Meta-analyses of adjuvant therapies for women with early

breast cancer Trialists’ Collaborative Group overview.Ann Oncol

2006;17:160-2.

2. Jemal A. Siegel R., Ward E. et al Cancer Statistics, 2009. CA Cancer J

Clin 2009; 59:225-49

3. AIRTUM Working Group. Epidemiologia & prevenzione (suppl 2)

2009.

4. Liaw D, Marsh DJ, Li J, Dahja PLM, Wang SI, Zheng Z, Bose S, Call

KM, Tsou HC, Peacocke M, Eng C, Parsons R: Germline mutations of

the PTEN gene in Cowden disease, an inherited breast and thyroid

cancer syndrome. Nat Genet 1997; 16: 64–67.

5. Minaguchi T, Yoshikawa H, Oda K, Ishino T, Yasugi T, Onda T,

Nakagawa S, Matsumoto K, Kawana K, Taketani Y: PTEN mutation

located only outside exons 5, 6, and 7 is an independent predictor of

favorable survival in endometrial carcinomas. Clin Cancer Res 2001; 7:

2636–2642.

6. Nassif NT, Lobo GP, Wu X, Henderson CJA, Morrison CD, Eng C,

Jalalludin B, Segelov E: PTEN mutations are common in sporadic

microsatellite stable colorectal cancer. Oncogene 2004; 23: 617–628.

7. Rasheed BKA, Stenzel TT, McLendon RE, Parsons R, Friedman AH,

Friedman HS, Bigner DD, Bigner SH: PTEN gene mutations are seen in

high-grade but not in low-grade gliomas. Cancer Res 1997; 57: 4187–

4190.

8. Suzuki H, Freije D, Nusskern DR, Okami K, Cairns P, Sidransky D,

Isaacs WB, Bova GS: Interfocal heterogeneity of PTEN/MMAC1 gene

alterations in multiple metastatic prostate cancer tissues. Cancer Res

1998; 58: 204–209.

36

9. Chen S, Yu S, Tsai M, Yeh K, Wang J, Kao M, Shih M, Chang J:

Mutation analysis of the putative tumor suppressor gene PTEN/MMAC1

in sporadic breast cancer. Breast Cancer Res Treat 1999; 55: 85–89.

10. Freihoff D, Kempe A, Beste B, Wappenschmidt B, Kreyer E, Hayashi

Y, Meindl A, Krebs D, Wiestler OD, von Deimling A, Schmutzler RK:

Exclusion of a major role for the PTEN tumour-suppressor gene in

breast carcinomas. Br J Cancer 1999; 79: 754–758.

11. Singh B, Ittmann MM, Krolewski JJ: Sporadic breast cancers exhibit

loss of heterozygosity on chromosome segment 10q23 close to the

Cowden disease locus. Genes Chromosomes Cancer 1998; 21: 166–171.

12. Perren A, Weng L, Boag AH, Ziebold U, Thakore K, Dahia PLM,

Komminoth P, Lees JA, Mulligan LM, Mutter GL, Eng C:

Immunohistochemical evidence of loss of PTEN expression in primary

ductal adenocarcinomas of the breast. Am J Pathol 1999; 155: 1253–

1260.

13. Depowski PL, Rosenthal SI, Ross JS: Loss of expression of the PTEN

gene protein product is associated with poor outcome in breast cancer.

Mod Pathol 2001; 14: 672–676.

14. Bose S, Crane A, Hibshoosh H, Mansukhani M, Sandweis L, Parsons R:

Reduced expression of PTEN correlates with breast cancer progression.

Hum Pathol 2002; 33: 405–409.

15. Zhou XP, Gimm O, Hampel H, Niemann T, Walker MJ, Eng C:

Epigenetic PTEN silencing in malignant melanomas without PTEN

mutation. Am J Pathol 2000; 157: 1123–1128.

16. Kurose K, Zhou X, Araki T, Cannistra SA, Maher ER, Eng C: Frequent

loss of PTEN expression is linked to elevated phosphorylated Akt levels,

but not associated with p27 and cyclin D1 expression, in primary

epithelial ovarian carcinomas. Am J Pathol 2001; 158: 2097– 2106.

37

17. Garcia JM, Silva J, Pena C, Garcia V, Rodriguez R, Cruz MA, Cantos

B, Provencio M, Espana P, Bonilla F: Promoter methylation of the

PTEN gene is a common molecular change in breast cancer. Genes

Chromosomes Cancer 2004; 41: 117–124.

18. Jones N et al Comprehensive analysis of PTEN status in breast

carcinomas Int. J. Cancer (2012)

19. Knowles E. et al PI3K pathway activation in breast cancer is associated

with the basal-like phenotype and cancer-specific mortality Int. J.

Cancer: 126, 1121–1131 (2010)

20. Cheung T, Lo KW, Yim S, Chan LK, Heung M, Chan C, Cheung AY,

Chung TK, Wong Y: Epigenetic and genetic alternation of PTEN in

cervical neoplasm. Gynecol Oncol 2004; 93: 621–627.

21. Goel A, Arnold CN, Niedzwiecki D, Carethers JM, Dowell JM,

Wasserman L, Compton C, Mayer RJ, Bertagnolli MM, Boland CR:

Frequent inactivation of PTEN by promoter hypermethylation in

microsatellite instabilityhigh sporadic colorectal cancers. Cancer Res

2004; 64: 3014–3021.

22. Sun H, Lesche R, Li DM, Ciliental J, Zhang H, Gao J, et al. PTEN

modulates cell cycle progression and cell survival by regulating

phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate and Akt/ protein kinase B

signaling pathway. Proc Natl Acad Sci U S A 1999;96:6199–204.

23. Maehama T, Dixon JE. PTEN: a tumour suppressor that functions as a

phospholipid phosphatase. Trends Cell Biol 1999;9:125–128.

24. Weng L, Brown J, Eng C. PTEN induces apoptosis and cell cycle arrest

through phosphoinositol-3-kinase/ Akt-dependent and -independent

pathways. Hum Mol Genet 2001;10:237–242.

25. Chung MJ, Jung SH, Lee BJ, Kang MJ, Lee DG (2004) Inactivation of

the PTEN gene protein product is associated with the invasiveness and

metastasis, but not angiogenesis, of breast cancer. Pathol Int 54(1):10–15

38

26. Zhu L, Loo WT, Louis WC (2007) PTEN and VEGF: possible

predictors for sentinel lymph node micro-metastasis in breast cancer.

Biomed Pharmacother 61(9):558–561

27. Allred, D.C., Harvey, J.M., Berardo, M., et al., 1998. Prognostic and

predictive factors in breast cancer by immunohistochemical analysis.

Modern Pathology 11, 155–168.

28. E. Razis et al. Evaluation of the association of PIK3CA mutations and

PTEN losswith efficacy of trastuzumab therapy in metastatic breast

cancer Breast Cancer Res Treat (2011) 128:447–456

29. Shi et al. Dysregulated pten-pkb and negative receptor status in human

breast cancer Int. J. Cancer: 104, 195–203 (2003)

30. Ana M. Gonzalez-Angulo et al PI3K pathway mutations and pten levels

in primary and metastatic breast cancer Mol Cancer Ther

2011;10:1093-1101.

31. Sgouros J et al. Correlation of nm23-H1 Gene Expression with Clinical

Outcome in Patients with Advanced Breast Cancer in vivo 21: 519-522 (2007)

32. Heimann R et al.The Relationship between nm23, Angiogenesis, and the

Metastatic Proclivity of Node-negative Breast Cancer Cancer Res

1998;58:2766-2771.

33. Shoman, N., Klassen, S., McFadden, A., et al., 2004. Reduced PTEN

expression predicts relapse in patients with breast carcinoma treated by

tamoxifen. Modern Pathology 18, 250–259.

34. Tsutsui, S., Inoue, H., Yasuda, K., et al., 2005. Reduced expression of

PTEN protein and its prognostic implications in invasive ductal

carcinoma of the breast. Oncology 68, 398–404.

35. Rita A. Sakr et al. Protocol for PTEN expression by

immunohistochemistry in formalin fixed paraffin embeded human breast

cancer. Appl Immunochem Morf Mol 2010 july 18(4) 371-374

39

36. Oda, Y., et al. (2000). Comparison of histological changes and changes

in nm23 and c-MET expression between primary and metastatic sites in

osteosarcoma: a clinicopathologic and immunohistochemical study.

Human Pathology, 31(6), 709–716.

37. Natascia Marino et al. Insights into the biology and prevention of tumor

metastasis provided by the Nm23 metastasis suppressor gene Cancer

Metastasis Rev 2012 DOI 10.1007/s10555-012-9374-8

38. Lacombe, M. L., et al. (2000). The human Nm23/nucleoside diphosphate

kinases. Journal of Bioenergetics and Biomembranes, 32 (3), 247–258.

39. Hartsough, M. T., et al. (2002). Nm23-H1 metastasis suppressor

phosphorylation of kinase suppressor of Ras via a histidine protein

kinase pathway. Journal of Biological Chemistry, 277(35), 32389–

32399.

40. Ma, D., McCorkle, J. R., & Kaetzel, D. M. (2004). The metastasis

suppressor NM23-H1 possesses 3′-5′ exonuclease activity. Journal

of Biological Chemistry, 279(17), 18073–18084.

41. Jarrett, S. G., et al. (2012). Metastasis suppressor NM23-H1 promotes

repair of UV-induced DNA damage and suppresses UVinduced

melanomagenesis. Cancer Research, 72(1), 133–143.

42. Reymond, A., et al. (1999). Evidence for interaction between human

PRUNE and nm23-H1 NDPKinase. Oncogene, 18(51), 7244–7252.

43. Muller, W., et al. (1998). Expression of nm23 in gastric carcinoma:

association with tumor progression and poor prognosis. Cancer, 83(12),

2481–2487.

44. Kapitanovic, S., et al. (2004). nm23-H1 expression and loss of

heterozygosity in colon adenocarcinoma. Journal of Clinical Pathology,

57(12), 1312–1318.

45. Kumar Dhar, D., et al. (1999). nm23 in the primary and metastatic sites

of gastric carcinoma. Relation to AFP-producing carcinoma. Oncology,

56(2), 122–128.

40

46. Betke, H., et al. (1998). The role of nm23 in melanoma progression and

its prognostic significance. Polish Journal of Pathology, 49(2), 93–96.

47. Leone, A., et al. (1993). Evidence for nm23 RNA overexpression, DNA

amplification and mutation in aggressive childhood neuroblastomas.

Oncogene, 8(4), 855–865.

48. Bal, A., et al. (2008). Expression of nm23 in the spectrum of

preinvasive, invasive and metastatic breast lesions. Diagnostic

Pathology, 3, 23.

49. Otsuki, Y., et al. (2001). Tumor metastasis suppressor nm23H1

regulates Rac1 GTPase by interaction with Tiam1. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America, 98(8),

4385–4390.

50. Seong, H. A., Jung, H., & Ha, H. (2007). NM23-H1 tumor suppressor

physically interacts with serine-threonine kinase receptor-associated

protein, a transforming growth factor-beta (TGF-beta) receptor-

interacting protein, and negatively regulates TGF-beta signaling.

Journal of Biological Chemistry, 282(16),12075–12096.

51. Rayner, K., et al. (2008). Discovery of NM23-H2 as an estrogen

receptor beta-associated protein: role in estrogen-induced gene

transcription and cell migration. The Journal of Steroid Biochemistry

and Molecular Biology, 108(1 2), 72–81.

52. Fan, Z., et al. (2003). Tumor suppressor NM23-H1 is a granzyme A-

activated DNase during CTL-mediated apoptosis, and the nucleosome

assembly protein SET is its inhibitor. Cell, 112(5), 659–672.

53. D'Angelo, A., et al. (2004). Prune cAMP phosphodiesterase binds

nm23-H1 and promotes cancer metastasis. Cancer Cell, 5(2), 137–149.

54. Polanski, R., et al. (2011). MDM2 interacts with NME2 (nonmetastatic

cells 2, protein) and suppresses the ability of NME2 to negatively

regulate cell motility. Carcinogenesis, 32(8), 1133– 1142.

41

55. Charpin, C., et al. (1998). Prognostic significance of Nm23/ NDPK

expression in breast carcinoma, assessed on 10-year follow-up by

automated and quantitative immunocytochemical assays. The Journal of

Pathology, 184(4), 401 407.

56. Royds, J. A., et al. (1993). Nm23 protein expression in ductal in situ and

invasive human breast carcinoma. Journal of the National Cancer

Institute, 85(9), 727–731.

57. Tokunaga, Y., Urano, T., Furukawa, K., Kondo, H., Kanematsu, T., and

Shiku, H. Reduced expression of nm23-Hl, but not of nm23-H2, is

concordant with the frequency of lymph-node metastasis of human

breast cancer. Int. J. Cancer, 55: 66-71. 1993.