Farmaci antibatterici: classificazione, meccanismo di azione, meccanismi di resistenza

Valutazione in vitro dell’attività antibatterica:saggio di microdiluizione in brodo

Giovanni Di Bonaventura, Ph.D.Università “G. D’Annunzio”, Chieti-Pescara

Chemioterapia - cenni storici

� Chemioterapia “empirica”� Corteccia di cinchona vs malaria (indiani

peruviani)� Muffe vs ferite

Mercurio vs sifilide (XVI secolo)� Mercurio vs sifilide (XVI secolo)

� Chemioterapia “moderna” (scientifica)� Paul Ehrlich (1854-1915)

� Concetto di “tossicità selettiva”� Arsfenamina (Salvarsan) vs sifilide (solo in vivo)

� Domagk (1935)� Colorante rosso (Prontosil) vs infezioni batteriche

� Fleming (1929)� Penicillium notatum vs stafilococchi (penicillina)

Cos’è un farmaco antibatterico ?

� Agente antibatterico:Composto in grado di interferire con la crescita e la

moltiplicazione batterica

Contrariamente al disinfettante, è attivo solo verso Contrariamente al disinfettante, è attivo solo verso batteri metabolicamente attivi (tranne polimixine)

� Antibiotico:� Sostanza a basso PM prodotta dal metabolismo di un

microrganismo: Actinomiceti (Streptomyces), Miceti (Penicillium, Cephalosporium)

� Chemioterapico:� Prodotto di sintesi (analogo strutturale di un antibiotico)

� Natura dell’inibizione:� Battericida:

� provoca la morte dell’agente infettivo (infezioni gravi)

� Batteriostatica: inibisce la crescita del microrganismo, consentendo lo

Classificazione degli agenti antimicrobici

� inibisce la crescita del microrganismo, consentendo lo sviluppo della risposta immunitaria anticorpale

� Tipologia di microrganismo:� Ampio spettro (tetracicline)� Spettro ristretto (penicillina)

� Meccanismo di azione:� Inibitori della parete cellulare� Inibitori della membrana cellulare� Inibitori della sintesi proteica (30S, 50S, tRNA)� Inibitori della sintesi di acidi nucleici� Inibitori di enzimi metabolici

� Adeguata attività antimicrobica

� Non interagisce con i meccanismi di difesa dell’ospite e con la flora commensale

� Tossicità selettiva:

Caratteristiche desiderabili di un agente antimicrobico

� Tossicità selettiva:� Attività rivolta verso il batterio ma non verso la cellula ospite

� Target “caratteristico” (per struttura od affinità)

� Indice terapeutico:� Concentrazione terapeutica max / concentrazione tox min

� Attivo a basse concentrazioni� Stabile, economico, facilmente somministrabile� Previene l’insorgenza di varianti resistenti� Raggiunge adeguate concentrazioni tissutali� Non associato ad effetti collaterali (ipersensibilità)

� Gli antimicrobici più comuni sono i β-lattamici:� Penicilline

� Cefalosporine

Inibitori della parete cellulare(β-lattamici, glicopeptidi, bacitracina)

� Cefalosporine

� Altri β-lattamici:� Acido clavulanico, tienamicina, sulbactam

� Moxalactam

� Monobattamici (aztreonam)

� Prodotte da Penicillium chrysogenum� Nucleo fondamentale: acido 6-amino-penicillinanico� Naturali:

� Benzil-penicillina (penicillina G)

Inibitori della parete cellularePenicilline

� Benzil-penicillina (penicillina G)� attiva verso cocchi Gram+ e Gram-

� Semi-sintetiche:� Meticillina + Isossazolilpenicilline (oxa-)

� Resistenti a β-lattamasi

� Aminopenicilline (ampi-, amoxi-)� Carbossipenicilline (carbeni-, ticar-)� Ureidopenicilline (pipera-, azlo-)� Sulfossipenicilline (sulbeni-, sun-)

� notevole penetrazione della membrana esterna dei Gram-; sensibili a β-lattamasi

� Presenza del nucleo acido 7-amino-cefalosporanico

� Spettro di azione esteso ai Gram-negativi� resistenti a β-lattamasi; penetrazione della membrana esterna

� Naturali:Cefalosporina C (Cephalosporium achremonium)

Inibitori della parete cellulareCefalosporine

� Cefalosporina C (Cephalosporium achremonium)

� Semi-sintetiche:� I generazione (cefazolina)

� II generazione (cefuroxime)

� III generazione (cefotaxime)

� IV generazione (cefepime)

� Cefamicine:� Naturali (streptomiceti)

� Struttura cefalosporina-simile (gruppo metossilico in C7)

� Esteso spettro di azione (soprattutto verso i batteri anaerobi)

� Target principale = parete cellulare batterica� Bersaglio caratteristico della cellula microbica (tox selettiva)

� Attività battericida su cellule in attiva divisione

Inibiscono la fase finale di polimerizzazione

β-lattamiciMeccanismo di azione

� Inibiscono la fase finale di polimerizzazione(reazione di transpeptidazione) della sintesi del peptidoglicano, legandosi “selettivamente” agli enzimi coinvolti nella reazione (Penicillin Binding Proteins – PBPs):

� Arresto crescita batterica

� Accrescimento oltre i limiti fisiologici

� Formazione dello sferoplasto e lisi cellulare:� Produzione di peptidoglicano “lasso”

� Induzione di enzimi endogeni batterici (mureina-idrolasi)

Peptidoglicanostruttura

Sintesi del peptdoglicanotranspeptidazione

� Penicilline:� Generalmente attive su gram-positivi aerobi ed anaerobi:

� Batteriemia, setticemia, faringite, otite media (S. aureus, S. epidermidis)Meningite, polmonite (S. pneumoniae)

Beta-lattamiciSpettro (uso terapeutico)

� Meningite, polmonite (S. pneumoniae)

� Alcuni Gram-negativi:� UTI (Proteus, E. coli)� Gastroenteriti (Salmonella , Shigella)

� Cefalosporine:� Spettro esteso anche ai Gram-negativi

� Meningiti (Haemophilus influenzae tipo b, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis)

� Resistenza a beta-lattamasi attive su penicilline

� Maggiore penetrazione attraverso la membrana esterna

� Penicilline:� Sebbene non associate ad effetti collaterali,

possono indurre ipersensibilità (10% dei casi) o neurotossicità (dosaggio> 40-50 milioni di unità)

Beta-lattamiciTossicità

� Acido clavulanico, sulbactam� Derivato strutturale dell’acido 6-amino-penicillanico

� Azione protettiva nei confronti delle β-lattamasi (in combinazione con penicilline)

Inibitori della parete cellularealtri β-lattamici

combinazione con penicilline)

� Moxalactam� Derivato strutturale dell’acido 7-amino-cefalosporanico

� Esteso spettro di azione, spiccata resistenza alle β-lattamasi

� Monobattamici (aztreonam)� Chromobacterium violaceum

� Nucleo fondamentale β-lattamico monociclico

� Rilevante attività vs Gram-negativi (anaerobi esclusi), spiccata resistenza alle β-lattamasi

� Polieni (anfotericina B, nistatina)� Legame irreversibile con lipidi di membrana (ergosterolo) e

conseguente distruzione di membrana.� Fungistatici, infezioni sistemiche (Candida spp)� Nefrotossicità

Azoli (itraconazolo, fluconazolo, chetoconazolo):

Inibitori della funzionalità della membrana citoplasmatica(Polieni, Azoli, Polimixine)

� Azoli (itraconazolo, fluconazolo, chetoconazolo):� Bloccano la sintesi di ergosterolo� Fungicidi, infezioni superficiali e sistemiche � Disfunzioni epatiche, nausea, vomito

� Polimixine (polimixina B, colistina):� Polipeptidi ciclici prodotti dal genere Bacillus� Interagiscono specificatamente con i lipidi di membrana esterna

(Gram-negativi) distruggendone il doppio strato fosfolipidico ed alterandone la permeabilità

� Meccanismo di azione simile ai disinfettanti (elevata nefrotox)� Spettro esteso, uso topico (associata a bacitracina)

Inibitori della sintesi proteica(Aminoglicosidi, Tetracicline, Cloramfenicolo, Macrolidi, Lincosamidi)

La selettività dell’azione di questi antibiotici risiede nelle sostanziali differenze esistenti tra i ribosomi procariotici ed eucariotici e nel processo di sintesi proteica

� Naturali (Streptomyces, Micromonospora):� Streptomicina

� Neomicina

Kanamicina

Inibitori della subunità 30 SAminoglicosidi

� Kanamicina

� Gentamicina

� Tobramicina

� Sisomicina

� Semi-sintetici:� Amikacina

� Netilmicina

� Meccanismi di azione (attività rapida battericida)1. Penetrazione dell’antibiotico nella cellula dove si lega

irreversibilmente alla subunità 30S ribosomiale, con formazione di un prodotto proteico “anomalo” (non funzionale)

Inibitori della subunità 30 S Aminoglicosidi

formazione di un prodotto proteico “anomalo” (non funzionale)

2. Parte della proteina “anomala” viene inserita a membrana generando dei pori che favoriscono l’ingresso di ulteriori quantità di antibiotico

3. Concentrazioni elevate dell’antibiotico impediscono il legame all’m-RNA di tutti i ribosomi, causando il blocco di sintesi proteica

� Induzione di errori nella lettura dei codoni di RNA-m (streptomicina-dipendenza)

� Esteso spettro di azione:� Inattivi nei confronti degli anerobi

� Gram-positivi e Gram-negativi (infezioni gravi da P. aeruginosa, Enterobacter spp)

Inibitori della subunità 30 S Aminoglicosidi

P. aeruginosa, Enterobacter spp)

� Tossicità:� Nefrotossicità

� Ototossicità (perdita cellule ciliate e danno permanente all’organo del Corti)

� Blocco neuromuscolare

Inibitori della subunità 30 S Tetracicline

� Streptomyces spp.

� struttura tetraciclica

� Meccanismo di azione:

Attività batteriostatica

� Legano reversibilmente la sub-unità 30S

Inibitori della subunità 30 S Tetracicline

� Legano reversibilmente la sub-unità 30S ribosomiale batterica, inibendo l’attacco dell’aminoacil-RNA-tmet e bloccando la formazione del complesso attivo traslazionale (polisoma). Possono inoltre inibire la sintesi proteica eucariotica, ma raramente raggiungono concentrazioni tossiche

� Esteso spettro di azione:� Gram-positivi (acne), Gram-negativi (infezioni

vie aeree)

� Ricketsie (trattamento di elezione)

Inibitori della subunità 30 S Tetracicline

� Ricketsie (trattamento di elezione)

� Clamidie (trattamento di elezione)

� Spirochete

� Alcuni protozoi

� Tossicità:� Superinfezioni (eliminazione flora commensale)

� Colorazione dei denti in via di sviluppo

� Macrolidi� Streptomyces

� Nucleo lattonico macrociclico con funzione chetonica

� Eritromicina

Inibitori della subunità 50 S Macrolidi, cloramfenicolo, lincosamidi

� Eritromicina

� Roxitromicina

� Azitromicina

� Claritromicina

� Cloramfenicolo� Streptomyces venezuelae

� Lincosamidi (lincomicina, clindamicina)

� Meccanismo di azione:

Attività batteriostatica� Legano, competendo per lo stesso sito, i ribosomi

Inibitori della subunità 50 S Macrolidi, cloramfenicolo, lincosamidi

� Legano, competendo per lo stesso sito, i ribosomi liberi a livello della sub-unità 50S disaccoppiando il processo di formazione del legame peptidico con l’attacco di nuovi ribosomi all’RNA-messaggero. Conseguentemente, si assiste al blocco della sintesi proteica.

� Spettro di azione:� Macrolidi

� Infezioni da patogeni intracellulari:Chlamydia

Inibitori della subunità 50 S Macrolidi, Cloramfenicolo, Lincosamidi

� Chlamydia� Campylobacter� Mycobacterium spp.� Polmonite da Mycoplasma pneumoniae� Legionellosi

� Cloramfenicolo� Gram+, Gram-

� Lincosamidi� Anaerobi obbligati (clindamicina)

Rifampina, Rifamicina,

Rifampicina, Rifabutina(battericidi)

� Antibiotici (Nocardia mediterranea)

� Meccanismo di azione – legano la subunità β della RNA-polimerasi DNA-dipendente, bloccando l’inizio della sintesi di mRNA.mRNA.

� Tossicità selettiva – differenze nella struttura della RNA-polimerasi batterica rispetto a quella eucariotica

� Spettro di azione – esteso, ma impiegati soprattutto nel trattamento della tubercolosi

Chinoloni (battericidi)acido nalidixico, ciprofloxacina, ofloxacina, norfloxacina, levofloxacina, lomefloxacina, sparfloxacina

� Chemioterapici

� Meccanismo di azione – legano la subunità GyrA della DNA girasi e la subunità ParC della topoisomerasi IV, prevenendo la girasi e la subunità ParC della topoisomerasi IV, prevenendo la despiralizzazione del DNA e, quindi, la sua sintesi.

� Tossicità selettiva – differente struttura enzimatica tra procarioti ed eucarioti

� Spettro di azione – Cocchi Gram-positivi ed infezioni delle vie urinarie

Novobiocina (battericida)

� Antibiotico (Streptomyces spheroides, S. niveus)

� Meccanismo di azione – lega la subunità GyrB della DNA girasi (topoisomerasi II), prevenendo la despiralizzazione del girasi (topoisomerasi II), prevenendo la despiralizzazione del DNA e, quindi, la sua sintesi.

� Tossicità selettiva – differente struttura enzimatica tra procarioti ed eucarioti

� Spettro di azione – azione sinergica con quella dei chinoloni

Chemioterapici “antimetaboliti”

Via biosintetica dei folati

acido p-aminobenzoico + idrossimetil-diidropteridina

acido diidropteroico

Diidropteroato-sintetasi

Diidrofolato-sintetasi

Sulfamidici

dei folati

acido diidrofolico

acido tetraidrofolico

sintetasi

Diidrofolato-reduttasi

TimidinaPurine

Metionina

Serina

Trimethoprim

Sulfamidici (batteriostatici)

� Meccanismo di azione – agiscono come analoghi strutturali dell’acido p-aminobenzoico inibendo, in maniera competitiva, la formazione di acido diidropteroico.

� Tossicità selettiva – via biosintetica dei folati presente nei soli batteri

� Spettro di azione – Esteso spettro di azione verso Gram-positivi e Gram-negativi; usati primariamente nel tratto urinario e nelle infezioni da Nocardia.

� Terapia combinatoria – usati in combinazione con il trimethoprim inibiscono la via dei folati a due differenti livelli, prevenendo l’emergenza di ceppi resistenti.

Trimethoprim, Metotrexato,

Pirimetamina (batteriostatici)

� Meccanismo di azione – legano la diidrofolato-reduttasi, inibendo la formazione di acido tetraidrofolico.

� Tossicità selettiva – sebbene la via metabolica sia comune ai procarioti ed eucarioti, l’enzima batterico mostra maggiore procarioti ed eucarioti, l’enzima batterico mostra maggiore affinità per il trimethoprim.

� Spettro di azione – Estesa attività verso batteri Gram-positivi e Gram-negativi; usati primariamente nel tratto urinario e nelle infezioni da Nocardia.

� Terapia combinatoria - usati in combinazione con i sulfamidici inibiscono la via dei folati a due differenti livelli, prevenendo l’emergenza di ceppi resistenti.

Resistenza ai farmaci antibatterici

� Tipologie di resistenza:� Resistenza “innata”

� Gram-negativi vs penicilline (membrana esterna)� Clamidie e Micoplasmi vs β-lattamici (assenza di parete)

Resistenza “acquisita”� Resistenza “acquisita”� Mutazione spontanea (resistenza cromosomica)� Acquisizione (coniugazione, trasduzione) di determinanti genetici

a localizzazione plasmidica o transposonica (Gram-negativi)

� Significato “clinico” della resistenza� I ceppi resistenti sopravvivono in presenza di

concentrazioni raggiunte in vivo a livello sierico dall’antibiotico in seguito a somministrazione di normali dosi terapeutiche. La resistenza predice il possibile fallimento della terapia antibiotica.

Antibiotico-resistenzaMeccanismi

� Modificazione del “bersaglio” del farmaco� Penicillin-binding proteins (penicilline, cefalosporine)� DPS (sulfamidici), DHFR (trimethoprim)� Subunità DNA-girasi (chinoloni, novobiocina)� Subunità-β della RNA-polimerasi (rifamicine)

Subunità 50S (macrolidi, lincosamidi)� Subunità 50S (macrolidi, lincosamidi)

� Inattivazione enzima attivante il “profarmaco”� Mutazione katG (isoniazide)� Alterate nitroreduttasi (composti nitroeterociclici)

� Alterata permeabilità� Minore influsso (Pseudomonas vs aminoglicosidi)� Maggiore efflusso (tetracicline)

� Inattivazione enzimatica del farmaco� Produzione di trasferasi (aminoglicosidi)� Produzione di β-lattamasi (β-lattamine)

β-lattamasi

� Enzimi in grado di idrolizzare, inattivandole, le β-lattamine per apertura del nucleo lattamico:� Penicillinasi ( ac. penicilloico)

� Cefalosporinasi ( ac.cefalosporoico)Cefalosporinasi ( ac.cefalosporoico)

� Localizzazione:� Gram-positivi: inducibili, esocellulari

� Gram-negativi: costitutivi, intracellulari (spazio peripl.)

� Controllo:� plasmidico (S. aureus, P. aeruginosa, H. influenzae)� trasposonico (Tn2-Tn3, Enterobacteria/ Pseudomonas)� Cromosomico (cefalosporinasi nei Gram-negativi)

Resistenza ai β-lattamici

Antibiotico-resistenza:il “problema” medico

� Meticillino-resistenza negli stafilococchi� 100.000 decessi/anno negli USA

� Circa il 50% delle infezioni nosocomiali è Circa il 50% delle infezioni nosocomiali è resistente ad almeno 1 antibiotico

� Esito infausto per il 90% dei pazienti affetti da tubercolosi multi-resistente

“abuso”/”uso non corretto” degli antibiotici

Lo sviluppo della resistenza è correlato al livello di impiego degli antibiotici

� L’abuso (uso non corretto) ha aumentato l’incidenza e la selezione delle mutazioni inducenti resistenza:

� L’abuso (uso non corretto) ha aumentato l’incidenza e la selezione delle mutazioni inducenti resistenza:� Profilassi in chirurgia

� Uso empirico (agente eziologico ignoto)

� Aumentato uso di antibiotici a spettro esteso

� Antibiotici (probiotici) nei mangimi animali

� Uso pediatrico per infezioni virali

� Scarsa compliance del paziente

Come “controllare” il problema

� Evitare l’impiego ripetuto della stessa molecola

� Modificare l’antibiotico per eludere il meccanismo di resistenza

� Usare combinazioni antibiotiche� Usare combinazioni antibiotiche

� Ridurre il consumo di antibiotici� educazione sanitaria, limitare l’uso di mangimi animali

� Aumentare la compliance del paziente� educazione sanitaria

� Sviluppo di nuove molecole� Peptidi naturali: magainine (da rane e squali)

� Ottimizzazione delle tecniche per la determinazione dell’antibiotico-sensibilità

Tests di antibiotico-sensibilità

Obiettivo dei tests per la determinazione della antibiotico-S è di predire il successo od il fallimento in vivo della terapia antibiotica.

I tests vengono effettuati in vitro, e misurano la I tests vengono effettuati in vitro, e misurano la risposta (crescita) di un microrganismo isolato verso un particolare antibiotico/antibiotici.

I tests sono eseguiti in condizioni standardizzate per garantire la riproducibilità dei risultati.

I risultati di questi tests debbono essere usati per guidare la scelta dell’antibiotico da adottare, alla quale contribuiscono anche le informazioni cliniche e l’esperienza professionale.

� MIC (Concentrazione Minima Inibente) è una misura quantitativa dell’attività di un antibiotico verso un determinato batterio. Definita come la più bassa concentrazione di antibiotico in grado

Tests di antibiotico-sensibilità Definizioni

più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica visibile.

� NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) pubblica i criteri per la interpretazione dei risultati dei tests di sensibilità (categorie interpretative).

� Categorie Interpretative (Sensibilità, S Intermedia, Resistenza) individuate da valori di MIC detti breakpoints (soglia, limite)

Interpretazione dei risultatiBREAKPOINTS

I breakpoints vengono individuati dalla NCCLS in base a:

– Livelli raggiunti in vivo (sangue, tessuti) dall’antibiotico

– Correlazione tra risultati in vitro (MIC) ed in vivo (risoluzione del caso clinico)

SensibilitàUna infezione sostenuta dal ceppo batterico isolato può essere trattata appropriatamente con il dosaggio usuale dell’antibiotico testato e raccomandato per il tipo di infezione clinica.

Sensibilità IntermediaGli isolati batterici mostrano MIC corrispondenti a livelli sierici e tessutali di antibiotico per i quali l’efficacia potrebbe essere più bassa di quella registrata per gli isolati sensibili. Questa categoria suggerisce l’efficacia clinica nei siti corporei dove gli categoria suggerisce l’efficacia clinica nei siti corporei dove gli antibiotici sono fisiologicamente concentrati (chinoloni nelle urine) o quando l’antibiotico può essere utilizzato a concentrazioni più alte di quelle normali (β-lattamici).

Resistenza Questa categoria predice il possibile fallimento dell’antibiotico testato. I ceppi resistenti non sono inibiti dalle normali concentrazioni sistemiche raggiunte in vivo dall’antibiotico in seguito a somministrazione di dosi normali.

Tecniche per la determinazione in vitro dell’antibiotico-sensibilita’

� Brodo diluizione (micro- e macrometodo)

Diffusione in agar (Kirby-Bauer)� Diffusione in agar (Kirby-Bauer)

� Agar diluizione

� Sistemi Automatizzati

Brodo diluizione

Semina inoculo batterico (5 x 105 cfu/ml)

Incubazione a 37°C per 18 h

Brodo diluizioneNCCLS-breakpoints

Piperacillina ≤16 32-64 ≥128 Cefazolina ≤8 16 ≥32

ANTIBIOTICO S I R

Cefotaxime ≤8 16-32 ≥64 Cefpodoxime ≤2 4 ≥8 Imipenem ≤4 8 ≥16 Vancomicina ≤4 8-16 ≥32 Gentamicina ≤4 8 ≥16

S = Sensibilità, I = Sensibilità Intermedia, R = Resistenza

Brodo diluizione

� VANTAGGI:

� Automatizzata

� Riproducibile (standardizzata)� Riproducibile (standardizzata)

� Quantitativa

� SVANTAGGI:

� Laboriosa (allestimento pannelli antibiotizzati)

� Costi

Tecniche per la determinazione in vitro dell’antibiotico-sensibilita’

� Brodo diluizione (micro- e macrometodo)

Diffusione in agar (Kirby-Bauer)� Diffusione in agar (Kirby-Bauer)

� Agar diluizione

� Sistemi Automatizzati

Diffusione in agar (Kirby-Bauer)

1. Allestimento brodocoltura da coltura pura

2. Semina brodocoltura

1

2

2. Semina brodocoltura

3. Apposizione dischetti antibiotizzati

4. Incubazione (37°C, 18-24h)

5. Misurazione diametro alone di inibizione

3

4

5

Diffusione in agar Risultati

Diffusione in agar (Kirby-Bauer)

� VANTAGGI:� Tecnica standardizzata (NCCLS)

� Flessibilità nella scelta degli antibiotici

Facilità di esecuzione� Facilità di esecuzione

� Economicità

� Correlazione tra risultati in vitro (antibiogramma) e risoluzione clinica (risultato in vivo)

� SVANTAGGI:� Impossibilità di totale automatizzazione

� Produce risultati qualitativi (categorie di sensibilità)

Attività battericida di un antibiotico

• Infezioni gravi: osteomieliti, endocarditi• Focolaio di infezione situato in distretti anatomici

difficilmente accessibili all’antibioticodifficilmente accessibili all’antibiotico

• Concentrazione Minima Battericida (MBC):

La più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica di almeno il 99.9% (1 germe su 1.000 elude l’azione antibiotica) della popolazione iniziale.

MIC/MBC test(Brodo diluizione)

MBC/MIC – killing quotient

� Tasso di uccisione = MBC / MIC

1-4 per antibiotici battericidi1-4 per antibiotici battericidi

(beta-lattamici, chinoloni)

>4 per antibiotici batteriostatici

(sulfamidici, tetracicline)